CN108743966B - 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物 - Google Patents
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Abstract
将目标抗体的重链235位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C)，轻链205位缬氨酸(V)改造为半胱氨酸(C)，并通过此改造后的半胱氨酸的游离巯基(‑SH)与偶联了小分子高活性细胞毒素(Payload)的mc‑vc‑PAB‑OH连接子进行定点偶联，形成均一性优良的半胱氨酸改造的抗体‑毒素偶联物，其毒素比抗体比例(DAR)为3.2‑4.0。此抗体‑毒素偶联物具有通式：2C3‑HC‑S235C‑LC‑V205C‑mc‑vc‑PAB‑payload。同时，本发明还披露了此TDC药物的制备、纯化方法，在表达EGFRvIII及过表达EGFRwt的肿瘤的治疗应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种化合物及其制备方法和用途，特别涉及一类半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)及其制备方法和用途。
背景技术
表皮生长因子受体EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)是一种糖蛋白，属于ErbB受体家族的一种，该家族包括EGFR(ErbB-1),HER2/c-neu(ErbB-2),Her 3(ErbB-3)和Her 4(ErbB-4)。EGFR是上皮生长因子(EGF)细胞增殖和信号传导的受体，贯通细胞膜，分子量170KDa，靠与配体结合来激活。激活后，EGFR由单体转化为二聚体。EGFR还可能和ErbB受体家族的其他成员聚合来激活，例如ErbB2/Her2/neu。
EGFR通常低量表达于多种正常组织细胞，包括皮肤、肝脏等，与正常生理作用相关。
EGFR过表达与多种肿瘤的发生与发展相关，包括头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、结直肠癌、脑胶质瘤、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌(Atalay et al.,2003；Herbst and Shin,2002)。
多种肿瘤在过量表达野生型EGFR(EGFRwt)的同时也表达突变型的EGFR，EGRFvIII(de2-7 EGFR)。EGRFvIII是EGFRwt第6-273氨基酸缺失的EGFR突变型(Sugawa et al.,1990)，介导配体非依赖型的细胞持续活化。EGRFvIII被报道于多种肿瘤中，包括脑胶质瘤、乳腺癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和前列腺癌(Wikstrand et al.,1997；OlapadeOlaopa etal.,2000)。EGRFvIII的出现往往预示肿瘤预后不良。
EGRFvIII特异性表达于肿瘤细胞组织中，正常组织细胞不表达EGRFvIII，这为靶向治疗提供了良好的靶点。
抗体-毒素偶联物(Antibody drug conjugate,ADC)是靶向治疗的热点领域，已在美国获批上市的两个药物Adcetris和Kadcyla表现出良好的临床疗效，并且有超过50个ADC药物在进行临床阶段研究。
以EGFRvIII为靶点的通过链间二硫键巯基非定点偶联的ADC药物ABT-414已在美国进行临床II期试验，体现出一定的临床效果，但由于其采用非定点偶联方式，其药物均一性差，对病人造成较严重的毒副作用，限制了其临床用药量，直接影响了其临床治疗效果。
发明内容
本发明的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)具有通式：2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload。其中2C3是亲本抗体2A1重链237位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C),轻链205位缬氨酸(V)改造为半胱氨酸(C)后的抗体。2C3的轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:6，2C3的重链氨基酸序列为SEQ ID NO:8。2C3的亲本抗体2A1轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:10，重链氨基酸序列为SEQ ID NO:12。2C3保持了其亲本抗体2A1与抗原结合的能力(亲和力)，抗原为人的野生型表皮生长因子受体(EGFRwt)及人的突变型表皮生长因子受体(de2-7EGFR/EGRFvIII)。2C3通过其重链237位和轻链205位改造的半胱氨酸巯基与mc-vc-PAB-payload进行抗体-毒素偶联物(TDC)定点偶联，毒素比抗体比例DAR为3.2-4.0。本发明的化合物半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)药物主要用于治疗表达EGFRvIII及过表达EGFRwt的肿瘤，包括脑胶质癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结直肠癌、膀胱癌、结直肠癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌等。
附图说明
图1为本发明RP-HPLC检测2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC DAR实验结果图；图2-图5为实施例26实验结果图。图6-图7为实施例27实验结果图；图8-图15为实施例28实验结果图；图16-图17为实施例29实验结果图；图18为实施例30实验结果图。
具体实施方式
本说明书中公开的所有特征，或公开的所有方法或过程中的步骤，除了互相排斥的特征和/或步骤以外，均可以以任何方式组合。
实施例1 mc的合成
