CN105899226A

CN105899226A - 半胱氨酸工程化iii型纤连蛋白域结合分子

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Publication number: CN105899226A
Application number: CN201480056568.3A
Authority: CN
Inventors: S.戈德伯格; S.贾科布斯; T.林; K.奥内尔
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2013-10-14
Filing date: 2014-10-13
Publication date: 2016-08-24
Anticipated expiration: 2034-10-13
Also published as: KR20220136463A; KR102478402B1; US20150104808A1; MX2019012876A; IL244623A0; EP3057608A4; US20190263915A1; JP2017500003A; JP2020011969A; EA035745B1; WO2015057545A2; AU2019253863B2; CN105899226B; JP6585040B2; US10196446B2; AU2019253863A1; WO2015057545A3; EA201690773A1; IL244623B; BR112016008125A2

Abstract

本发明公开了含经半胱氨酸改造的单特异性和双特异性EGFR和/或c‑Met FN3结构域的分子，所述分子包含一个或多个游离半胱氨酸氨基酸，所述分子通过以下来制备：诱变亲本分子的核酸序列并且用半胱氨酸替换一个或多个氨基酸残基以编码含有所述经半胱氨酸改造的FN3结构域的单特异性或双特异性分子；表达含有所述经半胱氨酸改造的FN3结构域的分子；以及回收含有所述经半胱氨酸改造的FN3结构域的分子。所述含有分离的经半胱氨酸改造的单特异性或双特异性FN3结构域的分子可共价附接到检测标记或药物部分并且以治疗方式使用。

Description

半胱氨酸工程化III型纤连蛋白域结合分子

技术领域

本发明涉及用半胱氨酸残基改造的结合分子，以及其制备和使用它们的方法。更具体地，本发明涉及III型纤连蛋白(FN3)结构域分子，该分子可结合到经半胱氨酸改造的EGFR和/或c-Met。

背景技术

表皮生长因子受体(EGFR或ErbB1或HER1)是一种170kDa的跨膜糖蛋白，该糖蛋白由c-erbB1原癌基因编码。EGFR是受体酪氨酸激酶(RTK)的人表皮生长因子受体(HER)家族的成员，该家族包括HER2(ErbB2)、HER3(ErbB3)和HER4(ErbB4)。这些RTK共享同源结构，所述同源结构由配体结合胞外结构域(ECD)、单一跨膜结构域和胞内结构域组成，该胞内结构域包含催化激酶结构域和C-端尾。EGFR信号传导由配体结合引发，然后诱导受体的构象变化、二聚化和反式自磷酸化(Ferguson等人，Annu Rev Biophys，37：353-73，2008)，这将引发信号转导级联，所述信号转导级联最终影响多种细胞功能，包括细胞增殖和存活。人们已将EGFR的表达或激酶活性的增加与多种人类癌症相关联，使得EGFR成为治疗干预的有吸引力的靶标(Mendelsohn等人，Oncogene 19：6550-6565，2000；Grünwald等人，J Natl CancerInst 95：851-67，2003；Mendelsohn等人，Semin Oncol 33：369-85，2006)。此外，EGFR基因拷贝数和蛋白质表达这两者的增加也被与对非小细胞肺癌中的EGFR酪氨酸激酶抑制剂IRESSA^TM(吉非替尼)的有利响应相关联(Hirsch等人，Ann Oncol 18：752-60，2007)。

EGFR治疗包括小分子和抗EGFR抗体两者，其被批准用于治疗结直肠癌、胰腺癌、头颈癌和非小细胞肺癌(NSCLC)(Baselga和Arteaga，J Clin Oncol 23：2445-2459(2005)；Gill等人，J Biol Chem，259：7755-7760，1984；Goldstein等人，Clin Cancer Res，1：1311-1318；1995；Prewett等人，Clin Cancer Res，4：2957-2966，1998)。

抗EGFR治疗的功效可取决于肿瘤类型和肿瘤中的EFGR突变/扩增状态，并且可导致皮肤毒性(De Roock等人，Lancet Oncol 11：753-762，2010；Linardou等人，Nat RevClin Oncol，6：352-366，2009；Li和Perez-Soler，Targ Oncol 4：107-119，2009)。EGFR酪氨酸激酶抑制剂(TKI)通常用作对于非小细胞肺癌(NSCLC)的二线治疗，但是由于抗性途径通常在十二个月内停止工作(Riely等人，Clin Cancer Res 12：839-44，2006)。

c-Met编码酪氨酸激酶受体。它是在发现用致癌物治疗可产生组成型活性融合蛋白TPR-MET之后于1984年最先被鉴定出的原癌基因(Cooper等人，Nature 311：29-33，1984)。c-Met通过其配体HGF实现的激活刺激了过多的细胞过程，包括生长、运动、侵入、转移、上皮-间质转化、血管生成/伤口愈合和组织再生(Christensen等人，Cancer Lett 225：1-26，2005；Peters和Adjei，Nat Rev Clin Oncol 9：314-26，2012)。c-Met被合成为单链蛋白，该单链蛋白通过蛋白水解裂解为由二硫键连接的50kDaα-亚基和140kDaβ-亚基(Ma等人，Cancer and Metastasis Reviews，22：309-325，2003)。c-Met在结构上类似于其他膜受体(诸如Ron和Sea)，并且由胞外配体结合结构域、跨膜结构域和胞质结构域(包含酪氨酸激酶结构域和C-端尾区结构域)构成。HGF：c-Met结合的准确化学计量目前尚不清楚，但是通常认为，两个HGF分子结合到两个c-Met分子导致在酪氨酸1230、1234和1235处的受体二聚化和自磷酸化(Stamos等人，The EMBO Journal 23：2325-2335，2004)。非配体依赖性c-Met自磷酸化也可由于基因扩增、突变或受体过表达而发生。

c-Met在许多类型的癌症中频繁扩增、突变或过表达，所述癌症包括胃癌、肺癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌和中枢神经系统癌。通常定位于激酶结构域的错义突变常见于遗传性乳头状肾癌(PRCC)中以及13％的散发性PRCC中(Schmidt等人，Oncogene 18：2343-2350，1999)。相比之下，定位于脑信号蛋白或c-Met的近膜结构域的c-Met突变则常常见于胃癌、头颈癌、肝癌、卵巢癌、NSCLC和甲状腺癌中(Ma等人，Cancer and Metastasis Reviews，22：309-325，2003；Sakakura等人，Chromosomes and Cancer，1999.24：299-305)。已在脑癌、结直肠癌、胃癌和肺癌中检测到c-Met扩增，通常与疾病进展相关(Ma等人，Cancer and Metastasis Reviews，22：309-325，2003)。非小细胞肺癌(NSCLC)和胃癌中最多分别有4％和20％表现出c-Met扩增(Sakakura等人，Chromosomes and Cancer，1999.24：299-305；Sierra和Tsao，Therapeutic Advancesin Medical Oncology，3：S21-35，2011)。即使在不存在基因扩增的情况下，也常在肺癌中观察到c-Met过表达(Ichimura等人，Jpn J Cancer Res，87：1063-9，1996)。此外，在临床样本中，近一半的肺腺癌表现出高水平的c-Met和HGF，这两者均与提高的肿瘤生长速率、转移和不良预后相关(Sierra和Tsao，Therapeutic Advances in Medical Oncology，3：S21-35，2011；Siegfried等人，Ann Thorac Surg 66：1915-8，1998)。

所有肿瘤中接近60％变得对EGFR酪氨酸激酶抑制剂具有抗性，这增加了c-Met的表达、扩增了c-Met或增加了其唯一已知的配体HGF(Turke等人，Cancer Cell，17：77-88，2010)，从而表明对于EGFR存在通过c-Met的补偿途径。c-Met扩增最初是在培养的细胞中发现的，所述细胞变得对吉非替尼(一种EGFR激酶抑制剂)具有抗性，并且通过Her3途径表现出提高的存活率(Engelman等人，Science，316：1039-43，2007)。这在临床样本中得到进一步验证，其中具有所获得的对埃罗替尼或吉非替尼的抗性的43位患者中有九位表现出c-Met扩增，而62位未经治疗的患者中仅两位表现出c-Met扩增。有趣的是，九位经过治疗的患者中有四位还获得了EGFR激活突变T790M，显示出同步抗性途径(Beat等人，Proc NatlAcad Sci U S A，104：20932-7，2007)。

EGFR和c-Met各自在癌症中的作用现在已经明确，从而使得这些靶标在联合治疗方面具有吸引力。这两种受体通过相同的存活和抗凋亡途径(ERK和AKT)进行信号传导；因此，抑制组合中的配对可以限制补偿途径激活的可能性，从而改善总体功效。靶向EGFR和c-Met的联合治疗在临床试验中使用与用于NSCL的抗c-Met单价抗体结合的Tarceva(埃罗替尼)(Spigel等人，2011 ASCO Annual Meeting Proceedings 2011，Journal of ClinicalOncology：Chicago，IL.，第7505页)以及与ARQ-197(c-Met的小分子抑制剂)结合的Tarceva(埃罗替尼)(Adjei等人，Oncologist，16：788-99，2011)进行测试。联合治疗或双特异性抗EGFR/c-Met分子在例如以下文献中有所描述：国际专利公布WO2008/127710、美国专利公布US2009/0042906、国际专利公布WO2009/111691、国际专利公布WO2009/126834、国际专利公布WO2010/039248、国际专利公布WO2010/115551。

目前用于拮抗治疗用的EGFR和/或c-Met信号传导途径的小分子和大分子(即，抗体)方法可能是亚最佳的，这是由于可能缺乏对小分子的特异性，并且因此缺乏小分子抑制剂面临的潜在脱靶活性和剂量限制性毒性。典型的二价抗体可导致膜结合受体的集群以及下游信号传导途径的不期望激活，并且单价抗体(半臂)给制造过程带来显著的复杂性和成本。

因此，存在对于还具有缀合细胞毒性药物的附加能力的另外的单特异性和双特异性EGFR和/或c-Met抑制剂的需要，从而使这些有效化合物靶向EGFR/c-met表达肿瘤细胞，增强这些EGFR/c-Met抑制剂的抗肿瘤活性。虽然抗体药物缀合物存在于本领域中，但附接药物部分的常规方式通常会得到分子的异质混合物，在该异质混合物中药物部分附接在抗体上的多个位点处。例如，细胞毒性药物常通过抗体的通常许多的赖氨酸残基缀合到抗体上，从而生成异质抗体-药物缀合物混合物。根据反应条件，异质混合物通常包含具有0至约8个或更多个附接药物部分的抗体分布。此外，在具有特定整数比的药物部分与抗体的缀合物的每个子组内的是其中药物部分附接在抗体上的各个位点处的潜在异质混合物。分析和制备方法不足以分离和表征由缀合反应产生的异质混合物内的抗体-药物缀合物种类的分子。抗体是大的、复杂的并且在结构上不同的生物分子，通常带有许多反应性官能团。其与接头试剂和药物-接头中间体的反应性取决于诸如pH、浓度、盐浓度和共溶剂之类的因素。此外，多步骤缀合过程可能由于难于控制反应条件且难于表征反应物和中间体而不可再现。

也已证明通过存在于抗体中的半胱氨酸的化学缀合。然而，通过蛋白质的各种氨基酸残基到半胱氨酸氨基酸的突变所得到的半胱氨酸硫醇基团中的改造可能会出现问题，特别是在未配对(游离Cys)残基或相对易进行反应或氧化的那些残基的情况下。蛋白质表面上的未配对Cys残基可以配对并氧化形成分子内二硫化物，并从而形成蛋白质二聚体或多聚体。二硫化物二聚体的形成使得新的Cys对于与药物、配体或其他标记的缀合无反应活性。此外，如果蛋白质在新改造的Cys和现有的Cys残基之间氧化形成分子内二硫键，则两个Cys基团均不可用于活性位点参与和相互作用。此外，通过错误折叠或损失三级结构可使得蛋白质为失活或非特异性的(Zhang等人，(2002)Anal.Biochem.311：1-9)。

因此，存在对于可经受均匀化学缀合并避免抗体缀合物所面临的问题的分子的需要。

发明内容

本发明提供了一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含在选自以下的位置处的至少一个半胱氨酸取代：基于SEQ ID NO：27的FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93，以及相关FN3结构域中的等效位置。在结构域或蛋白质中的某一位置处的半胱氨酸取代包括将现有的氨基酸残基替换为半胱氨酸残基。

本发明还提供了一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO：27的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO：27的氨基酸序列，并且特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合。

本发明还提供了一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO：114的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO：114的氨基酸序列，并且特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。

本发明提供了新型位置，在该位置处可使半胱氨酸取代生成经半胱氨酸改造的FN3结构域。所述位置包括SEQ ID NO：11-114和/或122-137的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91或93中的一个或多个。

本发明的一个方面是一种通过以下制备经分离的半胱氨酸改造FN3结构域的方法：用半胱氨酸残基替换一个或多个氨基酸残基来诱变亲本FN3结构域的核酸序列以编码经半胱氨酸改造的FN3结构域；表达经半胱氨酸改造的FN3结构域；以及分离经半胱氨酸改造的FN3结构域。

本发明的另一方面是一种化学缀合的、分离的、经半胱氨酸改造的FN3结构域，其中FN3结构域共价附接到包含马来酰亚胺部分的化学试剂。

本发明的另一个实施例是化学缀合的、分离的、经半胱氨酸改造的FN3结构域，其可抑制EGFR过表达肿瘤细胞系和/或c-Met表达肿瘤细胞系的生长。

本申请还提供了一种分离的经半胱氨酸改造的双特异性FN3分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)结构域和第二FN3结构域，其中第一FN3结构域和第二FN3结构域包含在选自残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处的半胱氨酸取代，并且特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，并且第二FN3结构域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。

本发明的另一方面是一种化学缀合的、分离的、经半胱氨酸改造的双特异性分子，其中双特异性分子共价附接到包含马来酰亚胺部分的化学试剂。

本发明的另外的方面是通过以下制备分离的经半胱氨酸改造的双特异性FN3的方法：用半胱氨酸残基替换一个或多个氨基酸残基来诱变亲本FN3双特异性分子的核酸序列以编码经半胱氨酸改造的双特异性分子；表达经半胱氨酸改造的分子；以及分离经半胱氨酸改造的双特异性分子。

附图说明

图1A和图1B：EGFR-结合FN3结构域的氨基酸比对。BC环和FG环在SEQ ID NO：18的残基22-28和75-86处被框出。一些变体包括热稳定性改善的L17A、N46K和E86I取代(根据Tencon SEQ ID NO：1的残基编号)。

图2：细胞毒素/接头结构。

图3：P54AR4-83v2蛋白质的晶体结构的带状图(SEQ ID NO：27)。被确定为半胱氨酸取代的容错的最终位置被示出为条状物和着色的黑色固体。结合环BC/FG为着色的灰色阴影。

图4：Tencon27支架(SEQ ID NO：99)和具有随机化C-CD-F-FG的另选表面的TCL14文库(SEQ ID NO：100)的序列比对。环残基被框出。并在序列上方标明环和链。

图5A和图5B：c-Met-结合FN3结构域的序列比对。C环和CD链以及F环和FG链被框出，并且跨越残基29-43和65-81。

图6：图中示出了使用含有单特异性或双特异性FN3结构域的分子进行预处理并用HGF刺激的H292细胞中的c-Met磷酸化的抑制。当相较于单特异性c-Met-结合FN3结构域(P114AR5P74-A5，在图中示出为A5)本身或其与EGFR-结合FN3结构域(P54AR4-83v2，在图中示出为83v2)结合时，观察到双特异性EGFR/c-Met分子(ECB1)的效力大幅增加。

图7：使用含有单特异性或双特异性FN3结构域的分子预处理的细胞中的EGFR和c-Met磷酸化的抑制。在表达高水平的EGFR、H292(A)和H596(B)的细胞系中，含有抗EGFR单特异性和双特异性FN3结构域的分子在减少EGFR磷酸化时同样有效。在表达相对于c-Met、H441(C)较低水平的EGFR的细胞系中，与单独的单特异性EGFR-结合FN3结构域相比，双特异性EGFR/c-Met分子提高了抑制EGFR磷酸化的效力。在相对于EGFR、H292(D)和H596(E)具有较低水平的c-Met的细胞系中，与仅有单特异性c-Met-结合FN3结构域相比，对c-Met磷酸化的抑制通过双特异性EGFR/c-Met分子得以显著增强。在研究中使用的分子是：双特异性ECB5(在图中示出为17-A3)、单特异性EGFR-结合FN3结构域P53A1R5-17(在图中示出为“17”)、双特异性EGFR/c-Met分子ECB3(在图中示出为83-H9)和单特异性c-Met结合FN3结构域P114AR7P93-H9(在图中示出为H9)。

图8：图中示出了从使用双特异性EGFR/c-Met分子给药6小时或72小时的小鼠分离的肿瘤中的药效动力学信号传导。在6小时和72小时时，所有分子显著减少了c-Met、EGFR和ERK磷酸化，抑制的程度取决于FN3结构域与EGFR和/或c-Met的亲和力。双特异性分子通过将具有高亲和力(83为p54AR4-83v2)或中等亲和力(图中的“17v2”为P53A1R5-17v2)的EGFR-结合FN3结构域连接到具有高亲和力(图中的“A3”为P114AR7P94-A3)或中等亲和力(图中的“A5”为P114AR5P74-A5)的c-Met-结合FN3结构域而生成。

图9：图中示出了在IP给药6小时(左图)和72小时(右图)后连接到白蛋白结合结构域(ABD)的各种亲和力的双特异性EGFR/cMet分子的血浆(上图)和肿瘤(下图)积聚。给药6小时后，在使用具有中等亲和力EGFR-结合FN3结构域(17v2)和高亲和力c-Met结合结构域(83v2)的双特异性分子给药的小鼠中肿瘤积聚达最大值。结合有高亲和力或中等亲和力EGFR或c-Met结合FN3结构域的双特异性分子如下：83v2-A5-ABD(ECB18；对于EGFR/cMet具有高/中等亲和力)、83v2-A3-ABD(ECB38；高/高)、17v2-A5(ECB28；中等/中等)、17v2-A3-ABD(ECB39；中等/高)。83v2是指p54AR4-83v2，17v2是指p53A1R5-17v2，A3是指p114AR7P94-A3，A5是指p114AR5P74-A5。

图10：将H292-HGF肿瘤异种移植物植入到SCID浅褐色小鼠中。当肿瘤达到大约80mm³的平均体积时，每周用双特异性EGFR/c-Met分子(25mg/kg)或PBS载体对小鼠给药三次。所有双特异性分子减少了肿瘤生长，肿瘤生长抑制(TGI)取决于对于c-Met和EGFR的分子亲和力。(高EGFR-高cMet是指p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3(ECB38)；高EGFR-中等cMet是指p54AR4-83v2-p114AR5P74-A5(ECB18)；中等EGFR-高cMet是指p53A1R5-17v2-p114AR7P94-A3(ECB39)；中等EGFR-中等cMet是指p53A1R5-17-p114AR5P74-A5(ECB28))。

图11：将H292-HGF肿瘤异种移植物植入到SCID浅褐色小鼠中，并用不同疗法对它们进行治疗。图中示出了疗法的抗肿瘤活性。(双特异性EGFR/c-Met分子是指p54AR4-83v2-p114AR7P94-A3-ABD(ECB38)；其他疗法为克唑替尼、埃罗替尼、西妥昔单抗，以及克唑替尼和埃罗替尼的组合)。

具体实施方式

如本文所用，术语“III型纤连蛋白(FN3)结构域”(FN3结构域)是指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(Bork和Doolittle，Proc Nat Acad Sci USA 89：8990-8994，1992；Meinke等人，J Bacteriol 175：1910-1918，1993；Watanabe等人，J Biol Chem 265：15659-15665，1990)。示例性FN3结构域是存在于人腱生蛋白C中15个不同的FN3结构域、存在于人纤连蛋白(FN)中15个不同的FN3结构域、以及非天然合成FN3结构域，如例如美国专利公布2010/0216708中所述。单独的FN3结构域通过结构域编号和蛋白质名称来表示，例如，腱生蛋白的第三FN3结构域(TN3)，或纤连蛋白的第十FN3结构域(FN10)。

如本文所用，术语“取代”或“取代的”或“突变”或“突变的”是指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸以生成该序列的变体。

如本文所用，术语“使随机化”或“随机化的”或“多样化的”或“使多样化”是指在多核苷酸或多肽序列中进行至少一处取代、插入或缺失。

如本文所用，“变体”是指因一处或多处修改(例如取代、插入或缺失)而不同于参考多肽或参考多核苷酸的多肽或多核苷酸。

如本文所用，术语“特异性地结合”或“特异性结合”是指本发明的FN3结构域以1×10^-6M或更低(例如1×10^-7M或更低、1×10^-8M或更低、1×10^-9M或更低、1×10^-10M或更低、1×10^-11M或更低、1×10^-12M或更低、或1×10^-13M或更低)的解离常数(K_D)结合到预定抗原的能力。通常，本发明的FN3结构域以比其对于非特异性抗原(例如BSA或酪蛋白)的K_D小至少10倍的K_D结合到预定抗原(即，EGFR或c-Met)，如通过使用例如Proteon仪器(BioRad)的表面等离子体共振所测得。因此，本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子以对于EGFR和c-Met两者至少1×10^-6M或更低的结合亲和力(K_D)特异性地结合每个EGFR和c-Met。然而，本发明的特异性地结合预定抗原的分离的FN3结构域可与其他相关抗原(例如，与来自其他物种(同源物)的相同预定抗原)具有交叉反应性。

