BR112017008986B1 - Anticorpo isolado, imunoconjugado, formulação farmacêutica, e uso do anticorpo - Google Patents

Anticorpo isolado, imunoconjugado, formulação farmacêutica, e uso do anticorpo Download PDF

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Abstract

ANTICORPOS, ÁCIDO NUCLEICO, CÉLULA HOSPEDEIRA, MÉTODO PARA PRODUZIR UM ANTICORPO, IMUNOCONJUGADO, FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, USO DO ANTICORPO E MÉTODO DE TRATAMENTO DE UM INDIVÍDUO QUE TEM CÂNCER. A invenção fornece anticorpos anti-TIM3 e métodos de uso dos mesmos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se a anticorpos anti-TIM3 e métodos de uso dos mesmos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] TIM3 é uma proteína humana que pertence à superfamília de imunoglobulinas, e família TIM de proteínas. Em seres humanos, similar aos camundongos, TIM-3 é expressa em células T, bem como em células fagocíticas como macrófagos e células dendríticas. A ligação de TIM-3 a uma proteína ligante (por exemplo, galectina-9) pode inibir a resposta de Th1 através de mecanismo de indução de apoptose e, portanto, leva a essa indução de tolerância periférica. A redução na expressão de TIM-3 humana com siRNA ou a inibição de TIM-3 humana por anticorpo de bloqueio aumentou a secreção de interferon alfa a partir do células T CD4 positivas, apoiando o papel inibitório de TIM-3 em células T humanas. Em fagócitos, TIM-3 também funciona como um receptor para reconhecer as células de apoptose. A análise de amostras clínicas de pacientes com doença autoimune não mostrou nenhuma expressão de TIM- 3 em células CD4 positivas. Em específico, em clones de células T derivadas do líquido cefalorraquidiano de pacientes com esclerose múltipla, o nível de expressão de TIM-3 foi menor e o nível de secreção de IFN-gama foi maior que os clones derivados de pessoas saudáveis normais (Koguchi K et al., J Exp Med. 203 (2006) 1413-1418).
[003] Há relatos sobre a relação de TIM-3 com doenças alérgicas ou asma (documentos WO96/27603 e WO 2003/063792).
[004] De acordo com a análise de microarranjo de células-tronco hematopoiéticas de pacientes com leucemia mieloide aguda (desse ponto em diante citada como “AML”) e células hematopoiéticas normais, TIM-3 é expressa em células-tronco AML e portanto a análise sugeriu o envolvimento de TIM-3 em malignidades hematológicas (Majeti R et al., PNAS, 106 (2009) 3396-3401 e documento WO 2009/091547).
[005] Exemplos dos anticorpos monoclonais anti-TIM-3 incluem anticorpo monoclonal de rato anti-TIM-3 humano (Clone 344823, fabricado pela R&D Systems) e anticorpo monoclonal de camundongo anti-TIM-3 humano (Clone F38-2E2, fabricado pela R&D Systems). O documento WO 2013/06490 refere-se a anticorpos anti-TIM-3 que mostram rápida internalização e imunoconjugados dos mesmos para tratar câncer e reduzir a inflamação. A patente US 2012/189617 refere-se a anticorpos anti-TIM-3 que exibem atividade efetora mais alta como uma citotoxicidade celular dependente de anticorpo (atividade ADCC) para doenças relacionadas a uma célula que expressa TIM-3 humana.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[006] A invenção fornece anticorpos anti-TIM3 e métodos para usar os mesmos.
[007] Um aspecto da invenção é um anticorpo isolado que se liga a TIM3, em que o anticorpo: • induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™)) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C.
[008] Outro aspecto da invenção é esse anticorpo anti-TIM3, em que o anticorpo: • compete para ligação a TIM3 com um anticorpo anti-Tim3 que compreende a VH de SEQ ID NO: 7 e VL de SEQ ID NO: 8; • se liga a uma TIM3 humana e de cinomolgo; • mostra como imunoconjugado uma atividade citotóxica em células que expressam TIM3; • induz a liberação de interferon-gama.
[009] Em uma realização, o anticorpo anti-TIM3 de acordo com a invenção é um anticorpo monoclonal.
[0010] Em uma realização, o anticorpo anti-TIM3 de acordo com a invenção é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico.
[0011] Em uma realização, o anticorpo anti-TIM3 de acordo com a invenção é um fragmento de anticorpo que se liga a TIM3.
[0012] Em uma realização, o anticorpo anti-TIM3 de acordo com a invenção é um fragmento Fab.
[0013] Em uma realização, o anticorpo anti-TIM3 de acordo com a invenção compreende: A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (4); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (11); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou D) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou F) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou G) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou H) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou I) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou J) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66;
[0014] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0015] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82.
[0016] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[0017] A invenção fornece ainda um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86.
[0018] Em uma realização, o anticorpo anti-TIM3 de acordo com a invenção é um anticorpo IgG1 inteiro.
[0019] Em uma realização, o anticorpo anti-TIM3 de acordo com a invenção é um anticorpo IgG1 inteiro com mutações L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
[0020] Outro aspecto da invenção é um ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo de acordo com a invenção.
[0021] Outro aspecto da invenção é um imunoconjugado que compreende o anticorpo de acordo com a invenção e um agente citotóxico.
[0022] Em uma realização preferencial da invenção é esse imunoconjugado em que o agente citotóxico é uma Exotoxina A ou uma Amatoxina de Pseudomonas.
[0023] Outro aspecto da invenção é uma formulação farmacêutica que compreende o anticorpo de acordo com a invenção ou o imunoconjugado de acordo com a invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[0024] Outro aspecto da invenção é um anticorpo de acordo com a invenção ou um imunoconjugado de acordo com a invenção para uso como um medicamento.
[0025] Outro aspecto da invenção é um anticorpo de acordo com a invenção ou o imunoconjugado de acordo com a invenção para uso no tratamento de câncer.
[0026] Outro aspecto da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção ou o imunoconjugado de acordo com a invenção para uso na fabricação de um medicamento.
[0027] Outro aspecto da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção ou o imunoconjugado de acordo com a invenção para uso na fabricação de um medicamento para tratamento de câncer.
[0028] Outro aspecto da invenção é um método para tratar um indivíduo que tem câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo de acordo com a invenção ou do imunoconjugado de acordo com a invenção.
[0029] Os anticorpos anti-TIM3 da presente invenção apresentam propriedades altamente valiosas como uma rápida e forte internalização em células cancerosas que expressam TIM3, uma forte atividade citotóxica como imunoconjugado (por exemplo, quando conjugados com exotoxinas ou amatoxinas de Pseudomonas).Eles são, portanto, agentes terapêuticos úteis para o tratamento de diferentes cânceres, especialmente tumores no sangue, como leucemias e linfomas. Além disso, eles apresentam uma forte liberação de citocinas imunoestimulatórias em uma Reação Mista de Linfócitos (MLR) e são, portanto, úteis como terapia de câncer imunoestimulatória. Em adição ao anticorpo humanizado, as versões aprimoraram a ligação e especificidade de ligação para células T CD4 em comparação aos anticorpos parentais.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0030] Figura 1A: Internalização baseada em FACS dependente de tempo de anticorpo anti-TIM3 Tim3_0022 (abreviado como <TIM-3> Ab(022)) internalizado em células CHOK1 rec que expressam huTIM-3 após incubação a 37°C.
[0031] Figura 1B: Resultados do ensaio de internalização baseado em FACS mostram esse fragmento Fab de anticorpo anti-TIM3 Tim3_0022 (abreviado como <TIM-3> Ab(022)) internalizado em células rec CHOK1 que expressam huTIM-3 após incubação a 37°C com cinética similar como formato de IgG total.
[0032] Figura 2A: Ligação de anticorpos anti-TIM3 a células RPMI- 8226 (designação de anticorpo clone 0016 refere-se ao anticorpo Tim3_0016, clone 0016 refere-se ao anticorpo variante Tim3_0016 (anticorpo Tim3_0018), clone 0022 refere-se ao anticorpo Tim3_00122, etc).
[0033] Figura 2B: Ligação de anticorpos anti-TIM3 a células Pfeiffer (designação de anticorpo clone 0016 refere-se ao anticorpo Tim3_0016, clone 0016 refere-se ao anticorpo variante Tim3_0016 (anticorpo Tim3_0018), clone 0022 refere-se ao anticorpo Tim3_00122, etc).
[0034] Figura 3: nível de expressão de TIM-3 em diferentes amostras de células AML de pacientes por FACS com o uso de mAbs anti-TIM- 3.
[0035] Figura 4: Comparação direta de ligação de anticorpos TIM3 a diferentes células mononucleares do sangue periférico (Monócitos, células NK, células T, células T CD4).
[0036] 4A: % de células positivas às quais Tim3_0016 variante (anticorpo Tim3_0018) e versões humanizadas se ligam.
[0037] 4B: Intensidade de Fluorescência média - ligação de variante Tim3_0016 (anticorpo Tim3_0018) e versões humanizadas a diferentes células mononucleares do sangue periférico.
[0038] 4C: % de células positivas às quais Tim3_0028, quimérico e versões humanizadas se ligam.
[0039] 4D: Intensidade de fluorescência média - ligação de Tim3_0028, quimérico e versões humanizadas pra diferentes células mononucleares do sangue periférico.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS REALIZAÇÕES DA INVENÇÃO I. DEFINIÇÕES
[0040] Uma “estrutura humana aceitante” para os propósitos no presente pedido é uma estrutura que compreende a sequência de aminoácidos de uma estrutura de domínio variável da cadeia leve (VL) ou uma estrutura de domínio variável da cadeia pesada (VH) derivada a partir de uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana, conforme definido abaixo. Uma estrutura humana aceitante “derivada a partir de” uma estrutura de imunoglobulina humana ou de uma estrutura consenso humana pode compreender a mesma sequência de aminoácidos da mesma ou pode conter alterações na sequência de aminoácidos. Em algumas realizações, o número de trocas de aminoácidos é 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, 5 ou menos, 4 ou menos, 3 ou menos ou 2 ou menos. Em algumas realizações, a estrutura humana aceitante VL é idêntica em sequência à sequência de estrutura de imunoglobulina humana VL ou sequência de estrutura consenso humana. (definir linhagem germinativa se apropriado).
[0041] Os termos “anticorpo anti-TIM3” e “um anticorpo que se liga a TIM3” referem-se a um anticorpo que é capaz de se ligar a TIM3 com afinidade suficiente, de modo que o anticorpo seja útil como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico no direcionamento de TIM3. Em uma realização, o grau de ligação de um anticorpo anti-TIM3 em relação a uma proteína sem TIM3 não relacionada é menor que cerca de 10% da ligação do anticorpo em relação a TIM3 conforme medido, por exemplo, por um ensaio de Ressonância Plasmônica de Superfície (por exemplo, BIACORE). Em certas realizações, a proteína de ligação ao antígeno que se liga a TIM3 humana tem um valor de KD da afinidade de ligação para ligação a TIM3 humana < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M). Em uma realização preferencial, o respectivo valor KD das afinidades de ligação é determinado em um ensaio de ressonância plasmônica de superfície com o uso do domínio extracelular tipo selvagem (ECD) de TIM3 humana (TIM3-ECD) para a afinidade de ligação a TIM3.
[0042] O termo “anticorpo” no presente pedido é usado no sentido mais amplo e engloba várias estruturas de anticorpos, incluindo, mas não se limitando a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos) e fragmentos de anticorpos, desde que eles exibam a atividade de ligação de antígeno desejada.
[0043] Um “fragmento de anticorpo” refere-se a uma molécula diferente de um anticorpo intacto, que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga ao antígeno ao qual se liga o anticorpo intacto. Exemplos de fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, Fv, Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, diacorpos, anticorpos lineares, moléculas de anticorpo de cadeia única (por exemplo, scFv) e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos.
[0044] Um “anticorpo que se liga ao mesmo epítopo”, como um anticorpo de referência, refere-se a um anticorpo que bloqueia a ligação do anticorpo de referência ao seu antígeno em um teste competitivo em 50% ou mais, e inversamente, o anticorpo de referência bloqueia a ligação do anticorpo ao seu antígeno em um ensaio de competição em 50% ou mais. Um ensaio de competição exemplar é fornecido no presente pedido.
[0045] O termo anticorpo “quimérico” refere-se a um anticorpo em que uma porção da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivada de uma fonte ou espécie específica, enquanto o restante da cadeia pesada e/ou da cadeia leve é derivado de uma fonte ou espécie diferente.
[0046] A “classe” de um anticorpo refere-se ao tipo de domínio constante ou região constante possuída por sua cadeia pesada. Existem cinco classes principais de anticorpos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, e várias dessas ainda podem ser divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2. Os domínios constantes da cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são chamados de α, δ, ε, Y e μ, respectivamente.
[0047] O termo “agente citotóxico”, como usado no presente pedido, refere-se a uma substância que inibe ou previne uma função celular e/ou causa morte ou destruição das células. Agentes citotóxicos incluem, mas não se limitam a isótopos radioativos (por exemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu), agentes quimioterapêuticos ou drogas, por exemplo, metotrexato, adriamicina, alcaloides da vinca (vincristina, vinblastina, etoposídeo), doxorrubicina, melfalan, mitomicina C, clorambucila, daunorrubicina ou outros agentes intercalantes), agentes inibidores do crescimento, enzimas e fragmentos dos mesmos, como enzimas nucleolíticas, antibióticos, toxinas como toxinas de molécula pequena ou toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, e os vários agentes antitumor ou anticâncer divulgados abaixo.
[0048] Em uma realização preferencial, o “agente citotóxico” é uma exotoxina A de Pseudomonas (ou variantes da mesma) documentos WO 2005052006, WO 2007016150, WO 2007014743, WO 2007031741, WO 200932954, WO 201132022, WO 2012/154530 e WO 2012/170617, Liu W, et al, PNAS 109 (2012) 11782-11787, Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576 e Alewine C, et al, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61. Em uma realização preferencial, a “exotoxina A de Pseudomonas” tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 ou compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 (sua preparação também descrita em Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576 e Alewine C, et al, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61).
[0049] Em outra realização preferencial o “agente citotóxico” é uma amatoxina (ou variantes da mesma) conforme descrito, por exemplo, nos documentos WO2010/115630, WO2010/115629, WO2012/119787,WO2012/041504 e WO2014135282 com variantes preferenciais descritas no documento WO 2012/041504 (por exemplo, conjugada através do átomo 6’ C de aminoácido 4 de amatoxina, particularmente através de um átomo de oxigênio ligado ao átomo 6’ C de aminoácido amatoxina, e em que o anticorpo TIM3 é conectado por um ligante através de um componente ureia) e documento WO2014135282.
[0050] Uma “quantidade efetiva” de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade efetiva nas dosagens e por períodos de tempo necessários para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado.
[0051] O termo “região Fc” no presente pedido é usado para definir uma região C-terminal de uma cadeia pesada da imunoglobulina que contém pelo menos uma porção da região constante. O termo inclui regiões Fc de sequência nativa e regiões Fc variantes. Em uma realização, uma região Fc da cadeia pesada de IgG humana se estende a partir de Cys226 ou de Pro230 até a terminação carboxila da cadeia pesada. No entanto, a lisina C-terminal (Lys447) da região Fc pode ou não estar presente. A menos que especificado de outra forma no presente pedido, a numeração de resíduos de aminoácidos na região Fc ou região constante é de acordo com o sistema de numeração EU, também chamado de índice EU, conforme descrito em Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), NIH Publication 91-3242.
[0052] “Região de estrutura” ou “FR” refere-se a resíduos de domínio variável, exceto resíduos da região hipervariável (HVR). A FR de um domínio variável geralmente consiste em quatro domínios FR: FR1, FR2, FR3 e FR4. Consequentemente, as sequências de HVR e FR geralmente aparecem na seguinte sequência em VH (ou VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
[0053] Os termos “anticorpo inteiro”, “anticorpo intacto” e “anticorpo completo” são usados de forma intercambiável no presente pedido para se referir a um anticorpo que tem uma estrutura substancialmente similar a uma estrutura de anticorpo nativo ou que tem cadeias pesadas que contêm uma região Fc conforme definido no presente pedido.
[0054] Os termos “célula hospedeira”, “linhagem celular hospedeira” e “cultura celular hospedeira” são usados de forma intercambiável e referem-se às células em que o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie dessas células. Células hospedeiras incluem “transformantes” e “células transformadas”, que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada a partir das mesmas sem consideração ao número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica a uma célula parental no conteúdo de ácido nucleico, mas pode conter mutações. Progênies mutantes que têm a mesma função ou atividade biológica como as triadas ou selecionadas para a célula originalmente transformada são incluídas no presente pedido.
[0055] Um “anticorpo humano” é aquele que possui uma sequência de aminoácidos que corresponde àquela de um anticorpo produzido por uma célula humana ou uma célula humana derivada de uma fonte não humana que utiliza repertórios de anticorpos humanos ou outras sequências que codificam anticorpos humanos. Essa definição de um anticorpo humano especificamente exclui um anticorpo humanizado que compreende resíduos de ligação de antígenos não humanos.
[0056] Uma “estrutura consenso humana” é uma estrutura que representa a maioria dos resíduos de aminoácidos que ocorrem comumente em uma seleção de sequências de estrutura de VL ou VH de imunoglobulina humana. Geralmente, a seleção de sequências de VL ou VH de imunoglobulina humana é a partir de um subgrupo de sequências de domínio variável. Geralmente, o subgrupo de sequências é um subgrupo como em Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Bethesda MD (1991), Publicação NIH 91-3242, Volumes 1 a 3. Em uma realização, para a VL, o subgrupo é subgrupo kappa I, como em Kabat et al., acima. Em uma realização, para a VH, o subgrupo é subgrupo III como em Kabat et al., acima.
[0057] Um anticorpo “humanizado” refere-se a um anticorpo quimérico que compreende resíduos de aminoácidos de HVRs não humanas e resíduos de aminoácidos de FRs humanas. Em certas realizações, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as HVRs (por exemplo, CDRs) correspondem às de um anticorpo não humano e todas ou substancialmente todas as FRs correspondem àquelas de um anticorpo humano. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente compreender pelo menos uma porção de uma região constante do anticorpo derivada a partir de um anticorpo humano. Uma “forma humanizada” de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo não humano, refere-se a um anticorpo que foi submetido à humanização.
[0058] O termo “região hipervariável” ou “HVR”, como usado no presente pedido, refere-se a cada uma das regiões de um domínio variável do anticorpo que são hipervariáveis na sequência (“regiões determinantes de complementaridade” ou “CDRs”) e/ou formam alças estruturalmente definidas (“alças hipervariáveis”) e/ou contêm os resíduos que entram em contato com o antígeno (“contatos de antígeno”). Geralmente, anticorpos compreendem seis HVRs: três na VH (H1, H2, H3) e três na VL (L1, L2, L3). HVRs exemplares no presente pedido incluem: (a) alças hipervariáveis que ocorrem nos resíduos dos aminoácidos 26 a 32 (L1), 50 a 52 (L2), 91 a 96 (L3), 26 a 32 (H1), 53 a 55 (H2) e 96 a 101 (H3) (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)); (b) CDRs que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 24 a 34 (L1), 50 a 56 (L2), 89 a 97 (L3), 31 a 35b (H1), 50 a 65 (H2) e 95 a 102 (H3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); (c) contatos de antígeno que ocorrem nos resíduos de aminoácidos 27c a 36 (L1), 46 a 55 (L2), 89 a 96 (L3), 30 a 35b (H1), 47 a 58 (H2) e 93 a 101 (H3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); e (d) combinações de (a), (b) e/ou (c), incluindo resíduos de aminoácidos de HVR 46 a 56 (L2), 47 a 56 (L2), 48 a 56 (L2), 49 a 56 (L2), 26 a 35 (H1), 26 a 35b (H1), 49 a 65 (H2), 93 a 102 (H3) e 94 a 102 (H3).
[0059] A menos que indicado de outra forma, resíduos de HVR e outros resíduos no domínio variável (por exemplo, resíduos de FR) são numerados no presente pedido de acordo com Kabat et al., acima.
[0060] Um “imunoconjugado” é um anticorpo conjugado a uma ou mais molécula(s) heteróloga(s) incluindo, mas não se limitando a um agente citotóxico. Em uma realização preferencial, um imunoconjugado é um anticorpo anti-TIM3 conforme descrito no presente pedido conjugado a um ou mais agentes citotóxicos (preferencialmente uma Exotoxina A ou uma amatoxina de Pseudomonas).
[0061] Um “indivíduo” ou “sujeito” é um mamífero. Mamíferos incluem, mas não se limitam a, animais domesticados (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, primatas humanos e não humanos como macacos), coelhos e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). Em certas realizações, o indivíduo ou sujeito é um humano.
[0062] Um anticorpo “isolado” é aquele que foi separado a partir de um componente de seu ambiente natural. Em algumas realizações, um anticorpo é purificado para mais de 95% ou 99% de pureza, conforme determinado, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, SDS-PAGE, focalização isoelétrica (IEF), eletroforese por capilaridade) ou cromatografia (por exemplo, troca iônica ou HPLC de fase reversa). Para revisão de métodos para avaliação de pureza de anticorpo consulte, por exemplo, Flatman, S. et al., J. Chromatogr. B 848 (2007) 79-87.
[0063] Um ácido nucleico “isolado” refere-se a uma molécula de ácido nucleico que foi separada de um componente de seu ambiente natural. Uma molécula isolada inclui uma molécula de ácido nucleico contida nas células que normalmente contêm a molécula de ácido nucleico, mas a molécula de ácido nucleico está presente fora do cromossomo ou em um local do cromossomo diferente daquele de localização natural no cromossomo.
