KR20220069046A - 단일 도메인 항체에 대한 변이체 핵산 라이브러리 - Google Patents

단일 도메인 항체에 대한 변이체 핵산 라이브러리 Download PDF

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KR20220069046A
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아론 사토
판카이 가그
치앙 리우
톰 유안
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트위스트 바이오사이언스 코포레이션
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Abstract

단일 도메인 항체를 포함하는 항체를 코딩하는 변이체 핵산 라이브러리와 관련된 방법 및 조성물이 본원에서 제공된다. 본 명세서에서 설명되는 방법을 사용하여 생성된 라이브러리는 개선된 결합 친화도를 포함하는 개선된 특성을 갖는다. 본 명세서에서 설명되는 라이브러리는 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 각각 코딩하는 핵산을 포함하는 다양한 라이브러리를 포함한다. 핵산 라이브러리가 번역될 때 생성된 단백질 라이브러리가 본원에서 추가로 설명된다. 본 명세서에서 설명되는 다양한 핵산 라이브러리를 발현하는 세포 라이브러리가 본 명세서에서 추가로 설명된다.

Description

단일 도메인 항체에 대한 변이체 핵산 라이브러리
상호 참조
본 출원은 2019년 9월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/904,620호; 2019년 11월 14일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/935,603호; 및 2019년 12월 9일에 출원된 미국 특허 가출원 제62/945,761호의 이익을 주장하며, 이들은 각각 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
배경
항체는 생물학적 표적에 대해 높은 특이성과 친화도로 결합하는 능력을 가지고 있다. 그러나, 치료 항체의 설계는 면역학적 효과와 효능의 균형 때문에 쉽지 않은 상태이다. VHH 항체와 같은 단일 도메인 항체는 몇 가지 유익한 특성을 가지고 있다. 따라서, 치료제에 사용하기 위한 VHH 항체와 같은 항체의 생성을 위한 조성물 및 방법을 개발할 필요가 있다.
참조에 의한 통합
본 명세서에 언급되는 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 마치 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참조로 포함되는 것으로 구체적이고 개별적으로 표시된 것과 동일한 정도로 본원에 참조로 포함된다.
간단한 요약
서열 번호(SEQ ID NO) 152 또는 155에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 번호 153 또는 156에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 번호 154 또는 157에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 항체 또는 항체 단편이 본원에서 제공된다. 또한, 서열 번호 158 또는 161에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 번호 159 또는 162에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 번호 160 또는 163에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편이 본원에서 제공된다.
본원에서 설명되는 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다.
본원에서 설명되는 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하는 방법이 본원에서 제공된다.
번역될 때 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 제공되고, 여기서 복수의 서열의 각각의 서열은 중쇄의 가변 영역(VH) 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 또는 경쇄의 가변 영역(VL) 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3을 코딩하는 변이체 서열을 포함하고; 라이브러리는 적어도 30,000개의 변이체 서열을 포함하고; 항체 또는 항체 단편은 100 nM 미만의 KD로 그의 항원에 결합한다. 항체가 단일 도메인 항체인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 단일 도메인 항체가 VHH 항체인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 항체가 TIGIT에 결합하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 84-100에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 번역될 때 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 101-117에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 중쇄의 가변 영역 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이 서열 번호 67-83 또는 118-128 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 경쇄의 가변 영역 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이 서열 번호 129-137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 항체가 CD47에 결합하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 항체가 CD3 엡실론에 결합하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 138-141에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 번역될 때 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 142-145에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 50,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 100,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 105개의 동일하지 않은 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 109개의 서열의 이론적 다양성을 갖는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다.
번역될 때 단일 도메인 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 제공되고, 여기서 복수의 서열의 각각의 서열은 중쇄의 가변 영역(VH) 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3을 코딩하는 변이체 서열을 포함하고; 라이브러리는 적어도 30,000개의 변이체 서열을 포함하고; 항체 또는 항체 단편은 100 nM 미만의 KD로 그의 항원에 결합한다. 번역될 때 VH의 길이가 약 90 내지 약 100개 아미노산인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 번역될 때 VH의 길이가 약 100 내지 약 400개 아미노산인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. VH의 길이가 약 270 내지 약 300개 염기쌍인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. VH의 길이가 약 300 내지 약 1200개 염기쌍인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 단일 도메인 항체가 VHH 항체인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 항체가 TIGIT에 결합하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 중쇄의 가변 영역 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이 서열 번호 67-83 또는 118-128 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 84-100 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 중쇄의 가변 영역 상의 CDR3이 서열 번호 101-117 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 항체가 CD47에 결합하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 항체가 CD3 엡실론에 결합하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 138-141에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 50,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 100,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 105개의 동일하지 않은 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 109개의 서열의 이론적 다양성을 갖는 핵산 라이브러리가 본원에서 추가로 제공된다.
단일 도메인 항체를 코딩하는 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 제공되며, 이 방법은 (a) i. 제1의 복수의 폴리뉴클레오타이드의 각각의 폴리뉴클레오타이드가 중쇄 상의 CDR1을 코딩하는 적어도 1000개의 변이체 서열을 코딩하는 것인 제1의 복수의 폴리뉴클레오타이드; ii. 제2의 복수의 폴리뉴클레오타이드의 각각의 폴리뉴클레오타이드가 중쇄 상의 CDR2를 코딩하는 적어도 1000개의 변이체 서열을 코딩하는 것인 제2의 복수의 폴리뉴클레오타이드; iii. 제3의 복수의 폴리뉴클레오타이드의 각각의 폴리뉴클레오타이드가 중쇄 상의 CDR3을 코딩하는 적어도 1000개의 변이체 서열을 코딩하는 것인 제3의 복수의 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 미리 결정된 서열을 제공하는 단계; 및 (b) 제1의 복수의 폴리뉴클레오타이드, 제2의 복수의 폴리뉴클레오타이드 및 제3의 복수의 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여 단일 도메인 항체를 코딩하는 변이체 핵산의 핵산 라이브러리를 형성하는 단계를 포함하는 단계로서, 변이체 핵산의 적어도 약 70%는 100 nM 미만의 KD로 그의 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 것인 단계를 포함한다. 단일 도메인 항체가 하나의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 단일 도메인 항체가 VHH 항체인 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 단일 도메인 항체가 TIGIT에 결합하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 단일 도메인 항체가 서열 번호 84-100 또는 138-141 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에 추가로 제공된다. 단일 도메인 항체가 CD47에 결합하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 서열을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 서열을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 적어도 105개의 동일하지 않은 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 핵산 라이브러리가 75 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 핵산 라이브러리가 50 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 핵산 라이브러리가 25 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 핵산 라이브러리가 10 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다. 핵산 라이브러리가 적어도 109개의 서열의 이론적 다양성을 갖는 것인, 핵산 라이브러리를 생성하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다.
도 1은 본 명세서에 개시되는 유전자 합성을 위한 예시적인 공정 워크플로우를 보여주는 단계의 다이어그램을 제시한 것이다.
도 2는 컴퓨터 시스템의 예를 도시한 것이다.
도 3은 컴퓨터 시스템의 아키텍쳐를 보여주는 블록도이다.
도 4는 복수의 컴퓨터 시스템, 복수의 휴대 전화 및 개인 데이터 보조 장치, 네트워크 연결 스토리지(NAS: Network Attached Storage)를 통합하도록 구성된 네트워크를 보여주는 다이어그램이다.
도 5는 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템의 블록도이다.
도 6-7은 20에서 4000까지의 친화도 역치(도 6) 또는 20에서 1000까지의 친화도 역치(도 7)를 보여주는, VHH 라이브러리에 대한 TIGIT 친화도 분포의 그래프를 도시한 것이다. 140개의 VHH 결합제 중에서, 51개의 변이체가 < 100 nM이었고, 90개의 변이체가 < 200 nM이었다.
도 8은 'VHH 라이브러리', 'VHH Shuffle' 라이브러리 및 'VHH hShuffle 라이브러리'에 대한 길이당 CDR3 수의 그래프를 도시한 것이다.
도 9는 TIGIT VHH Fc 결합제에 대한 TIGIT:CD155 차단 검정의 그래프를 도시한 것이다. 나노몰(nM) 단위의 TIGIT VHH Fc 결합제의 농도는 x축에 제시되고, 상대적인 HRP 신호는 y축에 제시된다.
도 10은 CD47 VHH Fc 결합제의 CD47 친화도 분포의 그래프를 도시한 것이다. 'VHH Ratio' 라이브러리(가로 막대), 'VHH Shuffle' 라이브러리(검은색 막대) 및 'VHH hShuffle' 라이브러리(점선 막대)에 대한 친화도 역치(1가 KD)는 x축에 제시되고, 수는 y축에 제시된다.
도 11은 CD47 VHH Fc 결합제에 대한 CD47-SIRP알파 억제 검정의 그래프를 도시한 것이다. 나노몰(nM) 단위의 CD47 VHH Fc 결합제의 농도는 x축에 제시되고, 상대적인 HRP 신호는 y축에 제시된다.
도 12a-12b는 GLP1R-43-77의 FACS 분석의 그래프(도 12a) 및 용량 곡선 및 특이성의 그래프(도 12b)를 도시한 것이다.
도 13a-13b는 CRTH2-41-51의 FACS 분석의 그래프(도 13a) 및 용량 곡선 및 cAMP 활성의 그래프(도 13b)를 도시한 것이다.
도 14a-14b는 CRTH2-44-59의 용량 곡선(도 14a) 및 FACS 분석(도 14b)의 그래프를 도시한 것이다.
도 15a-15e는 CRTH2-74, CRTH2-24, CRTH2-28, CRTH2-39, CRTH2-19, CRTH2-9, CRTH2-8, CRTH2-27, CRTH2-45, CRTH2-35, CRTH2-50, CRTH2-66, CRTH2-57, CRTH2-32, CRTH2-15, CRTH2-25, CRTH2-42, CRTH2-55, CRTH2-60, 및 CRTH2-70을 사용하여 평균 형광 강도(MFI) 대 CRTH2R Ig를 사용한 8-점 적정에 의해 측정된 세포 결합의 FACS 분석 플롯을 도시한 것이다.
도 16a는 100 nM에서 CRTH2-27 결합을 보여주는 예시적인 게이팅된 도트 플롯(gated dot plot)을 도시한 것이다.
도 16b는 100 nM에서 CRTH2-27 결합을 보여주는 예시적인 APC 히스토그램을 도시한 것이다.
도 17a는 비교 항체 gPCR-51을 사용한, 이전 도면에서와 같은 결합 분석을 도시한 것이다.
도 17b는 비교 항체 gPCR-52를 사용한, 이전 도면에서와 같은 결합 분석을 도시한 것이다.
도 18a-18b는 cAMP 검정에서 기능적 효과를 갖는 CRTH2-9, CRTH2-27, CRTH2-50, CRTH2-32, 및 CRTH2-42와의 IgG 결합 곡선을 도시한 것이다.
도 19a는 300, 100, 및 33 nM에서 시험된 모든 항체에 대한 CRTH2R cAMP 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 19b는 33 nM에서 시험된 모든 항체에 대한 CRTH2R cAMP 검정의 결과를 도시한 것이다.
도 20은 5개의 CRTH2R IgG(CRTH2-9, CRTH2-27, CRTH2-50, CRTH2-32, 및 CRTH2-42)에서 관찰되는 음성 알로스테리(allosteric) 효과를 나타낸다.
도 21a-21c는 비교 항체 52가 양성 알로스테리 조절제임을 보여주는, 알로스테리 조절제의 대조 실험을 도시한 것이다.
도 22a-22d는 CRTH2R IgG의 β-아레스틴 동원 검정에서 CRTH2R의 활성을 도시한 것이다.
도 23은 본 발명에서 생성된 라이브러리의 개요를 도시한 것이다.
도 24는 본 발명에서 생성된 파지-디스플레이된 과다면역 라이브러리의 설계 개요를 도시한 것이다.
도 25a-25b는 차세대 시퀀싱에 의해 평가된 과다면역 라이브러리의 중쇄 CDR 길이 분포를 도시한 것이다. 도 25a는 길이당 CDR3 수의 그래프를 도시한 것이다. 도 25b는 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3 길이의 그래프를 도시한 것이다.
도 26은 가용성 단백질 표적의 선택 워크플로우의 개요를 도시한 것이다.
도 27a-27d는 패닝 라운드 3 및 라운드 4 후의 hTIGIT ELISA로부터의 데이터 그래프를 도시한 것이다.
도 27e-27f는 hTIGIT 면역글로불린에 대한 CDRH3 길이, 수율, 및 친화도(KD)의 개요를 도시한 것이다.
도 28a-28d는 패닝 라운드 4 및 라운드 5 후의 인간 CD3 엡실론(hCD3) 및 사이노 CD3 엡실론(cCD3) ELISA로부터의 데이터 그래프를 도시한 것이다.
도 28e-28l은 교차 반응성 인간 CD3 엡실론(hCD3) 및 사이노 CD3 엡실론(cCD3) 면역글로불린의 그래프를 도시한 것이다.
도 29a-29g는 CD8+, CD3+, 및 CD3- T 세포에 대한 인간 CD3의 적정 그래프를 도시한 것이다.
도 30a-30f는 CRTH2R 면역글로불린 CRTH2-48-03(도 30a), CRTH2-48-21(도 30b), 및 CRTH2-48-27(도 30c)에 대한 결합 친화도 그래프, 및 CRTH2-48-03(도 30d), CRTH2-48-21(도 30e), 및 CRTH2-48-27(도 30f)에 대한 cAMP 검정을 도시한 것이다.
도 31a-31b는 A2AR-90-007의 용량 곡선 그래프(도 31a) 및 FACS 분석(도 31b)를 도시한 것이다.
상세한 설명
본 개시내용은 달리 지시되지 않는 한, 관련 기술 분야의 기술 내에 있는 통상적인 분자 생물학 기술을 사용한다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 관련 기술 분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
정의
본 개시내용 전체에 걸쳐, 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시된다. 범위 형식의 설명은 단지 편의성 및 간결함을 위한 것이며, 임의의 실시양태의 범위에 대한 융통성 없는 제한으로 해석되지 않아야 한다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 문맥에서 달리 명시적으로 지시하지 않는, 모든 가능한 하위 범위 및 하한 단위의 10분의 1까지의 해당 범위 내의 개별 수치값를 구체적으로 공개한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등, 및 해당 범위 내의 개별 값, 예를 들어 1.1, 2, 2.3, 5 및 5.9에서와 같은 하위 범위를 구체적으로 공개한 것으로 간주되어야 한다. 이는 범위의 폭에 관계없이 적용된다. 이들 개재하는 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 더 작은 범위에 포함될 수 있고, 또한 명시된 범위에서 구체적으로 배제된 임의의 한계에 따라 본 개시내용 내에 포함된다. 명시된 범위가 한계 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 경우, 문맥에서 달리 명시적으로 지시하지 않는 한, 포함된 한계 중 하나 또는 둘 모두를 제외한 범위도 개시내용에 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 용어는 단지 특정한 실시양태를 설명하기 위해 사용된 것으로서, 임의의 실시양태로 한정하는 것으로 의도되지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수 형태도 포함하는 것으로 의도된다. 본 명세서에서 사용될 때, "포함하다" 및/또는 "포함하는"이라는 용어는 명시된 특징, 정수, 단계, 작업, 요소 및/또는 성분의 존재를 특정하지만, 하나 이상의 다른 특징, 정수, 단계, 작업, 요소, 성분 및/또는 이들의 군의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다는 것이 추가로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "및/또는"이라는 용어는 관련된 나열된 항목 중 하나 이상의 임의의 모든 조합을 포함한다.
구체적으로 언급되거나 또는 문맥상 명백하지 않은 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 수치 또는 수치 범위와 관련하여 "약"이라는 용어는 언급된 수치 및 그의 ± 10%, 또는 범위에 대해 열거된 값의 열거된 하한의 10% 미만 및 열거된 상한의 10% 초과를 의미하는 것으로 이해된다.
구체적으로 언급되지 않는 한, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 단일 가닥 분자 뿐만 아니라, 이중 가닥 또는 삼중 가닥 핵산도 포함한다. 이중 또는 삼중 가닥 핵산에서, 핵산 가닥은 동시에 연장될 필요는 없다(즉, 이중 가닥 핵산은 두 가닥의 전체 길이를 따라 이중 가닥일 필요는 없다). 제공되는 경우, 핵산 서열은 달리 언급되지 않는 한, 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 본원에서 설명되는 방법은 단리된 핵산의 생성을 제공한다. 본원에서 설명되는 방법은 단리 및 정제된 핵산의 생성을 추가로 제공한다. 본원에서 언급되는 바와 같이, "핵산"은 적어도 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000개 또는 그 초과의 염기 길이를 포함할 수 있다. 더욱이, 임의의 수의 폴리펩타이드 세그먼트 코딩 뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 비-리보솜 펩타이드(NRP: non-ribosomal peptide)를 코딩하는 서열, 비-리보솜 펩타이드드 합성효소(NRPS: non-ribosomal peptide-synthetase) 모듈 및 합성 변이체, 다른 모듈 단백질, 예를 들어 항체의 폴리펩타이드 세그먼트, 다른 단백질 패밀리로부터의 폴리펩타이드 세그먼트를 코딩하는 서열, 예를 들어 비-코딩 DNA 또는 RNA, 예를 들어 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 전사 인자, 인핸서, siRNA, shRNA, RNAi, miRNA, 마이크로RNA로부터 유래된 작은 핵소체 RNA, 또는 임의의 관심있는 기능적 또는 구조적 DNA 또는 RNA 단위의 합성 방법이 본원에서 제공된다. 다음은 폴리뉴클레오타이드의 비제한적인 예이다: 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비코딩 영역, 유전자 사이의 DNA, 연결 분석으로부터 정의된 유전자좌위(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA(mRNA), 전달 RNA, 리보솜 RNA, 짧은 간섭 RNA(siRNA: short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(shRNA: short-hairpin RNA), 마이크로-RNA(miRNA), 작은 핵소체 RNA, 리보자임, 일반적으로 메신저 RNA(mRNA)의 역전사에 의해 또는 증폭에 의해 수득되는 mRNA의 DNA 표시인 상보성 DNA(cDNA: complementary DNA); 합성에 의해 또는 증폭에 의해 생산되는 DNA 분자, 게놈 DNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브, 및 프라이머. 본원에서 언급되는 유전자 또는 유전자 단편을 코딩하는 cDNA는 게놈 등가 서열 내에 개재하는 인트론 서열이 없는 엑손 서열을 코딩하는 적어도 하나의 영역을 포함할 수 있다.
