KR20220015445A - 항체-약물 접합체의 투약 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항체-약물 접합체 (ADC) 의 약학 제제, 투여 요법 및 투여 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, ADC 는 항암제, 예컨대 토포이소머라제 I 억제제에 링커를 통해 연결된 항-영양막 세포 표면 항원 2 (TROP2) 항체로 구성된다.
Description
본 발명은 항체-약물 접합체 (ADC) 의 약학 제제, 투여 요법 및 투여 분야에 관한 것이다. 더욱 구체적으로, ADC 는 엑사테칸의 유도체와 같은 토포이소머라제 I 억제제에 링커를 통해 연결된 항-영양막 세포 표면 항원 2 (TROP2) 항체로 구성된다.
관련 출원
이 출원은 2019년 5월 29일자로 출원된 미국 가출원 제 62/853,970 호, 및 2019년 9월 5일자로 출원된 미국 가출원 제 62/896,478 호에 대해 35 U.S.C. § 119(e) 하에 우선권을 주장하고, 이의 전체 내용은 참조에 의해 본원에 통합된다.
이하의 논의는 독자가 본 발명을 이해하는데 도움을 주기 위한 것일 뿐, 이에 대한 선행 기술을 설명하거나 구성하는 것으로 인정되지 않는다.
영양막 세포 표면 항원 2 (TROP2) 는 Tacstd2 유전자에 의해 코딩되는 323 개 아미노산의 막관통 당단백질이다. 이는 많은 암에서 차등적으로 발현되는 세포내 칼슘 신호 변환기이다 (Ripani E, et al., Int. J. Cancer, 76(5), 671-676 (1998), and El Sewedy T, et al., Int. J. Cancer, 75(2), 324-330 (1998)). 이것은 자기 재생, 증식, 침입, 및 생존을 위해 세포에 신호를 보낸다. TROP2 는 인간 영양막 및 암 세포에 공통적인, 면역 저항성에 추가적으로 관여한다 (Faulk WP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.75(4), 1947-1951 (1978), 및 Lipinski M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78(8), 5147-5150 (1981)). 인간 TROP2 의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 공용 데이터베이스에서, 예를 들어, Accession Nos. NM_002353 및 NP_002344 (NCBI) 로 이용가능하다.
TROP2 는 정상 상피 세포에서의 낮은 발현 수준에 비해 다양한 상피 세포 암종에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다. TROP2 의 발현은 또한 그 중에서도, 결장직장암 (Ohmachi T, et al., Clin. Cancer Res., 12(10), 3057-3063 (2006)), 위암 (Muhlmann G, et al., J. Clin. Pathol., 62(2), 152-158 (2009)), 췌장암 (Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99(8), 1290-1295 (2008)), 구강암 (Fong D, et al., Mod. Pathol., 21(2), 186-191 (2008)), 및 신경교종 (Ning S, et al., Neurol. Sci., 34(10), 1745-1750 (2013)) 의 불량한 예후와 상관관계가 있는 것으로 보고되었다. 결장직장암 세포를 모델로서 사용하여, TROP2 의 발현이 종양 세포의 스캐폴드-비의존성 세포 성장 및 면역결핍 마우스에서의 종양형성에 관여하는 것으로 추가로 보고되었다 (Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7(2), 280-285 (2008)).
TROP2 가 다양한 유형의 암과 관련되어 있으므로, 다수의 항-TROP2 항체를 제조하고 연구하였다. 이들 항체 중에서, 누드 마우스 이종이식 모델에서 일부 항종양 활성을 나타내는 비접합 항체 (국제 특허 공개 번호 WO2008/144891, WO2011/145744, WO2011/155579, 및 WO2013/077458) 뿐만 아니라, 항체-약물 접합체 (ADC) 로서 항종양 활성을 나타내는 항체 (국제 특허 공개 번호 WO2003/074566, WO2011/068845, 및 WO2013/068946, 및 미국 특허 번호 7999083) 에 대한 보고가 있었다. 그러나, 항-TROP2 항체 및 ADC 의 강도 및 커버리지는 현재까지 불충분하였고, 치료 표적으로서 TROP2 를 이용하기 위한 의학적 필요성이 여전히 충족되지 않는다.
본 발명은 다양한 암을 치료하기 위한 TROP2-특이적 ADC 및 이를 위한 투여 요법을 제공한다. 따라서, 본 발명은 TROP2 를 표적하는 안전하고 효과적인 암 치료에 대한 당업계의 요구를 충족시킨다.
요약
TROP2 를 표적으로 하는 항종양 항체는 현재까지 성공하지 못했으며, 많은 항종양 저분자량 화합물은 용납할 수 없는 부작용 및 독성 (심지어 항종양 효과가 우수한 화합물이라도) 으로 인해 안전성에 문제가 있다. 따라서, 안전성을 향상시키는 동시에 우수한 치료 효과를 달성할 필요가 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 치료 효능 및 안전성이 우수한 항종양 약물을 제공하는 것이다.
종양 세포 표적화, 종양 세포 인식, 종양 세포와의 결합, 종양 세포 내재화 등이 가능한 항-TROP2 항체에 대한 접합에 의해, 링커 구조 모이어티를 통해, 항종양 화합물 엑사테칸이 항체-약물 접합체로 전환될 경우, 항체에 기초한 세포사멸 활성을 얻을 수 있고, 항종양 화합물이 보다 확실하게 종양 세포에 전달되어 항종양 효과를 특이적으로 나타낼 수 있다. 따라서, 항종양 효과를 확실하게 나타낼 수 있으며, 화합물 단독 투여에 비하여 항종양 화합물의 투여량을 줄일 수 있어, 정상 세포에 대한 부정적 부작용을 줄이고 안전성을 증가시킨다.
엑사테칸 유도체 및 항-TROP2 항체를 포함하는 신규한 TROP2-표적화 ADC 및 이의 사용 방법이 본원에 기재되어 있다.
하나의 양상에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-TROP2 항체-약물 접합체를 제공하며, 상기 항체-약물 접합체는 링커에 의해 연결된 항-TROP2 항체 및 항종양 화합물을 포함한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 링커에 의해 연결된 항-TROP2 항체 및 항종양 화합물을 포함하는 항-TROP2 항체-약물 접합체를 암을 갖는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서의 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서의 항-TROP2 항체-약물 접합체의 용도를 제공하며, 상기 항체-약물 접합체는 링커에 의해 연결된 항-TROP2 항체 및 항종양 화합물을 포함한다.
일부 구현예에서, 링커 및 항종양 화합물은 하기 화학식으로 나타내진다:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
식 중 -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 화학식으로 나타내지는 구조를 갖는다:
이는 이의 위치 3 에서 항체에 연결되어 있고, 위치 1 에서의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌 기에 연결되어 있고, (NH-DX) 는 하기 화학식으로 나타내지는 기를 나타낸다:
식 중 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 연결 위치이다.
일부 구현예에서, 항-TROP2 항체는 그의 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 23 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 SEQ ID NO: 25 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 그의 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, SEQ ID NO: 27 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 SEQ ID NO: 28 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수는 2 내지 8 또는 3 내지 8 의 범위이다. 일부 구현예에서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수는 3.4 내지 4.5 의 범위이다. 일부 구현예에서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수는 4 이다.
일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO:45 의 아미노산 1-121 을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:46 의 아미노산 1-109 를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체는 SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함한다. 일부 구현예에서, 항-TROP2 항체는 중쇄의 카르복실 말단에 리신 잔기가 결여된다.
일부 구현예에서, 2 mg/kg 내지 10 mg/kg 의 범위의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 약 4 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 약 6 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 약 8 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여된다.
일부 구현예에서, 항체-약물 접합체는 정맥내 투여에 의해 투여된다.
일부 구현예에서, 항체-약물 접합체는 매 3 주 1 회 또는 매 4 주 1 회 투여된다.
일부 구현예에서, 암은 폐암, 신장암, 요로상피암, 결장직장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 폐암은 비-소세포 폐암 (NSCLC) 이다.
일부 구현예에서, 암은 저항성 또는 난치성이다. 일부 구현예에서, 저항성 또는 난치성은 항암 약물로의 치료로 인해 암에 의해 획득된 저항성 또는 난치성이다. 일부 구현예에서, 항암 약물은 EGFR-억제제, ALK-억제제, 백금-기반 화학치료제, 또는 체크포인트 억제제이다. 일부 구현예에서, 항암 약물은 게피티닙, 에를로티닙, 오시머티닙, 아파티닙, 알렉티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 시스플라틴, 카르보플라틴, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 두르발루맙, 티슬레리주맙, 신틸리맙 또는 세미플리맙이다.
일부 구현예에서, 암은 TROP2-발현 암이다. 일부 구현예에서, TROP2-발현 암은 TROP2-과발현 암이다. 일부 구현예에서, TROP2-과발현 암은 면역조직화학적 방법에서 TROP2 의 발현에 대해 높은 점수를 받은 암이다. 일부 구현예에서, TROP2-과발현 암은 제 자리 혼성화 방법에서 TROP2 의 발현에 대해 높은 점수를 받은 암이다.
일부 구현예에서, 암은 수술불가능 또는 재발성 암이다.
또한, 본원에서는 유효 성분으로 상기 양상 또는 구현예 중 어느 하나에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 염, 및 약학적으로 허용가능한 제형 성분을 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
상기의 일반 설명 및 하기의 구체적인 설명은 예시적이고 설명적인 것이며 청구된 기재의 추가 설명을 제공하고자 한다. 다른 목적, 장점 및 새로운 특성은 하기 도면의 간단한 설명 및 기재의 구체적인 설명을 통해서 당업자에게 쉽게 분명해질 것이다.
도 1 은 토포이소머라제 I 억제제 (DXd) 와의 TROP2-표적화 항체-약물 접합체 (이하 "항체 약물 접합체 (1)" 이라고 함) 의 구조를 나타낸다. ADC 는 항체 상의 시스테인 잔기에 결합된 테트라펩티드 링커를 보유한다. 도시된 ADC 는 4:1 의 약물 대 항체 비 (즉, DAR4) 를 갖는다.
도 2 는 개시된 ADC 에 포함될 수 있는 항-TROP2 항체의 중쇄 및 경쇄 서열 및 상기 항체에 연결된 세포독성제의 그래픽 화학식을 나타낸다.
도 3 은 뮤린 이종이식 CFPAC-1 종양 모델에서 항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 의 항종양 효과를 나타낸다.
도 4 는 인간에서 DS-1062a 의 반복 투여 동안의 혈장 농도의 추정을 나타낸다.
도 5 는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자를 치료하기 위한 1 상 연구 설계를 나타낸다.
도 6 은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에 대한 환자 인구통계 및 기준선 특성을 나타낸다.
도 7 은 인과성에 관계 없이, 환자의 ≥10% 에서 발생한 치료-응급 이상 반응 (TEAE) 을 갖는 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서의 환자의 수를 나타낸다.
도 8 은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서 대상체 (N=35) 의 종양 반응을 나타낸다.
도 9 는 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서 DS-1062a 치료 후의 표적 (A, B 및 C) 및 비-표적 (D) 병변에서의 종양의 반응을 나타낸다. 패널 A 는 4.0 mg/kg 의 DS-1062a 로 치료된 환자에서 표적 병변의 크기의 감소를 나타낸다. 패널 B 는 4.0 mg/kg 의 DS-1062a 로 치료된 또다른 환자에서 표적 병변의 크기의 감소를 나타낸다. 패널 C 는 2.0 mg/kg 의 DS-1062a 로 치료된 환자에서 표적 병변의 크기의 감소를 나타낸다. 패널 D 는 패널 C 와 동일한 환자에서 비-표적 병변의 수의 감소를 나타낸다.
도 10 은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서 대상체의 종양 크기의 변화를 나타낸다. 상부 패널은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 로부터의 대상체의 표적 병변에서 기준선으로부터의 최장 치수 측정치의 합계의 최상의 백분율 변화를 나타낸다. 하부 패널은 투약 그룹에 의해 분리된 종양 크기 변화의 스파이더 플롯을 나타낸다.
도 11 은 사이클 1 (PK 분석 세트) 에서 DS-1062a 의 평균 혈장 농도를 나타낸다.
도 12 는 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에 의해 입증된 효능의 요약을 나타낸다.
도 13 은 인과성에 관계 없이, 치료-응급 이상 반응 (TEAE) 을 갖는 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구에서 환자의 수를 나타낸다.
도 14 는 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구로부터의 대상체의 표적 병변에서 기준선으로부터의 최장 치수 측정치의 합계의 최상의 백분율 변화를 나타낸다.
도 15 는 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구 과정에 걸쳐 각 투여 그룹에 대한 종양 크기의 백분율 변화를 예시함으로써 반응의 빈도에 대한 명확한 투여량 효과를 나타낸다.
도 16 은 다수의 투여량 수준에 걸쳐 보여지는 지속적인 항종양 반응을 나타낸다. 많은 환자들이 부분적인 반응 (PR) 또는 안정한 질환 (SD) 을 보았다. 연구 종료 시점에 진행성 질환 (PD) 을 가진 환자는 오직 2 명이었다 (실시예 6).
도 17 은 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구에서 환자로부터의 전처리 생검에 기초한 TROP2 면역조직화학 H 점수 (IHC) 를 나타낸다. IHC 점수는 부분 반응 (PR) 과 같은 긍정적인 결과를 달성한 환자에서 더 높은 경향이 있었다. 이들 도면의 목적을 위해 하기 약어가 사용되었다: 역형성 림프종 키나제 억제제 (ALKi), 기준선 (BL), 사이클 3 일 1 (C3D1), 순환 유리 DNA (cfDNA), 표피 성장 인자 수용체 억제제 (EGFRi), 치료 종료 (EOT), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 억제제 (HER2i), 면역조직화학 (IHC), 히스토 스코어 (H-점수), 면역-종양학 (I/O), 평가불가능 (NE), 부분 반응 (PR), 진행성 질환 (PD), 안정한 질환 (SD), 환자 (Pt), 변이체 대립유전자 빈도 (VAF).
도 18 은 항체 약물 접합체 (1) 가 TROP2-음성 종양 (Calu-6) 과 대조적으로 TROP2-양성 종양 (NCI-H2170 및 HCC827) 에서 더 강한 항종양 활성을 갖는 폐암 이종이식 마우스 모델에서 항종양 활성을 갖는 것을 보여주는 전임상 연구로부터의 결과를 보여준다.
도 19 는 치료 과정에 걸쳐 무세포 DNA (cfDNA) 에 기초한 가변 대립유전자 빈도의 변화를 나타낸다. 그 결과는 cfDNA 가 치료 결과로서 일반적으로 감소하였음을 나타낸다.
도 20 은 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구의 다양한 투여 그룹에서 대상체의 종양 부피의 변화에 의해 평가된 바와 같은 전체 반응률 (ORR) 을 나타낸다.
도 21 은 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구에 의해 입증된 효능의 요약을 나타낸다.
도 22 는 예비 효능 연구 (실시예 7) 로부터의 투여 그룹에 의한 종양 크기 변화의 스파이더 플롯을 나타낸다.
도 23 은 예비 효능 연구 (실시예 7) 로부터의 약동학적 측정에 의해 결정된 항체-약물 접합체 (1), 총 항체, 및 유리 약물 (페이로드) 의 혈장 농도를 나타낸다.
도 2 는 개시된 ADC 에 포함될 수 있는 항-TROP2 항체의 중쇄 및 경쇄 서열 및 상기 항체에 연결된 세포독성제의 그래픽 화학식을 나타낸다.
도 3 은 뮤린 이종이식 CFPAC-1 종양 모델에서 항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 의 항종양 효과를 나타낸다.
도 4 는 인간에서 DS-1062a 의 반복 투여 동안의 혈장 농도의 추정을 나타낸다.
도 5 는 비-소세포 폐암 (NSCLC) 환자를 치료하기 위한 1 상 연구 설계를 나타낸다.
도 6 은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에 대한 환자 인구통계 및 기준선 특성을 나타낸다.
도 7 은 인과성에 관계 없이, 환자의 ≥10% 에서 발생한 치료-응급 이상 반응 (TEAE) 을 갖는 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서의 환자의 수를 나타낸다.
도 8 은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서 대상체 (N=35) 의 종양 반응을 나타낸다.
도 9 는 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서 DS-1062a 치료 후의 표적 (A, B 및 C) 및 비-표적 (D) 병변에서의 종양의 반응을 나타낸다. 패널 A 는 4.0 mg/kg 의 DS-1062a 로 치료된 환자에서 표적 병변의 크기의 감소를 나타낸다. 패널 B 는 4.0 mg/kg 의 DS-1062a 로 치료된 또다른 환자에서 표적 병변의 크기의 감소를 나타낸다. 패널 C 는 2.0 mg/kg 의 DS-1062a 로 치료된 환자에서 표적 병변의 크기의 감소를 나타낸다. 패널 D 는 패널 C 와 동일한 환자에서 비-표적 병변의 수의 감소를 나타낸다.
도 10 은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에서 대상체의 종양 크기의 변화를 나타낸다. 상부 패널은 초기 1 상 연구 (실시예 5) 로부터의 대상체의 표적 병변에서 기준선으로부터의 최장 치수 측정치의 합계의 최상의 백분율 변화를 나타낸다. 하부 패널은 투약 그룹에 의해 분리된 종양 크기 변화의 스파이더 플롯을 나타낸다.
도 11 은 사이클 1 (PK 분석 세트) 에서 DS-1062a 의 평균 혈장 농도를 나타낸다.
도 12 는 초기 1 상 연구 (실시예 5) 에 의해 입증된 효능의 요약을 나타낸다.
도 13 은 인과성에 관계 없이, 치료-응급 이상 반응 (TEAE) 을 갖는 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구에서 환자의 수를 나타낸다.
도 14 는 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구로부터의 대상체의 표적 병변에서 기준선으로부터의 최장 치수 측정치의 합계의 최상의 백분율 변화를 나타낸다.
도 15 는 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구 과정에 걸쳐 각 투여 그룹에 대한 종양 크기의 백분율 변화를 예시함으로써 반응의 빈도에 대한 명확한 투여량 효과를 나타낸다.
도 16 은 다수의 투여량 수준에 걸쳐 보여지는 지속적인 항종양 반응을 나타낸다. 많은 환자들이 부분적인 반응 (PR) 또는 안정한 질환 (SD) 을 보았다. 연구 종료 시점에 진행성 질환 (PD) 을 가진 환자는 오직 2 명이었다 (실시예 6).
도 17 은 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구에서 환자로부터의 전처리 생검에 기초한 TROP2 면역조직화학 H 점수 (IHC) 를 나타낸다. IHC 점수는 부분 반응 (PR) 과 같은 긍정적인 결과를 달성한 환자에서 더 높은 경향이 있었다. 이들 도면의 목적을 위해 하기 약어가 사용되었다: 역형성 림프종 키나제 억제제 (ALKi), 기준선 (BL), 사이클 3 일 1 (C3D1), 순환 유리 DNA (cfDNA), 표피 성장 인자 수용체 억제제 (EGFRi), 치료 종료 (EOT), 인간 표피 성장 인자 수용체 2 억제제 (HER2i), 면역조직화학 (IHC), 히스토 스코어 (H-점수), 면역-종양학 (I/O), 평가불가능 (NE), 부분 반응 (PR), 진행성 질환 (PD), 안정한 질환 (SD), 환자 (Pt), 변이체 대립유전자 빈도 (VAF).
도 18 은 항체 약물 접합체 (1) 가 TROP2-음성 종양 (Calu-6) 과 대조적으로 TROP2-양성 종양 (NCI-H2170 및 HCC827) 에서 더 강한 항종양 활성을 갖는 폐암 이종이식 마우스 모델에서 항종양 활성을 갖는 것을 보여주는 전임상 연구로부터의 결과를 보여준다.
도 19 는 치료 과정에 걸쳐 무세포 DNA (cfDNA) 에 기초한 가변 대립유전자 빈도의 변화를 나타낸다. 그 결과는 cfDNA 가 치료 결과로서 일반적으로 감소하였음을 나타낸다.
도 20 은 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구의 다양한 투여 그룹에서 대상체의 종양 부피의 변화에 의해 평가된 바와 같은 전체 반응률 (ORR) 을 나타낸다.
도 21 은 새로운 컷오프 날짜 (실시예 6) 로의 1 상 연구에 의해 입증된 효능의 요약을 나타낸다.
도 22 는 예비 효능 연구 (실시예 7) 로부터의 투여 그룹에 의한 종양 크기 변화의 스파이더 플롯을 나타낸다.
도 23 은 예비 효능 연구 (실시예 7) 로부터의 약동학적 측정에 의해 결정된 항체-약물 접합체 (1), 총 항체, 및 유리 약물 (페이로드) 의 혈장 농도를 나타낸다.
상세한 설명
이하, 도면을 참조하여 신규한 TROP2-표적화 ADC 및 이의 사용 방법의 다양한 구현예를 설명할 것이다. 하기 기재된 구현예는 본 발명의 구현예의 전형적인 예시로서 주어지며 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 항-TROP2 항체가 항종양 화합물에 링커 구조 모이어티를 통해 접합된 항종양 약물로서, 이것은 하기에 상세히 설명된다.
정의
방법은 설명된 특정 구현예에 제한되지 않으며, 따라서 변할 수 있다는 것으로 이해되어야 한다. 본 명세서에서 사용되는 전문용어는 오직 특정한 실시형태를 설명하려는 목적을 위한 것이고, 제한하려는 의도가 아니라는 것을 또한 이해해야 한다. 본 기술의 범위는 첨부된 청구범위에 의해서만 한정될 것이다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 본원에 기재된 것과 유사한 또는 동일한 임의의 방법 및 물질이 또한 본 발명의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 대표적인 예시적인 방법 및 물질은 이제 기술된다.
값의 범위가 제공되는 경우, 문맥이 달리 명확하게 나타내지 않는 한, 이 범위의 상한과 하한 사이의, 하한의 단위의 1/10 까지의 각각의 중간 값, 및 이 언급된 범위에서의 임의의 다른 언급된 또는 중간 값은 본 발명에 포함되는 것으로 이해해야 한다. 이들 더 작은 범위의 상한치 및 하한치는 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 본 발명 내에 포괄되고, 명시된 범위 내에서 임의의 구체적으로 배제시킨 제한에 따라서, 본 발명 내에 포괄된다. 언급된 범위가 하나 또는 둘 모두의 한계를 포함하는 경우, 이들 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위는 또한 본 발명에 포함된다.
명세서 및 청구항에서 사용시, 단수 형태 "한", "하나" 및 "그"는 내용에서 명학하게 달리 명시하지 않으면 단수 및 복수 인용을 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "포함하는" 은 조성물 및 방법이 열거된 요소를 포함하지만 다른 것은 배제하지 않는다는 것을 의미하는 것으로 의도된다. 조성물 및 방법을 정의하는데 사용되는 경우 "~로 본질적으로 이루어지는" 은 조성물 또는 방법에 임의의 필수적인 중요한 다른 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. "~로 이루어지는" 은 청구된 조성물 및 실질적인 방법 단계에 대한 다른 구성성분의 미량 초과의 요소를 배제하는 것을 의미할 것이다. 이들 전환 용어 각각에 의해 정의되는 구현예는 본 개시물의 범주 내에 있다. 따라서, 방법 및 조성물이 추가의 단계 및 성분을 포함할 수 있거나 (포함하는), 대안적으로, 중요하지 않은 단계 또는 조성물을 포함하거나 (본질적으로 이루어지는), 또는 대안적으로, 오직 언급된 방법 단계 및 조성물을 의도하는 (이루어지는) 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "약" 은 명시된 수뿐만 아니라 플러스 또는 마이너스 10% 를 의미한다. 예를 들어, "약 10" 은 "10" 및 "9-11" 모두로서 이해되어야 한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "선택적 (optional)" 또는 "선택적으로" 는 그 이후에 기재된 사건 또는 상황이 발생할 수 있거나 발생하지 않을 수 있고, 또한 그 기재가 상기 사건 또는 상황이 발생하는 예 및 발생하지 않은 예를 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "개체", "대상" 및 "환자" 는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 개시된 방법 또는 용도에 따라 치료되는 임의의 개별 포유동물, 예를 들어, 소, 개, 고양이, 말, 원숭이, 돼지, 카멜리드, 배트 또는 인간을 지칭한다. 바람직한 구현예에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 구절 "유효량", "치료학적 유효량", 및 "치료학적 수준" 은 ADC 가 이러한 치료를 필요로 하는 대상체에 투여되는, 즉 암 (예를 들어, 폐암, TROP2-발현 암, 또는 내성 또는 불응성 암) 을 치료 또는 예방하기 위한, 특정한 약리학적 효과를 제공하는 대상체에서의 투여량 또는 농도를 의미한다. ADC 의 치료적 유효량 또는 치료적 수준은, 그러한 투여량이 당업자에 의해 치료적 유효량인 것으로 여겨지더라도, 본원에 기재된 암을 치료하는데 항상 효과적이지는 않을 것임을 강조한다. 단지 편의를 위해, 예시적인 투여량, 약물 전달량, 치료 유효량, 및 치료 수준이 하기에 제공된다. 당업자는 특정 대상 및/또는 상태를 치료하기 위해 필요한 표준 관행에 따라 이러한 양을 조절할 수 있다. 치료 유효량은 투여 경로 및 투여 형태, 대상의 연령 및 체중, 및/또는 대상의 상태, 및 암의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다.
암과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "치료" 또는 "치료하기" 는 암의 감소, 억제 또는 제거; 암 세포 성장의 감소, 억제 또는 제거; 암의 확산의 감소, 억제 또는 제거; 또는 종양 또는 전이가 퇴화 또는 사멸하게 하는 것을 의미한다.
치료 및 치료하기는 또한, 선택적으로, 암 세포 성장이 억제되지 않고 및/또는 암이 사멸하지 않더라도, 대상의 질 또는 수명 또는 전체 생존을 향상시키는 것을 의미할 수 있다.