[0064] “Ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-TIM3” refere-se a uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam as cadeias pesada e leve do anticorpo (ou fragmentos do mesmo), incluindo molécula(s) de ácido nucleico em um único vetor ou vetores separados, e essa(s) molécula(s) de ácido nucleico(s) se apresenta(m) em um ou mais locais em uma célula hospedeira.
[0065] O termo “anticorpo monoclonal”, como usado no presente pedido, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogênea, isto é, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos e/ou se ligam ao mesmo epítopo, exceto por possíveis variantes de anticorpos, por exemplo, que contêm mutações que ocorrem naturalmente ou que surgem durante a produção de uma preparação de anticorpo monoclonal, essas variantes geralmente estando presentes em menores quantidades. Ao contrário das preparações de anticorpos policlonais, que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticorpo monoclonal de uma preparação de anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante em um antígeno. Dessa forma, o modificador “monoclonal” indica o caráter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser interpretado como uma exigência de produção do anticorpo por qualquer método específico. Por exemplo, os anticorpos monoclonais a serem usados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas incluindo, mas não se limitando ao método de hibridoma, métodos de DNA recombinante, métodos de exibição por fago, e métodos que utilizam animais transgênicos contendo tudo ou parte dos loci da imunoglobulina humana, esses métodos e outros métodos exemplares para produção de anticorpos monoclonais são descritos no presente pedido.
[0066] Um “anticorpo nu” refere-se a um anticorpo que não é conjugado a um componente heterólogo (por exemplo, componente citotóxico) ou radiomarcado. O anticorpo nu pode estar presente em uma formulação farmacêutica. (Incluir, se a técnica anterior tiver imunoconjugados).
[0067] “Anticorpos nativos” referem-se a moléculas de imunoglobulina que ocorrem naturalmente com estruturas variáveis. Por exemplo, os anticorpos IgG nativos são glicoproteínas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostas por duas cadeias leves idênticas e duas cadeias pesadas idênticas que são ligadas por bissulfeto. A partir da terminação N até C, cada cadeia pesada tem uma região variável (VH), também chamada de domínio variável pesado ou um domínio variável da cadeia pesada, seguido por três domínios constantes (CH1, CH2 e CH3). De maneira similar, a partir da terminação N a C, cada cadeia leve tem uma região variável (VL), também chamada de domínio variável leve ou um domínio variável da cadeia leve, seguido por um domínio constante leve (CL). A cadeia leve de um anticorpo pode ser atribuída para um dos dois tipos, chamados kappa (K) e lambda (A), com base na sequência de aminoácidos de seu domínio constante.
[0068] O termo “bula” é usado para se referir às instruções incluídas como de costume em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia de combinação, contraindicações e/ou advertências referentes ao uso desses produtos terapêuticos.
[0069] “Percentual (%) de identidade de sequência de aminoácidos” em relação a uma sequência de polipeptídeos de referência é definida como a porcentagem de resíduos de aminoácidos em uma sequência candidata que são idênticas aos resíduos de aminoácidos na sequência de polipeptídeos de referência, após alinhamento das sequências e introdução de gaps, se necessário, para alcançar o percentual máximo de identidade de sequência, e não considerando qualquer substituição conservativa como parte da identidade de sequência. Alinhamento, para os propósitos de determinação da porcentagem de identidade de sequência de aminoácidos, pode ser alcançado de várias maneiras, as quais estão dentro da técnica, por exemplo, com o uso de programas de computação disponíveis publicamente, como os programas de computação BLAST, BLAST-2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR). Os técnicos no assunto podem determinar parâmetros apropriados para alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para alcançar o alinhamento máximo ao longo das sequências inteiras sendo comparadas. Para os propósitos no presente pedido, no entanto, valores de % de identidade de sequência de aminoácidos são obtidos com o uso do programa de computador de comparação de sequências ALIGN-2. O programa de computador de comparação de sequência ALIGN-2 foi desenvolvido pela Genentech, Inc. e o código fonte foi depositado com a documentação de usuário no U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559, onde está registrado sob U.S. Copyright Registration n° TXU510087. O programa ALIGN-2 está publicamente disponível junto à Genentech, Inc., South San Francisco, Califórnia, ou pode ser compilado a partir do código fonte. O programa ALIGN-2 deve ser compilado para uso em um sistema operacional UNIX, inclusive UNIX V4.0D digital. Todos os parâmetros de comparação de sequência são definidos pelo programa ALIGN-2 e não variam.
[0070] Nas situações em que o ALIGN-2 é empregado para comparações de sequências de aminoácidos, a % de identidade de sequência de aminoácidos de uma dada sequência de aminoácidos A para, com ou contra, uma dada sequência de aminoácidos B (que pode alternativamente ser formulada como uma dada sequência de aminoácidos A que tem ou compreende certa % de identidade de sequência de aminoácidos a, com ou contra uma dada sequência de aminoácidos B) é calculada da seguinte forma:100 vezes a fração X/Y
[0071] em que X é o número de resíduos de aminoácidos pontuados como comparações idênticas pelo programa de alinhamento de sequências ALIGN-2 nesse alinhamento de programa de A e B, e em que Y é o número total de resíduos de aminoácidos em B. Considera-se que quando o comprimento da sequência de aminoácidos A não é igual ao comprimento da sequência de aminoácidos B, a % de identidade de sequência de aminoácidos A em relação a B não é igual à % de identidade de sequência de aminoácidos B em relação a A. A menos que especificamente declarado de outra forma, todos os valores de % de identidade de sequência de aminoácidos usados no presente pedido são obtidos conforme descrito no parágrafo imediatamente anterior, com o uso do programa de computador ALIGN-2.
[0072] O termo “formulação farmacêutica” refere-se a uma preparação que está em tal forma a permitir a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nesse para ser efetiva, e que não contém componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos para um sujeito ao qual a formulação seria administrada.
[0073] Um “veículo farmaceuticamente aceitável” refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, exceto um ingrediente ativo, que não é tóxico para um sujeito. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não se limita a, um tampão, excipiente, estabilizante ou conservante.
[0074] O termo “TIM3”, como usado no presente pedido, refere-se a qualquer proteína mucina imunoglobulina 3 de células T nativas (TIM3) (também conhecida como receptor 2 celular do vírus da hepatite A (HAVcr-2), molécula 3 de lesão renal (KIM-3), TIM-3, Tim3 ou Tim-3) a partir de qualquer fonte de vertebrados, incluindo mamíferos como primatas (por exemplo, humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos), a menos que indicado de outra forma. O termo engloba TIM3 não processado “inteiro”, bem como qualquer forma de TIM3 que resulta de processamento na célula. O termo também engloba variantes de TIM3 que ocorrem naturalmente, por exemplo, variantes de splicing ou variantes alélicas. A sequência de aminoácidos de um TIM3 humano exemplar é mostrada na SEQ ID NO: 77. A sequência de aminoácidos do Domínio Extracelular (ECD) de TIM3 é mostrada na SEQ ID NO: 78.
[0075] TIM3 é uma proteína humana que pertence à superfamília de imunoglobulinas, e família TIM de proteínas. Em seres humanos, como similar a camundongos, TIM-3 é expressa em células T, bem como células fagocíticas como macrófagos e células dendríticas. A ligação de TIM-3 a uma proteína ligante (por exemplo, galectina-9) pode inibir a resposta de Th1 através de mecanismo de indução de apoptose e, portanto, leva a essa indução de tolerância periférica. A redução na expressão de TIM-3 humana com siRNA ou a inibição de TIM-3 humana por anticorpo de bloqueio aumentou a secreção de interferon alfa a partir do células T CD4 positivas, apoiando o papel inibitório de TIM-3 em células T humanas. Em fagócitos, TIM-3 também funciona como um receptor para reconhecer as células de apoptose. A análise de amostras clínicas de pacientes com doença autoimune não mostrou nenhuma expressão de TIM- 3 em células CD4 positivas. Em específico, em clones de células T derivadas do líquido cefalorraquidiano de pacientes com esclerose múltipla, o nível de expressão da TIM-3 foi menor e o nível de secreção de IFN-gama maior que os clones derivados de pessoas saudáveis normais (Koguchi K et al., J Exp Med. 203 (2006) 1413-1418).
[0076] Há relatos sobre a relação de TIM-3 com doenças alérgicas ou asma (documentos WO 96/27603 e WO 2003/063792).
[0077] De acordo com a análise de microarranjo de células-tronco hematopoiéticas de pacientes com leucemia mieloide aguda (desse ponto em diante citada como “AML”) e células hematopoiéticas normais, TIM-3 é expressa em células-tronco AML e, portanto, a análise sugeriu o envolvimento de TIM-3 em malignidades hematológicas (Majeti R et al., PNAS, 106 (2009) 3396-3401 e documento WO 2009/091547).
[0078] Exemplos dos anticorpos monoclonais anti-TIM-3 incluem anticorpo monoclonal de rato anti-TIM-3 humano (Clone 344823, fabricado pela R&D Systems) e anticorpo monoclonal de camundongo anti-TIM-3 humano (Clone F38-2E2, fabricado pela R&D Systems).
[0079] Como usado no presente pedido, “tratamento” (e variações gramaticais do mesmo como “tratar” ou “tratando”) refere-se à intervenção clínica em uma tentativa de alterar o curso natural do indivíduo sendo tratado, e pode ser realizado tanto para profilaxia como durante o curso da patologia clínica. Efeitos desejados de tratamento incluem, mas não se limitam a, prevenção de ocorrência ou recorrência da doença, alívio de sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástase, diminuição da taxa de progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença e remissão ou prognósticos de melhora. Em algumas realizações, os anticorpos da invenção são usados para retardar o desenvolvimento de uma doença ou reduzir a progressão de uma doença.
[0080] O termo “região variável” ou “domínio variável” refere-se ao domínio de uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo, geralmente têm estruturas similares, com cada domínio compreendendo quatro regiões de estrutura conservadas (FRs) e três regiões hipervariáveis (HVRs). (Consulte, por exemplo, Kindt, T.J. et al. Kuby Immunology, 6a ed., W.H. Freeman e Co., N.Y. (2007), página 91). Um único domínio VH ou VL pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados com o uso de um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para selecionar uma biblioteca de domínios VL ou VH complementares, respectivamente. Consulte, por exemplo, Portolano, S. et al., J. Immunol. 150 (1993) 880-887; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628).
[0081] O termo “vetor”, como usado no presente pedido, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de reproduzir outro ácido nucleico ao qual está ligada. O termo inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, bem como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual este foi introduzido. Certos vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos para os quais eles são ligados de maneira funcional. Esses vetores são citados no presente pedido como “vetores de expressão”.
II. COMPOSIÇÕES E MÉTODOS
[0082] Em um aspecto, a invenção é baseada, em parte, na constatação de que os anticorpos anti-TIM3 selecionados da invenção se ligam a certos epítopos de TIM3, mostrando uma forte e rápida internalização e/ou alta atividade citotóxica contra células cancerosas como imunoconjugados e/ou mostrando uma forte liberação de citocina imunoestimulatória (por exemplo, interferon gama). Em certas realizações, são fornecidos anticorpos que se ligam a TIM3. Os anticorpos da invenção são úteis, por exemplo, para o diagnóstico ou tratamento de câncer.
A. ANTICORPOS ANTI-TIM3 EXEMPLARES
[0083] Em um aspecto, a invenção fornece anticorpos isolados que se ligam a TIM3. Em certas realizações, é fornecido um anti-TIM3, em que o anticorpo: • induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 50% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 55% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 60% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 65% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6).
[0084] Em certas realizações, é fornecido um anti-TIM3, em que o anticorpo: • compete para ligação a TIM3 com um anticorpo anti-Tim3 que compreende a VH e VL de Tim3_0016; • se liga a uma TIM3 humana e de cinomolgo; • mostra como imunoconjugado uma atividade citotóxica em células que expressam TIM3 (em uma realização os imunoconjugados têm um valor IC50 relativo da atividade citotóxica como exotoxina A de Pseudomonas conjugada em células RPMI-8226 de 0,1 ou menor (conforme medido no Exemplo 11); • induz a liberação de interferon gama (no ensaio MLR - consulte Exemplo 5).
[0085] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0086] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ou HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0087] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0088] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0089] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0090] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ou HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0091] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; ou HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; ou HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0092] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (4); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0093] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (11); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0094] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6.
[0095] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 8; ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 9 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 10; iii) ou variante humanizada de VH e VL do anticorpo em i) ou ii).
[0096] Em uma realização preferencial, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82.
[0097] Uma realização preferencial é um anticorpo que se liga ao anticorpo TIM3 humano, em que o anticorpo compreende uma de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80.
[0098] Uma realização preferencial é um anticorpo que se liga ao anticorpo TIM3 humano, em que o anticorpo compreende uma de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82.
[0099] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00100] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00101] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00102] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18.
[00103] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 19 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 20; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00104] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
[00105] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
[00106] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
[00107] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.
[00108] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 27 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 28; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00109] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00110] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00111] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00112] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34.
[00113] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 35 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 36; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00114] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[00115] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[00116] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[00117] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42.
[00118] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 43 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 44; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00119] Em uma realização preferencial, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86.
[00120] Uma realização preferencial é um anticorpo que se liga ao anticorpo TIM3 humano, em que o anticorpo compreende uma de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84.
[00121] Uma realização preferencial é um anticorpo que se liga ao anticorpo TIM3 humano, em que o anticorpo compreende uma de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86.
[00122] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[00123] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[00124] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[00125] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50.
[00126] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 51 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 52; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00127] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
[00128] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
[00129] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
[00130] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58.
[00131] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 59 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 60; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00132] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende pelo menos uma, duas, três, quatro, cinco ou seis HVRs selecionadas a partir de (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00133] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 que compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00134] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências de HVR de VH selecionadas a partir de (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende pelo menos uma, pelo menos duas, ou todas as três sequências HVR de VL selecionadas a partir de (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (c) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00135] Em outro aspecto, um anticorpo da invenção compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00136] Em uma realização, esse anticorpo anti-TIM3 compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 67 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 68; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00137] Em qualquer uma das realizações acima, um anticorpo anti-TIM3 é humanizado. Em uma realização, um anticorpo anti-TIM3 compreende HVRs como em qualquer uma das realizações acima, e ainda compreende uma estrutura humana aceitante, por exemplo, uma estrutura de imunoglobulina humana ou uma estrutura consenso humana. Em outra realização, um anticorpo anti-TIM3 compreende HVRs como em qualquer uma das realizações acima, e ainda compreende uma VH ou VL que compreende essa HVRs.
[00138] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-TIM3 fornecido no presente pedido. Por exemplo, em certas realizações, é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 8, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 9 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 10, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 19 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 20, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 27 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 28, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 35 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 36, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 43 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 44, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 51 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 52, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 59 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 60, ou um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo como um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 67 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 68.
[00139] Em uma realização preferencial, é fornecido um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 8.
[00140] Em uma realização preferencial, é fornecido um anticorpo que compete para ligação a TIM3 humana com um anticorpo anti-TIM3 que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 8 (conforme determinado em um ensaio de competição descrito no Exemplo 4 em células RPMI-8226 (ATCC® CCL-155™).
[00141] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 (por exemplo, um anticorpo que se liga a TIM3 humana), que compreende: A) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou C) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou D) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou E) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou F) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou. I) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou J) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00142] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 (por exemplo, um anticorpo que se liga a TIM3 humana) que compreende: K) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (4); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou L) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (11); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou M) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou N) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou O) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou. P) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou Q) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou R) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou S) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou T) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00143] Em um aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 (por exemplo, um anticorpo que se liga a TIM3 humana) que: A1) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 8; ii) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 9 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 10; iii) ou variante humanizada de VH e VL do anticorpo em i) ou ii); ou A2) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80, ou ii) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82; ou B) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 19 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 20; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i); ou C) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 27 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 28; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i); ou D) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 35 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 36; ii) ou variante humanizada de VH e VL do anticorpo em i); ou E) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 43 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 44; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i); ou F) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 51 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 52; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i); ou G1) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 59 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 60; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i); ou G2) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84, ou ii) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86; ou H) i) compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 67 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 68; ii) ou variante humanizada do VH e VL do anticorpo sob i).
[00144] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 (por exemplo, um anticorpo que se liga a TIM3 humana) que compreende: A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (4); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (11); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou D) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou F) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou G) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou H) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou I) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou J) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; em que o anticorpo é caracterizado de forma independente por uma ou mais dentre as seguintes propriedades: anticorpo anti-TIM3: • induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 50% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 55% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 60% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 65% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6).
[00145] Em outro aspecto, a invenção fornece um anticorpo anti- TIM3 (por exemplo, um anticorpo que se liga a TIM3 humana) que compreende: A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (4); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (11); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou D) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou. F) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou G) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou H) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou I) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou J) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66.
[00146] Em que o anticorpo é caracterizado de forma independente por uma ou mais dentre as seguintes propriedades: o anticorpo anti-TIM3: • Induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 50% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 55% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 60% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 65% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Compete para ligação a TIM3 com um anticorpo anti-Tim3 que compreende a VH de SEQ ID NO: 7 e VL de SEQ ID NO: 8; • Se liga a uma TIM3 humana e de cinomolgo; • Mostra como imunoconjugado uma atividade citotóxica em células que expressam TIM3 (em uma realização os imunoconjugados têm um valor IC50 relativo da atividade citotóxica como exotoxina A de Pseudomonas conjugada em células RPMI-8226 de 0,1 ou menor (conforme medido no Exemplo 11); • Induz a liberação de interferon gama (em um ensaio de Reação Mista de Linfócitos (MLR) conforme descrito no Exemplo 5).
[00147] Em um aspecto adicional da invenção, um anticorpo anti- TIM3 de acordo com qualquer uma das realizações acima é um anticorpo monoclonal, que inclui um anticorpo quimérico, humanizado ou humano. Em uma realização, um anticorpo anti-TIM3 é um fragmento de anticorpo, por exemplo, um fragmento Fv, Fab, Fab’, scFv, diacorpo ou F(ab’)2. Em outra realização, o anticorpo é um anticorpo inteiro, por exemplo, um anticorpo IgG1 ou IgG4 intacto ou outra classe de anticorpo ou isotipo conforme definido no presente pedido.
[00148] Em um aspecto adicional, um anticorpo anti-TIM3antibody de acordo com qualquer uma das realizações acima pode incorporar qualquer uma das características, individualmente ou em combinação, conforme descrito nas Seções 1 a 7 abaixo.
1. AFINIDADE DE ANTICORPO
[00149] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido tem uma constante de dissociação (KD) < 1 μM, < 100 nM, < 10 nM, < 1 nM, < 0,1 nM, < 0,01 nM ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, de 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, de 10-9 M a 10-13 M).
[00150] Em uma realização preferencial, KD é medido com o uso de ensaios de ressonância plasmônica de superfície com o uso de um BIACORE® a 25°C com chips CM5 de antígeno imobilizado a aproximadamente 10 unidades de resposta (RU). Resumidamente, chips biossensor dextrano carboximetilado (CM5, BIACORE Inc.) são ativados com hidrocloreto de N-etil- N’- (3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS), de acordo com as instruções do fornecedor. O antígeno é diluído com acetato de sódio 10 mM, pH 4,8, a 5 μg/mL (aproximadamente 0,2 μM) antes da injeção a uma taxa de fluxo de 5 μL/minuto para obter aproximadamente 10 unidades de resposta (RU) de proteína acoplada. Após a injeção de antígeno, etanolamina 1M é injetada para bloquear grupos não reagidos. Para medições cinéticas, diluições em série duas vezes de Fab (0,78 nM a 500 nM) são injetadas em PBS com tensoativo polissorbato 20 0,05% (TWEEN-20TM) (PBST) a 25°C a uma taxa de fluxo de aproximadamente 25 μL/min. As taxas de associação (kon ou ka) e taxas de dissociação (koff ou ka) são calculadas com o uso de um modelo de ligação Langmuir um para um simples (Programa de Computação de Avaliação BIACORE® versão 3.2) ajustando simultaneamente os sensorgramas de associação e dissociação. A constante de dissociação em equilíbrio KD é calculada como a razão kd/ka (koff/kon). Consulte, por exemplo, Chen, Y. et al., J. Mol. Biol. 293 (1999) 865-881). Se a taxa de associação exceder 106 M-1 s-1 pelo ensaio de ressonância plasmônica de superfície acima, então a taxa de associação pode ser determinada pelo uso de uma técnica de extinção de fluorescência que mede o aumento ou diminuição na intensidade de emissão de fluorescência (excitação = 295 nm; emissão = 340 nm, 16 nm de bandas de passagem) a 25°C de um anticorpo anti-antígeno 20nM em PBS (forma Fab), pH 1.2, na presença de concentrações crescentes de antígeno conforme medido em um espectrômetro, como um espectrofotômetro equipado com parada de fluxo (Aviv Instruments) ou um espectrofotômetro SLM-AMINCO™ série 8000 (ThermoSpectronic) com um cadinho misturador.
2. FRAGMENTOS DE ANTICORPOS
[00151] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um fragmento de anticorpo. Fragmentos de anticorpos incluem, mas não se limitam a, fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv e scFv, e outros fragmentos descritos abaixo. Para uma revisão de certos fragmentos de anticorpos, consulte Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129134). Para uma revisão de fragmentos scFv, consulte, por exemplo, Plueckthun, A., em The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore (eds.), Springer-Verlag, Nova York (1994), páginas 269-315; consulte também documento WO 93/16185; e patentes US 5.571.894 e 5.587.458. Para discussão de fragmentos Fab e F(ab’)2 que compreendem resíduos de epítopo que se ligam a receptores de resgate e têm meia-vida aumentada in vivo, consulte patente US 5.869.046.