术语“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或多核苷酸变体构成。

如本文所用，术语“稳定性”是指在生理条件下分子保持折叠状态以使得其保持至少一种其正常功能活性例如结合到预定抗原(诸如EGFR或c-Met)的能力。

如本文所用，“表皮生长因子受体”或“EGFR”是指具有SEQ ID NO：73中和GenBank登录号NP_005219中示出的序列的人EGFR(也称为HER-1或Erb-B1(Ullrich等人，Nature309：418-425，1984))，以及其天然存在的变体。此类变体包括熟知的EGFRvIII以及其他另选剪接的变体(例如，如SwissProt登录号P00533-1、P00533-2、P00533-3、P00533-4所标识)、变体GLN-98、ARG-266、Lys-521、ILE-674、GLY-962和PRO-988(Livingston等人，NIEHS-SNP，环境基因组计划，NIEHS ES15478)。

如本文所用，“EGFR配体”涵盖用于EGFR的所有(例如，生理)配体，包括EGF、TGF-α、肝素结合EGF(HB-EGF)、双调蛋白(AR)和上皮调节蛋白(EPI)。

如本文所用，“表皮生长因子”(EGF)是指熟知的具有SEQ ID NO：74中示出的氨基酸序列的由53个氨基酸组成的人EGF。

如本文所用，“肝细胞生长因子受体”或“c-Met”是指具有SEQ ID NO：101中或GenBank登录号NP_001120972中示出的氨基酸序列的人c-Met，以及其天然变体。

如本文所用，“肝细胞生长因子”(HGF)是指熟知的具有SEQ ID NO：102中示出的氨基酸序列的人HGF，其被裂解以形成由二硫键连接的α和β链的二聚体。

如本文所用，“阻碍结合”或“抑制结合”可互换地指本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的FN3结构域阻碍或抑制EGFR配体的结合(诸如EGF与EGFR和/或HGF与c-Met)的能力，并且涵盖部分的和完全的阻碍/抑制。当与在没有阻碍或抑制的情况下结合到EGFR的EGFR配体和/或结合到c-Met的HGF相比时，通过本发明的FN3结构域或包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子阻碍/抑制EGFR配体(诸如EGF与EGFR和/或HGF与c-Met)可部分或完全地降低EGFR信号传导和/或c-Met信号传导的正常水平。当抑制为至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％时，本发明的FN3结构域或包含EGFR/c-MetFN3结构域的双特异性分子对EGFR配体(诸如EGF与EGFR和/或HGF与c-Met)“阻碍结合”。结合的抑制可使用已知方法进行测量，例如通过使用FACS以及使用本文所述的方法测量表达A431细胞(该细胞暴露于本发明的FN3结构域或包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子)的EGFR上的生物素酰化EGF的结合抑制，或者使用熟知的方法和本文所述的方法测量c-Met胞外结构域上的生物素酰化HGF的结合抑制。

术语“EGFR信号传导”是指由结合到EGFR的EGFR配体诱导的信号转导，从而导致EGFR中的至少一个酪氨酸残基的自磷酸化。示例性EGFR配体为EGF。

如本文所用，“中和EGFR信号传导”是指本发明的FN3结构域抑制EGFR配体(诸如EGF)所诱导的EGFR信号传导至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的能力。

术语“c-Met信号传导”是指由结合到c-Met的HGF诱导的信号转导，从而导致c-Met中的至少一个酪氨酸残基的自磷酸化。通常，在位置1230、1234或1235处的至少一个酪氨酸残基在HGF结合时自磷酸化。

如本文所用，“中和c-Met信号传导”是指本发明的FN3结构域抑制HGF所诱导的c-Met信号传导至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的能力。

如本文所用，“过表达”、“过表达的”和“过度表达”可互换地指与相同组织类型的正常细胞相比在表面上具有可测量的更高水平的EGF和/或c-Met的癌症或恶性细胞。这种过表达可通过基因扩增或通过增加的转录或翻译而引起。EGFR和/或c-Met表达和过表达可在活细胞或裂解细胞上使用熟知的测定法例如ELISA、免疫荧光法、流式细胞术或放射免疫测定法来测量。另选地或除此之外，编码EGFR和/或c-Met的核酸分子的水平可在细胞中例如使用荧光原位杂交、DNA印迹或PCR技术来测量。当细胞表面上的EGFR和/或c-Met的水平与正常细胞相比高至少1.5倍时，EGFR和/或c-Met发生过表达。

如本文所用，“Tencon”是指具有SEQ ID NO：1中所示以及美国专利公布US2010/0216708中所述的序列的合成III型纤连蛋白(FN3)结构域。

如本文所用，“癌细胞”或“肿瘤细胞”是指在体内、离体和组织培养物中的癌性、癌前或转化的细胞，其具有自发或诱导的表型变化，但未必涉及新遗传物质的摄取。虽然转化可由感染转化病毒以及结合新基因组核酸、或摄取外源核酸而发生，但是还可自发地发生或在暴露于致癌物之后发生，从而使内源基因突变。转化/癌症示例为例如合适的动物宿主(诸如裸小鼠等)中体外、体内和离体的形态变化、细胞永生、异常生长控制、病灶形成、增殖、恶性肿瘤、肿瘤特异性标记物水平、侵入、肿瘤生长或抑制(Freshney，Culture ofAnimal Cells：A Manual of Basic Technique(3rd ed.1994))。

术语“载体”是指能够在生物系统内复制或可以在此类系统间移动的多核苷酸。载体多核苷酸通常含有诸如复制起点、聚腺苷酸化信号或选择标记之类的元件，其功能是促进这些多核苷酸在生物系统中的复制或保持。此类生物系统的示例可包括细胞、病毒、动物、植物和用能够复制载体的生物组分再造的生物系统。包含载体的多核苷酸可为DNA或RNA分子或这些分子的杂合分子。

术语“表达载体”是指可用于在生物系统或再造生物系统中指导由存在于表达载体中的多核苷酸序列所编码的多肽的翻译的载体。

术语“多核苷酸”是指包含由糖-磷酸主链或其他等同的共价化学方式所共价连接的核苷酸链的分子。双链DNA和单链DNA以及双链RNA和单链RNA是多核苷酸的典型示例。

术语“多肽”或“蛋白质”是指包含至少两个由肽键连接以形成多肽的氨基酸残基的分子。少于约50个氨基酸的小多肽可以称作“肽”。

如本文所用，术语“双特异性EGFR/c-Met分子”或“包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子”是指包含EGFR结合FN3结构域和不同的c-Met结合FN3结构域的分子，这些结构域直接或通过接头共价连接在一起。示例性双特异性EGFR/c-Met结合分子包含特异性地结合EGFR的第一FN3结构域以及特异性地结合c-Met的第二FN3结构域。

如本文所用，“价”是指在分子中存在对于抗原为特异性的结合位点的指定数目。因此，术语“单价”、“二价”、“四价”、和“六价”分别是指在分子中存在对于抗原为特异性的一个、两个、四个和六个结合位点。

如本文所用，“混合物”是指未共价连接在一起的两个或更多个FN3结构域的样品或制备物。混合物可由两个或更多个相同FN3结构域或不同FN3结构域组成。

物质组合物

本发明提供了含有经半胱氨酸改造的单特异性和双特异性EGFR和/或c-Met结合FN3结构域的分子，以及其制备和使用方法。

单特异性EGFR结合分子

本发明提供了III型纤连蛋白(FN3)结构域，其特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，因此可广泛用于治疗和诊断应用中。本发明提供了编码本发明的FN3结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞，以及制备和使用它们的方法。

本发明的FN3结构域结合具有高亲和力的EGFR并抑制EGFR信号传导，并且与小分子EGFR抑制剂相比时可提供在特异性方面的益处以及减小的脱靶毒性，并且与常规抗体治疗相比可提供改善的组织穿透性。

本发明的一个实施例是分离的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合。

在竞争测定法中，本发明的FN3结构域可以小于约1×10^-7M、小于约1×10^-8M、小于约1×10^-9M、小于约1×10^-10M、小于约1×10^-11M、或小于约1×10^-12M的IC₅₀值阻碍EGF结合EGFR，该竞争测定法采用A431细胞，并且使用链霉亲和素-藻红蛋白缀合物在存在或不存在本发明的FN3结构域的情况下培养的A431细胞上于600nM处检测来自结合的生物素酰化EGF的荧光量。示例性FN3结构域可以介于约1×10^-9M至约1×10^-7M之间的IC₅₀值阻碍EGF结合EGFR，诸如具有SEQ ID NO：18-29、107-110或122-137的氨基酸序列的EGFR结合FN3结构域。与在不存在本发明的FN3结构域的情况下使用相同测定条件的EGF与EGFR的结合相比时，本发明的FN3结构域可阻碍EGF与EGFR的结合至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

与在不存在本发明的FN3结构域的情况下使用相同测定条件的信号传导水平相比时，本发明的FN3结构域可抑制EGFR信号传导至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

配体的结合(诸如EGF与EGFR)刺激受体二聚化、自磷酸化、受体内部的激活、细胞质酪氨酸激酶结构域、以及参与调节DNA合成(基因激活)和细胞周期进程或分裂的多个信号转导和反式激活途径的引发。EGFR信号传导的抑制可导致抑制一个或多个EGFR下游信号传导途径，并因此使中和EGFR可具有多种效应，包括抑制细胞增殖和分化、血管生成、细胞运动和转移。

EGFR信号传导可使用各种熟知的方法来测量，例如测量在酪氨酸Y1068、Y1148和Y1173中任一处的受体的自磷酸化(Downward等人，Nature 311：483-5，1984)和/或天然或合成底物的磷酸化。磷酸化可使用熟知的方法检测，诸如ELISA测定法或使用磷酸酪氨酸特异性抗体的蛋白质印迹。示例性测定法可见于Panek等人，J Pharmacol Exp Thera 283：1433-44，1997和Batley等人，Life Sci 62：143-50，1998中。

在一个实施例中，当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，本发明的FN3结构域以小于约2.5×10^-6M，例如小于约1×10^-6M、小于约1×10^-7M、小于约1×10^-8M、小于约1×10^-9M、小于约1×10^-10M、小于约1×10^-11M、或小于约1×10^-12M的IC₅₀值抑制在EGFR残基酪氨酸1173处EGF诱导的EGFR磷酸化。

在一个实施例中，当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，本发明的FN3结构域以介于约1.8×10^-8M至约2.5×10^-6M之间的IC₅₀值抑制在EGFR残基酪氨酸1173处EGF诱导的EGFR磷酸化。这种示例性FN3结构域是具有SEQ ID NO：18-29、107-110或122-137的氨基酸序列的那些结构域。

在一个实施例中，本发明的FN3结构域以小于约1×10^-8M，例如小于约1×10^-9M、小于约1×10^-10M、小于约1×10^-11M、小于约1×10^-12M、或小于约1×10^-13M的解离常数(K_D)结合人EGFR，如本领域的技术人员所实践的那样通过表面等离子体共振或Kinexa方法测得。在一些实施例中，本发明的FN3结构域以介于约2×10^-10至约1×10^-8M之间的K_D结合人EGFR。FN3结构域对于EGFR的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。(参见例如Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions，”In Fundamental Immunology，Paul，W.E编辑，Raven Press：New York，NY(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，NY(1992)；以及本文描述的方法)。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，特定FN3结构域-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力及其他抗原结合参数(例如K_D、K_on、K_off)的测量优选地用蛋白质支架和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)来进行。

本发明的结合EGFR的示例性FN3结构域包括SEQ ID NO：18-29、107-110或122-137的FN3结构域。

在一个实施例中，特异性地结合EGFR的FN3结构域包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少87％相同的氨基酸序列。

在一个实施例中，特异性地结合EGFR的FN3结构域包含

FG环，该FG环包含序列HNVYKDTNX₉RGL(SEQ ID NO：179)或序列LGSYVFEHDVML(SEQID NO：180)，其中X₉为M或I；以及

BC环，该BC环包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：181)；其中

X₁为A、T、G或D；

X₂为A、D、Y或W；

X₃为P、D或N；

X₄为L或不存在；

X₅为D、H、R、G、Y或W；

X₆为G、D或A；

X₇为A、F、G、H或D；并且

X₈为Y、F或L。

本发明的特异性地结合EGFR并抑制EGFR的自磷酸化的FN3结构域可包含FG环作为结构特征，该FG环包含序列HNVYKDTNX₉RGL(SEQ ID NO：179)或序列LGSYVFEHDVML(SEQ IDNO：180)，其中X₉为M或I。这种FN3结构域还可包含长度为8或9个氨基酸并且由序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：181)限定的BC环，并且当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，以小于约2.5×10^-6M的IC₅₀值，并且以介于约1.8×10^-8M至约2.5×10^-6M之间的IC₅₀值抑制EGFR自磷酸化。

本发明的特异性地结合EGFR并抑制EGFR的自磷酸化的FN3结构域还包含序列

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX₉RGLPLSAEFTT(SEQ ID NO：182)，或序列

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVLGSYVFEHDVMLPLSAEFTT(SEQ ID NO：183)，

其中

X₁为A、T、G或D；

X₂为A、D、Y或W；

X₃为P、D或N；

X₄为L或不存在；

X₅为D、H、R、G、Y或W；

X₆为G、D或A；

X₇为A、F、G、H或D；

X₈为Y、F或L；并且

X₉为M或I。

可使用熟知的方法以及本文所述的方法生成EGFR结合FN3结构域并对其抑制EGFR自磷酸化的能力进行测试。

本发明的另一个实施例是特异性地结合EGFR的分离的FN3结构域，其中FN3结构域包含SEQ ID NO：18-29、107-110或122-137中示出的序列。

在一些实施例中，EGFR结合FN3结构域包含连接到N-端的起始甲硫氨酸(Met)或连接到特定FN3结构域的C-端的半胱氨酸(Cys)，例如以有利于半衰期延长分子的表达和/或缀合。

本发明的另一个实施例是特异性地结合EGFR并阻碍EGF与EGFR的结合的分离的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中FN3结构域从基于SEQ ID NO：1的Tencon序列设计的文库分离。

单特异性c-Met结合分子

本发明提供了III型纤连蛋白(FN3)结构域，其特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met结合，因此可广泛用于治疗和诊断应用中。本发明提供了编码本发明的FN3结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞，以及制备和使用它们的方法。

本发明的FN3结构域结合具有高亲和力的c-Met并抑制c-Met信号传导，与小分子c-Met抑制剂相比可提供在特异性方面的益处以及减小的脱靶毒性，并且与常规抗体治疗相比可提供改善的组织穿透性。本发明的FN3结构域是单价的，从而防止可通过其他二价分子而发生的不希望的受体集群和激活。

本发明的一个实施例是分离的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。

在一种测定法中，本发明的FN3结构域可以约小于约1×10^-7M、小于约1×10^-8M、小于约1×10^-9M、小于约1×10^-10M、小于约1×10^-11M、或小于约1×10^-12M的IC₅₀值阻碍HGF结合c-Met，该测定法在本发明的FN3结构域的存在下检测对生物素酰化HGF与c-Met-Fc融合蛋白的结合的抑制。示例性FN3结构域可以介于约2×10^-10M至约6×10^-8之间的IC₅₀值阻碍HGF结合c-Met。与在不存在本发明的FN3结构域的情况下使用相同测定条件的HGF与c-Met的结合相比时，本发明的FN3结构域可阻碍HGF与c-Met的结合至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

与在不存在本发明的FN3结构域的情况下使用相同测定条件的信号传导水平相比时，本发明的FN3结构域可抑制c-Met信号传导至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

HGF与c-Met的结合刺激受体二聚化、自磷酸化、受体内部的激活、细胞质酪氨酸激酶结构域、以及参与调节DNA合成(基因激活)和细胞周期进程或分裂的多个信号转导和反式激活途径的引发。c-Met信号传导的抑制可导致抑制一个或多个c-Met下游信号传导途径，并因此使中和c-Met可具有多种效应，包括抑制细胞增殖和分化、血管生成、细胞运动和转移。

c-Met信号传导可使用各种熟知的方法来测量，例如测量在至少一个酪氨酸残基Y1230、Y1234或I1235上的受体的自磷酸化，和/或天然或合成底物的磷酸化。在ELISA测定法中或在蛋白质印迹上，可例如使用对于磷酸酪氨酸具有特异性的抗体检测磷酸化。一些测定法用于分析酪氨酸激酶活性(Panek等人，J Pharmacol Exp Thera 283：1433-44，1997；Batley等人，Life Sci 62：143-50，1998)。

在一个实施例中，当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL重组人HGF测量时，本发明的FN3结构域以小于约1×10^-6M、小于约1×10^-7M、小于约1×10^-8M、小于约1×10^-9M、小于约1×10^-10M、小于约1×10^-11M、或小于约1×10^-12M的IC₅₀值抑制在c-Met残基1349处HGF诱导的c-Met磷酸化。

在一个实施例中，当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL重组人HGF测量时，本发明的FN3结构域以介于约4×10^-9M至约1×10^-6M之间的IC₅₀值抑制在c-Met酪氨酸Y1349处HGF诱导的c-Met磷酸化。

在一个实施例中，本发明的FN3结构域以等于或小于约1×10^-7M、1×10^-8M、1×10^- ⁹M、1×10^-10M、1×10^-11M、1×10^-12M，1×10^-13M、1×10^-14M、或1×10^-15M的解离常数(K_D)结合人c-Met，如本领域的技术人员所实践的那样通过表面等离子体共振或Kinexa方法测得。在一些实施例中，本发明的FN3结构域以介于约3×10^-10至约5×10^-8M之间的K_D结合人c-Met。FN3结构域对于c-Met的亲和力可使用任何合适的方法通过实验测定。(参见例如Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions，”In Fundamental Immunology，Paul，W.E编辑，Raven Press：New York，NY(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company：New York，NY(1992)；以及本文描述的方法)。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，特定FN3结构域-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力及其他抗原结合参数(例如K_D、K_on、K_off)的测量优选地用蛋白质支架和抗原的标准化溶液以及标准化缓冲液(诸如本文所述的缓冲液)来进行。

本发明的结合c-Met的示例性FN3结构域包括具有SEQ ID NO：32-49或111-114的氨基酸序列的FN3结构域。

在一个实施例中，特异性地结合c-Met的FN3结构域包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列至少83％相同的氨基酸序列。

在一个实施例中，特异性地结合c-Met的FN3结构域包含

C链和CD环，其包含序列DSFX₁₀IRYX₁₁EX₁₂X₁₃X₁₄X₁₅GX₁₆(SEQ ID NO：184)，其中

X₁₀为W、F或V；

X₁₁为D、F或L；

X₁₂为V、F或L；

X₁₃为V、L或T；

X₁₄为V、R、G、L、T或S；

X₁₅为G、S、A、T或K；并且

X₁₆为E或D；以及

F链和FG环，其包含序列TEYX₁₇VX₁₈IX₁₉X₂₀V KGGX₂₁X₂₂SX₂₃(SEQ ID NO：185)，其中

X₁₇为Y、W、I、V、G或A；

X₁₈为N、T、Q或G；

X₁₉为L、M、N或I；

X₂₀为G或S；

X₂₁为S、L、G、Y、T、R、H或K；

X₂₂为I、V或L；并且

X₂₃为V、T、H、I、P、Y、T或L。

本发明的特异性地结合c-Met并抑制c-Met的自磷酸化的FN3结构域还包含序列：

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX_1oIRYX₁₁EX₁₂X₁₃X₁₄X₁₅GX₁₆AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX₁₇VX₁₈IX₁₉X₂₀VKGGX₂₁X₂₂SX₂₃PLSAEFTT(SEQ ID NO：186)，

其中

X₁₀为W、F或V；并且

X₁₁为D、F或L；

X₁₂为V、F或L；

X₁₃为V、L或T；

X₁₄为V、R、G、L、T或S；

X₁₅为G、S、A、T或K；

X₁₆为E或D；

X₁₇为Y、W、I、V、G或A；

X₁₈为N、T、Q或G；

X₁₉为L、M、N或I；

X₂₀为G或S；

X₂₁为S、L、G、Y、T、R、H或K；

X₂₂为I、V或L；并且

X₂₃为V、T、H、I、P、Y、T或L。

本发明的另一个实施例是特异性地结合c-Met的分离的FN3结构域，其中FN3结构域包含SEQ ID NO：32-49或111-114中示出的序列。

本发明的另一个实施例是特异性地结合c-Met并阻碍HGF与c-Met的结合的分离的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中FN3结构域从基于SEQ ID NO：1的Tencon序列设计的文库分离。

从基于Tencon序列的文库分离EGFR或c-Met FN3结构域

Tencon(SEQ ID NO：1)是由来自人腱生蛋白-C的十五个FN3结构域的共有序列设计的非天然存在的III型纤连蛋白(FN3)结构域(Jacobs等人，Protein Engineering，Design，and Selection，25：107-117，2012；美国专利公布2010/0216708)。Tencon的晶体结构示出六个表面暴露环，这些环连接七个β-链作为FN3结构域的特性，所述β-链称为A、B、C、D、E、F和G，并且所述环称为AB、BC、CD、DE、EF和FG环(Bork和Doolittle，Proc Natl AcadSci USA 89：8990-8992，1992；美国专利6,673,901)。这些环或每个环中所选择的残基可随机化，以便构建可用于选择结合EGFR的新型分子的III型纤连蛋白(FN3)结构域文库。表1示出Tencon(SEQ ID NO：1)中每个环和β-链的位置和序列。