于30ml冰醋酸中加入6-氨基己酸3.9g(0.03mol)和1.2eq的马来酸酐3.5g(0.036mol)。反应液于120℃搅拌反应4～6h。反应完毕后，停止加热，自然冷却到室温。60℃减压浓缩除去大部分醋酸。所得棕黄色粘稠液倒入水中，再加入乙酸乙酯20ml×3萃取，合并有机层。有机层依次用水、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩得到棕黄色油状物，加入50ml水搅拌，有类白色固体析出，过滤，50℃减压干燥的目标产品5.08g，收率80％。mp：89-92℃。m/z：212.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,DMSO)：13.21(br,1H,COOH)、6.75(s,2H,COCH＝CHCO)、3.63(t,2H,J＝7.2Hz,NCH2CH2)、2.42(t,2H,J＝7.4Hz,CH2COOH)、1.52-1.68(m,4H,NCH2CH2CH2CH2)、1.30-1.42(m,2H,NCH2CH2CH2CH2)。
实施例2 Mc-OSu的合成
在氮气保护下于50ml乙腈中加入4.7g(22mmol)MC和25g(22mmol)HOSu。另取4.5g(22mmol)DCC溶于25ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于0℃反应2小时后再室温反应过夜。过滤，滤饼用乙腈10ml×3洗涤，滤液减压浓缩至干。所得油状物于室温减压干燥6h得到浅棕色固体6.4g，收率95％。(不纯化直接投下一步反应)m/z：309.2[M+H]+。1HNMR(400Mz,CDCl3)：1～2(m,6H,CCH2CH2CH2C)、2.68(t,2H,CH2CO)，2.95(s,4H,COCH2CH2CO)、3.68(t,2H,CH2N)、6.81(s,2H,CH＝CH)。
实施例3 Fmoc-Val-OSu的合成
于100mlTHF中加入Fmoc-Val 10g和HOSu 3.4g。另取DCC6g溶于50ml乙腈中，保持内温在0℃左右，将其缓慢滴入反应液中。反应液于室温搅拌反应24小时。过滤，滤饼用THF洗涤，滤液减压浓缩得到透明油状物。油状物未经纯化直接投下一步反应。m/z：437.4[M+H]+。
实施例4 Fmoc-vc的合成
于20mlTHF中加入Cit 4.0g(1.05eq)和碳酸氢钠的水溶液60ml(NaHCO32g,1.05eq)。另取22.35mmolFmoc-Val-OSu溶于60mlDME中，再将其加入反应液中。反应液于室温下搅拌反应24小时。反应完毕后，向体系中加入15％柠檬酸水溶液110ml，然后再用EA萃取两次，合并有机层，减压浓缩得到白色固体。并向白色固体中加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼于40℃减压干燥4h得产品4.83g，收率65％。m/z：497.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.92(6H,m)、1.35～1.65(4H,m)、2.10(1H,m)、3.01(2H,q)、3.99(1H,t)、4.01-4.45(2H,m)、4.45(2H,t)、5.46(2H,br)、6.03(1H,t)、7.20-8.02(8H,m)、8.25(1H,d)。
实施例5 Fmoc-vc-PABOH的合成
于反应瓶中加入DCM/MeOH＝2/1混合溶剂60ml，再加入Fmoc-vc 2g(4.2mmol)和PABOH 1.04g(2eq)，搅拌溶解部分后再加入EEDQ 2.0g(2eq)。反应体系在室温条件下避光搅拌反应2.0d。反应完毕后，40℃减压浓缩得到白色固体。收集白色固体，加入甲基叔丁基醚100ml搅洗，过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，所得白色固体40℃减压干燥得到2.2g，收率约88％。m/z：602.6(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.95(6H,m)、1.45～1.69(4H,m)、2.10(1H,m)、3.11(2H,m)、3.99(1H,m)、4.30(2H,d)、4.05～-4.66(2H,m)、4.55(2H,d)、5.21(1H,t)、5.51(2H,br)、6.11(1H,t)、7.09-8.10(12H,m)、8.21(1H,d)、10.51(1H,br)。
实施例6 vc-PABOH的合成
于10mlNMP中加入Fmoc-vc-PABOH 490mg(0.815mmol)搅拌溶解，再加入二乙胺2ml。于室温下搅拌反应24h。反应完毕后，于40℃减压浓缩，所得油状物中加入20mlDCM搅拌析晶，过滤，滤饼用DCM洗涤，所得固体减压干燥得到277mg,收率90％。m/z：380.2(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.89(6H,m),1.31～1.61(4H,m),1.82(1H,m),2.86(1H,m),2.89(2H,d),4.38(2H,d),4.44(1H,m),5.01(1H,br),5.35(2H,br),5.84(1H,br),7.14(2H,d),7.42(2H,d),8.08(1H,br),9.88(1H,br)。
实施例7 mc-vc-PABOH的合成
于10mlNMP中加入vc-PABOH 235mg(0.54mmol)和MC-OSu 184mg(1.1eq)，加毕于室温下搅拌反应24h。反应完毕，于40℃减压浓缩，所得油状物中加入20ml甲基叔丁基醚搅拌析晶。过滤，滤饼用甲基叔丁基醚洗涤，得到310mg产品，收率100％。m/z:573.3(M+H)+。1HNMR(400Mz,DMSO):0.89(6H,m)、1.15-1.99(10H,m)、2.11(1H,m)、2.31(2H,t)、3.21(2H,m)、3.53(2H,t)、4.32(1H,t)、4.51(1H,m)、4.59(2H,br)、5.24(1H,br)、5.56(2H,br)、6.20(1H,br)、7.12(2H,s)、7.23(2H,d),7.58(2H,d)、7.94(1H,d),8.1 7(1H,d)、10.21(1H,br)。
实施例8 mc-vc-PAB-PNP的合成
在氮气保护下取mc-vc-PABOH 168.6mg(0.294mmol)溶于5ml无水吡啶中，反应体系冷却到0℃左右。另取PNP179mg(3eq)溶于5mlDCM中，再将其缓慢加入到反应体系中。并于0℃左右保持10min后除去冰浴，再于室温搅拌反应3h。反应完毕，加入70mlEA和100ml 15％柠檬酸水溶液，分取有机层。有机层依次用柠檬酸，水，饱和食盐水洗涤，再无水硫酸钠干燥，过滤，滤液减压浓缩至干得到浅黄色油状物，加入甲基叔丁基醚析晶得到类白色固体86mg,收率40％。m/z:738(M+H)+。1HNMR(400Mz,CDCl3/CD3OD):0.84(6H,m)、1.11-1.84(10H,m)、2.05(1H,m)、2.15(2H,t)、3.09(2H,m)、3.32(2H,t)、4.12(1H,m)、4.38(1H,m)、5.15(2H,s)、6.61(2H,s)、6.84(1H,d),7.61(1H,d)、7.21(2H,d),7.50(2H,d)、7.61(2H,d),8.18(2H,d)、9.59(1H,br)。