[00152] Diacorpos são fragmentos de anticorpos com dois sítios de ligação ao antígeno que podem ser bivalentes ou biespecíficos. Consulte, por exemplo, patente EP 0 404 097; documento WO 1993/01161; Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; e Holliger, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448. Triacorpos e tetracorpos também são descritos em Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (20039 129-134).
[00153] Anticorpos com domínio único são fragmentos de anticorpos que compreendem todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas realizações, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano (Domantis, Inc., Waltham, MA; consulte, por exemplo, patente US 6.248.516 B1).
[00154] Fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas incluindo, mas não se limitando a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, bem como produção por células hospedeiras recombinantes (por exemplo, E. coli ou fago), conforme descrito no presente pedido.
3. ANTICORPOS QUIMÉRICOS E HUMANIZADOS
[00155] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um anticorpo quimérico. Certos anticorpos quiméricos são descritos, por exemplo, na patente US 4.816.567; e Morrison, S.L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984) 6851-6855). Em um exemplo, um anticorpo quimérico compreende uma região variável não humana (por exemplo, uma região variável derivada de um camundongo, rato, hamster, coelho ou primata não humano, como um macaco) e uma região constante humana. Em um exemplo adicional, um anticorpo quimérico é um anticorpo com “mudança de classe” em que a classe ou a subclasse foi alterada a partir daquela do anticorpo parental. Os anticorpos quiméricos incluem fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos.
[00156] Em certas realizações, um anticorpo quimérico é um anticorpo humanizado. Tipicamente, um anticorpo não humano é humanizado para reduzir a imunogenicidade para humanos, embora mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo parental não humano. Geralmente, um anticorpo humanizado compreende um ou mais domínios variáveis, em que, por exemplo, HVRs, por exemplo, CDRs, (ou porções das mesmas) são derivadas de um anticorpo não humano, e FRs (ou porções dos mesmos) são derivados de sequências de anticorpos humanos. Um anticorpo humanizado opcionalmente compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante humana. Em algumas realizações, alguns resíduos de FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo a partir do qual os resíduos de HVR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.
[00157] Anticorpos humanizados e métodos para produzir são revisados, por exemplo, em Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633, e ainda são descritos, por exemplo, em Riechmann, I. et al., Nature 332 (1988) 323-329; Queen, C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033; patentes US 5, 821.337, 7.527.791, 6.982.321 e 7.087.409; Kashmiri, S.V. et al., Methods 36 (2005) 25-34 (que descreve exnxerto de SDR (a-CDR)); Padlan, E.A., Mol. Immunol. 28 (1991) 489-498 (que descreve“resurfacing”); Dall’Acqua, W.F. et al., Methods 36 (2005) 43-60 (que descrevem “embaralhamento de FR”); e Osbourn, J. et al., Methods 36 (2005) 61-68 e Klimka, A. et al., Br. J. Cancer 83 (2000) 252-260 (que descrevem a abordagem “seleção guiada” para embaralhamento de FR).
[00158] Regiões de estrutura humanas que podem ser usadas para humanização incluem, mas não se limitam a: regiões de estrutura selecionadas com o uso do método de “melhor ajuste” (consulte, por exemplo, Sims, M.J. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2296-2308; regiões de estruturaderivadas a partir da sequência consenso de anticorpos humanos de um subgrupo específico de regiões variáveis da cadeia leve ou pesada (consulte, por exemplo, Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; e Presta, L.G. et al., J. Immunol. 151 (1993) 2623-2632); regiões de estrutura maduras humanas (mutadas somaticamente) ou regiões de estrutura de linhagem germinativa humana (consulte, por exemplo, Almagro, J.C. e Fransson, J., Front. Biosci. 13 (2008) 1619-1633); e regiões de estrutura derivadas de triagem de bibliotecas de FR (consulte, por exemplo, Baca, M. et al., J. Biol. Chem. 272 (1997) 10678-10684 e Rosok, M.J. et al., J. Biol. Chem. 271 (19969 22611-22618).
4. ANTICORPOS HUMANOS
[00159] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um anticorpo humano. Anticorpos humanos podem ser produzidos com o uso de várias técnicas conhecidas. Anticorpos humanos são geralmente descritos em van Dijk, M.A. e van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001) 368-374 e Lonberg, N., Curr. Opin. Immunol. 20 (2008) 450459).
[00160] Os anticorpos humanos podem ser preparados por administração de um imunógeno para um animal transgênico, que foi modificado para produzir anticorpos humanos intactos ou anticorpos intactos com regiões variáveis humanas em resposta à estimulação antigênica. Esses animais tipicamente contêm toda ou uma porção dos loci da imunoglobulina humana, que substitui os loci da imunoglobulina endógena, ou que estão presentes fora do cromossomo ou integrados aleatoriamente nos cromossomos do animal. Nesses camundongos transgênicos, os loci de imunoglobulina endógena geralmente foram inativados. Para revisão de métodos para obter anticorpos humanos a partir de animais transgênicos, consulte Lonberg, N., Nat. Biotech. 23 (2005) 1117-1125). Consulte também, por exemplo, patentes US 6.075.181 e 6.150.584 que descrevem a tecnologia XENOMOUSE™; patente US 5.770.429 que descreve a tecnologia HuMab®; patente US 7.041.870 que descreve a tecnologia K-M MOUSE®, e publicação de pedido de patente US 2007/0061900, que descreve a tecnologia VelociMouse®). Regiões variáveis humanas de anticorpos intactos gerados por esses animais podem ainda ser modificadas, por exemplo, por combinação com uma região constante humana diferente.
[00161] Anticorpos humanos também podem ser fabricados por métodos baseados em hibridoma. Linhagens celulares de mieloma humano e heteromieloma humano de camundongo foram descritas para produção de anticorpos monoclonais humanos. (Consulte, por exemplo, Kozbor, D., J. Immunol. 133 (1984) 3001-3005; Brodeur, B.R. et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nova York (1987), páginas 51-63; e Boerner, P. et al., J. Immunol. 147 (1991) 86-95). Anticorpos humanos gerados através de tecnologia de hibridoma de células B humanas também são descritos em Li, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006) 3557-3562. Métodos adicionais incluem aqueles descritos, por exemplo, na patente US 7.189.826 (que descreve a produção de anticorpos IgM monoclonais humanos de linhagens celulares de hibridomas) e Ni, Xiandai Mianyixue, 26 (2006) 265-268 (que descrevem hibridomas humano-humano). A tecnologia de hibridoma humano (tecnologia Trioma) também é descrita em Vollmers, H.P. e Brandlein, S., Histology and Histopathology 20 (2005) 927-937, e Vollmers, H.P., e Brandlein, S., Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology 27 (2005) 185-191.
[00162] Anticorpos humanos também podem ser gerados por isolamento de sequências de domínio variável de clone de Fv selecionadas a partir de bibliotecas de exibição por fago derivadas de humanos. Essas sequências de domínio variável podem então ser combinadas com um domínio constante humano desejado. Técnicas para seleção de anticorpos humanos a partir de bibliotecas de anticorpos são descritas abaixo.
5. ANTICORPOS DERIVADOS DE BIBLIOTECAS
[00163] Os anticorpos da invenção podem ser isolados por seleção de bibliotecas combinatórias para anticorpos com a atividade ou atividades desejadas. Por exemplo, uma variedade de métodos é conhecida na técnica para geração de bibliotecas de exibição por fago e seleção dessas bibliotecas para anticorpos que possuem as características de ligação desejadas. Esses métodos são revisados, por exemplo, em Hoogenboom, H.R. et al., Methods in Molecular Biology 178 (2001) 1-37 e ainda descrito, por exemplo, no McCafferty, J. et al., Nature 348 (1990) 552-554; Clackson, T. et al., Nature 352 (1991) 624-628; Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222 (1992) 581-597; Marks, J.D. e Bradbury, A., Methods in Molecular Biology 248 (2003) 161-175; Sidhu, S.S. et al., J. Mol. Biol. 338 (2004) 299-310; Lee, C.V. et al., J. Mol. Biol. 340 (2004) 1073-1093; Fellouse, F.A., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 (2004) 12467-12472; e Lee, C.V. et al., J. Immunol. Methods 284 (2004) 119-132.
[00164] Em certos métodos de exibição por fago, repertórios de genes de VH e VL são clonados separadamente por reação em cadeia da polimerase (PCR) e recombinados aleatoriamente em bibliotecas de fago, que podem ser então selecionados para fago de ligação de antígeno, conforme descrito em Winter, G. et al., Ann. Rev. Immunol. 12 (1994) 433-455). O fago tipicamente exibe fragmentos de anticorpos, tanto como fragmentos Fv de cadeia única (scFv) ou como fragmentos Fab. Bibliotecas de fontes imunizadas fornecem anticorpos com alta afinidade para o imunógeno sem a necessidade de construção de hibridomas. De maneira alternativa, o repertório virgem pode ser clonado (por exemplo, de humano) para fornecer uma fonte única de anticorpos para uma grande variedade de antígenos não próprios e também próprios sem qualquer imunização, conforme descrito por Griffiths, A.D. et al., EMBO J. 12 (1993) 725-734. Finalmente, bibliotecas virgens também podem ser produzidas sinteticamente por clonagem dos segmentos do gene V não rearranjados a partir de células-tronco e com o uso de primers de PCR que contém sequência aleatória para codificar as regiões de CDR3 altamente variáveis e para realizar o rearranjo in vitro, conforme descrito por Hoogenboom, H.R. e Winter, G., J. Mol. Biol. 227 (1992) 381-388). Publicações de patentes que descrevem bibliotecas de fago de anticorpo humano incluem, por exemplo: patente US 5.750.373 e publicações de patentes US 2005/0079574, 2005/0119455, 2005/0266000, 2007/0117126, 2007/0160598, 2007/0237764, 2007/0292936 e 2009/0002360.
[00165] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos isolados a partir de bibliotecas de anticorpos humanos são considerados anticorpos humanos ou fragmentos de anticorpos humanos descritos no presente pedido.
6. ANTICORPOS MULTIESPECÍFICOS
[00166] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido é um anticorpo multiespecífico, por exemplo, um anticorpo biespecífico. Os anticorpos multiespecíficos são anticorpos monoclonais que têm especificidades de ligação para pelo menos dois sítios diferentes. Em certas realizações, uma das especificidades de ligação é para TIM3 e a outra é para qualquer outro antígeno. Em certas realizações, os anticorpos biespecíficos podem se ligar a dois epítopos diferentes de TIM3. Anticorpos biespecíficos também podem ser usados para localizar agentes citotóxicos para células que expressam TIM3. Anticorpos biespecíficos podem ser preparados como anticorpos inteiros ou fragmentos de anticorpos.
[00167] As técnicas para fabricação de anticorpos multiespecíficos incluem, mas não se limitam a, coexpressão recombinante de dois pares da cadeia pesada-cadeia leve de imunoglobulina que têm especificidades diferentes (consulte, Milstein, C. e Cuello, A.C., Nature 305 (1983) 537-540, documento WO 93/08829, e Traunecker, A. et al., EMBO J. 10 (1991) 3655-3659), e “protuberância em orifício” elaborada geneticamente (consulte, por exemplo, patente US 5.731.168). Anticorpos multiespecíficos também podem ser produzidos por elaboração genética de efeitos de direcionamento eletrostático para produzir moléculas de anticorpo Fc- heterodiméricas (documento WO 2009/089004); reticulação de dois ou mais anticorpos ou fragmentos (consulte, por exemplo, patente US 4.676.980, e Brennan, M. et al., Science 229 (1985) 81-83); com o uso de zíperes de leucina para produzir anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Kostelny, S.A. et al., J. Immunol. 148 (1992) 1547-1553; com o uso de tecnologia “diacorpo” para produzir fragmentos de anticorpos biespecíficos (consulte, por exemplo, Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993) 6444-6448); e com o uso de dímeros Fv de cadeia única (scFv) (consulte, por exemplo, Gruber, M et al., J. Immunol. 152 (1994) 5368-5374); e preparação de anticorpos triespecíficos conforme descrito, por exemplo, em Tutt, A. et al., J. Immunol. 147 (1991) 6069).
[00168] Anticorpos elaborados geneticamente com três ou mais sítios de ligação ao antígeno funcionais, incluindo “anticorpos polvo”, também são incluídos no presente pedido (consulte, por exemplo, patente US 2006/0025576).
[00169] O anticorpo ou fragmento no presente pedido também inclui um “Fab de ação dupla” ou “DAF” que compreende um sítio de ligação de antígeno que se liga a TIM3, bem como a outro antígeno diferente (consulte, patente US 2008/0069820, por exemplo).
[00170] O anticorpo ou fragmento no presente pedido também inclui anticorpos multiespecíficos descritos nos documentos WO 2009/080251, WO 2009/080252, WO 2009/080253, WO 2009/080254, WO 2010/112193, WO 2010/115589, WO 2010/136172, WO 2010/145792, WO 2010/145793, WO2011/117330, WO2012/025525, WO2012/025530, WO2013/026835,WO2013/026831, WO2013/164325 ou WO 2013/174873.
7. VARIANTES DE ANTICORPOS
[00171] Em certas realizações, são contempladas sequências de aminoácidos variantes dos anticorpos fornecidos no presente pedido. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afinidade de ligação e/ou outras propriedades biológicas do anticorpo. Sequências de aminoácidos variantes de um anticorpo podem ser preparadas por introdução apropriada de modificações na sequência de nucleotídeos que codifica o anticorpo, ou por síntese peptídica. Essas modificações incluem, por exemplo, deleções, inserções e/ou substituições de resíduos dentro das sequências de aminoácidos do anticorpo. Qualquer combinação de deleção, inserção e substituição pode ser feita para se chegar ao constructo final, contanto que o constructo final possua as características desejadas, por exemplo, ligação de antígeno.
A) VARIANTES DE SUBSTITUIÇÃO, INSERÇÃO E DELEÇÃO
[00172] Em certas realizações, são fornecidas variantes de anticorpos que têm uma ou mais substituições de aminoácidos. Sítios de interesse para mutagênese de substituição incluem as HVRs e FRs. Aterações exemplares são fornecidas na Tabela 1, sob o título de “substituições exemplares”, e conforme ainda descritas abaixo, em referência às classes de cadeia laterais de aminoácidos. Substituições conservativas são mostradas na Tabela 1 sob o título de “substituições preferenciais”. As substituições de aminoácidos podem ser introduzidas em um anticorpo de interesse e os produtos selecionados para uma atividade desejada, por exemplo, ligação ao antígeno retida/aprimorada, diminuição de imunogenicidade e ADCC ou CDC aprimorada.TABELA 1
[00173] Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades comuns da cadeia lateral: (1) hidrofóbico: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) hidrofílico neutro: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácido: Asp, Glu; (4) básico: His, Lys, Arg; (5) resíduos que influenciam na orientação da cadeia: Gly, Pro; (6) aromático: Trp, Tyr, Phe.
[00174] Substituições não conservativas irão implicar na troca de um membro de uma dessas classes por outra classe.
[00175] Um tipo de variante substitucional envolve substituir um ou mais resíduos de região hipervariável de um anticorpo parental (por exemplo, um anticorpo humanizado ou humano). Geralmente, a(s) variante(s) resultante(s) selecionada(s) para estudo posterior terão modificações (por exemplo, aprimoramentos) em certas propriedades biológicas (por exemplo, afinidade aumentada, imunogenicidade reduzida) em relação ao anticorpo parental e/ou terão certas propriedades biológicas substancialmente mantidas do anticorpo parental. Uma variante substitucional exemplar é um anticorpo de afinidade maturada, que pode ser convenientemente gerado, por exemplo, com o uso de técnicas de maturação de afinidade com base na exibição por fago conforme essas descritas no presente pedido. Resumidamente, um ou mais resíduos de HVR são mutados e as variantes de anticorpos exibidas em fago e selecionadas para uma atividade biológica específica (por exemplo, afinidade de ligação).
[00176] Alterações (por exemplo, substituições) podem ser feitas em HVRs, por exemplo, para aprimorar a afinidade do anticorpo. Essas alterações podem ser produzidas em “hotspots” de HVR, isto é, resíduos codificados por códons que são submetidos a mutação em alta frequência durante o processo somático de maturação (consulte, por exemplo, Chowdhury, P.S., Methods Mol. Biol. 207 (2008) 179-196), e/ou SDRs (a-CDRs), com a VH ou VL variante resultante sendo testada quanto à afinidade de ligação. Afinidade de maturação por construção e reseleção de bibliotecas secundárias foi descrita, por exemplo, em Hoogenboom, H.R. et al. em Methods in Molecular Biology 178 (2002) 1-37. Em algumas realizações de maturação de afinidade é introduzida diversidade nos genes variáveis escolhidos para maturação por qualquer um de uma variedade de métodos (por exemplo, PCR propensa a erro, embaralhamento de cadeia ou mutagênese direcionada por oligonucleotídeo). Uma biblioteca secundária é então criada. A biblioteca é então selecionada para identificar quaisquer variantes de anticorpos com a afinidade desejada. Qualquer método para introduzir diversidade envolve abordagens direcionadas a HVR, na qual diversos resíduos de HVR (por exemplo, 4 a 6 resíduos de uma vez) são randomizados. Resíduos de HVR envolvidos em ligação ao antígeno podem ser especificamente identificados, por exemplo, com o uso de mutagênese ou modelagem de varredura de alanina. CDR-H3 e CDR-L3 em particular, são muitas vezes alvo.
[00177] Em certas realizações, substituições, inserções ou deleções podem ocorrer dentro de uma ou mais HVRs contanto que essas alterações não reduzam substancialmente a capacidade do anticorpo se ligar ao antígeno. Por exemplo, alterações conservativas (por exemplo, substituições conservativas conforme fornecidas no presente pedido) que não reduzam substancialmente a afinidade de ligação podem ser feitas em HVRs. Essas alterações podem estar fora de “hotspots” de HVR ou SDRs. Em certas realizações das sequências de VH e VL variantes fornecidas acima, cada HVR tanto não é alterada como contêm não mais que uma, duas ou três substituições de aminoácidos.
[00178] Um método útil para identificação de resíduos ou regiões de um anticorpo que pode ser direcionado para mutagênese é chamado de “mutagênese de varredura de alanina” conforme descrito por Cunningham, B.C. e Wells, J.A., Science 244 (1989) 1081-1085. Nesse método, um resíduo ou grupo de resíduos alvo (por exemplo, resíduos carregados como arg, asp, his, lys e glu) são identificados e substituídos por um aminoácido carregado negativamente ou neutro (por exemplo, alanina ou polialanina) para determinar se a interação do anticorpo com o antígeno é afetada. Além disso, podem ser introduzidas substituições nas localizações de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional às substituições iniciais. De maneira alternativa ou adicionalmente, uma estrutura cristalina de um complexo antígeno-anticorpo para identificar pontos de contato entre o anticorpo e o antígeno. Esses resíduos de contato e resíduos vizinhos podem ser direcionados ou eliminados como candidatos para substituição. As variantes podem ser selecionadas para determinar se contêm as propriedades desejadas.
[00179] Inserções de sequência de aminoácidos incluem fusões amino e/ou carbóxi-terminal, variando, de comprimento, de um resíduo a polipeptídeos que contêm uma centena ou mais de resíduos, bem como inserções intrassequência de resíduos de aminoácidos únicos ou múltiplos. Exemplos de inserções terminais incluem um anticorpo com um resíduo metionina N-terminal. Outras variantes de inserção da molécula de anticorpo incluem a fusão à terminação N ou C do anticorpo a uma enzima (por exemplo, para ADEPT) ou um polipeptídeo que aumenta a meia-vida no soro do anticorpo.
B) VARIANTES DE REGIÕES FC
[00180] Em certas realizações, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidas na região Fc de um anticorpo fornecido no presente pedido, gerando assim uma região Fc variante. A região Fc variante pode compreender uma sequência de região Fc humana (por exemplo, uma região Fc de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana) que compreende uma modificação de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos.
[00181] Anticorpos com função efetora reduzida incluem os com substituições de um ou mais resíduos da região Fc 238, 265, 269, 270, 297, 327 e 329 (patente US 6.737.056). Esses mutantes Fc incluem mutantes Fc com substituições em duas ou mais posições dos aminoácidos 265, 269, 270, 297 e 327, incluindo o também conhecido como mutante Fc “DANA” com substituições dos resíduos 265 e 297 para alanina (patente US 7.332.581).
[00182] São descritas certas variantes de anticorpos com ligação melhorada ou diminuída para FcRs. (Consulte, por exemplo, patente US 6.737.056, documento WO 2004/056312 e Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604).
[00183] Em uma realização da invenção, esse anticorpo é um IgG1 com mutações L234A e L235A ou com mutações L234A, L235A e P329G. Em outra realização, ou IgG4 com mutações S228P e L235E ou S228P, L235E e/ou P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat et al, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).
[00184] Anticorpos com meia-vida aumentada e ligação aprimorada para o receptor Fc neonatal (FcRn), que é responsável pela transferência de IgGs maternas para os fetos (Guyer, R.L. et al., J. Immunol. 117 (1976) 587-593, e Kim, J.K. et al., J. Immunol. 24 (1994) 2429-2434), são descritos na patente US 2005/0014934. Esses anticorpos compreendem uma região Fc com uma ou mais substituições nesse, que melhoram a ligação da região Fc ao FcRn. Essas variantes de Fc incluem as com substituições em um ou mais resíduos da região Fc: 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 ou 434, por exemplo, substituição do resíduo 434 da região Fc (patente US 7.371.826).
