TW202108180A - 抗體-藥物結合物的調劑 - Google Patents

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井口拓馬
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Abstract

本揭示係關於抗體-藥物結合物(ADC)之醫藥製劑、投劑方案、及投予之領域。更具體而言，ADC係由經由連接子而與抗癌劑(諸如拓樸異構酶I抑制劑)連接之抗滋胚層細胞表面抗原2(TROP2)抗體所構成。

Description

抗體-藥物結合物的調劑
本揭示係關於抗體-藥物結合物(ADC)之醫藥製劑、投劑方案、及投予之領域。更具體而言，ADC係由經由連接子而與拓樸異構酶I(topoisomerase I)抑制劑(諸如依喜替康(exatecan)之衍生物)連接之抗滋胚層細胞表面抗原2(anti-trophoblast cell surface antigen 2，TROP2)抗體所構成。
本申請案根據35 USC§119(e)請求2019年5月29日提出的美國臨時申請案第62/853,970號及2019年9月5日提出的美國臨時申請案第62/896,478號的優先權，其全部內容藉由引用併入本文。
下列討論僅係提供用以幫助讀者了解本揭示，並未容許描述為或構成其現有技術。
滋胚層細胞表面抗原2(TROP2)為Tacstd2基因所編碼的323個胺基酸跨膜醣蛋白。它為一細胞內鈣訊息傳導物(Ripani E, et al., Int. J. Cancer, 76(5), 671-676(1998)，及El Sewedy T, et al., Int. J. Cancer, 75(2), 324-330(1998))，其於許多癌症中差異地表現。它向細胞發出自我更新、增殖、侵襲、及生存的訊息。TROP2另外涉及免疫抗性，其為人類滋胚層和癌細胞所共有(Faulk WP, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.75(4), 1947-1951(1978)，及Lipinski M, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78(8), 5147-5150(1981))。人類TROP2的DNA序列及胺基酸序列可於公共資料庫上取得，例如，於登錄號NM_002353及NP_002344(NCBI)。
與正常上皮細胞中的低水平表現相比，發現TROP2於各種上皮細胞癌中被過度表現。亦有報告TROP2的表現與大腸直腸癌(Ohmachi T, et al., Clin. Cancer Res., 12(10), 3057-3063(2006))、胃癌(Muhlmann G, et al., J. Clin. Pathol., 62(2), 152-158(2009))、胰臟癌(Fong D, et al., Br. J. Cancer, 99(8), 1290-1295(2008))、口腔癌(Fong D, et al., Mod. Pathol., 21(2), 186-191(2008))、及神經膠質瘤(Ning S, et al., Neurol. Sci., 34(10), 1745-1750(2013))等之預後不良相關。使用大腸直腸癌細胞作為模型，進一步報告TROP2的表現涉及腫瘤細胞之不依賴支架的細胞生長以及免疫缺陷小鼠中的腫瘤形成(Wang J, et al., Mol. Cancer Ther., 7(2), 280-285(2008))。
考慮到TROP2與各種類型的癌症的關聯，已製備並研究多種抗TROP2抗體。此等抗體中，有報告：於裸鼠異種移植模型中表現出某些抗腫瘤活性之未結合的抗體(國際專利公開案號WO2008/144891、WO2011/145744、WO2011/155579、及WO2013/077458)，以及顯示抗腫瘤活性之抗體作為抗體-藥物結合物(ADC)(國際專利公開案號WO2003/074566、WO2011/068845、及WO2013/068946，及美國專利號No. 7999083)。然而，迄今抗TROP2抗體及ADC的強度和覆蓋範圍仍不足，仍有利用TROP2作為治療靶標的醫學需求未被滿足。
本揭示提供一種治療各種癌症之TROP2-特異性ADC及其投劑方案。因此，本揭示滿足本領域中靶向TROP2的安全及有效的癌症治療的需求。
迄今為止，靶向TROP2的抗腫瘤抗體尚未成功，且許多抗腫瘤低分子量化合物由於無法接受的副作用和毒性(即使具有優異抗腫瘤效果的化合物)而具有安全性的問題。因此，仍然有達到優異的治療效果並同時提高安全性的需求。如此，本揭示的目的係提供一種具有優異的治療功效及安全性的抗腫瘤藥物。
當抗腫瘤化合物依喜替康，經由連接子結構部分，藉由結合至能夠靶向腫瘤細胞、識別腫瘤細胞、結合於腫瘤細胞、內化至腫瘤細胞內等的抗TROP2抗體，而轉化為抗體-藥物結合物時，可獲得基於抗體的殺細胞活性，且可以更確定地將抗腫瘤化合物遞送至腫瘤細胞以特異性地表現出抗腫瘤效果。如此，可確定地展現抗腫瘤效果，且與單獨投予該化合物相比，可減少抗腫瘤化合物的劑量，其減少對正常細胞的不利副作用並增加安全性。
本文所描述者為包含依喜替康衍生物及抗TROP2抗體的新穎的靶向TROP2的ADC及其使用方法。
於一態樣，本揭示提供一種用於治療或預防癌症之抗TROP2抗體-藥物結合物，該抗體-藥物結合物包含抗TROP2抗體及藉由連接子連接之抗腫瘤化合物。
於另一態樣，本揭示提供一種於受試者中治療或預防癌症之方法，包含對罹患癌症的受試者投予抗TROP2抗體-藥物結合物，該抗TROP2抗體-藥物結合物包含抗TROP2抗體及藉由連接子連接之抗腫瘤化合物。
於另一態樣，本揭示提供一種抗TROP2抗體-藥物結合物之用途，其用於製造用以治療或預防癌症之醫藥，該抗體-藥物結合物包含抗TROP2抗體及藉由連接子連接之抗腫瘤化合物。
於一些實施方式，該連接子及該抗腫瘤化合物以下式表示： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX) 其中-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-具有下式所表示的結構：
Figure 02_image001
其於第3位與抗TROP2抗體連接且於第1位之氮原子上與含此結構的連接子結構內之亞甲基連接，且(NH-DX)表示下式所表示的基：
Figure 02_image003
其中於第1位的胺基之氮原子為連接位。
於一些實施方式，抗TROP2抗體於其重鏈可變區包含由SEQ ID NO：23之胺基酸序列所組成的CDRH1、由SEQ ID NO：24之胺基酸序列所組成的CDRH2及由SEQ ID NO：25之胺基酸序列所組成的CDRH3，並於其輕鏈可變區包含由SEQ ID NO：26之胺基酸序列所組成的CDRL1、由SEQ ID NO：27之胺基酸序列所組成的CDRL2及由SEQ ID NO：28之胺基酸序列所組成的CDRL3。
於一些實施方式，每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數於2至8或3至8的範圍內。於一些實施方式，每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數於3.4至4.5的範圍內。於一些實施方式，每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數為4。
於一些實施方式，抗體包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸1-121的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：46之胺基酸1-109的輕鏈可變區。於一些實施方式，抗體包含：包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈。於一些實施方式，抗TROP2抗體於重鏈之羧基末端缺乏離胺酸殘基。
於一些實施方式，對罹患癌症的受試者投予劑量範圍為2 mg/kg至10 mg/kg之抗體-藥物結合物。於一些實施方式，對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約4 mg/kg。於一些實施方式，對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約6 mg/kg。於一些實施方式，對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約8 mg/kg。
於一些實施方式，藉由靜脈內投予，投予抗體-藥物結合物。
於一些實施方式，每3週一次或每4週一次投予抗體-藥物結合物。
於一些實施方式，癌症係選自由肺癌、腎癌、泌尿上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、及食道癌所組成的群組。於一些實施方式，肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
於一些實施方式，癌症為抗性的或難治的。於一些實施方式，該抗性或難治性係由於以抗癌藥治療而由癌症獲得的抗性或難治性。於一些實施方式，該抗癌藥為EGFR-抑制劑、ALK-抑制劑、鉑系化學治療劑、或檢查點抑制劑。於一些實施方式，該抗癌藥為吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、奧希替尼(osimertinib)、阿法替尼(affatinib)、艾樂替尼(alectinib)、克唑替尼(crizotinib)、色瑞替尼(ceritinib)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、納武利尤單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、度伐鲁單抗(durvalumab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、信迪利單抗(sintilimab)、或西米普利單抗(cemiplimab)。
於一些實施方式，癌症為表現TROP2的癌症。於一些實施方式，表現TROP2的癌症為過度表現TROP2的癌症。於一些實施方式，過度表現TROP2的癌症為於免疫組織化學法中對TROP2的表現給予高分的癌症。於一些實施方式，過度表現TROP2的癌症為於原位雜交法中對TROP2的表現給予高分的癌症。
於一些實施方式，癌症為不宜手術的或復發性的癌症。
此處亦提供醫藥組成物，其含有如前述態樣或實施方式之任一者的抗體-藥物結合物或其鹽作為活性成分、及醫藥上可接受的調配成分。
上述概述及隨後的詳細描述為示例性及說明性且意圖提供所請求的揭示的進一步解釋。由下列圖式簡單說明及本揭示的詳細描述，所屬技術領域中具通常知識者將容易明瞭其他目的、優點、及新穎特徵。
下文，將參考附圖描述新穎的靶向TROP2的ADC之各種實施方式及使用其之方法。提供以下描述的實施方式作為本發明之實施方式的典型例，且並無意圖限制本發明之範圍。
本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物為一種抗腫瘤藥，其中抗TROP2抗體經由連接子結構部分而結合至抗腫瘤化合物，以下詳細說明。 [定義]
應當理解，方法不限於所描述的特定的實施方式，如此因而可加以變化。亦應理解，本文所使用的術語僅為了描述特定的實施方式的目的，並無意進行限制。本技術之範疇僅受限於附加的申請專利範圍。
除非另有定義，否則本文所使用的所有技術及科學用語具有與本發明所屬領域中具有通常知識者通常所理解的相同含義。儘管類似於或等同於本文彼等描述之任何方法及材料亦可以用於實施或測試本發明，但現在描述代表性的說明性方法及材料。
於提供數值範圍時，應理解為，除非上下文另外明確指出，每個中間值至下限單位的十分之一，在該範圍的上限和下限與該範圍內的任何其他所述值或中間值之間，包含於本發明內。此等較小範圍的上限和下限可獨立地被包括於較小範圍內，且亦被包含於本發明內，且受制於所述範圍內的任何明確排除的限制。於所述範圍包括極限值的一個或兩個時，排除彼等所包括的極限值中的一個或兩個的範圍亦被包括於本發明。
如說明書和申請專利範圍所使用，單數形式「一」、「一者」及「該」包括單數和複數形式，除非上下文另外明確指出。
如本文所使用，術語「包含」意圖意指組成物及方法包括所列出的要素，但不排除其他要素。當使用「基本上由…組成」定義組成物及方法時，應意指排除對於組成物或方法有任何重要意義的其他要素。「由...組成」應意指對於所請求的組成物及實質性的方法步驟，排除多於微量元素的其他成分。此等過渡術語中的各者定義的實施方式於本揭示的範疇內。因此，意圖該方法及組成物可包括另外的步驟及組分(包含)或可替代地包括不重要的步驟及組成(基本上由…組成)，或者可替代地僅意圖所述的方法步驟或組成(由…組成)。
如本文所使用，「約」意指正或負10%以及指定的數字。例如，「約10」應理解為「10」及「9-11」兩者。
如本文所使用，「可選擇」或「可選擇地」意指隨後描述的事件或情況可能會或可能不會發生，且該描述包括發生該事件或情況的示例以及未發生該事件或情況的示例。
本文中可交替使用術語「個體」、「受試者」及「病患」，指任何個別哺乳動物，例如牛、犬、貓、馬、猿猴、豬、駱駝科動物、蝙蝠、或人類，根據所揭示的方法或用途進行治療。於較佳實施方式中，該受試者為人類。
如本文所使用，用語「有效量」、「治療有效量」及「治療水平」，指受試者中的劑量或濃度，該劑量或濃度提供於需要此種治療的受試者中給予ADC的特定藥理作用，即治療或預防癌症(例如，肺癌、表現TROP2的癌症、或抗性或難治性癌症)。要強調的是，即使所屬技術領域中具通常知識者認為此種劑量為治療有效量，ADC的治療有效量或治療水平並非總是有效地治療本文所述的癌症。僅為了方便，下面提供示例性劑量、藥物遞送量、治療有效量、及治療水平。所屬技術領域中具通常知識者可根據治療特定受試者及/或病症所需的標準操作而調節此種量。治療有效量可能會基於投予途徑及劑型、受試者之的年齡及體重及/或受試者的病況(包括癌症的類型及嚴重性)而變化。
如本文所使用，關於癌症的術語「治療」或「處理」係指減少、抑制或消除癌症；減少、抑制或消除癌細胞生長；減少、抑制或消除癌症擴散；或引起腫瘤或轉移腫瘤消退或死亡。即使未抑制癌細胞生長及/或該癌症沒有死亡，治療及處理亦可選擇地意指改善受試者的生活品質或總體存活。
如本文所使用，關於癌症的術語「預防」或「防止」係指排除或預防轉移的發生(即，癌症在治療開始時不存在的繼發部位的癌症生長)，以及在受試者達到緩解或癌症/腫瘤被完全破壞或殺死時，排除或預防癌症的復發。
如本文所使用，術語「醫藥組成物」係指活性劑與惰性或活性的載劑(carrier)組合，使得該組成物特別適合於活體內(in vivo )或離體(ex vivo )的診斷或治療用途。
如本文所使用，術語「醫藥上可接受的載劑」係指任何標準藥物載劑，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水溶液、水、乳液(例如，諸如油/水或水/油乳液)，及各種型式的潤濕劑。該組成物亦可包括穩定劑及防腐劑。對於載劑、穩定劑及佐劑的例子，參見，例如，Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15th Ed., Mack Publ. Co., Easton, PA [1975]。
如本文所使用，用語「腸胃外投予」及「腸胃外地投予」指除腸內和局部投予以外的投予模式，通常藉由注射投予，包括但不限於靜脈內、肌肉內、動脈內、鞘內、囊內、眶內、心內、皮內、腹腔內、經氣管、皮下、表皮下、關節內、包膜下、蛛網膜下腔、脊椎內及胸骨內注射及輸注。
如本文所使用，用語「全身性投予」、「全身性地投予」、「末梢投予」 及「末梢地投予」係指將化合物、藥物或其他物質直接投予至中樞神經系統，如此其進入病患的全身，從而經受新陳代謝及其他類似過程，該投予例如皮下投予。
如本文所使用，術語「基因」不僅包括DNA，亦包括其mRNA、其cDNA、及其cRNA。
如本文所使用，術語「多核苷酸」以與核酸相同的意義使用，且亦包括DNA、RNA、探針、寡核苷酸及引子。
如本文所使用，術語「多肽」及「蛋白質」無區別而使用。
如本文所使用，術語「細胞」亦包括於動物個體中的細胞及經培養的細胞。
如本文所使用，術語「TROP2」以與TROP2蛋白質相同的意義使用。
如本文所使用，術語「CDR」指互補決定區(CDR)。已知抗體分子的每條重鏈和輕鏈具有三個互補決定區(CDR)。該CDR亦被稱為高度變異區，且存在於抗體之每個重鏈及輕鏈的可變區中。其為在其一級結構中具有異常高的變異性的位點，且於每條重及輕多肽鏈的一級結構中有三個分離的CDR。於此說明書，關於抗體的CDR，由重鏈之胺基酸序列的胺基末端側起，重鏈之CDR以CDRH1、CDRH2、及CDRH3表示，且由輕鏈之胺基酸序列的胺基末端側起，輕鏈之CDR以CDRL1、CDRL2、及CDRL3表示。此等位點於三級結構中彼此相鄰，並決定抗體對結合的抗原的特異性。
如本文所使用，用語「於嚴格條件下雜交」係指可藉由於市售雜交溶液ExpressHyb Hybridization Solution(由Clontech, Inc.製造)中，於68°C進行雜交，或使用固定有DNA的濾紙，於0.7-1.0M之NaCl存在下、於68℃進行雜交後，使用0.1-2倍濃度之SSC溶液(1xSSC溶液由150mM NaCl和15mM檸檬酸鈉組成)，於68°C進行洗滌，而達成鑑定的條件下或與其等效的條件下進行雜交的過程。
如本文所使用，術語「數個」係指1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3、或1至2。
作為本說明書中的胺基酸取代，較佳為保守性胺基酸取代。該保守性胺基酸取代係指取代發生於與胺基酸側鏈相關的胺基酸群組內中。較佳的胺基酸群組如下：酸性群組(天冬胺酸及麩胺酸)；鹼性群組(離胺酸、精胺酸、及組胺酸)；非極性群組(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、及色胺酸)；及未帶電極性家族(甘胺酸、天冬醯胺酸、麩醯胺酸、半胱胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、及酪胺酸)。更佳的胺基酸群組如下：脂肪族羥基群組(絲胺酸及蘇胺酸)；含醯胺基的群組(天冬醯胺酸及麩醯胺酸)；脂肪族群組(丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、及異白胺酸)；及芳香族群組(苯丙胺酸、色胺酸、及酪胺酸)。此種胺基酸取代較佳於不損害具有原始胺基酸序列的物質的特性的範圍內進行。
在整個說明中，組成物被描述為具有、包括或包含特定組分時，或在製程及方法中被描述為具有、包括或包含特定步驟時，另外，預期有本揭示之組成物基本上由所列舉的組分組成或由所列舉的組分組成，且有根據本揭示之製程及方法基本上由所列舉的加工步驟組成或由所列舉的加工步驟組成。
通常，除非另有說明，指定百分比的組成物以重量計，除非另有指明。再者，若變量未伴隨定義，則以變量控制的先前定義。 [TROP2]
TROP2係於人類滋胚層表現的TACSTD家族之一者，為涉及人類滋胚層及癌細胞共通的免疫抵抗性之1次跨膜型之1型細胞膜蛋白質。
為了本揭示之目的，TROP2蛋白質可直接純化自人類或非人類哺乳動物(諸如大鼠或小鼠)之表現TROP2的細胞及使用，或可製備及使用上述細胞的細胞膜劃分(fraction)。又，可通過基因工程藉由將其於宿主細胞中活體外合成或生產而獲得TROP2。於此基因工程，具體而言，將TROP2 cDNA整合至能夠表現TROP2 cDNA的載體中後，可藉由在含有轉錄及轉譯所需的酶、受質及能量物質的溶液中合成TROP2蛋白質而獲得TROP2蛋白質，或者藉由在另一原核或真核轉形的宿主細胞中表現TROP2。或者，表現上述基因工程化的TROP2的細胞或表現TROP2的細胞株可用於作為TROP2蛋白質。
TROP2之DNA序列及胺基酸序列可於公開資料庫取得且可參照例如存取編號NM_002353及NP_002344(NCBI)。
再者，TROP2之上述胺基酸序列之任一者其中一或數個胺基酸被取代、刪除及/或添加的胺基酸序所構成的蛋白質且亦具有與該蛋白質相等生物活性者亦包括於TROP2。
人類TROP2蛋白質包含由N端26個胺基酸殘基所構成的訊息序列、由248個胺基酸殘基所構成的細胞外域、由23個胺基酸殘基所構成的跨膜域、及由26個胺基酸殘基所構成的細胞內域。 [抗TROP2抗體]
用於本揭示之抗TROP2抗體-藥物結合物中的抗TROP2抗體可衍生自任何物種，該物種之較佳例可包括人類、大鼠、小鼠、及兔。於當衍生自人類物種以外的情形，其較佳為使用熟知技術而嵌合化或人源化。本發明之抗體可為多株抗體或單株抗體且較佳為單株抗體。
抗TROP2抗體能夠靶向腫瘤細胞、能夠辨識腫瘤細胞、能夠與腫瘤細胞結合、能夠內化至腫瘤細胞等，且可經由連接子結合至具有抗腫瘤活性之化合物而被轉化成抗體-藥物結合物。
該抗體抗腫瘤細胞之結合活性可使用流動式細胞測量術(flow cytometry)而確認。確認抗體內化至腫瘤細胞中之方法之例可包括：(1)使用與治療抗體結合的二次抗體(經螢光標記)而於螢光顯微鏡下可視化併入細胞中的抗體之試驗(Cell Death and Differentiation(2008)15, 751-761)；(2)使用與治療抗體結合的二次抗體(經螢光標記)而測量併入細胞內的螢光量的試驗(Molecular Biology of the Cell, Vol. 15, 5268-5282, December 2004)；或(3)使用與治療抗體結合的免疫毒素，其中於被併入細胞內時毒素被釋放而抑制細胞生長的Mab-ZAP試驗(Bio Techniques 28：162-165, January 2000)。可使用白喉毒素之觸媒區與蛋白質G之重組複合蛋白質作為免疫毒素。
因為結合於抗體-藥物結合物中的藥物發揮抗腫瘤效果，所以抗體本身不必須但較佳具有抗腫瘤效果。為了於腫瘤細胞上特異性地及選擇性地發揮抗腫瘤化合物的殺細胞活性，重要且為較佳的是抗體應具有內化而遷移到腫瘤細胞中的特性。
可使用於此領域中通常實施的方法而獲得抗TROP2抗體，該方法涉及以抗原性多肽免疫動物並收集及純化活體內產生的抗體。抗原之來源並未限於人類，且可以衍生自諸如小鼠、大鼠等的非人類動物的抗原而將動物免疫。於此情形，可測試抗體結合至獲得的異源抗原與人類抗源之交叉反應性以篩選出可適用於人類疾病的抗體。
或者，依據此領域中已知方法(例如，Kohler and Milstein, Nature(1975)256, p. 495-497；及Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, p. 365-367, Plenum Press, N.Y.(1980))，將產生抗抗原的抗體之產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞融合而建立融合瘤，因而可自其中獲得單株抗體。
抗原可藉由基因工程宿主細胞以產生編碼抗原蛋白質的基因而獲得。具體而言，製備允許表現抗原基因的載體並轉移至宿主細胞因而使該基因被表現。可純化因而表現的抗原。亦可使用藉由上述之經基因工程化的表現抗原的細胞或表現抗原的細胞株對動物免疫的方法而獲得抗體。
可藉由此領域中周知之程序獲得抗TROP2抗體。
