CN110845572A - 肿瘤靶向的grp类似物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了肿瘤靶向的GRP类似物及其应用。GRP类似物选自以下任意一条：线性多肽Gln‑5‑Htp‑β‑Ala‑Nva‑Gly‑His‑NH₂，环状多肽Lys‑Cys‑Gln‑5‑Htp‑β‑Ala‑Nva‑Gly‑His‑CysHis‑Gly‑Nva‑β‑Ala‑5‑Htp‑Gln‑NH₂，等。本发明高亲和多肽能和多种肿瘤细胞特异性结合，利用这个高亲和力特性可用于恶性肿瘤的光学成像和核医学显像。这些高亲和力多肽偶联荧光染料可作为肿瘤特异性靶向分子探针，预期能达到对肿瘤边界精准定位的效果，可为术前和术中影像导航带来实时性，具有提高手术精确度的优点。

Description

肿瘤靶向的GRP类似物及其应用

技术领域

本发明属于医学生物工程领域，涉及肿瘤靶向的GRP类似物及其应用。

背景技术

肿瘤己经成为威胁人类健康和生命的罪魁祸首，因此，肿瘤的早期诊断以及肿瘤的有效治疗显得尤为重要并且迫切。对于肿瘤，常规影像诊断技术主要为B超、CT和MRI，这些影像诊断技术是通过显示组织的功能变化来达到诊断的结果，有较好的应用价值，但在鉴别诊断、全身分期和早期疗效评价上仍存在一定的不足。不可否认，筛选和优化靶向肿瘤的多肽是一种新的途径，可以为肿瘤的诊断、分期以及手术指导开发新型的分子显像药物，可以发现更微小病灶，达到早期诊断的目的。

花菁类染料具有分子量小、毒性低、波长可调范围广、以及摩尔消光系数大等优点，使其广泛地用于荧光标记领域。通过对花菁类染料结构的修饰，使其连接上具有活性的反应基团，然后与特异性靶分子如抗体、蛋白质、短肽、小分子等的氨基或羧基发生反应形成稳定的共价键，形成具有特异性靶向分子探针进行荧光分子活体成像是近红外荧光染料的一个重要用途。单光子发射计算机断层/计算机断层扫描(Single-Photon emissiontomography/computerized tomography，SPECT/CT)是近20年来发展起来并在临床上推广的一种新型的核医学显像技术，主要是利用短半衰期放射性核素来标记具有特异性靶向的配体进行示踪显像，可显示活体内物质代谢、细胞增殖、受体分布等信息，用于疾病的诊断和人体生命活动的研究。所以，特异性靶向的配体是荧光成像以及放射性核素显像的关键。

近几年来，科研工作者已认识到某些癌细胞包含胃泌素释放肽(GRP)受体(GRP-R)，已完成许多有关与GRP受体家族结合的GRP和GRP类似物的调查和研究。但由于天然的GRP稳定性差，无法用于制备诊断试剂或治疗药物，因此，基于GRP的肿瘤靶向性开发了一系列GRP类似物用于肿瘤的诊断和治疗。CN102167728A公开了具有式M-N-O-P-G的用于诊断成像或治疗的新的和改进的化合物,其中M为光标记或金属螯合剂(与金属放射性核素络合或不络合的形式),N-O-P为连接基,G为GRP受体靶向肽。还提供用该发明的化合物对患者成像和/或对患者提供放射治疗或光治疗的方法。还提供由所述化合物制备诊断显像剂的方法和试剂盒。但是其改造主要集中的金属螯合剂和连接基团，且GRP受体靶向肽的序列与本发明也不相同。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一类新型的肿瘤靶向多肽，这类多肽能特异性的靶向肿瘤。

本发明的另一目的是提供所述肿瘤靶向多肽的应用。

本发明的又一目的是提供一种肿瘤诊断试剂。

肿瘤靶向的GRP类似物，选自以下任一条多肽：

YQG-1：Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-NH₂；

YQG-4：D-Phe-Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-NH₂，其中，D-Phe表示D型Phe；

YQG-2：Lys-Cys-Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-Cys，该多肽为二硫键环状多肽化合物，二硫键存在于2-9氨基酸残基之间；

YQG-3：His-Gly-Nva-β-Ala-5-Htp-Gln-NH₂；

YQG-5：Lys-Cys-D-Phe-Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-Cys,该多肽为二硫键环状多肽化合物，二硫键存在于2-10氨基酸残基之间；

