CN112933249A - 一种pd-l1靶向双模态分子探针及其制备方法和应用 - Google Patents
一种pd-l1靶向双模态分子探针及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种PD‑L1靶向双模态分子探针及其制备方法和应用。本发明的PD‑L1靶向双模态分子探针为同时由吲哚菁绿ICG和正电子放射性核素68Ga标记的多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。该双模态分子探针具有较高的标记率和稳定性，具有PD‑L1靶向特异性，选择性强、纯度高、分子量小、特异性强、无免疫原性、安全可靠，可用于检测肿瘤细胞中PD‑L1的表达情况，适于作为基于PD‑L1免疫治疗的预测和伴随诊断试剂。本发明提供的分子探针的制备方法具有简单易行、成本低廉的优势，实用性强，且具有良好生物安全性和较好的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，具体涉及一种PD-L1靶向双模态分子探针及其制备方法和应用。
背景技术
目前，随着对肿瘤免疫逃逸机制研究的不断深入，针对免疫检查点的抑制剂在多种实体瘤的治疗中表现出了较好的临床效果，成为癌症治疗史上里程碑式的事件，使人们认识到免疫治疗能够真正成为恶性肿瘤治疗的重要角色。其中PD-1/PD-L1的抑制更受关注，目前FDA已经批准的PD-1抗体和PD-L1抗体在治疗黑色素瘤、胶质母细胞瘤的临床疗效上也很突出，这些抗体药物具有很高的亲和性和特异性，然而抗体药物存在的缺陷是无法忽略的，包括成本高、免疫相关毒性、药代动力学和肿瘤渗透不足等，这些因素阻碍了抗体类药物更广泛的临床应用。因此，探寻合适的疗效预测标志物，进而精准的选择出免疫治疗潜在的获益人群成为研究的热点。准确预测肿瘤对PD-1/PD-L1阻断剂的反应依然是个挑战。
PD-L1在肿瘤细胞或肿瘤基质的表达已经被建议作为PD-1或PD-L1定向免疫治疗反应预测的潜在疗效预测标志物。但目前对PD-L1表达的检测尚未得到统一的国际标准，而且多方面因素导致了单一的PD-L1表达水平作为疗效预测物的不可靠性。研究PD-L1在不同肿瘤的表达情况以及其与患者临床病理参数、预后的相关性，可为不同肿瘤的免疫治疗提供治疗及预后相关的临床参考和依据。二者与肿瘤的密切关系决定了其是当前肿瘤诊断和免疫治疗的热门分子靶标之一，其表达水平也是肿瘤预后的指标之一。到目前为止，通过手术切除肿瘤或组织活检等有创技术来检测PD-1和PD-L1的表达程度，由于用于检测抗体的品牌、检测技术、检测时的环境条件以及判定PD-L1阳性的cutoff值的不同均可导致检测结果的不一致。由于活检程序的相关风险和免疫组织化学(IHC)的缺陷，肿瘤异质性空间表达导致PD-L1表达的不敏感和肿瘤取样不完全等因素可能导致PD-L1检测出现假阳性。此外，获取样本时患者可处于基线或其他各线治疗状态，这也是造成检测结果差异的原因之一。这些因素不但影响了对PD-L1表达水平检测的一致性，同时也会影响其检测的可靠性和可重复性。除此之外，PD-L1表达水平的动态变化也是影响判定PD-L1确切的表达状态因素之一。因此，常规检测方法如免疫组织化学(IHC)方法、原位免疫杂交技术(FISH)等来预测抗PD-1/抗-PD-L1免疫治疗效果存在一定的片面性和局限性。随着癌症免疫疗法的不断发展，需要通过分子分型优化个体患者的治疗方法，并开发非侵入性分子影像工具，最终实现对临床免疫检查点封锁的动态监测。因此，快捷、简便、动态准确识别肿瘤细胞表面PD-L1蛋白表达水平的方法对肿瘤的诊断、免疫治疗及预后评估有着重要的意义。
目前，在肿瘤临床治疗过程中或治疗后，无创的、可重复性、高准确性地检测肿瘤PD-1和PD-L1的表达水平及活性尚难以实现，因而迫切需要特异性的影像检测技术来指导肿瘤治疗。分子影像在免疫治疗和个性化医学中发挥越来越重要的作用。其中分子探针的制备是分子影像的关键，只有高灵敏度和特异性的分子探针引入体内后可与细胞内特定的靶分子发生特异性结合并产生某种信号，体外通过特定的影像设备，如：正电子发射计算机断层扫描(PET-CT)、单光子发射计算机断层成像术(SPECT)、磁共振成像(MRI)以及荧光成像等进行采集成像，从而达到特异性诊断的才能实现高度特异性的诊断。
核医学分子示踪技术为肿瘤的早期诊断和预后提供了很好的手段，利用放射性分子探针可以无创地检测及评估肿瘤PD-L1表达水平，提供机体整体与远处转移时PD-1与PD-L1表达信息，避免了病理切片及治疗手段对机体PD-1与PD-L1表达水平的影响，为筛选PD-1/PD-L1免疫治疗有疗效响应的患者、优化肿瘤抗PD-1/抗PD-L1治疗方案、评估预后提供了新策略。