암과 관련하여 본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "예방" 또는 "예방하기" 는 전이 (즉, 치료 개시 시에 암이 존재하지 않는 2차 부위에서의 암의 성장) 의 발생을 방지 또는 예방할 뿐만 아니라, 대상이 완치되거나 암/종양이 완전히 파괴 또는 사멸되는 경우 암의 재발을 방지 또는 예방하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학 조성물" 은 조성물을 생체내 또는 생체외 진단 또는 치료적 사용을 위해 특히 적합하게 하는 담체 (불활성 또는 활성) 와 활성제의 조합을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약학적으로 허용가능한 담체" 는 임의의 표준 약학 담체, 예컨대 인산염 완충 식염수, 물, 에멀젼 (예를 들어, 예컨대 유/수 또는 수/유 에멀젼), 및 다양한 유형의 습윤제를 의미한다. 조성물은 또한 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 아쥬반트의 예에 대해서는, 예를 들어, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975] 를 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "비경구 투여" 및 "비경구 투여된" 은 통상적으로 주사에 의한 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 관절낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관내, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 제한 없이 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "전신 투여", "전신 투여된", "말초 투여" 및 "말초 투여된" 은 중추신경계로 직접 들어가는 것 이외의 화합물, 약물 또는 다른 물질을 투여하여, 환자의 시스템으로 들어가고, 따라서, 예를 들어 피하 투여와 같은 대사 및 다른 유사한 과정을 겪게 하는 것을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "유전자" 는 DNA 뿐만 아니라, 이의 mRNA, 이의 cDNA 및 이의 cRNA 를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 핵산과 동일한 의미로 사용되며, 또한 DNA, RNA, 프로브, 올리고뉴클레오티드 및 프라이머를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 구별 없이 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "세포" 는 또한 동물 개체 내의 세포 및 배양된 세포를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "TROP2" 는 TROP2 단백질과 동일한 의미로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "CDR" 은 상보성 결정 영역 (CDR) 을 의미한다. 항체 분자의 중쇄 및 경쇄는 각각 3 개의 상보성 결정 영역 (CDR) 을 갖는 것으로 알려져 있다. CDR 은 과가변 도메인이라고도 하며, 항체의 각각의 중쇄 및 경쇄의 가변 영역에 존재한다. 이는 1 차 구조에서 비정상적으로 높은 가변성을 갖는 부위이며, 각각의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드 사슬의 1 차 구조에는 3 개의 별개의 CDR 이 있다. 본 명세서에서, 항체의 CDR 에 있어, 중쇄의 CDR 은 중쇄의 아미노산 서열의 아미노 말단쪽으로부터 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3 으로 표시되고, 경쇄의 CDR 은 경쇄의 아미노산 서열의 아미노 말단쪽으로부터 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3 으로 표시된다. 이들 부위는 3 차 구조에서 서로 근접하며 항체가 결합하는 항원에 대한 특이성을 결정한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 구절 "혼성화를 엄격한 조건 하에서 수행한다" 는, 확인이 상용화된 혼성화 용액 ExpressHyb Hybridization Solution (Clontech, Inc. 제조) 에서 68℃ 에서 혼성화를 수행함으로써, 또는 DNA 가 고정된 필터를 이용하여 0.7 내지 1.0 M NaCl 의 존재 하에서 68℃ 에서 혼성화를 수행한 후, 0.1 내지 2 x SSC 용액 (1 x SSC 용액은 150 mM NaCl 및 15 mM 시트르산나트륨으로 구성됨) 을 이용하여 68℃ 에서, 또는 이와 동등한 조건 하에서 세척을 수행하므로써 달성될 수 있는 조건 하에서 혼성화를 수행하는 과정을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "여러" 는 1 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 또는 1 내지 2 를 의미한다.
본 명세서에서 아미노산 치환으로는, 보존적 아미노산 치환이 바람직하다. 보존적 아미노산 치환은 아미노산 측쇄와 관련된 아미노산 그룹 내에서 일어나는 치환을 의미한다. 바람직한 아미노산 기는 다음과 같다: 산성 기 (아스파르트산 및 글루탐산); 염기성 기 (리신, 아르기닌 및 히스티딘); 비극성 기 (알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 및 트립토판); 및 비하전된 극성 패밀리 (글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌 및 티로신). 더욱 바람직한 아미노산 기는 다음과 같다: 지방족 히드록실 기 (세린 및 트레오닌); 아미드-함유 기 (아스파라긴 및 글루타민); 지방족 기 (알라닌, 발린, 류신 및 이소류신); 및 방향족 기 (페닐알라닌, 트립토판 및 티로신). 이러한 아미노산 치환은 원래의 아미노산 서열을 갖는 물질의 성질을 손상시키지 않는 범위 내에서 수행되는 것이 바람직하다.
상세한 설명 전반에 걸쳐, 조성물이 특정 성분을 갖거나 함유하거나 포함하는 것으로 기재되는 경우, 또는 공정 및 방법이 특정 단계를 갖거나 함유하거나 포함하는 것으로 기재되는 경우, 추가로, 언급된 성분으로 본질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어지는 본 설명의 조성물이 존재하며 언급된 공정 단계로 본질적으로 이루어지거나 이것으로 이루어지는 본 설명에 따른 공정 및 방법이 존재하는 것으로 고려된다.
일반적으로, 백분율을 지정하는 조성은 달리 명시하지 않는 한 중량에 의한 것이다. 또한, 변수에 정의가 수반되지 않는 경우, 변수의 이전 정의가 제어한다.
TROP2
TROP2 는 인간 영양아세포에서 발현되는 TACSTD 패밀리의 구성원이고, 인간 영양아세포 및 암 세포에 공통적인 면역 저항성에 관여하는 단일-통과 막관통 유형 1 세포막 단백질이다.
본 설명의 목적을 위하여, 인간 또는 비인간 포유동물 (예컨대, 래트 또는 마우스) 의 TROP2 발현 세포로부터 TROP2 단백질을 직접 정제하고 사용할 수 있거나, 상기 세포의 세포막 분획을 제조하고 사용할 수 있다. 또한, TROP2 는 이의 시험관 내 합성에 의해 또는 유전 공학을 통하여 숙주 세포에서 이의 생산에 의해 수득될 수 있다. 유전 공학에서, 구체적으로, TROP2 cDNA 를 TROP2 cDNA 를 발현할 수 있는 벡터에 통합시킨 후, 전사 및 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액에서 합성하거나, 또다른 원핵 또는 진핵 형질전환 숙주 세포에서 TROP2 를 발현시켜 TROP2 단백질을 수득할 수 있다. 대안적으로는, TROP2 단백질로서, 전술한 유전자 조작된 TROP2 발현 세포 또는 TROP2 를 발현하는 세포주를 사용할 수 있다.
TROP2 의 DNA 서열 및 아미노산 서열은 공용 데이터베이스에서 이용가능하고, 예를 들어, Accession Nos. NM_002353 및 NP_002344 (NCBI) 로 언급될 수 있다.
또한, TROP2 의 상기 기재된 아미노산 서열 중 어느 하나에 하나 또는 여러 개의 아미노산이 치환, 결실 및/또는 부가된 아미노산 서열로 구성되며, 이 단백질과 동등한 생물학적 활성을 갖는 단백질도 TROP2 에 포함된다.
인간 TROP2 단백질은 N-말단 26 개의 아미노산 잔기로 이루어진 신호 서열, 248 개의 아미노산 잔기로 이루어진 세포외 도메인, 23 개의 아미노산 잔기로 이루어진 막관통 도메인 및 26 개의 아미노산 잔기로 이루어진 세포내 도메인을 포함한다.
항-TROP2 항체
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체에 사용되는 항-TROP2 항체는 임의의 종으로부터 유래될 수 있으며, 이 종의 바람직한 예로는 인간, 랫트, 마우스, 및 토끼가 포함될 수 있다. 인간 종 이외의 다른 종에서 유래되는 경우, 잘 알려진 기술을 사용하여 키메라화 또는 인간화되는 것이 바람직하다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있으며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
항-TROP2 항체는 종양 세포를 표적할 수 있고, 종양 세포를 인지할 수 있고, 종양 세포에 결합할 수 있고, 종양 세포에 내재될 수 있으며, 항종양 활성을 가지는 화합물과 링커를 통한 접합에 의해 항체-약물 결합체로 전환될 수 있다.
종양 세포에 대한 항체의 결합 활성은 유세포 분석법을 이용하여 확인할 수 있다. 종양 세포로의 항체의 내재화를 확인하는 방법의 예는 (1) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지된) 를 사용하여 형광 현미경 하에 세포에 혼입된 항체를 시각화하는 분석 (Cell Death and Differentiation (2008) 15, 751-761), (2) 치료 항체에 결합하는 2 차 항체 (형광 표지된) 를 사용하여 세포에 혼입된 형광 강도를 측정하는 분석 (Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004), 또는 (3) 세포 내로 혼입시 독소가 방출되어 세포 성장을 억제하는 치료 항체에 결합하는 면역독소를 사용하는 Mab-ZAP 분석 (Bio Techniques 28: 162-165, January 2000) 을 포함할 수 있다. 면역독소로서 디프테리아 독소의 촉매 영역과 단백질 G 의 재조합 복합 단백질이 사용될 수 있다.
항체-약물 접합체에 접합된 약물이 항종양 효과를 발휘하기 때문에, 항체 자체가 항종양 효과를 가져야 하는 것이 바람직하지만 필수적인 것은 아니다. 종양 세포 상에서 항종양 화합물의 세포살상성 활성을 특이적으로 그리고 선택적으로 발휘하려는 목적을 위해, 항체가 종양 세포로 이동하기 위해 내재화하는 특성을 가져야 하는 것이 중요하고 또한 바람직하다.
항-TROP2 항체는 항원성 폴리펩티드로 동물을 면역화시키고, 생체 내에서 생산된 항체를 수집 및 정제하는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법을 이용하여 수득될 수 있다. 항원의 기원은 인간에 한정되지 않으며, 마우스, 래트 등과 같은 비인간 동물로부터 유래된 항원으로 동물을 면역화할 수 있다. 이 경우, 수득된 이종 항원에 결합하는 항체와 인간 항원의 교차-반응성을 시험하여 인간 질환에 적용가능한 항체를 스크리닝하기 위해 시험될 수 있다.
대안적으로, 항원에 대한 항체를 생산하는 항체-생산 세포를 당업계에 공지된 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature (1975) 256, p. 495-497; and Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 확립하고, 이로부터 모노클로날 항체를 수득할 수 있다.
항원은 숙주 세포를 유전적으로 조작하여 항원 단백질을 인코딩하는 유전자를 생성함으로써 수득될 수 있다. 구체적으로, 항원 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제조하고 이를 숙주 세포에 전달하여 유전자를 발현시킨다. 이렇게 발현된 항원은 정제될 수 있다. 항체는 또한 전술한 유전적으로 조작된 항원 발현 세포 또는 항원을 발현하는 세포주를 이용하여 동물을 면역시키는 방법을 이용하여 수득될 수 있다.
항-TROP2 항체는 당업계에 공지된 절차에 의해 수득될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 항-TROP2 항체는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 본 출원의 서열 목록에 제시된 아미노산 서열로 특정되는 것들이 바람직하게 사용될 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-TROP2 항체는 바람직하게는 하기 기재되는 특성을 갖는다.
(1) 하기 특성을 갖는 항체:
(a) TROP2 에 특이적으로 결합함, 및
(b) TROP2 에 결합함으로써 TROP2 발현 세포에 내재화하는 활성을 가짐.
(2) (1) 에 있어서, TROP2 가 인간 TROP2 인 항체.
(3) (1) 또는 (2) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 45 의 중쇄의 상보성 결정 영역 (CDR) H1, CDRH2, 및 CDRH3, 및/또는 SEQ ID NO: 46 의 경쇄의 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3 을 갖는 항체. 대안적으로 또는 부가적으로, (1) 또는 (2) 에 있어서, 항체가 중쇄 상보성 결정 영역으로서 SEQ ID NO: 23 으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, SEQ ID NO: 24 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 SEQ ID NO: 25 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3 을 갖고, 경쇄 상보성 결정 영역으로서 SEQ ID NO: 26 으로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, SEQ ID NO: 27 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 SEQ ID NO: 28 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3 을 갖는 항체.
(4) (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 이의 불변 영역이 인간 유래 불변 영역인 항체.
(5) (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간화된 항체인 항체.
(6) (5) 에 있어서, 항체가 (a) SEQ ID NO: 45 의 아미노산 위치 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열, (b) (a) 와 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (c) 적어도 하나의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 서열 (a) 또는 (b) 중 임의의 것으로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (d) SEQ ID NO: 46 의 아미노산 위치 1 내지 109 에 기재된 아미노산 서열, (e) (d) 와 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (f) 적어도 하나의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 서열 (d) 또는 (e) 중 임의의 것으로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체. 대안적으로 또는 부가적으로, (5) 에 있어서, 항체가 (a) SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열, (b) SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열, (c) SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열, (d) 서열 (a) 내지 (c) 중 임의의 것과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (e) 적어도 하나의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 서열 (a) 내지 (c) 중 임의의 것으로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 (f) SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열, (g) SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열, (h) SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열, (i) 서열 (f) 내지 (h) 중 임의의 것과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (j) 적어도 하나의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가에 의해 서열 (f) 내지 (h) 중 임의의 것으로부터 유래된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체.
(7) (6) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 45 의 아미노산 위치 1 내지 121 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 46 의 아미노산 위치 1 내지 109 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역을 갖는 항체. 대안적으로 또는 부가적으로, (6) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체.
(8) (7) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역으로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 갖는 항체.
(9) (6) 또는 (7) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 45 의 아미노산 위치 1 내지 451 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 의 아미노산 위치 1 내지 214 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체. 대안적으로 또는 부가적으로, (6) 또는 (7) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
(10) (6) 또는 (7) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 45 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체. 대안적으로 또는 부가적으로, (6) 또는 (7) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 12 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 12 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 12 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 16 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 16 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 16 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 로 나타내지는 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
(11) (8) 에 있어서, 항체가 SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄, 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 에 기재된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄로 이루어진 군으로부터 선택되는 중쇄 및 경쇄를 포함하는 항체.
(12) (1) 내지 (11) 중 어느 하나에 있어서, 항체가 중쇄의 카르복실 말단에 리신 잔기가 결여된 항체.
(13) 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계; 및 상기 단계에서 수득한 배양물로부터 관심의 항체를 수집하는 단계를 포함하는, (1) 내지 (12) 중 어느 하나에 따른 항체의 제조 방법에 의해 수득되는 항체.
본 개시 내용의 목적을 위해, SEQ ID NO: 45 및 46 의 완전한 서열을 하기 표 1 에 나타낸다 (뿐만 아니라 도 2 에).
표 1- 예시적인 항-TROP2 항체의 중쇄 및 경쇄 아미노산 서열
항-TROP2 항체의 제조
본 발명의 TROP2 에 대항하는 항체는 당업계에서 통상적으로 수행되는 방법을 사용하여 수득될 수 있으며, 상기 방법은 동물을 TROP2 또는 TROP2 의 아미노산 서열로부터 선택된 임의의 폴리펩티드로 면역화하고, 생체 내에서 생성된 항체를 수집 및 정제하는 것을 포함한다. 항원으로 사용될 TROP2 의 생물학적 종은 인간으로 제한되지 않으며, 동물은 마우스 또는 래트와 같은 인간 이외의 동물로부터 유래된 TROP2 로 면역화될 수 있다. 이 경우, 수득된 이종 TROP2 에 결합하는 항체와 인간 TROP2 의 교차-반응성을 검사함으로써, 인간 질환에 적용할 수 있는 항체를 선별할 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 공지의 방법 (예를 들어, Kohler and Milstein, Nature, (1975) 256, pp. 495-497; Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y. (1980)) 에 따라 TROP2 에 대항하는 항체를 생산하는 하나 이상의 항체-생산 세포(들) 을 골수종 세포와 융합하여 확립된 하이브리도마로부터 얻을 수 있다.
유전 공학을 이용하여 숙주 세포에서 TROP2 유전자를 발현시켜 항원으로 사용될 TROP2 를 얻을 수 있다. 구체적으로, TROP2 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터를 제작하고, 이를 숙주 세포에 트랜스펙션시켜 발현시킨 후, 발현된 TROP2 를 정제할 수 있다.
대안적으로는, TROP2 단백질로서, 전술한 유전자 조작된 TROP2 발현 세포 또는 TROP2 를 발현하는 세포주를 사용할 수 있다. 이하, TROP2 에 대항하는 항체를 수득하는 방법을 구체적으로 설명한다.
(1) 항원의 제조
항-TROP2 항체를 생산하기 위해 사용되는 항원의 예로는 TROP2, 또는 TROP2 의 적어도 6 개의 연속적인 아미노산을 포함하는 부분 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드, 또는 주어진 아미노산 서열 또는 담체를 첨가하여 얻은 유도체를 포함한다.
TROP2 는 인간 종양 조직 또는 종양 세포로부터 직접 정제되어 사용될 수 있다. 또한, TROP2 는 시험관 내에서 합성함으로써 또는 유전 공학에 의해 숙주 세포에서 이를 생산함으로써 수득될 수 있다.
유전 공학과 관련하여, 구체적으로, TROP2 cDNA 를 TROP2 cDNA 를 발현할 수 있는 벡터에 통합시킨 후, 전사 및 번역에 필요한 효소, 기질 및 에너지 물질을 포함하는 용액에서 합성하거나, 또다른 원핵 또는 진핵 형질전환 숙주 세포에서 TROP2 를 발현시켜 항원을 수득할 수 있다.
또한, 항원은 막 단백질인 TROP2 의 세포외 도메인을 항체의 불변 영역에 라이게이션시켜 수득된 융합 단백질을 적절한 숙주-벡터 시스템에서 발현시켜 분비성 단백질로서 수득할 수 있다.
TROP2 cDNA 는 TROP2 cDNA 를 주형으로 발현하는 cDNA 라이브러리 및 TROP2 cDNA 를 특이적으로 증폭시키는 프라이머를 이용하여 중합효소 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, 이하 "PCR"이라 함, Saiki, R. K., et al., Science, (1988) 239, pp. 487-489 참조) 을 수행하는 소위 PCR 방법에 의해 수득될 수 있다.
폴리펩티드의 시험관 내 합성으로는, 예를 들어, Roche Diagnostics, Inc. 의 Rapid Translation System (RTS) 를 예시할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 원핵 숙주 세포의 예로는 대장균 및 바실러스 서브틸리스를 포함한다. 숙주 세포를 표적 유전자로 형질전환시키기 위해, 숙주 세포는 레플리콘, 즉, 숙주와 양립가능한 종으로부터 유래된 복제 기원, 및 조절 서열을 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 형질전환된다. 또한, 벡터는 형질전환된 세포에 표현형 선택성을 부여할 수 있는 서열을 갖는 것이 바람직하다.
진핵 숙주 세포의 예는 척추동물 세포, 곤충 세포, 및 효모 세포를 포함한다. 척추동물 세포로는, 예를 들어, 원숭이 COS 세포 (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC: American Type Culture Collection), 뮤린 섬유모세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), 및 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포; ATCC: CCL-61) 의 디히드로폴레이트 리덕타제-결핍 균주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) 등이 종종 사용되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이렇게 수득된 형질전환체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법에 따라 배양될 수 있으며, 상기 형질전환체의 배양에 의해 표적 폴리펩티드가 세포내로 또는 세포외로 생산된다.
배양에 사용될 적합한 배지는 사용되는 숙주 세포에 따라 다양한 통상적으로 사용되는 배양 배지로부터 당업자에 의해 선택될 수 있다. 대장균이 사용되는 경우, 예를 들어, 필요에 따라 암피실린 또는 IPMG 와 같은 항생제가 보충된 LB 배지가 사용될 수 있다.
이러한 배양을 통해 형질전환체에 의해 세포내로 또는 세포외로 생산된 재조합 단백질은 단백질의 물리적 또는 화학적 특성을 이용하는 다양한 공지된 분리 방법 중 임의의 방법에 의해 분리 및 정제될 수 있다.
방법의 구체적인 예로는 통상적인 단백질 침전제로의 처리, 한외여과, 분자체 크로마토그래피 (겔 여과), 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피와 같은 다양한 유형의 액체 크로마토그래피, 투석 및 이들의 조합을 포함한다.
또한, 발현하고자 하는 재조합 단백질에 6 개의 히스티딘 잔기의 태그를 부착함으로써, 니켈 친화성 컬럼으로 단백질을 효율적으로 정제할 수 있다. 대안적으로, 발현하고자 하는 재조합 단백질에 IgG Fc 영역을 부착함으로써, 단백질 A 컬럼으로 단백질을 효율적으로 정제할 수 있다.
상기 방법을 조합함으로써, 다량의 표적 폴리펩티드를 높은 수율 및 높은 순도로 용이하게 생산할 수 있다.
전술한 형질전환체 자체가 항원으로도 사용될 수 있다. 대안적으로는, TROP2 를 발현하는 세포주를 항원으로 사용할 수 있다. 이러한 세포주의 예로는 인간 폐암 세포주 NCI-H322, PC14, NCIH-H2122, 및 LCAM1, 인간 전립선암 세포주 PC3, 인간 췌장암 세포주 BxPC-3, Capan-1, 및 PK-1, 인간 난소암 세포주 SKOV3, 및 인간 결장직장암 세포주 COLO205 를 포함하지만, 본 발명에 따른 세포주는 TROP2 를 발현하는 한 이들 세포주에 한정되지 않는다.
(2) 항-TROP2 모노클로날 항체의 생성
TROP2 에 특이적으로 결합하는 항체의 예로는 TROP2 에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체를 포함하며, 이러한 항체를 수득하는 방법은 하기에 기술된다.
모노클로날 항체의 생산은 일반적으로 다음의 작동 단계를 필요로 한다:
(a) 항원으로 사용될 생체중합체를 정제하거나, 항원-발현 세포를 제조하는 단계;
(b) 항원을 주입하여 동물을 면역시켜 항체-생산 세포를 제조하고, 혈액을 수집하고, 비장을 절제하는 시기를 결정하기 위해 항체 역가를 검정하는 단계;
(c) 골수종 세포 (이하 "골수종" 이라 함) 를 제조하는 단계;
(d) 항체-생산 세포를 골수종과 융합시키는 단계;
(e) 원하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 그룹을 스크리닝하는 단계;
(f) 하이브리도마를 단일 세포 클론으로 분할 (클로닝) 하는 단계;
(g) 선택적으로, 다량의 모노클로날 항체를 생산하기 위해 하이브리도마를 배양하거나 하이브리도마가 이식된 동물을 사육하는 단계;
(h) 이렇게 생산된 모노클로날 항체를 생물학적 활성 및 결합 특이성에 대해 검사하거나, 표지된 시약으로서의 성질에 대해 분석하는 단계; 등
이하, 상기 단계에 이어 모노클로날 항체를 제조하는 방법을 구체적으로 설명하나, 방법은 이에 제한되는 것은 아니며, 예를 들어 비장 세포 및 골수종 이외의 항체 생산 세포를 사용할 수 있다.
(a) 항원의 정제
항원으로는, 상기 방법으로 제조한 TROP2 또는 이의 부분 펩티드를 사용할 수 있다.
또한, TROP2 를 발현하는 재조합 세포로부터 제조된 막 분획 또는 TROP2 를 발현하는 재조합 세포 그 자체, 및 또한 당업자에게 공지된 방법에 의해 화학적으로 합성된 본 발명의 단백질의 부분 펩티드도 항원으로 사용될 수 있다.
또한, TROP2 를 발현하는 세포주를 항원으로 사용할 수 있다.
(b) 항체 생산 세포의 제조
단계 (a) 에서 수득된 항원을 프로인트 완전 또는 불완전 아쥬반트 등의 아쥬반트 또는 보조제, 예컨대 또는 알루미늄 포타슘 술페이트와 혼합하고, 산출되는 혼합물을 면역원으로 사용하여 실험 동물을 면역화시킨다. 대안적인 방법에서, 실험 동물은 면역원으로서 항원-발현 세포로 면역화된다. 실험 동물로서, 공지의 하이브리도마 제조 방법에 사용되는 모든 동물을 방해 없이 사용할 수 있다. 구체적으로, 예를 들어, 마우스, 래트, 염소, 양, 소, 말 등이 사용될 수 있다. 그러나, 추출된 항체 생산 세포와 융합되는 골수종 세포의 이용 용이성 관점에서, 면역화되는 동물로는 마우스 또는 래트를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 사용되는 마우스 또는 래트의 균주는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어 마우스의 경우, A, AKR, BALB/c, BDP, BA, CE, C3H, 57BL, C57BL, C57L, DBA, FL, HTH, HT1, LP, NZB, NZW, RF, R III, SJL, SWR, WB, 및 129 등의 다양한 균주를 사용할 수 있으며, 래트의 경우 예를 들어, Wistar, Low, Lewis, Sprague, Dawley, ACI, BN, Fischer 등을 사용할 수 있다.
이들 마우스 및 래트는 실험 동물, 예를 들어, CLEA Japan, Inc. 및 Charles River Laboratories Japan, Inc. 의 사육자/유통자로부터 수득할 수 있다.
하기에 기재된 골수종 세포와의 융합의 적합성을 고려하여, 마우스의 경우 BALB/c 균주, 및 래트의 경우 Wistar 및 Low 균주가 면역화되는 동물로서 특히 바람직하다.
또한, 인간과 마우스의 항원성 상동성을 고려하여, 자가-항체를 제거하기 위해 생물학적 기능이 감소된 마우스, 즉 자가면역성 질환이 있는 마우스를 사용하는 것이 바람직하다.
면역화 시 이러한 마우스 또는 래트의 연령은 바람직하게는 5 내지 12 주령, 더욱 바람직하게는 6 내지 8 주령이다.
동물을 TROP2 또는 이의 재조합체로 면역화시키기 위해, 예를 들어, Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois (1964) 등에 상세히 기재된 공지된 방법이 사용될 수 있다.
이들 면역화 방법 중에서, 본 발명에서 바람직한 구체적인 방법은 예를 들어, 다음과 같다.
즉, 첫째, 항원의 역할을 하는 막 단백질 분획 또는 항원을 발현하기 위한 세포를 동물에게 피내 또는 복강내 투여한다. 그러나, 면역화 효율을 증가시키기 위해서는 투여 경로 모두의 조합이 바람직하며, 전반부에 피내 투여를 하고 후반부 또는 마지막 투여시에만 복강 내 투여를 할 경우, 면역화 효율을 특히 증가시킬 수 있다.
항원의 투여 일정은 면역화되는 동물의 유형, 개체의 차이 등에 따라 달라진다. 그러나, 일반적으로, 항원의 투여 빈도가 3 내지 6 배이고, 투여 간격이 2 내지 6 주인 투여 일정이 바람직하고, 항원의 투여 빈도가 3 내지 4 배이고, 투여 간격이 2 내지 4 주인 투여 일정이 보다 바람직하다.
또한, 항원의 투여량은 동물의 유형, 개체의 차이 등에 따라 다르지만, 투여량은 일반적으로 0.05 내지 5 mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 0.5 mg 으로 설정된다.
상기 기재된 항원의 투여 후 1 내지 6 주, 바람직하게는 1 내지 4 주, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 주 후에 부스터 면역화를 수행한다. 면역원이 세포인 경우, 1 ×106 내지 1 ×107 세포가 사용된다.