YQG-6：His-Gly-Nva-β-Ala-5-Htp-Gln-D-Phe-NH₂。

其中，5-Htp为5-羟色氨酸，β-Ala为β-丙氨酸，Nva为正缬氨酸。

本发明所述的肿瘤靶向的GRP类似物在制备肿瘤诊断试剂中的应用，优选在制备肿瘤诊断显像剂中的应用，进一步优选在制备用于肿瘤边界的精准定位和术中影像导航的肿瘤诊断显像剂以及放射性核素显像中的应用。本发明所述的多肽化合物可特异性靶向至肿瘤部位，并且在肿瘤部位有很好的摄取和滞留，具有较高的靶/非靶比值，适合用作荧光肿瘤显像剂以及放射性核素显像剂，并可用于制备肿瘤术中影像导航及肿瘤边界精准定位的光学显像药物。

肿瘤诊断试剂，具备以下通式：M-L-G，

其中，M表示光标记或金属螯合剂，所述的金属螯合剂能够与放射性核素络合；

L为连接基团；

G为本发明所述的任意一个肿瘤靶向的GRP类似物YQG-X，(X＝1～6中的任意整数)。

所述的药物连接剂L优选自如结构式(II)所示6-氨基己酸(Aca)、PEG₄、PEG₆、G₆；

作为本发明的一种优选，所述的光标记选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子。

作为本发明的进一步优选，所述的光标记选自近红外荧光染料MPA、IRDye800、Cy7.5、Cy5.5。

当M为光标记时，此时的：M-L-G为一种具有优良显像性能的荧光分子影像探针，其结构中含有用于靶向肿瘤的本发明多肽YQG-X和用于光学成像的光标记以及起到增加靶向多肽与光标记之间的距离并调节体内药代动力学特性的连接剂L。

本发明还提供了制备所述多肽荧光分子影像探针的方法，包括：

1)近红外荧光染料MPA的合成

将冰醋酸、对肼基苯磺酸、甲基异丙基酮和醋酸钠混合反应，纯化后得产物2，2，3-三甲基[3H]-吲哚-5-磺酸；再将邻二氯苯加入到2，2，3-三甲基[3H]-吲哚-5-磺酸与1，3-丙磺酸内脂的混合物中，制得2，2，3-三甲基-5-磺酸-1-(3-磺酸-丙基)-[3H]-吲哚；再将该产物与N-[(3-(anilinomethylene)-2-chloro-1-cyclohexen-1-yl)methylene]-anilinemonohydrochloride反应得到绿色碳菁染料，最后将碳菁染料与巯基丙酸及三乙胺反应，制备液相分离纯化得水溶性近红外染料MPA。

2)MPA-L-YQG-X(X＝1-6)的合成

将分离纯化得到的近红外染料MPA与固相合成的L-YQG-X(X＝1-6)多肽溶于二甲基亚砜中，加入适量的N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温反应过夜，反应完成后经制备液相纯化分离得到目标荧光化合物。

作为本发明的一种优选，所述的金属螯合剂选自联肼尼克酰胺(HYNIC)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、7-[(4-羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、巯基乙酰三甘氨酸(MAG3)、二乙基三胺五乙酸(DTPA)或它们的组合修饰。所述的金属螯合剂能够与放射性核素结合。此时，M-L-G为一种放射性核素探针。

作为本发明的进一步优选，所述的金属螯合剂选自式(III)所示的物质：

或者将式(IV)中的双功能螯合剂HYNIC替换为DOTA，NOTA或DTPA中的任一种，放射性核素^99mTc替换为⁶⁸Ga，⁶⁴Cu，⁶⁷Ga，⁹⁰Y，¹¹¹In或¹⁷⁷Lu。

作为本发明的进一步优选，所述的肿瘤诊断试剂选自以下任意一种结构的物质：

，其结构中含有用于靶向肿瘤的多肽YQG-X和用于放射性标记的双功能螯合6-肼基吡啶-3-甲酸(HYNIC)或金属配体DOTA或MAG3，谷氨酸两个羧基连接两分子连接剂L的支架(L₂E)，L选自Aca、PEG₄、PEG₆、G₆，放射性核素M选自⁶⁸Ga，⁶⁴Cu，⁶⁷Ga，⁹⁰Y，或¹⁷⁷Lu。

