KR20150131177A - 항-CRTh2 항체 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20150131177A
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조-안 에스. 홍고
타오 후앙
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 항-CRTh2 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.

Description

항-CRTh2 항체 및 그의 용도 {ANTI-CRTH2 ANTIBODIES AND THEIR USE}
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은 2013년 3월 15일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 61/786,370을 우선권 주장하며, 상기 가출원의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
ASCII 텍스트 파일의 서열 목록 제출
ASCII 텍스트 파일 상의 하기 제출물의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다: 컴퓨터 판독가능 형태 (CRF)의 서열 목록 (파일명: 146392017340SEQLIST.TXT, 기록 날짜: 2014년 3월 6일, 크기: 115 KB).
발명의 분야
본 발명은 항-CRTh2 항체 및 그의 사용 방법에 관한 것이다.
T 헬퍼 2 세포 상에 발현된 화학유인물질 수용체-상동 분자 (CRTh2)는 G-단백질 커플링된 수용체 (GPCR) 패밀리의 구성원이다. CRTh2는 프로스타글란딘 D2 (PGD2)에 반응하여 호산구, 호염기구 및 T 헬퍼 유형 2 (Th2) 세포의 화학주성을 매개한다. 이러한 세포 유형, 특히 Th2 세포는 알레르기성 질환, 예컨대 천식의 발병기전의 원인인 것으로 고려되었다. CRTh2 억제는 동물 모델에서 약화된 기도 과민성 및 염증을 유도하는 것으로 제시되었다. 문헌 [Lukacs, et al.; Am. J. Phsiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 295:L767-779, 2008] 참조. 예를 들어, 이중 트롬복산 A2 수용체 및 CRTh2 수용체 길항제인 라마트로반은 시험관내 및 생체내에서 호산구 화학주성을 억제하며, 일본에서 알레르기성 비염의 치료에 대해 승인되어 있다. 문헌 [Bosnjak, B, et al., Respiratory Research 12:114, 2011] 참조. 다수의 다른 CRTh2 길항제, 예컨대 4-아미노테트라히드로키놀린 유도체 또는 인돌아세트산 유도체가 현재 개발 중에 있다. 문헌 [Pettipher; Br. J. Pharmacol. 153 (Suppl 1):S191-199, 2008; Royer et al.; Eur. J. Clin. Invest. 38:663-671, 2008; Stebbins et al.; Eur. J. Pharmacol. 638:142-149, 2010] 참조.
본 발명은 항-CRTh2 항체 및 그의 사용 방법을 제공한다.
한 측면에서, 치료 유효량이 인간 대상체에게 투여되는 경우에 인간 CRTh2에 결합하며 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 단리된 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 조작된 항체이다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 재조합 방법에 의해 (예를 들어, 시험관내에서 (예를 들어, 세포 배양에서) 항체를 코딩하는 핵산으로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포에 의해) 생산된다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 원핵 세포 (예를 들어, 박테리아 세포) 또는 진핵 세포 (예를 들어, CHO 세포, 림프성 세포)이다.
일부 실시양태에서, 항체는 하기 유형의 CRTh2 발현 세포: Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포 중 하나 이상을 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 ADCC 및/또는 CDC 활성을 개선시키도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, 항체는 ADCC를 개선시키고/거나 CDC 활성을 감소시키도록 조작되었다. 일부 실시양태에서, 항체는 비-푸코실화된다. 일부 실시양태에서, 항체는 알파1,6-푸코실트랜스퍼라제 (Fut8) 녹아웃을 갖는 세포주에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 항체는 β1,4-N-아세틸글리코스미닐트랜스퍼라제 III (GnT-III)을 과다발현하는 세포주에서 생산된다. 일부 실시양태에서, 세포주는 골지 α-만노시다제 II (ManII)를 추가로 과다발현한다. 일부 실시양태에서, 항체는 ADCC 및/또는 CDC 활성을 개선시키는 Fc 영역에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다. 일부 실시양태에서, 아미노산 치환은 S298A/E333A/K334A이다.
일부 실시양태에서, 항체는 네이키드 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 이중특이적 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 IgG1 항체이다.
일부 실시양태에서, 항체는 비-인간 영장류의 CRTh2에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 레서스 및/또는 시노몰구스 CRTh2에 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체는 인간 CRTh2에 대한 하기 항체: 19A2, 8B1, 31A5, 3C12 및 본원에 기재된 임의의 인간화 항체 중 적어도 하나의 결합을 경쟁적으로 억제한다. 일부 실시양태에서, ELISA 검정은 경쟁적 결합을 결정하는데 사용된다. 일부 실시양태에서, 항체는 하기 항-CRTh2 항체: 19A2, 8B1, 31A5, 3C12 및 본원에 기재된 임의의 인간화 항체 중 적어도 하나에 의해 결합된 CRTh2 에피토프와 동일하거나 또는 그와 중복되는 인간 CRTh2의 에피토프에 결합한다. 일부 실시양태에서, 항체는 하기 항-CRTh2 항체: 19A2, 8B1, 31A5, 3C12 및 본원에 기재된 임의의 인간화 항체 중 적어도 하나로부터의 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 CRTh2 신호전달을 추가로 차단한다. 일부 실시양태에서, 항체는 프로스타글란딘 D2에 반응한 CRTh2 발현 세포의 동원을 방지한다. 일부 실시양태에서, 항체는 CRTh2 발현 세포에서 Ca2+ 유동을 차단한다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간 CRTh2에 약 100 nM 이하의 Kd 값으로 결합한다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 X1ISNGGSTTX2YPGTVEG (서열 5) (여기서 X1은 Y 또는 R이고, X2는 Y 또는 D임)를 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다.
또 다른 측면에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 하기 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열: (i) RASENIYXNLA (서열 1) (여기서 X는 S, W 또는 Y임)를 포함하는 HVR-L1; (ii) AATQLAX (서열 2) (여기서 X는 D, E 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2; (iii) QHFWITPWT (서열 3)를 포함하는 HVR-L3; (iv) X1YX2MS (서열 4) (여기서 X1은 S 또는 F이고, X2는 S, L 또는 K임)를 포함하는 HVR-H1; (v) X1ISNGGSTTX2YPGTVEG (서열 5) (여기서 X1은 Y 또는 R이고, X2는 Y 또는 D임)를 포함하는 HVR-H2; 및 (vi) HRTNWDFDY (서열 6)를 포함하는 HVR-H3을 포함하는 것인 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것인 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다: (i) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (iii) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (iv) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (v) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (vi) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다: (i) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (iii) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (iv) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (v) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (vi) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 측면에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것인 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 다음을 포함한다: (i) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (iii) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (iv) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (v) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (vi) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3.
또 다른 측면에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 38-53으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 서열을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 54-65로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 측면에서, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 54-65로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 서열 38-48로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 54-60으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체가 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체는 서열 40의 VL 서열 및 서열 57의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 39의 VL 서열 및 서열 55의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 41의 VL 서열 및 서열 57의 VH 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체는 모노클로날 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체는 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 실시양태에서, 항체의 프레임워크 서열의 적어도 일부는 인간 컨센서스 프레임워크 서열이다. 일부 실시양태에서, 항체는 Fab, Fab'-SH, Fv, scFc 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 항체 단편이다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 본원에 기재된 핵산을 포함하는 숙주 세포가 본원에 제공된다. 또 다른 측면에서, 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되도록 하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 방법은 숙주 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항체 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체가 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 면역접합체는 제약 조성물 중에 존재한다. 면역접합체는 본원에 기재된 임의의 방법에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본원에 기재된 임의의 항-CRTh2 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물이 본원에 제공된다.
또 다른 측면에서, 유효량의 항-CRTh2 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 대상체에서 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인, 천식을 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 항체는 하기 유형의 CRTh2 발현 세포: Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포 중 하나 이상을 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 폐 조직으로부터 CRTh2 발현 세포를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 기관지폐포 세척액으로부터 CRTh2 발현 세포를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 폐로부터 적어도 하나의 유형의 CRTh2 발현 세포의 적어도 50%를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 폐로부터 적어도 하나의 유형의 CRTh2 발현 세포의 적어도 80%를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 폐로부터 적어도 하나의 유형의 CRTh2 발현 세포의 적어도 90%를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 대상체는 소수 과립구성 천식을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 시토카인의 수준은 항-CRTh2 항체의 투여 후에 대상체에서 감소된다. 일부 실시양태에서, 하기 세포 유형: Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포 중 적어도 하나에 의해 생산된 하나 이상의 시토카인의 수준이 감소된다. 일부 실시양태에서, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민 또는 류코트리엔 중 하나 이상의 수준이 대상체에서 감소된다. 일부 실시양태에서, 대상체는 흡입용 코르티코스테로이드, 단기 작용 β2 효능제, 장기 작용 β2 효능제 또는 그의 조합에 의해 적절하게 제어되지 않는 천식을 앓고 있다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 본원에 기재된 항체이다.
또 다른 측면에서, 유효량의 항-CRTh2 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 대상체에서 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인, CRTh2 발현 세포에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법이 본원에 제공된다.
일부 실시양태에서, 장애는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 천식, 소수 과립구성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 급성 또는 만성 기도 과민증, 과다호산구증가증성 증후군, 호산구성 식도염, 처그-스트라우스 증후군, 특발성 폐 섬유증, 시토카인과 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 악성종양, 만성 특발성 두드러기, 만성 자발성 두드러기, 물리적 두드러기, 한랭 두드러기, 압력-두드러기, 수포성 유천포창, 비강 폴립증, 식품 알레르기 및 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (ABPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 본원에 기재된 항체이다.
또 다른 측면에서, 유효량의 항-CRTh2 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 대상체에서 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인, 대상체에서 시토카인의 수준을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 실시양태에서, 하나 이상의 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민 또는 류코트리엔의 수준이 대상체에서 감소된다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 본원에 기재된 항체이다.
본원에 기재된 다양한 실시양태의 특성 중 하나, 일부 또는 전부가 조합되어 본 발명의 다른 실시양태를 형성할 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 이들 및 다른 측면은 통상의 기술자에게 명백하게 될 것이다. 본 발명의 상기 실시양태 및 다른 실시양태는 하기 상세한 설명에 추가로 기재된다.
도 1은 CRTh2가 인간 'Th2' 생물학 세포 상에서 발현된다는 것을 제시한다. CRTh2 발현은 나타내어진 바와 같은 인간 PBMC 집단 또는 배양된 인간 세포 상의 항-인간 CRTh2 Ab (BM16)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 평가하였다.
도 2는 CRTh2+ 기억 CD4+ T 세포가 CRTh2-기억 CD4+ T 세포와 비교하여 95% 초과의 기억 CD4+ T 세포 Th2 시토카인 (Il-4, IL-5, IL13 및 IL-9)을 생산한다는 것을 제시한다. CRTh2+CD45RO+ 및 CRTh2-CD45RO+ 기억 CD4+ T 세포를 인간 PBMC로부터 유동 세포측정법에 의해 단리하고, 37℃에서 48시간 동안 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극시켰다. 상청액을 수집하고, 루미넥스(Luminex)에 의해 나타내어진 바와 같은 시토카인 정량화에 적용시켰다.
도 3a-f는 세포주 상에 발현된 CRTh2 또는 1차 호염기구 및 호산구와 마우스 또는 인간화 항-CRTh2 항체의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 제시한다. 도 3a는 293 세포 상에 발현된 인간, 레서스 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이 CRTh2 뿐만 아니라 CRTh2를 발현하지 않는 야생형 293 세포와 마우스 항-CRTh2 하이브리도마 항체 (클론 19A2, 8B1, 31A5 및 3C12)의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 대조군 Ab (20 ug/ml, 착색된 히스토그램)와 비교하여 제시한다. 사용된 1차 항체 농도는 20 ug/ml (흑색 선), 2 ug/ml (회색 선) 및 0.2 ug/ml (옅은 회색 선)이었다. 도 3b는 300.19 세포 상에 발현된 인간, 레서스 원숭이 또는 시노몰구스 원숭이 아미노 말단 flag-태그부착된 CRTh2 뿐만 아니라 CRTh2를 발현하지 않는 야생형 300.19 세포와 마우스 항-CRTh2 항체 (mIgG2a로 클로닝된 19A2 및 8B1)의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 이소형 대조군 Ab (착색된 히스토그램)와 비교하여 제시한다. 사용된 1차 항체 농도는 1 ug/ml (인간, 시노; 흑색 선) 또는 5 ug/ml (레서스, 야생형; 흑색 선) 및 0.5 ug/ml (레서스, 야생형; 회색 선)이었다. 항-Flag Ab를 0.7 ug/ml로 사용하였다. 도 3c는 인간 PBMC 상의 호염기구 및 호산구에 대한 마우스 항-인간 CRTh2 항체 (19A2, 8B1, 31A5, 3C12)의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 제시한다. PBMC를 5 ug/ml (흑색 선), 0.5 ug/ml (회색 선)의 항-CRTh2 항체 또는 5 ug/ml (옅은 회색 선), 5 ug/ml (착색된 히스토그램)의 이소형 대조군 Ab와 함께, 이어서 형광-표지된 2차 항-마우스 IgG, 항-CD16, 항-HLADR 및 항-CD123과 함께 인큐베이션하였다. 도 3d 및 도 3e는 각각 293 세포 (도 3d) 또는 300.19 세포 (도 3e) 상에 발현된 아미노 말단 gD-태그부착 또는 flag-태그부착된 인간, 레서스 또는 시노몰구스 CRTh2와 인간화 h19A2.v1 및 조작된 인간화 h19A2.v12 항-CRTh2 항체의 반응성을, 각각의 CRTh2를 발현하지 않는 야생형 293 또는 300.19 세포와 비교하여 제시한다. 사용된 1차 항-CRTh2 Ab 농도는 다음과 같았고: 10 ug/ml (흑색 선), 1 ug/ml (회색 선) 및 0.1 ug/ml (옅은 회색 선); 이소형 대조군 Ab (2H7, 착색된 히스토그램)를 10 ug/ml로 사용하였고, 항-gD 항체를 2 ug/ml로 사용하였고, 항-Flag Ab를 0.7 ug/ml로 사용하였다. 도 3f는 1차 인간, 시노 및 레서스 호염기구 뿐만 아니라 말초 혈액으로부터의 1차 인간 호산구에 대한 10 ug/ml의 항-CRTh2 항체 h19A2.v1 및 h19A2.v12 (흑색 선)의 FACS 결합을 이소형 대조군 Ab (착색된 히스토그램)와 비교하여 제시한다.
도 4a-b는 293 세포 또는 300.19 세포 상에 표면 발현된 CRTh2에 대한 항-CRTh2 항체 (mIgG 또는 hFab)의 결합 친화도의 스캐차드 분석을 제시한다. 도 4a는 나타내어진 바와 같은 293 세포 또는 300.19 세포 상에 발현된 인간 CRTh2에 대한 마우스 항-CRTh2 전체 항체 19A2 및 8B1의 방사성리간드 세포 결합 검정을 제시한다. 도 4b는 293 세포 상에 발현된 인간 또는 시노몰구스 CRTh2에 대한 인간화 h19A2.v12 또는 h19A2.v60 Fab 단편의 방사성리간드 세포 결합 검정을 제시한다. 항-CRTh2 Ab에 대한 해리 상수 (KD)가 그래프에 나타내어져 있다. 결합/총은 결합된 125I-표지 항체 및 총 항체의 농도의 비를 나타내고, 총은 125I-표지 및 비표지 항체의 농도를 나타낸다.
도 5는 항-CRTh2 항체 8B1 및 3C12가 PGD2 유도된 칼슘 동원을 방지한다는 것을 제시한다. PGD2 자극에 반응하여 시험관내 분극화된 Th2 세포로부터의 Th2 세포 하위세트 (CD4+CCR4+CCR6-CXCR3-)의 칼슘 유동을 항-CRTh2 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 유동 세포측정법에 의해 모니터링하였다. CRTh2 수용체 길항제 CAY10471이 양성 대조군으로 포함되어 있다.
도 6a-b는 인간 CRTh2 BAC 트랜스제닉 마우스의 설계 및 특성화를 제시한다. 도 6a는 hCRTh2 BAC 트랜스제닉 마우스를 생성하기 위해 C57BL/6 마우스에 도입된 염색체 11 상의 인간 CRTh2 유전자를 함유하는 171 kb 게놈 영역을 도시한다. 도 6b는 hCRTh2.Bac.Tg 계통 85에서 혈액 호염기구 (CD123+FceRI+), 혈액 호산구 (CCR3+), 복막 비만 세포 (FceRI+CD117+), 슬와 림프절 CD4+CD44hi T 세포 (Th2 분극화 작용제 파파인에 의해 유도됨) 및 장간막 림프절 선천성 T 헬퍼 유형 2 세포 (마우스 IL-17E 플라스미드의 유체역학적 꼬리 정맥 주사에 의해 부스팅된 Lin-CD117+) 상에서의 유동 세포측정법에 의한 인간 CRTh2 발현 (항체 BM16)을 제시한다. 비교를 위해 인간 세포 상의 인간 CRTh2 발현의 유동 세포측정법 분석이 제시되어 있다. 호염기구, 호산구 및 IT2 세포를 PBMC로부터 염색하고, 인간 골수-유래 비만 세포로부터의 비만 세포, 및 Th2 세포 (CCR4+CXCR3-)를 인간 PBMC로부터 단리된 CD4+ T 세포로부터 Th2 분극화 조건 하에서 분화시켰다.
도 7a-b는 항-CRTh2 항체가 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 혈액 호염기구 및 호산구를 생체내 고갈시킨다는 것을 제시한다. CRTh2+ 호염기구 (CD123+FceRI+) 및 호산구 (CCR3+)의 기준선 수는 항-CRTh2 Ab (나타내어진 바와 같은 19A2, 3C12 또는 8B1)로 처리하기 전 제-4일 (도 7a) 또는 4시간 (도 7b)에 혈액으로부터 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스를 200 ug/마우스 i.v. (도 7a) 또는 150 ug/마우스 i.v. (도 7b)의 항-CRTh2 또는 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 혈액 호염기구 및 호산구 고갈을 나타내어진 바와 같은 제3일, 제6일 또는 제7일에 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 항-돼지풀 이소형 대조군 항체와 비교한 항-CRTh2에 의한 고갈 퍼센트는 도 7b에 나타내어져 있다.
도 8a-b는 항-CRTh2 항체 19A2 처리가 hCRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 TNP-OVA 유도된 만성 천식 모델에서 선천성 면역 세포를 고갈시켰고 Th2 기관지폐포 세척 (BAL) 시토카인 생산을 감소시켰다는 것을 제시한다. 도 8a는 유동 세포측정법에 의해 폐 조직에서 및 유동 세포측정법과 조합된 감별 세포 계수에 의해 BAL에서 평가된 호염기구, 호산구 및 비만 세포 수를 제시한다 (도 8a). 항-돼지풀 이소형 대조군 항체와 비교한 항-CRTh2에 의한 고갈 퍼센트가 그래프에 나타내어져 있다. 도 8b는 BAL에서 ELISA에 의해 결정된 IL-4 및 IL-13의 농도를 제시한다. 이소형 대조군 항체와 비교한 항-CRTh2 처리에 의한 감소 퍼센트가 그래프에 나타내어져 있다.
도 9a-b는 항-CRTh2 항체 19A2가 SCID 마우스에서 인간 IL-4 생산 Th2 세포 또는 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 선천성 유형 헬퍼 2 (IT2) 세포를 고갈시킨다는 것을 제시한다. 도 9a: PBMC로부터의 시험관내 분극화된 인간 Th2 세포를 SCID 마우스 내로 전달하고, 추가로 비-푸코실화 항-CRTh2 19A2 항체 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 rhIL-4 + 항-IFN-g 및 항-IL-12 mAb를 주사함으로써 생체내에서 7일 동안 추가로 분극화시켰다. 7일 후에, IL-4 또는 IFN-g 생산 CD4 T 세포의 백분율을 결정하였다. 이 목적을 위해, 비장세포를 수거하고, 4.5시간 동안 PdBu (50 ng/mL) 및 이오노마이신 (500 ng/mL)을 사용하여 생체외에서 자극시키고, 이때 자극의 마지막 3시간 동안 브레펠딘 A (BFA)를 첨가하였다. 세포를 항-hCD4로 표면 염색하고, 계열 세포를 항-mCD45, 항-mTer119 및 항-hCD19로 염색하였으며; 세포를 고정시키고 항-hIFNg 및 항-hIL-4로 염색하여 시토카인 양성 세포를 검출하였다. 도 9b: 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에 50 ug의 마우스 IL-17E 코딩 플라스미드, 이어서 항-CRTh2 또는 이소형 대조군 Ab를 주사하였다. 처리 제3일 후에, IT2 세포의 백분율 및 총 수를 유동 세포측정법에 의해 장간막 림프절에서 결정하였다. 항-돼지풀 이소형 대조군 항체와 비교한 항-CRTh2에 의한 고갈 퍼센트가 그래프에 나타내어져 있다.
도 10은 뮤린 항-CRTh2 항체 19A2의 경쇄 (서열 49) 및 중쇄 (서열 61) 가변 영역의 아미노산 서열을 제시한다. 중쇄 및 경쇄의 카바트(Kabat) CDR, 코티아(Chothia) CDR 및 콘택트(Contact) CDR 서열이 제공되어 있다.
도 11a-b는 항체 19A2로부터 유래된 인간화 항-CRTh2 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 정렬을 제시한다. 도 11a는 경쇄 가변 영역 서열 정렬을 제시한다. 각 항체의 경쇄 카바트 CDR, 코티아 CDR 및 콘택트 CDR 서열이 제공되어 있다 (hu19A2.v1 (서열 38), hu19A2.v12 (서열 39), hu19A2.v46 (서열 39), hu19A2.v52 (서열 40), hu19A2.v58 (서열 42), hu19A2.v60 (서열 41), hu19A2.v61 (서열 42), hu19A2.v62 (서열 41), hu19A2.v63 (서열 43), hu19A2.v64 (서열 42), hu19A2.v65 (서열 43), hu19A2.v66 (서열 44), hu19A2.v67 (서열 45), hu19A2.v68 (서열 44), hu19A2.v69 (서열 45), hu19A2.v70 (서열 46), hu19A2.v71 (서열 47), hu19A2.v72 (서열 48)). 도 11b는 중쇄 가변 영역 서열 정렬을 제시한다. 각 항체의 중쇄 카바트 CDR, 코티아 CDR 및 콘택트 CDR 서열이 제공되어 있다 (hu19A2.v1 (서열 54), hu19A2.v12 (서열 55), hu19A2.v46 (서열 57), hu19A2.v52 (서열 57), hu19A2.v58 (서열 57), hu19A2.v60 (서열 57), hu19A2.v61 (서열 55), hu19A2.v62 (서열 55), hu19A2.v63 (서열 55), hu19A2.v64 (서열 60), hu19A2.v65 (서열 60), hu19A2.v66 (서열 55), hu19A2.v67 (서열 55), hu19A2.v68 (서열 60), hu19A2.v69 (서열 60), hu19A2.v70 (서열 54), hu19A2.v71 (서열 54), hu19A2.v72 (서열 54)).
도 12는 뮤린 항-CRTh2 항체 8B1 및 3C12 및 인간화 항-CRTh2 hu8B1.v1의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 정렬을 제시한다 (mu8B1 - 경쇄 가변 영역 (서열 50), mu8B1 - 중쇄 가변 영역 (서열 62); mu3C12 - 경쇄 가변 영역 (서열 51), mu3C12 - 중쇄 가변 영역 (서열 63); hu8B1.v1 - 경쇄 가변 영역 (서열 52), hu8B1.v1 - 중쇄 가변 영역 (서열 64)). 각 항체의 경쇄 및 중쇄 카바트 CDR, 코티아 CDR 및 콘택트 CDR 서열이 제공되어 있다.
도 13은 뮤린 항-CRTh2 항체 31A5의 아미노산 서열을 제시한다. 항체 31A5의 경쇄 및 중쇄 카바트 CDR, 코티아 CDR 및 콘택트 CDR 서열이 제공되어 있다 (mu31A5 - 경쇄 가변 서열 (서열 53), mu31A5 - 중쇄 가변 서열 (서열 65)).
도 14는 인간화 항-CRTh2 항체 hu19A2.v1 및 hu19A2.v52의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열 정렬을 제시한다. 도 14a는 경쇄 가변 영역 서열 정렬을 제시한다 (hu19A2.v1 - 경쇄 가변 영역 (서열 38); hu19A2.v52 - 경쇄 가변 영역 (서열 40)). 각 항체의 경쇄 카바트 CDR, 코티아 CDR 및 콘택트 CDR 서열이 제공되어 있다. 도 14b는 중쇄 가변 영역 서열 정렬을 제시한다 (hu19A2.v1 - 중쇄 가변 영역 (서열 54); hu19A2.v52 - 중쇄 가변 영역 (서열 57)). 각 항체의 중쇄 카바트 CDR, 코티아 CDR 및 콘택트 CDR 서열이 제공되어 있다.
도 15a-c는 세포주 상에 발현된 CRTh2 또는 1차 호염기구 및 호산구와 인간화 및 인간화 친화도 성숙 항-CRTh2 항체의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 제시한다. 도 15a는 293 세포 상에 발현된 인간 CRTh2 뿐만 아니라 CRTh2를 발현하지 않는 야생형 293 세포와 1ug/ml (흑색 선) 및 0.1 ug/ml (회색 선)의 19A2 인간화 (h19A2.v1) 및 인간화 친화도 성숙 (h19A2.v46, h19A2.v52) 항-CRTh2 항체의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 대조군 Ab (1 ug/ml, 착색된 히스토그램)와 비교하여 제시한다. 도 15b는 293 세포 상에 발현된 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이 CRTh2 뿐만 아니라 CRTh2를 발현하지 않는 야생형 293 세포와 인간화 및 인간화 친화도 성숙 19A2 항-CRTh2 항체 (h19A2.v1, h19A2.v12, h19A2.v46, h19A2.v52)의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 대조군 Ab (0.55 ug/ml, 착색된 히스토그램)와 비교하여 제시한다. 사용된 1차 항체 농도는 0.55 ug/ml (흑색 선), 0.18 ug/ml (매우 진한 회색 선), 0.06 ug/ml (진한 회색 선), 0.02 ug/ml (회색 선) 및 0.006 ug/ml (옅은 회색 선)였다. 도 15c는 인간, 시노몰구스 원숭이 또는 레서스 원숭이 PBMC 상의 호염기구 및 호산구에 대한 인간화 친화도 성숙 항-인간 CRTh2 항체 h19A2.v52의 유동 세포측정법에 의한 반응성을 제시한다. PBMC를, 물질 및 방법에 기재된 바와 같은 호염기구 및 호산구를 검출하기 위한 계열-특이적 항체와 조합된 15 ug/ml (흑색 선), 5ug/ml (매우 진한 회색 선), 1.7 ug/ml (진한 회색 선), 0.6 ug/ml (회색 선) 또는 0.2 ug/ml (옅은 회색 선)의 형광-표지된 항-CRTh2 항체 또는 15 ug/ml의 이소형 대조군 Ab (착색된 히스토그램)와 함께 인큐베이션하였다.