부스터 면역화 수행시 항원의 투여량은 동물의 종류나 크기 등에 따라 다르지만, 예를 들어 마우스의 경우, 투여량은 일반적으로 0.05 내지 5 mg, 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mg, 더욱 바람직하게는 약 0.1 내지 0.2 mg 으로 설정된다. 면역원이 세포인 경우, 1 ×106 내지 1 ×107 세포가 사용된다.
비장 세포 또는 항체-생산 세포를 포함하는 림프구는 부스터 면역화로부터 1 내지 10 일, 바람직하게는 2 내지 5 일, 더욱 바람직하게는 2 내지 3 일 후에 면역화된 동물로부터 무균적으로 제거된다. 이때, 항체 역가를 측정하여, 항체-생산 세포의 공급원으로 충분히 증가된 항체 역가를 갖는 동물을 이용하는 경우, 후속 공정을 보다 효율적으로 진행할 수 있다.
여기서 사용되는 항체 역가를 측정하는 방법의 예는 RIA 방법 및 ELISA 방법을 포함하나, 방법이 이에 한정되는 것은 아니다. 예를 들어, ELISA 방법이 사용되는 경우, 본 발명에서 항체 역가 측정은 하기 기재된 절차에 따라 수행될 수 있다.
먼저, 정제된 또는 부분적으로 정제된 항원을 ELISA 를 위한 96 웰 플레이트와 같은 고체상의 표면에 흡착시키고, 항원이 흡착되지 않은 고체상의 표면을 혈청 알부민 (BSA) 과 같은 항원과 무관한 단백질로 덮는다. 표면을 세척한 후, 표면을 1 차 항체로서 연속적으로 희석된 샘플 (예를 들어, 마우스 혈청) 과 접촉시켜 샘플 내의 항체가 항원에 결합하도록 한다.
또한, 2 차 항체로는, 마우스 항체에 대항하는 효소로 표지된 항체를 첨가하여 마우스 항체에 결합시킨다. 세척 후, 효소에 대한 기질을 첨가하고, 기질의 분해 등에 의해 유도된 발색에 의해 발생하는 흡광도의 변화를 측정하고, 측정을 기초로 항체 역가를 계산한다.
면역화된 동물의 비장 세포 또는 림프구로부터 항체-생산 세포의 분리는 공지된 방법 (예를 들어, Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Kohler et al., Eur. J. Immunol. (1977), 6, p. 511; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550; Walsh, Nature (1977), 266, p. 495) 에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 비장 세포의 경우, 비장을 균질화하여 스테인레스 스틸 메쉬로 여과하여 세포를 수득하고, 세포를 이글 최소 필수 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium, MEM) 에 현탁하여 항체 생산 세포를 분리하는 일반적인 방법을 사용할 수 있다.
(c) 골수종 세포 (이하 "골수종" 이라 함) 의 제조
세포 융합에 사용되는 골수종 세포는 특별히 제한되지 않으며, 적합한 세포는 공지된 세포주로부터 선택될 수 있다. 그러나, 융합 세포로부터 하이브리도마를 선택하는 경우 편의성을 고려할 때, 선택 절차가 확립된 HGPRT (하이포잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스페라제) 결핍 균주를 사용하는 것이 바람직하다.
더욱 구체적으로, HGPRT-결핍 균주의 예는 마우스 유래의 X63-Ag8(X63), NS1-ANS/1(NS1), P3X63-Ag8.U1(P3U1), X63-Ag8.653(X63.653), SP2/0-Ag14(SP2/0), MPC11-45.6TG1.7(45.6TG), FO, S149/5XXO, 및 BU.1; 래트 유래의 210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3); 및 인간 유래의 U266AR(SKO-007), GM1500·GTG-A12(GM1500), UC729-6, LICR-LOW-HMy2(HMy2) 및 8226AR/NIP4-1(NP41) 를 포함한다. 이들 HGPRT-결핍 균주는 예를 들어, ATCC 등으로부터 입수가능하다.
이들 세포주는 8-아자구아닌 배지 (8-아자구아닌을 글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신, 및 우태아 혈청 (이하, "FBS" 라 함) 을 보충한 RPMI 1640 배지에 첨가함으로써 수득된 배지), 이스코브 개질 둘베코 배지 (IMDM), 또는 둘베코 개질 이글 배지 (DMEM) 등의 적절한 배지에서 계대배양된다. 이 경우, 세포 융합을 수행하기 3 내지 4 일 전에, 세포를 정상 배지 (예를 들어, 10% FCS 를 함유하는 ASF104 배지 (Ajinomoto Co., Ltd. 제조)) 에서 계대배양하여 세포 융합일에 2 x 107 세포 이상을 확보한다.
(d) 세포 융합
항체 생산 세포와 골수종 세포의 융합은 세포의 생존율이 과도하게 감소하지 않는 조건 하에서, 공지의 방법 (Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford (1987); Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois (1964), etc.) 에 따라 적절히 수행될 수 있다.
이러한 방법으로는, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체를 포함하는 용액에 항체 생산 세포와 골수종 세포를 고농도로 혼합하는 화학적 방법, 전기 자극을 이용한 물리적 방법 등이 사용될 수 있다. 이들 방법 중, 화학적 방법의 구체적인 예는 하기 기술되는 바와 같다.
즉, 중합체를 포함하는 용액에 폴리에틸렌 글리콜을 고농도로 사용하는 경우, 항체-생산 세포와 골수종 세포를 분자량이 1500 내지 6000, 더욱 바람직하게는 2000 내지 4000 인 폴리에틸렌 글리콜의 용액에서 30 내지 40℃, 바람직하게는 35 내지 38℃ 의 온도에서 1 내지 10 분, 바람직하게는 5 내지 8 분 동안 혼합한다.
(e) 하이브리도마의 그룹의 선택
상기 세포 융합에 의해 수득되는 하이브리도마의 선별 방법은 특별히 제한되지 않는다. 일반적으로, HAT (하이포잔틴, 아미노프테린, 티미딘) 선택 방법 (Kohler et al., Nature (1975), 256, p. 495; Milstein et al., Nature (1977), 266, p. 550) 이 사용된다.
이 방법은 아미노프테린의 존재 하에서 생존할 수 없는 HGPRT-결핍 균주의 골수종 세포를 사용하여 하이브리도마가 얻어지는 경우에 효과적이다. 즉, HAT 배지에서 융합되지 않은 세포 및 하이브리도마를 배양함으로써, 아미노프테린에 내성이 있는 하이브리도마 만을 선택적으로 생존 및 증식시킬 수 있다.
(f) 단일 세포 클론으로의 분할 (클로닝)
하이브리도마에 대한 클로닝 방법으로서, 메틸셀룰로오스 방법, 소프트 아가로오스 방법, 또는 제한 희석 방법과 같은 공지된 방법이 사용될 수 있다 (예를 들어, Barbara, B. M. and Stanley, M. S.: Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco (1980) 참조). 이들 방법 중, 특히, 메틸셀룰로오스 방법과 같은 3 차원 배양 방법이 바람직하다. 예를 들어, 세포 융합에 의해 생산된 하이브리도마의 그룹은 ClonaCell-HY Selection Medium D (StemCell Technologies, Inc. 사제, #03804) 과 같은 메틸셀룰로오스 배지에 현탁되고 배양된다. 이후, 형성된 하이브리도마 콜로니를 수집하여, 모노클로날 하이브리도마를 수득할 수 있다. 수집한 각각의 하이브리도마 콜로니를 배양하고, 수득된 하이브리도마 배양 상청액에서 안정한 항체 역가를 갖는 것으로 확인된 하이브리도마를 TROP2 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 균주로서 선별한다.
이와 같이 확립된 하이브리도마 균주의 예는 TROP2 하이브리도마 TINA1 을 포함한다. 본 명세서에서, TROP2 하이브리도마 TINA1 에 의해 생산된 항체를 "TINA1 항체" 또는 간단히 "TINA1" 이라 한다.
TINA1 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 목록의 SEQ ID NO: 2 로 나타내지는 아미노산 서열을 갖는다. 또한, TINA1 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 목록의 SEQ ID NO: 4 로 나타내지는 아미노산 서열을 갖는다.
(g) 하이브리도마 배양에 의한 모노클로날 항체의 제조
이렇게 선별된 하이브리도마를 배양함으로써, 모노클로날 항체를 효율적으로 수득할 수 있다. 그러나, 배양 전에, 표적 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝을 수행하는 것이 바람직하다.
이러한 스크리닝에서, 공지된 방법이 사용될 수 있다.
본 발명에서 항체 역가의 측정은, 예를 들어, 상기 기재된 항목 (b) 에서 설명된 ELISA 방법에 의해 수행될 수 있다.
상기 방법으로 수득된 하이브리도마는 액체 질소 또는 -80℃ 이하의 냉동고에 냉동된 상태로 보관될 수 있다.
클로닝 완료 후, 배지는 HT 배지에서 정상 배지로 교체되고, 하이브리도마를 배양한다.
대규모의 배양은 대형 배양 병을 이용한 회전 배양 또는 스피너 배양에 의해 수행된다. 대규모 배양에 의해 수득된 상청액으로부터, 본 발명의 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체는 겔 여과와 같은 당업자에게 공지된 방법을 이용하는 정제에 의해 수득될 수 있다.
또한, 하이브리도마 (예를 들어, 상기 BALB/c) 또는 Nu/Nu 마우스와 동일한 균주의 마우스의 복강에 하이브리도마를 주입하여 하이브리도마 증식시킴으로써, 본 발명의 모노클로날 항체를 다량 포함하는 복수 (ascites) 를 수득할 수 있다.
하이브리도마를 복강에 투여할 경우, 2,6,10,14-테트라메틸 펜타데칸 (프리스탄) 과 같은 광유를 3 내지 7 일 전에 투여하면, 더 많은 양의 복수를 얻을 수 있다.
예를 들어, 면역억제제를 하이브리도마와 동일한 균주의 마우스의 복강에 미리 주입하여 T 세포를 불활성화시킨다. 20 일 후, 106 내지 107 개의 하이브리도마 클론 세포를 무혈청 배지 (0.5 ml) 에 현탁시키고, 마우스의 복강에 현탁액을 투여하였다. 일반적으로, 복부가 팽창되어 복수로 채워지면, 마우스로부터 복수를 수집한다. 이 방법에 의해, 모노클로날 항체는 배양 용액에서의 농도보다 약 100 배 또는 훨씬 높은 농도에서 수득될 수 있다.
상기 방법에 의해 수득된 모노클로날 항체는 예를 들어, Weir, D. M.: Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1978) 에 기재된 방법에 의해 정제될 수 있다.
이렇게 수득된 모노클로날 항체는 TROP2 에 대한 항원 특이성이 높다.
(h) 모노클로날 항체의 분석
이렇게 수득된 모노클로날 항체의 이소타입 및 서브클래스는 다음과 같이 결정될 수 있다.
첫째, 확인 방법의 예는 Ouchterlony 방법, ELISA 방법, 및 RIA 방법이 포함된다.
Ouchterlony 방법은 간단하지만, 모노클로날 항체의 농도가 낮은 경우에는, 축합 작업이 필요하다.
한편, ELISA 방법 또는 RIA 방법을 사용하는 경우, 배양 상청액을 항원이 흡착된 고체상과 직접 반응시키고, 다양한 유형의 면역글로불린 이소타입 및 서브클래스에 해당하는 항체를 2 차 항체로 사용함으로써, 모노클로날 항체의 이소타입 및 서브클래스를 확인할 수 있다.
또한, 보다 간단한 방법으로, 시판되는 식별 키트 (예를 들어, Bio-Rad Laboratories, Inc. 에서 제조한 Mouse Typer Kit) 등을 사용할 수도 있다.
또한, 단백질의 정량적 결정은 Folin Lowry 방법 및 280 nm 에서의 흡광도에 기초한 계산 방법 (1.4 (OD 280) = 면역글로불린 1 mg/ml) 에 의해 수행될 수 있다.
또한, 상기 (2) 에서 (a) 내지 (h) 의 단계를 다시 수행하여 모노클로날 항체를 개별적으로 그리고 독립적으로 수득하는 경우에도, TINA1 항체와 동등한 세포독성 활성을 갖는 항체 또는 SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체를 수득할 수 있다. 이러한 항체의 한 예로서, TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체 또는 SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체. 새로 생산된 모노클로날 항체가 TINA1 항체 또는 SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체가 결합하는 부분적인 펩티드 또는 부분적인 3 차 구조에 결합하는 경우, 모노클로날 항체가 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 결정될 수 있다. 또한, 모노클로날 항체가 TINA1 항체, 또는 TROP2 에 대한 결합에 대해 SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 경쟁하는 것을 확인함으로써 (즉, 모노클로날 항체가 TINA1 항체, 또는 SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 및 TROP2 를 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 사이의 결합을 억제함), 특이적 에피토프 서열 또는 구조가 결정되지 않았더라도, 모노클로날 항체가 항-TROP2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 결정될 수 있다. 모노클로날 항체가 항-TROP2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 확인할 경우, 모노클로날 항체는 TINA1 항체 또는 SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체와 동등한 항원-결합 친화성 및 생물학적 활성을 가질 것으로 강하게 예측된다.
(3) 그 밖의 항체
본 발명의 항체는 TROP2 에 대항하는 상기 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 인간에 대한 이종 항원성을 감소시키기 위한 목적으로 인공 변형에 의해 얻어지는 재조합 항체, 예컨대 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체를 포함한다. 이들 항체는 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
키메라 항체로는, 항체 가변 영역과 불변 영역이 상이한 종으로부터 유래된 항체, 예를 들어, 마우스- 또는 래트-유래 항체 가변 영역과 인간-유래 항체 불변 영역이 연결된 키메라 항체를 예시할 수 있다 (참조, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855, (1984)).
인간화 항체로는, 인간-유래 항체에 상보성 결정 영역 (CDR) 만을 통합함으로써 수득한 항체 (참조 Nature (1986) 321, pp. 522-525), 및 CDR-그래프팅 방법에 의해 인간 항체에 CDR 서열 뿐만 아니라 골격의 아미노산 잔기의 일부를 이식함으로써 수득한 항체 (국제 공개 제 WO 90/07861 호) 를 예시할 수 있다.
그러나, 인간화 항체가 TINA1 항체의 모든 6 가지 유형의 CDR 서열을 갖는 한, TINA1 항체로부터 유래된 인간화 항체는 특정 인간화 항체에 제한되지 않는다. TINA1 항체의 중쇄 가변 영역은 서열 목록의 SEQ ID NO: 23 로 나타내지는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH1 (TAGMQ), 서열 목록의 SEQ ID NO: 24 로 나타내지는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH2 (WINTHSGVPKYAEDFKG) 및 서열 목록의 SEQ ID NO: 25 로 나타내지는 아미노산 서열로 이루어진 CDRH3 (SGFGSSYWYFDV) 을 갖는다. 또한, TINA1 항체의 경쇄 가변 영역은 서열 목록의 SEQ ID NO: 26 으로 나타내지는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL1 (KASQDVSTAVA), 서열 목록의 SEQ ID NO: 27 로 나타내지는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL2 (SASYRYT) 및 서열 목록의 SEQ ID NO: 28 로 나타내지는 아미노산 서열로 이루어진 CDRL3 (QQHYITPLT) 을 갖는다.
마우스 항체 TINA1 의 인간화 항체의 예로서, (1) 서열 목록의 SEQ ID NO: 12, 14, 또는 16 의 아미노산 잔기 20 내지 140 또는 SEQ ID NO: 45 의 아미노산 잔기 1-121 로 이루어지는 아미노산 서열, (2) 상기 기재된 아미노산 서열 (1) 과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (3) 상기 기재된 아미노산 서열 (1) 중 하나 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 중 임의의 하나로 이루어지는 중쇄 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 (4) 서열 목록의 SEQ ID NO: 18, 20, 또는 22 의 아미노산 잔기 21 내지 129 또는 SEQ ID NO: 46 의 아미노산 잔기 1 내지 109 로 이루어지는 아미노산 서열, (5) 상기 기재된 아미노산 서열 (4) 과 적어도 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 및 (6) 상기 기재된 아미노산 서열 (4) 중 하나 또는 수 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열 중 임의의 하나로 이루어지는 경쇄 가변 영역을 포함하는 경쇄의 임의적인 조합이 예시될 수 있다.
상기 기재된 중쇄와 경쇄의 바람직한 조합을 갖는 항체로서, SEQ ID NO: 45 의 아미노산 1-121 을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 의 아미노산 1-109 를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체가 예시될 수 있다.
또한, 상기 기재된 중쇄와 경쇄의 더욱 바람직한 조합을 갖는 항체로서, SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체가 예시될 수 있다.
상기 기재된 중쇄와 경쇄의 우수한 바람직한 조합을 갖는 항체로서, SEQ ID NO: 45 의 아미노산 1-121 을 포함하는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 의 아미노산 1-109 를 포함하는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 잔기 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 잔기 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 잔기 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 잔기 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 잔기 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 잔기 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 잔기 20 내지 140 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 잔기 21 내지 129 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 가변 영역을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체가 예시될 수 있다.
또한, 상기 기재된 중쇄와 경쇄의 또다른 더욱 바람직한 조합을 갖는 항체로서, SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체가 예시될 수 있다.
상기 기재된 중쇄와 경쇄의 우수한 바람직한 조합을 갖는 항체로서, SEQ ID NO: 45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 470 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체가 예시될 수 있다.
또한, 상기 기재된 중쇄와 경쇄의 더욱 우수한 바람직한 조합을 갖는 항체로서, SEQ ID NO: 12 의 아미노산 위치 20 내지 469 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 469 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 18 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; SEQ ID NO: 14 의 아미노산 위치 20 내지 469 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 20 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체; 및 SEQ ID NO: 16 의 아미노산 위치 20 내지 469 으로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 및 SEQ ID NO: 22 의 아미노산 위치 21 내지 234 로 이루어지는 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄로 이루어지는 항체가 예시될 수 있다.
상기 중쇄 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는 서열과 상기 경쇄 아미노산 서열과 높은 상동성을 갖는 서열을 결합함으로써, 각각의 상기 항체와 동등한 생물학적 활성을 갖는 항체를 선별할 수 있다. 이러한 상동성은 일반적으로 80% 이상의 상동성, 바람직하게는 90% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 95% 이상의 상동성, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성이다. 또한, 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열에 하나 내지 여러 개의 아미노산 잔기가 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열을 조합함으로써, 각각의 상기 항체와 동등한 생물학적 활성을 갖는 항체를 선별할 수도 있다.
2 개의 아미노산 서열 사이의 상동성은 Blast 알고리즘 버전 2.2.2 의 디폴트 파라미터를 사용하여 결정될 수 있다 (Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402). Blast 알고리즘은 ncbi.nlm.nih.gov/blast 사이트에 접속하여 인터넷을 통해서도 사용할 수 있다.
서열 목록의 SEQ ID NO: 12, 14, 또는 16 으로 나타내지는 중쇄 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기 1 내지 19 로 이루어진 아미노산 서열은 신호 서열이고, 아미노산 잔기 20 내지 140 으로 이루어진 아미노산 서열은 가변 영역이고, 아미노산 잔기 141 내지 470 으로 이루어진 아미노산 서열은 불변 영역이다.
또한, 서열 목록의 SEQ ID NO: 18, 20, 또는 22 으로 나타내지는 경쇄 아미노산 서열에서, 아미노산 잔기 1 내지 20 로 이루어진 아미노산 서열은 신호 서열이고, 아미노산 잔기 21 내지 129 으로 이루어진 아미노산 서열은 가변 영역이고, 아미노산 잔기 130 내지 234 으로 이루어진 아미노산 서열은 불변 영역이다.
또한, 본 발명의 항체는 TROP2 에 결합하는 인간 항체를 포함한다. 항-TROP2 인간 항체는 인간 염색체로부터 유래된 항체의 서열만을 갖는 인간 항체를 의미한다. 항-TROP2 인간 항체는 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 유전자를 포함하는 인간 염색체 단편을 갖는 인간 항체-생산 마우스를 이용하는 방법에 의해 수득될 수 있다 (Tomizuka, K. et al., Nature Genetics (1997) 16, pp. 133-143; Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res. (1998) 26, pp. 3447-3448; Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology: Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73 (Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999; Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97, pp. 722-727, 등 참조).
이러한 인간 항체-생산 마우스는 구체적으로 다음과 같이 생성될 수 있다. 내인성 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌가 파괴된, 그리고 대신, 효모 인공 염색체 (YAC) 벡터 등을 통해 인간 면역글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 좌가 도입된 유전적으로 변형된 동물은 녹아웃 동물 및 형질전환 동물을 생산하고 이들 동물들을 교배함으로써 생성된다.
또한, 재조합 DNA 기술에 따르면, 이러한 인간 항체의 중쇄 및 경쇄 각각을 인코딩하는 cDNA, 및 바람직하게는 이러한 cDNA 를 포함하는 벡터를 이용하여, 진핵 세포를 형질전환시키고, 재조합 인간 모노클로날 항체를 생산하는 형질전환체 세포를 배양함으로써, 배양 상청액으로부터 항체를 수득할 수도 있다.
여기서, 숙주로서, 예를 들어, 진핵 세포, 바람직하게는 CHO 세포, 림프구, 또는 골수종 세포와 같은 포유동물 세포가 사용될 수 있다.
또한, 인간 항체 라이브러리로부터 선별된 파지 디스플레이-유래 인간 항체를 수득하는 방법 (참조 Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science. (2002) 43 (7), pp. 2301-2308; Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), pp. 189-203; Siriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), pp. 427-431, 등) 도 공지되어 있다.
예를 들어, 파지의 표면에 인간 항체의 가변 영역을 단일-사슬 항체 (scFv) 로서 발현하고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 파지 디스플레이 방법 (Nature Biotechnology (2005), 23, (9), pp. 1105-1116) 을 사용할 수 있다.
항원에 대한 결합을 기초로 선별된 파지의 유전자를 분석함으로써, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변 영역을 인코딩하는 DNA 서열을 결정할 수 있다.
항원에 결합하는 scFv 의 DNA 서열을 결정하는 경우, 상기 서열을 포함하는 발현 벡터를 제조하고 벡터를 적절한 숙주에 도입하여 이를 발현시킴으로써 인간 항체를 수득할 수 있다 (국제 공개 번호 WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388; Annu. Rev. Immunol. (1994) 12, pp. 433-455; Nature Biotechnology (2005) 23 (9), pp. 1105-1116).
새롭게 생산된 인간 항체가 TINA1 항체가 결합하는 부분적인 펩티드 또는 부분적인 3 차 구조에 결합하는 경우, 인간 항체가 TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 결정될 수 있다. 또한, 인간 항체가 TINA1 항체와 TROP2 와의 결합에 대해 경쟁하는 것을 확인함으로써 (즉, 인간 항체가 TINA1 항체와 TROP2 사이의 결합을 억제함), 특이적 에피토프 서열 또는 구조가 결정되지 않더라도, 인간 항체가 TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 결정할 수 있다. 인간 항체가 TINA1 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 것을 확인하면, 인간 항체는 TINA1 항체와 동등한 생물학적 활성을 가질 것으로 강하게 예상된다.
상기 방법으로 얻어진 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체는 공지의 방법 등에 의해 항원에 대한 결합 특성을 평가할 수 있으며, 바람직한 항체를 선택할 수 있다.
항체의 특성 비교에 사용되는 또 다른 지표의 일 예로서, 항체의 안정성을 예시할 수 있다. 시차 주사 열량계 (DSC) 는 열 변성 중간점 온도 (Tm) 를 빠르고 정확하게 측정하여 단백질의 상대적 형태적 안정성에 대한 양호한 지표로 사용할 수 있는 장치이다. DSC 를 이용하여 Tm 값을 측정하고 값을 비교함으로써, 열 안정성의 차이를 비교할 수 있다. 항체의 저장 안정성은 항체의 열 안정성과 약간의 상관관계를 나타내는 것으로 알려져 있고 (Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology (2007) 12, pp. 265-273), 열 안정성을 지표로 사용하여 바람직한 항체를 선택할 수 있다. 항체를 선택하기 위한 다른 지표의 예는 다음의 특징을 포함한다: 적절한 숙주 세포에서의 수율이 높고; 수용액에서의 응집성이 낮다. 예를 들어, 가장 높은 수율을 보이는 항체가 항상 가장 높은 열 안정성을 보이는 것은 아니므로, 상기 지표를 바탕으로 종합적인 평가를 통해 인간에게 투여하기에 가장 적합한 항체를 선택할 필요가 있다.
본 발명에서, 항체의 변형된 변이체도 포함된다. 변형된 변이체는 본 발명의 항체를 화학적 또는 생물학적 변형에 적용함으로써 수득된 변이체를 의미한다. 화학적으로 변형된 변이체의 예는, 아미노산 골격에 화학적 모이어티를 연결하여 화학적으로 변형된 변이체, N-연결 또는 O-연결 탄수화물 사슬로 화학적으로 변형된 변이체 등을 포함한다. 생물학적으로 변형된 변이체의 예로는 번역후 변형 (예컨대, N-연결 또는 O-연결 당화, N- 또는 C-말단 가공, 탈아미드화, 아스파르트산의 이성질화, 또는 메티오닌의 산화) 에 의해 수득되는 변이체, 및 메티오닌 잔기가 원핵 숙주 세포에서 발현되어 N 말단에 부가된 변이체를 포함한다.
또한, 본 발명의 항체 또는 항원의 검출 또는 분리가 가능하도록 표지된 항체, 예를 들어 효소 표지된 항체, 형광 표지된 항체 및 친화도 표지된 항체 또한 상기 변형된 변이체의 의미에 포함된다. 이러한 본 발명의 항체의 변형된 변이체는 항체의 안정성 및 혈액 보유를 향상시키고, 이의 항원성을 감소시키고, 항체 또는 항원을 검출 또는 단리하는 등에 유용하다.
또한, 본 발명의 항체에 연결된 글리칸의 변형 (글리코실화, 탈푸코실화 등) 을 조절함으로써, 항체 의존적 세포 세포독성 활성을 향상시킬 수 있다. 항체의 글리칸의 변형을 조절하는 기술로는 국제 공개 번호 WO 1999/54342, WO 2000/61739, WO 2002/31140 등이 알려져 있다. 그러나, 기술은 그에 제한되지 않는다. 본 발명의 항체에는 글리칸의 변형이 조절된 항체도 포함된다.
항체 유전자를 먼저 분리한 후 유전자를 적절한 숙주에 도입하여 항체를 생산하는 경우, 적절한 숙주와 적절한 발현 벡터의 조합을 사용할 수 있다. 항체 유전자의 구체적인 예로는 본 명세서에 기재된 항체의 중쇄 서열을 인코딩하는 유전자와 그의 경쇄 서열을 인코딩하는 유전자의 조합을 포함한다. 숙주 세포가 형질전환되면, 중쇄 서열 유전자 및 경쇄 서열 유전자를 동일한 발현 벡터 내에, 또한 각각 상이한 발현 벡터 내에 삽입할 수 있다.
