ES2639222T5 - Células que producen unas composiciones de anticuerpo - Google Patents

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Description

DESCRIPCIÓN
Células que producen unas composiciones de anticuerpo
Campo técnico
En la presente memoria se describe una célula para la producción de una molécula de anticuerpo, tal como un anticuerpo útil para diversas enfermedades, un fragmento del anticuerpo y una proteína de fusión que presenta la región Fc del anticuerpo o similar, a un procedimiento para producir una composición del anticuerpo utilizando la célula, a la composición del anticuerpo y a la utilización de la misma.
Antecedentes de la técnica
Debido a que los anticuerpos presentan una elevada actividad de unión, especificidad de unión y una elevada estabilidad en sangre, se ha intentado aplicarlos al diagnóstico, a la prevención y al tratamiento de diversas enfermedades humanas [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1, 1995]. Además, se ha intentado producir un anticuerpo humanizado, tal como un anticuerpo híbrido humano o un anticuerpo con injertación de una región determinante de complementariedad humana (en adelante denominada "RDC") a partir de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano, mediante la utilización de técnicas de recombinación genética. El anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo en el que su región variable de anticuerpo (en adelante denominada "región V") es un anticuerpo derivado de un animal diferente del ser humano y su región constante (en adelante denominada "región C") se deriva de un anticuerpo humano. El anticuerpo con injertación de RDC humano es un anticuerpo en el que se ha sustituido la RDC de un anticuerpo humano por la RDC de un anticuerpo obtenido de un animal diferente de un ser humano.
Se ha descubierto que se encuentran presentes cinco clases en los anticuerpos obtenidos de los mamíferos: IgM, IgD, IgG, IgA e IgE. Los anticuerpos de la clase IgG humana se utilizan principalmente para el diagnóstico, la prevención y el tratamiento de diversas enfermedades humanas debido a que presentan características funcionales, tales como una semivida prolongada en sangre, diversas funciones efectoras y similares [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 1, 1995]. El anticuerpo de clase IgG humana se clasifica además en las 4 subclases siguientes: IgG1, igG2, IgG3 e IgG4. Hasta hoy se han llevado a cabo muchos estudios de la actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (en adelante denominada "actividad ADCC") y de la actividad citotóxica dependiente del complemento (en adelante denominada "actividad CDC") como funciones efectoras del anticuerpo de clase IgG y se ha informado de que entre los anticuerpos de la clase IgG humana, la subclase IgG1 presenta las actividades ADCC y CDC más elevadas [Chemical Immunology 65:88, 1997]. En vista de lo anteriormente expuesto, la mayoría de los anticuerpos humanizados antitumorales, incluyendo el Rituxan y el Herceptin disponibles comercialmente, que requieren funciones efectoras elevadas para la expresión de sus efectos, son anticuerpos de la subclase IgG1 humana.
La expresión de la actividad ADCC y de la actividad CDC de los anticuerpos de subclase IgG1 humana requiere la unión de la región Fc del anticuerpo a un receptor de anticuerpo presente sobre la superficie de una célula efectora, tal como una célula asesina, una célula asesina natural, un macrófago activado o similar (en adelante denominada "FcyR") y se unen diversos componentes del complemento. Con respecto a la unión, se ha sugerido que son importantes varios residuos aminoácidos en la región bisagra y en el segundo dominio de la región C (en adelante denominados "dominio Cy2") del anticuerpo [Eur. J. Immunol. 23:1098, 1993; Immunology 86:319, 1995; Chemical Immunology 65:88, 1997] y que también resulta importante una cadena de azúcar que se une al dominio Cy2 [Chemical Immunology 65:88, 1997].
Con respecto a la cadena de azúcar, Boyd et al. han examinado los efectos de una cadena de azúcar sobre la actividad de ADCC y de la actividad de CDC mediante el tratamiento de un anticuerpo con injertación de RDC humana, CAMPATH-1H (subclase IgG1 humana) producido por una célula de ovario de hámster chino (célula CHO) o una célula NS0 de mieloma de ratón (célula NS0) con diversos enzimas hidrolíticos de azúcares, y se ha informado de que la eliminación del ácido siálico del extremo no reductor no influye sobre ambas actividades pero que la actividad CDC por sí sola resultó afectada por la eliminación adicional del residuo de galactosa y se redujo la actividad en aproximadamente 50%, y que la eliminación completa de la cadena de azúcar provocó la eliminación de ambas actividades [Molecular Immunol. 32:1311, 1995]. Además, Lifely et al. han analizado la cadena de azúcar unida a un anticuerpo injertado con RDC humana, CAMPATH-1H (subclase IgG humana) que había sido producido por una célula CHO, una célula NS0 o una célula YO de mieloma de rata, han medido su actividad ADCC y han informado de que el anticuerpo CAMPATH-1H obtenido de la célula YO mostraba la actividad ADCC más elevada, sugiriendo que la N-acetilglucosamina (en adelante también denominada "GlcNAc") en la posición bisectante resulta importante para la actividad [Glycobiology 5:813, 1995; documento n° WO 99/54342]. Estos informes indican que la estructura de la cadena de azúcar desempeña un papel importante en las funciones efectoras de los anticuerpos humanos de la subclase IgG1 y que resulta posible preparar un anticuerpo que presente una función efectora más elevada mediante la modificación de la estructura de la cadena de azúcar. Sin embargo, de hecho, las estructuras de las cadenas de azúcar son diversas y complejas y no puede afirmarse que se haya identificado una estructura importante real para la función efectora.
Las cadenas de azúcar de las glucoproteínas se dividen en términos generales en dos tipos: una cadena de azúcar que se une a la asparagina (cadena sacárida unida mediante N-glucósido) y una cadena de azúcar que se une a otro aminoácido, tal como la serina, la treonina (cadena sacárida unida mediante O-glucósido), basándose en la forma de unión de la fracción proteína. Las cadenas de azúcar unidas mediante N-glucósido presentan diversas estructuras [Biochemical Experimentaron Method 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Gakujutsu Shuppan Center), editado por Reiko Takahashi, 1989], aunque es conocido que presentan una estructura nuclear común básica mostrada mediante la fórmula estructural (I) a continuación:
Figure imgf000003_0001
El extremo de la cadena de azúcar que se une a la asparagina se denomina extremo reductor y el lado contrario se denomina extremo no reductor. Es conocido que la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido incluye un tipo rico en manosas en el que la manosa sola se une al extremo no reductor de la estructura nuclear; un tipo complejo en el que el lado de extremo no reductor de la estructura nuclear presenta por lo menos una rama paralela de galactosa-N-acetilglucosamina (en adelante denominada "Gal-GlcNAc") y el lado de extremo no reductor de Gal-GlcNAc presenta una estructura de ácido siálico N-acetilglucosamina bisectante o similar; un tipo híbrido en el que el lado de extremo no reductor de la estructura nuclear presenta ramas del tipo tanto manosa como del tipo complejo, y similares.
En la región Fc de un anticuerpo de un tipo IgG, se encuentran presentes dos sitios de unión de cadena de azúcar unidas mediante N-glucósido. En la IgG sérica, al sitio de unión de cadena de azúcar generalmente se une una cadena de azúcar de tipo complejo que presenta una pluralidad de ramas y en la que la adición de ácido siálico o de N-acetilglucosamina bisectante es baja. Es conocido que existe variabilidad en la adición de galactosa al extremo no reductor de la cadena de azúcar de tipo complejo y en la adición de fucosa a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor [Biochemistry 36:130, 1997].
Se ha considerado que dicha estructura de una cadena de azúcar está determinada por los genes de cadena de azúcar, es decir, un gen para una glucosiltransferasa que sintetiza una cadena de azúcar y un gen para un enzima glucolítico que hidroliza la cadena de azúcar.
La síntesis de una cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se describe a continuación.
Las glucoproteínas se modifican con una cadena de azúcar en la luz del retículo endoplasmático (en adelante denominado "RE"). Durante la etapa de biosíntesis de la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido, se transfiere una cadena de azúcar relativamente grande a la cadena polipeptídica que se está elongando en la luz del RE. En la transformación, en primer lugar la cadena de azúcar se añade sucesivamente a los grupos fosfato de un portador de lípidos de cadena larga que comprende aproximadamente 20 unidades de a-isopreno, que se denomina dolicol-fosfato (en adelante también denominado "P-Dol"). Es decir, se transfiere la N-acetilglucosamina al dolicol-fosfato para formar de esta manera GlcNAc-P-P-Dol y seguidamente se transfiere un GlcNAc adicional para formar GlcNAc-GlcNAc-P-P-Dol. A continuación, se transfieren cinco manosas (en adelante la manosa también se denomina "Man") para formar de esta manera (Man)5-(GlcNAc)2-P-P-Dol y después se transfieren cuatro Man y tres glucosas (en adelante las glucosas también se denominan "Glc"). De esta manera, se forma un precursor de cadena de azúcar, (Glc)3-(Man)g-(GlcNAc)2-P-P-Dol, denominado oligosacárido nuclear. El precursor de cadena de azúcar, que comprende 14 azúcares, se transfiere en masa a un polipéptido que presenta una secuencia asparagina-X-serina o asparagina-X-treonina en la luz del RE. En la reacción, se libera dolicol pirofosfato (P-P-Dol) unido al oligosacárido nuclear aunque nuevamente se convierte en dolicol-fosfato mediante hidrólisis con pirofosfatasa y se recicla. El recorte de la cadena de azúcar se inicia inmediatamente después de la unión de la cadena de azúcar al polipéptido. Es decir, se eliminan 3 Glc y 1 o 2 Man en el RE y es conocido que la a-1,2-glucosidasa I, a-1,3-glucosidasa II y la a-1,2-manosidasa se relacionan con la eliminación.
La glucoproteína sometida a recorte en el RE se transfirió al cuerpo de Golgi y se modifica de diversas maneras. En la parte cis del cuerpo de Golgi, la N-acetilglucosamina fosfotransferasa, que se relaciona con la adición de manosa fosfato, N-acetilglucosamina 1-fosfodiéster a-N-acetilglucosaminidasa y a-manosidasa I se encuentran presentes y se reducen los residuos de Man a 5. En la parte intermedia del cuerpo de Golgi se encuentran presentes la N-acetilglucosamina transferasa I (GntI), que se relaciona con la adición de la primera GlcNAc externa de la cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante N-glucósidos, la a-manosidasa II, que se relaciona con la eliminación de 2 Man, la N-acetilglucosamina transferasa II (GnTII), que se relaciona con la adición de la segunda GIcNAc desde el extremo, y la a-1,6-fucosiltransferasa, que se relaciona con la adición de fucosa a la N-acetilglucosamina de extremo reductor. En la parte trans del cuerpo de Golgi, se encuentran presentes la galactosa transferasa, que se relaciona con la adición de galactosa y la sialiltransferasa, que se relaciona con la adición de ácido siálico, tal como ácido N-acetilneuramínico o similar. Es conocido que la cadena de azúcar unida mediante N-glucósidos se forma mediante las actividades de dichos diversos enzimas.
En general, la mayoría de los anticuerpos humanizados para los que se considera su aplicación en medicamentos se preparan utilizando técnicas de recombinación genética y se producen utilizando células CHO derivadas de tejido de ovario de hámster chino como células hospedadoras. Aunque, tal como se ha indicado anteriormente, debido a que la estructura de la cadena de azúcar desempeña un papel notablemente importante en la función efectora de los anticuerpos y se observan diferencias en la estructura de la cadena de azúcar de las glucoproteínas expresadas por las células hospedadoras, se desea el desarrollo de una célula hospedadora que pueda utilizarse para la producción de un anticuerpo con una función efectora más elevada.
Con el fin de modificar la estructura de la cadena de azúcar de la glucoproteína producida, se han intentado diversos métodos, tales como: 1) la aplicación de un inhibidor de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, 2) la selección de un mutante, 3) la introducción de un gen codificante de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, y similar. Se describen ejemplos específicos a continuación.
Entre los ejemplos de un inhibidor contra un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar se incluyen la tunicamicina, que inhibe selectivamente la formación de GlcNAc-P-P-Dol, que es la primera etapa de la formación de un oligosacárido nuclear que es un precursor de una cadena de azúcar unida mediante N-glucósido, castanospermina y N-metil-1-desoxinojirimicina que son inhibidores de la glucosidasa I, el bromocondulitol, que es un inhibidor de la glucosidasa II, la 1-desoxinojirimicina y el 1,4-dioxi-1,4-imino-D-manitol, que son inhibidores de la manosidasa I, la swainsonina, que es un inhibidor de la manosidasa II y similares. Entre los ejemplos de un inhibidor específico de una glucosiltransferasa se incluyen derivados desoxi de sustratos contra la N-acetilglucosamina transferasa V (GnTV) y similares [Glycobiology Series 2 - Destiny of Sugar Chain in Cell (Kodan-sha Scientific), editado por Katsutaka Nagai, Senichiro Hakomori y Akira Kobata, 1993]. Además, es conocido que la 1-desoxinojirimicina inhibe la síntesis de una cadena de azúcar de tipo complejo e incrementa la proporción de cadenas de azúcar de tipo rico en manosas y de tipo híbrido. De hecho se ha informado de que la estructura de cadena de azúcar de la IgG se modificó y se han modificado propiedades tales como la actividad de unión a antígeno y similares al añadir los inhibidores al medio [Molecular Immunol. 26:1113, 1989].
Los mutantes relacionados con la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar se seleccionan y obtienen principalmente en forma de una estirpe celular resistente a lectina. Por ejemplo, se han obtenido células CHO mutantes que presentan diversas estructuras de cadena de azúcar como estirpe celular resistente a lectina utilizando una lectina tal como la AGT (aglutinina de germen de trigo obtenida de T. vulgaris), ConA (concavalina A obtenida de C. ensiformis), RIC (una toxina obtenida de R. communis), L-PHA (leucoaglutinina obtenida de P. vulgaris), LCA (aglutinina de lenteja obtenida de L. culinaris), PSA (lectina de guisante obtenida de P. sativarum) o similar [Somatic Cell Mol. Genet. 12:51, 1986].
A título de ejemplo de la modificación de la estructura de cadena de azúcar de un producto obtenido mediante la introducción del gen de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en una célula hospedadora, se ha informado de que puede producirse una proteína en la que se añaden varios ácidos siálicos al extremo no reductor de la cadena de azúcar, mediante la introducción de p-galactósido-a-2,6-sialiltransferasa de rata en la célula CHO [J. Biol. Chem. 261:13848, 1989].
Además, se ha confirmado que se expresa un antígeno H (Fuca1-2Galp1) en el que se ha añadido fucosa (en adelante también denominada "Fuc") al extremo no reductor de la cadena de azúcar * = Wright y Morrison (J. Exp. Med, 1994, 180: 1087-1096, studied effects of altered carbohydrate structure of IgG1 produced in Lec1 cells. mediante la introducción de p-galactósido-2-a-fucosiltransferasa humana en células L de ratón [Science 252:1668, 1991]. Además, basándose en el conocimiento de que la adición de la N-acetilglucosamina en posición bisectante de la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido resulta importante para la actividad ADCC del anticuerpo, Umana et al. prepararon células CHO que expresaban p-1,4-N-acetilglucosamina transferasa III (GnTIII) y las compararon con la expresión de GnTIII de la estirpe celular parental. Confirmaron que no se observaba expresión de GnTIII en la estirpe celular parental de las células CHO [J. Biol. Chem. 261:13370, 1984] y que el anticuerpo expresado utilizando las células CHO expresantes de GnTIII producidas presentaban una actividad ADCC 16 veces superior a la del anticuerpo expresado utilizando la estirpe celular parental [Glycobiology 5:813, 1995; documento n° WO 99/54342]. Umana et al. también produjeron células CHO en las que habían introducido p-1,4-N-acetilglucosamina transferasa V (GnTV) y se informó de que la expresión en exceso de GnTIII o GnTV mostraba toxicidad para las células CHO.
Exposición de la invención
De esta manera, con el fin de modificar la estructura de cadena de azúcar de la glucoproteína que debía producirse, se intentó controlar la actividad del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la célula hospedadora, aunque en la práctica las estructuras de las cadenas de azúcar son diversas y complejas, y la solución de las funciones fisiológicas de las cadenas de azúcar resultaría insuficiente, por lo que se repitieron las pruebas de ensayo y error. En particular, aunque se ha encontrado poco a poco que la función efectora de los anticuerpos resulta muy influida por la estructura de la cadena de azúcar, todavía no se ha determinado una estructura de cadena de azúcar verdaderamente importante. Por lo tanto, para el desarrollo de medicamentos se espera a la identificación de una cadena de azúcar que influya sobre la función efectora de los anticuerpos y al desarrollo de una célula hospedadora a la que pueda añadirse una estructura de cadena de azúcar.
Un objetivo de la presente invención es proporcionar una célula hospedadora que produzca una composición de anticuerpo y pueda controlar una estructura de cadena de azúcar unida a una molécula de anticuerpo, una célula que pueda producir una composición de anticuerpo que presente una elevada actividad de ADCC, un método de producción de una composición de anticuerpo utilizando la célula y una composición de anticuerpo producida mediante el método de producción.
La presente invención se refiere a (1) a (4) siguientes.
[1.] Utilización de una estirpe celular resistente a la lectina para la producción de una composición de anticuerpo, comprendiendo la composición unas moléculas de anticuerpo que presentan unas cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas unidas a la región Fc, en la que de entre las cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas totales unidas a la región Fc en la composición, la proporción para una cadena de azúcar en la que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar es 20% o superior, en la que la estirpe celular resistente a la lectina puede obtenerse mediante la selección utilizando un medio que comprende la lectina a una concentración de 1 |ig/ml a 1 mg/ml, y en la que los anticuerpos son expresados utilizando la estirpe celular de CHO resistente a la lectina,
en la que la lectina es una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace a en la cadena de azúcar unida a N-glucósido, en la que la lectina es seleccionada de entre una lectina de Lens culinaris LCA o una lectina de Aleuria aurantia AAL.
[2.] Utilización de la estirpe celular según [1], en la que la estirpe celular es obtenida mediante un procedimiento que comprende
(a) cultivar una estirpe celular en un medio que comprende una concentración predeterminada de lectina y seleccionar a continuación una célula que adquiere una propiedad tal que su tasa de supervivencia es aumentada por lo menos 2 veces en comparación con la estirpe celular madre, o,
(b) cultivar una estirpe celular en un medio que comprende lectina y seleccionar a continuación una estirpe celular que puede ser cultivada a una tasa de supervivencia de 80%, a una concentración de lectina de por lo menos 2 veces la de la estirpe celular madre,
en la que la lectina es una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace |i en la cadena de azúcar unida a N-glucósido.
[3.] Utilización de la estirpe celular según [1] o [2], que comprende además cultivar dicha estirpe celular.
[4.] Utilización de la estirpe celular según [1] a [3], que comprende recuperar la composición de anticuerpo.
En la presente memoria son divulgados además (1) a (61) siguientes:
(1) una célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, que comprende una composición de anticuerpo que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc, en la que entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc en la composición, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es de 20% o superior.
(2) La célula CHO según (1), en la que la cadena de azúcar a la que no se encuentra unida la fucosa es una cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido en la que la posición 1 de fucosa no se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a.
(3) La célula CHO según (1) o (2), en la que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.
(4) La célula CHO según cualquiera de entre (1) y (3), en la que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa y/o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se encuentra reducida o anulada.
(5) La célula CHO según (4), en la que el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, es un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa),
(b) Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa, 4-reductasa),
(c) GFPP (GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa).
(6) La célula CHO según (5), en la que GMD es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65,
un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GMD.
(7) La célula CHO según (5), en la que GMD es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71 y que presenta actividad de GMD,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71 y que presenta actividad de GMD.
(8) La célula CHO según (5), en la que Fx es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de Fx.
(9) La célula CHO según (5), en la que Fx es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72 y que presenta actividad de Fx,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72 y que presenta actividad de Fx.
(10) La célula CHO según (5), en la que GFPP es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP. (11) La célula CHO según (5), en la que GFPP es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73 y que presenta actividad de GFPP,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73 y presenta actividad de GFpP.
(12) La célula CHO según (4), en la que el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una a-1,6-fucosiltransferasa.
(13) La célula CHO según (12), en la que la a-1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de a1,6-fucosiltransferasa.
(14) La célula CHO según (12), en la que la a-1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa.
(15) La célula CHO según cualquiera de entre (4) y (14), en la que la actividad enzimática se reduce o se anula mediante una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d) y (e), a continuación: (a) una técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante del enzima,
(b) una técnica para introducir un mutante negativo dominante de un gen codificante del enzima, (c) una técnica para introducir una mutación en el enzima,
(d) una técnica para inhibir la transcripción o la traducción de un gen codificante del enzima,
(e) una técnica para seleccionar una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
(16) La célula CHO según cualquiera de entre (4) y (15), que es resistente a por lo menos una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
(17) La célula CHO según cualquiera de entre (4) y (16), que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo producida por las células CHO parentales.
(18) La célula CHO según (17), que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo en la que el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc contenidas en la composición de anticuerpo, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es inferior a 20%.
(19) La célula CHO según (18), en la que la cadena de azúcar a la que no se encuentra unida la fucosa es una cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido en la que la posición 1 de la fucosa no se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a. (20) Un procedimiento para producir una composición de anticuerpo, que comprende cultivar la célula CHO según cualquiera de entre (1) y (19) en un medio para producir y acumular la composición de anticuerpo en el cultivo y recuperar la composición de anticuerpo a partir del cultivo.
(21) Una composición de anticuerpo que se produce utilizando el método según (20).
(22) Una composición de anticuerpo que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc, que es producida por una célula CHO, en la que entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc en la composición, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es de 20% o superior. (23) Una célula en la que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa y/o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se reduce o se anula mediante una técnica de ingeniería genética.
(24) La célula según (23), en la que el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, es un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación: (a) GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa),
(b) Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa, 4-reductasa),
(c) GFPP (GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa).
(25) La célula según (24), en la que GMD es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GMD.
(26) La célula según (24), en la que GMD es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71 y que presenta actividad de GMD,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71 y que presenta actividad de GMD.
(27) La célula según (24), en la que Fx es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de Fx.
(28) La célula según (24), en la que Fx es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72 y que presenta actividad de Fx,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72 y que presenta actividad de Fx.
(29) La célula según (24), en la que GFPP es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP. (30) La célula según (24), en la que GFPP es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73 y que presenta actividad de GFPP,
(c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73 y presenta actividad de GFPP.
(31) La célula según (23), en la que el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una a-1,6-fucosiltransferasa.
(32) La célula según (31), en la que la a-1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1,
(b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 2,
(c) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de a1,6-fucosiltransferasa,
(d) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 2, bajo condiciones restrictivas y que codifica una proteína que presenta actividad de a1,6-fucosiltransferasa.
(33) La célula según (31), en la que la a-1,6-fucosiltransferasa es una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d), (e) y (f):
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23, (b) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24, (c) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(f) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa.
(34) La célula según cualquiera de entre (23) y (33), en la que la técnica de ingeniería genética es una técnica seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:
(a) una técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante del enzima,
(b) una técnica para introducir un mutante negativo dominante de un gen codificante del enzima, (c) una técnica para introducir una mutación en el enzima,
(d) una técnica para inhibir la transcripción o la traducción de un gen codificante del enzima.
(35) La célula según cualquiera de entre (23) y (34), que es resistente a por lo menos una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido.
(36) La célula según cualquiera de entre (23) y (35), que es una célula seleccionada de entre el grupo que consiste en (a) a (i), a continuación:
(a) una célula CHO derivada de tejido de ovario de hámster chino,
(b) una estirpe celular de mieloma de rata, célula YB2/3HL.P2.G11.16.Ag.20,
(c) una estirpe celular de mieloma de ratón, células NS0,
(d) una estirpe celular de mieloma de ratón, célula SP2/0-Ag14,
(e) una célula BHK derivada de tejido de riñón de hámster chino,
(f) una célula de hibridoma productor de anticuerpos,
(g) una célula Namalwa de estirpe celular de leucemia humana,
(h) una célula madre embrionaria,
(i) una célula de huevo fertilizado.
(37) La célula según cualquiera de entre (23) y (36) en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo.
(38) La célula según (37), en la que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.
(39) Un procedimiento para producir una composición de anticuerpo, que comprende cultivar la célula según (37) o (38) en un medio para producir y acumular la composición de anticuerpo en el cultivo y recuperar la composición de anticuerpo a partir del cultivo.
(40) El procedimiento según (39), que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo obtenida a partir de su estirpe celular parental.
(41) Una composición de anticuerpo que se produce utilizando el procedimiento según (39) o (40).
(42) Un animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo, que comprende un genoma que se encuentra modificado de manera que la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa y/o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se encuentra reducida.
(43) Un animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo según (42), en el que el gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o un gen codificante del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se encuentra anulado.
(44) El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (42) o (43), en el que el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, es un enzima seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa),
(b) Fx (GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa, 4-reductasa),
(c) GFPP (GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa).
(45) El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (44), en el que GMD es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65,
(b) un ADN que se híbrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GMD.
(46) El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (44), en el que Fx es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de Fx.
(47) El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (44), en el que GFPP es una proteína codificada por un ADN de (a) o (b), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP. (48) El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (42) o (43), en el que el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una a-1-6-fucosiltransferasa.
(49) El animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo según (48), en el que la a-1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c) y (d), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1,
(b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 2,
(c) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de a1,6-fucosiltransferasa,
(d) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 2, bajo condiciones restrictivas y que codifica una proteína que presenta actividad de a1,6-fucosiltransferasa.
(50) El animal o vegetal no humano transgénico o la progenie del mismo según cualquiera de entre (42) y (49), en el que el animal no humano transgénico es un animal seleccionado de entre el grupo que consiste en vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono y conejo.
(51) Un procedimiento para producir una composición de anticuerpo, que comprende introducir un gen codificante de una molécula de anticuerpo en el animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo según cualquiera de entre (42) y (50), criar el animal o planta, aislar el tejido o líquido corporal que comprende el anticuerpo introducido a partir del animal o planta criado, y recuperar la composición de anticuerpo a partir del tejido o líquido corporal aislado.
(52) El procedimiento según (51), en el que la molécula de anticuerpo pertenece a una clase de IgG.
(53) El procedimiento según (51) o (52), que produce una composición de anticuerpo que presenta una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos más elevada que una composición de anticuerpo obtenida de un animal no humano o planta o la progenie del mismo el genoma del cual no ha sido modificado.
(54) Una composición de anticuerpo que se produce utilizando el procedimiento según (51) a (53).
(55) Un medicamento que comprende la composición de anticuerpo según (21), (22), (41) y (54) como ingrediente activo.
(56) El medicamento según (55), en el que el medicamento es un fármaco diagnóstico, un fármaco preventivo o un fármaco terapéutico para enfermedades acompañadas de tumores, enfermedades acompañadas de alergias, enfermedades acompañadas de inflamaciones, enfermedades autoinmunológicas, enfermedades de órganos circulatorios, enfermedades acompañadas de infecciones víricas o enfermedades acompañadas de infecciones bacterianas.
(57) Una proteína seleccionada de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) y (j), a continuación:
(a) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71, (b) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71 y que presenta actividad de GMD,
(c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72, (d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72 y que presenta actividad de Fx,
(e) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73, (f) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73 y que presenta actividad de GFPP,
(g) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23, (h) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(i) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24, (j) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(58) Un ADN que codifica la proteína según (57).
(59) Un ADN seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b), (c), (d) y (e), a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1,
(b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 2,
(c) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65,
(d) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48,
(e) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51.
(60) Un ADN genómico seleccionado de entre el grupo que consiste en (a), (b) y (c), a continuación:
(a) un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 3, (b) un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 67, (c) un ADN genómico que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 70. (61) Un vector diana para la recombinación homóloga, que comprende una longitud completa del ADN según cualquiera de entre (58) y (60), o una parte del mismo.
La célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo introducida según la presente invención puede ser cualquier célula CHO con la condición de que sea una célula CHO obtenida de tejido de ovario de hámster chino en la que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, que produce una composición de anticuerpo que comprende cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc de una molécula de anticuerpo, en la que el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc en la composición, la proporción, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es de 20% o superior.
En la presente invención, la molécula de anticuerpo incluye cualquier molécula con la condición de que comprende la región Fc de un anticuerpo. Entre los ejemplos se incluyen un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, una proteína de fusión que comprende una región Fc y similares.
El anticuerpo es una proteína que es producida en el cuerpo vivo mediante reacción inmunológica como resultado de la estimulación por antígenos exógenos y que presenta una actividad de unión específica al antígeno. Entre los ejemplos del anticuerpo se incluyen un anticuerpo secretado por una célula de hibridoma preparada a partir de una célula de bazo de un animal inmunizado con un antígeno, un anticuerpo preparado mediante una técnica de recombinación genética, es decir un anticuerpo obtenido mediante la introducción de un vector de expresión de anticuerpo en el que se ha insertado un gen de anticuerpo en una célula hospedadora, y similares. Entre los ejemplos específicos se incluyen un anticuerpo producido por un hibridoma, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano y similares.
Un hibridoma es una célula que se obtiene mediante fusión celular entre una célula B obtenida mediante la inmunización de un mamífero diferente de un ser humano con un antígeno y una célula de mieloma obtenida del ratón o similar y que puede producir un anticuerpo monoclonal que presenta la especificidad de antígeno deseada.
Entre los ejemplos del anticuerpo humanizado se incluye un anticuerpo híbrido humano, un anticuerpo injertado con RDC humano y similares.
Un anticuerpo híbrido humano es un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada de anticuerpo (en adelante denominado "VH", siendo la cadena pesada "cadena H") y una región variable de cadena ligera de anticuerpo (en adelante denominada "VL", siendo la cadena ligera "cadena L"), ambas de un animal diferente del ser humano, una región constante de cadena pesada de anticuerpo humano (en adelante también denominada "CH") y una región constante de cadena ligera de anticuerpo humano (en adelante también denominado "CL"). Como animal diferente del ser humano, puede utilizarse cualquier animal, tal como el ratón, la rata, el hámster, el conejo o similar, con la condición de que pueda prepararse un hibridoma a partir del mismo.
El anticuerpo híbrido humano puede producirse mediante la obtención del ADNc codificante de VH y VL a partir de un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales, insertándolos en un vector de expresión para una célula hospedadora que presenta genes codificantes de CH de anticuerpo humano y CL de anticuerpo humano, para construir de esta manera un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano y después introducir el vector en una célula hospedadora para expresar el anticuerpo.
Como CH del anticuerpo híbrido humano, puede utilizarse cualquier CH, con la condición de que pertenezca a una inmunoglobulina humana (en adelante denominada "lg_h"). Aunque las pertenecientes a la clase IgG_h resultan preferentes, puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase IgG_h, tales como IgG1_h, IgG2_h, IgG3_h e IgG4_h. Además, como CL del anticuerpo híbrido humano, puede utilizarse cualquier CL, con la condición de que pertenezca a la clase Ig_h, y también pueden utilizarse cualquiera perteneciente a la clase k o A.
Un anticuerpo injertado con RDC humana es un anticuerpo en el que las secuencias de aminoácidos de las RDC de VH y VL de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano se injertan en posiciones apropiadas de VH y VL de un anticuerpo humano.
El anticuerpo con injertación de RDC humano puede producirse mediante la construcción de los ADNc codificantes de regiones V en las que las RDC de VH y VL de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano se injertan en RDC de VH y VL de un anticuerpo humano, insertándolos en un vector de expresión para una célula hospedadora que presenta genes codificantes de CH de anticuerpo humano y de CL de anticuerpo humano, para construir de esta manera un vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC humano y después introducir el vector de expresión en una célula hospedadora para expresar el anticuerpo con injertación de r Dc humano.
Como CH del anticuerpo con injertación de la RDC humano, puede utilizarse cualquier CH, con la condición de que pertenezca a hlg, pero aquellos de la clase IgG_h resultan preferentes y puede utilizarse cualquiera de las subclases pertenecientes a la clase de IgG_h, tal como IgG1_h, IgG2_h, IgG3_h e IgG4_h. Además, como CL del anticuerpo injertado con RDC humano, puede utilizarse cualquier CL, con la condición de que pertenezca a la clase Ig_h, y también pueden utilizarse cualquiera perteneciente a la clase k o A.
Un anticuerpo humano es originalmente un anticuerpo existente naturalmente en el cuerpo humano, aunque también incluye anticuerpos obtenidos de una biblioteca fágica de anticuerpos humanos, un animal transgénico productor de anticuerpos humanos y una planta transgénica productora de anticuerpos humanos, que se preparan basándose en los avances recientes en las técnicas de ingeniería genética, de ingeniería celular y de ingeniería del desarrollo.
Con respecto al anticuerpo existente en el cuerpo humano, puede cultivarse un linfocito capaz de producir el anticuerpo mediante el aislamiento de un linfocito de sangre periférica humano, inmortalizándolo mediante su infección por virus EB o similar y después clonándolo, y el anticuerpo puede purificarse a partir del cultivo.
La biblioteca fágica de anticuerpos humanos es una biblioteca en la que se expresan fragmentos de anticuerpos, tales como Fab, anticuerpos de cadena sencilla y similares, sobre la superficie fágica mediante la inserción de un gen codificante de un anticuerpo preparado a partir de una célula B humana en un gen fágico. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo que presenta la actividad de unión de antígeno deseada puede recuperarse a partir de la biblioteca, utilizando su actividad para unirse a un sustrato inmovilizado con antígeno a modo de marcador. El fragmento de anticuerpo puede convertirse además en una molécula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H completas y dos cadenas L completas mediante técnicas de ingeniería genética.
Un animal transgénico no humano productor de anticuerpos humanos es un animal en el que se ha introducido un gen de anticuerpo humano en las células. Específicamente, un animal transgénico productor de anticuerpos humanos puede prepararse mediante la introducción de un gen de anticuerpo humano en una célula ES de un ratón, trasplantando la célula ES en un embrión de estadio temprano de otro ratón y seguidamente desarrollándolo. Mediante la introducción de un gen humano de anticuerpo híbrido en un huevo fertilizado y desarrollándolo, también puede prepararse el animal transgénico. Con respecto al método de preparación de un anticuerpo humano a partir del animal transgénico productor de anticuerpos humanos, puede producirse el anticuerpo humano y acumularse en un cultivo mediante la obtención de un hibridoma productor de anticuerpos humanos mediante un método de preparación de hibridomas habitualmente llevado a cabo en mamíferos diferentes del ser humano y después cultivándolo.
Entre los ejemplos del animal no humano transgénico se incluyen vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono, conejo y similares.
Además, en la presente invención, resulta preferente que el anticuerpo sea un anticuerpo que reconozca un antígeno de tipo tumoral, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una enfermedad de órgano circulatorio, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con enfermedad autoinmunológica o un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con infección vírica o bacteriana, y resulta preferente un anticuerpo humano que pertenece a la clase IgG.
Un fragmento de anticuerpo es un fragmento que comprende la región Fc de un anticuerpo. Entre los ejemplos del fragmento de anticuerpo se incluyen un monómero de cadena H, un dímero de cadenas H y similares.
Una proteína de fusión que comprende una región Fc es una composición en la que un anticuerpo que comprende la región Fc de un anticuerpo o el fragmento de anticuerpo se fusiona con una proteína, tal como un enzima, una citoquina o similar.
En la presente invención, entre los ejemplos de la cadena de azúcar que se une a la región Fc de una molécula de anticuerpo se incluyen una cadena de azúcar unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos de la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se incluyen un tipo complejo en el que el lado de extremo no reductor de la estructura nuclear presenta una o una pluralidad de ramas paralelas de galactosa-N-acetilglucosamina (en adelante denominadas "Gal-GlcNAc") y el lado de extremo no reductor de Gal-GlcNAc presenta una estructura, tal como ácido siálico, N-acetilglucosamina bisectante o similar.
En un anticuerpo, la región Fc presenta posiciones a las que se une una cadena de azúcar unida mediante N-glucósido que se describirá a continuación. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, se unen dos cadenas de azúcar por cada molécula de anticuerpo. Debido a que la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido que se une a un anticuerpo incluye cualquier cadena de azúcar que presenta la estructura nuclear representada por la fórmula estructural (I), pueden resultar posibles varias combinaciones de cadenas de azúcar para las dos cadenas de azúcar unidas mediante N-glucósido que se unen al anticuerpo. De acuerdo con lo anterior, puede considerarse la identidad de las sustancias desde el punto de vista de la estructura sacárida unida a la región Fc.
En la presente invención, la composición que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido en la región Fc puede comprender un anticuerpo que presenta la misma estructura de cadena de azúcar o un anticuerpo que presenta diferentes estructuras de cadena de azúcar, con la condición de que se obtenga el efecto de la presente invención a partir de la composición.
En la presente invención, la proporción de una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar de entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido a la región Fc contenida en la composición de anticuerpo es la proporción del número de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar respecto al número total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc contenida en la composición.
En la presente invención, la cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es una cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen una cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido en la que la posición 1 de la fucosa no se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina mediante un enlace a.
La composición de anticuerpo mostraba una elevada actividad de ADCC en el caso de que la proporción de cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar de entre el total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido de unión a la región Fc contenida en la composición de anticuerpo producida según la presente invención preferentemente es de 20% o superior, más preferentemente de 25% o superior, todavía más preferentemente de 30% o superior, todavía más preferentemente de 40% o superior, y todavía más preferentemente de 50% o superior. A medida que se reduce la concentración de anticuerpos, se reduce la actividad de la ADCC, aunque puede obtenerse una actividad elevada de ADCC aunque la concentración de los anticuerpos sea baja, con la condición de que la proporción de la cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar es de 20% o superior.
La proporción de cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar contenida en la composición que comprende una molécula de anticuerpo que presenta cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido en la región Fc puede determinarse liberando la cadena de azúcar de la molécula de anticuerpo utilizando un método conocido, tal como la hidrazinolisis, la digestión enzimática o similar [Biochemical Experimentation Methods 23 - Method for Studying Glycoprotein Sugar Chain (Japan Scientific Societies Press), editado por Reiko Takahashi, 1989], realizando el marcaje fluorescente o el marcaje con isótopo radioactivo de la cadena de azúcar liberada y separando después la cadena de azúcar marcada mediante cromatografía. Además, la cadena de azúcar liberada también puede determinarse mediante el análisis de la misma utilizando el método HPAED-PAD [J. Liq. Chromatogr. 6:1557, 1983].
En la presente invención, las células CHO derivadas de tejido de ovario de hámster chino incluye cualquier célula que sea una estirpe celular establecida a partir de un tejido ovárico de hámster chino (Cricetulus griseus). Entre los ejemplos de las células CHO indicadas en documentos tales como Journal of Experimental Medicine 108:945, 1958; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 60:1275, 1968; Genetics 55:513, 1968; Chromosoma 41:129, 1973; Methods in Cell Science 18:115, 1996; Radiation Research 148.260, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216, 1980; Proc. Natl. Acad Sci. 60:1275, 1968; Cell 6:121, 1975; Molecular Cell Genetics, apéndices I y II (páginas 883 a 900) y similares. Además, también pueden proporcionarse como ejemplos las estirpes celulares CHO-K1 (ATCC n° CCL-61), DUXB11 (ATCC n° CCL-9096) y Pro-5 (ATCC n° CCL-1781) registrados en la ATCC (The American Type Culture Collection) y una sub-línea celular disponible comercialmente CHO-S (Life Technologies, n° de cat. 11619) o líneas subcelulares obtenidas mediante la adaptación de estirpes celulares utilizando diversos medios.
En la presente invención, el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa, puede ser cualquier enzima con la condición de que sea un enzima relacionado con la síntesis del azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, como fuente de suministro de fucosa a una cadena de azúcar. El enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa, es un enzima que presenta una influencia sobre la síntesis del azúcar-nucleótido intracelular GDP-fucosa.
El azúcar-nucleótido intracelular GDP-fucosa es suministrado mediante una ruta de síntesis de novo o una ruta de síntesis de reutilización. De esta manera, todos los enzimas relacionados con las rutas de síntesis están incluidos en el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa.
Entre los ejemplos del enzima relacionado con la ruta de síntesis de novo del azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa, se incluyen GDP-manosa 4,6-deshidratasa (en adelante denominado "GMD"), GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa 4,6-reductasa (en adelante denominado "Fx") y similares.
Entre los ejemplos del enzima relacionado con la ruta de síntesis de reutilización del azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen la GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa (en adelante denominada "GFPP"), la fucoquinasa y similares.
Como enzima que presenta influencia sobre la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa, también se encuentra incluido un enzima que presenta influencia sobre la actividad del enzima relacionado con la síntesis del azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, y un enzima que presenta influencia sobre la estructura de sustancias como sustrato del enzima.
En la presente invención, entre los ejemplos de la GMD se incluyen:
una proteína codificada por un ADN de (a) o (b) a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65,
(b) un ADN que se híbrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 65, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GMD, (c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71,
(d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71 y que presenta actividad de GMD,
(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 71 y que presenta actividad de GMD, y similares.
Además, entre los ejemplos del ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de GMD se incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 65 y un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 65 bajo condiciones restrictivas y codifica una secuencia de aminoácidos que presenta actividad de GMD.
En la presente invención, entre los ejemplos de Fx se incluyen:
una proteína codificada por un ADN de (a) o (b) a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de Fx,
(c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72,
(d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72 y que presenta actividad de Fx,
(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 72 y que presenta actividad de Fx, y similares.
Además, entre los ejemplos del ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de Fx se incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 48 y un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 48 bajo condiciones restrictivas y codifica una secuencia de aminoácidos que presenta actividad de Fx.
En la presente invención, entre los ejemplos de la GFPP se incluyen:
una proteína codificada por un ADN de (a) o (b) a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51,
(b) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 51, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de GFPP, (c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73,
(d) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73 y que presenta actividad de GFPP,
(e) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 73 y que presenta actividad de GFPP, y similares.
Además, entre los ejemplos del ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de GFPP se incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 51 y un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 51 bajo condiciones restrictivas y codifica una secuencia de aminoácidos que presenta actividad de Fx.
En la presente invención, el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido incluye cualquier enzima, con la condición de que sea un enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. El enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se refiere a un enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Entre los ejemplos del enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la a-1,6-fucosiltransferasa, la a-L-fucosidasa y similares.
Además, entre los ejemplos se incluye un enzima que influye sobre la actividad del enzima relacionado con la reacción de unión de la posición 1 de la fucosa a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido y un enzima que influye sobre la estructura de sustancias como sustrato del enzima.
En la presente invención, entre los ejemplos de la a-1,6-fucosiltransferasa se incluyen:
una proteína codificada por un ADN de (a), (b), (c) o (d) a continuación:
(a) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1,
(b) un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 2,
(c) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 1, bajo condiciones restrictivas y codifica una proteína que presenta actividad de a1,6-fucosiltransferasa,
(d) un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 2, bajo condiciones restrictivas y que codifica una proteína que presenta actividad de a1,6-fucosiltransferasa,
(e) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23,
(f) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24,
(g) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(h) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(i) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 23 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa,
(j) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que presenta una homología de por lo menos 80% respecto a la secuencia de aminoácidos representada por SEC ID n° 24 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa, y similares.
Además, entre los ejemplos del ADN codificante de la secuencia de aminoácidos de la a-1,6-fucosiltransferasa se incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1 o n° 2 y un ADN que se hibrida con el ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1 o n° 2 bajo condiciones restrictivas y codifica una secuencia de aminoácidos que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa.
En la presente invención, un ADN que se hibrida bajo condiciones restrictivas es un ADN obtenido mediante, por ejemplo, un método tal como la hibridación de colonias, la hibridación de placas o la hibridación de transferencia southern utilizando un ADN tal como el ADN que presenta la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1, n° 2, n° 48, n° 51 o n° 65 o un fragmento parcial de la misma a modo de sonda, y específicamente incluye un ADN que puede identificarse llevando a cabo la hibridación a 65°C en presencia de cloruro sódico 0,7 a 1,0 M utilizando un filtro en el que se inmovilizan fragmentos de ADN derivados de una colonia o placa, seguido del lavado del filtro a 65°C con solución 0,1 a 2 x SSC (composición de la solución 1 x SSC que comprende cloruro sódico 150 mM y citrato sódico 15 mM). La hibridación puede llevarse a cabo siguiendo los métodos descritos en, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) (en adelante denominado "Molecular Cloning, Second Edition"), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (en adelante denominado "Current Protocols in Molecular Biology"); DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, 1995, y similares. Entre los ejemplos del ADN hibridable se incluye un ADN que presenta una homología de por lo menos 60% o superior, preferentemente de 70% o superior, más preferentemente de 80% o superior, todavía más preferentemente de 90% o superior, todavía más preferentemente de 95% o superior, respecto a la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1, n° 2, n° 48, n° 51 o n° 65.
En la presente divulgación, puede obtenerse la proteína que comprende una secuencia de aminoácidos en la que por lo menos un aminoácido ha sido delecionado, sustituido, insertado y/o añadido a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 23, n° 24, n° 71, n° 72 o n° 73 y que presenta actividad de a-1,6-fucosiltransferasa, actividad de GMD, actividad de Fx o actividad de GFPP, por ejemplo mediante la introducción de mutación dirigida a sitio en un ADN codificante de una proteína que presenta la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 1, n° 2, n° 65, n° 48 o n° 51, respectivamente, utilizando la mutagénesis dirigida a sitio descrita en, por ejemplo, Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Acids Research 10:6487, 1982; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:6409, 1982; Gene 34:315, 1985; Nucleic Acids Research 13:4431, 1985; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488, 1985, y similares. El número de aminoácidos que debe delecionarse, sustituirse, insertarse y/o añadirse es uno o más, y el número no se encuentra particularmente limitado, aunque es un número que puede delecionarse, sustituirse o añadirse mediante una técnica conocida, tal como la mutagénesis dirigida a sitio, por ejemplo es de 1 a varias decenas, preferentemente de entre 1 y 20, más preferentemente de entre 1 y 10, y todavía más preferentemente de entre 1 y 5.
Además, con el fin de mantener la actividad de a-1,6-fucosiltransferasa, la actividad de GMD, la actividad de Fx o la actividad de GFPP de la proteína que debe utilizarse en la presente invención, presenta una homología de por lo menos 80% o superior, preferentemente de 85% o superior, más preferentemente de 90% o superior, todavía más preferentemente de 95% o superior, todavía más preferentemente de 97% o superior, y todavía más preferentemente de 99% o superior, respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID n° 23, n° 24, n° 71, n° 72 o n° 73, calculada utilizando software de análisis, tal como BLAST [J. Mol. Biol. 215:403, 1990], FASTA [Methods in Enzymology 183:63, 1990] o similares.
Entre los ejemplos de la célula CHO utilizada según la presente invención se incluyen una célula en la que la actividad enzimática se encuentra reducida o delecionada.
Entre las células en las que la actividad de un enzima se encuentra reducida o delecionada se incluyen las células en las que la actividad de un enzima relacionado con la modificación de un azúcar-nucleótido intracelular, la GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se encuentra reducida o delecionada. Como método para obtener dichas células, puede utilizarse cualquier técnica, con la condición de que pueda reducir o delecionar la actividad enzimática de interés. Entre los ejemplos de la técnica para reducir o delecionar la actividad enzimática se incluyen:
(a) una técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante del enzima,
(b) una técnica para introducir un mutante negativo dominante de un gen codificante del enzima,
(c) una técnica para introducir una mutación en el enzima,
(d) una técnica para inhibir la transcripción y/o la traducción de un gen codificante del enzima.
(e) una técnica para seleccionar una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, y similares.
En la presente memoria, puede obtenerse la estirpe celular resistente a lectina mediante el cultivo de una estirpe celular en un medio que comprende una concentración predeterminada de lectina y después mediante la selección de una estirpe celular que adquiere dicha propiedad de manera que su tasa de supervivencia se incrementa en por lo menos 2 veces, preferentemente en 3 veces, y más preferentemente en 5 veces o más, que la estirpe celular parental con significancia estadística. Además, también puede obtenerse mediante el cultivo de una estirpe celular en un medio que comprende lectina, seguido de la selección de una estirpe celular que puede cultivarse a una determinada tasa de supervivencia, por ejemplo una tasa de supervivencia de 80%, a una concentración de lectina de por lo menos 2 veces, preferentemente de 5 veces, más preferentemente de 10 veces, y todavía más preferentemente de 20 veces o más, que la estirpe celular parental.
Como lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido, puede utilizarse cualquier lectina puede reconocer la estructura de cadena de azúcar. Entre los ejemplos se incluyen una lectina de Lens culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), una lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), una lectina de haba VFA (aglutinina obtenida de Vicia faba), una lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina obtenida de Aleuria aurantia) y similares.
La célula CHO de la presente invención puede producir una composición de anticuerpo que presenta una actividad de ADCC más elevada que la de una composición de anticuerpo producida por la célula CHO parental antes de aplicar la técnica para reducir o eliminar la actividad enzimática de interés.
Además, la célula CHO utilizada según la presente invención puede producir una composición de anticuerpo que presenta una actividad de ADCC más alta que la de una composición de anticuerpo en la que, del total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido unidas a la región Fc contenidas en la composición de anticuerpo, la proporción de cadenas de azúcar en las que la fucosa no se encuentra unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es inferior a 20%.
Un ejemplo de la estirpe celular parental que debe utilizarse en la presente invención es una célula en la que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido no se encuentra reducida. Específicamente, se utiliza una célula que no ha sido tratada para reducir o anular la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
En la presente invención, la actividad de ADCC es una actividad citotóxica en la que un anticuerpo unido a un antígeno de superficie celular sobre una célula tumoral en el cuerpo vivo activa una célula efectora mediante un receptor de Fc existente sobre la región de Fc de anticuerpo y la superficie de la célula efectora, obstruyendo de esta manera la célula tumoral y similares [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., capítulo 2.1, 1955]. Entre los ejemplos de la célula efectora se incluyen una célula asesina, una célula asesina natural, un macrófago activado y similares.
La presente invención se refiere además a la utilización de una célula en la que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se reduce mediante una técnica de ingeniería genética (a la que se hace referencia en la presente memoria en adelante como “la célula hospedadora de la presente invención”). La célula hospedadora de la presente invención resulta útil como célula hospedadora para producir una composición de anticuerpo que presenta una actividad de ADCC elevada.
La célula hospedadora utilizada según la presente invención puede ser cualquier huésped, con la condición de que pueda expresar una molécula de anticuerpo. Entre los ejemplos se incluyen una célula de levadura, una célula animal, una célula de insecto, una célula vegetal y similares. Entre los ejemplos de las células se incluyen aquellas que a continuación se proporcionan en el ítem 3. Entre las células animales entre los ejemplos preferentes se incluyen una célula CHO obtenida de un tejido de ovario de hámster chino, una estirpe celular de mieloma de rata YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20, una estirpe celular de mieloma de rata NS0, un mieloma de ratón SP2/0-Ag14, una célula BHK derivada de un tejido renal de hámster sirio, una célula de hibridoma productor de anticuerpos, una célula Namalwa de la estirpe celular de leucemia humana, una célula madre embrionaria, una célula de huevo fertilizado y similares.
A continuación se describe en detalle la presente invención.
1. Preparación de la célula hospedadora de la presente invención
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante las técnicas siguientes. Las técnicas bajo los puntos (1)(a)-(e),2-4 son divulgadas en la misma.
(1) Técnica de disrupción génica con diana en un gen codificante de un enzima
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse utilizando una técnica de disrupción génica utilizando como diana un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen GMD, Fx, GFPP, fucoquinasa y similares. Entre los ejemplos del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la a-1,6-fucosiltransferasa, la a-L-fucosidasa y similares.
El gen tal como se utiliza en la presente memoria incluye ADN y ARN.
El método de disrupción génica puede ser cualquier método, con la condición de que se incluya la posibilidad de interrumpir el gen del enzima diana. Entre los ejemplos se incluyen un método antisentido, un método de ribozima, un método de recombinación homóloga, un método RDO, un método de ARNi, un método en que se utilizan retrovirus, un método en que se utilizan trasposones y similares. Los métodos se describen específicamente a continuación.
(a) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante el método antisentido o el método de ribozima.
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante el método de ribozima descrito en Cell Technology 12:239, 1993; Bio/Technology 17:1097, 1999; Hum. Mol. Genet. 5:1083, 1995; Cell Technology 13:255, 1994; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1886, 1999, o similar, por ejemplo de la manera siguiente, utilizando como diana un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Se prepara un ADNc o un ADN genómico codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Se determina la secuencia de nucleótidos del ADNc o ADN genómico preparado.
Basándose en la secuencia de ADN determinada, se diseña una longitud apropiada de un gen antisentido o constructo de ribozima que comprende una fracción de ADN que codifica el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido una parte de su región no traducida o un intrón.
Con el fin de expresar el gen antisentido o ribozima en una célula, se prepara un vector recombinante mediante la inserción de un fragmento o la longitud total del ADN preparado cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.
Se obtiene un transformante mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.
La célula hospedadora de la presente invención puede obtenerse mediante la selección de un transformante basada en la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. La célula hospedadora de la presente invención también puede obtenerse mediante la selección de un transformante basándose en la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular o la estructura de cadena de azúcar de la molécula de anticuerpo producida.
Como célula hospedadora utilizada para la producción de la célula hospedadora de la presente invención, puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima diana relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y comprende un promotor en una posición que permite que el gen antisentido o ribozima diseñado pueda transferirse. Entre los ejemplos se incluyen vectores de expresión que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Con respecto al método para introducir un gen en diversas células hospedadoras, pueden utilizarse los métodos para introducir vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirán a continuación, en el ítem 3.
El método a continuación puede ejemplificarse como el método de selección de un transformante basado en la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Método para la selección de un transformante:
Entre los ejemplos del método para seleccionar una célula en la que se encuentra reducida la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen métodos bioquímicos o técnicas de ingeniería genética descritos en New Biochemical Experimentation Series 3 - Saccharides I, Glycoprotein (Tokyo Kagaku Dojin), editado por la Japanese Biochemical Society, 1988; Cell Engineering, suplemento, Experimental Protocol Series, Glycobiology Experimental Protocol, Glycoprotein, Glycolipid and Proteoglycan (Shujun-sha), editado por Naoyuki Taniguchi, Akemi Suzuki, Kiyoshi Furukawa y Kazuyuki Sugawara, 1996; Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; y similares. Entre los ejemplos del método bioquímico se incluyen un método en el que se evalúa la actividad enzimática utilizando un sustrato específico de enzima y similares. Entre los ejemplos de la técnica de ingeniería genética se incluye el análisis northern, la RT-PCR y similares que miden la cantidad de ARNm de un gen codificante del enzima.
Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 1(5). Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida se incluyen los métodos que se describen a continuación, en los ítems 5 y 6.
Como método para preparar un ADNc codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se proporciona a modo de ejemplo el método siguiente.
Preparación de ADN:
Se preparó un ARN total o ARNm a partir de un tejido o célula humano o animal no humano.
Se preparó una biblioteca de ADNc a partir del ARN total o ARNm preparado.
Se producen cebadores degenerados basándose en la secuencia de aminoácidos de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, y se obtiene un fragmento génico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, mediante PCR utilizando la biblioteca de ADNc preparada como molde.
Se prepara un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido puede obtenerse mediante cribado de la biblioteca de ADNc utilizando el fragmento génico obtenido a modo de sonda.
Con respecto al ARNm de un tejido o célula humano o no humano, puede utilizarse un producto disponible comercialmente (por ejemplo fabricado por Clontech) o puede prepararse a partir de un tejido o célula humano o no humano de la manera siguiente. Entre los ejemplos del método para preparar un ARN total a partir de un tejido o célula humano o animal no humano se incluye el método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymology 154:3, 1987], el método de tiocianato de guanidinio-fenol-cloroformo ácido (AGPC) [Analytical Biochemistry 162:156, 1987; Experimental Medicine 9:1937, 1991] y similares.
Además, entre los ejemplos del método de preparación de ARNm a partir de un ARN total como ARN poli(A)+ se incluyen un método de columna de celulosa con oligo(dT) inmovilizado (Molecular Cloning, segunda edición) y similares.
Además, puede prepararse ARNm utilizando un kit, tal como el kit de aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia) o similares.
Se preparó una biblioteca de ADNc a partir del ARNm preparado de un tejido o célula humano o animal no humano. Entre los ejemplos del método de preparación de bibliotecas de ADNc se incluyen los métodos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; A Laboratory Manual, segunda edición, 1989, y similares, o métodos utilizando kits disponibles comercialmente, tales como el sistema de plásmidos SuperScript para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (fabricado por Life Technologies), el kit de síntesis de ADNc-ZAP (fabricado por STRATAGENE) y similares.
Como vector de clonación para la utilización en la preparación de la biblioteca de ADNc, puede utilizarse cualquier vector, tal como un vector fágico, un vector plásmido o similar, con la condición de que sea autónomamente replicable en Escherichia coli K12. Entre los ejemplos se incluyen ZAP Express [fabricado por Stratagene, Strategies 5:58, 1992], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17:9494, 1989], Lambda ZAP II (fabricado por STRATAGENE), Agt10 y Agt11 [DnA Cloning, A Practical Approach, 1,49, 1985], ATriμlEx (fabricado por Clontech), XExCell (fabricado por Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983], pUC18 [Gene 33:103, 1985] y similares.
Puede utilizarse cualquier microorganismo como microorganismo huésped, aunque preferentemente se utiliza Escherichia coli. Entre los ejemplos se incluyen Escherichia coli XL1-Blue MRF' [fabricado por STRATAGENE, Strategies 5:81, 1992], Escherichia coli C600 [Genetics 39:440, 1954], Escherichia coli Y1088 [Science 222:778, 1983], Escherichia coli Y1090 [Science 222:778, 1983], Escherichia coli NM522 [J. Mol. Biol. 166:1, 1983], Escherichia coli K802 [J. Mol. Biol., 16:118, 1966], Escherichia coli JM105 [Gene 38:275, 1985] y similares.
La biblioteca de ADNc puede utilizarse sin modificación en los análisis posteriores y con el fin de obtener un ADNc de longitud completa con la máxima eficiencia posible mediante la reducción de la proporción de ADNc de longitud completa, puede utilizarse una biblioteca de ADNc preparada utilizando el método de caperuza oligo desarrollado por Sugano et al. [Gene 138:171, 1994; Gene 200:149, 1997; Protein, Nucleic Acid and Protein 41:603, 1996; Experimental Medicine 11:2491, 1993; cDNA Cloning (Yodo-sha) (1996); Methods for Preparing Gene Libraries (Yodo-sha) (1994)] en el análisis a continuación.
Se prepararon cebadores degenerados específicos para las secuencias de nucleótidos 5'-terminales y 3'-terminales de una secuencia de nucleótidos que se considera que codifica la secuencia de aminoácidos, basándose en la secuencia de aminoácidos del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido y el ADN se amplificó mediante PCR [PCR Protocols, Academic Press, 1990] utilizando la biblioteca de ADNc preparada como molde para obtener un fragmento génico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Puede confirmarse que el fragmento génico obtenido es un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, mediante un método utilizado habitualmente para analizar un nucleótido, tal como el método dideoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], un analizador de secuencias de nucleótidos ABIPRISM 377 DNA Sequencer (fabricado por PE Biosystems) o similar.
Se preparó un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido puede obtenerse llevando a cabo la hibridación de colonias o la hibridación de placas (Molecular Cloning, segunda edición) para el ADNc o la biblioteca de ADNc sintetizada a partir del ARNm contenido en el tejido o célula humano o animal no humano, utilizando el fragmento génico a modo de sonda de ADN.
Además, un ADN codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, también puede obtenerse realizando un cribado mediante PCR utilizando el ADNc o biblioteca de ADNc sintetizado a partir de ARNm contenido en un tejido o célula humano o animal no humano como molde y utilizando los cebadores utilizados para obtener el fragmento génico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
La secuencia de nucleótidos del ADN obtenido codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se analizó desde su extremo y se determinó mediante un método utilizado habitualmente para analizar un nucleótido, tal como el método dideoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)], un analizador de secuencias de nucleótidos ABIPRISM 377 d Na Sequencer (fabricado por PE Biosystems) o similar.
Un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido también puede determinarse a partir de genes en bases de datos mediante la búsqueda en bases de datos de secuencias de nucleótidos tales como GenBank, EMBL, DDBJ y similares utilizando un programa de recuperación de homologías tal como BLAST basado en la secuencia de nucleótidos determinada del ADNc.
Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del gen obtenido mediante el método, codificantes del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 48, n° 51 o n° 65. Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del gen codificante del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 1 o n° 2.
El ADNc codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido también puede obtenerse mediante síntesis química de la misma con un sintetizador de ADN, tal como un sintetizador de ADN modelo 392 fabricado por Perkin Elmer o similar utilizando el método de fosfoamidita, basándose en la secuencia de nucleótidos de ADN determinada.
A título de ejemplo del método para preparar un ADN genómico codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se proporciona a modo de ejemplo el método siguiente.