基于Tencon序列设计的文库因此可具有随机化的FG环或随机化的BC和FG环，诸如文库TCL1或TCL2，如下所述。Tencon BC环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在BC环处多样化的文库中随机化并且根据Tencon序列设计。Tencon FG环的长度为7个氨基酸，因此1、2、3、4、5、6或7个氨基酸可在FG环处多样化的文库中随机化并且根据Tencon序列设计。Tencon文库中的环处的进一步多样性可通过环处残基的插入和/或缺失来实现。例如，FG和/或BC环可延伸1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。Tencon中的FG环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中的相应环在4-28个残基的范围内。为了提供最大的多样性，FG环在序列以及长度方面可为多样化的以对应于4-28个残基的抗体CDR3长度范围。例如，FG环在长度方面可通过将环延伸额外的1、2、3、4或5个氨基酸进一步多样化。

根据Tencon序列设计的文库也可具有随机化可选表面，所述表面形成在FN3结构域的侧面上并且包含两条或更多条β链，以及至少一个环。一个这样的可选表面由Cβ-链和Fβ-链以及CD环和FG环中的氨基酸形成(C-CD-F-FG表面)。文库设计基于Tencon可选C-CD-F-FG表面且示于图4中，并且此类文库的详细生成在美国专利申请序列号13/852,930中有所描述。

基于Tencon序列设计的文库还包括基于Tencon变体设计的文库，诸如在第11位、第14位、第17位、第37位、第46位、第73位或第86位残基处具有取代的Tencon变体(残基编号对应于SEQ ID NO：1)，并且所述变体显示出改善的热稳定性。示例性Tencon变体在美国专利公布2011/0274623中有所描述，并且包括Tencon27(SEQ ID NO：99)，与SEQ ID NO：1的Tencon相比时，所述Tencon27具有取代E11R、L17A、N46V、E86I。

表1：

可使用随机的或定义的氨基酸集合在所选残基位置处使基于Tencon和其他FN3序列的文库随机化。例如，可使用NNK密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)产生具有随机取代的文库中的变体。在其他多样化方案中，DVK密码子可用于编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。另选地，NNS密码子可用于产生所有20种氨基酸残基并同时降低终止密码子的频率。可例如使用技术(http:_//www_sloning_com)来合成在待多样化的位置具有偏向氨基酸分布的FN3结构域文库。这种技术使用预先制备的双链三体的文库，其用作对于成千上万的基因合成工艺而言为足够的通用构建模块。该三体文库代表对构建任何期望的DNA分子所必需的所有可能的序列组合。密码子命名根据熟知的IUB密码。

本发明的特异性地结合EGFR或c-Met的FN3结构域可通过以下所述分离：使用顺式展示产生FN3文库(诸如Tencon文库)以将编码支架蛋白的DNA片段连接至编码RepA的DNA片段，从而生成在体外翻译之后形成的蛋白质-DNA复合物池，其中每种蛋白质与编码其的DNA稳定关联(美国专利7,842,476；Odegrip等人，Proc Natl Acad Sci USA 101，2806-2810，2004)；以及通过本领域已知以及实例中描述的任何方法针对与EGFR和/或c-Met的特异性结合对文库进行分析。可被使用的示例性熟知的方法为ELISA、夹心免疫测定以及竞争性和非竞争性测定(参见例如Ausubel等人编辑，1994，Current Protocols in MolecularBiology，第1卷，John Wiley父子，Inc.，New York)。所识别的特异性地结合EGFR或c-Met的FN3结构域使用本文所述的方法针对其阻碍EGFR配体(诸如EGF结合到EGFR或HGF结合到c-Met)的能力，以及针对其抑制EGFR和/或c-Met信号传导的能力进一步表征。

可使用任何FN3结构域作为模板以生成文库，并使用本文中提供的方法筛选文库中特异性地结合EGFR或c-Met的分子，从而生成本发明的特异性地结合EGFR或c-Met的FN3结构域。可被使用的示例性FN3结构域为腱生蛋白C的第三FN3结构域(TN3)(SEQ ID NO：75)、Fibcon(SEQ ID NO：76)，以及纤连蛋白的第十FN3结构域(FN10)(SEQ ID NO：77)。标准的克隆和表达技术用于将文库克隆到载体中或合成文库的双链cDNA盒，以在体外表达或翻译文库。可使用例如核糖体展示(Hanes和Pluckthun，Proc Natl Acad Sci USA，94，4937-4942，1997)、mRNA展示(Roberts和Szostak，Proc Natl Acad Sci USA，94，12297-12302，1997)或其他无细胞系统(美国专利5,643,76)。FN3结构域变体的文库可表达为展示在例如任何合适的噬菌体的表面上的融合蛋白。用于在噬菌体的表面上展示融合多肽的方法是熟知的(美国专利公布2011/0118144、国际专利公布WO2009/085462、美国专利6,969,108、美国专利6,172,197、美国专利5,223,409、美国专利6,582,915、美国专利6,472,147)。

本发明的特异性地结合EGFR或c-Met的FN3结构域可被修饰以改善其特性，诸如改善热稳定性以及热折叠和解折叠的可逆性。多种方法已应用于增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定序列比较的合理设计、稳定二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、对盐桥进行工程改造、蛋白质表面电荷的改变、定向进化和共有序列的构成(Lehmann和Wyss，Curr Opin Biotechnol，12，371-375，2001)。高度的热稳定性可增加所表达蛋白质的产量、改善溶解度或活性、降低免疫原性并且使生产中对冷链的需要最小化。可被取代以改善Tencon(SEQ ID NO：1)的热稳定性的残基为第11位、第14位、第17位、第37位、第46位、第73位或第86位残基，并且在美国专利公布2011/0274623中有所描述。对应于这些残基的取代可结合到本发明的FN3结构域或包含FN3结构域的双特异性分子中。

本发明的另一个实施例是特异性地结合EGFR并阻碍EGF与EGFR的结合的分离的FN3结构域，其包含SEQ ID NO：18-29、107-110、122-137中示出的序列，还包含在对应于Tencon(SEQ ID NO：1)中的位置11、14、17、37、46、73和86的一个或多个残基位置处的取代。

本发明的另一个实施例是特异性地结合c-Met并阻碍HGF与c-Met的结合的分离的FN3结构域，其包含SEQ ID NO：32-49或111-114中示出的序列，还包含在对应于Tencon(SEQID NO：1)中的位置11、14、17、37、46、73和86的一个或多个残基位置处的取代。

示例性取代为取代E11N、E14P、L17A、E37P、N46V、G73Y和E86I(根据SEQ ID NO：1进行编号)。

在一些实施例中，本发明的FN3结构域包含对应于Tencon(SEQ ID NO：1)中的取代L17A、N46V和E86I的取代。

特异性地结合EGFR的FN3结构域(图1)在与Tencon(SEQ ID NO：1)相比时具有延伸的FG环。因此，对应于Tencon(SEQ ID NO：1)中的残基11、14、17、37、46、73和86的残基为图1A和图1B中所示的除了SEQ ID NO：24的FN3结构域之外的EGFR FN3结构域中的残基11、14、17、37、46、73和91，其中由于在BC环中插入一个氨基酸，相应残基为残基11、14、17、38、74和92。

本发明的另一个实施例是特异性地结合EGFR并阻碍EGF与EGFR的结合的分离的FN3结构域，其包含SEQ ID NO：18-29、107-110或122-137中示出的氨基酸序列，任选地具有对应于Tencon(SEQ ID NO：1)中的取代L17A、N46V和E86I的取代。

本发明的另一个实施例是特异性地结合c-Met并阻碍HGF与c-Met的结合的分离的FN3结构域，其包含SEQ ID NO：32-49或111-114中示出的氨基酸序列，任选地具有对应于Tencon(SEQ ID NO：1)中的取代L17A、N46V和E86I的取代。

蛋白质稳定性和蛋白质易变性的测量可视为蛋白质完整性的相同或不同方面。蛋白质对由热、由紫外线或电离辐射、环境同渗容摩和pH(如果在液体溶液中)的变化、由小孔径过滤施加的机械剪切力、紫外线辐射、电离辐射(诸如由γ辐射)、化学或热脱水或任何其他可造成蛋白质结构破坏的作用或力引起的变性敏感或“易变”。可使用标准方法测定分子的稳定性。例如，可通过使用标准方法测量热熔融(“TM”)温度，即一半的分子变为解折叠的以摄氏度(℃)表示的温度来测定分子的稳定性。通常，TM越高，分子越稳定。除了热之外，化学环境也改变蛋白质的稳定性以维持特定的三维结构。

在一个实施例中，由TM的增加所测得，与工程改造之前的相同结构域相比，本发明的结合EGFR或c-Met的FN3结构域表现出稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。

化学变性同样可通过多种方法测量。化学变性剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、脲、丙酮、有机溶剂(DMF、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)、还原剂(例如，二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基硫苯和氢化物，诸如硼氢化钠)、非离子型和离子型去污剂、酸(例如，盐酸(HCl)、乙酸(CH₃COOH)、卤代乙酸)、疏水性分子(例如，磷脂)和靶向变性剂。变性程度的定量可依赖于功能特性的丧失，诸如结合靶分子的能力，或通过物理化学特性定量，诸如聚集的趋势、先前溶剂不可及的残基的暴露或者二硫键的破坏或形成。

在一个实施例中，如通过使用盐酸胍作为化学变性剂所测得，与工程改造之前的相同支架相比，本发明的结合EGFR或c-Met的FN3结构域表现出至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多的增加的稳定性。使用熟知的方法，在用增加浓度的盐酸胍处理后，增加的稳定性可被测量为降低的色氨酸荧光的函数。

本发明的FN3结构域可以单体、二聚体或多聚体，例如作为增加化合价和因此靶分子结合的亲和力的方式，或作为产生同时结合两种或多种不同的靶分子双特异性或多特异性支架的方式生成。二聚体和多聚体可由例如通过纳入氨基酸接头如含有聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸和脯氨酸的接头而连接单特异性、双特异性或多特异性蛋白质支架来生成。示例性接头包括(GS)₂(SEQ ID NO：78)接头、(GGGGS)₅(SEQ ID NO：79)接头、(AP)₂(SEQ ID NO：80)接头、(AP)₅(SEQ ID NO：81)接头、(AP)₁₀(SEQ ID NO：82)接头、(AP)₂₀(SEQID NO：83)接头、A(EAAAK)₅AAA(SEQ ID NO：84)接头。二聚体和多聚体可沿N-方向至C-方向彼此连接。使用天然存在的以及人工肽接头将多肽连接成新型连接的融合多肽在文献中是熟知的(Hallewell等人，J Biol Chem 264，5260-5268，1989；Alfthan等人，ProteinEng.8，725-731，1995；Robinson和Sauer，Biochemistry 35，109-116，1996；美国专利5,856,456)。

双特异性EGFR/c/Met结合分子

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子在与小分子EGFR抑制剂相比时可提供在特异性方面的益处以及减小的脱靶毒性，并且在与常规抗体治疗相比时可提供改善的组织穿透性。本发明至少部分地基于令人惊奇的发现，本发明的包含EGFR/c-MetFN3结构域的双特异性分子在与EGFR-结合FN3结构域和c-Met-结合FN3结构域的混合物相比时提供显著改善的协同抑制作用。分子可被设计为对EGFR和c-Met两者具有特定亲和力以使肿瘤渗透和保持最大化。

本发明的一个实施例是分离的包含FN3结构域的双特异性分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)结构域和第二FN3结构域，其中第一FN3结构域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，并且第二FN3结构域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子可通过直接或经由接头共价连接本发明的任何EGFR-结合FN3结构域与任何c-Met-结合FN3结构域而生成。因此，双特异性分子的第一FN3结构域可具有如上针对EGFR-结合FN3结构域所述的特性，并且双特异性分子的第二FN3结构域可具有如上针对c-Met-结合FN3结构域所述的特性。

在一个实施例中，当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，包含EGFR/c-MetFN3结构域的双特异性分子的第一FN3结构域以小于约2.5×10^-6M的IC₅₀值抑制在EGFR残基酪氨酸1173处EGF诱导的EGFR磷酸化；并且当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的第二FN3结构域以小于约1.5×10^-6M的IC₅₀值抑制在c-Met残基酪氨酸1349处HGF诱导的c-Met磷酸化。

在另一个实施例中，当在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，包含EGFR/c-MetFN3结构域的双特异性分子的第一FN3结构域以介于约1.8×10^-8M至约2.5×10^-6M之间的IC₅₀值抑制在EGFR残基酪氨酸1173处EGF诱导的EGFR磷酸化；并且当在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的第二FN3结构域以介于约4×10^-9M至约1.5×10^-6M之间的IC₅₀值抑制在c-Met残基酪氨酸1349处HGF诱导的c-Met磷酸化。

在另一个实施例中，包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的第一FN3结构域以小于约1×10^-8M的解离常数(K_D)结合人EGFR，并且包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的第二FN3结构域以小于约5×10^-8M的K_D结合人c-Met。

在结合EGFR和c-Met两者的双特异性分子中，第一FN3结构域以介于约2×10^-10至约1×10^-8M之间的K_D结合人EGFR，并且第二FN3结构域以介于约3×10^-10至约5×10^-8M之间的K_D结合人c-Met。

双特异性EGFR/c-Met分子对于EGFR和c-Met的亲和力可如上针对单特异性分子所述来测定。

在测定中，本发明的双特异性EGFR/c-Met分子中的第一FN3结构域可以介于约1×10^-9M至约1.5×10^-7M之间的IC₅₀值阻碍EGF结合EGFR，该测定采用A431细胞，并且使用链霉亲和素-藻红蛋白缀合物在存在或不存在第一FN3结构域的情况下培养的A431细胞上于600nM处检测来自结合的生物素酰化EGF的荧光量。与在不存在第一FN3结构域的情况下使用相同测定条件的EGF与EGFR的结合相比时，本发明的双特异性EGFR/c-Met分子中的第一FN3结构域可对EGF结合EGFR阻碍至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

在测定中，本发明的双特异性EGFR/c-Met分子中的第二FN3结构域可以介于约2×10^-10M至约6×10^-8M之间的IC₅₀值阻碍HGF结合c-Met，该测定在第二FN3结构域的存在下检测对生物素酰化HGF与c-Met-Fc融合蛋白的结合的抑制。与在不存在第二FN3结构域的情况下使用相同测定条件的HGF与c-Met的结合相比时，双特异性EGFR/c-Met分子中的第二FN3结构域可对HGF结合c-Met阻碍至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

与在不存在本发明的双特异性EGFR/c-Met分子的情况下使用相同测定条件的信号传导水平相比时，本发明的双特异性EGFR/c-Met分子可抑制EGFR和/或c-Met信号传导至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。

EGFR和c-Met信号传导可使用如上针对单特异性分子所述的各种熟知方法来测量。

与通过第一FN3结构域和第二FN3结构域的混合物观察到的协同抑制相比时，本发明的包含特异性地结合EGFR的第一FN3结构域和特异性地结合c-Met的第二FN3结构域的双特异性EGFR/c-Met分子提供了对EGFR和c-Met信号传导与肿瘤细胞增殖的显著增加的协同抑制。协同抑制可例如通过测量通过包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子以及通过两个单特异性分子(一个结合EGFR，另一个结合c-Met)的混合物的ERK磷酸化抑制来评估。与两个单特异性FN3结构域的混合物的IC₅₀值相比时，本发明的双特异性EGFR/c-Met分子可以小至少约100倍，例如小至少500、1000、5000或10,000倍的IC₅₀值抑制ERK磷酸化，表明与两个单特异性FN3结构域的混合物相比时，对于含双特异性EGFR/c-Met FN3结构域的分子的功效增加至少100倍。示例性的含双特异性EGFR-c-Met FN3结构域的分子可以约5×10^-9M或更小的IC₅₀值抑制ERK磷酸化。ERK磷酸化可使用标准方法以及本文所述的方法来测量。

与用第一FN3结构域和第二FN3结构域的混合物抑制H292细胞生长的IC₅₀值相比时，本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子可以比其小至少30倍的IC₅₀值抑制H292细胞增殖，其中细胞增殖用含有补充7.5ng/mL HGF的10％FBS的培养基来诱导。与使用第一FN3结构域和第二FN3结构域的混合物抑制肿瘤细胞增殖的IC₅₀值相比时，本发明的双特异性分子可以小约30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800或约1000倍的IC₅₀值抑制肿瘤细胞增殖。肿瘤细胞增殖的抑制可使用标准方法以及本文所述的方法来测量。

本发明的另一个实施例是包含FN3结构域的双特异性分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)结构域和第二FN3结构域，其中第一FN3结构域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，并且第二FN3结构域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合，其中

第一FN3结构域包含

FG环，该FG环包含序列HNVYKDTNX₉RGL(SEQ ID NO：179)或序列LGSYVFEHDVML(SEQID NO：180)，其中X₉为M或I；并且BC环，该BC环包含序列X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：181)，其中

X₁为A、T、G或D；

X₂为A、D、Y或W；

X₃为P、D或N；

X₄为L或不存在；

X₅为D、H、R、G、Y或W；

X₆为G、D或A；

X₇为A、F、G、H或D；并且

X₈为Y、F或L；并且

第二FN3结构域包含

X₁₀为W、F或V；

X₁₁为D、F或L；

X₁₂为V、F或L；

X₁₃为V、L或T；

X₁₄为V、R、G、L、T或S；

X₁₅为G、S、A、T或K；并且

X₁₆为E或D；以及

X₁₇为Y、W、I、V、G或A；

X₁₈为N、T、Q或G；

X₁₉为L、M、N或I；

X₂₀为G或S；

X₂₁为S、L、G、Y、T、R、H或K；

X₂₂为I、V或L；并且

X₂₃为V、T、H、I、P、Y、T或L。

在另一个实施例中，双特异性分子包含结合EGFR的第一FN3结构域，其包含序列：

其中在SEQ ID NO：X和X中，

X₁为A、T、G或D；

X₂为A、D、Y或W；

X₃为P、D或N；

X₄为L或不存在；

X₅为D、H、R、G、Y或W；

X₆为G、D或A；

X₇为A、F、G、H或D；

X₈为Y、F或L；并且

X₉为M或I。

在另一个实施例中，双特异性分子包含结合c-Met的第二FN3结构域，其包含序列：

LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁₀IRYX₁₁EX₁₂X₁₃X₁₄X₁₅GX₁₆AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX₁₇VX₁₈IX₁₉X₂₀VKGGX₂₁X₂₂SX₂₃PLSAEFTT(SEQ ID NO：186)，

其中

X₁₀为W、F或V；并且

X₁₁为D、F或L；

X₁₂为V、F或L；

X₁₃为V、L或T；

X₁₄为V、R、G、L、T或S；

X₁₅为G、S、A、T或K；

X₁₆为E或D；

X₁₇为Y、W、I、V、G或A；

X₁₈为N、T、Q或G；

X₁₉为L、M、N或I；

X₂₀为G或S；

X₂₁为S、L、G、Y、T、R、H或K；

X₂₂为I、V或L；并且

X₂₃为V、T、H、I、P、Y、T或L。

示例性的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子包含SEQ ID NO：50-72、106、118-121或138-165中示出的氨基酸序列。

本发明的双特异性EGFR/c-Met分子包含与其功能特性相关联的某些结构特性，诸如EGFR自磷酸化的抑制，诸如第一FN3结构域的FG环，该第一FN3结构域结合EGFR，所述EGFR包含序列HNVYKDTNX₉RGL(SEQ ID NO：179)或序列LGSYVFEHDVML(SEQ ID NO：180)，其中X₉为M或I。

在一个实施例中，本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子

在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，以小于约8×10^-7M的IC₅₀值抑制在EGFR残基酪氨酸1173处EGF诱导的EGFR磷酸化；

在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，以小于约8.4×10^-7M的IC₅₀值抑制在c-Met残基酪氨酸1349处HGF诱导的c-Met磷酸化；

以小于约9.5×10^-6M的IC₅₀值抑制由HGF诱导的NCI-H292细胞增殖，其中细胞增殖用含有7.5ng HGF的10％FBS诱导；

以小于约2.0×10^-8M的K_D结合EGFR；

以小于约2.0×10^-8M的K_D结合c-Met。

在A431细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，以介于约4.2×10^-9M和8×10^-7M之间的IC₅₀值抑制在EGFR残基酪氨酸1173处EGF诱导的EGFR磷酸化；

在NCI-H441细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，以介于约2.4×10^-8M至约8.4×10^-7M之间的IC₅₀值抑制在c-Met残基酪氨酸1349处HGF诱导的c-Met磷酸化；

以介于约2.3×10^-8M至约9.5×10^-6M之间的IC₅₀值抑制由HGF诱导的NCI-H292细胞增殖，其中细胞增殖用含有7.5ng HGF的10％FBS诱导；