[00185] Consulte também, Duncan, A.R. e Winter, G., Nature 322 (1988) 738-740; patente US 5.648.260; patente US 5.624.821; e documento WO 94/29351 com relação a outros exemplos de variantes de região Fc.
c) VARIANTES DE ANTICORPOS ELABORADOS GENETICAMENTE COM CISTEÍNA
[00186] Em certas realizações, pode ser desejável criar anticorpos elaborados geneticamente com cisteína, por exemplo, “thioMAbs”, em que um ou mais resíduos de um anticorpo são substituídos por resíduos de cisteína. Em realizações específicas, os resíduos substituídos ocorrem em sítios acessíveis do anticorpo. Mediante a substituição desses resíduos por cisteína, os grupos tióis reativos são, através disso, posicionados em sítios acessíveis do anticorpo e podem ser usados para conjugar o anticorpo a outros componentes, como componentes droga ou componentes ligante-droga, para criar um imunoconjugado, conforme ainda descrito no presente pedido. Em certas realizações, qualquer um ou mais dos seguintes resíduos podem ser substituídos por cisteína: V205 (numeração de Kabat) da cadeia leve; A118 (numeração EU) da cadeia pesada; e S400 (numeração EU) da região Fc da cadeia pesada. Anticorpos elaborados geneticamente com cisteína podem ser gerados conforme descrito, por exemplo, na patente US 7.521.541.
D) ANTICORPOS DERIVADOS
[00187] Em certas realizações, um anticorpo fornecido no presente pedido pode ser ainda modificado para conter componentes não proteináceos adicionais que são conhecidos na técnica e prontamente disponíveis. Os componentes adequados para derivatização do anticorpo incluem, mas não se limitam a, polímeros solúveis em água. Exemplos não limitantes de polímeros solúveis em água incluem, mas não se limitam a, polietileno glicol (PEG), copolímeros de etileno glicol/propileno glicol, carboximetilcelulose, dextrana, álcool polivinílico, polivinil pirrolidona, poli-1, 3- dioxolano, poli-1,3,6-trioxano, copolímero anidrido etileno/maleico, poliaminoácidos (tanto homopolímeros como copolímeros aleatórios), e dextrana ou poli(n-vinil pirrolidona)polietileno glicol, homopolímeros de propropileno glicol, copolímeros de óxido de prolipropileno/óxido de etileno, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol), álcool polivinílico e misturas dos mesmos. Propionaldeído de polietileno glicol pode ter vantagens na fabricação, devido a sua estabilidade em água. O polímero pode ter qualquer peso molecular e pode ser ramificado ou não ramificado. O número de polímeros fixados ao anticorpo pode variar, e se mais que um polímero for fixado, eles podem ser moléculas iguais ou diferentes. Em geral, o número e/ou tipo de polímero usado para derivatização pode ser determinado com base nas considerações que incluem, mas não se limitam a, propriedades específicas ou funções do anticorpo a serem melhoradas, se o anticorpo derivado for usado em uma terapia sob condições definidas, etc.
[00188] Em outra realização, são fornecidos conjugados de um anticorpo e componentes não proteináceos que podem ser seletivamente aquecidos por exposição à radiação. Em uma realização, o componente não proteináceo é um nanotubo de carbono (Kam, N.W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102 (2005) 11600-11605). A radiação pode ter qualquer comprimento de onda e inclui, mas não se limita a, comprimentos de onda que não são prejudiciais às células comuns, mas que aquecem o componente não proteináceo a uma temperatura na qual as células próximas ao componente não proteináceo do anticorpo são destruídas.
B. MÉTODOS RECOMBINANTES E COMPOSIÇÕES
[00189] Anticorpos podem ser produzidos com o uso de métodos recombinantes e composições, por exemplo, conforme descrito na patente US 4.816.567. Em uma realização, é fornecido o ácido nucleico isolado que codifica um anticorpo anti-TIM3 descrito no presente pedido. Esse ácido nucleico pode codificar uma sequência de aminoácidos que compreende a VL e/ou uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo (por exemplo, as cadeias leves e/ou pesadas do anticorpo). Em uma realização adicional, são fornecidos um ou mais vetores (por exemplo, vetores de expressão) que compreendem esse ácido nucleico. Em uma realização adicional, é fornecida uma célula hospedeira que compreende esse ácido nucleico. Nessa realização, uma célula hospedeira compreende (por exemplo, foi transformada com): (1) um vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo, ou (2) um primeiro vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VL do anticorpo e um segundo vetor que compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos que compreende a VH do anticorpo. Em uma realização, a célula hospedeira é eucarionte, por exemplo, célula de Ovário de Hamster Chinês (CHO) ou célula linfoide (por exemplo, célula Y0, NS0, Sp20). Em uma realização, é fornecido um método de produção de um anticorpo anti-TIM3, em que o método compreende cultivar uma célula hospedeira que compreende um ácido nucleico que codifica o anticorpo, conforme fornecido acima, sob condições adequadas para expressão do anticorpo e opcionalmente recuperação do anticorpo a partir das células hospedeiras (ou meio de cultura de célula hospedeira).
[00190] Para produção recombinante de um anticorpo anti-TIM3, o ácido nucleico que codifica um anticorpo, por exemplo, conforme descrito acima, é isolado e inserido em um ou mais vetores para clonagens adicionais e/ou expressão em uma célula hospedeira. Esse ácido nucleico pode ser prontamente isolado e sequenciado com o uso de procedimentos convencionais (por exemplo, com o uso de sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves do anticorpo).
[00191] Células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressão de vetores que codificam anticorpos incluem células procariontes ou eucariontes descritas no presente pedido. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em bactérias, em particular, quando não é necessária glicosilação e função efetora de Fc. Para expressão de fragmentos de anticorpos e polipeptídeos em bactérias, consulte, por exemplo, patentes US 5.648.237, US 5.789.199 e US 5.840.523. (Consulte também Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), páginas 245-254, que descreve expressão de fragmentos de anticorpos em E. coli). Após expressão, o anticorpo pode ser isolado a partir da pasta celular bacteriana em uma fração solúvel e pode ser purificado.
[00192] Além de procariontes, micróbios eucariontes como fungos filamentosos ou leveduras são hospedeiros de clonagem ou expressão adequados para vetores que codificam anticorpos, incluindo linhagens de fungos e leveduras, cujas vias de glicosilação foram “humanizadas”, resultando na produção de um anticorpo com um padrão de glicosilação parcialmente ou totalmente humano. Consulte Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 14091414; e Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215).
[00193] Células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados também são derivadas a partir de organismos multicelulares (invertebrados e vertebrados). Exemplos de células de invertebrados incluem células vegetais e de insetos. Foram identificadas numerosas linhagens de baculovírus que podem ser usadas em conjunto com células de inseto, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.
[00194] Culturas celulares de plantas também podem ser usadas como hospedeiras. Consulte, por exemplo, patentes US 5.959.177, 6.040.498, 6.420.548, 7.125.978 e 6.417.429 (que descrevem tecnologia PLANTIBODIESTM para produção de anticorpos em plantas transgênicas).
[00195] Células de vertebrados também podem ser usadas como hospedeiras. Por exemplo, linhagens celulares de mamíferos que são adaptadas para crescer em suspensão podem ser úteis. Outros exemplos de linhagens celulares hospedeiras de mamíferos úteis são linhagens CV1 de rim de macaco transformadas por SV40 (COS-7), linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 conforme descrito, por exemplo, em Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74); células de rim de filhote de hamster (BHK); células de Sertoli de camundongo (células TM4 conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252); células de rim de macaco (CV1); células de rim de macaco verde africano (VERO-76); células de carcinoma cervical humano (HELA); células de rim canino (MDCK; células de fígado de rato búfalo (BRL 3A); células de pulmão humano (W138); células de fígado humano (Hep G2); tumor mamário de camundongo (MMT 060562); células TRI, conforme descrito, por exemplo, em Mather, J.P., et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68; células MRC 5; e células FS4. Outras linhagens celulares hospedeiras de mamífero incluem células de ovário de hamster chinês (CHO), incluindo células CHO DHFR- (Urlaub, G., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); e linhagens celulares de mieloma, como Y0, NS0 e Sp2/0. Para uma revisão de determinadas linhagens celulares hospedeiras de mamíferos para produção de anticorpos, consulte, por exemplo, Yazaki, P. e Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), páginas 255-268.
C. ENSAIOS
[00196] Os anticorpos anti-TIM3 fornecidos no presente pedido podem ser identificados, selecionados ou caracterizados por suas propriedades físicas/químicas e/ou atividades biológicas por vários ensaios conhecidos na técnica.
1. ENSAIOS DE LIGAÇÃO E OUTROS ENSAIOS
[00197] Em um aspecto, um anticorpo da invenção é testado quanto à sua atividade de ligação ao antígeno, por exemplo, por métodos conhecidos como ELISA, Western blot, etc.
[00198] Em outro aspecto, ensaios de competição podem ser usados para identificar um anticorpo que compete com Tim3_0016 (que compreende uma sequência de VH de SEQ ID NO: 7 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 8) para ligação a TIM3 (ou alternativamente com o Tim3_0018 anticorpo variante Tim3_0016 com as 6 HVRs idênticas). Dessa forma, uma realização da invenção é um anticorpo que compete para a ligação a TIM3 humana com um anticorpo anti-TIM3 que compreende todas as 3 HVRs da sequência de VH de SEQ ID NO: 7 e todas as 3 HVRs da sequência de VL de SEQ ID NO: 8). Em certas realizações, esse anticorpo de competição se liga ao mesmo epítopo (por exemplo, um epítopo linear ou conformacional) que é ligado pelo anticorpo anti-TIM3 Tim3_0016. Métodos exemplares detalhados para mapear um epítopo ao qual um anticorpo se liga são fornecidos em Morris, G.E. (ed.), Epitope Mapping Protocols, em: Methods in Molecular Biology, Vol. 66, Humana Press, Totowa, NJ (1996).
[00199] Em um ensaio de competição exemplar, TIM3 imobilizada (-ECD) é incubada em uma solução que compreende um primeiro anticorpo marcado que se liga a TIM3 (por exemplo, anticorpo anti-TIM3 ou Tim3_0016) e um segundo anticorpo não marcado sendo testado quanto à sua capacidade para competir com o primeiro anticorpo para ligação a TIM3. O segundo anticorpo pode estar presente em um sobrenadante de hibridoma. Como um controle, TIM3 imobilizada é incubada em uma solução que compreende o primeiro anticorpo marcado, mas não o segundo anticorpo não marcado. Após incubação sob condições permissivas para ligação do primeiro anticorpo a TIM3, o excesso de anticorpo não ligado é removido e a quantidade de marcador associado a TIM3 imobilizada é medida. Se a quantidade de marcador associado a TIM3 imobilizado é substancialmente reduzida na amostra de teste em relação à amostra de controle, então isso indica que o segundo anticorpo está competindo com o primeiro anticorpo para ligação a TIM3. Consulte Harlow, E. e Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Capítulo 14, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1998). Para outro ensaio de competição exemplar consulte o Exemplo 4.
2. ENSAIOS DE ATIVIDADE
[00200] Em um aspecto, são fornecidos ensaios para identificar anticorpos anti-TIM3a dos mesmos que têm atividade biológica. A atividade biológica pode incluir, por exemplo, internalização de receptor TIM3 ou liberação de citocina, ou atividade citotóxica (como imunoconjugados conjugados a uma toxina), ou reatividade cruzada de ligação de cinomolgo, bem como ligação a diferentes tipos celulares. Também são fornecidos anticorpos que têm essa atividade biológica in vivo e/ou in vitro.
[00201] Em certas realizações, um anticorpo da invenção é testado quanto a essa atividade biológica, conforme descrito nos Exemplos 5 a 15.
D. IMUNOCONJUGADOS (APENAS PARA CÂNCER OU MODIFICAÇÃO PARA ALVO)
[00202] A invenção também fornece imunoconjugados que compreendem um anticorpo anti-TIM3 no presente pedido conjugado a um ou mais agentes citotóxicos, como agentes quimioterapêuticos ou drogas, agentes inibidores de crescimento, toxinas (por exemplo, toxinas proteicas, toxinas enzimaticamente ativas de origem bacteriana, fúngica, vegetal ou animal, ou fragmentos das mesmas), ou isótopos radioativos.
[00203] Em uma realização, um imunoconjugado é um conjugado anticorpo-droga (ADC), no qual um anticorpo é conjugado a uma ou mais drogas incluindo, mas não se limitando a, um maitansinoide (consulte patentes US 5.208.020, 5.416.064 e patente europeia EP 0 425 235 B1); uma auristatina como componentes droga monometil auristatina DE e DF (MMAE e MMAF) (consulte patentes US 5.635.483 e 5.780.588 e 7.498.298); uma dolastatina; uma caliqueamicina ou derivados das mesmas (consulte patentes US 5.712.374, US 5.714.586, US 5.739.116, US 5.767.285, US 5.770.701, US 5.770.710, US 5.773.001 e US 5.877.296; Hinman, L.M. et al., Cancer Res. 53 (1993) 33363342; e Lode, H.N. et al., Cancer Res. 58 (1998) 2925-2928); uma antraciclina, como daunomicina ou doxorrubicina (consulte Kratz, F. et al., Curr. Med. Chem. 13 (2006) 477-523; Jeffrey, S.C. et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 16 (2006) 358362; Torgov, M.Y. et al., Bioconjug. Chem. 16 (2005) 717-721; Nagy, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 829-834; Dubowchik, G.M. et al., Bioorg. & Med. Chem. Letters 12 (2002) 1529-1532; King, H.D. et al., J. Med. Chem. 45 (20029 4336-4343; e patente US 6.630.579); metotrexato; vindesina; um taxano como docetaxel, paclitaxel, larotaxel, tesetaxel e ortataxel; um tricoteceno; e CC1065.
[00204] Em outras realizações, um imunoconjugado compreende um anticorpo, conforme descrito no presente pedido, conjugado a uma toxina enzimaticamente ativa ou fragmento da mesma, incluindo, mas não se limitando a, cadeia A de difteria, fragmentos ativos não ligantes de toxina de difteria, cadeia A de exotoxina (de Pseudomonas aeruginosa), cadeia A de ricina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas da diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, e PAPS), inibidor de carantia momordica, curcina, crotina, inibidor Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina e os tricotecenos.
[00205] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente pedido, conjugado a uma exotoxina A de Pseudomonas (ou variantes) da mesma. A exotoxina A de Pseudomonas (PE) é uma toxina bacteriana com atividade citotóxica que pode ser efetiva para destruir ou inibir o crescimento de células indesejáveis, por exemplo, células cancerosas. Consequentemente, PE pode ser útil para tratar ou prevenir doenças como, por exemplo, câncer. Várias exotoxinas de Pseudomonas (PE) desumanizadas são conhecidas na técnica. As versões deletadas de domínio II (por exemplo, PE24) podem ser menos imunogênicas e podem causar menos efeitos colaterais (como, por exemplo, síndrome de queda capilar e hepatotoxicidade), em comparação a PE38, que contém domínio II Diferentes ligantes cliváveis de furina podem ser empregados em variantes de PE24. Essas exotoxinas de Pseudomonas desumanizadas (PE) são descritas, por exemplo, nas publicações de pedido de patente internacional documentos WO 2005052006, WO 2007016150, WO 2007014743, WO 2007031741, WO 200932954, WO 201132022, WO 2012/154530 e WO 2012/170617. O termo “exotoxina A de Pseudomonas”, como usado no presente pedido, engloba exotoxinas de Pseudomonas (PE) desumanizadas e tipo selvagem. Em uma realização preferencial, “uma exotoxina A de Pseudomonas” refere-se a uma variante PE24 desumanizada como, por exemplo, descrito mas não se limitando aos documentos WO 2009/32954, WO 2011/32022, WO 2012/154530, WO 2012/170617, Liu W, et al, PNAS 109 (2012) 11782-11787, Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576 e Alewine C, et al, Mol Cancro Ther. (2014) 2653-61. Em uma realização preferencial, “uma exotoxina A de Pseudomonas” compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 69 ou compreende as sequências de aminoácidos de SEQ ID NO: 70 (sua preparação também descrita em Mazor R, et al PNAS 111 (2014) 8571-8576 e Alewine C, et al, Mol Cancer Ther. (2014) 2653-61).
[00206] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente pedido, conjugado a uma Amatoxina ou variantes da mesma. Amatoxinas (α-amanitina, β-amanitina, amanina) são peptídeos cíclicos compostos de 8 aminoácidos. Elas podem ser isoladas a partir de cogumelos Amanita phalloides ou preparadas a partir de blocos de construção por síntese. Amatoxinas inibem especificamente a RNA polimerase II dependente de DNA de células de mamíferos e por esta transcrição e biossíntese de proteínas das células afetadas. A inibição da transcrição em uma célula causa interrupção de crescimento e proliferação. Embora não ligado covalentemente, o complexo entre amanitina e RNA polimerase II é muito firme (KD = 3 nM). A dissociação de amanitina a partir da enzima é um processo muito lento o que torna improvável a recuperação de uma célula afetada. Quando em uma célula a inibição da transcrição vai durar muito tempo, a célula sofre morte celular programada (apoptose), conforme mostrado em culturas de células Jurkat incubadas com α-amanitina ou, com muito mais eficiência nas células Jurkat incubadas com o oleato de O-metil-α-amanitina permeável à membrana. Em uma realização preferencial, o termo “Amatoxina”, como usado no presente pedido, refere-se a uma alfa-amanitina ou variante da mesma conforme descrito, por exemplo, nos documentos WO 2010/115630, WO 2010/115629, WO 2012/119787, WO 2012/041504 e WO 2014135282 com variantes preferenciais descritas no documento WO 2012/041504 (por exemplo, conjugada através do átomo 6’ C de aminoácido 4 de amatoxina, particularmente através de um átomo de oxigênio ligado ao átomo 6’ C de aminoácido amatoxina, e em que o anticorpo TIM3 é conectado por um ligante através de um componente ureia) e documento WO2014135282.
[00207] Em outra realização, um imunoconjugado compreende um anticorpo conforme descrito no presente pedido, conjugado a um átomo radioativo para formar um radioconjugado. Uma variedade de isótopos radioativos está disponível para a produção de radioconjugados. Exemplos incluem At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 e isótopos radioativos de Lu. Quando o radioconjugado é usado para detecção, este pode compreender um átomo radioativo para estudos cintigráficos, por exemplo, TC99m ou I123, ou um marcador de spin para formação de imagens por ressonância magnética nuclear (NMR) (também conhecida como imagem por ressonância magnética, MRI), como iodo-123 novamente, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono-13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro.
[00208] Conjugados de um anticorpo e agentes citotóxicos podem ser produzidos com o uso de uma variedade de agentes de acoplamento de proteína bifuncionais como propionato de N-succinimidil-3-(2-piridilditio) (SPDP), succinimidil-4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT), derivados de imidoésteres bifuncionais (como dimetil adipimidato HCl), ésteres ativos (como disuccinimidil suberato), aldeídos (como glutaraldeído), compostos bis-azido (como bis-(p-azidobenzoil) hexanediamina), derivados de bis-diazônio (como bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina), diisocianatos (como tolueno 2,6-diisocianato) e compostos de flúor bis-ativo (como 1,5-difluoro-2,4- dinitrobenzeno). Por exemplo, uma imunotoxina ricina pode ser preparada conforme descrito em Vitetta, E.S. et al., Science 238 (1987) 1098-1104. O ácido triamino penta-acético 1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno marcado com carbono 14 (MX-DTPA) é um agente quelante exemplar para a conjugação de radionucleotídeo ao anticorpo. Consulte documento WO 94/11026. O ligante pode ser um “ligante clivável” que facilita a liberação de uma droga citotóxica na célula. Por exemplo, um ligante ácido-lábil, ligante sensível a peptidase, ligante fotolábil, ligante dimetil ou ligante que contém bissulfeto (Chari, R.V. et al., Cancer Res. 52 (1992) 127-131; patente US 5.208.020) pode ser usado.
[00209] Os imunoconjugados ou ADCs no presente pedido contemplam expressamente, mas não se limitam a esses conjugados preparados com reagentes reticulantes incluindo, mas não se limitando a, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, sulfo-EMCS, sulfo-GMBS, sulfo-KMUS, sulfo-MBS, sulfo-SIAB, sulfo-SMCC, e sulfo-SMPB, e SVSB (succinimidil-(4-vinilsulfona) benzoato) que são comercialmente disponíveis (por exemplo, junto à Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., E.U.A).
E. MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA DIAGNÓSTICOS E DETECÇÃO
[00210] Em certas realizações, qualquer um dos anticorpos anti- TIM3 fornecidos no presente pedido são úteis para detectar a presença de MRSA em uma amostra biológica. O termo “detecção”, como usado no presente pedido, engloba detecção quantitativa ou qualitativa. Em certas realizações, uma amostra biológica compreende uma célula ou tecido, como células-tronco cancerosas AML.
[00211] Em uma realização, é fornecido um anticorpo anti-TIM3 para uso em um método para diagnóstico ou detecção. Em um aspecto adicional, é fornecido um método para detectar a presença de TIM3 em uma amostra biológica. Em certas realizações, o método compreende colocar a amostra biológica em contato com um anticorpo anti-TIM3 conforme descrito no presente pedido mediante condições permissivas para ligação do anticorpo anti-TIM3 ao TIM3, e detectar se é formado um complexo entre o anticorpo anti-TIM3 e TIM3. Esse método pode ser um método in vitro ou in vivo. Em uma realização, um anticorpo anti-TIM3 é usado para selecionar sujeitos elegíveis para terapia com um anticorpo anti-TIM3, por exemplo, onde TIM3 é um biomarcador para seleção de pacientes.
[00212] Disfunções exemplares que podem ser diagnosticadas com o uso de um anticorpo da invenção incluem câncer que inclui diferentes formas de cânceres hematológicos como AML ou mielomas múltiplos (MM).