도 16은 293 세포 상에 표면 발현된 CRTh2에 대한 항-CRTh2 항체 (Fab 단편)의 결합 친화도의 스캐차드 분석을 제시한다. 도 16a-b는 293 세포 상에 발현된 인간 또는 시노몰구스 CRTh2에 대한 인간화 h19A2.v52 Fab 단편의 상동 경쟁 방사성리간드 세포 결합 검정을 제시한다. 도 16c-d는 293 세포 상에 발현된 인간 또는 시노몰구스 CRTh2에 대한 인간화 h19A2.v46 Fab 단편의 상동 경쟁 방사성리간드 세포 결합 검정을 제시한다. 항-CRTh2 Ab에 대한 해리 상수 (KD)가 그래프에 나타내어져 있다. 결합/총은 각 검정에 사용된 결합된 125I-표지 항체 및 총 125I-표지 항체의 비를 나타낸다.
도 17a-b는 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에서 포르스콜린-유도된 cAMP 수준의 PGD2-매개된 억제 또는 포르스콜린-유도된 cAMP 수준에 대한 항-CRTh2 항체의 효과를 제시한다. 도 17a는 항-CRTh2 항체 h19A2.v52가 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에서 포르스콜린-유도된 cAMP 수준의 PGD2-매개된 억제에 대해 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다. 비교해 보면, 인간화 h8B1 항체는 용량-의존성 방식으로 포르스콜린-유도된 cAMP 수준의 PGD2-매개된 억제를 차단하였다. 도 17b는 항-CRTh2 항체 h8B1 및 h19A2.v52가 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에서 PGD2의 부재 하에 포르스콜린-유도된 cAMP 수준에 영향을 미치지 않는다는 것을 제시한다. 비교해 보면, 리간드 PGD2는 용량-의존성 방식으로 포르스콜린-유도된 cAMP 수준을 감소시켰다.
도 18a-c는 뮤린 항-CRTh2 항체 19A2(mIgG2a)가 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 혈액, 비장 및 골수에서 호염기구 및 호산구를 생체내 고갈시킨다는 것을 제시한다. CRTh2+ 호염기구 (CD123+FceRI+) 및 호산구 (CCR3+)의 기준선 수는 나타내어진 바와 같은 항-CRTh2 Ab 19A2로 처리하기 전 제-7일 (도 18a 및 도 18b)에 혈액으로부터 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스를 20 ug/마우스 또는 100 ug/마우스 i.v.의 항-CRTh2 또는 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 호염기구 및 호산구 고갈을 혈액에서 나타내어진 바와 같은 제3일 및 제7일에 (도 18a 및 도 18b) 또는 비장 및 골수 (BM)에서 제7일에 (도 18c) 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 기호는 개별 마우스로부터의 데이터를 나타낸다.
도 19a-c는 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 혈액, 비장 및 골수에서 인간화 항-CRTh2 항체 h19A2.v52 (hIgG1)의 단일 용량 후에 호염기구 또는 호산구 고갈의 용량 반응 및 지속시간을 제시한다. CRTh2+ 호산구 (CCR3+)의 기준선 수는 나타내어진 바와 같은 h19A2.v52로 처리하기 전 제-3일 (도 19a)에 혈액으로부터 유동 세포측정법에 의해 결정하였다. 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스를 10 ug/마우스 또는 200 ug/마우스 i.v.의 항-CRTh2 또는 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 호염기구 및 호산구 고갈을 혈액에서 (도 19a), 비장에서 (도 19b) 및 골수 (BM)에서 (도 19c) 나타내어진 바와 같은 제2일, 제7일 및 제14일에 유동 세포측정법에 의해 평가하였다. 기호는 개별 마우스로부터의 데이터를 나타낸다.
도 20a-b는 hCRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 TNP-OVA 유도된 만성 천식 모델에서 선천성 면역 세포 고갈 및 Th2 BAL 시토카인 생산의 감소에 있어서 이펙터 기능을 갖는 고갈성 항-CRTh2 19A2 mIgG2a 항체가 비-고갈성 항-CRTh2 19A2 mIgG2a_DANA Fc 돌연변이체 항체보다 더 효율적이라는 것을 제시한다. 도 20a는 유동 세포측정법에 의해 폐 조직에서 및 유동 세포측정법과 조합된 감별 세포 계수에 의해 BAL에서 평가된 호염기구, 호산구 및 비만 세포 수를 제시한다 (도 20a). 항-돼지풀 이소형 대조군 항체와 비교한 항-CRTh2 19A2 mIgG2a 항체 및 Fc 돌연변이체 19A2 mIgG2a_DANA 항체에 의한 고갈 퍼센트가 그래프에 나타내어져 있다. 도 20b는 BAL에서 ELISA에 의해 결정된 IL-4의 농도를 제시한다. 항-돼지풀 이소형 대조군 항체와 비교한 항-CRTh2 19A2 mIgG2a 항체 및 Fc 돌연변이체 19A2 mIgG2a_DANA 항체에 의한 감소 퍼센트가 그래프에 나타내어져 있다.
I. 정의
본원의 목적을 위한 "수용자 인간 프레임워크"는 하기 정의된 바와 같이 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 그의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 아미노산 서열 변화를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 아미노산 변화의 수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 실시양태에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 컨센서스 프레임워크 서열과 서열에 있어서 동일하다.
"친화도"는 분자 (예를 들어, 항체)의 단일 결합 부위와 그의 결합 파트너 (예를 들어, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총합의 강도를 지칭한다. 달리 나타내지 않는 한, 본원에 사용된 "결합 친화도"는 결합 쌍의 구성원들 (예를 들어, 항체 및 항원) 사이의 1:1 상호작용을 반영하는 고유 결합 친화도를 지칭한다. 분자 X의 그의 파트너 Y에 대한 친화도는 일반적으로 해리 상수 (Kd)로 표시될 수 있다. 친화도는 본원에 기재된 방법을 비롯한, 관련 기술분야에 공지된 통상의 방법에 의해 측정될 수 있다. 결합 친화도 측정을 위한 구체적인 설명적 및 예시적 실시양태가 하기 기재된다.
"친화도 성숙" 항체는 항원에 대한 항체의 친화도를 개선시키는 변경을 갖지 않는 모 항체와 비교하여 하나 이상의 초가변 영역 (HVR)에서 하나 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "CRTh2"는 달리 나타내지 않는 한 임의의 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들어, 인간, 레서스, 시노몰구스 CRTh2) 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)로부터의 임의의 천연 CRTh2를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 비프로세싱된 CRTh2, 뿐만 아니라 세포에서의 프로세싱으로부터 생성된 임의의 형태의 CRTh2를 포괄한다. 상기 용어는 또한 CRTh2의 자연 발생 변이체, 예를 들어, 스플라이스 변이체 또는 대립유전자 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 CRTh2의 아미노산 서열은 서열 84에 제시된다. 예시적인 레서스 CRTh2의 아미노산 서열은 서열 85에 제시된다. 예시적인 시노몰구스 CRTh2의 아미노산 서열은 서열 86에 제시된다. 예를 들어, 문헌 [L. Cosmi et al., Eur. J. Immunol. 30(10):2972-9 (2000); K. Nagat et al., FEBS Lett. 459(2): 195-9 (1999); 및 K. Nagata et al., J. Immunol. 162(3): 1278-86 (1999)]을 참조한다.
인간 CRTh2 서열 (서열 84)
Figure pct00001
레서스 CRTh2 서열 (NCBI 참조 번호 XM_001084746) (서열 85)
Figure pct00002
시노 CRTh2 서열 (서열 86)
Figure pct00003
용어 "항-CRTh2 항체" 및 "CRTh2에 결합하는 항체"는 항체가 CRTh2를 표적화하는데 있어서 진단제 및/또는 치료제로서 유용하도록 충분한 친화도로 CRTh2에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시양태에서, 항-CRTh2 항체의 비관련, 비-CRTh2 단백질에 대한 결합의 정도는, 예를 들어 방사성면역검정 (RIA)에 의해 측정시에, CRTh2에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시양태에서, CRTh2에 결합하는 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다. 특정 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 상이한 종으로부터의 CRTh2 사이에서 보존된 CRTh2의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미로 사용되고, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 및 목적하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 항체 단편을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 일부를 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일-쇄 항체 분자 (예를 들어, scFv); 및 항체 단편들로 형성된 다중특이적 항체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
참조 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 참조 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 반대로 참조 항체는 경쟁 검정에서 항체의 그의 항원에 대한 결합을 50% 이상 차단한다. 예시적인 경쟁 검정이 본원에 제공된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정한 공급원 또는 종으로부터 유래된 반면, 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지가 다른 공급원 또는 종으로부터 유래된 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 그의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 5종의 주요 부류의 항체: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 존재하고, 이들 중 몇몇은 하위부류 (이소형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 추가로 분류될 수 있다. 상이한 부류의 이뮤노글로불린에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다.
본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포 기능을 억제 또는 방지하고/거나 세포 사멸 또는 파괴를 유발하는 물질을 지칭한다. 세포독성제는 방사성 동위원소 (예를 들어, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소); 화학요법제 또는 약물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 아드리아미신, 빈카 알칼로이드 (빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드), 독소루비신, 멜팔란, 미토마이신 C, 클로람부실, 다우노루비신 또는 다른 삽입제); 성장 억제제; 효소 및 그의 단편, 예컨대 핵산분해 효소; 항생제; 독소, 예컨대 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소적 활성 독소 (그의 단편 및/또는 변이체 포함); 및 하기 개시된 다양한 항종양제 또는 항암제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
"이펙터 기능"은 항체 이소형에 따라 달라지는, 항체의 Fc 영역에 기인하는 생물학적 활성을 지칭한다. 항체 이펙터 기능의 예는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체-의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC); 식세포작용; 세포 표면 수용체 (예를 들어, B 세포 수용체)의 하향 조절; 및 B 세포 활성화.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 함유하는 이뮤노글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하는 것으로 사용된다. 상기 용어는 천연 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 한 실시양태에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 Cys226 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카르복실-말단으로 연장된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 리신 (Lys447)은 존재할 수 있거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에서 달리 명시되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변 영역 내의 아미노산 잔기의 넘버링은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같이 EU 인덱스로도 지칭되는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 초가변 영역 (HVR) 잔기 이외의 다른 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 다음 FR 도메인으로 이루어진다: FR1, FR2, FR3 및 FR4. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환가능하게 사용되며, 천연 항체 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양물"은 상호교환가능하게 사용되며, 외인성 핵산이 도입된 세포 (이러한 세포의 자손 포함)를 지칭한다. 숙주 세포는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"를 포함하며, 이는 1차 형질전환된 세포 및 계대배양 횟수와 관계없이 그로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량에 있어서 완전히 동일하지는 않을 수 있으나, 돌연변이를 함유할 수 있다. 본래 형질전환된 세포에 대해 스크리닝 또는 선택되는 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 보유하거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-코딩 서열을 이용하여 비-인간 공급원으로부터 유래된 항체이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 배제된다.
"인간 컨센서스 프레임워크"는 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택시에 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 이뮤노글로불린 VL 또는 VH 서열의 선택은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 행한다. 일반적으로, 서열의 하위군은 문헌 [Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), vols. 1-3]에서와 같은 하위군이다. 한 실시양태에서, VL의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 카파 I이다. 한 실시양태에서, VH의 경우에 하위군은 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에서와 같은 하위군 III이다.
"인간화" 항체는 비-인간 HVR로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 실시양태에서, 인간화 항체는 실질적으로 적어도 1개, 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 HVR (예를 들어, CDR)은 비-인간 항체의 것에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 항체의 것에 상응한다. 인간화 항체는 임의로 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들어 비-인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열이 초가변성이고/거나 구조적으로 한정된 루프 ("초가변 루프")를 형성하는 항체 가변 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연 4-쇄 항체는 다음 6개의 HVR을 포함한다; VH 내의 3개 (H1, H2, H3) 및 VL 내의 3개 (L1, L2, L3). HVR은 일반적으로 초가변 루프로부터의 및/또는 "상보성 결정 영역" (CDR)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하며, 후자는 서열 가변성이 가장 높고/거나 항원 인식과 관련된다. 본원에 사용된 HVR 영역은 위치 24-36 (L1에 대해), 46-56 (L2에 대해), 89-97 (L3에 대해), 26-35B (H1에 대해), 47-65 (H2에 대해) 및 93-102 (H3에 대해) 내에 위치한 임의의 번호의 잔기를 포함한다. 따라서, HVR은 이전에 기재된 위치에서의 잔기를 포함한다:
A) 24-34 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
B) L1의 24-34, L2의 50-56, L3의 89-97, H1의 31-35B, H2의 50-65, 및 H3의 95-102 (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
C) 30-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35 (H1), 47-58 (H2), 93-100a-j (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)).
VH 내의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 초가변 루프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. CDR은 또한 항원에 접촉하는 잔기인 "특이성 결정 잔기" 또는 "SDR"을 포함한다. SDR은 단축-CDR, 또는 a-CDR로 불리는 CDR의 영역 내에 함유된다. 예시적인 a-CDR (a-CDR-L1, a-CDR-L2, a-CDR-L3, a-CDR-H1, a-CDR-H2 및 a-CDR-H3)은 L1의 아미노산 잔기 31-34, L2의 50-55, L3의 89-96, H1의 31-35B, H2의 50-58 및 H3의 95-102에서 발생한다. (문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조.) 달리 나타내지 않는 한, HVR 잔기 및 가변 도메인에서의 다른 잔기 (예를 들어, FR 잔기)는 본원에서 문헌 [Kabat et al., 상기 문헌]에 따라 넘버링된다.
"면역접합체"는 세포독성제를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "대상체"는 포유동물이다. 포유동물은 가축 (예를 들어, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들어, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류 (예를 들어, 마우스 및 래트)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 개체 또는 대상체는 인간이다.
"단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분에서 분리된 것이다. 일부 실시양태에서, 항체는 예를 들어 전기영동 (예를 들어, SDS-PAGE, 등전 포커싱 (IEF), 모세관 전기영동) 또는 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환 또는 역상 HPLC)에 의해 결정시에 95% 또는 99% 초과의 순도로 정제된다. 항체 순도의 평가를 위한 방법의 검토에 대해서는, 예를 들어 문헌 [Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)]을 참조한다.
"단리된" 핵산은 그의 천연 환경의 성분으로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산은 핵산 분자를 통상적으로 함유하는 세포에 함유되는 핵산 분자를 포함하지만, 핵산 분자는 염색체외에 또는 그의 천연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-CRTh2 항체를 코딩하는 단리된 핵산"은 항체 중쇄 및 경쇄 (또는 그의 단편)를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자 (단일 벡터 또는 개별 벡터 내의 이러한 핵산 분자(들) 및 숙주 세포에서 하나 이상의 위치에 존재하는 이러한 핵산 분자(들) 포함)를 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는 것으로 사용되고, 즉 상기 집단을 구성하는 개별 항체는 일반적으로 소량으로 존재하는, 예를 들어 자연 발생 돌연변이를 포함하거나 모노클로날 항체 제제의 생산 동안 생성되는 가능한 변이체 항체를 제외하고는 동일하고/거나 동일한 에피토프에 결합한다. 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 폴리클로날 항체 제제와는 반대로, 모노클로날 항체 제제의 각각의 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 얻은 항체의 특성을 나타내고, 임의의 특정한 방법에 의한 항체 생산을 필요로 하는 것으로서 간주되지 않아야 한다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지-디스플레이 방법, 및 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유하는 트랜스제닉 동물을 이용하는 방법을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조할 수 있고, 이러한 방법 및 모노클로날 항체를 제조하기 위한 다른 예시적인 방법이 본원에 기재된다.
"네이키드 항체"는 이종 모이어티 (예를 들어, 세포독성 모이어티) 또는 방사성표지에 접합되지 않은 항체를 지칭한다. 네이키드 항체는 제약 제제에 존재할 수 있다.
"천연 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 이뮤노글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들어, 천연 IgG 항체는 디술피드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체 당단백질이다. N-말단에서 C-말단으로, 각각의 중쇄는 가변 영역 (VH) (또한 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어서 3개의 불변 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N-말단에서 C-말단으로, 각각의 경쇄는 가변 영역 (VL) (또한 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 도메인으로 지칭됨)에 이어서 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다. 항체의 경쇄는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기반으로, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 지칭되는 2가지 유형 중 하나로 할당될 수 있다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 제품의 상업용 패키지 내에 통상적으로 포함되어 있으며 이러한 치료 제품의 사용에 관한 적응증, 용법, 투여량, 투여, 조합 요법, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는 지침서를 지칭하는 것으로 사용된다.
참조 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 퍼센트 (%)"는 서열을 정렬시키고 필요한 경우에는 최대 서열 동일성 퍼센트 달성을 위해 갭을 도입한 후 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로 간주하지 않으면서 참조 폴리펩티드 서열 내의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열 내의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 관련 기술분야 기술 범위 내의 다양한 방법, 예를 들어 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메갈라인(Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 통상의 기술자는 비교할 전장 서열에 대한 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯한, 서열 정렬에 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상, 아미노산 서열 동일성 % 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨테크, 인크.(Genentech, Inc.) 소유로서, 소스 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱턴 디.씨.)에 사용자 문서로 제출되어 있고, 미국 저작권 등록 번호 TXU510087로 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨테크, 인크. (캘리포니아주 사우스 샌프란시스코)를 통해 공개적으로 이용가능하거나, 소스 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 디지털 UNIX V4.0D를 비롯한 UNIX 운영 시스템에서 사용되도록 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되어 있으며 변하지 않는다.
ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 사용되는 상황에서, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 % (대안적으로, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대해 특정 아미노산 서열 동일성 %를 갖거나 또는 이를 포함하는 주어진 아미노산 서열 A라는 어구로 기재될 수 있음)는 하기와 같이 계산된다: X/Y의 분율 x 100 (여기서, X는 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의한 A 및 B의 프로그램 정렬시에 상기 프로그램에 의해 동일한 매치로 점수화된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B의 아미노산 잔기의 총 수임). 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우에 B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 %가 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 %와 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 아미노산 서열 동일성 % 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 위 단락에 기재한 바와 같이 수득된다.
용어 "제약 제제"는 그 안에 함유된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 하는 형태로 존재하며, 제제가 투여될 대상체에게 허용되지 않는 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제제를 지칭한다.
"제약상 허용되는 담체"는 대상체에게 비독성인, 활성 성분 이외의 다른 제약 제제 내의 성분을 지칭한다. 제약상 허용되는 담체는 완충제, 부형제, 안정화제 또는 보존제를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 용어 "치료"는 임상 병리상태의 과정 동안 치료될 개체 또는 세포의 자연 과정을 변경하도록 설계된 임상 개입을 지칭한다. 치료의 바람직한 효과는 질환 진행 속도의 감소, 질환 상태의 호전 또는 완화, 및 경감 또는 개선된 예후를 포함한다. 일부 실시양태에서, 치료는 천식 제어를 개선시키고/거나 천식 악화를 감소시키고/거나 폐 기능을 개선시키고/거나 환자 보고된 증상을 개선한다. 예를 들어, 장애와 연관된 하나 이상의 증상이 완화 또는 제거된 경우에, 개체는 성공적으로 "치료된" 것이다.
본원에 사용된 "와 함께"는 한 치료 양식 뿐만 아니라 또 다른 치료 양식의 투여를 지칭한다. 이에 따라, "와 함께"는 한 치료 양식을, 개체에게 다른 치료 양식을 투여하기 전에, 그 동안 또는 그 후에 투여하는 것을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "예방"은 개체에서 질환의 발생 또는 재발과 관련하여 방지를 제공하는 것을 포함한다. 개체는 장애에 걸리기 쉽거나, 그에 감수성이거나 또는 장애의 발생 위험이 있을 수 있으나, 아직 장애를 갖는 것으로 진단되지는 않았다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CRTh2 항체는 장애의 발생을 지연시키기 위해 사용된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CRTh2 항체는 천식 악화 및/또는 폐 기능의 저하 또는 천식 상태를 예방한다.
본원에 사용된 장애가 발생할 "위험이 있는" 개체는 검출가능한 질환 또는 질환의 증상을 갖거나 갖지 않을 수 있고, 본원에 기재된 치료 방법 이전에 검출가능한 질환 또는 질환의 증상을 나타내거나 나타내지 않을 수 있다. "위험이 있는"은 개체가 관련 기술분야에 공지된 바와 같은 장애의 발생과 상관관계가 있는 측정가능한 파라미터인 하나 이상의 위험 인자를 갖는다는 것을 나타낸다. 이들 위험 인자 중 하나 이상을 갖는 개체는 이들 위험 인자 중 하나 이상이 없는 개체보다 장애 발생의 보다 높은 확률을 갖는다.
"유효량"은 적어도 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 치료 또는 예방 결과를 비롯한 목적 효과 또는 지시된 효과를 달성하는데 효과적인 양을 지칭한다. 유효량은 1회 이상의 투여로 제공될 수 있다.
"치료 유효량"은 적어도 특정한 장애의 측정가능한 개선에 요구되는 최소 농도이다. 본원에서 치료 유효량은 환자의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 개체에서 목적하는 반응을 도출하는 항체의 능력과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료 유효량은 항체의 임의의 독성 또는 유해한 효과를 치료상 유익한 효과가 능가하는 양이다. "예방 유효량"은 목적하는 예방 결과를 달성하는데 필요한 투여량에서 필요한 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다. 반드시는 아니지만 전형적으로, 예방 용량은 질환의 보다 초기 단계 전에 또는 보다 초기 단계에서 대상체에서 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 수 있다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체의 항원에 대한 결합에 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 (각각 VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 초가변 영역 (HVR)을 포함한다. (예를 들어, 문헌 [Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)] 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기 충분할 수 있다. 또한, 특정한 항원에 결합하는 항체는 각각 상보적 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 항원에 결합하는 항체로부터의 VH 또는 VL 도메인을 사용하여 단리할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)]을 참조한다.
본원에 사용된 용어 "벡터"는 그가 연결되는 또 다른 핵산을 증식시킬 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기-복제 핵산 구조로서의 벡터 뿐만 아니라 그가 내부에 도입된 숙주 세포의 게놈 내로 통합되는 벡터를 포함한다. 특정 벡터는 그가 작동가능하게 연결된 핵산의 발현을 지시할 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 지칭된다.
"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 또는 "ADCC"는 특정 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 킬러 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR) 상에 결합된 분비된 Ig가, 상기 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합한 후, 표적 세포를 세포독소로 사멸시키도록 만드는 세포독성의 한 형태를 지칭한다. 항체는 세포독성 세포를 "아암"시키고, 상기 메카니즘으로 표적 세포를 사멸시키는데 필요하다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 Fc 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-92 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 시험관내 ADCC 검정, 예컨대 미국 특허 번호 5,500,362 또는 5,821,337에 기재된 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로, 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al., PNAS USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다.
"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체 존재 하에의 표적 세포의 용해를 지칭한다. 고전적 보체 경로의 활성화는 동족 항원에 결합된 항체 (적절한 하위부류의 항체)에 대한 보체 시스템 제1 성분 (C1q)의 결합으로 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 바와 같은 CDC 검정을 수행할 수 있다.
용어 "천식"은 가변성 및 재발성 증상, 가역성 기류 폐쇄 (예를 들어, 기관지확장제에 의함) 및 기저 염증과 연관될 수 있거나 연관되지 않을 수 있는 기관지 과민반응을 특징으로 하는 복합 장애를 지칭한다. 천식의 예는 아스피린 민감성/악화된 천식, 아토피성 천식, 중증 천식, 경도 천식, 중등도 내지 중증 천식, 코르티코스테로이드 미경험 천식, 만성 천식, 코르티코스테로이드 내성 천식, 코르티코스테로이드 불응성 천식, 새로 진단된 치료받지 않은 천식, 흡연으로 인한 천식, 코르티코스테로이드로 제어되지 않는 천식, 및 문헌 [J Allergy Clin Immunol (2010) 126(5):926-938]에 언급된 바와 같은 다른 천식을 포함한다. 천식의 증상은 숨가쁨, 기침 (객담 생성 및/또는 객담 질 및/또는 기침 빈도에서의 변화), 천명, 흉부 압박, 기관지수축, 및 상기 증상 중 하나에 기인한 야간 각성 또는 이들 증상의 조합을 포함한다 (Juniper et al. (2000) Am. J. Respir. Crit. Care Med., 162(4), 1330-1334.).
용어 "경도 천식"은 일반적으로 1주 2회 미만의 증상 또는 악화, 1개월 2회 미만의 야간 증상을 경험하는 환자를 지칭하며, 악화 사이에 무증상이다. 경도 간헐성 천식은 필요한 경우에 종종 하기로 치료된다: 흡입용 기관지확장제 (단기-작용 흡입용 베타2-효능제); 공지된 유발인자의 회피; 매년 인플루엔자 백신접종; 6 내지 10년마다의 폐렴구균 백신접종, 및 일부 경우에, 흡입용 베타2-효능제, 크로몰린, 또는 확인된 유발인자에 대한 노출 전의 네도크로밀. 환자가 단기-작용 베타2-효능제에 대한 증가하는 필요성을 갖는 경우에 (예를 들어, 급성 악화에 대해 1일에 3 내지 4회 초과의 단기-작용 베타2-효능제를 사용하거나, 또는 증상에 대해 1개월 1개 초과의 캐니스터를 사용함), 환자는 요법에서의 증강을 필요로 할 수 있다.