可用於本發明之抗TROP2抗體並未特別限制，例如，較佳可使用彼等本案之序列表所示的胺基酸序列所特定者。本發明中使用的抗TROP2抗體較佳具有下述特性。 (1)一種具有下列特性之抗體： (a)特異性結合至TROP2，及 (b)具有藉由與TROP2結合而內化於表現TROP2的細胞中的活性。 (2)如(1)之抗體，其中TROP2為人類TROP2。 (3)如(1)或(2)之抗體，其中抗體具有SEQ ID NO：45之重鏈的互補決定區(CDR)H1、CDRH2、及CDRH3，及/或SEQ ID NO：46之輕鏈的CDRL1、CDRL2、及CDRL3。或者或另外地，如(1)或(2)之抗體，其中該抗體具有作為重鏈互補決定區之包含SEQ ID NO：23所表示的胺基酸序列之CDRH1、包含SEQ ID NO：24所表示的胺基酸序列之CDRH2、及包含SEQ ID NO：25所表示的胺基酸序列之CDRH3，及作為輕鏈互補決定區之包含SEQ ID NO：26所表示的胺基酸序列之CDRL1、包含SEQ ID NO：27所表示的胺基酸序列之CDRL2、及包含SEQ ID NO：28所表示的胺基酸序列之CDRL3。 (4)如(1)至(3)中任一項之抗體，其中其恒定區為人類衍生的恒定區。 (5)如(1)至(4)中任一項之抗體，其中該抗體為人源化抗體。 (6)如(5)之抗體，其中該抗體具有：包含選自由下列所組成的群組之胺基酸序列的重鏈可變區：(a)述於SEQ ID NO：45中胺基酸位置1至121的胺基酸序列，(b)具有與(a)至少95%以上同源性之胺基酸序列，及(c)由序列(a)或(b)任一者經至少一個胺基酸之刪除、置換或添加所衍生的胺基酸序列，及含選自由下列所組成的群組之胺基酸序列的輕鏈可變區：(d)述於SEQ ID NO：46中胺基酸位置1至109的胺基酸序列，(e)具有與(d)至少95%以上同源性之胺基酸序列，及(f)由序列(d)或(e)任一者經至少一個胺基酸之刪除、置換或添加所衍生的胺基酸序列。或者或另外地，如(5)之抗體，其中該抗體具有：包含選自由下列所組成的群組之胺基酸序列的重鏈可變區：(a)述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至140的胺基酸序列，(b)述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至140的胺基酸序列，(c)述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至140的胺基酸序列，(d)具有與序列(a)至(c)之任一者至少95%以上同源性之胺基酸序列，及(e)由序列(a)至(c)之任一者經至少一個胺基酸之刪除、置換或添加所衍生的胺基酸序列；及包含選自由下列所組成的群組之胺基酸序列的輕鏈可變區：(f)述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至129的胺基酸序列，(g)述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至129的胺基酸序列，(h)述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至129的胺基酸序列，(i)具有與序列(f)至(h)之任一者至少95%以上同源性之胺基酸序列，及(j)由序列(f)至(h)之任一者經至少一個胺基酸之刪除、置換或添加所衍生的胺基酸序列。 (7)如(6)之抗體，其中該抗體具有：包含述於SEQ ID NO：45中胺基酸位置1至121的胺基酸序列之重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：46中胺基酸位置1至109的胺基酸序列之輕鏈可變區。或者或另外地，如(6)之抗體，其中該抗體具有重鏈可變區及輕鏈可變區，其選自由下列組成的群組：包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，及包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區。 (8)如(7)之抗體，其中該抗體具有重鏈可變區及輕鏈可變區，其選自由下列組成的群組：包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區，及包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至140的胺基酸序列的重鏈可變區及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至129的胺基酸序列的輕鏈可變區。 (9)如(6)或(7)之抗體，其中該抗體包含：包含述於SEQ ID NO：45中胺基酸位置1至451的胺基酸序列之重鏈及包含述於SEQ ID NO：46中胺基酸位置1至214的胺基酸序列之輕鏈。或者或另外地，如(6)或(7)之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其選自由下列組成的群組：包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈。 (10)如(6)或(7)之抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO：45所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：46所表示的胺基酸序列的輕鏈。或者或另外地，如(6)或(7)之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其選自由下列組成的群組：包含SEQ ID NO：12所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：18所表示的胺基酸序列的輕鏈，包含SEQ ID NO：12所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：20所表示的胺基酸序列的輕鏈，包含SEQ ID NO：12所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：22所表示的胺基酸序列的輕鏈，包含SEQ ID NO：14所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：18所表示的胺基酸序列的輕鏈，包含SEQ ID NO：14所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：20所表示的胺基酸序列的輕鏈，包含SEQ ID NO：14所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：22所表示的胺基酸序列的輕鏈，包含SEQ ID NO：16所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：18所表示的胺基酸序列的輕鏈，包含SEQ ID NO：16所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：20所表示的胺基酸序列的輕鏈，及包含SEQ ID NO：16所表示的胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：22所表示的胺基酸序列的輕鏈。 (11)如(8)之抗體，其中該抗體包含重鏈及輕鏈，其選自由下列組成的群組：包含述於SEQ ID NO：12中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：18中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，包含述於SEQ ID NO：14中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：20中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈，及包含述於SEQ ID NO：16中胺基酸位置20至470的胺基酸序列的重鏈及包含述於SEQ ID NO：22中胺基酸位置21至234的胺基酸序列的輕鏈。 (12)如(1)至(11)中任一項之抗體，其中該抗體於重鏈之羧基末端缺乏離胺酸殘基。 (13)一種藉由生產如(1)至(12)中任一項之抗體的方法所獲得的抗體，該方法包含下列步驟：培養以表現載體轉形的宿主細胞，該表現載體含有編碼該抗體之多核苷酸；及自前述步驟獲得的培養物收集感興趣的該抗體。
為了本揭示之目的，SEQ ID NOs：45及46之完整序列示於下表1(以及圖2)。表 1– 示例性的抗 TROP2 抗體之重鏈及輕鏈胺基酸序列
SEQ ID NO： 胺基酸序列
45 QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
46 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
[抗TROP2抗體之生產]
本發明之針對TROP2之抗體可使用本領域中通常進行的方法而得到，該方法涉及以TROP2或選自TROP2的胺基酸序列的任意多肽對動物免疫，並收集及純化活體內產生的抗體。使用作為抗原的TROP2的生物種類不限於人類，且可以用源自人類以外的動物諸如小鼠或大鼠的TROP2對動物免疫。於此情況，藉由檢查與獲得的異源TROP2結合的抗體與人類TROP2之間的交叉反應性，可選擇適用於人類疾病的抗體。
再者，單株抗體可自融合瘤獲得，該融合瘤係依據已知方法(例如，Kohler and Milstein, Nature,(1975)256, pp. 495-497；Kennet, R. ed., Monoclonal Antibodies, pp. 365-367, Plenum Press, N.Y.(1980))，由融合一個以上產生抗體的細胞(產生針對TROP2之抗體)與骨髓瘤細胞而建立。
可以藉由使用基因工程於宿主細胞中表現TROP2基因而獲得使用作為抗原的TROP2。具體而言，可生產能夠表現TROP2基因的載體，並可將所生成的載體轉染到宿主細胞中以表現該基因，然後可純化表現的TROP2。
或者，可使用上述經基因工程的表現TROP2的細胞或表現TROP2的細胞株作為TROP2蛋白質。下文中，具體描述獲得針對TROP2的抗體之方法。
(1)抗原之製備
用於產生抗TROP2抗體的抗原之例包括TROP2，或由包含TROP2之至少6個連續的胺基酸的部分胺基酸序列所組成的多肽，或藉由對其添加指定胺基酸序列或載體而獲得的衍生物。
可直接從人類腫瘤組織或腫瘤細胞純化及使用TROP2。再者，TROP2可藉由於活體外合成或藉由基因工程於宿主細胞中生產而獲得。
關於基因工程，具體而言，將TROP2 cDNA整合至能表現TROP2 cDNA的載體中後，藉由在包含轉錄與轉譯所需的酶、受質及能量物質的溶液中合成抗原而獲得，或藉由於另一原核或真核轉形宿主細胞中表現TROP2，而可獲得抗原。
再者，亦可藉由於適當宿主-載體系統中表現自將為膜蛋白質之TROP2的細胞外域連結至抗體的恒定區而獲得的融合蛋白，而獲得呈分泌蛋白的抗原。
TROP2 cDNA可藉由例如所謂的PCR方法而獲得，其中聚合酶鏈反應(下文稱為「PCR」；參見Saiki, R. K., et al., Science,(1988)239, pp. 487-489)係使用表現TROP2 cDNA的cDNA庫作為模板及特異性擴增TROP2 cDNA的引子進行。
作為多肽之活體外合成，例如，可列舉由Roche Diagnostics, Inc.製造的Rapid Translation System(RTS)，但未限定於此。
原核宿主細胞之例包括大腸桿菌(Escherichia coli )及枯草桿菌(Bacillus subtilis )。為了以目標基因轉形宿主細胞，以質體載體轉形宿主細胞，該質體載體包含：衍生自能與宿主相容的物種的複製子，即複製起點，以及調控序列。此外，載體較佳具有能夠於經轉形的細胞上施加表型選擇性的序列。
真核宿主細胞包括脊椎動物細胞、昆蟲細胞、及酵母細胞。作為脊椎動物細胞，經常使用例如，猿猴COS細胞(Gluzman, Y., Cell,(1981)23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650; ATCC：美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection))、鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)、及中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞；ATCC：CCL-61)之缺乏二氫葉酸還原酶的菌株(Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980)77, pp. 4126-4220)等；但細胞未限定於此。
可依據本領域中通常進行的方法培養如此獲得的轉形體，並藉由培養該轉形體，於細胞內或細胞外產生目標多肽。
所屬技術領域中具通常知識者可依所運用的宿主細胞而自各種常用的培養基中選擇適合用於培養的培養基。若運用大腸桿菌，例如，可視需要而使用補充有抗生素例諸如胺苄青黴素(ampicillin)或IPMG的LB培養基。
可藉由任何已知之利用蛋白質的物理或化學性質的分離方法而分離及純化由轉形體通過此種培養在細胞內或細胞外產生的重組蛋白質。
該方法之具體例包括以通常的蛋白質沉澱劑處理、超濾、各種類型之液相層析(諸如分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、及親和力層析)、透析法、及其組合。
此外，藉由將六個組胺酸殘基的標籤附著到待表現的重組蛋白質，可用鎳親和管柱而有效地純化該蛋白質。或者，藉由將IgG Fc區附著到待表現的重組蛋白質上，可用蛋白質A管柱而有效地純化該蛋白質。
藉由組合上述方法，可容易地以高產率及高純度生產大量的目標多肽。
上述轉形體本身亦可以使用作為抗原。或者，可使用表現TROP2的細胞株作為抗原。此種細胞株之例可包括人類肺癌株NCI-H322、PC14、NCIH-H2122、及LCAM1；人類前列腺癌株PC3、人類胰臟癌株BxPC-3、Capan-1和PK-1；人類卵巢癌細胞株SKOV3；及人類結腸直腸癌株COLO205，但根據本發明之細胞株並未限定於此等細胞株，只要表現TROP2即可。
(2)抗TROP2單株抗體之生產
與TROP2特異性結合的抗體之例包括與TROP2特異性結合的單株抗體，於下文描述獲得此種抗體之方法。
單株抗體之生產一般要求下列操作步驟： (a)純化使用作為抗原之生物聚合物，或製備抗原表現細胞； (b)藉由抗原之注射而對動物進行免疫，收集血液，分析其抗體力價以決定何時切除脾臟，而製備產生抗體的細胞； (c)製備骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)； (d)融合產生抗體的細胞與骨髓瘤； (e)篩選產生所欲抗體之融合瘤群； (f)分割融合瘤成單一細胞殖株(選殖)； (g)可選擇地，培養融合瘤或飼育植入融合瘤的動物以生產大量單株抗體； (h)檢查如此產生的單株抗體的生物學活性及結合特異性，或測定其作為標記試劑的性質；等等。
以下，依上列步驟而詳細描述生產單株抗體之方法，然而，該方法並未限定於此，例如，可使用脾臟細胞及骨髓瘤以外的產生抗體的細胞。
(a)抗原之純化
就抗原而言，可使用如前述方法所製備的TROP2或其部分肽。
又，亦可使用由表現TROP2的重組細胞所製備的膜劃分、或表現TROP2的重組細胞本身、以及亦可藉由所屬技術領域中具通常知識者已知方法進行化學合成而得之本發明之蛋白質的部分肽作為抗原。
再者，亦可使用表現TROP2的細胞株作為抗原。
(b)產生抗體的細胞之製備
將步驟(a)所獲得的抗原、與諸如弗氏完全或不完全佐劑之佐劑、或諸如硫酸鋁鉀的輔助劑混合，並使用生成的混合物作為免疫原以免疫實驗動物。於另一種方法中，以表現抗原的細胞作為免疫原對實驗動物進行免疫。作為實驗動物，可以無障礙地使用已知的融合瘤生產方法中使用的任何動物。具體而言，例如可使用小鼠、大鼠、山羊、綿羊、牛、馬等。然而，由與摘取的產生抗體的細胞融合的骨髓瘤細胞之取得容易性等之觀點，較佳使用小鼠或大鼠作為要被免疫的動物。
又，使用的小鼠及大鼠之品系並未特別限制，於小鼠的情形，例如，可使用各種品系諸如A、AKR、BALB/c、BDP、BA、CE、C3H、57BL、C57BL、C57L、DBA、FL、HTH、HT1、LP、NZB、NZW、RF、R III、SJL、SWR、WB、及129等，於大鼠的情形，例如，可使用Wistar、Low、Lewis、Sprague、Dawley、ACI、BN、Fischer等。
此等小鼠及大鼠可獲自實驗動物飼育者/分銷商，例如CLEA Japan, Inc.、及Charles River Laboratories Japan, Inc.。
考量與下述的骨髓瘤細胞融合的相容性，作為被免疫的動物，於小鼠的情形，特佳為BALB/c品系，於大鼠的情形，特佳為Wistar及Low品系。
此外，考量人類與小鼠之間的抗原同源性，亦較佳使用去除自體抗體之具有生物學功能降低的小鼠，即，患有自體免疫疾病的小鼠。
此種小鼠或大鼠於免疫時的年齡較佳為5至12週齡，更佳為6至8週齡。
為了以TROP2或其重組體免疫動物，可使用例如，詳細描述之已知方法，例如，Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford(1987)；Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher Springfield, Illinois(1964)等。
於此等免疫方法中，本發明中較佳的具體方法例如以下。
即，首先，將作為抗原的膜蛋白質劃分或引起表現抗原的細胞對動物皮內或腹腔內投予。然而，為了提高免疫效率，較佳組合兩投予途徑，且在前半部分進行皮內投予而後半部分或僅在最後一次投藥時進行腹腔內投予，可以特別提高免疫效率。
抗原之投予時間表取決於被免疫動物之種類、個體差異等。然而，一般而言，較佳為如下投予時間表：抗原投予頻率為3至6次及投藥間隔為2至6週；且更佳為如下投予時間表：抗原投予頻率為3至4次及投藥間隔為2至4週。
又，抗原之劑量取決於動物之種類、個體差異等，然而，劑量一般設為0.05至5 mg，較佳約0.1至0.5 mg。
加強免疫(booster immunization)於投予如上述抗原後1至6週進行，較佳為1至4週，更佳為1至3週。當免疫原為細胞時，使用1×106 至1×107 個細胞。
於進行加強免疫時的抗原劑量依動物之種類或大小等而異，然而，例如，於小鼠的情形，劑量一般設為0.05至5mg，較佳為0.1至0.5mg，更佳為約0.1至0.2mg。當免疫原為細胞時，使用1×106 至1×107 個細胞。
於加強免疫後1至10日，較佳為2至5日，更佳為2至3日後，自被免疫動物無菌地取出包括產生抗體的細胞之脾臟細胞或淋巴球。於此時，測量抗體力價，且若使用具有充分提高的抗體力價的動物作為產生抗體的細胞的供應源，則可更有效地進行後續的程序。
此處使用的測量抗體力價的方法之例包括RIA法及ELISA法，但該方法未限於此。例如，若利用ELISA法，則本發明中抗體力價的測定可依照下述的程序進行。
首先，將純化或部分純化的抗原吸附於ELISA用96孔盤等之固相表面，並將無抗原吸附的固相表面以與抗原無關係的蛋白質(諸如牛血清白蛋白(BSA))覆蓋。將表面洗淨後，使與作為一級抗體之連續稀釋的樣品(例如，小鼠血清)接觸，使樣品中的抗體與抗原結合。
再者，作為二級抗體，添加經酵素標記的針對小鼠抗體的抗體並使其與小鼠抗體結合。洗淨後，添加該酵素之基質，測量由於基質分解引起的顯色發生而吸光度變化等，並基於此測量算出抗體力價。
可依據周知方法(例如，Kohler et al., Nature(1975), 256, p. 495；Kohler et al., Eur. J. Immunol.(1977), 6, p. 511；Milstein et al., Nature(1977), 266, p. 550；Walsh, Nature(1977), 266, p. 495)進行由被免疫動物的脾臓細胞或淋巴球分離產生抗體的細胞。例如，於脾臓細胞之情形，可運用一般方法，其中藉由將脾臟均一化，通過不銹鋼網過濾而得到細胞，並將該細胞懸浮於伊格爾(Eagle)氏最低必需培養基(Minimum Essential Medium，MEM)中，以分離出產生抗體的細胞。
(c)骨髓瘤細胞(以下稱為「骨髓瘤」)之製備
用於細胞融合的骨髓瘤細胞未特別限制且可由已知細胞株選擇適合的細胞。然而，考量當由融合的細胞選擇融合瘤之便利性，較佳使用其選擇程序已被建立的HGPRT(次黃嘌呤鳥糞嘌呤磷酸核糖基轉移酶(hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase))缺損株。
更具體而言，HGPRT-缺損株之例包括衍生自小鼠的X63-Ag8(X63)、NS1-ANS/1(NS1)、P3X63-Ag8.U1(P3U1)、X63-Ag8.653(X63.653)、SP2/0-Ag14(SP2/0)、MPC11-45.6TG1.7(45.6TG)、FO、S149/5XXO、及BU.1；衍生自大鼠的210.RSY3.Ag.1.2.3(Y3)；及衍生自人類的U266AR(SKO-007)、GM1500⋅GTG-A12(GM1500)、UC729-6、LICR-LOW-HMy2(HMy2)及8226AR/NIP4-1(NP41)。此等HGPRT-缺損株可自例如，ATCC等取得。
此等細胞株於適當培養基諸如8-氮鳥嘌呤培養基(於RPMI-1640培養基中添加麩醯胺酸、2-巰基乙醇、健他黴素(gentamycin)、及胎牛血清(以下稱為「FBS」)的培養基中添加8-氮鳥嘌呤的培養基)、伊斯科夫氏修飾杜爾貝科氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、或杜爾貝科氏修飾弋果氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；DMEM)繼代培養。於此情形，在進行細胞融合前3至4日，於正常培養基(例如，含10% FCS的ASF104培養基(由Ajinomoto Co., Ltd.製造))中繼代培養細胞，確保於細胞融合當日不少於2 x 107 個細胞。
(d)細胞融合
產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞間的融合可依據已知方法(Weir, D. M. Handbook of Experimental Immunology Vol. I. II. III., Blackwell Scientific Publications, Oxford(1987)；Kabat, E. A. and Mayer, M. M., Experimental Immunochemistry, Charles C Thomas Publisher, Springfield, Illinois(1964), etc.)，於不極度降低細胞的生存率的程度的條件下適當地進行。
就如此方法而言，可使用例如，於含有高濃度聚合物如聚乙二醇等之溶液中將產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞混合的化學法、使用電刺激的物理法等。此等方法中，化學法之具體例描述如下。
即，於含有高濃度聚合物的溶液中使用聚乙二醇的情形，於具有分子量1500至6000、更佳為2000至4000之聚乙二醇之溶液中，於溫度30至40℃、較佳為35至38℃下，將產生抗體的細胞與骨髓瘤細胞進行1至10分鐘、較佳為5至8分鐘混合。
(e)融合瘤群之選擇
選擇藉由上述細胞融合獲得的融合瘤之方法並未特別限制。通常，使用HAT(次黃嘌呤、胺基喋呤、胸腺嘧啶)選擇法(Kohler et al., Nature(1975), 256, p. 495；Milstein et al., Nature(1977), 266, p. 550)。
當使用於胺基喋呤中無法生存的HGPRT缺損株之骨髓瘤細胞而獲得融合瘤時，此方法為有效的。即，藉由將未融合細胞及融合瘤培養於HAT培養基，選擇性僅使具有對胺基喋呤有抗性的融合瘤存活，且可使增殖。
(f)分割成單一細胞殖株(選殖)
就融合瘤之選殖法而言，可使用已知方法，諸如甲基纖維素法、軟瓊脂糖法、或臨界稀釋法(參照例如，Barbara, B. M. and Stanley, M. S.：Selected Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Company, San Francisco(1980))。此等之方法中，尤其是三維培養法為較佳，諸如甲基纖維素法。例如，將藉由細胞融合所生產的融合瘤群懸浮於甲基纖維素培養基諸如ClonaCell-HY Selection Medium D(StemCell Technologies, Inc.製, #03804)並培養。然後，收集形成的融合瘤群落，因而可獲得單株融合瘤。培養所收集的各別融合瘤群落，選擇於獲得的融合瘤培養上清液中確認融合瘤具有穩定的抗體力價者作為產生TROP2單株抗體的融合瘤株。