[00213] Em certas realizações, são fornecidos anticorpos anti- TIM3 marcados. Os marcadores incluem, mas não se limitam a, marcadores ou componentes que são detectados diretamente (como marcadores fluorescentes, cromofóricos, eletrodensos, quimioluminescentes e radioativos), bem como componentes, como enzimas ou ligantes, que são detectados indiretamente, por exemplo, através de uma reação enzimática ou interação molecular. Marcadores exemplares incluem, mas não se limitam aos radioisótopos 32P, 14C, 125I, 3H e 131I, fluoróforos como os quelatos de terras raras ou fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbeliferona, luciferases, por exemplo, luciferase de vagalume e luciferase bacteriana (patente US 4.737.456), luciferina, 2,3-desidroftalazinedionas, peroxidase de rábano silvestre (HRP), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glicoamilase, lisozima, sacarídeos oxidases, por exemplo, glicose oxidase, galactose oxidase e glicose-6-fosfato desidrogenase, oxidases heterocíclicas como uricase e xantina oxidase, acopladas com uma enzima que emprega peróxido de hidrogênio para oxidar um corante precursor como HRP, lactoperoxidase ou microperoxidase, biotina/avidina, marcadores de spin, marcadores bacteriófagos, radicais livres estáveis e similares.
F. FORMULAÇÕES FARMACÊUTICAS
[00214] Formulações farmacêuticas de um anticorpo anti-TIM3 conforme descrito no presente pedido são preparadas por mistura desse anticorpo que tem o grau desejado de pureza com um ou mais veículos opcionais farmaceuticamente aceitáveis (Remington’s Pharmaceutical Sciences 16a edição, Osol, A. (ed.) (1980)), sob a forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente são não tóxicos para receptores nas dosagens e concentrações empregadas, e incluem, mas não se limitam a: tampões como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (como octadecildimetilbenzil cloreto de amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzil; alcila parabenos como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menor que cerca de 10 resíduos); polipeptídeos, proteínas, como albumina no soro, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos como poli(vinilpirrolidona); aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes como EDTA; açúcares como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; formação de sais de contra íons como sódio; complexos de metal (por exemplo, complexos Zn-proteína); e/ou tensoativos não iônicos como polietilenoglicol (PEG). Veículos farmaceuticamente aceitáveis exemplares no presente pedido ainda incluem agentes de dispersão de drogas intersticiais como glicoproteínas hialuronidase neutra ativa solúvel (sHASEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH-20 solúvel humana, como rhuPH20 (HYLENEX®, Baxter International, Inc.). Certas sHASEGPs exemplares e métodos de uso, incluindo rhuPH20, são descritos nas publicações de patentes US 2005/0260186 e 2006/0104968. Em um aspecto, uma sHASEGP é combinada com uma ou mais glicosaminoglicanases adicionais como condroitinases.
[00215] As formulações de anticorpo liofilizadas exemplares são descritas na patente US 6.267.958. As formulações de anticorpos aquosos incluem as descritas na patente US 6.171.586 e no documento WO 2006/044908, as últimas formulações incluindo um tampão acetato de histidina.
[00216] A formulação no presente pedido também pode conter mais de um ingrediente ativo conforme necessário para a indicação específica a ser tratada, preferencialmente aquela com atividades complementares que não afetem contrariamente uma a outra. Por exemplo, pode ser desejável para ainda fornecer (lista de drogas que podem ser combinadas com o anticorpo anti-TIM3). Esses ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são efetivas para o propósito pretendido.
[00217] Os ingredientes ativos podem ser retidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, em sistemas de distribuição de droga coloidal (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Essas técnicas são divulgadas em Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edição, Osol, A. (ed.) (1980).
[00218] Preparações de liberação sustentada podem ser preparadas. Exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo, cujas matrizes estão na forma de artigos modelados, por exemplo, filmes ou microcápsulas.
[00219] As formulações a serem usadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilidade pode ser facilmente realizada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.
G. MÉTODOS TERAPÊUTICOS E COMPOSIÇÕES
[00220] Qualquer um dos anticorpos anti-TIM3 (ou proteínas de ligação ao antígeno) ou imunoconjugados dos anticorpos anti-TIM3 (ou proteína de ligação ao antígeno) conjugados a um agente citotóxico, fornecidos no presente pedido podem ser usados em métodos terapêuticos.
[00221] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo anti-TIM3 ou imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico para uso como um medicamento. Em aspectos adicionais, é fornecido um anticorpo anti-TIM3 ou imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico para uso no tratamento de câncer. Em certas realizações, é fornecido um anticorpo anti-TIM3 ou imunoconjugados do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico para uso em um método de tratamento. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 ou imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico para uso em um método de tratamento de um indivíduo que tem câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo anti-TIM3 ou do imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico.
[00222] Em realizações adicionais, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 ou imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico para uso na indução de apoptose em uma célula cancerosa ou inibição de proliferação de célula cancerosa. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 ou imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico para uso em um método de indução de apoptose em uma célula cancerosa ou inibição de proliferação de célula cancerosa em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo anti-TIM3 ou do imunoconjugado dos anticorpos anti-TIM3 conjugados a um agente citotóxico para induzir apoptose em uma célula cancerosa ou para inibir a proliferação de célula cancerosa.
[00223] Em realizações adicionais, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 para uso como agente imunoestimulatório ou que estimula a secreção de IFN gama. Em certas realizações, a invenção fornece um anticorpo anti-TIM3 para uso em um método de imunoestimulação ou estimulação de secreção de IFN gama em um indivíduo que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo anti-TIM3 para imunoestimular ou estimular a secreção de IFN gama.
[00224] Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima é preferencialmente um humano. Em um aspecto adicional, a invenção fornece o uso de um anticorpo anti-TIM3 ou de um imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um agente citotóxico na fabricação ou preparação de um medicamento. Em uma realização, o medicamento é para tratamento de câncer. Em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método de tratar câncer, que compreende administrar a um indivíduo que tem câncer, uma quantidade efetiva do medicamento. Em uma realização adicional, o medicamento é para induzir apoptose em uma célula cancerosa ou inibir a proliferação de célula cancerosa. Em uma realização adicional, o medicamento é para uso em um método para induzir apoptose em uma célula cancerosa ou inibir a proliferação de célula cancerosa em um indivíduo que sofre de câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do medicamento para induzir apoptose em uma célula cancerosa ou para inibir a proliferação de célula cancerosa. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima pode ser um humano.
[00225] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar câncer. Em uma realização, o método compreende administrar a um indivíduo que tem câncer, uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-TIM3. Um “indivíduo”, de acordo com qualquer uma das realizações acima pode ser um humano.
[00226] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para induzir apoptose em uma célula cancerosa ou inibir a proliferação de célula cancerosa em um indivíduo que sofre de câncer. Em uma realização, o método compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva de um anticorpo anti-TIM3 ou um imunoconjugado do anticorpo anti-TIM3 conjugado a um composto citotóxico para induzir apoptose em uma célula cancerosa ou para inibir a proliferação de célula cancerosa no indivíduo que sofre de câncer. Em uma realização, um “indivíduo” é um humano.
[00227] Em um aspecto adicional, a invenção fornece formulações farmacêuticas que compreendem qualquer um dos anticorpos anti- TIM3 fornecidos no presente pedido, por exemplo, para uso em qualquer dos métodos terapêuticos acima. Em uma realização, uma formulação farmacêutica compreende qualquer um dos anticorpos anti-TIM3 fornecidos no presente pedido e um veículo farmaceuticamente aceitável.
[00228] Um anticorpo da invenção (e qualquer agente terapêutico adicional) pode ser administrado por qualquer meio adequado, incluindo parenteral, intrapulmonar e intranasal, e se desejado, para tratamento local, administração intralesional. Infusões parenterais incluem administração por via intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser por qualquer rota adequada, por exemplo, por injeções, como injeções intravenosa ou subcutânea, dependendo em parte, se a administração é breve ou contínua. Várias programações de dosagem incluindo, mas não se limitando a, administrações únicas ou múltiplas durante vários pontos no tempo, administração em bolus e infusão de pulso são contempladas no presente pedido.
[00229] Anticorpos da invenção seriam formulados, dosados e administrados de um modo consistente com as boas práticas médicas. Os fatores para consideração nesse contexto incluem a disfunção específica a ser tratada, o mamífero específico a ser tratado, a condição clínica de cada paciente, a causa da disfunção, o local de distribuição do agente, o método de administração, a programação de administração e outros fatores conhecidos pelos médicos especialistas. O anticorpo não precisa ser, mas é opcionalmente formulado com um ou mais agentes atualmente usados para prevenir ou tratar a disfunção em questão. A quantidade eficaz desses outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, do tipo de disfunção ou tratamento e dos outros fatores discutidos acima. Esses são geralmente usados nas mesmas dosagens e com rotas de administração conforme descritas no presente pedido, ou cerca de 1 a 99% das dosagens descritas no presente pedido, ou em qualquer dosagem e por qualquer rota que seja empiricamente/clinicamente determinada a ser apropriada.
[00230] Para a prevenção ou tratamento de doença, a dosagem apropriada de um anticorpo da invenção (quando usado sozinho ou em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais) dependerá do tipo de doença a ser tratada, do tipo de anticorpo, da severidade e curso da doença, se o anticorpo é administrado para propósitos preventivos ou terapêuticos, terapias prévias, o histórico clínico do paciente e a resposta ao anticorpo, e do diagnóstico do médico. O anticorpo é adequadamente administrado ao paciente de uma vez ou no decorrer de uma série de tratamentos. Dependendo do tipo e da severidade da doença, cerca de 1 μg/kg a 15 mg/kg (por exemplo, 0,5mg/kg a 10 mg/kg) de anticorpo pode ser uma dosagem candidata inicial para administrar ao paciente, por exemplo, tanto por uma ou mais administrações separadas como por infusão contínua. Uma dosagem diária típica pode variar de cerca de 1 μg/kg a 100 mg/kg ou mais, dependendo dos fatores mencionados acima. Para administrações repetidas no decorrer de vários dias ou mais tempo, dependendo da condição, o tratamento seria geralmente mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas da doença. Uma dosagem exemplar do anticorpo seria na faixa de cerca de 0,05 mg/kg a cerca de 10 mg/kg. Dessa forma, uma ou mais doses de cerca de 0,5 mg/kg, 2,0 mg/kg, 4,0 mg/kg ou 10 mg/kg (ou qualquer combinação das mesmas) podem ser administradas ao paciente. Essas doses podem ser administradas intermitentemente, por exemplo, a cada semana ou a cada três semanas (por exemplo, de modo que o paciente receba cerca de duas a cerca de vinte ou, por exemplo, cerca de seis doses do anticorpo). Pode ser administrada uma dose de carga inicial mais alta, seguida por uma ou mais doses mais baixas. Um regime de dosagem exemplar compreende administrar uma dose de carga inicial de cerca de 4 mg/kg, seguido por uma dose de manutenção semanal de cerca de 2 mg/kg do anticorpo. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso dessa terapia é facilmente monitorado por técnicas e ensaios convencionais.
[00231] Entende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser executados com o uso de um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo anti- TIM3.
[00232] Entende-se que qualquer uma das formulações ou métodos terapêuticos acima podem ser executados com o uso de um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo anti- TIM3.
III. ARTIGOS DE FABRICAÇÃO
[00233] Em outro aspecto da invenção, é fornecido um artigo de fabricação que contém materiais úteis para o tratamento, prevenção e/ou diagnóstico das disfunções descritas acima. O artigo de fabricação compreende um recipiente e um rótulo, ou uma bula associada ao recipiente. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas para solução IV, etc. Os recipientes podem ser fabricados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é por si mesma ou combinada com outra composição, eficaz para tratamento, prevenção e/ou diagnóstico da condição e pode ter um orifício de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser uma bolsa de solução intravenosa ou um frasco que tem uma tampa perfurável para uma agulha de injeção hipodérmica). Pelo menos um agente ativo na composição é um anticorpo da invenção. O rótulo ou bula indicam que a composição é usada para tratar a condição recomendada. Além disso, o artigo de fabricação pode compreender (a) um primeiro recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um anticorpo da invenção; e (b) um segundo recipiente com uma composição contida no mesmo, em que a composição compreende um agente citotóxico adicional ou de outro modo um agente terapêutico. O artigo de fabricação nessa realização da invenção pode, além disso, compreender uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica. De maneira alternativa ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode, ainda, compreender um segundo (ou terceiro) recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável, como água bacteriostática para injeção (BWFI), fosfato tamponado salino, solução de Ringer e solução de dextrose. Além disso, pode incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e seringas.
[00234] Entende-se que qualquer um dos artigos de fabricação acima podem incluir um imunoconjugado da invenção no lugar de, ou em adição a um anticorpo anti-TIM3. DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DE AMINOÁCIDOS SEQ ID NO: 1 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0016; SEQ ID NO: 2 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0016; SEQ ID NO: 3 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0016; SEQ ID NO: 4 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0016; SEQ ID NO: 5 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0016; SEQ ID NO: 6 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0016; SEQ ID NO: 7 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0016; SEQ ID NO: 8 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0016; SEQ ID NO: 9 domínio variável de cadeia pesada VH, variante Tim3_0016 (0018); SEQ ID NO: 10 domínio variável de cadeia leve VL, variante Tim3_0016 (0018); SEQ ID NO: 11 cadeia leve HVR-L1, Tim3_0016_HVR-L1 variante 1_NQ (remoção de sítio de glicosilação por mutação N para Q); SEQ ID NO: 12 cadeia leve HVR-L1, Tim3_0016_HVR-L1 variante 2_NS (remoção de sítio de glicosilação por mutação N para S); SEQ ID NO: 13 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0021; SEQ ID NO: 14 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0021; SEQ ID NO: 15 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0021; SEQ ID NO: 16 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0021; SEQ ID NO: 17 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0021; SEQ ID NO: 18 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0021; SEQ ID NO: 19 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0021; SEQ ID NO: 20 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0021; SEQ ID NO: 21 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0022; SEQ ID NO: 22 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0022; SEQ ID NO: 23 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0022; SEQ ID NO: 24 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0022; SEQ ID NO: 25 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0022; SEQ ID NO: 26 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0022; SEQ ID NO: 27 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0022; SEQ ID NO: 28 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0022; SEQ ID NO: 29 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0026; SEQ ID NO: 30 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0026; SEQ ID NO: 31 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0026; SEQ ID NO: 32 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0026; SEQ ID NO: 33 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0026; SEQ ID NO: 34 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0026; SEQ ID NO: 35 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0026; SEQ ID NO: 36 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0026; SEQ ID NO: 37 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0028; SEQ ID NO: 38 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0028; SEQ ID NO: 39 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0028; SEQ ID NO: 40 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0028; SEQ ID NO: 41 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0028; SEQ ID NO: 42 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0028; SEQ ID NO: 43 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0028; SEQ ID NO: 44 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0028; SEQ ID NO: 45 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0030; SEQ ID NO: 46 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0030; SEQ ID NO: 47 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0030; SEQ ID NO: 48 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0030; SEQ ID NO: 49 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0030; SEQ ID NO: 50 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0030; SEQ ID NO: 51 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0030; SEQ ID NO: 52 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0030; SEQ ID NO: 53 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0033; SEQ ID NO: 54 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0033; SEQ ID NO: 55 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0033; SEQ ID NO: 56 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0033; SEQ ID NO: 57 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0033; SEQ ID NO: 58 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0033; SEQ ID NO: 59 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0033; SEQ ID NO: 60 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0033; SEQ ID NO: 61 HVR-H1 de cadeia pesada, Tim3_0038; SEQ ID NO: 62 HVR-H2 de cadeia pesada, Tim3_0038; SEQ ID NO: 63 HVR-H3 de cadeia pesada, Tim3_0038; SEQ ID NO: 64 HVR-L1 de cadeia leve, Tim3_0038; SEQ ID NO: 65 HVR-L2 de cadeia leve, Tim3_0038; SEQ ID NO: 66 HVR-L3 de cadeia leve, Tim3_0038; SEQ ID NO: 67 domínio variável de cadeia pesada VH, Tim3_0038; SEQ ID NO: 68 domínio variável de cadeia leve VL, Tim3_0038; SEQ ID NO: 69 uma variante 1 de exotoxina A de Pseudomonas exemplar (exemplo PE24 desumanizada); SEQ ID NO: 70 uma variante 2 de exotoxina A de Pseudomonas exemplar (exemplo PE24 desumanizada); SEQ ID NO: 71 região constante da cadeia leve kappa humana; SEQ ID NO: 72 região constante da cadeia leve lambda humana; SEQ ID NO: 73 região constante de cadeia pesada humana derivada de IgG1; SEQ ID NO: 74 região constante da cadeia pesada humana derivada de IgG1 com mutações L234A e L235A; SEQ ID NO: 75 região constante da cadeia pesada humana derivada de IgG1 com mutações L234A, L235A e P329G; SEQ ID NO: 76 região constante de cadeia pesada humana derivada de IgG4; SEQ ID NO: 77 sequências TIM3 exemplares humanas; Tim3-0443).