Preparación de ADN genómico:
Entre los ejemplos del método de preparación del ADN genómico se incluyen métodos conocidos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology, y similares. Además, un ADN genómico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido también puede aislarse utilizando un kit tal como el sistema de cribado de bibliotecas de ADN genómico (fabricado por Genome Systems), kits Universal GenomeWalker™ (fabricado por Clontech) o similares.
Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del ADN genómico obtenido mediante el método codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 67 o n° 70. Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del ADN genómico codificante del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 3.
Además, la célula hospedadora de la presente invención también puede obtenerse sin utilizar un vector de expresión, mediante la introducción directa de un oligonucleótido antisentido o ribozima en una célula hospedadora, que se diseña basándose en la secuencia de nucleótidos codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
El oligonucleótido antisentido o ribozima puede prepararse mediante el método habitual o utilizando un sintetizador de ADN. Específicamente, puede prepararse basándose en la información de secuencia de un oligonucleótido que presenta una secuencia correspondiente continua de 5 a 150 bases, preferentemente de 5 a 60 bases, y más preferentemente de 10 a 40 bases, entre secuencias de nucleótidos de un ADNc y un ADN genómico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, mediante la síntesis de un oligonucleótido que corresponde a una secuencia complementaria al oligonucleótido (oligonucleótido antisentido) o un ribozima que comprende la secuencia oligonucleótida.
Entre los ejemplos del oligonucleótido se incluyen el oligo de ARN y derivados del oligonucleótido (en adelante denominado "derivados de oligonucleótido").
Entre los ejemplos de los derivados de oligonucleótido se incluyen derivados de oligonucleótido en los que un enlace fosfodiéster en el oligonucleótido se convierte en un enlace fosforotioato, un derivado de oligonucleótido en el que un enlace fosfodiéster en el que el oligonucleótido se convierte en un enlace fosfoamidato N3'-P5', un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa y un enlace fosfodiéster en el oligonucleótido se convierten en un enlace péptido-ácido nucleico, un derivado de oligonucleótido en el que el uracilo en el oligonucleótido se sustituye con C-5 propiniluracilo, un derivado de oligonucleótido en el que el uracilo en el oligonucleótido se sustituye con tiazol-uracilo C-5, un derivado de oligonucleótido en el que la citosina en el oligonucleótido se sustituye con propinilcitosina C-5, un derivado de oligonucleótido en el que la citosina en el oligonucleótido se sustituye con citosina modificada con fenoxazina, un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa en el oligonucleótido se sustituye con 2'-O-propilribosa y un derivado de oligonucleótido en el que la ribosa en el oligonucleótido se sustituye con 2'-metoxietoxiribosa [Cell Technology 16:1463, 1997].
(b) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante recombinación homologa
La célula hospedadora de la presente invención puede producirse mediante la modificación de un gen diana en el cromosoma mediante una técnica de recombinación homóloga, utilizando un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
El gen diana en el cromosoma puede modificarse mediante la utilización de un método descrito en Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994 (en adelante denominado "Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual"); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995) (en adelante denominado "Preparation of Mutant Mice using ES Cells"), o similar, por ejemplo de la manera siguiente.
Se preparó un ADN genómico codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Basándose en la secuencia de nucleótidos del ADN genómico, se preparó un vector diana para la recombinación homóloga de un gen diana que debe modificarse (por ejemplo un gen estructural del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, o un gen promotor.
La célula hospedadora de la presente invención puede producirse mediante la introducción del vector diana preparada en una célula hospedadora y la selección de una célula en la que se produce recombinación homóloga entre el gen diana y el vector diana.
Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Entre los ejemplos del método de preparación de un ADN genómico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en la preparación de ADN genómico en el ítem 1(1)(a) y similares.
Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del ADN genómico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 67 o n° 70. Entre los ejemplos de la secuencia de nucleótidos del ADN genómico codificante del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID n° 3.
El vector diana para la utilización en la recombinación homóloga del gen diana puede prepararse de acuerdo con un método descrito en Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995), o similares. El vector diana puede utilizarse como de tipo sustitución o de tipo inserción.
Para introducir el vector diana en diversas células hospedadoras, pueden utilizarse los métodos para introducir vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Entre los ejemplos del método para seleccionar eficientemente un recombinante homólogo se incluye un método, tal como la selección positiva, la selección de promotor, la selección negativa o la selección de poliA descritos en Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice using ES Cells, Yodo-sha (1995), o similares. Entre los ejemplos del método para seleccionar el recombinante homólogo de interés de las estirpes celulares seleccionadas se incluyen el método de transferencia southern para el ADN genómico (Molecular Cloning, segunda edición), PCR [PCR Protocols, Academic Press, 1990] y similares.
(c) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante el método RDO
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante un método de RDO (oligonucleótido ARN-ADN) dirigiendo un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, por ejemplo de la manera siguiente.
Se preparó un ADNc o un ADN genómico codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc o ADN genómico preparado.
Basándose en la secuencia de ADN determinada, se diseñó y se sintetizó una longitud apropiada de un constructo de RDO que comprende una fracción de ADN que codifica el enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido o una parte de su región no traducida o un intrón.
La célula hospedadora de la presente invención puede obtenerse mediante la introducción del RDO sintetizado en una célula hospedadora y después seleccionando un transformante en el que se ha producido una mutación en el enzima diana, es decir el enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Entre los ejemplos del método para introducir RDO en diversas células hospedadoras se incluyen métodos para introducir vectores recombinantes adecuadas para diversas células hospedadoras, que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Entre los ejemplos del método de preparación de ADNc codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en la preparación de ADN en el ítem 1(1)(a) y similares.
Entre los ejemplos del método de preparación de un ADN genómico codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos en la preparación de ADN genómico en el ítem 1(1)(a) y similares.
La secuencia de nucleótidos del ADN puede determinarse digiriéndola con enzimas de restricción apropiados, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similares, sometiendo los clones a la reacción utilizada generalmente como método de análisis de una secuencia de nucleótidos, tal como el método de dideoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977] de Sanger et al. o similares, y analizando seguidamente los clones utilizando un analizador automático de secuencias de nucleótidos, tal como el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) o similares.
El RDO puede prepararse mediante el método habitual o utilizando un sintetizador de ADN.
Entre los ejemplos del método de selección de una célula en la que se ha producido una mutación, mediante la introducción de la ROD en la célula hospedadora, en el gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos para detectar directamente mutaciones en los genes cromosómicos descritos en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology, y similares,
los métodos descritos en el ítem 1(1)(a) para la selección de un transformante mediante la evaluación de la actividad del enzima introducido relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar, en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, el método para la selección de un transformante utilizando la estructura sacárida de una glicoproteína sobre la membrana celular que se describirá a continuación, en el ítem 1(5), y el método para la selección de un transformante basándose en la estructura sacárida de la molécula de anticuerpo producida que se describirá a continuación en el ítem 5 o 6, y similares.
El constructo de la ROD puede diseñarse de acuerdo con los métodos descritos en Science 273:1386, 1996; Nature Medicine 4:285, 1998; Hepatology 25:1462, 1997; Gene Therapy 5:1960, 1999; J. Mol. Med. 75:829, 1997; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8774, 1999; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:8768, 1999; Nuc. Acids. Res. 27:1323, 1999; Invest. Dematol. 111:1172, 1998; Nature Biotech. 16:1343, 1998; Nature Biotech. 18:43, 2000; Nature Biotech. 18:555, 2000, y similares.
(d) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante el método de ARNi
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante el método de ARNi (interferencia de ARN) dirigiendo un gen de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, por ejemplo de la manera siguiente.
Se preparó un ADNc codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Se determinó la secuencia de nucleótidos del ADNc preparado.
Basándose en la secuencia de ADN determinada, se diseñó una longitud apropiada de un constructo génico de ARNi que comprendía la fracción de ADN que codifica el enzima relacionado con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido o una parte de su región no traducida.
Con el fin de expresar el gen de ARNi en una célula, se preparó un vector recombinante mediante la inserción de un fragmento o la longitud total del ADN preparado cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.
Se obtuvo un transformante mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.
La célula hospedadora de la presente invención puede obtenerse mediante la selección de un transformante basada en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, o la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular o de la molécula de anticuerpo producida.
Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima diana relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o del enzima diana relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y que comprende un promotor en una posición que permite que el gen de a Rní pueda transferirse. Entre los ejemplos se incluyen vectores de expresión que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Con método para introducir un gen en diversas células hospedadoras, pueden utilizarse métodos para introducir vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Entre los ejemplos del método de selección de un transformante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en el ítem 1(1)(a).
Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 1(5). Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 5 o 6.
Entre los ejemplos del método de preparación de ADNc codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en la preparación de ADN en el ítem 1(1)(a) y similares.
Además, la célula hospedadora de la presente invención también puede obtenerse sin utilizar un vector de expresión, mediante la introducción directa de un gen de ARNi diseñado basándose en la secuencia de nucleótidos codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
El gen de ARNi puede prepararse mediante el método habitual o utilizando un sintetizador de ADN.
El constructo de gen de ARNi puede diseñarse de acuerdo con los métodos descritos en Nature 391:806, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:15502, 1998; Nature 395:854, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5049, 1999; Cell 95:1017, 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:1451, 1999; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959, 1998; Nature Cell Biol. 2:70, 2000, y similares.
(e) Preparación de la célula hospedadora de la presente invención mediante un método que utiliza un trasposón
La célula hospedadora de la presente invención puede obtenerse mediante la inducción de una mutación utilizando un sistema de trasposón descrito en Nature Genet. 25:35, 2000, o similar, seleccionando seguidamente un mutante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, o la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína de una molécula de anticuerpo producida o sobre la membrana celular.
El sistema de trasposones es un sistema en el que se induce una mutación mediante la inserción aleatoria de un gen exógeno en el cromosoma, en el que un gen exógeno interpuesto entre trasposones se utiliza generalmente como vector para inducir una mutación, y se introduce simultáneamente en la célula un vector de expresión de trasposasa para la inserción aleatoria del gen en el cromosoma.
Puede utilizarse cualquier trasposasa, con la condición de que resulte adecuada para la secuencia del trasposón que debe utilizarse.
Como gen exógeno, puede utilizarse cualquier gen, con la condición de que pueda inducir una mutación en el ADN de una célula hospedadora.
Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima diana relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o del enzima diana relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen las células hospedadoras que se describen a continuación, en el ítem 3. Para la introducción del gen en diversas células hospedadoras, puede utilizarse el método de introducción de vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirá a continuación, en el ítem 3.
Entre los ejemplos del método de selección de un mutante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en el ítem 1(1)(a).
Entre los ejemplos del método para seleccionar un mutante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 1(5). Entre los ejemplos del método para seleccionar un mutante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 5 o 6.
(2) Método para introducir un mutante negativo dominante de un gen codificante del enzima
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse utilizando utilizando como diana un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, utilizando una técnica para introducir un mutante negativo dominante del enzima. Entre los ejemplos del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen GMD, Fx, GFPP, fucoquinasa y similares. Entre los ejemplos del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la a-1,6-fucosiltransferasa, la a-L-fucosidasa y similares.
Los enzimas catalizan reacciones específicas que presentan especificidad de sustrato y pueden prepararse mutantes negativos dominantes de los enzimas mediante disrupción del centro activo de los enzimas que catalizan la actividad catalítica que presenta especificidad de sustrato. El método para preparar un mutante negativo dominante se describe específicamente de la manera siguiente en referencia a GMD de entre los enzimas diana.
Como resultado del análisis de la estructura tridimensional de la GMD derivada de E. coli, se ha encontrado que 4 aminoácidos (la treonina en la posición 133, el ácido glutámico en la posición 135, la tirosina en la posición 157 y la lisina en la posición 161) presentan una función importante en la actividad del enzima (Structure 8:2, 2000). Es decir, al preparar mutantes mediante la sustitución de los 4 aminoácidos por otros aminoácidos diferentes basándose en la información de la estructura tridimensional, se reduce significativamente la actividad enzimática de la totalidad de los mutantes. Por otra parte, prácticamente no se observaron en los mutantes cambios en la capacidad de la GMD de unirse a la coenzima NADP de GMD y su sustrato GDP-manosa. De acuerdo con lo anterior, puede prepararse un mutante negativo dominante mediante la sustitución de los 4 aminoácidos que controlan la actividad enzimática de GMD. Por ejemplo, en GMD (SEC ID n° 65) derivada de células CHO, puede prepararse un mutante negativo dominante mediante sustitución de la treonina en la posición 155, el ácido glutámico en la posición 157, la tirosina en la posición 179 y la lisina en la posición 183 por otros aminoácidos, mediante comparación de la homología y la predicción de la estructura tridimensional utilizando la información de secuencia de aminoácidos basándose en los resultados de la GMD derivada de E. coli. Dicho gen en el que se introduce la sustitución de aminoácido puede prepararse mediante mutagénesis dirigida a sitio, descrita en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology o similares.
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology o similares, utilizando el gen mutante negativo dominante preparado del enzima diana, por ejemplo, tal como se indica a continuación.
Se preparó un gen codificante de un mutante negativo dominante (en adelante denominado "gen mutante negativo dominante") del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido.
Basándose en el ADN de longitud completa preparado del gen mutante negativo dominante, se preparó, en caso necesario, un fragmento de ADN de longitud apropiada que contenía una fracción codificante de la proteína.
Se produjo un vector recombinante mediante la inserción del fragmento de ADN o el ADN de longitud completa cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.
Se obtuvo un transformante mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante la selección de un transformante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o en la actividad del enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, o la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína de una molécula de anticuerpo producida o sobre la membrana celular.
Como célula hospedadora puede utilizarse cualquier célula, tal como de levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal, con la condición de que presente un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o del enzima diana relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen células hospedadoras que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y que comprende un promotor en una posición que permite llevar a cabo la transcripción del ADN codificante del mutante negativo dominante de interés. Entre los ejemplos se incluyen vectores de expresión que se describirán a continuación, en el ítem 3.
Para introducir el gen en diversas células hospedadoras, puede utilizarse el método para introducir vectores recombinantes adecuados para diversas células hospedadoras, que se describirá a continuación, en el ítem 3.
Entre los ejemplos del método de selección de un transformante basándose en la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en el ítem 1(1)(a).
Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 1(5). Entre los ejemplos del método para seleccionar un transformante basándose en la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida se incluyen los métodos que se describen a continuación, en el ítem 5 o 6.
(3) Método para introducir una mutación en el enzima
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante la introducción de una mutación en un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, seguido de la selección de una estirpe celular de interés en la que se ha producido la mutación en el enzima.
Entre los ejemplos del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen g Md , Fx, GFPP, fucoquinasa y similares. Entre los ejemplos del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la a-1,6-fucosiltransferasa, la a-L-fucosidasa y similares.
Entre los ejemplos del método se incluyen: 1) un método en el que se selecciona una estirpe celular deseada a partir de mutantes obtenidos mediante un tratamiento inductor de mutación de una estirpe celular parental con un mutágeno o mutantes generados espontáneamente, basándose en la actividad de un enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad de un enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, 2) un método en el que la estirpe celular deseada se selecciona de entre mutantes obtenidos mediante un tratamiento inductor de mutación de una estirpe celular parental con un mutágeno o mutantes generados espontáneamente, basándose en la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo producida, y 3) un método en el que la estirpe celular deseada se selecciona de entre mutantes obtenidos mediante un tratamiento inductor de mutación de una estirpe celular parental con un mutágeno o mutantes generados espontáneamente, basándose en la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular.
Como tratamiento inductor de mutación puede utilizarse cualquier tratamiento, con la condición de que pueda inducir una mutación puntual o una deleción o mutación por desplazamiento de marco en el ADN de las células de la estirpe celular parental.
Entre los ejemplos se incluyen el tratamiento con etilnitrosourea, nitrosoguanidina, benzopireno o un pigmento de acridina y el tratamiento con radiación. Además, pueden utilizarse como mutágenos diversos agentes alquilantes y carcinógenos. Entre los ejemplos del método que permite que actúe un mutágeno sobre las células se incluyen los métodos descritos en Tissue Culture Techniques, tercera edición (Asakura Shoten), editado por Japanese Tissue Culture Association (1996), Nature Genet. 24:314, 2000, y similares.
Entre los ejemplos del mutante generado espontáneamente se incluyen mutantes que se forman espontáneamente al continuar el subcultivo bajo condiciones generales de cultivo celular, sin aplicar un tratamiento especial inductor de mutaciones.
Entre los ejemplos del método para medir la actividad de la enzima relacionada con la síntesis de un azúcarnucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad del enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, se incluyen los métodos descritos en el ítem 1(1)(a). Entre los ejemplos del método para discriminar la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo preparada se incluyen los métodos que se describirán a continuación, en el ítem 5 o 6. Entre los ejemplos del método para discriminar la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína sobre la membrana celular se incluyen los métodos que se describirán a continuación, en el ítem 1(5).
(4) Método para inhibir la transcripción y/o la traducción de un gen codificante del enzima
La célula hospedadora de la presente invención puede prepararse mediante la inhibición de la transcripción y/o traducción de un gen diana mediante un método tal como la técnica de ARN/ADN antisentido [Bioscience and Industry 50:322, 1992; Chemistry 46:681, 1991; Biotechnology 9:358, 1992; Trends in Biotechnology 10:87, 1992; Trends in Biotechnology 10:152, 1992; Cell Engineering 16:1463, 1997], la técnica de triple hélice [Trends in Biotechnology 10:132, 1992] o similares, utilizando un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, y/o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, como la diana.
Entre los ejemplos del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, se incluyen GMD, Fx, GFPP, fucoquinasa y similares. Entre los ejemplos del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se incluyen la a-1,6-fucosiltransferasa, la a-L-fucosidasa y similares.
(5) Método de selección de una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido
La célula hospedadora de la presente divulgación puede prepararse mediante la utilización de un método de selección de una estirpe celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido
Entre los ejemplos del método de selección de una estirpe celular resistente a un a lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido se incluyen los métodos que utilizan lectina descritos en Somatic Cell Mol. Genet. 12:51, 1986, y similares. Como la lectina, puede utilizarse cualquier lectina, con la condición de que sea una lectina que reconozca una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido Entre los ejemplos se incluyen una lectina de Lens culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), una lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), una lectina de haba VFA (aglutinina obtenida de Vicia faba), una lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina obtenida de Aleuria aurantia) y similares.
Específicamente, la estirpe celular utilizada en la presente invención como se reivindica resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido puede seleccionarse mediante el cultivo de células durante un tiempo de entre 1 día y 2 semanas, preferentemente de entre 1 día y 1 semana, utilizando un medio que comprende la lectina como se menciona en las reivindicaciones a una concentración de entre 1 μg/ml y 1 mg/ml, subcultivando las células supervivientes o recolectando una colonia y transfiriéndola a un recipiente de cultivo y a continuación continuando el cultivo utilizando el medio que contiene lectina. Entre los ejemplos de la estirpe celular obtenidos mediante el método se incluyen CHO/CCR4-LCA Nega-13 (FERM n° BP-7756) obtenidos en el Ejemplo 14(2) que se describen a continuación.
2. Preparación de un animal no humano o planta transgénico o la progenie del mismo de la presente divulgación
El animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo de la presente divulgación es un animal no humano o planta transgénico o progenie del mismo en el que se modifica un gen genómico de manera que pueda controlarse la actividad de un enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo, y puede prepararse según un método similar al del ítem 1, utilizando un gen codificante de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, como la diana.
En un animal no humano transgénico, puede prepararse una célula madre embrionaria de la presente divulgación en la que se encuentra controlada la actividad del enzima relacionada con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad del enzima relacionada con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido, aplicando un método similar al del ítem 1 a una célula madre embrionaria del animal no humano deseado, tal como vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono, conejo o similar.
Específicamente, se preparó un clon mutante en el que un gen codificante del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o el enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja se inactiva o se sustituye con cualquier secuencia, mediante una técnica de recombinación homóloga [por ejemplo Nature 326(6110):295, 1987; Cell 51(3):503, 1987, o similares]. Utilizando el clon mutante preparado, puede prepararse un individuo híbrido que comprende un clon de células madre embrionarias y una célula normal, mediante un método de inyección quimérica en un blastocito de huevo fertilizado de un animal o mediante un método de agregación quimérica. El individuo híbrido se cruza con un individuo normal, de manera que puede obtenerse un animal no humano transgénico en el que la actividad del enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido se encuentra reducida o anulada en las células corporales completas.
Además, una célula de huevo fertilizado de la presente divulgación en la que se ha eliminado la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad del enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido es disminuida o suprimida, puede prepararse aplicando un método similar al del ítem 1 a un huevo fertilizado de un animal no humano de interés, tal como vaca, oveja, cabra, cerdo, caballo, ratón, rata, ave, mono, conejo o similar.
Un animal no humano transgénico en el que se ha eliminado la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa, o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida puede prepararse mediante el trasplante de la célula de huevo fertilizado preparada en el oviducto o útero de una hembra pseudogestante utilizando el método de trasplante embrionario descrito en Manipulation Mouse Embryo, segunda edición, o similar, seguido del nacimiento del animal.
En una planta transgénica, el callo de la presente divulgación en el que la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido ha sido disminuida o eliminada puede prepararse mediante la aplicación de un método similar al del ítem 1 a un callo o célula de la planta de interés.
Una planta transgénica en la que se encuentra reducida la actividad de un enzima relacionado con la síntesis de un azúcar-nucleótido intracelular, GDP-fucosa o la actividad de un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido puede prepararse mediante el cultivo del callo preparado utilizando un medio que comprende auxina y citoquinina para rediferenciarlo de acuerdo con un método conocido [Tissue Culture 20, 1994; Tissue Culture 21, 1995; Trends in Biotechnology 15:45, 1997].
3. Procedimiento para producir una composición de anticuerpo
La composición de anticuerpo puede obtenerse expresándola en una célula hospedadora utilizando los métodos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (en adelante denominado "Antibodies"); Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, tercera edición, Acad. Press, 1993 (en adelante también denominada "Monoclonal Antibodies"), y Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (en adelante también denominada "Antibody Engineering'), por ejemplo, tal como se indica a continuación.
Se preparó un ADNc de longitud completa codificante de una molécula de anticuerpo y se preparó una longitud apropiada de un fragmento de ADN que comprendía una fracción codificante de la molécula de anticuerpo.
Se preparó un vector recombinante mediante la inserción del fragmento de ADN o el ADN de longitud completa cadena abajo del promotor de un vector de expresión apropiado.
Puede obtenerse un transformante que produce la molécula de anticuerpo mediante la introducción del vector recombinante en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.
Como célula hospedadora, puede utilizarse cualquiera de entre una célula de levadura, una célula animal, una célula vegetal o similar, con la condición de que pueda expresar el gen de interés.
Como célula hospedadora también puede utilizarse una célula tal como una célula de levadura, una célula animal, una célula de insecto, una célula vegetal o similar en la que se ha introducido mediante una técnica de ingeniería genética un enzima relacionado con la modificación de una cadena de azúcar unida mediante N-glucósido que se une a la región Fc de la molécula de anticuerpo.
Como vector de expresión, se utiliza un vector que es de replicación autónoma en la célula hospedadora o que puede integrarse en el cromosoma y que comprende un promotor en una posición que permite que el ADN codificante de la molécula de anticuerpo pueda transferirse.
El ADNc puede prepararse a partir de un tejido o célula humano o no humano utilizando, por ejemplo, un cebador sonda específico para la molécula de anticuerpo de interés, de acuerdo con los métodos descritos en la preparación de ADN en el ítem 1(1)(a).
En el caso de que se utilice una levadura como célula hospedadora, entre los ejemplos de vector de expresión se incluyen YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) y similares.
Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en las levaduras. Entre los ejemplos se incluyen un promotor de un gen de la ruta glucolítica, tal como un gen de hexosa quinasa, etc., el promotor PH05, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH, el promotor gal 1, el promotor gal 10, el promotor de la proteína de choque térmico, el promotor MF a1, el promotor CUP 1 y similares.
Entre los ejemplos de célula hospedadora se incluyen los microorganismos pertenecientes al género Saccharomyces, al género Schizosaccharomyces, al género Kluyveromyces, al género Trichosporon, al género Schwanniomyces y similares, tales como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans and Schwanniomyces alluvius, etc.
Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método, con la condición de que pueda introducir ADN en levaduras. Entre los ejemplos se incluyen la electroporación [Methods in Enzymology 194:182, 1990], el método de esferoplastos [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:1929, 1978], el método de acetato de litio [J. Bacteriol. 153:163, 1983], un método descrito en Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1929, 1978, y similares.
En el caso de que se utilice una célula animal como huésped, entre los ejemplos del vector de expresión se incluyen pcDNAl, pcDM8 (disponible de Funakoshi), pAGE107 [solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 22979/91; Cytotechnology 3:133, 1990], pAs3-3 (solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 227075/90), pCDM8 [Nature 329:840, 1987], pcDNAI/Amp (fabricado por Invitrogen), pREP4 (fabricado por Invitrogen), pAGE103 [J. Biochemistry 101:1307, 1987], paGe210 y similares.
Puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula animal. Entre los ejemplos se incluye un promotor de gen TI (temprano inmediato) del citomegalovirus (CMV), un promotor temprano del SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de metalotioneína, un promotor de choque térmico, un promotor SRa y similares. Además, puede utilizarse un intensificador del gen TI del CMV humano conjuntamente con el promotor.
Entre los ejemplos de la célula hospedadora se incluyen una célula humana tal como una célula Namalwa, una célula de mono tal como una célula COS, una célula de hámster chino, tal como una célula CHO o HBT5637 (solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 299/88), una célula de mieloma de rata, una célula de mieloma de ratón, una célula derivada de riñón de hámster sirio, una célula madre embrionaria, una célula de huevo fertilizado y similares.
Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método, con la condición de que pueda introducir ADN en células animales. Entre los ejemplos se incluyen la electroporación /Cytotechnology 3:133, 1990], el método del fosfato de calcio (solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 227075/90), el método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987], el método de inyección [Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual], un método que utiliza una pistola de partícula (pistola génica) (patente japonesa n° 2606856, patente japonesa n° 2517813), el método de DEAE-dextrano [Biomanual Series 4-Gene Transfer and Expression Analysis (Yodo-sha), editado por Takashi Yokota y Kenichi Arai, 1994], el método del vector vírico (Manipulating Mouse Embryo, segunda edición) y similares.
En el caso de que se utilice una célula de insecto como huésped, la proteína puede expresarse mediante el método descrito en Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology 6:47, 1988, o similares.
Es decir, la proteína puede expresarse mediante la introducción simultánea de un vector de introducción de un gen recombinante y un baculovirus en una célula de insecto con el fin de obtener un virus recombinante en un sobrenadante de cultivo de células de insecto y después infectar las células de insecto con el virus recombinante.
Entre los ejemplos del vector de introducción de genes utilizado en el método se incluyen pVL1392, pVL1393, pBlueBacIII (todos fabricados por Invitrogen) y similares.
Entre los ejemplos de baculovirus se incluyen el virus de la polihedrosis nuclear Autographa californica, que infecta un insecto de la familia Barathra.
Entre los ejemplos de células de insecto se incluyen los oocitos de Spodoptera frugiperda Sf9 y Sf21 [Current Protocols in Molecular Biology, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York, 1992], un oocito de Trichoplusia ni High 5 (fabricado por Invitrogen) y similares.
Entre los ejemplos del método para la introducción simultánea del vector de introducción de genes recombinantes y el baculovirus para la preparación de virus recombinante se incluyen el método de fosfato de calcio (solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 227075/90), el método de lipofección [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987] y similares.
En el caso de que se utilice una célula vegetal como célula hospedadora, entre los ejemplos de vector de expresión se incluyen el plásmido Ti, el virus del mosaico del tabaco y similares.
Como promotor puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en una célula vegetal. Entre los ejemplos se incluye el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor actina 1 del arroz y similares.
Entre los ejemplos de célula hospedadora se incluyen células vegetales de la planta del tabaco, de la patata, del tomate, de la zanahoria, de la soja, de la colza, de la alfalfa, del arroz, del trigo, de la cebada, y similares.
Como método para introducir el vector recombinante, puede utilizarse cualquier método, con la condición de que pueda introducir ADN en una célula vegetal. Entre los ejemplos se incluye un método que utiliza Agrobacterium (solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 140885/84, solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 70080/85, documento n° 94/00977), la electroporación (solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 251887/85), un método que utiliza una pistola de partícula (pistola génica) (patente japonesa n° 2606856, patente japonesa n° 2517813), y similares.
Como método para expresar un gen, puede llevarse a cabo la producción mediante secreción, la expresión de una proteína de fusión de la región Fc con otra proteína y similares, de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, segunda edición, o similar, además de la expresión directa.
En el caso de que se exprese un gen en una bacteria, levadura, célula animal, célula de insecto o célula vegetal en la que se ha introducido un gen relacionado con la síntesis de una cadena de azúcar, puede obtenerse una molécula de anticuerpo a la que un gen introducido añade un azúcar o cadena de azúcar.
Puede obtenerse una composición de anticuerpo mediante el cultivo del transformante obtenido en un medio para producir y acumular la molécula de anticuerpo en el cultivo y después recuperarla a partir del cultivo resultante. El método para el cultivo del transformante utilizando un medio puede aplicarse de acuerdo con un método general que se utiliza para el cultivo de células hospedadoras.
Como medio para el cultivo de un transformante obtenido utilizando un procariota tal como Escherichia coli, etc., o un eucariota tal como una levadura, etc., como la célula hospedadora, el medio puede ser un medio natural o un medio sintético, con la condición de que comprenda materiales tales como una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, una sal inorgánica y similares que puedan resultar asimilados por el organismo y pueda llevarse a cabo eficientemente el cultivo del transformante.
Como fuente de carbono, pueden utilizarse aquellas que puedan ser asimiladas por el organismo. Entre los ejemplos se incluyen carbohidratos tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas que los contienen, almidón, hidrolizado de almidón, etc.; ácidos orgánicos, tales como ácido acético, ácido propiónico, etc.; alcoholes, tales como etanol, propanol, etc., y similares.
Entre los ejemplos de la fuente de nitrógeno se incluye amonio, sales amónicas de ácido inorgánico u orgánico, tales como cloruro amónico, sulfato amónico, acetato amónico, fosfato amónico, etc.; otros compuestos que contienen nitrógeno, peptona, extracto de carne, extracto de levadura, licor de maceración del maíz, hidrolizado de caseína, harina de soja, hidrolizado de harina de soja, diversas células fermentadas e hidrolizados de las mismas, y similares.
Entre los ejemplos del material inorgánico se incluyen dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro sódico, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre, carbonato de calcio y similares.
El cultivo se lleva a cabo de manera general bajo condiciones aeróbicas, tales como el cultivo bajo agitación, el cultivo bajo agitación de aireación sumergido o similares. La temperatura de cultivo preferentemente es de entre 15°C y 40°C y el tiempo de cultivo generalmente es de entre 16 horas y 7 días. Durante el cultivo, el pH se mantiene en un valor entre 3,0 y 9,0. El pH se ajusta utilizando un ácido inorgánico u orgánico, una solución de álcali, urea, carbonato de calcio, amonio o similar.
En caso necesario, puede añadirse al medio un antibiótico, tal como ampicilina, tetraciclina o similar, durante el cultivo.
En el caso de que se obtenga un microorganismo transformado con un vector recombinante utilizando un promotor inducible al cultivar el promotor, puede añadirse un inductor al medio, en caso necesario. Por ejemplo, al cultivar un microorganismo transformado con un vector recombinante obtenido utilizando un promotor lac, puede añadirse isopropil-p-D-tiogalactopiranósido al medio y al cultivar un microorganismo transformado con un vector recombinante obtenido utilizando un promotor trp, puede añadirse ácido indol-acrílico al medio.
En el caso de que se cultive un transformante obtenido utilizando una célula animal como la célula hospedadora, entre los ejemplos del medio se incluyen el medio RPMI 1640 utilizado generalmente [The Journal of the American Medical Association 199:519, 1967], medio MEM de Eagle [Science 122:501, 1952], medido MEM modificado por Dulbecco [Virology 8:396, 1959], medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine 73:1, 1950] y medio de Whitten [Developmental Engineering Experimentation Manual-Preparation of Transgenic Mice (Kodansha), editado por M. Katshuki, 1987], medio al que se añadió suero de feto bovino, etc., y similares.
El cultivo generalmente se llevó a cabo a un pH de entre 6 y 8 a una temperatura de entre 30°C y 40°C durante 1 a 7 días en presencia de 5% de CO2. En caso necesario, puede añadirse al medio un antibiótico, tal como canamicina, ampicilina o similar, durante el cultivo.
Entre los ejemplos del medio para la utilización durante el cultivo de un transformante obtenido utilizando una célula de insecto como huésped se incluyen el medio TNM-FH (fabricado por Pharmingen), el medio Sf-900 II SFM (fabricado por Life Technologies), ExCell 400 y ExCell 405 (ambos fabricados por JRH Biosciences), medio para insectos de Grace [Nature 195:788, 1962] y similares.
El cultivo generalmente se lleva a cabo a un pH del medio de entre 6 y 7 y a una temperatura de entre 25°C y 30°C durante 1 a 5 días.
Además, pueden añadirse antibióticos tales como la gentamicina al medio durante el cultivo, según se requiera.
Un transformante obtenido utilizando una célula vegetal puede cultivarse como una célula o mediante la diferenciación del mismo en célula u órgano vegetal. Entre los ejemplos del medio para el cultivo del transformante se incluyen el medio Murashige y Skoog (MS) y el medio de White utilizados de manera general, medios a los que se añade una hormona vegetal tal como auxina, citoquinina, etc., y similares.
El cultivo generalmente se lleva a cabo a un pH de entre 5 y 9 y a una temperatura de entre 20°C y 40°C durante 3 a 60 días.
En caso necesario, puede añadirse al medio un antibiótico, tal como canamicina, higromicina o similar, durante el cultivo.
De acuerdo con lo anterior, puede producirse una composición de anticuerpo mediante el cultivo de un transformante derivado de un microorganismo, una célula animal o una célula vegetal, que comprende un vector recombinante en el que se inserta un ADN codificante de una molécula de anticuerpo, de acuerdo con un método general de cultivo, produciendo y acumulando de esta manera la composición de anticuerpo y recuperando después la composición de anticuerpo a partir del cultivo.
Como método para expresar un gen, puede llevarse a cabo la producción mediante secreción, la expresión de una proteína de fusión y similares, de acuerdo con el método descrito en Molecular Cloning, segunda edición, o similar, además de la expresión directa. Entre los ejemplos del procedimiento para producir una composición de anticuerpo se incluyen la expresión intracelular en una célula hospedadora, un método de secreción extracelular a partir de una célula hospedadora y un método de producción sobre la cubierta externa de la membrana de una célula hospedadora. El método puede seleccionarse cambiando la célula hospedadora utilizada o la estructura de la composición de anticuerpo producida.
En el caso de que la composición de anticuerpo de la presente exposición se produzca en una célula hospedadora o sobre la cubierta externa de la membrana de una célula hospedadora, puede secretarse positivamente al exterior de la célula de acuerdo con el método de Paulson et al. [J. Biol. Chem. 264:17619, 1989], el método de Lowe et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8227, 1989; Genes Develop. 4:1288, 1990], los métodos descritos en la solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 336963/93 y solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 823021/94 y similares.
Es decir, una molécula de anticuerpo de interés puede secretarse positivamente al exterior de la célula a partir de una célula hospedadora mediante la inserción de un ADN codificante de la molécula de anticuerpo y un ADN codificante de un péptido de señal adecuado para la expresión de la molécula de anticuerpo en un vector de expresión utilizando una técnica de recombinación génica, introduciendo el vector de expresión en la célula hospedadora y expresando después la molécula de anticuerpo.
Además, puede incrementarse su cantidad de producción de acuerdo con el método descrito en la solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 227075/90 utilizando un sistema de amplificación génica utilizando un gen de dihidrofolato reductasa.
Además, la composición de anticuerpo también puede producirse utilizando un animal individual en el que se ha introducido un gene (animal no humano transgénico) o una planta individual (planta transgénica) que se construye mediante la rediferenciación de una célula animal o vegetal en la que se ha introducido el gen.
En el caso de que el transformante sea un animal individual o una planta individual, puede producirse una composición de anticuerpo de acuerdo con el método general mediante cría o cultivo, produciendo y acumulando de esta manera la composición de anticuerpo, recuperando después la composición de anticuerpo a partir del animal o planta individual.
Entre los ejemplos del procedimiento para producir una composición de anticuerpo utilizando un animal individual se incluyen un método en el que la composición de anticuerpo de interés se produce en un animal construido mediante la introducción de un gen de acuerdo con un método conocido [American Journal of Clinical Nutrition 63:627S, 1996; Bio/Technology 9:830, 1991].
En el caso de un animal individual, puede producirse una composición de anticuerpo mediante la cría de un animal no humano transgénico en el que se ha introducido un ADN codificante de una molécula de anticuerpo, produciendo y acumulando de esta manera la composición de anticuerpo en el animal, y recuperando después la composición de anticuerpo a partir del animal. Entre los ejemplos de los sitios del animal en que se produce y se acumula la composición se incluyen la leche (solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 309192/88) y huevos del animal. Como promotor utilizado en dicho caso, puede utilizarse cualquier promotor, con la condición de que pueda funcionar en un animal. Entre los ejemplos preferentes se incluyen promotores específicos de células de glándula mamaria, tales como el promotor caseína a, el promotor caseína p, el promotor lactoglobulina p, promotor de proteína ácida de suero y similares.
Un ejemplo del procedimiento para producir una composición de anticuerpo utilizando una planta individual incluye un método en el que se produce una composición de anticuerpo mediante el cultivo de una planta transgénica en la que se introduce un ADN codificante de una molécula de anticuerpo mediante un método conocido [Tissue Culture 20, 1994; Tissue Culture 21, 1995; Trends in Biotechnology 15:45, 1997] para producir y acumular la composición de anticuerpo en la planta y después recuperar la composición de anticuerpo a partir de la planta.
Con respecto a la purificación de una composición de anticuerpo producida por un transformante en el que se ha introducido un gen codificante de una molécula de anticuerpo, por ejemplo en el caso de que la composición de anticuerpo se exprese intracelularmente en estado disuelto, las células se recuperan tras el cultivo mediante centrifugación, se suspenden en un tampón acuoso y después se fragmentan utilizando un oscilador ultrasónico, prensa francesa, homogeneizador Manton Gaulin, molino Dynomill o similar, con el fin de obtener un extracto libre de células. Puede obtenerse un producto purificado de la composición de anticuerpo a partir de un sobrenadante obtenido mediante centrifugación del extracto libre de células, mediante la utilización de una técnica general de purificación para el aislamiento de enzimas, tal como la extracción con solvente, la precipitación a altas concentraciones salinas ("salting out"), la desalación con sulfato amónico, etc.; la precipitación con un solvente orgánico, la cromatografía de intercambio aniónico utilizando una resina, tal como dietilaminoetil (DEAE)-sefarosa, DIAION HPA-75 (fabricada por Mitsubishi Chemical), etc.; la cromatografía de intercambio catiónico utilizando una resina, tal como S-Sepharose FF (fabricada por Pharmacia), etc.; cromatografía hidrofóbica utilizando una resina, tal como butil-sefarosa, fenil-sefarosa, etc.; la filtración en gel utilizando un tamiz molecular; la cromatografía de afinidad; el cromatoenfoque; la electroforesis, tal como el enfoque isoeléctrico, etc.; y similares, que pueden utilizarse solos o en combinación.
Además, en el caso de que la composición de anticuerpo se exprese intracelularmente mediante la formación de un cuerpo insoluble, las células se recuperan, se fragmentan y se centrifugan de la misma manera, y el cuerpo insoluble de la composición de anticuerpo se recupera como una fracción precipitada. El cuerpo insoluble recuperado de la composición de anticuerpo se solubiliza utilizando un agente desnaturalizante de proteínas. La composición de anticuerpo se convierte en una estructura tridimensional normal mediante dilución o dialización de la solución solubilizada, obteniendo un producto purificado de la composición de anticuerpo mediante el mismo método de aislamiento mediante purificación.
En el caso de que la composición de anticuerpo se secrete extracelularmente, la composición de anticuerpo o derivados del mismo puede recuperarse a partir del sobrenadante de cultivo. Es decir, el cultivo se trató mediante una técnica, tal como centrifugación o similar, con el fin de obtener una fracción soluble y puede obtenerse una preparación purificada de la composición de anticuerpo a partir de la fracción soluble mediante el mismo método de aislamiento mediante purificación.
Entre los ejemplos de la composición de anticuerpo obtenida de esta manera se incluyen un anticuerpo, el fragmento del anticuerpo, una proteína de fusión que comprende la región Fc del anticuerpo, y similares.
A título de ejemplo para obtener la composición de anticuerpo, un procedimiento para producir una composición de un anticuerpo humanizado se describe a continuación, aunque también pueden obtenerse otras composiciones de anticuerpo de una manera similar al método.
(1) Construcción de vector para la expresión de anticuerpos humanizados
Un vector para la expresión de anticuerpos humanizados es un vector de expresión para células animales en las que se insertan genes codificantes de regiones C de cadena pesada (cadena P) y de cadena ligera (cadena L), que pueden construirse mediante clonación de cada uno de los genes codificantes de las regiones C de cadena H y de cadena L de un anticuerpo humano en un vector de expresión para células animales.
Las regiones C de un anticuerpo humano puede ser la cadena H y la cadena L de cualquier anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluyen la región C perteneciente a la subclase IgG1 en la cadena H de un anticuerpo humano (en adelante denominada "CYl_h"), la región C perteneciente a la clase k en la cadena L de un anticuerpo humano (en adelante denominado "CK_h") y similares.
Como genes codificantes de las regiones C de la cadena H y de la cadena L de un anticuerpo humano, puede utilizarse un ADN cromosómico que comprende un exón y un intrón o también puede utilizarse un ADNc.
Como vector de expresión para células animales, puede utilizarse cualquier vector, con la condición de que pueda insertarse un gen codificante de la región C de un anticuerpo humano en el mismo y expresarse en el mismo. Entre los ejemplos se incluyen pAGE107 [Cytotechnology 3:133, 1990], pAGE103 [J. Biochem. 101:1307, 1987], pHSG274 [Gene 27:223, 1984], pKCR [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527, 1981, pSG1 p d2-4 [Cytotechnology 4:173, 1990] y similares. Entre los ejemplos del promotor y el intensificador en el vector de expresión para células animales se incluyen el promotor e intensificador tempranos del SV40 [J. Biochem., 101, 1307 (1987)], promotor RTL de la leucemia de Moloney de ratón [Biochem. Biophys. Res. Commun. 149:960, 1987], el promotor [Cell 41:479, 1985] e intensificador [Cell, 33, 717 (1983)] de cadena H de inmunoglobulina y similares.
El vector de expresión de anticuerpos humanizados puede ser de un tipo en el que los genes codificantes de las cadenas H y L de un anticuerpo se encuentran en vectores separados o de un tipo en el que ambos genes se encuentran presentes en el mismo vector (tipo tándem). Con respecto a la facilidad de construcción de un vector de expresión de anticuerpos humanizados, facilidad de introducción en células animales y equilibrio entre las cantidades expresadas de las cadenas H y L de un anticuerpo en células animales, resulta más preferente un tipo tándem del vector de expresión de anticuerpos humanizados [J. Immunol. Methods 167:271, 1994].
El vector de expresión construido de anticuerpos humanizados puede utilizarse para la expresión de un anticuerpo híbrido humano y un anticuerpo injertado con RDC humano en células animales.
(2) Preparación de ADNc codificante de la región V de anticuerpos obtenidos de animales diferentes del ser humano
Los ADNc codificantes de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano, tal como un anticuerpo de ratón, pueden obtenerse de la manera siguiente.
Se sintetizó un ADNc mediante la extracción del ARNm de una célula de hibridoma que produce el anticuerpo de ratón de interés. El ADNc sintetizado se clonó en un vector, tal como un fago o un plásmido, con el fin de obtener una biblioteca de ADNc. Se aisló cada uno de un fago recombinante o un plásmido recombinante que comprende un ADNc codificante de la región V de cadena H y un fago recombinante o plásmido recombinante que comprende un ADNc codificante de la región V de la cadena L a partir de la biblioteca utilizando una parte de región C o una parte de región V de un anticuerpo de ratón presente como sonda. Se determinan las secuencia de nucleótidos completas de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo de ratón de interés en el fago recombinante o el plásmido recombinante y las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de cadenas H y L se deducen de las secuencias de nucleótidos.
Como animal diferente del ser humano, puede utilizarse cualquier animal, tal como el ratón, la rata, el hámster, el conejo o similar, con la condición de que pueda prepararse una célula de hibridoma a partir del mismo.
Entre los ejemplos de método para preparar ARN total a partir de una célula de hibridoma se incluyen el método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymology 154:3, 1987] y similares, y como ejemplo del método de preparación de ARNm a partir del ARN total, el método de columna de celulosa con oligo(dT) inmovilizado (Molecular Cloning, segunda edición), y similares. Además, entre los ejemplos de un kit para preparar ARN a partir de una célula de hibridoma se incluyen el kit de aislamiento de ARN Fast Track (fabricado por Invitrogen), el kit de purificación de ARN Quick Prep (fabricado por Pharmacia) y similares.
Entre los ejemplos del método para sintetizar ADNc y la preparación de una biblioteca de ADNc se incluyen los métodos habituales (Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1­ 34) y métodos utilizando un kit disponible comercialmente, tal como SuperScript™, el sistema de plásmidos para la síntesis de ADNc y la clonación de plásmidos (fabricado por Gibco Brl)) o el kit de síntesis de ADNc-ZAP (fabricado por Stratagene) y similares.
Durante la preparación de la biblioteca de ADNc, el vector en el que se inserta un ADN sintetizado utilizando el ARNm extraído de una célula de hibridoma como molde puede ser cualquier vector con la condición de que pueda insertarse el ADNc. Entre los ejemplos se incluyen ZAP Express [Strategies 5:58, 1992], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research 17:9494, 1989], AzaμlI (fabricado por Stratagene), Agt10 y Agt11 [d Na Cloning, A Practical Approach I:49, 1985], Lambda BlueMid (fabricado por Clontech), AExCell, pT7T3 18U (fabricado por Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol. 3:280, 1983], pUC18 [Gene 33:103, 1985] y similares.
Como Escherichia coli en la que se introduce la biblioteca de ADNc construida a partir de un vector fago o plásmido, puede utilizarse cualquier Escherichia coli, con la condición de que pueda introducirse, expresarse y mantenerse la biblioteca de ADNc. Entre los ejemplos se incluyen XL1-Blue MRF' [Strategies 5:81, 1992], C600 [Genetics 39, 440, 1954], Y1088 y Y1090 [Science 222:778, 1983], NM522 [J. Mol. Biol. 166, 1, 1983], K802 [J. Mol. Biol. 16, 118, 1966], JM105 [Gene, 38, 275, 1985] y similares.
Como método para seleccionar un clon de ADN codificante de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano a partir de la biblioteca de ADNc, puede utilizarse una hibridación de colonias o una hibridación de placas utilizando una sonda marcada con isótopos o con fluorescencia (Molecular Cloning, segunda edición). El ADNc codificante de las regiones V de las cadenas H y L también puede prepararse mediante la preparación de cebadores y llevando a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (en adelante denominada "PCR"; Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology, suplemento 1­ 34) utilizando un ADNc sintetizado a partir de ARNm o de una biblioteca de ADN a modo de molde.
La secuencia de nucleótidos de los ADNc puede determinarse mediante la digestión de los ADNc seleccionados con enzimas de restricción apropiados, clonando los fragmentos en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similares, llevando a cabo la reacción de un método generalmente utilizado de análisis de la secuencia de nucleótidos, tal como el método de dideoxi [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:5463, 1977] de Sanger et al. o similar, y analizando seguidamente los clones utilizando un analizador automático de secuencias de nucleótidos, tal como el secuenciador de ADN A.L.F. (fabricado por Pharmacia) o similares. Puede confirmarse si los ADNc obtenidos codifican las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo que contiene una secuencia de señal secretoria mediante la deducción de las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L a partir de la secuencia de nucleótidos determinada y comparándolas con las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991].
(3) Análisis de una secuencia de aminoácidos de la región V de anticuerpos obtenidos de animales diferentes del ser humano
Con respecto a las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo que contiene una secuencia de señal secretoria, puede deducirse la longitud de la secuencia de señal secretoria y las secuencias de aminoácidos N-terminales y también pueden encontrarse subgrupos a los que pertenecen, mediante la comparación de los mismos con las secuencias de aminoácidos completas de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991]. Además, las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L de cada RDC también pueden encontrarse mediante la comparación de las mismas con las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991].
(4) Construcción de vector de expresión de anticuerpo híbrido humano
Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano mediante la clonación de ADNc codificantes de las regiones V de cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano cadena arriba de genes codificantes de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construidos en el ítem 3(1). Por ejemplo, puede construirse un vector de expresión de anticuerpo híbrido humano mediante la unión de cada uno de los ADNc codificantes de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano a un ADN sintético que comprende secuencias de nucleótidos en los extremos 3'-terminales de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano y secuencias de nucleótidos en los extremos 5'-terminales de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano y que también presentan una secuencia de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en ambos extremos, y mediante la clonación de los mismos cadena arriba de los genes codificantes de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano contenido en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construidos que se describen en el ítem 3(1).
(5) Construcción de ADNc codificante de la región V de anticuerpo injertado con RDC humano
Los ADNc codificantes de las regiones V de las cadenas h y L de un anticuerpo injertado con RDC humano puede obtenerse de la manera siguiente. En primer lugar, se seleccionan las secuencias de aminoácidos de los marcos (en adelante denominados "RM") de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo humano para la injertación de las RDC de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo obtenido de un animal diferente del ser humano. Como secuencias de aminoácidos de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo humano, pueden utilizarse cualesquiera secuencias de aminoácidos con la condición de que se obtengan de un anticuerpo humano. Entre los ejemplos se incluyen secuencias de aminoácidos de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de anticuerpos humanos registrados en bases de datos tales como la Protein Data Bank, etc., secuencias de aminoácidos comunes en cada subgrupo de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de los anticuerpos conocidos [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services, 1991] y similares. Sin embargo, con el fin de producir un anticuerpo con injertación de RDC humano que presenta una actividad potente, resulta preferible seleccionar una secuencia de aminoácidos que presente una homología tan elevada como resulte posible (de por lo menos 60% o superior) con secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo de interés obtenido de un animal diferente del ser humano.
A continuación, las secuencias de aminoácidos de las RDC de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo de interés obtenidas de un animal diferente de un ser humano se injertan en las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las RM de las regiones V de las cadenas H y L de un anticuerpo humano para diseñar secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo injertado con RDC humana. Las secuencias de aminoácidos diseñadas se convierten en secuencias de ADN mediante la consideración de la frecuencia de uso de los codones en las secuencias de nucleótidos de los genes de anticuerpo [Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dep. Health and Human Services (1991)] y se diseñan las secuencias de ADN codificantes de las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo injertado con RDC humana. Basándose en las secuencias de ADN diseñadas, se sintetizan varios fragmentos de ADN sintéticos con una longitud de aproximadamente 100 bases y se lleva a cabo la PCR utilizándolos. En este caso, resulta preferible en cada una de las cadenas H y L que se diseñen 6 ADN sintéticos en vista de la eficiencia de reacción de la PCR y las longitudes de los ADN que pueden sintetizarse.
Además, pueden clonarse fácilmente en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construido en el ítem 3(1), mediante la introducción de secuencias de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en los extremos 5'-terminales del ADN sintético presente en ambos extremos. Después de la PCR, el producto amplificado se clona en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene) o similar y se determinan las secuencias de nucleótidos mediante el método en el ítem 3(2), obteniendo de esta manera un plásmido que presenta secuencias de ADN codificantes de las secuencias de aminoácidos de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo injertado con RDC humana deseado.
(6) Construcción de vector de expresión de anticuerpo injertado con RDC humana
Puede construirse un vector de expresión de anticuerpo injertado con RDC humana mediante la clonación de ADNc codificantes de las regiones V de cadenas H y L de un anticuerpo injertado con RDC humana construido en el ítem 3(5), cadena arriba del gen codificante de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados construido en el ítem 3(1). Por ejemplo, el vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC humana puede construirse mediante la introducción de secuencias de reconocimiento de un enzima de restricción apropiado en los extremos 5'-terminales de ambos extremos de un fragmento sintético de ADN, de entre los fragmentos sintéticos de ADN que se utilizan al llevar a cabo una PCR en el ítem 3(5) para la construcción de las regiones V de las cadenas H y L del anticuerpo con injertación de RDC humana, de manera que se clonan cadena arriba de los genes codificantes de las regiones C de las cadenas H y L de un anticuerpo humano en el vector para la expresión de anticuerpos humanizados indicado en el ítem 3(1) de manera que puedan expresarse en una forma adecuada.
(7) Producción estable de anticuerpos humanizados
Puede obtenerse un transformante capaz de producir establemente un anticuerpo híbrido humano y un anticuerpo injertado con RDC humano (ambos denominados en adelante en la presente memoria "anticuerpo humanizado") mediante la introducción de los vectores de expresión de anticuerpo humanizado indicados en los ítems 3(4) y (6) en una célula animal apropiada.
Entre los ejemplos del método para introducir un vector de expresión de anticuerpos humanizados en una célula animal se incluyen la electroporación [solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 257891/90; Cytotechnology 3:133, 1990] y similares.
Como célula animal en la que se introduce un vector de expresión de anticuerpo humanizado, puede utilizarse cualquier célula con la condición de que sea una célula animal que pueda producir el anticuerpo humanizado.
Entre los ejemplos se incluyen células de mieloma de ratón, tales como las células NS' y las células SP2/0, células de ovario de hámster chino, tales como las células CHO/dhfr- y las células CHO/DG44, mieloma de rata tal como las células YB2/0 y las células IR983F, células BHK obtenidas de riñón de hámster chino, células de mieloma humano tales como las células Namalwa y similares, y resultan preferentes las células CHO/DG44 de ovario de hámster chino, las células YB2/0 de mieloma de rata y las células hospedadoras de la presente invención indicadas en el ítem 5.
Tras la introducción del vector de expresión de anticuerpos humanizados, puede seleccionarse un transformante capaz de producir establemente el anticuerpo humanizado utilizando un medio de cultivo de células animales que comprende un agente tal como el sulfato de G418 (en adelante denominado "G418", fabricado por Sigma) y similares de acuerdo con el método dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 257891/90. Entre los ejemplos de medio para el cultivo de células animales se incluye el medio RPMI 1640 (fabricado por Nissui Pharmaceutical), el medio GIT (fabricado por Nihon Pharmaceutical), el medio Ex-C6ll 302 (fabricado por JRH), el medio IMDM (fabricado por Gibco BRL), el medio hibridoma-SFM (fabricado por Gibco BRL), medios obtenidos mediante la adición de diversos aditivos, tales como el suero de feto bovino (en adelante denominado "FBS") a dichos medios, y similares. El anticuerpo humanizado puede producirse y acumularse en el sobrenadante de cultivo mediante el cultivo del transformante obtenido en un medio. El nivel de expresión y la actividad de unión a antígeno del anticuerpo humanizado en el sobrenadante de cultivo pueden medirse mediante un método tal como el ensayo de inmunosorción ligada a enzima [en adelante denominado "ELISA"; Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1998, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996] o similares. Además, puede incrementarse el nivel de expresión de anticuerpo humanizado del transformante utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR de acuerdo con el método dado a conocer en la solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 257891/90.
El anticuerpo humanizado puede purificarse a partir de un sobrenadante de cultivo del transformante utilizando una columna de proteína A [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 8, 1988, Monoclonal Antibodies, Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996]. Además, también pueden utilizarse métodos de purificación utilizados generalmente para la purificación de proteínas. Por ejemplo, la purificación puede llevarse a cabo mediante la combinación de una filtración en gel, una cromatografía de intercambio iónico y una ultrafiltración. El peso molecular de la cadena H, la cadena L o la molécula de anticuerpo completa del anticuerpo humanizado purificado pueden medirse mediante, por ejemplo, electroforesis en gel de poliacrilamida [en adelante denominada "SDS-Pa GE"; Nature 227:680, 1970], Western blotting [Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, capítulo 12, 1988; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996] o similares.
De esta manera, se han descrito métodos para producir una composición de anticuerpo utilizando una célula animal como huésped, aunque, tal como se ha indicado anteriormente, la composición de anticuerpo también puede ser producida por una levadura, una célula de insecto, una célula vegetal, un animal individual o una planta individual mediante los mismos métodos que en la célula animal.
En el caso de que una célula hospedadora presente la capacidad de expresar una molécula de anticuerpo de manera innata, puede producirse la composición de anticuerpo de la presente exposición mediante la preparación de una célula que expresa la molécula de anticuerpo utilizando el método indicado en el ítem 1, cultivando la célula y después purificando la composición de anticuerpo de interés a partir del cultivo resultante.
4. Evaluación de actividad de la composición de anticuerpo
Como método para medir la cantidad de composición purificada de anticuerpo, la actividad de unión a un anticuerpo y la función efectora de la composición purificada de anticuerpo, puede utilizarse el método conocido que se describe en Monoclonal Antibodies, Antibody Engineering, y similares.
A título de ejemplos, en el caso de que la composición de anticuerpo sea de un anticuerpo humanizado, la actividad de unión a un antígeno y la actividad de unión a una estirpe celular en cultivo positiva para antígeno pueden medirse mediante métodos tales como ELISA, un método de inmunofluorescencia [Cancer Immunol. Immunother.
36:373, 1993] y similares. La actividad citotóxica contra una estirpe celular en cultivo positiva para antígeno puede evaluarse mediante la medición de la actividad de CDC, la actividad de ADCC [Cancer Immunol. Immunother.
36:373, 1993] y similares.
Además, puede evaluarse la seguridad y el efecto terapéutico de la composición de anticuerpo en el ser humano utilizando un modelo apropiado de especie animal relativamente próxima al ser humano, tal como Macaca fascicularis o similar.
5. Análisis de las cadenas de azúcar de unión a moléculas de anticuerpo expresadas en diversas células
La estructura de cadena de azúcar de unión a una molécula de anticuerpo expresada en diversas células puede analizarse de acuerdo con el análisis general de la estructura de cadena de azúcar de una glucoproteína. Por ejemplo, la cadena de azúcar que se une a una molécula de IgG comprende un azúcar neutro, tal como galactosa, manosa, fucosa o similar, un aminoazúcar tal como N-acetilglucosamina o similar, y un azúcar ácido, tal como ácido siálico o similar, y puede analizarse mediante un método tal como un análisis de la estructura de las cadenas de azúcar o similar utilizando el análisis de la composición de azúcares, el mapeado bidimensional de las cadenas de azúcar o similares.
(1) Análisis de las composiciones de azúcares neutros y aminoazúcares
La composición de cadenas de azúcar de unión a una molécula de anticuerpo puede analizarse llevando a cabo la hidrólisis ácida de las cadenas de azúcar con un ácido, tal como el ácido trifluoroacético o similar, para liberar un azúcar neutro o un aminoazúcar y medir las proporciones composicionales.
Entre los ejemplos se incluye un método de utilización de un analizador de la composición de azúcares (BioLC) fabricado por Dionex. El BioLC es un aparato que analizar la composición de azúcares mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento-detección amperométrica pulsada) [J. Liq. Chromatogr.
6:1577, 1983].
Las proporciones composicionales también pueden analizarse mediante un método de marcaje de fluorescencia utilizando 2-aminopiridina. Específicamente, las proporciones composicionales pueden calcularse de acuerdo con un método conocido [Agric. Biol. Chem. 55(1):283-284, 1991] mediante marcaje de una muestra hidrolizada con ácido con fluorescencia de 2-aminopiridilación y analizando después la composición mediante HPLC.
(2) Análisis de la estructura de las cadenas de azúcar
La estructura de las cadenas de azúcar de unión a una molécula de anticuerpo puede analizarse mediante el método de mapeado bidimensional de las cadenas de azúcar [Anal. Biochem. 171:73, 1988; Biochemical Experimentation Methods 23 - Methods for Studying Glycoprotein Sugar Chains (Japan Scientific Societies Press) editado por Reiko Takahashi, 1989]. El método de mapeado bidimensional de cadenas de azúcar es un método para deducir la estructura de las cadenas de azúcar por ejemplo representando gráficamente el tiempo de retención o la posición de elución de una cadena de azúcar mediante cromatografía de fase inversa en el eje X y el tiempo de retención o posición de elución de la cadena de azúcar mediante cromatografía de fase normal en el eje Y, respectivamente, y comparándolas con dichos resultados de las cadenas de azúcar conocidas.