如此樹立的融合瘤株之例包括TROP2融合瘤TINA1。於此說明書，將TROP2融合瘤TINA1所產生的抗體稱為「TINA1抗體」或僅稱為「TINA1」。
TINA1抗體之重鏈可變區具有序列表中SEQ ID NO：2所示的胺基酸序列。又，TINA1抗體之輕鏈可變區具有序列表中SEQ ID NO：4所示的胺基酸序列。
(g)藉由培養融合瘤之單株抗體的製備
藉由培養如此選擇的融合瘤，可有效地獲得單株抗體。然而，較佳於培養之前，篩選產生目的單株抗體的融合瘤。
於此種篩選，可運用已知方法。
於本發明中抗體力價之測量可藉由例如，上述(b)之項目中說明的ELISA法而進行。
藉由上述方法所獲得的融合瘤可以凍結狀態下儲存於液體氮中或-80℃以下之冷凍庫中。
完成選殖後，將培養基由HT培養基換成正常培養基，並培養該融合瘤。
大規模培養藉由使用大型培養瓶的旋轉培養、或旋轉器(spinner)培養而進行。自此大量培養獲得的上清液，藉由使用諸如凝膠過濾之所屬技術領域中具通常知識者所周知之方法純化，可獲得與本發明之蛋白質特異性結合的單株抗體。
又，將融合瘤注射至與融合瘤相同品系小鼠(例如，上述BALB/c)或Nu/Nu小鼠的腹腔中以增殖融合瘤，因而可獲得含有大量本發明之單株抗體的腹水。
於將融合瘤投予至腹腔的情形，若於事先(3~7日前)投予礦物油[諸如2,6,10,14-四甲基十五烷(2,6,10,14-tetramethylpentadecane；姥鮫烷(pristane))]，可獲得大量之腹水。
例如，於與融合瘤同品系的小鼠腹腔內預先注射免疫抑制劑以使T細胞失活。20日之後，使106 ~107 個融合瘤・選殖細胞懸浮於不含血清的培養基(0.5 ml)，並將此懸浮液投予至小鼠腹腔中。一般而言，當腹腔膨滿並充滿腹水時，自小鼠收集腹水。藉由此方法，可獲得單株抗體的濃度係高於培養液的約100倍以上。
藉由上述方法獲得的單株抗體可藉由述於下列之方法純化，例如，Weir, D. M.：Handbook of Experimental Immunology Vol. I, II, III, Blackwell Scientific Publications, Oxford(1978)。
如此獲得的單株抗體具有對TROP2之高抗原特異性。
(h)單株抗體之試驗
如下列所述可確認如此獲得的單株抗體之同型及亞型。
首先，鑑定法之例包括歐氏雙向擴散(Ouchterlony)法、ELISA法、或RIA法。
Ouchterlony法為簡便，但當單株抗體之濃度低時，需要濃縮操作。
另一方面，當使用ELISA法或RIA法時，藉由使培養上清液直接與抗原吸附固相反應，並使用對應免疫球蛋白同型及亞型之各種型式作為二次抗體，可鑑定單株抗體之同型及亞型。
此外，就更簡便的方法而言，亦可使用市售之鑑定用之套組(例如，由Bio-Rad Laboratories, Inc.製造的Mouse Typer Kit)等。
再者，蛋白質之定量可藉由Folin Lowry法及基於280nm中的吸光度(1.4(OD280)＝免疫球蛋白1mg/ml)計算的方法而進行。
再者，藉由再次進行(2)中(a)至(h)之步驟即使當分別及獨立獲得單株抗體，亦可能獲得具有與TINA1抗體相同細胞毒性活性的抗體或含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體。就此種抗體之一例而言有結合於與TINA1抗體相同之抗原決定位的抗體或含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體。若新產生的單株抗體與TINA1抗體或含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體結合的部分肽或部分三級結構，則可以確定單株抗體結合於相同的抗原決定位。又，藉由確認單株抗體與TINA1抗體或含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體競爭對於TROP2之結合(即，該單株抗體抑制TINA1抗體或含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體與TROP2之結合)，即使未決定具體的抗原決定位序列或結構，亦可決定該單株抗體結合至與抗TROP2抗體相同之抗原決定位。當其被確認該單株抗體結合至與抗TROP2抗體相同的抗原決定位，該單株抗體被強烈預期具有相等於TINA1抗體或含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體之抗原-結合親和力及生物活性。
(3)其他抗體
本發明之抗體不僅包括上述針對TROP2的單株抗體，亦包括以使對人類的異源抗原性降低為目的而藉由人工修飾獲得的重組抗體，諸如嵌合抗體、人源化抗體及人類抗體。可使用已知方法生產此等抗體。
就嵌合抗體而言，可例示：抗體可變區及恒定區為衍生自不同物種的抗體，例如，將來自小鼠或大鼠的抗體可變區的抗體與來自人類的抗體恒定區結合的嵌合抗體(參見Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 6851-6855,(1984))。
就人源化抗體而言，可例示：藉由僅將互補決定區(CDR)併入來自人類的抗體所獲得的抗體(see Nature(1986)321, pp. 522-525)、及藉由CDR移植法而藉由接枝框架之胺基酸殘基的一部分以及CDR序列至人類抗體所獲得的抗體(國際公開WO 90/07861)。
然而，來自TINA1抗體之人源化抗體並未限定於特定之人源化抗體，只要該人源化抗體具有TINA1抗體之所有6種CDR序列即可。TINA1抗體之重鏈可變區具有：由序列表中SEQ ID NO：23所示的胺基酸序列所構成的CDRH1(TAGMQ)、由序列表中SEQ ID NO：24所示的胺基酸序列所構成的CDRH2(WINTHSGVPKYAEDFKG)、及由序列表中SEQ ID NO：25所示的胺基酸序列所構成的CDRH3(SGFGSSYWYFDV)。又，TINA1抗體之輕鏈可變區具有：由序列表中SEQ ID NO：26所示的胺基酸序列所構成的CDRL1(KASQDVSTAVA)、由序列表中SEQ ID NO：27所示的胺基酸序列所構成的CDRL2(SASYRYT)、及由序列表中SEQ ID NO：28所示的胺基酸序列所構成的CDRL3(QQHYITPLT)。
就小鼠抗體TINA1之人源化抗體之例而言，可例示下列重鏈及輕鏈之任意組合，該重鏈包含由(1)由序列表中SEQ ID NO：12、14、或16之胺基酸殘基20至140或SEQ ID NO：45之胺基酸殘基1-121所構成的胺基酸序列，(2)具有與上述胺基酸序列(1)至少95%以上同源性的胺基酸序列，及(3)於上述(1)之胺基酸序列中有一或數個之胺基酸經刪除、取代或添加的胺基酸序列中任一者構成的重鏈可變區；及該輕鏈包含由(4)由序列表中SEQ ID NO：18、20、或22之胺基酸殘基21至129或SEQ ID NO：46之胺基酸殘基1-109所構成的胺基酸序列，(5)具有與上述胺基酸序列(4)至少95%以上同源性的胺基酸序列，及(6)於上述(4)之胺基酸序列中有一或數個之胺基酸經刪除、取代或添加的胺基酸序列中任一者構成的輕鏈可變區。
作為具有上述重鏈及輕鏈之較佳組合的抗體，可列舉：包含含有包含SEQ ID NO：45之胺基酸1-121的可變區的重鏈及含有包含SEQ ID NO：46之胺基酸1-109的可變區的輕鏈的抗體；由包含由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；及由包含由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體。
再者，就具有上述重鏈及輕鏈的更佳組合之抗體而言，可列舉：含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；及由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體。
就具有上述重鏈及輕鏈的優異較佳組合之抗體而言，可列舉：由含有包含SEQ ID NO：45之胺基酸1-121的可變區的重鏈及含有包含SEQ ID NO：46之胺基酸1-109的可變區的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸殘基20至140所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及包含由SEQ ID NO：18之胺基酸殘基21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：14之胺基酸殘基20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：18之胺基酸殘基21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；由包含由SEQ ID NO：14之胺基酸殘基20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：20之胺基酸殘基21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體；及由包含由SEQ ID NO：16之胺基酸殘基20至140所構成的胺基酸序列所構成的可變區的重鏈及包含由SEQ ID NO：22之胺基酸殘基21至129所構成的胺基酸序列所構成的可變區的輕鏈所構成的抗體。
此外，就具有上述重鏈及輕鏈的另一更佳組合之抗體而言，可列舉：由包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸序列所構成的重鏈及SEQ ID NO：20之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：20之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：16之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：16之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：20之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；及由SEQ ID NO：16之胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體。
就具有上述重鏈及輕鏈的優異較佳組合之抗體而言，可列舉：含有包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈的抗體；由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；及由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至470所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體。
再者，就具有上述重鏈及輕鏈的更優異較佳組合之抗體而言，可列舉：由SEQ ID NO：12之胺基酸位置20至469所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至469所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：18之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；由SEQ ID NO：14之胺基酸位置20至469所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：20之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體；及由SEQ ID NO：16之胺基酸位置20至469所構成的胺基酸序列所構成的重鏈及由SEQ ID NO：22之胺基酸位置21至234所構成的胺基酸序列所構成的輕鏈所構成的抗體。
藉由組合具有與上述重鏈胺基酸序列高同源性的序列與具有與上述輕鏈胺基酸序列高同源性的序列，可能選擇具有與上述各抗體同等生物活性的抗體。如此同源性，一般而言為80%以上之同源性，較佳為90%以上之同源性，更佳為95%以上之同源性，最佳為99%以上之同源性。又，藉由組合於重鏈或輕鏈之胺基酸序列中有一至數個之胺基酸殘基被取代、刪除或添加的胺基酸序列，亦可選擇具有與上述各抗體同等生物活性的抗體。
兩胺基酸序列間的同源性係可藉由使用Blast algorithm第2.2.2版之系統內定參數(default parameter)而決定(Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaeffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman(1997), 「Gapped BLAST and PSI-BLAST：a new generation of protein database search programs」, Nucleic Acids Res. 25：3389-3402)。Blast algorithm亦可透過訪問網際網路www.ncbi.nlm.nih.gov/blast而使用。
於序列表中SEQ ID NO：12、14、或16所示的重鏈胺基酸序列，由胺基酸殘基1至19所構成的胺基酸序列為訊息序列，由胺基酸殘基20至140所構成的胺基酸序列為可變區、及由胺基酸殘基141至470所構成的胺基酸序列為恒定區。
又，於序列表中SEQ ID NO：18、20或22所示的輕鏈胺基酸序列，由胺基酸殘基1至20所構成的胺基酸序列為訊息序列，由胺基酸殘基21至129所構成的胺基酸序列為可變區，及由胺基酸殘基130至234所構成的胺基酸序列為恒定區。
又，本發明之抗體包括與TROP2結合的人類抗體。抗TROP2人類抗體係指僅具有衍生自人類染色體的抗體的序列之人類抗體。抗TROP2人類抗體可藉由使用具有包含人類抗體之重鏈及輕鏈基因的人類染色體片段之產生人類抗體的小鼠之方法而獲得(參見，Tomizuka, K. et al., Nature Genetics(1997)16, pp. 133-143；Kuroiwa, Y. et al., Nucl. Acids Res.(1998)26, pp. 3447-3448；Yoshida, H. et al., Animal Cell Technology：Basic and Applied Aspects vol. 10, pp. 69-73(Kitagawa, Y., Matuda, T. and Iijima, S. eds.), Kluwer Academic Publishers, 1999；Tomizuka, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(2000)97, pp. 722-727等)。
如此產生人類抗體的小鼠可具體如下製備。藉由生產剔除動物及轉基因動物並將此等動物交配而創建經基因修飾的動物，其中內源性免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座已被破壞並取而代之的是通過酵母人工染色體(YAC)載體等導入人類免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座。
又，依據重組DNA技術，藉由使用各自編碼如此人類抗體之重鏈及輕鏈的cDNA，較佳為包含此種cDNA的載體，將真核細胞轉形，培養生產重組人類單株抗體的轉形體細胞，因而亦可由培養上清液獲得抗體。
此處，作為宿主，例如，可使用真核細胞，較佳為哺乳動物細胞，諸如CHO細胞、淋巴球或骨髓瘤細胞。
又，亦已知取得自人類抗體庫選出的來自噬菌體顯示的人類抗體的方法(參照Wormstone, I. M. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science.(2002)43(7), pp. 2301-2308；Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics(2002), 1(2), pp. 189-203；Siriwardena, D. et al., Ophthalmology(2002)109(3), pp. 427-431等)。
例如，可使用將人類抗體之可變區作為單鏈抗體(scFv)而使於噬菌體表面表現，並選擇與抗原結合的噬菌體的噬菌體顯示法(Nature Biotechnology(2005), 23,(9), pp. 1105-1116)。
藉由分析基於與抗原的結合而選擇的噬菌體基因，可決定編碼與抗原結合的人類抗體之可變區的DNA序列。
若與抗原結合的scFv之DNA序列被確定，可藉由製備包含該序列的表現載體並將該載體導入於適當宿主並使表現，而獲得人類抗體(國際公開No. WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388；Annu. Rev. Immunol.(1994)12, pp. 433-455；Nature Biotechnology(2005)23(9), pp. 1105-1116)。
若新生產的人類抗體與TINA1抗體所結合的部分肽或部分立體結構結合，則可判定該人類抗體結合於與TINA1抗體相同的抗原決定位。又，藉由確認該人類抗體與TINA1抗體競爭對TROP2的結合(即，該人類抗體會抑制TINA1抗體與TROP2之間的結合)，即使不確定具體的抗原決定位之序列或結構，也可判定該人類抗體結合於與TINA1抗體相同的抗原決定位。當確認人類抗體結合於與TINA1抗體相同的抗原決定位，該人類抗體被強烈地期待具有與TINA1抗體同等之生物活性。
可藉由已知方法等而評價藉由上述方法所獲得的嵌合抗體、人源化抗體、或人類抗體對於抗原的結合性，並選擇較佳抗體。
就於抗體性質之比較所使用的另一指標之一例而言，可例示抗體之安定性。示差掃描熱析儀(DSC)係能夠用於快速且正確地測量蛋白質之相對的結構安定性之良好指標的熱變性中點溫度(Tm)的裝置。藉由使用DSC測量Tm值並比較該值，可比較熱安定性的差異。已知抗體之保存安定性呈現與抗體之熱安定性有某程度之相關(Lori Burton, et. al., Pharmaceutical Development and Technology(2007)12, pp. 265-273)且藉由使用熱安定性作為指標可選擇較佳抗體。其他選擇抗體之指標之例包括下列特徵：於適當宿主細胞中的產量為高的；及於水溶液中之凝集性為低的。例如，顯示最高產量之抗體並非總是顯示最高熱安定性，因此，有必要藉由基於上述指標而全面地評估而選出最適合對人類投予之抗體。
於本發明，亦包括抗體之修飾變異體。修飾變異體係指藉由使本發明之抗體歷經化學或生物學修飾而獲得的變異體。化學修飾變異體之例包括藉由鍵結化學基團於胺基酸骨架上的化學修飾的變異體、以N-鍵結或O-鍵結碳水化物鏈之化學修飾體等。生物學修飾變異體之例包括藉由轉譯後修飾獲得的變異體(諸如N-鍵結或O-鍵結的醣苷化、N-或C-端加工、去醯胺化、天冬胺酸之異構物化、甲硫胺酸之氧化)、及藉由於原核生物宿主細胞中表現，而於N端附加甲硫胺酸殘基的變異體。
又，經標記的抗體因而能夠偵測或分離本發明之抗體或抗原，例如，經酵素標記的抗體、經螢光素標記的抗體、及親和性標記的抗體亦被包括於修飾變異體的意義中。本發明之抗體之此種修飾變異體有用於改進抗體之安定性及血液滯留性、減少其抗原性、偵測或分離抗體或抗原等。
又，藉由調節與本發明之抗體結合的聚醣之修飾(醣苷化、脫岩藻糖化(defucosylation)等)，可能增強抗體依賴性細胞毒性。就調節抗體之聚醣之修飾的技術而言，已知國際公開No. WO 1999/54342、WO 2000/61739、WO 2002/31140等。然而，未限定於此技術。於本發明之抗體，亦包括調節抗體中聚醣之修飾。
於藉由首先分離抗體基因然後將基因導入適合的宿主中產生抗體的情形，可以使用合適的宿主和適合的表現載體的組合。抗體基因之具體例包括編碼本說明書中描述的抗體的重鏈序列的基因及編碼其輕鏈序列的基因的組合。當宿主細胞被轉形，可能將重鏈序列基因及輕鏈序列基因插入相同的表現載體，亦可能分別插入不同的表現載體。
於使用真核細胞作為宿主的情形，可使用動物細胞、植物細胞、及真核微生物。就動物細胞而言，可例示哺乳動物細胞，例如，猴COS細胞(Gluzman, Y., Cell,(1981)23, pp. 175-182, ATCC CRL-1650)、鼠纖維母細胞NIH3T3(ATCC No. CRL-1658)、及中國倉鼠卵巢細胞(CHO細胞；ATCC：CCL-61)之二氫葉酸還原酵素缺損株(Urlaub, G. and Chasin, L. A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1980)77, pp. 4126-4220)。
使用原核細胞的情形，可例示例如，大腸桿菌、枯草桿菌。
藉由通過轉形將所欲抗體基因導入此等細胞並於活體外培養如此轉形的細胞，可獲得此抗體。於上述培養方法，有時取決於抗體序列產量可能會變化，因此，藉由使用產量作為具有等效結合活性的抗體中的指標，可能選擇容易作為藥物生產的抗體。因此，於本發明之抗體亦包含藉由下列抗體之製造方法所獲得的抗體，該方法之特徵為包括:培養經轉形的宿主細胞之步驟及自該培養步驟獲得的培養產物收集所欲抗體之步驟。
已知於培養的哺乳動物細胞中產生的抗體之重鏈之羧基末端的離胺酸殘基於被刪除(Journal of Chromatography A, 705：129-134(1995))，亦已知於培養的哺乳動物細胞中產生的抗體之重鏈之羧基末端的兩胺基酸殘基(甘胺酸及離胺酸)被刪除且新位於該羧基端的脯胺酸殘基被醯胺化(Analytical Biochemistry, 360：75-83(2007))。然而，此種重鏈序列之刪除及修飾並未影響抗體之抗原-結合親和性及效應子功能(補體之活性化、抗體依賴性細胞毒性等)。因此，依據本發明之抗體，亦包括歷經此種修飾之抗體及此抗體之功能片段，且亦涵括於重鏈羧基末端有一或二個之胺基酸被刪除的刪除變異體、藉由該刪除變異體的醯胺化所獲得的變異體(例如，重鏈之羧基端脯胺酸殘基已被醯胺化)等。依據本發明之於抗體重鏈之羧基末端具有缺失的刪除變異體之形式並未限於上述變異體，只要保留抗原-結合親和性及效應子功能即可。構成依據本發明之抗體的兩重鏈可為選自由全長重鏈所構成的群組及上述刪除變異體之一種形式，或可為選自其之組合的兩種形式。各刪除變異體之量之比率可受產生依據本發明之抗體的培養的哺乳類細胞之種類及培養條件的影響，然而，可例示於含於依據本發明之抗體中作為主要成分的兩重鏈之兩者中之羧基端中一胺基酸殘基已被刪除。
就本發明之抗體之同型而言，較佳可例示例如，IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、及IgG1或IgG2。
就抗體之生物活性而言，一般可例示抗原-結合活性、藉由與抗原結合而表現該抗原的細胞中內在化的活性、中和抗原之活性的活性、增強抗原活性的活性、抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性、補體依賴性細胞毒性(CDC)活性、及抗體依賴性細胞媒介吞噬作用(ADCP)活性。本發明之抗體之功能為與TROP2之結合活性，較佳為藉由與TROP2結合而於TROP2表現細胞中內在化的活性。再者，除了細胞內在化活性之外，本發明之抗體可具有ADCC活性、CDC活性、及/或ADCP活性。
獲得的抗體可純化至均一。抗體之分離、純化可利用習用蛋白質分離及純化法進行。例如，藉由適宜選擇及組合管柱層析、過濾器過濾、超過濾、鹽析、透析、製備性聚丙烯醯胺凝膠電泳、等電點電泳等可分離及純化抗體(Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual, Daniel R. Marshak et al. eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1996)；Antibodies：A Laboratory Manual. Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory(1988))，但該方法未限定於此等。