但由于抗体药物存在着制备繁琐、体外稳定性较差、分子较大、标记困难、穿透力弱，翻译后修饰且费用昂贵等原因使其进一步应用受到限制。因此，为了提高癌症诊断和治疗的特异性和准确性，弥补抗体的缺陷，迫切需要寻求针对新的肿瘤标志物设计小分子探针，以作为检测和治疗癌症的有效方法。因此，开发一种针对PD-1/PD-L1的小分子探针对PD-L1高表达的多种肿瘤的诊断将有突破性的重大意义。多肽类靶向小分子药物及诊断探针以成本低、分子量小、生物相容性好、穿透性强、无免疫原性、并有较快的血液清除速率、且制备简单等特点，在肿瘤靶向给药、癌症诊断等方面彰显出很强的优越性，甚至显示了替代抗体类诊疗试剂的趋势。因此，在癌症研究中针对肿瘤标志物合理设计并筛选对癌细胞的高特异亲和多肽，继而发展成为肿瘤的诊断试剂及治疗药物，是解决上述难题的有效途径。采用非侵入性方法可对整个肿瘤和相关转移灶同时成像，其可能与PD-L1表达状态中的原发性肿瘤不同，具有IHC无可比拟的优势，也不需要切除任何组织。由于靶向多肽其对PD-L1的高亲和力和特异性以及其增强的组织穿透，因此放射性标记的PD-L1靶向多肽可用作评估肿瘤PD-L1表达的有效分子探针而且更易进行临床转化。
发明内容
本发明的目的是提供一种PD-L1靶向双模态分子探针，该分子探针为PET和荧光双模态多肽探针。本发明还提供该分子探针的制备方法和应用。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种PD-L1靶向双模态分子探针，其为同时由吲哚菁绿ICG和正电子放射性核素68Ga标记的多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现，序列如SEQ ID NO.1所示的多肽能够特异性结合PD-L1，具有较高的亲和性，针对该多肽，在众多的标记物中，吲哚菁绿ICG和正电子放射性核素68Ga标记该多肽具有更高的稳定性和标记率，且不影响多肽的PD-L1靶向性，以吲哚菁绿ICG和正电子放射性核素68Ga标记该多肽得到的双模态分子探针的选择性和特异性更强，能够同时进行PET和近红外荧光成像技术检测，与其他标记的多肽探针相比，能够更好地检测PD-L1的表达。
优选地，所述ICG和68Ga分别通过双功能螯合剂DOTA与所述多肽连接。本发明选择双功能螯合剂DOTA作为分子探针的多肽与标记物之间的连接物，得到的双模态分子探针的稳定性和标记率显著提高，且不影响多肽的PD-L1靶向性，能够同时进行PET和近红外荧光成像技术检测，与其他标记的多肽探针相比，能够更好地检测PD-L1的表达。
其中，ICG通过巯基与DOTA偶连。
优选地，所述ICG通过双功能螯合剂DOTA与所述多肽连接得到的分子结构如式(I)所示：
在上述分子探针的基础上，本发明还提供所述分子探针的衍生物，所述衍生物为所述双模态分子探针的二价体或多价体，且能够特异性结合PD-L1；所述二价体或多价体为二个或多个所述双模态分子探针通过连接分子共价连接形成，或者，通过与多聚体混合、非共价连接形成。上述衍生物同样具有所述双模态分子探针的功能，能够同时进行PET和荧光成像检测PD-L1的表达。
优选地，所述的连接分子为2-S-(4-氨基苯)-1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。所述多聚体为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供所述PD-L1靶向双模态分子探针或其衍生物在制备药物中的应用。
以上所述的药物优选为用于PD-L1阳性肿瘤的预防、诊断或治疗的药物。
进一步优选地，所述药物用于PD-L1阳性肿瘤显像诊断或手术导航精准切除的检测。
本发明所述的PD-L1阳性肿瘤可为PD-L1蛋白过表达的所有肿瘤。
优选地，所述PD-L1阳性肿瘤为选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、食道癌和乳腺癌中的任意一种。
第三方面，本发明提供一种药物，其包括所述PD-L1靶向双模态分子探针或其衍生物。
可选地，所述药物还包括显像制剂。
优选地，所述药物中，所述双模态分子探针、其二价体或多价体与所述显像制剂相缀合或混合。
进一步优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物、磁共振造影剂、分子影像制剂中的任意一种。
可选地，所述药物还可包含载体(纳米材料、脂质体等高分子材料)。所述药物中，所述双模态分子探针、其二价体或多价体与所述载体相缀合或混合。
第四方面，本发明提供所述PD-L1靶向双模态分子探针的制备方法，该方法包括如下步骤：将序列如SEQ ID NO.1所示的多肽与DOTA连接，得到PDP线性多肽；将所述PDP线性多肽进行ICG标记后，再进行68Ga标记。
优选地，PD-L1靶向双模态分子探针的制备方法包括如下步骤：
(1)CK(DOTA)NTYYEDQG的制备
先通过Fmoc固相合成Fmoc-CK(Dde)NTYYEDQG，用2％水合肼将K的侧链保护基Dde脱掉暴露氨基后，将DOTA和Fmoc-CKNTYYEDQG多肽溶于DMF中，用DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；加入20％哌啶脱保护，室温反应10分钟；得到的产品经C18半制备柱HPLC分离纯化，得到PDP线性多肽CK(DOTA)NTYYEDQG；
(2)ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG的制备