其中YQG-X为本发明所述的任意一条肿瘤靶向的GRP类似物。

本发明还提供了制备所述放射性核素探针的方法，包括：

1)双功能螯合剂HYNIC-NHS的合成

将6-氯烟酸和80％水合肼加入到乙醇中，加热回流反应，反应完成后减压旋蒸溶剂，得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调PH＝5.5左右，析出固体，抽滤烘干得到黄色固体，产品经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为6-联肼烟酸。得到的6-联肼烟酸和对氨基苯甲醛加入到二甲基亚砜(DMSO)中，加热反应5-6小时，反应完成后加入到水中析出，抽滤得固体，此固体烘干后与1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)以及N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起加入到DMSO中室温反应，反应完成后加入水中析出固体，此固体通过硅胶柱纯化后经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为目标产物。

2)支架(L₂E)的合成

将叔丁氧羰基(t-Butyloxy carbony)保护的谷氨酸用2摩尔当量的二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在有机溶剂四氢呋喃(THF)室温搅拌过夜进行双羧基活化，反应完成后抽滤，滤液用THF进行洗涤，洗涤完成后加入到适量的二甲基亚砜(DMSO)中溶解，然后加入2摩尔当量的Aca或PEG_4或PEG_6或G₆，最后加入3摩尔当量的碱DIPEA室温反应2小时，反应2小时后加入三氟乙酸(TEA)进行Boc保护基的脱除，反应完成后通过制备液相进行分离纯化，通过质谱验证目标物L₂E。

3)中间体L₂E-HYNIC的合成

将制备得到的支架L₂E溶于DMSO中，然后加入相同摩尔量的HYNIC，再加入3倍摩尔量的DIPEA，室温反应2小时，反应完成后通过制备液相分离纯化并通过质谱对目标化合物进行确证。

4)(YQG-X)₂-L₂E-HYNIC的合成

将纯化的中间体L₂E-HYNIC溶于DMSO中，然后加入2摩尔量的EDCI和2摩尔量的NHS，室温反应5小时，用分析型高效液相检测反应进程，反应完成后加入2摩尔量的靶向肽YQG-X，然后再加入4摩尔量的DIPEA，室温反应3小时，反应完成后通过制备液相进行分离纯化并通过质谱确证。

5)放射性探针(YQG-X)₂-L₂E-HYNIC-^99mTc的合成

分别配制浓度为100.0mg/mL的TPPTS(三苯基磷三间磺酸钠)溶液，浓度为130.0mg/mL的Tricine(三甲基甘氨酸)，浓度为102.4mg/mL丁二酸-丁二酸钠缓冲液(其中丁二酸77.0mg，丁二酸钠25.4mg)，分别取10.0uL TPPTS溶液，10.0uL Tricine溶液，10.0uL丁二酸-丁二酸钠缓冲液分别和10.0uL(1.0mg/mL)所述(YQG-X)₂-L₂E-HYNIC混合于西林瓶中，然后加入10mCi Na ^99mTcO4于100℃金属浴加热20分钟，待反应结束后冷却至室温，分别制成多肽放射性药物，产品经Agilent ZORBAX SB-Aq分析柱分析鉴定。

本发明所述的新型多肽及以此系列多肽构建的荧光以及放射性核素探针与现有技术相比的有益效果为：

1、本发明发现的YQG-X系列多肽是低分子量多肽，合成成本低廉，并且此系列短肽有三个氨基酸是经修饰的非天然氨基酸，非天然氨基酸的引入可极大地提高此系列多肽在活体内的稳定性，不易在体内被降解，靶向活性不易被破坏，有更强的潜力靶向至靶部位，体内外实验结果表明了此系列探针在体内外具有优异的稳定性以及靶向性，稳定性的增强会促进此系列的影像探针在肿瘤部位的浓聚和滞留，进而达到更好的肿瘤显像效果，使得更加有利于在临床上推广应用。

2、YQG-X系列多肽经体内光学和放射性核素显像结果证实对多种肿瘤具有优异的显像效果，包括前列腺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌、肺癌以及肝癌，能特异性靶向肿瘤部位的性质将有可能实现对恶性肿瘤的核医学诊断、治疗以及光学成像指导外科医生进行手术导航，达到对病灶的精准切除。