항체 라이브러리
항체 생성을 위한 방법, 조성물 및 시스템이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 항체는 단일 도메인 항체이다. 항체의 최적화를 위한 본원에서 설명되는 방법, 조성물 및 시스템은 항체 서열의 자연적 다양성을 반영하는 비율-변이(ratio-variant) 접근법을 포함한다. 일부 경우에, 최적화된 항체의 라이브러리는 변이체 항체 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 CDR 영역을 포함하는 변이체 항체 서열이 설계된다. 일부 경우에, 변이 CDR 영역을 포함하는 변이체 항체 서열은 라마, 인간화 또는 키메라 프레임워크에서 천연 CDR 서열을 셔플링함으로써 생성된다. 일부 경우에, 이러한 라이브러리는 합성되고, 발현 벡터 내로 클로닝되고, 번역 산물(항체)이 활성에 대해 평가된다. 일부 경우에는, 서열의 단편이 합성되고, 이어서 조립된다. 일부 경우에, 발현 벡터는 파지 디스플레이와 같은 원하는 항체를 디스플레이하고 농축하는 데 사용된다. 일부 경우에, 파지 벡터는 Fab 파지미드 벡터이다. 경우에 따라 농축 동안 사용되는 선택 압력에는 결합 친화도, 독성, 면역학적 내성, 안정성 또는 기타 요인이 포함된다. 이러한 발현 벡터는 특정 특성을 갖는 항체가 선택되도록 하고("패닝(panning)"), 이러한 서열의 후속 증식 또는 증폭은 이러한 서열로 라이브러리를 농축하게 만든다. 패닝 라운드는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7회 또는 7회 초과의 라운드와 같이 여러 번 반복될 수 있다. 일부 경우에, 각각의 패닝 라운드에 여러 번의 세척이 포함된다. 일부 경우에, 각각의 패닝 라운드는 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16회 또는 16회 초과의 세척을 포함한다.
인-실리코(in-silico) 라이브러리 설계의 방법 및 시스템이 본 명세서에서 설명된다. 본 명세서에서 설명된 바와 같은 라이브러리는 일부 경우에 다양한 항체 서열을 포함하는 데이터베이스를 기반으로 하여 설계된다. 일부 경우에, 데이터베이스는 다양한 표적에 대한 복수의 변이체 항체 서열을 포함한다. 일부 경우에, 데이터베이스는 적어도 100, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개, 또는 5000개 초과의 항체 서열을 포함한다. 예시적인 데이터베이스는 iCAN 데이터베이스이다. 일부 경우에, 데이터베이스는 나이브(naive) 및 기억 B-세포 수용체 서열을 포함한다. 일부 경우에, 나이브 및 기억 B-세포 수용체 서열은 인간, 마우스 또는 영장류 서열이다. 일부 경우에, 나이브 및 기억 B-세포 수용체 서열은 인간 서열이다. 어떤 경우에, 데이터베이스는 위치 특이적 변이에 대해 분석된다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 항체는 CDR 영역에 위치 특이적 변이를 포함한다. 일부 경우에, CDR 영역은 변이를 위한 다중 부위를 포함한다.
CDR 영역의 변이를 포함하는 라이브러리가 본원에서 설명된다. 일부 경우에, CDR은 가변 중쇄의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이다. 일부 경우에, CDR은 가변 경쇄의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이다. 일부 경우에, 라이브러리는 CDR1, CDR2 또는 CDR3을 코딩하는 다중 변이체를 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 바와 같은 라이브러리는 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1200, 1500, 1700, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개, 또는 5000개 초과의 CDR1 서열을 코딩한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 바와 같은 라이브러리는 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1200, 1500, 1700, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개, 또는 5000개 초과의 CDR2 서열을 코딩한다. 일부 경우에, 본 명세서에서 설명되는 바와 같은 라이브러리는 적어도 50, 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 1200, 1500, 1700, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000개, 또는 5000개 초과의 CDR3 서열을 코딩한다. 인-실리코 항체 라이브러리는 일부 경우에 원하는 서열에 대해 합성, 조립 및 농축된다.
CDR1 변이체, CDR2 변이체, 및 CDR3 변이체의 합성 후, 일부 경우에, CDR1 변이체, CDR2 변이체 및 CDR3 변이체는 셔플링되어 다양한 라이브러리를 생성한다. 일부 경우에, 본 명세서에서 설명되는 방법에 의해 생성된 라이브러리의 다양성은 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018개 또는 1018개 초과의 서열의 이론적 다양성을 갖는다. 일부 경우에, 라이브러리는 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018개 또는 1018개 초과의 서열의 최종 라이브러리 다양성을 갖는다.
변이체 서열에 상응하는 생식계열 서열은 또한 라이브러리에서 서열을 생성하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명되는 방법에 의해 생성된 서열은 생식계열 서열로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개, 또는 16개 초과의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 생성된 서열은 생식선 서열로부터 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 이하, 또는 약 18개 이하의 돌연변이를 포함한다. 일부 경우에, 생성된 서열은 생식계열 서열에 비해 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개, 또는 약 18개의 돌연변이를 포함한다.
항체 라이브러리
본 명세서에서 설명되는 방법에서 생성된 라이브러리가 본 명세서에서 제공된다. 본원에서 설명되는 항체는 개선된 기능적 활성, 구조적 안정성, 발현, 특이성 또는 이들의 조합을 유도한다. 일부 경우에, 항체는 단일 도메인 항체이다. 일부 경우에, 단일 도메인 항체는 하나의 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 단일 도메인 항체는 VHH 항체이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 항체는 전형적인 항체 분자의 특징적인 2-아암의 Y-형태를 갖는 단백질 뿐만 아니라, 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 예시적인 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 그래프트 항체, 인간 항체, 인간화 항체, 합성 항체, 키메라 항체, 낙타화 항체, 단일쇄 Fv(scFv)(단일쇄 Fab 및 scFab를 포함하는 1가 분자를 형성하기 위해 VL 및 VH 영역이 쌍을 이루는 단일 단백질 사슬로 만들어질 수 있도록 하는 합성 또는 천연 링커에 의해 재조합 방법을 이용하여 VL 및 VH가 연결된 단편 포함), 단일쇄 항체, Fab 단편(VL, VH, CL, 및 CH1 도메인을 포함하는 1가 단편 포함), F(ab')2 단편(힌지 영역에서 디술파이드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편 포함), Fd 단편(VH 및 CH1 단편을 포함하는 단편 포함), Fv 단편(항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인을 포함하는 단편 포함), 단일 도메인 항체(dAb 또는 sdAb)(VH 도메인을 포함하는 단편 포함), 단리된 상보성 결정 영역(CDR), 디아바디(서로 결합되고 2개의 상이한 항원을 인식하는 2개의 VL 및 VH 도메인과 같은 2가 이량체를 포함하는 단편 포함), 단일 단량체 가변 도메인으로만 이루어진 단편, 디술파이드 연결된 Fv(sdFv), 인트라바디, 항-이디오타입(항-Id) 항체, 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 본원에서 개시되는 라이브러리는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 함유하는 최소 항체 단편으로 이루어진 Fv 항체를 포함하는 Fv 항체인 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fv 항체는 긴밀한 비-공유 회합의 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄 가변 도메인의 이량체로 이루어지고, 각각의 가변 도메인의 3개의 초가변 영역은 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면 상의 항원 결합 부위를 한정한다. 일부 실시양태에서, 6개의 초가변 영역은 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 단일 가변 도메인(또는 VHH 항체 또는 나노바디와 같은 하나의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 낙타류 동물로부터 단리된 단일 도메인 항체를 포함하는, 항원에 특이적인 3개의 초가변 영역만을 포함하는 Fv의 절반)은 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다. 일부 경우에, 본원에서 개시되는 라이브러리는, 항체가 VH, VL, 또는 VH와 VL 도메인 둘 모두를 포함하는 항체 단편을 포함하는 단일쇄 Fv 또는 scFv이고, 두 도메인 모두가 단일 폴리펩타이드 사슬에 존재하는, 항체를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, Fv 폴리펩타이드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성하도록 VH와 도메인과 VL 도메인 사이에 폴리펩타이드 링커를 추가로 포함한다. 일부 경우에, scFv는 Fc 단편에 연결되거나 또는 VHH는 Fc 단편(미니바디 포함)에 연결된다. 일부 경우에, 항체는 면역글로불린 분자 및 면역글로불린 분자의 면역학적 활성 단편, 예를 들어 항원 결합 부위를 함유하는 분자를 포함한다. 면역글로불린 분자는 임의의 유형(예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예를 들어, IgG 1, IgG 2, IgG 3, IgG 4, IgA 1 및 IgA 2) 또는 서브클래스이다.
일부 실시양태에서, 라이브러리는 의도하는 치료 표적의 종에 적응된 면역글로불린을 포함한다. 일반적으로, 이들 방법은 "포유류화"를 포함하고, 유용한 치료적 처리를 생성하기 위해 면역원성이 더 낮은 포유동물 항체 수용자(acceptor)에 공여자 항원 결합 정보를 전달하기 위한 방법을 포함한다. 일부 경우에, 포유동물은 마우스, 래트, 말, 양, 소, 영장류(예를 들어, 침팬지, 개코원숭이, 고릴라, 오랑우탄, 원숭이), 개, 고양이, 돼지, 당나귀, 토끼 및 인간이다. 일부 경우에, 항체의 고양이화(felinization) 및 개화(caninization)를 위한 라이브러리 및 방법이 본원에서 제공된다.
비-인간 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체일 수 있다. 인간화 항체는 일반적으로 하나 이상의 CDR로부터의 잔기가 비-인간 항체(공여자 항체)의 하나 이상의 CDR로부터의 잔기로 대체된 인간 항체(수여자 항체)이다. 공여자 항체는 원하는 특이성, 친화도, 또는 생물학적 효과를 갖는 마우스, 래트, 토끼, 닭, 또는 비-인간 영장류 항체와 같은 임의의 적합한 비-인간 항체일 수 있다. 일부 경우에, 수여자 항체의 선택된 프레임워크 영역 잔기는 공여자 항체로부터의 상응하는 프레임워크 영역 잔기로 대체된다. 인간화 항체는 또한 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 이루어진다.
"개화"는 개에서 치료제로서 유용한 처치를 생성하기 위해 공여자 항체로부터의 비-개 항원 결합 정보를 면역원성이 더 낮은 개 항체 수용자로 전달하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 제공되는 비-개 항체의 개화 형태는 비-개 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 경우에, 개화 항체는 수여자의 초가변 영역 잔기가 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 닭, 소, 말, 라마, 낙타, 단봉낙타, 상어, 비-인간 영장류, 인간, 인간화, 재조합 서열, 또는 원하는 특성을 갖는 조작된 서열과 같은 비-개 종("공여자" 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 대체된 개 항체 서열("수용자" 또는 "수여자" 항체)이다. 일부 경우에, 개 항체의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-개 FR 잔기로 대체된다. 일부 경우에, 개화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 개화 항체는 또한 개 항체의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
"고양이화"는 고양이에서 치료제로서 유용한 처치를 생성하기 위해 공여자 항체로부터의 비-고양이 항원 결합 정보를 면역원성이 더 낮은 고양이 항체 수용자로 전달하는 방법을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 본원에서 제공되는 비-고양이 항체의 고양이화 형태는 비-고양이 항체로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 일부 경우에, 고양이화 항체는 수용자의 초가변 영역 잔기가 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 염소, 닭, 소, 말, 라마, 낙타, 단봉낙타, 상어, 비-인간 영장류, 인간, 인간화, 재조합 서열, 또는 원하는 특성을 갖는 조작된 서열와 같은 비-고양이 종("공여자" 항체)으로부터의 초가변 영역 잔기로 대체된 고양이 항체 서열("수용자" 또는 "수여자" 항체)이다. 일부 경우에, 고양이 항체의 프레임워크 영역(FR) 잔기는 상응하는 비-고양이 FR 잔기로 대체된다. 일부 경우에, 고양이화 항체는 수여자 항체 또는 공여자 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함한다. 일부 경우에, 이들 변형은 항체 성능을 추가로 개선하기 위해 수행된다. 고양이화 항체는 또한 고양이화 항체의 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 적어도 일부를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 방법은 비-면역글로불린을 코딩하는 라이브러리의 생성에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 라이브러리는 항체 모방체를 포함한다. 예시적인 항체 모방체는 안티칼린, 아필린, 아피바디 분자, 아피머, 아피틴, 알파바디, 아비머, 아트리머, DARPin, 피노머, 쿠니츠(Kunitz) 도메인 기반 단백질, 모노바디, 안티칼린, 노틴, 아르마딜로 반복 단백질 기반 단백질, 및 비사이클릭 펩타이드를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
항체를 코딩하는 핵산을 포함하는, 본 명세서에서 설명되는 라이브러리는 항체의 적어도 하나의 영역에 변이를 포함한다. 변이를 위한 항체의 예시적인 영역은 상보성 결정 영역(CDR), 가변 도메인 또는 불변 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, CDR은 CDR1, CDR2 또는 CDR3이다. 일부 경우에, CDR은 CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3을 포함하지만 이에 제한되지 않는 중쇄 도메인이다. 일부 경우에, CDR은 CDRL1, CDRL2, 및 CDRL3을 포함하지만 이에 제한되지 않는 경쇄 도메인이다. 일부 경우에, 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인(VL) 또는 중쇄 가변 도메인(VH)이다. 일부 경우에, CDR1, CDR2, 또는 CDR3은 경쇄 가변 도메인(VL)의 영역이다. 경쇄 가변 도메인(VL)의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3은 각각 CDRL1, CDRL2 또는 CDRL3으로 지칭될 수 있다. 중쇄의 가변 도메인(VH)의 CDR1, CDR2 또는 CDR3은 각각 CDRH1, CDRH2 또는 CDRH3으로 지칭될 수 있다. 일부 경우에, VL 도메인은 카파 또는 람다 사슬을 포함한다. 일부 경우에, 불변 도메인은 경쇄 불변 도메인(CL) 또는 중쇄 불변 도메인(CH)이다.
항체의 적어도 하나의 영역에 변이를 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 상기 영역은 CDR 영역이다. 일부 경우에, 항체는 VHH 항체와 같은 하나의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 단일 도메인 항체이다. 일부 경우에, VHH 항체는 하나 이상의 CDR 영역에 변이를 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 VHH 라이브러리는 CDR1, CDR2 또는 CDR3의 적어도 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2400, 2600, 2800, 3000개 또는 3000개 초과의 서열을 포함한다. 예를 들어, 라이브러리는 CDR1의 적어도 2000개의 서열, CDR2의 적어도 1200개의 서열, 및 CDR3의 적어도 1600개의 서열을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 서열은 동일하지 않다.
본원에서 설명되는 바와 같은 라이브러리는 번역될 때 아미노산의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, 또는 이들의 조합의 다양한 길이를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 번역될 때 아미노산의 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, 또는 이들의 조합의 길이는 적어도 또는 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개, 또는 30개 초과의 아미노산이다.
본원에서 설명되는 변이체 CDR 서열을 갖는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리는 번역될 때 다양한 길이의 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 아미노산 단편의 길이 또는 합성된 아미노산의 평균 길이는 적어도 또는 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150개, 또는 150개 초과의 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 아미노산의 길이는 약 15 내지 150개, 20 내지 145개, 25 내지 140개, 30 내지 135개, 35 내지 130개, 40 내지 125개, 45 내지 120개, 50 내지 115개, 55 내지 110개, 60 내지 110개, 65 내지 105개, 70 내지 100개, 또는 75 내지 95개 아미노산이다. 일부 경우에, 아미노산의 길이는 약 22개 아미노산 내지 약 75개 아미노산이다. 일부 경우에, 항체는 적어도 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000개, 또는 5000개 초과의 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 VHH 라이브러리이다. 일부 경우에, 라이브러리는 항체 라이브러리이다.
VHH 항체를 코딩하는, 본원에서 설명되는 바와 같은 라이브러리는 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018개 또는 1018개 초과의 서열의 이론적 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하기 위해 셔플링된다. 일부 경우에, 라이브러리는 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018개 또는 1018개 초과의 서열의 최종 라이브러리 다양성을 갖는다.
항체 또는 면역글로불린을 코딩하는, 본원에서 설명되는 바와 같은 라이브러리는 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018개 또는 1018개 초과의 서열의 이론적 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하기 위해 셔플링된다. 일부 경우에, 라이브러리는 적어도 또는 약 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1016, 1017, 1018개 또는 1018개 초과의 서열의 최종 라이브러리 다양성을 갖는다.
본원에서 설명되는 방법은, 각각의 핵산이 적어도 하나의 미리 결정된 참조 핵산 서열의 미리 결정된 변이체를 코딩하는, 항체 또는 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리의 합성을 제공한다. 일부 경우에, 미리 결정된 참조 서열은 단백질을 코딩하는 핵산 서열이고, 변이체 라이브러리는 합성된 핵산에 의해 코딩되는 후속 단백질에서 단일 잔기의 복수의 상이한 변이체가 표준 번역 과정에 의해 생성되도록 적어도 단일 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 항체 라이브러리는 다중 위치에서 변이를 집합적으로 코딩하는 다양한 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, VL, 또는 VH 도메인의 적어도 하나의 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, VL, 또는 VH 도메인의 다중 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 라이브러리는 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3) 또는 프레임워크 요소 4(FW4)의 다중 코돈의 변이를 코딩하는 서열을 포함한다. 변이를 위한 예시적인 코돈의 수는 적어도 또는 약 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 225, 250, 275, 300개, 또는 300개 초과의 코돈을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에, 변이를 위한 항체의 적어도 하나의 영역은 중쇄 V-유전자 패밀리, 중쇄 D-유전자 패밀리, 중쇄 J-유전자 패밀리, 경쇄 V-유전자 패밀리, 또는 경쇄 J-유전자 패밀리로부터의 영역이다. 일부 경우에, 경쇄 V-유전자 패밀리는 면역글로불린 카파(IGK) 유전자 또는 면역글로불린 람다(IGL)를 포함한다.
다양한 수의 단편으로 합성되는, 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 단편은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, VL, 또는 VH 도메인을 포함한다. 일부 경우에, 단편은 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3), 또는 프레임워크 요소 4(FW4)를 포함한다. 일부 경우에, 항체 라이브러리는 적어도 또는 약 2개의 단편, 3개의 단편, 4개의 단편, 5개의 단편, 또는 5개 초과의 단편으로 합성된다. 각각의 핵산 단편의 길이 또는 합성된 핵산의 평균 길이는 적어도 또는 약 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600개, 또는 600개 초과의 염기쌍일 수 있다. 일부 경우에, 길이는 약 50 내지 600개, 75 내지 575개, 100 내지 550개, 125 내지 525개, 150 내지 500개, 175 내지 475개, 200 내지 450개, 225 내지 425개, 250 내지 400개, 275 내지 375개, 또는 300 내지 350개 염기쌍이다.