以介于约2×10^-10M至约2.0×10^-8M之间的K_D结合EGFR；

以介于约1×10^-9M至约2.0×10^-8M之间的K_D结合c-Met；

在一个实施例中，双特异性EGFR/c-Met分子包含EGFR-结合FN3结构域，其包含序列

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGV HNVYKDTNX₉RGLPLSAEFTT(SEQ ID NO：182)，其中

X₁为D；

X₂为D；

X₃为P；

X₄不存在；

X₅为H或W；

X₆为A；

X₇为F；

X₈为Y；并且

X₉为M或I；以及

c-Met-结合FN3结构域，其包含序列

PAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFX₁₀IRYX₁₁EX₁₂X₁₃X₁₄X₁₅GX₁₆AIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYX₁₇VX₁₈IX₁₉X₂₀VKGGX₂₁X₂₂SX₂₃PLSAEFTT(SEQ IDNO：186)，

其中

X₁₀为W；

X₁₁为F；

X₁₂为F；

X₁₃为V或L；

X₁₄为G或S；

X₁₅为S或K；

X₁₆为E或D；

X₁₇为V；

X₁₈为N；

X₁₉为L或M；

X₂₀为G或S；

X₂₁为S或K；

X₂₂为I；并且

X₂₃为P。

示例性双特异性EGFR/c-Met分子为具有SEQ ID NO：57、61、62、63、64、65、66、67和68中示出的序列的那些分子。

本发明的双特异性分子还可包含在第一FN3结构域和/或第二FN3结构域中的对应于如上所述的Tencon(SEQ ID NO：1)中的11、14、17、37、46、73和86的一个或多个残基位置处的取代，以及第29位处的取代。示例性取代为取代E11N、E14P、L17A、E37P、N46V、G73Y、E86I和D29E(根据SEQ ID NO：1进行编号)。本领域的技术人员将认识到，其他氨基酸可用于取代，诸如在与其侧链相关的氨基酸家族内的氨基酸，如下文所述。所生成的变体可使用本文的方法对其稳定性以及与EGFR和/或c-Met的结合进行测试。

在一个实施例中，包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子包含特异性地结合EGFR的第一FN3结构域以及特异性地结合c-Met的第二FN3结构域，其中第一FN3结构域包含序列：

LPAPKNLVVSX₂₄VTX₂₅DSX₂₆RLSWDDPX₂₇AFYX₂₈SFLIQYQX₂₉SEKVGEAIX₃₀LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYX₃₁VHNVYKDTNX₃₂RGLPLSAX₃₃FTT(SEQ ID NO：187)，其中

X₂₄为E、N或R；

X₂₅为E或P；

X₂₆为L或A；

X₂₇为H或W；

X₂₈为E或D；

X₂₉为E或P；

X₃₀为N或V；

X₃₁为G或Y；

X₃₂为M或I；并且

X₃₃为E或I；

并且第二FN3结构域包含序列：

LPAPKNLVVSX₃₄VTX₃₅DSX₃₆RLSWTAPDAAFDSFWIRYFX₃₇FX₃₈X₃₉X₄₀GX₄₁AIX₄₂LTVPGSERSYDLTGLKPGTEYVVNIX₄₃X₄₄VKGGX₄₅ISPPLSAX₄₆FTT(SEQ ID NO：188)；其中

X₃₄为E、N或R；

X₃₅为E或P；

X₃₆为L或A；

X₃₇为E或P；

X₃₈为V或L；

X₃₉为G或S；

X₄₀为S或K；

X₄₁为E或D；

X₄₂为N或V；

X₄₃为L或M；

X₄₄为G或S；

X₄₅为S或K；并且

X₄₆为E或I。

在其他实施例中，包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子包含第一FN3结构域，该第一FN3结构域包含与SEQ ID NO：27的氨基酸序列至少87％相同的氨基酸序列；以及第二FN3结构域，该第二FN3结构域包含与SEQ ID NO：41的氨基酸序列至少83％相同的氨基酸序列。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子可被设计为对EGFR和c-Met具有特定亲和力以使肿瘤积聚最大化。

本发明的另一个实施例是含有分离的双特异性FN3结构域的分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)结构域和第二FN3结构域，其中第一FN3结构域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，并且第二FN3结构域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合，其中第一FN3结构域和第二FN3结构域从基于SEQ ID NO：1的Tencon序列设计的文库分离。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子可通过使用熟知的方法共价偶联EGFR-结合FN3结构域和c-Met结合FN3结构域而生成。FN3结构域可通过接头连接，例如包含聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸、或丙氨酸和脯氨酸的接头。示例性接头包括(GS)₂(SEQID NO：78)接头、(GGGGS)₅(SEQ ID NO：79)接头、(AP)₂(SEQ ID NO：80)接头、(AP)₅(SEQ IDNO：81)接头、(AP)₁₀(SEQ ID NO：82)接头、(AP)₂₀(SEQ ID NO：83)接头、A(EAAAK)₅AAA(SEQID NO：84)接头。使用天然存在的以及人工肽接头将多肽连接成新型连接的融合多肽在文献中为熟知的(Hallewell等人，J Biol Chem 264，5260-5268，1989；Alfthan等人，ProteinEng.8，725-731，1995；Robinson和Sauer，Biochemistry 35，109-116，1996；美国专利5,856,456)。本发明的双特异性EGFR/c-Met分子可从第一FN3结构域的C-端到第二FN3结构域的N-端，或从第二FN3结构域的C-端到第一FN3结构域的N-端连接在一起。任何EGFR-结合FN3结构域可共价连接到c-Met-结合FN3结构域。示例性EGFR-结合FN3结构域为具有SEQ IDNO：18-29、107-110和122-137中示出的氨基酸序列的结构域，并且示例性c-Met结合FN3结构域为具有SEQ ID NO：32-49和111-114中示出的氨基酸序列的结构域。偶联到双特异性分子的EGFR-结合FN3结构域可在其N-端处额外包含起始甲硫氨酸(Met)。

包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的变体在本发明的范围内。例如，取代可在包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子中进行，只要所得变体在与亲本分子相比时保持对EGFR和c-Met的相似选择性和功效。示例性修饰为例如保守取代，其将导致变体具有与亲本分子的那些变体相似的特性。保守置换是在其侧链中相关的氨基酸家族内发生的那些。基因编码的氨基酸可被分为四类：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)；(3)非极性(丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)；以及(4)非荷电极性(甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)。苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸有时被共同分类为芳族氨基酸。另选地，氨基酸所有组成成分可以分组为：(1)酸性(天冬氨酸、谷氨酸)；(2)碱性(赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、(3)脂族的(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸)，其中丝氨酸和苏氨酸任选地分别分组为含羟基脂族的；(4)芳族(苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸)；(5)酰胺(天冬酰胺、谷氨酰胺)；和(6)含硫(半胱氨酸和甲硫氨酸)(Stryer(编辑)，Biochemistry，第2版，WHFreeman and Co.，1981)。可对包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子进行非保守取代，这涉及取代不同种类的氨基酸之间的氨基酸残基以改善双特异性分子的特性。可以使用本文描述的测定通过评估修饰的多肽或片段以类似于未经修饰的多肽或片段的方式产生应答的能力，容易地测定多肽或其片段的氨基酸序列中的变化是否导致功能同系物。其中已发生超过一个置换的肽、多肽或蛋白质可以容易地以相同方式进行测试。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子可以二聚体或多聚体，例如作为增加化合价，因此增加靶分子结合的亲和力的方式生成。多聚体可通过使用熟知的方法连接一个或多个EGFR-结合FN3结构域和一个或多个c-Met-结合FN3结构域(例如通过包含氨基酸接头)而生成，以形成包含至少三个单独FN3结构域的分子，所述单独FN3结构域对于EGFR或c-Met为至少双特异性的。

本发明的另一个实施例是包含FN3结构域的双特异性分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)结构域和第二FN3结构域，其中第一FN3结构域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，并且第二FN3结构域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合，其包含SEQ ID NO：50-72或106中示出的氨基酸序列。

半衰期延长部分

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子或单特异性EGFR或c-Met结合FN3结构域可例如通过共价相互作用结合其他亚基。在本发明的一个方面，本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子还包含半衰期延长部分。示例性半衰期延长部分为白蛋白、白蛋白-结合蛋白和/或结构域、转铁蛋白及其片段和类似物，以及Fc区结构域。示例性白蛋白-结合结构域示于SEQ ID NO：117中。

抗体恒定区结构域的全部或一部分可被附接到本发明的分子以赋予抗体样特性，特别是与Fc区域相关联的那些特性，诸如Fc效应子功能诸如Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调，并且可通过对负责这些活性的Fc中的残基进行修饰来进一步修饰(用于综述；参见Strohl，Curr Opin Biotechnol.20，685-691，2009)。

另外的部分可结合到本发明的双特异性分子中，诸如用于期望特性的聚乙二醇(PEG)分子，如PEG5000或PEG20,000；不同链长的脂肪酸和脂肪酸酯，如月桂酸酯、肉豆蔻酸酯、硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、糖类(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。这些部分可与蛋白质支架编码序列直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术产生。另选地，熟知的化学偶联方法可用于将这些部分附接到本发明的重组制备分子。

可通过使用熟知的方法将半胱氨酸残基结合到分子的C-端并将pegyl基团附接到半胱氨酸来将pegyl部分例如添加到本发明的双特异性或单特异性分子。具有C-端半胱氨酸的示例性双特异性分子为具有SEQ IN NO：170-178中示出的氨基酸序列的那些分子。

可通过多种熟知的测定法比较并入另外部分的本发明的单特异性和双特异性分子的官能度。例如，由于并入Fc结构域和/或Fc结构域变体而导致的改变的单特异性和/或双特异性分子的特性可在Fc受体结合测定中使用该受体的可溶形式来测定，该受体的可溶形式诸如FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn受体，或使用熟知的测量例如ADCC或CDC的基于细胞的测定，或在体内模型中评估本发明的分子的药代动力学特性。

多核苷酸、载体、宿主细胞

本发明以分离的多核苷酸或表达载体的部分或线性DNA序列的部分的形式提供编码本发明的EGFR-结合或c-Met结合FN3结构域或包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的核酸，包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列、与原核、真核或丝状噬菌体表达、组合物或其定向诱变剂的分泌和/或展示相容的载体。本文公开了某些示例性的多核苷酸，然而也可由在给定的表达系统中给定遗传密码的简并性或密码子偏好的多核苷酸编码蛋白质支架，并且本发明的蛋白质支架的文库也在本发明的范围内。

本发明的一个实施例为编码特异性地结合EGFR的FN3结构域的分离的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：18-29、107-110或122-137的氨基酸序列。

本发明的一个实施例为分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：97-98或168-169的多核苷酸序列。

本发明的一个实施例为编码特异性地结合c-Met的FN3结构域的分离的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：32-49或111-114中示出的序列的氨基酸序列。

本发明的一个实施例为编码包含EGFR/-c-Met FN3结构域的双特异性分子的分离的多核苷酸，其具有SEQ ID NO：50-72、106、118-121或138-165的氨基酸序列。

本发明的一个实施例为分离的多核苷酸，其包含SEQ ID NO：115-116或166-167的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以通过化学合成(诸如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成)来生产，并装配成完整的单链或双链分子。另选地，本发明的多核苷酸可以通过其他技术来制备，诸如PCR之后进行常规克隆。制备或获得具有给定的已知序列的多核苷酸的技术是本领域熟知的。

本发明的多核苷酸可包含至少一个非编码序列，诸如启动子或增强子序列、内含子、聚腺苷酸化信号、促进RepA结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可包含编码另外的氨基酸的另外的序列，其编码例如标记或标签序列诸如组氨酸标签或HA标签以促进蛋白质的纯化或检测、信号序列、融合蛋白配偶体诸如RepA、Fc或噬菌体外壳蛋白诸如pIX或pIII。

本发明的另一个实施例是包含至少一种本发明的多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或任何其他适于通过任何方式将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的载体。此类载体可以是包含可控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达的核酸序列元件的表达载体。此类元件可包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及有利于编码的多肽在给定表达系统中的表达的其他位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。

本发明的另一个实施例是包含本发明载体的宿主细胞。如本领域所熟知，本发明的单特异性EGFR-结合或c-Met结合FN3结构域或包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子可任选地由细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆群产生。参见例如Ausubel等人编辑，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley父子，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley父子，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，Current Protocols in ProteinScience，John Wiley父子，NY，NY，(1997-2001)。

选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物起源的或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、He G2、SP2/0、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生物、无限增殖化细胞或转化的细胞。另选地，宿主细胞可选自不能够使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，诸如BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)，以及任何天然或改造的大肠杆菌属(E.coli spp)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)或假单胞菌属(Pseudomonas spp)菌株。

本发明的另一个实施例是产生本发明的特异性地结合EGFR或c-Met的分离的FN3结构域或本发明的分离的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的方法，该方法包括在使得特异性地结合EGFR或c-Met的分离的FN3结构域或分离的包含EGFR-c-Met FN3结构域的双特异性分子得以表达的条件下培养本发明的分离的宿主细胞，以及纯化结构域或分子。

本发明的特异性地结合EGFR或c-Met的FN3结构域或分离的包含EGFR/c-Met FN3结构域的特异性分子可通过熟知的方法从重组细胞培养物纯化，例如通过蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸萃取、阴离子或阳离子交换色谱法、磷酸纤维素色谱法、疏水作用色谱法、亲和色谱法、羟基磷灰石色谱法和凝集素色谱法、或高效液相色谱法(HPLC)。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子和EGFR-结合或c-Met结合 FN3结构域的用途

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR结合FN3结构域或c-Met结合FN3结构域可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防人类疾病或细胞、组织、器官、体液或(一般来讲)宿主中的特定病理学疾病的发生，或减少人类疾病或细胞、组织、器官、体液或(一般来讲)宿主中的特定病理学疾病的症状。本发明的方法可用于治疗属于任何分类的动物患者。此类动物的示例包括哺乳动物，诸如人、啮齿动物、犬类、猫类和农畜。

本发明的一个方面是用于抑制表达EGFR和/或c-Met的细胞的生长或增殖的方法，该方法包括将细胞与本发明的分离的包含EGFR/c-Met FN3结构域的特异性分子、EGFR结合FN3结构域或c-Met结合FN3结构域接触。

本发明的另一个方面是用于抑制受试者体内的EGFR和/或c-Met表达肿瘤或癌细胞的生长或转移的方法，该方法包括向受试者施用有效量的本发明的分离的包含EGFR/c-Met FN3结构域的特异性分子、EGFR结合FN3结构域或c-Met结合FN3结构域，使得EGFR和/或c-Met表达肿瘤或癌细胞的生长或转移得以抑制。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR结合FN3结构域或c-Met结合FN3结构域可用于治疗特征在于EGFR、c-Met、EGF或其他EGFR配体或HGF的异常活化或产生的任何疾病或障碍，或与EGFR或c-Met表达相关的障碍，所述疾病或障碍可以涉及或可以不涉及恶性肿瘤或癌症，其中EGFR、c-Met、EGF或其他EGFR配体、或HGF的异常活化和/或产生在患有或易患该疾病或障碍的受试者的细胞或组织中发生。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子可用于治疗肿瘤，包括癌症和良性肿瘤。适于用本发明的双特异性分子治疗的癌症包括过表达EGFR和/或c-Met的那些癌症。适于用本发明的双特异性分子治疗的示例性癌症包括上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌、胃癌、胸腺癌、结肠癌、甲状腺癌、肝癌、或散发性或遗传性乳头状肾细胞癌(PRCC)。

本发明的特异性结合c-Met并阻碍HGF与c-Met的结合的FN3结构域可用于治疗肿瘤，包括癌症和良性肿瘤。适于用本发明的c-Met结合FN3结构域治疗的癌症包括过表达c-Met的那些癌症。适于用本发明的FN3结构域治疗的示例性癌症包括上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌和胸腺癌。

本发明的特异性地结合EGFR并阻碍EGF与EGFR的结合的FN3结构域可用于治疗肿瘤，包括癌症和良性肿瘤。适于用本发明的FN3结构域治疗的癌症包括过表达EGFR或变体的那些癌症。适于用本发明的FN3结构域治疗的示例性癌症包括上皮细胞癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结直肠癌、肛门癌、前列腺癌、肾癌、膀胱癌、头颈癌、卵巢癌、胰腺癌、皮肤癌、口腔癌、食道癌、阴道癌、宫颈癌、脾癌、睾丸癌和胸腺癌。

施用/药物组合物

对于治疗用途，可将本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR-结合FN3结构域或c-Met-结合FN3结构域制备为药物组合物，该药物组合物包含有效量的结构域或分子作为可药用载体中的活性成分。术语“载体(carrier)”是指据以施用该活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或载体(vehicle)。此类载体可以是液体，诸如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可使用0.4％生理盐溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，并且通常不含颗粒物。它们可通过熟知的常规灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可根据需要含有可药用辅助物质，以接近生理条件，诸如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。此类药物制剂中的本发明的分子的浓度可广泛改变，即小于约0.5％，通常为或至少约1％至多达15重量％或20重量％，且将根据所选择的具体施用方式，主要基于所需剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其他人蛋白如人血清白蛋白在内的合适的载体和制剂在例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版，Troy，D.B.编辑，LipincottWilliams and Wilkins，Philadelphia，PA 2006，第5部分，PharmaceuticalManufacturing，第691-1092页中有所描述，特别参见第958-989页。

用于本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR结合FN3结构域或c-Met结合FN3结构域的治疗用途的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适途径，诸如胃肠外施用，例如，真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用在片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒中的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中的制剂；或技术人员理解、本领域中熟知的其他方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：胃肠外、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。

因此，本发明的用于肌内注射的药物组合物可经制备以包含1mL无菌缓冲水，以及介于约1ng至约100mg之间的本发明的FN3结构域，例如约50ng至约30mg，或更优选地约5mg至约25mg。类似地，本发明的用于静脉内输注的药物组合物可制成为含有约250mL无菌林格氏溶液，以及约1mg至约30mg、例如约5mg至约25mg的本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR结合FN3结构域或c-Met结合FN3结构域。用于制备非肠道施用的组合物的实际方法是众所周知的，并且在例如“Remington′s Pharmaceutical Science”，第15版，Mack Publishing Company，Easton，PA中进行了更详细的描述。

本发明的包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR-结合FN3结构域或c-Met-结合FN3结构域可被冻干储存，并且在使用前在合适的载体中重构。此项技术已被证实对常规的蛋白制剂有效，并且可采用本领域已知的冻干和重构技术。

可向受试者以单次剂量施用包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR-结合FN3结构域或c-Met-结合FN3结构域，或者可以例如在一天、两天、三天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月或三个月之后重复施用。重复施用可为相同剂量或不同剂量。施用可重复一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或更多次。

包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR-结合FN3结构域或c-Met-结合FN3结构域可结合第二治疗剂同时、依次或单独地施用。第二治疗剂可为化疗剂、抗血管生成剂或细胞毒性药物。在用于治疗癌症时，包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子、EGFR-结合FN3结构域或c-Met-结合FN3结构域可与常规癌症疗法结合使用，所述常规癌症疗法诸如手术、放射疗法、化学疗法或它们的组合。可与本发明的FN3结构域结合使用的示例性试剂为HER2、HER3、HER4、VEGF的拮抗剂，以及蛋白质酪氨酸激酶抑制剂，诸如(吉非替尼)和Tarceva(埃罗替尼)。

虽然已概括地描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中进一步公开，所述实例不应理解为限制权利要求的范围。

实例1：Tencon文库的构建

Tencon(SEQ ID NO：1)是由来自人腱生蛋白-C的十五个FN3结构域的共有序列设计的免疫球蛋白样支架III型纤连蛋白(FN3)结构域(Jacobs等人，Protein Engineering，Design，and Selection，25：107-117，2012；美国专利公布2010/0216708)。Tencon的晶体结构示出连接七个β-链的六个表面暴露环。这些环或每个环内所选择的残基可随机化，以便构建可用于选择结合特异性靶标的新型分子的III型纤连蛋白(FN3)结构域文库。

Tencon：

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT(SEQ ID NO 1)：

TCL1文库的构建

被设计为仅使Tencon(SEQ ID NO：1)的FG环随机化的文库TCL1被构建用于与顺式-展示系统一起使用(Jacobs等人，Protein Engineering，Design，and Selection，25：107-117，2012)。在该系统中，制备单链DNA，该单链DNA包含用于Tac启动子的序列、Tencon文库编码序列、RepA编码序列、顺式元件和ori元件。在体外转录/翻译系统中表达时，产生顺式结合到DNA的Tencon-RepA融合蛋白复合物，其被该DNA编码。然后分离结合到靶分子的复合物，并通过聚合酶链反应(PCR)进行扩增，如下所述。

用于与顺式展示一起使用的TCL1文库的构建通过连续多轮PCR来实现以制备两半的最终线性双链DNA分子；5’片段包含启动子和Tencon序列，而3’片段包含repA基因以及顺式元件和ori元件。这两半通过限制酶切消化来结合以便产生整个构建体。TCL1文库被设计为仅在Tencon，KGGHRSN(SEQ ID NO：86)的FG环中并入随机氨基酸。NNS密码子用于该文库的构建，从而导致可能将全部20个氨基酸以及一个终止密码子并入FG环中。TCL1文库包含六个单独的子文库，每个具有不同的随机化FG环长度(7至12个残基)，以便进一步增加多样性。基于tencon的文库的设计示于表2中。