将1mg CK(DOTA)NTYYEDQG多肽溶于1×PBS中，0.5mg ICG-MAL溶于500μL去离子水中，将二者混合调pH至7.4，室温振荡反应24h，冷冻干燥后进行质谱检测和HPLC纯化；
(3)ICG-CK(68Ga-DOTA)NTYYEDQG的制备
将ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG溶于去离子水中；用5mL 0.1mol/L高纯度盐酸溶液淋洗锗镓68Ge/68Ga发生器，收集其中放射性含量最高的1mL，加入醋酸钠将混合液pH值调至3.5-4.5；将30μg前体ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG加入至混合液中并充分混匀，加热至100℃保持10min；得到ICG-CK(68Ga-DOTA)NTYYEDQG。
本发明针对序列如SEQ ID NO.1所示的多肽以及标记物的结构和性质特点开发了相适应的制备方法，上述制备方法能够保证本发明的双模态分子探针的高效、高纯度合成，标记率可达99.00％，且制备方法简单易行，成本低廉。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种靶向PD-L1的新型双模态多肽探针，该探针包括PDP多肽以及放射性核素68Ga和吲哚菁绿ICG，其中，PDP多肽是将多肽NTYYEDQG与功能螯合剂DOTA连接；放射性核素68Ga通过双功能螯合剂DOTA标记多肽，ICG-MAL通过巯基与DOTA偶连。本发明所提供的放射性核素68Ga标记的PD-L1靶向多肽的标记率可达99.00％，稳定性好，具有PD-L1靶向特异性，选择性强、纯度高、分子量小、特异性强、无免疫原性、安全可靠，可用于检测肿瘤细胞中PD-L1的表达情况，适于作为基于PD-L1免疫治疗的预测和伴随诊断试剂，以实时监控免疫治疗的疗效及其相应的受益患者筛选，为多种肿瘤的早期诊断和免疫治疗中检查点的动态监测等提供重要的理论和临床参考依据。
基于单抗的分子探针存在明显不足(分子量大、易失活、组织渗透慢、血液清除慢等)，而本发明提供的基于多肽的分子探针在保持良好靶向性基础上，能克服上述不足，具有显著优势。此外，PET在临床中普及度最高，因此，本发明的分子探针有利于后期临床转化，可以全面显示肿瘤区域以及转移灶的PD-L1表达水平，可在整个治疗过程中监测PD-L1水平的动态变化，而无需重复有创的取组织做活检。PD-L1生物标志物的鉴定有利于医生制定个性化治疗方案以取得最优的治疗效果，具有较好的研究前景和临床指导意义。
本发明提供的分子探针的制备方法具有简单易行、成本低廉的优势，实用性强，且具有良好生物安全性和较好的应用价值。
附图说明
图1为本发明实施例1中CK(DOTA)NTYYEDQG的质谱图。
图2为本发明实施例1中CK(DOTA)NTYYEDQG的液相色谱图。
图3为本发明实施例2中ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG的质谱图。
图4为本发明实施例3中68Ga-DOTA-NTYYEDQG的液相色谱图。
图5为本发明实施例4中ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG的小鼠近红外荧光成像。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1 PD-L1靶向双模态分子探针的合成
1、实验仪器与材料
N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸(TFA)，二氯甲烷(DCM)，茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水乙醚，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，上述试剂和材料均从商业途径获得。
2、PD-L1靶向多肽的合成
采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽，具体方法为：将被保护的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解同时去除侧链保护基团，具体如下：
(1)称取200mg的Wang树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入200mg的Gly依次进行反应；待反应完成后，向管加入80mg的Asn与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，向每管分别加入90mg的Asp与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，树脂脱保护后加入60mg的Glu与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，向每管分别加入80mg的Tyr与等量的HBTU进行偶联；