본원에서 설명되는 항체 또는 면역글로불린을 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리는 번역될 때 다양한 길이의 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 각각의 아미노산 단편의 길이 또는 합성된 아미노산의 평균 길이는 적어도 또는 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150개, 또는 150개 초과의 아미노산일 수 있다. 일부 경우에, 아미노산의 길이는 약 15 내지 150개, 20 내지 145개, 25 내지 140개, 30 내지 135개, 35 내지 130개, 40 내지 125개, 45 내지 120개, 50 내지 115개, 55 내지 110개, 60 내지 110개, 65 내지 105개, 70 내지 100개, 또는 75 내지 95개 아미노산이다. 일부 경우에, 아미노산의 길이는 약 22개 아미노산 내지 약 75개 아미노산이다. 일부 경우에, 항체는 적어도 또는 약 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000개, 또는 5000개 초과의 아미노산을 포함한다.
변이를 위한 항체의 적어도 하나의 영역에 대한 다수의 변이체 서열은 본원에서 설명되는 방법을 이용하여 드 노보(de novo) 합성된다. 일부 경우에, 다수의 변이체 서열은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, VL, VH, 또는 이들의 조합에 대해 드 노보 합성된다. 일부 경우에, 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3), 또는 프레임워크 요소 4(FW4)에 대해 다수의 변이체 서열이 드 노보 합성된다. 변이체 서열의 수는 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개, 또는 500개 초과의 서열일 수 있다. 일부 경우에, 변이체 서열의 수는 적어도 또는 약 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000개, 또는 8000개 초과의 서열이다. 일부 경우에, 변이체 서열의 수는 약 10 내지 500개, 25 내지 475개, 50 내지 450개, 75 내지 425개, 100 내지 400개, 125 내지 375개, 150 내지 350개, 175 내지 325개, 200 내지 300개, 225 내지 375개, 250 내지 350개, 또는 275 내지 325개의 서열이다.
항체의 적어도 하나의 영역에 대한 변이체 서열은 일부 경우에서 길이 또는 서열이 다양하다. 일부 경우에, 드 노보 합성되는 적어도 하나의 영역은 CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2, CDRL3, VL, VH, 또는 이들의 조합에 대한 것이다. 일부 경우에, 드 노보 합성되는 적어도 하나의 영역은 프레임워크 요소 1(FW1), 프레임워크 요소 2(FW2), 프레임워크 요소 3(FW3), 또는 프레임워크 요소 4(FW4)에 대한 것이다. 일부 경우에, 변이체 서열은 야생형과 비교하여 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50개, 또는 50개 초과의 변이체 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 서열은 야생형과 비교하여 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개의 추가의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 변이체 서열은 야생형과 비교하여 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50개 더 적은 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 포함한다. 일부 경우에, 라이브러리는 적어도 또는 약 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010개, 또는 1010개 초과의 변이체를 포함한다.
항체 라이브러리를 합성한 후, 항체 라이브러리를 스크리닝 및 분석에 사용할 수 있다. 예를 들어, 항체 라이브러리는 라이브러리 디스플레이 가능성 및 패닝에 대해 검정된다. 일부 경우에, 디스플레이 가능성은 선택 가능한 태그를 사용하여 검정된다. 예시적인 태그는 방사성 표지, 형광 표지, 효소, 화학발광 태그, 비색 태그, 친화성 태그 또는 관련 기술 분야에 공지된 다른 표지 또는 태그를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 태그는 히스티딘, 폴리히스티딘, myc, 헤마글루티닌(HA) 또는 FLAG이다. 예를 들어, 도 2b에 도시된 바와 같이, 일부 경우에, 항체 라이브러리는 단일 분자 실시간(SMRT) 시퀀싱, 폴로니(Polony) 시퀀싱, 라이게이션에 의한 시퀀싱, 가역적 종결자 시퀀싱, 양성자 검출 시퀀싱, 이온 반도체 시퀀싱, 나노포어 시퀀싱, 전자 시퀀싱, 피로시퀀싱, 막삼-길버트(Maxam-Gilbert) 시퀀싱, 사슬 종결(예를 들어, 생거(Sanger)) 시퀀싱, +S 시퀀싱, 또는 합성에 의한 시퀀싱을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 방법을 이용하여 시퀀싱함으로써 검정된다. 일부 경우에, 항체 라이브러리는 세포 또는 파지의 표면에 디스플레이된다. 일부 경우에, 항체 라이브러리는 파지 디스플레이를 이용하여 원하는 활성을 갖는 서열에 대해 농축된다.
일부 경우에, 항체 라이브러리는 기능적 활성, 구조적 안정성(예를 들어, 열적 안정성 또는 pH 안정성), 발현, 특이성, 또는 이들의 조합에 대해 검정된다. 일부 경우에, 항체 라이브러리는 접힐 수 있는 항체에 대해 검정된다. 일부 경우에, 항체의 영역은 기능적 활성, 구조적 안정성, 발현, 특이성, 접힘 또는 이들의 조합에 대해 검정된다. 예를 들어, VH 영역 또는 VL 영역은 기능적 활성, 구조적 안정성, 발현, 특이성, 접힘, 또는 이들의 조합에 대해 검정된다.
본원에서 설명되는 방법에 의해 생성된 항체 또는 IgG는 개선된 결합 친화도를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 1 nM 미만, 1.2 nM 미만, 2 nM 미만, 5 nM 미만, 10 nM 미만, 11 nm 미만, 13.5 nM 미만, 15 nM 미만, 20 nM 미만, 25 nM 미만, 또는 30 nM 미만의 결합 친화도(예를 들어, KD)를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 400 nM 미만, 350 nM 미만, 300 nM 미만, 250 nM 미만, 200 nM 미만, 150 nm 미만, 100 nM 미만, 50 nM 미만, 25 nM 미만, 15 nM 미만, 또는 10 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 1 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 1.2 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 2 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 5 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 10 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 13.5 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 15 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 20 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 25 nM 미만의 KD를 포함한다. 일부 경우에, 항체는 30 nM 미만의 KD를 포함한다.
일부 경우에, 본원에서 설명되는 바와 같은 방법에 의해 생성된 항체 또는 IgG의 친화도는 비교 항체와 비교하여 적어도 또는 약 1.5배, 2.0배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 또는 200배 초과의 개선된 결합 친화도이다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 바와 같은 방법에 의해 생성된 항체 또는 IgG의 친화도는 비교 항체와 비교하여 적어도 또는 약 1.5배, 2.0배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배, 100배, 200배, 또는 200배 초과의 개선된 기능이다. 일부 경우에, 비교 항체는 유사한 구조, 서열 또는 항원 표적을 갖는 항체이다.
본 명세서에서 설명되는 방법은 일부 경우에 항체 또는 IgG의 수율을 증가시킬 수 있다. 일부 경우에, 수율은 적어도 또는 약 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80 마이크로그램(ug), 또는 80 ug 초과이다. 일부 경우에, 수율은 약 5 내지 약 80, 약 10 내지 약 75, 약 15 내지 약 60, 약 20 내지 약 50, 또는 약 30 내지 약 40 마이크로그램(ug)의 범위이다.
발현 시스템
결합 도메인을 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리가 본원에서 제공되며, 여기서 라이브러리는 개선된 특이성, 안정성, 발현, 접힘 또는 하류 활성을 갖는다. 일부 경우에, 본 명세서에서 설명되는 라이브러리는 스크리닝 및 분석에 사용된다.
스크리닝 및 분석에 사용되는, 결합 도메인을 포함하는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 스크리닝 및 분석은 시험관내, 생체내 또는 생체외 검정을 포함한다. 스크리닝을 위한 세포는 살아있는 대상체 또는 세포주로부터 채취한 1차 세포를 포함한다. 세포는 원핵생물(예를 들어, 박테리아 및 진균) 또는 진핵생물(예를 들어, 동물 및 식물)로부터 유래된 것일 수 있다. 예시적인 동물 세포는 비제한적으로, 마우스, 토끼, 영장류 및 곤충으로부터의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 스크리닝을 위한 세포는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포주, 인간 배아 신장(HEK) 세포주, 또는 아기 햄스터 신장(BHK) 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않는 세포주를 포함한다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 핵산 라이브러리는 또한 다세포 유기체에 전달될 수 있다. 예시적인 다세포 유기체는 비제한적으로, 식물, 마우스, 토끼, 영장류 및 곤충을 포함한다.
본원에서 설명되는 핵산 라이브러리는 다양한 약리학적 또는 약동학적 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 일부 경우에, 라이브러리는 시험관내 검정, 생체내 검정 또는 생체외 검정을 이용하여 스크리닝된다. 예를 들어, 스크리닝되는 시험관내 약리학적 또는 약동학적 특성은 결합 친화도, 결합 특이성 및 결합 능력을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 스크리닝되는 본원에서 설명되는 라이브러리의 예시적인 생체내 약리학적 또는 약동학적 특성은 치료 효능, 활성, 전임상 독성 특성, 임상 효능 특성, 임상 독성 특성, 면역원성, 효능, 및 임상 안전성 특성을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
벡터에서 발현될 수 있는 핵산 라이브러리가 본원에서 제공된다. 본원에서 개시되는 핵산 라이브러리를 삽입하기 위한 발현 벡터는 진핵생물 또는 원핵생물 발현 벡터를 포함할 수 있다. 예시적인 발현 벡터는 비제한적으로, 포유동물 발현 벡터, 즉 pSF-CMV-NEO-NH2-PPT-3XFLAG, pSF-CMV-NEO-COOH-3XFLAG, pSF-CMV-PURO-NH2-GST-TEV, pSF-OXB20-COOH-TEV-FLAG(R)-6His, pCEP4 pDEST27, pSF-CMV-Ub-KrYFP, pSF-CMV-FMDV-daGFP, pEF1a-mCherry-N1 벡터, pEF1a-tdTomato 벡터, pSF-CMV-FMDV-Hygro, pSF-CMV-PGK-Puro, pMCP-tag(m), 및 pSF-CMV-PURO-NH2-CMYC; 박테리아 발현 벡터, 즉 pSF-OXB20-BetaGal, pSF-OXB20-Fluc, pSF-OXB20, 및 pSF-Tac; 식물 발현 벡터, 즉 pRI 101-ANDNA 및 pCambia2301; 및 효모 발현 벡터, 즉 pTYB21 및 pKLAC2, 및 곤충 벡터, 즉 pAc5.1/V5-His A 및 pDEST8를 포함한다. 일부 경우에, 벡터는 pcDNA3 또는 pcDNA3.1이다.
항체를 포함하는 구축물을 생성하기 위해 벡터에서 발현되는 핵산 라이브러리가 본원에서 설명된다. 일부 경우에, 구축물의 크기는 다양하다. 일부 경우에, 구축물은 적어도 또는 약 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 2000, 2400, 2600, 2800, 3000, 3200, 3400, 3600, 3800, 4000, 4200, 4400, 4600, 4800, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000개, 또는 10000개 초과의 염기를 포함한다. 일부 경우에, 구축물은 약 300 내지 1,000개, 300 내지 2,000개, 300 내지 3,000개, 300 내지 4,000개, 300 내지 5,000개, 300 내지 6,000개, 300 내지 7,000개, 300 내지 8,000개, 300 내지 9,000개, 300 내지 10,000개, 1,000 내지 2,000개, 1,000 내지 3,000개, 1,000 내지 4,000개, 1,000 내지 5,000개, 1,000 내지 6,000개, 1,000 내지 7,000개, 1,000 내지 8,000개, 1,000 내지 9,000개, 1,000 내지 10,000개, 2,000 내지 3,000개, 2,000 내지 4,000개, 2,000 내지 5,000개, 2,000 내지 6,000개, 2,000 내지 7,000개, 2,000 내지 8,000개, 2,000 내지 9,000개, 2,000 내지 10,000개, 3,000 내지 4,000개, 3,000 내지 5,000개, 3,000 내지 6,000개, 3,000 내지 7,000개, 3,000 내지 8,000개, 3,000 내지 9,000개, 3,000 내지 10,000개, 4,000 내지 5,000개, 4,000 내지 6,000개, 4,000 내지 7,000개, 4,000 내지 8,000개, 4,000 내지 9,000개, 4,000 내지 10,000개, 5,000 내지 6,000개, 5,000 내지 7,000개, 5,000 내지 8,000개, 5,000 내지 9,000개, 5,000 내지 10,000개, 6,000 내지 7,000개, 6,000 내지 8,000개, 6,000 내지 9,000개, 6,000 내지 10,000개, 7,000 내지 8,000개, 7,000 내지 9,000개, 7,000 내지 10,000개, 8,000 내지 9,000개, 8,000 내지 10,000개, 또는 9,000 내지 10,000개 범위의 염기를 포함한다.
세포에서 발현되는, 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 라이브러리는 리포터 유전자를 발현하도록 합성된다. 예시적인 리포터 유전자는 아세토하이드록시산 신타제(AHAS), 알칼리성 포스파타제(AP), 베타 갈락토시다제(LacZ), 베타 글루쿠로니다제(GUS), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 녹색 형광 단백질(GFP), 적색 형광 단백질(RFP), 황색 형광 단백질(YFP), 시안 형광 단백질(CFP), 세룰리안 형광 단백질, 시트린 형광 단백질, 주황색 형광 단백질, 체리 형광 단백질, 청록색(turquoise) 형광 단백질, 청색 형광 단백질, 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP), 루시퍼라제(Luc), 노팔린 신타제(NOS), 옥토핀 신타제(OCS), 루시퍼라제 및 이들의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 리포터 유전자의 조절을 결정하는 방법은 관련 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 형광측정법(예를 들어, 형광 분광법, 형광 활성화 세포 분류법(FACS), 형광 현미경법) 및 항생제 내성 측정을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
질환 및 장애
치료 효과를 가질 수 있는 VHH 항체를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 PD-1 결합 라이브러리가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린은 번역될 때 질환 또는 장애를 치료하는 데 사용되는 단백질을 생성한다. 예시적인 질환은 암, 염증성 질환 또는 장애, 대사 질환 또는 장애, 심혈관 질환 또는 장애, 호흡기 질환 또는 장애, 통증, 소화기 질환 또는 장애, 생식 질환 또는 장애, 내분비 질환 또는 장애, 또는 신경계 질환 또는 장애를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 경우에, 암은 고형암 또는 혈액암이다. 일부 경우에, 대상체는 포유류동물이다. 일부 경우에, 대상체는 마우스, 토끼, 개 또는 인간이다. 본 명세서에서 설명되는 방법으로 치료되는 대상체는 유아, 성인 또는 어린이일 수 있다. 본원에서 설명되는 바와 같은 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약제학적 조성물은 정맥 내로 또는 피하 투여될 수 있다.
일부 경우에, 질환 또는 장애는 TIGIT 기능 장애와 관련이 있다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 TIGIT를 통한 비정상적인 신호전달과 관련이 있다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 CD3 기능 장애와 관련이 있다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 CD3를 통한 비정상적인 신호전달과 관련이 있다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 암이다. 일부 경우에, 질환 또는 장애는 바이러스 감염이다.
단백질 표적
다양한 단백질 표적에 대해 설계될 수 있는 VHH 항체를 포함하는 면역글로불린 또는 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 라이브러리가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 단백질은 이온 채널, G 단백질 커플링된 수용체, 티로신 키나제 수용체, 면역 수용체, 막 단백질, 또는 이들의 조합이다. 일부 경우에, 단백질은 수용체이다. 일부 경우에, 단백질은 글루카곤 유사 펩타이드 1(GLP1) 수용체이다. 일부 경우에, 단백질은 프로스타글란딘 D2 수용체 2(DP2 또는 CRTH2) 수용체이다. 일부 경우에, 단백질은 아데노신 A2A 수용체이다. 일부 경우에, 단백질은 Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체(TIGIT)이다. 일부 경우에, 단백질은 분화 클러스터 47(CD47)이다. 일부 경우에, 단백질은 분화 클러스터 3 엡실론(CD3ε)이다.
서열 번호 1-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 항체 또는 면역글로불린이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-151 중 어느 하나의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개, 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 표 1a, 표 14b, 표 17, 및 표 20에 제시된 서열을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 118-137, 또는 152-163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 한 100%의 서열 동일성을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 118-137, 또는 152-163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 상동성을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 118-137, 또는 152-163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 상동성을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 118-137, 또는 152-163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 상동성을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 118-137, 또는 152-163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 상동성을 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 118-137, 또는 152-163 중 어느 하나의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
Figure pct00001
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 118-120, 129-131, 152, 155, 158, 또는 161 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 118-120, 129-131, 152, 155, 158, 또는 161 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 상동성을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 118-120, 129-131, 152, 155, 158, 또는 161 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 상동성을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 118-120, 129-131, 152, 155, 158, 또는 161 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 상동성을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 118-120, 129-131, 152, 155, 158, 또는 161 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 상동성을 포함하는 CDR1을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 118-120, 129-131, 152, 155, 158, 또는 161 중 어느 하나의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDR1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 121-123, 132-134, 153, 156, 159, 또는 162 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 121-123, 132-134, 153, 156, 159, 또는 162 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 상동성을 포함하는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 121-123, 132-134, 153, 156, 159, 또는 162 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 상동성을 포함하는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 121-123, 132-134, 153, 156, 159, 또는 162 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 상동성을 포함하는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 121-123, 132-134, 153, 156, 159, 또는 162 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 상동성을 포함하는 CDR2를 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 121-123, 132-134, 153, 156, 159, 또는 162 중 어느 하나의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDR2를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 124-128, 154, 157, 160, 또는 163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 124-128, 154, 157, 160, 또는 163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 상동성을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 124-128, 154, 157, 160, 또는 163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 상동성을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 124-128, 154, 157, 160, 또는 163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 상동성을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 124-128, 154, 157, 160, 또는 163 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 상동성을 포함하는 CDR3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 46-83, 124-128, 154, 157, 160, 또는 163 중 어느 하나의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDR3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 154 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 154 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 154의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 157에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 157에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 157의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 158에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 158에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 158의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 161에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 161에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 161의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH2; 서열 번호 154에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH3, 서열 번호 158에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 154에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH3; 서열 번호 158에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 154의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH3; 서열 번호 158의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH2; 서열 번호 154에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH3, 서열 번호 161에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 154에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH3; 서열 번호 161에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 152의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH1; 서열 번호 153의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 154의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH3; 서열 번호 161의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH2; 서열 번호 157에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH3, 서열 번호 158에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 157에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH3; 서열 번호 158에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 157의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH3; 서열 번호 158의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL1; 서열 번호 159의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 160의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH2; 서열 번호 157에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRH3, 서열 번호 161에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 157에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRH3; 서열 번호 161에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163에 대해 적어도 또는 약 95%, 97%, 99%, 또는 100%의 상동성을 포함하는 CDRL3을 포함한다. 일부 경우에, 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 155의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH1; 서열 번호 156의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH2; 및 서열 번호 157의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRH3; 서열 번호 161의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL1; 서열 번호 162의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL2; 및 서열 번호 163의 적어도 또는 약 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16개, 또는 16개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 CDRL3을 포함한다.