진핵 세포를 숙주로 사용하는 경우, 동물 세포, 식물 세포, 및 진핵 미생물을 이용할 수 있다. 동물 세포로는, 포유동물 세포, 예를 들어, 원숭이 COS 세포 (Gluzman, Y., Cell, (1981) 23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650), 뮤린 섬유모세포 NIH3T3 (ATCC No. CRL-1658), 및 중국 햄스터 난소 세포 (CHO 세포; ATCC: CCL-61) 의 디히드로폴레이트 리덕타제-결핍 균주 (Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1980) 77, pp. 4126-4220) 가 예시될 수 있다.
원핵 세포를 이용하는 경우, 예를 들어 대장균 및 바실러스 서브틸리스를 예시할 수 있다.
형질전환을 통해 원하는 항체 유전자를 이들 세포에 도입하고, 형질전환된 세포를 시험관 내에서 배양함으로써, 항체가 수득될 수 있다. 상기 배양 방법에서, 항체의 서열에 따라 수율이 달라지는 경우가 있으므로, 동등 결합 활성을 갖는 항체들 중에서 수율을 지표로 사용하여 쉽게 약제로서 생산될 수 있는 항체를 선별할 수 있다. 따라서, 본 발명의 항체에는, 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 배양 단계에서 수득된 배양 생성물로부터 원하는 항체를 수집하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항체 제조 방법에 의해 얻어진 항체도 포함된다.
배양된 포유동물 세포에서 생산된 항체의 중쇄의 카르복실 말단에서 리신 잔기가 결실된 것으로 알려져 있으며 (Journal of Chromatography A, 705: 129-134 (1995)), 배양된 포유동물 세포에서 생산된 항체의 중쇄의 카르복실 말단에서 2 개의 아미노산 잔기 (글리신 및 리신) 가 결실되고, 카르복실 말단에 새롭게 위치하는 프롤린 잔기가 아미드화된 것으로 알려져 있다 (Analytical Biochemistry, 360: 75-83 (2007)). 그러나, 이러한 중쇄 서열의 결실 및 변형은 항체의 항원 결합 친화성 및 효과기 기능 (보체의 활성화, 항체-의존성 세포 독성 등) 에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 항체에는, 이러한 변형을 거친 항체 및 항체의 기능적 단편도 포함되며, 중쇄의 카르복실 말단에서 하나 또는 두 개의 아미노산이 결실된 결실 변이체, 결실 변이체의 아미드화에 의해 수득되는 변이체 (예를 들어, 카르복실 말단 프롤린 잔기가 아미드화된 중쇄) 등도 포함된다. 본 발명에 따른 항체의 중쇄의 카르복실 말단에 결실을 갖는 결실 변이체의 유형은 항원 결합 친화도와 이펙터 기능이 보존되는 한 상기 변이체에 한정되지 않는다. 본 발명에 따른 항체를 구성하는 2 개의 중쇄는 전장 중쇄 및 상기 결실 변이체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1 종의 중쇄일 수 있고, 그로부터 선택된 2 종의 중쇄가 조합된 것일 수 있다. 각 결실 변이체의 양의 비율은 본 발명에 따른 항체를 생산하는 배양된 포유동물 세포의 유형 및 배양 조건에 의해 영향을 받을 수 있으나, 본 발명에 따른 항체의 주성분으로 포함된 2 개의 중쇄 모두에서 카르복실 말단의 하나의 아미노산 잔기가 결실된 경우를 예시할 수 있다.
본 발명의 항체의 이소타입으로는, 예를 들어, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4) 를 예시할 수 있으며, 바람직하게는 IgG1 또는 IgG2 를 예시할 수 있다.
항체의 생물학적 활성으로는, 일반적으로 항원 결합 활성, 항원에 결합하여 항원을 발현하는 세포에서 내재화하는 활성, 항원의 활성을 중화시키는 활성, 항원의 활성을 증진시키는 활성, 항체 의존적 세포독성 (ADCC) 활성, 보체 의존적 세포독성 (CDC) 활성, 및 항체 의존적 세포 매개 식세포작용 (ADCP) 활성이 예시될 수 있다. 본 발명의 항체의 기능은 TROP2 에 대한 결합 활성, 바람직하게는 TROP2 에 결합함으로써 TROP2-발현 세포에서 내재화하는 활성이다. 또한, 본 발명의 항체는 세포 내재화 활성 외에 ADCC 활성, CDC 활성, 및/또는 ADCP 활성을 가질 수 있다.
수득된 항체는 균질성으로 정제될 수 있다. 항체의 분리 및 정제는 통상의 단백질 분리 및 정제 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 컬럼 크로마토그래피, 필터 여과, 한외여과, 염 침전, 투석, 제조용 폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전점 포커싱 전기영동 등을 적절히 선택하고 조합함으로써 항체를 분리 및 정제할 수 있고 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1996); Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)), 그러나 방법이 이에 한정되는 것은 아니다.
이러한 크로마토그래피는 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 및 흡착 크로마토그래피를 포함한다.
이러한 크로마토그래피는 HPLC 또는 FPLC 와 같은 액체 크로마토그래피를 사용하여 수행될 수 있다.
친화성 크로마토그래피에 사용되는 컬럼으로는, Protein A 컬럼 및 Protein G 컬럼이 예시될 수 있다. 예를 들어, Protein A 컬럼을 이용한 컬럼으로는, Hyper D, POROS, Sepharose FF (Pharmacia) 등을 예시할 수 있다.
또한, 항원이 고정된 담체를 이용하여, 항원에 대한 항체의 결합성을 이용하여 항체를 정제할 수도 있다.
항암 화합물
본 발명의 개시된 항체-약물 접합체의 일부로서 항-TROP2 항체에 접합될 항종양 화합물을 이 섹션에서 설명한다.
본 발명에서 사용되는 항종양 화합물은 항종양 효과를 갖는 화합물로서, 링커 구조와 연결될 수 있는 치환기 또는 부분 구조를 갖는 화합물이라면 특별히 제한되지 않는다. 종양 세포에서 일부 또는 전체 링커가 절단되면, 항종양 화합물 모이어티가 방출되어 항종양 화합물의 항종양 효과를 나타낸다. 링커가 약물에 대한 연결 위치에서 절단되므로, 항종양 화합물은 그것의 비개질된 구조로 방출되어 그것의 원래의 항종양 효과를 나타낸다.
본 발명에서 사용되는 항종양 화합물로는, 캄프토테신 유도체 중 하나인 엑사테칸 (((1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온; 하기 화학식에 나타냄) 이 바람직하게 사용될 수 있다. 엑사테칸은 하기 화학식 1 에 나타내었다.
[화학식 1]
항종양 효과가 우수하지만, 엑사테칸은 항종양 약물로서 상용화되지 않았다. 화합물은 알려진 방법에 의해 용이하게 수득될 수 있고, 위치 1 에서의 아미노기는 바람직하게는 링커 구조에 대한 연결 위치로서 사용될 수 있다. 또한, 링커의 일부가 여전히 부착된 상태로 종양 세포에서도 엑사테칸이 방출될 수 있으며, 이것은 이러한 구조에서도 우수한 항암 효과를 나타내는 우수한 항암 화합물로 남아있다.
엑사테칸은 캄프토테신 구조를 가지므로, 산성 수성 매질 (예를 들어, 대략 pH 3) 에서는 닥힌 락톤 고리 (닫힌 고리) 를 갖는 구조로 평형이 이동하지만, 염기성 수성 매질 (예를 들어, 대략 pH 10) 에서는 열린 락톤 고리 (열린 고리) 를 갖는 구조로 평형이 이동한다고 알려져 있다. 폐쇄 고리 구조 및 개방 고리 구조에 상응하는 엑사테칸 잔기와 함께 도입되는 약물 접합체는 또한 동일한 항종양 효과를 가질 것으로 예상되며, 이들 상태 중 임의의 상태는 본 발명의 범위 내에 있다.
항종양 화합물의 다른 예는 독소루비신, 다우노루비신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 시클로시티딘, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 메토트렉세이트, 백금-기반 항종양제 (시스플라틴 또는 그의 유도체), 탁솔 또는 그의 유도체, 및 캄프토테신 또는 그의 유도체 (일본 특허 공개 제 6-87746 호에 기재된 항종양제) 를 포함할 수 있다.
항체-약물 접합체와 관련하여, 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 수는 효능 및 안전성에 영향을 미치는 핵심 인자이다. 항체-약물 접합체의 제조는 접합된 약물 분자의 수가 일정하도록 반응을 위한 원료와 시약의 사용량을 포함하는 반응 조건을 정의함으로써 수행되며, 항체-약물 접합체는 일반적으로 저분자량 화합물의 화학 반응과 달리, 상이한 수의 접합된 약물 분자를 포함하는 혼합물로서 수득된다. 항체 분자에 접합된 약물의 수는 평균 값, 즉, 접합된 약물 분자의 평균 수로 표현되거나 명시된다. 다른 원리로 구체적으로 설명되지 않는 한, 접합된 약물 분자의 수는 상이한 수의 접합된 약물 분자를 갖는 항체-약물 접합체 혼합물에 포함된 특정 수의 접합된 약물 분자를 갖는 항체-약물 접합체를 나타내는 경우를 제외하고는 평균 값을 의미한다. 항체 분자에 접합된 엑사테칸 분자의 수는 제어가능하고, 항체 당 접합된 약물 분자의 평균수로서, 대략 1 내지 10 개의 엑사테칸이 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 개의 엑사테칸이 연결될 수 있다. 바람직하게는, 이것은 2 내지 8, 더욱 바람직하게는 3 내지 8, 더욱 바람직하게는 3.5 내지 4.5, 또는 4 이다. 한편, 당업자는 본 출원의 실시예의 설명에 기초하여 요구되는 수의 약물 분자를 항체 분자에 접합시키기 위한 반응을 디자인할 수 있고, 제어되는 수의 엑사테칸 분자를 갖는 항체-약물 접합체를 수득할 수 있다.
링커 구조
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체와 관련하여, 항-TROP2 항체에 항종양 화합물을 접합시키기 위한 링커 구조를 설명한다. 링커는 하기 화학식의 구조를 갖는다:
-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-
항체는 L1 의 말단 (L2 에 대한 연결과 반대되는 말단) 에 연결되고, 항종양 화합물은 -La-(CH2)n2-C(=O)- 모이어티의 카르보닐기에 연결된다.
n1 은 0 내지 6 의 정수를 나타내고, 바람직하게는 1 내지 5, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 의 정수이다.
L1
L1 은 하기의 구조로 나타난다
-(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)-.
상기 식에서, n3 은 2 내지 8 의 정수이고, "-(숙신이미드-3-일-N)-" 은 하기 화학식으로 나타내지는 구조를 갖는다:
[화학식 2]
상기 부분 구조의 위치 3 은 항-TROP2 항체에 대한 연결 위치이다. 위치 3 에서 항-TROP2 항체에 대한 결합은 티오에테르 형성과의 결합을 특징으로 한다. 구조 모이어티의 위치 1 에서의 질소 원자는 구조를 포함하는 링커 내에 존재하는 메틸렌의 탄소 원자에 연결된다. 구체적으로 -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)-L2- 는 하기 화학식으로 나타내지는 구조이다 (여기서, "항체-S-" 는 항체에서 유래한다).
[화학식 3]
화학식에서, n3 은 2 내지 8, 바람직하게는 2 내지 5 의 정수이다.
L1 의 특정 예는 다음을 포함할 수 있다
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
L2
L2 는 하기 구조로 나타내지는 링커이다:
-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-,
L2 는 존재하지 않을 수 있고, 이러한 경우, L2 는 단일 결합이다. 상기에서, n4 는 1 내지 6, 바람직하게는 2 내지 4 의 정수이다. L2 는 그의 말단 아미노기에서 L1 에 연결되고, 다른 말단에서 그의 카르보닐기에서 LP 에 연결된다.
L2 의 특정 예는 다음을 포함할 수 있다
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-.
LP
LP 는 2 내지 7 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 잔기이다. 구체적으로, 이것은 2 내지 7 개의 아미노산이 펩티드 결합으로 연결된 올리고펩티드 잔기로 이루어진다. LP 는 N 말단에서 L2 에 연결되고, C 말단에서 링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-모이어티의 아미노기에 연결된다.
링커에서 LP 를 구성하는 아미노산은 특별히 제한되지 않으나, 이의 예는 L- 또는 D-아미노산, 바람직하게는 L-아미노산을 포함한다. 또한, 이것은 α-아미노산 외에 β-알라닌, ε-아미노카프로산, 또는 γ-아미노부티르산과 같은 구조를 갖는 아미노산일 수 있으며, 나아가 이것은 N-메틸화된 아미노산과 같은 비-천연 유형 아미노산일 수 있다.
LP 의 아미노산 서열은 특별히 제한되지 않으나, 구성 아미노산의 예는 페닐알라닌 (Phe; F), 타이로신 (Tyr; Y), 류신 (Leu; L), 글리신 (Gly; G), 알라닌 (Ala; A), 발린 (Val; V), 리신 (Lys; K), 시트룰린 (Cit), 세린 (Ser; S), 글루탐산 (Glu; E), 및 아스파르트산 (Asp; D) 을 포함한다.
이들 중에서, 바람직한 예는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산, 및 아스파르트산을 포함한다. 아미노산의 종류에 따라, 약물 방출 패턴을 조절할 수 있다. 아미노산의 수는 2 내지 7 일 수 있다.
LP 의 특정 예는 다음을 포함할 수 있다.
-GGF-,
-DGGF-,
-(D-)D-GGF-,
-EGGF-,
-GGFG-,
-SGGF-,
-KGGF-,
-DGGFG-,
-GGFGG-,
-DDGGFG-,
-KDGGFG-,
-GGFGGGF-.
상기에서, "(D-)D" 는 D-아스파르트산을 나타낸다.
본 발명의 항체-약물 접합체에 대한 LP 의 특히 바람직한 예는 -GGFG- 의 테트라펩티드 잔기를 포함할 수 있다.
La-(CH2)n2-C(=O)-
La-(CH2)n2-C(=O)- 중 La 는 -O- 또는 단일 결합의 구조이다. n2 는 0 내지 5, 더욱 바람직하게는 0 내지 3, 더욱 바람직하게는 0 또는 1 의 정수이다.
La-(CH2)n2-C(=O)- 의 예는 하기 구조를 갖는 것들을 포함할 수 있다:
-O-CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-O-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2-C(=O)-,
-CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
이들 중, -O-CH2-C(=O)-, -O-CH2CH2-C(=O)-, 또는 La 가 단일 결합이고, n2 가 0 인 경우가 바람직하다.
링커에서 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 로 나타내지는 구조의 구체적인 예는 하기를 포함할 수 있다
-NH-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-C(=O)-,
-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-.
-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-, -NH-CH2-O-CH2-C(=O)-, 또는 -NH-CH2CH2-O-C(=O)- 가 바람직하다.
링커에서, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 의 사슬 길이는 바람직하게는 4 내지 7 개 원자의 사슬 길이, 더욱 바람직하게는 5 또는 6 개 원자의 사슬 길이이다.
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체와 관련하여, 이것은 항-TROP2 항체-약물 접합체가 종양 세포 내부로 전달시 링커 모이어티가 절단되고 NH2-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX) 로 나타내지는 구조를 가지는 약물 유도체가 방출되어 항종양 작용을 발현하는 것으로 고려된다. 본 발명의 항체-약물 접합체로부터의 방출에 의해 항종양 효과를 나타내는 항종양 유도체의 예는 링커의 -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)- 로 나타내지는 구조가 말단 아미노기를 갖는 구조 모이어티를 갖는 항종양 유도체를 포함하고, 특히 바람직한 것은 하기를 포함한다.
NH2-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
NH2-CHCH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX).
한편, NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) 의 경우, 분자 내 아민 구조가 불안정하므로, 이것은 다시 자가 분해되어 하기를 방출시키는 것을 확인하였다:
HO-CH2-C(=O)-(NH-DX).
이들 화합물은 또한 바람직하게는 본 발명의 항체-약물 접합체의 제조 중간체로서 사용될 수 있다.
엑사테칸이 약물로서 사용되는 본 발명의 항체-약물 접합체의 경우, 하기 구조를 갖는 약물-링커 구조 모이어티 [-L1-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)] 가 항체에 연결되는 것이 바람직하다. 항체 당 상기 약물-링커 구조 모이어티의 평균 접합된 수는 1 내지 10, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10 일 수 있다. 바람직하게는, 이것은 2 내지 8, 더욱 바람직하게는 3 내지 8, 더욱 바람직하게는 3.5 내지 4.5, 또는 4 이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
이 중에서, 더욱 바람직한 것은 다음과 같다:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
특히 바람직한 것은 다음과 같다:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
본 발명의 항체-약물 접합체에서 항-TROP2 항체와 약물을 접합하기 위한 링커 구조에 있어서, 상기 설명된 링커의 각 부분에 나타난 바람직한 구조를 연결하여 바람직한 링커를 구성할 수 있다. 링커 구조로서, 바람직하게는 다음과 같은 구조를 갖는 것을 사용할 수 있다. 한편, 구조의 좌측 말단은 항체와의 연결 위치이고, 우측 말단은 약물과의 연결 위치이다.
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
이 중에서, 더욱 바람직한 것은 다음과 같다:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
특히 바람직한 것은 다음을 포함한다:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-,
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2O-CH2CH2O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-.
본 발명에서 사용되는 항-TROP2 항체-약물 접합체와 관련하여, 이것은 종양 세포 내부로 전달되면, 링커 모이어티가 절단되어 하기 화학식으로 나타내지는 구조를 갖는 약물 유도체:
NH2-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) 가 방출될 수 있다.
약물 유도체의 분자 내 아민 구조가 불안정하기 때문에, 이것은 다시 자가-분해되어 하기 화학식으로 나타내지는 화합물을 방출함을 확인하였다: HO-CH2-C(=O)-(NH-DX).
화합물은 하기 화학식에 의해 나타내질 수 있다:
[화학식 4]
(이하, 본 발명에서 "화합물 1" 로도 불림).
화합물 1 은 본 발명에서 사용된 항체-약물 접합체가 갖는 항종양 활성의 주요 약학적 활성 물질로서 고려되고, 토포이소머라제 I 억제 효과를 가짐을 확인하였다 (Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research, 2016, Oct 15; 22 (20):5097-5108, Epub 2016 Mar 29).
제조 방법
다음으로, 본 발명의 항체-약물 접합체 또는 이의 제조 중간체를 제조하는 대표적인 방법에 대하여 설명한다. 한편, 화합물은 본원에서 각 반응식에 제시된 화합물 번호와 함께 하기에 기술된다. 구체적으로, 이들은 "화학식 (1) 의 화합물", "화합물 (1)" 등으로 지칭된다. 이들 외의 번호를 가진 화합물도 유사하게 기술된다.
제조 방법 A
티오에테르를 통해 약물-링커 구조와 연결되는 화학식 (1) 로 나타내지는 항체-약물 접합체는, 예를 들어, 다음과 같은 방법으로 제조될 수 있다.
[화학식 5]
화학식에서, AB 는 설프히드릴 기를 갖는 항체를 나타내고, L1' 은 링커 말단이 말레이미딜 기인 L1 링커 구조를 나타낸다 (하기 제시된 화학식)
[화학식 6]
화학식에서, 질소 원자는 연결 위치이고, 구체적으로 L1 의 -(숙신이미드-3-일-N)-(CH2)n3-C(=O)- 중의 -(숙신이미드-3-일-N)- 모이어티가 말레이미딜 기인 기를 나타낸다. 추가로, -(NH-DX) 는 하기 화학식으로 나타내지는 구조를 나타낸다:
[화학식 7]
그리고 그것은 엑사테칸의 위치 1 에서 아미노기의 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 기를 나타낸다.
또한, 상기 반응식에서 화학식 (1) 의 화합물은 약물로부터 링커 말단에 상응하는 하나의 구조 모이어티가 하나의 항체에 연결된 구조로 해석된다. 그러나, 이것은 오직 편의를 위해 제공된 설명이고, 실제로 복수의 구조 모이어티가 하나의 항체 분자에 연결된 많은 경우가 있다. 아래 기재된 제조 방법의 설명에 대해서도 동일한 것이 적용된다.
항체-약물 접합체 (1) 는 하기 방법으로 수득할 수 있는 화합물 (2) 를 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 와 반응시켜 제조할 수 있다.
설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 수득될 수 있다 (Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press (1996)) 예는 하기를 포함한다: 트라우트 시약을 항체의 아미노기와 반응시킨다; N-숙신이미딜 S-아세틸티오알카노에이트를 항체의 아미노기와 반응시키고, 그에 뒤이어 히드록실아민과 반응시킨다; N-숙신이미딜 3-(피리딜디티오)프로피오네이트와 반응시킨 후, 항체를 환원제와 반응시킨다; 항체를 환원제 예컨대 디티오트레이톨, 2-머캅토에탄올, 및 트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP) 와 반응시켜 항체 내의 다이설파이드 결합을 환원시켜, 설프히드릴기를 형성시킨다, 그러나 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 항체 내 다이설파이드 당 환원제로서 TCEP 0.3 내지 3 몰 당량을 사용하고 킬레이트제를 포함하는 완충액 내에서 항체와 반응시키면, 항체 내 다이설파이드가 부분적으로 또는 완전히 환원된 항체를 얻을 수 있다. 킬레이트화제의 예는 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA) 및 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA) 을 포함한다. 이것은 1 mM 내지 20 mM 의 농도로 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 완충액의 예는, 인산나트륨, 붕산나트륨, 또는 아세트산나트륨의 용액을 포함한다. 구체적으로, 항체를 4℃ 내지 37℃ 에서 1 내지 4 시간 동안 TCEP 와 반응시킴으로써, 부분적으로 또는 완전히 감소된 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 를 수득할 수 있다.
한편, 약물-링커 모이어티에 대한 설프히드릴 기의 부가 반응을 수행함으로써, 약물-링커 모이어티는 티오에테르 결합에 의해 접합될 수 있다.
설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 당 2 내지 20 몰 당량의 화합물 (2) 을 사용하여, 항체 당 2 내지 8 개 약물 분자가 접합된 항체-약물 접합체 (1) 가 생산될 수 있다. 구체적으로, 그에 용해된 화합물 (2) 을 함유하는 용액을 반응을 위해 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 를 함유하는 완충액에 첨가하는 것이 충분하다. 이때, 사용될 수 있는 완충액의 예는 아세트산나트륨 용액, 인산나트륨, 및 붕산나트륨을 포함한다. 반응을 위한 pH 는 5 내지 9 이며, 더욱 바람직하게는, 반응은 pH 7 근처에서 수행된다. 화합물 (2) 를 용해시키는 용매의 예는 유기 용매, 예컨대 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 디메틸포름아미드 (DMF), 디메틸 아세트아미드 (DMA), 및 N-메틸-2-피리돈 (NMP) 을 포함한다.
그에 용해된 화합물 (2) 을 함유하는 유기 용매 용액을 반응을 위해 설프히드릴 기를 갖는 항체 (3a) 를 함유하는 완충액에 1 내지 20% v/v 로 첨가하는 것이 충분하다. 반응 온도는 0 내지 37℃, 더욱 바람직하게는 10 내지 25℃ 이고, 반응 시간은 0.5 내지 2 시간이다. 미반응 화합물 (2) 의 반응성을 티올-함유 시약으로 탈활성화시킴으로써 반응이 종결될 수 있다. 티올-함유 시약의 예는 시스테인 및 N-아세틸-L-시스테인 (NAC) 을 포함한다. 보다 구체적으로, 사용된 화합물 (2) 에 1 내지 2 몰 당량의 NAC 를 첨가하고, 실온에서 10 내지 30 분 동안 인큐베이션하여 반응을 종결시킬 수 있다.
생산된 항체-약물 접합체 (1) 를 아래 기재된 통상적 절차에 따라 농축, 완충제 교환, 정제, 및 항체 농도 및 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수의 측정에 적용하여, 항체-약물 접합체 (1) 를 식별할 수 있다.
통상적 절차 A: 항체 또는 항체-약물 접합체의 수성 용액의 농축
Amicon Ultra (50,000 MWCO, Millipore Corporation) 컨테이너에, 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 첨가하고, 항체 또는 항체-약물 접합체의 용액을 원심분리기 (Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.) 를 사용하여 원심분리 (2000 G 내지 3800 G 에서 5 내지 20 분 동안 원심분리) 에 의해 농축했다.
통상적 절차 B: 항체 농도의 측정
UV 검출기 (Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.) 를 사용하여, 항체 농도의 측정을 제조사에 의해 정의된 방법에 따라 수행했다. 이때, 각각의 항체에 대해 상이한 280 nm 흡광 계수를 사용했다 (1.3 mL㎎-1㎝-1 내지 1.8 mL㎎-1㎝-1).
통상적 절차 C-1: 항체를 위한 완충제 교환
Sephadex G-25 담체를 사용하여 NAP-25 칼럼 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을 제조사에 의해 정의된 방법에 따라 소듐 클로라이드 (137 mM) 및 에틸렌 디아민 테트라아세트산 (EDTA, 5 mM) 를 함유하는 포스페이트 완충제 (10 mM, pH 6.0; 이것은 명세서에서 PBS6.0/EDTA 로서 언급됨) 로 평형시켰다. 항체의 수성 용액을 단일 NAP-25 칼럼에 2.5 mL 의 양으로 적용하고, 그 후 3.5 mL 의 PBS6.0/EDTA 로 용출된 분획 (3.5 mL) 을 수집했다. 생성된 분획을 통상적 절차 A 에 의해 농축하였다. 통상적 절차 B 를 사용하여 항체 농도를 측정한 후에, PBS6.0/EDTA 를 사용하여 항체 농도를 10 ㎎/mL 로 조정했다.
통상적 절차 C-2: 항체를 위한 완충제 교환
Sephadex G-25 담체를 사용하여 NAP-25 칼럼 (Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation) 을 제조사에 의해 정의된 방법에 따라 소듐 클로라이드 (50 mM) 및 EDTA (2 mM) 를 함유하는 포스페이트 완충제 (50 mM, pH 6.5; 이것은 명세서에서 PBS6.5/EDTA 로서 언급됨) 로 평형시켰다. 항체의 수성 용액을 단일 NAP-25 칼럼에 2.5 mL 의 양으로 적용하고, 그 후 3.5 mL 의 PBS6.5/EDTA 로 용출된 분획 (3.5 mL) 을 수집했다. 생성된 분획을 통상적 절차 A 에 의해 농축하였다. 통상적 절차 B 를 사용하여 항체 농도를 측정한 후에, PBS6.5/EDTA 를 사용하여 항체 농도를 20 ㎎/mL 로 조정했다.