表2：

*TAPDAAFD：SEQ ID NO：1的残基22-28；

**KGGHRSN：SEQ ID NO：86

X是指由NNS密码子编码的简并氨基酸。

#是指文本中描述的“氨基酸的设计分布”。

为了构建TCL1文库，执行连续多轮PCR以附加Tac启动子，将简并性构建到F：G环中，并添加必要的限制性酶切位点以进行最终组装。首先，通过PCR以两个步骤生成包含FG环的启动子序列和Tencon序列5’的DNA序列。对应于全Tencon基因序列的DNA用作具有引物POP2220(SEQID NO：2)以及TC5’至FG(SEQID NO：3)的PCR模板。来自该反应的所得PCR产物用作模板以用于利用引物130mer(SEQID NO：4)和Tc5’至FG的下一轮PCR扩增，以完成将5’和启动子序列附加到Tencon。接下来，通过以下所述将多样性引入到F：G环中：扩增在第一步骤中用正向引物POP2222(SEQ ID NO：5)、反向引物TCF7(SEQ ID NO：6)、TCF8(SEQ IDNO：7)、TCF9(SEQ ID NO：8)、TCF10(SEQ ID NO：9)、TCF11(SEQ ID N NO：10)、或TCF12(SEQID NO：11)制备的DNA产物，其包含简并核苷酸。对于每个子文库执行至少八次100μL PCR反应以使PCR循环最小化并且使文库的多样性最大化。该PCR产物中的至少5μg被凝胶纯化并且与引物POP2222(SEQ ID NO：5)和POP2234(SEQ ID NO：12)一起用于随后的PCR步骤中，从而导致将6xHis标签和NotI限制性酶切位点附接到Tencon序列的3’端。该PCR反应使用仅15个PCR循环以及至少500ng的模板DNA进行。将所得PCR产物凝胶纯化，用NotI限制性酶消化，并且通过Qiagen柱纯化。

文库的3’片段是包含用于展示的元件的恒定DNA序列，所述元件包括PspOMI限制性酶切位点、repA基因的编码区、以及顺式元件和ori元件。PCR反应使用包含该具有M13正向引物和M13反向引物的DNA片段的质粒(pCR4Blunt)(Invitrogen)来执行。所得PCR产物使用PspOMI消化过夜并进行凝胶纯化。为了将文库DNA的5’部分连接到包含repA基因的3’DNA，在NotI和PspOMI酶以及T4连接酶的存在下将2pmol的5’DNA连接到等摩尔量的3’repADNA。在37℃下过夜连接之后，将小部分的连接DNA在凝胶上运行以检查连接效率。将连接的文库产物分成12个PCR扩增，并且用引物对POP2250(SEQ ID NO：13)和DidLigRev(SEQ IDNO：14)运行12次循环PCR反应。TCL1文库的每个子文库的DNA产率在32-34μg的范围内。

为了评估文库的质量，将小部分的工作文库用引物Tcon5new2(SEQ ID NO：15)和Tcon6(SEQ ID NO：16)扩增，并且通过连接酶非依赖性克隆将其克隆到经修饰的pET载体中。将质粒DNA转化到BL21-GOLD(DE3)感受态细胞(Stratagene)中，并使用T7启动子引物对96个随机挑取的菌落进行测序。未发现重复序列。总而言之，大约70％-85％的克隆具有完整启动子和未发生移码突变的Tencon编码序列。功能序列速率介于59％和80％之间，其排除带有终止密码子的克隆。

TCL2文库的构建

构建TCL2文库，其中将Tencon的BC和FG环随机化，并且严格控制每个位置处的氨基酸分布。表3示出在TCL2文库中的所需环位置处的氨基酸分布。所设计的氨基酸分布具有两个目标。首先，文库朝向残基偏置，基于Tencon晶体结构的分析和/或者根据同源性建模，这些残基被预测为在结构上对于Tencon折叠和稳定性很重要。例如，第29位被固定为仅仅疏水性氨基酸的亚群，因为该残基被包埋在Tencon折叠的疏水核心中。设计的第二层包括使氨基酸分布偏压，该偏压朝向优先存在于抗体重链HCDR3中的残基，以有效地产生高亲和力结合物(Birtalan等人，J Mol Biol 377：1518-28，2008；Olson等人，Protein Sci 16：476-84，2007)。针对该目标，表3的“设计的分布”是指如下的分布：6％丙氨酸、6％精氨酸、3.9％天冬酰胺、7.5％天冬氨酸、2.5％谷氨酸、1.5％谷氨酰胺、15％甘氨酸、2.3％组氨酸、2.5％异亮氨酸、5％亮氨酸、1.5％赖氨酸、2.5％苯丙氨酸、4％脯氨酸、10％丝氨酸、4.5％苏氨酸、4％色氨酸、17.3％酪氨酸和4％缬氨酸。该分布缺乏甲硫氨酸、半胱氨酸和终止密码子。

表3：

*残基编号基于SEQ ID NO：1的Tencon序列。

TCL2文库的5’片段包含启动子和Tencon(SEQ ID NO：1)的编码区，其被化学合成为文库池(Sloning Biotechnology)。该DNA池包含至少1×10¹¹个不同成员。在该片段的末端，BsaI限制性酶切位点包括在用于连接到RepA的设计中。

文库的3’片段是包含用于展示的元件的恒定DNA序列，所述元件包括6xHis标签、repA基因的编码区、以及顺式元件。通过PCR反应使用现有的DNA模板(上述)、以及引物LS1008(SEQ ID NO：17)和DidLigRev(SEQ ID NO：14)来制备DNA。为了组装完整的TCL2文库，将总共1μg的BsaI-消化5’Tencon文库DNA连接到通过用相同酶的限制酶切消化制备的3’片段。过夜连接之后，通过Qiagen柱纯化DNA，并通过测量260nm处的吸光度来定量DNA。通过12次循环PCR反应用引物对POP2250(SEQ ID NO：13)和DidLigRev(SEQ ID NO：14)来扩增所连接的文库产物。总共进行72次反应，每次包含50ng的连接DNA产物作为模板。TCL2工作文库DNA的总产率为约100μg。对小部分的工作文库进行亚克隆和测序，如上文针对文库TCL1所述。未发现重复序列。约80％的序列包含完整启动子和未发生移码突变的Tencon编码序列。

TCL14文库的构建

顶部(BC、DE和FG)和底部(AB、CD和EF)环，例如FN3结构域中报道的结合表面被形成FN3结构中心的β-链分隔。驻留在具有与仅由环形成的表面不同形状的FN3结构域的两个“侧面”上的可供选择的表面在FN3结构域的一个侧面上通过两个反平行β-链(Cβ-链和Fβ-链)以及CD环和FG环形成，并且在本文中称为C-CD-F-FG表面。

使Tencon的可供选择的表面随机化的文库通过随机化选择C链和F链的表面暴露残基，以及CD环和FG环的部分而生成，如图4所示。使用Tencon变体Tencon27(SEQ ID NO：99)来生成文库，该变体与Tencon(SEQ ID NO：1)相比具有以下取代：E11R L17A、N46V、E86I。用于构建该文库的方法的全部说明在美国专利申请序列号13/852,930中有所描述。

实例2：结合EGFR并抑制EGF结合的III型纤连蛋白(FN3)结构域的选择

文库筛选

顺式展示用于从TCL1和TCL2文库选择EGFR结合结构域。融合到IgG1 Fc(R&DSystems)的EGFR的重组人胞外结构域使用标准方法来进行生物素酰化，并且用于淘选(SEQID NO：73的全长EGFR的残基25-645)。对于体外转录和翻译(ITT)，将2-6μg的文库DNA用0.1mM完整氨基酸、1X S30预混组分和30μL S30提取物(Promega)在100μL的总体积中温育并且在30℃下温育。在1小时之后，添加450μL阻断溶液(PBS pH 7.4，补充有2％牛血清白蛋白、100μg/mL鲱鱼精子DNA和1mg/mL肝素)，并且将该反应物在冰上温育15分钟。通过将重组人EGF(R&D Systems)与生物素酰化重组EGFR-Fc在阻断溶液中于室温下混合1小时，而以摩尔比为1∶1和10∶1的EGFR与EGF组装EGFR-Fc：EGF复合物。对于结合，将500μL阻断的ITT反应物与100μL EGFR-Fc：EGF复合物混合并且在室温下温育1小时，之后将结合的复合物用中和亲和素磁珠或链霉抗生物素蛋白磁珠(Seradyne)拉下。通过用PBST和PBS连续洗涤来移除未结合的文库成员。在洗涤之后，通过加热到65℃并持续10分钟来从结合的复合物洗脱DNA，并将该DNA进行PCR扩增，并且通过限制酶切消化和连接来附接到编码RepA的DNA片段以用于进一步轮次的淘选。通过在每轮期间将靶EGFR-Fc的浓度从200nM连续降低到50nM以及增加洗涤严格性来分离高亲和力结合物。在第4轮和第5轮中，通过在10倍摩尔过量的非生物素酰化EGFR-Fc的存在下在PBS中洗涤过夜来移除未结合和弱结合的FN3结构域。

淘选之后，将所选择的FN3结构域通过PCR使用寡聚物Tcon5new2(SEQ ID NO：15)和Tcon6(SEQ ID NO：16)进行扩增，亚克隆到被修饰为包括连接酶非依赖性克隆位点的pET载体中，并且使用标准分子生物学技术转化成BL21-GOLD(DE3)(Stratagene)细胞以用于大肠杆菌中的可溶性表达。将编码C-端聚组氨酸标签的基因序列添加到每个FN3结构域以实现纯化和检测。在添加IPTG至1mM之前使培养物在1mL 96孔块中的补充有100μg/mL羧苄青霉素的2YT培养基中于37℃下生长至0.6-0.8的光密度，此时温度降低到30℃。在大约16小时后通过在-20℃下的离心和冷冻收获细胞。通过在振荡下将溶于0.6mL的HT裂解缓冲液(Novagen EMD Biosciences)中的每种细胞沉淀物于室温下温育45分钟来实现细胞裂解。

结合细胞上的EGFR的FN3结构域的选择

为了评估不同FN3结构域在更具生理性的环境中结合EGFR的能力，测量其结合A431细胞的能力。使A431细胞(American Type Culture Collection，产品目录号CRL-1555)过表达EGFR，其中每个细胞约2×10⁶个受体。将细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中并且使其在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下附接过夜。将FN3结构域表达细菌裂解物以1,000倍稀释到FACS染色缓冲液(Becton Dickinson)中，并且一式三份在板中于室温下温育1小时。取出裂解物，并且用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次。将细胞用在FACS染色缓冲液中1∶100稀释的抗五组氨酸-Alexa488抗体缀合物(Qiagen)以50μL/孔于室温下温育20分钟。用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次，之后在孔中填充100μL FACS染色缓冲液并在488nm处使用Acumen eX3读取器读取荧光度。对包含FN3结构域的细菌裂解物进行结合A431细胞的能力的筛选(用于TCL1和TCL2文库的1320种粗制细菌裂解物)，并且识别出516个阳性克隆，其中结合超过背景信号的≥10倍。筛选来自TCL14文库的300种裂解物以用于结合，从而产生结合EGFR的58个独特的FN3结构域序列。

抑制EGF结合细胞上的EGFR的FN3结构域的选择

为了更好地表征EGFR结合的机制，使用A431细胞测量各种识别的FN3结构域克隆以EGF竞争性方式结合EGFR的能力，并且与A431结合测定筛选并行运行。将A431细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中并且使其在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下附接过夜。用50μL/孔的1∶1,000稀释的细菌裂解物将细胞一式三份在板中于室温下温育1小时。将生物素酰化EGF(Invitrogen，产品目录号E-3477)添加到每个孔中以得到30ng/mL的最终浓度，并且在室温下温育10分钟。用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次。将细胞用在FACS染色缓冲液中1∶100稀释的链霉亲和素-藻红蛋白缀合物(Invitrogen)以50μL/孔于室温下温育20分钟。用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次，之后在孔中填充100μL FACS染色缓冲液并在600nm处使用Acumen eX3读取器读取荧光度。

通过上述EGF竞争测定法筛选包含FN3结构域的细菌裂解物。对来自TCL1和TCL2文库的1320种粗制细菌裂解物进行筛选，从而产生抑制EGF结合＞50％的451个阳性克隆。

识别的结合EGFR的FN3结构域的表达和纯化

用组氨酸MultiTrap^TM HP板(GE Healthcare)从澄清的大肠杆菌裂解物纯化组氨酸标记的FN3结构域，并且在pH 7.4的包含20mM磷酸钠、500mM氯化钠和250mM咪唑的缓冲液中洗脱。使用PD MultiTrap^TM G-25板(GE Healthcare)将纯化的样品交换到PBS(pH 7.4)中以供分析。

尺寸排阻色谱法分析

尺寸排阻色谱法用于确定结合EGFR的FN3结构域的聚集状态。将每种纯化的FN3结构域的等分试样(10μL)以0.3mL/min的流速以PBS(pH 7.4)的流动相注入到Superdex 755/150柱(GE Healthcare)上。通过280nm处的吸光度监测来自柱的洗脱液。在进一步的分析中排除通过SEC表现出高水平聚集的Centyrins。

来自EGFR-Fc的所选EGFR-结合FN3结构域的解离速率

对选择的EGFR-结合FN3结构域进行筛选，以识别在ProteOn XPR-36仪器(Bio-Rad)上结合EGFR-Fc时具有低解离速率(k_off)的那些结构域，以便选择具有高亲和力的结合物。将浓度为5μg/mL的山羊抗人Fc IgG(R&D systems)通过胺偶联(以pH 5.0)在所有6个配体通道上沿芯片上的水平取向以30μL/min的流速用含有0.005％吐温-20的PBS直接固定。固定密度平均为约1500个响应单位(RU)，其在不同通道中具有小于5％的变化。将EGFR-Fc在抗人Fc IgG表面上沿垂直配体取向捕获至大约600RU的密度。将测试的所有FN3结构域归一化为1μM的浓度，并且对其沿水平取向的结合进行测试。将所有6个分析物通道用于FN3结构域以使筛选通量最大化。以100μL/min的流速监测解离相10分钟。点间结合信号用作参考来监测分析物与固定化IgG表面之间的非特异性结合，并且从所有结合响应中扣除。将处理过的结合数据局部拟合到1∶1简单Langmuir结合模型以对于结合所捕获的EGFR-Fc的每个FN3结构域提取k_off。

EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制

对经纯化EGFR-结合FN3结构域的以单一浓度抑制A431细胞中EGF刺激的EGFR磷酸化的能力进行测试。使用EGFR磷酸(Tyr1173)试剂盒(Meso Scale Discovery)监测EGFR磷酸化。将细胞以20,000/孔接种在透明的经组织培养物处理的96孔板(Nunc)中100μL/孔的含有GlutaMAX^TM(Gibco)和10％胎牛血清(FBS)的RPMI培养基(Gibco)中，并且使其在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下附接过夜。完全移除培养基，并且用100μL/孔的不含FBS的培养基使细胞在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下饥饿过夜。然后用100μL/孔的含有EGFR-结合FN3结构域的预热(37℃)饥饿培养基以2μM的浓度在潮湿5％CO₂气氛中于37℃下处理细胞1小时。对照物仅用饥饿培养基处理。添加100μL/孔的含有100ng/mL重组人EGF的(R&D Systems，产品目录号236-EG)预热(37℃)饥饿培养基并轻轻混合，达到50ng/mL EGF和1μM EGFR-结合FN3结构域的最终浓度，并且在37℃、5％CO₂下温育15分钟，以刺激细胞。保留一组未刺激的对照孔作为阴性对照。完全移除培养基，并且按照制造商的说明书在振荡下用100μL/孔的完全裂解缓冲液(Meso Scale Discovery)将细胞于室温下裂解10分钟。按照制造商的说明书将被构造用于测量酪氨酸1173上的EGFR磷酸化的测定板(Meso Scale Discovery)用所提供的阻断溶液在室温下阻断1.5-2小时。然后用200μL/孔的1X Tris洗涤缓冲液(MesoScale Discovery)洗涤板4次。将细胞裂解物的等分试样(30μL/孔)转移到测定板上，该测定板覆盖有板密封膜(VWR)并且在室温下振荡温育1小时。将用200μL/孔的Tris洗涤缓冲液洗涤测定板4次，之后将25μL的用冰冷却的检测抗体溶液(Meso Scale Discovery)添加到每个孔中，小心不要引入气泡。将板在室温下振荡温育1小时，然后用200μL/孔的Tris洗涤缓冲液洗涤4次。按照以下所述检测信号：添加150μL/孔的读取缓冲液(Meso ScaleDiscovery)，并使用制造商安装的测定专用默认设置在成像器6000仪器(MesoScale Discovery)上读取。对每个EGFR-结合FN3结构域计算EGF刺激的阳性对照信号的抑制百分比。

对于来自TCL1和TCL2文库的232个识别的克隆测量EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制。这些克隆中有22个以1μM浓度抑制EGFR磷酸化≥50％。在去除表达较差或通过尺寸排阻色谱法被判定为多聚体的克隆之后，将九个克隆进行进一步生物表征。这些克隆的BC环和FG环序列示于表4中。九个所选克隆中有八个具有共同的FG环序列(HNVYKDTNMRGL；SEQ IDNO：95)，并且在多个克隆的BC环序列之间观察到具有显著相似性的区域。

表4：

实例3：抑制EGF结合的EGFR-结合FN3结构域的表征

大规模表达、纯化和内毒素去除

将表4中所示的9个FN3结构域放大，为详细表征提供更多材料。使用含有每种EGFR-结合FN3结构域变体的过夜培养物，用补充有100μg/mL氨苄青霉素的0.8L Terrific肉汤培养基将过夜培养物以1/80稀释并接种到新鲜培养基中，在37℃下振荡温育。当通过添加IPTG至最终浓度1mM使600nm下的光密度达到约1.2-1.5时，培养物被诱导，并且温度降低到30℃。4小时后，通过离心收集细胞，在需要使用之前将细胞沉淀物存储在-80℃下。

为进行细胞裂解，将解冻的沉淀物以每克沉淀物5mL的比率重悬于补充有25U/mL(Sigma-Aldrich)和1kU/mL rLysozyme^TM(Novagen EMDBiosciences)的1X中。在室温下通过轻轻搅拌进行裂解1小时，然后以56,000xg在4℃下离心50分钟。收集上清液并将其通过0.2μm过滤器过滤，然后上样到GEHealthcareAexplorer 100s色谱系统中用缓冲液A(50mM Tris-HCl pH 7.5，500mMNaCl，10mM咪唑)预平衡的5-mL HisTrap FF柱上。将该柱用20倍柱体积的缓冲液A洗涤，并且进一步用6倍柱体积的16％缓冲液B(50mM Tris-HCl pH7.5，500mM NaCl，250mM咪唑)洗涤。用10倍柱体积的50％B洗脱FN3结构域，然后用超过6倍柱体积的梯度为50％-100％的B洗脱。将包含FN3结构域蛋白质的级分汇集，使用Millipore 10K MWCO浓缩器进行浓缩，并且过滤，然后上样到用PBS预平衡的HiLoad^TM 16/60 Superdex^TM 75柱(GE Healthcare)上。从尺寸排阻柱洗脱的蛋白质单体峰被保留。

利用分批方法用ActiClean Etox树脂(Sterogene Bioseparations)去除内毒素。在内毒素去除之前，用1N NaOH在37℃下预处理树脂2小时(或在4℃下处理过夜)，并且用PBS充分洗涤直到pH稳定至约7，如用pH试纸所测得。将纯化的蛋白质通过0.2μm过滤器过滤，然后以10mL蛋白质与1mL树脂的比率添加到1mL Etox树脂中。在室温下通过轻轻搅拌，使内毒素与树脂的结合进行至少2小时。通过以500x g离心2分钟来移除树脂，并且保留蛋白质上清液。使用-PTS^TM盒测量内毒素水平，并且在-MCS读取器(Charles River)上进行分析。如果内毒素水平在第一次Etox处理之后高于5EU/mg，则重复上述过程直到内毒素水平降低到≤5EU/mg。在内毒素水平高于5EU/mg并且在用Etox连续处理两次之后稳定的情况下，为蛋白质建立阴离子交换或疏水作用色谱条件以去除剩余的内毒素。

所选EGFR-结合FN3结构域与EGFR-Fc的亲和力测定(EGFR-Fc亲和力)

选择的EGFR-结合FN3结构域与重组EGFR胞外结构域的结合亲和力通过使用Proteon仪器(BioRad)的表面等离子体共振方法进一步表征。该测定设置(芯片制备，EGFR-Fc捕获)类似于上文针对解离速率分析所述的测定设置。将所选择的EGFR结合FN3结构域以1μM浓度在3倍稀释系列中沿水平取向进行测试。注入缓冲液样品来监测基线稳定性。将用于每个EGFR-结合FN3结构域的所有浓度的解离相在100μL/min的流速下监测30分钟(对于来自解离速率筛选的k_off为约10^-2s^-1的那些)或1小时(对于k_off为约10^-3s^-1或更低的那些)。从响应数据中减去两组参考数据：1)用以校正EGFR-结合FN3结构域与固定化IgG表面之间的非特异性相互作用的点间信号；2)用以校正由于随时间变化的捕获EGFR-Fc表面的解离造成的基线漂移的缓冲通道信号。将用于每个FN3结构域的所有浓度下的处理过的结合数据全部拟合到1∶1简单Langmuir结合模型以提取对动力学(k_on、k_off)和亲和力(K_D)常数的估计。表5示出每种构建体的动力学常数，其中亲和力从200pM变化至9.6nM。