Específicamente, las cadenas de azúcar se liberan del anticuerpo sometiendo al mismo a hidrazinolisis y la cadena de azúcar liberada se somete a marcaje de fluorescencia con 2-aminopiridina (en adelante denominado "PA") [J. Biochem. 95:197, 1984] y después las cadenas de azúcar se separan de un exceso de reactivo de tratamiento de PA mediante filtración en gel y se someten a cromatografía de fase inversa. A continuación, cada pico de las cadenas de azúcar separadas se somete a cromatografía de fase normal. La estructura de cadena de azúcar puede deducirse representando gráficamente los resultados en un mapa bidimensional de las cadenas de azúcar y comparándolos con los puntos de un estándar de cadena de azúcar (fabricado por Takara Shuzo) o la literatura [Anal. Biochem. 171:73, 1988].
La estructura deducida mediante el método de mapeado bidimensional de las cadenas de azúcar puede confirmarse llevando a cabo adicionalmente una espectrometría de masas, tal como EM-MALDI-TOF de cada cadena de azúcar o similares.
6. Método de determinación inmunológica para discriminar la estructura de cadena de azúcar de la molécula de anticuerpo
Una composición de anticuerpo comprende una molécula de anticuerpo en la que las cadenas de azúcar de unión a la región Fc del anticuerpo presentan estructuras diferentes. La composición de anticuerpo en la que la proporción de cadena de azúcar en la que la fucosa no se encuentra unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor de la cadena de azúcar es 20% o más del total de cadenas de azúcar complejas unidas mediante N-glucósido que se unen a la región Fc de la composición de anticuerpo presenta una actividad de ADCC potente en el extremo reductor. La composición de anticuerpo puede identificarse mediante la utilización del método de análisis de la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo descrita en el ítem 6. Además, también puede identificarse mediante un método de determinación inmunológica utilizando una lectina.
La estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo puede identificarse mediante el método de determinación inmunológica utilizando una lectina de acuerdo con un método de determinación inmunológica conocido, tal como tinción western, RIA (radioinmunoensayo), VIA (viroinmunoensayo), EIA (enzimo inmunoensayo), FIA (fluoro-inmunoensayo), MIA (metalo-inmunoensayo) y similares, descritos en Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc. (1995); Immunoassay, 3a ed., Igakushoin (1987); Enzyme Antibody Method, edición revisada, Gakusai Kikaku (1985), y similares.
Una lectina que reconoce la estructura de cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo comprendida en una composición de anticuerpo se marca y la lectina marcada se deja reaccionar con una composición de anticuerpo, que es la muestra. A continuación, se mide la cantidad de complejo de lectina marcada que se forma con la molécula de anticuerpo.
Entre los ejemplos de la lectina utilizada para identificar la estructura de la cadena de azúcar de una molécula de anticuerpo se incluye WGA (aglutinina de germen de trigo obtenido de T. vulgaris), ConA (cocanavalina A obtenida de C. ensiformis), RIC (una toxina obtenida de R. communis), L-PHA (leucoaglutinina obtenida de P. vulgaris), LCA (aglutinina de lenteja obtenida de L. culinaris), PSA (lectina de guisante obtenida de P. sativum), AAL (lectina de Aleuria aurantia), ACL (lectina de Amaranthus caudatus), BPL (lectina de Bauhinia purpurea), DSL (lectina de Datura stramonium), DBA (aglutinina de Dolichos biflorus), EBL (lectina de corteza de saúco), ECL (lectina de Erythrina cristagalli), EEL (lectina de Euonymus eoropaeus), GNL (lectina de Galanthus nivalis), GSL (lectina de Griffonia simplicifolia), HPA (aglutinina de Helix pomatia), HHL (lectina de híbrido de Hippeastrum), Jacalina, LTL (lectina de Lotus tetragonolobus), LEL (lectina de Lycopersicon esculentum), MAL (lectina de Maackia amurensis), MPL (lectina de Maclura pomifera), NPL (lectina de Narcissus pseudonarcissus), PNA (aglutinina de cacahuete), E-PHA (eritroaglutinina de Phaseolus vulgaris), PTL (lectina de Psophocarpus tetragonolobus), RCA (aglutinina de Ricinus communis), STL (lectina de Solanum tuberosum), SJA (aglutinina de Sophora japonica), SBA (aglutinina de soja), UEA (aglutinina de Ulex europaeus), VVL (lectina de Vicia villosa) y WFA (aglutinina de Wisteria floribunda).Resulta preferente utilizar una lectina que reconozca específicamente una estructura de cadena de azúcar en la que la fucosa se une a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar compleja unida mediante N-glucósido. Entre los ejemplos se incluyen lectina de Lens culinaris LCA (aglutinina de lenteja obtenida de Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de guisante obtenida de Pisum sativum), lectina de haba VFA (aglutinina obtenida de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina obtenida de Aleuria aurantia).
7. Aplicación de una molécula de anticuerpo de la presente divulgación
La composición de anticuerpo de la presente divulgación presenta una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos. Un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos resulta útil para prevenir y tratar diversas enfermedades, incluyendo cánceres, enfermedades inflamatorias, enfermedades inmunológicas tales como enfermedades autoinmunológicas, alergias y similares, enfermedades de órganos circulatorios e infecciones víricas o bacterianas.
En el caso de los cánceres, concretamente los tumores malignos, las células de cáncer crecen. Los agentes antitumorales generales inhiben el crecimiento de las células de cáncer. En contraste, un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos puede tratar cánceres al dañar las células de cáncer mediante su efecto de eliminación celular y, por lo tanto, resulta más eficaz como agente terapéutico que los agentes antitumorales generales. Actualmente, en el agente terapéutico para cánceres, un efecto antitumoral de un medicamento de anticuerpo por sí solo resulta insuficiente, de manera que se ha llevado a cabo una terapia de combinación con quimioterapia [Science 280:1197, 1998]. En el caso de que se encontrase un efecto antitumoral más potente con la composición de anticuerpo de la presente divulgación por sí sola, se reduciría la dependencia de la quimioterapia y se reducirían los efectos secundarios.
En enfermedades inmunológicas tales como las enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunológicas, alergias y similares, se inducen reacciones in vivo de las enfermedades debido a la liberación de una molécula mediadora por los inmunocitos, de manera que puede inhibirse la reacción alérgica mediante la eliminación de los inmunocitos utilizando un anticuerpo que presente una potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.
Entre los ejemplos de enfermedades de órganos circulatorios se incluyen la arterioesclerosis y similares. Actualmente, la arterioesclerosis se trata utilizando catéteres con balón, aunque las enfermedades de órganos circulatorios pueden prevenirse y tratarse mediante la inhibición del crecimiento de las células arteriales en restricción tras el tratamiento con un anticuerpo con potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.
Pueden prevenirse y tratarse diversas enfermedades, incluyendo infecciones víricas y bacterianas, mediante la inhibición de la proliferación de las células infectadas por un virus o bacteria utilizando un anticuerpo con potente actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos.
Posteriormente se describen ejemplos de un anticuerpo que reconozca un antígeno de tipo tumoral, un anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación, un anticuerpo que reconozca antígenos relacionados con enfermedades de los órganos circulatorios y un anticuerpo que reconozca antígenos relacionados con infecciones víricas o bacterianas.
Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno de tipo tumoral se incluyen el anticuerpo anti-GD2 (Ohta et al., Anticancer Res. 13:331-336, 1993), el anticuerpo anti-GD3 (Ohta et al., Cancer Immunol. Immunother.
36:260-266, 1993), el anticuerpo anti-GM2 (Nakamura et al., Cancer Res. 54:1511-1516, 1994), el anticuerpo anti-HER2 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992), el anticuerpo anti-CD52 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992), el anticuerpo anti-MAGE (Jungbluth et al., British J. Cancer 83:493-497, 2000), el anticuerpo anti-HM1.24 (Ono et al., Molecular Immunol. 36:387-395, 1999), el anticuerpo antiproteína relacionada con la hormona paratiroidea (PTHrP) antibody (Ogata et al., Cancer 88:2909-2911,2000), el anticuerpo anti-factor básico de crecimiento fibroblástico y el anticuerpo anti-FGF8 (Matsuzaki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9911-9915, 1989), el anticuerpo anti-receptor del factor básico de crecimiento fibroblástico y el anticuerpo anti-receptor de FGF8 (Kuo et al., J. Biol. Chem. 265:16455-16463, 1990), el anticuerpo anti-factor de crecimiento similar a la insulina (Yao et al., J. Neurosci. Res. 40:647-659, 1995), el anticuerpo anti-PMSA (Murphy et al., J. Urology, 160, 2396-2401, 1998), el anticuerpo anti-factor de crecimiento endotelial vascular (Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599, 1997), el anticuerpo anti-receptor del factor de crecimiento endotelial vascular (Kanno et al., Oncogene 19:2138-2146, 2000) y similares.
Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con alergia o inflamación se incluyen el anticuerpo anti-interleuquina 6 (Abrams et al., Immunol. Rev. 127:5-24, 1992), el anticuerpo anti-receptor de interleuquina 6 (Sato et al., Molecular Immunol. 31:371-381, 1994), el anticuerpo anti-interleuquina 5 (Abrams et al., Immunol. Rev. 127:5-24, 1992), el anticuerpo anti-receptor de interleuquina 5 y el anticuerpo anti-interleuquina 4 (Biord et al., Cytokine 3:562-567, 1991), el anticuerpo anti-factor de necrosis tumoral (Tempest et al., Hybridoma 13:183-190, 1994), el anticuerpo anti-receptor del factor de necrosis tumoral (Amrani et al., Molecular Pharmacol.
58:237-245, 2000), el anticuerpo anti-CCR4 (Campbell et al., Nature 400:776-780, 1999), el anticuerpo antiquimioquina (Peri et al., J. Immuno. Meth. 174:249-257, 1994), el anticuerpo anti-receptor de quimioquina (Wu et al., J. Exp. Med. 186:1373-1381, 1997) y similares. Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con una enfermedad de órgano circulatorio se incluye el anticuerpo anti-GpIIb/IIIa (Co et al., J. Immunol. 152:2968-2976, 1994), el anticuerpo anti-factor de crecimiento derivado de plaquetas (Ferns et al., Science 253:1129-1132, 1991), el anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (Shulman et al., J. Biol. Chem. 272:17400-17404, 1997) y el anticuerpo anti-factor de coagulación sanguínea (Peter et al., Circulation 101:1158-1164, 2000) y similares.
Entre los ejemplos del anticuerpo que reconoce un antígeno relacionado con infección vírica o bacteriana se incluye el anticuerpo anti-gp120 (Tugarinov et al., Structure 8:385-395, 2000), el anticuerpo anti-CD4 (Schulze-Koops et al., J. Rheumatology 25:2065-2076, 1998), el anticuerpo anti-CCR4 y el anticuerpo anti-toxina Vero (Karnali et al., J. Clin. Microbiol. 37:396-399, 1999) y similares.
Dichos anticuerpos pueden obtenerse de organizaciones públicas tales como la ATCC (The American Type Culture Collection), el RIKEn Gene Bank at The Institute of Physical and Chemical Research, National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (nombre actual: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) y similares, o compañías privadas proveedoras de reactivos, tales como Dainippon Pharmaceutical, R & D SYSTEMS, PharMingen, Cosmo Bio, Funakoshi y similares.
El medicamento que comprende la composición de anticuerpo de la presente divulgación puede administrarse como agente terapéutico solo, aunque generalmente resulta preferente proporcionarlo como formulación farmacéutica producida mediante un método apropiado bien conocido en el campo técnico de la fabricación farmacéutica, mediante la mezcla del mismo con por lo menos un portador farmacéuticamente aceptable.
Resulta deseable seleccionar una vía de administración que resulte más eficaz en el tratamiento. Entre los ejemplos se incluyen la administración oral y la administración parenteral, tal como la administración bucal, traqueal, rectal, subcutánea, intramuscular, intravenosa o similar. En una preparación de anticuerpo, resulta preferente la administración intravenosa.
La forma de administración incluye sprays, cápsulas, tabletas, gránulos, jarabes, emulsiones, supositorios, inyecciones, pomadas, cintas y similares.
Entre los ejemplos de la preparación farmacéutica adecuados para la administración oral se incluyen emulsiones, sprays, cápsulas, tabletas, polvos, gránulos y similares.
Pueden producirse preparaciones líquidas, tales como emulsiones y jarabes, utilizando, a modo de aditivos, agua, sacáridos tales como sacarosa, sorbitol, fructosa, etc.; glicoles, tales como polietilenglicol, propilenglicol, etc.; aceites, tales como aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de soja, etc.; antisépticos, tales como ésteres de ácido p-hidroxibenzoico, etc.; saborizantes, tales como saborizante de fresa, hierbabuena, etc., y similares.
Pueden producirse cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos y similares utilizando, a modo de aditivo, rellenos, tales como lactosa, glucosa, sacarosa, manitol, etc.; agentes desintegrantes, tales como almidón, alginato sódico, etc.; lubricantes, tales como estearato de magnesio, talco, etc.; ligantes, tales como alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa, gelatina, etc.; surfactantes, tales como éster de ácido graso, etc.; plastificadores, tales como glicerina, etc., y similares.
Entre los ejemplos de la preparación farmacéutica adecuados para la administración parenteral se incluyen inyecciones, supositorios, sprays y similares.
Las inyecciones pueden prepararse utilizando un portador, tal como una solución salina, una solución de glucosa, una mezcla de ambas, o similares. Además, pueden prepararse inyecciones de polvos mediante liofilización de la composición de anticuerpo de la manera habitual y añadiendo cloruro sódico a la misma.
Pueden prepararse supositorios utilizando un portador, tal como manteca de cacao, grasa hidrogenada, ácido carboxílico o similares.
Además, pueden prepararse sprays utilizando la composición de anticuerpo por sí sola o utilizando un portador que no estimula la membrana mucosa bucal o de las vías respiratorias del paciente y puede facilitar la absorción de la composición de anticuerpo dispersándola en forma de partículas finas.
Entre los ejemplos del portador se incluyen lactosa, glicerol y similares. Dependiendo de las propiedades de la composición de anticuerpo y el portador, resulta posible producir preparaciones farmacéuticas, tales como aerosoles, polvos secos y similares. Además, los componentes ejemplificados como aditivos para preparaciones orales también pueden añadirse a las preparaciones parenterales.
Aunque la dosis clínica o la frecuencia de administración varía dependiendo del efecto terapéutico objetivo, del método de administración, del periodo de tratamiento, de la edad, del peso corporal y similares, habitualmente es de entre 10 μg/kg y 20 mg/kg al día por adulto.
Además, como método de examen del efecto antitumoral de la composición de anticuerpo contra diversas células tumorales, entre los ensayos in vitro se incluyen el método de medición de la actividad c Dc , el método de medición de la actividad ADCC y similares, y entre los ensayos in vivo se incluyen experimentos antitumorales utilizando un sistema antitumoral en un animal experimental, tal como un ratón, etc., y similares.
Las mediciones de la actividad CDC y de la actividad ADCC y los experimentos antitumorales pueden llevarse a cabo de acuerdo con los métodos descritos en Cancer Immunology Immunotherapy 36:373, 1993; Cancer Research 54:1511, 1994, y similares.
Se describe a continuación la presente divulgación con mayor detalle a partir de los ejemplos.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 muestra patrones de electroforesis de SDS-PAGE de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados (utilizando un gradiente de gel de 4% a 15%). Las figuras 1A y 1B muestran los resultados de la electroforesis bajo condiciones no reductoras y bajo condiciones reductoras, respectivamente. Los carriles 1 a 7 muestran los patrones de electroforesis de marcadores de peso molecular alto. Anticuerpo híbrido YB2/0-GD3, anticuerpo híbrido CHO/DG44-GD3, anticuerpo híbrido SP2/0-GD3, anticuerpo híbrido NS0-GD3 (302), anticuerpo híbrido NS0-GD3 (GIT) y marcadores de peso molecular bajo, respectivamente.
La figura 2 muestra las actividades de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados de unión a GD3, medidos mediante modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión a GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "o", "•", "□", "■" y "A" muestran las actividades del anticuerpo híbrido YB2/0-GD3, del anticuerpo híbrido CHO/DG44-GD3, del anticuerpo híbrido SP2/0-GD3, del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (302) y del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (GIT), respectivamente.
La figura 3 muestra las actividades de ADCC de cinco anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados para la estirpe celular de melanoma humano G-361. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "o", "•", "□", "■" y "A" muestran las actividades del anticuerpo híbrido YB2/0-GD3, del anticuerpo híbrido CHO/DG44-GD3, del anticuerpo híbrido SP2/0-GD3, del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (302) y del anticuerpo híbrido NS0-GD3 (GIT), respectivamente.
La figura 4 muestra los patrones de electroforesis de SDS-PAGE de tres anticuerpos anti-IL_h-5Ra con injertación de RDC (utilizando un gradiente de gel de 4% a 15%). Las figuras 4A y 4B muestran los resultados de la electroforesis llevada a cabo bajo condiciones no reductoras y bajo condiciones reductoras, respectivamente. Los carriles 1 a 5 muestran los patrones de electroforesis de los marcadores de peso molecular alto, anticuerpo de YB2/0-IL_h RDC, anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC, anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC y de los marcadores de peso molecular bajo, respectivamente.
La figura 5 muestra las actividades de tres anticuerpos anti-hIL-5Ra con injertación de RDC purificados de unión a IL-5Ra_h, medidos mediante modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión con IL-5Ra_h y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "o", "•" and "□" muestran las actividades del anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC, del anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC y del anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC, respectivamente.
La figura 6 muestra las actividades de ADCC de tres anticuerpos anti-IL-5Ra_h con injertación de RDC purificados para una línea de células T de ratón expresante de IL-5R_h llamada CTLL-2(h5R). La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "o", "•" and "□" muestran las actividades del anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC, del anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC y del anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC, respectivamente.
La figura 7 muestra las actividades de inhibición de tres anticuerpos anti-IL-5Ra_h con injertación de RDC purificados en un modelo de incremento de eosinófilos inducido por lL-5_h de Macaca fascicularis. La ordenada y las abscisas muestran el número de eosinófilos en sangre periférica y el número de días (el día de inicio de la administración de anticuerpo y de IL-5_h se definió como día 0). "101 y 102", "301, 302 y 303", "401, 402 yd 403" y "501, 502 y 503" muestran los resultados en el grupo de no administración de anticuerpo, en el grupo de administración de anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC, en el grupo de administración de CHO/d-IL-5R_h RDC y del grupo de administración de NS0-IL-5R_h RDC, respectivamente.
La figura 8 muestra los patrones de elución de la elución de HPLC de fase inversa de una cadena de azúcar tratada con PA (lado izquierdo) y de un patrón de elución obtenido mediante el tratamiento de la cadena de azúcar tratada con PA con a-L-fucosidasa y después analizados mediante HPLC de fase inversa (lado derecho) del anticuerpo anti-IL-5Ra con injertación de RDC purificado producido por YB2/0 (figura 8A) y del anticuerpo anti-IL-5Ra_h con injertación de RDC purificado producido por NS0 (figura 8B). La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
La figura 9 muestra un patrón de elución obtenido mediante la preparación de una cadena de azúcar tratada con PA a partir del anticuerpo anti-IL-5Ra_h con injertación de RDC purificado producido por las células CHO/d y el análisis del mismo mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
En la figura 10, la figura 10A muestra las actividades de unión a GD3 de una fracción no adsorbida y una parte de una fracción adsorbida, medidas mediante la modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión a GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "•" y "o" muestran la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida, respectivamente. La figura 10B muestra las actividades de ADCC de la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida para La línea de melanoma humano G-361. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "•" y "o" muestran la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida, respectivamente.
La figura 11 muestra los patrones de elución obtenidos mediante en análisis de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de una fracción no adsorbida y una parte de una fracción adsorbida mediante una HPLC de fase inversa. Las figuras 11A y 11B muestran un patrón de elución de la fracción no adsorbida y un patrón de elución de una parte de la fracción adsorbida, respectivamente. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
La figura 12 muestra los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de 6 anticuerpos híbridos anti-GD3 (figs. 12A a 12F) obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
La figura 13 muestra las actividades de unión a GD3 de 6 anticuerpos híbridos anti-GD3 que presentan una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa medidas mediante modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión a GD3 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "•", "□", "■", "A", "▲" y "x" muestran las actividades del anticuerpo híbrido anti-GD3 (50%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (45%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (29%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (24%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (13%) y del anticuerpo híbrido anti-GD3 (7%), respectivamente.
La figura 14 muestra actividades de ADCC de seis tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 que presentan una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa contra una estirpe celular de melanoma humano G-361, utilizando una célula efectora del donante A. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "•", "□", "■", "A", "▲" y "x" muestran las actividades del anticuerpo híbrido anti-GD3 (50%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (45%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (29%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (24%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (13%) y del anticuerpo híbrido anti-GD3 (7%), respectivamente.
La figura 15 muestra actividades de ADCC de seis tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 que presentan una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa contra una estirpe celular de melanoma humano G-361, utilizando una célula efectora del donante B. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "•", "□", "■", "A", "▲" y "x" muestran las actividades del anticuerpo híbrido anti-GD3 (50%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (45%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (29%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (24%), del anticuerpo híbrido anti-GD3 (13%) y del anticuerpo híbrido anti-GD3 (7%), respectivamente.
La figura 16 muestra los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de seis tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3, obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
La figura 17 muestra las actividades de unión a CCR4 de seis tipos de anticuerpo híbrido anti-CCR4 que presentan una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa medidas mediante modificación de la concentración de anticuerpo. La ordenada y las abscisas muestran la actividad de unión a CCR4 y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "■", "□", "▲", "A", "•" y "o" muestran las actividades del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (46%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (39%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (27%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (18%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (9%) y del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%), respectivamente.
La figura 18 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 que presentan una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa contra células CCR4/EL-4, utilizando una célula efectora del donante A. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "■", "□", "▲", "A", "•" y "o" muestran las actividades del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (46%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (39%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (27%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (18%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (9%) y del anticuerpo híbrido anti-CcR4 (8%), respectivamente. Además, las figuras 18A y 18B muestran los resultados obtenidos utilizando células efectoras del donante A y del donante B, respectivamente.
La figura 19 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 que presentan una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa contra células CCR4/EL-4, utilizando una célula efectora del donante B. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "■", "□", "▲", "A", "•" y "o" muestran las actividades del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (46%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (39%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (27%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (18%), del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (9%) y del anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%), respectivamente.
La figura 20 muestra la construcción de los plásmidos CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1.
La figura 21 muestra la construcción de los plásmidos CHAc-pBS e YBAc-pBS.
La figura 22 muestra la construcción de los plásmidos CHFT8d-pCR2.1 e YBFT8d-pCR2.1.
La figura 23 muestra la construcción de los plásmidos CHAcd-pBS e YBAcd-pBS.
La figura 24 muestra los resultados de la determinación de un producto de transcripción FUT8 en cada línea de célula hospedadora mediante RT-PCR competitiva. Se muestran las cantidades del producto de transcripción FUT8 en cada línea de célula hospedadora utilizando la secuencia de FUT8 de rata como estándar y se muestra el control interno. "■" y "□" muestran los resultados al utilizar las estirpes celulares CHO e YB2/0, respectivamente, como célula hospedadora.
La figura 25 muestra la construcción de un plásmido mfFUT8-pCR2.1.
La figura 26 muestra la construcción de un plásmido pBSmfFUT8.
La figura 27 muestra la construcción de un plásmido pAGEmfFUT8.
La figura 28 muestra los resultados del análisis de los niveles de expresión del gen FUT8 por una estirpe celular de expresión en exceso del gen utilizando una RT-PCR competitiva. La ordenada muestra los valores relativos de cantidades de transcripción de FUT8 respecto a las cantidades de transcripción de p-actina.
La figura 29 muestra las actividades de ADCC de un anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado a partir de una estirpe celular que expresa en exceso gen FUT8 contra una estirpe celular de melanoma humano G-361. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente.
La figura 30 muestra los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de anticuerpos producidos por estirpes celulares en las que se ha introducido mfFUT8-6 y pAGE249, obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. Las figuras 30A y 30B muestran los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de un anticuerpo producido por la estirpe celular en la que se ha introducido mfFUT8-6 y cadenas de azúcar tratadas con Pa preparadas a partir de un anticuerpo producido por la estirpe celular en la que se ha introducido pAGE249, respectivamente. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
La figura 31 muestra un patrón de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas con herceptina, obtenido mediante el análisis del mismo mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
La figura 32 muestra la construcción del plásmido CHfFUT8-pCR2.1.
La figura 33 muestra la construcción del plásmido ploxPPuro.
La figura 34 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-1.
La figura 35 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-2.
La figura 36 muestra la construcción del plásmido pscFUT8gE2-3.
La figura 37 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-3.
La figura 38 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-4.
La figura 39 muestra la construcción del plásmido pKOFUT8gE2-5.
La figura 40 muestra la construcción de un plásmido pKOFUT8Puro.
La figura 41 muestra los resultados de análisis southern del genoma de las líneas de células CHO con disrupción del gen de a-1,6-fucosiltransferasa 1st.AFUT82-46-1 y 1st.AFUT82-46.
La figura 42 muestra las actividades de ADCC de un anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado a partir de una estirpe celular con disrupción génica de alelo de FUT8. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo. "A " y "■" muestran las actividades de un anticuerpo purificado derivado de una célula CHO 5-03 productora de anticuerpos híbridos anti-CCR4 y un anticuerpo purificado derivado de 1st.AFUT82-46-1, respectivamente.
La figura 43 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 humanos producidos por estirpes celulares resistentes a lectina. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo. "□", "■", " ♦ " y "▲" muestran las actividades de los anticuerpos producidos por la cepa 5-03, CHO/CCR4-LCA, CHO/CCR4-AAL y CHO/CCR4-PHA, respectivamente.
La figura 44 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 humanos producidos por estirpes celulares resistentes a lectina. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente. "□", "A" y "•" muestran las actividades de los anticuerpos producidos por YB2/0 (KM2760 # 58-35-16), 5-03 y CHO/CCR4-LCA, respectivamente.
La figura 45 muestra los patrones de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de anticuerpos híbridos anti-CCR4 purificados, obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente. Las figuras 45A, 45B, 45C y 45D muestran los resultados de los análisis de un anticuerpo producido por la cepa 5-03, un anticuerpo producido por CHO/CCR4-LC1, un anticuerpo producido por CHO/CCR4-AAL y un anticuerpo producido por CHO/CCR4-PHA, respectivamente.
La figura 46 muestra la primera etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).
La figura 47 muestra la segunda etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).
La figura 48 muestra la tercera etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).
La figura 49 muestra la cuarta etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).
La figura 50 muestra la quinta etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).
La figura 51 muestra la sexta etapa de construcción de un vector de expresión de GMD derivada de células CHO (6 etapas en total).
La figura 52 muestra la resistencia de CHO/CCR4-LCA que expresa GMD para la lectina LCA. La medición se llevó a cabo dos veces definiendo la tasa de supervivencia de un grupo de células cultivadas sin adición de lectina LCA como 100%. En el dibujo, "249" muestra la tasa de supervivencia de CHO/CCR4-LCA en el que se ha introducido el vector de expresión pAGE249 para la lectina LCA. GMD muestra la resistencia de CHO7CCR4-LCA en la que se ha introducido un vector de expresión de GMD pAGE249GMD para la lectina LCA.
La figura 53 muestra actividades de ADCC de anticuerpos híbridos anti-CCR4 humanos producidos por células de las estirpes celulares CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD. La ordenada y las abscisas muestran la actividad citotóxica y la concentración de anticuerpo, respectivamente.
La figura 54 muestra una etapa de producción de un plásmido CHO-GMD en el que el extremo 5-terminal de un clon 34-2 se introduce en el extremo 5'-terminal de un ADNc clon 22-8 de GMD derivado de célula CHO. La figura 55 muestra un patrón de elución de cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de un anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado a partir de CHO/CCR4-LCA expresante de gen de GMD, obtenidos mediante el análisis de los mismos mediante HPLC de fase inversa. La ordenada y las abscisas muestran la intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución, respectivamente.
Ejemplo 1
Producción de anticuerpo híbrido humano anti-gangliósido GD3:
1. Construcción de vector de expresión en tándem pChiLHGM4 para el anticuerpo híbrido humano anti-gangliósido GD3
Se construyó un plásmido pChi641LGM40 mediante la ligación de un fragmento de aproximadamente 4,03 kb que contiene un ADNc de cadena L, obtenido mediante la digestión de un vector de expresión de cadena L, pChi641LGM4 [J. Immunol. Methods 167:271, 1994] para el anticuerpo híbrido humano anti-gangliósido GD3 (en adelante denominado "anticuerpo híbrido anti-GD3") con los enzimas de restricción MluI (fabricado por Takara Shuzo) y SalI (fabricado por Takara Shuzo) con un fragmento de aproximadamente 3,40 kb que contenía un gen de resistencia a G418 y una señal de procesamiento, obtenido mediante la digestión de un vector de expresión pAGE107 [Cytotechnology 3:133, 1990] para células animales con enzimas de restricción MluI (fabricado por Takara Shuzo) y SalI (fabricado por Takara Shuzo) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y transformando después E. coli HB101 (Molecular Cloning, segunda edición9 con el producto ligado.
A continuación, un fragmento de aproximadamente 5,68 kb que contiene un ADNc de cadena L, obtenido mediante la digestión del plásmido construido pChi641LGM40 con un enzima de restricción ClaI (fabricado por Takara Shuzo), creando extremos romos en el mismo utilizando el kit de creación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y digiriéndolo además con MluI (fabricado por Takara Shuzo), se ligó con un fragmento de aproximadamente 8,40 kb que contenía un ADNc de la cadena H, obtenido mediante digestión con un vector de expresión de la cadena H de anticuerpo híbrido anti-GD3, pChi641HGM4 [J. Immunol. Methods 167:271, 1994] con el enzima de restricción XhoI (fabricado por Takara Shuzo), creando extremos romos con el kit de creación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y digiriéndolo además con MluI (fabricado por Takara Shuzo) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y después E. coli HB101 (Molecular Cloning, segunda edición) se transformó con el producto ligado, construyendo de esta manera el vector de expresión en tándem pChi641LHGM4 para el anticuerpo híbrido anti-GD3.
2. Preparación de células que producen establemente anticuerpo híbrido anti-GD3
Las células que pueden producir establemente un anticuerpo híbrido anti-GD3 se prepararon utilizando el vector de expresión en tándem pChi641LHGM4 para el anticuerpo híbrido anti-GD3 construido en el ítem 1 del Ejemplo 1, tal como se indica a continuación.
(1) Preparación de célula productora de anticuerpos utilizando la célula YB2/0 de mieloma de rata
Tras introducir 5 μg del vector de expresión pChi641LHGM4 del anticuerpo híbrido anti-GD3 en 4x106 células de YB2/0 de mieloma de rata [ATCC n° CRL-1662; J.V. Kilmarin et al., J. Cell. Biol. 93:576-582, 1982] mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 40 ml de RPMI 1640-FBS(10) (medio RPMI1640 que comprendía FBS al 10% (fabricado por Gibco BRL)) y se dispensaron 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Sumitomo Bakelite). Tras cultivarlas a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2 , se añadió G418 hasta una concentración de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó de los pocillos el sobrenadante de cultivo, en el que se habían formado colonias de los transformantes que mostraban resistencia a G418 y se había observado el crecimiento de las colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-GD3 en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-GD3 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en el medio RPMI1640-FBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y el inhibidor de DHFR 50 nM, metotrexato (en adelante denominado "MTX", fabricado por Sigma), proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensaron 2 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM se indujeron mediante cultivo a 37°C durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-GD3 en sobrenadantes de cultivo en pocillos en la que se observó crecimiento de los transformantes mediante el ELISA mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1. Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-GD3 en sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM y después a 200 nM, y los transformantes capaces de crecer en el medio RPMI1640-FBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM y de producir el anticuerpo híbrido anti-GD3 en una gran cantidad se obtuvieron finalmente mediante el mismo método que se ha indicado anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares adecuadas y se aislaron en células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.
El clon 7-9-51 de células transformadas productoras de anticuerpo híbrido anti-GD3 obtenido se depositó el 5 de abril de 1999 como FERM n° BP-6691 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón) (nombre actual: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón)).
(2) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células CHO/DG44
Tras introducir 4 jg del vector de expresión de anticuerpo híbrido anti-GD3, pChi641LHGM4, en 1,6x106 células de CHO/DG44 [G. Urlaub y L.A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980], mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 10 ml de IMDM-f Bs (10) [medio IMDM que comprendía FBS al 10% y 1x concentración de complemento HT (fabricado por Gibco BRL)] y se dispensaron 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Iwaki Glass). Tras cultivarlas a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2 , se añadió G418 hasta una concentración de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó de los pocillos el sobrenadante de cultivo, en el que se habían formado colonias de los transformantes que mostraban resistencia a G418 y se había observado el crecimiento de las colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-GD3 en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-GD3 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en medio IMDM-dFBS(10) [medio IMDM que comprendía suero de feto bovino dializado al 10% (en adelante denominado "dFBS", fabricado por Gibco BRL)] que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 10 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensaron 0,5 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Iwaki Glass). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 10 nM se indujeron mediante cultivo a 37°C durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Con respecto a los transformantes en los pocillos en los que se había observado crecimiento, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM, y finalmente se obtuvieron transformantes capaces de crecer en el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 100 nM y de producir anticuerpo híbrido anti-GD3 en gran cantidad, mediante el mismo método que el indicado anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares adecuadas y se aislaron en células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.
(3) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células NS0 de mieloma de ratón
Tras introducir 5 μg del vector de expresión pChi641LHGM4 del anticuerpo híbrido anti-GD3 en 4x106 células NS0 de mieloma de ratón mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 40 ml de EX-CELL302-FBS(10) (medio EX-CELL302 que comprendía FBS al 10% y L-glutamina 2 mM [en adelante denominado "L-Gln", fabricado por Gibco BRL)] y se dispensaron 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Sumitomo Bakelite). Tras cultivarlas a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2 , se añadió G418 hasta una concentración de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó de los pocillos el sobrenadante de cultivo, en el que se habían formado colonias de los transformantes que mostraban resistencia a G418 y se había observado el crecimiento de las colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-GD3 en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-GD3 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en medio EX-CELL302-dFBS(10) (medio EX-CELL302 que comprendía dFBS al 10% y L-Gln 2 mM) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y Mt X 50 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensaron 2 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM se indujeron mediante cultivo a 37°C durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-GD3 en sobrenadantes de cultivo en pocillos en los que se había observado crecimiento de transformantes, mediante el ELISA mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1. Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-GD3 en sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM y después a 200 nM, y los transformantes capaces de crecer en el medio EX-CELL302-dFBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM y de producir el anticuerpo híbrido anti-GD3 en una gran cantidad se obtuvieron finalmente mediante el mismo método que se ha indicado anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares y se aislaron en forma de células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.
3. Medición de la actividad de unión del anticuerpo a GD3 (ELISA)
Se midió la actividad de unión a GD3 del anticuerpo tal como se indica a continuación.
En 2 ml de solución de etanol que contenía 10 μg de dipalmitoilfosfatidilcolina (fabricada por Sigma) y 5 μg de colesterol (fabricado por Sigma), se disolvieron 4 nmoles de GD3. En cada pocillo de una placa de 96 pocillos para ELISA (fabricada por Greiner), se dispensaron 20 μl de la solución (40 pmoles/pocillo de concentración final), seguido de secado al aire, se dispensó PBS que contenía albúmina de suero bovino al 1% (en adelante denominada "BSA", fabricada por Sigma) (en adelante denominado "PBS-BSA al 1%") a razón de 100 μl/pocillo y después se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora para el bloqueo de los grupos activos restantes. Tras descartar el PBS-BSA al 1%, se dispensó un sobrenadante de cultivo de un transformante o una solución diluida de un anticuerpo híbrido humano en 50 μl/pocillo para llevar a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, se lavó cada pocillo con PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (fabricado por Wako Pure Chemical Industries) (en adelante denominado "PBS-Tween"), una solución de anticuerpo de cabra anti-IgG humana marcado con peroxidasa (H y L) (fabricada por American Qualex) diluida 3.000 veces con PBS-BSA al 1% y se dispensó a razón de 50 μl/pocillo como solución de anticuerpo secundario y después se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con PBS-Tween, se dispensó solución de sustrato ABTS [solución preparada mediante disolución de 0,55 g de sal amónica de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) en 1 litro de tampón citrato 0,1 M (pH 4,2) y adición de 1 μl/m l de peróxido de hidrógeno a la solución inmediatamente antes del uso (en adelante se utiliza la misma solución)] en 50 μl/pocillo para el revelado de color y después se midió la absorbancia a 415 nm (en adelante denominada "DO415").
4. Purificación de anticuerpo híbrido anti-GD3
(1) Cultivo de célula productora de anticuerpos derivada de célula YB2/0 y purificación de anticuerpos
El clon de células transformadas productoras de anticuerpos híbridos anti-GD3 obtenido en el ítem 2(1) del Ejemplo 1 se suspendió en el medio de hibridoma-SFM que comprendía BSA al 0,2%, MTX 200 nM y triyodotironina 100 nM (en adelante denominado "T3", fabricado por Sigma), proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y se cultivó utilizando una botella centrifugadora de 2,0 litros de capacidad (fabricada por Iwaki Glass) bajo agitación a una velocidad de 50 rpm. Tras cultivarlas a 37°C durante 10 días en una sala de temperatura controlada, se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-GD3 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Bioprocessing) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado se denominó anticuerpo híbrido YB2/0-GD3.
(2) Cultivo de célula productora de anticuerpos derivada de célula CHO/DG44 y purificación de anticuerpos
El clon celular transformado productor de anticuerpo híbrido anti-GD3 obtenido en el ítem 2(2) del Ejemplo 1 se suspendió en el medio EX-CELL302 que comprendía L-Gln 3 mM, solución concentrada de ácidos grasos al 0,5% (en adelante denominada "CDLC", fabricada por Gibco BRL) y Pluronic F68 al 0,3% (en adelante denominada "PF68", fabricada por Gibco BRL), proporcionando una densidad de 1x106 células/ml y la suspensión se dispensó a razón de 50 ml en matraces de 175 mm2 (fabricados por Greiner). Tras cultivarlas a 37°C durante 4 días en un incubador con 5% de CO2 , se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-GD3 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Bioprocessing) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado se denominó anticuerpo híbrido CHO/DG44-GD3.
(3) Cultivo de células productoras de anticuerpos derivadas de células NS0 y purificación de anticuerpos
El clon de células transformadas productoras de anticuerpos híbridos anti-GD3 obtenido en el ítem 2(3) del Ejemplo 1 se suspendió en el medio EX-CELL302 que comprendía L-Gln 2 mM, G418 0,5 mg/ml, MTX 200 nM y FbS al 1%, proporcionando una densidad de 1x106 células/ml y la suspensión se dispensó a razón de 200 ml en matraces de 175 mm2 (fabricados por Greiner). Tras cultivarlas a 37°C durante 4 días en un incubador con 5% de CO2 , se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-GD3 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Bioprocessing) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado se denominó anticuerpo híbrido NS0-GD3 (302).
Además, el clon de células transformadas se suspendió en el medio GIT que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM, proporcionando una densidad de 3x105 células/ml, y la suspensión se dispensó a razón de 200 ml en matraces de 175 mm2 (fabricados por Greiner). Tras cultivarlas a 37°C durante 10 días en un incubador con 5% de CO2 , se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-GD3 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Bioprocessing) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado se denominó anticuerpo híbrido NS0-GD3 (GIT).
(4) Cultivo de células productoras de anticuerpos derivadas de células SP2/0 y purificación de los anticuerpos
El clon de células transformadas productoras de anticuerpos híbridos anti-GD3 (KM-871 (FERM n° BP-3512)) descrito en la solicitud publicada de patente japonesa no examinada n° 304989/93 (EP n° 533199) se suspendió en el medio GIT que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM, proporcionando una densidad de 3x105 células/ml, y la suspensión se dispensó a razón de 200 ml en matraces de 175 mm2 (fabricados por Greiner). Tras cultivarlas a 37°C durante 8 días en un incubador con 5% de CO2 , se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-GD3 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Bioprocessing) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado se denominó anticuerpo híbrido SP2/0-GD3.
5. Análisis del anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado
De acuerdo con un método conocido [Nature 227:680, 1970], 4 μg de cada uno de los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 producido y purificado a partir de las células animales respectivas, obtenidos en el ítem 4 del Ejemplo 1, se sometieron a SDS-PAGE para analizar el peso molecular y el grado de purificación. Se muestran los resultados en la figura 1. Tal como se muestra en la figura 1, se observó una única banda en aproximadamente 150 kilodaltons (en adelante denominados "kD") de peso molecular bajo condiciones no reductoras, y dos bandas de aproximadamente 50 kD y aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras, en cada uno de los anticuerpos híbridos anti-GD3 purificados. Los pesos moleculares prácticamente coincidieron con los pesos moleculares deducidos de las secuencias de nucleótidos de ADNc de las cadenas H y L del anticuerpo (cadena H: aproximadamente 49 Kd; cadena L: aproximadamente 23 Kd; molécula completa: aproximadamente 144 kD) y también coincidieron con los informes que indican que el anticuerpo IgG presentaba un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y resultaba degradado en cadenas H con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y cadenas L que presentaban un peso molecular de aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras debido al corte del enlace disulfuro (en adelante denominado "enlace S-S") en la molécula [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1998; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996], de manera que se confirmó que cada anticuerpo híbrido anti-GDE3 se había expresado y purificado en forma de molécula de anticuerpo con la estructura real.
Ejemplo 2
Evaluación de la actividad del anticuerpo híbrido anti-GD3:
1. Medición de la actividad de unión del anticuerpo híbrido anti-GD3 a GD3 (ELISA)
Se midió la actividad de los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado obtenidos en el ítem 4 del Ejemplo 1 de unión a GD3 (fabricados por Snow Brand Milk Products) mediante el ELISA mostrado en el ítem 3 del Ejemplo 1. La figura 2 muestra el resultado del examen de la actividad de unión medida mediante la modificación de la concentración del anticuerpo híbrido anti-GD3 que debía añadirse. Tal como se muestra en la figura 2, los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 mostraron prácticamente la misma actividad de unión a GD3. El resultado demuestra que las actividades de unión a antígeno de dichos anticuerpos son constantes independientemente de las células animales productoras de anticuerpos y los métodos de cultivo de las mismas. Además, la comparación entre el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (302) y el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (GIT) sugiere que las actividades de unión a antígeno son constantes independientemente de los medios utilizados en el cultivo.
2. Actividad citotóxica (actividad ADCC) in vitro del anticuerpo híbrido anti-GD3
Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 purificado obtenidos en el ítem 4 del Ejemplo 1, se midió la actividad ADCC de acuerdo con el método siguiente.
(1) Preparación de solución de células diana
Se cultivó la estirpe celular de melanoma humano G-361 (ATCC n° CRL 1424) utilizando el medio RPMI1640-FBS(10) para preparar 1x106 células, y las células se marcaron radioisotópicamente haciéndolas reaccionar con 3,7 MBq equivalentes de la sustancia radioactiva Na251CrO4 a 37°C durante 1 hora. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces en la suspensión de medio RPMI1640-FBS(10) y la centrifugación, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4°C durante 30 minutos en hielo para la disolución espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustó el precipitado a 2x105 células/ml mediante la adición de 5 ml del medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizó como solución de las células madre.
(2) Preparación de solución de células efectoras
De una persona sana se recolectaron 50 ml de sangre venosa y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricado por Takeda Pharmaceutical). La mezcla se centrifugó para aislar una capa de células mononucleares utilizando Lymphoprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras lavar con el medio RPMI1640-FBS(10) mediante centrifugación tres veces, el precipitado resultante se resuspendió, proporcionando una densidad de 2x106 células/ml con el medio y se utilizó como la solución de células efectoras.
(3) Medición de la actividad ADCC
En cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon), se dispensaron 50 μl de la solución de células diana preparada en (1) anteriormente (1x104 células/pocillo). A continuación, se añadieron a lo anterior 100 μl de la solución de células efectoras preparadas en (2), anteriormente (2x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras a células diana alcanzó 20:1). A continuación, se añadió cada uno de los anticuerpos híbridos anti-GD3, proporcionando una concentración final de entre 0,0025 y 2,5 μg/ml, seguido de la reacción a 37°C durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador y. Se calculó la cantidad de 51Cr liberado espontáneamente mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de células efectoras y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad total de 51Cr liberado mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de anticuerpos y añadiendo ácido clorhídrico 1 N en lugar de la solución de células efectoras y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad de ADCC a partir de la ecuación (II) a continuación:
Figure imgf000052_0001
Los resultados se muestran en la figura 3. Tal como se muestra en la figura 3, entre los cinco tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3, el anticuerpo híbrido de YB2/0-GD3 mostró la actividad ADCC más potente, seguido del anticuerpo híbrido de SP2/0-GD3, el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 y el anticuerpo híbrido de CHO-GD3, en ese orden. No se observó diferencia de actividad ADCC entre el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (302) y el anticuerpo híbrido de NS0-GD3 (GIT) preparado utilizando diferentes medios durante el cultivo. Los resultados anteriores demuestran que la actividad ADCC de los anticuerpos varía en gran medida dependiendo del tipo de células animales que deben utilizarse en la producción de los mismos. Respecto a su mecanismo, debido a que las actividades de unión a antígeno eran idénticas, se consideró que la unión estaba causada por una diferencia en la unión de la estructura a la región Fc de anticuerpo.
Ejemplo 3
Preparación de anticuerpo con injertación de RDC humana anti-cadena a de receptor de interleuquina 5 humana:
1. Preparación de células productoras estables de anticuerpo con injertación de RDC humana anti-cadena a de receptor de interleuquina 5 humana:
(1) Preparación de célula productora de anticuerpos utilizando la célula YB2/0 de mieloma de rata
Mediante la utilización del vector de expresión del anticuerpo con injertación de RDC humana anti-cadena a de receptor de interleuquina 5 humana (en adelante denominado "anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h"), pKANTEX1259HV3LV0, descrita en el documento n° WO 97/10354, se prepararon células capaces de producir establemente anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h tal como se indica a continuación.
Tras introducir 5 μg del vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h pKANTEX1259HV3LV0 en 4x106 células de YB2/0 de mieloma de rata mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 40 ml de RPMI1640-FBS(10) y se dispensaron 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Sumitomo Bakelite). Tras cultivarlas a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2 , se añadió G418 hasta una concentración de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó de los pocillos el sobrenadante de cultivo, en el que se habían formado colonias de los transformantes que mostraban resistencia a G418 y se había observado el crecimiento de las colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 3.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en el medio RPMI1640-FBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 50 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensaron 2 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM se indujeron mediante cultivo a 37°C durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en sobrenadantes de cultivo en pocillos en la que se observó crecimiento de los transformantes mediante el ELISA mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 3. Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM y después a 200 nM, y los transformantes capaces de crecer en el medio RPMI1640-FBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM y de producir el anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en una gran cantidad se obtuvieron finalmente de la manera indicada anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares y se aislaron en forma de células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada. El clon de células transformadas n° 3 productoras de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h obtenido se depositó el 5 de abril de 1999 como FERM n° BP-6690 en el National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Higashi 1-1-3, Tsukuba, Ibaraki, Japón) (nombre actual: International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukubashi, Ibaraki-ken, Japón)).
(2) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células CHO/dhfr-
Tras introducir 4 jg del vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h pKANTEX1259HV3LV0 descrito en el documento n° WO 97/10354 en 1,6x106 células de CHO/dhfr mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 10 ml de IMDM-FBS(10) y se dispensaron 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricada por Iwaki Glass). Tras cultivarlas a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2 , se añadió G418 hasta una concentración de 0,5 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó de los pocillos respectivos el sobrenadante de cultivo, en el que se habían formado colonias de los transformantes que mostraban resistencia a G418 y se había observado el crecimiento de las colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 3.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de los transformantes en medio IMDM-dFBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 10 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml, y la suspensión se dispensó a razón de 0,5 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Iwaki Glass). Los transformantes que mostraban resistencia a MTX 10 nM se indujeron mediante cultivo a 37°C durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2. Con respecto a los transformantes en los pocillos en los que se había observado crecimiento, se incrementó la concentración de MTX a 100 nM y después a 500 nM y finalmente se obtuvieron transformantes capaces de crecer en el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 500 nM y de producir anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en gran cantidad, mediante el mismo método que el indicado anteriormente. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares y se aislaron en forma de células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.
(3) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células NS0 de mieloma de ratón
Se preparó un vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h de acuerdo con el método de Yarranton et al. [Biotechnology 10:169, 1992] y utilizando el ADNc de cadena H de anticuerpo y el ADNc de cadena L en el vector de expresión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h, pKANTEX1259HV3LV0 descrito en el documento n° WO 97/10354, se transformaron célula NS0 para obtener transformantes capaces de producir el anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en gran cantidad. De entre los transformantes obtenidos, se seleccionaron las estirpes celulares y se aislaron en forma de células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces. Además, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.
2. Medición de la actividad de unión del anticuerpo a IL-5Ra h (ELISA)
Se midió la actividad de unión a IL-5Ra_h del anticuerpo tal como se indica a continuación.
Se preparó una solución mediante dilución del anticuerpo de ratón anti-IL-5Ra_h KM1257 descrito en el documento n° W o 97/10354 con PBS, proporcionando una concentración de 10 μg/ml y se dispensaron 50 μl de la solución resultante en cada pocillo de una placa de 96 pocillos para el ELISA (fabricado por Greiner), seguido de la reacción a 4°C durante 20 horas. Tras la reacción, se dispensó BSA-PBS al 1% a razón de 100 μl/pocillo y después se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora para bloquear los grupos activos restantes. Tras descartar PBS-BSA al 1%, una solución preparada mediante dilución de la IL-5Ra_h soluble descrita en el documento n° WO 97/10354 con PBS-BSA al 1%, proporcionando una concentración de 0,5 μg/ml, se dispensó a razón de 50 μl/pocillo, seguido de la reacción a 4°C durante 20 horas. Tras la reacción, se lavó cada pocillo con Tween-PBS, los sobrenadantes de cultivo de los transformantes o de las soluciones diluidas de anticuerpos con injertación de RDC humana purificados se dispensaron a razón de 50 μg/pocillo para llevar a cabo la temperatura de reacción durante 2 horas. Tras la reacción, se lavó cada pocillo con Tween-PBS, una solución de anticuerpo de cabra anti-IgG humana (H y L) marcado con peroxidasa (fabricada por American Qualex) diluida 3.000 veces con PBS-BSA al 1% y se dispensó a razón de 50 μl/pocillo como solución de anticuerpo secundario y después se llevó a cabo la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con Tween-PBS, la solución de sustrato ABTs se dispensó a razón de 50 μl/pocillo para el revelado del color y después se midió la absorbancia a DO415.
3. Purificación de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra h
(1) Cultivo de célula productora de anticuerpos derivada de célula YB2/0 y purificación de anticuerpos
El clon de células transformadas productoras de anticuerpos con injertación de RD anti-IL-5Ra_h obtenido en el ítem 1(1) del Ejemplo 1 se suspendió en el medio GIT que comprendía 0,5 mg/ml de G418 y MTX 200 nM, proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y la suspensión se dispensó a razón de 200 ml en matraces de 175 mm2 (fabricados por Greiner). Tras cultivarlas a 37°C durante 8 días en un incubador con 5% de CO2 , se recuperó el sobrenadante de cultivo. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de intercambio iónico y un método de filtración en gel. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado se denominó anticuerpo de YB2/0-IL-5R_h RDC.
(2) Cultivo de células productoras de anticuerpos derivada de células CHO/dhfr- y purificación de anticuerpos
El clon de células transformadas productoras de anticuerpos injertados con RDC anti-IL-5Ra_h obtenido en el ítem 1(2) del Ejemplo 3 se suspendió en el medio EX-CELL302 que comprendía L-Gln 3 mM, CDLC al 0,5% y PF68 al 0,3%, proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y se cultivó utilizando una botella centrifugadora de 4,0 litros de capacidad (fabricada por Iwaki Glass) bajo agitación a una velocidad de 100 rpm. Tras cultivarlas a 37°C durante 10 días en una sala de temperatura controlada, se recuperó el sobrenadante de cultivo. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de intercambio iónico y un método de filtración en gel. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado se denominó anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC.
(3) Cultivo de células productoras de anticuerpos derivadas de células NS0 y purificación de anticuerpos
El clon de células transformadas productoras de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h obtenido en el ítem 1(3) del Ejemplo 3 se cultivó de acuerdo con el método de Yarranton et al. [Bio/Technology 10:169, 1992] y después se recuperó un sobrenadante de cultivo. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando cromatografía de intercambio iónico y el método de filtración en gel. El anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado se denominó anticuerpo de NS0/IL-5R_h RDC.
4. Análisis de anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Ra h purificados
De acuerdo con un método conocido [Nature 227:680, 1970], 4 μg de cada uno de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h producido y purificado a partir de las células animales respectivas, obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3, se sometieron a SDS-PAGE para analizar el peso molecular y el grado de purificación. Se muestran los resultados en la figura 4. Tal como se muestra en la figura 4, se observó una única banda en aproximadamente 150 kilodaltons de peso molecular bajo condiciones no reductoras, y dos bandas de aproximadamente 50 kD y aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras, en cada uno de los anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Ra purificados. Los pesos moleculares prácticamente coincidieron con los pesos moleculares deducidos de las secuencias de nucleótidos de ADNc de las cadenas H y L del anticuerpo (cadena H: aproximadamente 49 Kd; cadena L: aproximadamente 23 Kd; molécula completa: aproximadamente 144 kD) y también coincidieron con los informes que indican que el anticuerpo IgG presentaba un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y resultaba degradado en cadenas H con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y cadenas L que presentaban un peso molecular de aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras debido al corte del enlace S-S en la molécula [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1998; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996], de manera que se confirmó que cada anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra se había expresado y purificado en forma de molécula de anticuerpo con la estructura real.
Ejemplo 4
Evaluación de actividad de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h
1. Actividad de unión de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra h (ELISA)
Se midió la actividad de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3 de unión a IL-5Ra_h mediante el ELISA mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 3. La figura 5 muestra el resultado del examen de la actividad de unión medida mediante la modificación de la concentración del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h que debía añadirse. Tal como se muestra en la figura 5, los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h mostraron prácticamente la misma actividad de unión a IL-5Ra_h. El resultado demuestra que las actividades de unión a antígeno de dichos anticuerpos son constantes independientemente de las células animales productoras de anticuerpos y los métodos de cultivo de las mismas, de manera similar al resultado del ítem 1 del Ejemplo 2.
2. Actividad citotóxica (actividad ADCC) in vitro del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra h
Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3, se midió la actividad ADCC de acuerdo con el método siguiente.
(1) Preparación de solución de células diana
Se cultivó la línea de células T de ratón CTLL-2(h5R) que expresaba las cadenas a y p de IL-5R_h descritos en el documento n° WO 97/10354 utilizando el medio RPMI1640-FBS(10), proporcionando una densidad de 1x106 células/0,5 ml, y las células se marcaron radioisotópicamente haciéndolas reaccionar con 3,7 MBq equivalentes de la sustancia radioactiva Na251CrO4 a 37°C durante 1,5 horas. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces en la suspensión de medio RPMI1640-FBS(10) y se centrifugaron, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4°C durante 30 minutos en hielo para la disolución espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustó el precipitado a una densidad de 2x105 células/ml mediante la adición de 5 ml del medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizó como solución de las células madre.
(2) Preparación de solución de células efectoras
De una persona sana se recolectaron 50 ml de sangre venosa y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricado por Takeda Pharmaceutical). La mezcla se centrifugó para aislar una capa de células mononucleares utilizando Polymorphprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) siguiendo las instrucciones del fabricante. Tras lavar con el medio RPMI1640-FBS(10) mediante centrifugación tres veces, las células resultantes se resuspendieron, proporcionando una densidad de 9x106 células/ml con el medio y se utilizaron como solución de células efectoras.
(3) Medición de la actividad ADCC
En cada pocilio de una placa de 96 pocilios de fondo en U (fabricada por Falcon), se dispensaron 50 μl de la solución de células diana preparada en (1) anteriormente (1x104 células/pocillo). A continuación, se añadieron a lo anterior 100 μl de la solución de células efectoras preparadas en (2), anteriormente (9x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras a células diana alcanzó 90:1). A continuación, se añadió cada uno de los anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h, proporcionando una concentración final de entre 0,001 y 0,1 μg/ml, seguido de la reacción a 37°C durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador y. Se calculó la cantidad de 51Cr liberado espontáneamente mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de células efectoras y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad total de 51Cr liberado mediante la misma operación, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de anticuerpos y añadiendo ácido clorhídrico 1 N en lugar de la solución de células efectoras y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante.
Se calculó la actividad de ADCC a partir de la ecuación (II), anteriormente proporcionada.
Los resultados se muestran en la figura 6. Tal como se muestra en la figura 6, entre los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h, el anticuerpo YB2/0-IL-5R_h RDC mostró la actividad ADCC más potente, seguido del anticuerpo CHO/d-IL-5R_h RDC y el anticuerpo NS0-IL-5R_h RDC, en este orden. De manera similar al resultado del ítem 2 del Ejemplo 2, los resultados anteriores demuestran que la actividad ADCC de los anticuerpos varía en gran medida dependiendo de las células animales que deben utilizarse en la producción de los mismos. Además, debido a que los anticuerpos producidos por las células YB2/0 mostraban la actividad ADCC más potente en ambos tipos de anticuerpo humanizado, se reveló que podía producirse un anticuerpo con actividad ADCC potente mediante la utilización de células YB2/0.
3. Evaluación de la actividad in vivo del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra h
Con el fin de evaluar la actividad in vivo de los tres tipos de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado obtenidos en el ítem 3 del Ejemplo 3, se examinó la actividad de inhibición en un modelo de eosinofilia creciente inducida por IL-5_h de Macaca fascicularis de acuerdo con el método siguiente.
Se administró la IL-5_h (método de preparación descrito en el documento n° WO 97/10354) en Macaca fascicularis bajo la piel dorsal a una dosis de 1 jg/kg, desde el primer día y una vez al día durante un total de 14 veces. Cada anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h se administró por vía intravenosa a una dosis de 0,3 mg/kg una hora antes de la administración de IL-5_h el día cero. A modo de control se utilizó un grupo sin adición de anticuerpo. En los grupos en los que se había administrado anticuerpo se utilizaron tres animales de Macaca fascicularis en cada grupo (n° 301, n° 302, n° 303, n° 401, n° 402, n° 403, n° 501, n° 502 y n° 503) y se utilizaron dos animales (n° 101 y n° 102) en el grupo sin adición de anticuerpo. Desde los 7 días antes del inicio de la administración y hasta 42 días después de la administración, se recolectó periódicamente aproximadamente 1 ml de sangre de una vena safena o una vena femoral y se midió el número de eosinófilos en 1 μl de sangre periférica. Se muestran los resultados en la figura 7. Tal como se muestra en la figura 7, el incremento de los eosinófilos en sangre resultó completamente inhibido en el grupo en el que se había administrado anticuerpo YB2/0-IL-5R_h RDC. Por otra parte, se observó una actividad de inhibición completa en un animal en el grupo en el que se había administrado el anticuerpo de CHO/d-IL-5R_h RDC, mientras que la actividad de inhibición no era suficiente en dos animales. En el grupo en el que se había administrado el anticuerpo de NS0-IL-5R_h RDC, no se observó actividad de inhibición completa y su efecto no resultó suficiente.
Los resultados anteriores demuestran que la actividad in vivo de los anticuerpos varía en gran medida dependiendo del tipo de células animales que deben utilizarse en la producción de los mismos. Además, debido a que se observó una correlación positiva entre el grado de actividad in vivo del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h y el grado de su actividad ADCC descrito en el ítem 2 del Ejemplo 4, se señaló que el grado de actividad de ADCC resulta notablemente importante para la expresión de la actividad del mismo.
Basándose en los resultados anteriormente proporcionados, se espera que un anticuerpo con potente actividad de ADCC también resulte útil en el campo clínico para diversas enfermedades en el ser humano.
Ejemplo 5
Análisis de las cadenas de azúcar que potencian la actividad de ADCC:
1. Preparación de cadena de azúcar marcada con 2-aminopiridina (cadena sacárida tratada con PA)
El anticuerpo humanizado de la presente invención se hidrolizó con ácido clorhídrico para eliminar el ácido siálico. Tras eliminar por completo el ácido clorhídrico, la cadena de azúcar se cortó de la proteína mediante hidrazinolisis [Method of Enzymology 83:263, 1982]. Se eliminó la hidrazina y se llevó a cabo la N-acetilación mediante la adición de una solución acuosa de acetato amónico y anhídrido acético. Tras la liofilización, se llevó a cabo el marcaje fluorescente con 2-aminopiridina [J. Biochem. 95:197, 1984]. La cadena de azúcar marcada fluorescentemente (cadena sacárida tratada con PA) se separó de las impurezas utilizando una columna Superdex Peptide HR 10/30 (fabricada por Pharmacia). La fracción de cadena de azúcar se secó utilizando un concentrador centrífugo y se utilizó como cadena de azúcar tratada con PA purificada.