일부 실시양태에서, CRTH2R에 결합하는 항체 또는 면역글로불린이 본원에서 설명된다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-23 또는 126-148 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-23 또는 126-148 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-23 또는 126-148 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-23 또는 126-148 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-23 또는 126-148 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 1-23 또는 126-148의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 24-45 또는 149-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 24-45 또는 149-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 24-45 또는 149-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 24-45 또는 149-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 24-45 또는 149-151 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CRTH2R 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 24-45 또는 149-151의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
다양한 단백질 표적에 대한 항체 또는 면역글로불린이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 단백질은 TIGIT이다. 일부 실시양태에서, TIGIT에 결합하는 항체 또는 면역글로불린이 본원에서 설명된다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 84-100 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 84-100 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 84-100 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 84-100 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 84-100 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 84-100 중 어느 하나의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 101-117 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 101-117 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 101-117 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 101-117 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 101-117 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, TIGIT 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 101-117 중 어느 하나의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 경우에, 단백질은 CD3 엡실론이다. 일부 실시양태에서, CD3에 결합하는 항체 또는 면역글로불린이 본원에서 설명된다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 138-141 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 138-141 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 138-141 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 138-141 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 138-141 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 138-141 중 어느 하나의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 중쇄 가변 도메인을 포함한다.
일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 142-145 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 142-145 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 95%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 142-145 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 97%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 142-145 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 99%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 142-145 중 어느 하나에 대해 적어도 또는 약 100%의 서열 동일성을 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 일부 경우에, CD3 항체 또는 면역글로불린 서열은 서열 번호 142-145 중 어느 하나의 적어도 또는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400개 또는 400개 초과의 아미노산을 갖는 적어도 일부를 포함하는 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
변이체 라이브러리
코돈 변이
본원에서 설명되는 변이체 핵산 라이브러리는 복수의 핵산을 포함할 수 있으며, 여기서 각각의 핵산은 참조 핵산 서열과 비교하여 변이체 코돈 서열을 코딩한다. 일부 경우에, 제1 핵산 집단의 각각의 핵산은 단일 변이 부위에 변이체를 함유한다. 일부 경우에, 제1 핵산 집단은 단일 변이 부위에 복수의 변이체를 함유하여 제1 핵산 집단이 동일한 변이 부위에 하나 초과의 변이체를 함유하도록 한다. 제1 핵산 집단은 동일한 변이 부위에서 다중 코돈 변이체를 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 제1 핵산 집단은 동일한 위치에서 최대 19개 또는 그 초과의 코돈을 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 제1 핵산 집단은 동일한 위치에서 최대 60개의 변이 삼중자를 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있거나, 제1 핵산 집단은 동일한 위치에서 최대 61개의 상이한 삼중자 코돈을 집합적으로 코딩하는 핵산을 포함할 수 있다. 각각의 변이체는 번역 동안 상이한 아미노산을 생성하는 코돈을 코딩할 수 있다. 표 1b는 변이 부위에 대한 각각의 가능한 코돈(및 대표 아미노산)의 목록을 제공한다.
Figure pct00002
Figure pct00003
핵산 집단은 다중 위치에서 최대 20개의 코돈 변이를 집합적으로 코딩하는 다양한 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 경우에, 집단의 각각의 핵산은 동일한 핵산의 하나 초과의 위치에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 집단 내의 각각의 핵산은 단일 핵산에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 긴 변이체 핵산은 긴 단일 핵산에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 변이체 핵산 집단은 단일 핵산에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다. 일부 경우에, 변이체 핵산 집단은 긴 단일 핵산에서 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 또는 그 초과의 코돈에서 코돈에 대한 변이를 포함한다.
고도의 병렬 핵산 합성
혁신적인 합성 플랫폼을 생성하기 위해 실리콘 상의 나노웰 내에서 폴리뉴클레오타이드 합성으로부터 유전자 조립에 이르기까지 종단간(end-to-end) 공정의 소형화, 병렬화 및 수직 통합을 활용하는 플랫폼 접근법이 본원에서 제공된다. 본원에서 설명되는 장치는 96웰 플레이트와 동일한 풋프린트를 제공하며, 실리콘 합성 플랫폼은 단일 고도 병렬 실행에서 최대 약 1,000,000개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오타이드, 또는 10,000개 또는 그 초과의 유전자를 생산하여, 전통적인 합성 방법에 비해 처리량을 최대 1,000배 또는 그 초과로 증가시킬 수 있다.
차세대 시퀀싱의 도래와 함께, 고분해능 게놈 데이터는 일반 생물학 및 질환 발병 기전 모두에서 다양한 유전자의 생물학적 역할을 탐구하는 연구에 중요한 요소가 되었다. 이 연구의 핵심에는 분자생물학의 센트럴 도그마 및 "잔기별 순차적 정보 전달"의 개념이 있다. DNA에 코딩된 게놈 정보는 메시지로 전사된 다음, 주어진 생물학적 경로 내에서 활성 산물인 단백질로 번역된다.
또 다른 흥미로운 연구 영역은 고도로 특이적인 세포 표적에 초점을 맞춘 치료 분자의 발견, 개발 및 제조이다. 높은 다양성의 DNA 서열 라이브러리는 표적 치료제에 대한 개발 파이프라인의 핵심이다. 유전자 돌연변이체는 그의 치료 표적에 대해 높은 친화도를 갖는 단백질의 높은 발현을 위해 최적화된 유전자가 이상적으로 최고점에 도달하는 설계, 구축, 및 시험 단백질 조작 사이클에서 단백질을 발현하기 위해 사용된다. 일례로서, 수용체의 결합 포켓을 고려한다. 결합 포켓 내 모든 잔기의 모든 서열 순열을 동시에 시험하는 능력은 철저한 탐색을 허용하여 성공 가능성을 높일 것이다. 연구자가 수용체 내의 특정 부위에서 가능한 모든 돌연변이를 생성하려고 시도하는 포화 돌연변이 유발은 이러한 개발 과제에 대한 하나의 접근법을 나타낸다. 이 방법은 비용 및 시간이 들고 노동집약적이지만, 각각의 변이체를 각각의 위치에 도입할 수 있다. 이와 대조적으로, 몇몇 선택된 위치 또는 짧은 DNA 스트레치가 광범위하게 변형될 수 있는 조합 돌연변이 유발은 편향된 표시를 갖는 변이체의 불완전한 레퍼토리를 생성한다.
약물 개발 파이프라인을 가속화하기 위해, 시험에 사용할 수 있는 올바른 위치에서 의도한 빈도로 사용할 수 있는 원하는 변이체를 갖는 라이브러리, 즉 정밀 라이브러리는 스크리닝을 위한 비용 뿐만 아니라 처리 시간을 절감할 수 있다. 원하는 빈도로 각각의 의도된 변이체의 정확한 도입을 제공하는 핵산 합성 변이체 라이브러리를 합성하는 방법이 본원에서 제공된다. 이는 최종 사용자에게 서열 공간을 철저히 샘플링할 수 있을 뿐만 아니라, 이러한 가설을 효율적인 방식으로 질의하여 비용 및 스크리닝 시간을 줄이는 능력으로 해석된다. 게놈 전체 편집은 중요한 경로, 각각의 변이체 및 서열 순열을 최적의 기능에 대해 시험할 수 있는 라이브러리를 밝혀낼 수 있으며, 수천 개의 유전자는 약물 발견을 위한 생물학적 시스템을 재조작하기 위해 전체 경로 및 게놈을 재구축하는 데 사용될 수 있다.
제1 예에서, 약물 자체는 본원에서 설명되는 방법을 이용하여 최적화될 수 있다. 예를 들어, 항체의 특정 기능을 개선하기 위해, 항체의 일부를 코딩하는 변이체 폴리뉴클레오타이드 라이브러리를 설계하고, 합성한다. 이어서, 항체에 대한 변이체 핵산 라이브러리를 본원에서 설명되는 공정(예를 들어, PCR 돌연변이 유발, 및 후속 벡터 내로의 삽입)에 의해 생성할 수 있다. 이어서, 항체를 생산 세포주에서 발현시키고, 향상된 활성에 대해 스크리닝한다. 예시적인 스크리닝은 항원에 대한 결합 친화도, 안정성 또는 이펙터 기능(예를 들어, ADCC, 보체 또는 아폽토시스)의 조절을 조사하는 것을 포함한다. 항체를 최적화하기 위한 예시적인 영역은 비제한적으로, Fc 영역, Fab 영역, Fab 영역의 가변 영역, Fab 영역의 불변 영역, 중쇄 또는 경쇄의 가변 도메인(VH 또는 VL), 및 VH 또는 VL의 특정 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다.
본원에서 설명되는 방법에 의해 합성된 핵산 라이브러리는 질환 상태와 관련된 다양한 세포에서 발현될 수 있다. 질환 상태와 관련된 세포는 세포주, 조직 샘플, 대상체로부터의 1차 세포, 대상체로부터 확장된 배양 세포, 또는 모델 시스템의 세포를 포함한다. 예시적인 모델 시스템은 비제한적으로, 질환 상태의 식물 및 동물 모델을 포함한다.
질환 상태의 예방, 감소 또는 치료와 관련된 변이체 분자를 확인하기 위해, 본원에서 설명되는 변이체 핵산 라이브러리는 질환 상태와 관련된 세포, 또는 질환 상태가 유도될 수 있는 세포에서 발현된다. 일부 경우에, 작용제가 세포에서 질환 상태를 유도하기 위해 사용된다. 질환 상태 유도를 위한 예시적인 도구는 비제한적으로, Cre/Lox 재조합 시스템, LPS 염증 유도, 및 저혈당을 유도하기 위한 스트렙토조토신을 포함한다. 질환 상태와 관련된 세포는 모델 시스템로부터의 세포 또는 배양된 세포뿐만 아니라, 특정 질환 상태를 갖는 대상체의 세포일 수 있다. 예시적인 질환 상태는 박테리아, 진균, 바이러스, 자가면역, 또는 증식성 장애(예를 들어, 암)를 포함한다. 일부 경우에, 변이체 핵산 라이브러리는 모델 시스템, 세포주, 또는 대상체로부터 유래된 1차 세포에서 발현되고, 적어도 하나의 세포 활성의 변화에 대해 스크리닝된다. 예시적인 세포 활성은 비제한적으로, 증식, 주기 진행, 세포 사멸, 부착, 이동, 생식, 세포 신호전달, 에너지 생산, 산소 활용, 대사 활성, 및 노화, 유리 라디칼 손상에 대한 반응, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
기재
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 표면으로 사용되는 장치는 균질한 어레이 표면, 패턴화된 어레이 표면, 채널, 비드, 겔 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 기재의 형태일 수 있다. 각각의 클러스터가 폴리뉴클레오타이드의 부착 및 합성을 지지하는 복수의 좌위를 포함하는, 복수의 클러스터를 포함하는 기재가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 기재는 균질한 어레이 표면을 포함한다. 예를 들어, 균질한 어레이 표면은 균질한 플레이트이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "좌위"는 표면으로부터 연장되는 미리 결정된 단일 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 지지체를 제공하는 구조 상의 별개의 영역을 지칭한다. 일부 경우에, 좌위는 2차원 표면, 예를 들어 실질적으로 평평한 표면에 있다. 일부 경우에, 좌위는 3차원 표면, 예를 들어 웰, 마이크로웰, 채널 또는 포스트(post)에 있다. 일부 경우에, 좌위의 표면은 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 적어도 하나의 뉴클레오타이드, 또는 바람직하게는 폴리뉴클레오타이드 집단의 합성을 위한 동일한 뉴클레오타이드 집단에 부착하도록 활성적으로 작용화된 물질을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 동일한 핵산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드 집단을 지칭한다. 일부 경우에, 기재의 표면은 기재의 하나 또는 복수의 표면을 포함한다. 제공된 시스템 및 방법을 이용하여 본원에서 설명되는 라이브러리 내에서 합성된 폴리뉴클레오타이드에 대한 평균 오류율은 종종 오류 수정 없이 1/1000 미만, 약 1/2000 미만, 약 1/3000 미만 또는 그 미만이다.
공통 지지체 상의 주소 지정 가능한 위치에 상이한 미리 결정된 서열을 갖는 복수의 폴리뉴클레오타이드의 병렬 합성을 지지하는 표면이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 기재는 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2,000; 5,000; 10,000; 20,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000개 초과 또는 이보다 많은 동일하지 않은 폴리뉴클레오타이드의 합성에 대한 지지를 제공한다. 일부 경우에, 표면은 별개의 서열을 코딩하는 50, 100, 200, 400, 600, 800, 1000, 1200, 1400, 1600, 1800, 2,000; 5,000; 10,000; 20,000; 50,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 10,000,000개 초과 또는 이보다 많은 폴리뉴클레오타이드의 합성에 대한 지지를 제공한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드의 적어도 일부는 동일한 서열을 갖거나 동일한 서열로 합성되도록 구성된다. 일부 경우에, 기재는 적어도 80, 90, 100, 120, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500개 또는 그 초과의 염기를 갖는 폴리뉴클레오타이드의 성장을 위한 표면 환경을 제공한다.
각각의 좌위가 폴리뉴클레오타이드 집단의 합성을 지지하는, 기재의 별개의 좌위에서 폴리뉴클레오타이드를 합성하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 각각의 좌위는 또 다른 좌위에서 성장된 폴리뉴클레오타이드 집단과는 상이한 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 집단의 합성을 지지한다. 일부 경우에, 각각의 폴리뉴클레오타이드 서열은 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 표면 상의 동일한 좌위 클러스터 내의 상이한 좌위에 걸쳐 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9개 또는 그 초과의 중복성을 갖도록 합성된다. 일부 경우에, 기재의 좌위는 복수의 클러스터 내에 위치된다. 일부 경우에, 기재는 적어도 10, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 11000, 12000, 13000, 14000, 15000, 20000, 30000, 40000, 50000개 초과 또는 이보다 많은 클러스터를 포함한다. 일부 경우에, 기재는 2,000; 5,000; 10,000; 100,000; 200,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,100,000; 1,200,000; 1,300,000; 1,400,000; 1,500,000; 1,600,000; 1,700,000; 1,800,000; 1,900,000; 2,000,000; 300,000; 400,000; 500,000; 600,000; 700,000; 800,000; 900,000; 1,000,000; 1,200,000; 1,400,000; 1,600,000; 1,800,000; 2,000,000; 2,500,000; 3,000,000; 3,500,000; 4,000,000; 4,500,000; 5,000,000; 또는 10,000,000개 초과 또는 이보다 많은 별개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에, 기재는 약 10,000개의 별개의 좌위를 포함한다. 단일 클러스터 내의 좌위의 양은 경우마다 다르다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 150, 200, 300, 400, 500개 또는 그 초과의 좌위를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 50-500개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 100-200개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 100-150개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 109, 121, 130 또는 137개의 좌위를 포함한다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 19, 20, 61, 64개 또는 그 초과의 좌위를 포함한다. 대안적으로 또는 조합하여, 폴리뉴클레오타이드 합성은 균질한 어레이 표면에서 일어난다.
일부 경우에, 기재 상에서 합성된 별개의 폴리뉴클레오타이드의 수는 기재에서 이용가능한 별개의 좌위의 수에 의존한다. 일부 경우에, 기재의 클러스터 또는 표면 내의 좌위의 밀도는 mm2당 적어도 또는 약 1, 10, 25, 50, 65, 75, 100, 130, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 1,000개 또는 그 초과의 좌위이다. 일부 경우에, 기재는 10-500, 25-400, 50-500, 100-500, 150-500, 10-250, 50-250, 10-200, 또는 50-200 mm2를 포함한다. 일부 경우에, 클러스터 또는 표면 내의 2개의 인접한 좌위의 중심 사이의 거리는 약 10-500, 약 10-200, 또는 약 10-100 um이다. 일부 경우에, 인접한 좌위의 2개의 중심 사이의 거리는 약 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 um 초과이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 좌위의 중심 사이의 거리는 약 200, 150, 100, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 um 미만이다. 일부 경우에, 각각의 좌위는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100 um의 폭을 갖는다. 일부 경우에, 각각의 좌위는 약 0.5-100, 0.5-50, 10-75, 또는 0.5-50 um의 폭을 갖는다.
일부 경우에, 기재 내의 클러스터 밀도는 적어도 또는 약 1개 클러스터/100 mm2, 1개 클러스터/10 mm2, 1개 클러스터/5 mm2, 1개 클러스터/4 mm2, 1개 클러스터/3 mm2, 1개 클러스터/2 mm2, 1개 클러스터/1 mm2, 2개 클러스터/1 mm2, 3개 클러스터/1 mm2, 4개 클러스터/1 mm2, 5개 클러스터/1 mm2, 10개 클러스터/1 mm2, 50개 클러스터/1 mm2, 또는 그 초과이다. 일부 경우에, 기재는 약 1개 클러스터/10 mm2 내지 약 10개 클러스터/1 mm2를 포함한다. 일부 경우에, 2개의 인접한 클러스터의 중심 사이의 거리는 적어도 또는 약 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 또는 5000 um이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 클러스터의 중심 사이의 거리는 약 50-100, 50-200, 50-300, 50-500, 및 100-2000 um이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 클러스터의 중심 사이의 거리는 약 0.05-50, 0.05-10, 0.05-5, 0.05-4, 0.05-3, 0.05-2, 0.1-10, 0.2-10, 0.3-10, 0.4-10, 0.5-10, 0.5-5, 또는 0.5-2 mm이다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 0.5 내지 약 2, 약 0.5 내지 약 1, 또는 약 1 내지 약 2 mm의 단면을 갖는다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 mm의 단면을 갖는다. 일부 경우에, 각각의 클러스터는 약 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.1, 1.15, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9 또는 2 mm의 내부 단면을 갖는다.
