CN103044522B

CN103044522B - 与整合素αvβ3受体具有高亲和力的多肽

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Publication number: CN103044522B
Application number: CN201310019870.9A
Authority: CN
Inventors: 顾月清; 艾观华; 董雪; 牛淼淼
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2013-01-21
Filing date: 2013-01-21
Publication date: 2015-07-22
Anticipated expiration: 2033-01-21
Also published as: CN103044522A

Abstract

本发明属于生物工程制药、蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，涉及对整合素受体αvβ3具有高亲和力的多肽及其应用，多肽序列为：Arg-Trp-Arg或Arg-Lys-Tyr。本发明的多肽比传统的RGD肽对于整合素αvβ3具有更强的亲和力。可用于癌症诊断和治疗中。

Description

与整合素αvβ3受体具有高亲和力的多肽

技术领域

本发明属于生物工程制药、蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，涉及对整合素受体αvβ3具有高亲和力的多肽及其应用，例如用于癌症诊断和治疗中。

背景技术

整合素家族是一个由许多结构和功能相似的蛋白质所组成的膜受体家族，每个成员的分子都是由α、β两条链(亚基)通过非共价键连接形成的跨膜异二聚体糖蛋白，是细胞表面重要的兼具黏附和信号传导功能的受体。现已经发现了由18种α亚基和8种β亚基构成的24种整合素，α和β亚基共同决定整合素的受体特异性。整合素通过胞外域与细胞外基质(extracellularmatix，ECM)，胞内段与细胞骨架、信号转导分子和其他一些蛋白相结合，介导细胞内外之间的双向信号传递。一方面，细胞内信号通过整合素传导，使其活化，从而调节整合素与细胞外配体的亲和力；另一方面，整合素与配体结合后把胞外信号传入细胞内，导致细胞骨架重组、基因表达和细胞分化等。整合素在细胞的黏附、增殖、分化、转移、凋亡等过程中起着重要的调控作用，在肿瘤的侵袭转移中发挥着重要作用，αvβ3就是其中的一种重要分子。研究表明，整合素αvβ3在骨肉瘤、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、胶质母细胞瘤等多种实体肿瘤细胞表面有高水平的表达。

迄今，一系列的整合素αvβ3的拮抗剂和分子探针相继被发现，ＬＭ609（商品名Ａｖａｓｔｉｎ，贝伐单抗，基因泰克公司）：ＬＭ609是鼠抗人整合素αｖβ3单克隆抗体，它能与起源于兔、鸡和仓鼠的αｖβ3发生特异性反应。与其他的单克隆抗体如αｖ或β3相比，ＬＭ609具有特异性和高效性的特点。ＬＭ609潜在的局限性在于它只能阻止αｖβ3介导的血管生成，而对其他整合素受体介导的血管生成途径没有影响。ＣＮＴＯ95：ＣＮＴＯ95是一个完全人性化的抗体且能够识别多个αｖ整合素，在一期临床试验中，ＣＮＴＯ95表现出了良好的安全性和耐受性。17Ｅ6抗体：17Ｅ6抗体是对纯化的人αｖβ3提出，能与至少αｖβ3、αｖβ5和αｖβ1发挥作用。17Ｅ6抗体通过αｖ强烈干扰细胞黏附，并抑制整合素与配体的结合。Ｂｏｓｃｈ等研究发现，17Ｅ6能够抑制ＨＩＶ-1感染原发性巨噬细胞，且对ＨＩＶ-1急性感染的巨噬细胞的ＢＡＬ复制的影响呈剂量依赖性，表明αｖ亚基可能是艾滋病毒感染的药理学靶点。除了以上报道的之外，还有许多其他类型的拮抗剂，如去整合素、多肽（主要是基于ＲＧＤ序列）和非肽类分子，也能特异性结合整合素αｖβ3而发挥作用。基于基质蛋白中RGD三肽序列能与整合素αvβ3特异结合，研究者们合成了大量含RGD序列的线形或环形多肽作为整合素αvβ3的拮抗剂。对αvβ3拮抗多肽的构效关系研究发现，含有2个二硫键的环形RGD多肽对肿瘤新生血管内皮细胞的抑制效力最强，是含单一二硫键环形RGD多肽的20倍，。环形RGD多肽由于多价态可以同时和几个αvβ3结合，因此较线形RGD多肽有更高的受体结合特异性。吴国球发现了三条与整合素αvβ3具有高亲和力的序列长度为17个氨基酸和18个氨基酸的多肽。此外，通过形成均多聚体或杂多聚体也可提高RGD肽对整合素受体的结合率和选择性。对RGD肽进行人为修饰的另一个发展方向是使RGD肽多聚化。多聚化RGD环肽具有比单体更高的亲和力，可有效提高肿瘤对放射性药物的摄取，延长放射性药物在肿瘤中的滞留时间。研究表明，只要RGD肽多聚体的连接体有足够的长度，RGD肽多聚体的每个单体都可以与整合素受体结合，且结合力比RGD单体的结合力要高很多，目前多聚化RGD肽已经由最初的二聚体逐渐发展到四聚体、八聚体，并向超聚体的方向发展。Li等用64Cu标记环状精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-络氨酸-赖氨酸[c(RGDyK)]的四聚体和八聚体，并进行体外实验和小动物正电子发射计算机断层显像（PET）显像，体外实验显示八聚体的特异性和亲和力都高于四聚体，八聚体的半数抑制浓度（IC50）值为10nM，四聚体的IC50值为35nM，动物显像也更为清晰，且在肿瘤部位存留时间长。