2. Análisis de HPLC de fase inversa de cadena de azúcar tratada con PA de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra h
Según el método en el ítem 1 del Ejemplo 5, los diversos anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h producidos en el Ejemplo 3 se sometieron a tratamiento de las cadenas de azúcar tratadas con PA y se llevó a cabo análisis de HPLC de fase inversa con una columna CLC-ODS (fabricada por Shimadzu). Se añadió una cantidad en exceso de a-L-fucosidasa (obtenida de riñón bovino, fabricado por Sigma) a la cadena de azúcar tratada con PA para la digestión (37°C, 15 horas) y después se analizaron los productos mediante HPLC de fase inversa (figura 8). Se confirmó que la cadena de azúcar unida a asparagina se eluye durante 30 a 80 minutos utilizando los estándares de cadena de azúcar tratados con PA fabricados por Takara Shuzo. Se calculó la proporción de cadenas de azúcar en las que las posiciones de elución en la HPLC de fase inversa se encontraban desplazadas (cadenas sacáridas eluidas entre 48 y 78 minutos) en la digestión con a-L-fucosidasa. Se muestran los resultados en la Tabla 1.
Tabla 1
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Aproximadamente 47% del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h producido por las células YB2/0 y aproximadamente 73% del anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h producido por las células NS0 eran cadenas de azúcar en las que la posición 1 de la fucosa se encontraba unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido (en adelante denominado "cadena sacárida que presenta a-1,6-fucosa"). De esta manera, la proporción de cadenas de azúcar en las que la posición 1 de la fucosa no se encuentra unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido (en adelante denominada "cadena sacárida libre de a-1,6-fucosa") es superior en el anticuerpo producido por la célula YB2/0 que en el anticuerpo producido por la célula NS0.
3. Análisis de la composición de monosacáridos de anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Ra h purificados
Las cadenas de azúcar de anticuerpos con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h producidos por células YB2/0, células NS0 y células CHO/d se hidrolizaron en monosacáridos mediante hidrólisis ácida con ácido trifluoroacético y el análisis de la composición de monosacáridos se llevó a cabo utilizando BioLC (fabricado por Dionex).
De entre las cadenas de azúcar unidas mediante N-glucósido, hay 3 unidades de manosa en una cadena de azúcar en la cadena de azúcar de tipo complejo unida mediante N-glucósido. En la Tabla 2 se muestra una proporción relativa de cada monosacárido obtenido estimando el número de manosas en 3.
Tabla 2
Figure imgf000057_0001
Debido a que las proporciones relativas de fucosa se encontraban en el orden YB2/0 < CHO/d < NS0, la cadena de azúcar producida en el anticuerpo producido por la célula YB2/0 mostraba el contenido de fucosa más bajo, tal como también se muestra en los presentes resultados.
4. Análisis de cadenas de azúcar del anticuerpo producido por las células CHO/dhfr
Se prepararon cadenas de azúcar tratadas con PA a partir de anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado producido por las células CHO/dhfr y el análisis de HPLC de fase inversa se llevó a cabo utilizando una columna CLC-ODS (fabricada por Shimadzu) (figura 9). En la figura 9, un tiempo de elución de 35 a 45 minutos correspondía a cadenas de azúcar que no presentaban fucosa y un tiempo de elución de entre 45 y 60 minutos correspondía a las cadenas de azúcar que presentaban fucosa. De manera similar al caso del anticuerpo producido por las células NS0 de mieloma de ratón, el anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h producido por las células CHO/dhfr presentaba un contenido de cadenas de azúcar libres de fucosa inferior que el de los anticuerpos producidos por las células YB2/0 de mieloma de rata.
Ejemplo 6
Separación del anticuerpo de actividad ADCC potente:
Se separó el anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h producido por las células YB2/0 de mieloma de rata utilizando una columna de lectina que se unía a cadenas de azúcar que presentaban fucosa. Se llevó a cabo una HPLC utilizando LC-6A fabricado por Shimadzu a un caudal de 1 ml/min. y a temperatura ambiente como la temperatura de la columna. Tras el equilibrado con tampón de Tris-sulfato 50 mM (pH 7,3), se inyectó el anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h purificado y después se eluyó mediante un gradiente lineal de densidades (60 minutos) de a-metilmanósido 0,2 M (fabricado por Nacalai Tesque). Se separó el anticuerpo con injertación de RDC anti-IL-5Ra_h en fracción no adsorbida y fracción adsorbida. Al muestrear la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida y medirse su actividad de unión a IL-5Ra_h, mostraron una actividad de unión similar (figura 10A). Al medir la actividad ADCC, la fracción no adsorbida mostró una potente actividad ADCC, 100 a 1.000 veces la actividad de la parte de fracción adsorbida (figura 10B). Además, se prepararon cadenas de azúcar tratadas con PA a partir de la fracción no adsorbida y una parte de la fracción adsorbida y se llevó a cabo el análisis de HPLC de fase inversa utilizando una columna c LC-ODS (fabricada por Shimadzu) (figura 11). En la fracción no adsorbida se encontraba presente principalmente un anticuerpo de unión a cadenas de azúcar libres de fucosa y en la parte de fracción adsorbida, se encontraba presente principalmente un anticuerpo de unión a cadenas de azúcar que presentaban fucosa.
Ejemplo 7
Evaluación de la actividad de anticuerpo híbrido anti-GD3 con diferentes proporciones de cadena de azúcar libre de a-1,6-fucosa:
1. Preparación de anticuerpo híbrido anti-GD3 con diferentes proporciones de cadena de azúcar libre de a-1,6-fucosa
De acuerdo con el método descrito en el ítem 2(1) del Ejemplo 1, se obtuvieron clones transformados obtenidos de las células YB2/0 capaces de producir un anticuerpo híbrido anti-GD3. Se prepararon anticuerpos a partir de los clones transformados obtenidos de células YB2/0 y se denominaron lotes 1, 2 y 3. Cada cadena de azúcar que se unía a los anticuerpos híbridos anti-GD3 de los lotes 1, 2 y 3 se analizó de acuerdo con el método del Ejemplo 11 (6) y se encontró que las proporciones de las cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa eran de 50%, 45% y 29%, respectivamente. En la presente memoria dichas muestras se denominan anticuerpo híbrido anti-GD3 (50%), anticuerpo híbrido anti-GD3 (45%) y anticuerpo híbrido anti-GD3 (29%).
Además, las cadenas de azúcar del anticuerpo híbrido anti-GD3 derivado de células CHO/DG44 preparadas en el ítem 2(2) del Ejemplo 1 se analizaron de acuerdo con el método del Ejemplo 11(6) y se encontró que la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa era de 7%. En la presente memoria la muestra se denomina anticuerpo híbrido anti-GD3 (7%).
Se mezcló anticuerpo híbrido anti-GD3 (45%) y anticuerpo híbrido anti-GD3 (7%) en una proporción de anticuerpo híbrido GD3 (45%): anticuerpo híbrido anti-GD3 (7%) de 5:3 o de 1:7. Se analizaron las cadenas de azúcar de las muestras de acuerdo con el método del Ejemplo 10(6) y se encontró que se habían preparado muestras que presentaban una proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa de 24% y de 13% (valores calculados). En la presente memoria se denominan anticuerpo híbrido anti-GD3 (24%) y anticuerpo híbrido anti-GD3 (13%).
Los resultados del análisis de cadenas de azúcar de cada una de las muestras se muestran en la figura 12. La proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa se muestra como valor medio del resultado de dos análisis de cadenas sacárida.
2. Evaluación de la actividad de unión a GD3 (ELISA)
Las actividades de unión de los seis tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 con una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa preparadas en el ítem 1 del Ejemplo 7 contra GD3 (fabricado por Snow Brand Milk Products) se midieron mediante el ELISA mostrado en el ítem del Ejemplo 1. Como resultado, la totalidad de los seis tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 mostró prácticamente la misma actividad de unión a GD3 mostrada en la figura 13 y se encontró que la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa no presentaba influencia sobre la actividad de unión a antígenos del anticuerpo.
3. Evaluación de la actividad ADCC sobre la estirpe celular de melanoma humano
Se midió la actividad ADCC de los anticuerpos híbridos anti-GD3 sobre una estirpe celular de melanoma humano G-361 (ATCC n° CRL 1424) de la manera siguiente.
(1) Preparación de suspensión de células diana
Se prepararon 1x106 células de una estirpe celular de melanoma humano G-361, se añadió a lo anterior un equivalente de 3,7 MBq de una sustancia radioactiva, Na251CrO4 y la mezcla se dejó reaccionar a 37°C durante 1 hora para marcar las células con el isótopo radioactivo. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces mediante un procedimiento en suspensión en medio y la posterior centrifugación, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4°C durante 30 minutos en hielo para llevar a cabo la disolución espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustaron las células a 2x105 células/ml mediante la adición de 5 ml del medio y se utilizaron como suspensión de células diana.
(2) Preparación de suspensión de células efectoras humanas
De una persona sana se recolectaron 50 ml de sangre periférica y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricada por Shimizu Pharmaceutical). Utilizando Lymphoprep (fabricado por Axis Shield), lo anterior se centrifugó (800 g, 20 minutos) siguiendo las instrucciones del fabricante, separando una capa de células mononucleares. Las células se lavaron mediante centrifugación (1.200 rpm, 5 minutos) tres veces utilizando un medio y después se resuspendieron en el medio, proporcionando una densidad de 2x106 células/ml y se utilizaron como suspensión de células efectoras humanas.
(3) Medición de la actividad ADCC
La suspensión de células diana preparada en (1) se dispensó a razón de 50 μl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se añadieron a lo anterior 100 μl de la suspensión de células efectoras humanas preparada en (2) (2x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras humanas a células diana alcanzó 20:1). Se añadió a lo anterior cada uno de los anticuerpos híbridos anti-GD3, proporcionando una concentración final de entre 0,0005 y 5 μg/ml, seguido de la reacción a 37°C durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador y. Se calculó la cantidad de 51Cr liberado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de células efectoras humanas y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de 51Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de anticuerpo y una solución 1 mol/l de ácido clorhídrico en lugar de la suspensión de células efectoras humanas y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad citotóxica (%) utilizando la ecuación (II).
Las figuras 14 y 15 muestran el resultado de la medición de la actividad de ADCC de los seis tipos de anticuerpo híbrido anti-GD3 que presentaban una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa a diversas concentraciones (0,0005 a 5 μg/ml) utilizando células efectoras de dos donantes sanos (A y B), respectivamente. Tal como se muestra en las figuras 14 y 15, la actividad de ADCC de los anticuerpos híbridos anti-GD3 mostraban una tendencia a incrementarse proporcionalmente a la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa a cada concentración de anticuerpo. La actividad de ADCC se redujo en el caso de que la concentración de anticuerpo fuese baja. A una concentración de anticuerpo de 0,05 μg/ml, el anticuerpo en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa es de 24%, 29%, 45% o 50% mostraron una actividad de ADCC prácticamente igual de potente pero la actividad de ADCC fue baja en el anticuerpo (13%) o (7%) en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa es inferior a 20%. Estos resultados fueron iguales en el caso de modificación del donante de células efectoras.
Ejemplo 8
Evaluación de la actividad de anticuerpo híbrido anti-CCR4 con diferentes proporciones de cadena de azúcar libre de a-1,6-fucosa:
1. Producción de células que producen establemente anticuerpo híbrido anti-CCR4
Las células que son capaces de producir establemente un anticuerpo híbrido anti-CCR4 se prepararon de la manera siguiente, utilizando el vector de expresión de tipo tándem pKANTEX2160 para un anticuerpo híbrido anti-CCR4 descrito en el documento n° WO 01/64754.
(1) Preparación de célula productora de anticuerpos utilizando la célula YB2/0 de mieloma de rata
Tras introducir 10 μg del vector de expresión de anticuerpo híbrido anti-CCR4 pKANTEX2160 en 4x106 células de YB2/0 de mieloma de rata mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 40 ml de hibridoma-SFM-FBS(5) [medio de hibridoma-SFM (fabricado por Invitrogen) que comprendía FBS al 5% (fabricado por PAA Laboratories)] y se dispensaron en 200 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Sumitomo Bakelite). Tras cultivarlas a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2 , se añadió G418 hasta una concentración de 1 mg/ml, seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó el sobrenadante de cultivo a partir de los pocillos en el que se observó crecimiento de transformantes que mostraban resistencia a G418 a partir de la formación de colonias, y se midió la actividad de unión a antígenos del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en el sobrenadante mediante ELISA, mostrado en el ítem 2 del Ejemplo 8.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en el medio hibridoma-SFM-FBS(5) que comprendía 1 mg/ml de G418 y el inhibidor de DHFR MTX 50 nM (fabricado por Sigma), proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml y la suspensión se dispensó en porciones de 1 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Tras cultivarlas a 37°C durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2 , se indujeron los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM. Se observó actividad de unión a antígeno del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en sobrenadantes de cultivo en pocillos en los que se observó crecimiento de los transformantes mediante el ELISA descrito en el ítem 2 del Ejemplo 8.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se observó producción del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en sobrenadantes de cultivo, se incrementó la concentración de MTX mediante el mismo método y finalmente se obtuvo un transformante capaz de crecer en medio de hibridoma-SFM-FBS(5) que comprendía MTX 200 nM y capaz de producir el anticuerpo híbrido anti-CCR4 en una gran cantidad. El transformante obtenido se convirtió en células individuales (clonación) mediante dilución limitante dos veces y la estirpe celular clonada obtenida se denominó KM2760 n° 58-35-16. En este caso, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente pequeña del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.
(2) Preparación de células productoras de anticuerpos utilizando células CHO/DG44
Tras introducir 4 μg del vector de expresión del anticuerpo híbrido anti-CCR4 pKANTEX2160 en 1,6x106 células CHO/DG44 mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990], las células se suspendieron en 10 ml de IMDM-dFBS(10)-HT(1) [medio IMDM (fabricado por Invitrogen) que comprendía FBS al 10% (fabricado por Invitrogen) y 1x concentración de suplemento HT (fabricado por Invitrogen)] y se dispensaron 100 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocillos (fabricado por Iwaki Glass). Tras cultivarlas a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2 , se cambió el medio a IMDM-dFBS(10) (medio IMDM que comprendía 10% de FBS dializado), seguido del cultivo durante 1 a 2 semanas. Se recuperó el sobrenadante de cultivo a partir de los pocillos en el que se observó crecimiento debido a la formación de un transformante que mostraba crecimiento independiente de HT y un nivel de expresión del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en el sobrenadante mediante ELISA descrito en el ítem 2 del Ejemplo 8.
Con respecto a los transformantes en pocillos en los que se había observado producción del anticuerpo híbrido anti-CCR4 en los sobrenadantes de cultivo, con el fin de incrementar la cantidad de anticuerpo producido utilizando un sistema de amplificación de gen DHFR, se suspendió cada uno de ellos en el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía MTX 50 nM, proporcionando una densidad de 1 a 2x105 células/ml, y la suspensión se dispensó a razón de 0,5 ml en los pocillos de una placa de 24 pocillos (fabricada por Iwaki Glass). Tras cultivarlas a 37°C durante 1 a 2 semanas en un incubador con 5% de CO2 , se indujeron los transformantes que mostraban resistencia a MTX 50 nM. Con respecto a los transformantes en los pocillos en los que se había observado crecimiento, se incrementó la concentración de MTX a 200 nM mediante el mismo método, y finalmente se obtuvo un transformante capaz de crecer en el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía MTX 200 nM y de producir anticuerpo híbrido anti-c CR4 en gran cantidad en una gran cantidad. El transformante obtenido se denominó 5-03. En este caso, utilizando el método para determinar el producto de transcripción de un gen de a-1,6-fucosiltransferasa mostrado en el Ejemplo 9, se seleccionó una estirpe celular productora de una cantidad relativamente reducida del producto de transcripción y se utilizó como estirpe celular adecuada.
2. Actividad de unión de anticuerpo al péptido parcial de CCR4 (ELISA)
Se seleccionó el compuesto 1 (SEC ID n° 25) como péptido de la región extracelular de CCR4 humano capaz de reaccionar con el anticuerpo híbrido anti-CCR4. Con el fin de utilizarlo en la medición de actividad mediante ELISA, se preparó un conjugado con BSA (albúmina de suero bovino) (fabricado por Nacalai Tesque) mediante el método siguiente y se utilizó a modo de antígeno. Es decir, se añadieron gota a gota 100 ml de una solución en DMSO que comprendía 25 mg/ml de SMCC [éster de N-hidroxisuccinimida de ácido 4-(N-maleimidometil)-ciclohexnao-1-carboxílico] (fabricado por Sigma) a 900 ml de una solución en PBS que contenía 10 mg de BSA bajo agitación con vórtex, seguido de agitación suave durante 30 minutos. Se aplicó una porción de 1 ml de la solución de reacción a una columna de filtración en gel, tal como una columna NAP-10 o similar equilibrada con 25 ml de PBS y después se eluyó con 1,5 ml de PBS y el eluido resultante se eluyó como solución de BSA-SMCC (la concentración de BSA se calculó basándose en la medición de A280). A continuación, se añadieron 250 ml de PBS a 0,5 mg de compuesto 1 y después se disolvieron completamente mediante la adición de 250 ml de DMF, y la solución de BSA-SMCC se añadió a lo anterior bajo agitación con vórtex, seguido de agitación suave durante 3 horas. La solución de reacción se dializó frente a PBS a 4°C durante la noche, se añadió a lo anterior azida sódica, proporcionando una concentración final de 0,05% y la mezcla se filtró a través de un filtro de 0,22 |jm para utilizarse como solución de BSA-compuesto 1.
Se dispensó el conjugado preparado a una concentración de 0,05 μg/ml y a razón de 50 μl/pocillo en una placa EIA de 96 pocillos (fabricado por Greiner) y se incubó para la adhesión a 4°C durante la noche. Tras lavar cada pocillo con PBS, se añadió a lo anterior BSA al 1%-PBS a razón de 100 μl/pocillo y se dejó reaccionar a temperatura ambiente para bloquear los grupos activos restantes. Tras lavar cada pocillo con PBS que contenía Tween-20 al 0. 05% (en adelante denominado "Tween-PBS"), se añadió un sobrenadante de cultivo de un transformante a razón de 50 μl/pocillo y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción, se lavó cada pocillo con Tween-PBS y después una solución de anticuerpo de cabra anti-IgG(Y) humana marcado con peroxidasa (fabricada por American Qualex) diluida 6000 veces con PBS-BSA al 1% se añadió a razón de 50 μl/pocillo como anticuerpo secundario y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora. Tras la reacción y posterior lavado con Tween-PBS, la solución de sustrato ABTS se dispensó a razón de 50 μl/pocillo para el revelado del color y 20 minutos después se detuvo la reacción mediante la adición de una solución de s Ds al 5% a razón de 50 μl/pocillo. A continuación se midió la absorbancia DO415. El anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido en el ítem 1 del Ejemplo 8 mostró la actividad de unión a CCR4.
3. Purificación de anticuerpo híbrido anti-CCR4
(1) Cultivo de célula productora de anticuerpos derivada de célula YB2/0 y purificación de anticuerpos
El clon KM2760 n° 58-35-16 de células transformantes expresantes de anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido en el ítem 1(1) del Ejemplo 8 se suspendió en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Invitrogen) que comprendía MTX 200 nM y 5% de GF21 de Daigo (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), proporcionando una densidad de 2x105 células/ml y se sometió a cultivo bajo agitación por lotes alimentados utilizando una botella centrifugadora (fabricada por Iwaki Glass) en una cámara termostatizada a 37°C. Tras cultivarlo durante 8 a 10 días, se purificó el anticuerpo híbrido anti-CCR4 a partir del sobrenadante de cultivo recuperado utilizando una columna de Prosep­ A (fabricada por Millipore) y la filtración en gel. El anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado se denominó KM2760-1.
(2) Cultivo de células productoras de anticuerpos derivadas de células CHO-DG44 y purificación de anticuerpos
La línea 5-03 de células transformantes productoras de anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenida en el ítem 1(2) del Ejemplo 8 se cultivó a 37°C en un incubador con 5% de CO2 utilizando medio IMDM-dFBS(10) en un matraz de 182 cm2 (fabricado por Greiner). Tras alcanzar la densidad celular la confluencia tras varios días, se descartó el sobrenadante del cultivo y las células se lavaron con 25 ml de tampón PBS y después se mezclaron con 25 ml de medio EXCELL 301 (fabricado por JRH). Tras cultivarlas a 37°C durante 7 días en un incubador con 5% de CO2 , se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-CCR4 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado se denominó KM3060.
Al medir la actividad de unión a CCR4 de KM2760-1 y KM3060 mediante ELISA, mostraron una actividad de unión equivalente.
4. Análisis de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 purificados
Cada 4 jg de los dos tipos de anticuerpo híbrido anti-CCR4 producidos y purificados a partir de las células animales respectivas, obtenidos en el ítem 1 del presente ejemplo, se sometió a SDS-PAGE de acuerdo con el método conocido [Nature 227:680, 1970] y se analizó el peso molecular y el grado de purificación. En cada uno de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 purificados, se encontró una única banda correspondiente a un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y se encontraron dos bandas en aproximadamente 50 kD y aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras. Los pesos moleculares prácticamente coincidieron con los pesos moleculares deducidos de las secuencias de nucleótidos de ADNc de las cadenas H y L del anticuerpo (cadena H: aproximadamente 49 Kd; cadena L: aproximadamente 23 Kd; molécula completa: aproximadamente 144 kD) y también coincidieron con los informes que indican que el anticuerpo de tipo IgG presenta un peso molecular de aproximadamente 150 kD bajo condiciones no reductoras y resulta degradado en cadenas H con un peso molecular de aproximadamente 50 kD y cadenas L que presentaban un peso molecular de aproximadamente 25 kD bajo condiciones reductoras debido al corte del enlace S-S en la molécula [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, capítulo 14, 1988, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press Limited, 1996], confirmando de esta manera que cada anticuerpo híbrido anti-CCR4 se había expresado y purificado en forma de molécula de anticuerpo con la estructura correcta.
5. Preparación de anticuerpo híbrido anti-CCR4 con diferentes proporciones de cadena de azúcar libre de a-1,6-fucosa
Se analizaron las cadenas de azúcar que se unían al anticuerpo híbrido anti-CCR4 KM2760-1 obtenido de células YB2/0 preparadas en el ítem 3(1) del Ejemplo 8 y al anticuerpo híbrido anti-CCR4 KM3060 obtenido de células CHO/DG44 preparadas en el ítem 3(2) del Ejemplo 2 de acuerdo con el método del Ejemplo 10(6). La proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa era de 87% y 8% en KM2760 y KM3060, respectivamente. En la presente memoria las muestras se denominan anticuerpo híbrido anti-CCR4 (87%) y anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%).
Se mezcló anticuerpo híbrido anti-CCR4 (87%) y anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%) en una proporción de anticuerpo híbrido ant-CCR4 (87%): anticuerpo híbrido anti-CCR4 (8%) = 1: 39, 16 : 67, 22 : 57, 32 : 47 ó 42: 37. Se analizaron las cadenas de azúcar de dichas muestras de acuerdo con el método del Ejemplo 10(6). La proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa era de 9%, 18%, 27%, 39% y 46%, respectivamente. En la presente memoria dichas muestras se denominan anticuerpo híbrido anti-CCR4 (9%), anticuerpo híbrido anti-CCR4 (18%), anticuerpo híbrido anti-CCR4 (27%), anticuerpo híbrido anti-CCR4 (39%) y anticuerpo híbrido anti-CCR4 (46%).
Los resultados del análisis de cadenas de azúcar de cada una de las muestras se muestran en la figura 16. La proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa se muestra como valor medio del resultado de dos análisis de cadenas sacárida.
6. Evaluación de la actividad de unión al péptido parcial de CCR4 (ELISA)
La actividad de unión de los seis tipos diferentes de anticuerpo híbrido anti-CCR4 que presentaban una cadena de azúcar libre de a-1,6-fucosa diferente preparada en el ítem 5 del Ejemplo 8 a péptido parcial de CCR4 se midió de acuerdo con el método descrito en el ítem 2 del Ejemplo 8.
Como resultado, tal como se muestra en la figura 17, los seis tipos de anticuerpo híbrido anti-CCR4 mostraron prácticamente la misma actividad de unión a CCR4 y se encontró que la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa no presentaba ninguna influencia sobre la actividad de unión a antígeno del anticuerpo.
7. Evaluación de la actividad ADCC sobre la estirpe celular humana de nivel elevado de expresión de CCR4
La actividad de ADCC de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 contra una célula humana CCR4/EL-4 de alto nivel de expresión de CCR4 (documento n° WO 01/64754) se midió de la manera siguiente.
(1) Preparación de suspensión de células diana
Se prepararon células (1,5x106) de una célula expresante de CCR4 humanas, células CCR4/EL-4, descritas en el documento n° WO 01/64754, y se añadió a las mismas 5,55 MBq equivalentes de una sustancia radioactiva Na251CrO4 , seguido de la reacción a 37°C durante 1,5 horas, para marcar de esta manera las células con un isótopo radioactivo. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces mediante suspensión en medio y la posterior centrifugación, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4°C durante 30 minutos en hielo para llevar a cabo la disolución espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustaron las células a 2x105 células/ml mediante la adición de 7,5 ml del medio y se utilizaron como suspensión de células diana.
(2) Preparación de suspensión de células efectoras humanas
De una persona sana se extrajeron 60 ml de sangre periférica y se añadieron 0,6 ml de heparina sodio (fabricada por Shimizu Pharmaceutical), seguido de la mezcla suave. La mezcla se centrifugó (800 g, 20 minutos) para aislar una capa de células mononucleares utilizando Lymphoprep (fabricado por Axis Shield) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células se lavaron mediante centrifugación (1.400 rpm, 5 minutos) tres veces utilizando un medio y después se resuspendieron en el medio, proporcionando una densidad de 5x106 células/ml y se utilizaron como suspensión de células efectoras humanas.
(3) Medición de la actividad ADCC
La suspensión de células diana preparada en (1) se dispensó a razón de 50 μl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se añadieron a lo anterior 100 μl de la suspensión de células efectoras humanas preparada en (2) (2x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras humanas a células diana alcanzó 50:1). 1). Además, se añadió a lo anterior cada uno de los anticuerpos híbridos anti-CCR4, proporcionando una concentración final de entre 0,0001 y 10 μg/ml, seguido de la reacción a 37°C durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador y. Se calculó la cantidad de 51Cr liberado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de células efectoras humanas y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de 51Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando 1 mol/l de solución de ácido clorhídrico en lugar de la solución de anticuerpo y la suspensión de células efectoras humanas y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad ADCC (%) utilizando la ecuación (II).
Las figuras 18 y 19 muestran el resultado de la medición de la actividad de ADCC de los anticuerpos híbrido anti-CCR4 que presentaban una proporción diferente de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa a diversas concentraciones (0,001 a 10 μg/ml) utilizando células efectoras de dos donantes sanos (A y B), respectivamente. Tal como se muestra en las figuras 18 y 19, la actividad de ADCC de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 mostraban una tendencia a incrementarse proporcionalmente a la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa a cada concentración de anticuerpo. La actividad de ADCC se redujo en el caso de que la concentración de anticuerpo fuese baja. A una concentración de anticuerpo de 0,01 μg/ml, el anticuerpo en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa es de 27%, 39% o 46% mostraron una actividad de ADCC prácticamente igual de potente pero la actividad de ADCC fue baja en el anticuerpo en el que la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa era inferior a 20%. Estos resultados fueron iguales en el caso de que se cambiase el donante de las células efectoras.
Ejemplo 9
Determinación del producto de transcripción del gen a-1,6-fucosiltransferasa en la estirpe celular huésped:
(1) Preparación de ADNc de cadena sencilla a partir de diversas estirpes celulares
Se prepararon muestras de ADNc de cadena sencilla a partir de células CHO/DG44 con deleción del gen dihidrofolato reductasa (dhfr) obtenidas de células de ovario de hámster chino y YB2/0 de mieloma de rata mediante el procedimiento a continuación.
Las células CHO/DG44 se suspendieron en medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y 1x concentración de complemento HT (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en matraz T75 para la utilización en cultivo celular adherente (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Además, las células YB2/0 se suspendieron en medio RPMI1640 (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y L-GLN 4 mmoles/l (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en matraz T75 para el cultivo celular de suspensión (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Se cultivaron a 37°C en un incubador con 5% de CO2 y se recuperaron 1x107 de las células hospedadoras respectivas en el primer, 2°, 3°, 4° y 5° días del cultivo para extraer el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril, se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricado por Promega), 5 μl de 10x tampón de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37°C durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.
En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 jg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación Superscript™ para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) y siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó una solución de 1x concentración de la solución de reacción para la clonación de a-1,6-fucosiltransferasa (en adelante denominada en ocasiones "FUT8") y p-actina derivada de las células hospedadoras respectivas y solución acuosa diluida 50 veces de la solución de reacción para la determinación de cada nivel de transcripción génica mediante PCR competitiva y las soluciones se almacenaron a -80°C hasta la utilización de las mismas.
(2) Preparación de fragmentos parciales de ADNc de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata
Se preparó cada fragmento parcial de ADNc de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata mediante el procedimiento siguiente (figura 20).
En primer lugar, se diseñaron cebadores (mostrados en la SEC ID n° 4 y n° 5) específicos para las secuencias de nucleótidos comunes al ADNc de FUT8 humano [J. Biochem. 121:626, 1997] y ADNc de FUT8 porcino [J. Biol. Chem. 271:27810, 1995].
A continuación, 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP y 0,5 jmmoles/l de cebadores específicos de gen (SEC ID n° 4 y n° 5)] que contenían 1 μl de cada uno de los ADNc preparados a partir de células CHO y ADNc preparado a partir de células YB2/0, ambos obtenidos en el ítem (1) 2 días después del cultivo, y se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricado por Takara Shuzo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72°C durante 10 minutos.
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y un fragmento amplificado específico de 979 pb se purificó utilizando el kit Geneclean Spin (fabricado por Bio 101) y se eluyó con 10 μl de agua estéril (en adelante el método se utiliza para la purificación de fragmentos de ADN a partir de un gel de agarosa). En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 μl del fragmento amplificado para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO Ta (fabricado por Invitrogen) y se transformó E. coliXL1-blue con la solución de reacción mediante el método de Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, 1972] (en adelante el método se utiliza para la transformación de E. coli). Se aislaron muestras de ADN plasmídico siguiendo un método conocido [Nucleic Acids Research 7:1513, 1979] (en adelante se utilizó el método para el aislamiento de plásmido) a partir de 6 clones con ADNc insertado de entre las colonias resistente a canamicina obtenidas.
La secuencia de nucleótidos de cada ADNc insertado en el plásmido se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que la totalidad de los ADNc insertados de los que se determinaron la secuencia mediante el método codificaban las secuencias parciales del marco de lectura abierta (ORF, según sus siglas en inglés) de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata (mostrados en SEC ID n° 6 y n° 7). Entre ellos, se seleccionaron muestras de ADN plasmídico que no contenía ningún error en absoluto mediante PCR en las secuencias. En la presente memoria dichos plásmidos se denominan CHFUT8-pCR2.1 y YBFUT8-pCR2.1.
(3) Preparación de ADNc de p-actina de hámster chino y de p-actina de rata
Se preparó ADNc de p-actina de hámster chino y de p-actina de rata mediante el procedimiento a continuación (figura 21).
En primer lugar, se diseñó un cebador directo específico para una secuencia común que contiene un codón de inicio de la traducción (mostrado en SEC ID n° 8) y cebadores inversos específicos para las secuencias respectivas que contienen un codón de terminación de la traducción (mostrado en las SEC ID n° 9 y n° 10) a partir de secuencias genómicas de p-actina de hámster chino (GenBank, n° U20114) y de p-actina de rata [Nucleic Acids Research 11:1759, 1983].
A continuación, 25 μl de una solución de reacción [tampón KOD n° 1 (fabricado por Toyobo), 0,2 mmoles/l de dNTP y MgCh 1 mmol/l, 0,4 jmoles/l de cebadores específicos de gen (Se C ID n° 8 y n° 9 o SEC ID n° 8 y n° 10) y DMSO al 5%] que contenían 1 μl de cada uno de los ADNc preparados a partir de células CHO y ADNc preparado a partir de células YB2/0, ambos obtenidos en el ítem (1) 2 días después del cultivo, y se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa KOD (fabricado por Toyobo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 1 minuto y posteriores 25 ciclos de calentamiento a 98°C durante 15 segundos, 65°C durante 2 segundos y 74°C durante 30 segundos en un ciclo.
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se purificó un fragmento amplificado específico de 1.128 pb. El fragmento de ADN se sometió a fosforilación 5'-terminal del ADN utilizando Megalabel (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recuperó el fragmento de ADN a partir de la solución de reacción utilizando el método de precipitación con etanol y se disolvió en 10 μl de agua estéril.
Separadamente se disolvieron 3 jg de plásmido pBluescript II KS(+) (fabricado por Stratagene) en 35 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 16 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por Takara Shuzo) para la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. A la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65°C durante 30 minutos para desfosforilar de esta manera el extremo del ADN. La solución de reacción se extrajo con fenol/cloroformo, seguido de la precipitación con etanol y el fragmento de ADN recuperado se disolvió en 100 μl de agua estéril.
Cada 4 μl de fragmento amplificado preparado a partir de ADNc de hámster chino o de fragmento amplificado (1.192 pb) preparado a partir de ADNc de rata se mezclaron con 1 μl del fragmento EcoRV-EcoRV (aproximadamente 3,0 kb) preparado a partir del plásmido pBluescript II KS(+) y 5 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) para la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli XL1-Blue y se aislaron las muestras de ADN plasmídico respectivas de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos.
La secuencia de nucleótidos de cada ADNc insertado en el plásmido se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que la totalidad de los ADNc insertados de los que se habían determinado las secuencias mediante el método codificaban las secuencias completas de ORF de la p-actina de hámster chino o de p-actina de rata. Entre ellos, se seleccionaron muestras de ADN plasmídico que no contenía ningún error en absoluto mediante PCR en las secuencias. En la presente memoria, los plásmidos se denominan CHAc-pBS e YBAc-pBS.
(4) Preparación de estándar de FUT8 y control interno
Con el fin de medir el nivel de transcripción de ARNm del gen de FUT8 en cada célula, como plásmidos, CHFT8-pCR2.1 o YBFT8-pCR2.1, en los que los fragmentos parciales de ADNc preparados en el ítem (2) de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata, respectivamente, se digirieron con el enzima de restricción EcoRI, y los ADNc lineales obtenidos se utilizaron como estándares para la preparación de una curva de calibración. CHFT8d-pCR2.1 e YBFT8d-pCR2.1, obtenidos de CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1, mediante la deleción de 203 pb entre ScaI e HindIII, una secuencia de nucleótidos interna de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata, respectivamente, se digirieron con el enzima de restricción EcoRI y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándares internos para la determinación de la cantidad de FUT8. Los detalles de los mismos se proporcionan a continuación.
Se prepararon los estándares de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata de la manera siguiente. En 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2 μg del plásmido CHFT8-pCR2.1 y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Separadamente, se disolvieron 2 μg de plásmido YBFT8-pCR2.1 en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Sometiendo una porción de cada una de las soluciones de reacción a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% se confirmó que un fragmento EcoRI-EcoRI (aproximadamente 1 kb) que contenía cada uno de los fragmentos parciales de ADNc de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata se había separado de los plásmidos CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1 mediante las reacciones de digestión con enzima de restricción. Se diluyó cada una de las soluciones de reacción con 1 μg/ml de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma), proporcionando concentraciones de 0,02 fg/μl, 0,2 fg/μl, 1 fg/μl, 2 fg/μl, 10 fg/μl, 20 fg/μl y 100 fg/μl y se utilizó como estándares de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata.
Se prepararon los estándares internos de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata de la manera siguiente (figura 22). Se preparó una solución de reacción [tampón KOD n° 1 (fabricado por Toyobo), 0,2 mmoles/l de dNTP, MgCh 1 mmol/l, cebadores específicos génicos 0,4 μmoles/l (SEC ID n° 11 y n° 12) y DMSO al 5%] que contenía 5 ng de CHFT8-pCR2.1 o YBFT8-pCR2.1 y se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa KOD (fabricado por Toyobo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 4 minutos y los posteriores 25 ciclos de calentamiento a 98°C durante 15 segundos, 65°C durante 2 segundos y 74°C durante 30 segundos en un ciclo. Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se purificó un fragmento amplificado específico de aproximadamente 4,7 kb. El extremo 5'-terminal de ADN se fosforiló utilizando Megalabel (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante y después se recuperó el fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 50 μl de agua estéril. Se mezcló el fragmento de ADN obtenido (5 μl, aproximadamente 4,7 kb) y 5 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de autociclización a 16°C durante 30 minutos.
Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5a y se aislaron las muestras de ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. La secuencia de nucleótidos de cada ADN plasmídico se determinó utilizando un aparato DNA Sequencer 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) y se confirmó que se había delecionado una secuencia de nucleótidos interna de 203 pb entre ScaL e HindIII de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata. Los plásmidos obtenidos se denominaron CHFT8d-pCR2.1 o YBFT8d-pCR2.1, respectivamente.
A continuación, se disolvieron 2 μg de plásmido CHFT8d-pCR2.1 en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Separadamente, se disolvieron 2 μg de plásmido YBFT8d-pCR2.1 en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 24 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Una parte de cada una de las soluciones de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% se confirmó que un fragmento EcoRI-EcoRI (aproximadamente 800 pb) que contenía un fragmento del que se habían delecionado 203 pb de las secuencias de nucleótidos internas de los fragmentos parciales de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata, se separó de los plásmidos CHFT8d-pCR2.1 o YBFT8d-pCR2.1 mediante reacciones de digestión con enzima de restricción. Se prepararon diluciones de 2 fg/μl a partir de las soluciones de reacción utilizando 1 μg/ml de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma) y se utilizó como controles internos de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata.
(5) Preparación de estándar de p-actina y control interno
Con el fin de medir el nivel de transcripción del ARNm del gen p-actina en diversas células hospedadoras, los plásmidos CHAc-pBS e YBAc-pBS, en los que la longitud completa del ORF de cada ADNc de p-actina de hámster chino y p-actina de rata preparado en el ítem (3) se habían insertado en pBluescript II KS(+), respectivamente, se digirieron con los enzimas de restricción HindIII y PstI y los enzimas de restricción HindIII y KpnI, respectivamente, y los ADN lineales digeridos se utilizaron como estándares para la preparación de una curva de calibración. CHAcdpBS e YBAcd-pBS, obtenidos de CHAc-pBS e YBAc-pBS, mediante la deleción de 180 pb entre DraIII y DraIII de una secuencia de nucleótidos interna de p-actina de hámster chino y de p-actina de rata se digirieron con los enzimas de restricción HindlII y PstI y los enzimas de restricción HindlII y Kpnl, respectivamente, y los ADN lineales digeridos se utilizaron como estándares internos para la determinación de la cantidad de p-actina. Los detalles de los mismos se proporcionan a continuación.
Se prepararon los estándares de p-actina de hámster chino y de p-actina de rata de la manera siguiente. En 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2 μg del plásmido CHAc-pBS y se añadieron 25 unidades del enzima de restricción HindlII (fabricado por Takara Shuzo) y 20 unidades de PstI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Separadamente se disolvieron 2 μg del plásmido YBAc-pBS en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron a lo anterior 25 unidades del enzima de restricción HindlII (fabricado por Takara Shuzo) y 25 unidades de Kpnl (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Una parte de cada una de las soluciones de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se confirmó que se separaba un fragmento HindIII-PstI y un fragmento HindIII-KpnI (de aproximadamente 1,2 kb) que contenía el ORF de longitud completa de cada ADNc de la p-actina de hámster chino y de la p-actina de rata, a partir de los plásmidos CHAcpBS e YBAc-pBS mediante las reacciones de digestión con los enzimas de restricción. Se diluyó cada una de las soluciones de reacción con 1 μg/ml de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma), proporcionando concentraciones de 2 pg/μl, 1 pg/μl, 200 fg /μl, 100 fg /μl y 20 fg /μl y se utilizaron como estándares de p-actina de hámster chino y/o de β-actina.
Se prepararon los estándares internos de p-actina de hámster chino y de p-actina de rata de la manera siguiente (figura 23). En 100 μl de NEBuffer 3 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 ng/μl, 1 μg/μl, 200 fg/μl, 100 fg /μl and 20 fg /μl l de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2 μg del plásmido CHAcpBS y se añadieron 10 unidades del enzima de restricción DraIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Se recuperaron fragmentos de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se convirtieron los extremos de ADN en extremos romos utilizando el kit de generación de extremos romos de ADN (fabricado por Takara Shuzo) siguiendo las instrucciones del fabricante y después se dividió la solución de reacción en dos partes iguales. En primer lugar, a una parte de la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65°C durante 30 minutos para desfosforilar los extremos del ADN. El fragmento de ADN se recuperó llevando a cabo el tratamiento de desfosforilación, el tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y el tratamiento de precipitación con etanol y después se disolvió en 10 μl de agua estéril. La parte restante de la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1 kb que contenía el fragmento parcial de ORF de la p-actina de hámster chino.
Se mezcló el fragmento DraIII-DraNI desfosforilado (4,5 μl), 4,5 μl del fragmento DraIII-DraIII de aproximadamente 1,1 kb y 5 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5a y se aislaron los ADN plasmídicos de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. La secuencia de nucleótidos de cada ADN plasmídico se determinó utilizando un aparato DNA Sequencer 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) y se confirmó que se había delecionado una secuencia DraIII-DraNI de la p-actina de hámster chino de 180 pb insertada en el plásmido. El plásmido se denominó CHAcd-pBS.
Además, se preparó un plásmido en el que se había delecionado un fragmento DraIII-DraIII de 180 pb de la pactina de rata mediante las mismas etapas de CHAcd-pBS. El plásmido se denominó YBAcd-pBS.
A continuación, se disolvieron 2 jg del plásmido CHAcd-pBS en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron a lo anterior 25 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo) y 20 unidades de PstI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Separadamente se disolvieron 2 jg del plásmido YBAcd-pBS en 40 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron a lo anterior 25 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo) y 24 unidades de KpnI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 3 horas. Una parte de cada una de las soluciones de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se confirmó que había separado un fragmento HindIII-PstI y un fragmento HindIII-KpnI (de aproximadamente 1,0 kb) que contenía un fragmento en el que se había delecionado la secuencia de nucleótidos interna de 180 pb del ORF de longitud completa de cada ADNc de p-actina de hámster chino y de p-actina de rata, de los plásmidos CHAcdpBS e YBAcd-pBS mediante las reacciones de digestión con los enzimas de restricción. Se prepararon diluciones de 200 fg /μl a partir de las soluciones de reacción utilizando 1 jg/m l de ARNt de levadura de panadería (fabricada por Sigma) y se utilizaron como controles internos de p-actina de hámster chino y de p-actina de rata.6
(6) Determinación del nivel de transcripción mediante PCR competitiva
Se llevó a cabo una PCR competitiva utilizando el ADN de control interno de FUT8 preparado en el ítem (4) y el ADNc derivado de la célula hospedadora obtenido en el ítem (1) como moldes, el valor determinado del producto de transcripción FUT8 en la línea de células hospedadoras se calculó a partir del valor relativo de la cantidad de producto amplificado obtenido de cada molde. Por otra parte, debido a que se considera que el gen p-actina se transcribe continuamente en cada célula y su nivel de transcripción es aproximadamente el mismo en las células, se determinó el nivel de transcripción del gen p-actina como medida de la eficiencia de la reacción de síntesis del ADNc en cada línea de células hospedadoras. Es decir, se llevó a cabo una PCR utilizando el ADN de control interno de p-actina preparado en el ítem (5) y el ADNc derivado de la célula hospedadora obtenido en el ítem (1) como moldes, el valor determinado del producto de transcripción de p-actina en la línea de células hospedadoras se calculó a partir del valor relativo de la cantidad de producto amplificado obtenido de cada molde. Los detalles de los mismos se proporcionan a continuación.
Se determinó el producto de transcripción de FUT8 mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se diseñó un grupo de cebadores específicos de secuencia (mostrado en las SEC ID n° 13 y n° 14) comunes a las secuencias internas de las secuencias parciales de ORF de FUT8 de hámster chino y de FUT8 de rata obtenidos en el ítem (2).
A continuación, se llevó a cabo la PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 μl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricada por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP, 0,5 jmoles/l de cebadores específicos de gen (SEC ID n° 13 y n° 14) y DMSO al 5%] que contenía 5 μl de solución de ADNc diluida 50 veces, preparada a partir de cada una de las líneas de células hospedadoras respectivas en el ítem (1) y 5 μl (10 fg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 3 minutos y los posteriores 32 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto en un ciclo.
Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 5 μl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg o 1 pg) del plásmido de estándar de FUT8 obtenido en el ítem (4) en lugar de cada ADNc derivado de línea de célula hospedadora y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de FUT8.
Se determinó el producto de transcripción de p-actina mediante el procedimiento siguiente. En primer lugar, se diseñaron dos juegos de los cebadores específicos de gen respectivos comunes a las secuencias internas de las longitudes completas de ORF de la p-actina de hámster chino y la p-actina de rata obtenidos en el ítem (3) (se muestran los primeros en las SEC ID n° 15 y n° 16, y los segundos se muestran en las SEC ID n° 17 y n° 18).
A continuación, se llevó a cabo la PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 μl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP, 0,5 jmoles/l de cebadores específicos de gen (SEC ID n° 15 y n° 16 o SEC ID n° 17 y n° 18) y DMSO al 5%] que contenía 5 μl de solución de ADNc diluida 50 veces, preparada a partir de las líneas de célula hospedadora respectivas en el ítem (1) y 5 μl (1 μg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 3 minutos y los posteriores 17 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos en un ciclo.
Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 5 μl (10 μg, 5 μg, 1 μg, 500 fg o 100 fg) del plásmido de estándar de p-actina obtenido en el ítem (5) en lugar de cada ADNc derivado de línea de célula hospedadora y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de p-actina.
Tabla 3
T ñ ( b) d l d d lifi ió
Figure imgf000067_0001
F: cebador directo , R: cebador inverso
Mediante la realización de la PCR con el juego de cebadores indicado en la Tabla 3 puede amplificarse un fragmento de ADN que presenta el tamaño mostrado en la columna de dianas de la Tabla 3 a partir de cada producto de transcripción génica y cada estándar y puede amplificarse un fragmento de ADN que presenta un tamaño mostrado en la columna de competidores de la Tabla 3 a partir de cada control interno.
Se sometió una porción de 7 μl de cada una de las soluciones tras la PCR a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% y después se tiñó el gel sumergiéndolo durante 30 minutos a concentración 1x de tinción de gel de ácidos nucleicos SYBR Verde I (fabricada por Molecular Probes). La cantidad de fragmento de ADN amplificado se midió mediante el cálculo de la intensidad de luminiscencia de cada ADN amplificado utilizando un aparato Fluoro-imager (FluorImager SI, fabricado por Molecular Dynamics).
La cantidad de producto amplificado formado mediante PCR utilizando un plásmido estándar como molde se midió mediante el método, y se preparó una curva de calibración representando gráficamente los valores medidos frente a las cantidades de plásmido estándar. Utilizando la curva de calibración se calculó la cantidad de ADNc de un gen de interés en cada estirpe celular a partir de la cantidad de producto amplificado al utilizar como molde cada ADNc derivado de estirpe celular de expresión, y se definió la cantidad como el nivel de transcripción de ARNm en cada estirpe celular.
La cantidad de producto de transcripción FUT8 en cada estirpe celular huésped al utilizar una secuencia de FUT8 de rata en el estándar y el control interno se muestra en la figura 24. Durante todo el periodo de cultivo la línea de células CHO mostró un nivel de transcripción 10 veces o más superior al de la estirpe celular YB2/0. También se observó la tendencia al utilizar una secuencia de FUT8 de hámster chino en el estándar y el control interno.
Además, se muestran los niveles de transcripción de FUT8 en la Tabla 4 como valores relativos respecto a la cantidad de producto de transcripción de p-actina. Durante todo el periodo de cultivo el nivel de transcripción de FUT8 en la línea de células YB2/0 era de aproximadamente 0,1% el de la p-actina, mientras que era de 0,5% a 2% en la línea de células CHO.
Los resultados muestran que la cantidad de producto de transcripción de FUT8 en la línea de células YB2/0 era significativamente inferior que la observada en la línea de células CHO.
Tabla 4
Figure imgf000068_0001
Ejemplo 10
Determinación del producto de transcripción del gen a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) en la estirpe celular productora de anticuerpos híbridos anti-gangliósido GD3:
(1) Preparación de ADNc de cadena sencilla a partir de diversas estirpes celulares productoras de anticuerpos
Se preparó ADNc de cadena sencilla a partir de las estirpes celulares DCHI01-20 y 61-33 productoras de anticuerpo híbrido anti-gangliósido GD3 de la manera siguiente. La DCHI01-20 es un clon transformante derivado de las células CHO/DG44 descritas en el ítem 2(2) del Ejemplo 1. Además, 61-33 es un clon obtenido llevando a cabo la adaptación sin suero de las células transformantes 7-9-51 derivadas de YB2/0 (FERM n° BP-6691, depósito internacional de organismos de patente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón) y llevando a cabo después el aislamiento de células individuales mediante dos diluciones limitantes.
Las células DCHI01-20 se suspendieron en medio EXCELL 302 (fabricado por Jrh Biosciences) complementado con 3 mmoles/l de L-GLN (fabricado por Life Technologies) y Pluronic F-68 al 0,3% (fabricado por Life Technologies) y concentrado de ácidos grasos al 0,5% (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en un matraz T75 para el cultivo celular de suspensión (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Además, las células 61-33 se suspendieron en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con fracción V de suero de feto bovino al 0,2% (fabricado por Life Technologies) (en adelante denominado "BSA") y se inocularon 15 ml de la suspensión en matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner) a una densidad de 2x105 células/ml. Se cultivaron a 37°C en un incubador con 5% de CO2 y se recuperaron 1x107 de las células hospedadoras respectivas en el día 1, 2, 3, 4 y 5 después del cultivo para extraer el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricado por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37°C durante 3o minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.
En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 jg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación Superscript™ para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. La solución de reacción se diluyó 50 veces con agua y se almacenó a -80°C hasta la utilización.
(2) Determinación del nivel de transcripción de cada gen mediante PCR competitiva
Se determinó el nivel de transcripción de los genes en el ADNc derivado de la estirpe celular productora de anticuerpos obtenida en el ítem (1) mediante PCR competitiva de acuerdo con el Ejemplo 9(6).
Se determinó el nivel de transcripción de ARNm derivado de gen de FUT8 en cada una de las estirpes celulares productoras de anticuerpos mediante el procedimiento a continuación.
CHFT8-pCR2.1 e YBFT8-pCR2.1, como plásmidos en los que los fragmentos parciales de ADNc preparados en el Ejemplo 9(2) de FUT8 de hámster chino o FUT8 de rata, respectivamente, insertados en pCR2.1 fueron digeridos con el enzima de restricción EcoRI, y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándares para la preparación de una curva de calibración para determinar el nivel de transcripción de FUT8.
CHFT8d-pCR2.1 e YBFT8d-pCR2.1, obtenidos mediante la deleción de 203 pb entre Scal e HindlII de una secuencia de nucleótidos interna de FUT8 de hámster chino y FUT8 de rata, respectivamente, en el Ejemplo 9(4) se digirieron con el enzima de restricción EcoRI y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándares internos para la determinación de la cantidad de FUT8.
Se llevó a cabo la PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 μl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP, 0,5 pmoles/l de cebadores específicos de gen de FUT8 (SEC ID n° 13 y n° 14) y DMSO al 5%] que contenía 5 μl de solución de ADNc diluida 50 veces, preparada a partir de cada una de las líneas de células hospedadoras productoras de anticuerpos en el ítem (1) y 5 μl (10 fg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 3 minutos y los posteriores 32 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto en un ciclo.
Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 5 μl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg o 1 pg) del plásmido de estándar de FUT8 en lugar de cada ADNc derivado de línea de célula hospedadora productora de anticuerpos y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de FUT8. En este caso, se utilizó 1 jg/m l de un ARNt de levadura de panadería (fabricado por Sigma) para la dilución del plásmido estándar.
Por otra parte, debido a que se considera que el gen p-actina se transcribe de manera constante en cada célula y su nivel de transcripción es aproximadamente el mismo en las células, se determinó el nivel de transcripción del gen p-actina como índice de la eficiencia de la reacción de síntesis del ADNc en cada línea de células productora de anticuerpos.
CHAc-pBS e YBAc-pBS como plásmidos en los que la longitud completa del ORF de cada ADNc de p-actina de hámster chino y p-actina de rata preparadas en el Ejemplo 9(3) insertados en pBluescript II KS(+), respectivamente, fueron digeridos con los enzimas de restricción HindIII y KpnI, y las muestras de ADN lineal obtenidas se utilizaron como estándares en la preparación de una curva de calibración para determinar el nivel de transcripción de pactina.
CHAcd-pBS e YBAcd-pBS, obtenidos mediante la deleción de 180 pb entre DraI y DraI de una secuencia de nucleótidos interna de p-actina de hámster chino y p-actina de rata, respectivamente, en el Ejemplo 9(5) se digirieron con los enzimas de restricción HindIII y KpnI, y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándares internos para la determinación de p-actina.
Se llevó a cabo la PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 μl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP, 0,5 pmoles/l de cebadores específicos de gen de p-actina (SEC ID n° 17 y n° 18) y DMSO al 5%] que contenía 5 μl de solución de ADNc diluida 50 veces, preparada a partir de cada una de las líneas de células hospedadoras productoras de anticuerpos y 5 μl (1 pg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 3 minutos y los posteriores 17 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos en un ciclo. Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 10 μg, 5 μg, 1 μg, 500 fg o 100 fg) del plásmido de estándar de p-actina en lugar de cada ADNc derivado de línea de célula hospedadora productora de anticuerpos y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de p-actina. En este caso, se utilizó 1 μg/ml de un ARNt de levadura de panadería (fabricado por Sigma) para la dilución del plásmido estándar.
Mediante la realización de la PCR con el juego de cebadores indicado en la Tabla 3 puede amplificarse un fragmento de ADN que presenta el tamaño mostrado en la columna de dianas de la Tabla 3 a partir de cada producto de transcripción génica y cada estándar y puede amplificarse un fragmento de ADN que presenta un tamaño mostrado en la columna de competidores de la Tabla 3 a partir de cada control interno.
Se sometió una porción de 7 μl de cada una de las soluciones tras la PCR a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% y después se tiñó el gel sumergiéndolo durante 30 minutos a una concentración 1x de tinción de gel de ácidos nucleicos SYBR Verde I (fabricada por Molecular Probes). La cantidad de fragmento de ADN amplificado se midió mediante el cálculo de la intensidad de luminiscencia de cada ADN amplificado utilizando un aparato Fluoro-imager (FluorImager SI, fabricado por Molecular Dynamics).
La cantidad de producto amplificado formado mediante PCR utilizando un plásmido estándar como molde se midió mediante el método, y se preparó una curva de calibración representando gráficamente los valores medidos frente a las cantidades de plásmido estándar. Utilizando la curva de calibración se calculó la cantidad de ADNc de un gen de interés en cada estirpe celular a partir de la cantidad de producto amplificado al utilizar como molde cada ADNc derivado de estirpe celular productora de anticuerpos, y el valor se definió como el nivel de transcripción de ARNm en cada estirpe celular.
Además, se muestran los niveles de transcripción de FUT8 en la Tabla 5 como valores relativos respecto a la cantidad de producto de transcripción de p-actina. Durante todo el periodo de cultivo el nivel de transcripción de FUT8 en la línea de células YB2/0 productora de anticuerpos 61-33 era de aproximadamente 0,3% o menos del de la p-actina, mientras que era de 0,7% a 1,5% en la línea de células CHO productora de anticuerpos.
Los resultados muestran que la cantidad de producto de transcripción de FUT8 en la línea de células YB2/0 productora de anticuerpos era significativamente inferior que la observada en la línea de células productora de anticuerpos derivada de células CHO.
Tabla 5
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Ejemplo 11 (ejemplo comparativo)
Preparación de estirpe celular sobreexpresante de gen de a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de ratón
(1) Construcción de plásmido de expresión de a-1,6-fucos¡ltransferasa (FUT8) de ratón
Se extrajo el ARN total de 1x107 células de una célula NS0 de mieloma de ratón (RCB0213, Cell Bank at The Institute of Physical and Chemical Research) subcultivada utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) que contenía suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricada por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37°C durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril. En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 μg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación Superscript™ para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante.
Se preparó ADNc de FUT8 de ratón mediante el procedimiento siguiente (figura 25).
En primer lugar se diseñó un cebador directo específico para una secuencia que contenía un codón de inicio de traducción (mostrado en SEC ID n° 19) y un cebador inverso específico para una secuencia que contenía el codón de terminación de traducción (mostrado en SEC ID n° 20) a partir de una secuencia de ADNc de FUT8 de ratón (GenBank, AB025198).
A continuación, se prepararon 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP, DMSO al 4% y 0,5 jmoles/l de cebadores específicos (SEC ID n° 19 y SEC ID n° 20)] que contenía 1 μl del ADNc derivado de células NS0 y se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72°C durante 10 minutos.
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se purificó un fragmento amplificado específico de 1.728 pb. En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 μl del fragmento de ADNc para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) y se transformó E. coli DH5a con la solución de reacción. Se aislaron los ADN plasmídicos de acuerdo con un método conocido a partir de 6 clones con inserción de ADNc de entre las colonias resistentes a canamicina obtenidas.
La secuencia de nucleótidos de cada ADNc insertado en el plásmido se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que la totalidad de los ADNc insertados las secuencias de los cuales habían sido determinadas codificaba la secuencia total del ORF de la FUT8 de ratón. De entre ellas se seleccionó un ADN plasmídico que no contenía ningún error de lectura de bases en absoluto mediante PCR (se muestran la secuencia de ADN y la secuencia de aminoácidos en SEC ID n° 2 y n° 24, respectivamente). Además, se observó una inconsistencia de 3 bases debido a la sustitución de aminoácidos en la secuencia en comparación con la secuencia de FUT8 de ratón registrada en GenBank. En la presente memoria el plásmido se denomina mfFUT8-pCR2.1.
A continuación, se construyó el plásmido pBSmfFUT8 que contiene el ORF de secuencia completa de FUT8 de ratón de la manera siguiente (figura 26). En primer lugar se disolvió 1 jg de plásmido pBluescript II KS(+) (fabricado por Stratagene) en 35 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. A la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65°C durante 30 minutos para desfosforilar de esta manera los extremos del ADN. La solución de reacción se extrajo con fenol/cloroformo, seguido de la precipitación con etanol y el fragmento de ADN recuperado se disolvió en 10 μl de agua estéril.
Separadamente, se disolvió 1 jg de plásmido mfFUT8-pCR2.1 en 35 μl de NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. La solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb que contenía el ORF de secuencia completa del ADNc de FUT8 de ratón.
Se mezcló el fragmento EcoRI-EcoRI derivado del plásmido pBluescript II KS(+) obtenido (1 μl, 2,9 kb), 4 μl del fragmento EcoRI-EcoRI (1,7 kb) preparado a partir del plásmido mfFUT8-pCR2.1 y 5 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5a y se aislaron los ADN plasmídicos de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pBSmfFUT8.
Utilizando pBSmfFUT8 y pAGE249, se construyó el vector de expresión pAGEmfFUT8 de FUT8 de ratón mediante el procedimiento a continuación (figura 27). El plásmido pAGE249 es un derivado de pAGE248 [J. Biol. Chem.
269:14730, 1994], que es un vector del que se ha eliminado un fragmento SphI-SphI (2,7 kb) que contenía el gen dihidrofolato reductasa (dhfr) en pAGE248.
En 50 μl de tampón universal H (fabricado por Takara Shuzo), se disolvió 1 jg de plásmido pAGE249 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SalI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, a la solución de reacción se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65°C durante 30 minutos para desfosforilar los extremos del ADN. La solución de reacción se extrajo con fenol/cloroformo, seguido de la precipitación con etanol y el fragmento de ADN recuperado se disolvió en 10 μl de agua estéril.
Separadamente, en 50 μl de tampón universal H (fabricado por Takara Shuzo), se disolvió 1 jg de plásmido pBSmfFUT8 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SalI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. La reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,7 kb que contenía el ORF de secuencia completa del ADNc de FUT8 de ratón.