此種層析之例包括親和性層析、離子交換層析、疏水性層析、凝膠過濾層析、逆相層析、及吸附層析。
可利用諸如HPLC或FPLC之液相層析進行此種層析。
就用於親和性層析所使用的管柱而言，可例示蛋白質A管柱及蛋白質G管柱。例如，就使用蛋白質A管柱的管柱而言，可例示Hyper D、POROS、Sepharose FF(Pharmacia)等。
再者，藉由使用具有固定抗原於其上的担體(carrier)，亦可以利用抗體與抗原的結合特性來純化抗體。 [抗腫瘤化合物]
於此節中說明與抗TROP2抗體結合的抗腫瘤化合物作為本發明所揭示的抗體-藥物結合物的一部分。
使用於本發明之抗腫瘤化合物並未特別限制，只要其具有抗腫瘤作用且具有取代基或允許連接到連接子結構的部分結構的化合物即可。當部分或全部連接子在腫瘤細胞中被切斷時，抗腫瘤化合物部分被釋放以顯示出抗腫瘤化合物的抗腫瘤作用。當在與藥物的連接位置處切斷連接子時，抗腫瘤化合物以其未修飾的結構釋放，以展現其固有的抗腫瘤效果。
就使用於本發明之抗腫瘤化合物而言，較佳可使用為喜樹鹼衍生物之一者的依喜替康(((1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4'：6,7]吲
Figure 109117829-A0304-12-01
并[1,2-b]喹啉-10,13(9H,15H)-二酮；示於下式)。依喜替康示於下式1。 [式1]
Figure 02_image005
儘管具有優異的抗腫瘤效果，依喜替康尚未作為抗腫瘤藥被商業化。該化合物可藉由已知方法而容易地獲得且位於位置1之胺基可較佳被使用作為連接連接子結構的位置。又，依喜替康亦可以在部分連接子仍附著於其上的同時在腫瘤細胞中釋放，且其仍為優異的抗癌化合物，即使在此種結構中亦表現出優異的抗腫瘤效果。
因為依喜替康具有喜樹鹼結構，所以已知在水性酸性介質(例如pH 3左右)中平衡偏向為具有封閉內酯環(封閉環)的結構，但在水性鹼性介質(例如，pH 10左右)下，其平衡偏向為具有開放內酯環(開放環)的結構。亦預期導入具有對應於閉環結構和開環結構的依喜替康殘基的藥物結合物具有相同的抗腫瘤效果，且此等狀態中的任何一種皆於本發明的範圍中。
抗腫瘤化合物之其他例可包括阿黴素(doxorubicin)、道諾黴素(daunorubicin)、絲裂黴素C(mitomycin C)、博來黴素(bleomycin)、環胞苷(Cyclocytidine)、長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、胺甲喋呤(methotrexate)、鉑系抗腫瘤劑(順鉑或其衍生物)、紫杉醇(Taxol)或其衍生物、其他之喜樹鹼或其衍生物(日本特開平6-87746號公報記載的抗腫瘤劑)。
關於抗體-藥物結合物，藥物分子對抗體每一分子的結合數為影響其有效性及安全性的關鍵因子。抗體-藥物結合物之生產藉由定義反應條件而進行，包括反應原料和試劑的使用量及以使抗體-藥物結合物具有恆定數目的反應試劑，與低分子量化合物的化學反應不同，抗體-藥物結合物通常以包含不同數目的結合的藥物分子的混合物形式獲得。抗體分子中結合的藥物數目由平均值表示或具體化，即結合的藥物分子的平均數目。原則上除非另外具體說明，否則結合的藥物分子的數量意指平均值，除了在其中代表具有特定數目的結合藥物分子的抗體-藥物結合物的情況之外，抗體-藥物結合物包含在具有不同數目的結合藥物分子的抗體-藥物結合物混合物中。依喜替康分子結合至抗體分子的數目為可控制的，且就每抗體之結合的藥物分子的平均數而言，可連結約1至10個依喜替康。於一些實施方式，可連結1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10個依喜替康。較佳地，其為2至8，更佳為3至8，更佳為3.5至4.5，或4。同時，所屬技術領域中具通常知識者可設計結合藥物分子對抗體分子所需數目的反應，基於本申請案之實施例之描述，且可獲得具有經控制數目的依喜替康分子的抗體-藥物結合物。 [連接子結構]
關於本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物，說明用於結合抗腫瘤化合物與抗TROP2抗體之連接子結構。連接子具有下列式之結構： -L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-
抗體被連結至L1 端(與L2 結合的相反側的端)，抗腫瘤化合物被連結至-La -(CH2 )n2 -C(=O)-部分的羰基。
n1 表示0至6之整數且較佳為1至5之整數，更佳為1至3。
L1
L1 表示-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n3 -C(=O)-之結構。
於上述，n3 為2至8之整數且「-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-」具有下式所表示的結構。 [式2]
Figure 02_image007
上列部分結構中的位置3為與抗TROP2抗體的連結位置。於位置3結合至抗TROP2抗體係特徵為硫醚形成的鍵結。此結構部分之位置1的氮原子與存在於包括結構的連接子中的亞甲基的碳原子連結。具體而言，-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n3 -C(=O)-L2 -為下式所示的結構(其中，「抗體-S-」係源自抗體)。 [式3]
Figure 02_image009
於式中，n3 為2至8之整數，且較佳為2至5。
L1 之具體例可包括： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。
L2
L2 為下列結構所示的連接子： -NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-，
L2 可不存在，此情形L2 為單鍵。於上述，n4 為1至6之整數，且較佳為2至4。L2 於末端之胺基連結至L1 且於另一末端羰基連結至LP 。
L2 之具體例可包括： -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-。
LP
LP 為2至7個之胺基酸所構成的胜肽殘基。具體而言，其由2至7個之胺基酸藉由胜肽鍵結的寡肽殘基構成。LP 於N末端與L2 連結，於C末端與連接子之-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-部分之胺基連結。
連接子中構成LP 的胺基酸並未特別限定，然而，其例包括L-或D-胺基酸，較佳為L-胺基酸。且除了α-胺基酸，其可為具有諸如β-丙胺酸、ε-胺基己酸、或γ-胺基丁酸的結構的胺基酸，再者，其可為諸如N-甲基化胺基酸的非自然形式胺基酸。
LP 之胺基酸序列並未特別限制，但構成胺基酸之例包括苯丙胺酸(Phe；F)、酪胺酸(Tyr；Y)、白胺酸(Leu；L)、甘胺酸(Gly；G)、丙胺酸(Ala；A)、纈胺酸(Val；V)、離胺酸(Lys；K)、瓜胺酸(Cit)、絲胺酸(Ser；S)、麩胺酸(Glu；E)、及天冬胺酸(Asp；D)。
此等中，較佳例包括苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、及天冬胺酸。依胺基酸之種類，可控制藥物釋放樣式。胺基酸之數目可為2至7之間。
LP 之具體例包括： -GGF-、 -DGGF-、 -(D-)D-GGF-、 -EGGF-、 -GGFG-、 -SGGF-、 -KGGF-、 -DGGFG-、 -GGFGG-、 -DDGGFG-、 -KDGGFG-、 -GGFGGGF-。
於上述，「(D-)D」表示D-天冬胺酸。
本發明之抗體-藥物結合物的LP 之特定較佳例可包括-GGFG-之四肽殘基。
La -(CH2 )n2 -C(=O)-
於La -(CH2 )n2 -C(=O)-之La 為-O-之結構、或為單鍵。n2 為0至5之整數，更佳為0至3，更佳為0或1。
La -(CH2 )n2 -C(=O)-之例可包括彼等具有下列結構者： -O-CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -O-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。
其中，-O-CH2 -C(=O)-、-O-CH2 CH2 -C(=O)-、或其中La 為單鍵，且n2 為0者為較佳。
連接子中-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-所表示的結構之具體例可包括： -NH-CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 -O-C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。 -NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、或-NH-CH2 CH2 -O-C(=O)-為較佳。
於連接子中，-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-之鏈長較佳為4至7個原子之鏈長，更佳為5或6個原子之鏈長。
關於本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物，認為當抗TROP2抗體-藥物結合物被轉移至腫瘤細胞之內部時，連接子部分被切斷，且具有由NH2 -(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-(NH-DX)所表示的結構的藥物衍生物被釋放而表現抗腫瘤作用。藉由自本發明之抗體-藥物結合物釋放而展現抗腫瘤效果之抗腫瘤衍生物之例，包括具有結構部分之抗腫瘤衍生物，其中由連接子之-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-所表示的結構具有末端胺基，且特別較佳者包括下列： NH2 -CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 NH2 -CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 NH2 -CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 NH2 -CHCH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
同時，於NH2 -CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)之情形，確認由於分子中的胺縮醛(aminal)結構為不安定的，其再次經歷自降解以釋放出以下： HO-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。 彼等化合物亦可較佳用於作為本發明之抗體-藥物結合物之製造中間體。
於本發明之抗體-藥物結合物中依喜替康被使用作為藥物者，其較佳為具有下列結構之藥物-連接子結構部分[-L1 -L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-(NH-DX)]被連接至抗體。該每抗體之藥物-連接子結構部分之平均結合數目可為1至10，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10。較佳地，其為2至8，更佳為3至8，更佳為3.5至4.5，或4。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
此等中，更較佳例為下列： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
特別較佳者為下列： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
關於本發明之抗體-藥物結合物中，結合抗TROP2抗體與藥物的連接子結構，較佳連接子可藉由上列說明的連接子的各部分所示的較佳結構所建構。就該連接子結構而言，可較佳使用彼等具有下列結構者。同時，結構之左端為與抗體之連結位置且右端為與藥物的連結位置。 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。
其中，更佳者為下列： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。
特佳者包括下列： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-、 -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 O-CH2 CH2 O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-。
關於本發明所使用的抗TROP2抗體-藥物結合物，當被轉移至腫瘤細胞之內部時，連接子部分被切斷，且可釋放具有由NH2 -CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)所表示的結構的藥物衍生物。 已確認藥物衍生物之分子中的胺縮醛結構為不安定的，再次經歷自降解以釋放出下式所示的化合物：HO-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
該化合物可以下式表示。 [式4]
Figure 02_image011
(下文，於本發明中亦稱為「化合物1」)。
化合物1被認為是本發明中使用的抗體-藥物結合物所具有的抗腫瘤活性的主要醫藥活性物質，且已被證實具有拓撲異構酶I抑制作用(Ogitani Y. et al., Clinical Cancer Research, 2016, Oct 15；22(20)：5097-5108, Epub 2016 Mar 29)。 [生產方法]
接著，說明本發明之抗體-藥物結合物或其製造中間體之代表性生產方法。同時，於下文中以每個反應式中所示的化合物編號來描述化合物。具體而言，其被稱為「式(1)之化合物」、「化合物(1)」等。除此以外具有數字的化合物亦被類似地描述。
[生產方法A]
式(1)所示之抗體-藥物結合物，其經由硫醚而與藥物-連接子結構結合，例如可藉由下列方法製造。 [式5]
Figure 02_image013
於式中，AB表示具有氫硫基的抗體，且L1' 表示L1 連接子結構中連接子末端為順丁烯二醯亞胺基(下列所示的式) [式6]
Figure 02_image015
於式中，氮原子為結合位置，具體而言，表示於L1 之-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-(CH2 )n3 -C(=O)-中-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-部分為順丁烯二醯亞胺基的基。再者，-(NH-DX)表示下式所示的結構：
[式7]
Figure 02_image017
且其表示依喜替康之位置1的胺基的一個氫原子被移除而衍生的基。
又，於上述之反應式中，式(1)之化合物被解釋為一種結構，其中自藥物至連接子末端的一個結構部分與一個抗體連接。然而，僅為了方便的目的而給予描述，實際上於許多情形有多個結構部分連接至一個抗體分子。此同樣適用於下述生產方法的說明。
藉由使以下述方法可獲得的化合物(2)與具有氫硫基的抗體(3a)反應，可製造抗體-藥物結合物(1)。
具有氫硫基的抗體(3a)可藉由本項技術領域中周知之方法獲得(Hermanson, G.T, Bioconjugate Techniques, pp. 56-136, pp. 456-493, Academic Press(1996))。其例包括：將Traut's試劑與抗體之胺基反應；N-琥珀醯亞胺基S-乙醯基硫烷酸酯類與抗體之胺基反應後，與羥基胺反應；與N-琥珀醯亞胺基 3-(吡啶二硫基)丙酸酯反應後，抗體與還原劑反應；抗體與還原劑反應，諸如二硫蘇糖醇、2-巰基乙醇、及參(2-羧基乙基)膦 鹽酸鹽(TCEP)，將抗體中的雙硫鍵還原而形成氫硫基，但其未限定於此。
具體而言，抗體中每個雙硫鍵使用0.3至3莫耳當量之TCEP作為還原劑並於含螯合劑的緩衝液中與抗體反應，可獲得抗體中雙硫鍵被部分或完全還原的抗體。螯合劑之例包括乙二胺四乙酸(EDTA)及二乙三胺五乙酸(DTPA)。其可以1 mM至20 mM之濃度使用。可使用的緩衝液之例包括磷酸鈉、硼酸鈉或乙酸鈉之溶液。具體而言，藉由將抗體與TCEP於4°C至37°C反應1至4小時，可獲得具有部分或完全被還原的氫硫基的抗體(3a)。
同時，藉由實施添加氫硫基於藥物-連接子部分的反應，藉由硫醚鍵可結合藥物-連接子部分。
每個具有氫硫基的抗體(3a)使用2至20莫耳當量的化合物(2)，可生產抗體-藥物結合物(1)，其中每抗體結合2至8個藥物分子。具體而言，將含有溶解於其中的化合物(2)的溶液添加至含有具有氫硫基的抗體(3a)的緩衝液中進行反應為充分。於此，可使用的緩衝液之例包括乙酸鈉、磷酸鈉、及硼酸鈉溶液。反應之pH為5至9，更佳為反應於接近pH 7進行。用於溶解化合物(2)之溶劑之例包括有機溶劑，諸如二甲亞碸(DMSO)、二甲基甲醯胺(DMF)、二甲基乙醯胺(DMA)、及N-甲基-2-吡啶酮(NMP)。
將含有溶解於其中的化合物(2)的有機溶劑溶液以1至20%v/v添加至含有具有氫硫基的抗體(3a)的緩衝液中進行反應為充分。反應溫度為0至37℃，更佳為10至25℃，且反應時間為0.5至2小時。可以藉由使未反應的化合物(2)與含硫醇的試劑的反應性失活而終止反應。含硫醇的試劑之例包括半胱胺酸及N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)。更具體而言，添加1至2莫耳當量之NAC 至使用的化合物(2)，藉由於室溫溫育10至30分鐘，可終止反應。
依據下述共通程序，所生產的抗體-藥物結合物(1)可歷經濃縮、緩衝液交換、純化、及抗體濃度及抗體每一分子結合的藥物分子之平均數之測量，而鑑定抗體-藥物結合物(1)。
共通程序A：抗體或抗體-藥物結合物之水溶液的濃度
於Amicon Ultra(50,000 MWCO, Millipore Corporation)容器中，添加抗體或抗體-藥物結合物之溶液並使用離心機(Allegra X-15R, Beckman Coulter, Inc.)，藉由離心而濃縮抗體或抗體-藥物結合物之溶液(離心5至20分鐘，於2000 G至3800 G)。
共通程序B：抗體濃度之測量
使用UV偵測器(Nanodrop 1000, Thermo Fisher Scientific Inc.)，依據製造商定義的方法，進行抗體濃度之測量。於此時，使用各抗體不同的280 nm 吸光係數(1.3 mLmg-1 cm-1 至1.8 mLmg-1 cm-1 )。
共通程序C-1：抗體之緩衝液交換
依據製造商定義的方法，將使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation)以含氯化鈉(137 mM)及乙二胺四乙酸(EDTA, 5 mM)的磷酸緩衝液(10 mM, pH 6.0；於本說明書中指PBS6.0/EDTA)平衡。將此抗體之水溶液施加2.5 mL之量於單一NAP-25管柱，然後以3.5 mL之PBS6.0/EDTA洗析而收集劃分(fraction)(3.5 mL)。藉由共通程序A濃縮生成的劃分。使用共通程序B測量抗體濃度後，使用PBS6.0/EDTA將抗體濃度調整為10 mg/mL。
共通程序C-2：抗體之緩衝液交換
依據製造商定義的方法，將使用Sephadex G-25擔體的NAP-25管柱(Cat. No. 17-0852-02, GE Healthcare Japan Corporation)以含氯化鈉(50 mM)及EDTA(2 mM)的磷酸緩衝液(50 mM, pH 6.5；於本說明書中指PBS6.5/EDTA)。將此抗體之水溶液施加2.5 mL之量於單一NAP-25管柱，然後以3.5 mL之PBS6.5/EDTA洗析而收集劃分(3.5 mL)。藉由共通程序A濃縮生成的劃分。使用共通程序B測量抗體濃度後，使用PBS6.5/EDTA將抗體濃度調整為20 mg/mL。
共通程序D：抗體-藥物結合物之純化
將NAP-25管柱以選自市售可取得的磷酸緩衝液(PBS7.4, Cat. No. 10010-023, Invitrogen)、含氯化鈉(137 mM)的磷酸鈉緩衝液(10 mM, pH 6.0；其被稱為PBS6.0)、及含山梨糖醇(5%)的乙酸緩衝液(10 mM, pH 5.5；其於說明書中被稱為ABS)之任一者平衡。將抗體-藥物結合物反應之水溶液施加約1.5 mL之量至NAP-25管柱，然後以製造商定義的量以緩衝液洗析而收集抗體劃分。將收集的劃分再次施加於NAP-25管柱，且藉由總共重複2-3次以用緩衝液洗析的凝膠過濾純化過程，排除未結合的藥物連接子和低分子量的化合物(參(2-羧基乙基)膦 鹽酸鹽(TCEP)、N-乙醯基-L-半胱胺酸(NAC)、及二甲亞碸)而獲得抗體-藥物結合物。
共通程序E：抗體-藥物結合物中抗體濃度及抗體每一分子結合的藥物分子之平均數(1)之測量
抗體-藥物結合物中結合的藥物濃度可藉由測量抗體-藥物結合物之水溶液的280nm及370nm之二波長中的UV吸光度後，進行下列呈示的計算而算出。
因任一波長的總吸光度相等於系統內存在的每一吸收化學物種之吸光度之和(吸光度之加成性)，當在抗體及藥物間的結合前後，抗體和藥物的莫耳吸光係數保持相同時，抗體-藥物結合物中的抗體濃度和藥物濃度以下列方程式表示。 A280 =AD,280+ AA,280 =εD,280 CD+ εA,280 CA 方程式(I) A370 =AD,370 + AA,370 =εD,370 CD+ εA,370 CA 方程式(II)
於上述，A280 表示於280nm的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，A370 表示於370nm的抗體-藥物結合物水溶液之吸光度，AA,280 表示於280nm的抗體之吸光度，AA,370 表示於370nm的抗體之吸光度，AD,280 表示於280nm的結合物前驅物之吸光度，AD,370 表示於370nm的結合物前驅物之吸光度，εA,280 表示於280nm的抗體之莫耳吸光係數，εA,370 表示於370nm的抗體之莫耳吸光係數，εD,280 表示於280nm的結合物前驅物之莫耳吸光係數，εD,370 表示於370nm的結合物前驅物之莫耳吸光係數，CA 表示抗體-藥物結合物中的抗體濃度，CD 表示抗體-藥物結合物中的藥物濃度。
就上述εA,280 、εA,370 、εD,280 、εD,370 而言，使用事先準備的值(基於計算所估計的值或由化合物之UV測量所獲得的實測值)。例如，可自抗體之胺基酸序列，使用已知之計算方法估算εA,280 (Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)。εA,370 通常為零。εD,280 及εD,370 係可藉由測量使用的結合物前驅物溶解於一定莫耳濃度的溶液之吸光度，基於朗伯-比爾定律(Lambert-Beer law)(吸光度＝莫耳濃度×莫耳吸光係數×光析管(cell)光徑長)而獲得。藉由測量抗體-藥物結合物之水溶液之A280 及A370 ，並使用該值代入式(I)及(II)而解出聯立方程式，可獲得CA 及CD 。又，藉由將CD 除以CA ，可獲得每一抗體結合的藥物之平均結合數。
共通程序F：抗體-藥物結合物中抗體每一分子結合的藥物分子之平均數之測量-(2)。
除了共通程序E之外，抗體-藥物結合物中抗體每一分子結合的藥物分子之平均數亦可使用下述方法並藉由高效液相層析(HPLC)分析而確定。
[F-1. HPLC分析用樣品之製備(抗體-藥物結合物之還原)]
抗體-藥物結合物溶液(約1 mg/mL, 60μL )與二硫蘇糖醇(DTT)水溶液(100 mM, 15μL)混合。將混合物於37°C溫育30分鐘以切斷抗體-藥物結合物之L鏈及H鏈間的雙硫鍵。將生成的樣品用於HPLC分析。
[F-2. HPLC分析]
於下列測量條件下進行HPLC分析：
HPLC系統：Agilent 1290 HPLC系統(Agilent Technologies, Inc.)