3、本发明中使用了稳定性以及水溶性更理想的近红外荧光染料MPA作为光学显像基团，改善了药物在体内的药代动力学。

4、本发明中引入了多个水溶性的PEG₄或PEG₆分子，以进一步改善药代动力学特性，特别是从非肿瘤组织的清除动力学。

5、本发明中使用HYNIC作为双功能螯合剂，同时使用Tricine和TPPTS作为协同配体从而使“^99mTc-HYNIC核”具有更好的体内外稳定性。

以下结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为实施例1制备的近红外染料MPA的结构(上)，HPLC分析图(中)以及MS(下)。

图2为实施例2制备的多肽YQG-1质谱图。

图3为实施例3制备的荧光靶向化合物MPA-Aca-YQG-1的结构(上)，HPLC分析图(中)及MS(下)。

图4实施例4制备的放射性药物(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc的结构表征

A为实施例4制备的放射性药物(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc的结构图。

B为实施例4制备的放射性药物(YQG-1)2-PEG4-E-HYNIC-99mTc的放射性HPLC图。

图5为实施例5制备的化合物MPA-Aca-YQG-1在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的光学成像图。

图6为实施例6制备的化合物Aca-YQG-1封闭后MPA-Aca-YQG-1在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的光学成像图

图7为实施例7制备的化合物MPA-PEG₄-YQG-2在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的光学成像图。

图7为实施例8制备的化合物MPA-PEG₆-YQG-3在乳腺癌T47d荷瘤鼠体内的光学成像图。

图9为实施例9制备的化合物(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像图。

图10为实施例10制备的化合物MPA-PEG₆-YQG-4在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的光学成像图。

图11为实施例11制备的化合物(YQG-5)₂-PEG₆-E-HYNIC-^99mTc在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的光学成像图。

图12为实施例12制备的化合物(YQG-6)₂-Aca₂-E-HYNIC-^99mTc在结直肠癌SW480荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例和应用例来进一步说明本发明：其中合成步骤中所使用的化学物质均为现有物质或市售商品。

实施例1近红外荧光染料MPA的合成

合成步骤参考我们课题组前期申请的一篇发明专利，授权专利号：CN101440282，主要合成步骤如下：

1.取30mL冰醋酸加入到对肼基苯磺酸(6g)、甲基异丙基酮(7mL)和醋酸钠(2g)的混合物中。将获得的棕色的悬浮液加热至沸，并回流16小时。随后用烧结玻璃过滤器趁热过滤，去掉未反应的悬浮物。待滤液冷至室温，用二氯甲烷析出产品，产品为棕色(2，2，3-三甲基[3H]-吲哚-5-磺酸)。

2.取50mL邻二氯苯加入到2，2，3-三甲基[3H]-吲哚-5-磺酸(15g)和1，3-丙磺酸内脂(4mL)。将混合物加热至130℃，并保持15小时。制得的固体用二氯甲烷研磨，最后制得产品2，2，3-三甲基-5-磺酸-1-(3-磺酸-丙基)-[3H]-吲哚。

3.取20mL无水乙醇加入到2，2，3-三甲基-5-磺酸-1-(3-磺酸-丙基)-[3H]-吲哚(500mg),N-[(3-(anilinomethylene)-2-chloro-1-cyclohexen-1-yl)methylene]anilinemonohydrochloride(100mg)与乙酸钠(100mg)，并加热回流2小时。待反应液冷至室温，利用悬蒸仪将溶剂去除。最后，利用硅胶柱分离获得纯的绿色碳菁染料。

4.取200mg上面制得的碳菁染料溶于10mL DMF中，再加入100μL巯基丙酸，反应15小时。用二氯甲烷析出粗产品，最后经制备液相分离得纯的水溶性近红外染料MPA。得到产品经分析型HPLC和ESI-MS质谱分析确认为预期产物MPA，参见图1。

实施例2YQG-1的合成

1)树脂溶胀

称取Rink Amide MBHA树脂，放入反应柱，加入适量的二氯甲烷(DCM)，微微鼓吹氮气10-30分钟，使树脂充分膨胀开来。抽掉DCM溶液，用DMF洗涤3遍，抽干。