Se mezcló el fragmento BamHI-SalI (1 μl, 6,5 kb) derivado del plásmido pAGE249, 4 μl del fragmento BamHI-SalI (1,7 kb) preparado a partir del plásmido pBSmfFUT8 y 5 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo), seguido de una reacción de ligación a 16°C durante 3o minutos. Utilizando la solución de reacción se transformó E. coli DH5a y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pAGEmfFUT8.
(2) Preparación de estirpe celular sobreexpresante de gen de a-1,6-fucos¡ltransferasa (FUT8) de ratón
Se obtuvo una estirpe celular expresante de gen de FUT8 estable mediante la introducción del vector de expresión de FUT8 de ratón pAGEmfFUT8 construido en el ítem (1) en 61-33. El clon 61-33 es un clon obtenido mediante la adaptación sin suero de la célula transformante 7-9-51 (FERM n° BP-6691, depósito internacional de organismos de patente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) derivado de una célula YB2/0 de alta producción de un anticuerpo híbrido anti-gangliósido GD3 y realizando después el aislamiento de células individuales mediante dos diluciones limitantes.
El plásmido pAGEmfFUT8 se transfirió al interior de 61-33 mediante el procedimiento siguiente, mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990]. En primer lugar, se disolvieron 3o μg de plásmido pAGEmfFUT8 en 600 μl de NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 100 unidades del enzima de restricción FspI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas, obteniendo un fragmento lineal. La solución de reacción se sometió a precipitación con etanol y el plásmido lineal recuperado se preparó en forma de una solución acuosa 1 jg / μl . A continuación, se suspendió 61-33 en un tampón K-PBS (KCl 137 moles/l, NaCl 2,7 moles/l, Na2 HPO48,1 moles/l, KH2 PO4 1,5 moles/l, MgCh 4,0 moles/l), proporcionando una densidad de 2x107 células/ml y se mezclaron 200 μl de la suspensión celular (4x106 células) con 10 μl (10 jg ) del plásmido lineal. La mezcla de células-ADN se transfirió a una cubeta de Gene Pulser (distancia entre electrodos: 2 mm) (fabricado por Bio-Rad) y después se llevó a cabo la electroporación utilizando un aparato de fusión celular Gene Pulser (fabricado por Bio-Rad) a un voltaje de pulso de 0,2 kV y 250 jF de capacidad eléctrica. La suspensión celular se mezcló con 10 ml de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies) y se dispensó en porciones de 100 μl en una placa de 96 pocillos para la utilización de las células en suspensión (fabricado por Greiner). Tras el cultivo de las mismas a 37°C durante 24 horas en 5% de CO2 , se extrajeron 50 μl del sobrenadante de cultivo y se dispensaron 100 μl de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Tecnologies). Se cultivaron durante 3 semanas, repitiendo la etapa de intercambio de medio a intervalos de 3 a 4 días y se obtuvieron 14 estirpes celulares que mostraban resistencia a la higromicina.
Por otra parte, se preparó una estirpe celular de control negativo mediante la introducción del plásmido pAGE249 como vector parental de pAGEmfFUT8 en 61-33. Siguiendo el procedimiento anteriormente indicado, se convirtieron 10 jg del plásmido pAGE249 en la forma lineal con el enzima de restricción FspI y se introdujeron en 4x106 células de 61-33 mediante electroporación. Se mezclaron las células con 15 ml de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies), se transfirieron a un matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner) y después se cultivaron a 37°C durante 24 horas en 5% de CO2. Tras el cultivo de las mismas, una mitad del sobrenadante de cultivo (7,5 ml) se extrajo mediante centrifugación a 800 rpm durante 4 minutos y las células se suspendieron en 7,5 ml de medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies) y se transfirió a un matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner). Se cultivaron durante 3 semanas, repitiendo la etapa de intercambio de medio a intervalos de 3 a 4 días y se obtuvo una estirpe celular resistente a higromicina.
(3) Análisis del nivel de expresión del gen de a-1.6-fucosiltransferasa (FUT8) de estirpes celulares sobreexpresantes del gen
Utilizando 6 estirpes celulares seleccionadas opcionalmente de entre 14 estirpes celulares sobreexpresantes de FUT8 de ratón de 61-33 en el ítem (2) y la estirpe celular de control negativo, se compararon los niveles de expresión de FUT8 mediante RT-PCR competitiva.
Se suspendió en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) cada una de dichas estirpes celulares sobreexpresantes, complementado con 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricado por Wako Pure Chemical Industries), suero de feto bovino al 5% dializado (fabricado por Life Technologies) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies), proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y después se transfirió a un matraz T75 para el cultivo celular en suspensión (fabricado por Greiner). Tras el cultivo de las mismas a 37°C durante 24 horas en 5% de CO2 , se recuperaron 1x107 células intactas para la extracción del ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 0,5 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricada por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37°C durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.
En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 2,5 jg del ARN total obtenido mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación Superscript™ para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. La solución de reacción se diluyó 50 veces con agua y se determinó el nivel de transcripción de cada gen mediante PCR competitiva según el Ejemplo 9(6).
Se determinó el nivel de transcripción de ARNm derivado de gen de FUT8 en cada una de las estirpes celulares mediante el procedimiento a continuación.
YBFT8-pCR2.1, como plásmido en el que se había insertado un fragmento parcial de ADNc preparado en el Ejemplo 9(2) de FUT8 de rata en pCR2.1, fue digerido con el enzima de restricción EcoRI, y el ADN lineal obtenido se utilizó como estándar para la preparación de una curva de calibración para determinar el nivel de transcripción de FUT8.
Entre los YBFT8d-pCR2.1 preparados en el Ejemplo 9(4), el YBFT8d-pCR2.1 obtenido mediante la deleción de 203 pb entre Scal e HindlII de una secuencia de nucleótidos interna de FUT8 de rata se digirió con el enzima de restricción EcoRI y los ADN lineales obtenidos se utilizaron como estándar interno para la determinación de FUT8.
Se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 μl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricada por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de dNTP, 0,5 pmoles/l de cebadores específicos de gen (s Ec ID n° l3 y n° 14) y DMSO al 5%] que contenía 5 μl de solución de ADNc diluida 50 veces, preparada a partir de cada una de las líneas de células hospedadoras respectivas anteriormente y 5 μl (10 fg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 3 minutos y los posteriores 32 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto en un ciclo.
Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 5 μl (0,1 fg, 1 fg, 5 fg, 10 fg, 50 fg, 100 fg, 500 fg o 1 pg) del plásmido estándar de FUT8 en lugar de cada ADNc derivado de línea de célula hospedadora y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de FUT8. En este caso, se utilizó 1 jg/m l de un ARNt de levadura de panadería (fabricado por Sigma) para la dilución del plásmido estándar.
Por otra parte, debido a que se considera que el gen p-actina se transcribe de manera constante en cada célula y su nivel de transcripción es aproximadamente el mismo en todas las células, se determinó el nivel de transcripción del gen p-actina como índice de la eficiencia de la reacción de síntesis del ADNc en cada estirpe celular de expresión.
YBAc-pBS, plásmido en el que se había insertado el ORF de longitud completa del ADNc de la p-actina de rata en pBluescript II KS(+), preparado en el Ejemplo 9(3), fue digerido con los enzimas de restricción HindlII y Kpnl, y el ADN lineal obtenido se utilizó como estándar en la preparación de una curva de calibración para determinar el nivel de transcripción del gen de la p-actina.
YBAcd-pBS, obtenido mediante la deleción de 180 pb entre DraI y DraI de una secuencia de nucleótidos interna de la p-actina de rata, fue digerida con los enzimas de restricción HindIII y KpnI, y el ADN lineal obtenido se utilizó como estándar interno para la determinación de la cantidad de p-actina.
Se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) en 20 μl de volumen total de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mmoles/l, cebadores específicos de p-actina 0,5 μmoles/l (s Ec ID n° 17 y n° 18) y DMSO al 5%] que contenía 5 μl de solución de ADNc diluida 50 veces preparada a partir de cada una de las estirpes celulares de expresión y 5 μl (1 pg) del plásmido como control interno. La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 3 minutos y los posteriores 17 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 65°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos en un ciclo.
Además, se llevó a cabo una PCR en una serie de reacción en la que se añadieron 10 pg, 5 pg, 1 pg, 500 fg o 100 fg) del plásmido de estándar de p-actina en lugar de cada ADNc derivado de estirpe celular de expresión y se utilizó en la preparación de una curva de calibración para el nivel de transcripción de p-actina. En este caso, se utilizó 1 jg/m l de un ARNt de levadura de panadería (fabricado por Sigma) para la dilución del plásmido estándar.
Mediante la realización de la PCR con el juego de cebadores indicado en la Tabla 3 pudo amplificarse un fragmento de ADN que presentaba el tamaño mostrado en la columna de dianas de la Tabla 3 a partir de cada producto de transcripción génica y cada estándar y puede amplificarse un fragmento de ADN que presenta un tamaño mostrado en la columna de competidores de la Tabla 3 a partir de cada control interno.
Cada una de las soluciones (7 μl) tras la PCR se sometió a una electroforesis en gel de agarosa al 1,75% y después se tiñó el gel sumergiéndolo durante 30 minutos a concentración 1x de tinción de gel de ácidos nucleicos SYBR Verde I (fabricada por Molecular Probes). La cantidad de fragmento de ADN amplificado se midió mediante el cálculo de la intensidad de luminiscencia de cada ADN amplificado utilizando un aparato Fluoro-imager (FluorImager SI, fabricado por Molecular Dynamics).
La cantidad de producto amplificado formado mediante PCR utilizando un plásmido estándar como molde se midió mediante el método, y se preparó una curva de calibración representando gráficamente los valores medidos frente a las cantidades de plásmido estándar. Utilizando la curva de calibración se calculó la cantidad de ADNc de un gen de interés en cada estirpe celular a partir de la cantidad de producto amplificado al utilizar como molde cada ADNc derivado de estirpe celular de expresión, y se definió la cantidad como el nivel de transcripción de ARNm en cada estirpe celular.
La figura 28 muestra los niveles de transcripción de FUT8 como valores relativos respecto a la cantidad de producto de transcripción de p-actina. Las tres estirpes celulares mfFUT8-1, mfFUT8-2 y mfFUT8-4 y la estirpe celular en la que se ha introducido pAGE249 eran estirpes celulares que mostraban un nivel de transcripción de FUT8 relativamente pequeño, que era equivalente a 0,3% a 10% del nivel de transcripción de p-actina. Por otra parte, las otras tres estirpes celulares mfFUT8-3, mfFUT8-6 y mfFUT8-7 eran estirpes celulares que mostraban un nivel de transcripción de FUT8 elevado, que era equivalente a 20% a 40% del nivel de transcripción de p-actina.
(4) Purificación del anticuerpo producido por una estirpe celular sobreexpresante de gen de a-1,6-fucos¡ltransferasa (FUT8)
Cada una de las seis estirpes celulares sobreexpresantes del gen de FUT8 y una estirpe celular de control negativo obtenidos en el ítem (2) se suspendió en medio de hibridoma-SFM (fabricado por Life Technologies) complementado con 200 nmoles/l de MTX, 0,5 mg/ml de higromicina B (fabricada por Wako Pure Chemical Industries) y BSA al 0,2% (fabricado por Life Technologies), proporcionando una densidad de 2x105 células/ml y después se inocularon 100 ml en total de la suspensión en tres matraces T225 para la utilización en el cultivo celular en suspensión (fabricados por Iwaki). Tras cultivarlas a 37°C durante 7 a 9 días en un incubador con 5% de CO2 , se contó el número de células intactas con el fin de confirmar que la viabilidad de las mismas era prácticamente igual (diferentes en 30% o menos) y después se recuperó cada suspensión celular. Se centrifugó cada una de las suspensiones celulares a 3.000 rpm a 4°C durante 10 minutos y el sobrenadante recuperado se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 1 hora y después se filtró utilizando una unidad de filtración PES (fabricada por Nalgene) que presentaba un diámetro de poro de 0,22 jm y una capacidad de 150 ml.
Se empaquetó un Prosep-A HighCapacity (fabricado por bioProcessing) en una columna de 0,8 cm de diámetro hasta un grosor de 2 cm y se lavó con 10 ml de tampón citrato 0,1 moles/l (pH 3,0) y 10 moles de tampón de glicina/NaOH 1 mol/l-NaCl 0,1 moles/l (pH 8,6) en ese orden para conseguir el equilibrado del portador. A continuación, se pasaron 100 ml de cada uno de los sobrenadantes de cultivo por la columna y se lavaron con 50 ml de tampón de glicina/NaOH 1 mol/l-NaCl 0,15 moles/l (pH 8,6). Tras lavarlas, el anticuerpo adsorbido en Prosep­ A se eluyó utilizando 2,5 ml de tampón citrato 0,1 moles/l (pH 3,0), el eluido se fraccionó en porciones de 500 μl y cada fracción se neutralizó mediante la mezcla con 100 μl de Tris-HCl 2 moles/l (pH 8,5). Se seleccionaron dos fracciones que contenían el anticuerpo a concentración elevada (1,2 ml en total) mediante el método de BCA [Anal. Biochem. 150:76, 1985], se agruparon y después se dializaron frente a tampón citrato 10 moles/l (pH 6,0) a 4°C durante un día y noche completos. Tras la diálisis, se recuperó la solución de anticuerpo y se sometió a esterilización mediante filtración utilizando un Millex GV de 0,22 jm de tamaño de poro (fabricado por Millipore).
(5) Actividad citotóxica in vitro (actividad ADCC) del anticuerpo producido por una estirpe celular sobreexpresante de gen de a-1.6-fucosiltransferasa (FUT8) de ratón
Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro de los anticuerpos anti-GD3 purificados en el ítem (4), se midió la actividad ADCC utilizando una célula positiva para GD3, la estirpe celular en cultivo de melanoma humano G-361 (RCB0991, Cell Bank at The Institute of Physical and Chemical Research).
Las células G-361 subcultivadas en medio RPMI1640 (fabricado por Life Technologies) que contenía suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) (en adelante denominado "RPMI1640-FBS(10)") se suspendieron en 500 μl de r Pm I1640-FBS(10) a una densidad de 1x106 células y se añadieron 3,7 MBq de Na251CrO4 al mismo, seguido del cultivo a 37°C durante 30 minutos para el marcaje de las células con el isótopo radioactivo. Tras la centrifugación a 1.200 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y las células diana se suspendieron en 5 ml de RPMI1640-FBS(10). Se repitió la etapa de lavado tres veces y después la suspensión celular se incubó durante 30 minutos sobre hielo para la disociación espontánea de la sustancia radioactiva. Se repitió nuevamente dos veces la etapa de lavado y después las células se suspendieron en 5 ml de RPMI1640-FBS(10), preparando de esta manera 2x105 células/ml de una suspensión de células diana.
Por otra parte, se recolectaron 30 ml de sangre periférica de una persona sana y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricada por Shimizu Pharmaceutical) y después se mezclaron con 30 ml de solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Pharmaceutical). Tras la mezcla, se aplicaron suavemente como capa superior 10 ml de la mezcla sobre 4 ml de Lymphoprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) y se centrifugó a temperatura ambiente a 2.000 rpm durante 30 minutos. Las fracciones de células mononucleares separadas se recolectaron de los tubos de centrifugación, se agruparon y después se suspendieron en 30 ml de RPMI1640-FBS(10). Tras la centrifugación a temperatura ambiente a 1.200 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y las células se suspendieron en 20 ml de RPMI1640-FBs (10). Se repitió dos veces la etapa de lavado y después se prepararon 2x106 células/ml de una suspensión de células efectoras utilizando RPMI1640-FBS(10).
La suspensión de células diana se dispensó a razón de 50 μl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se dispensó la suspensión de células efectoras a razón de 100 μl (2x105 células/pocillo) en cada pocillo, ajustando de esta manera la proporción de células efectoras a célula diana a 20: 1. A continuación, utilizando un tampón citrato 10 M (pH 6,0), se preparó una serie de soluciones diluidas de 0,01 μg/ml, 0,1 μg/ml, 1 μg/ml y 10 μg/ml de cada anticuerpo anti-GD3 obtenido en el ítem (4), y las soluciones diluidas se dispensaron a razón de 50 μl en los pocillos, proporcionando concentraciones finales de 0,0025 μg/ml, 0,025 μg/ml, 0,25 μg/ml y 2,5 μg/ml, respectivamente. Tras llevar a cabo la reacción a 37°C durante 4 horas en 5% de CO2 , la placa se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 minutos. En un tubo de RIA de 12 mm de diámetro (fabricado por Iwaki), se transfirieron 50 μl del sobrenadante en cada pocillo y se midió la cantidad del 51Cr disociado utilizando el contador MINAX-y auto-gamma 5550 (fabricado por Packard).
Además, se estimó la cantidad de 51Cr disociado espontáneamente llevando a cabo la misma reacción en una mezcla de reacción a la que se añadieron 150 μl de RPMI1640-FBS(10) en lugar de la suspensión de células efectoras y la solución de anticuerpo. Se estimó la cantidad de 51Cr total disociado llevando a cabo la misma reacción en una mezcla de reacción a la que se añadieron 100 μl de ácido clorhídrico 1 N y 50 μl de RPMI1640-FBS(10) en lugar de la suspensión de células efectoras y la solución de anticuerpo. Utilizando dichos valores se calculó la actividad de ADCC basándose en la fórmula (II) indicada en el ítem 2(3) del Ejemplo 2.
La figura 29 muestra la actividad de ADCC de cada uno de los anticuerpos anti-GD3 para la célula G-361. Tres estirpes celulares, mfFUT8-1, mfFUT8-2 y mfFUT8-4, con nivel de expresión de FUT8 bajo, tal como se muestra en la figura 28, mostraban una actividad de ADCC potente, equivalente a la de la estirpe celular de control negativo, en la que se había introducido pAGE249. Por otra parte, otras tres estirpes celulares, mfFUT8-3, mfFUT8-6 y mfFUT8-7, con nivel de expresión de FUT8 elevado, tal como se muestra en la figura 28, mostraban una actividad de ADCC reducida, equivalente a la del anticuerpo anti-GD3 producido en células CHO. Basándose en estos resultados se demostró que la actividad de ADCC de los anticuerpos producidos podía controlarse mediante la regulación del nivel de expresión de FUT8 en las células hospedadoras.
(6) Análisis de cadenas de azúcar del anticuerpo producido por una estirpe celular sobreexpresante de gen de a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de ratón
Se analizaron las cadenas de azúcar de los anticuerpos anti-GD3 purificados en el ítem (4). Las cadenas de azúcar de unión a los anticuerpos producidos por las estirpes celulares mfFUT8-6 y con introducción de pAGE249 fueron cortadas de las proteínas al someter los anticuerpos a hidrazinolisis [Methods in Enzymology 83:263, 1982]. Tras eliminar la hidrazina mediante evaporación bajo presión reducida, se llevó a cabo la N-acetilación mediante la adición de una solución acuosa de acetato amónico y anhídrido acético. Tras la liofilización, se llevó a cabo el marcaje fluorescente con 2-aminopiridina [J. Biochem. 95:197, 1984]. La cadena de azúcar marcada fluorescentemente (cadena sacárida tratada con PA) se separó del exceso de reactivos utilizando una columna Superdex Peptide HR 10/30 (fabricada por Pharmacia). Las fracciones de cadena de azúcar se secaron utilizando un concentrador centrífugo y se utilizaron como cadena de azúcar tratada con PA purificada. A continuación, el grupo purificado de cadena de azúcar tratado con PA se sometió a análisis de HPLc de fase inversa utilizando una columna CLC-ODS (fabricada por Shimadzu) (figura 30). Al calcularlo a partir del área del pico, el contenido de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa en mfFUT8-6 era de 10% y el contenido de cadenas de azúcar unidas a a-1,6-fucosa, de 90%. El contenido de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa en pAGE249 era de 20% y el contenido de cadenas de azúcar unidas a a-1,6-fucosa, de 80%. Basándose en estos resultados se encontró que el contenido de cadenas de azúcar con unión de a-1,6-fucosa del anticuerpo producido se incrementa sobreexpresando el gen de FUT8.
La figura 30 muestra los patrones de elución obtenidos al llevar a cabo el análisis de HPLC de fase inversa de cada una de las cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de los anticuerpos producidos por las estirpes celulares con introducción de mfFUT8-6 y pAGE249. Las figuras 30A y 30B muestran los patrones de elución de mfFUT8-6 y pAGE249, respectivamente. La intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución se han representado gráficamente como ordena y abscisa, respectivamente. Utilizando un tampón de fosfato sódico (pH 3,8) como tampón A y un tampón de fosfato sódico (pH 3,8) 1-butanol al 0,5% como tampón B, se llevó a cabo el análisis mediante el gradiente siguiente.
Figure imgf000076_0002
Los picos (i) a (ix) mostrados en las figuras 30 y 31 muestran las estructuras siguientes.
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
GlcNAc, Gal, Man, Fuc y PA indican N-acetilglucosamina, galactosa, mañosa, fucosa y un grupo piridilamino, respectivamente. En las figuras 30 y 31, se calculó la proporción de grupos de cadena de azúcar libres de a-1,6-fucosa a partir del área ocupada por los picos (i) a (iv) respecto a la ocupada por (i) a (ix), y la proporción de grupos de cadena de azúcar con unión de a-1,6-fucosa, a partir del área ocupada por los picos (v) a (ix) respecto a la ocupada por (i) a (ix).
Ejemplo 12
Preparación de gen de a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de célula CHO:
(1) Preparación de la secuencia de ADNc de a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de célula CHO
A partir de ADNc de cadena sencilla preparado a partir de células CHO/DG44 el segundo día de cultivo en el Ejemplo 9(1), se obtuvo ADNc de FUT8 de hámster chino mediante el procedimiento a continuación (figura 32).
En primer lugar se diseñó un cebador directo específico para una secuencia no traducible 5'-terminal (mostrada en SEC ID n° 21) y un cebador inverso específico para una secuencia no traducible 3'-terminal (mostrada en SEC ID n° 22) a partir de una secuencia de ADNc de f Ut 8 de ratón (GenBank, AB025198).
A continuación, se prepararon 25 ^l de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP, DMSO al 4% y 0,5 ^moles/l de cebadores específicos (SEc ID n° 21 y SEC ID n° 22)] que contenía 1 ^l del ADNc derivado de células CHO/DG44 y se llevó a cabo una PCR utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 1 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 2 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72°C durante 10 minutos.
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% y se purificó un fragmento amplificado específico de aproximadamente 2 kb. En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 ^l del fragmento de ADN para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) y se transformó E. co liDH5a con la solución de reacción. Se aislaron los ADN plasmídicos de acuerdo con un método conocido a partir de 8 clones con inserción de ADNc de entre las colonias resistentes a canamicina obtenidas.
La secuencia de nucleótidos de cada ADNc insertado en el plásmido se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó mediante el método que la totalidad de los ADNc insertados codificaban una secuencia que contenía el ORF completo de FUT8 de las células CHO. Entre ellos, se seleccionó un ADN plasmídico que no contenía ningún error de bases en absoluto en la PCR de las secuencias. En la presente memoria, el plásmido se denomina CHfFUT8-pCR2.1. La secuencia de nucleótidos determinada y la secuencia de aminoácidos del ADNc de FUT8 de CHO se muestran en las SEC ID n° 1 y n° 23, respectivamente.
(2) Preparación de la secuencia genómica de a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de célula CHO
Utilizando como sonda el fragmento de ADNc del ORF de longitud completa de FUT8 de las células CHO obtenido en el ítem (1), se obtuvo un clon genómico de FUT8 de células CHO de acuerdo con un método de cribado genómico conocido que se describe en, por ejemplo, Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocols in Molecular Biology, A Laboratory Manual, segunda edición, 1989. A continuación, tras digerir el clon genómico obtenido utilizando diversos enzimas de restricción, se llevó a cabo la hibridación southern utilizando un fragmento AfaI-Sau3Al (aproximadamente 280 pb) que contenía el codón de inicio del ADNc de FUT8 de células CHO como sonda, y después se seleccionó un fragmento XbaI-XbaI (aproximadamente 2,5 kb) y un fragmento SacI-SacI (aproximadamente 6,5 kb) de entre los fragmentos de enzima de restricción que mostraban reacción positiva, ser insertó en pBluescript II KS(+) (fabricado por Stratagene).
La secuencia de nucleótidos de cada uno de los fragmentos genómicos obtenidos se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. De esta manera se confirmó que el fragmento Xbal-Xbal codificaba una secuencia de un intrón cadena arriba de aproximadamente 2,5 kb que contenía el exón 2 de FUT8 de célula CHO y el fragmento SacI-SacI codificaba una secuencia de un intrón cadena abajo de aproximadamente 6,5 kb que contenía el exón 2 de FUT8 de célula CHO. En la presente memoria, el plásmido que contenía el fragmento XbaI-XbaI se denominó pFUT8fgE2-2 y el plásmido que contenía el fragmento SacI-SacI se denominó pFUT8fgE2-4. La secuencia de nucleótidos determinada (aproximadamente 9,0 kb) de la región genómica que contenía el exón 2 de FUT8 de célula CHO se muestra en la SEC ID n° 3.
Ejemplo 13 (ejemplo ilustrativo)
Preparación de célula CHO en la que se ha interrumpido el gen de a-1,6-fucosa-transferasa y producción de anticuerpo utilizando la célula:
Se preparó una célula CHO de la que se había delecionado la región genómica que comprendía el exón 2 del gen de a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8) de célula CHO y se evaluó la actividad de ADCC del anticuerpo producido por la célula.
1. Construcción del plásmido vector pKOFUT8Puro con diana en el exón 2 del gen de a-1,6-fucos¡ltransferasa (FUT8) de hámster chino
(1) Construcción del plásmido ploxPPuro
Se construyó el plásmido ploxPPuro mediante el procedimiento a continuación (figura 33).
En primer lugar se disolvió 1,0 μg de plásmido pKOSelectPuro (fabricado por Lexicon) en 35 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción AscI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb que contenía una unidad de expresión de gen de resistencia a la puromicina.
Por otra parte, se disolvió 1,0 jg de plásmido ploxP descrito en la solicitud publicada de patente japonesa examinada n° 314512/99 en 35 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción AscI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 2,0 kb.
El fragmento AscI-AscI obtenido (4,5 μl, aproximadamente 1,5 kb) obtenido del plásmido pKOSelectPuro, 0,5 μl de fragmento AscI-AscI (aproximadamente 2,0 kb) obtenido del plásmido ploxP y 5,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina ploxPPuro.
(2) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-1
Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-1 mediante el procedimiento a continuación (figura 34), utilizando el plásmido pFUT8fgE2-2 obtenido en el Ejemplo 12(2), que presentaba una región genómica que comprendía el exón 2 de FUT8 de hámster chino.
En 35 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 μg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2,0 jg del plásmido pFUT8fgE2-2 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SacI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 μg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb.
Separadamente, en 35 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 μg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvió 1,0 jg del plásmido LITMUS28 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SacI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 μg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 2,8 kb.
El fragmento EcoRV-SacI obtenido (4,5 μl, aproximadamente 1,5 kb) obtenido del plásmido pFUT8fgE2-2, 0,5 μl de fragmento EcoRV-SacI (aproximadamente 2,8 kb) obtenido del plásmido LITMUS28 y 5,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8gE2-1.
(3) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-2
Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-2 mediante el procedimiento a continuación (figura 35), utilizando el plásmido pKoFuT8gE2-1 obtenido en el ítem (2).
En 30 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 jg/m l de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvieron 2,0 jg del plásmido pKOFUT8gE2-1 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 30 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 jg/m l de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción Kpnl (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kb.
Separadamente, se disolvió 1,0 jg de plásmido ploxPPuro en 30 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción Hpal (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 30 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 jg/m l de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción Kpnl (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb.
Una porción de 4,0 μl del fragmento EcoRV-Kpnl obtenido (aproximadamente 1,5 kb) del plásmido pKOFUT8gE2-1, 1,0 μl de fragmento Hpal-Kpnl (aproximadamente 3,5 kb) obtenido del plásmido ploxPPuro y 5,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8gE2-2.
(4) Construcción del plásmido pscFUT8gE2-3
Se construyó el plásmido pscFUT8gE2-3 mediante el procedimiento a continuación (figura 36), utilizando el plásmido pFUT8fgE2-4 obtenido en el Ejemplo 12(2), que presentaba una región genómica que comprendía el exón 2 de FUT8 de hámster chino.
Se disolvieron 2,0 jg de plásmido pFUT8fgE2-3 en 35 μl de tampón NEBuffer 1 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción Hpall (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y después se convirtieron los extremos del a Dn en romos utilizando Blunting High (fabricado por Toyobo) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se recuperó el fragmento de ADN mediante precipitación con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y se disolvió en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 3,5 kb.
Por otra parte, en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) se disolvió 1,0 jg del plásmido LITMUS39 (fabricado por New England Biolabs) y la solución se mezcló con 20 unidades del enzima de restricción EcoRV (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción Hindlll (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 2,8 kb.
El fragmento HpaN-HindNI obtenido (4,0 μl, aproximadamente 3,5 kb) del plásmido pFUT8fgE2-4, 1,0 μl de fragmento EcoRV-HindlII (aproximadamente 2,8 kb) obtenido del plásmido LITMUS39 y 5,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pscFUT8gE2-3.
(5) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-3
Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-3 mediante el procedimiento a continuación (figura 37), utilizando el plásmido pFUT8fgE2-4 obtenido en el Ejemplo 12(2), que presentaba una región genómica que comprendía el exón 2 de FUT8 de hámster chino.
En 35 μl de tampón NEBuffer para EcoRI (fabricado por New England Biolabs) se disolvieron 2,0 μg del plásmido pFUT8fgE2-4 y se añadieron 2o unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por New England Biolabs) y 20 unidades del enzima de restricción HindlII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,8 kb.
Separadamente se disolvió 1,0 jg de plásmido pBluescript II KS(+) (fabricado por Stratagene) en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción EcoRI (fabricado por New England Biolabs) y 20 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 3,0 kb.
El fragmento HindIII-EcoRI obtenido (4,0 μl, aproximadamente 1,8 kb) del plásmido pFUT8fgE2-4, 1,0 μl de fragmento HindIII-EcoRI (aproximadamente 3,0 kb) obtenido del plásmido pBluescript II KS(+) y 5,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8gE2-3.
(6) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-4
Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-4 mediante el procedimiento a continuación (figura 38), utilizando los plásmidos pscFUT8fgE2-3 y pKOFUT8gE2-3 obtenido en los ítems (4) y (5).
En 35 μl de tampón NEBuffer para SalI (fabricado por New England Biolabs), que contenía 100 μg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs), se disolvió 1,0 jg del plásmido pscFUT8fgE2-3 y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SacI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 30 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) que contenía 100 μg/ml de BSA (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 3,6 kb.
Separadamente, se disolvió 1,0 jg de plásmido pKOFUT8gE2-3 en 35 μl de tampón NEBuffer para SalI (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SalI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 35 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción HindIII (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, se añadieron 35 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,5 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65°C durante 30 minutos para desfosforilar los extremos del ADN. Tras el tratamiento de desfosforilación, se recuperó el fragmento de ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se disolvió en 10 μl de agua estéril.
El fragmento SaII-HindIII obtenido (4,0 μl, aproximadamente 3,1 kb) del plásmido pscFUT8fgE2-3, 1,0 μl de fragmento EcoRV-HindIII (aproximadamente 4,8 kb) obtenido del plásmido LITMUS39 y 5,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8gE2-4.
(7) Construcción del plásmido pKOFUT8gE2-5
Se construyó el plásmido pKOFUT8gE2-5 mediante el procedimiento a continuación (figura 39), utilizando los plásmidos pKOFUT8fgE2-2 y pKOFUT8gE2-4 obtenido en los ítems (3) y (6).
Se disolvió 1,0 μg de plásmido pKOFUT8fgE2-2 en 30 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SmaI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 25°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 30 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, se añadieron 30 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,0 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65°C durante 1 hora para desfosforilar los extremos del ADN. Tras el tratamiento de desfosforilación, se recuperó el fragmento de ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se disolvió en 10 μl de agua estéril.
Separadamente, se disolvió 1,0 jg de plásmido pKOFUT8gE2-4 en 30 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción SmaI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 25°C durante 2 horas. Se recuperó un fragmento de ADN de la solución de reacción mediante precipitación con etanol y se disolvió en 30 μl de tampón NEBuffer 2 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 5,2 kb.
El fragmento Smal-BamHI obtenido (0,5 μl, aproximadamente 5,0 kb) del plásmido pKOFUT8fgE2-2, 4,5 μl de fragmento Smal-BamHI (aproximadamente 5,4 kb) obtenido del plásmido pKOFUT8gE2-4 y 5,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 15 horas. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8gE2-5.
(8) Construcción del plásmido pKOFUT8Puro
Se construyó el plásmido pKOFUT8Puro mediante el procedimiento a continuación (figura 40), utilizando el plásmido pKOFUT8gE2-5 obtenido en el ítem (7).
En primer lugar se disolvió 1,0 jg de plásmido pKOSelectDT (fabricado por Lexicon) en 50 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 16 unidades del enzima de restricción Rsrll (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, la solución se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8%, purificando un fragmento de ADN de aproximadamente 1,2 kb que contenía una unidad de expresión de una toxina diftérica.
Separadamente, se disolvió 1,0 jg de plásmido pKOFUT8gE2-5 en 50 μl de tampón NEBuffer 4 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 16 unidades del enzima de restricción Rsrll (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 2 horas. Tras la reacción de digestión, se añadieron 30 μl de tampón Tris-HCl 1 mol/l (pH 8,0) y 3,0 μl de fosfatasa alcalina derivada de E. coli C15 (fabricada por Takara Shuzo), seguido de la reacción a 65°C durante 1 hora para desfosforilar los extremos del ADN. Tras el tratamiento de desfosforilación, se recuperó el fragmento de ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se disolvió en 10 μl de agua estéril.
El fragmento RsrlI-RsrN obtenido (1,0 μl, aproximadamente 1,2 kb) obtenido del plásmido pKOSelectDT, 1,0 μl de fragmento RsrlI-RsrN (aproximadamente 10,4 kb) obtenido del plásmido pKOFUT8gE2-5 y 3,0 μl de Ligation High (fabricado por Toyobo) se mezclaron y seguidamente se llevó a cabo la reacción de ligación a 16°C durante 30 minutos. Se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción y se aisló un ADN plasmídico de acuerdo con un método conocido a partir de los clones resistentes a ampicilina obtenidos. En la presente memoria el plásmido se denomina pKOFUT8Puro.
2. Preparación de células CHO en las que se ha interrumpido una copia de la región genómica que contiene el exón 2 del gen de a-1,6-fucos¡ltransferasa (FUT8)
(1) Introducción de vector de reconocimiento
Se introdujo el vector de reconocimiento pKOFUT8Puro de la región genómico de FUT8 de hámster chino construido en el ítem 1 del presente ejemplo, en la cepa 5-03 preparada en el ítem 1(2) del Ejemplo 8.
Se introdujo un gen del plásmido pKOFUT8Puro en la cepa 5-03 tal como se indica a continuación de acuerdo con el método de electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990]. En primer lugar, se disolvieron 150 jg de plásmido pKOFUT8Puro en 1,8 ml de NEBuffer para SalI (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 600 unidades del enzima de restricción SalI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante 5 horas, obteniendo un fragmento lineal. La solución de reacción se sometió a extracción con fenol/cloroformo, seguido de precipitación con etanol y el plásmido lineal recuperado se preparó en forma de una solución acuosa 1 μg/μl. Separadamente, se suspendió la cepa 5-03 en un tampón K-PBS (KCl 137 mmoles/l, NaCl 2,7 mmoles/l, Na2HPO48,1 mmoles/l, KH2 PO41,5 mmoles, MgCh 4,0 mmoles), proporcionando una densidad de 8x107 células/ml. Tras mezclar 200 μl de la suspensión celular (1,6x106 células) con 4 μl (4 jg ) del plásmido lineal, se transfirió un volumen entero de la mezcla de células-ADN a una cubeta de Gene Pulser (distancia entre electrodos: 2 mm) (fabricado por Bio-Rad) y después se llevó a cabo la electroporación utilizando un aparato de fusión celular Gene Pulser (fabricado por Bio-Rad) a un voltaje de pulso de 350 V y 250 jF de capacidad eléctrica. Tras llevar a cabo la electroporación utilizando 30 cubetas de la misma manera, se suspendió la suspensión celular en medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y complemento HT a concentración 1x (fabricado por Life Technologies) y se inoculó en 30 placas de cultivo celular adherente de 1 0 cm de diámetro (fabricadas por Falcon). Tras el cultivo de las mismas a 37°C durante 24 horas en 5% de CO2 , se separó el sobrenadante de cultivo y se dispensó medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con 15 jg/ml de puromicina (fabricado por Sigma) y suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies) en porciones de 10 ml. Tras cultivarlas durante 10 días, repitiendo el intercambio de medio a intervalos de 3 a 4 días, se obtuvieron estirpes celulares resistentes a puromicina.
(2) Preparación de estirpes celulares con vector de reconocimiento introducido
Se obtuvieron 900 colonias arbitrarias tal como se indica a continuación, a partir de las estirpes celulares resistentes a puromicina obtenidas en el ítem (1 ).
En primer lugar, se separó el sobrenadante de cultivo de la placa de 10 cm en la que habían formado estirpes celulares resistentes a puromicina y se añadieron 7 ml de tampón fosfato a la placa, que seguidamente se colocó bajo un estereomicroscopio. A continuación, se raspó cada colonia y se aspiró utilizando Pipetteman (fabricado por Gilson) y se transfirió a una placa de fondo redondo de 96 pocillos (fabricada por Falcon). Tras el tratamiento de tripsina, se inoculó cada clon en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para la utilización en cultivo celular adherente (fabricado por Iwaki Glass) y se cultivó durante 1 semana utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con 15 jg/m l de puromicina (fabricada por Sigma) y suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies).
Tras el cultivo de las mismas, cada clon en la placa se sometió a tratamiento de tripsina y después se mezcló con dos volúmenes de un medio liofilizante (DMSO al 20%, suero de feto bovino al 40% e iMDM al 40%). Se inoculó una mitad de la mezcla en una placa de fondo plano de 96 pocillos para el cultivo celular adherente (fabricada por Iwaki Glass) como placa réplica, mientras que la mitad restante de la mezcla se sometió a crioconservación como placas maestras. La placa réplica se cultivó durante 1 semana utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con 15 μg/ml de puromicina (fabricado por Sigma) y suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies).
(3) Diagnóstico de la recombinación homologa mediante PCR genómica
El diagnóstico de la recombinación homóloga en los 900 clones obtenidos en el ítem (2) se llevó a cabo mediante PCR genómica.
En primer lugar, se preparó el ADN genómico de cada clon a partir de la placa réplica preparada en el ítem (2) de acuerdo con un método conocido [Analytical Biochemistry 201:331, 1992] y se disolvió durante la noche en 30 μl de un tampón TE-ARNasa (pH 8,0 (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l, 200 jg/m l de ARNasa A). Además, se diseñó un cebador (mostrado en la SEC ID n° 26) que se une a una secuencia fuera de la región homóloga del vector de reconocimiento en la región genómica de FUT8 obtenida en el Ejemplo 12 y un cebador (mostrado en la SEC ID n° 27) que se une a la secuencia de loxP en el vector.
Utilizando la ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo), se prepararon 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP y 0,5 jmoles/l de cebadores específicos (s e C ID n° 26 y SEC ID n° 27)] que contenía 10 μl de la solución de ADN genómico anteriormente preparada y se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se llevó a cabo mediante calentamiento a 94°C durante 3 minutos y 38 ciclos posteriores de calentamiento utilizando la reacción a 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos en un ciclo.
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (p/v) y se identificó como clon positivo un fragmento de amplificación específica de aproximadamente 1,7 kb que contenía una región de límite entre la región genómica de las células CHO y la región homóloga del vector de reconocimiento. Mediante el método se encontró un clon positivo.
(4) Diagnóstico de la recombinación homóloga mediante transferencia southern del genoma
El diagnóstico de la recombinación homóloga en el clon, la señal positiva del cual se confirmó en el ítem (3), se llevó a cabo mediante transferencia southern del genoma.
Entre las placas maestras crioconservadas en el ítem (2), se seleccionó una placa de 96 pocilios que contenía el clon positivo encontrado en el ítem (3) y se incubó a 37°C durante 10 minutos en 5% de CO2. Tras la incubación, se recolectaron las células de un pocillo correspondiente al clon positivo y se inocularon en una placa de fondo plano de 24 pocillos para células adherentes (fabricada por Greiner). Tras cultivarlas durante 1 semana utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con 15 μg/ml de puromicina (fabricado por Sigma) y suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies), las células se inocularon en una placa de fondo plano de 6 pocillos para la adhesión celular (fabricada por Greiner). Se preparó el ADN genómico del clon en la placa de acuerdo con un método conocido [Nucleic Acids Research 3:2303, 1976] y se disolvió durante la noche en 150 μl de un tampón TE-ARNasa (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l, 200 μg/ml de ARNasa A).
Se disolvieron 12 μg del ADN genómico obtenido en 120 μl de tampón NEBuffer 3 (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 25 unidades del enzima de restricción PstI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante la noche. Se recuperó un fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol, se disolvió en 20 μl de tampón TE (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l) y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (p/v). Tras la electroforesis, se transfirió el ADN genómico a una membrana de nilón de acuerdo con un método conocido [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3683, 1979]. Tras completar la transferencia, la membrana de nilón se calentó a 80°C durante 2 horas.
Separadamente se preparó una sonda utilizada en la transferencia southern de la manera siguiente. En primer lugar, se diseñaron cebadores (SEC ID n° 28 y n° 29) que unen una secuencia fuera de la región homóloga del vector de reconocimiento con la región genómica de FUT8 obtenida en el Ejemplo 12. A continuación, utilizando la ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo), se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP y 0,5 μmoles/l de cebadores específicos (SEC ID n° 28 y SEC ID n° 29)] que contenía 4,0 ng del plásmido pFUT8fgE2-2 obtenido en el Ejemplo 12(2) y se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR se llevó a cabo mediante calentamiento a 94°C durante 1 minuto y posteriores 25 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 74°C durante 1 minuto en un ciclo. Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% (p/v), purificando un fragmento de ADN de sonda de aproximadamente 230 pb. La solución de ADN de sonda obtenida (5 μl) se marcó con un isótopo radioactivo utilizando 1,75 MBq de [a-32P]dCTP y el sistema de marcaje de ADN Megaprime, dCTP (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).
La hibridación se llevó a cabo de la manera siguiente. En primer lugar, la membrana de nilón se selló dentro de una botella centrifugadora y se llevó a cabo una prehibridación a 65°C durante 3 horas mediante la adición de 15 ml de una solución de hibridación [SSPE 5x, 50 x solución de Denhardt, SDS al 0,5% (p/v), ADN de esperma de salmón 100 μg/ml]. A continuación, la sonda de ADN marcada con 32P se desnaturalizó por calor y se introdujo en la botella. A continuación, se calentó la membrana de nilón a 65°C durante la noche.
Tras la hibridación, la membrana de nilón se sumergió en 50 ml de SSC 2x-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65°C durante 15 minutos. Tras repetir la etapa de lavado dos veces, la membrana se sumergió en 50 ml de SSC 0,2-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65°C durante 15 minutos. Tras el lavado, la membrana de nilón se expuso a una película para rayos X a -80°C durante dos noches para el revelado.
Mediante tratamiento con el enzima de restricción PstI, se formó un fragmento de ADN de aproximadamente 4,4 kb a partir de un alelo de FUT8 de tipo salvaje. Por otra parte, se formó un fragmento de ADN de aproximadamente 6,0 kb a partir de un alelo en el que se había generado la recombinación homóloga con un vector de reconocimiento.
Mediante el método, dichos fragmentos específicos de aproximadamente 4,4 kb y aproximadamente 6,0 kb se encontraron a partir del ADN genómico del clon positivo en el ítem (3). Debido a que la proporción cuantitativa de ambos fragmentos era de 1: 1, se confirmó que el clon era un clon en el que se había interrumpido una copia del alelo de FUT8. En adelante en la presente memoria, el clon se denomina cepa 1st.AFUT82-46.
3. Deleción del gen de resistencia a fármaco de la célula CHO en la que se ha interrumpido 1 copia del gen de a-1,6-fucosiltransferasa (FUT8)
(1) Introducción de vector de expresión de la recombinasa Cre
Se introdujo el vector pBS185 de expresión de la recombinasa Cre (fabricado por Life Technologies) en la cepa 1st.AFUT82-46 preparada en el ítem 2 del presente ejemplo.
Se introdujo un gen del plásmido pBS185 en la cepa 1st.AFUT82-46 tal como se indica a continuación de acuerdo con el método de electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990]. En primer lugar, se suspendió la cepa 1st.AFUT8 2-46 en un tampón K-p Bs (KCl 137 mmoles/l, NaCl 2,7 mmoles/l, Na2 HPO4 8,1 mmoles/l, KH2 PO4 1,5 mmoles, MgCl2 4,0 mmoles), proporcionando una densidad de 8x107 células/ml. Tras mezclar 200 μl de la suspensión celular (1,6x106 células) y 4 μg del plásmido pBS185, se transfirió un volumen entero de la mezcla de células-ADN a una cubeta de Gene Pulser (distancia entre electrodos: 2 mm) (fabricado por Bio-Rad) y después se llevó a cabo la electroporación utilizando un aparato de fusión celular Gene Pulser (fabricado por Bio-Rad) a un voltaje de pulso de 350 V y 250 jF de capacidad eléctrica. Tras la transferencia génica, se suspendió la suspensión celular en 10 ml de medio IMDm (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y complemento HT a concentración 1x (fabricado por Life Technologies) y se diluyó adicionalmente 20.000 veces utilizando el mismo medio. Las células se inocularon en 7 placas de cultivo celular adherente de 10 cm de diámetro (fabricadas por Falcon) y después se cultivaron a 37°C durante 24 horas con 5% de CO2. Tras cultivarlas, se separó el sobrenadante de cultivo y se dispensaron 10 ml del medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies). El cultivo se llevó a cabo durante 10 días, repitiendo el intercambio de medio a intervalos de 3 a 4 días.
(2) Preparación de estirpes celulares con vector de expresión de recombinasa Cre introducido
Se obtuvieron 400 colonias arbitrarias tal como se indica a continuación, a partir de la estirpe celular obtenida en el ítem (1).
En primer lugar, se separó el sobrenadante de cultivo de la placa de 10 cm y se añadieron 7 ml de tampón fosfato a la placa, que seguidamente se colocó bajo un estereomicroscopio. A continuación, se raspó cada colonia y se aspiró utilizando Pipetteman (fabricado por Gilson) y se transfirió a una placa de fondo redondo de 96 pocillos (fabricada por Falcon). Tras el tratamiento de tripsina, se inoculó cada clon en una placa de fondo redondo de 96 pocillos para la utilización en cultivo celular adherente (fabricado por Iwaki Glass) y se cultivó durante 1 semana utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies).
Tras el cultivo de las mismas, cada clon en la placa se sometió a tratamiento de tripsina y después se mezcló con dos volúmenes de un medio liofilizante (DMSO al 20%, suero de feto bovino al 40% e iMd M al 40%). Se inoculó una mitad de la mezcla en una placa de fondo plano de 96 pocillos para el cultivo celular adherente (fabricada por Iwaki Glass) como placa réplica, mientras que la mitad restante de la mezcla se sometió a crioconservación como placa maestra.
A continuación, la placa réplica se cultivó durante 6 días utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con 15 jg/m l de puromicina (fabricado por Sigma) y suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies). Un clon positivo del que se había eliminado el gen de resistencia a puromicina interpuesto entre las secuencias de loxP mediante la expresión de la recombinasa Cre moría en presencia de puromicina. Mediante este método de selección se encontraron 91 clones positivos.
(3) Diagnóstico de la eliminación de genes de resistencia a fármaco mediante transferencia southern del genoma
El diagnóstico de la eliminación del gen de resistencia a fármaco mediante transferencia southern del genoma se llevó a cabo en 6 clones opcionales de entre los clones positivos encontrados en el ítem (2).
Entre las placas maestras crioconservadas en el ítem (2), se seleccionó una placa de 96 pocillos que contenía los 6 clones positivos y se incubó a 37°C durante 10 minutos en 5% de CO2. Tras la incubación, se recolectaron las células de un pocillo correspondiente a cada clon positivo y se inocularon en una placa de fondo plano de 24 pocillos para células adherentes (fabricada por Greiner). Tras cultivarlas durante 1 semana utilizando medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies), las células se inocularon en una placa de fondo plano de 6 pocillos para la adhesión celular (fabricada por Greiner). Se prepararon los ADN genómicos de cada clon en la placa de acuerdo con un método conocido [Nucleic Acids Research 3:2303, 1976] y se disolvieron durante la noche en 150 μl de un tampón TE-ARNasa (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l, 200 jg/m l de ARNasa A).
Se disolvieron 12 jg del ADN genómico obtenido en 120 μl de tampón NEBuffer para BamHI (fabricado por New England Biolabs) y se añadieron 20 unidades del enzima de restricción BamHI (fabricado por New England Biolabs), seguido de la reacción de digestión a 37°C durante la noche. Se recuperó un fragmento de ADN a partir de la solución de reacción mediante precipitación con etanol, se disolvió en 20 μl de tampón TE (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l) y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,4% (p/v). Tras la electroforesis, se transfirió el a Dn genómico a una membrana de nilón de acuerdo con un método conocido [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76:3683, 1979]. Tras completar la transferencia, la membrana de nilón se calentó a 80°C durante 2 horas.
Por otra parte, se preparó una sonda utilizada en la transferencia southern de la manera siguiente. En primer lugar, se diseñaron cebadores (SEC ID n° 30 y n° 31) que se unen a una secuencia fuera de la región homóloga del vector de reconocimiento en la región genómica de FUT8 obtenida en el Ejemplo 12. A continuación, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) mediante la preparación de 20 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP y 0,5 μmoles/l de cebadores específicos (SEC ID n° 30 y SEC ID n° 31)] que contenía 4.0 ng del plásmido pFUT8fgE2-2 obtenido en el Ejemplo 12(2). La PCR se llevó a cabo mediante calentamiento a 94°C durante 1 minuto y posteriores 25 ciclos de calentamiento a 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 74°C durante 1 minuto en un ciclo. Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% (p/v), purificando un fragmento de ADN de sonda de aproximadamente 230 pb. Una porción de 5 μl de la solución de ADN de sonda obtenida se marcó con un isótopo radioactivo utilizando 1,75 MBq de [a-32P]dcTP y el sistema de marcaje de ADN Megaprime, dCTP (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).
La hibridación se llevó a cabo de la manera siguiente. En primer lugar, la membrana de nilón se selló dentro de una botella centrifugadora y se llevó a cabo una prehibridación a 65°C durante 3 horas mediante la adición de 15 ml de una solución de hibridación [SSPE 5x, 50 x solución de Denhardt, SDS al 0,5% (p/v), ADN de esperma de salmón 100 μg/ml]. A continuación, la sonda de ADN marcada con 32P se desnaturalizó por calor y se introdujo en la botella y la membrana de nilón se calentó durante la noche a 65°C.
Tras la hibridación, la membrana de nilón se sumergió en 50 ml de SSC 2x-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65°C durante 15 minutos. Tras repetir la etapa de lavado dos veces, la membrana se sumergió en 50 ml de SSC 0,2-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65°C durante 15 minutos. Tras el lavado, la membrana de nilón se expuso a una película para rayos X a -80°C durante dos noches para el revelado.
Mediante tratamiento con el enzima de restricción BamHI, se formó un fragmento de ADN de aproximadamente 19.0 kb a partir de un alelo de FUT8 de tipo salvaje. Además, se formó un fragmento de ADN de aproximadamente 12,5 kb a partir de un alelo en el que se había generado la recombinación homóloga con un vector de reconocimiento. Además, al delecionar el gen de resistencia a puromocina (aproximadamente 1,5 kb) en el que se había generado recombinación homóloga, se formó un fragmento de ADN de aproximadamente 11,0 kb mediante el mismo tratamiento.
Mediante el método, dichos fragmentos específicos de aproximadamente 19,0 kb y aproximadamente 11,0 kb se encontraron a partir del ADN genómico de 5 de los 6 clones. Debido a que la proporción cuantitativa de ambos fragmentos era de 1: 1, se demostró que el gen de resistencia a puromicina había sido delecionado de las estirpes celulares en las que se había interrumpido 1 copia de la región genómica de FUT8. En adelante en la presente memoria, uno de los clones se denomina 1st.AFUT82-46-1. Además, los resultados de la transferencia southern del genoma de las cepas 1st.AFUT82-46-1, 1st.AFUT82-46 y 5-03 se muestran en la figura 41. Adicionalmente, la cepa 1st.AFUT82-46-1, denominada 2-46-1, fue depositada el 26 de septiembre de 2001 como FERM n° BP-7755 en el depósito internacional de organismos de patente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566 Japón)
4. Purificación del anticuerpo producido por una estirpe celular con interrupción del gen de a-1,6-fucos¡ltransferasa (FUT8)
La cepa 1st.AFUT8 2-46-1 obtenida en el ítem 3 del presente ejemplo mediante la interrupción de una copia del alelo de FUT8 se suspendió en medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con 15 μg/ml de puromicina (fabricado por Sigma) y suero de feto bovino al 10% dializado (fabricado por Life Technologies), proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y después se inocularon 60 ml en total de la suspensión en dos matraces T182 para la utilización en el cultivo celular adherente (fabricados por Greiner). Tras cultivarlas durante 3 días, se descartó el sobrenadante y se cambió por el total de 60 ml de medio EXCELL301 (fabricado por JRH Biosciences).
Tras cultivarlas a 37°C durante 7 días en un incubador con 5% de CO2 , se contó el número de células intactas con el fin de confirmar que la viabilidad de las mismas era prácticamente igual (diferentes en 30% o menos) y después se recuperó cada suspensión celular. Se centrifugó la suspensión celular a 3.000 rpm a 4°C durante 10 minutos y el sobrenadante recuperado se centrifugó a 10.000 rpm a 4°C durante 1 hora y después se filtró utilizando una unidad de filtración p Es (fabricada por Nalgene) de 150 ml de capacidad con un diámetro de poro de 0,22 μm.
Se empaquetó Prosep-A HighCapacity (fabricado por bioProcessing) en una columna de 0,8 cm de diámetro hasta un grosor de 2 cm y se lavó con 10 ml de tampón citrato 0,1 moles/l (pH 3,0) y 10 moles de tampón de glicina/NaOH 1 mol/l-NaCl 0,15 moles/l (pH 8,6) en ese orden para conseguir el equilibrado del portador. A continuación, se pasaron 100 ml d ecada uno de los sobrenadantes de cultivo por la columna y se lavaron con 50 ml de tampón de glicina/NaOH 1 mol/l-NaCl 0,15 moles/l (pH 8,6). Tras lavarlas, el anticuerpo adsorbido en Prosep-A se eluyó utilizando 2,5 ml de tampón citrato 0,1 moles/l (pH 3,0), el eluido se fraccionó en porciones de 500 μl y cada fracción se neutralizó mediante la mezcla con 100 μl de Tris-HCl 2 moles/l (pH 8,5). Se seleccionaron dos fracciones que contenían el anticuerpo a concentración elevada (1,2 ml en total) mediante el método de BCA [Anal. Biochem.
150:76, 1985], se agruparon y después se dializaron frente a tampón citrato 10 moles/l-NaCl 0,15 moles/l (pH 6,0) a 4°C durante un día y noche completos. Tras la diálisis, se recuperó la solución de anticuerpo y se sometió a esterilización mediante filtración utilizando un Millex GV de 0,22 μm de tamaño de poro (fabricado por Millipore).
5. Actividad citotóxica in vitro (actividad de ADCC) del anticuerpo producido por una estirpe celular con interrupción del gen de a-1,6-fucos¡ltransferasa (FUT8)
Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro del anticuerpo anti-CCR4 purificado en el ítem 4 del presente ejemplo, se midió la actividad de ADCC utilizando la estirpe celular CCR4/EL-4 positiva para CCR4 indicada en el Ejemplo 8.
Las células CCR4/EL-4 subcultivadas en medio RPMI1640 (fabricado por Life Technologies) que contenía suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) (en adelante denominado "RPMI1640-FBS(10)") se suspendieron en 500 μl de RPMI1640-FBS(10) a una densidad de 1x106 células y se añadieron 3,7 MBq de Na251CrO4 al mismo, seguido del cultivo a 37°C durante 90 minutos para el marcaje de las células con el isótopo radioactivo. Tras la centrifugación a 1.200 rpm durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante y las células diana se suspendieron en 5 ml de RPMI1640-FBS(10). Se repitió la etapa de lavado tres veces y después la suspensión celular se incubó durante 30 minutos sobre hielo para la disociación espontánea de la sustancia radioactiva. Se repitió nuevamente dos veces la etapa de lavado y después las células se suspendieron en 5 ml de RPMI1640-FBS(10), preparando de esta manera 2x105 células/ml de una suspensión de células diana.
Separadamente, se recolectaron 30 ml de sangre venosa de una persona sana, se mezcló suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricada por Shimizu Pharmaceutical) y después se mezcló con 30 ml de solución salina fisiológica (fabricada por Otsuka Pharmaceutical). Tras la mezcla, se aplicaron suavemente como capa superior 10 ml de la mezcla sobre 4 ml de Lymphoprep (fabricado por Nycomed Pharma AS) y se centrifugó a temperatura ambiente a 2.000 rpm durante 30 minutos. Las fracciones de células mononucleares separadas se recolectaron de los tubos de centrifugación, se agruparon y después se suspendieron en 30 ml de RPMl1640-FBS(10). Tras la centrifugación a temperatura ambiente a 1.200 rpm durante 15 minutos, se descartó el sobrenadante y las células se suspendieron en 20 ml de RPMI1640-FBS(10). Se repitió dos veces la etapa de lavado y después se prepararon 2,5x106 células/ml de una suspensión de células efectoras utilizando RPMI1640-FBS(10).
La suspensión de células diana se dispensó a razón de 50 μl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se dispensó la suspensión de células efectoras a razón de 100 μl (2,5x105 células/pocillo) en cada pocillo, ajustando de esta manera la proporción de células efectoras a célula diana a 25: 1. A continuación, utilizando RPMI1640-FBS(10), se preparó una serie de soluciones diluidas de 0,01 μg/ml, 0,1 μg/ml, 1 μg/ml y 10 μg/ml de cada uno de los anticuerpos anti-CCR4 obtenidos en el ítem 5 del Ejemplo 13 y las soluciones diluidas se dispensaron a razón de 50 μl en los pocillos, proporcionando concentraciones finales de 0,0025 μg/ml, 0,025 μg/ml, 0,25 μg/ml y 2,5 μg/ml, respectivamente. Tras llevar a cabo la reacción a 37°C durante 4 horas en 5% de CO2 , la placa se centrifugó a 1.200 rpm durante 5 minutos. En un tubo de RIA de 12 mm de diámetro (fabricado por Iwaki), se extrajeron 75 μl del sobrenadante de cada pocillo y se midió la cantidad del 51Cr disociado utilizando el contador MINAX-y auto-gamma 5550 (fabricado por Packard).
Además, se estimó la cantidad de 51Cr disociado espontáneamente llevando a cabo la misma reacción en una mezcla de reacción a la que se añadieron 150 μl de RPMI1640-FBS(10) en lugar de la suspensión de células efectoras y la solución de anticuerpo. Se estimó la cantidad de 51Cr total disociado llevando a cabo la misma reacción en una mezcla de reacción a la que se añadieron 100 μl de ácido clorhídrico 1 N y 50 μl de RPMI1640-FBS(10) en lugar de la suspensión de células efectoras y la solución de anticuerpo. Utilizando estos valores se calculó la actividad ADCC utilizando la ecuación (II).
La figura 42 muestra la actividad de ADCC de cada uno de los anticuerpos anti-CCR4. El anticuerpo obtenido de la cepa 1st.AFUT8 2-46-1 en la que se había interrumpido 1 copia del alelo de FUT8 mostró una actividad de ADCC significativamente más potente que la del anticuerpo producido por la cepa 5-03, que es la línea de células CHO antes de la disrupción génica. Además, no se observaron cambios en la actividad de unión a antígeno de dichos anticuerpos. Basándose en estos resultados se confirmó que la actividad de ADCC de los anticuerpos producidos podía mejorarse mediante la disrupción del alelo de FUT8 en las células hospedadoras.