일부 경우에, 기재는 약 표준 96웰 플레이트의 크기, 예를 들어 약 100 내지 약 200 mm x 약 50 내지 약 150 mm이다. 일부 경우에, 기재는 약 1000, 500, 450, 400, 300, 250, 200, 150, 100 또는 50 mm 이하의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 기재의 직경은 약 25-1000, 25-800, 25-600, 25-500, 25-400, 25-300, 또는 25-200 mm이다. 일부 경우에, 기재는 적어도 약 100; 200; 500; 1,000; 2,000; 5,000; 10,000; 12,000; 15,000; 20,000; 30,000; 40,000; 50,000 mm2 또는 그 초과의 평평한 표면적을 갖는다. 일부 경우에, 기재의 두께는 약 50-2000, 50-1000, 100-1000, 200-1000, 또는 250-1000 mm이다.
표면 물질
본원에서 제공되는 기재, 장치 및 반응기는 본원에서 설명되는 방법, 조성물 및 시스템에 적합한 임의의 다양한 물질로 제작된다. 특정 예에서, 기재 물질은 낮은 수준의 뉴클레오타이드 결합을 나타내도록 제작된다. 일부 경우에, 기재 물질은 높은 수준의 뉴클레오타이드 결합을 나타내는 별개의 표면을 생성하도록 변형된다. 일부 경우에, 기재 물질은 가시광 및/또는 UV광 투과성이다. 일부 경우에, 기재 물질은 충분히 전도성이며, 예를 들어 기재의 전체 또는 일부에 걸쳐 균일한 전기장을 형성할 수 있다. 일부 경우에, 전도성 물질은 전기 접지에 연결된다. 일부 경우에, 기재는 열 전도성이거나 절연된다. 일부 경우에, 물질은 화학적 또는 생화학적 반응, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 합성 반응 공정을 지지하기 위해 내화학성 및 내열성이다. 일부 경우에, 기재는 가요성 물질을 포함한다. 가요성 물질의 경우, 물질은 비제한적으로, 변형 및 비변형된 나일론, 니트로셀룰로스, 폴리프로필렌 등을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 기재는 단단한 물질을 포함한다. 단단한 물질의 경우, 물질은 비제한적으로, 유리; 퓨즈 실리카; 실리콘, 플라스틱(예를 들어, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리카르보네이트, 및 이들의 블렌드 등); 금속(예를 들어, 금, 백금 등)을 포함할 수 있다. 기재, 고체 지지체 또는 반응기는 실리콘, 폴리스티렌, 아가로스, 덱스트란, 셀룰로스 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리디메틸실록산(PDMS) 및 유리로 이루어진 군으로부터 선택되는 물질로부터 제작될 수 있다. 기재/고체 지지체 또는 그 안의 미세구조, 반응기는 본원에서 제시되는 물질 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 적합한 물질의 조합으로 제조될 수 있다.
표면 아키텍쳐
본원에서 설명되는 방법, 조성물 및 시스템에 적합한 표면 아키텍쳐를 갖는, 본원에서 설명되는 방법, 조성물 및 시스템을 위한 기재가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 기재는 상승 및/또는 하강 특징부(feature)를 포함한다. 이러한 특징부를 갖는 것의 한 가지 이점은 폴리뉴클레오타이드 합성을 지지하는 표면적의 증가이다. 일부 경우에, 상승 및/또는 하강 특징부를 갖는 기재는 3차원 기재로 지칭된다. 일부 경우에, 3차원 기재는 하나 이상의 채널을 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 좌위는 채널을 포함한다. 일부 경우에, 채널은 물질 침착 장치와 같은 침착 장치를 통해 시약 침착에 이용될 수 있다. 일부 경우에, 시약 및/또는 유체는 하나 이상의 채널과 유체 소통하여 더 큰 웰에 수집된다. 예를 들어, 기재는 클러스터가 있는 복수의 좌위에 상응하는 복수의 채널을 포함하고, 복수의 채널은 클러스터의 하나의 웰과 유체 소통한다. 일부 방법에서, 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리는 클러스터의 복수의 좌위에서 합성된다.
폴리뉴클레오타이드 합성을 위해 구성된, 본원에서 설명되는 방법, 조성물 및 시스템을 위한 기재가 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 구조는 표면에서 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 제어된 유동 및 물질 전달 경로를 허용하도록 구성된다. 일부 경우에, 기재의 구성은 폴리뉴클레오타이드의 합성 동안 물질 전달 경로, 화학적 노출 시간, 및/또는 세척 효능의 제어되고 균일한 분포를 가능하게 한다. 일부 경우에, 기재의 구성은 예를 들어 성장하는 폴리뉴클레오타이드에 의한 배제된 부피가 폴리뉴클레오타이드 성장에 사용 가능하거나 적합한 초기 사용 가능 부피의 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1%, 또는 그 미만을 초과하여 차지하지 않도록 성장하는 폴리뉴클레오타이드에 충분한 부피를 제공함으로써 증가된 스윕(sweep) 효율을 가능하게 한다. 일부 경우에, 3차원 구조는 관리된 유체 유동을 가능하게 하여, 화학 물질 노출의 신속한 교환을 허용한다.
본원에서 설명되는 방법, 조성물 및 시스템에 적합한 구조를 포함하는, 본원에서 설명되는 방법, 조성물 및 시스템을 위한 기재가 본원에 제공된다. 일부 경우에, 격리는 물리적 구조에 의해 달성된다. 일부 경우에, 격리는 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 능동 및 수동 영역을 생성하는 표면의 차별적 작용화에 의해 달성된다. 일부 경우에, 차별적 작용화는 기재 표면에 걸쳐 소수성을 교대로 배치함으로써 달성되며, 이에 의해 침착된 시약의 비딩(beading) 또는 습윤(wetting)을 야기하는 물 접촉각 효과를 생성한다. 더 큰 구조를 사용하면, 인접한 지점의 시약이 튀고 별개의 폴리뉴클레오타이드 합성 위치가 교차 오염되는 것을 줄일 수 있다. 일부 경우에, 물질 침착 장치와 같은 장치를 사용하여 시약을 별개의 폴리뉴클레오타이드 합성 위치에 침착시킨다. 3차원 특징부를 갖는 기재는 낮은 오류율(예를 들어, 약 1:500, 1:1000, 1:1500, 1:2,000, 1:3,000, 1:5,000, 또는 1:10,000 미만)로 다수의 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 약 10,000개 초과)의 합성을 허용하는 방식으로 구성된다. 일부 경우에, 기재는 약 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 300, 400 또는 500개 또는 약 상기 개수 초과의 특징부/mm2의 밀도를 갖는 특징부를 포함한다.
기재의 웰은 기재의 또 다른 웰과 동일하거나 상이한 폭, 높이, 및/또는 부피를 가질 수 있다. 기재의 채널은 기재의 또 다른 채널과 동일하거나 상이한 폭, 높이 및/또는 부피를 가질 수 있다. 일부 경우에, 클러스터의 직경 또는 클러스터를 포함하는 웰의 직경, 또는 둘 모두는 약 0.05-50, 0.05-10, 0.05-5, 0.05-4, 0.05-3, 0.05-2, 0.05-1, 0.05-0.5, 0.05-0.1, 0.1-10, 0.2-10, 0.3-10, 0.4-10, 0.5-10, 0.5-5, 또는 0.5-2 mm이다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 5, 4, 3, 2, 1, 0.5, 0.1, 0.09, 0.08, 0.07, 0.06, 또는 0.05 mm 미만이다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 1.0 내지 1.3 mm이다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 1.150 mm이다. 일부 경우에, 클러스터 또는 웰 또는 둘 모두의 직경은 약 0.08 mm이다. 클러스터의 직경은 2차원 또는 3차원 기재 내의 클러스터를 지칭한다.
일부 경우에, 웰의 높이는 약 20-1000, 50-1000, 100-1000, 200-1000, 300-1000, 400-1000, 또는 500-1000 um이다. 일부 경우에, 웰의 높이는 약 1000, 900, 800, 700, 또는 600 um 미만이다.
일부 경우에, 기재는 클러스터 내의 복수의 좌위에 상응하는 복수의 채널을 포함하며, 채널의 높이 또는 깊이는 5-500, 5-400, 5-300, 5-200, 5-100, 5-50, 또는 10-50 um이다. 일부 경우에, 채널의 높이는 100, 80, 60, 40, 또는 20 um 미만이다.
일부 경우에, 채널, 좌위(예를 들어, 실질적으로 평평한 기재에서) 또는 채널과 좌위 둘 모두(예를 들어, 좌위가 채널에 상응하는 3차원 기재에서)의 직경은 약 1-1000, 1-500, 1-200, 1-100, 5-100, 또는 10-100 um, 예를 들어 약 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 um이다. 일부 경우에, 채널, 좌위, 또는 채널과 좌위 둘 모두의 직경은 약 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 또는 10 um 미만이다. 일부 경우에, 2개의 인접한 채널, 좌위 또는 채널 및 좌위의 중심 사이의 거리는 약 1-500, 1-200, 1-100, 5-200, 5-100, 5-50, 또는 5-30, 예를 들어 약 20 um이다.
표면 변형
다양한 표면 변형을 포함하는 표면에서의 폴리뉴클레오타이드 합성 방법이 본원에서 제공된다. 일부 경우에, 표면 변형은 기재 표면 또는 기재의 선택된 부위 또는 영역의 하나 이상의 화학적 및/또는 물리적 특성을 변경하기 위해 추가 또는 공제 공정에 의한 표면의 화학적 및/또는 물리적 변경에 사용된다. 예를 들어, 표면 변형은 (1) 표면의 습윤 특성 변경, (2) 표면 작용화, 즉, 표면 작용기 제공, 변형 또는 치환, (3) 표면 탈작용화, 즉 표면 작용기의 제거, (4) 예를 들어 에칭을 통한 표면의 화학적 조성의 변경, (5) 표면 거칠기의 증가 또는 감소, (6) 표면에 대한 코팅, 예를 들어 표면의 습윤 특성과는 상이한 습윤 특성을 나타내는 코팅의 제공, 및/또는 (7) 표면에 대한 미립자의 침착을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
일부 경우에, 표면의 상부에 화학층(접착 촉진제로 지칭됨)의 추가는 기재 표면 상의 좌위의 구조화된 패턴화를 용이하게 한다. 접착 촉진의 적용을 위한 예시적인 표면은 비제한적으로, 유리, 실리콘, 이산화규소 및 질화규소를 포함한다. 일부 경우에, 접착 촉진제는 표면 에너지가 높은 화학 물질이다. 일부 경우에, 제2 화학층이 기재의 표면에 침착된다. 일부 경우에, 제2 화학층은 표면 에너지가 낮다. 일부 경우에, 표면에 코팅된 화학층의 표면 에너지는 표면에 액적의 국소화를 지지한다. 선택한 패턴화 배열에 따라, 좌위의 근접성 및/또는 좌위에서 유체 접촉 영역이 변경될 수 있다.
일부 경우에, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 합성을 위해 핵산 또는 다른 모이어티가 침착된 기재 표면 또는 분해된(resolved) 좌위는 평탄하거나 실질적으로 평면이거나(예를 들어, 2차원), 불규칙성, 예를 들어 상승 또는 하강 특징부(예를 들어, 3차원 특징부)를 갖는다. 일부 경우에, 기재 표면은 하나 이상의 상이한 화합물 층으로 변형된다. 이러한 관심 변형층은 비제한적으로, 금속, 금속 산화물, 중합체, 작은 유기 분자 등과 같은 무기 및 유기 층을 포함한다.
일부 경우에, 기재의 분해된 좌위는 표면 에너지를 증가 및/또는 감소시키는 하나 이상의 모이어티로 작용화된다. 일부 경우에, 모이어티는 화학적으로 불활성이다. 일부 경우에, 모이어티는 원하는 화학 반응, 예를 들어 폴리뉴클레오타이드 합성 반응에서 하나 이상의 공정을 지지하도록 구성된다. 표면의 표면 에너지 또는 소수성은 표면에 부착되는 뉴클레오타이드의 친화도를 결정하는 요인이다. 일부 경우에, 기재 작용화를 위한 방법은 (a) 이산화규소를 포함하는 표면을 갖는 기재를 제공하는 단계; 및 (b) 본원에서 설명되거나 관련 기술 분야에 공지된 적합한 실란화제, 예를 들어 유기작용성 알콕시실란 분자를 사용하여 표면을 실란화하는 단계를 포함한다. 방법 및 작용화제는 미국 특허 제5474796호(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 기재되어 있다.
일부 경우에, 기재 표면은 전형적으로 기재 표면에 존재하는 반응적 친수성 모이어티를 통해 기재 표면에 실란을 커플링하기에 효과적인 반응 조건 하에 실란의 혼합물을 함유하는 유도체화 조성물과의 접촉에 의해 작용화된다. 실란화는 일반적으로 유기작용성 알콕시실란 분자와의 자가 조립을 통해 표면을 덮는다. 다양한 실록산 작용화 시약이, 예를 들어 표면 에너지를 낮추거나 증가시키기 위해 현재 관련 기술 분야에 알려진 바와 같이 추가로 사용될 수 있다. 유기작용성 알콕시실란은 그의 유기적 기능에 따라 분류된다.
폴리뉴클레오타이드 합성
폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 본 개시내용의 방법은 포스포르아미다이트 화학을 수반하는 공정을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성은 염기와 포스포르아미다이트의 커플링을 포함한다. 폴리뉴클레오타이드 합성은 커플링 조건 하에 포스포르아미다이트의 침착에 의한 염기 커플링을 포함할 수 있으며, 여기서 동일한 염기는 선택적으로 1회 초과, 즉 이중 커플링으로 포스포르아미다이트가 침착된다. 폴리뉴클레오타이드 합성은 미반응 부위의 캐핑을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 캐핑은 선택적이다. 폴리뉴클레오타이드 합성은 또한 산화 또는 산화 단계 또는 산화 단계들을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 합성은 탈차단(deblocking), 탈트리틸화 및 황화를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성은 산화 또는 황화를 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 반응 동안 하나 또는 각각의 단계 사이에서, 장치는 예를 들어 테트라졸 또는 아세토니트릴을 사용하여 세척된다. 포스포르아미다이트 합성 방법에서 임의의 하나의 단계에 대한 시간 프레임은 약 2분, 1분, 50초, 40초, 30초, 20초 및 10초 미만일 수 있다.
포스포르아미다이트 방법을 이용한 폴리뉴클레오타이드 합성은 포스파이트 트리에스테르 연결의 형성을 위해 성장하는 폴리뉴클레오타이드 사슬에 포스포르아미다이트 빌딩 블록(예를 들어, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트)을 후속적으로 부가하는 것을 포함할 수 있다. 포스포르아미다이트 폴리뉴클레오타이드 합성은 3'에서 5' 방향으로 진행한다. 포스포르아미다이트 폴리뉴클레오타이드 합성은 합성 사이클마다 성장하는 핵산 사슬에 하나의 뉴클레오타이드의 제어된 부가를 가능하게 한다. 일부 경우에, 각각의 합성 사이클은 커플링 단계를 포함한다. 포스포르아미다이트 커플링은 예를 들어 링커를 통해 활성화된 뉴클레오시드 포스포르아미다이트와 기재에 결합된 뉴클레오시드 사이의 포스파이트 트리에스테르 연결의 형성을 수반한다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 활성화된 장치에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트는 활성화제와 함께 장치에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포아미다이트는 기재 결합된 뉴클레오시드에 비해 1.5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100배 과량 또는 그 초과의 양으로 장치에 제공된다. 일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 추가는 무수 환경, 예를 들어 무수 아세토니트릴에서 수행된다. 뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 추가한 후, 장치는 선택적으로 세척된다. 일부 경우에, 커플링 단계는 선택적으로 기재에 대한 뉴클레오시드 포스포르아미다이트 추가 사이의 세척 단계와 함께 1회 이상 추가로 반복된다. 일부 경우에, 본원에서 사용되는 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 1, 2, 3회 또는 그 초과의 순차적 커플링 단계를 포함한다. 커플링 전에, 많은 경우에, 장치에 결합된 뉴클레오시드는 중합을 방지하는 기능을 하는 보호기를 제거하여 탈보호된다. 일반적인 보호기는 4,4'-디메톡시트리틸(DMT)이다.
커플링 후, 포스포르아미다이트 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 선택적으로 캐핑 단계를 포함한다. 캐핑 단계에서, 성장하는 폴리뉴클레오타이드는 캐핑제로 처리된다. 캐핑 단계는 추가적인 사슬 신장으로부터 커플링 후 미반응된 기재 결합된 5'-OH 기를 차단하는 데 유용하며, 내부 염기 결실을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 형성을 방지한다. 또한, 1H-테트라졸로 활성화된 포스포르아미다이트는 구아노신의 06 위치와 약간 반응할 수 있다. 이론에 매이지 않으면서, I0/물로 산화될 때, 이 부산물은 아마도 O6-N7 이동을 통해 탈퓨린화를 겪을 수 있다. 무퓨린 부위는 폴리뉴클레오타이드의 최종 탈보호 과정에서 결국 절단되어 전체 길이 산물의 수율을 감소시킬 수 있다. O6 변형은 I2/물로 산화되기 전에 캐핑 시약으로 처리하여 제거될 수 있다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드 합성 동안 캐핑 단계를 포함하면, 캐핑이 없는 합성과 비교하여 오류율이 감소한다. 일례로서, 캐핑 단계는 아세트산 무수물과 1-메틸이미다졸의 혼합물로 기재 결합된 폴리뉴클레오타이드를 처리하는 것을 포함한다. 캐핑 단계 후, 장치는 선택적으로 세척된다.