2)脱除Fmoc

反应柱中加入20％的六氢吡啶DMF溶液，去保护5分钟一次，8分钟一次。反应结束后用DMF洗涤6遍。

3)偶联

准确称取投料树脂摩尔数3倍的Fmoc-His(trt)-OH与O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，完全溶于DMF中，加入N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)使羧基活化，然后将溶液加入反应柱进行反应，1h后检测，检测结构呈阳性即可。依次按照顺序从C端向N端偶联脱除Fmoc，直至偶联完最后一个氨基酸Fmoc-Gln-OH，然后脱除Fmoc后，再将目标树脂肽收缩，称重。

4)裂解

配制87.5％TFA+5％苯甲硫醚+2.5％乙二硫醇+2.5％苯酚+2.5％水的裂解液，在低温条件下，将裂解液缓慢加入树脂肽中，切割液体积按照粗肽树脂重量的7-8倍，缓慢搅拌2h后，抽滤得液体，加入冰乙醚搅拌，然后离心得固体，用乙醚洗涤三遍，抽干称重并且测定质荷比，确定分子量。

5)纯化分离

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得目的肽浓缩液，然后冻干得目的多肽，经LC-MS鉴定产物：[M+2H]²⁺＝356.90，[M+H]⁺＝712.35，计算值(m/z)为711.77(C₃₂H₄₅N₁₁O₈)。质谱图参见图2.

YQG-2、YQG-3、YQG-6均可参考上述方法制备。

实施例3制备荧光靶向化合物MPA-Aca-YQG-1

称取固相合成的Aca-YQG-1化合物10mg，制备的染料MPA纯品12.38mg加入到200μL二甲基亚砜(DMSO)中，然后加入2.3mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)偶联剂以及3.82mg N-羟基丁二酰亚胺(NHS)，混匀后再加入4.1mg N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，室温反应过夜，反应完成后用制备液相进行分离纯化，制备液相条件如下所示：使用了Agilent 1220Infinity II系列HPLC系统配备Agilent ZORBAX SB-C18半制备柱(9.4×250mm，5um)，梯度淋洗60分钟，流速2mL/min，其中流动相A为超纯水(0.01％TFA)，B为乙腈(0.01％TFA)。淋洗梯度设定为：0-5分钟时95％A和5％B，15分钟时80％A和20％B，45分钟时50％A和50％B，60分钟时5％A和95％B。最后制得的绿色产物经分析型HPLC和ESI-MS质谱分析确认为预期产物MPA-Aca-YQG-1，参见图3。在上述制备过程中，以固相合成的L-YQG-X多肽替代步骤中使用的Aca-YQG-1多肽，即得到本发明其他多种具有肿瘤靶向光学成像功能的多肽化合物。

实施例4制备的靶向放射性药物(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc

制备的靶向放射性药物(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc的合成步骤如下：

1)双功能螯合剂HYNIC-NHS的合成

将1g 6-氯烟酸和2.0mL 80％水合肼加入到10mL乙醇中，加热回流反应4小时，反应完成后减压旋蒸溶剂，得到的粘稠物加入到蒸馏水中，调PH＝5.5左右，析出固体，抽滤烘干得到黄色固体0.86g，产品经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为6-联肼烟酸。得到的0.86g 6-联肼烟酸和0.61g对氨基苯甲醛加入到3.0mL二甲基亚砜(DMSO)中，加热反应5-6小时，反应完成后加入到水中析出，抽滤，烘干得固体1.2g。此烘干的1.2g固体后与2.5g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)以及1.5g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)一起加入到DMSO中室温反应，反应完成后加入水中析出固体，此固体通过硅胶柱纯化后干燥，称重1.3g，经ESI-MS质谱和核磁氢谱确定为目标产物。

2)支架(PEG₄)₂E的合成

将5.0g叔丁氧羰基(t-Butyloxy carbony)保护的谷氨酸，8.3g二环己基碳二亚胺(DCC)以及4.6g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到100mL有机溶剂四氢呋喃(THF)中，室温搅拌过夜进行双羧基活化，反应完成后抽滤，滤液用THF进行洗涤，洗涤完成后不进一步纯化，直接加入到50mL的二甲基亚砜(DMSO)中溶解，然后加入10g PEG₄，最后加入14.6g DIPEA室温反应2小时，检测反应完成后，往反应中加入3.0mL三氟乙酸(TEA)进行Boc保护基的脱除，反应完成后通过制备液相进行分离纯化，最后烘干得到稠状固体7.8g，通过质谱验证为预期目标物(PEG₄)₂E