偵測器：UV吸收光譜儀(測量波長：280 nm)
管柱：PLRP-S(2.1×50mm，8μm，1000Å；Agilent Technologies, Inc., P/N PL1912-1802)
管柱溫度：80℃
移動相A：0.04%三氟乙酸(TFA)水溶液
移動相B：含0.04% TFA的乙腈溶液
梯度程式：29%-36%(0 min-12.5 min)、36%-42% (12.5-15 min)、42%-29%(15 min-15.1 min)、29%-29% (15.1 min-25 min)
樣品注入量：15 μL
[F-3.資料分析]
[F-3-1]與未結合的抗體之L鏈(L0 )及H鏈(H0 )相比，結合藥物的L鏈(連結於一藥物分子的L鏈：L1 )及H鏈(連結於一藥物分子的H鏈：H1 、連結於二個藥物分子的H鏈：H2 、連結於三個藥物分子的H鏈：H3 )展現與結合的藥物分子數成比例的較高疏水性，如此具有較大保留時間。因此此等鏈以L0 及L1 、或H0 、H1 、H2 、及H3 之順序被洗析出。藉由將保留時間與L0 和H0 進行比較，可以將檢測峰分配於L0 、L1 、H0 、H1 、H2 、及H3 之任一者。
[F-3-2]由於藥物連接子具有UV吸收，使用L鏈、H鏈、及藥物連接子的莫耳吸光係數，依據下列式回應結合的藥物連接子的數目而校正峰面積值。
[表現式1]
Figure 02_image019
[表現式2]
Figure 02_image021
此處，就各抗體中的L鏈或H鏈之莫耳吸光係數(280 nm)而言，可使用藉由已知計算方法，由各抗體之L鏈或H鏈之胺基酸序列估算的值(Protein Science, 1995, vol. 4, 2411-2423)。於hTINA的情形，依據其胺基酸序列，分別使用34690之莫耳吸光係數及95000之莫耳吸光係數作為L鏈及H鏈的估算值。就藥物連接子之莫耳吸光係數(280 nm)而言，使用使各藥物連接子與巰基乙醇或N-乙醯基半胱胺酸反應，而將順丁烯二醯亞胺基轉變為琥珀醯亞胺硫醚的化合物之實測的莫耳吸光係數(280nm)。
[F-3-3]依據下式計算波峰面積之校正值合計之各鏈波峰面積比(%)。
[表現式3]
Figure 02_image023
[F-3-4]依據下式計算於抗體-藥物結合物中抗體每一分子結合的藥物分子之平均數。
結合的藥物分子之平均數目=(L0 波峰面積比×0+L0 波峰面積比×1+H0 波峰面積比×0+H1 波峰面積比×1+H2 波峰面積比×2+H3 波峰面積比×3)/100×2。
生產方法1中的式(2)所示化合物以下式表示：
(順丁烯二醯亞胺-N-基)-(CH2 )n3 -C(=O)-L2 -LP -NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -C(=O)-(NH-DX)
於式中， n3 表示2至8之整數， L2 表示-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-或單鍵，其中n4 表示1至6之整數， LP 表示由2至7個胺基酸所組成的胜肽殘基，該胺基酸選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、及天冬胺酸， n1 表示0至6之整數， n2 表示0至5之整數， La 表示-O-或單鍵， (順丁烯二醯亞胺-N-基)-為下式所示的順丁烯二醯亞胺基(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)： [式8]
Figure 02_image025
其中氮原子為連結位置， -(NH-DX)為下式所示的基： [式9]
Figure 02_image027
其中於位置1的胺基之氮原子為連結位置。
當L2 為單鍵或為-NH-(CH2CH2-O)n4-CH2CH2-C(=O)-，n4 為2至4之整數之化合物作為製造中間體為較佳。
就LP 之胜肽殘基而言，具有包含選自下列胺基酸的胜肽殘基的化合物作為製造中間體為較佳，該胺基酸選自苯丙胺酸、甘胺酸、纈胺酸、離胺酸、瓜胺酸、絲胺酸、麩胺酸、及天冬胺酸。於彼等胜肽殘基中，LP 為由4個胺基酸所構成的胜肽殘基的化合物作為製造中間體為較佳。更具體而言，LP 為-GGFG-之四肽殘基的化合物作為製造中間體為較佳。
又，就-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -而言，具有-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -的化合物作為製造中間體為較佳。具有-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 的化合物為更佳。
又，於式(2)所示的化合物，n3 為2至5之整數、L2 為單鍵、及-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -為-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -的化合物作為製造中間體為較佳。NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -為-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -的化合物為更佳。n3 為2或5之整數的化合物為進一步較佳。
又，於式(2)所示的化合物，n3 為2至5之整數、L2 為-NH-(CH2 CH2 -O)n4 -CH2 CH2 -C(=O)-、n4 為2至4之整數、及-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -為-NH-CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -的化合物作為製造中間體為較佳。n4 為2或4之整數的化合物為更佳。-NH-(CH2 )n1 -La -(CH2 )n2 -為-NH-CH2 CH2 CH2 -、-NH-CH2 -O-CH2 -、或-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -的化合物為進一步較佳。
就此種有用於本發明之化合物之製造的較佳中間體，可例示下列者。 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
藉由使選自上述之製造中間體化合物之群組的藥物-連接子化合物與抗TROP2抗體或其反應性衍生物反應，並於存在於抗TROP2抗體的雙硫鍵位置形成硫醚鍵，可製造本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物。於此情形，較佳使用抗TROP2抗體之反應性衍生物。特別是將抗TROP2抗體還原而獲得的反應性衍生物為較佳。
下列為作為製造中間體之更佳化合物。 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
於上述之中間體化合物群組中，下式表示的化合物為進一步較佳的化合物： (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 -C(=O)-NH-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -O-CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 CH2 -C(=O)-(NH-DX)、 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)、或 (順丁烯二醯亞胺-N-基)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX)。
為了確保結合之量，可將於相似製造條件所獲得具有平均藥物數為相等數之複數個結合物(例如，±1左右)混合而製備新的批次。於此情形，平均藥物數落在混合前結合物中之平均藥物數間。
[生產方法2]
為先前之生產方法中所使用的中間體的式(2)所示的化合物及其藥理學上可接受的鹽，例如可藉由下列方法生產。 [式10]
Figure 02_image029
於式中，L1' 表示順丁烯二醯亞胺基，且P1 、P2 、及P3 各自表示保護基。
藉由將羧酸(5)誘導為活性酯，混合酸酐、酸鹵化物等，於鹼存在下，與NH2 -DX(4)或其藥理上可容許的鹽反應，可製造化合物(6)。NH2 -DX(4)表示依喜替康(化學名：(1S,9S)-1-胺基-9-乙基-5-氟-2,3-二氫-9-羥基-4-甲基-1H,12H-苯并[de]哌喃并[3',4'：6,7]吲
Figure 109117829-A0304-12-01
并[1,2-b] 喹啉-10,13(9H,15H)-二酮)。
此反應可運用胜肽合成通常使用的反應試劑及條件。有各種活性酯。例如，其可藉由使用諸如N,N'-二環己基碳二亞胺或1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳二亞胺 鹽酸鹽之縮合劑，使諸如 p-硝基酚、N-羥基苯并三唑、N-羥基琥珀醯亞胺等的酚類，與羧酸(5)反應而製造。又，活性酯亦可藉由下列反應而製造：羧酸(5)與五氟苯基三氟乙酸酯等之反應；羧酸(5)與1-苯并三唑基氧基三吡咯啶鏻六氟亞磷酸鹽之反應；羧酸(5)與氰基膦酸二乙酯(鹽溶法)之反應；羧酸(5)與三苯基膦及2,2'-二吡啶基二硫醚(向山法(Mukaiyama's method))之反應；羧酸(5)與諸如4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三
Figure 109117829-A0304-12-02
－2-基)-4-甲基
Figure 109117829-A0304-12-03
啉鎓氯化物(DMTMM)的三
Figure 109117829-A0304-12-02
衍生物之反應等。又，藉由例如於鹼存在下，羧酸(5)以諸如氯化亞硫醯及草醯氯之酸鹵化物處理的酸鹵化物法，亦可進行反應。
藉由將如上述獲得的羧酸(5)之活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物，與化合物(4)於適當鹼存在下且於惰性溶劑中於-78℃至150℃之反應溫度下反應，可製造化合物(6)。同時，「惰性溶劑」係指於使用溶劑的反應中不抑制目標反應的溶劑。
上述之各步驟所使用的鹼之具體例可包括鹼金屬或鹼土金屬之碳酸鹽、烷氧化物、氫氧化物、或氫化物，包括碳酸鈉、碳酸鉀、乙醇鈉、丁醇鉀、氫氧化鈉、氫氧化鉀、氫化鈉、及氫化鉀；包括n-丁基鋰的烷基鋰、包括二異丙胺鋰的二烷基胺基鋰所代表的有機金屬鹼；包括雙(三甲基矽烷基)胺基鋰的雙矽烷基胺之有機金屬鹼；及包括三級胺或含氮雜環化合物的有機鹼，諸如吡啶、2,6-二甲吡啶、柯林鹼(collidine)、4-二甲基胺基吡啶、三乙基胺、N-甲基
Figure 109117829-A0304-12-03
啉、二異丙基乙基胺、及二氮雜雙環[5.4.0]十一-7-烯(DBU)。
本發明之反應所使用的惰性溶劑之例包括：鹵化烴溶劑，諸如二氯甲烷、氯仿、及四氯化碳；醚溶劑，諸如四氫呋喃、1,2-二甲氧基乙烷、及二
Figure 109117829-A0304-12-04
烷；芳香族烴溶劑，諸如苯及甲苯；及醯胺溶劑，諸如N,N-二甲基甲醯胺、N,N-二甲基乙醯胺、及N-甲基吡咯啶-2-酮。除了此等之外，於一些情形中可使用亞碸溶劑諸如二甲亞碸及環丁碸；酮溶劑，諸如丙酮及甲基乙基酮；及醇溶劑，諸如甲醇及乙醇。又，可混合此等溶劑而使用。
就化合物(6)之末端胺基之保護基P1 而言，可使用一般用於胜肽合成的胺基之保護基，例如，三級丁氧基羰基、9-茀基甲基氧基羰基、及苄基氧基羰基。其他胺基之保護基之例可包括：烷醯基，諸如乙醯基；烷氧基羰基，諸如甲氧基羰基及乙氧基羰基；及芳基甲氧基羰基，諸如對甲氧基苄基氧基羰基、及對(或鄰)硝基苄基氧基羰基；芳基甲基，諸如苄基及三苯基甲基；芳醯基，諸如苄醯基；及芳基磺醯基，諸如2,4-二硝基苯磺醯基及鄰硝基苯磺醯基。保護基P1 可取決於例如具有要保護的胺基的化合物之性質而選擇。
藉由脫保護獲得的化合物(6)之末端胺基的保護基P1 ，可製造化合物(7)。取決於保護基，可選擇此脫保護的試劑及條件。
藉由誘導具有N末端以P2 保護的胜肽羧酸(8)成為活性酯、混合酸酐等並將其與獲得的化合物(7)反應，可製造化合物(9)。用於形成胜肽羧酸(8)與化合物(7)間之胜肽鍵的反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑可自彼等化合物(6)之合成所述者被適當選擇及使用。保護基P2 可自彼等化合物(6)之保護基所述者被適當選擇及使用，該選擇可基於例如具有要保護的胺基的化合物的性質而進行。如通常用於胜肽合成，藉由重複將構成胜肽羧酸(8)的胺基酸或胜肽依序的反應和脫保護以進行延伸，亦可製造化合物(9)。
脫保護獲得的化合物(9)之胺基的保護基P2 ，可製造化合物(10)。於此脫保護，取決於保護基，可選擇試劑及條件。
藉由將羧酸(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等，並使其與獲得的化合物(10)反應，可製造化合物(2)。用於形成羧酸(11)及化合物(10)間的胜肽鍵所使用的反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑，可自彼等化合物(6)之合成所述者被適當選擇及使用。
化合物(9)亦可例如以下述之方法製造。
藉由將具有N末端以P2 保護的胜肽羧酸(8)誘導成活性酯、混合酸酐等並於鹼存在下使其與具有以P3 保護的羧基的胺化合物(12)反應，可製造化合物(13)。用於形成胜肽羧酸(8)與化合物(12)之間的胜肽鍵之反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑，可自彼等化合物(6)之合成所述者被適當選擇及使用。
化合物(13)之胺基的保護基P2 可以通常使用的保護基進行保護。
具體而言，羥基的保護基之例包括：烷氧基甲基，諸如甲氧基甲基；芳基甲基，諸如苄基、4-甲氧基苄基、及三苯基甲基；烷醯基，諸如乙醯基；芳醯基，諸如苄醯基；及矽烷基，諸如三級丁基二苯基矽烷基。羧基可被保護，例如，以諸如甲基、乙基、及三級丁基的烷基、烯丙基、或諸如苄基的芳基甲基作為酯。胺基的保護基之例包括，例如，烷氧基羰基，諸如三級丁氧基羰基、甲氧基羰基、及乙氧基羰基；烯丙基氧基羰基、或芳基甲氧基羰基，諸如9-茀基甲基氧基羰基、苄基氧基羰基、對甲氧基苄基氧基羰基、及對(或鄰)硝基苄基氧基羰基；烷醯基，諸如乙醯基；芳基甲基諸如苄基及三苯基甲基；芳醯基，諸如苄醯基；及芳基磺醯基，諸如2,4-二硝基苯磺醯基或鄰硝基苯磺醯基。
就羧基的保護基P3 而言，可使用於有機合成化學中尤其是胜肽合成中通常使用作為羧基的保護基者。具體例包括具諸如甲基、乙基、或三級丁基的烷基酯、烯丙基酯、及苄基酯，且可自上述保護基適當選擇該保護基。於此種情形，較佳為胺基的保護基及羧基的保護基可彼等較佳以不同方法或不同條件移除。例如，代表例包括P2 為三級丁氧基羰基及P3 為苄基之組合。可自前述者選擇保護基，取決於例如具有要保護的胺基及羧基的化合物之性質。於保護基之移除，可依保護基而選擇試劑及條件。
藉由將獲得的化合物(13)之羧基的保護基P3 脫保護，可製造化合物(14)。於此脫保護，取決於保護基而選擇試劑及條件。
藉由將獲得的化合物(14)誘導成活性酯、混合酸酐、酸鹵化物等並與化合物(4)於鹼存在下反應，可製造化合物(9)。於此反應，亦可使用胜肽合成通常所使用的反應試劑及條件，且用於反應的反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑可自彼等於化合物(6)之合成所述者適當選擇。
化合物(2)亦可例如藉由下述之方法而製造。
將化合物(13)之胺基的保護基P2 脫保護，可製造化合物(15)。於此脫保護，取決於保護基，可選擇試劑及條件。
藉由將羧酸衍生物(11)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等並使其與獲得的化合物(15)於鹼存在下反應，可製造化合物(16)。用於形成胜肽羧酸(11)與化合物(15)間的醯胺鍵的反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑，可自彼等於化合物(6)之合成所述者適當選擇。
藉由將獲得的化合物(16)之羧基的保護基進行脫保護，可製造化合物(17)。可以相似於用以製造化合物(14)的羧基之脫保護進行脫保護。
藉由將化合物(17)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等並使其與化合物(4)於鹼存在下反應，可製造化合物(2)。於此反應，亦可使用胜肽合成通常所使用的反應試劑及條件，且用於反應的反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑可自彼等於化合物(6)之合成所述者適當選擇。
[生產方法3]
中間體之式(2)所示的化合物亦可藉由下述方法製造。 [式11]
Figure 02_image031
於式中，L1’ 對應於具有末端被轉變成順丁烯二醯亞胺基的結構的L1 ，且P4 表示保護基。
藉由將化合物(11)誘導成活性酯、混合酸酐等並與具有C末端以P4 保護的胜肽羧酸(18)於鹼存在下反應，可製造化合物(19)。用於形成胜肽羧酸(18)與化合物(11)間的胜肽鍵之反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑可自彼等於化合物(6)之合成所述者適當選擇。化合物(18)之羧基的保護基P4 可自上述保護基適當選擇。
藉由將獲得的化合物(19)之羧基的保護基進行脫保護，可製造化合物(20)。可以相似於用以製造化合物(14)的羧基之脫保護進行脫保護。
藉由將獲得的化合物(20)誘導為活性酯、混合酸酐等並使其與化合物(7)反應，可製造化合物(2)。於此反應，亦可使用胜肽合成通常所使用的反應試劑及條件，且用於反應的反應條件、試劑、鹼、及惰性溶劑可自彼等於化合物(6)之合成所述者適當選擇。
[生產方法4]
以下，詳述生產方法2 中所述的生產中間體中具有n1 =1、La =O之化合物(10b)的方法。式(10b)所示化合物、其鹽或彼等之溶媒合物例如可依據下列方法製造。 [式12]
Figure 02_image033
於式中，LP 係如上定義，L表示醯基，其為諸如乙醯基之烷醯基或諸如苄醯基之芳醯基、氫原子等，X及Y各表示由1至3個胺基酸所組成的寡肽，P5 及P7 各表示胺基之保護基，且P6 表示羧基之保護基。
式(21)所表示的化合物可藉由使用或應用日本特開No. 2002-60351或文獻所述之方法製造(J. Org. Chem., 51卷，3196頁，1986年)，視需要，進行保護基之移除或官能基之修飾。或者，其亦可藉由以醛或酮處理具有經保護的末端胺基的胺基酸或具有經保護的胺基的寡肽之酸醯胺而獲得。
藉由以具有羥基之化合物(22)處理化合物(21)於由冰冷至室溫的溫度條件的溫度範圍，在惰性溶劑中於酸或鹼存在下，可製造化合物(23)。
可被使用於此處之酸之例包括無機酸，諸如氫氟酸、鹽酸、硫酸、硝酸、磷酸、硼酸；有機酸，諸如乙酸、檸檬酸、對甲苯磺酸、及甲烷磺酸；及路易士酸，諸如四氟硼酸鹽、氯化鋅、氯化錫、氯化鋁、及氯化鐵。此等中，磺酸，特別是對甲苯磺酸為較佳。就鹼而言，可適當選擇及使用前述鹼之任一者。其較佳例包括鹼金屬烷氧化物，諸如其三級丁醇鉀；鹼金屬氫氧化物，諸如氫氧化鈉及氫氧化鉀；鹼金屬氫化物，諸如氫化鈉及氫化鉀；二烷基胺基鋰所代表的有機金屬鹼，諸如二異丙胺鋰；及雙矽烷基胺之有機金屬鹼，諸如雙(三甲基矽烷基)胺基鋰。用於反應的溶劑之例包括醚溶劑，諸如四氫呋喃及1,4-二
Figure 109117829-A0304-12-04
烷；及芳香族烴溶劑，諸如苯及甲苯。可製備彼等溶劑為與水之混和物。又，胺基之保護基如P5 所例示者並未特別限制，只要其為通常用於胺基之保護的基即可。代表例包括於生產方法2描述的胺基之保護基。然而，於本反應中，可能有P5 所例示的胺基之保護基被切斷的情形。於此情形，由於其可能需要再次導入保護基，因而必須進行與用於保護胺基的適當試劑的反應。
藉由移除化合物(23)之保護基P6 可製造化合物(24)。此處，P6 例示的羧基之保護基之代表例敘述於生產方法2，可自其中選出適當者。於化合物(23)中，理想的是胺基的保護基P5 和羧基的保護基P6 為可藉由不同方法或不同條件移除的保護基。例如，代表例包括其中P5 為9-茀基甲基氧基羰基，P6 為苄基的組合。保護基可取決於例如具有要保護的胺基及羧基的化合物的性質而選擇。於保護基之移除，取決於保護基而選擇試劑及條件。
由將羧酸(24)誘導為活性酯、混合酸酐、或酸鹵化物等並使其與化合物(4)或其藥理上可容許的鹽反應以製造化合物(25)隨後藉由移除獲得的化合物(25)之保護基P5 ，可製造化合物(26)。於化合物(4)及羧酸(24)之間的反應，及移除保護基P6 的反應，可使用彼等生產方法2所述的相同試劑及反應條件。
藉由使化合物(26)與具有經保護的末端胺基的胺基酸或具有經保護的胺基的寡肽(27)反應以製造化合物(9b)並移除獲得的化合物(9b)之保護基P7 ，可製造化合物(10b)。P7 所表示的胺基之保護基並未特別限制，只要其為一般用於保護胺基者。其代表例包括生產方法2所描述的胺基之保護基。於移除保護基，取決於該保護基而選擇試劑及條件。於化合物(26)與化合物(27)間之反應，可利用通常用於胜肽合成的試劑及條件。依據上述方法，藉由前述方法製造的化合物(10b)可被誘導成本發明之化合物(1)。