实施例9 mc-vc-PAB-MMAE的合成
于2mlDMF中加入20mg mc-vc-PAB-PNP(1.5eq)和3mgHOBT。室温搅拌片刻后，加入13mgMMAE，0.5ml吡啶，25ulDIEA。反应液于室温下搅拌反应2d。反应完毕后，反应液直接用制备柱纯化，收集所需成分浓缩后冻干，得到约10mg产品，收率约42％。m/z:1317.1(M+H)+。
实施例10 mc-vc-PAB-MMAF的合成
按照实施例9的操作，得到mc-vc-PAB-MMAF约12.5mg，收率45.2％，m/z:1331.7(M+H)+。
实施例11 mc-vc-PAB-PBD的合成
按照实施例9的操作，得到mc-vc-PAB-PBD约9.5mg，收率32.5％，m/z:1325.4(M+H)+。
实施例12 mc-vc-PAB-DOX的合成
按照实施例9的操作，得到mc-vc-PAB-DOX约11.2mg，收率38.9％，m/z:1143.2(M+H)+。
实施例13 mc-vc-PAB-SN-38的合成
将100mg购买的10-O-Boc-SN-38用10ml干燥的二氯甲烷溶解后，加入25.6mg(1eq)DMAP，于0℃下滴加三光气的二氯甲烷溶液(62mg三光气用2ml二氯甲烷溶解)，滴毕，继续于0℃下反应12h，减压除去二氯甲烷，用10ml干燥的DMF溶解后，加入144mg mc-vc-PABOH，转至室温搅拌24h，经过制备液相分离得到mc-vc-PAB-SN-38 41mg，两步收率总的为19.7％，m/z:992.1(M+H)+。
实施例14 2C3抗体的表达与纯化
使用FreestyleTM 293-F(Invitrogen)悬浮细胞表达2C3抗体。转染前一天，以6×105个/mL密度将细胞接种于含300mL F17完全培养基(FreestyleTM F17表达培养基，Gibco公司)的1L摇瓶中，37℃，5％CO2，120rpm细胞培养摇床过夜培养。次日，用PEI进行抗体表达质粒的转染，其中质粒:PEI比例为2:1。转染后一天，按2.5％(v/v)加入TN1补料培养基，继续培养4天后离心收集上清。
收集得到的细胞表达上清，经Protein A亲和层析柱(Mabselect Sure LX，GE公司)，以0.1M柠檬酸(pH3.0)洗脱，捕获的抗体用1M Tris-HCl(pH9.0)按1/10(v/v)调节至pH7.0，再通过凝胶过滤层析柱SEC(Superdex 200，GE公司)去除多聚体和内毒素等杂质，同时将抗体缓冲液置换成PBS(pH7.4)，收集UV280nm目标峰样品经超滤离心管(30KD，Pall公司)浓缩至5mg/ml。
通过此方法获得的2C3抗体，浓度为5mg/ml，目标抗体单体(POI％)大于98％，用于后续试验。
实施例15通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-MMAE制备
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC样品
细胞表达的2C3抗体，经过Mabselect Sure纯化，低pH洗脱后马上加入Tris溶液中和，并换液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液。化合物mc-vc-PAB-MMAE，白色粉末，将其溶解于DMA中备用。为了去除突变半胱氨酸残基上的屏蔽物，需要先将抗体还原。按照20倍分子比将1M的DTT水溶液加入2C3抗体溶液中，混匀后20℃反应4小时。反应时间到后将样品的pH调整至5.0，并通过SP Sepharose F.F.阳离子交换层析去除样品中的DTT和屏蔽物。随后按照10倍分子比将DHAA溶液加入样品中，25℃避光反应3小时，使抗体链间二硫键重新连接。然后加入mc-vc-PAB-MMAE溶液，使得mc-vc-PAB-MMAE与抗体突变半胱氨酸进行偶联，充分混匀后25℃反应1小时。反应结束后使用SP Sepharose F.F.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-PAB-MMAE,得到2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC样品。
实施例16通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC。
实施例17通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-PBD制备
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-PBD TDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-PBD制备2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-PBDTDC。
实施例18通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-SN38制备
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-SN38 TDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-SN38制备2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-SN38 TDC。
实施例19通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-Dox制备
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-Dox TDC样品
按照实施例15的操作步骤，通过偶联2C3抗体和mc-vc-PAB-Dox制备2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-Dox TDC。
实施例20通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-Dox制备2A1-mc-vc-PAB–MMAE ADC样品