6)中间体(PEG₄)₂E-HYNIC的合成

将制备得到的0.5g支架(PEG₄)₂E溶于DMSO中，然后加入0.31g HYNIC-NHS，再加入0.32g DIPEA，室温反应2小时，反应完成后通过制备液相分离纯化并冷冻干燥，得到黄的固体0.64g，通过质谱验证为预期目标化合物。

7)(YQG-1)₂-(PEG₄)₂E-HYNIC的合成

将纯化的5mg中间体(PEG₄)₂E-HYNIC溶于0.3mL DMSO中，然后加入2.1mg EDCI和1.25mg NHS，室温反应5小时，用分析型高效液相检测反应进程，反应完成后加入靶向肽7.8mg YQG-1，然后再加5.6mg DIPEA，室温反应3小时，反应完成后通过制备液相进行分离纯化，最后得到黄色固体6.5mg，通过质谱确证为目标产物。

8)放射性探针(YQG-1)₂-(PEG₄)₂E-HYNIC-^99mTc的合成

分别配制浓度为100.0mg/mL的TPPTS(三苯基磷三间磺酸钠)溶液，浓度为130.0mg/mL的Tricine(三甲基甘氨酸)，浓度为102.4mg/mL丁二酸-丁二酸钠缓冲液(其中丁二酸77.0mg，丁二酸钠25.4mg)，分别取10.0uL TPPTS溶液，10.0uL Tricine溶液，10.0uL丁二酸-丁二酸钠缓冲液分别和10.0uL(1.0mg/mL)所述(YQG-1)₂-(PEG₄)₂E-HYNIC混合于西林瓶中，然后加入10mCi Na ^99mTcO4于100℃金属浴加热20分钟，待反应结束后冷却至室温，制得多肽放射性药物(YQG-1)₂-(PEG₄)₂E-HYNIC-^99mTc，产品经Agilent ZORBAX SB-Aq分析柱分析鉴定，放射性液相分析如图4-2所示。使用的HPLC法为配备了放射性在线检测器(Flow-RAM)和Agilent ZORBAX SB-Aq分析柱(4.6×250mm，5um)的Agilent 1220InfinityII系列HPLC系统。梯度淋洗45分钟，流速1mL/min，其中流动相A为超纯水(0.01％TFA)，B为乙腈(0.01％TFA)。淋洗梯度设定为：0-5分钟时95％A和5％B，15分钟时70％A和30％B，20分钟时65％A和35％B，25分钟时45％A和55％B，45分钟时5％A和95％B。

实施例5化合物MPA-Aca-YQG-1在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的光学成像

按实施例3制备好化合物MPA-Aca-YQG-1并配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠(体重约22克)尾静脉，并于给药后1h、2h、4h、8h、10h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。显像结果图如图5所示，化合物MPA-Aca-YQG-1在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从2h的成像图中可以看出探针已经在肿瘤中有明显摄取，直至10h探针依然在肿瘤中有滞留，其中，4h时探针在肿瘤部位富集最多，而在其它背景器官的摄取清除较快，从膀胱的信号可以推断出此探针主要通过肾脏代谢。

实施例6化合物Aca-YQG-1封闭后MPA-Aca-YQG-1在胰腺癌CFPAC-1荷瘤鼠体内的光学成像

取未用荧光标记的Aca-YQG-1 500微克溶于0.1mL的生理盐水，分别注射于3只胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠中，1h后把探针化合物MPA-Aca-YQG-1配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于提前注射了500微克Aca-YQG-1的3只胰腺癌CFPAC-1荷瘤裸鼠尾静脉中，并于给药后1h、2h、4h、8h、10h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。显像结果图如图6所示，荧光探针MPA-Aca-YQG-1在3只荷瘤裸鼠中的成像结果基本一致，从各个时间点的光学影像图可明显看出，提前用未标记荧光染料的化合物Aca-YQG-1封闭以后，肿瘤部位未见明显的荧光信号，可说明探针MPA-Aca-YQG-1在体内与肿瘤部位的结合是特异性结合。

实施例7制备YQG-2

1)树脂溶胀

称取Fmoc-Cys(trt)-2chlorotrityl Resin树脂，放入反应柱，加入适量的二氯甲烷(DCM)，微微鼓吹氮气10-30分钟，使树脂充分膨胀开来。抽掉DCM溶液，用DMF洗涤3遍，抽干。