本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物，當留在空氣中或再結晶時，例如用於純化時，可能吸收水分而具有吸附水或變成水合物，且此種化合物及含水的鹽亦包括於本發明中。
本發明亦包括以各種放射性或非放射性同位素標誌的化合物。構成本發明之抗體-藥物結合物的1個以上原子可以非天然比率含有原子同位素。該原子同位素之例包括氘(2 H)、氚(3 H)、碘-125(125 I)及碳-14(14 C)。又，本發明之化合物可以諸如氚(3 H)、碘-125(125 I)、碳-14(14 C)、銅-64(64 Cu)、鋯-89(89 Zr)、碘-124(124 I)、氟-18(18 F)、銦-111(111 I)、碳-11(11 C)及碘-131(131 I)之放射性同位素進行放射性標誌。以放射性標記的化合物有用於作為治療或預防劑、諸如試驗試劑的研究試劑及諸如活體診斷顯影劑的診斷試劑。不論是否與放射性有關，本發明之抗體-藥物結合物之任何同位素變異種皆為於本發明之範圍中。 [抗體-藥物結合物(ADC)]
本揭示提供一種靶向TROP2的抗體-藥物結合物(ADC)，其包含抗TROP2抗體及諸如拓樸異構酶I抑制劑(DXd)之抗腫瘤化合物。參見圖1。於一些實施方式，靶向TROP2的ADC可包含式13，如下所示： [式13]
Figure 02_image035
於一些實施方式，ADC之重鏈可包含：QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTAGMQWVRQAPGQGLEWMGWINTHSGVPKYAEDFKGRVTISADTSTSTAYLQLSSLKSEDTAVYYCARSGFGSSYWYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：45)。
於一些實施方式，ADC之輕鏈可包含：DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASYRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAVYYCQQHYITPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：46)。
本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物展現針對癌細胞的細胞毒性活性，如此，其可被使用作為藥物，特別是作為癌症之治療劑及/或預防劑。
即，本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物可被選擇用於作為化療藥物，化療為治療癌症的主要方法，就其結果而言，可延緩癌細胞之發展、抑制其成長，進而殺死癌細胞。此可使癌症病患免於癌症所引起的症狀、或達成罹癌病患之QOL改善，並藉由保持罹癌病患之生命達成治療效果。即使本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物未達成殺死癌細胞，藉由抑制或控制癌細胞增殖，可於癌症病患達成更長期之生存的同時，達成更高QOL。
於此種藥物治療，其可單獨用於作為藥物以及與以輔助療法之另一療法組合且可與外科手術、放射線療法、荷爾蒙療法等組合。此外，其亦可作為新輔助療法(neoadjuvant therapy)中的藥物療法之藥劑使用。
除了上述治療用途外，由於抗體對抗原的結合性，還可期待抑制微小轉移癌細胞生長進而藉由結合至這些癌細胞而將其殺死之效果。尤其，當於原發性之癌細胞中確認TROP2之表現時，藉由投予本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物，可期待癌轉移之抑制或預防效果。例如，可期待抑制、殺死轉移過程中在體液中的癌細胞的效果、或例如任一者之組織著床後立即抑制、殺死微小癌細胞的效果。又，可期待癌轉移的抑制、預防效果，尤其於癌的外科移除後。因此，可期待抑制癌轉移的效果。
藉由全身性療法對病患投予本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物，及另外藉由局部投予至癌症組織，可期待發揮治療效果。
本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物所適用的癌症種類之例包括肺癌、腎癌、泌尿上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、或食道癌，然而，其未被限定於此等，只要其為於治療受試者的癌細胞中，為表現抗體-藥物結合物中之抗體可辨識的蛋白質的癌細胞即可。
本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物可較佳被投予至哺乳動物，但其更佳為被投予至人類。 [醫藥組成物及投予模式]
考量劑量或投予濃度，含有本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物的醫藥組成物中所使用的物質可由此領域中通常使用的製劑添加物等適當選擇而適用。
本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物可作為含有至少一種醫藥上適合的成分的醫藥組成物被投予。例如，該醫藥組成物可典型地含有至少一種醫藥載劑(例如，滅菌液體)。於一些實施方式，該液體包括，例如，水及油(石油及動物起源、植物起源或合成起源之油)。該油可為例如，花生油、大豆油、礦物油、或芝麻油。當醫藥組成物被靜脈內投予時，水為更代表性的載劑。鹽水溶液、右旋糖水溶液及甘油水溶液亦可用作液體載劑，尤其用於注射用溶液。適當的醫藥賦形劑為為本項技術領域所周知。若需要時，上述組成物亦可含有微量之潤濕劑、乳化劑、或pH緩衝劑。適當的醫藥載劑之例被E.W.Martin揭示於「Remington's Pharmaceutical Sciences」。該調配劑對應投予模式。
各種劑型之藥理學上可接受的載劑為本項技術領域中所熟知。例如，固體製劑之賦形劑、潤滑劑、結合劑、及崩散劑為已知；液體製劑之溶劑、助溶劑、懸浮劑、等滲劑、緩衝劑、及緩和劑為已知。於一些實施方式，醫藥組成物包括一或多種額外的組分，諸如一或多種防腐劑、抗氧化劑、安定劑等。
此外，揭示的醫藥組成物可被調配成溶液、微乳液、脂質體、或其他適合高藥物濃度的序化結構(ordered structure)。載劑可為溶劑或分散介質，包含例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、及液體聚乙二醇等)、及其適合的混合物。例如藉由使用諸如卵磷脂的包衣、在分散液的情況下藉由維持所需的粒徑以及藉由使用表面活性劑，可維持適當的流動性。於一些實施方式中，較佳於組成物中包括等張劑，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇、或氯化鈉。藉由在組成物中包括延遲吸收的試劑，例如單硬脂酸鹽和明膠，可促使可注射的組成物的延長吸收。
可以藉由將所需量的活性化合物與一種或上述列舉成分的組合併入適當的溶劑中，隨後進行滅菌微孔過濾，而製備無菌注射溶液。通常，藉由將活性化合物併入無菌媒劑中來製備分散體，該無菌媒劑含有鹼性分散介質和所需的其他上文列舉的成分。於用於製備無菌可注射溶液的無菌粉末的情形，較佳的製備方法為真空乾燥及冷凍乾燥(凍乾)，其從其先前無菌過濾的溶液中產生活性成分加上任何其他所欲成分的粉末。
各種遞送系統為已知且可用於投予本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物。投予路徑之例包括皮內、肌肉內、腹腔內、靜脈內、及皮下路徑，但並未限定於此等。例如該投予可藉由注射(injection)或推注注射(bolus injection)。依據特定的較佳實施方式，抗體-藥物結合物的投予藉由注射進行。腸胃外投予為較佳投予途徑。
依據代表性實施方式，醫藥組成物被開處方呈適合靜脈內投予至人類的醫藥組成物，依據常規程序。用於靜脈內投予之組成物一般為無菌且等張的水性緩衝溶液的溶液。若需要，該藥物可含有助溶劑及緩解注射位置疼痛的局部麻醉劑(例如，利多卡因(lignocaine))。一般而言，上述成分分別以含於容器中的凍乾粉或無水濃縮物的任何一種形式被提供，其藉由密封於具有一定量活性劑的安瓿或小袋中或以單位劑型的混合物獲得。當藥物為藉由注射投予的形式，其可由含無菌藥物等級的水或鹽水的注射瓶投予。當藉由注射投予藥物時，可提供用於注射的無菌水或鹽水的安瓿瓶，使得上述成分於投予前彼此混合。
本發明之醫藥組成物可為僅含有本案之抗TROP2抗體-藥物結合物之醫藥組成物或含有該抗TROP2抗體-藥物結合物及至少一種非該結合物之癌症治療劑的醫藥組成物。本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物可與其它癌症治療劑同時或連續投予。據此可使抗癌效果增強。以如此目的被使用的其他抗癌劑係可與抗體-藥物結合物同時、各別、或連續地被投予至個體，且可變換各自之投予間隔而投予。癌症治療劑之例包括亞伯杉(abraxane)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、順鉑、吉西他濱(gemcitabine)、愛萊諾迪肯(irinotecan)(CPT-11)、太平洋紫杉醇、培美曲塞(pemetrexed)、索拉非尼(sorafenib)、長春鹼、國際公開第2003/038043號所述藥物、LH-RH類似物(亮丙瑞林(leuprorelin)、戈舍瑞林(goserelin)等)、磷酸雌二醇氮芥(estramustine phosphate)、雌激素(estrogen)拮抗藥(他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)等)、及芳香酶抑制劑(阿那曲唑(anastrozole)、利妥唑(letrozole)、依西美坦(exemestane)等)，但只要具有抗腫瘤活性的藥物即可，並未限定。
該醫藥組成物可被調配成具有所欲組成及所需純度的調配物之冷凍乾燥調配物或液體調配物。當調配為冷凍乾燥調配物時，其可為含有此領域所使用的適當製調配物添加物的調配物。又於液體調配物亦同樣地，其可被調配為含有此領域所使用的各種調配物添加物的液體調配物。
醫藥組成物之組成及濃度可依投予方法而變化。然而，當抗體-藥物結合物具有對抗原的較高親和力時，含於本發明之醫藥組成物中的抗TROP2抗體-藥物結合物即使於小劑量下亦展現醫藥效果，即，就抗原的解離常數(即，Kd值)而言，較高親和性(=較低Kd值)。如此，為了決定抗體-藥物結合物的劑量，可基於抗體-藥物結合物和抗原之間的親和性有關的情況而決定劑量。當本發明之抗體-藥物結合物被投予至人類時，可投予例如，約0.001至100 mg/kg一次或以1至180日之間隔投予數次。 [表現TROP2的癌症]
TROP2於上皮癌中被高度表現，且其表現與不良的生存能力有關。表現TROP2的癌症之例包括，但未限於肺癌、腎癌、尿道上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、及食道癌。此等癌症之任一種皆可藉由揭示的ADC及ADC投劑方案進行治療。然而，應理解，只要癌細胞表現TROP2，其即可依據所揭示的方法對其治療，即使其未落入前述的癌症類別中。
非小細胞肺癌(NSCLC)為肺癌之一種型式，其特別適合於利用已揭示的ADC及投藥方案的治療。例如，實施例5-7詳述第I期臨床研究，其中所揭示的ADC被投予至患有NSCLC的受試者。
所揭示的靶向TROP2的ADC可被用於治療前述表現TROP2的癌症之任一者。 [治療方法及用途]
本揭示提供治療癌症之方法，包含投予本文所揭示的抗TROP2抗體-藥物結合物。本文亦提供揭示的任何抗TROP ADC用於治療癌症。
於一些實施方式，該癌症為表現TROP2的癌症。表現TROP2的癌症可包括，但未限於，肺癌(例如，非小細胞肺癌或NSCLC)、腎癌、尿道上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、及食道癌。
於本揭示之目的，術語「過度表現TROP2的癌症」 並未被特別限制，只要其被所屬技術領域中具通常知識者辨識為過度表現TROP2的癌症即可。過度表現TROP2的癌症之較佳例可包括於免疫組織化學法(IHC)或原位雜交法(ISH)中給予TROP2表現為高分的癌症。本發明之原位雜交法包括螢光原位雜交法(FISH)及雙色原位雜交法(DISH)。
藉由免疫組織化學法對TROP2表現的程度進行評分的方法，或藉由原位雜交法決定對TROP2表現的陽性或陰性的方法並未特別限制，只要其被所屬技術領域中具通常知識者所認可即可。
本發明之ADC及治療方法及用途較佳為用於治療不宜手術的癌症或復發性的癌症。
於一些實施方式，本發明之ADC及治療方法及用途亦可用於作為治療癌症之醫藥組成物，其包含本發明所使用的抗體-藥物結合物、其鹽、或其水合物作為活性成分，及醫藥上可接受的調配成分。
於一些實施方式，本發明之ADC及治療方法及用途對癌症展現優異的抗腫瘤活性，其對現有抗癌藥表現出抗性(即，抗藥性癌症)，特別是對現有抗癌藥獲得抗藥性的癌症(即，繼發性抗藥性癌症)。如此，當將本發明之治療用ADC應用於癌症病患中對現有抗癌藥物具有抗性的癌症病患組(具有以現有抗癌藥治療史的病患)時，本發明之治療用ADC發揮顯著的抗腫瘤效果。尤其，要治療的癌症可能對以EGFR-抑制劑治療(即，吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼、阿法替尼)、ALK-抑制劑治療(即，艾樂替尼、克唑替尼、色瑞替尼)、鉑系化學治療劑(即，順鉑、卡鉑)、及/或檢查點抑制劑治療(即，納武利尤單抗、派姆單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗、伊匹單抗、度伐鲁單抗、替雷利珠單抗、信迪利單抗、西米普利單抗)為有抗性或難治性的治療。
本發明本發明之治療用ADC可代替現有的抗癌藥或與此等現有的抗癌藥組合投予於癌症病患，從而對例如具有已獲得對此等現有抗癌藥抗藥性的癌症展現高治療效果。
如此，於所揭示的方法及用途之一些實施方式，要治療的癌症可為肺癌(例如，非小細胞肺癌或NSCLC)、腎癌、尿道上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、及食道癌之抗性型。
本發明之治療用ADC及方法或用途可延緩癌細胞發展、抑制其生長，及進一步殺死癌細胞。此等效果可使癌症病患免於由癌症引起的症狀或實現癌症病患的生活品量(QOL)的改善，並藉由維持癌症病患的生命而獲得治療效果。即使本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物並未達成殺死癌細胞，藉由抑制或控制癌細胞生長，其可提供癌症病患之較高QOL，同時達成較長期存活。
於所揭示的方法及用途之一些實施方式中，該ADC可被單獨用於作為藥物，或其可於輔助療法中與另外的療法組合作為藥物且可與外科手術、放射線療法、荷爾蒙療法等組合。再者，其亦可作為新輔助療法中的藥物療法之藥物使用。於一些實施方式，該ADC可與下列組合，例如，抗癌劑，包括但未限於，亞伯杉、太平洋紫杉醇、順鉑、卡鉑、吉西他濱、愛萊諾迪肯(CPT-11)、培美曲塞、索拉非尼、長春鹼、國際公開第2003/038043號所述藥物、LH-RH 類似物(亮丙瑞林、戈舍瑞林等)、磷酸雌二醇氮芥、雌激素拮抗藥(他莫昔芬、雷洛昔芬等)、芳香酶抑制劑(阿那曲唑、利妥唑、依西美坦等)、EGFR-抑制劑治療(吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼、阿法替尼)、ALK-抑制劑治療(艾樂替尼、克唑替尼、色瑞替尼)、及/或檢查點抑制劑治療(納武利尤單抗、派姆單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗、伊匹單抗、度伐鲁單抗、替雷利珠單抗、信迪利單抗、西米普利單抗)。
除了上述治療方法及用途之外，亦預期抑制小的轉移性癌細胞的生長並進一步殺死它們的預防效果。尤其，當於原發性癌細胞中證實TROP2的表現時，藉由投予本發明的抗TROP2抗體-藥物結合物，可預期癌症轉移的抑制或預防效果。例如，可以預期在轉移過程中抑制及殺死體液中的癌細胞的效果，或者例如在植入任何組織後立即抑制及殺死小癌細胞的效果。因此，特別是在外科手術切除癌症後，可以預期癌症轉移之抑制或預防效果。
於該方法及用途之一些實施方式中，罹患癌症的受試者(例如，表現TROP2的癌症)可被投予約0.1至約15 mg/kg、約0.5至約12 mg/kg、約1.0至約10 mg/kg、或約4至約8 mg/kg。換言之，於一些實施方式中，該ADC被投予至受試者之劑量可為約0.1、約0.2、約0.3、約0.4、約0.5、約0.6、約0.7、約0.8、約0.9、約1.0、約1.25、約1.5、約1.75、約2.0、約2.25、約2.5、約2.75、約3.0、約3.25、約3.5、約3.75、約4.0、約4.25、約4.5、約4.75、約5.0、約5.25、約5.5、約5.75、約6.0、約6.25、約6.5、約6.75、約7.0、約7.25、約7.5、約7.75、約8.0、約8.25、約8.5、約8.75、約9.0、約9.25、約9.5、約9.75、約10.0、約10.25、約10.5、約10.75、約11.0、約11.25、約11.5、約11.75、或約12 mg/kg以上。於一些實施方式，被投予至受試者之該ADC之劑量可為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25、11.5、11.75、或12mg/kg以上。於一些實施方式，該劑量可為約2mg/kg至約10mg/kg、約2 mg/kg至約8mg/kg、約4mg/kg至約10mg/kg、約4 mg/kg至約8 mg/kg、約6 mg/kg至約10 mg/kg、或約6 mg/kg至約8 mg/kg。於較佳實施方式中，劑量可為2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8 mg/kg、9mg/kg、或10mg/kg，但更佳為4mg/kg、6mg/kg或8mg/kg。
於該方法及用途之一些實施方式中，抗TROP2 ADC或其醫藥組成物經由腸胃外投予被投予至罹患癌症的受試者。較佳的腸胃外投予途徑包括但不限於注射，例如靜脈內、肌肉內、及皮下注射。用於本發明之抗TROP2抗體-藥物結合物可被預期藉由作為對病患的全身性療法的應用，以及此外，對於癌症組織的局部應用，而發揮治療效果。
投予時機或方案可為每1週一次(q1w)、每2週一次(q2w)、每3週一次(q3w)、每4週一次(q4w)、每5週一次(q5w)、每6週一次(q6w)、每7週一次(q7w)、每8週一次(q8w)、每9週一次(q9w)、或每10週一次(q10w)，但較佳為每3或4週一次。
投予方案可被調整以提供最佳期望反應(例如，如腫瘤消退或緩解的治療反應)。例如，於一些實施方式，投予方案可為2 mg/kg 每3週一次(q3w)、4 mg/kg 每3週一次(q3w)、6 mg/kg 每3週一次(q3w)、8 mg/kg 每3週一次(q3w)、2 mg/kg 每4週一次(q4w)、4 mg/kg 每4週一次(q4w)、6 mg/kg 每4週一次(q4w)、或8 mg/kg 每4週一次(q4w)。於一些實施方式，可單次推注投予，而於一些實施方式，可隨時間經過而分成數次投予，亦可根據情況指示按比例減少或增加劑量。
此外，儘管該方法及用途的受試者一般為癌症病患，但病患的年齡未被限制。所揭示的方法及用途有用於治療癌症、惡性疾病或癌細胞增殖，並在所有年齡組和同齡組(cohorts)中具有各種復發和預後結果。如此，於一些實施方式，該受試者可為兒科受試者，然而於其它實施方式，該受試者可為成人受試者。
提供下列實施例以說明本發明。然而，應了解本發明並未限定於此等實施例中所述的特定條件或細節。 實施例 [實施例1–抗體藥物結合物之製造]
依據國際公開No. WO2015/098099及國際公開No. WO2017/002776所揭示的生產方法，抗TROP2抗體(例如，包含由SEQ ID NO：45中胺基酸位置1至451的胺基酸序列所組成的重鏈及由SEQ ID NO：46中胺基酸位置1至214的胺基酸序列所組成的輕鏈的抗體)被用於製造抗體-藥物結合物(1)及抗體-藥物結合物(2)(下文稱為「抗體-藥物結合物(1)」及「抗體-藥物結合物(2)」)，其中經由硫醚鍵，抗TROP2抗體被結合至下式所示的藥物連接子：
Figure 02_image037
其中n表示每單一抗體分子之平均藥物對抗體的比值(DAR)；且抗體-藥物結合物(1)之n之值落入3.5至4.5的範圍；然而，抗體-藥物結合物(2)之n之值落入6.5至8.0。
抗體-藥物結合物(1)及抗體-藥物結合物(2)之一般結構及序列見於圖1及2。 [實施例2–抗體藥物結合物之抗腫瘤效果的試驗]