Ejemplo 14
Preparación de células CHO/DG44 resistentes a lectina y producción de anticuerpo utilizando las células:
(1) Preparación de CHO/DG44 resistentes a lectina
Se cultivaron células CHO/DG44 hasta alcanzar un estadio inmediatamente previo a la confluencia, mediante cultivo en un matraz de 75 cm2 para el cultivo adherente (fabricado por Greiner) utilizando medio IMDM-FBS(10) [medio IMDM que comprende suero de feto bovino al 10% (FBS) y una concentración 1x de complemento HT (fabricado por Gibco b Rl )]. Tras el lavado de las células con 5 ml de PBS de Dulbecco (fabricado por Invitrogen), se añadieron a las mismas 1,5 ml de tripsina al 0,05% (fabricado por Invitrogen) diluido con PBS de Dulbecco y se incubó a 37°C durante 5 minutos para desenganchar las células del fondo del matraz. Las células desenganchadas se recuperaron mediante una operación de centrifugación utilizada generalmente en el cultivo celular y se suspendieron en medio IMDM-FBS(10), proporcionando una densidad de 1x105 células/ml y después se añadió o no se añadió 0,1 μg/ml del agente alquilante N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (en adelante denominado "MNNG", fabricado por Sigma). Tras incubarlas a 37°C durante 3 días en un incubador de CO2 (fabricado por Tabai), se descartó el sobrenadante de cultivo y las células se lavaron nuevamente, se desengancharon y se recuperaron mediante las mismas operaciones, se suspendieron en medio IMDM-FBS(10) y después se inocularon en una placa de 96 pocillos de cultivo adherente (fabricada por Iwaki Glass), proporcionando una densidad de 1.000 células/pocillo. A cada pocillo, como concentración final en medio, se añadió 1 mg/ml de aglutinina de Lens culinaris (en adelante denominada "LCA", fabricada por Vector), 1 mg/ml de aglutinina de Aleuria aurantia (lectina de Aleuria aurantia, en adelante denominada "AAL", fabricada por Vector) o 1 mg/ml de aglutinina de haba (leucoaglutinina de Phaseolus vulgaris, en adelante denominada "L-PHA", fabricada por Vector). Tras cultivarlas a 37°C durante 2 semanas en un incubador de CO2 , las colonias que aparecieron eran CHO/DG44 resistentes a lectina. Con respecto a la célula CHO/DG44 resistente a lectina obtenida, la estirpe celular resistente a LCA se denominó CHO-LCA, la estirpe celular resistente a AAL se denominó CHO-AAL y la estirpe celular resistente a L-PHA se denominó CHO-PHA. Al examinar la resistencia de dichas estirpes celulares a diversos tipos de lectina, se encontró que CHO-LCA también era resistente a AAL y que CHO-AAL también era resistente a LCA. Además, CHO-LCA y CHO-AAL también mostraron resistencia a una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar idéntica a la estructura de cadena de azúcar reconocida por LCA y AAL, es decir, una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa se encuentra unida a la posición 6 del residuo de N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante enlace a en la cadena de azúcar unida mediante N-glucósido. Específicamente, se encontró que CHO-LCA y CHO-AAL pueden mostrar resistencia y sobreviven incluso en un medio complementado con 1 mg/ml a una concentración final de aglutinina de guisante (aglutinina de Pisum sativum, en adelante denominada "PSA", fabricada por Vector). Además, incluso en caso de no añadir el agente alquilante MNNG, se pudieron obtener estirpes celulares resistentes a lectina mediante el incremento del número de células que debían tratarse. En adelante en la presente memoria, se utilizaron dichas estirpes celulares en los análisis.
(2) Preparación de células productoras de anticuerpos híbridos anti-CCR4 humanos
Se introdujo el plásmido pKANTEX2160 de expresión de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4 en tres estirpes celulares resistentes a lectina obtenidas en (1) mediante el método descrito en el Ejemplo 8, y se llevó a cabo la amplificación génica con el fármaco MTX para preparar una estirpe celular productora de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4. Mediante la medición del nivel de expresión de anticuerpo mediante el ELISA descrito en el Ejemplo 8-2, se obtuvieron transformantes expresantes de anticuerpos a partir de CHO-LCA, CHO-AAL y CHO-PHA. Con respecto a cada uno de los transformantes obtenidos, un transformante obtenido de CHO-LCA se denominó CHO/CCR4-LCA, un transformante obtenido de CHO-AAL se denominó CHO/CCR4-AAL y un transformante obtenido de CHO-PHA se denominó CHO/CCR4-PHA. Además, CHO/CCR4-LCA, nombre de Nega-13, fue depositado el 26 de septiembre de 2001, como FERM n° BP-7756 en el depósito internacional de organismos de patentes, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japón).
(3) Producción de anticuerpo de potente actividad de ADCC por células CHO resistentes a lectina
Utilizando los tres transformantes obtenidos en (2), se obtuvieron anticuerpos purificados mediante el método descrito en el Ejemplo 8-3. La actividad de unión a antígeno de cada uno de los anticuerpos híbridos purificados humanos anti-CCR4 se evaluó utilizando el ELISA descrito en el Ejemplo 8-2. Los anticuerpos producidos por todos los transformantes mostraron una actividad de unión a antígeno similar a la del anticuerpo producido por una línea de células recombinantes (cepa 5-03) preparada en el Ejemplo 8 utilizando células CHO/DG44 generales como huésped. Utilizando dichos anticuerpos purificados, se evaluó la actividad de ADCC de cada uno de los anticuerpos híbridos purificados humanos anti-CCR4 de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 8-7. Se muestran los resultados en la figura 43. En comparación con el anticuerpo producido por la cepa 5-03, se observó una actividad de ADCC incrementada en aproximadamente 100 veces en los anticuerpos producidos por CHO/CCR4-LCA y CHO/CCR4-AAL. Por otra parten, no se observó ningún incremento significativo de la actividad de ADCC en el anticuerpo producido por CHO/CCR4-PHA. Además, al comparar las actividades de ADCC de los anticuerpos producidos por CHO/CCR4-LCA e YB2/0 de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 8-7, se encontró que el anticuerpo producido por CHO/CCR4-LCA mostraba una actividad de ADCC más potente que el anticuerpo producido por la cepa 5-03 similar al caso del anticuerpo KM2760-1 producido por la estirpe celular YB2/0 preparada en el Ejemplo 8-1 (figura 44).
(4) Análisis de cadenas de azúcar de anticuerpos producidos por células CHO resistentes a lectinas
Se analizaron las cadenas de azúcar de los anticuerpos híbridos anti-CCR4 purificados humanos en el ítem (3). La solución de cada uno de los anticuerpos purificados se intercambió por KH2 PO4 10 mM utilizando Ultra Free 0,5-10K (fabricado por Millipore). El intercambio se llevó a cabo de manera que la proporción de intercambio fuese de 80 veces o superior. La concentración de los anticuerpos tras el intercambio de soluciones se midió utilizando UV-1600 (fabricado por Shimadzu). Se calculó el coeficiente de absorción molar a partir de la secuencia de aminoácidos de cada anticuerpo basándose en la ecuación (III) a continuación [Advances in Protein Chemistry 12:303, 1962], y se determinó la concentración definiendo la absorbancia a 280 nm en 1,38 mg/ml.
Figure imgf000088_0001
E1mol/l: coeficiente de absorción a 280 nm (mg-1 ml cm-1)
E1mol/ml: coeficiente de absorción molar a 280 nm (M-1cm-1)
A: coeficiente de absorción molar del triptófano a 280 nm = 5.550 (M-1cm-1)
B: coeficiente de absorción molar de la tirosina a 280 nm = 1340 (M-1cm-1)
C: coeficiente de absorción molar de la cistina a 280 nm = 200 (M-1cm-1)
n1 : número de triptófanos por cada molécula de anticuerpo
n2 : número de tirosinas por cada molécula de anticuerpo
n3: número de cistinas por cada molécula de anticuerpo
PM: peso molecular de anticuerpo (g/mol)
En una probeta Hydraclub S-205, se introdujeron 100 jg de cada anticuerpo y se secaron utilizando un evaporador centrífugo. La muestra seca en la probeta se sometió a hidrazinolisis utilizando Hydraclub, fabricado por Hohnen. Se dejó que la muestra reaccionase con la hidrazina a 110°C durante 1 hora utilizando un reactivo de hidrazinolisis fabricado por Hohnen hydrazinolysis [Method of Enzymology 83:263, 1982]. Tras la reacción, se evaporó la hidrazina bajo presión reducida y el tubo de reacción se retornó a la temperatura ambiente dejándolo en reposo durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 250 μl de un reactivo de acetilación fabricado por Hohnen y se añadieron 25 μl de anhídrico acético al mismo, seguido de agitación intensa para la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, se añadieron 250 μl de un reactivo de acetilación y 25 μl de anhídrico acético al mismo, seguido de agitación intensa para la reacción a temperatura ambiente durante 1 hora. La muestra se congeló a -80°C en un congelador y se liofilizó durante aproximadamente 17 horas. Se recuperaron las cadenas de azúcar de la muestra liofilizada utilizando el kit de preparación de glicanos de cartucho de celulosa fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd. La solución de cadenas de azúcar de muestra se secó utilizando un evaporador centrífugo y después de sometió a marcaje fluorescente con 2-aminopiridina [J. Biochem. 95:197, 1984]. La solución de 2-aminopiridina se preparó mediante la adición de 760 μl de HCl por cada 1 g de 2-aminopiridina (solución 1x PA) y diluyendo la solución 10 veces con agua purificada mediante ósmosis inversa (solución de PA diluida 10 veces). La solución de cianoborohidruro sódico se preparó mediante la adición de 20 μl de solución 1x PA y 430 μl de agua purificada mediante ósmosis inversa por cada 10 mg de cianoborohidruro sódico. A la muestra se añadieron 67 μl de una solución de PA diluida 10 veces, seguido de la reacción a 100°C durante 15 minutos y se enfrió espontáneamente y se añadieron adicionalmente a lo anterior 2 μl de cianoborohidruro sódico, seguido de la reacción a 90°C durante 12 horas para el marcaje fluorescente de las cadenas de azúcar de muestra. Los grupos de cadena de azúcar marcados fluorescentemente (grupo de cadena de azúcar tratado con PA) se separaron del exceso de reactivos utilizando una columna Superdex Peptide HR 10/30 (fabricada por Pharmacia). Esta etapa se llevó a cabo utilizando bicarbonato amónico 10 mM como eluyente a un caudal de 0,5 ml/min. y a una temperatura de columna la temperatura ambiente y utilizando un detector de fluorescencia de 320 nm de longitud de onda de excitación y 400 nm de longitud de onda de fluorescencia. El eluido se recuperó 20 a 30 minutos después de la adición de la muestra y se secó utilizando un evaporador centrífugo para la utilización como cadenas de azúcar tratadas con PA purificadas. A continuación, se llevó a cabo el análisis de HPLC de fase inversa de las cadenas de azúcar tratadas con PA purificadas, utilizando una columna CLC-ODS (fabricada por Shimadzu, φ 6,0 nm x 159 nm). La etapa se llevó a cabo a una temperatura de columna de 55°C y a un caudal de 1 ml/min. y utilizando un detector de fluorescencia de 320 nm de longitud de onda de excitación y 400 nm de longitud de onda de fluorescencia. La columna se equilibró con un tampón de fosfato sódico 10 mM (pH 3,8) y la elución se llevó a cabo durante 80 minutos con un gradiente lineal de densidades de 1-butanol al 0,5%. Cada una de las cadenas de azúcar tratadas con PA se identificó mediante análisis de la descomposición de los iones metastables de cada pico de las cadenas de azúcar tratadas con PA separadas, utilizando espectrometría de masas de tiempo de vuelo mediante ionización láser asistida por matriz (análisis de EM MALDI-TOF, por sus siglas en inglés), la comparación de las posiciones de elución con estándares de cadena de azúcar tratada con PA fabricados por Takara Shuzo, y el análisis de HPLC de fase inversa tras la digestión de cada cadena de azúcar tratada con PA utilizando diversos enzimas (figura 45). El contenido de cada una de las cadenas de azúcar se estimó a partir del área de cada pico de cadena de azúcar tratada con PA mediante análisis de HPLC de fase inversa. Se excluyeron de la estimación de área de pico las cadenas de azúcar tratadas con PA el extremo reductor de las cuales no fuese N-acetilglucosamina, debido a que constituían impurezas o productos secundarios durante la preparación de las cadenas de azúcar tratadas con PA.
El análisis se llevó a cabo de la misma manera que en el Ejemplo 11(6), utilizando un tampón de fosfato sódico (pH 3,8) como tampón A y un tampón de fosfato sódico (pH 3,8) 1-butanol al 0,5% como tampón B.
En la figura 45, se calculó la proporción de grupos de cadena de azúcar libre de a-1,6-fucosa a partir del área ocupada por los picos (i) a (iv) respecto a la ocupada por (i) a (viii), y la proporción de grupos de cadena de azúcar con unión de α-1 ,6 -fucosa, a partir del área ocupada por los picos (v) a (viii) respecto a la ocupada por (i) a (viii).
Los resultados del análisis de estructuras de cadena de azúcar de los anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4 purificados producidos por las estirpes celulares resistentes a lectina se muestran en la Tabla 6 . Los resultados muestran el análisis de cadenas de azúcar del anticuerpo híbrido humano anti-CCR4 producido por estirpes celulares resistentes a lectina. La proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa (%) calculada a partir de las áreas de pico mediante el análisis según el método descrito en el Ejemplo d(4) se muestra en la tabla.
Tabla 6
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En comparación con el anticuerpo producido por la cepa 5-03, la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa se incrementó de 9% a 48% en el anticuerpo producido por CHO/CCR4-LCA al calcularla a partir del área del pico analizado. La proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa se incrementó a de 9% a 27% en el anticuerpo producido por CHO/CCR4-AAL. Por otra parte, no se observaron prácticamente cambios en el patrón de cadenas de azúcar y en la proporción de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa en la estirpe celular resistente a PHA en comparación con la cepa 5-03.
Ejemplo 15
Análisis de las estirpes celulares CHO resistentes a lectina:
1. Análisis del nivel de expresión de enzima GMD en la estirpe celular CHO/CCR4-LCA productora de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4
Mediante el método de RT-PCR se analizó el nivel de expresión de cada uno de los genes de la GMD (GDP-manosa 4,6-deshidratasa), de GFPP (GDP-ceto-6-desoximanosa 3,5-epimerasa, 4-reductasa) y de FX (GDP-beta-L-fucosa pirofosforilasa) conocidos como enzimas biosintéticos de la fucosa y de FUT8 (a-1,6-fucosiltransferasa) como fucosa transferasa, en la estirpe celular CHO/CCR4-LCA productora de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4 obtenida en el Ejemplo 14.
(1) Preparación de ARN a partir de diversas estirpes celulares
Cada una de las estirpes celulares CHO/DG44, la estirpe celular 5-03 productora de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4 obtenida en el Ejemplo 8-1(2) y la estirpe celular CHO/CCR4-LCA productora de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4 obtenida en el Ejemplo 14(2), se subcultivó a 37°C en un incubador con 5% de CO2 y después se cultivó durante 4 días. Tras el cultivo de las mismas, se preparó ARN total a partir de 1x107 células de cada estirpe celular utilizando el minikit RNeasy Protect (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante. A continuación, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 5 μg de cada ARN en 20 μl de una solución de reacción utilizando el sistema de síntesis de primera cadena Super Script para RT-PCR (fabricado por Gibco Brl) siguiendo las instrucciones del fabricante.
(2) Análisis del nivel de expresión del gen GMD mediante RT-PCR
Con el fin de amplificar el ADN de GMD mediante PCR, se preparó un cebador de ADN sintético 24-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 32 y un cebador de ADN sintético 26-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 33, basándose en la secuencia de ADNc obtenida de células CHO que se muestra en el Ejemplo 17-1.
A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 jM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 32 y n° 33] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 30 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 350 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).
(3) Análisis del nivel de expresión del gen GFPP mediante RT-PCR
Con el fin de amplificar el ADNc de GFPP mediante PCR, se preparó un cebador de ADN sintético 27-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 34 y un cebador de ADN sintético 23-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 35, basándose en la secuencia de ADNc de GFPP obtenida de células CHO que se muestra en el Ejemplo 16-2.
A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 jM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 34 y n° 35] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 24 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 600 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).
(4) Análisis del nivel de expresión del gen FX mediante RT-PCR
Con el fin de amplificar el ADNc de FX mediante PCR, se preparó un cebador de ADN sintético 28-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC iD n° 36 y un cebador de ADN sintético 28-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 37, basándose en la secuencia de ADNc de FX obtenida de células CHO que se muestra en el Ejemplo 16-1.
A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 jM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 36 y n° 37] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 22 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).
(5) Análisis del nivel de expresión del gen FUT8 mediante RT-PCR
Con el fin de amplificar el ADNc de FUT8 mediante PCR, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 jM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 13 y n° 14] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 20 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 600 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).
(6) Análisis del nivel de expresión del gen de p-actina mediante RT-PCR
Con el fin de amplificar el ADNc de p-actina mediante PCR, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 ml, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 jM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 15 y n° 16] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla preparada a partir de cada estirpe celular en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 14 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras someter 10 μl de la solución de reacción de PCR a electroforesis en agarosa, se tiñeron los fragmentos de ADN utilizando verde Cybrer (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN de aproximadamente 800 pb utilizando un Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics).
(7) Niveles de expresión de los genes de GMD, GFPP, FX y FUT8 en cada estirpe celular
La cantidad de fragmento amplificado por PCR de cada gen en las cepas 5-03 y CHO/CCR4-LCA se calculó dividiendo los valores de las cantidades de los fragmentos amplificados por PCR obtenidos del ADNc de GMD, GFPP, FX y FUT en cada estirpe celular medidos en los ítems (2) a (6) por el valor de la cantidad del fragmento amplificado por PCR obtenido del ADNc de p-actina en cada estirpe celular, y definiendo la cantidad de los fragmentos amplificados por PCR en las células CHO/DG44 como 1. Se muestran los resultados en la Tabla 7.
Tabla 7
Figure imgf000090_0001
Tal como se muestra en la Tabla 7, el nivel de expresión del gen GDM en CHO/CCR4-LCA se redujo a aproximadamente 1/10 en comparación con las otras estirpes celulares. En este caso el ensayo se llevó a cabo independientemente dos veces y se utilizó el valor promedio.
2. Análisis utilizando CHO/CCR4-LCA productor de anticuerpos híbridos humanos anti-CCR4 en la que se ha forzado la expresión del gen GMD
(1) Construcción del vector de expresión pAGE249GMD del gen GMD obtenido de células CHO
Basándose en la secuencia de ADN de GMD derivada de células CHO obtenida en el Ejemplo 17-1, se preparó un cebador 28-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 38 y un cebador 29-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 39. A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 38 y n° 39] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla de GMD preparado a partir de las células CHO en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 8 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 58°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto en un ciclo, y después 22 ciclos de calentamiento a 94°C durante I minuto y 68°C en un ciclo. Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 600 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se conectó al vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando ele ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener un plásmido mt-C (ver la figura 46).
A continuación, basándose en la secuencia de ADNc de GMD derivada de células CHO obtenida en el Ejemplo 17-1, se preparó un cebador 45-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 40 y un cebador 31-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos mostrada en SEC ID n° 41. A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 40 y n° 41] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla de GMD preparado a partir de las células CHO en el ítem (1) como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 8 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 57°C durante 1 minuto y 72°C durante 1 minuto en un ciclo, y después 22 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 150 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se conectó al vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando ele ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener el plásmido ATG (ver la figura 47).
A continuación, se dejó reaccionasen 3 μg del plásmido CHO-GMD preparado en el Ejemplo 17-1 con el enzima de restricción SacI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 900 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se dejó que el plásmido mt-C (1,4 μg) reaccionase con el enzima de restricción SacI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 3,1 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN recuperados se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido, obteniendo el plásmido WT-N(-) (ver la figura 48).
A continuación, se dejó que 2 μg del plásmido WT-N(-) reaccionasen con el enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se dejó que el plásmido pBluescript SK(-) (3 μg, fabricado por Stratagene) reaccionase con el enzima de restricción BamHI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 3 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN recuperados se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido, obteniendo el plásmido WT-N(-) en pBS (ver la figura 49).
A continuación, se dejó que 2 μg del plásmido WT-N(-) en pBS reaccionasen con el enzima de restricción HindlII (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 4 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se dejó que una porción de 2 jg del plásmido ATG reaccionase con el enzima de restricción HindIII (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, se recuperó un ADN llevando a cabo la extracción con fenol/cloroformo y la precipitación con etanol y se dejó que reaccionase con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas, el ADN digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 150 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN respectivos recuperados se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido, obteniendo el plásmido WT en pBS (ver la figura 50).
A continuación, se dejó que reaccionasen 2 jg del plásmido pAGE249 con los enzimas de restricción HindIII y BamHI (ambos fabricados por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas y el digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 6,5 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se dejó que reaccionase el plásmido WT (2 jg ) con los enzimas de restricción HindIII y BamHI (ambos fabricados por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas y el digerido se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 1,2 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN respectivos recuperados se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido, obteniendo el plásmido pAGE249GMD (ver la figura 51).
(2) Expresión estable del gen GMD en CHO/CCR4-LCA
El vector de expresión pAGE249GMD (5 jg ) del gen GMD obtenido de células CHO linearizado mediante la digestión del mismo con el enzima de restricción FspI (fabricado por New England Biolabs), introducido en 1,6x106 células CHO7CCR4-LCA mediante electroporación [Cytotechnology 3:133, 1990]. A continuación, las células se suspendieron en 30 ml de medio IMDM-dFBS(10) [medio IMDM (fabricado por Gibco BRL) complementado con 10% de dFBS] que contenía MTX 200 nM (fabricado por Sigma) y cultivadas utilizando un matraz de 182 cm2 (fabricado por Greiner) a 37°C durante 24 horas en un incubador con 5% de CO2. Tras cultivarlas, el medio se cambio por medio IMDM-dFBS(10) que contenía 0,5 mg/ml de higromicina y MTX 200 nM (fabricado por Sigma), seguido del cultivo durante 19 días, obteniendo colonias de transformantes resistentes a higromicina.
De la misma manera, se introdujo el vector pAGE249 en CHO/CCR4-LCA mediante el mismo método, obteniendo colonias de transformantes resistentes a higromicina.
(3) Cultivo de CHO/CCR4-LCA expresantes de gen GMD y purificación del anticuerpo
Utilizando el medio IMDM-dFBS(10) que comprendía MTX 200 nM (fabricado por Sigma) y 0,5 mg/ml de higromicina, las células transformantes expresantes de GMD obtenidas en el ítem (2) se cultivaron utilizando un matraz de 182 cm2 (fabricado por Greiner) a 37°C en un incubador con 5% de CO2. Varios días después, tras alcanzar la densidad celular la confluencia, se descartó el sobrenadante del cultivo y las células se lavaron con 25 ml de tampón PBS (fabricado por Gibco BRL) y después se mezclaron con 35 ml de medio EXCELL 301 (fabricado por JRH). Tras cultivarlas a 37°C en un incubador con 5% de CO2 durante 7 días, se recuperó el sobrenadante de cultivo. Se purificó el anticuerpo híbrido anti-CCR4 a partir del sobrenadante de cultivo utilizando una columna Prosep-A (fabricada por Millipore) siguiendo las instrucciones del fabricante.
De la misma manera, las células transformantes en las que se había introducido el vector pAGE249 se cultivaron mediante el mismo método y después se recuperó el anticuerpo híbrido anti-CCR4 y se purificó a partir del sobrenadante de cultivo.
(4) Medición de la resistencia a lectinas en células transformadas
Las células transformantes expresantes de GMD obtenidas en el ítem (2) se suspendieron en medio IMDM-dFBS(10) que comprendía MTX 200 nM (fabricado por Sigma) y 0,5 mg/ml de higromicina, proporcionando una densidad de 6x104 células/ml, y la suspensión se dispensó en porciones de 50 μl/pocillo en una placa de cultivo de 96 pocilios (fabricada por Iwaki Glass). A continuación, un medio preparado mediante suspensión a concentraciones de 0 mg/ml, 0,4 mg/ml, 1,6 mg/ml o 4 mg/ml de LCA (aglutinina de Lens culinaris: fabricada por Vector Laboratories) en medio IMDM-dFBS(10) que contenía MTX 200 nM (fabricado por Sigma) y se añadieron 0,5 mg/ml de higromicina a la placa a razón de 50 μl/pocillo, seguido del cultivo de las mismas a 37°C durante 96 horas en un incubador con 5% de CO2. Tras cultivarlas, se añadió WST-I (fabricado por Boehringer) a razón de 10 μl/pocillo y se incubaron a 37°C durante 30 minutos en un incubador con 5% de CO2 para producir el revelado del color y después se midió la absorbancia a 450 nm y a 595 nm (en adelante denominada "DO450" y "DO595", respectivamente) utilizando un lector de microplacas (fabricado por Bio-Rad). De la misma manera, se midieron mediante el mismo método las células transformantes en las que se había introducido el vector pAGE249. El ensayo se llevó a cabo dos veces de manera independiente.
La figura 52 muestra el número de células supervivientes en cada pocillo en porcentaje al utilizar un valor calculado restando DO595 de DO450 medidas anteriormente, como el número de supervivientes de cada grupo celular y el número de células supervivientes en cada uno de los pocillos libres de LCA se define como 100%. Tal como se muestra en la figura 52, se observó una reducción de la resistencia a LCA en las células CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD y la proporción de supervivencia era de aproximadamente 40% en presencia de 0,2 mg/ml de LCA y la proporción de supervivencia era de aproximadamente 20% en presencia de 0,8 mg/ml de LCA. Por otra parte, en las células CHO/CCR4-LCA en las que se había introducido el vector pAGE249, la proporción de supervivencia era de 100% en presencia de 0,2 mg/ml de LCA y la proporción de supervivencia era de aproximadamente 80% incluso en presencia de 0,8 mg/ml de LCA. Basándose en estos resultados, se sugiere que el nivel de expresión del gen GMD en las células CHO/CCR4-LCA se encuentra reducido y, como resultado, se obtuvo una resistencia a LCA.
(5) Actividad citotóxica (actividad de ADCC) in vitro de anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido de CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD
Con el fin de evaluar la actividad citotóxica in vitro del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido en el ítem (3), se midió la actividad de ADCC de acuerdo con los métodos siguientes.
i) Preparación de una suspensión de células diana
Se añadieron 3,7 MBq equivalentes de una sustancia radioactiva Na251CrO4 a 1x106 células de CCR4-EL4 (ver el Ejemplo 8-7) cultivadas utilizando un medio preparado mediante la adición de 500 μg/ml de G418 sulfato (fabricado por Nacalai Tesque) al medio RPMI1640-FBS(10), seguido de la reacción a 37°C durante 90 minutos, marcando de esta manera las células con un isótopo radioactivo. Tras la reacción, las células se lavaron tres veces en la suspensión de medio RPMI1640-FBS(10) y la posterior centrifugación, se resuspendieron en el medio y después se incubaron a 4°C durante 30 minutos en hielo para la disociación espontánea de la sustancia radioactiva. Tras la centrifugación, se ajustaron las células a 2x105 células/ml mediante la adición de 5 ml de medio RPMI1640-FBS(10) y se utilizaron como suspensión de células diana.
ii) Preparación de una suspensión de células efectoras
De una persona sana se recolectaron 50 ml de sangre venosa y se mezclaron suavemente con 0,5 ml de heparina sodio (fabricado por Takeda Pharmaceutical). Utilizando Lymphoprep (fabricado por Nycomed Pharma AS), la mezcla se centrifugó siguiendo las instrucciones del fabricante para separar una capa de células mononucleares. Las células se lavaron tres veces mediante centrifugación utilizando medio RPMI1640-FBS(10) y después se resuspendieron en el medio, proporcionando una densidad de 2x106 células/ml y se utilizaron como suspensión de células efectoras.
iii) Medición de la actividad ADCC
La suspensión de células diana preparada en 1) se dispensó a razón de 50 μl (1x104 células/pocillo) en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fondo en U (fabricada por Falcon). A continuación, se añadieron 100 μl de la suspensión de células efectoras humanas preparada en 2) a lo anterior (2x105 células/pocillo, la proporción de células efectoras humanas a células diana era de 25: 1). Se añadió a lo anterior cada uno de los diversos anticuerpos híbridos anti-CCR4 (el anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado en el ítem (3), y KM2760-1 y MM3060), proporcionando una concentración final de entre 0,0025 y 2,5 μg/ml, seguido de la reacción a 37°C durante 4 horas. Tras la reacción, se centrifugó la placa y se midió la cantidad de 51Cr en el sobrenadante utilizando un contador y. Se calculó la cantidad de 51Cr disociado espontáneamente llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la suspensión de células efectoras humanas y la solución de anticuerpo y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la cantidad de 51Cr disociado total llevando a cabo el mismo procedimiento, utilizando únicamente el medio en lugar de la solución de anticuerpo y una solución 1 N de ácido clorhídrico en lugar de la suspensión de células efectoras humanas y midiendo la cantidad de 51Cr en el sobrenadante. Se calculó la actividad ADCC basándose en la fórmula (II).
Los resultados de las mediciones de actividad de ADCC se muestran en la figura 53. Tal como se muestra en la figura 53, la actividad de ADCC del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido de las CHO7CCR4-LCA expresantes de GMD se redujo en medida similar a la de KM3060 obtenido en el Ejemplo 8. Por otra parte, la actividad de ADCC del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido de las CHO7CCR4-LCA en las que se había introducido el vector pAGE249 mostró un grado de actividad de ADCC similar a la del anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido a partir de las CHO/CCR4-LCA. Basándose en estos resultados, se sugiere que el nivel de expresión del gen GMD en las células CHO/CCR4-LCA se encuentra reducido y, como resultado, puede producirse un anticuerpo con una potente actividad de ADCC.
(6) Análisis de cadenas de azúcar del anticuerpo híbrido anti-CCR4 obtenido de CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD
Las cadenas de azúcar que se unían al anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido en el ítem (3) se analizaron de acuerdo con el método mostrado en el Ejemplo 14(4), mostrándose los resultados del análisis en la figura 55. En comparación con el anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado preparado a partir de CHO/CCR4-LCA en el Ejemplo 14, la proporción de cadenas de azúcar que no presentan a-1,6-fucosa en el anticuerpo híbrido anti-CCR4 purificado obtenido de las CHO/CCR4-LCA expresantes de GMD se redujo a 9% al calcular a partir del área del pico. De esta manera, se demostró que la proporción de cadenas de azúcar que no presentaban a-1,6-fucosa en el anticuerpo producido por la célula se reducía a un nivel similar al del anticuerpo producido por la cepa 5-03, mediante la expresión del gen GMD en las CHO/CCR4-LCA.
Ejemplo 16
Preparación de diversos genes codificantes de enzimas relacionados con la síntesis de cadenas de azúcar en las células CHO:
1. Determinación de la secuencia de ADNc de FX obtenido de células CHO
(1) Extracción de ARN total de las células CHO/DG44
Las células CHO/DG44 se suspendieron en medio IMDM que contenía suero de feto bovino al 10% (fabricado por Life Technologies) y complemento HT a concentración 1x (fabricado por Life Technologies) y se inocularon 15 ml de la suspensión en un matraz T75 para la utilización en cultivo celular adherente (fabricado por Greiner), proporcionando una densidad de 2x105 células/ml. El segundo día después del cultivo de las mismas a 37°C en un incubador con 5% de CO2 , se recuperaron 1x107 células y se extrajo el ARN total de las mismas utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) siguiendo las instrucciones del fabricante.
(2) Preparación de ADNc de cadena sencilla a partir de células CHO/DG44
El ARN total preparado en (1) se disolvió en 45 μl de agua estéril y se añadió a lo anterior 1 μl de ADNasa libre de ARNasa RQ1 (fabricada por Promega), 5 μl del tampón 10x de ADNasa adjunto y 0,5 μl de inhibidor de ribonucleasa RNasin (fabricado por Promega), seguido de la reacción a 37°C durante 30 minutos para degradar el ADN genómico contaminante en la muestra. Tras la reacción, se purificó nuevamente el ARN total utilizando RNAeasy (fabricado por Qiagen) y se disolvió en 50 μl de agua estéril.
En 20 μl de la mezcla de reacción utilizando oligo(dT) como cebador, se sintetizó ADNc de cadena sencilla a partir de 3 μg de cada una de las muestras de ARN total obtenidas mediante reacción de transcripción inversa utilizando el sistema de preamplificación Superscript™ para la síntesis del ADNc de primera cadena (fabricado por Life Technologies) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó una solución acuosa diluida 50 veces de la solución de reacción en la clonación de GFPP y FX. Lo anterior se almacenó a -80°C hasta que fue utilizado.
(3) Preparación de fragmento parcial de ADNc de FX obtenido de hámster chino
Mediante el procedimiento a continuación se preparó el fragmento parcial de ADNc de FX obtenido de hámster chino.
En primer lugar, se diseñaron cebadores (mostrados en SEC ID n° 42 y n° 43) específicos para secuencias de nucleótidos comunes registradas en una base de datos pública, es decir, un ADNc de FX humano (GeneBank n° de acceso U58766) y un ADNc de ratón (GenBank n° de acceso M30127).
A continuación, se prepararon 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmoles/l de los dNTP y 0,5 μmoles/l de cebadores específicos (SEC ID n° 42 y SEC ID n° 43)] que contenía 1 μl del ADNc de cadena sencilla obtenido de células CHO/DG44 y se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 5 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 58°C durante 2 minutos y 72°C durante 3 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72°C durante 10 minutos.
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2% y un fragmento amplificado específico de 301 pb se purificó utilizando el kit QuiaexII Gel (fabricado por Qiagen) y se eluyó con 20 μl de agua estéril (en adelante el método se utiliza para la purificación de fragmentos de ADN a partir de un gel de agarosa). En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 μl del fragmento amplificado para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) y se transformó E. coli DH5a con la solución de reacción mediante el método de Cohen et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, 1972] (en adelante el método se utiliza para la transformación de E. coli). Se aislaron muestras de ADN plasmídico siguiendo un método conocido [Nucleic Acids Research 7:1513, 1979] (en adelante se utilizó el método para el aislamiento de plásmido) a partir de las colonias resistentes a canamicina obtenidas para obtener 2 clones en los que se habían insertado fragmentos parciales de ADNc de FX, respectivamente. Se denominan pCRFX clon 8 y pCRFX clon 12.
La secuencia de nucleótidos del ADNc insertado en cada uno de los clon 8 de FX y clon 12 de FX se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que cada uno de los ADNc insertados la secuencia de los cuales se había determinado codificaba una secuencia parcial de marco de lectura abierta (ORF) de FX de hámster chino.
(4) Síntesis de ADNc de cadena sencilla para RACE
Se prepararon muestras de ADNc de cadena sencilla para 5'- y 3'-RACE a partir del ARN total de CHO/DG44 extraído en el ítem (1) utilizando el kit de amplificación de ADNc RACE SMARTTM (fabricado por Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso como transcriptasa inversa se utilizó la transcriptasa inversa PowerScript™ (fabricada por Clontech). Cada ADNc de cadena sencilla tras la preparación se diluyó 10 veces con el tampón de tricina-EDTA adjunto en el kit y se utilizó como molde para la PCR.
(5) Determinación mediante el método RACE del ADNc de longitud completa de FX obtenido de hámster chino
Basándose en la secuencia parcial del FX obtenida de hámster chino determinada en el ítem (3), se diseñaron los cebadores FXGSP1-1 (SEC ID n° 44) y FXGSP1-2 (SEC ID n° 45) para 5'-RACE específico de FX de hámster chino y cebadores FXGSP2-1 (SEC ID n° 46) y FXGSP2-2 (SEC ID n° 47) para 3'-RACE específico de FX de hámster chino.
A continuación, se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el kit de PCR Advantage2 (fabricado por Clontech), mediante la preparación de 50 μl de una solución de reacción [tampón para PCR Advantage2 (fabricado por Clontech), dNTP 0,2 mM, 0,2 μmoles/l de cebadores específicos de FX de hámster chino y concentración 1x de cebadores comunes (fabricados por Clontech)] que contenía 1 μl del ADNc de cadena sencilla obtenido de CHO/DG44 para RACE preparado en el ítem (4).
La PCR se llevó a cabo repitiendo 20 ciclos de calentamiento a 94°C durante 5 segundos, 68°C durante 10 segundos y 72°C durante 2 minutos en un ciclo.
Tras completar la reacción, se diluyó 1 μl de la solución de reacción 50 veces con el tampón de tricina-EDTA y se utilizó a modo de molde 1 μl de la solución diluida. La solución de reacción se preparó nuevamente y la PCR se llevó a cabo bajo las mismas condiciones. Los moldes, la combinación de cebadores utilizada en la primera y segunda PCR y la longitud de los fragmentos de ADN amplificados por las PCR se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8
Combinación de cebadores utilizados en PCR RACE de ADNc de FX de hámster chino y tamaño de los productos de PCR
Figure imgf000095_0001
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1% y el fragmento amplificado específico de interés se purificó utilizando el kit de extracción en gel QiaexII (fabricado por Qiagen) y se eluyó con 20 ml de agua estéril. En un plásmido pCR2.1, se insertaron 4 μl del fragmento amplificado y se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen).
Se aislaron los ADN plasmídicos a partir de las colonias resistentes a canamicina que aparecieron, con el fin de obtener 5 clones de ADNc que contenían la región 5' de FX de hámster chino. Se denominaron FX5' clon 25, FX5' clon 26, FX5' clon 27, FX5' clon 28, FX5' clon 31 y FX5' clon 32.
De la misma manera, se obtuvieron 5 clones de ADNc que contenían la región 3' de FX de hámster chino. Estos clones 3' de FX se denominaron FX3' clon 1, FX3' clon 3, FX3' clon 6, FX3' clon 8 y FX3' clon 9.
La secuencia de nucleótidos de la fracción de ADNc de cada uno de los clones obtenidos mediante RACE 5' y 3' se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) según el método descrito en las instrucciones del fabricante. Mediante la comparación de las secuencias de nucleótidos del ADNc determinadas mediante el método, se excluyeron los errores de lectura de las bases nucleótidas debidos a la PCR y se determinó la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ADNc de FX de hámster chino. La secuencia determinada se muestra en SEC ID n° 48.
2. Determinación de la secuencia de ADNc de GFPP obtenida de células CHO
(1) Preparación de fragmento parcial de ADNc de GFPP obtenido de hámster chino
Mediante el procedimiento a continuación se preparó el fragmento parcial de ADNc de GFPP obtenido de hámster chino.
En primer lugar, se compararon las secuencias de nucleótidos de un ADNc de GFPP (GenBank n° de acceso AF017445), las secuencias de EST de ratón con alta homología con la secuencia (GenBank n° de acceso AI467195, AA422658, BE304325 y AI466474) y secuencias de EST de rata (GenBank n° de acceso BF546372, AI058400 y AW144783), registradas en bases de datos públicas y se diseñaron los cebadores GFPP FW9 y GFPP RV9 (SEC ID n° 49 y n° 50) específicos para GFPP de rata en una región altamente conservada en estas tres especies.
A continuación, se llevó a cabo una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando una ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo) mediante la preparación de 25 μl de una solución de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mM de los dNTP y 0,5 jmoles/l de cebadores específicos para GFPP FW9 y GFPP RV9 (SEC ID n° 49 y SEC ID n° 50)] que contenía 1 μg del ADNc de cadena sencilla obtenido de CHO/DG44 preparado en el ítem 1(2). La PCR se llevó a cabo mediante el calentamiento a 94°C durante 5 minuto, seguido de 30 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 58°C durante 2 minutos y 72°C durante 3 minutos en un ciclo, y calentamiento final a 72°C durante 10 minutos.
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 2% y el fragmento amplificado específico de 1,4 Kpb se purificó utilizando el kit de extracción en gel QiaexII (fabricado por Qiagen) y se eluyó con 20 μl de agua estéril. En un plásmido pCR2.1, se utilizaron 4 μl del fragmento amplificado para la inserción siguiendo las instrucciones del fabricante del kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen) y se transformó E. coli DH5a con la solución de reacción.
Se aislaron los ADN plasmídicos a partir de las colonias resistentes a canamicina que aparecieron, con el fin de obtener 3 clones en los que se integraron respectivamente fragmentos parciales de ADNc de GFPP. Se denominan GFPP clon 8, GFPP clon 11 y GFPP clon 12.
La secuencia de nucleótidos del ADNc insertado en cada uno de los clones GFPP clon 8, GFPP clon 11 y GFPP clon 12 se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) y el kit BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction (fabricado por Perkin Elmer) siguiendo el método en las instrucciones del fabricante. Se confirmó que el ADNc insertado la secuencia del cual se había determinado codificaba una secuencia parcial de marco de lectura abierta (ORF) de GFPP de hámster chino.
(2) Determinación mediante el método RACE del ADNc de longitud completa de GFPP obtenido de hámster chino
Basándose en la secuencia parcial del FX obtenida de hámster chino determinada en el ítem 2(1), se diseñaron los cebadores GFPP GSP1-1 (SEC ID n° 52) y GFPP GSP1-2 (SEC ID n° 53) para 5'-RACE específico de FX de hámster chino y cebadores GFPP GSP2-1 (SEC ID n° 54) y GFPP GSP2-2 (SEC ID n° 55) para 3'-RACE específico de GFPP de hámster chino.
A continuación, se llevó a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando el kit de PCR Advantage2 (fabricado por Clontech), mediante la preparación de 50 μl de una solución de reacción [tampón para PCR Advantage2 (fabricado por Clontech), dNTP 0,2 mM, 0,2 jmoles/l de cebadores específicos de GFPP de hámster chino para RACE y concentración 1x de cebadores comunes (fabricados por Clontech)] que contenía 1 μl del ADNc de cadena sencilla obtenido de CHO/DG44 para RACE preparado en el ítem (4).
La PCR se llevó a cabo repitiendo 20 ciclos de calentamiento a 94°C durante 5 segundos, 68°C durante 10 segundos y 72°C durante 2 minutos en un ciclo.
Tras completar la reacción, se diluyó 1 μl de la solución de reacción 50 veces con el tampón de tricina-EDTA y se utilizó a modo de molde 1 μl de la solución diluida. La solución de reacción se preparó nuevamente y la PCR se llevó a cabo bajo las mismas condiciones. Los moldes, la combinación de cebadores utilizada en la primera y segunda PCR y la longitud de los fragmentos de ADN amplificados mediante las PCR se muestran en la Tabla 9.
Tabla 9
Figure imgf000097_0001
Tras la PCR, la solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1% y el fragmento amplificado específico de interés se purificó utilizando el kit de extracción en gel QiaexIl (fabricado por Qiagen) y se eluyó con 20 μl de agua estéril. En un plásmido pCR2.1, se insertaron 4 μl del fragmento amplificado y se transformó E. coli DH5a utilizando la solución de reacción de acuerdo con las instrucciones adjuntas al kit de clonación TOPO TA (fabricado por Invitrogen).
Se aislaron los ADN plasmídicos a partir de las colonias resistentes a canamicina que aparecieron, con el fin de obtener 4 clones de ADNc que contenían la región 5' de GFPP de hámster chino. Se denominaron GFPP5' clon 1, GFPP5' clon 2, GFPP5' clon 3 y GFPP5' clon 4.
De la misma manera, se obtuvieron 5 clones de ADNc que contenían la región 3' de GFPP de hámster chino. Se denominaron GFPP3' clon 10, GFPP3' clon 16 y GFPP3' clon 20.
La secuencia de nucleótidos del ADNc de cada uno de los clones obtenidos mediante RACE 5' y 3' se determinó utilizando el secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer) según el método descrito en las instrucciones del fabricante. Mediante la comparación de las secuencias de nucleótidos del ADNc después de la determinación de las secuencias de nucleótidos, se excluyeron los errores de lectura de las bases debidos a la PCR y se determinó la secuencia de nucleótidos de longitud completa del ADNc de GFPP de hámster chino. La secuencia determinada se muestra en SEC ID n° 51.
Ejemplo 17
Preparación de gen GDM obtenido de células CHO:
1. Determinación de la secuencia de ADNc de GMD obtenida de células CHO
(1) Preparación de ADNc de gen GMD obtenido de células CHO (preparación de ADNc parcial excluyendo las secuencias 5'- y 3'-terminales)
Se buscó el ADNc de GMD obtenido de roedores en una base de datos pública (BLAST) utilizando una secuencia de ADNc de GMD de origen humano (GenBank n° de acceso AF042377) registrada en GenBank como pregunta y se obtuvieron tres tipos de secuencia EST de ratón (GenBank n° de acceso BE986856, BF158988 y BE284785). Mediante la ligación de estas secuencias EST, se determinó una secuencia de ADNc de GMD de ratón deducida. Basándose en la secuencia de ADNc de GMD de origen ratón, se generó un cebador 28-mero que presentaba la secuencia representada por SEC ID n° 56, un cebador 27-mero que presentaba la secuencia representada por SEC ID n° 57, un cebador 25-mero que presentaba la secuencia representada por SEC ID n° 58, un cebador 24-mero que presentaba la secuencia representada por SEC ID n° 59 y un cebador 25-mero que presentaba la secuencia representada por SEC ID n° 60.
A continuación, con el fin de amplificar el ADNc de GMD obtenido de células CHO, se llevó a cabo una PCR mediante el método a continuación. Una porción de 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 jM de dos cebadores de ADN sintéticos] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla obtenido de células CHO preparado en el Ejemplo 15-1(1) como molde. En este caso, se utilizaron las combinaciones de SEC ID n° 56 y SEC ID n° 57, SEC ID n° 58 y SEC ID n° 57, SEC ID n° 56 y SEC ID n° 59 o SEC ID n° 56 y SEQ ID n° 60 a modo de cebadores de ADN sintéticos. La reacción se llevó a cabo utilizando un ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y los posteriores 30 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo.
La solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa para encontrar que se había amplificado un fragmento de ADN de aproximadamente 1,5 kpb en el producto de PCR al utilizar los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 56 y n° 57, se amplificó un fragmento de aproximadamente 1,1 kpb en el producto de PCR al utilizar los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 57 y n° 59, se amplificó de fragmento de aproximadamente 350 pb en el producto de PCR al utilizar los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 56 y n° 59 y se amplificó un fragmento de aproximadamente 1 kpb en el producto de PCR al utilizar los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 56 y n° 60. Se recuperaron los fragmentos de ADN utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN recuperados se ligaron a un vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y se transformó E. coli DH (preparado por Toyobo) utilizando las muestras obtenidas de ADN plasmídico recombinante, obteniendo de esta manera los plásmidos 22-8 (que presenta un fragmento de ADN de aproximadamente 1.2 kpb amplificado a partir de cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 56 y SEC ID n° 57), 23-3 (que presenta un fragmento de ADN de aproximadamente 1,1 kpb amplificado a partir de cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 58 y SEC ID n° 57), 31-5 (un fragmento de ADN de aproximadamente 350 pb amplificado a partir de cebadores de a Dn sintéticos de Se C ID n° 56 y SEC ID n° 59) y 34-2 (que presenta un fragmento de ADN de aproximadamente 1 kpb amplificado a partir de cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 56 y SEC ID n° 60). La secuencia de ADNc de GMD obtenida de células CHO contenida en dichos plásmidos se determinó del modo habitual utilizando un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por Perkin Elmer) (ya que una secuencia de 28 bases situada cadena abajo del codón de inicio metionina en el lado 5'-terminal y una secuencia de 27 bases situada cadena arriba del codón de terminación en el lado 3'-terminal originadas en secuencias de ADN de oligo sintético, son secuencias de ADNc de GMD de ratón).
Además, se llevaron a cabo las etapas siguientes con el fin de preparar un plásmido en el que se combinaron los fragmentos de ADNc de GMD obtenidos de células CHO contenidos en los plásmidos 22-8 y 34-2. Se dejó que reaccionase el plásmido 22-8 (1 μg) con el enzima de restricción EcoRI (fabricado por Takara Shuzo) a 37°C durante 16 horas y el digerido se sometió a electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 4 kpb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Se dejó que reaccionase el plásmido 34-2 (2 jg ) con el enzima de restricción EcoRI a 37°C durante 16 horas y el digerido se sometió a electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 150 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por Bio 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los fragmentos de ADN recuperados se sometieron respectivamente a desfosforilación terminal utilizando fosfatasa alcalina de intestino bovino (fabricada por Takara Shuzo) y después se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y se transformó E. coli DH5a (preparado por Toyobo) utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido, obteniendo un plásmido CHO-GMD (ver la figura 54).
(2) Determinación de la secuencia 5'-terminal de ADNc de GMD obtenida de células CHO
Se preparó un cebador 24-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 61 a partir de las secuencias de nucleótidos de la región no codificante del lado 5'-terminal del ADNc de GMD humano y de ratón obtenido de células CHO, y un cebador 32-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 62 a partir de la secuencia de ADNc de GMD obtenida de células CHO y se llevó a cabo la PCR mediante el método proporcionado a continuación para la amplificación del ADNc. A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 jM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 61 y n° 62] que contenían 0,5 μl del ADNc de cadena sencilla de GMD preparado en el Ejemplo 15-1(1) como molde, y se llevó a cabo la reacción en el mismo utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 20 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto, 55°C durante 1 minuto y 72°C durante 2 minutos en un ciclo, seguido de 18 ciclos de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras el fraccionamiento de la solución de reacción de PCR mediante electroforesis en agarosa, se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 300 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se ligó a un vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener de esta manera 5'-GMD del plásmido. Utilizando un secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer), se determinó la secuencia de nucleótidos de 28 bases situada cadena bajo de la metionina de inicio del ADNc de GMD obtenida de células CHO contenida en el plásmido.
(3) Determinación de la secuencia 3'-terminal del ADNc de GMD obtenido de células CHO
Con el fin de obtener la secuencia 3'-terminal del ADNc de GMD obtenida de células CHO, se llevó a cabo el método RACE mediante el método a continuación. Se preparó ADNc de cadena sencilla para 3'-RACE a partir del ADNc obtenido de células CHO obtenido en el Ejemplo 15-1(1) utilizando el kit de amplificación de ADNc RACE SMARTtm (fabricado por Clontech) siguiendo las instrucciones del fabricante. En este caso como transcriptasa inversa se utilizó la transcriptasa inversa PowerScript™ (fabricada por Clontech). Cada ADNc de cadena sencilla tras la preparación se diluyó 10 veces con el tampón de tricina-EDTA adjunto en el kit y se utilizó como molde para la PCR.
A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM del cebador de ADN sintético 25-mero mostrado en s Ec ID n° 63 generado basándose en la secuencia del ADNc de GMD obtenido de células CHO determinada en el ítem (1)] y una concentración 1x de mezcla de cebadores universales (adjunta al kit de amplificación de ADNc por RACE SMARTTM, fabricado por Clontech] que contenía 1 μl del ADNc para 3'-RACE como molde, y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 30 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo.
Tras completar la reacción, 1 μl de la solución de reacción de PCR se diluyó 20 veces con tampón de tricina-EDTA (fabricado por Clontech). A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM del cebador de ADN sintético 25-mero mostrado en SEC ID n° 64 generado basándose en la secuencia del ADNc de GMD obtenido de células CHO determinada en el ítem (1)] y 0,5 μM de cebador universal anidado (adjunto al kit de amplificación de ADNc por RACE SMART™, fabricado por Clontech] que contenía 1 μl de la solución acuosa diluida 20 veces a modo de molde] y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 30 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo.
Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 700 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se ligó a un vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a (fabricado por Toyobo) se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener de esta manera 3'-GMD plasmídico. Utilizando un secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer), se determinó la secuencia de nucleótidos de 27 bases situada cadena arriba del codón de terminación del ADNc de GMD obtenido de células CHO contenido en el plásmido.
La secuencia del ADNc de longitud completa del gen de GMD obtenido de células CHO determinada en los ítems (1), (2) y (3) y la secuencia de aminoácidos correspondiente se muestran en SEC ID n° 65 y n° 71, respectivamente.
2. Determinación de la secuencia genómica que contenía el gen de GMD obtenido de células CHO/DG44
Se preparó un cebador 25-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n° 66 a partir de la secuencia de ADNc de g Md de ratón determinada en el Ejemplo 17-1. A continuación, se obtuvo un ADN genómico obtenido de células CHO mediante el método a continuación. Se suspendió KC861 obtenido de células CHO/DG44 en medio IMDM-dFBS(10)-HT(1) [medio IMDM-dFBS(10) que comprendía una concentración 1x de complemento HT (fabricado por Invitrogen)], proporcionando una densidad de 3x105 células/ml y la suspensión se dispensó a razón de 2 ml/pocillo en una placa de fondo plano de 6 pocillos para la utilización como célula adherente (fabricado por Greiner). Tras cultivarlas a 37°C en un incubador con 5% de CO2 hasta la confluencia de las células sobre la placa, se preparó ADN genómico a partir de las células sobre la placa mediante un método conocido [Nucleic Acids Research 3:2303, 1976] y se disolvió durante la noche en 150 μl de tampón TE-ARNasa (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmoles/l, EDTA 1 mmol/l, 200 μg/ml de ARNasa A).
Se preparó una solución de reacción (20 μl) [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 59 y n° 66] que contenían 100 ng del ADN genómico obtenido a partir de células CHO/DG44 y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 30 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 1 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo. Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 100 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se ligó a un vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a (preparado por Toyobo) se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener de esta manera un plásmido ex3. Utilizando un secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer), se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN genómico obtenido de células CHO contenido en el plásmido. Se muestra el resultado en la SEC ID n° 67.
A continuación, se generó un cebador 25-mero que presentaba la secuencia de nucleótidos representada por SEC ID n ° 68 y un cebador 25-mero que presentaba la secuencia de nucleótido representada por s Ec ID n° 69 basados en la secuencia del ADNc de GMD obtenido de células CHO determinada en el Ejemplo 17-1. A continuación, se prepararon 20 μl de una solución de reacción [tampón Ex Taq 1x (fabricado por Takara Shuzo), dNTP 0,2 mM, 0,5 unidades de polimerasa Ex Taq (fabricada por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de ADN sintéticos de SEC ID n° 68 y SEC ID n° 69] que contenían 100 ng del ADN genómico obtenido de células CHO/DG44 y se llevó a cabo la PCR utilizando el ciclador térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer) mediante calentamiento a 94°C durante 5 minutos y 30 ciclos posteriores de calentamiento a 94°C durante 17 minuto y 68°C durante 2 minutos en un ciclo.
Tras completar la reacción, la solución de reacción de PCR se fraccionó mediante electroforesis en agarosa y después se recuperó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pb utilizando el kit Gene Clean II (fabricado por BIO 101) siguiendo las instrucciones del fabricante. El fragmento de ADN recuperado se ligó a un vector pT7Blue(R) (fabricado por Novagen) utilizando el kit de ligación de ADN (fabricado por Takara Shuzo) y E. coli DH5a (preparado por Toyobo) se transformó utilizando el ADN plasmídico recombinante obtenido para obtener de esta manera un plásmido ex4. Utilizando un secuenciador de ADN 377 (fabricado por Perkin Elmer), se determinó la secuencia de nucleótidos del ADN genómico obtenido de células CHO contenido en el plásmido. Se muestra el resultado en la SEC ID n° 70.
Ejemplo 18
Análisis de cadenas de azúcar de anticuerpos disponibles convencionalmente:
Las cadenas de azúcar de unión al anticuerpo herceptina anti-HER2neu disponible convencionalmente (fabricado por Genentech y Roche) producidas por células CHO como célula hospedadora se analizaron siguiendo el método del Ejemplo 10(6) (figura 31). Al calcularlo a partir del área de cada pico del diagrama de elución, el contenido de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa en la herceptina era de 16% y el contenido de cadenas de azúcar unidas a a-1,6-fucosa era de 84%. Se llevó a cabo el mismo análisis en otros anticuerpos disponibles comercialmente, el Rituxan (fabricado por Genentech, Roche e IDEC) y el Zenapax (fabricado por Roche y PDL) y el contenido de cadenas de azúcar libres de a-1,6-fucosa era inferior al de la herceptina.
La figura 31 es un gráfico que muestra el patrón de elución de las cadenas de azúcar tratadas con PA preparadas a partir de herceptina, obtenido mediante el análisis de la misma mediante HPLC de fase inversa. La intensidad relativa de fluorescencia y el tiempo de elución se han representado gráficamente como ordena y abscisa, respectivamente. Las condiciones del análisis mediante HPLC de fase inversa, el análisis de la estructura de las cadenas de azúcar y el cálculo de las proporciones de grupos de cadena de azúcar que no contenían cadenas de azúcar con a-1,6-fucosa se llevó a cabo mediante los métodos del Ejemplo 11(6).
Aplicabilidad industrial
La presente divulgación proporciona una célula que puede producir una composición de anticuerpo, un procedimiento para producir una composición de anticuerpo utilizando la célula, la composición de anticuerpo y la utilización de la misma.
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Claims (4)

REIVINDICACIONES
1. Utilización de una estirpe celular resistente a la lectina para la producción de una composición de anticuerpo, comprendiendo la composición unas moléculas de anticuerpo que presentan unas cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas unidas a la región Fc, en la que de entre las cadenas de azúcar unidas a N-glucósido complejas totales unidas a la región Fc en la composición, la proporción para una cadena de azúcar en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena de azúcar es 20% o más, en la que la estirpe celular resistente a la lectina puede obtenerse por selección utilizando un medio que comprende la lectina a una concentración de 1 |ig/ml a 1 mg/ml, y en la que los anticuerpos son expresados utilizando la estirpe celular de CHO resistente a la lectina,
en la que la lectina es una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida a N-glucósido,
en la que la lectina es seleccionada de entre una lectina de Lens culinaris LCA o una lectina de Aleuria aurantia AAL.
2. Utilización de la estirpe celular según la reivindicación 1, en la que la estirpe celular es obtenida mediante un procedimiento que comprende
(a) cultivar una estirpe celular en un medio que comprende una concentración predeterminada de lectina y seleccionar a continuación una célula que adquiere una propiedad tal que su tasa de supervivencia es aumentada por lo menos 2 veces en comparación con la estirpe celular madre, o,
(b) cultivar una estirpe celular en un medio que comprende lectina y seleccionar a continuación una estirpe celular que puede ser cultivada a una tasa de supervivencia de 80%, a una concentración de lectina de por lo menos 2 veces la de la estirpe celular madre,
en la que la lectina es una lectina que reconoce una estructura de cadena de azúcar en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante un enlace a en la cadena de azúcar unida a N-glucósido.
3. Utilización de la estirpe celular según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además cultivar dicha estirpe celular.
4. Utilización de la estirpe celular según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además recuperar la composición de anticuerpo.
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Families Citing this family (901)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7183387B1 (en) 1999-01-15 2007-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
ES2571230T3 (es) 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
FR2807767B1 (fr) 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
US6946292B2 (en) 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
US20040093621A1 (en) * 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
US8093357B2 (en) 2002-03-01 2012-01-10 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US7317091B2 (en) 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
CN102911987B (zh) * 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
AU2003236020B2 (en) * 2002-04-09 2009-03-19 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Cell with depression or deletion of the activity of protein participating in GDP-fucose transport
JPWO2003084569A1 (ja) * 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物含有医薬
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
US20050031613A1 (en) * 2002-04-09 2005-02-10 Kazuyasu Nakamura Therapeutic agent for patients having human FcgammaRIIIa
WO2003085118A1 (fr) * 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Procede de production de composition anticorps
WO2004022597A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3の血中可溶化ｎ端ﾍﾟﾌﾟﾁﾄﾞに対する抗体
DK2345671T3 (en) 2002-09-27 2016-02-15 Xencor Inc Optimized Fc variants and methods for their formation
CL2003002461A1 (es) * 2002-11-27 2005-01-07 Dow Chemical Company Agroscien Inmunoglobulina que comprende al menos un glicano afucosilado, composicion que la contiene, secuencia nucleotidica y vector que la comprende, procedimiento para producir dicha inmunoglobulina en plantas.