2)脱除Fmoc

反应柱中加入20％的六氢吡啶DMF溶液，去保护5分钟一次，8分钟一次。反应结束后用DMF洗涤6遍。

3)偶联

准确称取投料树脂摩尔数3倍的Fmoc-His(trt)-OH与O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)，完全溶于DMF中，加入DIEA使羧基活化，然后将溶液加入反应柱进行反应，1h后检测，检测结构呈阳性即可。依次按照顺序从C端向N端偶联脱除Fmoc，直至偶联完最后一个氨基酸Fmoc-Lys(trt)-OH，然后脱除Fmoc后，再将目标树脂肽收缩，称重。

4)裂解

配制87.5％TFA+5％苯甲硫醚+2.5％乙二硫醇+2.5％苯酚+2.5％水的裂解液，在低温条件下，将裂解液缓慢加入树脂肽中，切割液体积按照粗肽树脂重量的7-8倍，缓慢搅拌2h后，抽滤得液体，加入冰乙醚搅拌，然后离心得固体，用乙醚洗涤三遍，抽干称重并且测定质荷比，确定分子量为。

5)二硫键成环

将样品溶于纯水中进行搅拌，调节PH，使多肽水溶液呈弱碱性，加入双氧水，反应0.5h后进行检测，检测结果呈阳性即可，调节多肽溶液PH，使之呈酸性。

6)纯化分离

采用高效液相色谱法进行纯化，纯化用色谱填料为10μm的反相C18，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取环化好后的溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得目的肽浓缩液，然后冻干得目的多肽。经LC-MS鉴定产物：[M+2H]²⁺＝523.24，[M+H]⁺＝1046.12，计算值(m/z)为1045.21(C₄₄H₆₄N₁₄O₁₂S₂)。

实施例8制备的化合物MPA-PEG₄-YQG-2在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的光学成像

按实施例2相同方法制备好化合物MPA-PEG₄-YQG-2并配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠(体重约23克)尾静脉，并于给药后1h、2h、4h、8h、10h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。2h显像结果图如图7所示，探针MPA-PEG₄-YQG-2在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向前列腺PC-3肿瘤细胞，并且主要通过肾脏代谢出体外。

实施例8制备的化合物MPA-PEG₆-YQG-3在乳腺癌T47d荷瘤鼠体内的光学成像

按实施例1相同方法制备YQG-3，按实施例2相同方法制备好化合物MPA-PEG₆-YQG-3并配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠(体重约23克)尾静脉，并于给药后1h、2h、4h、8h、10h和12h进行光学信号采集。观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。2h显像结果图如图8所示，探针MPA-PEG₆-YQG-3在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向乳腺癌T47d肿瘤细胞，并且主要通过肾脏代谢出体外。

实施例10制备的化合物(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像

按实施例4方法制备好化合物(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc并配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠尾静脉，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h进行SPECT信号采集。观察放射性核素探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。1h显像结果图如图9所示，探针(YQG-1)₂-PEG₄-E-HYNIC-^99mTc在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向前列腺癌PC-3肿瘤细胞，并且主要通过肾脏代谢出体外。

实施例11制备的化合物MPA-PEG₆-YQG-4在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的光学成像

按实施例3相同方法制备好化合物MPA-PEG₆-YQG-4并配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠尾静脉，并于给药后1h、2h、4h、8h、10h和12h进行光学信号采集，观察探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。2h显像结果图如图10所示，探针MPA-PEG₆-YQG-4在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向前列腺癌PC-3肿瘤细胞，并且主要通过肾脏代谢出体外。

实施例12制备的化合物(YQG-5)₂-PEG₆-E-HYNIC-^99mTc在前列腺癌PC-3荷瘤鼠体内的光学成像

按实施例4方法制备好化合物(YQG-5)₂-PEG₆-E-HYNIC-^99mTc并配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只前列腺癌PC-3荷瘤裸鼠尾静脉，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h进行SPECT信号采集。观察放射性核素探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。1h显像结果图如图11所示，探针(YQG-5)₂-PEG₆-E-HYNIC-^99mTc在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向前列腺癌PC-3肿瘤细胞，并且主要通过肾脏代谢出体外。