[00235] A seguir, as sequências de aminoácidos dos domínios VH e VL incluindo HVRs marcadas ( HVRs em negrito, letras sublinhadas) de anticorpos anti-TIM3 variantes Tim3-0016, Tim3-0016 (0018) e suas versões humanizadas Tim3-0433 e Tim3-0434, Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028 e suas versões humanizadas Tim3-0438 e Tim3-0443, Tim3-0030 e Tim3-0033, Tim3-0038 são listadas: VH TIM3_0016 1 qvtlkesgpg ilqpsqtlrl tcsfsgfsls tsgmsvgwir qpsgkglewl 51 ahiwlnddvf fnpalksrlt iskdtsnnqv flqiasvvta dtatyycvra 101 ngylyaldyw gqgtsvtvss VL Tim3_0016: 1 qivltqspai msaspgqkvt itcsasssvn ytqwyqqklg sspklwiyda 51 fklapgvpar fsgsgtgtsy sltissmeae daasyfchqw ssypwtfggg 101 tkleik VH Tim3_0018(= VL Tim3_0016 variante): 1 qvtlkesgpg ilqpsqtlsl tcsfsgfsls tsgmsvgwir qpsgkglewl 51 ahiwlnddvf fnpalkrrlt iskdtsnnqv flqiasvvta dtatyycvra 101 ngylyaldyw gqgisvtvss VL Tim3_0018 (= VL Tim3_0016 variante): 1 qivltqspai msaspgqkvt itcsasssvn ytqwyqqklg sspklwiyda 51 fklapgvpar fsgsgtgtsy sltissmeae daasyfchqw ssypwtfggg 101 tkleik versão humanizada de VH de variante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0433) 1 qitlkesgpt lvkptqtltl tctfsgfsls tsgmsvgwir qppgkglewl 51 ahiwlnddvf fnpalksrlt itkdtsknqv vltmtnmdpv dtatyycvra 101 ngylyaldyw gqgtlvtvss versão humanizada de VL de variante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0433) 1 ettltqspaf msatpgdkvn iacsasssvs ytqwyqqkpg eapklwiyda 51 fklapgippr fsgsgygtdf tltinniese daayyfchqw ssypwtfgqg 101 tkleik versão humanizada de VH de variante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0434) 1 qitlkesgpt Ivkptqtltl tctfsgfsls tsgmsvgwir qppgkglewl 51 ahiwlnddvf fnpalksrlt itkdtsknqv vltmtnmdpv dtatyycvra 101 ngylyaldyw gqgtlvtvss versão humanizada de VL de variante Tim3_0016 (0018) (= Tim3-0434) 1 diqltqspsf Isasvgdrvt itcsasssvs ytqwyqqkpg kapklwiyda 51 fklapgvpsr fsgsgsgtef tltisslqpe dfatyfchqw ssypwtfgqg 101 tkleik VH Tim3_0021: 1 QVQLQQSGPQ LVRPGASVQI SCKASGYSFT SYLLHWLKQR PGQGLEWIGM 51 IDPSDSETRL NQKFKDKATL TVDKSSSTAY MQLSSPTSED SAVYYCARDG 101 YYAWYYFDCW GQGTTLTVSS VL Tim3_0021: 1 DIVLTQSPAT LSVTPGDRVS LSCRASQSIG NNLHWYQQKS HESPRLLIKY 51 ASHSISGIPS KFSGTGSGTD FTLSFNSVET EDFGMYFCQQ SNSWPLTFGA 101 GTKLELK VH Tim3_0022: 1 EVQLQESGPS LVKPSQTLSL TCSVTGDSIA SAYWNWIRKF PGNKLEYMGY 51 INYSGSTYYN PSLKSRISIT RDTSQNQYYL QLNSVTTEDT ATYYCVTGDY 101 FDYWGRGTTL TVSS VL aTim3_0022: 1 DIQMTQSPSS LSAYLGGKVT ITCKARQDVR KNIGWYQHKP GKGPRLLIWY 51 TSTLQSGIPS RFSGSGSGRD YSFNINNLEP EDIATYYCLQ YDNLPFTFGT 101 GTKLEIR VH Tim3_0026: 1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT DYSMHWVKQA PGRGLKWMGY 51 INTETYEPTF GADFKGRFAF SLDTSATTAY LQINSLKTED TATFFCGGGG 101 YPAYWGQGTV VIVSA VL Tim3_0026 1 DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSRTIL HSSGNTYLEW YLQKPGQSPK 51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLNI SRVEAEDLGV YYCFQDSHVP 101 FTFGTGTKLE IK VH Tim3_0028: 1 EVQLQQSVAE LVRPGASVKL SCTASGFNIK TTYMHWVKQR PEQGLEWIGR 51 IDPADDNTKY APKFQGKATI TADTSSNTAY LQLSSLTSED AAIYYCVRDF 101 GYVAWFAYWG QGTLVTFSA VL Tim3_0028: 1 NIVMTPTPKF LPVSSGDRVT MTCRASQSVD NYVAWYQQKP GQSPKLLIYY 51 ASNRYIGVPD RFTGSGSGTD FTFTISSVQV EDLAVYFCQQ HYSSPYTFGS 101 GTKLEIK versão humanizada de VH de Tim3-0028 (= Tim3-0438) 1 evqlvesggg lvqpggslrl scaasgfnik ttymhwvrqa pgkglewvgr 51 idpaddntky apkfqgkati sadtskntay Iqmnslraed tavyycvrdf 101 gyvawfaywg qgtlvtvss versão humanizada de VL de Tim3-0028 (= Tim3-0438) 1 divmtqspls Ipvtpgepas iscrasqsvd nyvawylqkp gqspqlliyy 51 asnryigvpd rfsgsgsgtd ftlkisrvea edvgvyycqq hysspytfgq 101 gtkveik versão humanizada de VH de Tim3-0028 (= Tim3-0443) 1 evqlvesggg Ivqpggslrl scaasgfnik ttymhwvrqa pgkglewvgr 51 idpaddntky apkfqgkati sadtskntay lqmnslraed tavyycvrdf 101 gyvawfaywg qgtlvtfss versão humanizada de VL de Tim3-0028 (= Tim3-0443) 1 divmtqspls lpvtpgepas iscrasqsvd nyvawylqkp gqspqlliyy 51 asnryigvpd rfsgsgsgtd ftlkisrvea edvgvyycqq hysspytfgq 101 gtkveik VH aTim3_0030: 1 QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYPFS EYSIHWVKQA PGKGLKWMVY 51 VNTETGQPIV GDDFRGRFVL SLETSASTAY LQINNLKNED TATYFCGGGG 101 YPAYWGQGTL VTVSA VL aTim3_0030: 1 DVLMTQTPLS LPVSLGDQAS ISCRSSRSIV HSSGNTYLEW YLQKPGQSPK 51 LLIYKVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLNI SRVEAEDLGV YYCFQDSHVP 101 FTFGTGTKLE IK VH aTim3_0033: 1 QGQMHQSGAE LVKPGSSVKL SCKTSGFTFS SSFISWLKQK PGQSLEWIAW 51 IYAATGSTSY NQKFTNKAQL TVDTSSSAAY MQFSSLTTED SAIYYCARHA 101 GYPHYYAMDY WGQGTSVTVS S VL aTim3_0033: 1 DIQMTQSPAS LSASVGETVT ITCRASENIF SNLAWYQQKQ GKSPQLLVYS 51 ATNLGDGVPS RFSGSGSGTQ FSLKINSLQP EDFGNYYCQH FYKIPFTFGT 101 GTKLEIK VH aTim3_0038: 1 EVQLQQSGAE PLKPGASVKL TCTTSGFNIK DYYIHWVKQR SDQGLEWIGR 51 IDPEDGELIY APKFQDKATI TVDTSSNIAY LQLNSLTSED TAVYYCSRDH 101 GYVGWFAYWG QGTLVTVSA VL aTim3_0038: 1 NVVMTQSPKS MIMSVGQRVT LNCKASENVD TYVSWYQQKP EQSPKLLIYG 51 ASNRYTGVPD RFTGSRSATD FTLTISSVQA EDLAVYYCGQ SYSYPWTFGG 101 GTKLEFR A SEGUIR, SÃO LISTADAS VÁRIAS REALIZAÇÕES ESPECÍFICAS DA INVENÇÃO 1. Um anticorpo isolado que se liga a TIM3, em que o anticorpo: • induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 50% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 55% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 60% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) em pelo menos 65% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); 2. O anticorpo anti-TIM3, de acordo com a realização 1, em que o anticorpo: • compete para ligação a TIM3 com um anticorpo anti-Tim3 que compreende a VH e VL de Tim3_0016; • se liga a uma TIM3 humana e de cinomolgo; • mostra como imunoconjugado uma atividade citotóxica em células que expressam TIM3 (em uma realização os imunoconjugados têm um valor IC50 relativo da atividade citotóxica como exotoxina A de Pseudomonas conjugada em células RPMI-8226 de 0,1 ou menor (conforme medido no Exemplo 11); • induz a liberação de interferon-gama (em um ensaio MLR). 3. O anticorpo, de acordo com a realização 1, que é um anticorpo humano, humanizado ou quimérico; 4. O anticorpo, de acordo com a realização 1, que é um fragmento de anticorpo que se liga a TIM3; 5. O fragmento de anticorpo, de acordo com a realização 4, que é um fragmento Fab; 6. O anticorpo anti-TIM3, de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, que compreende: A) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou C) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou D) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 16; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou E) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 23; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 24; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou F) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 31; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 32; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou G) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou H) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 48; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou I) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 55; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou J) (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 63; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 64; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; 7. Um anticorpo isolado, que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; 8. O anticorpo, de acordo com a realização 7, em que o anticorpo compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82; 9. O anticorpo, de acordo com a realização 7, em que o anticorpo compreende: uma sequência de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80; 10. O anticorpo, de acordo com a realização 7, em que o anticorpo compreende: uma sequência de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82; 11. Um anticorpo isolado, que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende (a) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37; (b) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38; (c) HVR-H3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 39; (d) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 40; (e) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (f) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; 12. O anticorpo, de acordo com a realização 11, em que o anticorpo compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86; 13. O anticorpo, de acordo com a realização 11, em que o anticorpo compreende: uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84; 14. O anticorpo, de acordo com a realização 11, em que o anticorpo compreende: uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86; 15. O anticorpo anti-TIM3, de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, que compreende: A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (4); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (11); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou D) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou F) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou G) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou H) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou J) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66; 16. Um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; 17. O anticorpo, de acordo com a realização 16, em que o anticorpo compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82; 18. O anticorpo, de acordo com a realização 16, em que o anticorpo compreende: uma sequência de VH de SEQ ID NO: 79 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 80; 19. O anticorpo, de acordo com a realização 16, em que o anticorpo compreende: uma sequência de VH de SEQ ID NO: 81 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 82; 20. Um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; 21. O anticorpo, de acordo com a realização 20, em que o anticorpo compreende: i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84, ou ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86; 22. O anticorpo, de acordo com a realização 20, em que o anticorpo compreende: de SEQ ID NO: 84; 23. O anticorpo, de acordo com a realização 20, em que o anticorpo compreende: uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86; 24. O anticorpo anti-TIM3, de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, que compreende: A) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (4); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou B) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (11); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou C) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; ou D) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 15; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (16); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 18; ou E) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 21, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 22, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 23; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (24); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 26; ou F) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 29, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 30, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 31; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (32); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 34; ou compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42; ou H) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 46, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 47; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (48); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 49 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; ou I) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 53, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 54, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 55; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (56); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 58; ou J) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 61, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 62, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 63; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (64); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 65 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 66;
[00236] em que o anticorpo é caracterizado de forma independente por uma ou mais dentre as seguintes propriedades: o anticorpo anti-TIM3: • Induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 50% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 55% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 60% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 65% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Compete para ligação a TIM3 com um anticorpo anti-Tim3 que compreende a VH de SEQ ID NO: 7 e VL de SEQ ID NO: 8; • Se liga a uma TIM3 humana e de cinomolgo; • Mostra como imunoconjugado uma atividade citotóxica em células que expressam TIM3 (em uma realização os imunoconjugados têm um valor IC50 relativo da atividade citotóxica como exotoxina A de Pseudomonas conjugada em células RPMI-8226 de 0,1 ou menor (conforme medido no Exemplo 11); • Induz a liberação de interferon gama (em um ensaio de Reação Mista de Linfócitos (MLR) conforme descrito no Exemplo 5); 25. Um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 3; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (12); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6;
[00237] Em que o anticorpo é caracterizado de forma independente por uma ou mais dentre as seguintes propriedades: o anticorpo anti-TIM3: • Induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 50% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 55% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 60% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 65% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Compete para ligação a TIM3 com um anticorpo anti-Tim3 que compreende a VH de SEQ ID NO: 7 e VL de SEQ ID NO: 8; • Se liga a uma TIM3 humana e de cinomolgo; • Mostra como imunoconjugado uma atividade citotóxica em células que expressam TIM3 (em uma realização os imunoconjugados têm um valor IC50 relativo da atividade citotóxica como exotoxina A de Pseudomonas conjugada em células RPMI-8226 de 0,1 ou menor (conforme medido no Exemplo 11); • Induz a liberação de interferon gama (em um ensaio de Reação Mista de Linfócitos (MLR) conforme descrito no Exemplo 5); 26. Um anticorpo isolado que se liga a TIM3 humana, em que o anticorpo compreende G) (a) um domínio VH que compreende (i) HVR-H1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37, (ii) HVR-H2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 38, e (iii) HVR-H3 que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir da SEQ ID NO: 39; e (b) um domínio VL que compreende (i) HVR-L1 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: (40); (ii) HVR-L2 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41 e (iii) HVR-L3 que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 42;
[00238] Em que o anticorpo é caracterizado de forma independente por uma ou mais dentre as seguintes propriedades: o anticorpo anti-TIM3: • Induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 45% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 50% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 55% após 120 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 60% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Em uma realização, o anticorpo induz a internalização de TIM3 (em um ensaio FACS em células RPMI8226 que expressam TIM3) de pelo menos 65% após 240 minutos a 37°C (consulte Exemplo 6); • Compete para ligação a TIM3 com um anticorpo anti-Tim3 que compreende a VH de SEQ ID NO: 7 e VL de SEQ ID NO: 8; • Se liga a uma TIM3 humana e de cinomolgo; • Mostra como imunoconjugado uma atividade citotóxica em células que expressam TIM3 (em uma realização os imunoconjugados têm um valor IC50 relativo da atividade citotóxica como exotoxina A de Pseudomonas conjugada em células RPMI-8226 de 0,1 ou menor (conforme medido no Exemplo 11); • Induz a liberação de interferon gama (em um ensaio de Reação Mista de Linfócitos (MLR) conforme descrito no Exemplo 5); 27. O anticorpo, de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, que é um anticorpo IgG1 inteiro; 28. O anticorpo, de acordo com qualquer uma das realizações anteriores, que é um anticorpo IgG1 inteiro com mutações L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat); 29. Ácido nucleico isolado que codifica o anticorpo, de acordo com qualquer uma das realizações anteriores; 30. Uma célula hospedeira, que compreende o ácido nucleico, de acordo com a realização 29; 31. Um método, para produzir um anticorpo, que compreende cultivar a célula hospedeira, de acordo com a realização 30, de modo que o anticorpo seja produzido; 32. O método, de acordo com a realização 31, que ainda compreender a recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira; 33. Um imunoconjugado que compreende o anticorpo, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 28, e um agente citotóxico; 34. O Imunoconjugado, de acordo com a realização 33, em que o agente citotóxico é Exotoxina A ou uma Amatoxina de Pseudomonas; 35. Uma formulação farmacêutica que compreende o anticorpo, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 28, e um veículo farmaceuticamente aceitável; 36. O anticorpo de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 28, ou o imunoconjugado, de acordo com qualquer uma das realizações 33 ou 34, para uso como um medicamento; 37. O anticorpo, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 28, ou o imunoconjugado de acordo com qualquer uma das realizações 33 ou 34, para uso no tratamento de câncer; 38. Uso, do anticorpo, de acordo com qualquer uma das realizações 1 a 28, ou o imunoconjugado de acordo com qualquer uma das realizações 33 ou 34, na fabricação de um medicamento; 39. Uso, de acordo com a realização 38, em que o medicamento é para tratamento de câncer; 40. Um método de tratamento de um indivíduo que tem câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade efetiva do anticorpo de acordo com a reivindicação 1, ou do imunoconjugado de acordo com a realização 33.
EXEMPLOS
[00239] A seguir estão os exemplos de métodos e composições da invenção. Entende-se que várias outras realizações podem ser praticadas, dada a descrição geral fornecida acima.
[00240] Embora a invenção acima mencionada tenha sido descrita com algum detalhe a título de ilustração e exemplos para propósitos de clareza de entendimento, as descrições e exemplos não devem ser interpretados como limitação ao escopo da invenção. As divulgações de todas as patentes e literaturas científicas citadas no presente pedido são expressamente incorporadas em sua totalidade como referência.
EXEMPLO 1A GERAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TIM3 IMUNIZAÇÃO DE CAMUNDONGOS
[00241] Camundongos NMRI foram geneticamente imunizados com o uso de um vetor de expressão de plasmídeo que codifica Tim-3 humano inteiro por aplicação intradérmica de 100 ug de DNA de vetor (plasmídeo 15304_hTIM3-fl), seguido por Eletroporação (2 pulsos quadrados de 1000 V/cm, duração 0,1 ms, intervalo de 0,125 s; seguido por 4 pulsos quadrados de 287,5 V/cm, duração de 10 ms, intervalo de 0,125 s. Os camundongos receberam 6 imunizações consecutivas nos dias 0, 14, 28, 42, 56, 70 e 84. O sangue foi coletado nos dias 36, 78 e 92 e o soro preparado, que foi usado para determinação do título por ELISA (consulte abaixo). Animais com títulos mais altos foram selecionados para estímulo no dia 96, por injeção intravenosa de 50 ug de quimera de Fc humana de Tim-3 humana recombinante, e anticorpos monoclonais foram isolados por tecnologia de hibridoma, por fusão de esplenócitos para linhagem celular de mieloma 3 dias após estímulo.
DETERMINAÇÃO DE TÍTULOS NO SORO (ELISA)
[00242] Quimera de Fc humana de Tim-3 recombinante humana foi imobilizada em uma placa NUNC Maxisorp com 96 poços em 0,3 ug/mL, 100 μL/poço, em PBS, seguido por: bloqueio da placa com Croteína C 2% em PBS, 200 μL/poço; aplicações de diluições em série anti-soro, em duplicatas, em Croteína C 0,5% em PBS, 100 μL/po^o; detecção com anticorpo de cabra anti-camundongo conjugado a HRP (Jackson Immunoresearch/Dianova 115-036-071; 1/16 000). Para todas as etapas, as placas foram incubadas por 1 h a 37°C. Entre todas as etapas, as placas foram lavadas 3 vezes com Tween 20 0,05% em PBS. O sinal foi desenvolvido por adição de substrato solúvel BM Blue POD (Roche), 100 uL/poço; e interrompido por adição de HCl 1 M, 100 uL/poço. Foi lida a absorbância a 450 nm, contra 690 nm como referência. O título foi definido como diluição de antissoro resultando em metade do sinal máximo.
EXEMPLO 1B CARACTERIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TIM3 ELISA PARA TIM3
[00243] Placas de Estreptavidina Nunc-Maxi Sorp (MicroCoat n° 11974998/MC1099) foram revestidas por 25 μL/pogio com Tim3-ECD-His-Biotina (biotiniladas com BirA Ligase) e incubadas à RT por 1 h durante agitação a 400 rpm de rotação. Após lavagem (3 x 90 μL/po^o com tampão PBST) 25 μL de amostras aTim3 s ou anticorpo de referência diluído (1:2 etapas) aTim3 F38-2E2 (Biolegend) foi adicionado e incubado 1h à RT. Após lavagem (3 x 90 μL/po^o com tampão PBST) 25 μL/po^o POD de ovelha anti-camundongo (GE NA9310V) foi adicionado em diluição 1:9000 e incubado à RT por 1 h durante agitação a 400 rpm de rotação. Após lavagem (4 x 90 μL/po^o com tampão PBST) 25 μL/po^o de substrato TMB (Calbiochem, n° CL07) foi adicionado e incubado até OD 1,5 a 2,5. Em seguida, a reação foi interrompida por adição de 25 μL/pog:o de solução HCL 1 N. A medição ocorreu a 370/492 nm.
[00244] Os resultados de ELISA são listados como valores de EC50 (ng/mL) em resumo na Tabela 2 abaixo.
EXEMPLO ELISA DE CÉLULA PARA TlM3
[00245] Linhagem celular CHO-K1 aderente transfectada de maneira estável com plasmídeo 15312_hTIM3-fl_pUC_Neo que codifica Tim3 humano inteiro e seleção com G418 (marcador de resistência à Neomicina no plasmídeo) foram semeadas a uma concentração de 1,2 x 10E6/mL em placas de fundo plano de 384 poços e cultivadas durante a noite.
[00246] No dia seguinte adicionou-se 25 μL/pogio de amostra Tim3 ou anticorpo de referência aTim3 livre de Azida F38-2E2 (Biolegend, 354004) e incubou- se por 2h a 4°C (para evitar intemalização). Após lavagem (3 x 90 μL/poço de PBST (BIOTEK Washer: Prog. 29, 1 x 90) as células foram fixadas por remoção brusca do tampão residual e adição de 50 μL/po^o de Glutaraldeído 0,05%: Diluição de 1:500 de Glutaraldeído 25% (Sigma Cat.n°: G5882) em tampão IxPBS e incubada por 1 h à RT. Após lavagem (3 x 90 μL/po^o de PBST (BIOTEK Washer: Prog. 21, 3 x 90 GreinLysin) 25 μL/pog:o de anticorpo secundário foi adicionado para detecção (POD de ovelha anti-camundongo; POD de Rábano silvestre ligado ao fragmento F(ab’)2; GE NA9310) seguido por 2h de incubação à RT durante agitação a 400 rpm. Após lavagem (3 x 90 μL/po^o de PBST (BIOTEK Washer: Prog. 21, 3 x 90 GreinLysin) adicionou-se 25 μL/po^o de solução de substrato TMB (Roche 11835033001) e incubou-se até OD 1,5 a 2,5. Em seguida, a reação foi interrompida por adição de 25 μL/po^o de solução HCL 1 N. A medição ocorreu a 370/492 nm.
[00247] Os resultados de ELISA de células são listados como valores “EC50 CHO-Tim3” (ng/mL) em resumo na Tabela 2 abaixo.TABELA 2 AFINIDADES DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS EXEMPLARES (ELISA E BIACORE)
CARACTERIZAÇÃO BIACORE DOS ABS TIM3
[00248] Um ensaio baseado em ressonância plasmônica de superfície (SPR) foi usado para determinar os parâmetros cinéticos da ligação entre vários ligantes Tim3 murinos, bem como referências de ligação de Tim3 humana comercial. Portanto, um IgG anti-camundongo foi imobilizado por acoplamento de amina à superfície de um chip sensor CM5 (BIAcore). As amostras foram então capturadas e Tim3-ECD hu/cy monomérica, bem como um dímero Tim3-ECD humano marcado com Fc foi ligada a elas. A superfície do chip sensor foi regenerado após cada ciclo de análise. A constante de equilíbrio KD foi finalmente adquirida por ajuste dos dados para um modelo de interação de Langmuir 1:1.
[00249] Cerca de 12000 unidades de resposta (RU) de 30 μg/mL de IgG anti-camundongo (GE Healthcare n° BR-1008-38) foram acopladas sobre as manchas 1,2,4 e 5 das células de fluxo 1 a 4 (manchas 1,5 estão ativas e as manchas 2,4 são manchas de referência) de um chip sensor CM5 em um BIAcore B4000 em pH 5,0 pelo uso de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare.
[00250] A amostra e o tampão de corrida foram HBS-EP+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,05% v/v, pH 7,4). Temperatura da célula de fluxo foi definida para 25°C e a temperatura do compartimento de amostra para 12°C. O sistema foi preparado com tampão de corrida.
[00251] As amostras foram injetadas por 30 segundos com uma concentração de 200 μg/mL e ligadas às manchas 1 e 5 de cada célula de fluxo, permitindo a medição de oito amostras em paralelo. Em seguida um conjunto completo de diferentes concentrações (cyno monomérico, humano e huFc fusionado a Tim3-ECD humano dimérico) (consulte Tabela X) foi injetado sobre cada amostra por 240 s seguido por um tempo de dissociação de 30/1800 s (consulte Tabela 1). Cada ciclo de análise (captura de amostra, mancha 1 e 5 - injeção Tim3 ECD) foi então regenerado com uma injeção de duração de 30 segundos de glicina-HCl pH 1,7. A taxa de fluxo foi definida para 30 μL/min para toda a corrida.
[00252] Finalmente os dados referenciados duplos foram ajustados para um modelo de interação de Langmuir 1:1 com o uso do programa de computação avaliação Biacore B4000. As afinidades resultantes para humana monomérica, Tim3 de cino e huFc fusionada a Tim3 humana dimérica são mostradas nas Tabelas 2 e 3. A afinidade para o dímero Tim3 é provavelmente mais afetada pela avidez e, portanto, aparentemente mais forte do que a afinidade para huTim3 monomérica.TABELA 3A AFINIDADES DE LIGAÇÃO DETERMINADAS POR BIACORE-VALORES KD ADQUIRIDAS POR UMA MEDIÇÃO SPR.-N.F. SIGNIFICA NENHUM AJUSTE POSSÍVEL, MAIS PROVAVELMENTE DEVIDO A NENHUMA LIGAÇÃO OU LIGAÇÃO FRACA
DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE A TIM3 ATRAVÉS DE SPR (VARIANTE TIM3-0016 QUIMÉRICA (0018) E VERSÕES HUMANIZADAS)
[00253] A proteína A foi imobilizada por acoplamento de amina à superfície de um chip sensor CM5 (Biacore). As amostras foram então capturadas e hu Tim3-ECD foi ligada a elas. A superfície do chip sensor foi regenerada após cada ciclo de análise. A constante de equilíbrio e as constantes de taxa cinética foram finalmente adquiridas por ajuste dos dados para um modelo de interação de Langmuir 1:1.
[00254] Cerca de 2000 unidades de resposta (RU) de 20 μg/mL de Proteína A foram acopladas sobre as manchas 1, 2, 4 e 5 de todas as células de fluxo de um chip sensor CM5 em um instrumento Biacore B4000 com o uso de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare.
[00255] A amostra e o tampão de corrida foram HBS-EP+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,05 % v/v, pH 7,4). Temperatura da célula de fluxo foi definida para 25°C e a temperatura do compartimento de amostra para 12°C. O sistema foi preparado com tampão de corrida.