所选EGFR-结合FN3结构域与细胞上的EGFR的结合(A431细胞结合测定)

将A431细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中并且使其在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下附接过夜。将纯化的EGFR-结合FN3结构域(1.5nM至30μM)在室温下添加到一式三份板中的细胞(以50uL)中保持1小时。去除上清液，并且用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次。将细胞用在FACS染色缓冲液中1∶100稀释的抗五组氨酸-Alexa488抗体缀合物(Qiagen)以50μL/孔于室温下温育20分钟。用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次，之后在孔中填充100μL FACS染色缓冲液并在488nm处使用Acumen eX3读取器读取荧光度。将数据绘制为原始荧光信号与FN3结构域摩尔浓度的对数的函数关系，并且使用GraphPad Prism 4(GraphPad Software)拟合到具有可变斜率的S形剂量-响应曲线以计算EC₅₀值。表5记录了每种构建体的范围为2.2至＞20μM的EC₅₀。

使用所选EGFR-结合FN3结构域对EGF结合细胞上的EGFR的抑制(A431细胞EGF竞争测定)

将A431细胞以5,000/孔接种到不透明的黑色96孔板中并且使其在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下附接过夜。将纯化的EGFR-结合FN3结构域(1.5nM至30μM)在室温下添加到一式三份板中的细胞(50uL/孔)中保持1小时。将生物素酰化EGF(Invitrogen，产品目录号E-3477)添加到每个孔中以得到30ng/mL的最终浓度，并且在室温下温育10分钟。用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次。将细胞用在FACS染色缓冲液中1∶100稀释的链霉亲和素-藻红蛋白缀合物(Invitrogen)以50μL/孔于室温下温育20分钟。用150μL/孔的FACS染色缓冲液洗涤细胞3次，之后在孔中填充100μL FACS染色缓冲液并在600nm处使用Acumen eX3读取器读取荧光度。将数据绘制为原始荧光信号与FN3结构域摩尔浓度的对数的函数关系，并且使用GraphPad Prism 4(GraphPad Software)拟合到具有可变斜率的S形剂量-响应曲线以计算IC₅₀值。表5记录了范围为1.8至121nM的IC₅₀值。

EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制(磷酸-EGRF测定)

通过测量抑制的IC₅₀值，更加全面地评估显著抑制EGF刺激的EGFR磷酸化的所选FN3结构域。在不同的FN3结构域浓度(0.5nM至10μM)下评估EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制，如上文在“EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制”中所述。将数据绘制为电致化学发光信号与FN3结构域摩尔浓度的对数的函数关系，并且通过使用GraphPad Prism 4(GraphPad Software)将数据拟合到具有可变斜率的S形剂量响应来确定IC₅₀值。表5记录了范围为18nM至＞2.5nM的IC_５0值。

人肿瘤细胞生长的抑制(NCI-H292生长和NCI-H322生长测定)

EGFR依赖性细胞生长的抑制通过以下所述进行评估：测量EGFR过表达人肿瘤细胞系NCI-H292和NCI-H322(American Type Culture Collection，产品目录号分别为CRL-1848和CRL-5806)的活力，然后将其暴露于EGFR-结合FN3结构域。将细胞以500细胞/孔(NCI-H292)或1,000细胞/孔(NCI-H322)接种在不透明的经组织培养物处理的白色96孔板(Nunc)中100μL/孔的含有GlutaMAX^TM和10mM HEPE的RPMI培养基(Gibco)中，该培养基补充有10％热灭活胎牛血清(Gibco)和1％青霉素/链霉素(Gibco)，并且使其在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下附接过夜。通过添加包含一定浓度范围的EGFR-结合FN3结构域的5μL/孔的磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)来处理细胞。仅用5μL/孔的PBS或溶于PBS的25mM乙二胺四乙酸来处理对照物。将细胞在37℃，5％CO₂下温育120小时。活细胞通过添加75μL/孔的CellTiter-试剂(Promega)，再在板振荡器上混合2分钟，然后在黑暗中于室温下再温育10分钟来进行检测。在设置为发光模式的SpectraMax M5板读取器(Molecular Devices)上读取板，其中0.5秒/孔的读取时间只针对培养基空白样。将数据绘制为经PBS处理的细胞生长百分比与FN3结构域摩尔浓度的对数的函数关系。通过使用GraphPad Prism 4(GraphPadSoftware)将数据拟合到用于具有可变斜率的S形剂量响应的公式来确定IC₅₀值。表5示出使用NCI-H292和NCI-H322细胞的IC₅₀值范围分别为5.9nM至1.15μM和9.2nM至＞3.1μM。

表5示出在每种测定中EGFR-结合FN3结构域的生物特性的概述。

表5：

实例4：EGFR-结合FN3结构域的改造

对EGFR结合FN3结构域的亚群进行改造以增加每个分子的构象稳定性。将突变L17A、N46V和E86I(在美国专利公布2011/0274623中有所描述)通过DNA合成结合到克隆P54AR4-83、P54CR4-31和P54AR4-37中。对新的突变体P54AR4-83v2、P54CR431-v2和P54AR4-37v2进行表达和纯化，如上所述。使用在PBS中的差示扫描量热法评估每个突变体的稳定性，以便将其与相应亲本分子的稳定性进行比较。表6示出每个克隆被显著地稳定，其中T_m的平均增值为18.5℃。

表6：

FN3结构域克隆	SEQ ID NO：	T_m(℃)
			P54AR4-83	25	50.6
P54AR4-83v2	27	69.8
			P54CR4-31	26	60.9
P54CR4-31v2	28	78.9
			P54AR4-37	22	45.9
P54AR4-37v2	29	64.2

实例5：EGFR-结合FN3结构域的半胱氨酸改造和化学缀合

FN3结构域的半胱氨酸突变体由基础Tencon分子及其变体制成，其变体不具有半胱氨酸残基。这些突变可使用本领域中已知的标准分子生物学技术来进行，以将独特的半胱氨酸残基结合到基础Tencon序列(SEQ ID NO：1)或其他FN3结构域中，用作用于小分子药物、荧光标签、聚乙二醇或任意数量的其他化学实体的化学缀合位点。待选择的突变位点应满足某些标准。例如，突变为包含游离半胱氨酸的Tencon分子应当：(i)在大肠杆菌中高度表达，(ii)维持高水平的溶解性和热稳定性，并且(iii)在缀合后维持与靶抗原结合。由于Tencon支架仅具有约90-95个氨基酸，因此可易于在支架的每个位置处构建单一半胱氨酸变体以严格地确定化学缀合的理想位置。

使来自P54AR4-83v2突变体(SEQ ID NO：27)的第1-95位(或当存在N-端甲硫氨酸时为第2-96位)的每个单独氨基酸残基突变为半胱氨酸以评估最佳化学缀合位点，所述单独氨基酸残基结合EGFR。

构建、表达和纯化

P54AR4-83v2的每个单独半胱氨酸变体的氨基酸序列被反向翻译成使用用于大肠杆菌表达的优选密码子编码蛋白质的核酸序列，并且产生合成基因(DNA 2.0)。将这些基因克隆到pJexpress401载体(DNA 2.0)中以用于由T5启动子序列驱动并且转化成大肠杆菌菌株BL21(Agilent)的表达。提供P54AR4-83v2“半胱氨酸扫描”文库作为排列到96孔板中的甘油原料，并且每一者的表达和纯化遵循实例2中所描述的相同过程。

化学缀合

对于P54AR4-83v2“半胱氨酸扫描”文库，缀合过程被整合到纯化过程中。使用组氨酸-捕集HP板(产品目录号28-4008-29，GE Healthcare)通过将澄清裂解物添加到96孔板的孔中并且以100x g离心5分钟来使澄清裂解物中的半胱氨酸变体结合到Ni-NTA树脂上。用缓冲液A洗涤树脂3次，然后添加N-乙基马来酰亚胺(NEM)成为500μL的1.5mM溶液。在电烤振荡器上室温温育1小时之后，通过离心并用洗涤液A洗涤三次来去除过量的NEM。将缀合的半胱氨酸变体用2×150μL的缓冲液B洗脱，并且用具有Ultracel-10膜的MultiScreen过滤板(产品目录号MAUF1010，Millipore)或用96孔PD MultiTrap板(产品目录号28-9180-06，GEHealthcare)交换到PBS中。通过质谱法来表征缀合物(表7)。将表达较差(从5mL培养物获得小于0.1mg的蛋白质或者通过质谱法未检测到蛋白质)或与NEM的缀合较差(小于80％缀合，如通过质谱法所测得)的半胱氨酸变体从进一步的分析中排除。这是因为由于较差的表达而消除了L1C、W21C、Q36C、E37C、A44C、D57C、L61C、Y67C和F92C，并且由于低缀合效率而消除了A17C、L19C、I33C、Y35C、Y56C、L58C、T65C、V69C、I71C和T94C。

表7：

分析尺寸排阻色谱法

对于P54AR4-83v2的每个NEM-缀合的半胱氨酸变体的尺寸排阻色谱法如实例2中所述进行。表8汇总了结果。每种蛋白质的单体百分比通过以下所述来确定：整合Abs280信号，并且将单体区域中的峰值(5.5-6分钟)与低聚物区域中的峰值(4-5.3分钟)进行比较。

表8

EGFR结合测定

P54AR4-83v2的NEM-缀合的半胱氨酸变体与EGFR的相对结合亲和力如实例2中所述进行评估。表9汇总了示出每种半胱氨酸变体EGFR结合亲和力相对于P54AR4-83v2亲本蛋白质的比率的数据。如通过ELISA测定所测得，将减小了与EGFR的结合(用10nM蛋白质处理时，小于用P54AR4-83v2亲本观察的信号的65％)的半胱氨酸缀合物从进一步的分析中排除：P2C、A3C、P4C、K5C、L7C、D23C、W25C、F27C、Y28C、F31C、S55C、G73C、H75C、V77C、Y78C、T81C、N82C、M83C和G85C。

表9

热稳定性

半胱氨酸-NEM缀合物的热稳定性通过差示扫描量热法(DSC)来评估。所测试的仅有的缀合物是被确定为以高水平表达、有效地缀合并且保持EGFR结合的那些。另外，将BC环和FG环内的半胱氨酸变体排除。通过将400μL等分试样的变体从25℃加热至100℃，在VP-DSC仪器(MicroCal)中以1℃/分钟的扫描速率来生成稳定性数据。在所述样品上完成第二次相同的扫描以便评估热折叠/解折叠的可逆性。根据2-态解折叠模型拟合数据以便计算熔融温度(表10)。将具有降低的熔融温度(≤63℃，或比P54AR4-83v2亲本低＞8℃)或表现出不可逆解折叠的半胱氨酸变体从进一步的分析中排除：V9C、V12C、T13C、R18C、E29C、E39C、G42C、V49C、P50C、G51C、P63C。

表10

细胞毒性测定

使用针对NEM缀合描述的方法将P54AR4-83v2半胱氨酸变体通过酶裂解Val-Cit接头或不可裂解PEG₄接头(VC-MMAF，参见图2)缀合到细胞毒性微管蛋白抑制剂单甲基奥瑞斯他汀F(MMAF)。在之前的步骤中排除之后保留的32个变体连同P54AR4-83v2亲本(SEQ IDNO：217和255)和Tencon(SEQ ID NO：265)一起缀合作为阴性对照。

通过测量EGFR-过表达人肿瘤细胞系H1573的活力，然后暴露于半胱氨酸变体-细胞毒素缀合物来评估细胞杀伤。将细胞以7000/孔接种在经组织培养物处理的具有透明底部的黑孔板(Falcon 353219)中100μL/孔的含有5％胎牛血清(Gibco)的无酚红RPMI培养基(Gibco 11835-030)中。使细胞在潮湿的5％CO₂气氛中于37℃下附接过夜。将培养基从96孔板中吸出，并且用50uL新鲜培养基以及在新鲜培养基中制成的50uL 2X抑制剂处理细胞。通过终点测定用Cell TiterGlo(Promega)在70小时处测定细胞活力。通过使用GraphPadPrism 5(GraphPad Software)将数据拟合到用于具有可变斜率的S形剂量响应的公式来确定IC₅₀值。表11记录了从CellTiter Glo数据的分析获得的IC₅₀值。83v2-cys/vcMMAF缀合物的两个重复样的平均IC₅₀为0.7nM。所测试的32个缀合物中有四个的IC₅₀值大于亲本的两倍(高于1.4nM)，并且这四个缀合物被丢弃：L32C、T68C、Y72C和V74C。另外，三种缀合物得到超过比亲本更有效的两倍的IC₅₀值，并且可特别适合于格式化为药物缀合物：N6C、E53C和T93C。

表11

最终半胱氨酸变体

在所测试的96个位置中，当半胱氨酸变体缀合到细胞毒性药物时，发现半胱氨酸变体中的28个满足以下标准：在大肠杆菌中保持高表达水平，通过硫醇-马来酰亚胺化学的有效缀合，保持与靶抗原EGFR的结合，保持热稳定性和可逆解折叠特性，以及保持具有高EGFR表达的细胞杀伤。这些位置为：N6C(SEQ ID NO：210和248)、V8C(SEQ ID NO：189和227)、S10C(SEQ ID NO：190和228)、E11C(SEQ ID NO：191和229)、E14C(SEQ ID NO：192和230)、D15C(SEQ ID NO：193和231)、S16C(SEQ ID NO：194和232)、S20C(SEQ ID NO：195和233)、S30C(SEQ ID NO：196和234)、Q34C(SEQ ID NO：197和235)、S38C(SEQ ID NO：198和236)、K40C(SEQ ID NO：199和237)、V41C(SEQ ID NO：200和238)、I45C(SEQ ID NO：201和239)、L47C(SEQ ID NO：202和240)、T48C(SEQ ID NO：203和241)、E53C(SEQ ID NO：204和242)、R54C(SEQ ID NO：205和243)、T59C(SEQ ID NO：206和244)、G60C(SEQ ID NO：207和245)、K62C(SEQ ID S 208和246)、G64C(SEQ ID NO：209和247)、T68C(SEQ ID NO：210和248)、S70C(SEQ ID NO：211和249)、L88C(SEQ ID NO：212和250)、S89C(SEQ ID NO：213和251)、A90C(SEQ ID NO：214和252)、I91C(SEQ ID NO：215和253)以及T93C(SEQ ID NO：216和254)。这28个位置在83v2蛋白质的结构内的定位示于图3中。

实例6：结合c-Met并抑制HGF结合的III型纤连蛋白(FN3)结构域的选择

人c-Met上的筛选

针对生物素酰化-人c-Met胞外结构域(bt-c-Met)筛选TCL14文库以识别能够特异性地结合c-Met的FN3结构域。为进行选择，使3μg的TCL14文库在大肠杆菌S30线性提取物(Promega，Madison，WI)中体外转录并翻译(IVTT)，并且表达的文库用Cis Block(2％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、100μg/mL鲱鱼精子(Promega)、1mg/mL肝素(Sigma-Aldrich))阻断。为进行选择，bt-c-Met以浓度为400nM(第1轮)、200nM(第2和3轮)和100nM(第4和5轮)添加。结合的文库成员使用中和亲和素磁珠(Thermo Fisher，Rockford，IL)(第1、3和5轮)或链霉抗生物素蛋白磁珠(Promega)(第2和4轮)回收，而未结合的文库成员通过用500uL PBS-T洗涤珠粒5-14次接着用500uL PBS洗涤2次来去除。

进行另外的选择轮次以识别具有改善的亲和力的FN3结构域分子。简而言之，如上所述制备来自第5轮的输出并且使其经历另外重复的选择轮次，其中变化如下：与bt-c-Met的温育从1小时减少至15分钟，并且珠粒捕获从20分钟减少至15分钟，bt-c-Met减少至25nM(第6和7轮)或2.5nM(第8和9轮)，而且在过量的非生物素酰化c-Met存在下进行另外1小时的洗涤。这些变化的目的是同时选择具有可能较快的结合速率和较慢的解离速率的结合物，从而产生大致较低的K_D。

使用TCON6(SEQID No.30)和TCON5 E86I短(SEQID No.31)引物将第5、7和9轮输出PCR克隆到包含连接酶非依赖性克隆位点(pET15-LIC)的修饰的pET15载体(EMDBiosciences，Gibbstown，NJ)中，并且在转化和IPTG诱导(1mM最终，30℃°，持续16小时)之后使用标准方法将蛋白质表达为C-端组氨酸6-标记蛋白质。通过离心收获细胞并随后用补充有0.2mg/mL鸡蛋清溶解酵素(Sigma-Aldrich)的Bugbuster HT(EMD Biosciences)溶解。通过离心使细菌溶解物澄清并将上清液转移至新的96深孔板。

对于抑制HGF与c-Met结合的FN3结构域的筛选

将存在于大肠杆菌裂解物中的FN3结构域针对其抑制HGF以生物化学形式结合到纯化的c-Met胞外结构域的能力进行筛选。

将重组人c-Met Fc嵌合体(PBS中的0.5μg/mL，100μL/孔)涂覆在96孔白色Maxisorp板(Nunc)上并且在4℃下温育过夜。将板用300μL/孔的具有0.05％吐温20的Tris缓冲盐水溶液(TBS-T，Sigma-Aldrich)在Biotek板洗涤器上洗涤两次。将测定板在振荡下用StartingBlock T20(200μL/孔，Thermo Fisher Scientific，Rockland，IL)在室温(RT)下阻断1小时，并且用300μL的TBS-T再洗涤两次。将FN3结构域裂解物使用HamiltonSTARplus机器人系统在StartingBlock T20中稀释(从1∶10至1∶100,000)。将裂解物(50μL/孔)在振荡下在测定板上于RT下温育1小时。在不洗涤板的情况下，将bt-HGF(StartingBlock T20中的1μg/mL，50μL/孔，生物素酰化)在RT下添加到板并持续30分钟同时振荡。包含Tencon27裂解物的对照孔接收Starting Block T20或稀释的bt-HGF。然后将板用300μL/孔的TBS-T洗涤4次，并且在振荡下用100μL/孔的链霉抗生物素蛋白-HRP(TBS-T中的1∶2000，Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)于RT下温育30-40分钟。再次将板用TBS-T洗涤4次。为了产生信号，将根据制造商的说明书制备的POD化学发光底物(50μL/孔，Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)添加到板，并且在大约3分钟内，使用SoftMaxPro在Molecular Devices M5上读取发光度。利用下列计算来确定抑制百分比：100-((RLU_样品-平均RLU_{无bt-HGF对照})/(平均RLU_bt-HGF对照-平均RLU_{无bt-HGF对照})×100)。50％或更大的抑制百分比值被认为是命中。

FN3结构域的高通量表达和纯化

用组氨酸MultiTrap^TM HP板(GE Healthcare)从澄清的大肠杆菌裂解物纯化组氨酸标记的FN3结构域，并且用包含20mM磷酸钠、500mM氯化钠和250mM咪唑的缓冲液(pH 7.4)洗脱。使用PD MultiTrap^TM G-25板(GE Healthcare)将纯化的样品交换到PBS(pH 7.4)中以供分析。

HGF与c-Met的结合抑制的IC ₅₀ 测定

所选FN3结构域在HGF竞争测定法中进一步表征。使用上述测定法生成纯化的FN3结构域的剂量响应曲线(起始浓度为5μM)。计算抑制百分比值。将数据绘制为抑制百分比与FN3结构域摩尔浓度的对数的函数关系，并且通过使用GraphPad Prism 4(GraphPadSoftware)将数据拟合到具有可变斜率的S形剂量响应来确定IC₅₀值。

从第5轮识别35个独特序列以在1∶10的稀释下表现出活性，其中IC₅₀值的范围为0.5至1500nM。第7轮产生39个在1∶100的稀释下具有活性并且IC₅₀值的范围为0.16至2.9nM的独特序列。从第9轮识别66个独特序列，其中命中被定义为在1∶1000的稀释下具有活性。在第9轮中观察到低至0.2nM的IC₅₀值。

实例7：结合c-Met并抑制HGF结合的FN3结构域的表征

将FN3结构域如以上在实例2中所述来表达和纯化。尺寸排阻色谱法和动力学分析分别如以上在实例1和2中所述来进行。表12示出C链、CD环、F链和FG环的序列，以及对于每个结构域的整个氨基酸序列的SEQ ID NO：。