发明内容

本发明公开了我们发现的两条对整合素αvβ3具有高亲和力的多肽，且这两条非RGD的多肽比传统的RGD肽对于整合素αvβ3具有更强的亲和力。采用花菁类近红外荧光染料（ICG-Der-02），其侧链上有一个羧基官能团，适用作生物荧光标记。通过1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)催化体系可以有效地将将其活化，与多肽分子链末端的氨基共价偶联形成酰胺键，构建花菁类近红外荧光染料-肽（ICG-Der-02-peptide）分子探针，从而可使多肽带有明显的近红外荧光特性。这些多肽对整合素αvβ3受体特异结合的性质实现特定恶性肿瘤的近红外成像，从而达到实时无损在位监测早期恶性肿瘤的目的。整合素αvβ3受体在乳腺癌、肺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、膀胱癌、骨肉瘤等多种实体肿瘤细胞表面有高水平表达，下面的试验选用了乳腺癌细胞（MDA-MD-231）与多肽连接有较好的靶向，给药后肿瘤部位即有明显的信号。这些多肽序列偶联的探针是一种水溶性良好，毒性较低，靶向作用良好的肿瘤诊断试剂，它们的发现为进一步肿瘤药物的研发拓展了新的空间，对于合理设计肿瘤治疗方案提供了重要的基础。

本发明公开了两条对整合素αvβ3有高亲和力的多肽，可用于肿瘤的治疗与诊断。其氨基酸序列为：

1、Arg-Trp-Arg（以下简称RWR）；

2、Arg-Lys-Tyr（以下简称RKY）；

这2条多肽对整合素αvβ3具有高亲和力，单独或组合用于在肿瘤新生血管的治疗或诊断、用于药物辅料或连接物的应用。

本发明两条新的对整合素αvβ3具有高亲和力的多肽，扩大了与αvβ3受体结合肽的种类。现有针对整合素αvβ3的诊断试剂，它们一般含有传统经典的RGD序列，而本发明的对整合素αvβ3具有诊断试效果的这些多肽均为非RGD的序列，且均为小肽，合成成本低廉。

本实验采用一种近红外荧光染料ICG-Der-02（吲哚花箐类衍生物），结构式如下：

它是一种水溶性染料，易溶于水、甲醇等强极性溶剂，不溶于乙醚等非极性溶剂，在二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）中溶解性高。将近红外染料ICG-Der-02分别与本发明的RWR、RKY偶联。

近红外荧光探针ICG-Der-02-RWR，ICG-Der-02-RKY的制备如下：

取1mg近红外有机染料ICG-Der-02（详见参考文献：Jie Cao，Shunan Wan，JunmeiTian，Siwen Li，Dawei Deng.Fast clearing RGD-based near-infrared fluorescentprobes for in vivo tumor diagnosis，Contrast Media Mol.Imaging2012，7390-402）溶于1ml无水二甲基甲酰胺（DMF）中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS）(摩尔比ICG-Der-02∶EDC∶NHS=1∶1.5∶1.5)，避光反应4h，活化。称取1mmol RWR肽溶入含有ICG-Der-02荧光染料的1ml Na₂B₄O₇缓冲液（pH8.4）中，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚糖凝胶G-25柱，Na₂B₄O₇缓冲液（pH8.4）作洗脱液，得到纯化的ICG-Der-02-RWR的结合产物，-20℃储存备用。通过紫外吸收光谱对合成的ICG-Der-02-RWR探针进行初步的表征，ICG-Der-02、RWR、RKY的紫外吸收峰分别在780nm、282nm、280nm，粗品经高效液相纯化RWR、RKY的保留时间分别为9.112min、12.299min，通过质谱鉴定RWR、RKY相对分子量分别为516.61、465.56，合成后的ICG-Der-02-RWR、ICG-Der-02-RKY的紫外吸收几乎与ICG-Der-02相同，说明ICG-Der-02偶联成功连上RWR、RKY肽后，对ICG-Der-02的光谱性质并未产生任何影响。MDA-MB-231肿瘤动物模型的构建