[00256] Diferentes amostras foram injetadas por 30 segundos com uma concentração de 10 nM e ligadas consecutivamente aos locais 1 e 5 em todas as células de fluxo. Então um conjunto completo de diluições de Tim3- ECD humana monomérica (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 x 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM e 2 x 0 nM) foi consecutivamente injetado para cada amostra por 300 s. Cada injeção de antígeno foi seguida por um tempo de dissociação de 12 s/1000 s e duas etapas de regeneração de 30 s com uma solução de Glicina-HCl pH 1,5, da qual pelo menos a última continha um período de estabilização após a injeção de 20 segundos.
[00257] Finalmente os dados referenciados duplos foram ajustados para um modelo de interação de Langmuir 1:1 com o uso do programa de computação avaliação Biacore B4000. Os valores KD resultantes são mostrados na Tabela 3b.
DETERMINAÇÃO DA AFINIDADE A TIM3 ATRAVÉS DE SPR (TIM3-0028 QUIMÉRICA E VERSÕES HUMANIZADAS)
[00258] Uma IgG anti-Fc humana foi imobilizada por acoplamento de amina à superfície de um chip sensor CM5 (Biacore). As amostras foram então capturadas e hu Tim3-ECD foi ligado a elas. A superfície do chip sensor foi regenerada após cada ciclo de análise. A constante de equilíbrio e as constantes de taxa cinética foram finalmente adquiridas por ajuste dos dados para um modelo de interação de Langmuir 1:1.
[00259] Cerca de 2500 unidades de resposta (RU) de 10 μg/mL de IgG anti-Fc humana (GE Healthcare n° BR-1008-39) foram acopladas sobre as manchas 1, 2, 4 e 5 de todas as células de fluxo de um chip sensor CM5 em um instrumento Biacore B4000 com o uso de um kit de acoplamento de amina fornecido pela GE Healthcare.
[00260] A amostra e o tampão de corrida foram HBS-EP+ (HEPES 0,01 M, NaCl 0,15 M, EDTA 3 mM, Tensoativo P20 0,05 % v/v, pH 7,4). Temperatura da célula de fluxo foi definida para 25°C e a temperatura do compartimento de amostra para 12°C. O sistema foi preparado com tampão de corrida.
[00261] Diferentes amostras foram injetadas por 30 segundos com uma concentração de 10 nM e ligadas consecutivamente aos locais 1 e 5 em todas as células de fluxo. Então um conjunto completo de diluições de Tim3-ECD humana monomérica (600 nM, 200 nM, 66,7 nM, 2 x 22,2 nM, 7,4 nM, 2,5 nM e 2 x 0 nM) foi consecutivamente injetado para cada amostra por 300 s. Cada injeção de antígeno foi seguida por um tempo de dissociação de 12 s/700 s e duas etapas de regeneração de 30 s com uma solução de MgCl2 3 M, das quais pelo menos uma continha uma “lavagem extra após a injeção” com tampão de corrida.
[00262] Finalmente os dados referenciados duplos foram ajustados para um modelo de interação de Langmuir 1:1 com o uso do programa de computação avaliação Biacore B4000. Os valores KD resultantes são mostrados na Tabela 3b.TABELA 3B AFINIDADES DE LIGAÇÃO DETERMINADAS POR BIACORE-VALORES KD ADQUIRIDAS POR UMA MEDIÇÃO SPR
EXEMPLO 2 GERAÇÃO DE DERIVADOS DE ANTICORPOS ANTI-TIM3 DERIVADOS DE ANTICORPOS QUIMÉRICOS
[00263] Anticorpos Tim3 quiméricos foram gerados por amplificação das regiões das cadeias pesada e leve variáveis das variantes Tim3-0016, Tim3-0016 (0018) de anticorpos de camundongo anti-TIM3, Tim3-0021, Tim3-0022, Tim3-0026, Tim3-0028, Tim3-0030 e Tim3-0033, Tim3-0038 através de PCR e clonagem dos mesmos em vetores de expressão de cadeia pesada como proteínas de fusão com esqueletos de IgG1 humana / CH1 humana-Dobradiça-CH2-CH3 com mutações LALA e PG (Leucina 234 para Alanina, Leucina 235 para Alanina, Prolina 329 para Glicina) anulando funções efetoras e vetores de expressão de cadeia leve como proteínas de fusão para C-kappa humana. Plasmídeos LC e HC foram então cotransfectados em HEK293 e purificados após 7 dias a partir de sobrenadantes por métodos padrão para purificação de anticorpo.
REMOÇÃO DE SÍTIO DE GLICOSILAÇÃO NYT: MODIFICAÇÃO DE POSIÇÃO 1 HVR- L1 EM TIM3-0016, VARIANTE TIM3 0016 (DENOMINADA 0018 OU TIM3 0018) POR SUBSTITUIÇÃO DE N POR Q OU S
[00264] Mutações dentro da região de cadeia leve variável de Tim3_0016 e variante Tim3_0016 (0018) foram geradas por mutagênese in vitro com o uso do kit “Quick Change Lightning Site-directed Mutagenesis” de acordo com as instruções do fabricante. Por este método, a asparagina (N) do motivo NYT do sítio de glicosilação de asparagina na HVR-L1 da cadeia leve (SEQ ID NO: 4) foi substituída por glutamina (Q) (resultando na SEQ ID NO: 11 = Tim3_0016_HVR-L1 variante 1_ NQ) ou alternativamente, a asparagina (N) foi substituída por serina (S) (resultando na SEQ ID NO: 12 = Tim3_0016_HVR-L1 variante 2_ NS). Em ambos, o motivo NYT do sítio de glicosilação foi modificado com êxito. Plasmídeos LC e HC que codificam variantes foram então cotransfectados em HEK293 e purificados após 7 dias a partir de sobrenadantes por métodos padrão para purificação de anticorpo.
[00265] Os mutantes gerados foram testados por ELISA em humano Tim3, ELISA em Tim3 de cinomolgo e ELISA celular em células CHO-K1 aderentes que expressam Tim3 humana inteira. TABELA 4
[00266] Descobriu-se que todos os mutantes gerados apresentam ainda mais ligação funcional a TIM3 humano (humano), TIM3 de cino (cino) ou TIMR humano em células CHO do que os anticorpos parentais Tim3_0016 ou o anticorpo Tim3_0016 variante Tim3_0018, respectivamente.
DERIVADOS DE ANTICORPOS HUMANIZADOS HUMANIZAÇÃO DOS DOMÍNIOS VH E VL DE VARIANTE ANTI-TIM3-0016 (0018) MURINA E ANTI-TIM3 0028
[00267] Baseado na sequência de aminoácidos dos domínios VH e VL de a) variante Tim3_0016 (0018) do anticorpo anti-Tim3 (com as sequências aminoácido das 6 HVRs em que na cadeia leve da HVR-L1 variante 2_NS (remoção de de glicosilação por mutação N a S) foi usada (SEQ ID NOs: 1, 2,3,12 ,5 e 6) variantes Tim3-0433 e Tim3-0434 de anticorpos anti-Tim3 humanizadas foram geradas e baseadas na sequência de aminoácidos dos domínios VH e VL de b) anticorpo Tim3_0028 anti-Tim3 (com as sequências de aminoácidos das 6 HVRs (SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41 e 42) variantes Tim3-0438 e Tim3-0443 de anticorpos anti-Tim3 humanizadas foram geradas.
[00268] As sequências de aminoácidos humanizadas para regiões variáveis de cadeia pesada e leve foram traduzidas de forma reversa para o DNA e o cNDA resultante foi sintetizado (GenArt) e então clonado nos vetores de expressão de cadeia pesada como proteínas de fusão com esqueletos de IgG1 humana / CH1-Dobradiça-CH2-CH3 com mutações LALA e PG (Leucina 234 para Alanina, Leucina 235 para Alanina, Prolina 329 para Glicina) anulando funções efetoras ou nos vetores de expressão de cadeia leve como proteínas de fusão para C-kappa humana. Plasmídeos LC e HC foram então cotransfectados em HEK293 e purificados após 7 dias a partir de sobrenadantes por métodos padrão para purificação de anticorpo. Os anticorpos Tim3 humanizados são nomeados da seguinte forma:TABELA SEQUÊNCIAS VH E VL DE ANTICORPOS HUMANIZADOSTABELA SEQUÊNCIAS HVR DE ANTICORPOS HUMANIZADOS
EXEMPLO 3 MARCAÇÃO FLUORESCENTE DE ANTICORPO MONOCLONAL PURIFICADO
[00269] A marcação fluorescente do anticorpo monoclonal derivado de hibridoma foi realizada pelo uso do Kit de Marcação de Anticorpo Monoclonal Alexa Fluor 488 (fabricado pela Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após a marcação, cada anticorpo foi confirmado ser positivamente marcado com Alexa Fluor 488 (desse ponto em diante citado como “Alexa-488”) por análise FACSCalibur (fabricado pela BD Biosciences) para TIM-3 que expressa células RPMI-8226 e Pfeiffer.
EXEMPLO 4 CLASSIFICAÇÃO DE GRUPOS DE EPÍTOPO DE LIGAÇÃO COM O USO DE FACS BASEADA EM ENSAIO DE COMPETIÇÃO
[00270] A relação de epítopos entre anticorpos anti-TIM3 gerados e seis anticorpos de referência anti-TIM3 foi analisada por uma FACS baseada em ensaio de competição de ligação. Os anticorpos de referência TIM3 foram os seguintes: anticorpos 4177 e 8213 conforme descrito na patente US 2012/189617, anticorpos 1.7E10 e 27.12E12 conforme descrito no documento WO 2013/06490; anticorpo 344823 (Clone 344823, fabricado pela R&D Systems)e anticorpo F38-2E2 (Clone F38-2E2, fabricado pela BioLegend e R&D Systems). Em resumo, deixou-se o anticorpo de teste interagir e se ligar com as células RPMI-8226 que expressam TIM-3 (ATCC® CCL-155™) e, em seguida, foi avaliado pelo método de citometria de fluxo se outro anticorpo anti-TIM-3 também poderia se ligar a células que expressam TIM-3.
[00271] Em resumo, foram incubadas células RPMI-8226 que expressam TIM3 humana com Bloqueio de Fc humano BD por 10 min à RT e coradas em duas configurações experimentais diferentes para excluir o impacto da diferença na afinidade dos anticorpos testados na ligação:1) com anti-TIM3 purificado divulgado (10 μg/mL em tampão de coloração BD por 0,5 h a 4°C), que foram conjugados com Alexa*488 de acordo com as instruções do fabricante (Sondas Moleculares A-20181) com uma média de 2,7 fluoróforos por anticorpo. Em seguida a) foram adicionados anticorpos anti-TIM3 recombinantes de referência (1-4) não marcados ou Isotipo de controle (10 μg/mL) por 0,5 h a 4°C em SB BD e após lavagem com SB BD corado com Abs anti-huFcY marcados com PE (JIR, 109-116-098, 1:200, 0,5 h a 4°C em SB BD) ou b) foram adicionados anticorpos anti-TIM3 de referência disponíveis (5-6) marcados com PE ou controles de Isotipos apropriados (10 μg/mL) por 0,5 h a 4°C em SB BD. Após lavagem e centrifugação de sinais MFI de células RPMI-8226 coradas foram analisados por citômetro de fluxo BD Biosciences FACSCanto.TABELA 5 RESUMO DE CARACTERIZAÇÃO DE EPÍTOPO - COMPETIÇÃO DE ANTICORPOS TIM3 PARA LIGAÇÃO A TIM3
[00272] Os resultados do mapeamento de grupos de epitopes baseado em FACS mostram que Tim3_0016 e Tim3_0016 variante Tim3_0018 não apresentam competição de ligação com quaisquer anticorpos de referência anti-TIM-3 testados e sugeriu-se que esses Abs reconheceram o novo epítopo diferente dos epítopos ao qual todos os anticorpos de referência TIM3 descritos anteriormente reconheceram, enquanto que Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028 e Tim3_0038 competiram para uma extensão diferente para ligação a TIM3 expressa na superfície em células JRPMI-8226 com vários competidores.
EXEMPLO 5 EFEITO DE ANTICORPOS ANTI-TIM-3 HUMANOS NA PRODUÇÃO DE CITOCINAS EM UMA REAÇÃO MISTA DE LINFÓCITOS (MLR)
[00273] Uma reação mista de linfócitos foi usada para demonstrar o efeito do bloqueio da via de TIM-3 para células efetoras de linfócitos. Células T no ensaio foram testadas quanto à ativação e secreção de IFN-gama na presença ou ausência de um mAb anti-TIM-3.
[00274] Linfócitos humanos foram isolados do sangue periférico de doadores saudáveis por centrifugação em gradiente de densidade com o uso de Leukosep (Greiner Bio One, 227 288). Resumidamente, o sangue heparinizado foi diluído com três vezes o volume de PBS e alíquotas de 25 mL do sangue diluído forma colocadas em camadas em tubos Leukosep de 50 mL. Após centrifugação a 800 x g por 15 min à temperatura ambiente (quebra w/o), os linfócitos contendo frações foram coletados, lavados e usados diretamente no ensaio funcional ou ressuspensos em meio de congelamento (DMSO 10%, FCS 90%) em 1,0E+07 células/mL e armazenados em nitrogênio líquido. A razão 1:1 de células alvo/respondedoras foi usada no ensaio MLR (isto é, cada cultura MLR continha - 2,0E+05 PBMCs de cada doador em um volume total de 200 μL. Anticorpos monoclonais anti-TIM3, Tim3_0016, Tim3_0016 variant (Tim3_0018), Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0026, Tim3_0028, Tim3_0030, Tim3_0033, Tim3_0038 e F38-2E2 (BioLegend), foram adicionadas a cada cultura em diferentes concentrações de anticorpo. Nenhum anticorpo ou um anticorpo controle de isotipo foi usado como controle negativo e rec hu IL-2 (20 UE/mL) foi usado como controle positivo. As células foram cultivadas por 6 dias a 37°C. Após o Dia 6, 100 μL de meio foi tomado de cada cultura para medição de citocina. Os níveis de IFN-gama foram medidos com o uso do kit ELISA OptEIA (BD Biosciences).
[00275] Os resultados são mostrado na Tabela 6 (secreção/liberação de IFN-g). Os anticorpos monoclonais anti-TIM-3 promoveram ativação de células T e secreção de IFN-gama de maneira dependente da concentração. Os anticorpos anti-TIM3, Tim3_0021, Tim3_0022, Tim3_0028 e Tim3_0038 reduzem a liberaçãoda citocina inflamatória (IFN- gama) mais do que o anticorpo F38-2E2. Tim3_0016, Tim3_0016 variante (Tim3_0018), Tim3_0033 e Tim3_0038 mostraram uma liberação similar em comparação ao anticorpo F38-2E2. Ao contrário, culturas contendo o anticorpo controle de isotipo não apresentaram um aumento na secreção de IFN-gama.TABELA 6A PORCENTAGEM DE ANTICORPO ANTI-TIM3 INDUZIDA POR LIBERAÇÃO DE IFN-GAMA EM COMPARAÇÃO A REC HU IL-2 (20 UE/ML) ( = 100%) COMO CONTROLE POSITIVO E NENHUM ANTICORPO COMO CONTROLE NEGATIVO
[00276] Em experimentos adicionais, os valores EC50 dos seguintes anticorpos quiméricos e humanizados (gerados conforme descrito acima) em combinação com 0,1μg/mL de mAb anti-PD1 foram medidos: O anticorpo chi_Tim3_018 quimérico e suas versões humanizadas Tim3-433 e Tim3-434 , anticorpo chi_Tim3_028 quimérico e suas versões humanizadas Tim3-438 e Tim3-443 foram medidos com diferentes misturas de doadores de linfócitos (D2 e D3, ou D1 e D5, respectivamente). Os resultados são mostrados na Tabela 6b.TABELA 6B EC50 DE ANTICORPO ANTI-TIM3 INDUZIDO (SECREÇÃO/LIBERAÇÃO DE IFN-G/)
EXEMPLO 6 INTERNALIZAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TIM-3 EM CÉLULAS QUE EXPRESSAM TIM-3
[00277] Anticorpos específico para TIM-3 descritos no presente pedido podem ser internalizados em células que expressam TIM-3, incluindo linfoma, mieloma múltiplo e células AML que expressam TIM-3. Por exemplo, os anticorpos específicos para TIM-3 divulgados e fragmentos dos mesmos são mostrados como sendo internalizados em células CHO TIM 3 rec estáveis que expressam TIM-3 humana, conforme avaliado por ELISA baseado em célula, citometria de fluxo (FACS) e microscopia confocal.
[00278] Por exemplo, células CHO-K1 transfectadas com Tim3 estáveis (clone 8) (4 x 104 células/poço/100μL) foram inoculadas em MTP de 98 poços com o uso de meio de cultura fresco. Após fixação celular durante a noite, o meio de cultura celular foi removido e os anticorpos de teste foram adicionados às células (10 μg/mL no meio de cultura celular) e incubado por 0,5 hora a 4°C. Como referência, foi usado um anticorpo de camundongo anti-humano comercial (TIM3 MAB 11E365 (US Biological, T5469-92P). Após lavagem (2x com meio de cultura celular) e centrifugação, as células foram incubados por 3 horas a a) 4°C ou b) 37°C em 200 μL de meio de cultura. A internalização ocorre tipicamente a 37°C, mas não a 4°C, que fornece outro controle para a reação. Em seguida as células foram fixadas com 100 μL/poço de gluteraldeído 0,05% (Sigma Cat. n°: G5882) em 1x PBS por 10 min à temperatura ambiente (RT). Este foi seguido por três etapas de lavagem com 200 μL de PBS-T e anticorpo secundário de ovelha anti-camundongo-POD (POD de rábano silvestre ligado ao Fragmento F(ab’)2; GE NA9310)) foram adicionados por 1 hora à RT. Após as etapas de lavagem final (3 x PBS-T), o substrato TMB foi adicionado (Roche n.° de encomenda 11835033001) por 15 min e a revelação da cor foi parada com o uso de HCl 1 N. ODs finais foram determinadas por medição a 450/620 nm em um leitor ELISA. Este procedimento ELISA celular foi usado para avaliação de rendimento médio da capacidade de internalização dos anticorpos de teste que foram purificados a partir de sobrenadantes de hibridoma.
[00279] A porcentagem de internalização foi calculada como a seguir: Internalização (%= = (1- ODamostra_37°C / OD amostra_4°C)*100
[00280] Os resultados são mostrados nas Figuras 1A e B para (internalização). Quase todos os anticorpos monoclonais anti-TIM-3 testados foram internalizados de modo similar em células CHO-K1 transfectadas com Tim3 estáveis após 3h de incubação a 37°C (nem todos os dados mostrados).
[00281] A determinação de valores EC50 de internalização (dependência do tempo), bem como a comparação das cinéticas da internalização dependendo de mono versus bivalência foi estimada por FACS para candidatos selecionados.
[00282] Em resumo, células CHO-K1 que expressam de modo estável TIM3 humana foram inoculadas (4 x 105 células/poço/50μL) em MTP de fundo v de 98 poços com o uso de meio de cultura fresco e incubadas com Líquido NF Redimune® por 10 min à RT para bloquear ligação inespecífica. Em seguida, 50 μL/poço de anti-TIM3 purificado selecionado (10μg/mL no meio de cultura celular) foram adicionados e incubados por 1h a 4°C. Após lavagem (com meio de cultura celular) e centrifugação, as células foram incubados por 0,25, 0,5, 1,2, 3, 4, 6 e 24 horas a a) 4°C ou b) 37°C em 200 μL de meio de cultura. Em seguida, as células foram lavadas com PBS/BSA 1% e o anticorpo secundário IgG de cabra anti-camundongo Alexa Fluor 488 foram adicionados por 1 hora a 4oC. Após a lavagem e a centrifugação, 125 μL de CellFix (BD Bioscience, 1:1000) foram adicionados e sinais MFI de células coradas foram analisados por citômetro de fluxo FACSCanto BD Biosciences.
[00283] A porcentagem de internalização foi calculada como a seguir: Internalização (%) = (1- MFIamostra_37°C / MFIamostra_4°c)*100
EXEMPLO PARA A AVALIAÇÃO DE INTERNALIZAÇÃO DEPENDENTE DE TEMPO DE ANTICORPOS ANTI-TIM3 TIM3 0016, TIM3 0016 VARIANTE (TIM3 0018),TIM3 0021, TIM3 0028, TIM3 0030, TIM3 0033, TIM3 0038 EM CÉLULAS RPMI- 8226 (ATCC® CCL-155™)
[00284] Os anticorpos anti-TIM3 atualmente divulgados são internalizados rapidamente em células RPMI-8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL-155™) a um nível elevado. Os experimentos foram conduzidos conforme descrito acima com células RPMI-8226 que expressam TIM3 (ATCC® CCL- 155™) em vez de células CHOK1 rec que expressam huTIM-3. Os resultados são mostrados nas Tabela 7. Como anticorpos de referência TIM3, os seguintes anticorpos foram usados: anticorpo 8213 conforme descrito na patente US 2012/189617, anticorpo 27.12E12 conforme descrito no documento WO 2013/06490. Tim3_0016, Tim3_0016 variante (Tim3_0018), Tim3_0038 foram usadas como versões quiméricas de IgG1 humana.TABELA 7 PORCENTAGEM DE INTERNALIZAÇÃO NO PONTO NO TEMPO INDICADO (0 MIN DEFINIDO COMO 0 PORCENTO)
[00285] A partir dos resultados, os anticorpos da invenção são rapidamente internalizados em alta porcentagem em comparação a anticorpos de referência em células RPMI-8226 (ATCC® CCL-155™)
EXEMPLO 7 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TIM-3 A MONÓCITOS HUMANOS ISOLADOS QUE EXPRESSAM TIM-3
[00286] Os monócitos CD14+ foram isolados do sangue periférico anticoagulado de doadores saudáveis por centrifugação por gradiente de densidade com o uso de Ficoll-Paque (GE Healthcare) (consulte Protocolos Gerais nos Manuais de Usuário ou visite www.miltenyibiotec.com/protocols) e subsequente seleção positiva através de Microesferas de CD14. Primeiro as células CD14+ são marcadas magneticamente com microesferas CD14. Em seguida a suspensão de células é carregado sobre uma coluna MACS® que é colocado no campo magnético de um separador MACS. As células CD14+ marcadas magneticamente são retidas na coluna. As células não marcadas são corridas, esta fração é depletada das células CD14+. Após a remoção da coluna do campo magnético, as células CD14+ retidas magneticamente podem ser eluídas como a fração de células selecionadas positivamente. Após centrifugação a 200 x g por 10 min à temperatura ambiente, os monócitos foram coletados e usados diretamente no ensaio de ligação ou ressuspensos em meio de congelamento (DMSO 10%, FCS 90%) em 1,0E+07 células/mL e armazenados em nitrogênio líquido.