於此實驗之目的，使5-6週齡雌性BALB/c裸鼠(Charles River Laboratories，日本)歷經實驗。將購自ATCC之人類胰臟腺癌細胞株CFPAC-1細胞懸浮於鹽水，並移植4×106 細胞至各該雌性裸鼠的身體右側部分。移植14日後，將小鼠分組(第0日)。於單次投予組(每3週一次)，於第0日以0.3mg/kg或1mg/kg之劑量投予抗體-藥物結合物(1)及(2)。於頻繁投予組(於三週間每週一次)，於第0日、第8日及第14日以0.3mg/kg之劑量投予抗體-藥物結合物(1)及(2)。媒劑投予組被定為對照組。藉由計算獲得第22日之腫瘤生長抑制(TGI)。於投予組中沒有一組確認有諸如體重損失之特別顯著的發現。
測量/計算表達式：每週兩次以電子數位卡尺(CD-15CX，Mitutoyo Corp.)測量腫瘤的長軸及短軸，並計算腫瘤體積(mm3 )。計算表達式如下所示： 腫瘤體積(mm3 )=1/2×長軸(mm)×[短軸(mm)]2
依據下列表達式計算腫瘤生長抑制(TGI)： 腫瘤生長抑制(%)=100×(1-T/C) 其中T表示投予試驗物質的小鼠組之平均腫瘤體積；且 C表示對照小鼠組之平均腫瘤體積。
抗體-藥物結合物(1)及(2)分別以乙酸鹽緩衝鹽水(pH5.5)(Nacalai Tesque Inc.製造，以下稱為「ABS緩衝液」)稀釋。經由尾靜脈投予該稀釋液(10 mL/kg)。
抗體-藥物結合物(1)及(2)之抗腫瘤效果示於圖3。於抗體-藥物結合物(1)，以0.3mg/kg之劑量的單次投予組之TGI為15%及以1mg/kg之劑量的單次投予組之TGI為86%；然而，以劑量(0.3mg/kg)之頻繁投予組之TGI為34%。於抗體-藥物結合物(2)，以0.3mg/kg之劑量的單次投予組之TGI為43%且以1mg/kg之劑量的單次投予組之TGI為94%；然而，以劑量(0.3mg/kg)之頻繁投予組之TGI為80%。
由上述之結果，於抗體-藥物結合物(1)及(2)兩者之情形，當以1mg/kg之劑量單次投予組與以0.3mg/kg之劑量頻繁投予組相比，兩者提供總量幾乎相等的劑量，單次投予組之TGI高於頻繁投予組。由此，證實僅一次投予三週的總劑量的單次投予方法比重複投予一周的劑量三次的頻繁投予方法具有更優異的功效。於抗體-藥物結合物(1)及(2)之間的比較，抗體-藥物結合物(1)之以1mg/kg劑量的單次投予組的TGI高於抗體-藥物結合物(2)以0.3mg/kg 劑量的單次投予組的TGI且低於抗體-藥物結合物(2)以1mg/kg劑量的單次投予組的TGI。由此，證實抗體-藥物結合物(1)及(2)之間的治療劑量差異在三倍範圍內。 [實施例3–抗體藥物結合物之安全性評估]
依據實施例1所製造的抗體-藥物結合物(1)及(2)被分別投予至交叉反應性物種，食蟹猴。更具體而言，以每三週一次的間隔投予抗體-藥物結合物(1)，共計三次；然而，以一週一次的間隔投予抗體-藥物結合物(2)，共計二次。於抗體-藥物結合物(1)的情形，觀察持續直到最終投予的第二天。於抗體-藥物結合物(2)的情形，觀察持續直到最終投予的第二週。結果，抗體-藥物結合物(2)之最高非重度毒性劑量(HNSTD)少於10 mg/kg；然而，抗體-藥物結合物(1)之HNSTD為30 mg/kg。如此，證實抗體-藥物結合物(1)較抗體-藥物結合物(2)，具有較佳安全性。 [實施例4–於人類中抗體-藥物結合物(1)之有效用量/劑量之評估]
下文，「抗體-藥物結合物(1)」亦可稱為「DS-1062a」。
抗體-藥物結合物(1)(即，DS-1062a)以0.2、0.6、2或6 mg/kg之劑量靜脈內投予至食蟹猴一次。之後，基於抗體-藥物結合物(1)之血漿濃度，使用目標介導的藥物處置模型計算藥物動力學參數。又，評估重複投予於人類期間之抗體-藥物結合物的血漿濃度隨時間的變化。抗體-藥物結合物(1)每三週重複一次由0.27、0.54、0.81、1.6、3.2和6.4 mg/kg組成的投劑週期，三次(q3w × 3)。將結果示於圖4。將人類中估計的抗體-藥物結合物(1)隨時間的血漿濃度變化與在帶有CFPAC-1腫瘤的小鼠模型中第21日的血漿濃度進行比較。結果，每三週一次對人類投予時(q3w)估算的血漿濃度的劑量超過於小鼠中顯示出腫瘤消退效果的最低濃度(1 mg/kg投予組，0.312μg/mL)，於投予間隔的一半和大部分期間，分別為0.27及0.81mg/kg。由此，估計：抗體-藥物結合物(1)在人類中的有效用量/劑量為每三週一次0.27mg/kg或更高。 [實施例5–初始第1期臨床研究]
[簡介]
DS-1062a為具有新穎拓樸異構酶I抑制劑(依喜替康衍生物；DXd)之滋胚層細胞表面抗原2(TROP2)-標靶抗體-藥物結合物。在酶處理後DS-1062a結合至細胞表面上的TROP2，內化並釋放DXd至細胞質，其抑制拓撲異構酶I並導致目標細胞的細胞凋亡。
TROP2於包括肺癌的上皮癌中被高度表現，並與不良生存有關。於臨床前研究中，DS-1062a於異種移植小鼠模型中顯示出有希望的抗腫瘤活性。
[目的]
此研究之目的係評估DS-1062a之安全性及耐受性並確認最大耐受劑量(MTD)及推薦的擴展劑量(RDE)(參見clinicaltrials.gov identifier NCT03401385)。
[研究設計及方法]
第1期研究為DS-1062a的多中心、開放標籤、多劑量、首次在人體中的研究，該研究招募了美國及日本的受試者。如圖5所示，此研究包括劑量遞增治療群組及劑量擴展治療群組。劑量遞增治療群組包括DS-1062a的單次靜脈輸注及21日的劑量限制毒性(DLT)觀察期(週期1))。劑量擴展治療群組包括在RDE處向NSCLC受試者投予DS-1062a。
劑量遞增治療群組之主要目標係識別RDE的MTD並評估劑量的安全性和耐受性。
劑量擴展治療群組之主要目標係確認於RDE ，DS-1062a之安全性及耐受性。
次要目標包括測量DS-1062a的藥物動力學(PK)性質、總TROP2抗體、藥物成分、以及DS1062a的抗腫瘤活性。探索性目標包括評估與對DS-1062a的反應相關的生物標誌物。
納入標準包括：病患年齡≥20歲(日本)或≥18歲(美國)，有病理學證明的轉移性NSCLC，無標準治療可選擇；美國東部腫瘤協作組的體能狀態(Eastern Cooperative Oncology Group performance status)為0或1；基於RECIST版本1.1之可量測的疾病；預期壽命≥3個月；及用於藉由免疫組織化學測量近期的TROP2水平之可用的腫瘤組織。
排除標準包括：患有多種原發性惡性腫瘤的病患(除了已適當切除的非黑色素瘤皮膚癌、經過原位治療的治愈性疾病、或其它經過治愈且無疾病證據≥3年的實體瘤)；或具有臨床顯著意義/可疑的肺部疾病。
病病患評估包括心臟超音波檢查或多閘門式造影掃描，12導聯心電圖、AE、PK、人類抗人類抗體、生物標誌物、及在預先指定就診時間的腫瘤評估。在這初始第1期研究中所招募的病患的人口統計及基線特徵如圖6所示。
確定MTD的DS-1062a之劑量遞增係使用以過量控制原則逐步遞增的貝葉斯(Bayesian)邏輯回歸模型，藉由修飾的連續重新評估方法進行指導。使用柯羅普-皮爾遜(Clopper-Pearson)方法以95%信賴區間(Cl)總結客觀反應率(ORR)；使用Kaplan-Meier方法總結無進展生存期(PFS)/總體生存期(OS)。使用描述性統計總結安全性終點、DS-1062a的PK參數、抗TROP2抗體、DXd、及血漿抗藥物抗體。
[結果]
在七個DS-1062a投劑組中，有39名病患進入研究截止期，並納入病患的人口統計學和基線特徵。病患(N=39)在8.86(3.0-31.1)週的中位(範圍)持續時間內，暴露於DS-1062a的中位(範圍)為3.0(1-10)個治療週期。
兩名病患需要DS-1062a劑量中斷(4 mg/kg組中的一名及8 mg/kg組中的一名)，而6.0 mg/kg組中的1名病患需要降低劑量。總體上，有23名(54.8%)病患中止DS-1062a的治療。停藥的主要原因係13名病患各RECIST的PD(n=4 各[0.5和2.0 mg/kg]；n=3 [1.0 mg/kg]；n=1各 [0.27和4.0 mg/kg])。因臨床進展而停藥的兩名病患(每人分別為0.27 mg/kg和6.0 mg/kg中的1名)，退出的兩名病患(每人分別為0.5 mg/kg和4.0 mg/kg中的1名)，及一名病患基於醫生的決定停藥(1.0 mg/kg組)。五名病患(於1.0mg/kg組中的n=3，0.27-mg/kg組中的n=2)由於「其它」原因而停藥。
總體上，有87.2%(34/39)的病患報告≥1 TEAE，但除其中一個報告的TEAE以外，所有病患均被認為≤3級(圖7)。最常見的TEAE為疲勞，被報告於13位病患(33.3%)。除報告於2名病患的3級疲勞外，所有3級TEAE均僅各報告於1名病患(0.5和2.0 mg/kg投劑組各1名)。
於23/39(59.0%)的病患中報告與藥物相關的TEAE，其中此等病患之21/23(91.3%)具有此等TEAE的程度定為1級或2級。按頻率下降順序，最頻繁的TEAE(≥3例病患)為噁心(n=10)；輸液相關反應(n=8)；疲勞(n=7);脫髮(n=6);嘔吐(n=5)；貧血和皮疹(各n=4)；及食慾降低和口腔炎(各n=3)。與輸注相關的反應均為1級或2級事件，且為可控制/可逆。
10/39(25.6%)病患中報告了嚴重的TEAE；大多數(n=8)為3級，各1位為2級和5級(敗血症5級；6.0 mg/kg投劑組)。超過1名病患無嚴重的TEAE。僅1例嚴重的TEAE被認為與藥物有關(發熱，2級；4.0 mg/kg投劑組)。
於6.0 mg/kg投劑組的病患中發生了一種劑量限制性毒性(DLT)(眼瞼皮疹，等級3；已解決)。尚未達到MTD。
於35例可評估腫瘤的病患中，觀察到7例PR(基於RECIST，但包括單點PR，尚未確認反應)，如圖8所示。數據切割後，觀察到另外3例PR(均於8.0 mg投劑組)，共計觀察到10個PR。
於三名病患中進行了電腦(圖9 A、C和D)和正子發射(圖9B)斷層掃描。於開始以DS-1062a治療4.5個月後，劑量為4.0 mg/kg的兩投劑組的病患中，證實腫瘤大小最大減少36.6%(圖9A)和38.4%(圖9B)。於2 mg/kg投劑組中的另一病患在開始以DS-1062a治療後3個月腫瘤大小最大減少了65.5%(圖9C)，並且在治療開始後3個月和7個月內，多發肺轉移的數量顯著減少(非目標病變)(圖9D)。
標靶病變中離基線之最長尺寸的總和的最佳百分比變化說明於圖10。在2.0 mg/kg投劑組病患中，觀察到最佳百分比變化(腫瘤減少68%)。
關於藥物動力學，DS-1062a的全身暴露以近似與劑量成比例的方式增加，如圖11所示。DS-1062a的血漿水平與總抗TROP2抗體相似，暗示在循環中DS-1062a為穩定的。DXd的暴露量低於DS-1062a。
[概要]
截至數據截止，DS-1062a為耐受性良好。於6.0 mg/kg的投劑組中觀察到一種DLT 3級皮疹，該皮疹為暫時的且可逆的。以DS-1062a觀察到10例PR和16例穩定疾病。其中具PRs病患的兩例先前曾以EGFR或ALK抑制劑治療(即，艾樂替尼、克唑替尼、色瑞替尼、奧希替尼)。該研究的總體療效率被提供於圖12。 [實施例6–截至新截止日期的第1期臨床研究]
在初始數據截止後，於第1期研究中招募另外的病患，使參與者總數達到59(N=59)。所有病患均患有未切除的晚期NSCLC腫瘤，此等腫瘤對於護理標準(SOC)為復發/難治的。病患為57.7%男性，88.5%具有IV期疾病，73.1%具有腺癌組織學，80.8%具有美國東部腫瘤協作組的體能狀態(ECOG PS)為1，並且86.5%在先前的免疫檢查點抑制劑治療為失敗的。使用相同的劑量遞增和劑量擴展研究設計。
無論是否有因果關係，具有治療出現的不良事件(TEAE)的截至新截止日期的第1期研究中病患的數量示於圖13。簡而言之，劑量限制毒性(DLT)達到10 mg/kg，且最大耐受劑量(MTD)於8 mg/kg被建立，其亦為未來劑量擴展部分中的推薦擴展劑量(RDE)。病患的中位暴露期間為10.6週(範圍3.0–43.1)。14例(26.9%)病患發生嚴重TEAE，3例(5.8%)病患死亡；沒有死亡與研究藥物有關。與劑量減少、中斷或停藥相關的TEAEs分別發生於5例(9.6%)、5例(9.6%)和2例(3.8%)的病患中。以6.0 mg/kg劑量治療的一名疾病進展的病患(1.9%)發生特別引起呼吸衰竭的肺部不良事件(5級)，被判定為非間質性肺病(ILD)。包括數據截止後的病例在內，觀察到4例尚未判定的可能的ILD報告(1例2級肺炎[6.0 mg/kg]，1例2級組織性肺炎[8 mg/kg]，1例2級肺炎[8 mg/kg]和1例5級[於疾病進展病患中呼吸衰竭；8.0 mg/kg]。
在研究的劑量遞增治療群組中，所有劑量均觀察到十二(12)個局部反應(至少確認10個反應)。劑量為8 mg/kg時，有5/7的病患出現局部反應(PR)，而有2/7的病患顯示穩定疾病(SD)。在該組中6/7繼續治療。圖14顯示在受試者的標靶病變中離基線最長尺寸測量值之總和的最佳百分比變化；圖15顯示明顯的劑量效應對反應頻率的影響，由於在高投劑組的病患觀察到更一致及明顯的腫瘤大小縮小；及圖16顯示在各個治療組中觀察到的抗腫瘤活性(表示病患先前接受過EGFR、ALK及HER2靶向治療)。
經由免疫組織化學評估治療前的腫瘤生檢以確定TROP2表現，並將病患反應示於圖17。如圖12、17、21及26所示，一些病患接受先前的EGFR抑制劑或ALK抑制劑治療或接受免疫-腫瘤學治療。達到部分反應(PR)的八名病患中有六名具有大於中位數之H分數，而穩定疾病(SD)的8/15及進行性疾病的4/12具有大於中位數之H分數。此與臨床前數據(參見圖18)一致，該臨床前數據顯示抗體藥物結合物(1)(即DS-1062a)於肺癌異種移植小鼠模型中具有抗腫瘤活性，而在TROP2陽性腫瘤(NCI-H2170及HCC827)中具有更強的抗腫瘤活性，與TROP2陰性腫瘤(Calu-6)相反。
亦藉由評估無細胞DNA(cfDNA)而確定可變等位基因頻率(variable allele frequencies，VAF)的變化。於第3週期的第1天(C3D1)和治療結束(EOT)時檢查了VAF。顯示於圖19之此等結果，指出DS-1062a降低了達到SD和PR的病患的cfDNA。
綜上所述，DS-1062a於劑量高達8 mg/kg時為良好耐受性，其證實為MTD及RDE。不能耐受10 mg/kg，兩名受試者具有3級黏膜炎。雖然8 mg/kg和6 mg/kg兩者為良好耐受性，但與6 mg/kg相比，8 mg/kg表現出更佳的初步療效信號，在8 mg/kg時具有較高的總體反應率(ORR)。確實，圖20顯示於8 mg/kg投劑組中，ORR為最佳。
在2.0–8.0 mg/kg的範圍內觀察到抗腫瘤活性的劑量依賴效果。在經過高度預處理的未選擇的NSCLC病患中，包括免疫檢查點抑制劑在內的護理標準(SOC)復發或進展，在劑量遞增期間觀察到十二(12)個部分反應。功效結果摘要被提供於圖21。 [實施例7–抗體藥物結合物之初步功效]
截至2019年11月16日，已以DS-1062a治療的95名受試者中有88名可評估其反應。
於6 mg/kg劑量組(5/18有反應的受試者，全部為PR)中，研究者評估的總反應率(ORR；未確認)為27.8%(95%CI：9.7、53.5)且於8 mg/kg劑量組(13/34，全部為PR)中為38.2%(95%CI：22.2、56.4)(表2及圖22)。疾病控制率(DCR=CR+PR+SD)在6 mg/kg中為72.2%，在8 mg/kg中為79.4%。
在數據截止日期，於6 mg/kg劑量組中所有5名PR受試者皆繼續治療，沒有疾病進展或死亡。
於8 mg/kg劑量組中，13名PR受試者中有6名正在進行治療，而無疾病進展或死亡；2名進行性疾病；1名死亡；及4名終止DS-1062a，由於非疾病進展或死亡的其他原因。表 2- 截至 2019 年 11 月 16 日，研究 DS1062AJ101 中的研究者於可評估受試者中評估的客觀反應率、疾病控制率及最佳總體反應情況的摘錄 (J101 ，反應可評估分析組 )
功效變量 劑量遞增 * 劑量遞增+劑量擴展 劑量遞增
2 mg/kg (N=6) 4 mg/kg (N=6) 6 mg/kg (N=18) 8 mg/kg (N=34) 10 mg/kg (N=8)
ORR(CR+PR) 1(16.7) 2(33.3) 5(27.8) 13(38.2) 1(12.5)
95%確切 CIa 0.4, 64.1 4.3, 77.7 9.7, 53.5 22.2, 56.4 0.3, 52.7
DCR(CR+PR+SD) 4(66.7) 4(66.7) 13(72.2) 27(79.4) 7(87.5)
95%精確CIa 22.3, 95.7 22.3, 95.7 46.5, 90.3 62.1, 91.3 47.3, 99.7
BOR=最佳客觀反應；CI=信賴區間；CR=完全反應；DCR=疾病控制率；NE=無法評估； ORR=客觀反應率；PD=疾病進展；PR=部分反應；SD=穩定疾病   *低於2mg/kg的劑量無反應；因此，未呈現0.27mg/kg、0.5mg/kg、及1mg/kg的劑量組。  a 使用2側精確(Clopper-Pearson)法
可評估反應的受試者為具基線及基線後腫瘤評估的受試者，或中止研究治療的受試者。
[藥物動力學]
在61例接受DS-1062a(0.27 mg/kg至10 mg/kg)的受試者中，使用非房室模型分析(Non-compartmental analysis)評估初步的單劑及多劑PK。
圖23顯示重複投劑DS-1062a 8 mg/kg時，DS-1062a、總抗體及游離藥物(在圖中命名為有效載荷)之血漿濃度。平均AUClast、Cmax、及平均終末半衰期(t1/2)分別為914 µg∙d/mL、196 µg/mL及5.45天。
DS-1062a及總抗TROP2抗體的血漿水平相似且游離藥物的暴露量低於DS-1062a，暗示DS-1062a於循環中穩定。
[結論]
在第I期研究中，證明DS-1062a為可耐受且安全劑量高達8 mg/kg。
在88位可評估療效的受試者中，DS-1062a在2 mg/kg或更高劑量下為有效，於8 mg/kg組中達到ORR為38.2%(13/34位受試者)和DCR為79.4%(27/34位受試者)。
結果優於在NSCLC中經過免疫檢查點抑制劑和鉑系化療後用作標準療法的多西他賽(docetaxel)(表3)。
此外，先前有90.9%(20/22個受試者)的PR受試者已經接受過免疫檢查點抑制劑(例如，納武利尤單抗、派姆單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗、伊匹單抗、度伐鲁單抗)的治療，且所有受試者先前接受過鉑系化學療法(例如，順鉑、卡鉑)治療。如此，DS-1062a已顯示出對此等標準療法為難治療或不耐受的NSCLC 受試者替代多西他賽的潛力。
此外，Sactizumab govitecan，一種在美國開發的靶向TROP2的競爭性抗體-藥物結合物，於接受標準治療的受試者的第2期研究中，於NSCLC具有19%之ORR，暗示DS-1062a可能比該競爭性藥物更有效。
因此，用於本發明的含有DS-1062a的治療劑及治療性醫藥組成物，以及藉由投予本發明之DS-1062a為特徵的治療方法，已顯示對於不能切除的晚期非小細胞肺癌病患的治療為優異的，其中該病患的非小細胞肺癌對於標準療法為難治或復發或無法適用標準療法。
第I期研究連續地評估4 mg、6 mg及8 mg的安全性和初步療效。
此外，計劃進行多個第II期研究，預計於2020年開始。表 3–DS-1062a 與多西他賽之間的療效比較
  適應症(NSCLC) n ORR (95% CI) DCR (95% CI)
DS-1062a SOC後的NSCLC 全部參加者 4 mg/kg N=18 33.3% (2/6) (4.3%至77.7%) 66.7% (4/6) (22.3%至95.7%)
6 mg/kg N=18 27.8% (5/18) (9.7%至53.5%) 72.2% (13/18) (46.5%至90.3%)
8mg/kg N=34 38.2%b (13/34) (22.2%至56.4%) 79.4% (27/34) (62.1%至91.3%)
多西他賽單一療法1 在鉑系雙重化療期間或之後具有進展的NSCLC受試者 N=290 12.0% (36/290) (9.0%至17.0%) 54.0% (158/290) (未提供)
多西他賽+ 雷莫蘆單抗(ramucirumab) 組合療法2 第一線鉑系化療方案期間或之後具有進展的NSCLC受試者 N=628 22.9% (144/628) (19.7%至26.4%) 64.0% (402/628) (60.1至67.8%)
1.Borghaei H, Paz-Ares L, Horn L, et al. Nivolumab versus Docetaxel in advanced nonsquamous non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 2015;373(17):1627-39. 2.Garon EB, Ciuleanu TE, Arrieta O, et al. Ramucirumab plus docetaxel versus placebo plus docetaxel for second-line treatment of stage IV non-small-cell lung cancer after disease progression on platinum-based therapy(REVEL): a multicentre, double-blind, randomised phase 3 trial Lancet. 2014;384(9944):665-73, Suppl.: 3.