용어 "중등도 천식"은 일반적으로 환자가 1주 2회 초과의 악화를 경험하고, 악화가 수면 및 활동에 영향을 미치고; 환자가 1개월 2회 초과의 천식으로 인한 야간 각성을 갖고; 환자가 매일 또는 격일의 단기-작용 흡입용 베타2-효능제를 필요로 하는 만성 천식 증상을 가지며; 환자의 치료전 기준선 최고 호기 유량 (PEF) 또는 1초간 강제 호기량 (FEV1)이 예측된 60 내지 80 퍼센트이고, PEF 가변성이 20 내지 30 퍼센트인 천식을 지칭한다.
용어 "중증 천식"은 일반적으로 환자가 거의 연속적인 증상, 빈번한 악화, 천식으로 인한 빈번한 야간 각성, 제한된 활동, 예측된 60 퍼센트 미만의 PEF 또는 FEV1 기준선, 및 20 내지 30 퍼센트의 PEF 가변성을 갖는 것인 천식을 지칭한다.
용어 "FEV1"은 강제 호기의 처음 1초에 내쉰 공기의 부피를 지칭한다. 이는 기도 폐쇄의 척도이다. FEV1은 다른 유사한 방식, 예를 들어 FEVs로 기재될 수 있으며, 모든 이러한 유사한 변형이 동일한 의미를 갖는다는 것을 이해해야 한다.
용어 "코르티코스테로이드"는 글루코코르티코이드 및 미네랄로코르티코이드를 포함한다. 예를 들어, 코르티코스테로이드는 플루티카손 (플루티카손 프로피오네이트 (FP) 포함), 베클로메타손, 부데소니드, 시클레소니드, 모메타손, 플루니솔리드, 베타메타손, 히드로코르티손, 프레드니손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론 및 트리암시놀론을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. "흡입가능한 코르티코스테로이드"는 흡입에 의한 전달에 적합한 코르티코스테로이드를 의미한다. 예시적인 흡입가능한 코르티코스테로이드는 플루티카손, 베클로메타손 디프로피오네이트, 부데소니드, 모메타손 푸로에이트, 시클레소니드, 플루니솔리드, 트리암시놀론 아세토니드 및 현재 이용가능하거나 미래에 이용가능하게 될 임의의 다른 코르티코스테로이드이다. 흡입될 수 있고 장기-작용 베타2-효능제와 조합되는 코르티코스테로이드의 예는 부데소니드/포르모테롤 및 플루티카손/살메테롤을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
용어 "시토카인"은 또 다른 세포 상에서 세포간 매개자로서 작용하는 하나의 세포 집단에 의해 방출되는 단백질에 대한 일반적 용어이다. 이러한 시토카인의 예는 림포카인, 모노카인; 인터류킨 (IL), 예컨대 IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, 예를 들어 프로류킨(PROLEUKIN)® rIL-2; 종양-괴사 인자, 예컨대 TNF-α 또는 TNF-β; 및 다른 폴리펩티드 인자, 예를 들어 LIF 및 kit 리간드 (KL)이다. 본원에 사용된 용어 시토카인은 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연-서열 시토카인의 생물학적 활성 등가물 (합성에 의해 생산된 소분자 물질 및 그의 제약상 허용되는 유도체 및 염 포함)을 포함한다.
본원 및 첨부된 청구범위에 사용된 단수 형태는 문맥상 명백하게 달리 나타내지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들어, "항체"에 대한 언급은 하나 내지 다수의 항체 (예컨대, 몰 양)에 대한 언급이고, 통상의 기술자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
본원에 기재된 본 발명의 측면 및 실시양태는 측면 및 실시양태를 "포함하는 것", 이들로 "이루어진 것" 및 이들로 "본질적으로 이루어진 것"을 포함하는 것으로 이해된다.
II. 조성물 및 방법
한 측면에서, CRTh2에 결합하는 항체가 본원에 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-CRTh2는 유효량이 대상체 (예를 들어, 인간 대상체)에게 투여되는 경우에 인간 CRTh2에 결합하며 CRTh2 발현 세포를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 또한 비-인간 영장류의 CRTh2 (예를 들어, 레서스 또는 시노몰구스 CRTh2)에 결합한다. 본 발명의 항체는, 예를 들어 CRTh2 발현 세포에 의해 매개되는 장애의 진단 또는 치료에 유용하다.
예시적인 항-CRTh2 항체
한 측면에서, 본 발명은 CRTh2에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 특정 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 하기 특성 중 하나 이상을 갖는다: (1) 유효량이 대상체에게 투여되는 경우에 CRTh2 (예를 들어, 인간 CRTh2)에 결합하며 CRTh2 발현 세포 (예를 들어, Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 및/또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포)를 고갈시킴; (2) ADCC를 개선시키도록 조작되었음; (3) 비-푸코실화되거나 또는 감소된 푸코실화를 가짐; (4) 인간 CRTh2에 대한 하기 항체: 19A2, 8B1, 31A5, 3C12 및 본원에 기재된 임의의 인간화 항체 중 적어도 하나의 결합을 경쟁적으로 억제함; (5) 하기 항-CRTh2 항체: 19A2, 8B1, 31A5, 3C12 및 본원에 기재된 임의의 인간화 항체 중 적어도 하나에 의해 결합된 CRTh2 에피토프와 동일하거나 또는 그와 중복되는 인간 CRTh2의 에피토프에 결합함; (6) 인간의 CRTh2 및 비-인간 영장류의 CRTh2 (예를 들어, 레서스 및/또는 시노몰구스 CRTh2)에 결합함; (7) CRTh2 신호전달을 차단함; (8) 프로스타글란딘 D2에 반응하여 CRTh2 발현 세포의 동원을 방지함; (9) CRTh2 발현 세포에서 Ca2+ 유동을 차단함; (10) 효능작용 활성을 나타내지 않음; (11) CRTh2 발현 세포 (예를 들어, 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포)에서 포르스콜린-유도된 cAMP 수준을 감소시키지 않음; 및 (12) CRTh2 발현 세포 (예를 들어, 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포)에서 포르스콜린-유도된 cAMP 수준의 프로스타글란딘 D2 유발된 억제를 차단함.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 뮤린 항체 19A2, 8B1, 31A5 및 3C12, 및 본원에 기재된 인간화 항체 (예를 들어, hu8B1.v1, hu19A2.v1, v12, v38, v46, v47, v51-v53, v57, v58, 및 v60-v72) 중 어느 하나의 HVR-L1, HVR-L2 및 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함하는 경쇄 가변 영역; 및/또는 (b) 뮤린 항체 19A2, 8B1, 3C12 및 31A5, 및 본원에 기재된 인간화 항체 (예를 들어, hu8B1.v1, hu19A2.v1, v12, v38, v46, v47, v51-v53, v57, v58, 및 v60-v72) 중 어느 하나의 HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, HVR-L1, HVR-L2, HVR-L3, HVR-H1, HVR-H2 및 HVR-H3은 도 10, 11a, 11b, 12, 13 및 14에 제시된 바와 같은 카바트 CDR, 코티아 CDR 또는 콘택트 CDR 서열을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (iii) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (iv) 서열 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (v) 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (vi) 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-CRTh2 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (iii) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (iv) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (v) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (vi) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-CRTh2 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (i) RASENIYXNLA (서열 1) (여기서 X는 S, W 또는 Y임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (ii) AATQLAX (서열 2) (여기서 X는 D, E 또는 S임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; (iii) QHFWITPWT (서열 3)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3; (iv) X1YX2MS (서열 4) (여기서 X1은 S 또는 F이고, X2는 S, L 또는 K임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (v) X1ISNGGSTTX2YPGTVEG (서열 5) (여기서 X1은 Y 또는 R이고, X2는 Y 또는 D임)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (vi) HRTNWDFDY (서열 6)의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 HVR을 포함하는 항-CRTh2 항체를 제공한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3 및 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함한다. 추가 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 한 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 35 또는 36으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 항체는 (a) (i) 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (ii) 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (iii) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VH HVR 서열을 포함하는 VH 도메인; 및 (b) (i) 서열 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, (ii) 서열 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 모든 3개의 VL HVR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 (a) 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 10, 11, 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 18의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 7의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 (a) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1; (b) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3; (d) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (e) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (f) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함한다.
임의의 상기 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 단리된 항체이다. 임의의 상기 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 인간화 항체이다. 한 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR 및 도 10, 11, 12, 13 및 14에 제시된 HVR (카바트 CDR, 코티아 CDR 또는 콘택트 CDR 서열을 포함하는 HVR 포함)을 포함하고, 수용자 인간 프레임워크, 예를 들어 인간 이뮤노글로불린 프레임워크 또는 인간 컨센서스 프레임워크를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR을 포함하고, 도 11a, 12 및 14a에 제시된 바와 같은 FR (예를 들어, FR1, FR2, FR3 또는 FR4) 서열을 포함하는 VL을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 임의의 상기 실시양태에서와 같은 HVR 및 도 10, 11, 12, 13 및 14에 제시된 HVR (카바트 CDR, 코티아 CDR 또는 콘택트 CDR 서열을 포함하는 HVR 포함)을 포함하고, 도 11b, 12 및 14b에 제시된 바와 같은 FR (예를 들어, FR1, FR2, FR3 또는 FR) 서열을 포함하는 VH를 추가로 포함한다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CRTh2 항체는 카바트에 의해 정의된 바와 같은 HVR을 포함하며, 예를 들어 항-CRTh2 항체는 각각의 CDR이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 카바트에 의해 정의된 것인 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CRTh2 항체는 코티아에 의해 정의된 바와 같은 HVR을 포함하며, 예를 들어 항-CRTh2 항체는 각각의 CDR이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 코티아에 의해 정의된 것인 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CRTh2 항체는 콘택트 CDR 서열에 의해 정의된 바와 같은 HVR을 포함하며, 예를 들어 항-CRTh2 항체는 각각의 CDR이 본원에 추가로 기재된 바와 같이 콘택트 CDR 서열에 의해 정의된 것인 CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함한다.
또 다른 측면에서, 서열 38-53으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 항-CRTh2 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-CRTh2 항체는 CRTh2에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 서열 38-53 중 임의의 것에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입, 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-CRTh2 항체는 서열 38-53으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 7-9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 10-12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 22 또는 23의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 25의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VL은 (a) 서열 24의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1; (b) 서열 26의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2; 및 (c) 서열 28의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 항-CRTh2 항체는 서열 54-65로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비해 치환 (예를 들어, 보존적 치환), 삽입 또는 결실을 함유하지만, 그 서열을 포함하는 항-CRTh2 항체는 CRTh2에 결합하는 능력을 유지한다. 특정 실시양태에서, 총 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 아미노산이 서열 54-65 중 임의의 것에서 치환, 삽입 및/또는 결실되었다. 특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 HVR 외부의 영역에서 (즉, FR에서) 일어난다. 임의로, 항-CRTh2 항체는 서열 54-65 중 임의의 것의 VH 서열 (그 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 13-17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 18-21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다. 특정한 실시양태에서, VH는 (a) 서열 31의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, (b) 서열 34의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 (c) 서열 37의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개의 HVR을 포함한다.
또 다른 측면에서, 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VH 및 상기 제공된 임의의 실시양태에서와 같은 VL을 포함하는 항-CRTh2 항체가 제공된다. 일부 실시양태에서, 항체는 임의의 뮤린 항체 8B1, 3C12, 31A5 및 19A2, 및 인간화 항체 hu19A2 (v1, v12, v38, v46, v47, v51-v53, v57, v58, 및 v60-v72 포함)의 VH 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체는 임의의 뮤린 항체 8B1, 3C12, 31A5 및 19A2, 및 인간화 항체 hu19A2 (v1, v12, v38, v46, v47, v51-v53, v57, v58, 및 v60-v72 포함)의 VL 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 54-60으로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열 및 서열 38-48로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 55의 VH 서열 및 서열 39의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 57의 VH 서열 및 서열 41의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 61의 VH 서열 및 서열 49의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 62의 VH 서열 및 서열 50의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 63의 VH 서열 및 서열 51의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 64의 VH 서열 및 서열 52의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 65의 VH 서열 및 서열 53의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 한 실시양태에서, 항체는 서열 57의 VH 서열 및 서열 40의 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 제공된 항-CRTh2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 뮤린 항체 8B1, 3C12, 31A5 및 19A2, 및 인간화 항체 hu19A2 (v1, v12, v38, v46, v47, v51-v53, v57, v58, 및 v60-v72 포함)와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다.
추가 측면에서, 인간 CRTh2 및 적어도 하나의 비-인간 영장류 CRTh2 둘 다에 결합하는 항-CRTh2 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 인간 CRTh2 및 시노몰구스 CRTh2에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 인간 CRTh2 및 레서스 CRTh2에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 인간 CRTh2, 레서스 CRTh2 및 시노몰구스 CRTh2에 결합한다. 특정 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 100 nM 미만의 KD로 인간 CRTh2 및 적어도 하나의 비-인간 영장류 CRTh2 둘 다에 결합한다 (예를 들어, 항-CRTh2 항체는 100 nM 미만의 KD로 인간 CRTh2에 결합하고, 100 nM 미만의 KD로 적어도 하나의 비-인간 영장류 CRTh2에 결합한다). 특정 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 75 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 nM 또는 10 nM 미만의 KD로 인간 CRTh2 및 적어도 하나의 비-인간 영장류 CRTh2 둘 다에 결합한다. 특정 실시양태에서, 인간 CRTh2 및 적어도 하나의 비-인간 영장류 CRTh2 둘 다에 결합하는 항-CRTh2 항체는 고갈성 항체, 예를 들어 본원에 추가로 기재된 바와 같은 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 항체이다.
본 발명의 추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-CRTh2 항체는 키메라, 인간화 또는 인간 항체를 포함하는 모노클로날 항체이다. 한 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 항체 단편, 예를 들어 Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디 또는 F(ab')2 단편이다. 또 다른 실시양태에서, 항체는 전장 항체, 예를 들어 무손상 IgG1 항체, 또는 본원에 정의된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 이소형 (예를 들어, IgG2, IgG3 또는 IgG4)이다. 일부 실시양태에서, 항체는 서열 77-83으로 이루어진 군으로부터 선택된 중쇄 서열 및/또는 서열 66-76으로 이루어진 군으로부터 선택된 경쇄 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 임의의 상기 실시양태에 따른 항-CRTh2 항체는 하기 섹션에 기재된 바와 같은 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 포함할 수 있다:
항체 친화도
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 ≤ 1 μM, ≤ 150 nM, ≤ 100 nM, ≤ 50 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어, 10-8 M 이하, 예를 들어 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들어 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (Kd)를 갖는다.
한 실시양태에서, Kd는 하기 검정에 기재된 바와 같이 관심 항체의 Fab 버전 및 그의 항원을 사용하여 수행된 방사성표지된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 측정된다. 항원에 대한 Fab의 용액 결합 친화도는 비표지된 항원의 적정 시리즈의 존재 하에 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지된 항원과 평형화시킨 다음, 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 플레이트로 포획함으로써 측정된다 (예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)] 참조). 검정 조건을 확립하기 위해, 마이크로타이터(MICROTITER)® 멀티-웰 플레이트 (써모 사이언티픽(Thermo Scientific))를 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6) 중 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (카펠 랩스(Cappel Labs))로 밤새 코팅한 후, PBS 중의 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 2 내지 5시간 동안 실온 (대략 23℃)에서 차단하였다. 비-흡착 플레이트 (눈크(Nunc) #269620)에서는 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원을 관심 Fab의 연속 희석물과 혼합한다 (예를 들어, 문헌 [Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)]의 항-VEGF 항체, Fab-12의 평가와 일치함). 이어서, 관심 Fab를 밤새 인큐베이션하지만; 평형에 도달하는 것을 확실하게 하기 위해 더 오랜 기간 (예를 들어, 약 65시간) 동안 계속 인큐베이션할 수 있다. 이후에, 혼합물을 포획 플레이트로 옮겨 실온에서 (예를 들어, 1시간 동안) 인큐베이션한다. 이어서, 용액을 제거하고, 플레이트를 PBS 중 0.1% 폴리소르베이트 20 (트윈(TWEEN)-20®)으로 8회 세척하였다. 플레이트를 건조시킬 때, 150 μl/웰의 섬광제 (마이크로신트(MICROSCINT)-20™; 팩커드(Packard))를 첨가하고, 플레이트를 탑카운트(TOPCOUNT)™ 감마 계수기 (팩커드)로 10분 동안 계수한다. 최대 결합의 20% 이하를 제공하는 각 Fab의 농도를 선택하여 경쟁 결합 검정에 사용한다. 일부 실시양태에서, Kd는 또한 세포 표면 상에 발현된 CRTh2에의 항체의 결합에 대해 측정될 수 있다.
또 다른 실시양태에 따르면, Kd는 예를 들어 ~10 반응 단위 (RU)로 고정화된 항원 CM5 칩을 사용하여 25℃에서 비아코어(BIACORE)®-2000 또는 비아코어®-3000 (비아코어, 인크.(BIAcore, Inc.), 뉴저지주 피스카타웨이)을 사용하는 표면 플라즈몬 공명 검정을 사용하여 측정된다. 간략하게, 카르복시메틸화 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, 비아코어, 인크.)을 공급업체의 지침에 따라 N-에틸-N'-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화시킨다. 항원을 10 mM 아세트산나트륨 (pH 4.8)을 사용하여 5 μg/ml (~0.2 μM)로 희석한 후에 커플링된 단백질 대략 10 반응 단위 (RU)가 달성되도록 5 μl/분의 유량으로 주사한다. 항원의 주사 후에, 1 M 에탄올아민을 주사하여 미반응기를 차단한다. 동역학적 측정을 위해, Fab의 2배 연속 희석물 (0.78 nM 내지 500 nM)을 대략 25 μl/분의 유량으로 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (트윈-20™) 계면활성제를 갖는 PBS (PBST) 내에 주사한다. 간단한 일-대-일 랭뮤어(Langmuir) 결합 모델 (비아코어® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 사용하여 회합 및 해리 센서그램을 동시에 피팅시켜 회합률 (kon) 및 해리율 (koff)을 계산한다. 평형 해리 상수 (Kd)는 koff/kon의 비로 계산한다. 예를 들어, 문헌 [Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999)]을 참조한다. 상기 표면-플라즈몬 공명 검정에 의한 온-레이트가 106 M- 1 s-1을 초과하는 경우에, 온-레이트는 분광측정계, 예컨대 정지-유동 설치 분광광도계 (아비브 인스트루먼츠(Aviv Instruments)) 또는 교반 큐벳이 장착된 8000-시리즈 SLM-아민코(SLM-AMINCO)™ 분광광도계 (써모스펙트로닉(ThermoSpectronic))에서 측정할 때 증가하는 농도의 항원의 존재하에 PBS (pH 7.2) 중 20 nM의 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서의 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm, 방출 = 340 nm, 16 nm 통과 대역)의 증가 또는 감소를 측정하는 형광 켄칭 기술을 사용하여 결정할 수 있다.
항체 단편
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체 단편이다. 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fv 및 scFv 단편, 및 하기 기재된 다른 단편을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 특정 항체 단편의 검토를 위해, 문헌 [Hudson et al. Nat. Med. 9:129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Pluckthuen, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 WO 93/16185; 및 미국 특허 번호 5,571,894 및 5,587,458을 참조한다. 샐비지 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편의 논의에 대해, 미국 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
디아바디는 2가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트리아바디 및 테트라바디는 또한 문헌 [Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)]에 기재되어 있다.
단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시양태에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다 (도만티스, 인크.(Domantis, Inc.), 매사추세츠주 월섬; 예를 들어 미국 특허 번호 6,248,516 B1 참조).
항체 단편은 본원에 기재된 바와 같은 무손상 항체의 단백질분해적 소화 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들어, 이. 콜라이(E coli) 또는 파지)에 의한 생산을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 기술에 의해 제조될 수 있다.
키메라 및 인간화 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567; 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)]에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비-인간 가변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 또는 비-인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 예에서, 키메라 항체는 부류 또는 하위부류가 모 항체의 것으로부터 변화된 "부류 교체된" 항체이다. 키메라 항체는 그의 항원-결합 단편을 포함한다.
특정 실시양태에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 모 비-인간 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성이 감소하도록 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 HVR, 예를 들어 CDR (또는 그의 부분)이 비-인간 항체로부터 유래되고, FR (또는 그의 부분)이 인간 항체 서열로부터 유래된 1개 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 또한 임의로 인간 불변 영역의 적어도 일부분을 포함할 것이다. 일부 실시양태에서, 인간화 항체의 일부 FR 잔기는, 예를 들어 항체 특이성 또는 친화도를 복원하거나 개선시키기 위해, 비-인간 항체 (예를 들어, HVR 잔기가 유래된 항체)로부터의 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 그의 제조 방법은 예를 들어 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)]에서 검토되었고, 예를 들어 문헌 [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)]; 미국 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; [Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)] (SDR (a-HVR) 그라프팅 기재); [Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)] ("재표면화" 기재); [Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)] ("FR 셔플링" 기재); 및 [Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)] (FR 셔플링에 대한 "가이드 선택" 접근법 기재)에 추가로 기재되어 있다.
인간화에 사용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 "최적-적합" 방법을 사용하여 선택된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)] 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정한 하위군의 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)] 참조); 인간 성숙 (체세포 성숙) 프레임워크 영역 또는 인간 배선 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)] 참조); 및 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유래된 프레임워크 영역 (예를 들어, 문헌 [Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)] 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
인간 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 관련 기술분야의 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 문헌 [van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 시험투여에 반응하여 인간 가변 영역을 갖는 무손상 인간 항체 또는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 트랜스제닉 동물에게 면역원을 투여하여 제조될 수 있다. 이러한 동물은 전형적으로 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌를 대체하거나, 또는 염색체외에 존재하거나 또는 동물의 염색체로 무작위로 통합된 인간 이뮤노글로불린 유전자좌의 전부 또는 일부를 함유한다. 이러한 트랜스제닉 마우스에서, 내인성 이뮤노글로불린 유전자좌는 일반적으로 불활성화되었다. 트랜스제닉 동물로부터 인간 항체를 수득하는 방법의 검토를 위해, 문헌 [Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)]을 참조한다. 또한, 예를 들어 미국 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584 (제노마우스(XENOMOUSE)™ 기술 기재); 미국 특허 번호 5,770,429 (HuMab® 기술 기재); 미국 특허 번호 7,041,870 (K-M 마우스(K-M MOUSE)® 기술 기재), 및 미국 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900 (벨로시마우스(VelociMouse)® 기술 기재)을 참조한다. 이러한 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터의 인간 가변 영역은, 예를 들어 상이한 인간 불변 영역과 조합시켜 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한 하이브리도마-기반 방법에 의해 제조될 수 있다. 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 기재되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991)] 참조.) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통해 생성된 인간 항체는 또한 문헌 [Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)]에 기재되어 있다. 추가의 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터의 모노클로날 인간 IgM 항체의 생산 기재) 및 문헌 [Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006)] (인간-인간 하이브리도마 기재)에 기재된 것을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (트리오마(Trioma) 기술)은 또한 문헌 [Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)]에 기재되어 있다.
인간 항체는 또한 인간-유래 파지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변 도메인 서열을 단리하여 생성될 수 있다. 이어서, 이러한 가변 도메인 서열은 바람직한 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 하기 기재된다.
라이브러리-유래 항체
본 발명의 항체는 원하는 활성을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 스크리닝하여 단리될 수 있다. 예를 들어, 파지 디스플레이 라이브러리를 생성하고, 원하는 결합 특성을 갖는 항체에 대해 이러한 라이브러리를 스크리닝하는 다양한 방법이 관련 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]에 검토되어 있고, 예를 들어 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552-554; Clackson et al., Nature 352: 624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1992); Marks and Bradbury, in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338(2): 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340(5): 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101(34): 12467-12472 (2004); 및 Lee et al., J. Immunol. Methods 284(1-2): 119-132(2004)]에 추가로 기재되어 있다.
특정 파지 디스플레이 방법에서, VH 및 VL 유전자의 레퍼토리는 개별적으로 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 클로닝되고, 파지 라이브러리에 무작위로 재조합되며, 이는 이어서 문헌 [Winter et al., Ann. Rev. Immunol., 12: 433-455 (1994)]에 기재된 바와 같이 항원-결합 파지에 대해 스크리닝될 수 있다. 파지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv (sFv) 단편 또는 Fab 단편으로 디스플레이한다. 면역화된 공급원으로부터의 라이브러리는 하이브리도마를 구축할 필요 없이 면역원에 대한 고-친화도 항체를 제공한다.
대안적으로, 나이브 레퍼토리를 클로닝 (예를 들어, 인간으로부터)하여, 문헌 [Griffiths et al., EMBO J, 12: 725-734 (1993)]에 기재된 바와 같이 어떠한 면역화도 없이 광범위한 비-자기 및 또한 자기 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공할 수 있다. 최종적으로, 문헌 [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227: 381-388 (1992)]에 기재된 바와 같이, 줄기 세포로부터의 재배열되지 않은 V-유전자 절편을 클로닝하고, 고도로 가변성인 CDR3 영역을 코딩하며 시험관내 재배열이 달성되도록 무작위 서열을 함유하는 PCR 프라이머를 사용함으로써, 나이브 라이브러리를 또한 합성적으로 제조할 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 기재하고 있는 특허 공개는, 예를 들어 미국 특허 번호 5,750,373, 및 미국 특허 공개 번호 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936, 및 2009/0002360을 포함한다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편으로 여겨진다.
