CN104629752B - 一种识别凋亡细胞的荧光分子探针制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种识别凋亡细胞的分子探针的制备方法，该方法利用胱氨酸为原料通过氨基与荧光分子反应得到荧光分子探针。该方法简单易行，可以将不同的荧光分子如FITC、Cy5.5、NIR797等连接到胱氨酸上，细胞和活体实验均表明该探针对凋亡细胞具有良好的识别作用。
Description
技术领域
本发明涉及靶向细胞凋亡的小分子荧光探针的制备技术。
背景技术
细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的有序的死亡，是机体维持细胞群体数量稳定的重要方式。细胞凋亡异常是多种疾病的重要发病机制，因此对细胞凋亡进行实时无创的检测对于很多疾病的临床诊断和基础研究均具有重要的意义。细胞凋亡会伴有细胞内的磷脂酰丝氨酸的外翻，使细胞膜具有负电性的磷脂表面。
迄今为止，检测凋亡的方法手段有很多。从病理学角度来看，细胞质以及细胞核的皱缩、DNA的裂解、凋亡小体的形成等，这些都是凋亡标志性病理学特征。然而，这些特征标志仅能通过病理组织切片染色来加以验证，这大大阻碍了凋亡检测在临床中的应用。
近年来，分子影像学的异军崛起，为疾病诊断提供了更加丰富的信息，大大提高了疾病在体检测的灵敏度和特异度。而就凋亡的分子影像而言，也有很多相应的分子探针，诸如针对凋亡细胞膜上外翻的磷脂酰丝氨酸的AnnexinV、针对凋亡细胞Caspase酶活化的一些智能响应探针等，这些分子探针在一定程度上能够反应细胞凋亡。然而一方面，这些探针大部分仅能聚集于细胞膜上，并不能进入细胞内，这样大大减小了探针的对比信噪比；另一方面，这些分子探针的分子量都相对较大，很大程度上影响了其在体内的生物分布，导致其在血液中的分子稳定性也较差，并且探针在血池中的清除率也相对较慢，同时这些大分子的分子探针也加大了合成的难度。而小分子量的分子探针却能够很好地规避上述缺点，更适用于临床转化。因此我们针对凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸，设计了一类小分子凋亡探针。这类分子中具有胱氨酸结构,其两个羧基通过质子化作用，能够选择性的进入到具有负电性磷脂表面的凋亡细胞内，从而实现对凋亡细胞的识别。不仅如此，该探针可通过质子化作用，进入到细胞胞质内，极大的提高了探针对比信噪比。同时该方法具有简单易行，制备的探针灵敏度高的特点，通过商品化的药品，可以实现一步法制备。通过改变不同的荧光分子类型，可以得到应用于不同的生物环境的荧光探针。
发明内容
技术问题：本发明的目的是提供一种简单易行的方法，制备识别凋亡细胞的荧光分子探针。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：一种靶向细胞凋亡的荧光分子探针制备方法，步骤如下：胱氨酸分子和荧光分子溶液混合，恒温振荡器上反应3小时，制备得到检测细胞凋亡的荧光分子探针(效果图见附图)。
优选的：1)为保证胱氨酸上两个氨基均与荧光分子反应，加入的荧光分子的量是胱氨酸物质的量的2.2-3倍；
2）荧光分子可以是FITC、Cy5.5-NHS和NIR797；
3)反应温度为室温，即25摄氏度；
有益效果：我们针对凋亡细胞外翻的磷脂酰丝氨酸，设计了一类小分子凋亡探针。这类分子中具有胱氨酸结构,其两个羧基通过质子化作用，能够选择性的进入到具有负电性磷脂表面的凋亡细胞内，从而实现对凋亡细胞的识别。不仅如此，该探针可通过质子化作用，进入到细胞胞质内，极大的提高了探针对比信噪比。同时该方法具有简单易行，制备的探针灵敏度高的特点，通过商品化的药品，可以实现一步法制备。通过改变不同的荧光分子类型，可以得到应用于不同的生物环境的荧光探针。
附图说明
图1、荧光分子探针合成路线示意图；
图2、可见光荧光分子探针靶向小鼠脑卒中模型病灶中凋亡细胞与AnnexinV共染效果图
具体实施方式。
本发明的目的是提供一种简单易行的方法制备一种能够识别凋亡细胞的荧光分子探针。该荧光分子探针利用商品化的化学药品，只需要一步反应即可制备，且易于纯化。
实施例1
1)可见光荧光分子探针的制备：称取4mmol胱氨酸溶于600微升碳酸钠水溶液中，称取8.9mmol的FITC溶于100微升的二甲基亚砜中。
2)将两溶液混匀，25摄氏度下振荡3小时。
3)得到的混合物放入截留分子量为1000的再生纤维素纤维材质的透析袋中在纯水中透析6小时，中间换2次水。
4)所得溶液冻干，即得到可见光荧光分子探针。
实施例2
1)近红外荧光分子探针的制备：称取4mmol胱氨酸溶于600微升碳酸钠水溶液中，称取9mmolCy5.5-NHS溶于100微升的二甲基亚砜中。
2)将两溶液混匀，25摄氏度下振荡3小时。
3)得到的混合物放入截留分子量为1000的再生纤维素纤维材质的透析袋中在纯水中透析6小时，中间换2次水。
4)所得溶液冻干，即得到近红外荧光分子探针。
实施例3
为了更好的说明本发明效果，我们将实施例1中制备的可见光荧光分子探针注射到小鼠脑卒中模型中，然后将卒中病灶组织切片行AnnexinV染色，证明该荧光分子探针对凋亡细胞的靶向性。
1）C57/BL6小鼠进行光栓大脑中动脉脑卒中模型，在造模后30min内，从尾静脉注射探针FITC荧光分子探针（1mg/ml，0.3ml）；
2）24小时后，处死小鼠，取脑进行冰冻切片，与AnnexinV免疫荧光染色。
通过与传统凋亡检测金标准AnnexinV进行对比，我们发现,在脑卒中梗死灶区域,红色的AnnexinV阳性细胞与绿色探针标记的细胞有很好的共染效应。同时，相对于主要集中在细胞膜表面的AnnexinV，我们的探针能够在胞质中聚集，大大提高了探针的对比信噪比。
Claims (1)
1.一种识别细胞凋亡的荧光探针制备方法，其特征在于：利用胱氨酸的氨基与荧光分子的活性基团反应，所述的活性基团为N-羟基琥珀酰亚胺活性酯或异硫氰酸酯，得到荧光分子探针；所述的荧光探针分子按如下步骤制备：
1)为保证胱氨酸的两个氨基均与荧光分子发生反应，加入的荧光分子的量是胱氨酸物质的量的2.2-3倍；
2）荧光分子为异硫氰酸荧光素、异硫氰酸罗丹明、Cy5.5-NHS、NIR797；
3)反应温度为室温；
4)将反应后混合产物纯化。
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