일부 경우에, 뉴클레오시드 포스포르아미다이트의 첨가 후, 및 선택적으로 캐핑 및 하나 이상의 세척 단계 후에, 장치 결합된 성장하는 핵산은 산화된다. 산화 단계는 포스파이트 트리에스테르가 자연적으로 발생하는 포스페이트 디에스테르 뉴클레오시드간 연결의 보호된 전구체인 4배위된 포스페이트 트리에스테르로 산화되는 것을 포함한다. 일부 경우에, 성장하는 폴리뉴클레오타이드의 산화는 선택적으로 약염기(예를 들어, 피리딘, 루티딘, 콜리딘)의 존재 하에 요오드 및 물로 처리함으로써 달성된다. 산화는 예를 들어 tert-부틸 히드로퍼옥사이드 또는 (1S)-(+)-(10-캄포술포닐)-옥사지리딘(CSO)을 사용하여 무수 조건 하에 수행될 수 있다. 일부 방법에서, 캐핑 단계는 산화 후에 수행된다. 제2 캐핑 단계는 지속될 수 있는 산화로부터 잔류하는 물이 후속 커플링을 억제할 수 있기 때문에 장치를 건조시킬 수 있다. 산화 후, 장치 및 성장하는 폴리뉴클레오타이드는 선택적으로 세척된다. 일부 경우에, 산화 단계는 폴리뉴클레오타이드 포스포로티오에이트를 수득하기 위한 황화 단계로 치환되며, 임의의 캐핑 단계는 황화 후에 수행될 수 있다. 3-(디메틸아미노메틸리덴)아미노)-3H-1,2,4-디티아졸-3-티온, DDTT, 3H-1,2-벤조디티올-3-온 1,1-디옥사이드(보우케이지(Beaucage) 시약으로도 알려짐), 및 N,N,N'N'-테트라에틸티우람 디술파이드(TETD)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 많은 시약으로 효율적인 황 전달이 가능하다.
뉴클레오시드 혼입의 후속 사이클이 커플링을 통해 일어나도록 하기 위해, 장치 결합된 성장하는 폴리뉴클레오타이드의 보호된 5' 말단을 제거하여 1차 하이드록실기가 다음 뉴클레오시드 포스포르아미다이트와 반응성이 되도록 한다. 일부 경우에, 보호기는 DMT이고, 탈차단은 디클로로메탄 내의 트리클로로아세트산을 사용하여 발생한다. 연장된 시간 동안 또는 권장되는 산 용액보다 더 강한 용액으로 탈트리틸화를 수행하면, 고체 지지체 결합된 폴리뉴클레오타이드의 탈퓨린화가 증가할 수 있어 원하는 전체 길이 산물의 수율이 감소한다. 본원에서 설명되는 개시내용의 방법 및 조성물은 바람직하지 않은 탈퓨린화 반응을 제한하는 제어된 탈차단 조건을 제공한다. 일부 경우에, 장치 결합된 폴리뉴클레오타이드는 탈차단 후에 세척된다. 일부 경우에, 탈차단 후의 효율적인 세척은 낮은 오류율을 갖는 합성된 폴리뉴클레오타이드에 기여한다.
폴리뉴클레오타이드의 합성 방법은 전형적으로 다음과 같은 단계의 반복적인 순서를 수반한다: 활성화된 표면, 링커 또는 이전에 탈보호된 단량체와 연결하기 위해 활성적으로 작용화된 표면(예를 들어, 좌위)에 보호된 단량체의 적용; 후속적으로 적용된 보호된 단량체와 반응성이 되도록 적용된 단량체의 탈보호; 및 연결을 위한 또 다른 보호된 단량체의 적용. 하나 이상의 중간 단계는 산화 또는 황화를 포함한다. 일부 경우에, 하나 이상의 세척 단계는 하나의 단계 또는 모든 단계에 선행하거나 뒤따른다.
포스포르아미다이트 기반 폴리뉴클레오타이드 합성 방법은 일련의 화학적 단계를 포함한다. 일부 경우에, 합성 방법의 하나 이상의 단계는 시약 사이클링을 수반하고, 방법의 하나 이상의 단계는 단계에 유용한 시약을 장치에 적용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 시약은 일련의 액체 침착 및 진공 건조 단계에 의해 사이클링된다. 웰, 마이크로웰, 채널 등과 같은 3차원 특징부를 포함하는 기재의 경우, 시약은 선택적으로 웰 및/또는 채널을 통해 장치의 하나 이상의 영역을 통과한다.
본원에서 설명되는 방법 및 시스템은 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 폴리뉴클레오타이드 합성 장치에 관한 것이다. 합성은 병렬일 수 있다. 예를 들어, 적어도 또는 약 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 1000, 10000, 50000, 75000, 100000개 또는 그 초과의 폴리뉴클레오타이드가 병렬로 합성될 수 있다. 병렬로 합성될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 총 수는 2-100000, 3-50000, 4-10000, 5-1000, 6-900, 7-850, 8-800, 9-750, 10-700, 11-650, 12-600, 13-550, 14-500, 15-450, 16-400, 17-350, 18-300, 19-250, 20-200, 21-150, 22-100, 23-50, 24-45, 25-40, 30-35개일 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 병렬로 합성된 폴리뉴클레오타이드의 총 수가 이들 값 중 임의의 값에 의해 제한되는 임의의 범위, 예를 들어 25-100에 속할 수 있음을 이해한다. 병렬로 합성된 폴리뉴클레오타이드의 총 수는 범위의 종점 역할을 하는 임의의 값에 의해 정의된 임의의 범위에 속할 수 있다. 장치 내에서 합성된 폴리뉴클레오타이드의 총 몰 질량 또는 각각의 폴리뉴클레오타이드의 몰 질량은 적어도 또는 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 100, 250, 500, 750, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, 10000, 25000, 50000, 75000, 100000 피코몰, 또는 그 초과일 수 있다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 폴리뉴클레오타이드의 평균 길이는 적어도 또는 약 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500개 뉴클레오타이드 또는 그 초과일 수 있다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 폴리뉴클레오타이드의 평균 길이는 최대 또는 약 최대 500, 400, 300, 200, 150, 100, 50, 45, 35, 30, 25, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10개 뉴클레오타이드 또는 그 미만일 수 있다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 폴리뉴클레오타이드의 평균 길이는 10-500, 9-400, 11-300, 12-200, 13-150, 14-100, 15-50, 16-45, 17-40, 18-35, 19-25일 수 있다. 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 폴리뉴클레오타이드의 평균 길이가 이들 값 중 임의의 값에 의해 제한되는 임의의 범위, 예를 들어 100-300에 속할 수 있음을 이해한다. 장치 내의 각각의 폴리뉴클레오타이드의 길이 또는 폴리뉴클레오타이드의 평균 길이는 범위의 종점 역할을 하는 임의의 값에 의해 정의된 임의의 범위에 속할 수 있다.
본원에서 제공되는 표면에서 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 방법은 빠른 속도의 합성을 가능하게 한다. 예를 들어, 시간당 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드가 합성된다. 뉴클레오타이드는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 우리딘 빌딩 블록, 또는 이의 유사체/변형된 버전을 포함한다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리는 기재에서 병렬로 합성된다. 예를 들어, 약 또는 적어도 약 100; 1,000; 10,000; 30,000; 75,000; 100,000; 1,000,000; 2,000,000; 3,000,000; 4,000,000; 또는 5,000,000개의 분해된 좌위를 포함하는 장치는 적어도 동일한 수의 별개의 폴리뉴클레오타이드의 합성을 지지할 수 있으며, 별개의 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 분해된 좌위에서 합성된다. 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드의 라이브러리는 약 3개월, 2개월, 1개월, 3주, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일, 24시간 또는 그 미만에 본원에서 설명되는 낮은 오류율로 장치에서 합성된다. 일부 경우에, 본원에서 설명되는 기재 및 방법을 이용하여 낮은 오류율로 합성된 폴리뉴클레오타이드 라이브러리로부터 조립된 더 큰 핵산은 약 3개월, 2개월, 1개월, 3주, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2일, 24시간 또는 그 미만에 제조된다.
일부 경우에, 본원에서 설명되는 방법은 복수의 코돈 부위에서 상이한 변이 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리의 생성을 제공한다. 일부 경우에, 핵산은 1개 부위, 2개 부위, 3개 부위, 4개 부위, 5개 부위, 6개 부위, 7개 부위, 8개 부위, 9개 부위, 10개 부위, 11개 부위, 12개 부위, 13개 부위, 14개 부위, 15개 부위, 16개 부위, 17개 부위 18개 부위, 19개 부위, 20개 부위, 30개 부위, 40개 부위, 50개 부위 또는 그 초과의 변이 코돈 부위를 가질 수 있다.
일부 경우에, 변이 코돈 부위의 하나 이상의 부위는 인접할 수 있다. 일부 경우에, 변이 코돈 부위의 하나 이상의 부위는 인접하지 않고, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 코돈에 의해 분리될 수 있다.
일부 경우에, 핵산은 변이 코돈 부위의 다중 부위를 포함할 수 있으며, 모든 변이 코돈 부위는 서로 인접하여 변이 코돈 부위의 스트레치를 형성한다. 일부 경우에, 핵산은 변이 코돈 부위의 다중 부위를 포함할 수 있으며, 어떠한 변이 코돈 부위도 서로 인접하지 않는다. 일부 경우에, 핵산은 변이 코돈 부위의 다중 부위를 포함할 수 있으며, 변이 코돈 부위 중 일부는 서로 인접하여 변이 코돈 부위의 스트레치를 형성하고, 일부 변이 코돈 부위는 서로 인접하지 않는다.
도면을 참조하면, 도 1은 더 짧은 핵산으로부터 핵산(예를 들어, 유전자)의 합성을 위한 예시적인 공정 워크플로우를 도시한 것이다. 워크플로우는 일반적으로 (1) 단일 가닥 핵산 라이브러리의 드 노보 합성, (2) 핵산 연결을 통한 더 큰 단편의 형성, (3) 오류 수정, (4) 품질 관리, 및 (5) 배송 단계로 구분된다. 드 노보 합성 전에, 의도된 핵산 서열 또는 핵산 서열의 그룹이 미리 선택된다. 예를 들어, 유전자 그룹은 생성을 위해 미리 선택된다.
생성을 위한 큰 핵산이 선택되면, 핵산의 미리 결정된 라이브러리가 드 노보 합성을 위해 설계된다. 고밀도 폴리뉴클레오타이드 어레이를 생성하기 위한 다양한 적합한 방법이 알려져 있다. 워크플로우 예에서, 장치 표면 층이 제공된다. 이 예에서, 표면의 화학은 폴리뉴클레오타이드 합성 공정을 개선하기 위해 변경된다. 표면 에너지가 낮은 영역은 액체를 밀어내기 위해 생성되고, 표면 에너지가 높은 영역은 액체를 끌어당기기 위해 생성된다. 표면 자체는 평평한 표면의 형태이거나 또는 표면적을 증가시키는 돌출부 또는 마이크로웰과 같은 형태의 변화를 포함할 수 있다. 워크플로우 예에서, 선택된 높은 표면 에너지 분자는 국제 특허 출원 공개 WO/2015/021080(그 전체가 본원에 참조로 포함됨)에 개시된 바와 같이 DNA 화학을 지지하는 이중 기능을 수행한다.
폴리뉴클레오타이드 어레이의 계내 제조는 고체 지지체에서 생성되고, 단일 뉴클레오타이드 연장 과정을 활용하여 다수의 올리고머를 병렬로 연장한다. 물질 침착 장치와 같은 침착 장치는 다수의 폴리뉴클레오타이드가 한 번에 하나의 잔기를 병렬로 연장하여 미리 결정된 핵산 서열을 갖는 올리고머를 생성하도록 단계적 방식으로 시약을 방출하도록 설계된다(102). 일부 경우에, 폴리뉴클레오타이드는 이 단계에서 표면으로부터 절단된다. 절단은 암모니아 또는 메틸아민과 같은 가스 절단을 포함한다.
생성된 폴리뉴클레오타이드 라이브러리는 반응 챔버에 배치된다. 이 예시적인 워크플로우에서, 반응 챔버("나노반응기"로도 지칭됨)는 PCR 시약을 함유하고, 폴리뉴클레오타이드 라이브러리에 내려진 실리콘 코팅된 웰이다(103). 폴리뉴클레오타이드의 밀봉 전 또는 후에(104), 시약을 첨가하여 폴리뉴클레오타이드를 기재로부터 방출한다. 예시적인 워크플로우에서, 폴리뉴클레오타이드는 나노반응기의 밀봉 후에 방출된다(105). 일단 방출되면, 단일 가닥폴리뉴클레오타이드의 단편은 DNA의 전체 긴 범위 서열에 걸쳐 있도록 혼성화된다. 부분적 혼성화(105)는 합성된 각각의 폴리뉴클레오타이드가 풀에서 적어도 하나의 다른 폴리뉴클레오타이드와 중첩되는 작은 부분을 갖도록 설계되기 때문에 가능하다.
혼성화 후, PCA 반응이 시작된다. 폴리머라제 사이클 동안, 폴리뉴클레오타이드는 상보적인 단편에 어닐링되고, 갭은 폴리머라제에 의해 채워진다. 각각의 사이클은 서로를 찾는 폴리뉴클레오타이드에 따라 다양한 단편의 길이를 무작위로 증가시킨다. 단편 간의 상보성은 이중 가닥 DNA의 완전한 큰 전체 범위를 형성할 수 있게 한다(106).
PCA가 완료된 후, 나노반응기는 장치로부터 분리되고(107), PCR용 프라이머를 갖는 장치와의 상호작용을 위해 위치된다(108). 밀봉 후에, 나노반응기는 PCR에 적용되고(109), 더 큰 핵산이 증폭된다. PCR 후(110), 나노챔버를 열고(111), 오류 수정 시약을 첨가하고(112), 챔버를 밀봉하고(113), 이중 가닥 PCR 증폭 산물로부터 불일치 염기쌍 및/또는 상보성이 저조한 가닥을 제거하기 위해 오류 수정 반응이 일어난다(114). 나노반응기를 열고, 분리한다(115). 이어서, 오류 수정된 산물은 PCR 및 분자 바 코딩과 같은 추가의 처리 단계를 거친 다음, 배송(123)을 위해 포장된다(122).
일부 경우에, 품질 관리 조치가 취해진다. 오류 수정 후, 품질 관리 단계는 예를 들어 오류 수정된 산물의 증폭을 위한 시퀀싱 프라이머를 갖는 웨이퍼와의 상호작용(116), 오류 수정된 증폭 산물을 함유하는 챔버에 웨이퍼의 밀봉(117), 및 추가 라운드의 증폭 수행(118)을 포함한다. 나노반응기를 열고(119), 산물을 풀링하고(120), 시퀀싱한다(121). 허용 가능한 품질 관리 결정이 이루어진 후, 포장된 산물(122)은 배송이 승인된다(123).
일부 경우에, 도 1에서와 같은 워크플로우에 의해 생성된 핵산은 본원에서 개시되는 중첩 프라이머를 사용하여 돌연변이 유발된다. 일부 경우에, 프라이머의 라이브러리는 고체 지지체 상에서 계내 제조에 의해 생성되고, 단일 뉴클레오타이드 연장 과정을 활용하여 다수의 올리고머를 병렬로 연장한다. 물질 침착 장치와 같은 침착 장치는 다수의 폴리뉴클레오타이드가 한 번에 하나의 잔기를 병렬로 연장하여 미리 결정된 핵산 서열을 갖는 올리고머를 생성하도록 단계적 방식으로 시약을 방출하도록 설계된다(102).
컴퓨터 시스템
본 명세서에서 설명되는 임의의 시스템은 컴퓨터에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 컴퓨터를 통해 로컬로 또는 원격으로 자동화될 수 있다. 다양한 경우에서, 본 개시내용의 방법 및 시스템은 컴퓨터 시스템 상의 소프트웨어 프로그램 및 그의 사용을 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 물질 침착 장치 이동, 분배 동작 및 진공 작동을 조정 및 동기화하는 것과 같은 분배/진공/재충전 기능의 동기화를 위한 컴퓨터 제어는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 컴퓨터 시스템은 기재의 특정 영역에 정확한 시약을 전달하기 위해 사용자 지정 염기 서열와 물질 침착 장치의 위치 사이의 인터페이스로 프로그래밍될 수 있다.
도 2에 도시된 컴퓨터 시스템(200)은 매체(211) 및/또는 네트워크 포트(205)로부터 판독할 수 있는 논리 장치로서 이해될 수 있으며, 이는 고정 매체(212)를 갖는 서버(209)에 선택적으로 연결될 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 시스템은 CPU(201), 디스크 드라이브(203), 키보드(215) 및/또는 마우스(216) 및 선택적인 모니터(207)와 같은 임의적인 입력 장치를 포함할 수 있다. 데이터 통신은 로컬 또는 원격 위치에 있는 서버로 표시된 통신 매체를 통해 달성될 수 있다. 통신 매체는 데이터를 전송 및/또는 수신하는 임의의 수단을 포함할 수 있다. 예를 들어, 통신 매체는 네트워크 연결, 무선 연결 또는 인터넷 연결일 수 있다. 이러한 연결은 월드 와이드 웹을 통한 통신을 제공할 수 있다. 본 개시내용에 관한 데이터는 도 2에 도시된 바와 같이 당사자(222)에 의한 수신 및/또는 검토를 위해 이러한 네트워크 또는 연결을 통해 전송될 수 있는 것으로 고려된다.
도 3에 도시된 바와 같이, 고속 캐시(304)는 프로세서(302)에 의해 최근에 사용되었거나 자주 사용되는 명령 또는 데이터를 위한 고속 메모리를 제공하기 위해 프로세서(302)에 연결되거나 통합될 수 있다. 프로세서(302)는 프로세서 버스(308)에 의해 노스 브리지(north bridge)(306)에 연결된다. 노스 브리지(306)는 메모리 버스(312)에 의해 랜덤 액세스 메모리(RAM)(310)에 연결되고, 프로세서(302)에 의해 RAM(310)에 대한 액세스를 관리한다. 노스 브리지(306)는 또한 칩셋 버스(316)에 의해 사우스 브리지(south bridge)(314)에 연결된다. 사우스 브리지(314)는 다시 주변 버스(318)에 연결된다. 주변 버스는 예를 들어 PCI, PCI-X, PCI Express, 또는 다른 주변 버스일 수 있다. 노스 브리지 및 사우스 브리지는 종종 프로세서 칩셋으로 지칭되고, 프로세서, RAM, 및 주변 버스(318) 상의 주변 구성 요소 간의 데이터 전달을 관리한다. 일부 대안적인 아키텍쳐에서, 노스 브리지의 기능은 별도의 노스 브리지 칩을 사용하는 대신 프로세서에 통합될 수 있다. 일부 경우에서, 시스템(300)은 주변 버스(318)에 부착된 가속기 카드(322)를 포함할 수 있다. 가속기는 특정 처리를 가속하기 위한 필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이(Field Programmable Gate Array, FPGA) 또는 다른 하드웨어를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가속기는 적응형 데이터 재구성에 사용되거나, 또는 확장된 세트 처리에 사용되는 대수식을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
소프트웨어 및 데이터는 외부 스토리지(324)에 저장되고, 프로세서에 의한 사용을 위해 RAM(310) 및/또는 캐시(304)에 로딩될 수 있다. 시스템(300)은 시스템 자원을 관리하기 위한 작동 시스템을 포함하고; 작동 시스템의 비제한적인 예는 Linux, WindowsTM,　MACOSTM, BlackBerry OSTM, iOSTM, 및 다른 기능적으로 동등한 작동 시스템 뿐만 아니라, 본 개시내용의 예시적인 상황에 따라 데이터 저장 및 최적화를 관리하기 위해 작동 시스템의 상부에서 실행되는 애플리케이션 소프트웨어를 포함한다. 이 예에서, 시스템(300)은 또한 분산 병렬 처리에 사용될 수 있는 네트워크 연결 스토리지(NAS) 및 다른 컴퓨터 시스템과 같은 외부 스토리지에 네트워크 인터페이스를 제공하기 위해 주변 버스에 연결된 네트워크 인터페이스 카드(NIC)(320 및 321)를 포함한다.