细胞表达的2A1抗体，经过Mabselect Sure纯化，低pH洗脱后马上加入Tris溶液中和，并换液为pH7.5的Tris-HCl缓冲液。Mc-vc-PAB-MMAE，白色粉末，将其溶解于DMA中备用。为了将抗体的链间二硫键打开，需要先将抗体还原。按照20倍分子比将1M的DTT水溶液加入2A1抗体溶液中，混匀后20℃反应4小时。反应时间到后将样品的pH调整至5.0，并通过SPSepharose F.F.阳离子交换层析去除样品中的DTT。然后加入mc-vc-PAB-MMAE溶液，使得mc-vc-PAB-MMAE与抗体与打开的链间二硫键的半胱氨酸残基进行偶联，充分混匀后25℃反应1小时。反应结束后使用SP Sepharose F.F.阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-PAB-MMAE。得到2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC样品。
实施例21通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备2A1-mc-vc-PAB–MMAF ADC样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-MMAF制备2A1-mc-vc-PAB–MMAF ADC。
实施例22通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-PBD制备2A1-mc-vc-PAB–PBD ADC样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-PBD制备2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC。
实施例23通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-SN38制备2A1-mc-vc-PAB-SN38ADC样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-SN38制备2A1-mc-vc-PAB-SN38ADC。
实施例24通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-Dox制备2A1-mc-vc-PAB–Dox ADC样品
按照实施例20的操作步骤，通过偶联2A1抗体和mc-vc-PAB-Dox制备2A1-mc-vc-PAB-Dox ADC。
实施例25 RP-HPLC检测毒素比抗体比例DAR
用高效液相色谱反向层析方法分析TDC及ADC样品，根据对应峰面积计算DAR。具体方法如下：
色谱柱：Proteomix RP-1000(4.6*100mm，5μm)；
流动相A：0.1％的TFA水溶液；B：0.1％的TFA乙腈溶液
1mg/ml的TDC和ADC中1M DTT储存液，使DTT终浓度为100mM，各样品混匀后于37℃水浴加热60min。
70％流动相A与30％流动相B平衡，流动相A与B梯度洗脱，80℃，214nm检测。DAR计算公式为：DAR＝[LC-1D面积/(LC面积+LC-1D面积)+HC-1D面积/(HC面积+HC-1D面积)]×2。
根据计算得到定点偶联DAR＝3.4，其化合物均一性很好。
附表1、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload TDC、2A1-mc-vc-PAB-payload ADC偶联效率DAR表
附表1显示，通过半胱氨酸改造进行定点偶联的TDC化合物偶联效率均较高(理论最高值为4.0)，DAR≥3.4，产品均一性显著好于通过抗体天然链间二硫键进行半胱氨酸非定点偶联的ADC化合物(DAR理论最高值为8.0)。
实施例26 SEC-HPLC检测TDC聚集情况
将TDC样品保存于37℃，第0、7、21天分别用SEC-HPLC分析其聚集情况，具体方法如下：
色谱柱：TSKgel SuperSW mAb HR(7.8mm×30cm)
流动相：0.15M，pH7.0的磷酸盐缓冲液。
25℃，214nm检测
SEC-HPLC检测2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC聚集情况，样品于37℃存放3周，聚集体含量变化很小；
SEC-HPLC检测通过抗体天然链间二硫键进行半胱氨酸非定点偶联的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC样品，样品偶联结束后立即检测，约有30％的聚集体，其中包括大量高分子量聚集体。
附表2、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-payload TDC、2A1-mc-vc-PAB-payload ADC目标单体含量列表
附表2显示，通过抗体天然链间二硫键进行半胱氨酸非定点偶联的ADC化合物目标单体含量显著低于通过半胱氨酸改造进行定点偶联的TDC化合物。
实施例27 TDC保持了骨架抗体2C3与原始抗体2A1对于EGFRvIII的亲和力
用间接ELISA法对比TDC、2C3及2A1对于EGFRvIII的相对亲和力。具体步骤如下：
重组EGFRvIII-His*6抗原包板；鱼皮明胶封闭；分别稀释2A1、2C3、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX TDC，最高浓度50ug/ml，4倍梯度稀释，共11个浓度；HRP标记的二抗孵育；TMB显色，检测450nm处吸收。检测结果以A450对浓度作图，如图3所示，2C3偶联后的TDC保持了与2A1相似的亲和力，EC50值很接近；说明2A1上重链S237C与轻链V205C的定点突变以及2C3与mc-vc-PAB-payload的定点偶联不影响其与EGFRvIII抗原的亲和力。
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC与2C3保持了2A1与抗原EGFRvIII的亲和力。
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-MMAE TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-PBD TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-SN38 TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-DOX TDC保持了2A1与抗原EGFRvIII的亲和力，2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc--PAB-payload可与多种小分子细胞毒素进行定点偶联并保持抗原-抗体亲和力。
实施例28细胞毒性药效检测