다중특이적 항체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들어 이중특이적 항체이다. 다중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 부위에 대해 결합 특이성을 갖는 모노클로날 항체이다. 특정 실시양태에서, 결합 특이성 중 하나는 CRTh2에 대한 것이고, 다른 것은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 특정 실시양태에서, 이중특이적 항체는 CRTh2의 2개의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 이중특이적 항체는 또한 CRTh2를 발현하는 세포에 세포독성제를 국재화시키는데 사용될 수 있다. 이중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 제조하기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공-발현 (문헌 [Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)] 참조), 및 "노브-인-홀(knob-in-hole)" 조작 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,731,168 참조)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다중특이적 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 제조하기 위한 정전기 스티어링 효과의 조작 (WO 2009/089004A1); 2개 이상의 항체 또는 단편의 가교 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,676,980, 및 문헌 [Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)] 참조); 이중특이적 항체를 생산하기 위한 류신 지퍼의 사용 (예를 들어, 문헌 [Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)] 참조); 이중특이적 항체 단편의 제조를 위한 "디아바디" 기술의 사용 (예를 들어, 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)] 참조); 및 단일-쇄 Fv (scFv) 이량체의 사용 (예를 들어, 문헌 [Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)] 참조); 및 예를 들어 문헌 [Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)]에 기재된 바와 같은 삼중특이적 항체의 제조에 의해 제조될 수 있다.
"옥토퍼스 항체"를 비롯한, 3개 이상의 기능적 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체가 또한 본원에 포함된다 (예를 들어, US 2006/0025576A1 참조).
본원의 항체 또는 단편은 또한 CRTh2 뿐만 아니라 또 다른 상이한 항원에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (예를 들어, US 2008/0069820 참조).
항체 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 고려된다. 예를 들어, 항체의 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 항체를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에 적절한 변형을 도입하거나 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들어 항체의 아미노산 서열 내 잔기의 결실 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구축물이 원하는 특성, 예를 들어 항원-결합을 보유하도록, 최종 구축물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 이루어질 수 있다.
치환, 삽입 및 결실 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위는 HVR 및 FR을 포함한다. 보존적 치환은 "보존적 치환"의 표제 하에 표 1에 제시된다. 보다 더 실질적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제 하에 표 1에 아미노산 측쇄 부류에 관하여 하기 추가로 기재된 바와 같이 제공된다. 아미노산 치환은 관심 항체에 도입되고, 생성물은 원하는 활성, 예를 들어 유지/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대해 스크리닝될 수 있다.
<표 1>
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아미노산은 공통적인 측쇄 특성에 따라 분류될 수 있다:
a. 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
b. 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
c. 산성: Asp, Glu;
d. 염기성: His, Lys, Arg;
e. 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: Gly, Pro;
f. 방향족 : Trp, Tyr, Phe.
비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또 다른 부류로 교환하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 모 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 1개 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택된 생성된 변이체(들)는 모 항체에 비해 특정 생물학적 특성 (예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형 (예를 들어, 개선)을 가질 것이고/거나 모 항체의 특정 생물학적 특성을 실질적으로 유지할 것이다. 예시적인 치환 변이체는, 예를 들어 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이-기반 친화도 성숙 기술을 이용하여 편리하게 생성될 수 있는 친화도 성숙 항체이다. 간략하게, 1개 이상의 HVR 잔기가 돌연변이화되고, 변이체 항체가 파지 상에 디스플레이되고, 특정한 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화도)에 대해 스크리닝된다.
변경 (예를 들어, 치환)은, 예를 들어 항체 친화도를 개선시키기 위해 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟", 즉 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이화를 겪은 코돈에 의해 코딩되는 잔기 (예를 들어, 문헌 [Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)] 참조), 및/또는 SDR (a-CDR)에서 이루어질 수 있으며, 이때 생성된 변이체 VH 또는 VL가 결합 친화도에 대해 시험된다. 2차 라이브러리로부터의 구축 및 재선택에 의한 친화도 성숙은, 예를 들어 문헌 [Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)]에 기재되었다. 친화도 성숙의 일부 실시양태에서에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 오류-유발 PCR, 쇄 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의한 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내로 도입된다. 이어서, 2차 라이브러리가 생성된다. 이어서, 원하는 친화도를 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하게 위해 라이브러리가 스크리닝된다. 다양성을 도입하는 다른 방법은 HVR-유도된 접근법과 연관되며, 여기서 여러 HVR 잔기 (예를 들어, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합과 연관된 HVR 잔기는, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
특정 실시양태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이러한 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실질적으로 감소시키지 않는 한, 하나 이상의 HVR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들어, 결합 친화도를 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예를 들어, 본원에 제공된 바와 같은 보존적 치환)이 HVR에서 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 HVR "핫스팟" 또는 SDR의 외부일 수 있다. 상기 제공된 변이체 VH 및 VL 서열의 특정 실시양태에서, 각각의 HVR은 변경되지 않거나, 또는 1, 2 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 함유한다.
문헌 [Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085]에 기재된 바와 같이, 돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인에 유용한 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 지칭된다. 이 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기들의 군이 확인되고 (예를 들어, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu), 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어 항체와 항원과의 상호작용에 영향을 미치는지의 여부를 결정한다. 추가의 치환은 초기 치환에 대한 기능적 감수성을 입증하는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 항체와 항원 사이의 접촉점을 확인하기 위해 항원-항체 복합체의 결정 구조. 이러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 치환을 위한 후보로 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 함유하는지의 여부를 결정하기 위해 스크리닝될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 길이 범위가 1개의 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 효소 (예를 들어, ADEPT의 경우) 또는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드가 상기 항체의 N- 또는 C-말단에 융합된 것을 포함한다.
글리코실화 변이체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도를 증가시키거나 또는 감소시키도록 변경된다. 항체에 대한 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 생성되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 이에 부착된 탄수화물이 변경될 수 있다. 포유동물 세포에 의해 생산된 천연 항체는 전형적으로 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에의 N-연결에 의해 일반적으로 부착되는 분지형 이중안테나 올리고사카라이드를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)]을 참조한다. 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예를 들어 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스 및 시알산 뿐만 아니라 이중안테나 올리고사카라이드 구조의 "줄기" 내의 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 항체 내의 올리고사카라이드의 변형은 특정 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 제조하기 위해 이루어질 수 있다.
한 실시양태에서, Fc 영역에 부착된 탄수화물 구조에서 푸코스가 감소되었거나 결핍된 Fc 영역을 포함하며, ADCC 기능을 개선시킬 수 있는 항체 변이체가 제공된다. 구체적으로, 야생형 CHO 세포에서 생산된 동일한 항체 상의 푸코스의 양과 비교하여 푸코스가 감소된 항체가 본원에서 고려된다. 즉, 이들은 천연 CHO 세포 (예를 들어, 천연 글리코실화 패턴을 생산하는 CHO 세포, 예컨대 천연 FUT8 유전자를 함유하는 CHO 세포)에 의해 생산된 경우에 이들이 달리 가질 수 있는 것보다 더 낮은 양의 푸코스를 갖는 것을 특징으로 한다. 특정 실시양태에서, 항체는 그 상의 N-연결 글리칸의 약 50%, 40%, 30%, 20%, 10% 또는 5% 미만이 푸코스를 포함하는 것이다. 예를 들어, 이러한 항체에서 푸코스의 양은 1% 내지 80%, 1% 내지 65%, 5% 내지 65% 또는 20% 내지 40%일 수 있다. 특정 실시양태에서, 항체는 그 상의 N-연결 글리칸 중 어느 것도 푸코스를 포함하지 않는 항체이며, 즉 항체는 완전히 푸코스가 없거나, 또는 푸코스를 전혀 갖지 않거나, 또는 비-푸코실화된다. 푸코스의 양은, 예를 들어 WO 2008/077546에 기재된 바와 같이 MALDI-TOF 질량 분광측정법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 당구조물 (예를 들어, 복합체, 하이브리드 및 고만노스 구조물)의 합에 비해 Asn297에서 당 쇄 내의 푸코스의 평균적인 양을 계산하여 결정된다. Asn297은 Fc 영역의 약 위치 297 (Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 나타내지만; Asn297은 또한 항체의 부수적 서열 변이에 의해 위치 297의 약 ± 3 아미노산 상류 또는 하류, 즉 위치 294과 300 사이에 위치할 수 있다. 이러한 푸코실화 변이체는 개선된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 공개 번호 US 2003/0157108 (Presta, L.); US 2004/0093621 (교와 핫코 고교 캄파니, 리미티드(Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd))을 참조한다. "탈푸코실화" 또는 "푸코스-결핍" 항체 변이체에 대한 문헌의 예는 하기를 포함한다: US 2003/0157108; WO 2000/61739; WO 2001/29246; US 2003/0115614; US 2002/0164328; US 2004/0093621; US 2004/0132140; US 2004/0110704; US 2004/0110282; US 2004/0109865; WO 2003/085119; WO 2003/084570; WO 2005/035586; WO 2005/035778; WO2005/053742; WO2002/031140; Okazaki et al. J. Mol. Biol. 336:1239-1249 (2004); 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004)]. 탈푸코실화 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (문헌 [Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)]; 미국 특허 출원 번호 US 2003/0157108 A1 (Presta, L); 및 WO 2004/056312 A1 (Adams et al., 특히 실시예 11)), 및 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, 문헌 [Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)]; 및 WO2003/085107 참조)를 포함한다.
이등분된 올리고사카라이드를 갖는 항체 변이체가 추가로 제공되며, 예를 들어 항체의 Fc 영역에 부착된 이중안테나 올리고사카라이드가 GlcNAc에 의해 이등분된다. 이러한 항체 변이체는 푸코실화가 감소될 수 있고/거나 ADCC 기능이 개선될 수 있다. 이러한 항체 변이체의 예는, 예를 들어 WO 2003/011878 (Jean-Mairet et al.); 미국 특허 번호 6,602,684 (Umana et al.); US 2005/0123546 (Umana et al.), 및 문헌 [Ferrara et al., Biotechnology and Bioengineering, 93(5): 851-861 (2006)]에 기재되어 있다. Fc 영역에 부착된 올리고사카라이드 내에 적어도 1개의 갈락토스 잔기를 갖는 항체 변이체가 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체는 개선된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이러한 항체 변이체는, 예를 들어 WO 1997/30087 (Patel et al.); WO 1998/58964 (Raju, S.); 및 WO 1999/22764 (Raju, S.)에 기재되어 있다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 Fc 영역을 포함하는 항체 변이체는 FcγRIII에 결합할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 Fc 영역을 포함하는 항체 변이체는 인간 이펙터 세포의 존재 하에 ADCC 활성을 갖거나 또는 인간 야생형 IgG1Fc 영역을 포함하는 달리 동일한 항체와 비교하여 인간 이펙터 세포의 존재 하에 증가된 ADCC 활성을 갖는다.
Fc 영역 변이체
특정 실시양태에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역에 도입되어 Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은, 항체의 생체내 반감기는 중요하지만 특정 이펙터 기능 (예컨대, 보체 및 ADCC)은 불필요하거나 해로운 적용에 대해 바람직한 후보가 되도록 하는 일부 이펙터 기능 (모든 이펙터 기능은 아님)을 보유하는 항체 변이체를 고려한다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정을 수행할 수 있다. 예를 들어, 항체에 FcγR 결합이 결핍되어 있지만 (따라서, 아마도 ADCC 활성이 결핍될 것임), FcRn 결합 능력은 보유하고 있는 것을 확인하기 위해서 Fc 수용체 (FcR) 결합 검정을 수행할 수 있다. ADCC를 매개하는 1차 세포인 NK 세포는 FcγRIII만을 발현하는 반면에, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서의 FcR 발현은 문헌 [Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)]의 페이지 464, 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 비제한적 예는 미국 특허 번호 5,500,362 (예를 들어, 문헌 [Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)]; 5,821,337 (문헌 [Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)] 참조)에 기재되어 있다. 대안적으로, 비-방사성 검정 방법을 사용할 수 있다 (예를 들어, 유동 세포측정법을 위한 악티(ACTI)™ 비-방사성 세포독성 검정 (셀테크놀로지, 인크.(CellTechnology, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰); 및 시토톡스(CytoTox) 96® 비-방사성 세포독성 검정 (프로메가(Promega), 위스콘신주 매디슨) 참조). 이러한 검정에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안적으로 또는 추가로, 관심 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 문헌 [Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)]에 개시된 것과 같은 동물 모델에서 평가할 수 있다. 또한, C1q 결합 검정을 수행하여, 항체가 C1q에 결합할 수 없고 따라서 CDC 활성이 결핍되었는지를 확인할 수 있다. 예를 들어, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서의 C1q 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)] 참조). FcRn 결합 및 생체내 클리어런스/반감기 결정을 또한 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)] 참조).
감소된 이펙터 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 이상의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 6,737,056). 이러한 Fc 돌연변이체는 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 2개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체 (잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는, 소위 "DANA" Fc 돌연변이체 포함)를 포함한다 (미국 특허 번호 7,332,581).
FcR에 대해 개선되거나 또는 감소된 결합을 갖는 특정 항체 변이체가 기재된다. (예를 들어, 미국 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 및 문헌 [Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)] 참조.)
특정 실시양태에서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들어 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 예시적 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 그의 Fc 영역에 하기 아미노산 치환을 포함한다: S298A, E333A 및 K334A.
일부 실시양태에서, 예를 들어 미국 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642, 및 문헌 [Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)]에 기재된 바와 같이, 변경된 (즉, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 생성하는 변경들이 Fc 영역에서 만들어진다.
증가된 반감기, 및 모체 IgG를 태아에게 전달하는 것을 담당하는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 개선된 결합 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))을 갖는 항체가 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에 기재되어 있다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이러한 Fc 변이체는 Fc 영역 잔기: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서의 치환, 예를 들어 Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것을 포함한다 (미국 특허 번호 7,371,826).
Fc 영역 변이체의 다른 예에 관하여 또한 문헌 [Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)]; 미국 특허 번호 5,648,260; 미국 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 참조한다.
시스테인 조작된 항체 변이체
특정 실시양태에서, 항체의 1개 이상의 잔기를 시스테인 잔기로 치환시킨 시스테인 조작된 항체, 예를 들어 "티오MAb"를 생성하는 것이 바람직할 수 있다. 특정한 실시양태에서, 이와 같이 치환된 잔기는 항체의 접근가능한 부위에서 일어난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써 반응성 티올 기가 항체의 접근가능한 부위에 배치되게 되고, 이것을 사용하여 항체를 본원에 추가로 기재한 바와 같이 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합시켜 면역접합체를 생성할 수 있다. 특정 실시양태에서, 하기 잔기 중 어느 하나 이상이 시스테인으로 치환될 수 있다: 경쇄의 V205 (카바트 넘버링); 중쇄의 A118 (EU 넘버링); 및 중쇄 Fc 영역의 S400 (EU 넘버링). 시스테인 조작된 항체는, 예를 들어 미국 특허 번호 7,521,541에 기재된 바와 같이 생성될 수 있다.
항체 유도체
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 항체는 관련 기술분야에 공지되고 용이하게 입수가능한 추가의 비단백질성 잔기를 함유하도록 추가로 변형될 수 있다. 항체의 유도체화에 적합한 모이어티는 수용성 중합체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 수용성 중합체의 비제한적 예는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1,3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트리옥산, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산 (단독중합체 또는 랜덤 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 단독중합체, 폴리프로필렌 옥시드/에틸렌 옥시드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올 (예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 그의 혼합물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데히드가 물에서의 안정성으로 인해 제조에 이점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량을 가질 수 있고, 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 항체에 부착된 중합체의 수는 변할 수 있고, 하나 초과의 중합체가 부착될 경우, 중합체들은 동일하거나 상이한 분자일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 사용되는 중합체의 수 및/또는 유형은 개선될 항체의 특정한 특성 또는 기능, 항체 유도체가 규정된 조건 하에 요법에서 사용될 것인지의 여부 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는 고려사항을 기반으로 결정될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 항체, 및 방사선 노출에 의해 선택적으로 가열될 수 있는 비단백질성 모이어티의 접합체가 제공된다. 한 실시양태에서, 비단백질성 모이어티는 탄소 나노튜브이다 (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). 방사선은 임의의 파장일 수 있고, 통상적인 세포에는 해를 끼치지 않지만 항체-비단백질성 모이어티에 근접한 세포는 사멸시키는 온도로 비단백질성 모이어티를 가열하는 파장을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
재조합 방법 및 조성물
항체는 예를 들어 미국 특허 번호 4,816,567에 기재된 바와 같은 재조합 방법 및 조성물을 사용하여 생산할 수 있다. 한 실시양태에서, 본원에 기재된 항-CRTh2 항체를 코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 이러한 핵산은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들어, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄)을 코딩할 수 있다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 하나 이상의 벡터 (예를 들어, 발현 벡터)가 제공된다. 추가 실시양태에서, 이러한 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 한 이러한 실시양태에서, 숙주 세포는를 다음을 포함한다 (예를 들어, 다음으로 형질감염된다): (1) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터, 또는 (2) 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 벡터 및 항체의 VH를 포함하는 아미노산 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 제2 벡터. 한 실시양태에서, 숙주 세포는 진핵생물의 것, 예를 들어 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프성 세포 (예를 들어, Y0, NS0, Sp20 세포)이다. 한 실시양태에서, 상기 제공된 바와 같은 항-CRTh2 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건 하에 배양하는 것, 및 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 상기 항체를 임의로 회수하는 것을 포함하는, 항-CRTh2 항체를 제조하는 방법이 제공된다.
항-CRTh2 항체의 재조합 생산을 위해, 예를 들어 상기 기재된 바와 같은 항체를 코딩하는 핵산을 단리하고, 추가의 클로닝 및/또는 숙주 세포에서의 발현을 위해 하나 이상의 벡터에 삽입한다. 이러한 핵산은 통상적인 절차를 사용하여 용이하게 단리하고 서열분석할 수 있다 (예를 들어, 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하는 것에 의함).
항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 발현에 적합한 숙주 세포는 본원에 기재된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들어, 특히 글리코실화 및 Fc 이펙터 기능이 필요하지 않을 경우에, 항체를 박테리아에서 생산할 수 있다. 박테리아에서의 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들어 미국 특허 번호 5,648,237, 5,789,199, 및 5,840,523을 참조한다. (또한, 문헌 [Charlton, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ, 2003), pp. 245-254] (이. 콜라이에서의 항체 단편의 발현 기재) 참조.) 발현 후에, 항체를 가용성 분획에서 박테리아 세포 페이스트로부터 단리할 수 있고, 추가로 정제할 수 있다.
원핵생물 뿐만 아니라, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어 부분 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체를 생산하도록 하는 진균 및 효모 균주를 비롯한 사상 진균 또는 효모가 항체-코딩 벡터의 클로닝 또는 숙주 발현에 적합하다. 문헌 [Gerngross, Nat. Biotech. 22:1409-1414 (2004), 및 Li et al., Nat. Biotech. 24:210-215 (2006)]을 참조한다.
글리코실화 항체의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포를 포함한다. 다수의 바큘로바이러스 균주가 곤충 세포와 함께, 특히 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염에 사용될 수 있는 것으로 확인되었다.
식물 세포 배양물을 또한 숙주로서 이용할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,959,177, 6,040,498, 6,420,548, 7,125,978, 및 6,417,429 (트랜스제닉 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES)™ 기술 기재)를 참조한다.
척추동물 세포를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 예를 들어, 현탁액 중에서 성장시키는데 적합한 포유동물 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40에 의해 형질전환시킨 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 태아 신장 세포주 (예를 들어 문헌 [Graham et al., J. Gen Virol. 36:59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293 세포); 새끼 햄스터 신장세포 (BHK); 마우스 세르톨리 세포 (예를 들어 문헌 [Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 자궁경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 마우스 유방 종양 (MMT 060562); 예를 들어 문헌 [Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)]에 기재된 바와 같은 TRI 세포; MRC 5 세포; 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포, 예를 들어 DHFR- CHO 세포 (Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주의 검토를 위해, 예를 들어 문헌 [Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다.
검정
본원에 제공된 항-CRTh2 항체는 관련 기술분야에 공지된 다양한 검정에 의해 확인되거나, 스크리닝되거나, 또는 그의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 특성화될 수 있다.
결합 검정 및 기타 검정
한 측면에서, 본 발명의 항체는, 예를 들어 ELISA, 웨스턴 블롯 등과 같은 공지된 방법으로 그의 항원 결합 활성에 대해 시험된다.
또 다른 측면에서, 경쟁 검정을 사용하여, CRTh2에의 결합에 대해 뮤린 항체 8B1, 3C12, 31A5 및 19A2, 및 인간화 항체 hu19A2 (v1, v12, v38, v46, v47, v51-v53, v57, v58, 및 v60-v72 포함)과 경쟁하는 항체를 확인할 수 있다. 특정 실시양태에서, 이러한 경쟁 항체는 뮤린 항체 8B1, 3C12, 31A5 및 19A2, 및 인간화 항체 hu19A2 (v1, v12, v38, v46, v47, v51-v53, v57, v58, 및 v60-v72 포함)에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들어, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프의 맵핑에 대한 상세한 예시적인 방법은 문헌 [Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols," in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)]에서 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 세포 표면 상에 고정화된 CRTh2 또는 CRTh2 발현 세포를, CRTh2에 결합하는 제1 표지된 항체 (예를 들어, 인간 또는 비-인간 영장류) 및 CRTh2에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁하는 그의 능력에 대해 시험되는 제2 비표지된 항체를 포함하는 용액 중에서 인큐베이션한다. 제2 항체는 하이브리도마 상청액 중에 존재할 수 있다. 대조군으로서, 고정화된 CRTh2 또는 CRTh2 발현 세포를, 제1 표지된 항체를 포함하나 제2 비표지된 항체는 포함하지 않는 용액에서 인큐베이션한다. CRTh2에 대한 제1 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 인큐베이션한 후에, 과량의 미결합 항체를 제거하고, 고정화된 CRTh2 또는 CRTh2 발현 세포와 연관된 표지의 양을 측정한다. 고정화된 CRTh2 또는 CRTh2 발현 세포와 연관된 표지의 양이 대조군 샘플에 비해 시험 샘플에서 실질적으로 감소된 경우에, 이는 제2 항체가 CRTh2에의 결합에 대해 제1 항체와 경쟁한다는 것을 나타낸다. 문헌 [Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)]을 참조한다.
활성 검정
관련 기술분야에 공지되어 있고 본원 (예를 들어, 실시예 1)에 기재된 검정이 항-CRTh2 항체의 생물학적 활성을 확인하고 시험하는데 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, CRTh2 발현 세포 (예를 들어, Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및/또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포)를 고갈시키는 항-CRTh2 항체를 시험하기 위한 검정이 제공된다. 생물학적 활성에 대한 예시적인 시험은, 예를 들어 면역 세포, 예컨대 호염기구 및 호산구 상에 인간 CRTh2를 발현하는 트랜스제닉 마우스를 제공하고, 이러한 트랜스제닉 마우스에게 항-CRTh2 항체를 투여하고, 마우스의 혈액 또는 조직에서 인간 CRTh2-양성 세포의 수준 (예를 들어, 수 또는 백분율) 또는 마우스의 혈액 또는 조직에서 CRTh2를 발현하는 것으로 공지된 세포 유형의 수준 (예를 들어, 수 또는 백분율)을 측정하는 것을 포함할 수 있다. 또 다른 예시적인 시험은, 예를 들어 인간 CRTh2를 발현하는 마우스를 제공하고, 이러한 마우스를 공지된 방법을 사용하여 TNP-OVA로 감작화/시험투여하고, 이어서 항-CRTh2 항체를 투여하는 것을 포함할 수 있다.
TNP-OVA 시험투여된 마우스 폐 조직, 혈액, BAL 및 BALF는 CRTh2-양성 세포의 존재 또는 CRTh2를 발현하는 것으로 공지된 세포 유형의 존재에 대해 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, Th2 시토카인 생산 세포가 항-CRTh2 항체에 의해 고갈되는 것을 검출하기 위한 검정이 제공된다. 예를 들어, 시험관내 분극화된 인간 Th2 세포를 SCID 마우스에 복강내로 주사할 수 있고, 항-CRTh2 항체를 상기 마우스에게 투여한다. 시토카인 생산 세포의 수준은 PMA 및 이오노마이신에 의한 생체외 자극 후에 평가될 수 있다. 일부 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는 임의의 이들 검정에서 CRTh2 발현 세포를 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 중 어느 하나의 비율로 고갈시킬 수 있다.
CRTh2 신호전달을 차단하는 항-CRTh2 항체를 시험하기 위한 검정이 또한 제공된다. CRTh2 신호전달을 평가하기 위한 예시적인 방법은 CRTh2-양성 세포를 제공하고, 이러한 세포를 항-CRTh2 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서 리간드, 예컨대 PGD2에 의해 자극시키고 (포르스콜린의 존재 또는 부재 하에), 최종적으로 관련 기술분야에 공지된 임의의 방법에 의해 세포내 cAMP 또는 Ca2 + 함량의 변화를 측정하는 것을 포함할 수 있다.
TNP-OVA, 파파인 또는 프로스타글란딘 D2에 반응한 CRTh2 발현 세포의 동원을 방지하는 항-CRTh2 항체를 시험하기 위한 검정이 또한 제공된다. PGD2에 반응한 CRTh2-발현 세포의 동원에 대한 예시적인 시험은 항-CRTh2 항체의 존재 또는 부재 하에 면역 세포 (예컨대 호염기구 및 호산구) 상에 인간 CRTh2를 발현하는 트랜스제닉 마우스의 기도 내로 PGD2를 투여하고, 폐 조직 및 기관지 폐포 세척액 내로 CRTh2-양성 세포의 후속 유입을 평가하는 것을 포함할 수 있다. 평가는 CRTh2에 대해 절제된 조직을 염색하고, 유동 세포측정법 또는 관련 기술분야에 공지된 임의의 다른 방법을 통해 세포 유입을 결정하는 것을 포함하는 수많은 방법으로 달성될 수 있다.
CRTh2 발현 세포에서 Ca2 + 유동을 차단하는 항-CRTh2 항체를 시험하기 위한 검정이 또한 제공된다. 예시적인 시험은 indo-1/AM 염료 및 항-CRTh2 모노클로날 항체와 함께 인큐베이션 한 후에, 리간드, 예컨대 PGD2에 반응하는 Ca2 + 유동에 대한 세포를 유동 세포측정법을 사용하여 모니터링하는 것을 포함할 수 있다.