取～2×10⁶MDA-MB-231乳腺癌细胞（以含10％的胎牛血清（FBS）的L15完全培养基于5％CO2、37℃细胞培养箱常规培养）接种于右侧腋部皮下（n=5）。接种后，这些裸鼠继续饲养并1周检测3次肿瘤的生长情况。当肿瘤的直接达到0.4-0.6cm左右的时候，用于成像实验。ICG-Der-02-RWR、ICG-Der-02-RKY探针在体靶向的研究。

当肿瘤长到0.4～0.6cm时，分别将0.2ml探针尾静脉注射入MDA-MB-231肿瘤模型裸鼠体内。在注射后0～48小时，通过近红外成像系统在不同的时间点分别对裸鼠进行成像检测，并对比不同探针之间的不同。对肿瘤部位荧光信号强度的目标特定区域（ROI）分析，进行如下计算：肿瘤/正常组织比值（tumor/normal tissue ratio,T/N ratio）=[肿瘤信号强度-背景信号强度]/[正常组织（肌肉）信号强度-背景信号强度]，来定量不同探针在不同肿瘤中的靶向性，该值越大说明其靶向性越强。

实验结果

如图1、2所示，注射ICG-Der-02-RWR、ICG-Der-02-RKY探针后，首先是分布到全身，肝脏部位信号最强，最后逐渐转移到肝-肾-膀胱代谢途径，肿瘤部位在探针注射1h后，开始有较弱的荧光信号，随着探针在体内的代谢，探针在肿瘤部位聚集越来越多，其荧光强度在注射后的4h达到峰值，肿瘤边缘的轮廓较清晰，6h时持续这种状况一直到24h，肿瘤部分荧光信号依然存在，持续很强。从近红外成像原图可以看出肿瘤部分发光，由于说明书附图是黑白图像，稍稍有些模糊。这一结果说明探针ICG-Der-02-RWR、ICG-Der-02-RKY探针对整合素αvβ3受体高表达肿瘤有较好的靶向性，探针可快速靶向MDA-MB-231肿瘤部位（1h-24h）。用ROI值进一步定量分析探针在肿瘤部位聚集的荧光强度，如图1、2显示，注射ICG-Der-02-RWR、ICG-Der-02-RKY探针4h后MDA-MB-231肿瘤荧光强度与正常组织的比值（T/N）值4.83±0.07，达到最大，ICG-Der-02-RKY T/N的值4.48±0.04，达到最大，用统计学分析，ICG-Der-02-RWR和ICG-Der-02-RKY两种探针在MDA-MB-231肿瘤模型中荧光强度T/N比值有显著性差异（p）值(p<0.05)，这个值比文献报道的RGD值3.59±0.11大，该值越大靶向性越强，说明本发明的RWR、RKY型肽比RGD靶向性更强，为构建RWR、RKY靶头的探针在临床早期肿瘤诊断方面是很有潜力的。

附图说明

图1是ICG-Der-02-RWR在荷瘤裸鼠体内成像图

图2是ICG-Der-02-RKY在荷瘤裸鼠体内成像图

具体实施方式

实施例1

RWR的合成

先用R-D-Arg（芴甲氧羰酰基-精氨酸-王树脂）0.36/2mmol5.55g，加入原料L-Trp2.106g，缩合剂用HBTU[2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯]1.44g反应时间半小时，脱帽时间40分钟，再加入原料L-Arg2.6g，缩合剂用HBTU1.44g反应时间半小时，脱帽时间40分钟.然后纯化：样品水乙腈溶解，上样到C18制备柱，用HPLC进行梯度洗脱，收集液体，检测液体纯度。把合格的样品旋蒸，在冻干机里冻干，得到200毫克的RWR。

序列为：Arg-Trp-Arg

质谱图中可以看出RWR分子量是517.61-1=516.61。紫外光谱图中284nm处有肽的吸收峰。

实施例2

RKY的合成

先用R-D-Tyr(芴甲氧羰酰基-精氨酸-王树脂)0.33/2mmol6.06g,加入原料D-Lys1.88g，缩合剂用HBTU1.44g反应时间25分钟，脱帽时间30分钟，再加入原料D-Arg2.6g，缩合剂用HBTU1.44g反应时间半小时，脱帽时间30分钟.然后纯化：样品水乙腈溶解，上样到C18制备柱，用HPLC进行梯度洗脱，收集液体，检测液体纯度。把合格的样品旋蒸，在冻干机里冻干，得到200毫克的RKY。

序列为：Arg-Lys-Tyr。

质谱图中可以看出Arg-Lys-Tyr分子量是466.56-1=465.56。紫外光谱图中273nm处有肽的吸收峰。

Claims

1.一种多肽，其序列为：Arg-Trp-Arg。

2.一种多肽，其序列为：Arg-Lys-Tyr。

3.权利要求1或2的多肽用于制备诊断乳腺癌的试剂的用途。