通过下列实验过程测定TDC及ADC的细胞毒性活性：将TDC及ADC分别加入到EGFR过量表达或EGFRvIII表达的人的肿瘤细胞培养基中，细胞培养72小时后测定细胞存活率。基于细胞的体外实验用于测定细胞存活率、细胞毒性和本发明TDC诱导的细胞程序性死亡。
通过细胞增殖试验测定抗体-毒素偶联物的体外药效。CellTiter
AqueousOneSolution Cell Proliferation Assay为商购的(Promega Corp.，Madison,WI)。CellTiter
AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(a)是一种用比色法来检测细胞增殖和细胞毒性实验中的活细胞数量的检测试剂。此试剂含有一个新型的四唑化合物[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium,inner salt；MTS]和一种电子偶联剂(phenazine ethosulfate；PES)。PES具有增强的化学稳定性，这使它可与MTS混合形成稳定的溶液。这种方便的“单溶液”模式，是在第一代CellTiter
AQueous Assay的基础上的改进，CellTiter
AQueous Assay中使用的电子偶联剂PMS与MTS溶液是分开提供的。MTS(Owen’s reagent)被细胞生物还原成为一种有色的甲臜产物，可直接溶解于培养基中(图1)。这种转化很可能是在代谢活跃的细胞中的脱氢酶产生的NADPH或NADH的作用下完成的。检测时，只需将少量的CellTiter
AQueous One Solution Reagent直接加入培养板孔的培养基中，孵育1–4小时，然后以酶标仪读取490nm的吸光度值。
在490nm处检测到的甲臜产物的量与培养中的活细胞数成正比。由于MTS的甲臜产物在组织培养基中可溶，CellTiter
AQueous One Solution Assay与MTT或INT法相比操作步骤更少。
本发明中采用A431(EGFR过表达细胞)和U87-EGFRvIII(EGFR突变体稳定细胞系)作为体外药效检测的研究体系。在96孔板中，进行细胞铺板6000/孔，24小时后，进行抗体加药。对A431的用药浓度为2uM-3.8nM，两倍稀释，对U87-EGFRvIII的用药浓度为2nM-0.4pM。处理72小时后MTS检测细胞活性。
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC、2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC、2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC对EGFRwt过表达的人皮肤鳞癌细胞A431的IC50检测结果。TDC细胞毒性活性优于ADC。
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-Dox TDC及其对应的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC、2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC、2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC、2A1-mc-vc-PAB-SN38ADC、2A1-mc-vc-PAB-Dox ADC对表达EGFRvIII的U87-EGFRvIII的IC50检测结果。TDC细胞毒性活性优于ADC。
附表3、TDC、ADC对EGFRwt过表达细胞系A431及EGFRvIII表达稳定性株U87-EGFRvIII细胞毒性IC50检测结果。
附表3结果显示，2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38 TDC、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-Dox TDC对EGFRwt过表达细胞系A431及EGFRvIII表达稳定性株U87-EGFRVIII细胞毒性活性优于其对应的2A1-mc-vc-PAB-MMAE ADC、2A1-mc-vc-PAB-MMAF ADC、2A1-mc-vc-PAB-PBD ADC、2A1-mc-vc-PAB-SN38 ADC、2A1-mc-vc-PAB-Dox ADC。
实施例29荷瘤小鼠药效检测
本发明中建立了U87-EGFRvIII荷瘤小鼠模型，以评价TDC和ADC偶联药物的体内药效。即以3×106 U87-EGFRvIII细胞通过皮下注射到4～6周鼠龄的BALB/c裸鼠两侧，待小鼠肿瘤平均大小生长至65～88mm3，随机分组，每组5只，在第0天，2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD、2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB-MMAF、2A1-mc-vc-PAB-PBD分别以1mg/kg剂量进行单次静脉给药，2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX、2A1-mc-vc-PAB-SN38、2A1-mc-vc-PAB-DOX以6mg/kg剂量给药。数据显示为测量时肿瘤平均体积±SE。
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD、2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB-MMAF、2A1-mc-vc-PAB-PBD在第0天，分别以1mg/kg剂量进行单次静脉给药。TDC组(2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD)抑瘤效果显著优于ADC组(2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB-MMAF、2A1-mc-vc-PAB-PBD)。2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX、2A1-mc-vc-PAB-SN38、
2A1-mc-vc-PAB-DOX在第0天，分别以6mg/kg剂量进行单次静脉给药。TDC组(2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX)抑瘤效果显著优于ADC组(2A1-mc-vc-PAB-SN38、2A1-mc-vc-PAB-DOX)。
实施例30大鼠毒性检测