면역접합체
본 발명은 또한 하나 이상의 세포독성제, 예컨대 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소 (예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적 활성 독소 또는 그의 단편) 또는 방사성 동위원소에 접합된 본원의 항-CRTh2항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 실시양태에서, 면역접합체는 항체가 메이탄시노이드 (미국 특허 번호 5,208,020, 5,416,064 및 유럽 특허 EP 0 425 235 B1 참조); 아우리스타틴, 예컨대 모노메틸아우리스타틴 약물 모이어티 DE 및 DF (MMAE 및 MMAF) (미국 특허 번호 5,635,483 및 5,780,588, 및 7,498,298 참조); 돌라스타틴; 칼리케아미신 또는 그의 유도체 (미국 특허 번호 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001 및 5,877,296; 문헌 [Hinman et al., Cancer Res. 53:3336-3342 (1993); 및 Lode et al., Cancer Res. 58:2925-2928 (1998)] 참조); 안트라시클린, 예컨대 다우노마이신 또는 독소루비신 (Kratz et al., Current Med. Chem. 13:477-523 (2006); Jeffrey et al., Bioorganic & Med. Chem. Letters 16:358-362 (2006); Torgov et al., Bioconj. Chem. 16:717-721 (2005); Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:829-834 (2000); Dubowchik et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12:1529-1532 (2002); King et al., J. Med. Chem. 45:4336-4343 (2002); 및 미국 특허 번호 6,630,579 참조); 메토트렉세이트; 빈데신; 탁산, 예컨대 도세탁셀, 파클리탁셀, 라로탁셀, 테세탁셀 및 오르타탁셀; 트리코테센; 및 CC1065를 포함하나 이에 제한되지는 않는 하나 이상 약물에 접합된 항체-약물 접합체 (ADC)이다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하나 이에 제한되지는 않는 효소적 활성 독소 또는 그의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 면역접합체는 방사성접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 이용가능하다. 그 예는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 면역접합체는 검출용으로 사용되는 경우에, 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들어 tc99m 또는 I123을 포함하거나, 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상화, mri로도 공지됨)용 스핀 표지, 예컨대 아이오딘-123, 아이오딘-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망가니즈 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성제의 접합체는 다양한 이관능성 단백질 커플링제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오린 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드를 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트화제이다. WO94/11026을 참조한다. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들어, 산-불안정성 링커, 펩티다제-감수성 링커, 광불안정성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (문헌 [Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)]; 미국 특허 번호 5,208,020)가 사용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 입수가능한 (예를 들어, 피어스 바이오테크놀로지, 인크.(Pierce Biotechnology, Inc.; 미국 일리노이주 록포드)로부터의) 가교-링커 시약 (BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 및 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하나 이에 제한되지는 않음)으로 제조된 이러한 접합체를 명백하게 고려하나 이에 제한되지는 않는다.
진단 및 검출을 위한 방법 및 조성물
특정 실시양태에서, 본원에 제공된 임의의 항-CRTh2 항체는 생물학적 샘플 내의 CRTh2 의 존재를 검출하는데 유용하다. 본원에 사용된 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 특정 실시양태에서, 생물학적 샘플은 세포 또는 조직, 예컨대 Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포를 포함한다.
한 실시양태에서, 진단 또는 검출 방법에 사용하기 위한 항-CRTh2 항체가 제공된다. 추가 측면에서, 생물학적 샘플 내의 CRTh2의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 특정 실시양태에서, 방법은 생물학적 샘플을 CRTh2에 대한 항-CRTh2 항체의 결합을 허용하는 조건 하에서 본원에 기재된 바와 같은 항-CRTh2 항체와 접촉시키고, 항-CRTh2 항체와 CRTh2 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 것을 포함한다. 이러한 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 한 실시양태에서, 항-CRTh2 항체는, 예를 들어 CRTh2가 환자의 선택을 위한 바이오마커인 경우에 항-CRTh2 항체를 사용하는 요법에 적격인 대상체를 선택하는데 사용된다.
본 발명의 항체를 사용하여 진단될 수 있는 예시적인 장애는 천식, 소수 과립구성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 급성 또는 만성 기도 과민증, 과다호산구증가증성 증후군, 호산구성 식도염, 처그-스트라우스 증후군, 특발성 폐 섬유증, 시토카인과 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 염증 또는 악성종양, 만성 특발성 두드러기, 만성 자발성 두드러기, 물리적 두드러기, 예를 들어 한랭 두드러기 및 압력-두드러기, 수포성 유천포창, 비강 폴립증, 식품 알레르기, 및 낭성 섬유증 동반 또는 비동반 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (ABPA)을 포함한다.
특정 실시양태에서, 표지된 항-CRTh2 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 발색, 전자-밀집, 화학발광 및 방사성 표지), 뿐만 아니라 간접적으로, 예를 들어 효소적 반응 또는 분자 상호작용을 통해 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 예시적인 표지는 방사성동위원소 32P, 14C, 125I, 3H, 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라제, 예를 들어 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제 (미국 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제, 예를 들어 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 염료 전구체를 산화시키기 위해 과산화수소를 사용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토퍼옥시다제 또는 마이크로퍼옥시다제와 커플링된 헤테로시클릭 옥시다제, 예컨대 우리카제 및 크산틴 옥시다제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정한 자유 라디칼 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
제약 제제
본원에 기재된 바와 같은 항-CRTh2 항체의 제약 제제는 원하는 정도의 순도를 갖는 상기 항체를 하나 이상의 임의의 제약상 허용되는 담체 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))와 혼합하여 동결건조 제제 또는 수용액의 형태로 제조한다. 제약상 허용되는 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 비독성이고, 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 기타 유기 산; 항산화제, 예를 들어 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 만노스 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염 형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들어, Zn-단백질 착물); 및/또는 비-이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에서 예시적인 제약상 허용되는 담체는 간질성 약물 분산액 작용제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다제 당단백질 (sHASEGP), 예를 들어 인간 가용성 PH-20 히알루로니다제 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (힐레넥스(HYLENEX)®, 백스터 인터내셔널, 인크.(Baxter International, Inc.))을 추가로 포함한다. rHuPH20을 포함하는, 특정 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법은 미국 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에 기재되어 있다. 한 측면에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나제, 예컨대 콘드로이티나제와 조합된다.
예시적인 동결건조 항체 제제는 미국 특허 번호 6,267,958에 기재되어 있다. 수성 항체 제제는 미국 특허 번호 6,171,586 및 WO2006/044908에 기재된 것을 포함하고, 후자의 제제는 히스티딘-아세테이트 완충제를 포함한다.
본원의 제제는 또한 치료할 특정한 적응증에 필요한 하나 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로 유해한 영향을 주지 않는 보완적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 하기를 추가로 제공하는 것이 바람직할 수 있다 (그러나 하기 제한되지는 않음): IL4 억제제 (예를 들어, AER-001, IL4/IL13 트랩, 또는 항-IL4 항체), IL5 억제제 (예를 들어, 메폴리주맙, CAS 번호 196078-29-2; 레실리주맙, 또는 또 다른 항-IL5 항체), IL9 억제제 (예를 들어, MEDI-528, 또는 또 다른 항-IL9 항체), IL13 억제제 (예를 들어, IMA-026, IMA-638 (또한 안루킨주맙으로 지칭됨, INN 번호 910649-32-0; QAX-576; IL4/IL13 트랩), 트랄로키누맙 (또한 CAT-354로 지칭됨, CAS 번호 1044515-88-9); AER-001, ABT-308 (또한 인간화 13C5.5 항체로 지칭됨), 또는 또 다른 항-IL13 항체), 항-IL17 항체, 항-IL25 항체, 항-IL33 항체, 항-TSLP 항체, 항-OX40L 항체, 항-OX40 항체, IL-4-수용체 알파 억제제 (예를 들어, AMG-317, AIR-645, 또는 또 다른 항-IL4Ra 항체), 항-IL5Ra 항체, 항-17RA 항체, 또는 항-CCR4 항체. 이러한 활성 성분은 의도된 목적에 유효한 양으로 조합되어 적합하게 존재한다.
활성 성분은 예를 들어 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로에멀젼에서 코아세르베이션 기술 또는 계면 중합에 의해 제조되는 마이크로캡슐, 예를 들어 각각 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 봉입될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 개시되어 있다.
지속-방출 제제가 제조될 수 있다. 지속-방출 제제의 적합한 예는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스를 포함하고, 이 매트릭스는 성형품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 일반적으로 멸균된다. 멸균은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다.
치료 방법 및 조성물
본원에 제공된 임의의 항-CRTh2 항체는 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 측면에서, 의약으로서 사용하기 위한 항-CRTh2 항체가 제공된다. 추가 측면에서, CRTh2에 의해 매개되는 장애를 치료하는데 사용하기 위한 항-CRTh2 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 치료 방법에 사용하기 위한 항-CRTh2 항체가 제공된다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 CRTh2에 의해 매개되는 장애를 갖는 개체에게 유효량의 항-CRTh2 항체를 투여하는 것을 포함하는 상기 개체의 치료 방법에 사용하기 위한 항-CRTh2 항체를 제공한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 장애는 천식, 소수 과립구성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 급성 또는 만성 기도 과민증, 과다호산구증가증성 증후군, 호산구성 식도염, 처그-스트라우스 증후군, 특발성 폐 섬유증, 시토카인과 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 염증 또는 악성종양, 만성 특발성 두드러기, 만성 자발성 두드러기, 물리적 두드러기, 예를 들어 한랭 두드러기 및 압력-두드러기, 수포성 유천포창, 비강 폴립증, 식품 알레르기, 및 낭성 섬유증 동반 또는 비동반 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (ABPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 CRTh2 발현 세포 (예를 들어, Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및/또는 선천성 유형 2(IT2) 세포)를 고갈시키거나 또는 개체에서 하나 이상의 시토카인, 효소 또는 다른 염증 매개물 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민, 트립타제 및/또는 류코트리엔)의 수준을 감소시키는데 사용하기 위한 항-CRTh2 항체를 제공한다. 일부 실시양태에서, 하기 세포 유형 중 적어도 하나에 의해 생산된 하나 이상의 시토카인이 감소된다: Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2(IT2) 세포. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에게 CRTh2 발현 세포를 고갈시키고/거나 하나 이상의 시토카인을 감소시키기 위한 유효량의 항-CRTh2 항체를 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 CRTh2 발현 세포 (예를 들어, Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및/또는 선천성 유형 2(IT2) 세포)를 고갈시키고/거나 개체에서의 하나 이상의 시토카인, 효소 또는 다른 염증 매개물 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민, 트립타제 및/또는 류코트리엔)의 수준을 감소시키는 방법에서 사용하기 위한 항-CRTh2 항체를 제공한다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 바람직하게는 인간이다.
추가 측면에서, 본 발명은 의약의 제작 또는 제조에 있어서 항-CRTh2 항체의 용도를 제공한다. 한 실시양태에서, 의약은 CRTh2에 의해 매개되는 장애의 치료를 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 CRTh2에 의해 매개되는 장애를 갖는 개체에게 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 상기 장애의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 장애는 천식, 소수 과립구성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 급성 또는 만성 기도 과민증, 과다호산구증가증성 증후군, 호산구성 식도염, 처그-스트라우스 증후군, 특발성 폐 섬유증, 시토카인과 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 염증 또는 악성종양, 만성 특발성 두드러기, 만성 자발성 두드러기, 물리적 두드러기, 예를 들어 한랭 두드러기 및 압력-두드러기, 수포성 유천포창, 비강 폴립증, 식품 알레르기, 및 낭성 섬유증 동반 또는 비동반 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (ABPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 추가 실시양태에서, 의약은 개체에서 CRTh2 발현 세포 (예를 들어, Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및/또는 선천성 유형 2(IT2) 세포)를 고갈시키고/거나 개체에서 하나 이상의 시토카인, 효소 또는 다른 염증 매개물 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민, 트립타제 및/또는 류코트리엔)의 수준을 감소시키기 위한 것이다. 추가 실시양태에서, 의약은 개체에게 CRTh2 발현 세포를 고갈시키고/거나 하나 이상의 시토카인을 감소시키기 위한 유효량의 의약을 투여하는 것을 포함하는 개체에서의 CRTh2 발현 세포 (예를 들어, Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및/또는 선천성 유형 2(IT2) 세포)를 고갈시키고/거나 개체에서의 하나 이상의 시토카인, 효소 또는 다른 염증 매개물 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민, 트립타제 및/또는 류코트리엔)의 수준을 감소시키는 방법에 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 CRTh2에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 이러한 장애를 갖는 개체에게 유효량의 항-CRTh2 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 이러한 실시양태에서, 방법은 개체에게 유효량의, 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 장애는 천식, 소수 과립구성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 급성 또는 만성 기도 과민증, 과다호산구증가증성 증후군, 호산구성 식도염, 처그-스트라우스 증후군, 특발성 폐 섬유증, 시토카인과 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 염증 또는 악성종양, 만성 특발성 두드러기, 만성 자발성 두드러기, 물리적 두드러기, 예를 들어 한랭 두드러기 및 압력-두드러기, 수포성 유천포창, 비강 폴립증, 식품 알레르기, 및 낭성 섬유증 동반 또는 비동반 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (ABPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 임의의 상기 실시양태에 따른 "개체"는 인간일 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 개체에서 CRTh2 발현 세포 (예를 들어, Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구, 및/또는 선천성 유형 2(IT2) 세포)를 고갈시키고/거나 개체에서 하나 이상의 시토카인, 효소 또는 다른 염증 매개물 (예를 들어, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민, 트립타제 및/또는 류코트리엔)의 수준을 감소시키는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 방법은 개체에게 CRTh2 발현 세포를 고갈시키고/거나 하나 이상의 시토카인을 감소시키기 위한 유효량의 항-CRTh2 항체를 투여하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, "개체"는 인간이다. 일부 실시양태에서, 개체는 천식, 소수 과립구성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 급성 또는 만성 기도 과민증, 과다호산구증가증성 증후군, 호산구성 식도염, 처그-스트라우스 증후군, 특발성 폐 섬유증, 시토카인과 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 염증 또는 악성종양, 만성 특발성 두드러기, 만성 자발성 두드러기, 물리적 두드러기, 예를 들어 한랭 두드러기 및 압력-두드러기, 수포성 유천포창, 비강 폴립증, 식품 알레르기, 및 낭성 섬유증 동반 또는 비동반 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (ABPA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 장애를 갖는다.
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 천식을 앓고 있는 개체를 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서 개체는 US 2012/0156194에 정의된 바와 같은 호산구성 염증 양성 (EIP)이다. 특정 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 천식을 앓고 있는 개체를 치료하는데 사용될 수 있으며, 여기서 개체는 US 2012/0156194에 정의된 바와 같은 호산구성 염증 음성 (EIN)이다. 또한, 문헌 [DF Choy et al., J Immunol. 186(3): 1861-9 (2011); Arron et al. (2013) Adv Pharmacol 66: 1-49; 및 G. Jia et al., J Allergy Clin Immunol. 130(3): 647-654 (2012)]을 참조한다.
특정 실시양태에서, 천식을 앓고 있는 환자는 총 혈청 또는 혈장 페리오스틴의 높은 수준을 나타낸다. 특정 실시양태에서, EIP 환자는 혈청 또는 혈장 페리오스틴 수준에 대해 시험된 환자를 지칭하며, 여기서 혈청 또는 혈장 페리오스틴 수준은 환자 집단의 중간 또는 평균 혈청 또는 혈장 페리오스틴 수준과 동일하거나 그보다 더 높다 (또한 높은 페리오스틴으로서 지칭될 수 있음). 특정 실시양태에서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 ELISA 또는 샌드위치 면역검정을 사용하여 혈청 또는 혈장 페리오스틴 수준에 대해 시험된 환자는 20 ng/ml 이상의 총 페리오스틴 수준을 가질 수 있다 (호산구성 양성). 특정 실시양태에 따르면, EIP인 환자에서의 총 페리오스틴 수준은 혈청 또는 혈장에서 21 ng/ml 이상, 22 ng/ml 이상, 23 ng/ml 이상, 24 ng/ml 이상, 25 ng/ml 이상, 26 ng/ml 이상, 27 ng/ml 이상, 28 ng/ml 이상, 29 ng/ml 이상, 30 ng/ml 이상, 31 ng/ml 이상, 32 ng/ml 이상, 33 ng/ml 이상, 34 ng/ml 이상, 35 ng/ml 이상, 36 ng/ml 이상, 37 ng/ml 이상, 38 ng/ml 이상, 39 ng/ml 이상, 40 ng/ml 이상, 41 ng/ml 이상, 42 ng/ml 이상, 43 ng/ml 이상, 44 ng/ml 이상, 45 ng/ml 이상, 46 ng/ml 이상, 47 ng/ml 이상, 48 ng/ml 이상, 49 ng/ml 이상, 50 ng/ml 이상, 51 ng/ml 이상, 52 ng/ml 이상, 53 ng/ml 이상, 54 ng/ml 이상, 55 ng/ml 이상, 56 ng/ml 이상, 57 ng/ml 이상, 58 ng/ml 이상, 59 ng/ml 이상, 60 ng/ml 이상, 61 ng/ml 이상, 62 ng/ml 이상, 63 ng/ml 이상, 64 ng/ml 이상, 65 ng/ml 이상, 66 ng/ml 이상, 67 ng/ml 이상, 68 ng/ml 이상, 69 ng/ml 이상 및 70 ng/ml 이상으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
특정 실시양태에서, 천식을 앓고 있는 환자는 총 혈청 또는 혈장 페리오스틴의 낮은 수준을 나타낸다. 특정 실시양태에서, EIN 환자는 혈청 또는 혈장 페리오스틴 수준에 대해 시험된 환자를 지칭하며, 여기서 혈청 또는 혈장 페리오스틴 수준은 20 ng/mL 미만이다.
EIP 스테이터스는 환자의 상태를 나타내며, 스테이터스를 결정하는데 사용된 검정의 유형에 좌우되지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 다른 호산구성 염증 진단 검정, 예를 들어 다른 페리오스틴 검정, 예컨대 ELISA 검정 및 엘렉시스(Elecsys)® 페리오스틴 검정 (US2012/0156194에 제시된 바와 같은 것)이 호산구성 염증 스테이터스를 시험하고 총 페리오스틴 수준을 측정하는데 사용되거나 또는 사용되도록 개발될 수 있다. 또한, 문헌 [Jia et al., 2012, J. Allergy Clin. Immunol. 130:647-654], 및 US2012/0156194 (이들은 그 전문이 본원에 참조로 포함됨)를 참조한다.
본원에 사용된 용어 "총 페리오스틴"은 적어도 페리오스틴의 이소형 1, 2, 3 및 4를 지칭한다. 인간 페리오스틴 이소형 1, 2, 3 및 4는 각각 NCBI 데이터베이스에 따른 하기 아미노산 서열: NP_006466 (서열 87); NP_001129406 (서열 88), NP_001129407 (서열 89), 및 NP_001129408 (서열 90)을 포함하는 것으로 관련 기술분야에 공지되어 있고, 이소형 5는 부분적으로 서열분석되었다. 이소형 5는 서열 91의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시양태에서, 페리오스틴의 이소형은 인간 페리오스틴이다. 추가 실시양태에서, 용어 총 페리오스틴은 이소형 1-4 뿐만 아니라 인간 페리오스틴의 이소형 5를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 총 페리오스틴은 총 혈청 페리오스틴 또는 총 혈장 페리오스틴 (즉, 각각 전혈로부터 수득된 혈청 샘플 또는 전혈로부터 수득된 혈장 샘플로부터의 총 페리오스틴, 전혈은 환자로부터 수득됨)이다.
일부 실시양태에서, 개체에게 투여된 항-CRTh2 항체는 개체에서 CRTh2 발현 세포를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 항체는 폐 조직 및/또는 기관지폐포 세척액으로부터 CRTh2 발현 세포를 고갈시킨다. 일부 실시양태에서, 개체에서 적어도 하나의 유형의 CRTh2 발현 세포 (예컨대 폐로부터의 것)는 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 중 어느 하나의 비율로 고갈된다. 일부 실시양태에서, 개체에서 적어도 하나의 유형의 시토카인 Th2 발현 세포 (예컨대 폐로부터의 것)는 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 및 100% 중 어느 하나의 비율로 고갈된다. 본원에 사용된 "기준선"은 개체에게 본원에 기재된 항-CRTh2 항체를 투여하기 전의 수준을 지칭한다. 항체의 투여 전 및 후의 CRTh2 발현 세포의 수준은 관련 기술분야에 공지된 및 본원에 기재된 방법을 사용하여 시험될 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에서 사용하기 위한 본원에 제공된 임의의 항-CRTh2 항체를 포함하는 제약 제제를 제공한다. 한 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-CRTh2 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 제약 제제는 본원에 제공된 임의의 항-CRTh2 항체 및 예를 들어 하기 기재된 바와 같은 하나 이상의 추가의 치료제를 포함한다.
본 발명의 항체는 요법에서 단독으로 또는 기타 작용제와 조합되어 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 하나 이상의 추가의 치료제와 공-투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 추가의 치료제는 흡입용 코르티코스테로이드, 단기 작용 β2 효능제, 장기 작용 β2 효능제, 장기 작용 무스카린성 효능제, 류코트리엔 수용체 길항제, 비만 세포 억제제 (예컨대, 예를 들어, 크로몰린), CRTh2 소분자 억제제, 또는 그의 조합이다.
상기 언급된 이러한 조합 요법은 조합 투여 (여기서 2종 이상의 치료제가 동일한 또는 개별 제제에 포함됨), 및 개별 투여를 포함하고, 이 경우에 본 발명의 항체의 투여는 추가의 치료제 및/또는 아주반트의 투여 전에, 그와 동시에 및/또는 그 후에 수행될 수 있다.
본 발명의 항체 (및 임의의 추가의 치료제)는 비경구, 폐내 및 비강내를 비롯한 임의의 적합한 수단에 의해 투여될 수 있고, 원하는 경우에 국부 치료를 위해 병변내 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여를 포함한다. 투여는 임의의 적합한 경로, 예를 들어 부분적으로는 투여가 단기적인지 장기적인지에 따라 정맥내 또는 피하 주사와 같은 주사에 의해 수행될 수 있다. 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 볼루스 투여 및 펄스 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 다양한 투여 스케줄이 본원에서 고려된다.
본 발명의 항체는 우수한 의료 행위와 일치하는 방식으로 제제화되고 투약되고 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려할 인자는 치료할 특정한 장애, 치료할 특정한 포유동물, 개별 환자의 임상 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 스케줄링, 및 진료의에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그럴 필요는 없지만, 임의로 해당 장애를 예방 또는 치료하는데 현재 사용되는 하나 이상의 작용제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 작용제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 좌우된다. 이는 일반적으로 상기 기재된 바와 동일한 투여량 및 투여 경로로, 또는 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량으로 및 임의의 경로에 의해 사용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위해, 본 발명의 항체의 적절한 투여량 (단독으로 또는 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 조합하여 사용되는 경우)은 치료할 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 중증도 및 경과, 항체가 예방 또는 치료 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 담당의의 판단에 따라 달라질 것이다. 항체는 한번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 적합하게 투여된다. 질환의 유형 및 중증도에 따라, 예를 들어 1회 이상의 개별 투여에 의해서든 아니면 연속 주입에 의해서든지 상관없이, 약 1 μg/kg 내지 15 mg/kg (예를 들어, 0.1mg/kg-10mg/kg)의 항체가 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 한 가지 전형적인 1일 투여량은 상기 언급된 인자에 따라 약 1 μg/kg 내지 100 mg/kg 또는 그 초과의 범위일 수 있다. 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 일반적으로 상태에 따라 질환 증상의 원하는 저해가 일어날 때까지 지속될 것이다. 한 예시적인 항체 투여량은 약 0.05 mg/kg 내지 약 10 mg/kg 범위일 것이다. 따라서, 약 0.5 mg/kg, 2.0 mg/kg, 4.0 mg/kg 또는 10 mg/kg (또는 그의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 용량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다 (예를 들어, 약 2회 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 용량의 항체가 환자에게 제공되도록 투여됨). 보다 높은 초기 로딩 용량을 투여한 후, 1회 이상의 보다 낮은 용량을 투여할 수 있다. 그러나, 다른 투여 요법이 유용할 수 있다. 이러한 요법의 진행은 통상의 기술 및 검정에 의해 용이하게 모니터링된다.
임의의 상기 제제 또는 치료 방법은 항-CRTh2 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 사용하여 수행할 수 있는 것으로 이해된다.
제조 물품 및 키트
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 기재된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 항-CRTh2 항체 중 하나 이상을 포함하는 제조 물품 또는 키트가 제공된다. 제조 물품 또는 키트는 용기, 및 용기 상의 또는 용기와 회합된 라벨 또는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 용기는 예를 들어 병, 바이알, 시린지, IV 용액 백 등을 포함한다. 용기는 다양한 물질, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로부터 형성될 수 있다. 용기는 조성물 자체를 수용하거나 또는 상기 조성물을 상태의 치료, 예방 및/또는 진단에 유효한 또 다른 조성물과 조합하여 수용하며, 멸균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있음). 조성물 내의 하나 이상의 활성제는 본 발명의 항체이다. 라벨 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 상태를 치료하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 또한, 제조 물품 또는 키트는 (a) 본 발명의 항체를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 제1 용기; 및 (b) 추가의 세포독성제 또는 다른 치료제를 포함하는 조성물을 내부에 함유하는 제2 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시양태에서의 제조 물품 또는 키트는, 조성물이 특정한 상태를 치료하기 위해 사용될 수 있다는 것을 나타내는 포장 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 제조 물품 또는 키트는 제약상 허용되는 완충제, 예컨대 정박테리아 주사용수 (BWFI), 포스페이트-완충 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 (또는 제3) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 다른 완충제, 희석제, 필터, 바늘 및 시린지를 비롯한, 상업적 및 사용자 관점에서 바람직한 다른 물질을 추가로 포함할 수 있다.
임의의 상기 제조 물품 또는 키트는 항-CRTh2 항체를 대신하여 또는 이에 더하여 본 발명의 면역접합체를 포함할 수 있는 것으로 이해된다.