說明書中所述之所有專利及出版物指示本揭示所屬技術領域中具通常知識者的水平。所有專利及出版物皆以相同程度藉由引用併入本文中，如同每個各別的出版物被明確及單獨地指出藉由引用併入。
又，所屬技術領域中具通常知識者容易理解本揭示為良好適應於實現目的並獲得所述的結果及優點，以及其中固有的結果及優點。所屬技術領域中具通常知識者將想到其中的修飾及其他用途。此等修飾包含於本揭示的精神內，且由請求項的範圍所界定，該請求項陳述本揭示之非限制性實施方式。
無。
圖1顯示具有拓樸異構酶I抑制劑(DXd)之靶向TROP2的抗體-藥物結合物(此處稱為「抗體藥物結合物(1)」)之結構。ADC具有四肽連接子，其結合至抗體上的半胱胺酸殘基。圖中的ADC具有藥物對抗體比例為4：1(即，DAR4)。
圖2顯示可被併入所揭示的ADC之抗TROP2抗體之重鏈及輕鏈序列及連結至抗體的細胞毒性劑之圖解式。
圖3顯示鼠異種移植CFPAC-1腫瘤模型中抗體-藥物結合物(1)及(2)之抗腫瘤效果。
圖4顯示在人類中重複投予DS-1062a期間血漿濃度的估算。
圖5顯示用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)病患之第1期研究設計。
圖6顯示初始第1期研究之病患人口統計及基線特徵(實施例5)。
圖7顯示具有治療出現的不良事件(TEAE)之初始第1期研究(實施例5)中的病患數，其無論是否有因果關係，病患發生率≥10%。
圖8顯示初始第1期研究(實施例5)中受試者(N=35)之腫瘤反應。
圖9顯示在初始第1期研究(實施例5)中DS-1062a治療後，於標靶(A、B、及C)及非標靶(D)病變中的腫瘤反應。A組顯示以4.0mg/kg DS-1062a治療的病患中標靶病變大小的減小。B組顯示以4.0mg/kg DS-1062a治療的另一病患中標靶病變大小的減小。C組顯示以2.0mg/kg DS-1062a治療的病患中標靶病變大小的減小。D組顯示與C組相同的病患中非標靶病變的數目的減少。
圖10顯示在初始第1期研究(實施例5)中受試者的腫瘤大小的變化。頂部組顯示了來自初始第1期研究(實施例5)的受試者的標靶病變中由基線的最長尺寸測量值總和之最佳百分比變化(示例5)。底部組顯示由投劑組分開的腫瘤大小變化的蜘蛛圖。
圖11顯示於循環1(PK分析組)中DS-1062a的平均血漿濃度。
圖12顯示初始第1期研究(實施例5)所證明的功效之摘述。
圖13顯示具有治療出現的不良事件(TEAE)之截至新截止日期的第1期研究(實施例6)中的病患之數量，無論是否有因果關係。
圖14顯示自截至新截止日期的第1期研究的受試者的標靶病變中由基線之最長尺寸測量值的總和的最佳百分比變化(實施例6)。
圖15係藉由說明在截至新截止日期的第1期研究的過程中，每個投劑組腫瘤大小的百分比變化，而顯示對反應頻率的明確劑量效應(實施例6)。
圖16顯示跨多個劑量水平所觀察到的持久的抗腫瘤反應。許多病患出現部分反應(PR)或穩定疾病(SD)。於研究結束時僅兩名病患患有進行性疾病(PD)(實施例6)。
圖17顯示基於來自在截至新截止日期的第1期研究中的病患的治療前生檢的TROP2免疫組織化學H評分(IHC)(實施例6)。於彼等達到諸如部分反應(PR)之正向結果的病患中，IHC得分趨向於更高。為了說明此等圖式的目的，使用下列縮寫：間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase)抑制劑(ALKi)、基線(BL)、第三療程第1日(cycle 3 day 1(C3D1))、循環游離DNA(cfDNA)、上皮生長因子受體抑制劑(EGFRi)、治療結束(EOT)、人類上皮生長因子受體2抑制劑(HER2i)、免疫組織化學(IHC)、組織分數(H-score)、免疫-腫瘤學(I/O)、無法評估的(NE)、部份反應(PR)、進行性疾病(PD)、穩定疾病(SD)、病患(Pt)、變異等位基因頻率(variant allele frequency)(VAF)。
圖18顯示臨床前研究的結果，結果顯示抗體藥物結合物(1)於肺癌異種移植小鼠模型中具有抗腫瘤活性，與TROP2陰性腫瘤(Calu-6)相比，在TROP2陽性腫瘤(NCI-H2170及HCC827)中具有更強的抗腫瘤活性。
圖19顯示治療過程中，基於無細胞DNA(cell free DNA，cfDNA)的可變等位基因頻率發生變化。結果指出由於治療的結果，cfDNA通常會減少。
圖20顯示如藉由在截至新截止日期之第1期研究的各種投劑組中受試者的腫瘤體積變化而評估的總體反應率(ORR)(實施例6)。
圖21顯示藉由截至新截止日期之第1期研究證明的功效的摘述(實施例6)。
圖22顯示來自初步功效研究(實施例7)的劑量組的腫瘤大小變化的蜘蛛圖。
圖23顯示如藉由來自初步功效研究(實施例7)的藥物動力學測定的抗體-藥物結合物(1)、總抗體、及游離藥物(有效載荷(payload))的血漿濃度。
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無。

Claims (66)

  1. 一種用於治療或預防癌症之抗TROP2抗體-藥物結合物，該抗體-藥物結合物包含抗TROP2抗體及藉由連接子連接之抗腫瘤化合物，其中該連接子及該抗腫瘤化合物係以下式表示： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX) 其中-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-具有下式所表示的結構：
    Figure 03_image039
    其於第3位與抗TROP2抗體連接且於第1位之氮原子上與含此結構的連接子結構內之亞甲基連接，且(NH-DX)表示下式所表示的基：
    Figure 03_image041
    其中於第1位的胺基之氮原子為連接位， 其中該抗TROP2抗體於其重鏈可變區中包含由SEQ ID NO：23之胺基酸序列所組成的CDRH1、由SEQ ID NO：24之胺基酸序列所組成的CDRH2及由SEQ ID NO：25之胺基酸序列所組成的CDRH3，並於其輕鏈可變區中包含由SEQ ID NO：26之胺基酸序列所組成的CDRL1、由SEQ ID NO：27之胺基酸序列所組成的CDRL2及由SEQ ID NO：28之胺基酸序列所組成的CDRL3。
  2. 如請求項1之抗體-藥物結合物，其中每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數於2至8或3至8的範圍內。
  3. 如請求項1或2之抗體-藥物結合物，其中每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數為3.5至4.5。
  4. 如請求項1至3中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸1-121的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：46之胺基酸1-109的輕鏈可變區。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈。
  6. 如請求項1至5中任一項之抗體-藥物結合物，其中該抗TROP2抗體於重鏈之羧基末端缺乏離胺酸殘基。
  7. 如請求項1至6中任一項之抗體-藥物結合物，其中對罹患癌症的受試者投予劑量範圍為2 mg/kg至10 mg/kg之抗體-藥物結合物。
  8. 如請求項1至7中任一項之抗體-藥物結合物，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約4 mg/kg。
  9. 如請求項1至7中任一項之抗體-藥物結合物，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約6 mg/kg。
  10. 如請求項1至7中任一項之抗體-藥物結合物，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約8 mg/kg。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體-藥物結合物，其中藉由靜脈內投予，投予該抗體-藥物結合物。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體-藥物結合物，其中每3週一次或每4週一次投予該抗體-藥物結合物。
  13. 如請求項1至12中任一項之抗體-藥物結合物，其中該癌症係選自由肺癌、腎癌、泌尿上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、及食道癌所組成的群組。
  14. 如請求項13之抗體-藥物結合物，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體-藥物結合物，其中該癌症為抗性的或難治的。
  16. 如請求項15之抗體-藥物結合物，其中抗性或難治係自癌症由於以抗癌藥治療而獲得的抗性或難治性。
  17. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中該抗癌藥為EGFR-抑制劑、ALK-抑制劑、鉑系化療劑、或檢查點抑制劑。
  18. 如請求項16之抗體-藥物結合物，其中該抗癌藥為吉非替尼(gefitinib)、厄洛替尼(erlotinib)、奧希替尼(osimertinib)、阿法替尼(affatinib)、艾樂替尼(alectinib)、克唑替尼(crizotinib)、色瑞替尼(ceritinib)、順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、納武利尤單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、阿特珠單抗(atezolizumab)、阿維魯單抗(avelumab)、伊匹單抗(ipilimumab)、度伐鲁單抗(durvalumab)、替雷利珠單抗(tislelizumab)、信迪利單抗(sintilimab)、或西米普利單抗(cemiplimab)。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗體-藥物結合物，其中該癌症為表現TROP2的癌症。
  20. 如請求項19之抗體-藥物結合物，其中該表現TROP2的癌症為過度表現TROP2的癌症。
  21. 如請求項1至20中任一項之抗體-藥物結合物，其中該癌症為不宜手術的或復發性的癌症。
  22. 一種醫藥組成物，其含有如請求項1至21中任一項之抗體-藥物結合物或其鹽作為活性成分、及醫藥上可接受的調配成分。
  23. 一種於受試者中治療或預防癌症之方法，其包含對罹患癌症的受試者投予抗TROP2抗體-藥物結合物，該抗TROP2抗體-藥物結合物包含抗TROP2抗體及藉由連接子連接之抗腫瘤化合物，其中該連接子及該抗腫瘤化合物係以下式表示： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX) 其中-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-具有下式所表示的結構：
    Figure 03_image043
    其於第3位與抗TROP2抗體連接且於第1位之氮原子上與含此結構的連接子結構內之亞甲基連接，且(NH-DX)表示下式所表示的基：
    Figure 03_image045
    其中於第1位的胺基之氮原子為連接位， 其中該抗TROP2抗體於其重鏈可變區中包含由SEQ ID NO：23之胺基酸序列所組成的CDRH1、由SEQ ID NO：24之胺基酸序列所組成的CDRH2及由SEQ ID NO：25之胺基酸序列所組成的CDRH3，並於其輕鏈可變區中包含由SEQ ID NO：26之胺基酸序列所組成的CDRL1、由SEQ ID NO：27之胺基酸序列所組成的CDRL2及由SEQ ID NO：28之胺基酸序列所組成的CDRL3。
  24. 如請求項23之方法，其中每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數於2至8或3至8的範圍內。
  25. 如請求項23或24之方法，其中每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數為3.5至4.5。
  26. 如請求項23至25中任一項之方法，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸1-121的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：46之胺基酸1-109的輕鏈可變區。
  27. 如請求項23至26中任一項之方法，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈。
  28. 如請求項23至27中任一項之方法，其中該抗TROP2抗體於重鏈之羧基末端缺乏離胺酸殘基。
  29. 如請求項23至28中任一項之方法，其中對罹患癌症的受試者投予劑量範圍為2 mg/kg至10 mg/kg之抗體-藥物結合物。
  30. 如請求項23至29中任一項之方法，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約4 mg/kg。
  31. 如請求項23至29中任一項之方法，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約6 mg/kg。
  32. 如請求項23至29中任一項之方法，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約8 mg/kg。
  33. 如請求項23至32中任一項之方法，其中藉由靜脈內投予，投予該抗體-藥物結合物。
  34. 如請求項23至33中任一項之方法，其中每3週一次或每4週一次投予該抗體-藥物結合物。
  35. 如請求項23至34中任一項之方法，其中該癌症係選自由肺癌、腎癌、泌尿上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、及食道癌所組成的群組。
  36. 如請求項35之方法，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
  37. 如請求項23至36中任一項之方法，其中該癌症為抗性的或難治的。
  38. 如請求項37之方法，其中抗性或難治係自癌症由於以抗癌藥治療而獲得的抗性或難治性。
  39. 如請求項38之方法，其中該抗癌藥為EGFR-抑制劑、ALK-抑制劑、鉑系化療劑、或檢查點抑制劑。
  40. 如請求項38之方法，其中該抗癌藥為吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼、阿法替尼、艾樂替尼、克唑替尼、色瑞替尼、順鉑、卡鉑、納武利尤單抗、派姆單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗、伊匹單抗、度伐鲁單抗、替雷利珠單抗、信迪利單抗、或西米普利單抗。
  41. 如請求項23至40中任一項之方法，其中該癌症為表現TROP2的癌症。
  42. 如請求項41之方法，其中該表現TROP2的癌症為過度表現TROP2的癌症。
  43. 如請求項23至42中任一項之方法，其中該癌症為不宜手術的或復發性的癌症。
  44. 如請求項23至43中任一項之方法，其中該抗體-藥物結合物以包含至少一種醫藥上可接受的調配成分的醫藥組成物被投予。
  45. 一種抗TROP2抗體-藥物結合物用於製造治療或預防癌症之醫藥之用途，該抗體-藥物結合物包含抗TROP2抗體及藉由連接子連接之抗腫瘤化合物，其中該連接子及該抗腫瘤化合物係以下式表示： -(琥珀醯亞胺-3-基-N)-CH2 CH2 CH2 CH2 CH2 -C(=O)-GGFG-NH-CH2 -O-CH2 -C(=O)-(NH-DX) 其中-(琥珀醯亞胺-3-基-N)-具有下式所表示的結構：
    Figure 03_image047
    其於第3位與抗TROP2抗體連接且於第1位之氮原子上與含此結構的連接子結構內之亞甲基連接，且(NH-DX)表示下式所表示的基：
    Figure 03_image049
    其中於第1位的胺基之氮原子為連接位， 其中該抗TROP2抗體於其重鏈可變區中包含由SEQ ID NO：23之胺基酸序列所組成的CDRH1、由SEQ ID NO：24之胺基酸序列所組成的CDRH2及由SEQ ID NO：25之胺基酸序列所組成的CDRH3，並於其輕鏈可變區中包含由SEQ ID NO：26之胺基酸序列所組成的CDRL1、由SEQ ID NO：27之胺基酸序列所組成的CDRL2及由SEQ ID NO：28之胺基酸序列所組成的CDRL3。
  46. 如請求項45之用途，其中每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數於2至8或3至8的範圍內。
  47. 如請求項45或46之用途，其中每個抗體結合的抗腫瘤化合物的平均單位數為3.5至4.5。
  48. 如請求項45至47中任一項之用途，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之胺基酸1-121的重鏈可變區及包含SEQ ID NO：46之胺基酸1-109的輕鏈可變區。
  49. 如請求項45至48中任一項之用途，其中該抗體包含：包含SEQ ID NO：45之重鏈及包含SEQ ID NO：46之輕鏈。
  50. 如請求項45至49中任一項之用途，其中該抗TROP2抗體於重鏈之羧基末端缺乏離胺酸殘基。
  51. 如請求項45至50中任一項之用途，其中對罹患癌症的受試者投予劑量範圍為2 mg/kg至10 mg/kg之抗體-藥物結合物。
  52. 如請求項45至51中任一項之用途，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約4 mg/kg。
  53. 如請求項45至51中任一項之用途，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約6 mg/kg。
  54. 如請求項45至15中任一項之用途，其中對罹患癌症的受試者投予抗體-藥物結合物之劑量為約8 mg/kg。
  55. 如請求項45至54中任一項之用途，其中藉由靜脈內投予，投予該抗體-藥物結合物。
  56. 如請求項45至55中任一項之用途，其中每3週一次或每4週一次投予該抗體-藥物結合物。
  57. 如請求項45至56中任一項之用途，其中該癌症係選自由肺癌、腎癌、泌尿上皮癌、大腸直腸癌、前列腺癌、多形性神經膠質母細胞瘤、卵巢癌、胰臟癌、乳癌、黑色素瘤、肝癌、膀胱癌、胃癌、子宮頸癌、頭頸癌、及食道癌所組成的群組。
  58. 如請求項57之用途，其中該肺癌為非小細胞肺癌(NSCLC)。
  59. 如請求項45至58中任一項之用途，其中該癌症為抗性的或難治的。
  60. 如請求項59之用途，其中抗性或難治係自癌症由於以抗癌藥治療而獲得的抗性或難治性。
  61. 如請求項60之用途，其中該抗癌藥為EGFR-抑制劑、ALK-抑制劑、鉑系化療劑、或檢查點抑制劑。
  62. 如請求項60之用途，其中該抗癌藥為吉非替尼、厄洛替尼、奧希替尼、阿法替尼、艾樂替尼、克唑替尼、色瑞替尼、順鉑、卡鉑、納武利尤單抗、派姆單抗、阿特珠單抗、阿維魯單抗、伊匹單抗、度伐鲁單抗、替雷利珠單抗、信迪利單抗、或西米普利單抗。
  63. 如請求項45至62中任一項之用途，其中該癌症為表現TROP2的癌症。
  64. 如請求項63之用途，其中該表現TROP2的癌症為過度表現TROP2的癌症。
  65. 如請求項45至64中任一項之用途，其中該癌症為不宜手術的或復發性的癌症。
  66. 如請求項45至65中任一項之用途，其中該抗體-藥物結合物以包含至少一種醫藥上可接受的調配成分的醫藥組成物被投予。
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