本发明为评估半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物耐受性，采用正常Sprague-Dawley大鼠以单剂量静脉注射TDC或ADC(第一天)，其中
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAE、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-MMAF、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-PBD、2A1-mc-vc-PAB-MMAE、2A1-mc-vc-PAB-MMAF、2A1-mc-vc-PAB-PBD给药剂量为50mg/kg，2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-SN38、2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-DOX、2A1-mc-vc-PAB-SN38、2A1-mc-vc-PAB-DOX给药剂量为100mg/kg。给药后每天监测体重变化情况。第12天后处死大鼠。
TDC及ADC大鼠毒性检测，体重变化情况。在前5天，ADC组体重均持续下降，5天逐渐恢复；TDC组与对照组显著差异，表明TDC组安全性显著好于ADC组。
本发明并不限于由实施例中披露的具体实施方案的范围，这些实施例用来例示本发明的几个方面，在功能上等效的任意实施方案均属于本发明的范围。实际上，除本文所示和所述的以外，本发明的各种变型对本领域技术人员而言也是显而易见的并且属于本文所附权利要求的范围。
序列表
<110> 四川百利药业有限责任公司
<120> 半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 324
<212> DNA
<213> 2C3轻链可变区(（VL）DNA序列)
<400> 1
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60
atcacttgcc attcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagagacca 120
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggacgatga agttccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggagccgat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa acgt 324
<210> 2
<211> 108
<212> PRT
<213> 2C3轻链可变区(（VL）氨基酸序列)
<400> 2
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105
<210> 3
<211> 348
<212> DNA
<213> 2C3重链可变区(（VH）DNA序列)
<400> 3
gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctagc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattttg cctggaactg gattcggcag 120
tttccaggaa acaagctgga gtggatgggc tacataagtt atagtggtaa cactaggtac 180
aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgcgaca catccaagaa ccaattcttc 240
ctgcagttga actctgtgac tattgaggac acagccacat attactgtgt aacggcggga 300
cgcgggtttc cttattgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgca 348
<210> 4
<211> 112
<212> PRT
<213> 2C3重链可变区(（VH）氨基酸序列)
<400> 4
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
<210> 5
<211> 645
<212> DNA
<213> 2C3轻链(（LC）DNA序列)
<400> 5
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60
atcacttgcc attcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagagacca 120
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggacgatga agttccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggagccgat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc cctgcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 6
<211> 214
<212> PRT
<213> 2C3轻链(（LC）氨基酸序列)
<400> 6
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Cys Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 7
<211> 1341
<212> DNA
<213> 2C3重链(（HC）DNA序列)
<400> 7
gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctagc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattttg cctggaactg gattcggcag 120
tttccaggaa acaagctgga gtggatgggc tacataagtt atagtggtaa cactaggtac 180
aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgcgaca catccaagaa ccaattcttc 240
ctgcagttga actctgtgac tattgaggac acagccacat attactgtgt aacggcggga 300