실시예
하기는 본 발명의 방법 및 조성물의 실시예이다. 상기 제공된 일반적 설명에 따라 다양한 다른 실시양태가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1. 뮤린 항-인간 CRTh2 항체의 생성
물질 및 방법
클로닝 및 세포주
레서스 및 시노 CRTh2 cDNA를 레서스 및 시노 혈액으로부터 추출된 총 RNA로부터 RT-PCR에 의해 수득하고, 아미노-말단 Flag 태그, gD 태그를 함유하거나 또는 태그를 함유하지 않는 포유동물 발현 벡터 pRK5 벡터 내로 클로닝하였다. 오리진(Origene)으로부터의 인간 전장 cDNA (진 뱅크(Gene Bank) NM_004778)를 아미노-말단 Flag 태그, gD 태그를 갖거나 또는 태그를 갖지 않는 벡터 pRK5 내로 클로닝하였다. 서열 확인시에, CRTh2 클론은 위치 204에 진 뱅크 NM_004778에 나타난 바와 같은 발린 대신에 알라닌을 함유하였다 (예를 들어, 진 뱅크 참조 서열에 비해 V204A 치환을 갖는 서열 84).
CRTh2-함유 플라스미드를 퓨젠(Fugene) 6 (로슈(Roche))을 사용하여 293 세포 내로 형질감염시키고, 태그부착된 또는 태그부착되지 않은 CRTh2의 표면 발현을 모노클로날 항-Flag 항체 (클론 M2, 시그마(Sigma)), 항-gD Ab (클론 952, 제넨테크)를 사용하거나 또는 인간 CRTh2에 대한 래트 항-CRTh2 항체 BM16 (BD 파밍겐(BD Pharmingen))을 포함한 특이적 항-CRTh2 Ab를 사용하여 확인하였다. 또한, CRTh2-함유 플라스미드를 전기천공에 의해 마우스 전구-B 세포주인 300.19 세포 내에 도입하고, 표면 CRTh2 발현을 Flag-태그 발현으로 확인하였다. 또한, 300.19 세포의 표면 상의 CRTh2 발현을 인간 CRTh2에 대한 클론 BM16 (BD 파밍겐)을 포함한 항-CRTh2 모노클로날 항체에 의해 결정하였다.
항-인간 CRTh2 항체의 생성
항-인간 CRTh2 항체를 생성하기 위해, Balb/c 마우스 (찰스 리버(Charles River))를 다음 2가지 방법 중 하나를 사용하여 면역화시켰다: DNA 면역화 및 세포 면역화. DNA 면역화를 위해, Balb/c 마우스를 pRK5 벡터 + 아주반트로서의 마우스 Flt3-L 및 GM-CSF 중 50 ug의 인간 CRTh2 DNA를 갖는 유체역학적 꼬리 정맥 주사에 의해 매주 면역화시켰다. 세포 면역화를 위해, Balb/c 마우스 (찰스 리버, 캘리포니아주 홀리스터)를 PBS 중에 희석된 인간 CRTh2로 안정하게 형질감염된 5백만개의 300.19 세포를 사용하여 매주 2회 i.p. 주사를 통해 복강내로 면역화시켰다. 마우스는 10회 용량을 투여받았고, 이어서 융합 3일 전에 4천만개의 세포 i.p.와 함께 20 백만개의 세포 i.v.의 융합전 부스트를 투여받았다.
하이브리도마를 표준 방법에 의해 생성하였다. 비장세포를 X63-Ag8.653 마우스 골수종 세포 (아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection), 메릴랜드주 록빌)와 전기융합 (BTX, 뉴욕주 호손)을 통해 융합하고, 10% 태아 소 혈청 (FBS), 4.5 g/L 글루코스, 25 mM HEPES, 0.15 mg/ml 옥살로아세트산, 100 μg/ml 피루브산, 0.2 U/ml 인슐린, 2 mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신 (페니실린-스트렙토마이신, 인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드), NCTC-109 (론자), NEAA (인비트로젠)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; 론자(Lonza), 스위스 바젤)에서 밤새 37℃, 7% CO2에서 인큐베이션한 후에, 5.7 μM 아자세린 및 100 μM 하이포크산틴 (HA, 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루이스)으로 보충된 기재된 바와 같은 배지가 있는 96-웰 플레이트 내로 플레이팅하였다. 세포를 10일 동안 배양하고, 이어서 ELISA 및 FACS 분석하였다. FACS에 의해 마우스 IgG의 발현을 입증하고 강한 특이적 결합을 보인 웰로부터의 세포를 증식시키고 한계 희석에 의해 서브클로닝하였다. 서브클로닝의 제2 라운드 후에 가장 높은 FACS 결합을 입증하는 최종 클론을 생물반응기 (인테그라 바이오사이언시스(Integra Biosciences), 스위스 쿠어)에서의 대규모 생산을 위해 증식시켰다. 이어서, 상청액을 이전에 기재된 바와 같은 단백질 A 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (Hongo et al., Hybridoma 19:303, 2000). 하이브리도마로부터의 정제된 항체를 293 세포 또는 300.19 세포 상에 발현된 인간 CRTh2에 결합하는 능력에 대해 유동 세포측정법에 의해 스크리닝하였다. 결합 반응성을 또한 인간 말초 혈액으로부터의 호염기구 및 호산구 대해 시험하였다. 클론 19A2, 8B1, 31A5 및 3C12의 경쇄 및 중쇄를 pRK5 벡터 내로 서브클로닝하였다. 모든 중쇄를 마우스 IgG2a Fc 영역을 함유하도록 클로닝하였다. 항-CRTh2 항체를 표준 절차를 사용하여 CHO 세포에서 생산하였다. 비-푸코실화 19A2 및 8B1 항체를 FUT8-/- CHO 세포주로부터 생산하였다.
유동 세포측정법
인간 전혈을 건강한 공여자로부터 수득하고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 EL 완충제 (퀴아젠(Qiagen))로의 적혈구 용해 후에 염색 절차에 사용하였다. 혈액 세포를 다양한 농도의 A467-접합된 항-CRTh2 항체와 함께 또는 항-CRTh2 항체 + 2차 항-마우스 IgG-PE 항체 (잭슨 이뮤노리서치 래보러토리(Jackson ImmunoResearch Laboratory))와 함께 인큐베이션하였다. 백혈구 집단 염색에 사용된 항체는 다음과 같았다: FITC-항-인간 CD15, CD16, PerCP-항-인간 HLADR 및 CD4, APC-항-인간 CD123, CXCR3, CD14, BDCA1, 비오틴-항-인간 CCR6, 및 PE-항-인간 CCR4. 사용된 Ab는 BD 파밍겐으로부터 구입하였다. 조절 T 세포 상의 CRTh2 발현을 결정하기 위해, CD4+CD25+ T 세포를 인간 PBMC로부터 MACS 단리 (밀테니 바이오텍(Miltenyi Biotec))에 의해 풍부화시키고, 항-CRTh2 (항체 BM16)로 표면 염색하고, 이어서 항-FoxP3 (BD 바이오사이언스(BD Bioscience))로 세포내 염색하였다. 인간 비만 세포 상의 CRTh2 발현을 평가하기 위해, 비만 세포를 3-4주 동안 200 ng/mL rhIL-6, 100 ng/mL rhSCF (페프로테크(PeproTech)) 및 30 ng/mL rhIL-3 (R&D 시스템(R&D system))을 갖는 스템프로(StemPro)-34 SFM 완전 배지 (깁코(Gibco))에서 새로운 인간 골수 CD34+ 세포 (올셀즈(AllCells))를 배양시킴으로써 생성하였다. 비만 세포를 항-CD117, 항-CD123, 및 항-FceRI (BD 바이오사이언스)로 염색하였다. 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 Th2 세포 상의 인간 CRTh2 발현을 결정하기 위해, 50ul PBS 중 50ug 파파인을 마우스 우측 뒷발바닥 내에 주사하고, 슬와 림프절 세포를 3일 후에 수집하고, 항-mCD4-PerCP, 항-mCD44-FITC, 및 BM16-A647로 염색하였다. 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 선천성 T 헬퍼 유형 (IT) 2 세포 상의 인간 CRTh2 발현을 조사하기 위해, pRK5 벡터 내 50 ug 마우스 IL-17E를 유체역학적으로 꼬리 정맥 내로 주사하였다. 3일 후에 장간막 림프절 세포를 수집하고, 항-mCD117-PE, BM16-A647, 아이오딘화프로피듐 및 계열 마커 (FITC-표지: CD3, CD4, CD8, B220, FceRI, CD11c, Gr1, NK1.1, F4/80, DX5 및 PerCP-표지: CCR3)로 염색하였다. FITC-항-인간 CD15, CD16, PerCP-항-인간 HLADR 및 CD4, APC-항-인간 CD123, CXCR3, CD14, BDCA1, 비오틴-항-인간 CCR6, 및 PE-항-인간 CCR4를 BD 파밍겐으로부터 구입하였다. 시노몰구스 원숭이 및 레서스 원숭이 혈액을 건강한 원숭이로부터 수득하고, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 EL 완충제 (퀴아젠)로의 적혈구 용해 후에 염색 절차에 사용하였다. 혈액 세포를 다양한 농도의 A467-접합된 항-CRTh2 항체와 함께 인큐베이션하였다. 백혈구 집단 염색에 사용된 항체는 다음과 같았다: FITC-항-인간 CD123 (BD 파밍겐), PE-항-인간 CD125 (BD 파밍겐), 및 PerCP-eFluor710 항-인간 FceRI (이바이오사이언스(eBioscience)). 샘플을 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro) 소프트웨어 (BD 바이오사이언시스)를 사용하는 FACS칼리버(FACSCalibur) 유동 세포측정기 상에서 수득하고, 데이터 분석을 플로우조(Flowjo) (트리 스타, 인크(Tree Star, Inc))를 사용하여 수행하였다.
CRTh2+ 기억 CD4+ T 세포 단리 및 시토카인 생산의 정량화
무훼손 기억 CD4+ T 세포를 아토피성 공여자로부터의 인간 PBMC로부터 MACS 단리 (밀테니 바이오텍)에 의해 단리하고, 이어서 20분 동안 37℃에서 CD45RO-FITC, CD4-PerCP (BD 파밍겐), 및 BM16-PE (밀테니 바이오텍) 항체로 염색하였다. CRTh2+CD45RO+CD4+ 및 CRTh2-CD45RO+CD4+ 기억 T 세포를 Facs아리아(FacsAria) 분류기 (BD)에 의해 분류하였다. CRTh2+ 및 CRTh2- 기억 CD4+ T 세포의 순도는 98% 초과였다. 동일한 수의 분류된 세포를 37℃에서 48시간 동안 10 ug/mL의 플레이트-결합된 항-hCD3 mAb 및 1 ug/ml 가용성 항-hCD28로 자극시켰다. 상청액을 수집하고, 인간 바이오-플렉스(Bio-Plex) (바이오-라드(Bio-Rad)) 항체-고정화된 비드를 사용하여 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17A, TNFα, IFNγ 및 GM-CSF에 대해 분석하고, 루미넥스 100 기기 (루미넥스)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 플레이트 판독하였다.
방사성리간드 세포 결합 검정 (스캐차드 분석)
재조합 CRTh2 수용체를 발현하는 세포에 결합하는 항-CRTh2 항체에 대한 평형 해리 상수 (KD)를 방사성리간드 세포 결합 검정을 사용하여 결정하였다. 항-CRTh2 항체를 아이오도겐 방법을 사용하여 아이오딘화하였고, 방사성표지된 항체는 Fab 항체의 경우 19-22 μCI/μg 및 IgG 항체의 경우 10-14 μCI/μg의 비활성의 범위를 가졌다. CRTh2 수용체를 발현하는 세포를 증가하는 농도의 비표지 항-CRTh2 항체와 조합된 고정된 농도의 아이오딘화 항-CRTh2 항체와 함께 (무첨가 완충제 단독 샘플을 포함) 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2-시간 인큐베이션 후에, 경쟁 반응물을 밀리포어 멀티스크린(Millipore Multiscreen) 필터 플레이트에 옮기고, 결합 완충제로 4회 세척하여 결합된 아이오딘화 항체로부터의 유리물을 분리시켰다. 필터를 왈락 위자드(Wallac Wizard) 1470 감마 계수기 상에서 계수하였다. 결합 데이터를 뉴리간드(NewLigand) 소프트웨어 (제넨테크)를 사용하여 평가하였으며, 이는 항-CRTh2 항체의 결합 친화도를 결정하기 위해 먼슨(Munson) 및 로드바드(Rodbard)의 피팅 알고리즘을 사용한다 (Munson and Rodbard, Anal. Biochem, 1980; 107: 220-239).
에피토프 맵핑
정제된 마우스 항-CRTh2 모노클로날 항체 19A2 및 래트 항-CRTh2 모노클로날 항체 BM16을 EZ-링크 술포-NHS-비오틴 키트 (피어스/써모-피셔(Pierce/Thermo-Fisher), 일리노이주 록포드)를 사용하여 비오티닐화하였다. 활성은 인간 CRTh2 또는 레서스 CRTh2로 안정하게 형질감염된 293 세포 상에서 FACS 적정에 의해 확인하였다. 50 ul의 형질감염된 293 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트 (BD 팔콘(BD Falcon), 뉴저지주 프랭클린 레이크스)에 첨가하고, 1% FBS를 함유하는 PBS 중에 천만개 세포/ml의 농도로 현탁시키고, 이어서 50 μl의 비표지 항체를 20 ug/ml의 농도로 현탁시키고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 비오티닐화 항체를 이전 FACS 적정 실험에 의해 결정된 바와 같은 2 ug/ml의 농도 (19A2 및 BM16)로 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 세포를 원심분리를 사용하여 2회 세척함으로써 세포를 펠릿화하고, 이어서 1% FBS를 함유하는 200 μl의 PBS를 첨가하였다. 이어서, 세포를 4℃에서 30분 동안 피코에리트린-접합된 스트렙타비딘 (지메드/라이프 테크놀로지스(Zymed/Life Technologies), 뉴욕주 그랜드 아일랜드)과 함께 인큐베이션하였다. 세포를 세척하고, 1% 포르말린을 함유하는 PBS 중에 고정시키고, FACS칼리버 유동 세포측정기 (BD 바이오사이언시스, 캘리포니아주 산호세) 상에서 유동 세포측정법에 의해 분석하였다.
인간 T 세포 분극화
무훼손 나이브 CD4+ T 세포를 건강한 공여자로부터의 PBMC로부터 MACS 분리 (밀테니 바이오텍)에 의해 단리하였다. 세포를 10 ug/mL의 플레이트-결합된 항-CD3 mAb 및 1 ug/mL 가용성 항-CD28 mAb (BD 바이오사이언시스)의 존재 하에 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 50 uM 2-ME, 1 mM 피루브산나트륨, 100U/mL 페니실린, 100 ug/mL 스트렙토마이신, 및 1mM 비-필수 아미노산으로 보충된 완전 DMEM 배지에서 배양하였다. 인간 Th 하위세트 분극화 조건은 다음과 같았다: Th1: 10 ng/mL rhIL12 및 2 ug/mL 항-hIL-4; Th2: 20 ng/mL rhIL-4 (R&D 시스템), 2 ug/mL 항-hIL-12 및 5 ug/mL 항-hIFNγ (BD 바이오사이언시스). 2 라운드의 분극화를 수행하였으며, 이때 각 라운드는 활성화 단계에 이어서 휴지 단계로 이루어졌고, 제2 재자극을 1 ug/mL 플레이트-결합된 항-CD3 mAb 및 1ug/ml 가용성 항-CD28 mAb의 존재 하에 수행하였다.
칼슘 동원 검정
시험관내 분극화된 Th2 세포를 30분 동안 37℃에서 5 μM indo-1/AM 및 0.2% 플루로닉 F127 (몰레큘라 프로브(Molecular Probe))과 함께 인큐베이션하고, 세척하고, 이후 15분 동안 37℃에서 항-CCR6, 항-CCR4, 항-CD4, 및 항-CXCR3 mAb로 염색하였으며; 세척 후에 세포를 30분 동안 37℃에서 1 uM의 항-CRTh2 mAb 또는 이소형 대조군 항체와 함께 인큐베이션한 다음, 100 nM PGD2 (시그마)로 자극시켰다. 칼슘 방출을 유동 세포측정법에 의해 모니터링하였다.
CRTh2 기능적 cAMP 차단 검정
PGD2-CRTh2 신호전달에 있어서 항-CRTh2 항체의 차단 활성을 포르스콜린 및 PGD2 (시그마; 미주리주 세인트 루이스)의 존재 하에 항-CRTh2와 재조합 세포주 cAMP 헌터(Hunter)™ CHO-K1 CRTh2 Gi (디스커버엑스(DiscoveRx); 캘리포니아주 프리몬트)와의 인큐베이션 후에 세포 cAMP 수준을 측정함으로써 분석하였다. 간략하게, 세포를 384-웰 조직 배양 플레이트 (코닝(Corning) Cat# 3707; 뉴욕주 코닝)에서 10,000개 세포/웰로 밤새 배양하였다. 배양 배지의 제거 후에, 10 μL의 시험 항체 (PBS 중에 연속 희석됨)를 각 웰에 첨가하고, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 포르스콜린 및 PGD2를 각 웰에 첨가하여 각각 12.5 μM 및 4 nM의 최종 농도에 도달하였다. 37℃에서의 또 다른 30분 인큐베이션 후에, 플레이트를 화학발광 판독기로서 엔비전(Envison) (퍼킨 엘머; 매사추세츠주 월섬)과 함께 히트헌터(HitHunter)® cAMP XS+ 키트 (디스커버엑스)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 cAMP 분석에 적용시켰다. 이어서, 데이터를 분석하고 프리즘(Prism) (그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software); 캘리포니아주 라 졸라)을 사용하여 플로팅하였다.
인간 CRTh2 BAC 트랜스제닉 마우스의 생성
BAC 벡터 백본 (RPCI 인간 BAC 라이브러리 11; 클론 ID RP11-68H20)에 인간 CRTh2 유전자를 함유하는 171 Kb 단편을 인비트로젠으로부터 구입하였다. 28 Kb의 더 짧은 버전을 재조합조작을 통해 수득하였다. 171 Kb 또는 28 Kb BAC 구축물을 C57BL/6 마우스로부터 수거된 수정 난모세포 내로 마이크로주사하였다. 인간 CRTh2 트랜스진의 존재는 마우스 꼬리 DNA로부터 RT-PCR에 의해 결정하였다. 확인된 9개 창시자 중 7개가 유동 세포측정법에 의해 시험된 면역 세포 유형 상에서 유사한 인간 CRTh2 발현 패턴을 일으켰다. 이들 계통 중 계통 85는 인간 PBMC로부터의 1차 인간 호염기구 및 호산구 상의 인간 CRTh2 수준과 비교하였을 때 마우스 호염기구 및 호산구 상에서 유사한 인간 CRTh2 발현 수준을 유동 세포측정법에 의해 입증하였다.
인간 CRTh2 BAC 트랜스제닉 마우스에서 항-CRTh2 항체에 의한 혈액 호염기구 및 호산구 고갈의 측정
마우스 또는 인간화 항-인간 CRTh2 항체 또는 이소형 대조군 항체 (mIgG1: 항-gp120 항체; mIgG2a: 항-돼지풀 항체; hIgG1: 항-gD 항체)를 나타내어진 용량으로 6-8주령의 인간 CRTh2 BAC tg 마우스 내에 제0일에 정맥내 주사하였다. 3, 6 또는 7일 후에 안구 혈액을 채혈하여 나타내어진 바와 같이 유동 세포측정법에 의해 호염기구 및 호산구 수를 분석하였다. 대안적으로, 한 군의 마우스를 제2일, 제3일, 제7일 또는 제14일에 희생시키고, 혈액, 비장 및 골수를 수거하고, 유동 세포측정법에 의해 호산구 및 호염기구의 계산을 위해 처리하였다. 적혈구를 EL 완충제 (퀴아젠)로 용해시켰다. 백혈구, 비장세포 또는 골수 세포를 항-CD123-FITC, 항-FcεRI-PE, 및 항-CCR3-PerCP로 염색하여 호염기구 및 호산구를 검출하였다. 절대 세포 수를 칼리브라이트(CaliBRITE) FITC 비드 (BD 바이오사이언시스)를 사용하는 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.
인간 CRTh2 BAC 트랜스제닉 마우스에서의 TNP-OVA 유도된 폐 염증
인간 CRTh2 BAC tg 마우스를 100 ul 멸균 PBS 중 2 mg 수산화알루미늄 중 50 ug TNP-OVA (바이오서치 테크놀로지스(Biosearch Technologies))를 사용하여 복강내 주사에 의해 제0일에 감작시켰다. 감작후 제35일에 시작하여, 마우스를 네뷸라이저를 통해 30분 동안 PBS 중 에어로졸화된 1% TNP-OVA를 사용하여 연속 7일 동안 시험투여하였다. 마우스를 제38일 내지 제41일에 1일에 1회 100 uL의 염수 중 200 ug의 항-인간 CRTh2 항체 클론 19A2 mIgG2a (비-푸코실화 또는 wt), Fc 돌연변이체 Ab 19A2 mIgG2a_DANA, 또는 항-돼지풀 대조군 항체 (mIgG2a)로 복강내 처리하였다. 모든 마우스를 제42일에 안락사시켰다. 마우스를 20 ml의 PBS로 우심실을 통해 관류시켜 폐의 말초 혈액을 청정화하고, 전체 폐를 유동 세포측정법을 위해 제거하였다. 혈액을 유동 세포측정법에 의한 평가를 위해 심장 천공을 통해 수집하였다. BAL을 세포 계수 및 시토카인 분석을 위해 수집하였다. BAL 액 IL-4 및 IL-13 시토카인 농도를 ELISA (R&D)에 의해 제조업체의 프로토콜에 따라 결정하였다. 19A2 항체의 이펙터 기능-결핍 버전인 19A2_DANA는 Fcγ 수용체 결합을 폐지시키는 2개의 잔기의 돌연변이화 (D265A, N297A)에 의해 생성하였다.
Th2 세포를 고갈시키는 항-인간 CRTh2 Ab의 잠재력을 평가하기 위한 인간 SCID 모델
제-7일에, 인간 PBMC를 315 ng/mL의 혈청 IgE 수준을 갖는 아토피성 공여자로부터 백혈구분리반출술 및 피콜 밀도 구배 원심분리 (지이 헬스케어(GE Healthcare))에 의해 단리하였다. 동일한 공여자로부터의 PBMC의 분취물을 이후 마우스 내로의 전달을 위해 동결시켰다. 무훼손 나이브 CD4+ T 헬퍼 세포를 나이브 CD4+ T 세포 단리 키트 II (밀테니 바이오텍 130-094-131)를 사용하여 비-CD4+ T 세포 및 기억 T 세포의 고갈에 의해 PBMC로부터 추가로 단리하였다. 정제된 나이브 CD4+ T 세포를 하기와 같은 Th2에 대한 스큐잉 조건: 5 ug/mL의 항-인간 IFNg (BD 554698), 2 ug/mL의 항-IL12 (BD 554659), 및 20 ng/mL의 재조합 인간 IL-4 (R&D 시스템 204-IL) 하에서 3일 동안 10 ug/mL의 플레이트-결합된 항-CD3 (BD 555329) 및 1 ug/mL의 가용성 항-CD28 (BD 555725)로 자극시켰다. Th2 조건 하에서 자극시킨 CD4+ T 세포를 SCID-베이지색 마우스 내로의 전달 실험에 사용하였다.
제0일에, SCID-베이지색 마우스 (챨스리버)를 세슘 137 공급원으로부터 3.5 Gy로 준치사적으로 조사하였다. 인간 T 세포를 100 ul의 PBS 중에 하기 혼합물로서 마우스 내로 복강내 주사를 통해 전달하였다: 동일한 공여자로부터의 6x107개의 분극화된 T 세포 (상기 기재된 바와 같음) 및 4x107개의 살아있는 사전 동결된 인간 PBMC. 100 ul의 PBS 중 100 ug의 항-인간 IFNg 및 100 ug의 항-인간 IL-12 항체를 제0일 및 제3일에 마우스 내로 복강내 주사하였다. 100 ng의 재조합 인간 IL-4를 제1일, 제2일 및 제3일에 마우스 내로 복강내 주사하였다. 마우스를 세포 전달 전인 제0일에 및 제3일에 100 ul의 PBS 중 200 ug의 항-인간 CRTh2 항체 (클론 19A2, 비-푸코실화) 또는 항-돼지풀 이소형 대조군 항체로 처리하였다. 모든 마우스를 제7일에 안락사시키고, 비장을 수집하였다. 비장세포를 FACS에 의한 세포내 시토카인 수준의 평가를 위해 4.5시간 동안 37℃에서 PdBu (50 ng/mL) 및 이오노마이신 (500 ng/mL)으로 생체외 자극시켰다. 세포를 항-hCD4로 표면 염색하고, 동일한 채널로 항-mCD45, 항-mTer119, 및 항-hCD19로 염색하여 이러한 계열 양성 세포를 제외시켰다. 세포를 고정시키고 항-hIFNg 및 항-hIL-4로 염색하였다.
IT2 세포의 고갈을 위한 모델
인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 선천성 T 헬퍼 유형 (IT) 2 세포의 수를 증가시키기 위해, pRK5 벡터 내 50 ug/마우스 IL-17E를 1.6 ml 링거액 중에 꼬리 정맥 내로 유체역학적으로 주사하였다. 3일 후에 장간막 림프절 세포를 수집하고, IT2 세포 백분율 및 수를, 항-mCD117-PE, BM16-A647로 염색하고 계열 양성 뿐만 아니라 사멸 세포 (계열: CD3, CD4, CD8, B220, FceRI, CD11c, Gr1, NK1.1, F4/80, DX5 및 CCR3)를 제외함으로써 유동 세포측정법에 의해 결정하였다.