통상적 절차 D: 항체-약물 접합체의 정제
NAP-25 컬럼을 시판되는 포스페이트 완충제 (PBS7.4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen), 염화나트륨 (137 mM) 을 함유하는 인산나트륨 완충제 (10 mM, pH 6.0; PBS6.0 으로 지칭됨), 및 소르비톨 (5%) 을 함유하는 아세테이트 완충제 (10 mM, pH 5.5; 이것은 명세서에서 ABS 로서 언급됨) 로부터 선택된 임의의 완충제로 평형시켰다. 항체-약물 접합체 반응의 수성 용액을 약 1.5 mL 의 양으로 NAP-25 컬럼에 적용한 후, 제조자에 의해 정의된 양의 완충제로 용출시켜 항체 분획을 수집하였다. 수집된 분획을 다시 NAP-25 컬럼에 적용하고, 완충제로 용출하는 겔 여과 정제 공정을 총 2 내지 3 회 반복하여, 비-접합 약물 링커 및 저분자량 화합물 (트리스(2-카르복시에틸)포스핀 히드로클로라이드 (TCEP), N-아세틸-L-시스테인 (NAC), 및 디메틸 설폭사이드) 을 제외한 항체-약물 접합체를 수득하였다.
통상적 절차 E: 항체-약물 접합체 중 항체 농도 및 항체 분자 (1) 당 접합된 약물 분자의 평균수의 측정.
두 개의 파장 280 nm 및 370 nm 에서 항체-약물 접합체의 수성 용액의 UV 흡광도를 측정하고, 이어서 아래 제시된 계산을 수행함으로써 항체-약물 접합체 중 접합된 약물 농도를 계산할 수 있다.
임의의 파장에서 전체 흡광도는 시스템에 존재하는 모든 흡광 화학종의 흡광도 합 (흡광도의 부가도) 과 같기 때문에, 항체와 약물 간의 접합 전후에 항체와 약물의 몰 흡수 계수가 동일하게 유지되는 경우, 항체-약물 접합체 내의 항체 농도 및 약물 농도는 하기 식으로 표현된다.
상기에서, A280 는 280 nm 에서의 항체-약물 접합체의 수성 용액의 흡광도를 나타내고, A370 는 370 nm 에서의 항체-약물 접합체의 수성 용액의 흡광도를 나타내고, AA,280 는 280 nm 에서의 항체의 흡광도를 나타내고, AA,370 는 370 nm 에서의 항체의 흡광도를 나타내고, AD,280 는 280 nm 에서의 접합체 전구체의 흡광도를 나타내고, AD,370 는 370 nm 에서의 접합체 전구체의 흡광도를 나타내고, εA,280 는 280 nm 에서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εA,370 는 370 nm 에서의 항체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,280 는 280 nm 에서의 접합체 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, εD,370 는 370 nm 에서의 접합체 전구체의 몰 흡광 계수를 나타내고, CA 는 항체-약물 접합체 중 항체 농도를 나타내고, CD 는 항체-약물 접합체 중 약물 농도를 나타낸다.
상기에서 εA,280, εA,370, εD,280, 및 εD,370 에 관하여, 미리 준비된 값 (계산에 기초하여 추정된 값 또는 화합물의 UV 측정에 의해 수득된 측정 값) 을 사용한다. 예를 들어, εA,280 은 알려진 계산 방법을 사용하여 항체의 아미노산 서열로부터 추정될 수 있다 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423). εA,370 은 일반적으로 0 이다. εD,280 및 εD,370 은 사용된 접합체 전구체가 특정 몰 농도로 용해되어 있는 용액의 흡광도를 측정함으로써 람베르트-비어 법칙 (흡광도 = 몰 농도 × 몰 흡광 계수 × 세포 경로 길이) 에 근거해서 수득될 수 있다. 항체-약물 접합체의 수용액의 A280 및 A370 을 측정하고, 상기 값을 이용하여 연립 방정식 (I) 및 (II) 를 구함으로써, CA 및 CD 를 얻을 수 있다. 나아가, CD 를 CA 로 나누어서, 항체 당 접합된 약물의 평균수를 수득할 수 있다.
통상적 절차 F: 항체-약물 접합체 중 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수의 측정 - (2).
항체-약물 접합체 중 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수를 또한 앞서 언급된 통상적 절차 E 에 더하여 하기 방법을 사용하여 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 분석에 의해 확인할 수 있다.
[F-1. HPLC 분석을 위한 샘플의 제조 (항체-약물 접합체의 환원)]
항체-약물 접합체 용액 (대략 1 ㎎/mL, 60 μL) 을 수성 디티오트레이톨 (DTT) 용액 (100 mM, 15 μL) 과 혼합한다. 혼합물을 37℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션하고, 항체-약물 접합체의 L 사슬과 H 사슬 사이의 다이설파이드 결합을 절단한다. 결과로 생긴 샘플을 HPLC 분석에서 사용한다.
[F-2. HPLC 분석]
HPLC 분석을 하기 측정 조건 하에 수행한다:
HPLC 시스템: Agilent 1290 HPLC 시스템 (Agilent Technologies, Inc.)
검출기: UV 흡광 분광계 (측정 파장: 280 nm)
컬럼: PLRP-S (2.1 × 50 ㎜, 8 μm, 1000 Å; Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)
컬럼 온도: 80℃
이동상 A: 0.04% 수성 트리플루오로아세트산 (TFA) 용액
이동상 B: 0.04% TFA 을 함유하는 아세토니트릴 용액
구배 프로그램: 29%-36% (0 min-12.5 min), 36%-42% (12.5-15 min), 42%-29% (15 min-15.1 min), 29%-29% (15.1 min-25 min)
샘플 주입 부피: 15 mL
[F-3. 데이터 분석]
[F-3-1] 비접합 항체의 L 사슬 (L0) 및 H 사슬 (H0) 에 비하여, 약물이 접합된 L 사슬 (하나의 약물 분자와 연결된 L 사슬: L1) 및 H 사슬 (하나의 약물 분자와 연결된 H 사슬: H1, 2 개의 약물 분자와 연결된 H 사슬: H2, 3 개의 약물 분자와 연결된 H 사슬: H3) 는 접합된 약물 분자의 수에 비례하여 더 높은 소수성을 나타내어 더 큰 체류 시간을 갖는다. 이들 사슬은 그러므로 L0 및 L1 또는 H0, H1, H2, 및 H3 의 순서로 용출된다. 검출 피크는 L0 및 H0 와의 체류 시간의 비교에 의해 L0, L1, H0, H1, H2, 및 H3 중 임의의 것에 배정될 수 있다.
[F-3-2] 약물 링커는 UV 를 흡수하므로, 피크 면적 값은 L 사슬, H 사슬, 및 약물 링커의 몰 흡광 계수를 사용하여 하기 수식에 따라 접합된 약물 링커 분자의 수에 대응하여 보정된다.
[수식 1]
[수식 2]
이때, 각 항체의 L 사슬 또는 H 사슬의 몰 흡광 계수 (280nm) 에 있어서, 각 항체의 L 사슬 또는 H 사슬의 아미노산 서열로부터 공지의 계산법 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423) 에 의해 추정된 값을 사용할 수 있다. hTINA 의 경우, 아미노산 서열에 따라, 각각 L 사슬 및 H 사슬에 대해 몰 소멸 계수 34690 및 몰 소멸 계수 95000 을 추정 값으로서 사용하였다. 약물 링커의 몰 소멸 계수 (280 nm) 에 있어서, 각 약물 링커와 메르캅토에탄올 또는 N-아세틸시스테인의 반응에 의해 말레이미드 기가 석신이미드 티오에테르로 전환된 화합물의 측정된 몰 소멸 계수 (280 nm) 를 사용하였다.
[F-3-3] 각각의 사슬의 피크 면적 비 (%) 는 하기 수식에 따라 피크 면적의 보정된 값의 전체에 대해 계산된다.
[수식 3]
[F-3-4] 항체-약물 접합체 중 항체 분자 당 접합된 약물 분자의 평균수는 하기 수식에 따라 계산된다.
접합된 약물 분자의 평균 수 = (L0 피크 면적 비율 × 0 + L0 피크 면적 비율 × 1 + H0 피크 면적 비율 × 0 + H1 피크 면적 비율 × 1 + H2 피크 면적 비율 × 2 + H3 피크 면적 비율 × 3) / 100 × 2.
제조 방법 1 에서 화학식 (2) 로 나타내지는 화합물은 하기 화학식으로 나타내지는 화합물이다:
(말레이미드-N-일)-(CH2)n3-C(=O)-L2-LP-NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2-C(=O)-(NH-DX)
화학식에서,
n3 은 2 내지 8 의 정수를 나타내고,
L2 는 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 또는 단일 결합을 나타내며, n4 는 1 내지 6 의 정수를 나타내고,
LP 는 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산, 및 아스파르트산으로부터 선택되는 2 내지 7 개의 아미노산으로 구성된 펩티드 잔기를 나타낸다
n1 은 0 내지 6 의 정수를 나타내고,
n2 은 0 내지 5 의 정수를 나타내고,
La 는 -O- 또는 단일 결합을 나타내고,
(말레이미드-N-일)- 은 하기 화학식으로 나타내지는 말레이미딜 기 (2,5-디옥소-2,5-디히드로-1H-피롤-1-일 기) 이다.
[화학식 8]
식 중, 질소 원자는 연결 위치이고,
-(NH-DX) 은 하기 화학식으로 나타내지는 기이다:
[화학식 9]
식 중, 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 연결 위치이다.
L2 가 단일 결합 또는 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 인 경우, n4 가 2 내지 4 의 정수인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다.
LP 의 펩티드 잔기로서, 페닐알라닌, 글리신, 발린, 리신, 시트룰린, 세린, 글루탐산, 및 아스파르트산으로부터 선택된 아미노산을 포함하는 펩티드 잔기를 갖는 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. 이들 펩티드 잔기 중, LP 가 4 개의 아미노산으로 이루어진 펩티드 잔기인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. 더욱 구체적으로, LP 가 -GGFG- 의 테트라펩티드 잔기인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다.
또한, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 의 경우, -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 를 갖는 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. -NHCH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2 를 갖는 화합물이 보다 바람직하다.
또한, 상기 화학식 (2) 로 표시되는 화합물에서, n3 이 2 내지 5 의 정수이고, L2 가 단일 결합이며, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가 -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가 -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2 인 화합물이 더욱 바람직하다. n3 이 2 또는 5 의 정수인 화합물이 추가로 바람직하다.
또한, 화학식 (2) 로 나타내지는 화합물에서, n3 이 2 내지 5 의 정수이고, L2 가 -NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)- 이며, n4 가 2 내지 4 의 정수이고, -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가 -NH-CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2CH2CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 제조 중간체로서 바람직하다. n4 가 2 또는 4 의 정수인 화합물이 더욱 바람직하다. -NH-(CH2)n1-La-(CH2)n2- 가 -NH-CH2CH2CH2-, -NH-CH2-O-CH2-, 또는 -NH-CH2CH2-O-CH2- 인 화합물이 추가로 바람직하다.
본 발명의 화합물의 제조에 유용한 이러한 바람직한 중간체로서, 하기를 예시할 수 있다.
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 제조 중간체 화합물의 상기 그룹으로부터 선택된 약물-링커 화합물을 항-TROP2 항체 또는 이의 반응성 유도체와 반응시키고 항-TROP2 항체 내에 존재하는 다이설파이드 결합 부위에 티오에테르 결합을 형성하여 제조할 수 있다. 이 경우, 항-TROP2 항체의 반응성 유도체를 사용하는 것이 바람직하다. 특히, 항-TROP2 항체를 환원시켜 수득되는 반응성 유도체가 바람직하다.
다음은 제조 중간체로서 보다 바람직한 화합물이다.
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX).
상기 중간체 화합물 그룹 중, 하기 화학식으로 나타내지는 화합물:
(말레이미드-N-일)-CH2CH2-C(=O)-NH-CH2CH2-O-CH2CH2-O-CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2CH2-C(=O)-(NH-DX),
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX), 또는
(말레이미드-N-일)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX) 가 추가로 바람직한 화합물이다.
접합체의 양을 확보하기 위하여, 동등한 수의 약물 (예를 들어, 약± 1) 을 갖도록 유사한 생산 조건 하에서 수득된 복수의 접합체를 혼합하여 새로운 로트를 제조할 수 있다. 이 경우에, 약물의 평균수는 혼합 전에 접합체 내의 약물의 평균수 사이에 속한다.
제조 방법 2
이전의 제조 방법에서 사용된 중간체로서의 화학식 (2) 로 나타내지는 화합물 및 이의 약리학적으로 허용가능한 염은 예를 들어, 하기 방법에 의해 제조될 수 있다.
[화학식 10]
화학식에서, L1' 은 말레이미딜 기를 나타내고, P1, P2 및 P3 는 각각 보호기를 나타낸다.
화합물 (6) 은 카르복실산 (5) 를 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고 이를 염기의 존재 하에 NH2-DX (4) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. NH2-DX (4) 는 엑사테칸 (화학명: (1S,9S)-1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[de]피라노[3',4':6,7]인돌리지노[1,2-b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온) 을 나타낸다.
펩티드 합성에 통상적으로 사용되는 반응 시약 및 조건이 반응을 위해 사용될 수 있다. 다양한 종류의 활성 에스테르가 있다. 예를 들어, N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드와 같은 축합제를 사용하여 p-니트로페놀, N-히드록시 벤조트리아졸, N-히드록시 석신이미드 등과 같은 페놀을 카르복실산 (5) 과 반응시켜 제조할 수 있다. 또한, 활성 에스테르는 카르복실산 (5) 과 펜타플루오로페닐 트리플루오로아세테이트 등의 반응; 카르복실산 (5) 과 1-벤조트리아졸릴 옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스파이트의 반응; 카르복실산 (5) 과 디에틸 시아노포스포네이트의 반응 (염착법); 카르복실산 (5) 과 트리페닐포스핀 및 2,2'-디피리딜 다이설파이드의 반응 (무카이야마법); 카르복실산 (5) 과 4-(4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진-2-일)-4-메틸모르폴리늄 클로라이드 (DMTMM) 와 같은 트리아진 유도체의 반응 등에 의해 생성될 수도 있다. 또한, 반응은 예를 들어, 산 할라이드 방법에 의해 수행될 수 있으며, 이에 의해 카르복실산 (5) 은 염기의 존재 하에 산 할라이드, 예컨대, 티오닐 클로라이드 및 옥살릴 클로라이드로 처리된다.
상기와 같이 수득된 카르복실산 (5) 의 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 또는 산 할라이드를 -78℃ 내지 150℃ 의 반응 온도에서 불활성 용매 중의 적합한 염기의 존재 하에 화합물 (4) 와 반응시킴으로써, 화합물 (6) 을 제조할 수 있다. 한편, "불활성 용매" 는 용매가 사용되는 표적 반응을 저해하지 않는 용매를 의미한다.
상기 기재된 각 단계에 사용되는 염기의 구체적인 예는 탄산나트륨, 탄산칼륨, 에톡시화나트륨, 부톡시화칼륨, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수소화나트륨 및 수소화칼륨을 포함하는 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속의 탄산염, 알콕시드, 수산화물 또는 수소화물, n-부틸 리튬을 포함하는 알킬 리튬으로 나타내지는 유기금속 염기, 리튬 디이소프로필아미드를 포함하는 디알킬아미노 리튬; 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드를 포함하는 비스실릴아민의 유기금속 염기; 및 피리딘, 2,6-루티딘, 콜리딘, 4-디메틸아미노피리딘, 트리에틸아민, N-메틸모르폴린, 디이소프로필에틸아민 및 디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔 (DBU) 과 같은 3 급 아민 또는 질소-함유 헤테로시클릭 화합물을 포함하는 유기 염기를 포함할 수 있다.
본 발명의 반응에 사용되는 불활성 용매의 예는, 디클로로메탄, 클로로포름, 및 사염화탄소와 같은 할로겐화 탄화수소 용매; 테트라히드로퓨란, 1,2-디메톡시에탄, 및 디옥산과 같은 에테르 용매; 벤젠 및 톨루엔과 같은 방향족 탄화수소 용매; 및 N,N-디메틸포름아미드, N,N-디메틸아세트아미드, 및 N-메틸피롤리딘-2-온과 같은 아미드 용매를 포함한다. 이들 외에도, 디메틸 설폭사이드 및 설포란 등의 설폭사이드 용매; 아세톤 및 메틸 에틸 케톤 등의 케톤 용매; 및 메탄올 및 에탄올 등의 알코올 용매 등을 일부 경우에서 사용할 수 있다. 또한, 이들 용매는 혼합되어 사용될 수 있다.
화합물 (6) 의 말단 아미노기에 대한 보호기 P1 로서, 일반적으로 펩티드 합성에 사용되는 아미노기에 대한 보호기, 예를 들어 tert-부틸옥시 카르보닐기, 9-플루오레닐메틸옥시 카르보닐기, 및 벤질옥시 카르보닐기를 사용할 수 있다.
아미노기에 대한 다른 보호기의 예는 아세틸기와 같은 알카노일기; 메톡시카르보닐기 및 에톡시카르보닐기와 같은 알콕시카르보닐기; 파라메톡시벤질옥시 카르보닐기, 및 파라 (또는 오르토)니트로벤질옥시 카르보닐기와 같은 아릴메톡시 카르보닐기; 벤질기 및 트리페닐 메틸기와 같은 아릴메틸기; 벤조일기와 같은 아로일기; 및 2,4-디니트로벤젠 술포닐기 및 오르토니트로벤젠 술포닐기와 같은 아릴 술포닐기를 포함할 수 있다. 보호기 P1 은 예를 들어, 보호하고자 하는 아미노기를 갖는 화합물의 특성에 따라 선택될 수 있다.
수득된 화합물 (6) 의 말단 아미노기에 대한 보호기 P1 을 탈보호하여, 화합물 (7) 을 제조할 수 있다. 이러한 탈보호를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
화합물 (9) 는 P2 로 보호된 N 말단을 갖는 펩티드 카르복실산 (8) 을 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물 등으로 유도체화하고, 이를 수득된 화합물 (7) 과 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 펩티드 카르복실산 (8) 과 화합물 (7) 사이에 펩티드 결합을 형성하는데 사용되는 반응 조건, 시약, 염기, 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택되고 사용될 수 있다. 보호기 P2 는 화합물 (6) 의 보호기에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택되고 사용될 수 있고, 선택은 예를 들어, 보호될 아미노기를 갖는 화합물의 특성에 기초하여 이루어질 수 있다. 펩티드 합성에 일반적으로 사용되는 바와 같이, 연신을 위해 펩티드 카르복실산 (8) 을 구성하는 아미노산 또는 펩티드를 순차적으로 반응 및 탈보호시켜 화합물 (9) 을 제조할 수도 있다.
수득된 화합물 (9) 의 아미노기에 대한 보호기 P2 을 탈보호하여, 화합물 (10) 을 제조할 수 있다. 이러한 탈보호를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
카르복실산 (11) 을 활성 에스테르, 혼합 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고, 얻어진 화합물 (10) 과 반응시킴으로써 화합물 (2) 을 제조할 수 있다. 카르복실산 (11) 과 화합물 (10) 사이에 펩티드 결합을 형성하는데 사용되는 반응 조건, 시약, 염기, 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택되고 사용될 수 있다.
화합물 (9) 는 또한, 예를 들어, 하기 방법에 의해 제조될 수 있다.
화합물 (13) 는 P2 로 보호된 N 말단을 갖는 펩티드 카르복실산 (8) 을 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물 등으로 유도체화하고, 이를 P3 로 보호된 카르복시 기를 갖는 아민 화합물 (12) 과 염기의 존재 하에 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 펩티드 카르복실산 (8) 과 화합물 (12) 사이에 펩티드 결합을 형성하는데 사용되는 반응 조건, 시약, 염기, 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택되고 사용될 수 있다.
화합물 (13) 의 아미노기에 대한 보호기 P2 는 통상적으로 사용되는 보호기로 보호될 수 있다.
구체적으로, 히드록실기의 보호기의 예는 메톡시메틸기 등의 알콕시메틸기; 벤질기, 4-메톡시벤질기, 트리페닐메틸기 등의 아릴메틸기; 아세틸기 등의 알카노일기; 벤조일기 등의 아로일기; 및 tert-부틸 디페닐실릴기 등의 실릴기를 포함한다. 카르복시기는, 예를 들어, 메틸기, 에틸기, 및 tert-부틸기와 같은 알킬기, 알릴기, 또는 벤질기와 같은 아릴메틸기를 갖는 에스테르로서 보호될 수 있다. 아미노기에 대한 보호기의 예는, 예를 들어 tert-부틸옥시 카르보닐기, 메톡시카르보닐기, 및 에톡시카르보닐기와 같은 알킬옥시 카르보닐기; 9-플루오레닐메틸옥시 카르보닐기, 벤질옥시 카르보닐기, 파라메톡시벤질옥시 카르보닐기, 및 파라 (또는 오르토)니트로벤질옥시 카르보닐기와 같은 알릴옥시카르보닐기, 또는 아릴메톡시 카르보닐기; 아세틸기와 같은 알카노일기; 벤질기 및 트리페닐 메틸기와 같은 아릴메틸기; 벤조일기와 같은 아로일기; 및 2,4-디니트로벤젠 술포닐기 또는 오르토니트로벤젠 술포닐기와 같은 아릴 술포닐기를 포함한다.
카르복시기의 보호기 P3 는 유기 합성 화학, 특히 펩티드 합성에서 카르복시기의 보호기로 통상적으로 사용되는 보호기를 사용할 수 있다. 구체적인 예로는 메틸기, 에틸기, 또는 tert-부틸과 같은 알킬기를 갖는 에스테르, 알릴 에스테르, 및 벤질 에스테르가 포함되며, 보호기는 상기 기재된 보호기로부터 적합하게 선택될 수 있다. 이러한 경우, 아미노기에 대한 보호기 및 카복시기에 대한 보호기는 바람직하게는 상이한 방법 또는 상이한 조건에 의해 제거될 수 있는 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표적인 예는 P2 가 tert-부틸옥시 카르보닐기이고 P3 가 벤질기인 조합을 포함한다. 보호기는, 예를 들어, 보호되는 아미노기 및 카르복시기를 갖는 화합물의 특성에 따라 상기 언급된 것들로부터 선택될 수 있다. 보호기의 제거를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
수득된 화합물 (13) 의 카르복시기에 대한 보호기 P3 을 탈보호하여, 화합물 (14) 을 제조할 수 있다. 이러한 탈보호를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택된다.
화합물 (9) 은 수득된 화합물 (14) 를 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고 염기의 존재 하에 화합물 (4) 와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 반응을 위해, 펩티드 합성에 일반적으로 사용되는 반응 시약 및 조건이 또한 사용될 수 있고, 반응에 사용되는 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택될 수 있다.
화합물 (2) 는 또한, 예를 들어, 하기 방법에 의해 제조될 수 있다.
화합물 (13) 의 아미노기에 대한 보호기 P2 을 탈보호하여, 화합물 (15) 을 제조할 수 있다. 이러한 탈보호를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택될 수 있다.
화합물 (16) 은 카르복실산 유도체 (11) 를 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고 이를 염기의 존재 하에 수득된 화합물 (15) 와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 펩티드 카르복실산 (11) 과 화합물 (15) 사이에 아미드 결합을 형성하는데 사용되는 반응 조건, 시약, 염기, 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택될 수 있다.
수득된 화합물 (16) 의 카르복시기에 대한 보호기를 탈보호하여, 화합물 (17) 을 제조할 수 있다. 이러한 탈보호는 화합물 (14) 를 제조하기 위한 카르복시기에서의 탈보호와 유사하게 수행될 수 있다.
화합물 (2) 은 화합물 (17) 를 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고 염기의 존재 하에 화합물 (4) 와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 반응을 위해, 펩티드 합성에 일반적으로 사용되는 반응 시약 및 조건이 또한 사용될 수 있고, 반응에 사용되는 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택될 수 있다.
제조 방법 3
중간체의 화학식 (2) 로 나타내지는 화합물은 또한 하기 방법에 의해 제조될 수 있다.
[화학식 11]
화학식에서, L1' 은 말단이 말레이미딜기로 전환된 구조를 갖는 L1 에 해당하고, P4 는 보호기를 나타낸다.
화합물 (19) 는 화합물 (11) 을 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물 등으로 유도체화하고, 이를 P4 로 보호된 C 말단을 갖는 펩티드 카르복실산 (18) 과 염기의 존재 하에 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 펩티드 카르복실산 (18) 과 화합물 (11) 사이에 펩티드 결합을 형성하는데 사용되는 반응 조건, 시약, 염기, 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택될 수 있다. 화합물 (18) 의 카르복시기에 대한 보호기 P4 는 상기 기재된 보호기로부터 적합하게 선택될 수 있다.
수득된 화합물 (19) 의 카르복시기에 대한 보호기를 탈보호하여, 화합물 (20) 을 제조할 수 있다. 이러한 탈보호는 화합물 (14) 를 제조하기 위한 카르복시기의 탈보호와 유사하게 수행될 수 있다.
화합물 (2) 은 수득된 화합물 (20) 를 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물 등으로 유도체화하고 화합물 (7) 와 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 반응을 위해, 펩티드 합성에 일반적으로 사용되는 반응 시약 및 조건이 또한 사용될 수 있고, 반응에 사용되는 반응 조건, 시약, 염기 및 불활성 용매는 화합물 (6) 의 합성에 대해 기재된 것들로부터 적합하게 선택될 수 있다.
제조 방법 4
이하 본원에서, 제조 방법 2 에 기재된 제조 중간체 (10) 에서 n1 = 1, La = O 을 갖는 화합물 (10b) 을 제조하는 방법을 상세히 설명한다. 화학식 (10b) 로 나타내지는 화합물, 이의 염 또는 용매화물은 예를 들어, 다음과 같은 방법에 따라 제조될 수 있다.
[화학식 12]
화학식에서, LP 는 상기에서 정의한 바와 같고, L 은 아세틸기와 같은 알카노일기 또는 벤조일기과 같은 합금기, 수소 원자 등인 아실기이고, X 및 Y 는 각각 1 내지 3 개의 아미노산으로 이루어진 올리고펩티드를 나타내고, P5 및 P7 은 각각 아미노기에 대한 보호기를 나타내고, P6 은 카르복시기에 대한 보호기를 나타낸다.