(2)待偶联完毕后，向每管分别加入100mg的Tyr与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，向每管分别加入80mg的Thr与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，每Asn与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，Lys(Dde)与等量的HBTU进行偶联；待偶联完毕后，用2％水合肼将Lys的侧链保护基Dde脱掉暴露氨基后，加入四氮杂环十二烷四乙酸(DOTA)到DMF中，用DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；加入20％哌啶脱保护，室温反应10分钟，管中加入90mg的Cys与等量的HBTU进行偶联；经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，用95％TFA裂解得到的产品CK(DOTA)NTYYEDQG，粗品MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续试验。CK(DOTA)NTYYEDQG的质谱和液相色谱检测结果如图1和图2所示，表明该多肽探针的纯度和偶连物的正确性。
实施例2 ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG的制备
将1mg实施例1制备的CK(DOTA)NTYYEDQG多肽溶于1×PBS中，0.5mg ICG-MAL溶于500μL去离子水中，将二者混合调pH至7.4，室温振荡反应24h，冷冻干燥后进行质谱检测和HPLC纯化，得到ICG标记的CK(DOTA)NTYYEDQG。
ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG的结构式如式(I)所示，其质谱检测结果如图3所示，证明了多肽探针的纯度和偶连物的正确性
实施例3 ICG-CK(68Ga-DOTA)NTYYEDQG的制备
将实施例2制备的ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG溶于去离子水中；用5mL 0.1mol/L高纯度盐酸溶液淋洗锗镓(68Ge/68Ga)发生器(JSC Isotope)至EP管中，收集其中放射性含量最高的1mL，加入1.25mol/L醋酸钠100μL将混合液pH值调至3.5-4.5；将30μg前体加入至混合液中并充分混匀，加热至100℃保持10min；反应结束后将反应液冷却至室温，并加入无菌注射用水4mL后，通过无菌滤膜(0.22μm,13mm)过滤至无菌产品瓶中，得到ICG-CK(68Ga-DOTA)NTYYEDQG。
参考上述方法制备68Ga-DOTA-NTYYEDQG。
对68Ga-DOTA-NTYYEDQG的放射性进行检测：使用高效液相色谱(美国Waters公司，515型泵)；紫外检测器(486型，)，放射性检测器(美国EG&G BERTHOLD公司)，放射性活度计CRC-25PET(美国Capintec公司)，Waters色谱柱Nova-Pak C18(4.6×150mm,5μm)。上步中分析型HPLC方法如下：使用Waters HPLC系统配备Waters C18分析柱(4.6mm×250mm)，流动相A为乙腈(0.1％三氟乙酸)，流动相B为水(0.1％三氟乙酸)，流速为1mL/min，梯度洗脱条件：0min，乙腈/水(5/95,v/v)；5min，乙腈/水(5/95,v/v)；10min，乙腈/水(80/20,v/v)；15min，乙腈/水(100/0,v/v)；18min，乙腈/水(100/0,v/v)；20min，乙腈/水(5/95,v/v)，洗脱剂中含有0.1％TFA，流速为1mL/min。紫外检测波长为210nm，柱温20℃。放射性检测应用HPLC专用放射性探测器。
由图4的放射性HPLC图谱中可知，68Ga-DOTA-NTYYEDQG的保留时间(RetentionTime)为11.6min，放化纯度(purity)>99％，可以作为PET探针靶向表达PD-L1的肿瘤成像。
实施例4 ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG小动物荧光成像
将非小细胞肺癌细胞系NCI-H1975用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基培养，按1×106通过皮下注射入Balb/c裸鼠右后肢，待肿瘤长至50mm3。称取1mg ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG多肽溶于1mL的1×PBS中，尾静脉注射150μL的ICG-多肽半小时后，使用IVISSpectrum小动物活体光学三维成像系统进行信号采集。28h解剖后取主要器官进行体外荧光分布成像。
结果如图5所示，将上述制备得到的多肽显像制剂经尾静脉注射入PD-L1高表达的荷瘤小鼠体内，在1小时之内，肿瘤部位荧光信号逐渐增强，证明了本发明的分子探针具有PD-L1靶向性，可以实现微小肿瘤的高灵敏度活体成像。