결과
CRTh2는 천식과 연관된 세포 상에서 발현된다
인간 PBMC로부터의 세포 또는 배양된 인간 세포 상에서의 CRTh2 발현을 항-인간 CRTh2 항체 (클론 BM16)를 사용하여 유동 세포측정법에 의해 평가하였다 (도 1). CRTh2는 최근에 보고된 바와 같이 (Mjosberg, Nat. Imm. 12(11):1055-62 (2011)) 인간 혈액 호염기구, 호산구, 분극화된 Th2 세포, 골수 유래 비만 세포 상에서 뿐만 아니라 선천성 T 헬퍼 유형 2 (IT2) 세포 상에서 선택적으로 발현된다. CRTh2는 분극화된 Th1 세포, 호중구, 수지상 세포, 단핵구 및 조절 T 세포 상에서 발현되지 않는다. CRTh2 발현은 B 세포, NK 세포, NK T 세포 및 혈소판 상에서 검출되지 않는다 (데이터는 제시되지 않음).
CRTh2 세포는 Th2 시토카인 생산과 연관된다
CRTh2가 Th2 시토카인 생산과 연관된 T 세포 하위세트 상에서 발현되는 것을 평가하기 위해, CRTh2+ 및 CRTh2- 기억 CD4 T 세포를 FACS 분류하고, 항-CD3 및 항-CD28 항체로 자극시켜 Th2 시토카인 생산을 평가하였다. CRTh2+ 기억 CD4 T 세포는 CRTh2- 기억 CD4 T 세포 집단과 비교하였을 때 95% 초과의 기억 T 세포 Th2 시토카인을 생산하였다 (도 2). 시험된 추가의 공여자는 유사한 결과를 제시하였다.
항-인간 CRTh2 항체의 생성 및 시험관내 특성화
항-인간 CRTh2 항체를 인간 CRTh2를 과다발현하는 300.19 세포로 아주반트 없이 면역화시킨 Balb/c 마우스로부터 생성하였다.
용량 의존성 방식으로 인간 CRTh2를 과다발현하는 293 세포 또는 300.19 세포에 결합하지만 293 또는 300.19 야생형 세포에는 결합하지 않는 항-CRTh2 항체를 본원에 기재된 바와 같이 생성하였다 (도 3a 및 3b). 항-인간 CRTh2 Ab를 또한 293 또는 300.19 세포에서 과다발현된 시노몰구스 (시노) 또는 레서스 원숭이 CRTh2와의 교차-반응성에 대해 시험하였다. 293 세포 상에 발현된 시노 CRTh2에 대한 소량의 교차-반응성을 제시한 클론 19A2를 제외하고는 어떤 Ab도 시노 또는 레서스 CRTh2와의 반응성을 제시하지 않았다. 항-인간 CRTh2 항체는 또한 인간 전혈로부터의 1차 인간 호염기구 및 호산구와 용량 의존성 방식으로 반응하였다. 후보 항-인간 CRTh2 항체를 293 세포 또는 300.19 세포의 표면 상에 과다발현된 인간 CRTh2에 결합하는 그의 능력, 뿐만 아니라 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터의 1차 호염기구 및 호산구와의 그의 상대 반응성을 기준으로 선택하였다 (도 3). 상기 기재된 면역화로부터 생성된 모든 추가의 항체는 인간 CRTh2에 결합하였지만, 레서스 또는 시노 CRTh2와 교차-반응하지는 않았다 (데이터는 제시되지 않음). 인간화 클론 h19A2.v1 및 클론 h19A2.v12를 또한 293 세포 또는 300.19 세포 상에 발현된 CRTh2와의 반응성, 뿐만 아니라 1차 혈액 호염기구 및 호산구 상의 CRTh2와의 반응성에 대해 시험하였다. 19A2와 유사하게, 인간화 h19A2.v1은 293 세포 (도 3d), 300.19 세포 (도 3e) 상에 발현된 인간 CRTh2 및 1차 혈액 호염기구 및 호산구 (도 3f) 상의 CRTh2와 반응하였으며, 293 또는 300.19 세포 상에 과다발현된 시노 CRTh2와는 소량의 교차-반응성을 나타냈다. 인간화 h19A2.v1은 과다발현 293 또는 300.19 세포주 및 1차 레서스 혈액 호염기구 상의 레서스 CRTh2와는 반응하지 않았다. 대조적으로, 인간화 및 조작된 항체 h19A2.v12는 293 세포 (도 3d) 또는 300.19 세포 (도 3e) 상에 발현된 인간, 시노몰구스 및 레서스 CRTh2, 뿐만 아니라 1차 혈액 호염기구 (도 3f) 상의 인간, 시노 및 레서스 CRTh2와 용량-의존성 방식으로 반응하였다. 또한, 항체 h19A2.v12는 1차 인간 혈액 호산구 상의 CRTh2도 검출하였다.
상동 경쟁을 이용한 방사성표지된 리간드 분석을 수행하여 293 세포 및 300.19 세포 상에 표면 발현된 인간 CRTh2에 대한 항-CRTh2 항체의 해리 상수 (KD)를 평가하였다. 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에 대한 마우스 항-인간 CRTh2 클론 19A2 및 8B1 (전체 IgG)의 KD 값은 각각 2 nM 및 2.6 nM이었다. 300.19 세포에 대한 항체 19A2의 KD 값은 10.2 nM이었다 (도 4a). 인간화 항체 h19A2.v12 및 h19A2.v60의 KD 값의 직접 측정을 얻기 위해, 이러한 항체의 Fab 단편을 생성시키고, 방사성리간드 세포 결합 검정에 적용시켰다 (도 4b). 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에 대한 h19A2.v12 및 h19A2.v60 (IgG의 Fab 단편)의 KD 값은 각각 51 nM 및 56 nM이었다. 시노몰구스 원숭이 CRTh2를 발현하는 293 세포에 대한 h19A2.v12 및 h19A2.v60 (IgG의 Fab 단편)의 KD 값은 각각 152 nM 및 39 nM이었다. 이러한 측정을 기준으로 하여, 인간 대 시노 CRTh2에 대한 상대 결합 친화도는 h19A2.12에 대해 3배 이내이고, h19A2.v60에 대해 동등효력인 것으로 보인다 (도 4b).
인간화 항체 h19A2.v52 및 h19A2.v46의 KD 값의 직접 측정을 얻기 위해, 이러한 항체의 Fab 단편을 생성시키고, 방사성리간드 세포 결합 검정에 적용시켰다 (도 15). 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에 대한 h19A2.v52 및 h19A2.v46 (IgG의 Fab 단편)의 KD 값은 각각 13.7 nM 및 6.4 nM이었다. 시노몰구스 원숭이 CRTh2를 발현하는 293 세포에 대한 h19A2.v52 및 h19A2.v46 (IgG의 Fab 단편)의 KD 값은 각각 21.3 nM 및 8.6 nM이었다.
항-CRTh2 항체의 차단 기능을 평가하기 위해, 리간드 프로스타글란딘 (PGD2)에 대한 시험관내 분극화된 Th2 세포의 칼슘 동원을 항-CRTh2 또는 이소형 대조군 항체의 존재 하에 조사하였다. PGD2에 대한 칼슘 유동을 8B1 및 3C12와의 세포의 예비-인큐베이션에 의해 완전히 방지하였고, 반면에 31A5는 부분 효과를 제시하였다. 항-CRTh2 19A2 항체와의 인큐베이션은 CA2+ 유동에 유의한 영향을 미치지 않았으며 (도 5), 이는 19A2가 CRTh2의 기능을 차단할 수 있는 8B1 및 3C12와 달리, CRTh2에 대한 비-차단 항체임을 나타낸다.
인간 CRTh2의 트랜스제닉 마우스 모델의 생성
항-CRTh2 항체의 생체내 고갈 능력을 특성화하기 위해, 트랜스제닉 마우스 모델 (인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스)을 BAC 벡터 상의 인간 CRTh2 유전자를 C57BL/6 수정 난모세포 내로 도입함으로써 생성하였다 (도 6a). 혈액 호염기구 및 호산구 상의 인간 CRTh2 발현이 7개의 창시자에서 확인되었지만, hCRTh2.Bac.tg 계통에서 마우스 Th2 세포 상에서의 hCRTh2의 발현은 검출될 수 없었다. 3개의 대표적 창시자 계통을 보다 상세한 분석에 적용시켰다 (데이터는 제시되지 않음). 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스의 창시자 계통 85는, 각각 1차 인간 혈액 호염기구 및 호산구 뿐만 아니라 골수 유래 인간 비만 세포와 비교하였을 때, 마우스 혈액 호염기구 및 호산구 뿐만 아니라 복막 비만 세포 상에서 인간 CRTh2의 유사한 발현 수준을 입증하였다 (도 6b). 따라서, 창시자 85 hCRTh2.Bac.Tg 마우스를 모든 이후의 생체내 고갈 연구에 사용하였다. 또한, 창시자 계통 85는, 발현 수준이 PBMC로부터의 인간 선천성 T 헬퍼 유형 (IT) 2 세포 상의 발현과 비교하였을 때 보다 낮은 것처럼 보이긴 하였지만 마우스 IT2 세포 상에서 인간 CRTh2를 발현하였다 (도 6b).
항-CRTh2 항체는 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 혈액 호염기구 및 호산구를 고갈시켰다.
항-CRTh2 항체가 CRTh2+ 호염기구 및 호산구를 생체내 고갈시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 19A2 또는 3C12 항체 중 어느 하나의 1회 용량을 나타내어진 바와 같이 CRTh2.Bac.Tg 마우스에게 투여하였다 (도 7a). 19A2 또는 3C12의 단일 용량은 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같이 처리 후 제3일에 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 말초 혈액에서 호염기구 및 호산구를 완전히 고갈시켰다 (도 7a). 호염기구 및 호산구의 유의한 고갈이 처리 후 제7일에도 여전히 관찰되었다. 8B1 및 19A2 항체는 또한 처리 후 제6일에 평가된 바와 같이 항체의 단일 용량 후에 혈액으로부터 호염기구 및 호산구를 고갈시켰다 (도 7b).
항-CRTh2 항체는 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 TNP-OVA 유도된 만성 천식 모델에서 폐 내 호염기구 및 호산구를 고갈시킨다
항-CRTh2 항체가 조직 내 CRTh2+ 세포를 고갈시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 항-CRTh2 항체 치료의 효과를 TNP-OVA 유도된 만성 천식 모델에서 조사하였다. i.p. 200 ug/마우스의 치료 요법에서 항체 19A2의 4회 용량은 폐 호산구 및 호염기구를 완전히 고갈시켰고, 또한 폐 비만 세포를 80%만큼 고갈시켰다 (도 8). 또한, 기관지 폐포 세척액 (BALF)에서 호산구는 100% 고갈되었다. 또한, 기관지 폐포 세척액 (BALF)에서 Th2 시토카인 IL-4 및 IL-13은 각각 100% 및 48%만큼 감소되었다 (도 8b).
항-CRTh2 항체는 SCID 마우스에서 Th2 시토카인 생산 세포를 고갈시킨다
인간 CRTh2 발현이 인간 CRTh2.Tg 마우스에서의 Th2 세포 (CD4+CD44hi) 상에서 검출되지 않기 때문에, Th2 세포 고갈은 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 평가될 수 없었다. 항-CRTh2 항체가 Th2 시토카인 생산 세포를 생체내에서 고갈시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 시험관내 분극화된 인간 Th2 세포를 SCID 마우스 내로 전달하고, 1주 2회 항-CRTh2 또는 이소형 대조군 Ab로 처리하고, IL-4 생산 세포를 투여 개시 후 제7일에 PMA 및 이오노마이신으로 생체외 자극시킨 후에 평가하였다. 세포내 IL-4 염색은 IL-4 생산 세포의 92%가 19A2 항-CRTh2 항체 처리에 의해 고갈되었지만 IFNg 생산 세포는 감소되지 않았다는 것을 나타냈다 (도 9a).
항-CRTh2는 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 선천성 유형 2 세포를 고갈시킨다
선천성 유형 2 (IT2) 세포 (또한 선천성 림프성 유형 2 세포 또는 ILC2 세포로 칭함)를 고갈시키는 항-CRTh2 항체의 능력을 평가하기 위해, hCRTh2.Bac.Tg 마우스 내로 IL-17E 함유 플라스미드를 주사하여 IT2 세포 수를 증가시켰다. 마우스를 항-hCRTh2 또는 이소형 대조군 항체의 단일 용량으로 i.v.로 처리하고, IT2 세포 백분율 및 수를 처리 후 제3일에 유동 세포측정법에 의해 장간막 림프절에서 검출하였다. 항-hCRTh2 처리는 hCRTh2.Bac.Tg 마우스에서 장간막 림프절 IT2 세포의 백분율 및 수를 50% 초과만큼 현저하게 감소시켰다.
실시예 2. 항체 인간화 및 친화도 성숙
포유동물 세포에서의 비오티닐화 CRTh2의 발현
인간, 시노몰구스 및 레서스 CRTh2 cDNA 및 Q16E 또는 R19H 돌연변이를 갖는 인간 CRTh2를 링커 및 아비태그 서열 (GSGGLNDIFEAQKIEWH)을 코딩하는 서열에 대한 3' 말단에서 인 프레임 융합된 포유동물 발현 벡터 pRK5 내로 클로닝하였다. 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 BirA 비오틴 리가제 유전자를 또한 포유동물 발현 벡터 pRK5 내로 클로닝하였다. 각 종으로부터 CRTh2를 코딩하는 플라스미드를 BirA 발현 플라스미드와 9:1의 비로 혼합하고, 10% 태아 소 혈청을 함유하며 10 μM 비오틴으로 보충된 둘베코 변형 이글 배지에서 리포펙타민 2000 시약 (인비트로젠)을 사용하여 293T 세포 내로 공동-형질감염시켰다. 세포를 형질감염 24시간 후에 수거하고, 비오티닐화 CRTh2를 함유하는 형질 막 분획을 정제하였다.
형질 막 분획의 정제
형질감염된 세포 (2.5 x 108개)를 프로테아제 억제제 칵테일 믹스 (로슈)를 함유하는 PBS (150 mM NaCl, 10 mM 인산나트륨, pH 7.4) 중에서 2회 세척하고, 세포 펠릿을 -80℃에서 동결시켰다. 세포를 해동시키고, 4 ml의 용해 완충제 (프로테아제 억제제 믹스를 함유하는 1 mM EDTA, 50 mM HEPES 완충제, pH7.4) 중에 재현탁시키고, 타이트-피팅 막자를 사용하여 8 스트로크로 다운스 균질화기(Dounce homogenizer)에서 용해시켰다. 초기 용해 후에, 500 mM 수크로스를 함유하는 4 ml의 용해 완충제를 첨가하고, 타이트-피팅 막자를 사용하여 8 스트로크로 균질화시켰다. 세포 파편을 10분 동안 770 x g로 원심분리에 의해 제거하고, 상청액 중 막 물질을 17,000 x g로 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 펠릿화된 막을 다운스 균질화기에서 루즈-피팅 막자의 8 스트로크로 250 mM 수크로스를 함유하는 6 ml의 용해 완충제 중에 재현탁시켰다. 거대 파편을 10분 동안 770 x g로 원심분리에 의해 제거하였다. 상청액을 반투명 SW40 원심분리 튜브에서 1.12 M 수크로스를 함유하는 4 ml의 용해 완충제 상에 조심스럽게 놓고, 4℃에서 1시간 동안 25,000 rpm으로 SW40Ti 로터 (베크만(Beckman))에서 회전시켰다. 고농도와 저농도 수크로스 분획 사이 계면의 물질을 피펫으로 수집하고, 수크로스가 없는 동등 부피의 용해 완충제와 혼합하고, 4℃에서 10분 동안 16,000 x g로 원심분리에 의해 펠릿화하였다. 펠릿화된 혈장 막을 1 ml의 용해 완충제 중에 재현탁시키고, -80℃에서 저장하였다. 모든 균질화 단계를 얼음 상에서 수행하였다.
곤충 세포로부터의 CRTh2의 발현 및 정제
단백질 발현: 호모 사피엔스(Homo sapiens) 및 마카카 파시쿨라리스(Macaca fascicularis) CRTh2의 Ala3-Asp330을 코딩하는 DNA를 C-말단 아비-태그 및 His8-태그를 함유하는 변형된 pAcGP67 바큘로바이러스 전달 벡터 (BD 바이오사이언시스) 내로 클로닝하였다. 재조합 바큘로바이러스를 바큘로골드 발현 시스템 (BD 바이오사이언시스)을 사용하여 ESF 921 배지 (익스프레션 시스템즈(Expression Systems))에서 pAcGP67 구축물 및 선형화된 바큘로바이러스 DNA로 Sf9 세포를 공동형질감염시켜 생성하였다. 바이러스를 3 라운드의 증폭을 통해 생성하였다. 태그부착되지 않은 에스케리키아 콜라이 BirA (Met1-Lys321)를 발현하는 재조합 바큘로바이러스를 유사하게 생성하였다. 40 mL의 두 바이러스 (CRTh2 및 BirA)를 사용하여 10 L의 Tni.PRO 세포를 2 x 106개 세포/mL의 밀도로 공동-감염시켰다. 세포를 27℃에서 48시간 동안 추가로 성장시키고, 원심분리에 의해 배지로부터 제거하였다.
단백질 정제: 수거된 세포 펠릿을 미세유동화기를 통한 3회 통과에 의해 완전 EDTA-무함유 프로테아제 억제제 칵테일 (로슈)을 함유하는 50 mM 트리스 pH 8, 200 mM NaCl (TBS) 중에 재현탁 및 용해시켰다. 용해물의 청정화 후에, 막을 4℃에서 2시간 동안 45 Ti 초원심분리기 로터 (베크만)에서 40K로 원심분리에 의해 수거하였다. 30 그램의 막 펠릿을 TBS (10 g/L) 중에 재현탁시키고, 4℃에서 2시간 동안 1% (wt/vol) 라우릴 말토스 네오펜틸 글리콜 (LMNG, 아피메트릭스(Affymetrix))로 가용화시켰다. 청정화 후에, 샘플을 Ni-NTA 수지 (퀴아젠) 상에 배치-결합시키고, 15 mM 이미다졸을 함유하는 0.12% (wt/vol) 디기토닌 (EMD 바이오사이언시스(EMD Biosciences))을 함유하는 TBS로 세척하였다. 단백질을 300 mM 이미다졸을 함유하는 동일한 완충제로 용리시키고, 4℃에서 100 MWKO 스핀 농축기 (비바스핀(Vivaspin), 지이 헬스케어)를 사용하여 농축시키고, 이미다졸이 없는 TBS-디기토닌 (0.12%) 완충제 중에 5배 희석시켰다. 비오티닐화-CRTh2 단백질 농도를 단백질 표준에 대한 비교에 의해 평가하였으며; 샘플을 분취하고 액체 질소 중에 순간 동결시켰다.
가용화된 CRTh2를 사용한 ELISA
뉴트라비딘 (피어스)를 4℃에서 밤새 96-웰 맥시소르프(Maxisorp) ELISA 플레이트 (10 mM 카르보네이트 완충제 중 2 μg/ml, pH 9.6, 웰당 100 μl) 상에 코팅시키고, 0.5% 소 혈청 알부민을 함유하는 PBS (차단 완충제)로 차단하였다. CRTh2 또는 대조군 막 단백질 또는 정제된 CRTh2를 함유하는 형질 막을 차단 완충제 중에 희석하고, 얼음 상에서 15분 동안 1% 도데실말토시드 (DDM) 중에 용해시키고, 불용성 물질을 30분 동안 4℃에서 16,000 x g로 원심분리에 의해 제거하였다. 가용화된 CRTh2 또는 대조군 막 단백질을 0.2% DDM을 함유하는 차단 완충제 중에 희석하고, 뉴트라비딘-코팅된 플레이트에 첨가하였다. 단백질을 10분 동안 인큐베이션하고, 플레이트를 0.05% DDM을 함유하는 PBS로 세척하였다. 항체를 0.2% DDM을 함유하는 차단 완충제 중에 연속 희석하고, 4℃에서 1시간 동안 포획 항원과 함께 인큐베이션하였다. 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하고, 0.2% DDM을 함유하는 차단 완충제 중에 희석된 퍼옥시다제에 접합된 항-인간 또는 항-마우스 IgG를 플레이트에 첨가하였다. 4℃에서 30분 인큐베이션한 후에, 플레이트를 상기 기재된 바와 같이 세척하고, TMB 기질을 플레이트에 첨가하였다. 퍼옥시다제 반응을 동등 부피의 1 M 인산에 의해 정지시키고, 광학 흡광도를 450 nm에서 판독하였다. 사용된 CRTh2 단백질의 양은 재조합 인간, 시노몰구스 및 레서스 CRTh2에 결합하는 항-CRTh2 Mab를 사용하여 ELISA에 의해 결정시에 웰의 포화를 달성하는데 충분하였다.
항체 인간화
Mab 19A2의 CDR 서열 (도 10)을 올리고뉴클레오티드-지정 부위 돌연변이유발에 의해 컨센서스 카파 1 (컨센서스 K1) 및 컨센서스 VH3 (컨센서스 H3) 프레임워크 상에 그라프팅하였다 (Dennis, M.S. (2010). CDR repair: A novel approach to antibody humanization. In Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, S.J. Shire, W. Gombotz, K. Bechtold-Peters and J. Andya, eds. (Springer, New York), pp. 9-28). 모 뮤린 19A2 항체에 존재하는 경쇄의 위치 71 (카바트 넘버링 시스템) 및 중쇄의 49에서의 프레임워크 잔기를 또한 인간화 항체 hu19A2.v1의 프레임워크 위치 내에 혼입시켰다 (도 11a 및 11b). Mab 8B1의 CDR 서열 (도 12)을 올리고뉴클레오티드-지정 부위 돌연변이유발에 의해 컨센서스 K1 및 컨센서스 VH1 (컨센서스 H1) 프레임워크 상에 그라프팅하였다. 모 뮤린 8B1 항체에 존재하는 경쇄의 위치 46, 66, 69 및 71 및 중쇄의 37, 67, 69, 71 및 91에서의 프레임워크 잔기를 또한 인간화 항체 hu8B1.v1의 프레임워크 위치 내로 혼입시켰다 (도 12). 모든 항체를 pRK5 벡터 내로 클로닝하였다. 인간화 항체를 293T 세포에서 인간 IgG1로 발현시키고, 단백질 A-세파로스 상의 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. Mab의 결합을 인간, 시노몰구스 및 레서스 CRTh2를 사용하여 ELISA에 의해 결정하였다.
친화도 성숙
hu19A2.v1의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 박테리오파지 M13의 p3 단백질에 융합된 Fab 단편을 디스플레이하는 파지 디스플레이 벡터 내로 클로닝하였다. 경쇄 또는 중쇄의 모든 3개 CDR을 제거하고 정지 코돈을 코딩하는 서열로 대체한 "정지" 주형 벡터의 2개 세트를 제조하였다. 무작위화 중쇄 또는 경쇄 CDR을 갖는 라이브러리를 올리고뉴클레오티드-지정 부위 돌연변이유발에 의해 생성하였다. 각 올리고뉴클레오티드가 NNK (N=A, T, C 또는 G; K=T 또는 G)로서 무작위화된 하나의 코돈을 갖는, 각 CDR에 대한 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 경쇄의 카바트 위치 27 내지 34, 50 내지 56 및 89 내지 97은 24개 올리고뉴클레오티드의 세트로 무작위화하였고, 카바트 위치 26 내지 35, 49 내지 58 및 95 내지 100a는 28개의 올리고뉴클레오티드로 무작위화하였다. 무작위화 라이브러리를 이. 콜라이 XL1-블루 세포 (애질런트 테크놀로지스(Agilent technologies)) 내로 전기천공시키고, 돌연변이체 헬퍼 파지 KO7+ (Lamboy et al., ChemBioChem 9: 2846 - 2852 (2008))를 사용하여 세포당 10개 입자-형성 단위의 감염 다중도로 감염시키고, 회수되도록 하고, 37℃에서 50 μg/ml 카르베니실린 및 100 μg/ml 카나마이신을 함유하는 2YT 브로쓰에서 밤새 성장시켰다. 세포를 원심분리에 의해 제거하고, 상청액 중 Fab를 디스플레이하는 파지를 농축시키고, PEG 침전 (ref)에 의해 정제하였다. 파지를 4 라운드의 선택에 적용시켰다. 각 라운드에서, 0.2% DDM을 함유하는 차단 완충제 중 파지를 뉴트라비딘-코팅된 ELISA 플레이트에 결합된, 야생형 서열 또는 Q16E 또는 R19H 돌연변이를 갖는 DDM-가용화된 인간 CRTh2와 함께 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 0.05% DDM을 함유하는 PBS로 세척하고, 파지를 10분 동안 100 μl의 0.1 N HCl로 용리시켰다. 파지를 수집하고, pH를 1/8 부피의 1 M 트리스 염기를 첨가하여 중화하였다. 파지를 사용하여 이. 콜라이 XL1-블루를 감염시키고, 상기 기재된 바와 같이 증식시켰다. 제4 라운드로부터의 파지를 사용하여 이. 콜라이 XL1-블루를 감염시키고, 50 μg/ml 카르베니실린을 함유하는 LB 상에 플레이팅하여 단리된 클론을 수득하였다. 클론을 디데옥시 사슬 종결제 방법에 의해 서열분석하고, 각 위치에서의 돌연변이를 표로 만들었다. 선호되는 돌연변이를 인간화 hu19A2.v1 인간 IgG1 클론 내로 도입하고, IgG를 인간 293T 세포에서 발현시키고, 친화성-크로마토그래피에 의해 정제하였다. 인간, 레서스 및 시노 CRTh2에 대한 IgG의 결합을 ELISA에 의해 시험하였다. 제2 세대 라이브러리를 경쇄 돌연변이 S31W 및 중쇄 돌연변이 Y58D를 포함하는 hu19A2.v12를 기준으로 하여 생성하였다. 이 제2 세대 라이브러리를, DDM 대신에 0.12% 디기토닌 중의 Sf9 세포에서 발현된 정제된 인간 및 시노몰구스 CRTh2 항원을 선택에서 사용하는 것을 제외하고는 상기 기재된 바와 같이 선택하였다. 또한 중쇄의 위치 31을, 그 위치에서 조합되어 트립토판 및 시스테인을 제외한 모든 아미노산을 코딩하는 축중성 코돈 NHK 및 VNK를 갖는 2개의 올리고뉴클레오티드로 무작위와하였다. 경쇄의 위치 31에서의 트립토판을 인간화 19A2.v58, 19A2.v60 및 19A2.v52에서 티로신으로 변경하였다. 19A2.v46은 위치 31에 티로신 보다 트립토판을 함유한다는 것을 제외하고는 19A2.52와 서열에 있어서 동일하다. 위치 56에서의 아스파르트산을 19A2.v60 및 다른 클론에서 글루탐산으로 변경하여 이성질체화 부위를 제거하였다.