화학식 (21) 로 나타내지는 화합물은 일본 특허 공개 제2002-60351호 또는 문헌 (J. Org. Chem., Vol. 51, page 3196, 1986) 에 기재된 방법을 사용하거나 적용함으로써, 그리고 필요에 따라 보호기의 제거 또는 작용기의 변형을 수행함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, 이것은 보호된 말단 아미노기를 갖는 아미노산 또는 보호된 아미노기를 갖는 올리고펩티드의 산 아미드를 알데히드 또는 케톤으로 처리함으로써 또한 수득될 수 있다.
화합물 (21) 과 히드록실기를 갖는 화합물 (22) 을, 불활성 용매 중에서, 산 또는 염기의 존재 하에, 실온까지 냉각하는 온도 조건에서 반응시켜, 화합물 (23) 을 제조할 수 있다.
여기서 사용될 수 있는 산의 예로는 불산, 염화수소, 황산, 질산, 인산 및 붕산과 같은 무기산; 아세트산, 시트르산, 파라톨루엔 술폰산 및 메탄술폰산과 같은 유기산; 및 테트라플루오로보레이트, 염화아연, 염화주석, 염화알루미늄 및 염화철과 같은 루이스산을 포함할 수 있다. 그 중에서도 술폰산, 특히 파라톨루엔 술폰산이 바람직하다. 염기에 대해서는, 전술한 염기 중 어느 하나를 적절히 선택하고 사용할 수 있다. 이의 바람직한 예는 알칼리 금속 알콕사이드, 예컨대 칼륨 tert-부톡사이드; 알칼리 금속 히드록사이드, 예컨대 소듐 히드록사이드 및 포타슘 히드록사이드; 알칼리 금속 히드라이드, 예컨대 소듐 히드라이드 및 포타슘 히드라이드; 디알킬아미노 리튬으로 나타내지는 유기금속 염기, 예컨대 리튬 디이소프로필아미드; 및 비스실릴아민의 유기금속 염기, 예컨대 리튬 비스(트리메틸실릴)아미드를 포함한다. 반응에 사용되는 용매의 예로는 테트라히드로퓨란 및 1,4-디옥산과 같은 에테르 용매; 및 벤젠 및 톨루엔과 같은 방향족 탄화수소 용매를 포함한다. 이들 용매는 물과의 혼합물로서 제조될 수 있다. 또한, P5 에 예시된 아미노기에 대한 보호기는 아미노기를 보호하는데 통상적으로 사용되는 그룹이라면 특별히 제한되지 않는다. 대표적인 예는 제조 방법 2 에 기재된 아미노기에 대한 보호기를 포함한다. 그러나, 본 반응에서는, P5 로 예시한 아미노기에 대한 보호기가 절단되는 경우가 있을 수 있다. 이러한 경우, 다시 보호기를 도입하는 것이 필요할 수 있으므로 아미노기를 보호하기 위한 적절한 시약을 사용하여 반응시킬 필요가 있다.
화합물 (24) 은 화합물 (23) 의 보호기 P6 을 제거하여 제조할 수 있다. 여기서, P6 에 의해 예시되는 카르복시기의 보호기의 대표적인 예는 제조 방법 2 에 기재되어 있으며, 이들 중에서 적절한 것을 선택할 수 있다. 화합물 (23) 에서, 아미노기에 대한 보호기 P5 및 카복시기에 대한 보호기 P6 은 상이한 방법 또는 상이한 조건에 의해 제거될 수 있는 보호기인 것이 바람직하다. 예를 들어, 대표적인 예는 P5 가 9-플루오레닐메틸옥시 카르보닐기이고 P6 가 벤질기인 조합을 포함한다. 보호기는 예를 들어, 보호되는 아미노기 및 카르복시기를 갖는 화합물의 특성에 따라 선택될 수 있다. 보호기의 제거를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택된다.
화합물 (26) 은 카르복실산 (24) 를 활성 에스테르, 혼합된 산 무수물, 산 할라이드 등으로 유도체화하고 이를 화합물 (4) 또는 이의 약리학적으로 허용가능한 염과 반응시킨 후 수득된 화합물 (25) 의 보호기 P5 를 제거함으로써 제조될 수 있다. 화합물 (4) 와 카르복실산 (24) 사이의 반응 및 보호기 P6 를 제거하기 위한 반응의 경우, 제조 방법 2 에 기재된 바와 동일한 시약 및 반응 조건을 사용할 수 있다.
화합물 (10b) 은, 화합물 (26) 을, 말단 아미노기가 보호된 아미노산 또는 아미노기가 보호된 올리고펩티드 (27) 와 반응시켜 화합물 (9b) 를 제조하고, 수득된 화합물 (9b) 의 보호기 P7 을 제거함으로써 제조될 수 있다. 또한, P7 에 의해 나타내어진 아미노기에 대한 보호기는 아미노기를 보호하는데 통상적으로 사용된다면 특별히 제한되지 않는다. 이의 대표적인 예는 제조 방법 2 에 기재된 아미노기에 대한 보호기를 포함한다. 보호기의 제거를 위해, 시약 및 조건은 보호기에 따라 선택된다. 화합물 (26) 과 화합물 (27) 사이의 반응을 위해, 펩티드 합성에 통상적으로 사용되는 반응 시약 및 조건이 사용될 수 있다. 상기와 같은 방법으로 제조된 화합물 (10b) 은 전술한 방법에 따라 본 발명의 화합물 (1) 로 유도체화될 수 있다.
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는, 이것이 예를 들어, 정제를 위해 공기 중에 방치되거나 재결정화되는 경우, 수분을 흡수하여 흡착수를 가지거나 수화물이 될 수 있으며, 이러한 화합물 및 물을 포함하는 염도 본 발명에 포함된다.
다양한 방사성 또는 비-방사성 동위원소로 표지된 화합물이 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 항체-약물 접합체를 구성하는 하나 이상 원자는 원자 동위원소를 비자연적 비로 함유할 수 있다. 원자 동위원소의 예는 중수소 (2H), 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I), 및 탄소-14 (14C) 를 포함한다. 나아가, 본 발명의 화합물은 방사성 동위원소 예컨대 삼중수소 (3H), 요오드-125 (125I), 탄소-14 (14C), 구리-64 (64Cu), 지르코늄-89 (89Zr), 요오드-124 (124I), 불소-18 (18F), 인듐-111 (111I), 탄소-11 (11C) 및 요오드-131 (131I) 로 방사성-표지될 수 있다. 방사성 동위원소로 표지된 화합물은 치료제 또는 예방제, 연구용 시약 예컨대 어세이 시약 및 진단용 물질 예컨대 인 비보 (in vivo) 진단 이미징제로서 유용하다. 방사능과 관련되지 않고, 임의의 동위원소 변이체 유형의 본 발명의 항체-약물 접합체가 본 발명의 범위 내에 있다.
항체-약물 접합체 (ADC)
본 발명은 항-TROP2 항체와 토포이소머라아제 I 억제제 (DXd) 와 같은 항암 화합물을 포함하는 TROP2-표적화 항체-약물 접합체 (ADC) 를 제공한다. 도 1 을 참조한다. 일부 구현예에서, TROP2-표적화 ADC 는 하기 제시된 화학식 13 을 포함할 수 있다:
[화학식 13]
일부 구현예에서, ADC 의 중쇄는 다음을 포함할 수 있다:
일부 구현예에서, ADC 의 경쇄는 다음을 포함할 수 있다:
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 암 세포에 대항하여 세포독성 활성을 나타내므로, 약물, 특히 암의 치료제 및/또는 예방제로서 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 암을 치료하는 주된 방법인 화학요법을 위한 약물로 선택적으로 사용할 수 있어, 그 결과 암 세포의 발달을 지연시키고, 성장을 억제시키며, 암 세포를 더욱 사멸시킬 수 있다. 이는 암 환자가 암으로 인한 증상으로부터 자유롭거나 암 환자의 QOL 의 개선을 달성할 수 있으며, 암 환자의 생명을 유지함으로써 치료 효과를 얻을 수 있도록 한다. 본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 암 세포의 사멸을 달성하지 못하더라도, 암 세포의 성장을 억제 또는 통제함으로써 장기 생존을 달성하면서 암 환자의 QOL 을 높일 수 있다.
이러한 약물 치료에서는, 약물 단독 및 보조 요법에서의 추가 요법과 병용하여 약물로도 사용될 수 있으며, 외과 수술, 방사선요법, 호르몬 요법 등과도 병용될 수 있다. 또한, 신보조 요법에서 약물 요법에 대한 약물로서 사용될 수도 있다.
상기 치료적 용도 이외에도, 항원에 대한 항체의 결합 특성에 의해 미세한 전이성 암 세포의 성장을 억제하고, 이들 암 세포에 결합하여 이들을 더 죽이는 효과도 기대할 수 있다. 특히, 1 차 암 세포에서 TROP2 의 발현을 확인할 경우, 본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체를 투여함으로써 암 전이 억제 또는 예방 효과를 기대할 수 있다. 예를 들어, 전이 과정에서 체액에서 암 세포를 억제 및 사멸하는 효과 또는 예를 들어, 임의의 조직에 이식된 직후 미세 암 세포를 억제 및 사멸하는 효과를 기대할 수 있다. 또한, 특히 암의 수술적 제거 후에도, 암 전이의 억제 또는 예방 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 암 전이를 억제하는 효과를 기대할 수 있다.
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 환자에게 전신 요법으로 투여하고, 추가로 암 조직에 국소 투여하여 치료 효과를 발휘하기를 기대할 수 있다.
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체가 적용되는 암 유형의 예는 폐암, 신장암, 요로상피암, 대장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 또는 식도암을 포함하나, 치료 대상으로서 암 세포에서 항체-약물 접합체 내의 항체가 인지할 수 있는 단백질을 발현하는 암 세포이면 제한되지 않는다.
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 바람직하게는 포유동물에게 투여될 수 있으나, 더욱 바람직하게는 인간에게 투여된다.
약학 조성물 및 투여 방식
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체를 포함하는 약학 조성물에 사용되는 물질은 투여량 또는 투여 농도 측면에서 당업계에서 일반적으로 사용되는 제형 첨가제 등으로부터 적절하게 선택되고 적용될 수 있다.
본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 적어도 하나의 약학적으로 적합한 성분을 포함하는 약학 조성물로서 투여될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 전형적으로 적어도 하나의 약학 담체 (예를 들어, 멸균된 액체) 를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 액체는 예를 들어, 물 및 오일 (석유 및 동물 기원, 식물 기원 또는 합성 기원의 오일) 을 포함한다. 오일은 예를 들어, 땅콩유, 대두유, 광물유 또는 참기름일 수 있다. 물은 약학 조성물이 정맥 내로 투여될 때 좀더 전형적인 담체이다. 염류 용액, 수성 덱스트로스 용액, 및 수성 글리세롤 용액이 또한 액체 담체로서, 특히 주사용 용액을 위해 이용될 수 있다. 적합한 약학 비히클은 당업계에 공지되어 있다. 원하는 경우, 상기 조성물은 또한 미량의 보습제, 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수 있다. 적합한 약학적 담체의 예는 "Remington's Pharmaceutical Sciences" (저자 E. W. Martin) 에 기재되어 있다. 제형은 투여 방식에 상응한다.
다양한 투여 형태에 대한 약리학적으로 허용가능한 담체는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 고체 제제를 위한 부형제, 윤활제, 결합제 및 붕해제가 공지되어 있고; 액체 제제를 위한 용매, 가용화제, 현탁화제, 등장화제, 완충제 및 진정제가 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 추가의 성분, 예컨대 하나 이상의 방부제, 항산화제, 안정화제 등을 포함한다.
부가적으로, 기재된 약학 조성물은 용액, 마이크로에멀전, 리포좀, 또는 높은 약물 농도에 적합한 다른 규칙적 구조로서 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜, 등), 및 이의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들어, 코팅, 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우 필요한 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 일부 구현예에서, 등장화제, 예를 들어 당, 다가 알코올 예컨대 만니톨, 소르비톨, 또는 소듐 클로라이드를 조성물 중에 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 조성물의 연장된 흡수는, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수를 지연시키는 작용제를 조성물에 포함시킴으로써 초래될 수 있다.
멸균된 주사가능 용액은 적절한 용매 중 필요량으로 활성 화합물을, 필요에 따라, 상기 열거한 성분 중 하나 또는 조합과 혼입한 후 멸균 마이크로여과함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본적 분산 매질 및 상기 열거한 것들로부터의 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로 활성 화합물을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능 용액 제조용 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 이전에 멸균-여과된 이의 용액으로부터 임의 추가적인 원하는 성분 + 활성 성분의 분말을 산출시키는 냉동-건조 (동결건조) 및 진공 건조이다.
다양한 전달 시스템이 알려져 있으며, 이들은 본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체의 투여에 사용될 수 있다. 투여 경로의 예로는 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 및 피하 경로 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여는 예를 들어 주사 또는 볼루스 주사에 의해 이루어질 수 있다. 특정한 바람직한 구현예에 따르면, 항체-약물 접합체의 투여는 주사에 의해 수행된다. 비경구 투여는 바람직한 투여 경로이다.
대표적인 구현예에 따르면, 약학 조성물은 인체에 정맥내 투여에 적합한 약학 조성물로서, 통상적인 절차에 따라 처방된다. 정맥내 투여를 위한 조성물은 전형적으로 멸균 및 등장성 수성 완충제 중 용액이다. 필요한 경우, 약물은 주사 부위에서 통증을 완화시키기 위해 가용화제 및 국소 마취제 (예를 들어, 리그노카인) 를 함유할 수 있다. 일반적으로, 상기 성분은 활성제의 양을 갖는 앰플 또는 사켓에 밀봉하여 얻어지는 용기에 담긴 동결건조된 분말 또는 무수 농축물 중 어느 하나로서 또는 단위 투여 형태의 혼합물로서 개별적으로 제공된다. 약물이 주사에 의한 투여 형태인 경우, 이것은 멸균 약학 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주사병으로부터 투여될 수 있다. 약물을 주사에 의해 투여한 경우, 투여하기 전에 전술한 성분들을 서로 혼합하도록 멸균수 또는 주사용 염수의 앰플을 제공할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 출원의 항-TROP2 항체-약물 접합체만을 포함하는 약학 조성물 또는 항-TROP2 항체-약물 접합체와 상기 결합체 이외의 적어도 하나의 암 치료제를 포함하는 약학 조성물일 수 있다. 본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 다른 암 치료제와 동시에 또는 연속으로 투여될 수 있다. 따라서 항암 효과가 향상될 수 있다. 이러한 목적으로 사용되는 또다른 항암제는 항체-약물 접합체와 동시에, 별도로, 또는 이후에 개체에 투여될 수 있으며, 이것은 각각에 대한 투여 간격을 달리하여 투여될 수 있다. 암 치료제의 예는 아브락산, 파클리탁셀, 시스플라틴, 겜시타빈, 이리노테칸 (CPT-11), 파클리탁셀, 페메트렉세드, 소라페닙, 비노렐빈, 국제 공개 번호 WO 2003/038043 호에 기재된 약물, LH-RH 유사체 (류프로렐린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴 포스페이트, 에스트로겐 길항제 (타목시펜, 랄록시펜 등), 및 아로마타제 억제제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 등) 를 포함하나, 항종양 활성을 갖는 약물이면 제한되지 않는다.
약학 조성물은 원하는 조성과 요구되는 순도를 갖는 제형으로서 동결건조 제형 또는 액체 제형으로 제형화될 수 있다. 동결건조 제형으로서 제형화될 때, 이것은 당해 분야에서 사용되는 적합한 제형 첨가제를 함유하는 제형일 수 있다. 또한 액체 제형의 경우, 이것은 당해 분야에서 사용되는 다양한 제형 첨가제를 함유하는 액체 제형으로서 제형화될 수 있다.
약학 조성물의 조성 및 농도는 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 항-TROP2 항체-약물 접합체는 항원에 대한 높은 친화도, 즉, 항원에 대한 해리 상수 (즉, Kd 값) 에 있어서 높은 친화도 (= 낮은 Kd 값) 를 가질 경우, 적은 투여량으로도 약학적 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 항체-약물 접합체의 투여량을 결정하기 위해, 투여량은 항체-약물 접합체와 항원 사이의 친화성과 관련된 상황을 고려하여 결정될 수 있다. 본 발명의 항체-약물 접합체를 인간에게 투여하는 경우, 예를 들어, 약 0.001 내지 100 mg/kg 은 1 회 또는 1 내지 180 일 동안 1 회의 간격으로 수 회 투여될 수 있다.
TROP2-발현 암
TROP2 는 상피암에서 높게 발현되며, 이의 발현은 불량한 생존과 관련이 있다. TROP2-발현 암의 예는 폐암, 신장암, 요로상피암, 결장직장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 및 식도암을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 암 중 임의의 암은 개시된 ADC 및 ADC 투여 요법에 의해 치료될 수 있다. 그러나, 암 세포가 TROP2 를 발현하는 한, 이것이 상기 언급된 암의 카테고리에 속하지 않더라도 개시된 방법에 따라 치료될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.
비-소세포 폐암 (NSCLC) 은 개시된 ADC 및 투여 요법을 이용하는 치료에 특히 적합한 폐암의 유형이다. 예를 들어, 실시예 5-7 은 개시된 ADC 가 NSCLC 를 갖는 대상체에 투여되는 I 상 임상 연구를 상세히 설명한다.
개시된 TROP2-표적화 ADC 는 전술한 TROP2-발현 암 중 임의의 것을 치료하는데 사용될 수 있다.
치료 방법 및 용도
본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 항-TROP2 항체-약물 접합체를 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 방법을 제공한다. 또한, 본원에는 암 치료에 사용하기 위한 임의의 개시된 항-TROP ADC 가 제공된다.
일부 구현예에서, 암은 TROP2-발현 암이다. TROP2-발현 암은 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 또는 NSCLC), 신장암, 요로상피암, 결장직장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 및 식도암을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 목적상, 용어 "TROP2-과발현 암" 은 당업자에 의해 TROP2-과발현 암으로 인식되는 한, 특별히 제한되지 않는다. TROP2-과발현 암의 바람직한 예는 면역조직화학 방법 (IHC) 또는 제 자리 혼성화 방법 (ISH) 에서 TROP2 의 발현에 대해 높은 점수를 받은 암을 포함할 수 있다. 본 발명의 제 자리 혼성화 방법은 형광 제 자리 혼성화 방법 (FISH) 및 이중 컬러 제 자리 혼성화 방법 (DISH) 을 포함한다.
면역조직화학 방법에 의해 TROP2 발현도를 점수화하는 방법, 또는 제 자리 혼성화 방법에 의해 TROP2 발현에 대한 양성 또는 음성을 결정하는 방법은 당업자가 인지하는 한 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 ADC 및 치료 방법 및 용도는 수술불가능 또는 재발성 암의 치료에 바람직하게 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 ADC 및 치료 방법 및 용도는 또한, 유효 성분으로서 본 발명에 사용된 항체-약물 접합체, 이의 염, 또는 이의 수화물, 및 약학적으로 허용가능한 제형 성분을 포함하는 암 치료용 약학 조성물로서 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 ADC 및 치료 방법 및 용도는 기존의 항암 약물에 대한 내성을 나타내는 암 (즉, 내성 암), 특히 기존의 항암 약물에 대한 내성을 획득한 암 (즉, 2 차 내성 암) 에 대항하여 우수한 항종양 활성을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 치료용 ADC 는 암 환자 중 기존 항암 약물 (기존 항암 약물로 치료한 이력이 있는 환자) 에 내성을 보이는 암 환자군에 적용시 현저한 항종양 효과를 발휘한다. 특히, 치료되는 암은 EGFR-억제제 치료 (즉, 게피티닙, 에를로티닙, 오시머티닙, 아파티닙), ALK-억제제 치료 (즉, 알렉티닙, 크리조티닙, 세리티닙), 백금-기반 화학요법제 (즉, 시스플라틴, 카르보플라틴), 및/또는 체크포인트 억제제 치료 (즉, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 두르발루맙, 티슬렐리주맙, 신틸리맙, 세미플리맙) 으로의 치료에 대해 내성이거나 저항성일 수 있다.
본 발명의 치료용 ADC 는 암 환자에게 기존 항암 약물 대신 또는 이러한 기존 항암 약물과 병용하여 투여될 수 있어, 예를 들어 이러한 기존 항암 약물에 대한 내성을 획득한 암에 대해 높은 치료 효과를 나타낸다.
따라서, 개시된 방법 및 용도의 일부 구현예에서, 치료되는 암은 폐암 (예를 들어, 비-소세포 폐암 또는 NSCLC), 신장암, 요로상피암, 결장직장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 및 식도암의 내성 형태일 수 있다.
본 발명의 ADC 및 치료 방법 또는 용도는 암 세포의 발달을 지연시키고, 성장을 억제하며, 암 세포를 추가로 사멸시킬 수 있다. 이들 효과는 암 환자가 암으로 인한 증상으로부터 자유롭거나 암 환자의 삶의 질 (QOL) 의 개선을 달성할 수 있으며, 암 환자의 생명을 유지함으로써 치료 효과를 얻을 수 있도록 한다. 본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체는 암 세포의 사멸을 달성하지 못하더라도, 암 세포의 성장을 억제 또는 통제함으로써 장기 생존을 달성하면서 암 환자의 높은 QOL 을 제공할 수 있다.
개시된 방법 및 용도의 일부 구현예에서, ADC 는 약물 단독으로서 사용될 수 있거나, 또는 보조 요법에서의 추가 요법과 병용하여 약물로도 사용될 수 있으며, 외과 수술, 방사선요법, 호르몬 요법 등과도 병용될 수 있다. 또한, 신보조 요법에서 약물 요법에 대한 약물로서 사용될 수도 있다. 일부 구현예에서, ADC 는, 예를 들어, 아브락산, 파클리탁셀, 시스플라틴, 카르보플라틴, 겜시타빈, 이리노테칸 (CPT-11), 페메트렉세드, 소라페닙, 비노렐빈, 국제 공개 번호 WO 2003/038043 호에 기재된 약물, LH-RH 유사체 (류프로렐린, 고세렐린 등), 에스트라무스틴 포스페이트, 에스트로겐 길항제 (타목시펜, 랄록시펜 등), 아로마타제 억제제 (아나스트로졸, 레트로졸, 엑세메스탄 등), EGFR-억제제 치료 (게피티닙, 에를로티닙, 오시머티닙, 아파티닙), ALK-억제제 치료 (알렉티닙, 크리조티닙, 세리티닙), 및/또는 체크포인트 억제제 치료 (니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 듀발루맙, 티슬렐리주맙, 신틸리맙, 세미플리맙) 을 포함하나 이에 제한되지 않는 항암제와 병용될 수 있다.
상술한 치료 방법 및 용도 이외에도, 소형의 전이성 암 세포의 성장을 억제하고, 이를 추가로 사멸시키는 예방 효과도 기대할 수 있다. 특히, 1 차 암 세포에서 TROP2 의 발현을 확인할 경우, 본 발명의 항-TROP2 항체-약물 접합체를 투여함으로써 암 전이 억제 또는 예방 효과를 기대할 수 있다. 예를 들어, 전이 과정에서 체액에서 암 세포를 억제 및 사멸하는 효과 또는 예를 들어, 임의의 조직에 이식된 직후 소형의 암 세포를 억제 및 사멸하는 효과를 기대할 수 있다. 따라서, 특히 암의 수술적 제거 후에도, 암 전이의 억제 또는 예방 효과를 기대할 수 있다.
방법 및 용도의 일부 구현예에서, 암 (예를 들어, TROP2-발현 암) 을 앓는 대상체는 약 0.1 내지 약 15 mg/kg, 약 0.5 내지 약 12 mg/kg, 약 1.0 내지 약 10 mg/kg, 또는 약 4 내지 약 8 mg/kg 으로 투여될 수 있다. 즉, 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 ADC 의 투여량은 약 0.1, 약 0.2, 약 0.3, 약 0.4, 약 0.5, 약 0.6, 약 0.7, 약 0.8, 약 0.9, 약 1.0, 약 1.25, 약 1.5, 약 1.75, 약 2.0, 약 2.25, 약 2.5, 약 2.75, 약 3.0, 약 3.25, 약 3.5, 약 3.75, 약 4.0, 약 4.25, 약 4.5, 약 4.75, 약 5.0, 약 5.25, 약 5.5, 약 5.75, 약 6.0, 약 6.25, 약 6.5, 약 6.75, 약 7.0, 약 7.25, 약 7.5, 약 7.75, 약 8.0, 약 8.25, 약 8.5, 약 8.75, 약 9.0, 약 9.25, 약 9.5, 약 9.75, 약 10.0, 약 10.25, 약 10.5, 약 10.75, 약 11.0, 약 11.25, 약 11.5, 약 11.75, 또는 약 12 mg/kg 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 대상체에게 투여되는 ADC 의 투여량은 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.25, 1.5, 1.75, 2.0, 2.25, 2.5, 2.75, 3.0, 3.25, 3.5, 3.75, 4.0, 4.25, 4.5, 4.75, 5.0, 5.25, 5.5, 5.75, 6.0, 6.25, 6.5, 6.75, 7.0, 7.25, 7.5, 7.75, 8.0, 8.25, 8.5, 8.75, 9.0, 9.25, 9.5, 9.75, 10.0, 10.25, 10.5, 10.75, 11.0, 11.25, 11.5, 11.75, 또는 12 mg/kg 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 투여량은 약 2 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 2 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 10 mg/kg, 약 4 mg/kg 내지 약 8 mg/kg, 약 6 mg/kg t내지 약 10 mg/kg, 또는 약 6 mg/kg 내지 약 8 mg/kg 일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 투여량은 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4 mg/kg, 5 mg/kg, 6 mg/kg, 7 mg/kg, 8 mg/kg, 9 mg/kg, 또는 10 mg/kg, 더욱 바람직하게는 4 mg/kg, 6 mg/kg 또는 8 mg/kg 일 수 있다.
방법 및 용도의 일부 구현예에서, 항-TROP2 ADC 또는 이의 약학 조성물은 비경구 투여를 통해 암을 갖는 대상체에게 투여된다. 투여의 바람직한 비경구 경로는 정맥내, 근육내 및 피하 주사와 같은 주사를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 항-TROP2 항체-약물 접합체는 환자에게 전신 요법으로서 적용에 의해, 그리고 부가적으로 암 조직에 국소 적용에 의해 치료 효과를 발휘하기를 기대할 수 있다.