[00287] Conforme mostrado na literatura, os monócitos expressam constitutivamente TIM3 em sua superfície. 1x105 CD14+ monócitos humanos isolados (50 μL/poço) foram colocados em MTP de fundo v de 98 poços em meio de cultura fresco e incubados com Redimune® NF Líquido por 15 min à RT para bloquear ligação inespecífica. Em seguida 50 μL/poço de mAbs anti- TIM3 divulgados ou mAbs 344823 anti-TIM-3 de referência (R&D) e F38-2E2 (BioLegend) (10μg/mL em meio de cultura celular ) foram adicionados e incubados por 1 h a 4°C. Em seguida, as células foram lavadas com PBS/BSA 1% e o anticorpo secundário de cabra anti-camundongo F(ab’)2 marcado com PE (Jackson Lab 115-006-072) foram adicionados por 1 hora a 4°C. Após lavagem e centrifugação de sinais MFI de células coradas foram analisados por citômetro de fluxo BD Biosciences FACSCanto.
[00288] A ligação específica foi calculada como a seguir: Ligação Específica (MFI) = Geom. Média de MFIamostra - Geom. Média de MFIcontrole isotipo
[00289] Os resultados são mostrados na Tabela 8: (Ligação a Monócitos humanos). Os clones de TIM3, Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0020, Tim3_0028 e Tim3_0038 se ligam a monócitos humanos de diferentes doadores ainda melhor do que os Abs anti-TIM-3 de referência.TABELA 8 LIGAÇÃO A MONÓCITOS HUMANOS
EXEMPLO 8 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TIM-3 A MONÓCITOS DE CINO ISOLADOS QUE EXPRESSAM TIM-3
[00290] Os monócitos CD14+ foram isolados do sangue periférico anticoagulado de macaco cinomolgo (Covance) por gradiente de densidade com o uso de Ficoll-Paque (GE Healthcare) (consulte Protocolos Gerais nos Manuais de Usuário ou visite www.miltenyibiotec.com/protocols) e subsequente seleção positiva através de Microesferas NHP CD14. Primeiro as células CD14+ são marcadas magneticamente com microesferas CD14. Em seguida a suspensão de células é carregado sobre uma coluna MACS® que é colocado no campo magnético de um separador MACS. As células CD14+ marcadas magneticamente são retidas na coluna. As células não marcadas são corridas, esta fração é depletada das células CD14+. Após a remoção da coluna do campo magnético, as células CD14+ retidas magneticamente podem ser eluídas como a fração de células selecionadas positivamente. Após centrifugação a 200 x g por 10 min à temperatura ambiente, os monócitos foram coletados e usados diretamente no ensaio de ligação ou ressuspensos em meio de congelamento (DMSO 10%, FCS 90%) em 1,0E+07 células/mL e armazenados em nitrogênio líquido.
[00291] Conforme mostrado na literatura, os monócitos expressam constitutivamente TIM3 em sua superfície. 1x105 CD14+monócitos de cino isolados (50 μL/poço) foram colocados em MTP de fundo v de 98 poços em meio de cultura fresco e incubados com Redimune® NF Líquido por 15 min à RT para bloquear ligação inespecífica. Em seguida, 50 μL/poço de anti-TIM3 marcado com Alexa488 (10 μg/mL em meio de cultura celular) foram adicionados e incubados por 1h a 4°C. Após lavagem e centrifugação de sinais MFI de células coradas foram analisados por citômetro de fluxo BD Biosciences FACSCanto.
[00292] A ligação específica foi calculada como a seguir: Ligação Específica (MFI) = Geom. Média Geométrica de MFIamostra Média de MFIcontrole de isotipo
[00293] Os resultados são mostrados na Tabela 9 (Ligação a Monócitos de Cino). Os clones de TIM3, Tim3_0016, Tim3_0018, Tim3_0026, Tim3_0028 e Tim3_0030 se lligam a monócitos de cino de diferentes doadores de cino. TABELA 9 LIGAÇÃO A MONÓCITOS DE CINO
EXEMPLO 9 LIGAÇÃO DE ANTICORPOS ANTI-TIM-3 A LINHAGENS CELULARES NHL E MM QUE EXPRESSAM TIM-3
[00294] A capacidade de ligação de anticorpos anti-TIM3 divulgados e dois anticorpos de referência anti-TIM3 clones (1) 4177 e (2) 8213 (Kyowa) foram analisados por FACS. Em resumo, células de linfoma de células B que expressam TIM3 humana (exemplificadas como células Pfeiffer) e células de mieloma múltiplo (exemplificadas como células RPMI-8226) foram incubadas com Bloqueio de Fc humano BD por 10 min à RT para bloquear ligação inespecífica. Em seguida, 2 x 105 células (50 μL/poço) foram colocadas em MTP de fundo em V de 98 poços e foram adicionados 50 μL/poço de anti-TIM3 marcado com Alexa488 (10 μg/mL em tampão de coloração BD) e incubadas por 1h a 4°C. Após lavagem e centrifugação de sinais MFI de células coradas foram analisados por citômetro de fluxo BD Biosciences FACSCanto.
[00295] A ligação específica foi calculada como a seguir: Ligação Específica (MFI) = Geom. Média Geométrica de MFIamostra Média de MFIcontrole de isotipo
[00296] Os resultados são mostrados na Figura 2A e 2B (ligação a células RPMI-8226 e Pfeiffer).
EXEMPLO 10 ATIVIDADE CITOTÓXICA DE ANTICORPOS ANTI-TIM-3 EM CÉLULAS NHL E MM QUE EXPRESSAM TIM-3
[00297] Anticorpos específicos para TIM3 conjugados com exotoxina de Pseudomonas (PE 24) mataram efetivamente as células que expressam TIM3.
[00298] A atividade citotóxica de anticorpos anti-TIM3 divulgados e um anticorpo de referência anti-TIM3 comercial disponível clone 11E365 (disponível junto à US Biological) foi analisada com Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente Promega Cell Titer-Glo. Em resumo, para 5 x 103 células (50 μL/poço em MTP de 98 poços MTP, em triplicata) CHO recombinantes estáveis que expressam TIM-3 ou 2 x104 células (50μL/poço em MTP de 98 poços, em triplicata) de linfoma de células B que expressam TIM3 humana (exemplificadas como células Pfeiffer) ou células de mieloma múltiplo (exemplificadas como células RPMI-8226) foram adicionadas a 25 μL/po^o em diluição em série 1:5 de anticorpos anti-TIM-3 divulgados com concentração mais alta de 10 μg/mL ou meio apropriado para células não tratadas ou controle de isotipo para células tratadas não direcionadas. O tratamento varia de 10μg/ml/mL a 1ng/ml/mL em triplicata. Todos os anticorpos foram usados como versões de FCY de camundongo inteiras. Para conjugação da exotoxina de Pseudomonas, 10 μg/mL de Fabs específicos para fragmento FCY de camundongo conjugado com PE 24 foram adicionados e incubados por 3 dias a 37°C. Cicloheximida como um inibidor de síntese protéica conhecido em eucariontes foi usada como controle positivo. A viabilidade das células tratadas foi medida com Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente Promega Cell Titer-Glo.
[00299] A atividade citotóxica foi calculada como a seguir:Rel. inibição (%) = (1-(E amostra - e controle negativo)/( e controle positivo - e controle negativo))*100
[00300] Os resultados são mostrados na Tabela 10 (atividade citotóxica de mAbs anti-TIM3 em linhagens celulares recombinantes que expressam TIM-3, NHL e MM em formato sanduíche).TABELA 10
[00301] Todos os clones TIM3 testados são altamente potentes (IC50 na faixa de 0,01 a 0,2 nM) em células recombinantes CHO K1 estáveis que expressam TIM-3 humana e Pfeiffer que expressam níveis altos e moderados de TIM-3 e até mesmo mais potentes em sua atividade citotóxica do que a referência de internalização forte anti-TIM-3 Ab clone 11E365, US Biological. TIM3 clones 0016, 0018, 0021, 0022, 0033 e 0038 também são potentes em células RPMI-8226 que expressam níveis 5 vezes menores em comparação a células CHO TIM-3 recombinantes.
EXEMPLO 11 COMPARAÇÃO DA ATIVIDADE CITOTÓXICA DE ANTICORPOS ANTI-TIM3 DIVULGADOS VERSUS DOIS ANTICORPOS DE REFERÊNCIA ANTI-TIM3 1.7.E10 E 27-12E12 (CONFORME DESCRITO NO DOCUMENTO WO 2013/06490)
[00302] A atividade citotóxica de anticorpos anti-TIM3 divulgados e dois anticorpos de referência anti-TIM3, os anticorpos de referência TIM3 1.7E10 e 27.12E12, conforme descrito no documento WO 2013/06490 foi analisado com o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente Promega Cell Titer-Glo. Todos os anticorpos foram usados como formato IgG1 humano inteiro incluindo a parte Fc gama humana. Neste experimento, a conjugação da exotoxina de Pseudomonas foi obtida através de Fabs específicos de fragmento FCY humano conj ugados com PE 24 (10 μg/mL) que foram adicionados e incubados por 5 dias a 37°C.
[00303] Os resultados são mostrados na Tabela 11. - Comparação de atividade citotóxica de mAbs Anti-TIM3 em linhagens celulares NHL e MM que expressam TIM-3.TABELA 11 COMPARAÇÃO DE ATIVIDADE CITOTÓXICA DE MABS ANTI-TIM3 EM LINHAGENS CELULARES NHL E MM QUE EXPRESSAM TIM-3
[00304] Todos os clones TIM3 divulgados são altamente ativos (IC50 na faixa de 0,02 a 0,08 nM) em células Pfeiffer e RPMI-8226 que expressam TIM-3 e até mesmo mais potentes em sua atividade citotóxica do que a forte referência de internalização Ab anti-TIM-3 clone 27-12E12. Todos os anticorpos foram comparados como exotoxina de Pseudomonas (PE24) conjugados com o uso da mesma exotoxina de Pseudomonas sob as mesmas condições.
EXEMPLO 12 ATIVIDADE CITOTÓXICA DE CONSTRUCTOS FAB-PE24 DE ANTICORPOS ANTI- TIM3 DIVULGADOS EM DIFERENTES LINHAGENS CELULARES MM, NHL E AML (QUE EXPRESSAM TIM3, MAS NÃO PSMA)
[00305] A atividade citotóxica foi analisada com o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente Promega Cell Titer-Glo, conforme descrito acima. Diluições em série 1:5 de fragmentos Fab de anticorpos anti-TIM3 conjugados diretamente a PE24 com a concentração mais alta de 50 μg/mL ou meio apropriado para células não tratadas ou sem ligação a anti-PSMA Fab-PE24 de controle para células tratadas não direcionadas foram incubados com 7,5 x103 células Pfeiffer ou 2 x 103 células RPMI-8226 (50 μL/poço em MTP de 98 poços) para 4 dias a 37°C. O tratamento varia de 50 μg/ml/mL a 8 ng/ml/mL em triplicata. Cicloheximida foi usada como controle positivo.
[00306] Os resultados são mostrados na Tabela 12. (Atividade citotóxica de constructos Fab-PE24 de anticorpos anti-TIM3 em linhagens celulares MM, NHL e AML).TABELA 12 ATIVIDADE CITOTÓXICA DE CONSTRUCTOS FAB-PE24 DE ANTICORPOS ANTI- TIM3 DIVULGADOS EM DIFERENTES LINHAGENS CELULARES MM, NHL E AML (RPMI-8226, KARPAS-299, CMK, TF-1, MOLM-13)
[00307] Todos os constructos Fab-PE24 testados de anticorpos anti-TIM3 divulgados são altamente potentes (IC50 faixa 1 a 10 nM) em células MM (RPMI-8226) e NHL (Karpas-299) que expressam nível moderado de TIM-3 e demonstram atividade citotóxica significativa em linhagens celulares AML (CMK, TF-1, MOLM-13) que expressam níveis muito baixos de TIM-3.
EXEMPLO 13 ATIVIDADE CITOTÓXICA DE IMUNOCONJUGADOS (CONJUGADOS DE EXOTOXINA A PSEUDOMONAS) (CONSTRUCTOS FAB-PE24) DE ANTI-TIM3 DIVULGADO NA HASTE LEUCÊMICA PRIMÁRIA/CÉLULAS AML PROGENITORAS DE PACIENTES RECIDIVOS/REFRATÁRIOS
[00308] As células CD34+ do sangue periférico de pacientes recidivos/refratários foram obtidas junto à AllCells, LLC, Alameda, CA.TABELA 13 CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS DE PACIENTES AML
[00309] Após confirmação da pureza e viabilidade de todas as amostras (pureza na faixa de 84 a 94% e viabilidade na faixa de 95 a 99%), o nível de expressão de TIM-3 foi avaliado por FACS conforme descrito no Exemplo 7 com o uso de mAbs anti-TIM-3 344823 (R&D). (consulte a Figura 3)
[00310] Todos as amostras de células-tronco de leucemia primária (4/4)/AML progenitoras (CD34+) provenientes de pacientes de recidiva/refratários demonstraram expressão homogênea de TIM-3 em diferentes níveis.
[00311] Para a avaliação da atividade citotóxica de constructos Fab-PE24 de clones de anti-TIM3 0016 e 0022 em 1 x104 células AML CD34+ (50 μL/poço em MTP de 98 poços, em triplicado) foram incubadas com diluições em série 1:5 de fragmentos Fab com a concentração mais alta de 50 μg/mL ou meio apropriado para células não tratadas ou Fab-PE24 anti- PSMA de controle sem ligação para células tratadas não direcionadas por 3 dias a 37°C. Cicloheximida foi usada como controle positivo. A atividade citotóxica foi analisada com o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente Promega Cell Titer-Glo, conforme descrito acima no Exemplo 12.
[00312] Os resultados são mostrados na Tabela 14. (Atividade citotóxica de constructos Fab-PE24 de anticorpos anti-TIM3 divulgados em células AML CD34+ primárias). TABELA 14 ATIVIDADE CITOTÓXICA DE CONSTRUCTOS FAB-PE24 DE ANTICORPOS ANTI- TIM3 DIVULGADOS EM CÉLULAS AML CD34+ PRIMÁRIAS
[00313] Constructos Fab-PE24 de anticorpos anti-TIM3 Tim3_0016 e Tim3_0022 são altamente potentes em amostras AML primárias (2/4) (PB0142 e PB0135) (IC50 na faixa de 30 a 116 nM) e demonstram atividade citotóxica significativa em todas as células-tronco de leucemia primária (4/4)/AML progenitoras (CD34+) que expressam diferentes níveis deTIM-3.
EXEMPLO 14 COMPARAÇÃO DA POTÊNCIA DE CONSTRUCTOS FAB-PE24 DE ANTICORPOS ANTI- TIM3 SELECIONADOS NAS LINHAGENS CELULARES NHL E MM
[00314] A avaliação da atividade citotóxica de construtos Fab- PE24 acoplados à sortase de anticorpos anti-TIM3 divulgados selecionados foi analisada com o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente Promega Cell Titer- Glo, conforme descrito acima no Exemplo 12.
[00315] Os resultados são mostrados na Tabela 15. (Atividade citotóxica de constructos Fab-PE24 de anticorpos anti-TIM3 selecionados em células NHL e MM). TABELA 15 ATIVIDADE CITOTÓXICA DE CONSTRUCTOS FAB-PE24 DE ANTICORPOS ANTI-TIM3 SELECIONADOS EM CÉLULAS NHL E MM
[00316] Alta potência citotóxico foi demonstrada com constructos FAB-PE24 de todos os anticorpos anti-TIM3 divulgados selecionados (IC50 na faixa de 0,3 a 5 nM) em células NHL (Pfeiffer) e MM (RPMI-8226) que expressam nível moderado de TIM-3.
[00317] A atividade citotóxica foi observada com constructos Fab- PE24 de anticorpos anti-TIM3 divulgados Tim3_ 0016 e Tim3_ 0038.
EXEMPLO 15 COMPARAÇÃO DE ATIVIDADE CITOTÓXICA DE CONSTRUCTO FAB-PE24 VERSUS CONJUGADO IGG TOTAL-AMATOXINA DO MESMO CLONE DE ANTICORPO ANTI-TIM-3 DIVULGADO EM CÉLULAS PFEIFFER
[00318] A avaliação da atividade citotóxica de constructos Fab- PE24 de clones anti-TIM3 0016 divulgados versus IgG total do mesmo clone conjugado com Amatoxina (de acordo com os procedimentos descritos no documento WO 2012/041504 (conjugado através do átomo 6’ de aminoácido amatoxin 4, particularmente através de um átomo de oxigênio ligado ao átomo 6’ C de aminoácido amatoxina, e em que o anticorpo TIM3 é conectada por um ligante através de uma componente de ureia) foi analisado com o Ensaio de Viabilidade Celular Luminescente Promega Cell Titer-Glo, conforme descrito acima no Exemplo 12.
[00319] Os resultados são mostrados na Tabela 16. (Atividade citotóxica de constructo Fab-PE24 versus conjugado IgG total-Amatoxina de clone anti-TIM3 0016 em células NHL).TABELA 16 ATIVIDADE CITOTÓXICA DE CONSTRUCTO FAB-PE24 VERSUS CONJUGADO IGG TOTAL-AMATOXINA DE CLONE ANTI-TIM3 0016 EM CÉLULAS NHL
[00320] Atividade citotóxica do clone anti-TIM-3 0016 conjugado a Amanitina (IC50 0,8 nM) é comparável com a atividade citotóxica do constructo Fab-PE24 do mesmo clone (IC50 0,3 nM) em células NHL (Pfeiffer) que expressam o nível moderado de TIM-3.
EXEMPLO 15 COMPARAÇÃO DIRETA DE LIGAÇÃO DE ANTICORPOS TIM3 A DIFERENTES CÉLULAS MONONUCLEARES DO SANGUE PERIFÉRICO (PBMC) ENSAIO DE LIGAÇÃO
[00321] PBMCs recém isoladas ou 3 dias ativadas de modo policlonal (anti-CD3 ligado à placa e anticorpos anti-CD28 solúveis, 1 ug/mL cada, ambos da BD Pharmingen) células T CD4 foram coradas com anticorpos anti-TIM Tim3-0018, Tim3-0028 ou versões humanizadas ou quiméricas dos mesmos conjugados diretamente a Alexa 647 por 1 hora a 4°C. As células foram lavadas para eliminar anticorpo não ligado e coradas para marcadores de superfície por 30 minutos a 4°C para discriminar os monócitos (CD14+ (BD Pharmingen)), células NK (CD16+(eBioscience), CD56+ (BioLegend) e CD3+) e células T (CD3+ (eBioscience)) antes de serem fixadas com BD Cell Fix. As células foram adquiridas na LSRFortessa, BD Biosciences.
[00322] Os resultados são mostrados nas Figuras 4A a 4 D (nas Figuras as seguintes designações foram usadas: para Tim3-0018: 0018 (aTIM- 3), para Tim3-0018 humanizada versão Tim3-0434: 0434(h0018), para Tim3- 0028: 0028 (aTIM-3), para Tim3-0028 quimérico: chi0028, para Tim3-0028 humanizado versão Tim3-0438: 0438(h0028)). Os dados mostram que osanticorpos humanizados aprimoraram a ligação e especificidade de ligação para células T CD4 em comparação aos anticorpos parentais.

Claims (11)

1. ANTICORPO ISOLADO, que se liga a TIM3, caracterizado pelo anticorpo compreender: (i) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84, ou (ii) uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86.
2. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo anticorpo compreender uma sequência de VH de SEQ ID NO: 83 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 84.
3. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo anticorpo compreender uma sequência de VH de SEQ ID NO: 85 e uma sequência de VL de SEQ ID NO: 86.
4. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por ser um anticorpo IgG1 inteiro.
5. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por ser um anticorpo IgG1 inteiro com mutações L234A, L235A e P329G (numeração de acordo com o índice EU de Kabat).
6. IMUNOCONJUGADO, caracterizado por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um agente citotóxico.
7. FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender o anticorpo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou o imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 6, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
8. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou o imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ser para uso como um medicamento.
9. ANTICORPO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou o imunoconjugado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por ser para uso no tratamento de câncer.
10. USO DO ANTICORPO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou do imunoconjugado, conforme definido na reivindicação 6, caracterizado por ser para fabricação de um medicamento.
11. USO, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo medicamento ser para tratamento de câncer.
BR112017008986-6A 2014-11-06 2015-11-05 Anticorpo isolado, imunoconjugado, formulação farmacêutica, e uso do anticorpo BR112017008986B1 (pt)

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