마우스 및 인간화 항-인간 CRTh2 항체의 생성 및 시험관내 특성화
인간화 클론 h19A2.v1, h19A2.v46, 및 h19A2.v52를 293 세포 상에 발현된 인간 CRTh2와의 반응성에 대해 시험하였다. 19A2와 유사하게, 인간화 항-CRTh2 항체는 293 세포 상에 발현된 인간 CRTh2와 용량 의존성 방식으로 반응하였다 (도 15a). 추가로, 인간화 친화도 성숙 클론 h19A2.v12, h19A2.v46, 및 h19A2.v52는 또한 293 세포 상에 발현된 시노 및 레서스 CRTh2와의 용량-의존성 반응성을 제시한 반면 인간화 항체 h19A2.v1은 293 세포 상에 발현된 시노 및 레서스 CRTh2와 어떠한 반응성도 보이지 않았다 (도 15b). 또한, 인간화 및 친화도 성숙 항체 h19A2.v52는 전혈로부터의 1차 인간, 시노 및 레서스 호염기구 및 호산구와 용량-의존성 방식으로 반응하였다 (도 15c).
상동 경쟁을 이용한 방사성표지된 리간드 분석을 수행하여 293 세포 상에 표면 발현된 인간 및 시노몰구스 원숭이 CRTh2에 대한 항-CRTh2 항체의 해리 상수 (KD)를 평가하였다. 인간화 항체 h19A2.v52 및 h19A2.v46의 KD 값의 직접 측정을 얻기 위해, 이러한 항체의 Fab 단편을 생성하였다 (도 16). 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에 대한 인간화 항-CRTh2 클론 19A2.v52 및 19A2.v46 (IgG의 Fab 단편)의 KD 값은 각각 13.7 nM 및 6.4 nM이었다. 시노몰구스 원숭이 CRTh2를 발현하는 293 세포에 대한 h19A2.v52 및 h19A2.v46 (IgG의 Fab 단편)의 KD 값은 각각 21.3 nM 및 8.6 nM이었다. 이러한 측정치를 기준으로 하여, 시노몰구스 대비 인간 CRTh2에 대한 상대 결합 친화도는 h19A2.52에 대해 2배 이내이고 (도 16a 및 b), h19A2.v46에 대해 동등효력에 근접한 것으로 보인다 (도 16c 및 d).
인간화 및 친화도 성숙 항-CRTh2 항체의 차단 기능을 평가하기 위해, 인간 CRTh2를 발현하는 293 세포에서의 포르스콜린-유도된 cAMP 수준의 PGD2-매개된 억제에 대한 항-CRTh2 항체의 효과를 시험하였다. 포르스콜린 + PGD2 자극된 hCRTh2 발현 293 세포를 8B1 항체로 처리하는 것은 cAMP 수준을 용량-의존성 방식으로 증가시켰다 (도 17a). 따라서, 8B1 항체는 포르스콜린-유도된 cAMP 수준의 PGD2-매개된 감소를 용량-의존성 방식으로 차단하였으며, 이는 8B1이 PGD2에 반응하여 Th2 세포에서 칼슘 유동을 억제하는 그의 능력과 유사한 PGD2 기능 차단 능력을 가진다는 것을 나타낸다. 비교해 보면, h19A2.v52는 포르스콜린-유도된 cAMP 인간 CRTh2 293 세포 검정에서 PGD2 기능 차단 능력을 제시하지 않았다. 또한, 항-CRTh2 항체가 PGD2의 부재 하에서 포르스콜린-유도된 cAMP 수준에 대해 직접 효과를 나타내는지의 여부를 시험하였다. 도 17b에 제시된 바와 같이, 다양한 농도의 항-CRTh2 항체는 인간 CRTh2 293 세포에서 포르스콜린-유도된 cAMP 수준에 대해 어떠한 효과도 나타내지 않았으며, 이는 이러한 항체가 본 검정에서 효능작용 활성을 보이지 않는다는 것을 나타낸다. 비교해 보면 PGD2는 포르스콜린-유도된 cAMP 수준을 감소시켰다.
항-CRTh2 항체 19A2가 혈액, 비장 및 골수에서 CRTh2+ 호염기구 및 호산구를 생체내 고갈시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 19A2 항체의 단일 용량을 나타내어진 바와 같이 CRTh2.Bac.Tg 마우스에게 투여하였다 (도 18a 및 b). 20ug/마우스 또는 100ug/마우스 19A2의 단일 용량은 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같이, 제3일에 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서 말초 혈액 및 비장 내 호염기구 및 호산구를, 처리 후 제7일에 혈액, 비장 및 골수 내 호산구를 완전히 고갈시켰다 (도 18a, b 및 c). 호염기구의 유의한 고갈은 또한 처리 후 제7일에 비장에서의 두 용량 수준에서 관찰된 반면, 골수에서의 호염기구 고갈은 100ug/마우스 용량에서 보다 확연하였다. 혈액에서의 호염기구의 고갈은 처리 후 제7일에 가변성이었다.
인간화 및 친화도 성숙 항-CRTh2 항체 h19A2.v52가 혈액, 비장 및 골수에서 CRTh2+ 호염기구 및 호산구를 생체내 고갈시킬 수 있는지의 여부를 시험하기 위해, 0.5mg/kg 또는 10mg/kg 19A2.v52 hIgG1 항체의 단일 용량을 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에게 투여하였다 (도 19a). 0.5mg/kg 또는 10mg/kg h19A2.v52의 단일 용량은 유동 세포측정법에 의해 결정된 바와 같이 제2일에 인간 CRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 말초 혈액, 비장 또는 골수에서 호산구를 완전히 고갈시켰다. 제7일 및 제14일에 호산구는 10mg/kg 용량에서 비장 (도 19b) 및 골수 (도 19c)에서 고갈된 상태로 남아있었을 뿐만 아니라 혈액 (도 19a)에서 보다 큰 정도로 고갈된 상태로 남아있었다. 0.5mg/kg 용량과 비교해 보면, 호산구는 제7일에 부분적으로 및 제14일에 완전히 혈액, 비장 및 골수에서 기준선으로 돌아갔다. 또한, 호염기구의 유의한 고갈은 비장에서 제2일에 두 용량 수준에서 및 제7일에 10mg/kg 용량에서 관찰된 반면 골수에서의 호염기구 고갈은 제2일 및 제7일에 두 용량에서 보다 덜 확연하였다. 호염기구 수준은 비장에서 제7일에 0.5mg/kg 용량에서 및 비장 및 골수에서 제14일에 두 용량에서 기준선으로 돌아갔다.
항-CRTh2 항체의 이펙터 기능이 조직 내 CRTh2+ 세포의 효율적 고갈에 요구되는지의 여부를 평가하기 위해, hCRTh2.Bac.Tg 마우스에서의 TNP-OVA 유도된 만성 천식 모델에서 선천성 면역 세포 고갈 및 Th2 BAL 시토카인 생산의 감소에 대하여 Fc 돌연변이체 항-CRTh2 19A2_DANA 항체의 효과를 항-CRTh2 19A2와 비교하였다. i.p. 200 ug/마우스의 치료 요법에서 항체 19A2의 4회 용량은 폐 호산구, 호염기구 및 비만 세포를 각각 96%, 86% 및 72%만큼 고갈시켰으며 (도 20a), 이와 비교하여 19A2_DANA 처리는 폐에서 호산구, 호염기구 및 비만 세포를 각각 26%, 34% 및 31%만큼 단지 부분적으로만 감소시켰다 (도 20a). 또한, 기관지 폐포 세척 (BAL) 액에서의 호산구는 19A2 처리로 99% 고갈되었지만, 19A2_DANA 처리로는 단지 16% 고갈되었다. 또한, BAL 액에서의 Th2 시토카인 IL-4는 19A 처리 후에 100%만큼 감소된 반면에 19A2_DANA 처리는 BAL IL-4의 단지 20% 감소를 가져왔다 (도 20b).
<표 2>
인간화 19A2 변이체의 카바트 CDR 서열
Figure pct00005
Figure pct00006
<표 3>
항체 mu8B1, hu8B1.v1, mu3C12 및 mu31A5의 카바트 CDR 서열
Figure pct00007
뮤린 항체 가변 서열
Figure pct00008
인간화 8B1 가변 영역 서열
Figure pct00009
인간화 19A2 가변 영역 서열
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
Figure pct00015
인간화 19A2 전장 서열
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
페리오스틴 서열
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
상기 발명은 이해를 명확하게 하고자 하는 목적으로 예시 및 실시예로서 어느 정도 상세하게 기재되었지만, 상기 설명 및 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 그의 전문이 명백하게 참조로 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> REIF, Karin HOTZEL, Isidro HONGO, Jo-Anne S. 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Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe 225 230 235 240 Ile Glu Ala Glu Asp Asp Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr 245 250 255 Ser Asp Ile Leu Glu Ala Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe 260 265 270 Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu 275 280 285 Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His 290 295 300 Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val 305 310 315 320 Phe Glu Thr Leu Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp 325 330 335 Ser Ile Thr Val Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val 340 345 350 Thr Asn Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp 355 360 365 Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe 370 375 380 Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ala Leu Arg Pro Asp 385 390 395 400 Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp 405 410 415 Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His 420 425 430 Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile 435 440 445 Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr 450 455 460 Ala Val Cys Ile Glu Asn Ser Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly 465 470 475 480 Arg Asn Gly Ala Ile His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu 485 490 495 Lys Ser Leu His Glu Lys Leu Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe 500 505 510 Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys Glu Leu Leu Thr Gln Pro 515 520 525 Gly Asp Trp Thr Leu Phe Val Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met 530 535 540 Thr Ser Glu Glu Lys Glu Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala Leu Gln 545 550 555 560 Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly 565 570 575 Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys 580 585 590 Ile Phe Leu Lys Glu Val Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys 595 600 605 Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val 610 615 620 Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu 625 630 635 640 Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val 645 650 655 Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Val Thr Val Tyr Lys Pro Ile 660 665 670 Ile Lys Lys Tyr Thr Lys Ile Ile Asp Gly Val Pro Val Glu Ile Thr 675 680 685 Glu Lys Glu Thr Arg Glu Glu Arg Ile Ile Thr Gly Pro Glu Ile Lys 690 695 700 Tyr Thr Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr Leu Lys 705 710 715 720 Lys Leu Leu Gln Glu Asp Thr Pro Val Arg Lys Leu Gln Ala Asn Lys 725 730 735 Lys Val Gln Gly Ser Arg Arg Arg Leu Arg Glu Gly Arg Ser Gln 740 745 750 <210> 91 <211> 695 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 91 Met Ile Pro Phe Leu Pro Met Phe Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ile Val 1 5 10 15 Asn Pro Ile Asn Ala Asn Asn His Tyr Asp Lys Ile Leu Ala His Ser 20 25 30 Arg Ile Arg Gly Arg Asp Gln Gly Pro Asn Val Cys Ala Leu Gln Gln 35 40 45 Ile Leu Gly Thr Lys Lys Lys Tyr Phe Ser Thr Cys Lys Asn Trp Tyr 50 55 60 Lys Lys Ser Ile Cys Gly Gln Lys Thr Thr Val Leu Tyr Glu Cys Cys 65 70 75 80 Pro Gly Tyr Met Arg Met Glu Gly Met Lys Gly Cys Pro Ala Val Leu 85 90 95 Pro Ile Asp His Val Tyr Gly Thr Leu Gly Ile Val Gly Ala Thr Thr 100 105 110 Thr Gln Arg Tyr Ser Asp Ala Ser Lys Leu Arg Glu Glu Ile Glu Gly 115 120 125 Lys Gly Ser Phe Thr Tyr Phe Ala Pro Ser Asn Glu Ala Trp Asp Asn 130 135 140 Leu Asp Ser Asp Ile Arg Arg Gly Leu Glu Ser Asn Val Asn Val Glu 145 150 155 160 Leu Leu Asn Ala Leu His Ser His Met Ile Asn Lys Arg Met Leu Thr 165 170 175 Lys Asp Leu Lys Asn Gly Met Ile Ile Pro Ser Met Tyr Asn Asn Leu 180 185 190 Gly Leu Phe Ile Asn His Tyr Pro Asn Gly Val Val Thr Val Asn Cys 195 200 205 Ala Arg Ile Ile His Gly Asn Gln Ile Ala Thr Asn Gly Val Val His 210 215 220 Val Ile Asp Arg Val Leu Thr Gln Ile Gly Thr Ser Ile Gln Asp Phe 225 230 235 240 Ile Glu Ala Glu Asp Asp Leu Ser Ser Phe Arg Ala Ala Ala Ile Thr 245 250 255 Ser Asp Ile Leu Glu Ala Leu Gly Arg Asp Gly His Phe Thr Leu Phe 260 265 270 Ala Pro Thr Asn Glu Ala Phe Glu Lys Leu Pro Arg Gly Val Leu Glu 275 280 285 Arg Ile Met Gly Asp Lys Val Ala Ser Glu Ala Leu Met Lys Tyr His 290 295 300 Ile Leu Asn Thr Leu Gln Cys Ser Glu Ser Ile Met Gly Gly Ala Val 305 310 315 320 Phe Glu Thr Leu Glu Gly Asn Thr Ile Glu Ile Gly Cys Asp Gly Asp 325 330 335 Ser Ile Thr Val Asn Gly Ile Lys Met Val Asn Lys Lys Asp Ile Val 340 345 350 Thr Asn Asn Gly Val Ile His Leu Ile Asp Gln Val Leu Ile Pro Asp 355 360 365 Ser Ala Lys Gln Val Ile Glu Leu Ala Gly Lys Gln Gln Thr Thr Phe 370 375 380 Thr Asp Leu Val Ala Gln Leu Gly Leu Ala Ser Ala Leu Arg Pro Asp 385 390 395 400 Gly Glu Tyr Thr Leu Leu Ala Pro Val Asn Asn Ala Phe Ser Asp Asp 405 410 415 Thr Leu Ser Met Asp Gln Arg Leu Leu Lys Leu Ile Leu Gln Asn His 420 425 430 Ile Leu Lys Val Lys Val Gly Leu Asn Glu Leu Tyr Asn Gly Gln Ile 435 440 445 Leu Glu Thr Ile Gly Gly Lys Gln Leu Arg Val Phe Val Tyr Arg Thr 450 455 460 Ala Val Cys Ile Glu Asn Ser Cys Met Glu Lys Gly Ser Lys Gln Gly 465 470 475 480 Arg Asn Gly Ala Ile His Ile Phe Arg Glu Ile Ile Lys Pro Ala Glu 485 490 495 Lys Ser Leu His Glu Lys Leu Lys Gln Asp Lys Arg Phe Ser Thr Phe 500 505 510 Leu Ser Leu Leu Glu Ala Ala Asp Leu Lys Glu Leu Leu Thr Gln Pro 515 520 525 Gly Asp Trp Thr Leu Phe Val Pro Thr Asn Asp Ala Phe Lys Gly Met 530 535 540 Thr Ser Glu Glu Lys Glu Ile Leu Ile Arg Asp Lys Asn Ala Leu Gln 545 550 555 560 Asn Ile Ile Leu Tyr His Leu Thr Pro Gly Val Phe Ile Gly Lys Gly 565 570 575 Phe Glu Pro Gly Val Thr Asn Ile Leu Lys Thr Thr Gln Gly Ser Lys 580 585 590 Ile Phe Leu Lys Glu Val Asn Asp Thr Leu Leu Val Asn Glu Leu Lys 595 600 605 Ser Lys Glu Ser Asp Ile Met Thr Thr Asn Gly Val Ile His Val Val 610 615 620 Asp Lys Leu Leu Tyr Pro Ala Asp Thr Pro Val Gly Asn Asp Gln Leu 625 630 635 640 Leu Glu Ile Leu Asn Lys Leu Ile Lys Tyr Ile Gln Ile Lys Phe Val 645 650 655 Arg Gly Ser Thr Phe Lys Glu Ile Pro Val Thr Val Tyr Ser Pro Glu 660 665 670 Ile Lys Tyr Thr Arg Ile Ser Thr Gly Gly Gly Glu Thr Glu Glu Thr 675 680 685 Leu Lys Lys Leu Leu Gln Glu 690 695

Claims (72)

  1. 치료 유효량이 인간 대상체에게 투여되는 경우에 인간 CRTh2에 결합하며 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 단리된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 하기 유형의 CRTh2 발현 세포: Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포 중 하나 이상을 고갈시키는 항체.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, ADCC 및/또는 CDC 활성을 개선시키도록 조작된 항체.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, ADCC를 개선시키고/거나 CDC 활성을 감소시키도록 조작된 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 비-푸코실화된 항체.
  6. 제5항에 있어서, 알파1,6-푸코실트랜스퍼라제 (Fut8) 녹아웃을 갖는 세포주에서 생산된 항체.
  7. 제5항에 있어서, β1,4-N-아세틸글리코스미닐트랜스퍼라제 III (GnT-III)을 과다발현하는 세포주에서 생산된 항체.
  8. 제7항에 있어서, 세포주가 골지 α-만노시다제 II (ManII)를 추가로 과다발현하는 것인 항체.
  9. 제3항에 있어서, ADCC 및/또는 CDC 활성을 개선시키는 Fc 영역에서의 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함하는 항체.
  10. 제9항에 있어서, 아미노산 치환이 S298A/E333A/K334A인 항체.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 네이키드 항체인 항체.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 항체인 항체.
  13. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 항체인 항체.
  14. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체인 항체.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 이중특이적 항체인 항체.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, IgG1 항체인 항체.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CRTh2에 대한 하기 항체: 19A2, 8B1, 31A5 및 3C12 중 적어도 하나의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체.
  18. 제17항에 있어서, ELISA 검정이 경쟁적 결합을 결정하는데 사용되는 것인 항체.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 항-CRTh2 항체: 19A2, 8B1, 31A5 및 3C12 중 적어도 하나에 의해 결합된 CRTh2 에피토프와 동일하거나 또는 그와 중복되는 인간 CRTh2의 에피토프에 결합하는 항체.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 하기 항-CRTh2 항체: 19A2, 8B1, 31A5 및 3C12 중 하나로부터의 6개의 초가변 영역 (HVR)을 포함하는 항체.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 비-인간 영장류의 CRTh2에 결합하는 항체.
  22. 제21항에 있어서, 레서스 및/또는 시노몰구스 CRTh2에 결합하는 항체.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CRTh2 신호전달을 추가로 차단하는 항체.
  24. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 프로스타글란딘 D2에 반응한 CRTh2 발현 세포의 동원을 방지하는 항체.
  25. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, CRTh2 발현 세포에서 Ca2+ 유동을 차단하는 항체.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 CRTh2에 약 100 nM 이하의 Kd 값으로 결합하는 항체.
  27. 제1항에 있어서, 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 X1ISNGGSTTX2YPGTVEG (서열 5) (여기서 X1은 Y 또는 R이고, X2는 Y 또는 D임)를 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
  28. 제1항에 있어서, 서열 35 또는 36의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3, 서열 27의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3, 및 서열 32 또는 33의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2를 포함하는 항체.
  29. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 및 중쇄 가변 영역은 하기 6개의 초가변 영역 (HVR) 서열:
    (i) RASENIYXNLA (서열 1) (여기서 X는 S, W 또는 Y임)를 포함하는 HVR-L1;
    (ii) AATQLAX (서열 2) (여기서 X는 D, E 또는 S임)를 포함하는 HVR-L2;
    (iii) QHFWITPWT (서열 3)를 포함하는 HVR-L3;
    (iv) X1YX2MS (서열 4) (여기서 X1은 S 또는 F이고, X2는 S, L 또는 K임)를 포함하는 HVR-H1;
    (v) X1ISNGGSTTX2YPGTVEG (서열 5) (여기서 X1은 Y 또는 R이고, X2는 Y 또는 D임)를 포함하는 HVR-H2; 및
    (vi) HRTNWDFDY (서열 6)를 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 것인 단리된 항-CRTh2 항체.
  30. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 여기서 경쇄 가변 영역은 서열 7, 8 또는 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1, 서열 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2, 및 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3을 포함하는 것인 단리된 항-CRTh2 항체.
  31. 제29항에 있어서, 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 추가로 포함하는 항체.
  32. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 13, 14, 15, 16 또는 17의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1, 서열 18, 19, 20 또는 21의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2, 및 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3을 포함하는 중쇄 가변 영역을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (ii) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2;
    (iii) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (iv) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (v) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (vi) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 항체.
  34. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열 8의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (ii) 서열 10의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2;
    (iii) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (iv) 서열 13의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (v) 서열 19의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (vi) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 항체.
  35. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열 9의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L1;
    (ii) 서열 11의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L2;
    (iii) 서열 3의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-L3;
    (iv) 서열 15의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H1;
    (v) 서열 20의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H2; 및
    (vi) 서열 6의 아미노산 서열을 포함하는 HVR-H3
    을 포함하는 항체.
  36. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 38-53으로 이루어진 군으로부터 선택된 VL 서열을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체.
  37. 제36항에 있어서, 서열 54-65로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 추가로 포함하는 항체.
  38. 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 포함하며, 서열 54-65로 이루어진 군으로부터 선택된 VH 서열을 포함하는 단리된 항-CRTh2 항체.
  39. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 40의 VL 서열 및 서열 57의 VH 서열을 포함하는 항체.
  40. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 39의 VL 서열 및 서열 55의 VH 서열을 포함하는 항체.
  41. 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 서열 41의 VL 서열 및 서열 57의 VL 서열을 포함하는 항체.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체인 항체.
  43. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 인간화 또는 키메라 항체인 항체.
  44. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 프레임워크 서열의 적어도 일부가 인간 컨센서스 프레임워크 서열인 항체.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, Fab, Fab'-SH, Fv, scFc 또는 (Fab')2 단편으로부터 선택된 항체 단편인 항체.
  46. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항의 항체의 항원-결합 단편.
  47. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체 및 제46항의 항원-결합 단편을 코딩하는 단리된 핵산.
  48. 제47항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  49. 제48항의 숙주 세포를 배양하여 항체가 생산되도록 하는 것을 포함하는, 항체를 생산하는 방법.
  50. 제49항에 있어서, 숙주 세포에 의해 생산된 항체를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  51. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체 또는 제46항의 항원-결합 단편 및 세포독성제를 포함하는 면역접합체.
  52. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체 또는 제46항의 항원-결합 단편 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  53. 유효량의 항-CRTh2 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 대상체에서 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인, 천식을 치료하는 방법.
  54. 제53항에 있어서, 항체가 하기 유형의 CRTh2 발현 세포: Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포 중 하나 이상을 고갈시키는 것인 방법.
  55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 폐 조직으로부터 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인 방법.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 기관지폐포 세척액으로부터 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인 방법.
  57. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 폐로부터 적어도 하나의 유형의 CRTh2 발현 세포의 적어도 50%를 고갈시키는 것인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 폐로부터 적어도 하나의 유형의 CRTh2 발현 세포의 적어도 80%를 고갈시키는 것인 방법.
  59. 제57항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 항체를 투여하기 전의 기준선과 비교하여 폐로부터 적어도 하나의 유형의 CRTh2 발현 세포의 적어도 90%를 고갈시키는 것인 방법.
  60. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 소수 과립구성 천식을 앓고 있는 것인 방법.
  61. 제53항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 시토카인의 수준이 항-CRTh2 항체의 투여 후에 대상체에서 감소되는 것인 방법.
  62. 제61항에 있어서, 하기 세포 유형: Th2 세포, 비만 세포, 호산구, 호염기구 또는 선천성 유형 2 (IT2) 세포 중 적어도 하나에 의해 생산된 하나 이상의 시토카인의 수준이 감소되는 것인 방법.
  63. 제61항에 있어서, IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민 또는 류코트리엔 중 하나 이상의 수준이 대상체에서 감소되는 것인 방법.
  64. 제53항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 흡입용 코르티코스테로이드, 단기 작용 β2 효능제, 장기 작용 β2 효능제 또는 그의 조합에 의해 적절하게 제어되지 않는 천식을 앓고 있는 것인 방법.
  65. 제53항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
  66. 제53항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체 또는 제46항의 항원-결합 단편인 방법.
  67. 유효량의 항-CRTh2 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 대상체에서 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인, CRTh2 발현 세포에 의해 매개되는 장애를 치료하는 방법.
  68. 제67항에 있어서, 장애가 천식, 소수 과립구성 천식, 아토피성 피부염, 알레르기성 비염, 급성 또는 만성 기도 과민증, 과다호산구증가증성 증후군, 호산구성 식도염, 처그-스트라우스 증후군, 특발성 폐 섬유증, 시토카인과 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 염증, CRTh2 발현 세포와 연관된 악성종양, 만성 특발성 두드러기, 만성 자발성 두드러기, 물리적 두드러기, 한랭 두드러기, 압력-두드러기, 수포성 유천포창, 비강 폴립증, 식품 알레르기 및 알레르기성 기관지폐 아스페르길루스증 (ABPA)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체 또는 제46항의 항원-결합 단편인 방법.
  70. 유효량의 항-CRTh2 항체를 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 항체는 대상체에서 CRTh2 발현 세포를 고갈시키는 것인, 대상체에서 시토카인의 수준을 감소시키는 방법.
  71. 제70항에 있어서, 하나 이상의 IL-4, IL-5, IL-9, IL-13, IL-17, 히스타민 또는 류코트리엔의 수준이 대상체에서 감소되는 것인 방법.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 항-CRTh2 항체가 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항의 항체 또는 제46항의 항원-결합 단편인 방법.
KR1020157028534A 2013-03-15 2014-03-14 항-CRTh2 항체 및 그의 용도 KR20150131177A (ko)

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