US8084582B2 (en) 2003-03-03 2011-12-27 Xencor, Inc. Optimized anti-CD20 monoclonal antibodies having Fc variants
US8388955B2 (en) 2003-03-03 2013-03-05 Xencor, Inc. Fc variants
US20090010920A1 (en) 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
WO2004081048A1 (ja) 2003-03-13 2004-09-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 変異受容体に対するアゴニスト活性を有するリガンド
JP2004298180A (ja) * 2003-03-18 2004-10-28 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
JP2010220615A (ja) * 2003-03-18 2010-10-07 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd ゲノムが改変されたマウス
US9051373B2 (en) 2003-05-02 2015-06-09 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2005017155A1 (ja) 2003-06-18 2005-02-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha フコーストランスポーター
FR2858235B1 (fr) 2003-07-31 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Utilisation d'anticorps optimises en adcc pour traiter les patients faibles repondeurs
EP1652923B1 (en) 2003-08-08 2011-10-12 Perseus Proteomics Inc. Gene overexpressed in cancer
EP1666501A4 (en) * 2003-08-11 2008-12-24 Chugai Pharmaceutical Co Ltd ANTI-HM1.24 ANTIBODIES WITH MODIFIED SUGAR CHAIN
US9714282B2 (en) 2003-09-26 2017-07-25 Xencor, Inc. Optimized Fc variants and methods for their generation
US8883147B2 (en) 2004-10-21 2014-11-11 Xencor, Inc. Immunoglobulins insertions, deletions, and substitutions
US8399618B2 (en) 2004-10-21 2013-03-19 Xencor, Inc. Immunoglobulin insertions, deletions, and substitutions
WO2005035577A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
WO2005035582A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｃｃｒ４に特異的に結合する抗体組成物
WO2005035583A1 (ja) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Ｉｌ－５受容体に特異的に結合する抗体組成物
AU2004279742A1 (en) * 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Fused protein composition
CA2542125A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of .alpha.1,6-fucosyltransferase
KR101017336B1 (ko) * 2003-10-09 2011-02-28 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 안티트롬빈 ⅲ 조성물의 제조 방법
AU2004280064A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genomically modified cell neutralized to serum-free system
AU2004279736A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition specifically binding to ganglioside GM2
JPWO2005035741A1 (ja) * 2003-10-09 2006-12-21 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
WO2005035581A1 (ja) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ヒトVEGF受容体Flt-1に特異的に結合する抗体組成物
US7691810B2 (en) * 2003-10-09 2010-04-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Method of producing recombinant antithrombin III composition
FR2861395B1 (fr) 2003-10-23 2006-02-17 Lab Francais Du Fractionnement Facteur viii viralement securise a faible teneur en multimeres superieurs
CA2548817A1 (en) 2003-12-04 2005-06-23 Xencor, Inc. Methods of generating variant proteins with increased host string content and compositions thereof
JPWO2005053742A1 (ja) * 2003-12-04 2007-06-28 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物を含有する医薬
US8491902B2 (en) 2003-12-04 2013-07-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Medicament comprising recombinant antibody against chemokine receptor CCR4
US7329353B2 (en) 2004-01-23 2008-02-12 Amgen Inc. LC/MS method of analyzing high molecular weight proteins
EP1737890A2 (en) 2004-03-24 2007-01-03 Xencor, Inc. Immunoglobulin variants outside the fc region
MY145073A (en) 2004-07-09 2011-12-15 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican 3 antibody
EP1919950A1 (en) 2004-07-15 2008-05-14 Xencor, Inc. Optimized fc variants
US20150010550A1 (en) 2004-07-15 2015-01-08 Xencor, Inc. OPTIMIZED Fc VARIANTS
US20060223147A1 (en) * 2004-08-05 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Process for producing glycoprotein composition
EP1800693B1 (en) 2004-08-24 2013-07-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Adjuvant therapy with the use of anti-glypican 3 antibody
WO2006046751A1 (ja) 2004-10-26 2006-05-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 糖鎖改変抗グリピカン３抗体
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8367805B2 (en) 2004-11-12 2013-02-05 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
KR101027427B1 (ko) 2004-11-12 2011-04-11 젠코어 인코포레이티드 ＦcRn에 대하여 증가된 결합력을 갖는 Ｆc 변이체
US8546543B2 (en) 2004-11-12 2013-10-01 Xencor, Inc. Fc variants that extend antibody half-life
CN105535967B (zh) 2005-02-15 2022-05-03 杜克大学 抗cd19抗体及其在肿瘤学中的应用
WO2006109696A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換え卵胞刺激ホルモン組成物
WO2006109695A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えハプトグロビン組成物
WO2006109698A1 (ja) * 2005-04-06 2006-10-19 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. 遺伝子組換えエリスロポイエチン組成物
AU2006244445B2 (en) 2005-05-05 2013-04-18 Duke University Anti-CD19 antibody therapy for autoimmune disease
US8217147B2 (en) 2005-08-10 2012-07-10 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
WO2007041635A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Xencor, Inc. Fc variants with optimized fc receptor binding properties
JP4860703B2 (ja) 2005-10-06 2012-01-25 ゼンコー・インコーポレイテッド 最適化された抗ｃｄ３０抗体
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
AU2007205935B2 (en) 2006-01-17 2013-07-11 Synthon Biopharmaceuticals B.V. Compositions and methods for humanization and optimization of N-glycans in plants
EP2540741A1 (en) 2006-03-06 2013-01-02 Aeres Biomedical Limited Humanized anti-CD22 antibodies and their use in treatment of oncology, transplantation and autoimmune disease
US20080118978A1 (en) 2006-04-28 2008-05-22 Takashi Sato Anti-tumor agent
MY157757A (en) 2006-07-18 2016-07-15 Sanofi Aventis Antagonist antibody against epha2 for the treatment of cancer
WO2008020586A1 (en) 2006-08-14 2008-02-21 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Diagnosis and treatment of cancer using anti-desmoglein-3 antibody
PT2059536E (pt) 2006-08-14 2014-04-14 Xencor Inc Anticorpos otimizados que visam cd19
WO2008036688A2 (en) 2006-09-18 2008-03-27 Xencor, Inc. Optimized antibodies that target hm1.24
CA2665528C (en) 2006-10-12 2018-01-23 The University Of Tokyo Diagnosis and treatment of cancer using anti-ereg antibody
EP1914242A1 (en) 2006-10-19 2008-04-23 Sanofi-Aventis Novel anti-CD38 antibodies for the treatment of cancer
JP5378795B2 (ja) 2006-10-20 2013-12-25 中外製薬株式会社 抗ｈｂ−ｅｇｆ抗体を有効成分として含む医薬組成物
AR063975A1 (es) 2006-11-28 2009-03-04 Centelion Fusiones fc con receptor para fgf soluble modificadas con actividad biologica mejorada
EP2103628A4 (en) 2006-12-14 2012-02-22 Forerunner Pharma Res Co Ltd MONOCLONAL ANTIBODY ANTI-CLAUDIN 3, AND TREATMENT AND DIAGNOSIS OF CANCER USING SUCH ANTIBODY
CN101563460A (zh) * 2006-12-22 2009-10-21 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 选择方法
EP2123676A4 (en) 2007-01-05 2011-01-05 Univ Tokyo DIAGNOSIS AND TREATMENT OF CANCER USING ANTI-PRG-3 ANTIBODIES
EP2119780B1 (en) 2007-01-24 2015-03-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition having enhanced effector activity
US20110236374A1 (en) 2007-01-24 2011-09-29 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Genetically recombinant antibody composition capable of binding specifically to ganglioside gm2
EP2468776A3 (en) 2007-02-09 2012-11-14 Genentech, Inc. Anti-Robo4 antibodies and uses therefor
EP3118221B1 (en) 2007-02-26 2019-08-21 Oxford BioTherapeutics Ltd Proteins
WO2008104803A2 (en) 2007-02-26 2008-09-04 Oxford Genome Sciences (Uk) Limited Proteins
CN101641115B (zh) 2007-03-08 2013-04-24 卡罗拜奥斯制药公司 用于实体瘤治疗的EphA3抗体
WO2008114733A1 (ja) 2007-03-16 2008-09-25 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. 抗Claudin-4抗体
JP5575636B2 (ja) 2007-05-07 2014-08-20 メディミューン，エルエルシー 抗ｉｃｏｓ抗体ならびに、腫瘍、移植および自己免疫疾患の治療におけるその使用
JP2010527356A (ja) 2007-05-14 2010-08-12 メディミューン，エルエルシー 好酸球レベルを低下させる方法
EP2708557A1 (en) 2007-05-30 2014-03-19 Xencor, Inc. Method and compositions for inhibiting CD32B expressing cells
CN101821288A (zh) 2007-06-21 2010-09-01 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
US8722858B2 (en) 2007-06-25 2014-05-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-Prominin-1 antibody having ADCC activity or CDC activity
US7919313B2 (en) † 2007-07-12 2011-04-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivating alpha 1,6 fucosyltransferase (FUT8) gene expression
WO2009018386A1 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Medimmune, Llc Multispecific epitope binding proteins and uses thereof
HUE032301T2 (en) 2007-08-30 2017-09-28 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-EPHA2 antibody
PH12018501459A1 (en) 2007-09-26 2019-11-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified antibody constant region
AU2008321840B2 (en) 2007-11-14 2014-02-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Diagnosis and treatment of cancer using anti-GPR49 antibody
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US8092804B2 (en) 2007-12-21 2012-01-10 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα)-173
EP2604628A3 (en) 2007-12-21 2013-08-21 Medimmune Limited Binding members for interleukin-4 receptor alpha (IL-4R) - 173
SI2235059T1 (sl) 2007-12-26 2015-06-30 Xencor, Inc. Fc variante s spremenjeno vezjo na fcrn
US9274119B2 (en) 2008-01-11 2016-03-01 The University Of Tokyo Anti-CLDN6 antibody
ES2613963T3 (es) 2008-01-18 2017-05-29 Medimmune, Llc Anticuerpos manipulados con cisteína para conjugación específica de sitio
CN106349390B (zh) 2008-04-02 2019-12-10 宏观基因有限公司 Bcr-复合体-特异性抗体和其使用方法
PL2247304T3 (pl) 2008-04-02 2017-01-31 Macrogenics, Inc. Przeciwciała specyficzne wobec HER2/neu oraz sposoby ich zastosowania
CL2009000647A1 (es) 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
DK2708559T3 (en) 2008-04-11 2018-06-14 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule capable of repeatedly binding two or more antigen molecules
ES2828627T3 (es) 2008-04-25 2021-05-27 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo multivalente estable
JPWO2009142186A1 (ja) * 2008-05-20 2011-09-29 株式会社カネカ 細胞障害性組成物
US9226934B2 (en) 2008-06-02 2016-01-05 The University Of Tokyo Anti-cancer drug
WO2010033279A2 (en) 2008-06-04 2010-03-25 Macrogenics, Inc. Antibodies with altered binding to fcrn and methods of using same
KR20110039220A (ko) 2008-06-30 2011-04-15 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤 항ｃｄ27 항체
JP5730570B2 (ja) 2008-07-17 2015-06-10 協和発酵キリン株式会社 抗システムａｓｃアミノ酸トランスポーター２（ａｓｃｔ２）抗体
JP5662149B2 (ja) 2008-08-13 2015-01-28 協和発酵キリン株式会社 遺伝子組換えプロテインｓ組成物
EP2331578B1 (en) 2008-09-17 2014-06-04 Xencor, Inc. Novel compositions and methods for treating ige-mediated disorders
CA2735900A1 (en) 2008-09-19 2010-03-25 Medimmune, Llc Antibodies directed to dll4 and uses thereof
KR20110084196A (ko) 2008-09-26 2011-07-21 유레카 쎄라퓨틱스, 인코포레이티드 다양한 글리코실화 패턴을 가진 세포계 및 단백질
PE20110707A1 (es) 2008-10-14 2011-10-11 Genentech Inc Variantes de inmunoglobulinas
CA2743469C (en) 2008-11-12 2019-01-15 Medimmune, Llc Antibody formulation
CN106432503B (zh) 2008-12-19 2020-03-06 宏观基因有限公司 共价双抗体及其用途
JP5756292B2 (ja) 2008-12-22 2015-07-29 中外製薬株式会社 抗ｈｓ６ｓｔ２抗体及びその用途
EP3318573A1 (en) 2008-12-23 2018-05-09 F. Hoffmann-La Roche AG Mmunoglobulin variants with altered binding to protein a
EP2385114A4 (en) 2008-12-25 2012-08-08 Univ Tokyo CANCER TREATMENT DIAGNOSIS WITH ANTI-TM4SF20 ANTIBODY
HUE029946T2 (en) 2008-12-26 2017-04-28 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anti-CD4 antibody
WO2010074192A1 (ja) 2008-12-26 2010-07-01 国立大学法人東京大学 抗lgr7抗体を用いる癌の診断および治療
WO2010084408A2 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oxford Biotherapeutics Ltd. Pta089 protein
WO2010102244A1 (en) 2009-03-06 2010-09-10 Kalobios Pharmaceuticals, Inc. Treatment of leukemias and chronic myeloproliferative diseases with antibodies to epha3
EP2233500A1 (en) 2009-03-20 2010-09-29 LFB Biotechnologies Optimized Fc variants
TWI461211B (zh) 2009-03-20 2014-11-21 Genentech Inc 抗－ｈｅｒ抗體
US8124740B2 (en) 2009-03-25 2012-02-28 Genentech, Inc. Anti- α5 β1 antibodies and uses thereof
JP5616428B2 (ja) 2009-04-07 2014-10-29 ロシュ グリクアート アクチェンゲゼルシャフト 三価の二重特異性抗体
US8575316B2 (en) 2009-04-09 2013-11-05 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-Siglec-15 antibody
ES2571235T3 (es) 2009-04-10 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para el tratamiento de un tumor sanguíneo que utiliza el anticuerpo anti-TIM-3
WO2010119691A1 (ja) 2009-04-16 2010-10-21 国立大学法人東京大学 抗tmprss11e抗体を用いた癌の診断と治療
EP2423228B1 (en) 2009-04-20 2015-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody containing igg2 having amino acid mutation introduced therein
EP2949673A1 (en) 2009-04-27 2015-12-02 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Anti-il-3ra antibody for use in treatment of blood tumor
AR076875A1 (es) 2009-05-15 2011-07-13 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo contra receptor de la tirosina quinasa (anti-axl)
WO2010137654A1 (ja) 2009-05-29 2010-12-02 株式会社未来創薬研究所 Egfファミリーリガンドのアンタゴニストを成分とする医薬組成物
PL2438171T3 (pl) * 2009-06-02 2015-04-30 Regeneron Pharma Komórki z niedoborem fukozylacji
JP6039181B2 (ja) 2009-06-11 2016-12-07 大学共同利用機関法人情報・システム研究機構 タンパク質の生産方法
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
AU2010270979B2 (en) 2009-06-22 2015-04-23 Medimmune, Llc Engineered Fc regions for site-specific conjugation
WO2011014457A1 (en) 2009-07-27 2011-02-03 Genentech, Inc. Combination treatments
US9345661B2 (en) 2009-07-31 2016-05-24 Genentech, Inc. Subcutaneous anti-HER2 antibody formulations and uses thereof
CN102597234B (zh) 2009-08-07 2014-10-29 协和发酵麒麟株式会社 人源化抗淀粉样-b寡聚体抗体
EP2463369A4 (en) 2009-08-07 2013-09-18 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd HUMANIZED ANTIBODIES AGAINST AMYLOID B OLIGOMERS
CN102574917A (zh) 2009-08-17 2012-07-11 株式会社未来创药研究所 含有抗hb-egf抗体作为有效成分的药物组合物
DK2473522T3 (en) 2009-09-02 2016-11-28 Genentech Inc Smoothened MUTANT AND METHODS OF USING THE SAME
WO2011028952A1 (en) 2009-09-02 2011-03-10 Xencor, Inc. Compositions and methods for simultaneous bivalent and monovalent co-engagement of antigens
AU2010293383B2 (en) 2009-09-10 2014-12-18 Kyowa Kirin Co., Ltd. Medicament including antibody composition specifically bound to human CC chemokine receptor 4 (CCR4)
AR078161A1 (es) 2009-09-11 2011-10-19 Hoffmann La Roche Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento.
MY160680A (en) * 2009-09-22 2017-03-15 Probiogen Ag Process for producing molecules containing specialized glycan structures
US8697073B2 (en) 2009-09-30 2014-04-15 Fujifilm Ri Pharma Co., Ltd. Anti-podoplanin antibody, and pharmaceutical composition containing anti-podoplanin antibody
TW201116297A (en) 2009-10-02 2011-05-16 Sanofi Aventis Antibodies that specifically bind to the EphA2 receptor
RU2583298C2 (ru) 2009-10-07 2016-05-10 Макродженикс, Инк. ПОЛИПЕПТИДЫ, СОДЕРЖАЩИЕ Fc-УЧАСТОК, КОТОРЫЕ ДЕМОНСТРИРУЮТ ПОВЫШЕННУЮ ЭФФЕКТОРНУЮ ФУНКЦИЮ БЛАГОДАРЯ ИЗМЕНЕНИЯМ СТЕПЕНИ ФУКОЗИЛИРОВАНИЯ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
US20120282177A1 (en) 2009-11-02 2012-11-08 Christian Rohlff ROR1 as Therapeutic and Diagnostic Target
EP3279215B1 (en) 2009-11-24 2020-02-12 MedImmune Limited Targeted binding agents against b7-h1
WO2011071577A1 (en) 2009-12-11 2011-06-16 Genentech, Inc. Anti-vegf-c antibodies and methods using same
PL2516465T3 (pl) 2009-12-23 2016-11-30 Przeciwciała anty-bv8 i ich zastosowania
WO2011091078A2 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Xencor, Inc. Antibody fc variants with enhanced complement activity
TR201806936T4 (tr) 2010-01-29 2018-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dll3 antikoru.
WO2011097527A2 (en) 2010-02-04 2011-08-11 Xencor, Inc. Immunoprotection of therapeutic moieties using enhanced fc regions
RU2577125C2 (ru) 2010-02-10 2016-03-10 Фуджифилм Ри Фарма Ко., Лтд. Меченное радиоактивным металлом антитело против кадгерина
EP2533810B1 (en) 2010-02-10 2016-10-12 ImmunoGen, Inc. Cd20 antibodies and uses thereof
EP2536748B1 (en) 2010-02-18 2014-08-20 Genentech, Inc. Neuregulin antagonists and use thereof in treating cancer
US20120321557A1 (en) 2010-02-26 2012-12-20 Forerunner Pharma Research Co., Ltd. Anti-icam3 antibody and use thereof
EP2543727B1 (en) 2010-03-02 2016-08-31 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Modified antibody composition
NZ602161A (en) 2010-03-04 2014-12-24 Macrogenics Inc Antibodies reactive with b7-h3, immunologically active fragments thereof and uses thereof
BR112012022044A2 (pt) 2010-03-24 2020-08-25 Genentech Inc ''anticorpo,imunoconjugado,formulação farmacêutica,uso do anticorpo,método de tratamento,anticorpo biespecifico isolado e célula hospedeira''.
JP5767207B2 (ja) 2010-03-26 2015-08-19 協和発酵キリン株式会社 新規修飾部位導入抗体および抗体フラグメント
EP2552957A4 (en) 2010-03-29 2013-11-20 Zymeworks Inc ANTIBODIES HAVING ENHANCED OR DELETED EFFECTIVE FUNCTION
TWI667346B (zh) 2010-03-30 2019-08-01 中外製藥股份有限公司 促進抗原消失之具有經修飾的FcRn親和力之抗體
WO2011147834A1 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Roche Glycart Ag Antibodies against cd19 and uses thereof
WO2011150454A1 (en) 2010-06-01 2011-12-08 Monash University ANTIBODIES DIRECTED TO THE UNPROCESSED RECEPTOR TYROSINE KINASE c-MET
TR201807750T4 (tr) * 2010-06-11 2018-06-21 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Anti-TIM-3 antikoru.
TW201204388A (en) 2010-06-18 2012-02-01 Genentech Inc Anti-Axl antibodies and methods of use
DK3323830T3 (da) 2010-06-19 2023-09-25 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anti-gd2 antibodies
WO2011161119A1 (en) 2010-06-22 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against insulin-like growth factor i receptor and uses thereof
WO2011161189A1 (en) 2010-06-24 2011-12-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-hepsin antibodies and methods of use
US9485812B2 (en) 2010-07-08 2016-11-01 Honda Motor Co., Ltd. High frequency heating coil
MX2013000083A (es) 2010-07-09 2013-02-26 Genentech Inc Anticuerpos de anti-neuropilina y metodos de uso.
WO2012010582A1 (en) 2010-07-21 2012-01-26 Roche Glycart Ag Anti-cxcr5 antibodies and methods of use
AU2011283694B2 (en) 2010-07-29 2017-04-13 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points
JP5964300B2 (ja) 2010-08-02 2016-08-03 マクロジェニクス，インコーポレーテッド 共有結合型ダイアボディおよびその使用
CN103153341B (zh) 2010-08-03 2015-05-27 霍夫曼-拉罗奇有限公司 慢性淋巴细胞性白血病(cll)生物标志物
WO2012019061A2 (en) 2010-08-05 2012-02-09 Stem Centrx, Inc. Novel effectors and methods of use
JP2013541937A (ja) 2010-08-05 2013-11-21 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲー 抗ｍｈｃ抗体−抗ウイルス性サイトカイン融合タンパク質
SI2603530T1 (en) 2010-08-13 2018-02-28 Roche Glycart Ag Anti-FAP antibodies and methods of use
TW201209063A (en) 2010-08-13 2012-03-01 Roche Glycart Ag Anti-tenascin-C A2 antibodies and methods of use
WO2012025536A1 (en) 2010-08-25 2012-03-01 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibodies against il-18r1 and uses thereof
EP2608807A1 (en) 2010-08-27 2013-07-03 Stem Centrx, Inc. Notum protein modulators and methods of use
SG10201408229WA (en) 2010-08-31 2015-02-27 Genentech Inc Biomarkers and methods of treatment
SG10201506959SA (en) 2010-09-03 2015-10-29 Stemcentrx Inc Novel modulators and methods of use
WO2012043747A1 (ja) 2010-09-30 2012-04-05 独立行政法人理化学研究所 グリオーマの治療方法、グリオーマの検査方法、所望の物質をグリオーマに送達させる方法、及びそれらの方法に用いられる薬剤
EP3828205A1 (en) 2010-10-01 2021-06-02 Oxford BioTherapeutics Ltd Anti-ror1 antibodies
EP2625197B1 (en) 2010-10-05 2016-06-29 Genentech, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
KR101814852B1 (ko) 2010-10-29 2018-01-04 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 신규 항 dr5 항체
CN103228674B (zh) 2010-11-10 2019-07-05 霍夫曼-拉罗奇有限公司 用于神经疾病免疫疗法的方法和组合物
EP2644698B1 (en) 2010-11-17 2018-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Multi-specific antigen-binding molecule having alternative function to function of blood coagulation factor viii
CN108715614A (zh) 2010-11-30 2018-10-30 中外制药株式会社 与多分子的抗原重复结合的抗原结合分子
AU2011360938B2 (en) 2010-12-08 2016-07-28 Abbvie Stemcentrx Llc Novel modulators and methods of use
SG10201602874VA (en) 2010-12-15 2016-05-30 Kek High Energy Accelerator Protein production method
ES2656079T3 (es) 2010-12-15 2018-02-23 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Procedimiento para producir proteínas
EP3447491A3 (en) 2010-12-16 2019-06-05 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnosis and treatments relating to th2 inhibition
EP2655418B1 (en) 2010-12-20 2017-10-04 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-mesothelin antibodies and immunoconjugates
US20120195910A1 (en) 2010-12-22 2012-08-02 Genentech, Inc. Anti-pcsk9 antibodies and methods of use
US9085772B2 (en) 2010-12-27 2015-07-21 National University Corporation Nagoya University Method for suppressing receptor tyrosine kinase-mediated pro-survival signaling in cancer cell
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
FR2971250A1 (fr) 2011-02-07 2012-08-10 Univ Nantes Anticorps anti-gb3 utiles dans le traitement des maladies associees a l'angiogenese
SA112330278B1 (ar) 2011-02-18 2015-10-09 ستيم سينتركس، انك. مواد ضابطة جديدة وطرق للاستخدام
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
MX341921B (es) 2011-02-28 2016-09-07 Hoffmann La Roche Proteinas de union a antigeno.
MX346663B (es) * 2011-03-06 2017-03-27 Merck Serono Sa Lineas de celulas de bajo nivel de fucosa y usos de las mismas.
MX354359B (es) 2011-03-29 2018-02-28 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
CN103596983B (zh) 2011-04-07 2016-10-26 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗fgfr4抗体及使用方法
WO2012144208A1 (ja) 2011-04-18 2012-10-26 国立大学法人東京大学 抗itm2a抗体を用いる癌の診断および治療
SI2699602T1 (sl) 2011-04-19 2017-06-30 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Bispecifična protitelesa anti-igf-1r in anti-erbb3
DK2703486T3 (en) 2011-04-25 2018-05-28 Daiichi Sankyo Co Ltd ANTI-B7-H3 ANTIBODY
WO2012146630A1 (en) 2011-04-29 2012-11-01 F. Hoffmann-La Roche Ag N-terminal acylated polypeptides, methods for their production and uses thereof
CA2833212C (en) 2011-05-12 2020-06-09 Genentech, Inc. Multiple reaction monitoring lc-ms/ms method to detect therapeutic antibodies in animal samples using framework signature peptides
CN103596980B (zh) 2011-05-16 2017-08-08 霍夫曼-拉罗奇有限公司 Fgfr1激动剂及使用方法
NZ618016A (en) 2011-05-21 2015-05-29 Macrogenics Inc Deimmunized serum-binding domains and their use for extending serum half-life
JPWO2012176779A1 (ja) 2011-06-20 2015-02-23 協和発酵キリン株式会社 抗ｅｒｂＢ３抗体
CN103649125A (zh) 2011-06-22 2014-03-19 霍夫曼-拉罗奇有限公司 利用包含mhc i类的复合物通过循环中的病毒特异性细胞毒性t细胞清除靶细胞
PL2726094T3 (pl) 2011-06-28 2017-06-30 Oxford Biotherapeutics Ltd Cel terapeutyczny i diagnostyczny
MX2013014687A (es) 2011-06-30 2014-02-17 Genentech Inc Formulaciones de anticuerpo anti-c-met.
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
WO2013022855A1 (en) 2011-08-05 2013-02-14 Xencor, Inc. Antibodies with modified isoelectric points and immunofiltering
JP2014526891A (ja) 2011-08-17 2014-10-09 ジェネンテック， インコーポレイテッド ニューレグリン抗体とその使用
RU2014109038A (ru) 2011-08-23 2015-09-27 Рош Гликарт Аг Антитела к хондроитинсульфат протеогликану меланомы
EP2748197A2 (en) 2011-08-26 2014-07-02 Merrimack Pharmaceuticals, Inc. Tandem fc bispecific antibodies
CN103930781A (zh) 2011-09-15 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 促进分化的方法
CN103930111A (zh) 2011-09-19 2014-07-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 包含c-met拮抗剂和b-raf拮抗剂的组合治疗
TW201817745A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
JP6322411B2 (ja) 2011-09-30 2018-05-09 中外製薬株式会社 複数の生理活性を有する抗原の消失を促進する抗原結合分子
MX366968B (es) 2011-09-30 2019-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno que induce la inmunorespuesta al antigeno objetivo.
WO2013052155A1 (en) 2011-10-05 2013-04-11 Genentech, Inc. Methods of treating liver conditions using notch2 antagonists
US10851178B2 (en) 2011-10-10 2020-12-01 Xencor, Inc. Heterodimeric human IgG1 polypeptides with isoelectric point modifications
DK2766392T3 (da) 2011-10-10 2019-10-07 Xencor Inc Fremgangsmåde til oprensning af antistoffer
CN103917556B (zh) 2011-10-14 2018-02-06 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗HtrA1抗体及使用方法
WO2013056148A2 (en) 2011-10-15 2013-04-18 Genentech, Inc. Methods of using scd1 antagonists
WO2013059531A1 (en) 2011-10-20 2013-04-25 Genentech, Inc. Anti-gcgr antibodies and uses thereof
US20140302511A1 (en) 2011-10-28 2014-10-09 Pharmalogicals Research Pte. Ltd. Cancer stem cell-specific molecule
MX2014004991A (es) 2011-10-28 2014-05-22 Genentech Inc Combinaciones terapeuticas y metodos para tratar el melanoma.
PT2773671T (pt) 2011-11-04 2021-12-14 Zymeworks Inc Geração de anticorpo heterodimérico estável com mutações no domínio fc
CN104066748A (zh) 2011-11-21 2014-09-24 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗c-met抗体的纯化
WO2013083497A1 (en) 2011-12-06 2013-06-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Antibody formulation
WO2013087789A1 (en) 2011-12-13 2013-06-20 Glykos Finland Ltd. Antibody isoform arrays and methods thereof
EP3354660A1 (en) 2011-12-22 2018-08-01 F. Hoffmann-La Roche AG Expression vector element combinations, novel production cell generation methods and their use for the recombinant production of polypeptides
SG10201601882PA (en) 2011-12-22 2016-04-28 Hoffmann La Roche Expression Vector Organization, Novel Production Cell Generation Methods And Their Use For The Recombinant Production Of Polypeptides
BR112014013035A2 (pt) 2011-12-22 2018-10-09 Hoffmann La Roche métodos de seleção de células, conjuntos de expressão bicistrônica, células eucarióticas, vetores lentivirais, uso de vetor lentiviral, bibliotecas de ventores lentivirais e de células eucarióticas, métodos de seleção de células, fluxos de trabalho e uso de célula
EP3539982A3 (en) 2011-12-23 2020-01-15 Pfizer Inc Engineered antibody constant regions for site-specific conjugation and methods and uses therefor
WO2013096791A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Genentech, Inc. Process for making high concentration protein formulations
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
RU2014133547A (ru) 2012-01-18 2016-03-10 Дженентек, Инк. Способы применения модуляторов fgf19
TW201335187A (zh) 2012-01-18 2013-09-01 Genentech Inc 抗ｌｒｐ５抗體及使用方法
KR20140119777A (ko) 2012-01-31 2014-10-10 제넨테크, 인크. 항-ig-e m1'' 항체 및 그의 사용 방법
SG11201404751UA (en) 2012-02-09 2014-09-26 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Modified fc region of antibody
JP6545959B2 (ja) 2012-02-11 2019-07-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｒスポンジン転位およびその使用方法
TR201808458T4 (tr) 2012-02-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche FC-reseptör bazlı afinite kromatografisi.
EP3626254A1 (en) 2012-03-16 2020-03-25 University Health Network Soluble toso protein and its use in treating autoimmune disorders
US20130259867A1 (en) 2012-03-27 2013-10-03 Genentech, Inc. Diagnosis and treatments relating to her3 inhibitors
JP6280031B2 (ja) 2012-03-29 2018-02-14 中外製薬株式会社 抗ｌａｍｐ５抗体およびその利用
ES2660472T3 (es) 2012-03-30 2018-03-22 Daiichi Sankyo Company, Limited Anticuerpo anti-Siglec-15 modificado con CDR
AR090549A1 (es) 2012-03-30 2014-11-19 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 e inmunoconjugados
EP2832855A4 (en) 2012-03-30 2016-02-24 Daiichi Sankyo Co Ltd NEW ANTI-SIGLEC ANTIBODY-15
JP6188681B2 (ja) 2012-04-09 2017-08-30 第一三共株式会社 抗ｆｇｆｒ２抗体
WO2013155346A1 (en) 2012-04-11 2013-10-17 The Regents Of The University Of California Diagnostic tools for response to 6-thiopurine therapy
AU2013254313B2 (en) 2012-04-27 2017-03-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-ROBO4-antibody
EP2844300B1 (en) 2012-05-01 2018-10-17 Genentech, Inc. Anti-pmel17 antibodies and immunoconjugates
AU2013258834B2 (en) 2012-05-10 2017-09-07 Zymeworks Bc Inc. Heteromultimer constructs of immunoglobulin heavy chains with mutations in the Fc domain
WO2013170191A1 (en) 2012-05-11 2013-11-14 Genentech, Inc. Methods of using antagonists of nad biosynthesis from nicotinamide
US9416189B2 (en) 2012-05-11 2016-08-16 Microbial Chemistry Research Foundation Anti-CXADR antibody
JP6294311B2 (ja) 2012-05-23 2018-03-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 治療薬の選択方法
RU2743463C2 (ru) 2012-05-30 2021-02-18 Чугаи Сейяку Кабусики Кайся Специфичная к ткани-мишени антигенсвязывающая молекула
KR101566539B1 (ko) 2012-06-08 2015-11-05 국립암센터 신규한 Ｔｈ2 세포 전환용 에피토프 및 이의 용도
AR091462A1 (es) 2012-06-15 2015-02-04 Genentech Inc Anticuerpos anti-pcsk9, formulaciones, dosificacion y metodos de uso
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
KR102143476B1 (ko) 2012-07-02 2020-08-12 쿄와 기린 가부시키가이샤 항ｂｍｐ９ 항체를 유효 성분으로 하는, 신장성 빈혈, 암성 빈혈 등의 빈혈에 대한 치료제
EP3339328A1 (en) 2012-07-04 2018-06-27 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-biotin antibodies and methods of use
EP2869848B1 (en) 2012-07-04 2016-09-21 F. Hoffmann-La Roche AG Covalently linked antigen-antibody conjugates
CN104394886B (zh) 2012-07-04 2017-05-24 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 抗茶碱抗体及使用方法
MX356162B (es) 2012-07-05 2018-05-16 Genentech Inc Sistema de expresion y secrecion.
JP6310845B2 (ja) 2012-07-06 2018-04-11 学校法人 聖マリアンナ医科大学 Ｈｔｌｖ−１関連脊髄症患者の治療方法および治療剤
MX2015000359A (es) 2012-07-09 2015-04-14 Genentech Inc Anticuerpos e inmunoconjugados anti-cd79b.
CN104428007B (zh) 2012-07-09 2018-03-16 基因泰克公司 包含抗cd22抗体的免疫缀合物
ES2661572T3 (es) 2012-07-09 2018-04-02 Genentech, Inc. Inmunoconjugados que comprenden anticuerpos anti-CD79b
CA2873889A1 (en) 2012-07-09 2014-01-16 Genentech, Inc. Anti-cd22 antibodies and immunoconjugates
HUE056217T2 (hu) 2012-07-13 2022-02-28 Roche Glycart Ag Bispecifikus anti-VEGF/anti-ANG-2 antitestek és ezek alkalmazása szemészeti érbetegségek kezelésében
AU2013295848B2 (en) 2012-07-25 2018-05-24 Celldex Therapeutics, Inc. Anti-KIT antibodies and uses thereof
GB201213652D0 (en) 2012-08-01 2012-09-12 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
EA031631B1 (ru) 2012-09-27 2019-01-31 Чугаи Сеияку Кабушики Каиша Способ лечения или предупреждения злокачественного новообразования, способ отбора пациента, способ тестирования предрасположенности к злокачественному новообразованию у субъекта, гибридный полипептид и его применения
EP2905290B1 (en) 2012-10-05 2019-12-04 Kyowa Kirin Co., Ltd. Heterodimeric protein composition
KR102584005B1 (ko) 2012-10-11 2023-09-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 글리신아미드 화합물의 제조 방법
JP6272230B2 (ja) 2012-10-19 2018-01-31 第一三共株式会社 親水性構造を含むリンカーで結合させた抗体−薬物コンジュゲート
WO2014071358A2 (en) 2012-11-05 2014-05-08 Foundation Medicine, Inc. Novel ntrk1 fusion molecules and uses thereof
WO2014072306A1 (en) 2012-11-08 2014-05-15 F. Hoffmann-La Roche Ag Her3 antigen binding proteins binding to the beta-hairpin of her3
TWI657095B (zh) 2012-11-13 2019-04-21 美商建南德克公司 抗血球凝集素抗體及使用方法
CN105025923B (zh) 2012-12-06 2018-03-27 国立大学法人金泽大学 间皮瘤的治疗方法
TWI614266B (zh) 2012-12-07 2018-02-11 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd 抗ｆｏｌｒ１抗體
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
CN104884474A (zh) 2012-12-21 2015-09-02 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含i类mhc的二硫键连接多价多功能蛋白质
KR20160007478A (ko) 2013-01-10 2016-01-20 젠맵 비. 브이 인간 IgG1 Fc 영역 변이체 및 그의 용도
EP2943511B1 (en) 2013-01-14 2019-08-07 Xencor, Inc. Novel heterodimeric proteins
US9701759B2 (en) 2013-01-14 2017-07-11 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10968276B2 (en) 2013-03-12 2021-04-06 Xencor, Inc. Optimized anti-CD3 variable regions
US9605084B2 (en) 2013-03-15 2017-03-28 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US11053316B2 (en) 2013-01-14 2021-07-06 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10131710B2 (en) 2013-01-14 2018-11-20 Xencor, Inc. Optimized antibody variable regions
US10487155B2 (en) 2013-01-14 2019-11-26 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
EP2945969A1 (en) 2013-01-15 2015-11-25 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
CA2898326C (en) 2013-01-18 2022-05-17 Foundation Medicine, Inc. Methods of treating cholangiocarcinoma
WO2014116749A1 (en) 2013-01-23 2014-07-31 Genentech, Inc. Anti-hcv antibodies and methods of using thereof
EP2953974B1 (en) 2013-02-05 2017-12-20 EngMab Sàrl Bispecific antibodies against cd3epsilon and bcma
EP2762496A1 (en) 2013-02-05 2014-08-06 EngMab AG Method for the selection of antibodies against BCMA
JP6357113B2 (ja) 2013-02-08 2018-07-11 株式会社医学生物学研究所 ヒトｎｒｇ１タンパク質に対する抗体
GB201302447D0 (en) 2013-02-12 2013-03-27 Oxford Biotherapeutics Ltd Therapeutic and diagnostic target
KR20150118159A (ko) 2013-02-22 2015-10-21 에프. 호프만-라 로슈 아게 암의 치료 방법 및 약물 내성의 예방 방법
US20140242083A1 (en) 2013-02-26 2014-08-28 Roche Glycart Ag Anti-mcsp antibodies
KR20150143458A (ko) 2013-03-06 2015-12-23 메리맥 파마슈티컬즈, 인크. 항-C-MET 탠덤 Fc 이중특이적 항체
CN105246511A (zh) 2013-03-06 2016-01-13 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗和预防癌症药物抗性的方法
EP2968565A2 (en) 2013-03-14 2016-01-20 Genentech, Inc. Methods of treating cancer and preventing cancer drug resistance
EP2970474B1 (en) 2013-03-14 2017-12-20 Genentech, Inc. Anti-b7-h4 antibodies and immunoconjugates
CN105246508A (zh) 2013-03-14 2016-01-13 基因泰克公司 Mek抑制剂化合物与her3/egfr抑制剂化合物的组合及使用方法
US9562099B2 (en) 2013-03-14 2017-02-07 Genentech, Inc. Anti-B7-H4 antibodies and immunoconjugates
JP2016520528A (ja) 2013-03-15 2016-07-14 ジェネンテック， インコーポレイテッド 癌の治療及び抗癌剤耐性の防止方法
AU2014232501C1 (en) 2013-03-15 2021-04-22 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
KR20150131177A (ko) 2013-03-15 2015-11-24 제넨테크, 인크. 항-CRTh2 항체 및 그의 용도
WO2014145907A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Xencor, Inc. Targeting t cells with heterodimeric proteins
TR201809571T4 (tr) 2013-03-15 2018-07-23 Hoffmann La Roche Ll-22 polipeptidleri ile ıl-22 fc füzyon proteinleri ve kullanım yöntemleri.
US10106624B2 (en) 2013-03-15 2018-10-23 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
US10519242B2 (en) 2013-03-15 2019-12-31 Xencor, Inc. Targeting regulatory T cells with heterodimeric proteins
CA2903576C (en) 2013-03-15 2021-06-08 Nai-Kong V. Cheung High affinity anti-gd2 antibodies
CA2905798C (en) 2013-03-15 2023-01-24 Genentech, Inc. Biomarkers and methods of treating pd-1 and pd-l1 related conditions
US9260527B2 (en) 2013-03-15 2016-02-16 Sdix, Llc Anti-human CXCR4 antibodies and methods of making same
JP6568514B2 (ja) 2013-03-15 2019-08-28 エーシー イミューン エス．エー． 抗タウ抗体及び使用方法
US10858417B2 (en) 2013-03-15 2020-12-08 Xencor, Inc. Heterodimeric proteins
AU2014236815B2 (en) 2013-03-15 2019-04-04 Genentech, Inc. Compositions and methods for diagnosis and treatment of hepatic cancers
UA118028C2 (uk) 2013-04-03 2018-11-12 Рош Глікарт Аг Біспецифічне антитіло, специфічне щодо fap і dr5, антитіло, специфічне щодо dr5, і спосіб їх застосування
WO2014174596A1 (ja) 2013-04-23 2014-10-30 株式会社医学生物学研究所 ヘパリン結合上皮増殖因子様増殖因子に対する機能性モノクローナル抗体
EP3327034A1 (en) 2013-04-29 2018-05-30 F. Hoffmann-La Roche AG Fcrn-binding abolished anti-igf-1r antibodies and their use in the treatment of vascular eye diseases
EP2992010B1 (en) 2013-04-29 2021-03-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor binding modified asymmetric antibodies and methods of use
MY172430A (en) 2013-04-29 2019-11-25 Hoffmann La Roche Human fcrn-binding modified antibodies and methods of use
TWI573805B (zh) 2013-05-20 2017-03-11 建南德克公司 抗轉鐵蛋白受體抗體及其使用方法
KR20160015286A (ko) 2013-05-31 2016-02-12 제넨테크, 인크. 항-세포벽 테이코산 항체 및 접합체
ES2793174T3 (es) 2013-05-31 2020-11-13 Genentech Inc Anticuerpos antiteicoicos de pared y conjugados
BR112015032414A2 (pt) 2013-06-24 2017-11-07 Chugai Pharmaceutical Co Ltd agente terapêutico compreendendo anticorpo antiepirregulina humanizado como ingrediente ativo para carcinoma de pulmão de célula não pequena excluindo adenocarcinoma
SI3027651T1 (sl) 2013-08-01 2019-05-31 Five Prime Therapeutics, Inc. Afukozilirana protitelesa proti fgfr2iiib
CA2922889A1 (en) 2013-09-17 2015-03-26 Genentech, Inc. Methods of using anti-lgr5 antibodies
MX2016003643A (es) 2013-09-30 2016-12-20 Daiichi Sankyo Co Ltd Anticuerpo anti-lps o11.
TWI664977B (zh) 2013-10-08 2019-07-11 第一三共股份有限公司 抗ｆｇｆｒ２抗體及其與其他藥劑之組合
KR20160068855A (ko) 2013-10-11 2016-06-15 제넨테크, 인크. Nsp4 억제제 및 사용 방법
PE20160561A1 (es) 2013-10-11 2016-06-03 Oxford Biotherapeutics Ltd Anticuerpos conjugados contra ly75 para el tratamiento de cancer
ES2764833T3 (es) 2013-10-11 2020-06-04 The United States Of America Represented By The Sec Dep Of Health And Human Services Anticuerpos contra TEM8 y su uso
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
RU2016114074A (ru) 2013-10-18 2017-11-23 Дженентек, Инк. Анти-rspo антитела и способы применения
EP3060685B1 (en) 2013-10-23 2019-05-01 F. Hoffmann-La Roche AG Method of predicting the response of an asthma patient to therapy
EP3070167A4 (en) 2013-11-06 2017-06-07 Osaka University Antibody having broad neutralizing activity in group 1 influenza a virus
NZ717673A (en) 2013-11-21 2020-02-28 Hoffmann La Roche Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
EP3763813A1 (en) 2013-12-04 2021-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecules, the antigen-binding activity of which varies according to the concentration of compounds, and libraries of said molecules
KR20160098328A (ko) 2013-12-13 2016-08-18 제넨테크, 인크. 항-cd33 항체 및 면역접합체
US8980273B1 (en) 2014-07-15 2015-03-17 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
US8986691B1 (en) 2014-07-15 2015-03-24 Kymab Limited Method of treating atopic dermatitis or asthma using antibody to IL4RA
HUE047699T2 (hu) 2013-12-17 2020-05-28 Hoffmann La Roche Eljárások rákbetegségek kezelésére PD-1-tengelyhez kötõdõ antagonisták és taxánok alkalmazásával
CN110156893B (zh) 2013-12-17 2023-03-03 基因泰克公司 抗cd3抗体及使用方法
US20150210772A1 (en) 2013-12-17 2015-07-30 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using pd-1 axis binding antagonists and an anti-cd20 antibody
EP3083687A2 (en) 2013-12-17 2016-10-26 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
TWI728373B (zh) 2013-12-23 2021-05-21 美商建南德克公司 抗體及使用方法
RU2743077C2 (ru) 2013-12-25 2021-02-15 Дайити Санкио Компани, Лимитед Конъюгат анти-trop2 антитело-лекарственное средство
BR112016013347B1 (pt) 2013-12-26 2023-12-12 Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation Anticorpo monoclonal humano neutralizante anti-il-33, composição farmacêutica, inibidor da expressão de citocinas, molécula de ácido nucleico, vetor, célula bacteriana transgênica, método de produção e uso dos mesmos
TW201609093A (zh) 2013-12-27 2016-03-16 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Ｆｇｆｒ門控蛋白變異基因及以其爲標的之醫藥
BR112016012666A2 (pt) 2014-01-03 2017-09-26 Hoffmann La Roche conjugado, anticorpos, formulação farmacêutica e usos de conjugado
JP6476194B2 (ja) 2014-01-03 2019-02-27 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 二重特異性抗ハプテン／抗血液脳関門受容体抗体、それらの複合体、及び血液脳関門シャトルとしてのそれらの使用
MX2016008191A (es) 2014-01-03 2017-11-16 Hoffmann La Roche Conjugados de toxina polipeptidica-anticuerpo unidos covalentemente.
WO2015103549A1 (en) 2014-01-03 2015-07-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
RU2694659C2 (ru) 2014-01-06 2019-07-16 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Одновалентные модули-переносчики через гематоэнцефалический барьер
EP3835318A1 (en) 2014-01-15 2021-06-16 F. Hoffmann-La Roche AG Fc-region variants with modified fcrn- and maintained protein a-binding properties
EP3096797A1 (en) 2014-01-24 2016-11-30 F. Hoffmann-La Roche AG Methods of using anti-steap1 antibodies and immunoconjugates
CN105829346B (zh) 2014-01-31 2019-08-23 第一三共株式会社 抗her2抗体－药物偶联物
AU2015214264B2 (en) 2014-02-04 2018-12-20 Curis, Inc. Mutant Smoothened and methods of using the same
CN106163548A (zh) 2014-02-08 2016-11-23 健泰科生物技术公司 治疗阿尔茨海默氏病的方法
AU2015213741B2 (en) 2014-02-08 2020-10-08 Genentech, Inc. Methods of treating Alzheimer's Disease
TW201902515A (zh) 2014-02-12 2019-01-16 美商建南德克公司 抗jagged1抗體及使用方法
KR20160124165A (ko) 2014-02-21 2016-10-26 제넨테크, 인크. 항-il-13/il-17 이중특이적 항체 및 그의 용도
AU2015225867B2 (en) 2014-03-07 2020-02-06 University Health Network Methods and compositions for modifying the immune response
US10435694B2 (en) 2014-03-14 2019-10-08 Genentech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US20170107294A1 (en) 2014-03-21 2017-04-20 Nordlandssykehuset Hf Anti-cd14 antibodies and uses thereof
EP3122900A1 (en) 2014-03-24 2017-02-01 F. Hoffmann-La Roche AG Cancer treatment with c-met antagonists and correlation of the latter with hgf expression
SG10202008629XA (en) 2014-03-28 2020-10-29 Xencor Inc Bispecific antibodies that bind to cd38 and cd3
CR20160500A (es) 2014-03-31 2016-12-14 Genentech Inc Anticuerpos anti-ox40 y métodos de uso
WO2015153514A1 (en) 2014-03-31 2015-10-08 Genentech, Inc. Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
ES2859648T3 (es) 2014-04-10 2021-10-04 Daiichi Sankyo Co Ltd Conjugado anticuerpo-fármaco anti-HER3
WO2015164615A1 (en) 2014-04-24 2015-10-29 University Of Oslo Anti-gluten antibodies and uses thereof
US11760807B2 (en) 2014-05-08 2023-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting drug which is administered to patient responsive to GPC3-targeting drug therapy
MX2016015162A (es) 2014-05-22 2017-03-03 Genentech Inc Anticuerpos anti - gpc3 e inmunoconjugados.
JP2017524371A (ja) 2014-05-23 2017-08-31 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｍｉｔバイオマーカーとその使用方法
AU2015271749B2 (en) 2014-06-03 2018-03-01 Xbiotech Inc. Compositions and methods for treating and preventing Staphylococcus aureus infections
MX2016016233A (es) 2014-06-11 2017-03-31 Genentech Inc Anticuerpos anti-lgr5 y sus usos.
US20230190750A1 (en) 2014-06-13 2023-06-22 Genentech, Inc. Methods of treating and preventing cancer drug resistance
EP3164419A1 (en) 2014-06-26 2017-05-10 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-brdu antibodies and methods of use
WO2016007235A1 (en) 2014-07-11 2016-01-14 Genentech, Inc. Anti-pd-l1 antibodies and diagnostic uses thereof
CN106488775A (zh) 2014-07-11 2017-03-08 基因泰克公司 Notch途径抑制
AU2015292326A1 (en) 2014-07-24 2017-02-23 Xencor, Inc. Rapid clearance of antigen complexes using novel antibodies
EP3186284B1 (en) 2014-08-28 2022-04-06 BioAtla, Inc. Conditionally active chimeric antigen receptors for modified t-cells
TWI751102B (zh) 2014-08-28 2022-01-01 美商奇諾治療有限公司 對ｃｄ１９具專一性之抗體及嵌合抗原受體
SG10201809668TA (en) 2014-09-12 2018-11-29 Genentech Inc Anti-her2 antibodies and immunoconjugates
TW201625689A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 抗－ｂ７－ｈ４抗體及免疫結合物
EP3191520B1 (en) 2014-09-12 2020-01-01 Genentech, Inc. Anti-cll-1 antibodies and immunoconjugates
CN107124870A (zh) 2014-09-17 2017-09-01 基因泰克公司 包含抗her2抗体和吡咯并苯并二氮杂*的免疫缀合物
EP3689910A3 (en) 2014-09-23 2020-12-02 F. Hoffmann-La Roche AG Method of using anti-cd79b immunoconjugates
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
EP3207057A2 (en) 2014-10-16 2017-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-alpha-synuclein antibodies and methods of use
WO2016070001A1 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Jounce Therapeutics, Inc. Methods of treating conditions with antibodies that bind b7-h4
BR112017009151A2 (pt) 2014-11-03 2018-03-06 Genentech, Inc. ensaios para detectar subgrupos imunológicos de célula t e métodos de uso dos mesmos
WO2016073380A1 (en) 2014-11-03 2016-05-12 Genentech, Inc. Method and biomarkers for predicting efficacy and evaluation of an ox40 agonist treatment
WO2016071376A2 (en) 2014-11-06 2016-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-region variants with modified fcrn-binding and methods of use
BR112017006591A2 (pt) 2014-11-06 2018-01-16 Hoffmann La Roche polipeptídeo heterodimérico, formulação farmacêutica e uso de um polipeptídeo heterodimérico
WO2016073282A1 (en) 2014-11-06 2016-05-12 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and tigit inhibitors
WO2016077369A1 (en) 2014-11-10 2016-05-19 Genentech, Inc. Animal model for nephropathy and agents for treating the same
EA201791029A1 (ru) 2014-11-10 2017-12-29 Дженентек, Инк. Антитела против интерлейкина-33 и их применение
EP3875481A1 (en) 2014-11-14 2021-09-08 The U.S.A. as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
US20160166685A1 (en) 2014-11-17 2016-06-16 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ox40 binding agonists and pd-1 axis binding antagonists
EP3221362B1 (en) 2014-11-19 2019-07-24 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-transferrin receptor antibodies and methods of use
CN107250158B (zh) 2014-11-19 2022-03-25 基因泰克公司 抗转铁蛋白受体/抗bace1多特异性抗体和使用方法
US10882920B2 (en) 2014-11-19 2021-01-05 Genentech, Inc. Antibodies against BACE1 and use thereof for neural disease immunotherapy
ES2835823T3 (es) 2014-11-20 2021-06-23 Hoffmann La Roche Politerapia de moléculas de unión a antígeno biespecíficas activadoras de linfocitos T para CD3 y para el receptor de folato 1 (FolR1) y antagonistas de la unión al eje de PD-1
US10259887B2 (en) 2014-11-26 2019-04-16 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
IL252480B2 (en) 2014-11-26 2023-12-01 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind CD3 and tumor antigens
JP2017536830A (ja) 2014-11-26 2017-12-14 ゼンコー・インコーポレイテッドＸｅｎｃｏｒ、 Ｉｎｃ． Ｃｄ３及びｃｄ３８に結合するヘテロ二量体抗体
WO2016090040A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 Genentech, Inc. Anti-staphylococcus aureus antibody rifamycin conjugates and uses thereof
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
JP6742314B2 (ja) 2014-12-03 2020-08-19 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗黄色ブドウ球菌抗体リファマイシン複合体及びその使用
EP3227336B1 (en) 2014-12-05 2019-07-03 F.Hoffmann-La Roche Ag Anti-cd79b antibodies and methods of use
WO2016094566A2 (en) 2014-12-10 2016-06-16 Genentech, Inc. Blood brain barrier receptor antibodies and methods of use
LT3233921T (lt) 2014-12-19 2021-12-10 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antikūnai ir panaudojimo būdai
EP3237449A2 (en) 2014-12-22 2017-11-01 Xencor, Inc. Trispecific antibodies
US20160200815A1 (en) 2015-01-05 2016-07-14 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies that inhibit tim-3:lilrb2 interactions and uses thereof
KR20170128234A (ko) 2015-01-16 2017-11-22 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 Ror1에 특이적인 항체 및 키메라 항원 수용체
EP3247723A1 (en) 2015-01-22 2017-11-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha A combination of two or more anti-c5 antibodies and methods of use
JP2018512597A (ja) 2015-02-04 2018-05-17 ジェネンテック， インコーポレイテッド 突然変異体スムースンド及びその使用方法
KR102605798B1 (ko) 2015-02-05 2023-11-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 이온 농도 의존적 항원 결합 도메인을 포함하는 항체, Fc 영역 개변체, IL-8에 결합하는 항체, 및 그들의 사용
WO2016130539A2 (en) 2015-02-09 2016-08-18 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Multi-specific antibodies with affinity for human a33 antigen and dota metal complex and uses thereof
EP3261665A1 (en) 2015-02-24 2018-01-03 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Middle east respiratory syndrome coronavirus immunogens, antibodies, and their use
US10227411B2 (en) 2015-03-05 2019-03-12 Xencor, Inc. Modulation of T cells with bispecific antibodies and FC fusions
MX2017011486A (es) 2015-03-16 2018-06-15 Genentech Inc Métodos de detección y cuantificación de il-13 y sus usos en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades asociadas a th2.
WO2016146833A1 (en) 2015-03-19 2016-09-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Biomarkers for nad(+)-diphthamide adp ribosyltransferase resistance
PL3271389T3 (pl) 2015-03-20 2020-08-10 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizujące przeciwciała wiążące się z gp120 i ich stosowanie
US10023635B2 (en) 2015-03-23 2018-07-17 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to ICOS
US10472412B2 (en) 2015-03-25 2019-11-12 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific multivalent fusion proteins
US20180208658A1 (en) 2015-04-03 2018-07-26 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting afp peptide/mhc complexes and uses thereof
SI3286315T1 (sl) 2015-04-24 2021-09-30 F. Hoffmann-La Roche Ag Postopek identifikacije bakterij, ki obsegajo vezavne polipeptide
CR20200517A (es) 2015-04-28 2021-01-12 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp PROTEINA DE UNION A RGma Y SUS USO
EP3288981A1 (en) 2015-05-01 2018-03-07 Genentech, Inc. Masked anti-cd3 antibodies and methods of use
WO2016179194A1 (en) 2015-05-04 2016-11-10 Jounce Therapeutics, Inc. Lilra3 and method of using the same
MA42043A (fr) 2015-05-07 2018-03-14 Agenus Inc Anticorps anti-ox40 et procédés d'utilisation de ceux-ci
CN116196414A (zh) 2015-05-11 2023-06-02 豪夫迈·罗氏有限公司 治疗狼疮性肾炎的组合物和方法
HRP20201900T4 (hr) 2015-05-12 2024-06-07 F. Hoffmann - La Roche Ag Terapeutski i dijagnostički postupci kod raka
WO2016181357A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-17 Zumutor Biologics, Inc. Afucosylated protein, cell expressing said protein and associated methods
JP2018520658A (ja) 2015-05-29 2018-08-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド ヒト化抗エボラウイルス糖タンパク質抗体及びその使用
IL294138A (en) 2015-05-29 2022-08-01 Genentech Inc Therapeutic and diagnostic methods for cancer
JP2018516933A (ja) 2015-06-02 2018-06-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｉｌ−３４抗体を使用して神経学的疾患を治療するための組成物及び方法
WO2016196975A1 (en) 2015-06-03 2016-12-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary Department Of Health & Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
JP6793134B2 (ja) 2015-06-05 2020-12-02 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
EP3303397A1 (en) 2015-06-08 2018-04-11 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of treating cancer using anti-ox40 antibodies and pd-1 axis binding antagonists
AU2016274585A1 (en) 2015-06-08 2017-12-14 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-OX40 antibodies
EP3307780A1 (en) 2015-06-15 2018-04-18 Genentech, Inc. Antibodies and immunoconjugates
AR105026A1 (es) 2015-06-16 2017-08-30 Genentech Inc ANTICUERPOS MADURADOS POR AFINIDAD Y HUMANIZADOS PARA FcRH5 Y MÉTODOS PARA SU USO
TW201718647A (zh) 2015-06-16 2017-06-01 建南德克公司 抗-cll-1抗體及使用方法
EP3916018A1 (en) 2015-06-16 2021-12-01 Genentech, Inc. Anti-cd3 antibodies and methods of use
KR20180018538A (ko) 2015-06-17 2018-02-21 제넨테크, 인크. Pd-1 축 결합 길항제 및 탁산을 사용하여 국소적 진행성 또는 전이성 유방암을 치료하는 방법
AU2016280159A1 (en) 2015-06-17 2017-12-07 Genentech, Inc. Anti-HER2 antibodies and methods of use
LT3313879T (lt) 2015-06-24 2022-03-25 F. Hoffmann-La Roche Ag Antikūnai prieš transferino receptorių su pritaikytu giminingumu
JP2018520153A (ja) 2015-06-29 2018-07-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド 臓器移植における使用のためのｉｉ型抗ｃｄ２０抗体
ES2938186T3 (es) 2015-06-29 2023-04-05 Daiichi Sankyo Co Ltd Procedimiento de fabricación selectiva de un conjugado anticuerpo-fármaco
AU2016288461B2 (en) 2015-06-29 2021-10-07 Ventana Medical Systems, Inc. Materials and methods for performing histochemical assays for human pro-epiregulin and amphiregulin
BR112018001955B1 (pt) 2015-08-03 2021-05-11 Engmab Sárl anticorpo monoclonal que se liga às células b humanas (bcma), composição farmacêutica e seu uso
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
WO2017040342A1 (en) 2015-08-28 2017-03-09 Genentech, Inc. Anti-hypusine antibodies and uses thereof
TWI751300B (zh) 2015-09-18 2022-01-01 日商中外製藥股份有限公司 Il-8 結合抗體及其用途
JP6904947B2 (ja) 2015-09-22 2021-07-21 スプリング バイオサイエンス コーポレーション 抗ｏｘ４０抗体及びその診断用途
SG10201911226QA (en) 2015-09-23 2020-01-30 Genentech Inc Optimized variants of anti-vegf antibodies
AU2016326738B2 (en) 2015-09-24 2023-08-31 Abvitro Llc HIV antibody compositions and methods of use
TWI836305B (zh) 2015-09-24 2024-03-21 日商第一三共股份有限公司 抗ｇａｒｐ抗體及其製造方法及用途
JP6764474B2 (ja) 2015-09-25 2020-09-30 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔｉｇｉｔ抗体及び使用方法
MA43345A (fr) 2015-10-02 2018-08-08 Hoffmann La Roche Conjugués anticorps-médicaments de pyrrolobenzodiazépine et méthodes d'utilisation
EP3150636A1 (en) 2015-10-02 2017-04-05 F. Hoffmann-La Roche AG Tetravalent multispecific antibodies
AR106189A1 (es) 2015-10-02 2017-12-20 Hoffmann La Roche ANTICUERPOS BIESPECÍFICOS CONTRA EL A-b HUMANO Y EL RECEPTOR DE TRANSFERRINA HUMANO Y MÉTODOS DE USO
TWI819458B (zh) 2015-10-02 2023-10-21 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 雙特異性抗‐人類cd20/人類轉鐵蛋白受體抗體及使用方法
US10392441B2 (en) 2015-10-07 2019-08-27 United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services IL-7R-alpha specific antibodies for treating acute lymphoblastic leukemia
CA2998208A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 Jounce Therapeutics, Inc. Gene signatures for determining icos expression
KR20180069065A (ko) 2015-10-29 2018-06-22 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-변이체 fc-부위 항체 및 사용 방법
EP3184547A1 (en) 2015-10-29 2017-06-28 F. Hoffmann-La Roche AG Anti-tpbg antibodies and methods of use
CN108289951A (zh) 2015-10-30 2018-07-17 豪夫迈·罗氏有限公司 抗-因子d抗体和缀合物
EP3368578B1 (en) 2015-10-30 2021-03-17 H. Hoffnabb-La Roche Ag Anti-htra1 antibodies and methods of use thereof
CN115010805A (zh) 2015-11-03 2022-09-06 美国政府(由卫生和人类服务部的部长所代表) Hiv-1 gp41中和抗体及其用途
EP3371217A1 (en) 2015-11-08 2018-09-12 H. Hoffnabb-La Roche Ag Methods of screening for multispecific antibodies
RU2021107536A (ru) 2015-11-23 2021-07-02 Файв Прайм Терапьютикс, Инк. Ингибиторы fgfr2 отдельно или в комбинации с иммуностимулирующими агентами в лечении рака
US11623957B2 (en) 2015-12-07 2023-04-11 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind CD3 and PSMA
TWI747936B (zh) 2015-12-18 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 抗ｃ５抗體及使用方法
CA3006529A1 (en) 2016-01-08 2017-07-13 F. Hoffmann-La Roche Ag Methods of treating cea-positive cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-cea/anti-cd3 bispecific antibodies
CN108602883A (zh) 2016-01-20 2018-09-28 基因泰克公司 用于阿尔茨海默氏病的高剂量治疗
AU2017213826A1 (en) 2016-02-04 2018-08-23 Curis, Inc. Mutant smoothened and methods of using the same
KR20180119632A (ko) 2016-02-29 2018-11-02 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
EP4112641A1 (en) 2016-03-15 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of treating cancers using pd-1 axis binding antagonists and anti-gpc3 antibodies
JP6943872B2 (ja) 2016-03-25 2021-10-06 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多重全抗体及び抗体複合体化薬物定量化アッセイ
JP6887613B2 (ja) * 2016-03-31 2021-06-16 国立大学法人東北大学 がん微小環境を標的とした抗ポドカリキシン抗体
US20170319688A1 (en) 2016-04-14 2017-11-09 Genentech, Inc. Anti-rspo3 antibodies and methods of use
KR20230162730A (ko) 2016-04-15 2023-11-28 바이오아트라, 인코퍼레이티드 항 Axl항체 및 이의 면역접합체와 이것들의 용도
AU2017250296A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
AU2017248766A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
UA123323C2 (uk) 2016-05-02 2021-03-17 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Димерний злитий поліпептид
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
CN109071640B (zh) 2016-05-11 2022-10-18 豪夫迈·罗氏有限公司 经修饰抗生腱蛋白抗体及使用方法
US11254742B2 (en) 2016-05-13 2022-02-22 Bioatla, Inc. Anti-Ror2 antibodies, antibody fragments, their immunoconjugates and uses thereof
US20200123237A1 (en) 2016-05-18 2020-04-23 Genmab B.V. Antibodies and methods of use thereof in treatment of infectious disease
JP2019522633A (ja) 2016-05-20 2019-08-15 ジェネンテック， インコーポレイテッド Ｐｒｏｔａｃ抗体コンジュゲート及び使用方法
US20170370906A1 (en) 2016-05-27 2017-12-28 Genentech, Inc. Bioanalytical analysis of site-specific antibody drug conjugates
ES2963807T3 (es) 2016-06-08 2024-04-02 Xencor Inc Tratamiento de enfermedades relacionadas con la IgG4 con anticuerpos anti-CD19 de reticulación a CD32B
IL263542B1 (en) 2016-06-14 2024-06-01 Xencor Inc Bispecific antibodies inhibit immunological checkpoint
WO2017223405A1 (en) 2016-06-24 2017-12-28 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
WO2018005706A1 (en) 2016-06-28 2018-01-04 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind somatostatin receptor 2
EP3484923A1 (en) 2016-07-15 2019-05-22 Takeda Pharmaceutical Company Limited Methods and materials for assessing response to plasmablast- and plasma cell-depleting therapies
WO2018014260A1 (en) 2016-07-20 2018-01-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Multispecific antigen binding proteins and methods of use thereof
KR102553195B1 (ko) 2016-07-29 2023-07-07 주노 쎄러퓨티크스 인코퍼레이티드 항-cd19 항체에 대한 항-이디오타입 항체
MX2018015721A (es) 2016-07-29 2019-05-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpos biespecificos que exhiben actividad de funcion de cofactor fviii alternativa mejorada.