도 4는 복수의 컴퓨터 시스템(402a 및 402b), 복수의 휴대 전화 및 개인 데이터 보조 장치(402c), 및 네트워크 연결 스토리지(NAS)(404a 및 404b)를 갖는 네트워크(400)를 보여주는 다이어그램이다. 예시적인 상황에서, 시스템(402a, 402b, 및 402c)은 데이터 저장을 관리하고, 네트워크 연결 스토리지(NAS)(404a 및 404b)에 저장된 데이터에 대한 데이터 액세스를 최적화할 수 있다. 수학적 모델이 데이터에 대해 사용될 수 있고, 컴퓨터 시스템(402a 및 402b), 및 휴대 전화 및 개인 데이터 보조 시스템(402c)에 걸쳐 분산 병렬 처리를 사용하여 평가될 수 있다. 컴퓨터 시스템(402a 및 402b), 휴대 전화 및 개인 데이터 보조 시스템(402c)은 또한 네트워크 연결 스토리지(NAS)(404a 및 404b)에 저장된 데이터의 적응형 데이터 재구성을 위한 병렬 처리를 제공할 수 있다. 도 4는 단지 예를 도시한 것으로서, 본 개시내용의 다양한 예와 함께 매우 다양한 다른 컴퓨터 아키텍쳐 및 시스템이 사용될 수 있다. 예를 들어, 블레이드 서버를 사용하여 병렬 처리를 제공할 수 있다. 프로세서 블레이드는 백 플레인(back plane)을 통해 연결되어 병렬 처리를 제공할 수 있다. 스토리지는 백 플레인에 연결되거나, 또는 별도의 네트워크 인터페이스를 통해 네트워크 연결 스토리지(NAS)로서 연결될 수도 있다. 일부 예시적인 경우에, 프로세서는 별도의 메모리 공간을 유지하고, 네트워크 인터페이스, 백 플레인 또는 다른 프로세서에 의한 병렬 처리를 위한 다른 커넥터를 통해 데이터를 전송할 수 있다. 다른 경우에서, 일부 또는 모든 프로세서는 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용할 수 있다.
도 5는 예시적인 상황에 따른 공유 가상 주소 메모리 공간을 사용하는 멀티프로세서 컴퓨터 시스템(500)의 블록 다이어그램이다. 시스템은 공유 메모리 서브시스템(504)에 액세스할 수 있는 복수의 프로세서(502a-f)를 포함한다. 시스템은 메모리 서브시스템(504)에 복수의 프로그래밍 가능한 하드웨어 메모리 알고리즘 프로세서(MAP)(506a-f)를 통합한다. 각각의 MAP(506a-f)는 메모리(508a-f) 및 하나 이상의 필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA)(510a-f)를 포함할 수 있다. MAP는 설정 가능한 기능 유닛을 제공하고, 특정 알고리즘 또는 알고리즘의 일부는 각각의 프로세서와 긴밀하게 조정하여 처리하기 위해 FPGA(510a-f)에 제공될 수 있다. 예를 들어, MAP는 데이터 모델에 관한 대수식을 평가하고 예시적인 상황에서 적응형 데이터 재구성을 수행하는 데 사용할 수 있다. 이 예에서, 각각의 MAP는 이들 목적을 위해 모든 프로세서에 의해 전역적으로 액세스할 수 있다. 하나의 구성에서, 각각의 MAP는 관련 메모리(508a-f)에 액세스하기 위해 직접 메모리 액세스(DMA)를 사용하여 각각의 마이크로프로세서(502a-f)와 독립적으로 및 이로부터 비동기적으로 작업을 실행할 수 있다. 이 구성에서, MAP는 알고리즘의 파이프라인 방식 및 병렬 실행을 위해 또 다른 MAP에 결과를 직접적으로 공급할 수 있다.
상기 컴퓨터 아키텍쳐 및 시스템은 단지 예시로서, 일반 프로세서, 공동 프로세서, FPGA 및 다른 프로그래밍 가능한 논리 장치, 시스템 온 칩(SOC), 특정 용도 지향 집적 회로(ASIC), 및 다른 처리 및 논리 요소의 임의의 조합을 사용하는 시스템을 비롯하여 다양한 다른 컴퓨터, 휴대 전화, 개인 데이터 보조 아키텍쳐 및 시스템을 예시적인 경우와 관련하여 사용할 수 있다. 일부 경우에, 컴퓨터 시스템의 전체 또는 일부는 소프트웨어 또는 하드웨어로 실행될 수 있다. 랜덤 액세스 메모리, 하드 드라이브, 플래시 메모리, 테이프 드라이브, 디스크 어레이, 네트워크 연결 스토리지(NAS) 및 다른 로컬 또는 분산 데이터 저장 장치 및 시스템을 포함하는 임의의 다양한 데이터 저장 매체가 예시적인 경우와 관련하여 사용될 수 있다.
예시적인 경우에서, 컴퓨터 시스템은 상기 또는 다른 컴퓨터 아키텍쳐 및 시스템 중 임의의 것에서 실행되는 소프트웨어 모듈을 사용하여 실행될 수 있다. 다른 경우에서, 시스템의 기능은 펌웨어, 프로그래밍 가능한 논리 장치, 예를 들어 도 3에서 언급된 필드 프로그래밍 가능 게이트 어레이(FPGA), 시스템 온 칩(SOC), 특정 용도 지향 집적 회로(ASIC), 또는 다른 처리 및 논리 요소에서 부분적으로 또는 완전히 실행될 수 있다. 예를 들어, 세트 프로세서 및 옵티마이저는 도 3에 도시된 가속기 카드(322)와 같은 하드웨어 가속기 카드를 사용하여 하드웨어 가속을 통해 실행될 수 있다.
하기 실시예는 본원에서 개시되는 실시양태의 원리 및 실시를 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 보다 명확하게 설명하기 위해 제시되며, 청구된 실시양태의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 달리 명시되지 않는 한, 모든 부 및 백분율은 중량 기준이다.
실시예
하기 실시예는 본 개시내용의 다양한 실시양태를 예시하기 위해 제공되며, 어떠한 방식으로든 본 개시내용을 제한하고자 의도하지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법과 함께 본 실시예는 현재 바람직한 실시양태를 나타내고, 예시적이며, 본 개시내용의 범위에 대한 제한으로 의도되지 않는다. 청구범위에 의해 정의된 본 개시내용의 사상 내에 포함되는 변경 및 기타 용도는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 실시될 수 있을 것이다.
실시예 1: 장치 표면의 작용화
장치는 폴리뉴클레오타이드 라이브러리의 부착 및 합성을 지지하도록 작용화되었다. 장치 표면을 먼저 90% H2SO4 및 10% H2O2를 포함하는 피라냐(piranha) 용액을 사용하여 20분 동안 습식 세정하였다. 장치를 탈이온수로 여러 비이커에서 세정하고, 탈이온수 거위목형 수전 아래에 5분 동안 유지하고, N2로 건조하였다. 이어서, 장치를 NH4OH(1:100; 3 mL:300 mL)에 5분 동안 담그고, 핸드건을 사용하여 탈이온수로 세정하고, 탈이온수가 있는 3개의 연속 비이커에 각각 1분 동안 담근 다음, 핸드건을 사용하여 탈이온수로 다시 세정하였다. 이어서, 장치 표면을 O2에 노출시켜 장치를 플라즈마 세정하였다. SAMCO PC-300 기기를 하류 모드로 1분 동안 250 와트에서 O2 플라즈마 에칭에 사용하였다.
세척된 장치 표면을 다음과 같은 파라미터를 갖는 YES-1224P 증착 오븐 시스템을 사용하여 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드를 포함하는 용액으로 능동적으로 작용화하였다: 0.5 내지 1 torr, 60분, 70℃, 135℃ 기화기. 장치 표면을 브루어 사이언스(Brewer Science) 200X 스핀 코터를 사용하여 레지스트 코팅하였다. SPR™ 3612 포토레지스트를 40초 동안 2500 rpm에서 장치에 스핀 코팅하였다. 장치를 브루어 핫 플레이트에서 90℃에서 30분 동안 사전 베이킹하였다. 장치를 칼 수스(Karl Suss) MA6 마스크 정렬 기기를 사용하여 포토리소그래피에 적용하였다. 장치를 2.2초 동안 노출시키고, MSF 26A에서 1분 동안 현상하였다. 남은 현상액을 핸드건으로 세정하고, 장치를 물에 5분 동안 담갔다. 장치를 100℃에서 오븐에서 30분 동안 베이킹한 후, 니콘(Nikon) L200을 사용하여 리소그래피 결함을 육안으로 검사하였다. 디스컴(descum) 공정을 이용하여 1분 동안 250 와트에서 O2 플라즈마 에칭에 대한 SAMCO PC-300 기기로 잔류 레지스트를 제거하였다.
장치 표면을 10 μL의 경질 광유와 혼합된 100 μL의 퍼플루오로옥틸트리클로로실란 용액으로 수동적으로 작용화하였다. 장치를 챔버에 넣고, 10분 동안 펌핑한 다음, 밸브를 펌프에 대해 닫고, 10분 동안 정치하였다. 챔버를 공기로 환기하였다. 장치를 최대 전력(크레스트(Crest) 시스템에서 9)에서 초음파 처리하면서 70℃에서 500 mL NMP에서 5분 동안 2회의 담금 과정을 수행하여 레지스트 박리하였다. 이어서, 장치를 최대 전력에서 초음파 처리하면서 실온에서 500 mL 이소프로판올에 5분 동안 담갔다. 장치를 200 프루프(proof) 에탄올 300 mL에 담그고, N2로 취입 건조시켰다. 작용화된 표면은 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 지지체 역할을 하도록 활성화되었다.
실시예 2: 올리고뉴클레오타이드 합성 장치에서 50-mer 서열의 합성
2차원 올리고뉴클레오타이드 합성 장치를 유동셀(flowcell)에 조립하고, 이를 유동셀(Applied Biosystems (ABI394 DNA Synthesizer"))에 연결하였다. 2차원 올리고뉴클레오티드 합성 장치는 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드(Gelest)로 균일하게 작용화되었으며, 이는 본원에서 설명되는 폴리뉴클레오티드 합성 방법을 이용하여 50 bp의 예시적인 폴리뉴클레오티드("50-mer 폴리뉴클레오티드")를 합성하기 위해 사용되었다.
50-mer의 서열은 서열 번호 104에 제시된 바와 같다:
5'AGACAATCAACCATTTGGGGTGGACAGCCTTGACCTCTAGACTTCGGCAT##TTTTTTTTTT3'(서열 번호 104)
상기 식에서, #은 티미딘-숙시닐 헥사미드 CED 포스포르아미다이트(ChemGenes의 CLP-2244)를 나타내며, 이는 탈보호 동안 표면으로부터 올리고의 방출을 가능하게 하는 절단 가능한 링커이다.
합성은 표 2의 프로토콜 및 ABI 합성기에 따라 표준 DNA 합성 화학(커플링, 캐핑, 산화 및 탈차단)을 이용하여 수행되었다.
Figure pct00004
Figure pct00005
포스포르아미다이트/활성화제 조합은 유동셀을 통한 벌크 시약의 전달과 유사하게 전달되었다. 환경이 전체 시간 동안 시약으로 "습윤" 상태를 유지하므로, 건조 단계는 수행되지 않았다.
유동 제한기는 더 빠른 유동을 가능하게 하기 위해 ABI 394 합성기로부터 제거되었다. 유동 제한기가 없는 경우, 아미다이트(ACN 중 0.1 M), 활성화제(ACN 중 0.25 M 벤조일티오테트라졸("BTT"; GlenResearch로부터의 30-3070-xx)) 및 Ox(20% 피리딘, 10% 물 및 70% THF 중 0.02 M I2)에 대한 유속은 대략 ~ 100 uL/sec이었고, 아세토니트릴("ACN") 및 캐핑 시약(CapA 및 CapB의 1:1 혼합물, 여기서 CapA는 THF/피리딘 중의 아세트산 무수물이고, CapB는 THF 중의 16% 1-메틸이미다졸임)에 대해 대략 ~200 uL/sec였고, 탈차단제(톨루엔 중의 3% 디클로로아세트산)에 대해 대략 ~ 300 uL/sec이었다(유동 제한기가 존재하는 모든 시약에 대한 ~ 50 uL/sec와 비교됨). 산화제를 완전히 밀어내는 시간을 관찰하고, 이에 따라 화학물질 유동 시간을 조정하고, 상이한 화학물질 사이에 추가의 ACN 세척을 도입하였다. 폴리뉴클레오티드 합성 후, 칩은 75 psi에서 밤새 기체 암모니아에서 탈보호되었다. 폴리뉴클레오티드를 회수하기 위해 5방울의 물을 표면에 가하였다. 이어서, 회수된 폴리뉴클레오티드를 바이오어낼라이저(BioAnalyzer) 소형 RNA 칩에서 분석하였다.
실시예 3: 올리고뉴클레오티드 합성 장치에서 100-mer 서열의 합성
50-mer 서열의 합성에 대해 실시예 2에서 기재된 것과 동일한 과정이 하기 100-mer 폴리뉴클레오티드의 합성에 이용되었으며, 표면으로부터 추출된 폴리뉴클레오티드는 바이오어낼라이저 기기에서 분석되었다.
"100-mer 폴리뉴클레오티드(서열 번호 105)":
5'CGGGATCCTTATCGTCATCGTCGTACAGATCCCGACCCATTTGCTGTCCACCAGTCATGCTAGCCATACCATGATGATGATGATGATGAGAACCCCGCAT##TTTTTTTTTT3',
상기 식에서, #은 2개의 상이한 실리콘 칩(제1 칩은 N-(3-트리에톡시실릴프로필)-4-하이드록시부티르아미드로 균일하게 작용화되고, 제2 칩은 11-아세톡시운데실트리에톡시실란과 n-데실트리에톡시실란의 5/95 혼합물로 작용화됨) 상의 티미딘-숙시닐 헥사미드 CED 포스포르아미다이트(ChemGenes의 CLP-2244)를 나타낸다.
2개의 칩으로부터의 10개의 모든 샘플은 하기 열순환 프로그램을 이용하여 50 uL PCR 혼합물(25 uL NEB Q5 매스터믹스, 2.5 uL의 10 uM 정방향 프라이머, 2.5 uL의 10 uM 역방향 프라이머, 표면으로부터 추출된 1 uL 폴리뉴클레오티드, 및 50 uL까지의 물) 중의 정방향(5'ATGCGGGGTTCTCATCATC3'; 서열 번호 106) 및 역방향(5'CGGGATCCTTATCGTCATCG3'; 서열 번호 107) 프라이머를 사용하여 추가로 PCR 증폭되었다:
98℃, 30초,
98℃, 10초; 63℃, 10초; 72℃, 10초; 12 사이클 반복,
72℃, 2분.
PCR 산물은 또한 바이오어낼라이저에서 실행되었으며, 100-mer 위치에서 날카로운 피크를 나타내었다. 이어서, PCR 증폭된 샘플을 클로닝하고, 생거 시퀀싱을 수행하였다. 표 3은 칩 1의 스팟 1-5에서 취한 샘플 및 칩 2의 스팟 6-10에서 취한 샘플에 대한 생거 시퀀싱 결과를 요약한 것이다.
Figure pct00006
따라서, 합성된 폴리뉴클레오타이드의 고품질 및 균일성은 상이한 표면 화학을 갖는 2개의 칩에서 반복되었다. 전체적으로, 시퀀싱된 100-mer의 89%는 오류가 없는 완벽한 서열이었으며, 262개 중 233개에 상응한다.
표 4는 스팟 1-10의 폴리뉴클레오타이드 샘플에서 얻은 서열에 대한 오류 특징을 요약한 것이다.
Figure pct00007
실시예 4: VHH 라이브러리
합성 VHH 라이브러리가 개발되었다. 맞춤형 CDR 다양성이 있는 'VHH Ratio' 라이브러리의 경우, 클러스탈 오메가(Clustal Omega)를 사용하여 2391개의 VHH 서열(iCAN 데이터베이스)을 정렬하여 각각의 위치에서 컨센서스를 결정하고, 프레임워크는 각각의 위치에서 컨센서스로부터 유도되었다. 2391개의 모든 서열의 CDR은 위치 특이적 변이에 대해 분석되었으며, 이 다양성은 라이브러리 설계에 도입되었다. 셔플링된 CDR 다양성이 있는 'VHH Shuffle' 라이브러리의 경우, iCAN 데이터베이스에서 나노바디 서열의 특유한 CDR을 스캐닝하였다. 1239개의 특유한 CDR1, 1600개의 특유한 CDR2, 및 1608개의 특유한 CDR3이 확인되었고, 프레임워크는 iCAN 데이터베이스의 2391개 서열 사이의 각각의 프레임워크 위치에서 컨센서스로부터 유도되었다. 각각의 특유한 CDR은 개별적으로 합성되고, 컨센서스 프레임워크에서 셔플링되어 3.2 x 109개의 이론적 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하였다. 라이브러리는 제한 효소 분해를 사용하여 파지미드 벡터에 클로닝되었다. 'VHH hShuffle' 라이브러리(셔플링된 CDR 다양성이 있는 합성 "인간" VHH 라이브러리)의 경우, iCAN 데이터베이스에서 나노바디 서열의 특유한 CDR을 스캐닝하였다. 1239개의 특유한 CDR1, 1600개의 특유한 CDR2, 및 1608개의 특유한 CDR3이 확인되었고, 프레임워크 1, 3, 및 4는 인간 생식계열 DP-47 프레임워크로부터 파생되었다. 프레임워크 2는 iCAN 데이터베이스의 2391개 서열 중 각각의 프레임워크 위치의 컨센서스에서 유도되었다. 각각의 특유한 CDR을 개별적으로 합성하고, NUGE 도구를 사용하여 부분적으로 인간화된 프레임워크에서 셔플링하여 3.2 x 109개의 이론적 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하였다. 그런 다음, 라이브러리를 NUGE 도구를 사용하여 파지미드 벡터에 클로닝하였다.