表12：

C环残基对应于所指示SEQ ID NO：的残基28-37

CD链残基对应于所指示SEQ ID NO：的残基38-43

F环残基对应于所指示SEQ ID NO：的残基65-74

FG链残基对应于所指示SEQ ID NO：的残基75-81

所选c-Met-结合FN3结构域与细胞上的c-Met的结合

将NCI-H441细胞(产品目录号HTB-174，American Type Culture Collection，Manassas，VA)以20,000细胞/孔接种在聚-D-赖氨酸涂覆的黑色透明底部96孔板(BDBiosciences，San Jose，CA)处，并且使其在37℃，5％CO₂下附接过夜。将纯化的FN3结构域(50μL/孔；0至1000nM)在复制板中在4℃下添加到细胞并持续1小时。移除上清液并且将细胞用FACS染色缓冲液(150μL/孔，BD Biosciences，产品目录号554657)洗涤三次。将细胞用生物素酰化-抗组氨酸抗体(在FACS染色缓冲液中1∶160稀释，50μL/孔，R&D Systems，产品目录号BAM050)在4℃下温育30分钟。将细胞用FACS染色缓冲液(150μL/孔)洗涤三次，之后将孔用抗小鼠IgG1-Alexa 488缀合抗体(在FACS染色缓冲液中1∶80稀释，50μL/孔，LifeTechnologies，产品目录号A21121)在4℃下温育30分钟。将细胞用FACS染色缓冲液(150μL/孔)洗涤三次并且留在FACS染色缓冲液(50μL/孔)中。使用Acumen eX3读取器测定总荧光度。将数据绘制为原始荧光信号与FN3结构域摩尔浓度的对数的函数关系，并且使用GraphPad Prism 4(GraphPad Software)拟合到具有可变斜率的S形剂量-响应曲线以计算EC₅₀值。发现FN3结构域表现出一定范围的结合活性，其中EC₅₀值介于1.4和22.0之间，如表13中所示。

HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制

使用来自Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD)的c-Met磷酸(Tyr1349)试剂盒将纯化的FN3结构域对于其抑制NCI-H441中的c-Met的HGF刺激的磷酸化的能力进行测试。将细胞以20,000/孔接种在经组织培养物处理的透明96孔板中100μL/孔的含有10％胎牛血清(FBS；Life Technologies)的RPMI培养基(包含Glutamax和HEPES，LifeTechnologies)中，并且使其在37℃，5％CO2下附接过夜。完全移除培养基，并且使细胞在无血清RPMI培养基(100μL/孔)中于37℃，5％CO2下饥饿过夜。然后用包含FN3结构域的新鲜无血清RPMI培养基(100μL/孔)以20μM的浓度在37℃，5％CO₂下补充细胞低于1小时。对照物仅用培养基处理。用100ng/mL重组人HGF(100μL/孔，R&D Systems，产品目录号294-HGN)刺激细胞，并且将细胞在37℃，5％CO₂下温育15分钟。保留一组未刺激的对照孔作为阴性对照。然后完全移除培养基，并且按照制造商的说明书在振荡下用完全裂解缓冲液(50μL/孔，Meso Scale Discovery)将细胞于室温下裂解10分钟。按照制造商的说明书将被构造用于测量磷酸化c-Met的测定板用所提供的阻断溶液在室温下阻断1小时。然后将板用Tris洗涤缓冲液(200μL/孔，Meso Scale Discovery)洗涤三次。将细胞裂解物(30μL/孔)转移到测定板，并且在振荡下于在RT下温育1小时。然后将测定板用Tris洗涤缓冲液洗涤四次，之后在振荡下将冰冷的检测抗体溶液(25μL/孔，Meso Scale Discovery)在RT下添加到每个孔并持续1小时。再次将板用Tris洗涤缓冲液冲洗四次。按照以下所述检测到信号：添加150读取缓冲液(150μL/孔，Meso Scale Discovery)，并使用制造商安装的测定专用默认设置在成像器6000仪器(Meso Scale Discovery)上读取。将数据绘制为电致化学发光信号与FN3结构域摩尔浓度的对数的函数关系，并且通过使用GraphPad Prism 4将数据拟合到具有可变斜率的S形剂量响应来确定IC₅₀值。发现FN3结构域抑制IC50值范围为4.6至1415nM的磷酸化c-Met，如表13所示。

人肿瘤细胞生长的抑制

c-Met-依赖性细胞生长的抑制通过测量U87-MG细胞(American Type CultureCollection，产品目录号HTB-14)的活力，然后暴露于c-Met-结合FN3结构域来评估。将细胞以8000细胞/孔在100μL/孔的RPMI培养基中接种在不透明白色96孔组织培养物处理的板(Nunc)中，补充有10％FBS，并且使其在37℃，5％CO₂下附接过夜。在接种后二十四小时，吸出培养基并且用无血清RPMI培养基补充细胞。在血清饥饿后二十四小时，通过添加包含c-Met-结合FN3结构域(30μL/孔)的无血清培养基来处理细胞。将细胞在37℃，5％CO₂下温育72小时。通过添加100μL/孔的CellTiter-试剂(Promega)，然后在板振荡器上混合10分钟来检测活细胞。在设置为发光模式的SpectraMax M5板读取器(Molecular Devices)上读取板，其中读取时间为0.5秒/孔。将数据绘制为针对FN3结构域摩尔浓度的对数的原始发光单位(RLU)。通过使用GraphPad Prism 4将数据拟合到用于具有可变斜率的S形剂量响应的公式来确定IC₅₀值。表13记录了范围为1nM至＞1000nM的IC₅₀值。

表13：c-Met-结合FN3结构域的生物学特性汇总

c-Met-结合FN3结构域的热稳定性

在PBS中的差示扫描量热法用于评估每个FN3结构域的稳定性。实验的结果示于表 14中。

表14：

实例8：双特异性抗EGFR/c-Met分子的生成和表征

双特异性EGFR/c-Met分子的生成

将实例1-6中描述的EGFR和c-Met-结合FN3结构域的多种组合接合到能够结合EGFR和c-Met两者的双特异性分子中。另外，制备示于SEQ ID NO：107-110中的具有氨基酸序列的EGFR-结合FN3结构域，以及示于SEQ ID NO：111-114中的具有氨基酸序列的c-Met结合FN3结构域并且将其接合到双特异性分子中。形成合成基因以编码SEQ ID No.50-72和106中所述的氨基酸序列(表15)，使得以下形式得以维持：EGFR-结合FN3结构域后面是肽接头，所述肽接头后面是c-Met-结合FN3结构域。将聚-组氨酸标签结合在C-端处以帮助纯化。除了表15中描述的那些分子之外，两个FN3结构域之间的接头根据长度、序列组成和结构根据表16中列出的那些而改变。可以设想到，多个其他接头可用于连接此类FN3结构域双特异性EGFR/c-Met分子，其使用IMAC和凝胶过滤色谱法步骤如对于单特异性EGFR或c-MetFN3结构域所述由大肠杆菌来表达和纯化。

表15：

表16：

双特异性EGFR/c-Met分子与单独的单特异性分子相比增强功效，从而表明亲和力。

将NCI-H292细胞在包含10％FBS的RPMI培养基中接种在96孔板中。24小时之后，将培养基替换为无血清RPMI。在血清饥饿后24小时，将细胞用不同浓度的FN3结构域处理：高亲和力单特异性EGFR FN3结构域(P54AR4-83v2)、弱亲和力单特异性c-Met FN3结构域(P114AR5P74-A5)、两种单特异性EGFR和c-Met FN3结构域的混合物、或由连接到高亲和力EGFR FN3结构域的低亲和力c-Met FN3结构域构成的双特异性EGFR/c-Met分子(ECB1)。将细胞用单特异性或双特异性分子处理1小时，然后用EGF、HGF、或EGF和HGF的组合在37℃，5％CO₂下刺激15分钟。将细胞用MSD裂解缓冲液裂解，并根据制造商的说明书，使用适当的MSD测定板来评估细胞信号传导，如上所述。

低亲和力c-Met FN3结构域以610nM的IC₅₀抑制c-Met的磷酸化(图6)。正如预期，EGFR FN3结构域不能抑制c-Met磷酸化，并且单特异性分子的混合物看起来与单独的c-MetFN3结构域相同。然而，双特异性EGFR/c-Met分子以1nM的IC₅₀抑制c-Met的磷酸化(图6)，从而在改善功效方面相对于单独的c-Met单特异性提供多于2-log位移。

在具有可变c-Met和EGFR密度以及比率的多个细胞类型中评价双特异性EGFR/c-Met分子通过亲和力作用增强c-Met和/或EGFR磷酸化的抑制的潜能(图7)。将NCI-H292、NCI-H441或NCI-H596细胞接种到96孔板中的包含10％FBS的RPMI培养基中。24小时之后，将培养基替换为无血清RPMI。在血清饥饿后24小时，将细胞用不同浓度的单特异性EGFR-结合FN3结构域、单特异性c-Met FN3结构域、或双特异性EGFR/c-Met分子(ECB5，由P53A1R5-17v2和P114AR7P94-A3构成)来处理。将细胞用单特异性或双特异性分子处理1小时，然后用EGF、HGF、或EGF和HGF的组合在37℃，5％CO₂下刺激15分钟。将细胞用MSD裂解缓冲液裂解，并根据制造商的说明书，使用适当的MSD测定板来评估细胞信号传导，如上所述。

图7(A-C)示出在三个不同细胞系中与双特异性EGFR/cMet分子相比使用单特异性EGFR-结合FN3结构域的EGFR的抑制。为了评估EGFR磷酸化测定法中的亲和力，将中等亲和力EGFR-结合FN3结构域(1.9nM)(P53A1R5-17v2)与包含连接到高亲和力c-Met-结合FN3结构域(0.4nM)(P114AR7P94-A3)的相同EGFR-结合FN3结构域的双特异性EGFR/c-Met分子进行比较。在H292和H596细胞中，对于单特异性和双特异性分子，EGFR的磷酸化的抑制是可比较的(图7A和图7B)，这可能是因为这些细胞系具有EGFR与c-Met受体的高比率。为了测试该理论，在比EGFR表现出更多c-Met受体的NCI-H441细胞中评价EGFR磷酸化的抑制。用双特异性EGFR/c-Met分子处理NCI-H441细胞与单特异性EGFR-结合FN3结构域相比使EGFR磷酸化的抑制的IC₅₀降低了30倍(图7C)。

在c-Met磷酸化测定中使用具有与EGFR(0.26nM)的高亲和力以及与c-Met(10.1nM)的中等亲和力的分子来评价用双特异性EGFR/c-Met分子增强功效的潜能。在NCI-H292和NCI-H596细胞中，与单特异性c-Met-结合FN3结构域相比，c-Met的磷酸化的抑制用双特异性分子分别增强134和1012倍(图7D和图7E)。

已经证实，将用双特异性EGFR/c-Met分子的EGFR和c-Met磷酸化的抑制的增强功效翻译成信号传导和增殖的增强抑制。对于这些实验，将FN3 EGFR-结合和c-Met-结合FN3结构域的混合物与双特异性EGFR/c-Met分子进行比较。如表17和18中所述，当与单特异性结合物的混合物相比细胞用双特异性EGFR/c-Met分子处理时，ERK磷酸化(表17)和H292细胞的增殖(表18)的IC₅₀值减小。双特异性EGFR/c-Met分子的ERK磷酸化的抑制的IC₅₀相对于两种单特异性EGFR和c-Met FN3结构域的混合物低143倍，示出亲和力对该测定中的分子的功效的作用。在表17中，单特异性EGFR-和c-Met结合FN3结构域不完全抑制活性，并且因此示出的IC₅₀值应被视为下限。增殖测定使用EGFR和c-Met结合FN3结构域的不同组合作为混合物或以双特异性格式连接来完成。双特异性EGFR/c-Met分子的增殖的抑制的IC₅₀相对于单特异性亲本EGFR或c-Met结合FN3结构域的混合物低34-236倍。这证实了，在受体水平处观察到的亲和力作用(图6和图7)转化成抑制细胞信号传导(表17)和细胞增殖(表18)的改善。

表17：

表18：

体内肿瘤异种移植物：PK/PD

为了确定单特异性和双特异性FN3结构域分子在体内的功效，对肿瘤细胞进行改造以分泌人HGF(鼠科动物HGF不结合人HGF)。人HGF使用慢病毒感染(表达人HGF的慢病毒DNA载体(登录号X16322)和来自Genecopoeia的慢病毒包装试剂盒)在NCI-H292细胞中稳定地表达。在感柒之后，HGF表达细胞被选择为具有4μg/mL嘌呤霉素(Invitrogen)。使用来自MesoScale Discovery的测定板在汇集的细胞的条件培养基中检测到人HGF。

将SCID浅褐色小鼠在每个动物的背侧上皮下接种有表达人HGF的NCI-H292细胞(200μL的体积的Cultrex(Trevigen)中的2.0×10⁶个细胞)。肿瘤测量每周进行两次，直到肿瘤体积在150-250mm³的范围内。然后给予小鼠单个IP剂量的双特异性EGFR/c-Met分子(连接到白蛋白结合结构域以增加半衰期)或PBS载体。在给药之后的6小时或72小时处，提取肿瘤并且立即在液氮中冷冻。通过心脏穿刺将血液样本收集到包含蛋白酶抑制剂的3.8％柠檬酸盐中。紧接着在收集之后，对血液样本进行离心，并且将所得血浆转移到样品管并储存在-80℃下。对肿瘤进行称重，切成小块，并且在包含具有HALT蛋白酶/磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液(Pierce)、50mM氟化钠(Sigma)、2mM活化原钒酸钠(Sigma)、和1mM PMSF(MesoScale Discovery)的Lysing Matrix A管(LMA)中裂解。将裂解物从LMA基质移除并且离心以移除不溶性蛋白质。将可溶性肿瘤蛋白用BCA蛋白质测定进行定量并且在肿瘤裂解缓冲液中稀释到等效蛋白质水平。使用来自MesoScale Discovery的测定板测量磷酸化c-Met、EGFR和ERK(根据制造商方案，并且如上所述)。

图6示出实验结果。每个双特异性EGFR/c-Met分子在6小时和72小时处显著降低磷酸化c-Met、EGFR和ERK的水平。图6中呈现的数据示出同时抑制c-Met和EGFR的重要性以及每个受体的双特异性EGFR/c-Met分子的亲和力如何起抑制下游ERK的作用。在6小时和72小时处，与包含中等亲和力EGFR-结合FN3结构域(P53A1R5-17v2，在图中示为“17”，K_D＝1.9nM)的那些分子相比，包含高亲和力EGFR-结合FN3结构域(P54AR4-83v2，在图中示为“8”，K_D＝0.26nM)的分子更大程度地抑制EGFR的磷酸化。不管亲和力如何，所有四个测试的双特异性分子在6小时时间点处都完全抑制ERK的磷酸化。在72小时时间点处，与中等亲和力c-Met-结合FN3结构域(P114AR5P74-A5，在图中示为“A5”，K_D＝10.1nM，图6)相比，包含高亲和力c-Met-结合结构域(P114AR7P94-A3，在图中示为“A3”，K_D＝0.4nM)的分子显著抑制ERK的磷酸化。

在血液中以及在肿瘤中给药后6小时和72小时处，测量每个双特异性EGFR/c-Met分子的浓度(图9)。有趣的是，具有中等亲和力EGFR-结合结构域(P53A1R5-17v2，K_D＝1.9nM)但高亲和力c-Met-结合FN3结构域(P114AR7P94-A3，K_D＝0.4nM)的双特异性分子相对于其他分子在6小时处具有显著更多的肿瘤积聚，而到72小时差异减小。可以假设，在肿瘤之外的细胞具有较低水平的EGFR和c-Met表面表达，并且因此中等亲和力EGFR分子不如与较高亲和力EGFR-结合FN3结构域相比那样紧密地结合正常组织。因此，存在可用于在肿瘤中结合的更多自由的中等亲和力EGFR-结合FN3结构域。因此，确定与每个受体的适当亲和力可允许识别具有减小的全身毒性和增加的肿瘤积聚的治疗。

利用双特异性EGFR/c-Met分子的肿瘤功效研究

将SCID浅褐色小鼠在每个动物的背侧中皮下接种表达人HGF的NCI-H292细胞(200μL中的Cultrex(Trevigen)中的2.0×10⁶个细胞)。在植入后一周，将小鼠分层成具有等效肿瘤体积的组(平均肿瘤体积＝77.9+/-1.7mm³)。对小鼠用双特异性分子每周给药三次，并且每周记录两次肿瘤体积。用四个不同双特异性分子观察到肿瘤生长抑制(TGI)，其中对于c-Met和EGFR具有可变亲和力。图10示出当c-Met-结合FN3结构域为中等亲和力(打开与闭合三角形，P54AR4-83v2-P114AR5P74-A5与P53A1R5-17-P114AR5P74-A5相比)时，与中等亲和力EGFR-结合FN3结构域相比，在用包含高亲和力EGFR-结合FN3结构域的分子治疗的小鼠中观察到肿瘤生长延迟时，抑制c-Met和EGFR的优点。此外，数据示出在包含高或中等亲和力EGFR-结合FN3结构域但高亲和力c-Met-结合FN3结构域的双特异性分子示出最大功效(灰色和黑色虚线，P54AR4-83v2-P114AR7P94-A3和P53A1R5-17v2-P114AR7P94-A3)时，具有高亲和力c-Met-结合FN3结构域的重要性。

EGFR和c-Met的双特异性分子和其他抑制剂的功效

在SCID/浅褐色小鼠中的皮下H292-HGF人肺癌异种移植物模型的治疗中评价双特异性EGFR/c-Met分子(ECB38)和小分子抑制剂克唑替尼(c-Met抑制剂)和埃罗替尼(EGFR抑制剂)、西妥昔单抗(抗EGFR抗体)(各自作为单个试剂)，以及crizotnib和erlontinib的组合的体内治疗功效(图11)。

将H292-HGF细胞在补充有胎牛血清(10％v/v)和L-谷氨酰胺(2mM)的RPMI1640培养基中在37℃下在空气中的5％CO2气氛中在体外维持。将细胞通过胰蛋白酶-EDTA处理进行每周两次常规次级培养。收获在指数生长期中生长的细胞，并且对其进行计数以用于肿瘤接种。

对于肿瘤发展，在0.1mL的具有cultrex(1∶1)的PBS中，将每个小鼠在右胁区域处用H292-HGF肿瘤细胞(2×10⁶)皮下接种。当平均肿瘤尺寸达到139mm³时，开始治疗。每个研究组中的试验制品管理和动物数量在以下实验设计表(表26)中示出。肿瘤细胞接种的日期表示为第0天。

表26

N：动物数；经口：口服施用；腹膜内：腹膜内注射3次/周：在每周的第1、3和5天给药。

QD：一天一次Q4d：四天一次；克唑替尼和埃罗替尼的组合的间隔为0.5小时；给药体积根据体重来调整(10l/g)；a：在分组后第14天未给药。

在开始治疗之前，对所有动物进行称重并且测量肿瘤体积。由于肿瘤体积可影响任何给定治疗的有效性，因此将小鼠分配到使用基于其肿瘤体积的随机化块设计的组中。这将确保所有组在基线处是可比较的。使用随机化块设计将实验动物分配到组中。首先，根据实验动物的初始肿瘤体积将实验动物分成均匀块。其次，在每个块内，对治疗的实验动物进行随机化。使用随机化块设计分配实验动物确保了每个动物具有被分配到给定治疗的相同概率，并且因此减小了系统误差。

在常规监测时，对动物的肿瘤生长和治疗对正常行为的任何影响进行检查，诸如移动性、食物和水消耗的视觉估计、体重增加/减少(体重每周测量两次)、眼睛/头发光泽以及任何其他异常反应。

主要终点是肿瘤生长是否可被延迟或患有肿瘤的小鼠是否可治愈。将肿瘤尺寸在两个维度上使用卡尺每周测量两次，并且使用以下式以mm³表示体积：V＝0.5a×b²，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。然后使用肿瘤尺寸计算T-C和T/C值。通过以下计算T-C：T作为治疗组的平均肿瘤尺寸达到1000mm³所需的时间(按天计)，并且C为对照组的平均肿瘤尺寸达到相同尺寸的时间(按天计)。T/C值(以百分比计)是抗肿瘤功效的指示；T和C分别为在给定某天治疗组和对照组的平均体积。完全肿瘤消退(CR)被定义为减小至低于触诊极限(62.5mm³)的肿瘤。部分肿瘤消退(PR)被定义为与初始肿瘤体积相比减小的肿瘤。在3次或更多次连续的肿瘤测量中CR或PR的最短持续时间是要考虑为持久的CP或PR所需的。

对体重减轻超过20％、或该组的平均肿瘤尺寸超过2000mm³的动物执行安乐死。观察两周后，在最终给药后终止该研究。

在每个时间点处对于每个组的肿瘤体积提供汇总统计，包括平均值和平均值的标准误差(SEM)(示于下表19中)。使用单向ANOVA评价组中肿瘤体积差异的统计分析，然后使用Games-Howell进行个体比较(不假设相等方差)。使用SPSS 18.0分析所有数据。p＜0.05被视为在统计上具有显著性。

表19：治疗组中的肿瘤尺寸

在肿瘤接种后23天时，载体处理组(第1组)的平均肿瘤尺寸达到1,758mm³。用双特异性EGFR/c-Met分子以25mg/kg剂量水平(第2组)治疗导致所有小鼠中的完全肿瘤消退(CR)，这在＞3次的连续肿瘤测量中是持久的(平均TV＝23mm³，T/C值＝1％，p＝0.004，与第23天的载体组相比)。

用克唑替尼作为单一制剂以50mg/kg剂量水平(第3组)治疗显示出没有抗肿瘤活性，第23天的平均肿瘤尺寸为2,102mm³(T/C值＝120％，p＝0.944，与载体组相比)。