NL2017270B1 (en) 2016-08-02 2018-02-09 Aduro Biotech Holdings Europe B V New anti-hCTLA-4 antibodies
JP6527643B2 (ja) 2016-08-05 2019-06-05 中外製薬株式会社 Ｉｌ−８関連疾患の治療用又は予防用組成物
EP3497129A1 (en) 2016-08-08 2019-06-19 H. Hoffnabb-La Roche Ag Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US10793632B2 (en) 2016-08-30 2020-10-06 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
US11168148B2 (en) 2016-09-07 2021-11-09 The Regents Of The University Of California Antibodies to oxidation-specific epitopes
WO2018053032A1 (en) 2016-09-13 2018-03-22 Humanigen, Inc. Epha3 antibodies for the treatment of pulmonary fibrosis
SG10201607778XA (en) 2016-09-16 2018-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-Dengue Virus Antibodies, Polypeptides Containing Variant Fc Regions, And Methods Of Use
JP6976315B2 (ja) 2016-09-19 2021-12-08 エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲーF. Hoffmann−La Roche Aktiengesellschaft 補体因子に基づくアフィニティークロマトグラフィー
AU2017330405B2 (en) 2016-09-23 2024-02-01 Genentech, Inc. Uses of IL-13 antagonists for treating atopic dermatitis
MX2019003768A (es) 2016-10-03 2019-06-24 Juno Therapeutics Inc Moleculas de enlace especificas de hpv.
EP3522933B1 (en) 2016-10-05 2021-12-15 F. Hoffmann-La Roche AG Methods for preparing antibody drug conjugates
AU2017339517B2 (en) 2016-10-06 2024-03-14 Foundation Medicine, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
US20190330368A1 (en) 2016-10-07 2019-10-31 Daiichi Sankyo Company, Limited Therapy for drug-resistant cancer by administration of anti-her2 antibody/drug conjugate
WO2018068201A1 (en) 2016-10-11 2018-04-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against ctla-4
AU2017342559B2 (en) 2016-10-14 2022-03-24 Xencor, Inc. Bispecific heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15Ralpha Fc-fusion proteins and PD-1 antibody fragments
CN110267678A (zh) 2016-10-29 2019-09-20 霍夫曼-拉罗奇有限公司 抗mic抗体和使用方法
CN110461868A (zh) 2016-11-01 2019-11-15 根马布私人有限公司 多肽变体及其用途
MY195110A (en) 2016-11-02 2023-01-10 Jounce Therapeutics Inc Antibodies to PD-1 and uses Thereof
CN110167964B (zh) 2016-11-02 2023-12-01 百时美施贵宝公司 组合用于治疗多发性骨髓瘤的针对bcma和cd3的双特异性抗体和免疫药物
TWI791471B (zh) 2016-11-15 2023-02-11 美商建南德克公司 用於用抗ｃｄ２０/抗ｃｄ３雙特異性抗體進行治療之給藥
EP3468991A1 (en) 2016-11-21 2019-04-17 cureab GmbH Anti-gp73 antibodies and immunoconjugates
TW201825119A (zh) 2016-11-30 2018-07-16 日商協和醱酵麒麟有限公司 使用抗ccr4抗體及抗pd-1抗體治療癌症之方法
AR110321A1 (es) 2016-12-07 2019-03-20 Genentech Inc Anticuerpos antitau y métodos de uso
JP2020511937A (ja) 2016-12-07 2020-04-23 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ｔａｕ抗体及び使用方法
AU2017375946A1 (en) 2016-12-12 2019-06-20 Genentech, Inc. Methods of treating cancer using anti-PD-l1 antibodies and antiandrogens
CA3046293A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and immune checkpoint inhibitor
US11618785B2 (en) 2016-12-22 2023-04-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-CD3 antibody and molecules comprising the antibody
JOP20190134A1 (ar) 2016-12-23 2019-06-02 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لنيوروبيلين وطرق استخدامها
AU2017388346A1 (en) 2016-12-26 2019-07-11 Kagoshima University Antibody capable of binding to myelin oligodendrocyte glycoprotein
TW201825515A (zh) 2017-01-04 2018-07-16 美商伊繆諾金公司 Ｍｅｔ抗體以及其免疫結合物及用途
MX2019004692A (es) 2017-01-06 2019-11-08 Eutilex Co Ltd Anticuerpos 4-1bb anti-humano y usos de los mismos.
WO2018132597A1 (en) 2017-01-12 2018-07-19 Eureka Therapeutics, Inc. Constructs targeting histone h3 peptide/mhc complexes and uses thereof
EP3572428A4 (en) 2017-01-17 2020-12-30 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-GPR20 ANTIBODY AND ANTI-GPR20 ANTIBODY MEDICINAL CONJUGATE
JPWO2018139404A1 (ja) 2017-01-24 2019-11-14 協和キリン株式会社 放射線障害の治療又は予防剤並びに治療又は予防方法
AU2018218753A1 (en) 2017-02-07 2019-09-26 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-GPRC5D antibody and molecule containing same
US11021535B2 (en) 2017-02-10 2021-06-01 The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
AR110873A1 (es) 2017-02-10 2019-05-08 Genentech Inc Anticuerpos contra triptasa, composiciones de estos y usos de estos
MX2019009346A (es) 2017-02-10 2019-10-02 Genmab Bv Variantes de polipeptidos y usos de los mismos.
EP3882271A3 (en) 2017-02-10 2022-01-05 Eutilex Co., Ltd. Ifn-gamma-inducible regulatory t cell convertible anti-cancer (irtca) antibody and uses thereof
TW201834696A (zh) 2017-02-28 2018-10-01 學校法人近畿大學 藉由投予抗her3抗體－藥物複合體之egfr－tki抗性之非小細胞肺癌的治療方法
ES2953595T3 (es) 2017-03-01 2023-11-14 Hoffmann La Roche Procedimientos diagnósticos y terapéuticos para el cáncer
EP3590535A4 (en) 2017-03-02 2020-12-30 St. Marianna University School of Medicine PREVENTIVE OR THERAPEUTIC AGENT AGAINST HTLV-1 ASSOCIATED MYELOPATHY WITH THE USE OF LOW DOSE ANTI-CCR4 ANTIBODIES
CA3056248A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Genentech, Inc. Optimized antibody compositions for treatment of ocular disorders
JP2020515543A (ja) 2017-03-28 2020-05-28 ジェネンテック， インコーポレイテッド 神経変性疾患の治療方法
HUE054316T2 (hu) 2017-03-29 2021-08-30 Shionogi & Co Gyógyászati készítmény rák kezelésére
JOP20190203A1 (ar) 2017-03-30 2019-09-03 Potenza Therapeutics Inc بروتينات رابطة لمولد ضد مضادة لـ tigit وطرق استخدامها
US11306152B2 (en) 2017-03-30 2022-04-19 Tohoku University Anti-podoplanin antibody
TW201839400A (zh) 2017-04-14 2018-11-01 美商建南德克公司 用於癌症之診斷及治療方法
MX2019012419A (es) 2017-04-21 2019-12-05 Genentech Inc Uso de antagonistas de klk5 para el tratamiento de una enfermedad.
JP7295030B2 (ja) 2017-04-26 2023-06-20 ユーリカ セラピューティックス， インコーポレイテッド グリピカン３を特異的に認識するコンストラクト及びその使用
CN110799541A (zh) 2017-04-27 2020-02-14 特沙诺有限公司 针对淋巴细胞活化基因-3(lag-3)的抗体药剂及其用途
US11116835B2 (en) 2017-05-10 2021-09-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Epstein Barr virus antibodies, vaccines, and uses of the same
TW202330036A (zh) 2017-05-15 2023-08-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物之製造方法
EP3624837A1 (en) 2017-05-16 2020-03-25 Five Prime Therapeutics, Inc. Anti-fgfr2 antibodies in combination with chemotherapy agents in cancer treatment
WO2019006472A1 (en) 2017-06-30 2019-01-03 Xencor, Inc. TARGETED HETETRODIMERIC FUSION PROTEINS CONTAINING IL-15 / IL-15RA AND ANTIGEN-BINDING DOMAINS
TW201908341A (zh) 2017-07-18 2019-03-01 日商協和醱酵麒麟有限公司 抗人類ccr1單株抗體
KR20240006698A (ko) 2017-07-21 2024-01-15 제넨테크, 인크. 암에 대한 치료 및 진단 방법
PL3658589T3 (pl) 2017-07-26 2024-03-18 Forty Seven, Inc. Przeciwciała anty-sirp-alfa i powiązane sposoby
SG11202000759XA (en) 2017-07-27 2020-02-27 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cd147 antibody
EP3673918A4 (en) 2017-08-23 2021-05-19 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTIBODY-DRUG CONJUGATE PREPARATION AND ASSOCIATED LYOPHILIZATION
WO2019040780A1 (en) 2017-08-25 2019-02-28 Five Prime Therapeutics Inc. ANTI-B7-H4 ANTIBODIES AND METHODS OF USE
WO2019044947A1 (ja) 2017-08-31 2019-03-07 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートの改良製造方法
CN117838881A (zh) 2017-08-31 2024-04-09 第一三共株式会社 制备抗体-药物缀合物的新方法
JP7382922B2 (ja) 2017-09-20 2023-11-17 中外製薬株式会社 Ｐｄ－１系結合アンタゴニストおよびｇｐｃ３標的化剤を使用する併用療法のための投与レジメン
TWI820044B (zh) 2017-09-29 2023-11-01 日商第一三共股份有限公司 抗體－吡咯并苯二氮呯衍生物複合體
MX2020003536A (es) 2017-10-03 2020-09-14 Juno Therapeutics Inc Moleculas de union especifica a virus de papiloma humano (hpv).
TW201927336A (zh) 2017-10-05 2019-07-16 日商第一三共股份有限公司 細胞毒性ｔ細胞耗竭用組成物
CA3078974A1 (en) 2017-10-12 2019-04-18 Immunowake Inc. Vegfr-antibody light chain fusion protein
BR112020008323A2 (pt) 2017-11-01 2020-11-03 Juno Therapeutics Inc anticorpos e receptores de antígenos quiméricos específicos para antígeno de maturação de células b
KR20200075860A (ko) 2017-11-06 2020-06-26 제넨테크, 인크. 암의 진단 및 치료 방법
JP7311425B2 (ja) 2017-11-08 2023-07-19 協和キリン株式会社 ＣＤ４０とＥｐＣＡＭに結合するバイスペシフィック抗体
US10981992B2 (en) 2017-11-08 2021-04-20 Xencor, Inc. Bispecific immunomodulatory antibodies that bind costimulatory and checkpoint receptors
CA3082383A1 (en) 2017-11-08 2019-05-16 Xencor, Inc. Bispecific and monospecific antibodies using novel anti-pd-1 sequences
US10875915B2 (en) 2017-12-01 2020-12-29 Pfizer Inc. Anti-CXCR5 antibodies and compositions and uses thereof
US11485779B2 (en) 2017-12-12 2022-11-01 Kyowa Kirin Co., Ltd. Anti-BMP10 monoclonal antibody or fragment thereof
US12006356B2 (en) 2017-12-15 2024-06-11 Juno Therapeutics, Inc. Anti-CCT5 binding molecules and chimeric antigen receptors comprising the same
US11319355B2 (en) 2017-12-19 2022-05-03 Xencor, Inc. Engineered IL-2 Fc fusion proteins
US20190211098A1 (en) 2017-12-22 2019-07-11 Genentech, Inc. Use of pilra binding agents for treatment of a disease
SG11202004806SA (en) 2017-12-22 2020-06-29 Jounce Therapeutics Inc Antibodies to lilrb2
CN111542543B (zh) 2017-12-28 2023-12-22 南京传奇生物科技有限公司 针对pd-l1的抗体及其变体
CA3082280A1 (en) 2017-12-28 2019-07-04 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Single-domain antibodies and variants thereof against tigit
EP3724223A1 (en) 2018-01-02 2020-10-21 The United States of America, as represented by The Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to ebola virus glycoprotein and their use
JP7426724B2 (ja) 2018-01-05 2024-02-02 エイシー イミューン ソシエテ アノニム ミスフォールドされたｔｄｐ－４３結合分子
TWI802633B (zh) 2018-01-15 2023-05-21 大陸商南京傳奇生物科技有限公司 針對pd-1之單域抗體及其變異體
CA3088649A1 (en) 2018-01-16 2019-07-25 Lakepharma, Inc. Bispecific antibody that binds cd3 and another target
MA51676A (fr) 2018-01-26 2021-05-05 Hoffmann La Roche Protéines de fusion il-22 fc et procédés d'utilisation
KR20200125590A (ko) 2018-01-26 2020-11-04 제넨테크, 인크. 조성물 및 사용 방법
AU2019214183B2 (en) 2018-02-01 2022-04-07 Innovent Biologics (Suzhou) Co., Ltd. Fully human anti-B cell maturation antigen (BCMA) single chain variable fragment, and application thereof
AR115360A1 (es) 2018-02-08 2021-01-13 Genentech Inc Moléculas de unión al antígeno y métodos de uso
KR102417088B1 (ko) 2018-02-09 2022-07-07 제넨테크, 인크. 비만 세포 매개 염증성 질환에 대한 치료 및 진단 방법
WO2019158645A1 (en) 2018-02-14 2019-08-22 Abba Therapeutics Ag Anti-human pd-l2 antibodies
BR112020016986A2 (pt) 2018-02-21 2021-03-02 Five Prime Therapeutics, Inc. formulações de anticorpo contra b7-h4
MA51907A (fr) 2018-02-21 2021-05-26 Hoffmann La Roche Posologie pour un traitement avec des protéines de fusion il-22 fc
AU2019226034A1 (en) 2018-02-21 2020-10-15 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to HIV-1 Env and their use
SG11202007820QA (en) 2018-02-21 2020-09-29 Five Prime Therapeutics Inc B7-h4 antibody dosing regimens
CN111836831A (zh) 2018-02-26 2020-10-27 豪夫迈·罗氏有限公司 用于抗tigit拮抗剂抗体和抗pd-l1拮抗剂抗体治疗的给药
AU2019228600A1 (en) 2018-03-02 2020-09-24 Five Prime Therapeutics, Inc. B7-H4 antibodies and methods of use thereof
CA3093205A1 (en) 2018-03-05 2019-09-12 Saitama Medical University Pharmaceutical composition for treating or preventing heterotopic ossification
US20200040103A1 (en) 2018-03-14 2020-02-06 Genentech, Inc. Anti-klk5 antibodies and methods of use
JP2021515583A (ja) 2018-03-14 2021-06-24 ベイジン シュアンイー ファーマサイエンシーズ カンパニー， リミテッド 抗クローディン１８．２抗体
JP7377590B2 (ja) 2018-03-14 2023-11-10 ノビミューン エスアー 抗ｃｄ３イプシロン抗体およびそれを使用する方法
SG11202009010RA (en) 2018-03-15 2020-10-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-dengue virus antibodies having cross-reactivity to zika virus and methods of use
EP3774917A4 (en) 2018-03-30 2022-01-19 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. SINGLE DOMAIN ANTIBODIES AGAINST LAG-3 AND USES THEREOF
US10982006B2 (en) 2018-04-04 2021-04-20 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind fibroblast activation protein
TW202011029A (zh) 2018-04-04 2020-03-16 美商建南德克公司 偵測及定量fgf21之方法
MA52193A (fr) 2018-04-05 2021-02-17 Juno Therapeutics Inc Récepteurs de lymphocytes t et cellules modifiées les exprimant
CN110373374B (zh) * 2018-04-12 2023-07-07 上海颢哲信息科技有限公司 一种降低抗体核心岩藻糖基化的方法和组合物
JP2021521784A (ja) 2018-04-18 2021-08-30 ゼンコア インコーポレイテッド ＩＬ−１５／ＩＬ−１５ＲａＦｃ融合タンパク質とＰＤ−１抗原結合ドメインを含むＰＤ−１標的化ヘテロダイマー融合タンパク質およびそれらの使用
US11505595B2 (en) 2018-04-18 2022-11-22 Xencor, Inc. TIM-3 targeted heterodimeric fusion proteins containing IL-15/IL-15RA Fc-fusion proteins and TIM-3 antigen binding domains
US20210230255A1 (en) 2018-04-27 2021-07-29 Fondazione Ebri Rita Levi-Montalcini Antibody directed against a tau-derived neurotoxic peptide and uses thereof
CA3098486A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
EP3804764A4 (en) 2018-05-28 2022-04-06 Daiichi Sankyo Company, Limited TREATMENT OF HER2 MUTANT CANCER BY ADMINISTRATION OF ANTI-HER2 ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
KR20210018192A (ko) 2018-05-31 2021-02-17 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항인간 tlr7 항체
JP2021525806A (ja) 2018-06-01 2021-09-27 タユー ファシャ バイオテック メディカル グループ カンパニー， リミテッド 疾患または状態を処置するための組成物およびそれらの使用
EP3805400A4 (en) 2018-06-04 2022-06-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule showing changed half-life in cytoplasm
US20210127649A1 (en) * 2018-06-07 2021-05-06 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Transgenic mouse for aglycosylated antibody production and use of aglycosylated antibody produced therefrom
CN112469440A (zh) 2018-06-18 2021-03-09 优瑞科生物技术公司 靶向前列腺特异性膜抗原(psma)的构建体和其用途
US20200030443A1 (en) 2018-06-23 2020-01-30 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, a platinum agent, and a topoisomerase ii inhibitor
JP7397445B2 (ja) 2018-06-26 2023-12-13 協和キリン株式会社 Ｃｅｌｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ３に結合する抗体
US11965035B2 (en) 2018-06-26 2024-04-23 Kyowa Kirin Co., Ltd. Antibody binding to chondroitin sulfate proteoglycan 5
SG11202013138RA (en) 2018-07-02 2021-01-28 Amgen Inc Anti-steap1 antigen-binding protein
WO2020014306A1 (en) 2018-07-10 2020-01-16 Immunogen, Inc. Met antibodies and immunoconjugates and uses thereof
PE20211858A1 (es) 2018-07-13 2021-09-21 Genmab As Variantes de anticuerpos anti-cd38 y sus usos
JP2021526845A (ja) 2018-07-13 2021-10-11 ゲンマブ エー／エス Ｃｄ３８抗体を使用したトロゴサイトーシスを介した治療
WO2020018789A1 (en) 2018-07-18 2020-01-23 Genentech, Inc. Methods of treating lung cancer with a pd-1 axis binding antagonist, an antimetabolite, and a platinum agent
MX2021000745A (es) 2018-07-20 2021-03-26 Surface Oncology Inc Composiciones anti-cd112r y metodos.
AU2019311557A1 (en) 2018-07-25 2021-02-04 Daiichi Sankyo Company, Limited Effective method for manufacturing antibody-drug conjugate
BR112021001509A2 (pt) 2018-07-31 2021-04-27 Daiichi Sankyo Company, Limited agente terapêutico para um tumor de cérebro metastásico
SG11202101152QA (en) 2018-08-03 2021-03-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Antigen-binding molecule containing two antigen-binding domains that are linked to each other
CN112512587A (zh) 2018-08-06 2021-03-16 第一三共株式会社 抗体药物缀合物和微管蛋白抑制剂的组合
CA3051549A1 (en) 2018-08-09 2020-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for assessing binding affinity of an antibody variant to the neonatal fc receptor
CN112839960A (zh) 2018-08-10 2021-05-25 中外制药株式会社 抗cd137抗原结合分子及其应用
TW202021618A (zh) 2018-08-17 2020-06-16 美商２３與我有限公司 抗ｉｌ１ｒａｐ抗體及其使用方法
EP3842546A4 (en) 2018-08-23 2022-06-29 Daiichi Sankyo Company, Limited Sensitivity marker for antibody-drug conjugate
CA3110254C (en) * 2018-08-29 2023-08-29 United Biopharma Inc Afucosylated antibodies and manufacture thereof
GB201814281D0 (en) 2018-09-03 2018-10-17 Femtogenix Ltd Cytotoxic agents
EP4268831A3 (en) 2018-09-12 2024-05-22 Fred Hutchinson Cancer Center Reducing cd33 expression to selectively protect therapeutic cells
KR20210063330A (ko) 2018-09-19 2021-06-01 제넨테크, 인크. 방광암에 대한 치료 및 진단 방법
KR20210062005A (ko) 2018-09-20 2021-05-28 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her3 항체-약물 콘쥬게이트 투여에 의한 her3 변이암의 치료
JP7475687B2 (ja) 2018-09-21 2024-04-30 国立大学法人 東京医科歯科大学 ヒトｈｍｇｂ１に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、及びそれを含有するアルツハイマー病を治療又は予防するための医薬組成物
JP7475336B2 (ja) 2018-09-21 2024-04-26 ジェネンテック， インコーポレイテッド トリプルネガティブ乳癌のための診断方法
TW202028467A (zh) 2018-09-28 2020-08-01 日商協和麒麟股份有限公司 抗體組合物
WO2020072821A2 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Xencor, Inc. Il-12 heterodimeric fc-fusion proteins
JP2022503886A (ja) 2018-10-05 2022-01-12 ファイブ プライム セラピューティクス， インコーポレイテッド 抗ｆｇｆｒ２抗体製剤
AU2019361923A1 (en) 2018-10-15 2021-06-03 Five Prime Therapeutics, Inc. Combination therapy for cancer
WO2020081493A1 (en) 2018-10-16 2020-04-23 Molecular Templates, Inc. Pd-l1 binding proteins
EP3867646A1 (en) 2018-10-18 2021-08-25 F. Hoffmann-La Roche AG Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
WO2020089437A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Engmab Sàrl Combination therapy
SG11202104993SA (en) 2018-11-14 2021-06-29 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-cdh6 antibody-pyrrolobenzodiazepine derivative conjugate
MX2021005751A (es) 2018-11-16 2021-10-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Anticuerpos contra mucina 16 y métodos de uso de los mismos.
KR20210100656A (ko) 2018-12-05 2021-08-17 제넨테크, 인크. 암 면역요법을 위한 진단 방법 및 조성물
MX2021006573A (es) 2018-12-06 2021-07-15 Genentech Inc Tratamiento conjunto de linfoma difuso de linfocitos b grandes que comprende un inmunoconjugado anti-cd79b, un agente alquilante y un anticuerpo anti-cd20.
WO2020123275A1 (en) 2018-12-10 2020-06-18 Genentech, Inc. Photocrosslinking peptides for site specific conjugation to fc-containing proteins
KR20210102341A (ko) 2018-12-11 2021-08-19 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 컨쥬게이트와 parp 저해제의 조합
EP3883609A2 (en) 2018-12-20 2021-09-29 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Ebola virus glycoprotein-specific monoclonal antibodies and uses thereof
AR117327A1 (es) 2018-12-20 2021-07-28 23Andme Inc Anticuerpos anti-cd96 y métodos de uso de estos
EP3898667A2 (en) 2018-12-20 2021-10-27 F. Hoffmann-La Roche AG Modified antibody fcs and methods of use
CA3120474A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 23Andme, Inc. Anti-il-36 antibodies and methods of use thereof
US20220040324A1 (en) 2018-12-21 2022-02-10 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugate and kinase inhibitor
US20220064312A1 (en) 2018-12-27 2022-03-03 Shionogi & Co., Ltd. Novel Anti-CCR8 Antibody
MX2021007797A (es) 2018-12-28 2021-10-26 Kyowa Kirin Co Ltd Anticuerpo biespecifico que se une al receptor de transferrina (tfr).
WO2020141145A1 (en) 2018-12-30 2020-07-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Anti-rabbit cd19 antibodies and methods of use
TW202043272A (zh) 2019-01-14 2020-12-01 美商建南德克公司 使用pd-1軸結合拮抗劑及rna疫苗治療癌症之方法
EP3915581A4 (en) 2019-01-24 2023-03-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha NOVEL CANCER ANTIGENS AND ANTIBODIES OF THESE ANTIGENS
GB201901197D0 (en) 2019-01-29 2019-03-20 Femtogenix Ltd G-A Crosslinking cytotoxic agents
PE20212198A1 (es) 2019-01-29 2021-11-16 Juno Therapeutics Inc Anticuerpos y receptores quimericos de antigenos especificos para receptor 1 huerfano tipo receptor tirosina-cinasa (ror1)
EP3931220A1 (en) 2019-02-27 2022-01-05 F. Hoffmann-La Roche AG Dosing for treatment with anti-tigit and anti-cd20 or anti-cd38 antibodies
SG11202109406TA (en) 2019-03-01 2021-09-29 Xencor Inc Heterodimeric antibodies that bind enpp3 and cd3
CA3126728A1 (en) 2019-03-08 2020-09-17 Genentech, Inc. Methods for detecting and quantifying membrane-associated proteins on extracellular vesicles
WO2020186176A1 (en) 2019-03-14 2020-09-17 Genentech, Inc. Treatment of cancer with her2xcd3 bispecific antibodies in combination with anti-her2 mab
EP3943108A4 (en) 2019-03-19 2023-01-04 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha ANTIGEN-BINDING MOLECULE CONTAINING AN ANTIGEN-BINDING DOMAIN WHOSE ANTIGEN-BINDING ACTIVITY IS ALTERED DEPENDING ON THE MTA, AND BANK FOR OBTAINING SUCH ANTIGEN-BINDING DOMAIN
JPWO2020196474A1 (es) 2019-03-25 2020-10-01
EP3949987A4 (en) 2019-03-25 2023-02-22 Daiichi Sankyo Company, Limited ANTI-HER2 ANTIBODY PYRROLOBENZODIAZEPINE DERIVATIVE CONJUGATE
EP3949988A4 (en) 2019-03-27 2022-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF AN ANTIBODY-DERIVATIVE CONJUGATE OF PYRROLOBENZODIAZEPINE AND A PARP INHIBITOR
WO2020198731A2 (en) 2019-03-28 2020-10-01 Danisco Us Inc Engineered antibodies
AU2020258480A1 (en) 2019-04-19 2021-10-21 Genentech, Inc. Anti-mertk antibodies and their methods of use
CN114269376A (zh) 2019-05-03 2022-04-01 豪夫迈·罗氏有限公司 用抗pd-l1抗体治疗癌症的方法
EP3962523A2 (en) 2019-05-03 2022-03-09 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
MX2021013825A (es) 2019-05-14 2022-01-18 Genentech Inc Procedimientos de uso de inmunoconjugados anti-cd79b para tratar el linfoma folicular.
WO2020230899A1 (ja) 2019-05-15 2020-11-19 協和キリン株式会社 Ｃｄ４０とｆａｐに結合するバイスペシフィック抗体
TW202108625A (zh) 2019-05-15 2021-03-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd40及gpc3結合之雙專一性抗體
US20230085439A1 (en) 2019-05-21 2023-03-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Antibodies that bind human metapneumovirus fusion protein and their use
BR112021023487A2 (pt) 2019-05-23 2022-02-08 Ac Immune Sa Moléculas de ligação anti-tdp-43 e usos das mesmas
AU2020285681A1 (en) 2019-05-29 2022-01-27 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage of an antibody-drug conjugate
EA202290208A1 (ru) 2019-07-02 2022-03-25 Дзе Юнайтед Стейтс Оф Эмерика, Эз Репрезентед Бай Дзе Секретэри, Дипартмент Оф Хелт Энд Хьюман Сервисиз МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТ EGFRvIII, И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
JPWO2021020282A1 (es) 2019-07-26 2021-02-04
CA3148740A1 (en) 2019-08-06 2021-02-11 Aprinoia Therapeutics Limited Antibodies that bind to pathological tau species and uses thereof
EP4028054A1 (en) 2019-09-12 2022-07-20 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating lupus nephritis
TW202124425A (zh) 2019-09-13 2021-07-01 日商協和麒麟股份有限公司 DcR3改型體
WO2021055694A1 (en) 2019-09-20 2021-03-25 Genentech, Inc. Dosing for anti-tryptase antibodies
PE20221110A1 (es) 2019-09-27 2022-07-11 Genentech Inc Administracion de dosis para tratamiento con anticuerpos antagonistas anti-tigit y anti-pd-l1
EP4045090A1 (en) 2019-10-18 2022-08-24 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
EP4049675A4 (en) 2019-10-25 2023-11-22 Daiichi Sankyo Company, Limited COMBINATION OF ANTI-GARP ANTIBODY AND IMMUNOREGULATOR
CN115066613A (zh) 2019-11-06 2022-09-16 基因泰克公司 用于治疗血液癌症的诊断和治疗方法
JP2023504736A (ja) 2019-12-06 2023-02-06 ジュノー セラピューティクス インコーポレイテッド Ｇｐｒｃ５ｄ標的結合ドメインに対する抗イディオタイプ抗体ならびに関連する組成物および方法
WO2021113776A1 (en) 2019-12-06 2021-06-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to bcma-targeted binding domains and related compositions and methods
KR20220113790A (ko) 2019-12-13 2022-08-16 제넨테크, 인크. 항-ly6g6d 항체 및 사용 방법
CN115279388A (zh) 2019-12-20 2022-11-01 百时美施贵宝公司 岩藻糖基化抑制剂用于生产无岩藻糖基化抗体的用途
AR120898A1 (es) 2019-12-26 2022-03-30 Univ Osaka Agente para tratar o prevenir neuromielitis óptica en fase aguda
CN113045655A (zh) 2019-12-27 2021-06-29 高诚生物医药(香港)有限公司 抗ox40抗体及其用途
US20230058982A1 (en) 2019-12-27 2023-02-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-ctla-4 antibody and use thereof
CN110818795B (zh) 2020-01-10 2020-04-24 上海复宏汉霖生物技术股份有限公司 抗tigit抗体和使用方法
EP4091632A1 (en) 2020-01-15 2022-11-23 Osaka University Agent for prevention or treatment of diabetic autonomic neuropathy
US20230090965A1 (en) 2020-01-15 2023-03-23 Osaka University Prophylactic or therapeutic agent for dementia
IL294453A (en) 2020-01-16 2022-09-01 Genmab As Formulations of cd38 antibodies and uses thereof
WO2021194481A1 (en) 2020-03-24 2021-09-30 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
WO2022050954A1 (en) 2020-09-04 2022-03-10 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-tigit and anti-pd-l1 antagonist antibodies
MX2022009391A (es) 2020-01-31 2022-09-26 Genentech Inc Metodos para inducir linfocitos t especificos para neoepitopo con un antagonista de union al eje de pd-1 y una vacuna de arn.
JP2023513059A (ja) 2020-01-31 2023-03-30 ザ クリーブランド クリニック ファウンデーション 抗ミューラー管ホルモン受容体２抗体及び使用方法
TW202144395A (zh) 2020-02-12 2021-12-01 日商中外製藥股份有限公司 用於癌症之治療的抗cd137抗原結合分子
US11692038B2 (en) 2020-02-14 2023-07-04 Gilead Sciences, Inc. Antibodies that bind chemokine (C-C motif) receptor 8 (CCR8)
TW202140561A (zh) 2020-02-14 2021-11-01 日商協和麒麟股份有限公司 與cd3結合之雙特異性抗體
EP4093762A1 (en) 2020-02-20 2022-11-30 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Epstein-barr virus monoclonal antibodies and uses thereof
WO2021170071A1 (en) 2020-02-28 2021-09-02 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-cd137 constructs, multispecific antibody and uses thereof
BR112022016491A2 (pt) 2020-02-28 2022-10-11 Shanghai Henlius Biotech Inc Construto anti-cd137 e usos do mesmo
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
CN117551194A (zh) 2020-03-19 2024-02-13 基因泰克公司 同种型选择性抗TGF-β抗体及使用方法
TW202144419A (zh) 2020-03-24 2021-12-01 美商建南德克公司 Ｔｉｅ２結合劑及其使用方法
JP7285495B2 (ja) 2020-03-30 2023-06-02 国立大学法人三重大学 二重特異的抗体
EP4130036A4 (en) 2020-03-30 2024-05-15 National Cancer Center ANTIBODY-DRUG CONJUGATE
TW202204401A (zh) 2020-04-01 2022-02-01 日商協和麒麟股份有限公司 抗體組合物
EP4127724A1 (en) 2020-04-03 2023-02-08 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
WO2021207662A1 (en) 2020-04-10 2021-10-14 Genentech, Inc. Use of il-22fc for the treatment or prevention of pneumonia, acute respiratory distress syndrome, or cytokine release syndrome
IL297541A (en) 2020-04-24 2022-12-01 Genentech Inc Methods for using anti-cd79b immunoconjugates
AU2021262744A1 (en) 2020-04-27 2022-10-06 The Regents Of The University Of California Isoform-independent antibodies to lipoprotein(a)
CN115885050A (zh) 2020-04-28 2023-03-31 基因泰克公司 用于非小细胞肺癌免疫疗法的方法和组合物
EP4146283A1 (en) 2020-05-03 2023-03-15 Levena (Suzhou) Biopharma Co., Ltd. Antibody-drug conjugates (adcs) comprising an anti-trop-2 antibody, compositions comprising such adcs, as well as methods of making and using the same
WO2021231976A1 (en) 2020-05-14 2021-11-18 Xencor, Inc. Heterodimeric antibodies that bind prostate specific membrane antigen (psma) and cd3
KR20230010749A (ko) 2020-05-17 2023-01-19 아스트라제네카 유케이 리미티드 Sars-cov-2 항체 및 이를 선택 및 이용하는 방법
EP4157881A1 (en) 2020-05-27 2023-04-05 Staidson (Beijing) Biopharmaceuticals Co., Ltd. Antibodies specifically recognizing nerve growth factor and uses thereof
KR20230018425A (ko) 2020-05-29 2023-02-07 23앤드미 인코포레이티드 항-cd200r1 항체 및 이의 사용 방법
CN116529260A (zh) 2020-06-02 2023-08-01 当康生物技术有限责任公司 抗cd93构建体及其用途
CA3185858A1 (en) 2020-06-02 2021-12-09 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-cd93 constructs and uses thereof
WO2021252977A1 (en) 2020-06-12 2021-12-16 Genentech, Inc. Methods and compositions for cancer immunotherapy
CA3181820A1 (en) 2020-06-16 2021-12-23 Genentech, Inc. Methods and compositions for treating triple-negative breast cancer
BR112022025801A2 (pt) 2020-06-18 2023-10-03 Hoffmann La Roche Métodos para tratar um paciente e para tratar um paciente com escc avançado, kit, anticorpo, uso de um anticorpo e uso de um antagonista de ligação
CN116234824A (zh) 2020-06-22 2023-06-06 阿尔米雷尔有限公司 抗il-36抗体及其使用方法
CN116670285A (zh) 2020-06-23 2023-08-29 江苏康缘药业股份有限公司 抗cd38抗体及其用途
WO2021260582A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and aurora b inhibitor
WO2021260578A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and cdk9 inhibitor
WO2021260583A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and dna-pk inhibitor
KR20230043109A (ko) 2020-06-24 2023-03-30 아스트라제네카 유케이 리미티드 항체-약물 접합체 및 atr 억제제의 조합
JP2023539715A (ja) 2020-06-24 2023-09-19 アストラゼネカ ユーケー リミテッド 抗体－薬物コンジュゲートとａｔｍ阻害剤との組合わせ
US20230256092A1 (en) 2020-06-30 2023-08-17 Shionogi & Co., Ltd. Combined use of anti-ccr8 antibody and chemotherapeutic agent
KR20230041023A (ko) 2020-07-17 2023-03-23 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 제조 방법
KR20230042055A (ko) 2020-07-20 2023-03-27 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항 her2 항체-약물 콘주게이트와 her 이량체화 저해제의 조합
GB2597532A (en) 2020-07-28 2022-02-02 Femtogenix Ltd Cytotoxic compounds
AU2021315665A1 (en) 2020-07-29 2023-03-16 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-CD93 constructs and uses thereof
WO2022031749A1 (en) 2020-08-03 2022-02-10 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for lymphoma
WO2022029660A1 (en) 2020-08-05 2022-02-10 Juno Therapeutics, Inc. Anti-idiotypic antibodies to ror1-targeted binding domains and related compositions and methods
MX2023001440A (es) 2020-08-07 2023-03-06 Genentech Inc Proteinas de fusion del ligando para flt3 y metodos de uso.
JP2023537078A (ja) 2020-08-10 2023-08-30 アストラゼネカ・ユーケイ・リミテッド ＣＯＶＩＤ－１９を治療及び防止するためのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２抗体
WO2022034228A1 (en) 2020-08-14 2022-02-17 Ac Immune Sa Humanized anti-tdp-43 binding molecules and uses thereof
IL300666A (en) 2020-08-19 2023-04-01 Xencor Inc ANTI–CD28 COMPOSITIONS
WO2022043517A2 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Cureab Gmbh Anti-golph2 antibodies for macrophage and dendritic cell differentiation
KR20230066094A (ko) 2020-09-12 2023-05-12 아스트라제네카 유케이 리미티드 항-her2 항체-약물 접합체 치료법을 위한 채점 방법
AU2021341526A1 (en) 2020-09-14 2023-04-27 Ichnos Sciences SA Antibodies that bind to il1rap and uses thereof
IL301547A (en) 2020-10-05 2023-05-01 Genentech Inc Dosage for treatment with bispecific anti-FCRH5/anti-CD3 antibodies
US20230372527A1 (en) 2020-10-09 2023-11-23 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
CN116685325A (zh) 2020-10-20 2023-09-01 豪夫迈·罗氏有限公司 Pd-1轴结合拮抗剂和lrrk2抑制剂的组合疗法
AU2021366287A1 (en) 2020-10-20 2023-04-13 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments specifically binding to Gremlin-1 and uses thereof
WO2022093981A1 (en) 2020-10-28 2022-05-05 Genentech, Inc. Combination therapy comprising ptpn22 inhibitors and pd-l1 binding antagonists
WO2022098628A2 (en) 2020-11-04 2022-05-12 Genentech, Inc. Subcutaneous dosing of anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies
MX2023005132A (es) 2020-11-04 2023-05-25 Genentech Inc Dosificacion para el tratamiento con anticuerpos biespecificos anti-cd20/anti-cd3.
EP4240493A2 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibodies and anti-cd79b antibody drug conjugates
WO2022102634A1 (ja) 2020-11-11 2022-05-19 第一三共株式会社 抗体－薬物コンジュゲートと抗ＳＩＲＰα抗体の組み合わせ
EP4245322A1 (en) 2020-11-12 2023-09-20 Daiichi Sankyo Company, Limited Treatment for mesothelioma through administration of anti-b7-h3 antibody-drug conjugate
AU2021387127A1 (en) 2020-11-30 2023-06-22 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Her2 targeting agent
JPWO2022124247A1 (es) 2020-12-09 2022-06-16
TW202237638A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 烏苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
TW202237639A (zh) 2020-12-09 2022-10-01 日商武田藥品工業股份有限公司 鳥苷酸環化酶ｃ（ｇｃｃ）抗原結合劑之組成物及其使用方法
WO2022132904A1 (en) 2020-12-17 2022-06-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies targeting sars-cov-2
WO2022140797A1 (en) 2020-12-23 2022-06-30 Immunowake Inc. Immunocytokines and uses thereof
MX2023008285A (es) 2021-01-13 2023-09-12 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Conjugado de anticuerpo anti-dll3-farmaco.
JP2024503657A (ja) 2021-01-13 2024-01-26 メモリアル スローン－ケタリング キャンサー センター 抗体－ピロロベンゾジアゼピン誘導体コンジュゲート
WO2022162203A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Vaccinvent Gmbh Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
CN117120084A (zh) 2021-01-28 2023-11-24 维肯芬特有限责任公司 用于调节b细胞介导的免疫应答的方法和手段
CA3206395A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Hassan JUMAA-WEINACHT Method and means for modulating b-cell mediated immune responses
IL304955A (en) 2021-02-09 2023-10-01 Us Health Antibodies targeting the spike protein of a coronavirus
CA3210753A1 (en) 2021-02-09 2022-08-18 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Human monoclonal antibodies against pneumococcal antigens
IL305181A (en) 2021-02-15 2023-10-01 Takeda Pharmaceuticals Co Cell therapy compositions and methods for modulating TGF-B signaling
AR124914A1 (es) 2021-02-18 2023-05-17 Mitsubishi Tanabe Pharma Corp Nuevo anticuerpo anti-pad4
US20220378929A1 (en) 2021-02-25 2022-12-01 MediBoston Limted Anti-her2 antibody-drug conjugates and uses thereof
US20240181073A1 (en) 2021-03-03 2024-06-06 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-Drug Conjugates Comprising an Anti-BCMA Antibody
EP4301472A1 (en) 2021-03-05 2024-01-10 Dynamicure Biotechnology LLC Anti-vista constructs and uses thereof
CN117157319A (zh) 2021-03-09 2023-12-01 Xencor股份有限公司 结合cd3和cldn6的异二聚抗体
JP2024518013A (ja) 2021-03-10 2024-04-24 イミュノウェイク インコーポレイテッド 免疫調節分子及びその使用
JP2024509274A (ja) 2021-03-10 2024-02-29 ゼンコア インコーポレイテッド Ｃｄ３及びｇｐｃ３に結合するヘテロ二量体抗体
BR112023018621A2 (pt) 2021-03-15 2023-10-24 Hoffmann La Roche Métodos para tratar nefrite lúpica, esgotar células b periféricas, kits para tratar nefrite lúpica e anticorpos anti-cd20 tipo ii
WO2022197877A1 (en) 2021-03-19 2022-09-22 Genentech, Inc. Methods and compositions for time delayed bio-orthogonal release of cytotoxic agents
CN117616041A (zh) 2021-03-25 2024-02-27 当康生物技术有限责任公司 抗-igfbp7构建体及其用途
IL305818A (en) 2021-03-29 2023-11-01 Daiichi Sankyo Co Ltd Multispecific stable compound and its use
AR125344A1 (es) 2021-04-15 2023-07-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-c1s
TW202243689A (zh) 2021-04-30 2022-11-16 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體及抗ｃｄ７８ｂ抗體藥物結合物的組合治療之給藥
TW202310876A (zh) 2021-05-12 2023-03-16 美商建南德克公司 使用抗ｃｄ７９ｂ免疫結合物治療瀰漫性大ｂ細胞淋巴瘤之方法
TW202306993A (zh) 2021-05-14 2023-02-16 美商建南德克公司 Ｔｒｅｍ２之促效劑
TW202306994A (zh) 2021-06-04 2023-02-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ddr2抗體及其用途
EP4351582A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 F. Hoffmann-La Roche AG Combination of a particular braf inhibitor (paradox breaker) and a pd-1 axis binding antagonist for use in the treatment of cancer
WO2022266660A1 (en) 2021-06-17 2022-12-22 Amberstone Biosciences, Inc. Anti-cd3 constructs and uses thereof
TW202311291A (zh) 2021-06-25 2023-03-16 日商中外製藥股份有限公司 抗ctla-4抗體的用途
IL309115A (en) 2021-06-25 2024-02-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-CTLA-4 antibodies
WO2023283611A1 (en) 2021-07-08 2023-01-12 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing tnfr2 and uses thereof
KR20240058075A (ko) 2021-07-14 2024-05-03 스테이드슨 (베이징) 바이오팔마슈티칼스 캄퍼니 리미티드 Cd40을 특이적으로 식별하는 항체 및 이의 응용
WO2023004386A1 (en) 2021-07-22 2023-01-26 Genentech, Inc. Brain targeting compositions and methods of use thereof
WO2023019092A1 (en) 2021-08-07 2023-02-16 Genentech, Inc. Methods of using anti-cd79b immunoconjugates to treat diffuse large b-cell lymphoma
CN117897409A (zh) 2021-08-13 2024-04-16 基因泰克公司 抗类胰蛋白酶抗体的给药
CN117858905A (zh) 2021-08-19 2024-04-09 豪夫迈·罗氏有限公司 多价抗变体fc区抗体及使用方法
KR20240049285A (ko) 2021-08-26 2024-04-16 쿄와 기린 가부시키가이샤 Cd116 및 cd131에 결합하는 이중 특이적 항체
IL310382A (en) 2021-08-27 2024-03-01 Genentech Inc Methods for treating tau pathologies
WO2023034750A1 (en) 2021-08-30 2023-03-09 Genentech, Inc. Anti-polyubiquitin multispecific antibodies
AR127743A1 (es) 2021-09-06 2024-02-28 Genmab Bv Anticuerpos capaces de unirse a cd27, variantes y usos de los mismos
WO2023042097A1 (en) 2021-09-15 2023-03-23 Daiichi Sankyo Company, Limited Antibody-drug conjugate for use in methods of treating chemotherapy-resistant cancer
CA3232223A1 (en) 2021-09-17 2023-03-23 Ying Fu Synthetic humanized llama nanobody library and use thereof to identify sars-cov-2 neutralizing antibodies
TW202321308A (zh) 2021-09-30 2023-06-01 美商建南德克公司 使用抗ｔｉｇｉｔ抗體、抗ｃｄ３８抗體及ｐｄ—１軸結合拮抗劑治療血液癌症的方法
KR20240082388A (ko) 2021-10-08 2024-06-10 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 프리필드 시린지 제제의 조제 방법
AU2022368385A1 (en) 2021-10-18 2024-04-11 Daiichi Sankyo Company, Limited Anti-cd37 antibody-drug conjugate
TW202342095A (zh) 2021-11-05 2023-11-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 用於治療和預防ｃｏｖｉｄ—１９之組成物
AU2022379952A1 (en) 2021-11-05 2024-05-16 American Diagnostics & Therapy, Llc (Adxrx) Monoclonal antibodies against carcinoembryonic antigens, and their uses
WO2023086807A1 (en) 2021-11-10 2023-05-19 Genentech, Inc. Anti-interleukin-33 antibodies and uses thereof
TW202334202A (zh) 2021-11-16 2023-09-01 瑞士商Ａｃ免疫有限公司 用於治療和診斷的新分子
TW202337494A (zh) 2021-11-16 2023-10-01 美商建南德克公司 用莫蘇妥珠單抗治療全身性紅斑狼瘡（ｓｌｅ）之方法及組成物
CA3238116A1 (en) 2021-11-18 2023-05-25 Matthew Simon SUNG Combination of antibody-drug conjugate and parp1 selective inhibitor
TW202334238A (zh) 2021-11-30 2023-09-01 日商第一三共股份有限公司 蛋白酶分解性遮蔽抗體
WO2023109901A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies and methods of use
WO2023109900A1 (en) 2021-12-17 2023-06-22 Shanghai Henlius Biotech, Inc. Anti-ox40 antibodies, multispecific antibodies and methods of use
TW202333800A (zh) 2021-12-28 2023-09-01 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及rasg12c抑制劑之組合
TW202339805A (zh) 2021-12-28 2023-10-16 英商阿斯特捷利康英國股份有限公司 抗體-藥物結合物及atr抑制劑之組合
AR128222A1 (es) 2022-01-07 2024-04-10 Johnson & Johnson Entpr Innovation Inc MATERIALES Y MÉTODOS DE PROTEÍNAS DE UNIÓN A IL-1b
WO2023139292A1 (en) 2022-01-24 2023-07-27 Cambridge Enterprise Limited Tau therapy
WO2023154824A1 (en) 2022-02-10 2023-08-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human monoclonal antibodies that broadly target coronaviruses
AR128540A1 (es) 2022-02-16 2024-05-22 Ac Immune Sa Moléculas de unión anti-tdp-43 humanizadas y usos de las mismas
WO2023159182A1 (en) 2022-02-18 2023-08-24 Rakuten Medical, Inc. Anti-programmed death-ligand 1 (pd-l1) antibody molecules, encoding polynucleotides, and methods of use
WO2023173026A1 (en) 2022-03-10 2023-09-14 Sorrento Therapeutics, Inc. Antibody-drug conjugates and uses thereof
WO2023175483A1 (en) 2022-03-16 2023-09-21 Astrazeneca Uk Limited A scoring method for an anti-trop2 antibody‑drug conjugate therapy
US20230414750A1 (en) 2022-03-23 2023-12-28 Hoffmann-La Roche Inc. Combination treatment of an anti-cd20/anti-cd3 bispecific antibody and chemotherapy
WO2023192827A1 (en) 2022-03-26 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Bispecific antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023192881A1 (en) 2022-03-28 2023-10-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to hiv-1 env and their use
WO2023191816A1 (en) 2022-04-01 2023-10-05 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023194565A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Ac Immune Sa Anti-tdp-43 binding molecules
WO2023201299A1 (en) 2022-04-13 2023-10-19 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions of therapeutic proteins and methods of use
TW202404637A (zh) 2022-04-13 2024-02-01 瑞士商赫孚孟拉羅股份公司 抗ｃｄ２０／抗ｃｄ３雙特異性抗體之醫藥組成物及使用方法
WO2023203177A1 (en) 2022-04-20 2023-10-26 Kantonsspital St. Gallen Antibodies or antigen-binding fragments pan-specifically binding to gremlin-1 and gremlin-2 and uses thereof
TW202400140A (zh) 2022-04-27 2024-01-01 日商第一三共股份有限公司 抗體-藥物結合物與ezh1及/或ezh2抑制劑之組合
WO2023209177A1 (en) 2022-04-29 2023-11-02 Astrazeneca Uk Limited Sars-cov-2 antibodies and methods of using the same
TW202406934A (zh) 2022-05-03 2024-02-16 美商建南德克公司 抗Ｌｙ６Ｅ抗體、免疫結合物及其用途
WO2023219613A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2023218378A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of an antibody specific for a tumor antigen and a cd47 inhibitor
WO2023228095A1 (en) 2022-05-24 2023-11-30 Daiichi Sankyo Company, Limited Dosage regimen of an anti-cdh6 antibody-drug conjugate
WO2023235699A1 (en) 2022-05-31 2023-12-07 Jounce Therapeutics, Inc. Antibodies to lilrb4 and uses thereof
WO2023240058A2 (en) 2022-06-07 2023-12-14 Genentech, Inc. Prognostic and therapeutic methods for cancer
WO2023237706A2 (en) 2022-06-08 2023-12-14 Institute For Research In Biomedicine (Irb) Cross-specific antibodies, uses and methods for discovery thereof
WO2024015897A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020432A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Genentech, Inc. Dosing for treatment with anti-fcrh5/anti-cd3 bispecific antibodies
WO2024020407A1 (en) 2022-07-19 2024-01-25 Staidson Biopharma Inc. Antibodies specifically recognizing b- and t-lymphocyte attenuator (btla) and uses thereof
WO2024020564A1 (en) 2022-07-22 2024-01-25 Genentech, Inc. Anti-steap1 antigen-binding molecules and uses thereof
WO2024023750A1 (en) 2022-07-28 2024-02-01 Astrazeneca Uk Limited Combination of antibody-drug conjugate and bispecific checkpoint inhibitor
WO2024030829A1 (en) 2022-08-01 2024-02-08 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Monoclonal antibodies that bind to the underside of influenza viral neuraminidase
WO2024028732A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Cd98 binding constructs for treating brain tumors
WO2024028731A1 (en) 2022-08-05 2024-02-08 Janssen Biotech, Inc. Transferrin receptor binding proteins for treating brain tumors
WO2024037633A2 (en) 2022-08-19 2024-02-22 Evive Biotechnology (Shanghai) Ltd Formulations comprising g-csf and uses thereof
WO2024044779A2 (en) 2022-08-26 2024-02-29 Juno Therapeutics, Inc. Antibodies and chimeric antigen receptors specific for delta-like ligand 3 (dll3)
WO2024049949A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for bladder cancer
WO2024054929A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 Dynamicure Biotechnology Llc Anti-vista constructs and uses thereof
WO2024054822A1 (en) 2022-09-07 2024-03-14 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Engineered sars-cov-2 antibodies with increased neutralization breadth
WO2024064826A1 (en) 2022-09-22 2024-03-28 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to plasmodium falciparum circumsporozoite protein and their use
WO2024091991A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for multiple myeloma
WO2024097741A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Gilead Sciences, Inc. Anticancer therapies using anti-ccr8 antibody, chemo and immunotherapy combinations
WO2024102734A1 (en) 2022-11-08 2024-05-16 Genentech, Inc. Compositions and methods of treating childhood onset idiopathic nephrotic syndrome
WO2024100200A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Cis Pharma Ag Anti-l1-cam antibodies and their uses for diagnostic and therapeutic applications
WO2024108053A1 (en) 2022-11-17 2024-05-23 Sanofi Ceacam5 antibody-drug conjugates and methods of use thereof
WO2024116094A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Daiichi Sankyo Company, Limited Combination of antibody-drug conjugates and dnmt inhibitors
CN116200329B (zh) * 2023-02-22 2023-08-29 洛阳赛奥生物工程技术有限公司 一种无血清昆虫培养基及应用

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5613352A (en) 1979-07-02 1981-02-09 Tokan Kogyo Co Ltd Easily openable container
DE3382838T2 (de) 1983-01-13 2004-04-15 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Transgene dicotyledone Pflanzenzellen und Pflanzen
NL8300698A (nl) 1983-02-24 1984-09-17 Univ Leiden Werkwijze voor het inbouwen van vreemd dna in het genoom van tweezaadlobbige planten; agrobacterium tumefaciens bacterien en werkwijze voor het produceren daarvan; planten en plantecellen met gewijzigde genetische eigenschappen; werkwijze voor het bereiden van chemische en/of farmaceutische produkten.
JPS60123857A (ja) 1983-12-09 1985-07-02 Konishiroku Photo Ind Co Ltd 画像形成方法
EP0429093B1 (de) 1984-05-11 2001-08-08 Syngenta Participations AG Transformation von Pflanzenerbgut
ZA872705B (en) 1986-04-22 1987-10-05 Immunex Corporation Human g-csf protein expression
IL84459A (en) 1986-12-05 1993-07-08 Agracetus Apparatus and method for the injection of carrier particles carrying genetic material into living cells
EP0279582A3 (en) 1987-02-17 1989-10-18 Pharming B.V. Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion
JP2928287B2 (ja) 1988-09-29 1999-08-03 協和醗酵工業株式会社 新規ポリペプチド
JPH02257891A (ja) 1989-03-31 1990-10-18 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 組換え動物細胞による蛋白質の製造
JPH0322979A (ja) 1989-06-19 1991-01-31 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd 新規プラスミノーゲン活性化因子
US5204253A (en) 1990-05-29 1993-04-20 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method and apparatus for introducing biological substances into living cells
CA2078539C (en) 1991-09-18 2005-08-02 Kenya Shitara Process for producing humanized chimera antibody
JP3131322B2 (ja) 1991-12-17 2001-01-31 協和醗酵工業株式会社 新規α２→３シアリルトランスフェラーゼ
US5591616A (en) 1992-07-07 1997-01-07 Japan Tobacco, Inc. Method for transforming monocotyledons
JP3154564B2 (ja) * 1992-09-07 2001-04-09 科学技術振興事業団 モノクローナル抗体の改変方法
ES2233974T3 (es) 1995-09-11 2005-06-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Anticuerpo contra la cadena alfa del receptor de la interleucina 5 humana.
EP0816503B1 (en) * 1996-01-24 2006-07-05 Toyo Boseki Kabushiki Kaisha Alpha-1-6 fucosyltransferases
JP3527250B2 (ja) * 1996-04-10 2004-05-17 ニオズ テクノロジーズ インコーポレイティド Ｇｄｐ―フコースピロホスホリラーゼをコードする核酸
US5728568A (en) * 1996-11-22 1998-03-17 Genetics Institute, Inc. Human GDP-mannose 4,6 dehydratase
JP4550947B2 (ja) * 1997-03-19 2010-09-22 協和発酵キリン株式会社 ガングリオシドｇｍ２に対するヒト型相補性決定領域（ｃｄｒ）移植抗体
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
JP3991294B2 (ja) 1998-05-06 2007-10-17 株式会社ヴァレオサーマルシステムズ 自動車用空気調和装置のファンユニット
US20020012979A1 (en) * 1998-06-08 2002-01-31 Alan Berry Vitamin c production in microorganisms and plants
ES2571230T3 (es) * 1999-04-09 2016-05-24 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Procedimiento para controlar la actividad de una molécula inmunofuncional
JP2000308526A (ja) 1999-04-28 2000-11-07 Yoshihiro Inomura 鐙型ブラシ
CN100455599C (zh) 2000-03-03 2009-01-28 协和发酵工业株式会社 基因重组抗体及其抗体片段
JP5623683B2 (ja) * 2000-03-22 2014-11-12 フィトン ホールディングス，リミティド ライアビリティ カンパニー 動物型糖鎖付加機能をもつ植物細胞
CN102311986B (zh) 2000-10-06 2015-08-19 协和发酵麒麟株式会社 产生抗体组合物的细胞
AU2004279736A1 (en) * 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition specifically binding to ganglioside GM2
JP6109648B2 (ja) * 2013-05-29 2017-04-05 株式会社ぐるなび 鉄道を利用した商品販売支援システム

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HUS2000035I1 (hu) 2022-11-28
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ES2620359T3 (es) 2017-06-28

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