综上所述，本发明的双模态多肽探针具有靶向表达PD-L1阳性肿瘤细胞的特性，因而在实际应用中，可以将本发明的靶向多肽探针用于肿瘤的靶向治疗和成像，实现免疫治疗反应标志物PD-L1的无创可视化检测。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 福建医科大学附属第一医院
<120> 一种PD-L1靶向双模态分子探针及其制备方法和应用
<130> KHP211112454.1
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asn Thr Tyr Tyr Glu Asp Gln Gly
1 5
Claims (10)
1.一种PD-L1靶向双模态分子探针，其特征在于，其为同时由吲哚菁绿ICG和正电子放射性核素68Ga标记的多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的PD-L1靶向双模态分子探针，其特征在于，所述ICG和68Ga分别通过双功能螯合剂DOTA与所述多肽连接。
3.根据权利要求1或2所述的PD-L1靶向双模态分子探针，其特征在于，所述ICG通过双功能螯合剂DOTA与所述多肽连接得到的分子结构如式(I)所示：
4.权利要求1～3任一项所述的PD-L1靶向双模态分子探针的衍生物，其特征在于，所述衍生物为所述双模态分子探针的二价体或多价体且能够特异性结合PD-L1；
所述二价体或多价体为二个或多个所述双模态分子探针通过连接分子共价连接形成，或者，通过与多聚体混合、非共价连接形成；
优选地，所述的连接分子为2-S-(4-氨基苯)-1,4,7三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亚胺(EDC)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；
和/或，所述多聚体为聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、环糊精、聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)、聚乳酸(PLA)、聚乳酸-乙醇胺(PLGA)中的任意一种或至少两种的组合。
5.权利要求1～3任一项所述的PD-L1靶向双模态分子探针或权利要求4所述的衍生物在制备药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为用于PD-L1阳性肿瘤的预防、诊断或治疗的药物；
优选地，所述PD-L1阳性肿瘤为选自黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾癌、前列腺癌、结直肠癌、胰腺癌、肝癌、胃癌、食道癌和乳腺癌中的任意一种。
7.一种药物，其特征在于，包括权利要求1～3任一项所述的PD-L1靶向双模态分子探针或权利要求4所述的衍生物。
8.根据权利要求7所述的药物，其特征在于，所述药物还包括显像制剂；
优选地，所述药物中，所述双模态分子探针、其二价体或多价体与所述显像制剂相缀合或混合；
更优选地，所述的显像制剂为放射性核素、放射性核素标记物、磁共振造影剂、分子影像制剂中的任意一种。
9.权利要求1～3任一项所述的PD-L1靶向双模态分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将序列如SEQ ID NO.1所示的多肽与DOTA连接，得到PDP线性多肽；将所述PDP线性多肽进行ICG标记后，再进行68Ga标记。
10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)CK(DOTA)NTYYEDQG的制备
先通过Fmoc固相合成Fmoc-CK(Dde)NTYYEDQG，用2％水合肼将Lys的侧链保护基Dde脱掉暴露氨基后得到Fmoc-CKNTYYEDQG，将DOTA和Fmoc-CKNTYYEDQG多肽溶于DMF中，用DIEA调节pH值至8.5-9.0，室温搅拌过夜；加入20％哌啶脱保护，室温反应10分钟；得到的产品经C18半制备柱HPLC分离纯化，得到PDP线性多肽CK(DOTA)NTYYEDQG；
(2)ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG的制备
将1mg CK(DOTA)NTYYEDQG多肽溶于1×PBS中，0.5mg ICG-MAL溶于500μL去离子水中，将二者混合调pH至7.4，室温振荡反应24h，冷冻干燥后进行质谱检测和HPLC纯化；
(3)ICG-CK(68Ga-DOTA)NTYYEDQG的制备
将ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG溶于去离子水中；用5mL 0.1mol/L高纯度盐酸溶液淋洗锗镓68Ge/68Ga发生器，收集其中放射性含量最高的1mL，加入醋酸钠将混合液pH值调至3.5-4.5；将30μg前体ICG-CK(DOTA)NTYYEDQG加入至所述混合液中并充分混匀，加热至100℃保持10min，得到ICG-CK(68Ga-DOTA)NTYYEDQG。
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