투여 시기 또는 요법은 1 주마다 한 번 (q1w), 2 주마다 한 번 (q2w), 3 주마다 한 번 (q3w), 4 주마다 한 번 (q4w), 5 주마다 한 번 (q5w), 6 주마다 한 번 (q6w), 7 주마다 한 번 (q7w), 8 주마다 한 번 (q8w), 9 주마다 한 번 (q9w), 또는 10 주마다 한 번 (q10w) 일 수 있으나, 바람직하게는 3 또는 4 주마다 한 번이다.
투여 요법은 최적의 원하는 반응 (예를 들어, 종양 퇴행 또는 완화와 같은 치료 반응) 을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 투여 요법은 3 주마다 1 회 2 mg/kg (q3w), 3 주마다 1 회 4 mg/kg (q3w), 3 주마다 1 회 6 mg/kg (q3w), 3 주마다 1 회 8 mg/kg (q3w), 4 주마다 1 회 2 mg/kg (q4w), 4 주마다 1 회 4 mg/kg (q4w), 4 주마다 1 회 6 mg/kg (q4w), 또는 4 주마다 1 회 8 mg/kg (q4w) 일 수 있다. 그리고 일부 구현예에서, 단일 볼루스가 투여될 수 있는 반면, 일부 구현예에서, 여러 개의 분할된 투여량이 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 투여량은 상황에 의해 표시된 바와 같이 비례적으로 감소되거나 증가될 수 있다.
또한, 방법 및 용도의 대상은 일반적으로 암 환자이지만, 환자의 연령은 제한되지 않는다. 개시된 방법 및 용도는 모든 연령 그룹 및 코호트에 걸쳐 다양한 재발 및 예후 결과를 갖는 암, 악성 질환, 또는 암 세포 증식을 치료하는데 유용하다. 따라서, 일부 구현예에서, 대상체는 소아 대상체일 수 있는 반면, 다른 구현예에서, 대상체는 성인 대상체일 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해서 제시된다. 그러나, 본 발명이 이들 실시예에서 기재되는 특정한 상태 또는 세부 사항에 제한되지 않는다는 것이 이해되어야 한다.
실시예
실시예 1 - 항체 약물 접합체의 제조
국제 공개 번호 WO2015/098099 및 국제 공개 번호 WO2017/002776 에 개시된 제조 방법에 따라, 항-TROP2 항체 (예를 들어, SEQ ID NO: 45 의 아미노산 위치 1 내지 451 의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 및 SEQ ID NO: 46 의 아미노산 위치 1 내지 214 의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄를 포함하는 항체) 를 사용하여, 하기 화학식으로 나타내지는 약물 링커에, 티오에테르 결합을 통해, 항-TROP2 항체가 결합된 항체-약물 접합체 (1) 및 항체-약물 접합체 (2) (이하, "항체-약물 접합체 (1)" 및 "항체-약물 접합체 (2)" 라 함) 를 제조하였다:
상기 식에서, n 은 단일 항체 분자 당 평균 약물 대 항체 비 (DAR) 를 나타내고; 항체-약물 접합체 (1) 의 n 의 값은 3.5 내지 4.5 의 범위 내에 있는 반면; 항체-약물 접합체 (2) 의 n 의 값은 6.5 내지 8.0 의 범위 내에 있다.
항체-약물 접합체 (1) 및 항체-약물 접합체 (2) 의 일반적인 구조 및 서열은 도 1 및 2 에서 발견된다.
실시예 2 - 항체 약물 접합체의 항종양 효과 시험
이 실험의 목적을 위해, 5-6 주령의 암컷 BALB/c 누드 마우스 (Charles River Laboratories Japan) 를 실험에 적용하였다. ATCC 에서 구입한 인간 췌장 선암종 세포주인 CFPAC-1 세포를 식염수에 현탁시키고, 각각의 암컷 누드 마우스의 몸 오른쪽 부분에 4 ×106 개의 세포를 이식하였다. 이식 14 일 후, 마우스를 그룹화하였다 (0일). 단일 투여 그룹 (3 주마다 1 회) 에서, 항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 를 제 0 일에 0.3 mg/kg 또는 1 mg/kg 의 투여량으로 투여하였다. 빈번한 투여 그룹 (3 주 동안 주 1 회) 에서, 항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 를 제 0 일, 제 8 일 및 제 14 일에 0.3 mg/kg 의 투여량으로 투여하였다. 비히클 투여군을 대조군으로서 결정했다. 제 22 일에 종양 성장 억제 (TGI) 를 계산에 의해 얻었다. 투여 그룹 중 어느 것에서도, 특히 체중 감소 등 주목할 만한 결과가 확인됐다.
측정/계산식: 종양의 장축 및 단축을 전자식 디지털 캘리퍼 (CD-15CX, Mitutoyo Corp.) 로 주 2 회 측정하고, 종양 부피 (mm3) 를 계산하였다. 계산식은 다음과 같다:
종양 부피 (mm3) = 1/2 ×주 축 (mm) ×[부 축 (mm)]2
종양 성장 억제 (TGI) 는 다음의 계산식에 따라 계산되었다:
종양 성장 억제 (%) = 100 ×(1-T/C)
식에서, T 는 시험 물질이 투여된 마우스 군의 평균 종양 부피를 나타내고; C 는 대조군 마우스 군의 평균 종양 부피를 나타낸다.
항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 를 각각 아세테이트 완충 식염수 (pH5.5) (Nacalai Tesque Inc. 제조, 이하 "ABS 버퍼" 라 함) 로 희석하였다. 희석 용액 (10 mL/kg) 을 꼬리 정맥을 통해 투여하였다.
항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 의 항종양 효과를 도 3 에 나타내었다. 항체-약물 접합체 (1) 에서, 0.3 mg/kg 의 투여량에서의 단일 투여군의 TGI 는 15% 였고, 1 mg/kg 의 투여량에서의 단일 투여군의 TGI 는 86% 였던 반면; 투여량 (0.3 mg/kg) 에서의 빈번한 투여군의 TGI 는 34% 였다. 항체-약물 접합체 (2) 에서, 0.3 mg/kg 의 투여량에서의 단일 투여군의 TGI 는 43% 였고, 1 mg/kg 의 투여량에서의 단일 투여군의 TGI 는 94% 였던 반면; 투여량 (0.3 mg/kg) 에서의 빈번한 투여군의 TGI 는 80% 였다.
상기 결과로부터, 항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 의 경우 모두, 1 mg/kg 의 투여량에서의 단일 투여군을 0.3 mg/kg 의 투여량에서의 빈번한 투여군과 비교하였을 때 (모두 거의 동등한 투여량을 제공하였음), 단일 투여군의 TGI 가 빈번한 투여군의 TGI 보다 높았다. 이로부터, 총 3 주 투여량을 1 회 투여하는 단일 투여 방법이 1 주 동안 3 회 투여량을 반복 투여하는 빈번한 투여 방법에 비해 효능이 더 우수한 것으로 나타났다. 항체-약물 접합체 (1) 과 (2) 를 비교하면, 항체-약물 접합체 (1) 의 단일 투여군의 1 mg/kg 의 투여량에서의 TGI 는 항체-약물 접합체 (2) 의 단일 투여군의 0.3 mg/kg 의 투여량에서의 TGI 보다 높고, 항체-약물 접합체 (2) 의 단일 투여군의 1 mg/kg 의 투여량에서의 TGI 보다 낮다. 이로부터, 항체-약물 접합체 (1)과 (2) 의 치료 투여량에서의 차이가 3 배 범위 내에 있음을 확인하였다.
실시예 3 - 항체 약물 접합체의 안정성 평가
실시예 1 에 따라 제조된 항체-약물 접합체 (1) 및 (2) 를 교차-반응성 종인 시노몰구스 원숭이에 개별적으로 투여하였다. 더욱 구체적으로, 항체-약물 접합체 (1) 은 3 주마다 1 회, 총 3 회 간격으로 투여한 반면; 항체-약물 접합체 (2) 는 1 주일에 1 회, 총 2 회 간격으로 투여하였다. 항체-약물 접합체 (1) 의 경우, 최종 투여 다음 날까지 관찰을 계속하였다. 항체-약물 접합체 (2) 의 경우, 최종 투여 다음 주까지 관찰을 계속하였다. 그 결과, 항체-약물 접합체 (2) 의 최고 무독성 투여량 (HNSTD) 은 10 mg/kg 미만이었으나; 항체-약물 접합체 (1) 의 HNSTD 는 30 mg/kg 이었다. 따라서, 항체-약물 접합체 (1) 는 항체-약물 접합체 (2) 보다 안전성이 우수함을 확인하였다.
실시예 4 - 인간에서 항체-약물 접합체 (1) 의 유효 투여량/용량 추정
이하, "항체-약물 접합체 (1)" 은 "DS-1062a" 라고도 한다.
항체-약물 접합체 (1) (즉, DS-1062a) 를 시노몰구스 원숭이에게 0.2, 0.6, 2 또는 6 mg/kg 의 투여량으로 정맥내 1 회 투여하였다. 그 후, 항체-약물 접합체 (1) 의 혈장 농도에 기초하여, 표적 매개 약물 배치 모델을 사용하여 약동학적 파라미터를 계산하였다. 또한, 인간에게 반복 투여시 시간에 따른 항체-약물 접합체의 혈장 농도 변화를 평가하였다. 항체-약물 접합체 (1) 는 0.27, 0.54, 0.81, 1.6, 3.2 및 6.4 mg/kg 으로 이루어진 투여 주기를 3 주마다 1 회, 3 회 (q3w× 3) 반복하여 투여하였다. 결과가 도 4 에 제시되어 있다. 인간에서 추정된 항체-약물 접합체 (1) 의 시간에 따른 혈장 농도 변화를 CFPAC-1 종양-함유 마우스 모델에서 제 21 일에 혈장 농도와 비교하였다. 그 결과, 인간에게 3 주마다 한 번 (q3w) 투여할 때 추정된 혈장 농도가 투여 간격의 절반 및 대부분에서, 마우스에서 종양 퇴행 효과를 나타내는 최소 농도 (1 mg/kg 투여군, 0.312 mg/mL) 를 초과하는 투여량은 각각 0.27 및 0.81 mg/kg 이었다. 이로부터, 인간에서 항체-약물 접합체(1) 의 유효 투여량/용량은 3 주에 한 번씩, 0.27 mg/kg 이상인 것으로 추정되었다.
실시예 5 - 초기 1 상 임상 연구
개요
DS-1062a 는 신규한 토포이소머라제 I 억제제 (엑사테칸 유도체; DXd) 를 갖는 영양막 세포-표면 항원 2 (TROP2)-표적화 항체-약물 접합체이다. DS-1062a 는 세포 표면 상의 TROP2 에 결합하고, 효소 처리 후 DXd 를 세포질로 내재화 및 방출하여 토포이소머라제 I 을 억제하고 표적 세포의 아폽토시스를 유도한다.
TROP2 는 폐암을 포함하는 상피암에서 높게 발현되며, 불량한 생존과 관련이 있다. 전임상 연구에서, DS-1062a 는 이종이식 마우스 모델에서 유망한 항종양 활성을 나타내었다.
목적
본 연구의 목적은 DS-1062a 의 안전성 및 내약성을 평가하고 최대 내약 용량 (MTD) 및 확장 권장 용량 (RDE) 을 결정하는 것이었다 (clinicaltrials.gov identifier NCT03401385 참조).
연구 설계 및 방법
1 상 연구는 미국 및 일본에서 대상체를 등록한, DS-1062a 의 멀티센터, 오픈-라벨, 다중-용량, 최초 인간 연구였다. 이 연구는 도 5 에 도시된 바와 같이, 투여량 증대 부문 및 투여량 확장 부문 둘 모두를 포함하였다. 투여량 증대 부문은 DS-1062a 의 단일 정맥내 주입 및 21 일 용량-제한 독성 (DLT) 관찰 기간 (사이클 1) 을 포함하였다. 투여량-확장 부문은 RDE 에서 DS-1062a 의 용량을 NSCLC 대상체에게 투여하는 것을 포함하였다.
투여량 증대 부문의 1 차 목적은 RDE 에 대한 MTD 를 확인하고 용량의 안전성 및 내약성을 평가하는 것이었다.
투여량 확장 부문에 대한 1 차 목적은 RDE 에서 DS-1062a 의 안전성 및 내약성을 확인하는 것이었다.
2 차 목적은 DS-1062a 의 약동학적 (PK) 특성, 총 TROP2 항체, 약물 성분, 및 DS1062a 의 항종양 활성을 측정하는 것을 포함하였다. 실험 목적은 DS-1062a 에 대한 반응과 관련된 바이오마커를 평가하는 것을 포함하였다.
포함 기준은 다음을 포함한다: 표준 치료 옵션 없이, 병리학적으로 문서화된, 전이성 NSCLC 를 갖는 ≥20 세 (일본) 또는 ≥18 세 (미국) 환자; 동부 협동 종양학 그룹 수행 상태 0 또는 1; RECIST 버전 1.1 에 기초한 측정가능한 질환; ≥3 개월의 기대 수명; 및 면역조직화학에 의한 최근 TROP2 수준의 측정을 위한 이용가능한 종양 조직.
배제 기준은 다음을 포함한다: 다발성 1 차 악성종양을 갖는 환자 (적합하게 절제된 비-흑색종 피부암, 치유적으로 치료된 제 자리 질환, 또는 질환의 증거 없이 ≥3 년 동안 치유적으로 치료된 다른 고형 종양을 제외함); 또는 임상적으로 유의한/의심되는 폐 질환.
환자 평가에는 초음파심전도 또는 다중게이트 획득 스캔, 12-리드 심전도, AE, PK, 인간 항-인간 항체, 바이오마커, 및 사전 지정된 방문에서의 종양 평가가 포함되었다. 이 초기 1 상 연구에 등록된 환자의 인구통계학 및 베이스라인 특성이 도 6 에 도시되어 있다.
MTD 를 결정하기 위한 DS-1062a 의 용량 증대를, 과량 조절 원리로 증대 후 베이지안 로지스틱 회귀 모델을 사용하여 변형된 연속 재평가 방법에 의해 안내하였다. 객관적 반응 속도 (ORR) 는 Clopper-Pearson 방법을 사용하여 95% 신뢰 구간 (Cl) 으로 요약하였고; 무진행 생존 (PFS)/전체 생존 (OS) 은 Kaplan-Meier 방법을 사용하여 요약하였다. 안정성 종점, DS-1062a 의 PK 파라미터, 항-TROP2 항체, DXd, 및 혈장 항약물 항체를 기술적 통계를 사용하여 요약하였다.
결과
7 개의 DS-1062a 투여 그룹, 및 환자 인구 및 기준선 특성 중에서 39 명의 환자를 컷오프에 등록하였다. 환자 (N=39) 를 8.86 (3.0-31.1) 주의 중간 (범위) 기간에 걸쳐, DS-1062a 를 이용한 3.0 (1-10) 치료 주기의 중간 (범위) 에 노출시켰다.
2 명의 환자는 DS-1062a 용량 중단 (4 mg/kg 그룹에 1 명, 8 mg/kg 그룹에 1 명) 이 필요하였고, 6.0 mg/kg 그룹에 1 명은 용량 감소가 필요하였다. 전체적으로, 23 명 (54.8%) 의 환자가 DS-1062a 로의 치료를 중단했다. 중단의 주요 이유는 13 명의 환자에서 RECIST 당 PD 였다 (n=4 각각 [0.5 및 2.0 mg/kg]; n=3 [1.0 mg/kg]; n=1 각각 [0.27 및 4.0 mg/kg]). 임상 진행 (0.27 mg/kg 과 6.0 mg/kg 에 각각 1 명) 으로 인해 2 명의 환자가 중단되었고, 2 명의 환자가 퇴원 (0.5 mg/kg 과 4.0 mg/kg 에 각각 1 명) 하였으며, 1 명의 환자가 의사의 판단에 따라 중단되었다 (1.0 mg/kg 그룹). 5 명의 환자 (1.0-mg/kg 그룹에서 n=3 및 0.27-mg/kg 그룹에서 n=2) 는 "다른" 이유로 중단되었다.
전체적으로, 환자의 87.2% (34/39) 은 ≥1 TEAE 를 보고하였지만, 보고된 TEAE 중 하나를 제외한 모두는 등급 ≤3 으로 간주되었다 (도 7). 가장 빈번한 TEAE 는 13 명 (33.3%) 의 환자에서 보고된 피로였다. 모든 등급 3 TEAE 는 2 명의 환자 (0.5- 및 2.0-mg/kg 투여군에서 각각 1명) 에서 보고된 등급 3 피로를 제외하고 각각 1 명의 환자에서만 보고되었다.
약물-관련 TEAE 는 23/39 (59.0%) 환자에서 보고되었고, 이들 환자 중 21/23 (91.3%) 는 중증도가 등급 1 또는 2 로서 이들 TEAE 를 갖는다. 가장 빈번한 TEAE (≥3 명의 환자에서) 는 빈도가 내려가는 순서로, 오심 (n=10); 주입-관련 반응 (n=8); 피로 (n=7); 탈모증 (n=6); 구토 (n=5); 빈혈 및 발진 (n=4 각각); 및 감소된 식욕 및 구내염 (n=3 각각) 이었다. 주입-관련 반응은 모두 등급 1 또는 2 이벤트였고, 관리 가능/가역적이었다.
심각한 TEAE 는 10/39 (25.6%) 환자에서 보고되었고; 대부분 (n=8) 은 등급 3 이었고, 1 명은 각각 등급 2 및 등급 5 (등급 5 패혈증; 6.0 mg/kg 투여군) 였다. 심각한 TEAE 는 1 명 이상의 환자에서 발생하지 않았다. 단지 1 개의 심각한 TEAE 만이 약물-관련된 것으로 간주되었다 (발열, 등급 2; 4.0-mg/kg 투여군).
6.0-mg/kg 투여군의 환자에게서 1 회 투여량 제한 독성 (DLT) (반구진 발진, 등급 3; 해소됨) 가 발생하였으며, MTD 에 도달하지 않았다.
35 명의 종양 평가가능한 환자 중에서, 7 개의 PR (RECIST 에 기초하지만, 단일-지점 PR 을 포함하고, 아직 확인된 반응이 없음) 이 도 8 에 나타낸 바와 같이 관찰되었다. 데이타컷에 이어서, 총 10 개의 PR 에 대해 3 개의 추가의 PR (모두 8.0-mg 투약 그룹 내) 이 관찰되었다.
3 명의 환자에서 계산된 (도 9A, C 및 D) 및 양전자 방출 (도 9B) 을 취하였다. 4.0-mg/kg 투여군에서 2 명의 환자는 DS-1062a 로의 치료 개시 후 4.5 개월 동안 종양 크기에서 최대 36.6% (도 9A) 및 38.4% (도 9B) 감소를 나타냈다. 2-mg/kg 투여군의 또다른 환자는 DS-1062a 로의 치료 개시 후 3 개월 후에 종양 크기가 최대 65.5% 감소하였고 (도 9C), 치료 개시 후 3 개월 및 7 개월에서 다중 폐 전이 (비-표적 병변) 의 수가 현저하게 감소하였다 (도 9D).
표적 병변에서 기준선으로부터 가장 긴 치수의 합의 최상의 백분율 변화가 도 10 에 도시되어 있다. 2.0-mg/kg 투여군의 환자에서 최상의 백분율 변화 (68% 종양 감소) 가 관찰되었다.
약동학과 관련하여, DS-1062a 에 대한 전신 노출은 도 11 에 도시된 바와 같이, 대략 용량-비례 방식으로 증가하였다. DS-1062a 및 전체 항-TROP2 항체의 혈장 수준은 유사하였으며, 이는 DS-1062a 가 순환에서 안정함을 시사한다. DXd 의 노출은 DS-1062a 의 노출보다 낮았다.
요약
데이터컷에 있어서, DS-1062a 이 잘 견뎌냈다. 6.0-mg/kg 투여군에서 일시적인 가역적인 등급 3 피부 발진의 하나의 DLT 가 관찰되었다. DS-1062a 에서 10 개의 PR 및 16 개의 안정한 질환이 관찰되었다. PR 을 갖는 환자 중 2 명은 이전 EGFR- 또는 ALK-억제제 치료 (즉, 알렉티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 오시머티닙) 를 가졌다. 연구의 전체 효능 비율은 도 12 에 제공된다.
실시예 6 - 신규 컷오프 일자로서의 1 상 임상 연구
초기 데이터컷 후, 추가 환자를 1 상 연구에 등록하여, 전체 참가자 수를 59 명 (N=59) 으로 가져왔다. 모든 환자는 표준 치료 (SOC) 에 재발/불응성인 절제되지 않은 진행성 NSCLC 종양을 가졌다. 환자는 57.7% 남성이었고, 88.5% 는 IV 기 질환을 갖고, 73.1% 는 선암종 조직학을 갖고, 80.8% 는 1 의 동부 협동 종양학 그룹 수행 상태 (ECOG PS) 를 갖고, 86.5% 는 이전 면역 체크포인트 억제제 치료에 실패하였다. 동일한 용량 증가 및 투여량 확장 연구 설계를 사용하였다.
인과성에 관계 없이, 치료-응급 이상 반응 (TEAE) 을 갖는 새로운 컷오프 날짜로의 1 상 연구에서 환자의 수를 도 13 에 나타낸다. 간략하게, 용량 제한 독성 (DLT) 은 10 mg/kg 에 도달하였고, 최대 허용 용량 (MTD) 은 8 mg/kg 으로 확립되었으며, 이는 또한 미래의 투여량 확장 부분에서 확장 권장 용량 (RDE) 이었다. 환자에 대한 평균 노출 기간은 10.6 (범위 3.0 내지 43.1) 주였다. 심각한 TEAE 는 14 명 (26.9%) 의 환자에서 발생하였고 사망이 3 명 (5.8%) 의 환자에서 발생하였다; 사망자는 연구 약물과 관련되지 않았다. 용량 감소, 중단 또는 중지에 관련된 TEAE 는 각각 5 명 (9.6%), 5 명 (9.6%) 및 2 명 (3.8%) 의 환자에서 발생하였다. 6.0 mg/kg 용량으로 치료된 질환 진행을 갖는 1 명의 환자 (1.9%) 는 간질성 폐 질환 (ILD) 이 아닌 것으로 판정된, 호흡 부전의 특별한 관심의 폐 부작용 (등급 5) 을 일으켰다. 포스트-데이타 컷-오프의 경우를 포함하여, 아직 조정되지 않은 가능한 ILD 리포트가 4 회 관찰되었다 (1 등급 2 폐렴 [6.0 mg/kg], 1 등급 2 조직화된 폐렴 [8 mg/kg], 1 등급 2 폐렴 [8 mg/kg], 및 1 등급 5 [질병 진행 환자의 호흡 부전; 8.0 mg/kg]).
12 개의 부분 반응 (적어도 10 개가 확인됨) 이 연구의 용량 증대 부문에서 모든 투여량에 걸쳐 관찰되었다. 8 mg/kg 에서, 5/7 환자는 부분 반응 (PR) 을 보였고, 2/7 환자는 안정한 질환 (SD) 을 보였다. 이 그룹에서 6/7 가 치료를 계속하였다. 도 14 는 대상체의 표적 병변에서 기준선으로부터의 최장 치수 측정치의 합계의 최상의 백분율 변화를 나타내고; 도 15 는 더 높은 투여군의 환자가 종양 크기의 보다 일관되고 현저한 감소를 보였기 때문에, 반응 빈도에 대한 명백한 용량 효과를 나타내고; 도 16 은 다양한 치료군 (이전에 EGFR-, ALK- 및 HER2-표적화 요법으로 치료를 받은 환자가 나타냄) 에서 관찰된 항종양 활성을 나타낸다.
전처리 종양 생검을 면역조직화학을 통해 평가하여 TROP2 발현을 측정하고, 환자 반응을 도 17 에 나타내었다. 도 12, 17, 21 및 26 에 나타낸 바와 같이, 일부 환자는 이전 EGFR-억제제 또는 ALK-억제제 요법을 받았거나 면역-종양학 치료를 받았다. 부분 반응 (PR) 을 달성한 8 명의 환자 중 6 명은 중앙값보다 높은 H 스코어를 갖는 반면, 안정한 질병 (SD) 을 갖는 8/15 및 진행성 질병을 갖는 4/12 명은 중앙값보다 높은 H 스코어를 갖는다. 이것은 항체 약물 접합체 (1) (즉, DS-1062a) 가 TROP2-음성 종양 (Calu-6) 과 대조적으로 TROP2-양성 종양 (NCI-H2170 및 HCC827) 에서 더 강한 항종양 활성을 갖는 폐암 이종이식 마우스 모델에서 항종양 활성을 갖는 것을 보여주는 전임상 데이터 (도 18 참조) 와 일치한다.
가변 대립유전자 빈도 (VAF) 의 변화는 또한 무세포 DNA (cfDNA) 를 평가함으로써 결정되었다. VAF 는 사이클 3, 제 1 일 (C3D1) 및 치료 종료 (EOT) 에서 체크하였다. 도 19 에 나타낸 이들 결과는 DS-1062a 가 SD 및 PR 을 달성한 환자에서 cfDNA 를 감소시켰음을 나타낸다.
요약하면, DS-1062a 는 MTD 및 RDE 로서 확립된 최대 8 mg/kg 의 용량에서 잘 용인되었다. 10 mg/kg 은 용인되지 않았으며, 2 명의 대상체는 등급 3 점막염을 가졌다. 8 및 6 mg/kg 둘 모두가 잘 용인되었지만, 8 mg/kg 은 8 mg/kg 에서 더 높은 전체 반응 속도 (ORR) 로 6 mg/kg 에 비해 더 양호한 예비 효능 신호를 입증하였다. 실제로, 도 20 은 ORR 이 8 mg/kg 투여 그룹에서 가장 우수하였음을 보여준다.
항종양 활성에 대한 용량 의존적 효과는 2.0 내지 8.0 mg/kg 의 범위에 대해 관찰되었다. 면역 체크포인트 억제제를 포함하는, 표준 치료 (SOC) 로부터 재발하거나 진전된 과다하게 전처리된 비선택된 NSCLC 환자에서 용량 증대 동안 12 명의 부분 반응이 관찰되었다. 효능 결과 요약을 도 21 에 제공한다.
실시예 7 - 항체 약물 접합체의 예비적 효능
2019년 11월 16일 현재, DS-1062a 로 치료된 95 명의 대상체 중 88 명이 반응을 위해 평가될 수 있었다.
조사자-평가된 전체 반응률 (ORR; 미확인) 은 6 mg/kg 투여량 그룹 (5/18 대상체, 모두 PR 가 있는 반응 포함) 에서 27.8% (95% CI: 9.7, 53.5) 및 8 mg/kg 투여량 그룹 (13/34, 모두 PR 포함) 에서 38.2% (95% CI: 22.2, 56.4) 였다 (표 2 및 도 22). 질병 통제율 (DCR=CR+PR+SD) 은 6 mg/kg 에서 72.2%, 및 8 mg/kg 에서 79.4% 였다.