实施例13制备的化合物(YQG-6)₂-Aca₂-E-HYNIC-^99mTc在结直肠癌SW480荷瘤鼠体内的SPECT-CT成像

按实施例4方法制备好化合物(YQG-6)₂-Aca₂-E-HYNIC-^99mTc并配制成生理盐水溶液，取0.1mL(约10nmol)分别注射于3只结直肠癌SW480荷瘤裸鼠尾静脉，并于给药后0.5h、1h、2h、3h、4h进行SPECT信号采集。观察放射性核素探针在小鼠体内的分布以及在肿瘤区域的富集。1h显像结果图如图12所示，探针(YQG-6)₂-Aca₂-E-HYNIC-^99mTc在肿瘤部位有明显的摄取，说明此探针可靶向结直肠癌SW480肿瘤细胞，并且主要通过肾脏代谢出体外。

本发明高亲和多肽能和多种肿瘤细胞特异性结合，利用这个高亲和力特性可用于恶性肿瘤的光学成像和核医学显像。这些高亲和力多肽偶联荧光染料可作为肿瘤特异性靶向分子探针，预期能达到对肿瘤边界精准定位的效果，可为术前和术中影像导航带来实时性，具有提高手术精确度的优点。此系列多肽还可偶联放射性核素在体实时检测恶性肿瘤，以达到疾病诊断或者治疗的目的。

Claims (10)

1.肿瘤靶向的GRP类似物，其特征在于选自以下任一条多肽：

YQG-1：Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-NH₂；

YQG-4：D-Phe-Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-NH₂，

YQG-2：Lys-Cys-Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-Cys，其中2-9，二硫键；

YQG-3：His-Gly-Nva-β-Ala-5-Htp-Gln-NH₂；

YQG-5：Lys-Cys-D-Phe-Gln-5-Htp-β-Ala-Nva-Gly-His-Cys,其中2-10，二硫键；

YQG-6：His-Gly-Nva-β-Ala-5-Htp-Gln-D-Phe-NH₂；

其中：D-Phe表示D型Phe,5-Htp为5-羟色氨酸，β-Ala为β-丙氨酸，Nva为正缬氨酸。

2.权利要求1所述的肿瘤靶向的GRP类似物在制备肿瘤诊断试剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于权利要求1所述的肿瘤靶向的GRP类似物在制备肿瘤诊断显像剂中的应用；优选在制备肿瘤边界的精准定位和术中影像导航显像试剂或制备放射性核素显像试剂中的应用。

4.肿瘤诊断试剂，其特征在于具备以下通式：

M-L-G，

其中，M表示光标记或金属螯合剂，所述的金属螯合剂能够与放射性核素络合；L为连接基团；

G为权利要求1所述的任意一个肿瘤靶向的GRP类似物。

5.根据权利要求4所述的肿瘤诊断试剂，其特征在于所述的光标记选自有机发色团、有机荧光团、光吸收化合物、光反射化合物、光散射化合物和生物发光分子。

6.根据权利要求5所述的肿瘤诊断试剂，其特征在于所述的光标记选自近红外荧光染料MPA、IRDye800、Cy7.5、Cy5.5。

7.根据权利要求4所述的肿瘤诊断试剂，其特征在于所述的金属螯合剂选自联肼尼克酰胺、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸、7-[(4-羟基丙基)亚甲基]-1,4,7-三氮杂化壬烷-1,4-二乙酸、1,4,7,10-四氮杂环四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸、巯基乙酰三甘氨酸、二乙基三胺五乙酸或它们的组合修饰。

8.根据权利要求4所述的肿瘤诊断试剂，其特征在于所述的金属螯合剂选自式(III)所示的物质：

或者将式(III)中的双功能螯合剂HYNIC替换为DOTA，NOTA或DTPA中的任一种，放射性核素^99mTc替换为⁶⁸Ga，⁶⁴Cu，⁶⁷Ga，⁹⁰Y，¹¹¹In或¹⁷⁷Lu。

9.根据权利要求4所述的肿瘤诊断试剂，其特征在于所述的L选自6-氨基己酸、PEG₄、PEG₆或G₆中的任意一种或多种。

10.根据权利要求4～5中任一项所述的肿瘤诊断试剂，其特征在于选自以下任意一种结构的物质：

其中YQG-X为权利要求1中所述的任意一条肿瘤靶向的GRP类似物。

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