cgcgggtttc cttattgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc tagcaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtgcgtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtaaatg a 1341
<210> 8
<211> 446
<212> PRT
<213> 2C3重链(（HC）氨基酸序列)
<400> 8
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Cys Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
<210> 9
<211> 645
<212> DNA
<213> 2A1轻链(（LC）DNA序列)
<400> 9
gacatcctga tgacccaatc tccatcctcc atgtctgtat ctctgggaga cacagtcagc 60
atcacttgcc attcaagtca ggacattaac agtaatatag ggtggttgca gcagagacca 120
gggaaatcat ttaagggcct gatctatcat ggaaccaact tggacgatga agttccatca 180
aggttcagtg gcagtggatc tggagccgat tattctctca ccatcagcag cctggaatct 240
gaagattttg cagactatta ctgtgtacag tatgctcagt ttccgtggac gttcggtgga 300
ggcaccaagc tggaaatcaa acgtacggtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360
tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420
cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480
gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540
ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600
ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttag 645
<210> 10
<211> 214
<212> PRT
<213> 2A1 轻链(（LC）氨基酸序列)
<400> 10
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Ser Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Ser Ile Thr Cys His Ser Ser Gln Asp Ile Asn Ser Asn
20 25 30
Ile Gly Trp Leu Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ser Phe Lys Gly Leu Ile
35 40 45
Tyr His Gly Thr Asn Leu Asp Asp Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Asp Tyr Tyr Cys Val Gln Tyr Ala Gln Phe Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 11
<211> 1341
<212> DNA
<213> 2A1重链(（HC）DNA序列)
<400> 11
gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctagc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60
acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattttg cctggaactg gattcggcag 120
tttccaggaa acaagctgga gtggatgggc tacataagtt atagtggtaa cactaggtac 180
aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgcgaca catccaagaa ccaattcttc 240
ctgcagttga actctgtgac tattgaggac acagccacat attactgtgt aacggcggga 300
cgcgggtttc cttattgggg ccaagggact ctggtcactg tctctgcagc tagcaccaag 360
ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggggg cacagcggcc 420
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc 480
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg gctgtcctac agtcctcagg actctactcc 540
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 600
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 660
aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc 720
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 780
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 840
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt 900
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 960
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg 1020
cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 1080