用埃罗替尼作为单一制剂以50mg/kg剂量水平(第4组)治疗显示出较小的抗肿瘤活性，但是与载体组相比未发现显著差异；第23天的平均肿瘤尺寸为1,122mm³(T/C值＝64％，p＝0.429，与载体组相比)，其中与载体组相比，在肿瘤尺寸为1,000mm³时具有4天的肿瘤生长延迟。

克唑替尼(50mg/kg，第5组)和埃罗替尼(50mg/kg，第5组)的组合显示出显著的抗肿瘤活性；第23天的平均肿瘤尺寸为265mm³(T/C＝15％，p＝0.008)，其中与载体组相比，在肿瘤尺寸为1,000mm³时具有17天的肿瘤生长延迟。

西妥昔单抗以1mg/小鼠剂量水平作为单一制剂(第6组)显示出显著的抗肿瘤活性；第23天的平均肿瘤尺寸为485mm³(T/C＝28％，p＝0.018)，其中与载体组相比，在肿瘤尺寸为1,000mm³时具有17天的肿瘤生长延迟。图11示出各种疗法的抗肿瘤活性。

表20：抗肿瘤活性

在载体组中观察到中等到严重的体重减轻，这可能是由于增加的肿瘤负担；当在第23天BWL＞20％时，3只小鼠死亡并且对1只小鼠执行安乐死。在第2组中观察到双特异性EGFR/c-Met分子的轻微毒性；当在治疗期间BWL＞20％时，对3只小鼠执行安乐死；当在2周的观察期期间撤出治疗时，体重逐渐恢复。与载体组相比，在克唑替尼或埃罗替尼单一疗法组中观察到更严重的体重减轻，表明具有治疗相关的毒性。克唑替尼和埃罗替尼的组合在给药阶段期间通常为耐受的，但是在该研究结束时观察到严重的体重减轻，这可能是由于在非治疗期间恢复了快速的肿瘤生长。西妥昔单抗的单一疗法在该研究中良好耐受；仅在该研究结束时由于肿瘤生长恢复而观察到体重减轻。

总而言之，在SCID/浅褐色小鼠中的H292-HGF人肺癌异种移植物模型中，25mg/kg(3次/周×3周)的双特异性EGFR/c-Met分子产生了完整响应。在10只小鼠中的7只中该治疗是耐受的，从而导致10只小鼠中的3只小鼠体重严重减轻。图11和表20示出在治疗后的时间点期间各种疗法对肿瘤尺寸的影响。

实例9：双特异性EGFR/c-Met分子的半衰期延长

许多方法已被描述为减少肾脏过滤，并且由此延长蛋白质的血清半衰期，所述方法包括用聚乙二醇(PEG)或其他聚合物修饰，结合白蛋白，融合到结合白蛋白或其他血清蛋白的蛋白质结构域，基因融合到白蛋白，融合到IgG Fc结构域，以及融合到长的、非结构化的氨基酸序列。

用PEG修饰双特异性EGFR/c-Met分子以便通过在分子的C-端处结合游离半胱氨酸来增加流体动力学半径。最通常地，半胱氨酸残基的游离硫醇基团用于使用标准方法附接PEG分子，该PEG分子用马来酰亚胺或碘乙酰胺基团官能化。各种形式的PEG可用于修饰蛋白质，所述蛋白质包含1000、2000、5000、10,000、20,000、或40,000kDa的线性PEG。这些分子量的分支PEG分子也可用于修饰。在一些情况下，PEG基团也可通过双特异性EGFR/c-Met分子中的伯胺附接。

除了聚乙二醇化之外，双特异性EGFR/c-Met分子的半衰期通过产生这些蛋白质作为具有天然存在的3-螺旋束血清白蛋白结合结构域(ABD)或共有白蛋白结合结构域(ABDCon)的融合分子而延长。通过表16中所述的接头中的任一者将这些蛋白质结构域连接到c-Met-结合FN3结构域的C-端。ABD或ABDCon结构域也可在一级序列中置于EGFR-结合FN3结构域与c-Met结合FN3结构域之间。

实例10：所选双特异性EGFR/c-Met分子的表征

对所选EGFR/c-Met分子表征其与EGFR和c-Met两者的亲和力，其抑制EGFR和c-Met自磷酸化的能力，以及其对HGF细胞的增殖的影响。根据实例3中所述的方案，双特异性EGFR/c-Met分子与重组EGFR和/或c-Met胞外结构域的结合亲和力通过使用Proteon仪器(BioRad)的表面等离子体共振方法来进一步分析。表征的结果示于表21中。

表21

实例11：经半胱氨酸改造的双特异性抗EGFR/c-Met分子的生成和表征

双特异性EGFR/c-Met分子的生成

根据由P54AR4-83v2突变体(实例5)的半胱氨酸扫描生成的数据，半胱氨酸突变体也被设计在称为ECB147(SEQ ID NO：218和256)的双特异性抗EGFR/c-Met分子中，该分子由P54AR4-83v2(SEQ ID NO：27)、cMet结合物P114AR7P95-C5v2(SEQ ID NO：114)、以及用于半衰期延长的白蛋白结合结构域组成。这三个结构域由(Ala-Pro)₅接头(SEQ ID NO：81)连接。具有一个、两个或四个半胱氨酸的变体被设计为在FN3结构域(SEQ ID NO：219-225和257-263)之一的C-端处、接头区域中、或赖氨酸-62位置处具有取代。另一个双特异性变体，ECB82cys(SEQ ID NO：226和264)由P54AR4-83v2(SEQ ID NO：27)、P114AR7P94-A3v22(SEQID NO：111)、和白蛋白-结合结构域的变体(所有三个结构域由AP接头连接)、以及单个C-端半胱氨酸组成。非靶向Tencon支架(SEQ ID NO：265)的额外半胱氨酸变体也被用于构建对照缀合物。如之前实例中所述对所有变体进行构建、表达和纯化。通过SDS-PAGE分析来评估纯度。使用Superdex 75 5/150柱(GE Healthcare)的分析型尺寸排阻色谱法表明FN3结构域制剂在符合单体蛋白的时间处不含聚集体和洗脱物。质谱测定的质量符合理论质量(表22)。

表22

化学缀合

为了将纯化的双特异性半胱氨酸变体化学缀合到含有马来酰亚胺的分子，首先用TCEP还原蛋白质以生成游离硫醇。将1-2mg的每个双特异性半胱氨酸变体与过量的TCEP在中性pH(Sigma产品目录号646547)下混合，并且于室温下温育30-60分钟。通过添加3倍体积的饱和硫酸铵溶液(4.02M)来去除TCEP，以沉淀半胱氨酸变体。在以16000-20000x g于4℃下离心20分钟并且去除上清液之后，将蛋白质沉淀物溶解于PBS或磷酸钠缓冲液中，并且立即与5倍至10倍过量的含有马来酰亚胺的分子混合。将反应物在室温下温育30-60分钟，然后用过量的游离硫醇(诸如半胱氨酸或β-巯基乙醇)淬灭以清除过量的马来酰亚胺。用Zeba脱盐柱(Thermo产品目录号89890)，通过采用Tosoh G3000SWxl柱(产品目录号P4619-14N，7.8mm×30cm，5μm)的制备级SEC，或通过将半胱氨酸变体与Ni-NTA树脂结合、洗涤并基本上如上所述洗脱，从而去除未结合的马来酰亚胺。缀合物通过SDS-PAGE和质谱法进行表征。该一般方法用于将双特异性半胱氨酸变体缀合到荧光素马来酰亚胺(Thermo产品目录号62245)、PEG24-马来酰亚胺(Quanta Biodesign产品目录号10319)、以及具有各种接头的马来酰亚胺-细胞毒素分子(参见图2中的结构)。

EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制

使用来自Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD)的EGFR磷酸(酪氨酸1173)试剂盒对纯化的双特异性PEG24-马来酰亚胺缀合物测试其抑制人肿瘤细胞系NCI-H292(Amuerican Type Culture Collection，产品目录号CRL-1848)中的EGFR的EGF刺激的磷酸化的能力，如实例3中所述。将该缀合物与未修饰的ECB38(SEQ ID No.109)进行比较，该未修饰的ECB38与ECB147的不同之处在于两个氨基酸。如表23所示，该缀合物与ECB38以相似的IC₅₀值抑制EGFR，从而表明在设计位点处的修饰不显著影响靶结合。

表23

蛋白质名称	IC₅₀(nM)
		ECB38	2.3
ECB147v3-PEG24	1.6
		ECB147v5-PEG24	0.9
ECB147v6-PEG24	1.4
		ECB147v7-PEG24	1.4

HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制

使用来自Meso Scale Discovery(Gaithersburg，MD)的c-Met磷酸(酪氨酸1349)试剂盒对纯化的双特异性PEG24-马来酰亚胺缀合物抑制NCI-H292细胞中的c-Met的由HGF刺激的磷酸化的能力进行测试，并且如实例7中所述。如表24所示，该缀合物与ECB38以相似的IC₅₀值抑制c-Met，从而表明在这些位点处的修饰不显著改变靶结合。

表24

蛋白质名称	IC₅₀(nM)
		ECB38	1.3
ECB147v3-PEG24	0.5
		ECB147v5-PEG24	0.4
ECB147v6-PEG24	0.4
		ECB147v7-PEG24	0.5

细胞毒性测定

对由连接到来自奥瑞斯他汀家族的细胞毒性微管蛋白抑制剂的ECB147半胱氨酸变体、83v2-cys或Tencon-cys组成的缀合物(图2)进行癌细胞中的靶依赖性细胞毒性的测试。抑制剂通过不可裂解PEG₄接头或酶裂解缬氨酸-瓜氨酸或缬氨酸-赖氨酸接头连接到含有半胱氨酸的蛋白质。通过测量EGFR-过表达人肿瘤细胞系H1573和A431以及EGFR-阴性肿瘤细胞系MDA-MB-435的活力，然后使用实例4中所述的步骤暴露于蛋白质-细胞毒素缀合物来评估细胞杀伤。表25记录了从在66、72或90小时的时间点处的CellTiter Glo或IncuCyte对象计数数据的分析获得的IC₅₀值。蛋白质-药物缀合物显示出表达靶抗原EGFR的细胞的有效细胞杀伤。在所测试的许多细胞系中，多药物缀合物也表现出增加的细胞毒性。

表25

序列表

SEQ ID NO：73，PRT，智人，EGFR

SEQ ID NO：75，PRT，智人，腱生蛋白-C

＞SEQ ID NO：101

PRT

智人

cMet

＞SEQ ID NO：179

PRT

人工

EGFR结合FN3结构域的FG环

HNVYKDTNX₉RGL；

其中X₉为M或I。

＞SEQ ID NO：180

PRT

人工

EGFR结合FN3结构域的FG环

LGSYVFEHDVML(SEQ ID NO：180)。

＞SEQ ID NO：181

PRT

人工

EGFR结合FN3结构域的BC环

X₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈(SEQ ID NO：181)；其中

X₁为A、T、G或D；

X₂为A、D、Y或W；

X₃为P、D或N；

X₄为L或不存在；

X₅为D、H、R、G、Y或W；

X₆为G、D或A；

X₇为A、F、G、H或D；并且

X₈为Y、F或L。

＞SEQ ID NO：182

PRT

人工

EGFR结合FN3结构域

LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWX₁X₂X₃X₄X₅X₆X₇X₈DSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVHNVYKDTNX₉RGLPLSAEFTT(SEQ ID NO：182)，

X₁为A、T、G或D；

X₂为A、D、Y或W；

X₃为P、D或N；

X₄为L或不存在；

X₅为D、H、R、G、Y或W；

X₆为G、D或A；

X₇为A、F、G、H或D；

X₈为Y、F或L；并且

X₉为M或I

＞SEQ ID NO：183

PRT

人工

EGFR结合FN3结构域

其中

X₁为A、T、G或D；

X₂为A、D、Y或W；

X₃为P、D或N；

X₄为L或不存在；

X₅为D、H、R、G、Y或W；

X₆为G、D或A；

X₇为A、F、G、H或D；并且

X₈为Y、F或L。

＞SEQ ID NO：184

PRT

人工

C-met结合FN3结构域C链和CD环序列

DSFX₁₀IRYX₁₁E X₁₂X₁₃X₁₄X₁₅GX₁₆(SEQ ID NO：184)，其中

X₁₀为W、F或V；

X₁₁为D、F或L；

X₁₂为V、F或L；

X₁₃为V、L或T；

X₁₄为V、R、G、L、T或S；

X₁₅为G、S、A、T或K；并且

X₁₆为E或D；以及

＞SEQ ID NO：185

PRT

人工

c-Met结合FN3结构域F链和FG环

TEYX₁₇VX₁₈IX₁₉X₂₀V KGGX₂₁X₂₂SX₂₃(SEQ ID NO：185)，其中

X₁₇为Y、W、I、V、G或A；

X₁₈为N、T、Q或G；

X₁₉为L、M、N或I；

X₂₀为G或S；

X₂₁为S、L、G、Y、T、R、H或K；

X₂₂为I、V或L；并且

X₂₃为V、T、H、I、P、Y、T或L。

＞SEQ ID NO：186

PRT

人工

c-Met结合FN3结构域

其中

X₁₀为W、F或V；并且

X₁₁为D、F或L；

X₁₂为V、F或L；

X₁₃为V、L或T；

X₁₄为V、R、G、L、T或S；

X₁₅为G、S、A、T或K；

X₁₆为E或D；

X₁₇为Y、W、I、V、G或A；

X₁₈为N、T、Q或G；

X₁₉为L、M、N或I；

X₂₀为G或S；

X₂₁为S、L、G、Y、T、R、H或K；

X₂₂为I、V或L；并且

X₂₃为V、T、H、I、P、Y、T或L。

＞SEQ ID NO：187

PRT

人工

包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的EGFR FN3结构域

X₂₄为E、N或R；

X₂₅为E或P；

X₂₆为L或A；

X₂₇为H或W；

X₂₈为E或D；

X₂₉为E或P；

X₃₀为N或V；

X₃₁为G或Y；

X₃₂为M或I；并且

X₃₃为E或I；

＞SEQ ID NO：188

包含EGFR/c-Met FN3结构域的双特异性分子的c-Met FN3结构域

X₃₄为E、N或R；

X₃₅为E或P；

X₃₆为L或A；

X₃₇为E或P；

X₃₈为V或L；

X₃₉为G或S；

X₄₀为S或K；

X₄₁为E或D；

X₄₂为N或V；

X₄₃为L或M；

X₄₄为G或S；

X₄₅为S或K；并且

X₄₆为E或I。

Claims

1.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含在选自FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处的至少一个半胱氨酸取代，其中所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1。

2.根据权利要求1所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中所述半胱氨酸取代位于选自SEQ ID NO:111-114或122-137的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处。

3.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其中所述分离的经半胱氨酸改造的FN3结构域特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合。

4.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列，其中至少一个半胱氨酸取代来自SEQ ID NO:114的氨基酸序列，其中所述分离的经半胱氨酸改造的FN3特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。

5.根据权利要求1所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其还包含半衰期延长部分。

6.根据权利要求6所述的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其中所述半衰期延长部分为结合白蛋白的分子、聚乙二醇(PEG)，或免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。

7.一种制备经半胱氨酸改造的FN3结构域的方法，其包括：

(i) 通过用编码半胱氨酸氨基酸残基的核苷酸残基替换一个或多个核苷酸残基来诱变亲本FN3结构域的核酸序列，以编码所述经半胱氨酸改造的FN3结构域；

(ii) 表达所述经半胱氨酸改造的FN3结构域；以及

(iii) 回收所述经半胱氨酸改造的FN3结构域。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述FN3结构域基于SEQ ID NO:1，并且所述诱变步骤包括进行定点诱变。

9.根据权利要求8所述的方法，其包括在大肠杆菌(E.coli)中表达所述经半胱氨酸改造的FN3结构域。

10.根据权利要求8所述的方法，其还包括在所述回收步骤之后：将所述经半胱氨酸改造的FN3结构域与硫醇反应性化学试剂反应，以生成化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域。

11.根据权利要求10所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，测量所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域的EGFR结合。

12.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，在添加所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域之后测量EGFR过表达肿瘤细胞系的细胞生长的抑制。

13.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，测量所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域的c-Met结合。

14.根据权利要求11所述的方法，其还包括在所述反应步骤之后，在添加所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域之后测量c-Met表达肿瘤细胞系的细胞生长的抑制。

15.根据权利要求11所述的方法，其中所述硫醇反应性试剂包含马来酰亚胺部分。

16.根据权利要求15所述的方法，其中包含所述马来酰亚胺部分的所述硫醇反应性试剂选自NEM、MMAE和MMAF。

17.根据权利要求16所述的方法，其中在EGFR过表达H1573细胞中测量时，所述化学缀合的经半胱氨酸改造的FN3结构域具有介于约1.7×10^-10M和约1.3×10^-9M之间的细胞生长IC₅₀值。

18.一种分离的经半胱氨酸改造的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其包含选自SEQ IDNO:189-216和227-254的氨基酸序列。

19.一种分离的经半胱氨酸改造的双特异性FN3分子，其包含第一III型纤连蛋白(FN3)结构域和第二FN3结构域，其中所述第一FN3结构域包含在选自所述第一FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处的半胱氨酸取代，特异性地结合表皮生长因子受体(EGFR)并阻碍表皮生长因子(EGF)与EGFR的结合，并且所述第二FN3结构域特异性地结合肝细胞生长因子受体(c-Met)并阻碍肝细胞生长因子(HGF)与c-Met的结合。

20.根据权利要求20所述的分离的经半胱氨酸改造的双特异性FN3分子，其中所述第二FN3结构域包含在选自所述第二FN3结构域的残基6、8、10、11、14、15、16、20、30、34、38、40、41、45、47、48、53、54、59、60、62、64、70、88、89、90、91和93的位置处的半胱氨酸取代。

21.根据权利要求20所述的分离的经半胱氨酸改造的双特异性FN3分子，其包含选自SEQ ID NO:219-226和257-264的氨基酸序列。

22.根据权利要求20所述的分离的经半胱氨酸改造的双特异性分子，其中所述分子化学缀合至硫醇反应性试剂。

23.根据权利要求22所述的分离的经半胱氨酸改造的双特异性分子，其中所述硫醇反应性试剂为马来酰亚胺部分。

24.根据权利要求23所述的分离的经半胱氨酸改造的双特异性分子，其中所述马来酰亚胺部分选自NEM、PEG24-马来酰亚胺、荧光素马来酰亚胺、MMAE和MMAF。

25.根据权利要求24所述的经半胱氨酸改造的双特异性分子，其中当在NCI-H292细胞中使用50ng/mL人EGF测量时，所述第一FN3结构域以介于约0.9×10^-9M和约2.3×10^-9M之间的IC₅₀值抑制在EGFR残基酪氨酸1173处EGF诱导的EGFR磷酸化，并且当在NCI-H292细胞中使用100ng/mL人HGF测量时，所述第二FN3结构域以介于约4×10^-10M和约1.3×10^-9M之间的IC₅₀值抑制在c-Met残基酪氨酸1349处HGF诱导的c-Met磷酸化。

26.根据权利要求25所述的经半胱氨酸改造的双特异性分子，其中所述经半胱氨酸改造的双特异性分子具有选自以下的细胞生长IC₅₀值：

(i) 当在EGFR过表达H1573细胞中测量时，介于约5.0×10^-11M和约5.8×10^-10M之间；以及

(ii) 当在EGFR过表达A731细胞中测量时，介于约7.8×10^-12M和约1.1×10^-9M之间。

27.根据权利要求26所述的经半胱氨酸改造的双特异性分子，其还包含半衰期延长部分。

28.根据权利要求27所述的经半胱氨酸改造的双特异性分子，其中所述半衰期延长部分为结合白蛋白的分子、聚乙二醇(PEG)，或免疫球蛋白的Fc区的至少一部分。

29.一种制备分离的经半胱氨酸改造的双特异性分子的方法，其包括：

(i) 通过用编码半胱氨酸残基的核苷酸残基替换一个或多个核苷酸残基来诱变亲本双特异性分子的核酸序列，以编码所述经半胱氨酸改造的双特异性分子；

(ii) 表达所述经半胱氨酸改造的双特异性分子；以及

(iii) 回收所述经半胱氨酸改造的双特异性分子。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述诱变步骤包括进行定点诱变。

31.根据权利要求30所述的方法，其包括在大肠杆菌(E.coli)中表达所述经半胱氨酸改造的双特异性分子。

32.根据权利要求30所述的方法，其还包括在所述回收步骤之后：将所述经半胱氨酸改造的双特异性分子与硫醇反应性化学试剂反应，以生成化学缀合的经半胱氨酸改造的双特异性分子。

33.根据权利要求32所述的方法，其还包括选自以下的步骤：

(i) 测量所述化学缀合的经半胱氨酸改造的双特异性分子的EGFR结合；

(ii) 测量因所述化学缀合的经半胱氨酸改造的双特异性分子导致的在细胞系中的EGF刺激的EGFR磷酸化的抑制；

(iii) 测量因所述化学缀合的经半胱氨酸改造的双特异性分子导致的在细胞系中的HGF刺激的c-Met磷酸化的抑制；以及

(iv) 测量在添加所述化学缀合的经半胱氨酸改造的双特异性分子之后EGFR过表达肿瘤细胞系的细胞生长的抑制。

34.本文所述的任何发明。