데이터 컷오프 날짜에서, 6 mg/kg 투여군 중 PR 을 갖는 5 명의 대상체 모두는 질환 진행 또는 사망 없이 치료를 진행 중이었다.
8 mg/kg 투여량 군에서, PR 을 갖는 13 명의 대상체 중 6 명은 질환 진행 또는 사망 없이 치료 진행 중이었고; 2 명은 진행성 질환이었고; 1 명은 사망하였고; 4 명은 질환 진행 또는 사망 이외의 이유로 DS-1062a 를 중단하였다.
표 2- 연구 DS1062-A--J101 (반응 평가가능한 분석 세트) 에서 2019년 11월 16일 평가가능한 대상체에서 조사자-평가 목표 반응률, 질병 통제율 및 최상의 전체 반응의 요약
반응 평가가능한 대상체는 기준선 및 후-기준선 종양 평가 둘 다를 갖거나 연구 치료를 중단한 대상체였다.
약동학
DS-1062a (0.27 mg/kg 내지 10 mg/kg) 를 투여받은 61 명의 대상체에서 비구획 분석을 사용하여 예비 단일 및 다중-용량 PK 를 평가하였다.
도 23 은 8 mg/kg 의 DS-1062a 의 반복 투여량에서 DS-1062a, 총 항체 및 자유 약물 (도면에서 페이로드로 명명됨) 의 혈장 농도를 나타낸다. 평균 AUClast, Cmax 및 평균 말단 반감기 (t1/2) 는 각각 914 ㎍·d/mL, 196 ㎍/mL 및 5.45 일이었다.
DS-1062a 및 전체 항-TROP2 항체의 혈장 수준은 유사하였고, 유리 약물의 노출은 DS-1062a 의 노출보다 낮았으며, 이는 DS-1062a 가 순환에서 안정함을 시사한다.
결론
이러한 DS-1062a 는 I 상 연구에서 8 mg/kg 이하의 투여량에서 허용가능하고 안전하다는 것이 입증되었다.
88 명의 효능 평가가능 대상체 중, DS-1062a 는 2 mg/kg 이상의 투여량에서 효능이 있어서, 8 mg/kg 군에서 38.2% (13/34 대상체) 의 ORR 및 79.4% (27/34 대상체) 의 DCR 을 달성하였다.
NSCLC 에서 면역 체크포인트 억제제 및 백금-기반 화학요법 후 표준 요법으로 사용되는 도세탁셀에 비해 우수한 결과를 나타내었다 (표 3).
또한, PR 대상체의 90.9% (20/22 대상체) 는 이전에 면역 체크포인트 억제제 (예를 들어, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 두르발루맙) 로 치료되었고, 모든 대상체는 이전에 백금-기반 화학요법제 (예를 들어, 시스플라틴, 카르보플라틴) 로 치료되었다. 따라서, DS-1062a 는 이들 표준 요법에 내성이 있거나 내성이 없는 NSCLC 대상체를 갖는 대상체에서 도세탁셀로 대체될 가능성을 보여주었다.
또한, 미국에서 개발된 TROP2 를 표적으로 하는 경쟁적 항체-약물 접합체인 삭티주맙 고비테칸 (Sactizumab govitecan) 은 표준 관리를 받은 대상체의 2 상 연구에서 NSCLC 에서 19% 의 ORR 을 가지며, 이는 DS-1062a 가 경쟁적 약물보다 더 효과적일 수 있음을 시사한다.
따라서, 본 발명에서 사용된 DS-1062a 를 포함하는 치료제 및 치료용 약학 조성물 및 본 발명의 DS-1062a 를 투여하는 것을 특징으로 하는 치료 방법은 표준 요법에 불응하거나 재발하거나 표준 요법을 적용할 수 없는 절제불가능한 진행 비-소세포 폐암 환자의 치료에 우수한 것으로 밝혀졌다.
4 mg, 6 mg, 및 8 mg 의 안전성 및 예비 효능은 I 상 연구에서 연속적으로 평가되고 있다.
또한 2020 년에 시작될 예정인 다단계 II 상 연구가 계획되어 있다.
표 3- DS-1062a 와 도세탁셀 간의 효능 비교
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본 명세서에서 언급된 모든 특허 및 공개 문헌은 본 발명이 속하는 당업자의 기술 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공개 문헌은 각 개개의 공개 문헌이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타난 바와 같은 정도까지 여기에 참조로 포함된다.
또한, 당업자는 본 개시가 언급된 목적을 수행하고, 언급된 단점 및 이점 뿐만 아니라 그 안에 내재된 것들을 획득하도록 잘 적응된다는 것을 용이하게 이해할 것이다. 그안의 변형 및 다른 용도가 해당 분야의 숙련자에게 일어날 것이다. 이러한 변형은 본 발명의 취지 내에 포함되고, 본 발명의 비-제한적인 구현예를 설명하는 청구항의 범주에 의해 정의된다.
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<210> 1
<211> 363
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
cagatccagt tggtgcagtc tggacctgag ctgaagaagc ctggagagac agtcaggatc 60
tcctgcaagg cttctgggta taccttcaca actgctggaa tgcagtgggt gcaaaagatg 120
ccaggaaagg gtttgaagtg gattggctgg ataaacaccc actctggagt gccaaaatat 180
gcagaagact tcaagggacg gtttgccttc tctttggaaa cctctgccag cactgcatat 240
ttacagataa gcaacctcaa aaatgaggac acgactacgt atttctgtgc gagatcgggg 300
ttcggtagta gctactggta cttcgatgtc tggggcgcag ggaccgcggt caccgtctcc 360
tca 363
<210> 2
<211> 121
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 3
<211> 327
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 3
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 60
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 120
ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg gcatcctacc gctacactgg agtccctgat 180
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggct ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 240
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatatta ctccgctcac gttcggtgct 300
gggaccaagc tggagctgaa acgggct 327
<210> 4
<211> 109
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 4
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala
100 105
<210> 5
<211> 449
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
gcctccggac tctagagcca ccatggtgct gcagacccag gtgttcatct ccctgctgct 60
gtggatctcc ggcgcgtacg gcgatatcgt gatgattaaa cgtacggtgg ccgccccctc 120
cgtgttcatc ttccccccct ccgacgagca gctgaagtcc ggcaccgcct ccgtggtgtg 180
cctgctgaat aacttctacc ccagagaggc caaggtgcag tggaaggtgg acaacgccct 240
gcagtccggg aactcccagg agagcgtgac cgagcaggac agcaaggaca gcacctacag 300
cctgagcagc accctgaccc tgagcaaagc cgactacgag aagcacaagg tgtacgcctg 360
cgaggtgacc caccagggcc tgagctcccc cgtcaccaag agcttcaaca ggggggagtg 420
ttaggggccc gtttaaacgg gggaggcta 449
<210> 6
<211> 1132
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
gcctccggac tctagagcca ccatgaaaca cctgtggttc ttcctcctgc tggtggcagc 60
tcccagatgg gtgctgagcc aggtgcaatt gtgcaggcgg ttagctcagc ctccaccaag 120
ggcccaagcg tcttccccct ggcaccctcc tccaagagca cctctggcgg cacagccgcc 180
ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc gaacccgtga ccgtgagctg gaactcaggc 240
gccctgacca gcggcgtgca caccttcccc gctgtcctgc agtcctcagg actctactcc 300
ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc agcttgggca cccagaccta catctgcaac 360
gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg gacaagagag ttgagcccaa atcttgtgac 420
aaaactcaca catgcccacc ctgcccagca cctgaactcc tggggggacc ctcagtcttc 480
ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc 540
gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc 600
gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccc cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg 660
gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc 720
aaggtctcca acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggc 780
cagccccggg aaccacaggt gtacaccctg cccccatccc gggaggagat gaccaagaac 840
caggtcagcc tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg 900
gagagcaatg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc ctcccgtgct ggactccgac 960
ggctccttct tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcagggcaac 1020
gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacaccca gaagagcctc 1080
tccctgtctc ccggcaaatg agatatcggg cccgtttaaa cgggggaggc ta 1132
<210> 7
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 7
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
atccagttgg tgcagtctgg acctgagctg aagaagcctg gagagacagt caggatctcc 120
tgcaaggctt ctgggtatac cttcacaact gctggaatgc agtgggtgca aaagatgcca 180
ggaaagggtt tgaagtggat tggctggata aacacccact ctggagtgcc aaaatatgca 240
gaagacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcatattta 300
cagataagca acctcaaaaa tgaggacacg actacgtatt tctgtgcgag atcggggttc 360
ggtagtagct actggtactt cgatgtctgg ggcgcaggga ccgcggtcac cgtcagctca 420
gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 8
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 8
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Lys Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys Trp Ile Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Thr Thr
100 105 110
Tyr Phe Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Ala Gly Thr Ala Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 9
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 9
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacattgtga tgacccagtc tcacaaattc atgtccacat cagtaggaga cagggtcagc 120
atcacctgca aggccagtca ggatgtgagt actgctgtag cctggtatca acagaaacca 180
ggacaatctc ctaaactgct gatttactcg gcatcctacc gctacactgg agtccctgat 240
cgcttcactg gcagtggatc tgggacggct ttcactttca ccatcagcag tgtgcaggct 300
gaagacctgg cagtttatta ctgtcagcaa cattatatta ctccgctcac gttcggtgct 360
gggaccaagc tggagctgaa acgggctgtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
gagagcgtga ccgagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctgagcag caccctgacc 600
ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 10
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of chimeric murine-human TINA1
antibody
<400> 10
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser
20 25 30
Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ala Phe Thr Phe Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
Ala Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 11
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H1
<400> 11
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccacc gccggcatgc agtgggtgcg ccaggctcct 180
ggacagggcc tggaatggat gggctggatc aacacccaca gcggcgtgcc caaatacgcc 240
gaggacttca agggcagagt gaccatcagc gccgacacca gcacctccac agcctacctg 300
cagctgagca gcctgaagtc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aagcggcttc 360
ggcagcagct actggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctcgtgac cgtcagctca 420
gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 12
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H1
<400> 12
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 13
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H2
<400> 13
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
gtgcagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaaccag gcgccagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccacc gccggcatgc agtgggtgcg ccaggctcct 180
ggacagggcc tggaatggat gggctggatc aacacccaca gcggcgtgcc caaatacgcc 240
gaggacttca agggcagagt gaccatcagc ctggacacca gcacctccac cgcctacctg 300
cagctgagca gcctgaagtc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aagcggcttc 360
ggcagcagct actggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctcgtgac cgtcagctca 420
gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 660
tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 720
aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccctgcccag cacctgaact cctgggggga 780
ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cccgggagga gcagtacaac 960
agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 1020
gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080
aaagccaaag gccagccccg ggaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140
atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 1200
gccgtggagt gggagagcaa tggccagccc gagaacaact acaagaccac ccctcccgtg 1260
ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320
cagcagggca acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacc 1380
cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 14
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H2
<400> 14
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 15
<211> 1410
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H3
<400> 15
atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt gctgagccag 60
atccagctgg tgcagtctgg cgccgaagtg aagaaacccg gcgagagcgt gaaggtgtcc 120
tgcaaggcca gcggctacac ctttaccacc gccggcatgc agtgggtgca gcagatgcct 180
ggcaagggcc tggaatggat gggctggatc aacacccaca gcggcgtgcc caaatacgcc 240
gaggacttca agggcagagt gaccttcagc ctggacacca gcacctccac cgcctacctg 300
cagctgagca gcctgaagtc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccag aagcggcttc 360
ggcagcagct actggtactt cgacgtgtgg ggccagggca ccctcgtgac cgtcagctca 420
gcctccacca agggcccaag cgtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggc 480
ggcacagccg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaacccgt gaccgtgagc 540
tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgctgtcct gcagtcctca 600
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ccctcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840
gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 900
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cagaagagcc tctccctgtc tcccggcaaa 1410
<210> 16
<211> 470
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of heavy chain of humanized TINA1 antibody,
type H3
<400> 16
Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp
1 5 10 15
Val Leu Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys
20 25 30
Pro Gly Glu Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Thr Ala Gly Met Gln Trp Val Gln Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala
65 70 75 80
Glu Asp Phe Lys Gly Arg Val Thr Phe Ser Leu Asp Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp
115 120 125
Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
275 280 285
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 17
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L1
<400> 17
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gacatccaga tgacccagag ccctagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgacc 120
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ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 18
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L1
<400> 18
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
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50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
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Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
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<210> 19
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L2
<400> 19
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
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<210> 20
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L2
<400> 20
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
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His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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225 230
<210> 21
<211> 702
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
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ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 22
<211> 234
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> amino acid sequence of light chain of humanized TINA1 antibody,
type L3
<400> 22
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
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Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro
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Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser
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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
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Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
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Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
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Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
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Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
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<211> 5
<212> PRT
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<400> 23
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1 5
<210> 24
<211> 17
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 24
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1 5 10 15
Gly
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<213> Mus musculus
<400> 25
Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val
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<211> 11
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<213> Mus musculus
<400> 26
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<400> 27
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<210> 28
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<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 28
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<211> 1410
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 29
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<211> 470
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65 70 75 80
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100 105 110
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145 150 155 160
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
165 170 175
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
180 185 190
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
195 200 205
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
210 215 220
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
225 230 235 240
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
245 250 255
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
305 310 315 320
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
325 330 335
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
340 345 350
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
355 360 365
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
370 375 380
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
385 390 395 400
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
405 410 415
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
420 425 430
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
435 440 445
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
450 455 460
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
465 470
<210> 31
<211> 702
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 31
atggtgctgc agacccaggt gttcatctcc ctgctgctgt ggatctccgg cgcgtacggc 60
gatatccagc tgacccagag ccccagcagc ctgagcgcca gcgtgggcga cagagtgtcc 120
atcacatgca aggccagcca ggacgtgtcc attgccgtgg cctggtatca gcagaagccc 180
ggcaaggccc ccaagctgct gatctacagc gccagctacc ggtacaccgg cgtgcccgac 240
agattcagcg gcagcggctc cggcaccgac ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 300
gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag cactacatca cccccctgac cttcggagcc 360
ggcaccaagg tggaaatcaa gcgtacggtg gccgccccct ccgtgttcat cttccccccc 420
tccgacgagc agctgaagtc cggcaccgcc tccgtggtgt gcctgctgaa taacttctac 480
cccagagagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tgcagtccgg gaactcccag 540
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ctgagcaaag ccgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccaccagggc 660
ctgagctccc ccgtcaccaa gagcttcaac aggggggagt gt 702
<210> 32
<211> 234
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser
1 5 10 15
Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser
20 25 30
Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp
35 40 45
Val Ser Ile Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro
50 55 60
Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65 70 75 80
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
85 90 95
Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr
100 105 110
Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
115 120 125
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
130 135 140
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
145 150 155 160
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
165 170 175
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
180 185 190
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
195 200 205
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
210 215 220
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
225 230
<210> 33
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer mG2aVR2
<400> 33
agagttccag gtcaaggtca ctggctcagg 30
<210> 34
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer mKVR2
<400> 34
agtccaactg ttcaggacgc cattttgtcg 30
<210> 35
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer 3.3-F1
<400> 35
tataccgtcg acctctagct agagcttggc 30
<210> 36
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer 3.3-R1
<400> 36
gctatggcag ggcctgccgc cccgacgttg 30
<210> 37
<211> 47
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1H-F
<400> 37
ccagatgggt gctgagccag atccagttgg tgcagtctgg acctgag 47
<210> 38
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1H-R
<400> 38
cttggtggag gctgagctga cggtgaccgc ggtccctgcg ccccagac 48
<210> 39
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1L-F
<400> 39
atctccggcg cgtacggcga cattgtgatg acccagtctc acaaattc 48
<210> 40
<211> 45
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer TINA1L-R
<400> 40
ggagggggcg gccacagccc gtttcagctc cagcttggtc ccagc 45
<210> 41
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer EG-Inf-F
<400> 41
agctcccaga tgggtgctga gc 22
<210> 42
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer EG1-Inf-R
<400> 42
gggcccttgg tggaggctga gc 22
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer CM-LKF
<400> 43
ctgtggatct ccggcgcgta cggc 24
<210> 44
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> nucleotide sequence of primer KCL-Inf-R
<400> 44
ggagggggcg gccaccgtac g 21
<210> 45
<211> 451
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Heavy chain of anti-TROP2 antibody
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Ala
20 25 30
Gly Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr His Ser Gly Val Pro Lys Tyr Ala Glu Asp Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Phe Gly Ser Ser Tyr Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser
115 120 125
Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala
130 135 140
Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val
145 150 155 160
Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala
165 170 175
Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val
180 185 190
Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His
195 200 205
Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys
210 215 220
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
225 230 235 240
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
245 250 255
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
260 265 270
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
275 280 285
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
290 295 300
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
305 310 315 320
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
325 330 335
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
340 345 350
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser
355 360 365
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
370 375 380
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
385 390 395 400
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
405 410 415
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
420 425 430
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
435 440 445
Pro Gly Lys
450
<210> 46
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Light chain of anti-TROP2 antibody
<400> 46
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
Claims (66)
- 암의 치료 또는 예방에 사용하기 위한 항-TROP2 항체-약물 접합체로서, 항체-약물 접합체는 항-TROP2 항체 및 링커에 의해 연결된 항종양 화합물을 포함하고, 링커와 항종양 화합물은 하기 화학식으로 나타내지는 것을 특징으로 하는, 항-TROP2 항체-약물 접합체:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
식 중 -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 화학식으로 나타내지는 구조를 가짐:
이는 이의 위치 3 에서 항체에 연결되어 있고, 위치 1 에서의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌 기에 연결되어 있고, (NH-DX) 는 하기 화학식으로 나타내지는 기를 나타냄:
식 중, 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 연결 위치이고, 항-TROP2 항체는 그의 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 23 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 SEQ ID NO: 25 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 그의 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, SEQ ID NO: 27 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 SEQ ID NO: 28 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함함. - 제 1 항에 있어서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수가 2 내지 8 또는 3 내지 8 의 범위인 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수가 3.5 내지 4.5 인 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:45 의 아미노산 1-121 을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:46 의 아미노산 1-109 를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP2 항체가 중쇄의 카르복실 말단에 리신 잔기가 결여된 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 mg/kg 내지 10 mg/kg 의 범위의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 6 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 8 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 정맥내 투여에 의해 투여되는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 매 3 주 1 회 또는 매 4 주 1 회 투여되는 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, 신장암, 요로상피암, 결장직장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 항체-약물 접합체.
- 제 13 항에 있어서, 폐암이 비-소세포 폐암 (NSCLC) 인 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 저항성 또는 난치성인 항체-약물 접합체.
- 제 15 항에 있어서, 저항성 또는 난치성이 항암 약물로의 치료로 인해 암에 의해 획득된 저항성 또는 난치성인 항체-약물 접합체.
- 제 16 항에 있어서, 항암 약물이 EGFR-억제제, ALK-억제제, 백금-기반 화학치료제, 또는 체크포인트 억제제인 항체-약물 접합체.
- 제 16 항에 있어서, 항암 약물이 게피티닙, 에를로티닙, 오시머티닙, 아파티닙, 알렉티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 시스플라틴, 카르보플라틴, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 두르발루맙, 티슬레리주맙, 신틸리맙 또는 세미플리맙인 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 TROP2-발현 암인 항체-약물 접합체.
- 제 19 항에 있어서, TROP2-발현 암이 TROP2-과발현 암인 항체-약물 접합체.
- 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 수술불가능성 또는 재발성 암인 항체-약물 접합체.
- 유효 성분으로 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 따른 항체-약물 접합체 또는 이의 염, 및 약학적으로 허용가능한 제형 성분을 포함하는 약학 조성물.
- 대상체에서의 암의 치료 또는 예방 방법으로서, 암을 가진 대상체에게 항-TROP2 항체 및 링커에 의해 연결된 항종양 화합물을 포함하고, 링커와 항종양 화합물은 하기 화학식으로 나타내지는 항-TROP2 항체-약물 접합체를 투여하는 것을 포함하는 방법:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
식 중 -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 화학식으로 나타내지는 구조를 가짐:
이는 이의 위치 3 에서 항체에 연결되어 있고, 위치 1 에서의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌 기에 연결되어 있고, (NH-DX) 는 하기 화학식으로 나타내지는 기를 나타냄:
식 중, 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 연결 위치이고, 항-TROP2 항체는 그의 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 23 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 SEQ ID NO: 25 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 그의 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, SEQ ID NO: 27 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 SEQ ID NO: 28 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함함. - 제 23 항에 있어서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수가 2 내지 8 또는 3 내지 8 의 범위인 방법.
- 제 23 항 또는 제 24 항에 있어서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수가 3.5 내지 4.5 인 방법.
- 제 23 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:45 의 아미노산 1-121 을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:46 의 아미노산 1-109 를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 방법.
- 제 23 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 방법.
- 제 23 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP2 항체가 중쇄의 카르복실 말단에 리신 잔기가 결여된 방법.
- 제 23 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 mg/kg 내지 10 mg/kg 의 범위의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 방법.
- 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 방법.
- 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 6 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 방법.
- 제 23 항 내지 제 29 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 8 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 방법.
- 제 23 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 정맥내 투여에 의해 투여되는 방법.
- 제 23 항 내지 제 33 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 매 3 주 1 회 또는 매 4 주 1 회 투여되는 방법.
- 제 23 항 내지 제 34 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, 신장암, 요로상피암, 결장직장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
- 제 35 항에 있어서, 폐암이 비-소세포 폐암 (NSCLC) 인 방법.
- 제 23 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 저항성 또는 난치성인 방법.
- 제 37 항에 있어서, 저항성 또는 난치성이 항암 약물로의 치료로 인해 암에 의해 획득된 저항성 또는 난치성인 방법.
- 제 38 항에 있어서, 항암 약물이 EGFR-억제제, ALK-억제제, 백금-기반 화학치료제, 또는 체크포인트 억제제인 방법.
- 제 38 항에 있어서, 항암 약물이 게피티닙, 에를로티닙, 오시머티닙, 아파티닙, 알렉티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 시스플라틴, 카르보플라틴, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 두르발루맙, 티슬레리주맙, 신틸리맙 또는 세미플리맙인 방법.
- 제 23 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 TROP2-발현 암인 방법.
- 제 41 항에 있어서, TROP2-발현 암이 TROP2-과발현 암인 방법.
- 제 23 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 수술불가능성 또는 재발성 암인 방법.
- 제 23 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 제형 성분을 포함하는 약학 조성물로 투여되는 방법.
- 암의 치료 또는 예방을 위한 의약의 제조에서의 항-TROP2 항체-약물 접합체의 용도로서, 항체-약물 접합체는 항-TROP2 항체 및 링커에 의해 연결된 항종양 화합물을 포함하고, 링커와 항종양 화합물은 하기 화학식으로 나타내지는 용도:
-(숙신이미드-3-일-N)-CH2CH2CH2CH2CH2-C(=O)-GGFG-NH-CH2-O-CH2-C(=O)-(NH-DX)
식 중 -(숙신이미드-3-일-N)- 은 하기 화학식으로 나타내지는 구조를 가짐:
이는 이의 위치 3 에서 항체에 연결되어 있고, 위치 1 에서의 질소 원자 상에서 이 구조를 함유하는 링커 구조 내의 메틸렌 기에 연결되어 있고, (NH-DX) 는 하기 화학식으로 나타내지는 기를 나타냄:
식 중, 위치 1 에서의 아미노기의 질소 원자는 연결 위치이고, 항-TROP2 항체는 그의 중쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 23 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH1, SEQ ID NO: 24 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH2 및 SEQ ID NO: 25 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRH3, 및 그의 경쇄 가변 영역에 SEQ ID NO: 26 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL1, SEQ ID NO: 27 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL2 및 SEQ ID NO: 28 의 아미노산 서열로 이루어지는 CDRL3 을 포함함. - 제 45 항에 있어서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수가 2 내지 8 또는 3 내지 8 의 범위인 용도.
- 제 45 항 또는 제 46 항에 있어서, 항체 당 접합된 항종양 화합물의 단위의 평균 수가 3.5 내지 4.5 인 용도.
- 제 45 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:45 의 아미노산 1-121 을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 SEQ ID NO:46 의 아미노산 1-109 를 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 용도.
- 제 45 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 SEQ ID NO:45 를 포함하는 중쇄 및 SEQ ID NO:46 을 포함하는 경쇄를 포함하는 용도.
- 제 45 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-TROP2 항체가 중쇄의 카르복실 말단에 리신 잔기가 결여된 용도.
- 제 45 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 mg/kg 내지 10 mg/kg 의 범위의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 용도.
- 제 45 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 4 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 용도.
- 제 45 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 6 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 용도.
- 제 45 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 약 8 mg/kg 의 항체-약물 접합체의 투여량이 암이 있는 대상체에게 투여되는 용도.
- 제 45 항 내지 제 54 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 정맥내 투여에 의해 투여되는 용도.
- 제 45 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 매 3 주 1 회 또는 매 4 주 1 회 투여되는 용도.
- 제 45 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, 신장암, 요로상피암, 결장직장암, 전립선암, 다형성 교모세포종, 난소암, 췌장암, 유방암, 흑색종, 간암, 방광암, 위암, 자궁경부암, 두경부암 및 식도암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 용도.
- 제 57 항에 있어서, 폐암이 비-소세포 폐암 (NSCLC) 인 용도.
- 제 45 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 저항성 또는 난치성인 용도.
- 제 59 항에 있어서, 저항성 또는 난치성이 항암 약물로의 치료로 인해 암에 의해 획득된 저항성 또는 난치성인 용도.
- 제 60 항에 있어서, 항암 약물이 EGFR-억제제, ALK-억제제, 백금-기반 화학치료제, 또는 체크포인트 억제제인 용도.
- 제 60 항에 있어서, 항암 약물이 게피티닙, 에를로티닙, 오시머티닙, 아파티닙, 알렉티닙, 크리조티닙, 세리티닙, 시스플라틴, 카르보플라틴, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 이필리무맙, 두르발루맙, 티슬레리주맙, 신틸리맙 또는 세미플리맙인 용도.
- 제 45 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 TROP2-발현 암인 용도.
- 제 63 항에 있어서, TROP2-발현 암이 TROP2-과발현 암인 용도.
- 제 45 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 수술불가능성 또는 재발성 암인 용도.
- 제 45 항 내지 제 65 항 중 어느 한 항에 있어서, 항체-약물 접합체가 적어도 하나의 약학적으로 허용가능한 제형 성분을 포함하는 약학 조성물로 투여되는 용도.
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