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 1140
gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac 1200
ggctccttct tcctctatag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac 1260
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc 1320
tccctgtctc cgggtaaatg a 1341
<210> 12
<211> 446
<212> PRT
<213> 2A1重链(（HC）氨基酸序列)
<400> 12
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Ser Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp
20 25 30
Phe Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Asn Thr Arg Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Ile Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Thr Ala Gly Arg Gly Phe Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr
210 215 220
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
225 230 235 240
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
245 250 255
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
260 265 270
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
275 280 285
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
290 295 300
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
305 310 315 320
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
325 330 335
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
340 345 350
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
355 360 365
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
370 375 380
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
385 390 395 400
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
405 410 415
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
420 425 430
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440 445
Claims (9)
1.半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物(TDC)， 具有通式：
2C3-HC-S237C-LC-V205C-mc-vc-PAB-payload；
其中2C3是目标抗体重链237位丝氨酸(S)改造为半胱氨酸(C),轻链205位缬氨酸(V)改造为半胱氨酸(C)后的抗体；2C3轻链氨基酸序列为SEQ ID NO:6，重链氨基酸序列为SEQ IDNO:8。
2.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中mc-vc-PAB-OH连接子为：
3.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中Payload选自MMAE、MMAF、PBD、SN-38或Dox；
MMAE、MMAF、PBD、SN-38及Dox分子式为：
4.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其中毒素比抗体比例(DAR)为3.2-4.0。
5.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，mc-vc-PAB连接子与抗体进行定点偶联的位点氨基酸序列为：LLGGPCVFLFP与GLSSPCTKSFN，其中，C为目标抗体重链237位丝氨酸与轻链205位缬氨酸改造的半胱氨酸。
6.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，2C3抗体选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。
7.权利要求2所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，2C3抗体轻链保守区选自kappa和lamda序列。
8.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其适应症为表达EGFRvIII及过表达EGFRwt的肿瘤，包括脑胶质癌、非小细胞肺癌、头颈癌、结直肠癌、膀胱癌、肾癌、前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌。
9.权利要求1所述的半胱氨酸改造的抗体-毒素偶联物，其主要定点偶联步骤为：首先使用DTT还原抗体，解除抗体上改造的半胱氨酸残基上的屏蔽，并通过阳离子交换层析去除DTT与屏蔽物；然后使用DHAA氧化抗体，使抗体的链间二硫键重新连接；最后加入mc-vc-PAB-payload与抗体改造的半胱氨酸残基偶联，并通过阳离子交换层析去除未偶联上抗体分子的mc-vc-PAB-payload。
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