카테라(Carterra) SPR 시스템을 사용하여 VHH-Fc 변이체에 대한 결합 친화도 및 친화도 분포를 평가하였다. VHH-Fc는 12 nM KD의 하한값 및 1685 nM KD의 상한값으로 TIGIT에 대한 다양한 친화도를 보여준다(데이터는 표시되지 않음). 표 5a는 ELISA, 단백질 A(mg/ml) 및 KD(nM)에 대한 VHH-Fc 클론에 대한 특정 값을 제공한다. 도 7a 및 도 7b는 20 - 4000의 친화도 역치(도 7a; 1가 KD) 및 20 - 1000 친화도 역치(도 7b; 1가 KD)에 걸쳐 VHH 라이브러리에 대한 TIGIT 친화도 분포를 도시한 것이다. 시험된 140개의 VHH 결합제 중에서, 51개의 변이체가 100 nM 미만의 친화도를 갖고, 90개의 변이체가 200 nM 미만의 친화도를 가졌다.
도 8은 'VHH Ratio' 라이브러리, 'VHH Shuffle 라이브러리' 및 'VHH hShuffle 라이브러리'에 대한 길이당 CDR3 수의 데이터를 보여준다. 표 5b는 'VHH Ratio' 라이브러리, 'VHH Shuffle 라이브러리' 및 'VHH hShuffle 라이브러리'에 대한 TIGIT 특유 클론 및 TIGIT 결합제의 수를 보여준다.
Figure pct00008
Figure pct00009
VHH-Fc TIGIT 클론의 열안정성 및 경쟁 분석은 도 9 및 표 6에 제시되어 있다. 경쟁 분석을 위해, 4 ug/mL TIGIT를 고정하고, 0.05 - 100 nM VHH-Fc와 함께 인큐베이팅한 후, 2 ug/mL 비오틴-CD155 및 1:5000의 스트렙타비딘-HRP와 함께 인큐베이팅하였다.
Figure pct00010
CD47 VHH 변이체도 생성하고, 분석하였다. 도 10은 CD47 친화도 분포를 보여준다. 표 7은 'VHH Ratio' 라이브러리, 'VHH Shuffle 라이브러리' 및 'VHH hShuffle 라이브러리'에 대한 CD47 특유 클론 및 TIGIT 결합제의 수를 보여준다. 표 8은 CD47 VHH 변이체의 결합 친화도를 보여준다. 표 8에서 알 수 있는 바와 같이, 8개의 CD47 VHH 결합제는 hCD47에 대해 100 nM 미만의 친화도를 갖고, 6개의 CD47 VHH 결합제는 cCD47에 대해 100 nM 미만의 친화도를 가졌다.
Figure pct00011
Figure pct00012
VHH-Fc CD47 클론의 억제 및 열안정성 분석은 도 11 및 표 9에 도시되어 있다. 억제 분석을 위해, 3 ug/mL의 CD47을 고정하고, 0.3-132 nM의 VHH-Fc와 함께 인큐베이팅한 후, 0.25 ug/mL 비오틴-SIRP 알파 및 1:5000의 스트렙타비딘-HRP와 함께 인큐베이팅하였다.
Figure pct00013
실시예 5. GLP1R에 대한 VHH 라이브러리
GLP1R에 대한 VHH 라이브러리는 실시예 4에 기재된 방법과 유사하게 개발되었다. 간략하게 설명하면, GLP1R을 발현하는 안정한 세포주가 생성되었고, 표적 발현은 FACS에 의해 확인되었다. 그런 다음, 표적의 80%를 초과하는 표적을 발현하는 세포를 세포 기반 선택에 사용하였다. 관심 표적을 안정적으로 과다발현하는 세포에 대해 5 라운드의 세포 기반 선택을 수행하였다. 108개의 세포가 각각의 선택 라운드에 사용되었다. 표적 발현 세포를 선택하기 전에, 각각의 라운드의 파지는 108개의 CHO 배경 세포에서 먼저 고갈되었다. 후속 선택 라운드에서 세척 횟수를 늘려 선택의 엄격도를 높였다. 그런 다음, 트립신을 사용하여 파지로부터 세포를 용출하고, 다음 라운드의 패닝을 위해 파지를 증폭하였다. 라운드 4 및 라운드 5로부터의 총 1000개의 클론을 NGS에 의해 시퀀싱하여 VHH-Fc로 재포맷하기 위한 특유한 클론을 확인하였다.
156개의 특유한 GLP1R VHH Fc 결합제 중 53개는 모 세포에 비해 2배인 표적 세포 평균 형광 강도(MFI) 값을 가졌다. 변이체 GLP1R-43-77에 대한 데이터는 도 12a-12b 및 표 10-11에서 볼 수 있다. 표 11은 RL1-A 채널로 검출된 유세포 분석 데이터를 보여준다.
Figure pct00014
Figure pct00015
실시예 6. CRTH2R에 대한 VHH 라이브러리
CRTH2R에 대한 VHH 라이브러리는 실시예 4에 기재된 방법과 유사하게 개발되었다. 간략하게 설명하면, CRTH2R을 발현하는 안정한 세포주가 생성되었고, 표적 발현은 FACS에 의해 확인되었다. 그런 다음, 표적의 80%를 초과하는 표적을 발현하는 세포를 세포 기반 선택에 사용하였다. 관심 표적을 안정적으로 과다발현하는 세포에 대해 5 라운드의 세포 기반 선택을 수행하였다. 108개의 세포가 각각의 선택 라운드에 사용되었다. 표적 발현 세포를 선택하기 전에, 각각의 라운드의 파지는 108개의 CHO 배경 세포에서 먼저 고갈되었다. 후속 선택 라운드에서 세척 횟수를 늘려 선택의 엄격도를 높였다. 그런 다음, 트립신을 사용하여 파지로부터 세포를 용출하고, 다음 라운드의 패닝을 위해 파지를 증폭하였다. 라운드 4 및 라운드 5로부터의 총 1000개의 클론을 NGS에 의해 시퀀싱하여 VHH-Fc로 재포맷하기 위한 특유한 클론을 확인하였다.
175개의 특유한 CRTH2R VHH Fc 결합제 중 26개는 모 세포에 비해 2배인 표적 세포 평균 형광 강도(MFI) 값을 가졌다. 변이체 CRTH2R-41-51에 대한 데이터는 도 13a-13b 및 표 12-13에서 볼 수 있다. 표 13은 RL1-A 채널로 검출된 유세포 분석 데이터를 보여준다. 변이체 CRTH2R-44-59에 대한 데이터는 도 14a-14d에서 볼 수 있다.
Figure pct00016
Figure pct00017
실시예 7. CRTH2R에 대한 IgG의 확인
항-CRTH2R 항체의 세포 결합은 위양성을 배제하기 위해 모 음성 및 표적 양성 세포를 비교하여 CHO CRTH2R-양성 세포(GFP+) 및 모 CHO 세포(GFP-)에 대한 시험에 의해 결정되었다. 표 14a에 나열된 항체를 100 nM(15 ug/mL)에서 시작하여 총 8점에 대해 3배 적정으로 적정하였다. CRTH2R IgG 항체에 대한 중쇄 및 경쇄 서열은 표 14b에 제시되어 있다. 농도에 의한 평균 형광 강도(MFI)에 의해 검출된 결합은 도 15a-15e에 도시되어 있다. CRTH2-27을 사용하여 100 nM에서의 예시적인 게이팅된 도트 플롯 및 APC 히스토그램이 도 16a-16b에 도시되어 있다. 2개의 항체(gPCR-51 및 gPCR-52)를 양성 대조군으로 사용하였다. 2개의 양성 대조군의 결합 프로파일은 도 17a-17b에 도시되어 있다.
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
후속 실시예에서, 5개의 항체가 cAMP 검정에서 기능적 효과를 갖는 것으로 나타났다: CRTH2-9, CRTH2-27, CRTH2-50, CRTH2-32, 및 CRTH2-42. 이들 항체의 결합 곡선은 도 18a-18b에서 비교된다.
실시예 8. cAMP 검정을 사용한 길항제 활성
CRTH2R IgG 항체의 라이브러리를 검정하여 PGD2-유도된 cAMP 신호에서 길항제의 기능을 결정하였다. 간단히 설명하면, 세포를 실온에서 1시간 동안 IgG(적정 1:3)와 함께 사전 인큐베이팅하였다. 이어서, CRTH2R이 Gαi 커플링되어 있기 때문에, 세포를 포스콜린의 존재 하에 37℃에서 30분 동안 PGD2(0.59 nM)로 자극하였다.
상대적인 광 단위(rlu)로 검출된 신호에 대한 항체의 효과를 결정하였다(데이터는 나타내지 않음). 시험된 최고 농도(300 nM)에서, 일부 CRTH2R IgG는 신호의 상향 편향을 일으켰으며, 이것은 PGD2 자극에 의해 유도된 cAMP 신호의 억제를 나타낸다. 비교를 위해, 시험된 3개의 가장 높은 IgG 농도에 대해 처리된 IgG 대 처리된 대조군의 비율을 나타내는 막대 차트가 도 19a에 도시되어 있다. 도 19b에 도시된 항체는 33 nM에서 20% 초과의 길항제 활성을 유도한 CRTH2R IgG 항체, 구체적으로 CRTH2-74, CRTH2-24, CRTH2-28, CRTH2-19, CRTH2-45, CRTH2-9, CRTH2-8, CRTH2-15, CRTH2-42, CRTH2-60 및 CRTH2-70을 보여준다.
실시예 9. PGD2-유도된 cAMP 신호의 알로스테리 조절
알로스테리 활성에 대해 CRTH2R IgG 항체를 검정하였다. 알로스테리 조절은 PGD2-유도된 cAMP 신호에서 CRTH2R IgG 항체를 검정하여 결정되었다. 간단히 설명하면, 세포를 IgG 항체 부재 하에 또는 100 nM CRTH2R IgG 항체의 존재 하에 재인큐베이팅하였다. 이어서, 세포를 포스콜린의 존재 하에 다양한 농도의 PGD2로 자극한 후, cAMP 활성에 대한 검정을 수행하였다.
cAMP 검정의 결과는 도 20에 도시되어 있다. PGD2 용량 반응 곡선의 오른쪽 방향 이동(및 IC50 값의 증가)은 음성 알로스테리 효과를 나타낸다. 도 20에 도시된 바와 같이, CRTH2R IgG 중 5개(CRTH2-9, CRTH2-27, CRTH2-50, CRTH2-32 및 CRTH2-42)는 PGD2 단독과 비교하여 2.0 초과의 IC50 배수 차이를 일으켰고, 이것은 이들이 음성 알로스테리 조절제임을 시사한다.
실시예 10. PGD2-유도된 cAMP 신호의 작용제 활성
CRTH2R IgG 항체를 작용제 기능에 대해 검정하였다. PGD2-유도된 cAMP 신호에서 실시예 7에서 설명된 바와 같이 CRTH2R IgG 항체를 검정함으로써 작용제 활성을 결정하였다.
간단히 설명하면, 세포를 포스콜린의 존재 하에 PGD2 또는 CRTH2R IgG 항체로 처리하였다. CRTH2R IgG 항체에는 CRTH2-74, CRTH2-24, CRTH2-28, CRTH2-39, CRTH2-19, CRTH2-9, CRTH2-8, CRTH2-27, CRTH2-45, CRTH2-35, CRTH2-50, CRTH2-66, CRTH2-57, CRTH2-32, CRTH2-15, CRTH2-25, CRTH2-42, CRTH2-55, CRTH2-60, 및 CRTH2-70이 포함되었다. 처리 자극은 37℃에서 30분 동안 수행되었다. 그런 다음, cAMP 검정을 수행하였다(데이터는 표시되지 않음).
실시예 11. 알로스테리 조절제를 나타내는 대조군 실험
공지된 CRTH2R 길항제(소분자 OC000459) 및 2개의 대조군 항체에 대해 알로스테리 조절을 결정하였다. 실험은 실시예 9에 기재된 것과 유사하게 수행하였다. 간단히 설명하면, 세포를 OC000459, 비교 CRTH2R AB51 항체 또는 비교 CRTH2R AB52 항체로 처리하였다. 그런 다음, 세포를 포스콜린의 존재 하에 PGD2로 자극하였다.
결과는 도 21a-21c에 도시되어 있다. OC000459는 곡선의 강한 오른쪽 방향 이동 및 IC50 값의 459배 증가를 야기한다(도 21a). CRTH2R AB51과의 인큐베이팅은 IC50 값의 변화를 일으키지 않았다(도 21b). 비교 항체 #52와의 인큐베이팅은 IC50 값의 3.5배 감소를 유발하였고, 이것은 상기 항체가 양성 알로스테리 조절제임을, 즉 작용제 효과를 갖는다는 것을 나타낸다(도 21c).
실시예 12. 길항제 조절에 대한 CRTH2R β-아레스틴 동원 검정
9개의 CRTH2R IgG 항체에 의한 길항제 조절을 결정하였다. 9개의 CRTH2R IgG 항체에는 CRTH2-9, CRTH2-27, CRTH2-50, CRTH2-32, CRTH2-42, CRTH2-74, CRTH2-55, CRTH2-28 및 CRTH2-39가 포함되었다. OC000459와 비교하여 이들 9개 항체의 길항제 기능은 PGD2-유도된 β-아레스틴 동원을 사용하여 결정되었다. 소분자 OC000459를 사용한 양성 대조군을 포함한 결과는 도 22a-22d에 제시되어 있다.
실시예 13. 알로스테리 조절에 대한 CRTH2R β-아레스틴 동원 검정
9개의 CRTH2R IgG에 의한 알로스테리 조절을 결정하였다. 9개의 CRTH2R IgG에는 CRTH2-9, CRTH2-27, CRTH2-50, CRTH2-32, CRTH2-42, CRTH2-74, CRTH2-55, CRTH2-28 및 CRTH2-39가 포함되었다. OC000459와 비교하여 이들 9개 항체의 알로스테리 조절은 PGD2-유도된 β-아레스틴 동원을 사용하여 결정되었다.
간단히 설명하면, 세포를 실온에서 1시간 동안 IgG(100 nM)와 함께 사전 인큐베이팅한 후, 37℃에서 90분 동안 PGD2 자극을 가하였다. 데이터는 각각의 그래프에서 첫 번째 데이터 점(최저 PGD2 및 0 Ab)에 대해 정규화되었다.
실시예 14. 과다면역 면역글로불린 라이브러리
과다면역 면역글로불린(IgG) 라이브러리는 실시예 4에서 설명된 것과 유사한 방법을 사용하여 생성되었다. 간단히 설명하면, 과다면역 IgG 라이브러리는 3명의 건강한 기증자 각각으로부터의 3,700만 개 초과의 특유한 IgH 서열로 이루어진 인간 나이브 및 기억 B-세포의 데이터베이스에 대한 분석으로부터 생성되었다. 2백만 개 초과의 CDRH3 서열이 분석으로부터 수집되었고, 실시예 1-3과 유사한 방법을 사용하여 개별적으로 구축되었다. 개발시에 자주 문제를 제기하는 임의의 중복 CDRH3 및 잠재적 문제 모티프는 라이브러리 합성 단계 동안 제거되었다. 그런 다음, 이러한 CDRH3 서열 다양성을 조합 방식으로 조립하고, DP47 인간 프레임워크에 통합하여 1 x 1010개 크기의 고기능성 항체 Fab 라이브러리를 구축하였다. 설계의 개략도는 도 24에서 볼 수 있다.
과다면역 항체 라이브러리의 중쇄 CDR 길이 분포를 차세대 시퀀싱(NGS)에 의해 평가하였다. CDR 길이 분포의 데이터는 도 25a-25b에 도시되어 있다. 일반적으로, 가용성 단백질 표적의 선택은 라운드 1에서 PBST 세척 3회, 라운드 2에서 PBST 세척 5회, 라운드 3에서 PBST 세척 7회, 라운드 4에서 PBST 세척 9회 및 라운드 5에서 PBST 세척 12회를 수반하였다. 탈지유 차단이 사용되었다. 도 26을 참조한다.
인간 TIGIT(hTIGIT)의 경우, 1 uM 비오티닐화된 항원을 300 ul 다이나비드(Dynabead) M-280과 10 mg/mL로 혼합하여 100 ul당 100pmol의 농도를 생성하였다. 다양한 선택 라운드에 대한 세부 정보는 표 15에 제시되어 있다.
Figure pct00023
다양한 라운드의 선택 후, hTIGIT IgG를 분석하였다. 데이터는 도 27a-27f 및 표 16에서 볼 수 있다. 도 27a 내지 27d는 라운드 3 및 라운드 4로부터의 ELISA 데이터를 보여준다. 도 27e-27f는 분석된 hTIGIT IgG에 대한 CDRH3 길이, 수득량(ug), 및 KD(nM)의 데이터를 보여준다.
Figure pct00024
17개의 동일하지 않은 hTIGIT 면역글로불린이 16 nM 내지 300 nM 초과의 범위의 1가 친화도로 확인되었다. 이들 면역글로불린의 대부분은 잘 발현되었고, 1 ml의 발현 부피에서 20 ug 초과의 정제된 단백질을 생산하였다. hTIGIT 면역글로불린에 대한 서열은 표 17에 제시되어 있다.
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
인간 CD3 엡실론(hCD3) 및 사이노 CD3 엡실론(cCD3) 면역글로불린의 확인을 수행하였다. 다양한 선택 라운드의 세부 사항은 표 18에 제시되어 있다.
Figure pct00028
다양한 라운드의 선택 후, CD3 엡실론(CD3ε) IgG를 분석하였다. 데이터는 도 28a-28l 및 표 19a-19b에서 볼 수 있다. 도 28a-28f는 라운드 4 및 라운드 5로부터의 ELISA 데이터를 보여준다. 도 28g-28l은 인간 CD3 엡실론 및 사이노 CD3 엡실론 면역글로불린의 교차 반응성에 대한 데이터를 보여준다.
Figure pct00029
Figure pct00030
인간/사이노 CD3 엡실론 교차 반응성 면역글로불린인 5개의 면역글로불린을 포함하는 19개의 동일하지 않은 hCD3 엡실론 및 사이노 CD3 엡실론 면역글로불린이 확인되었다. 인간/사이노 CD3 엡실론 교차 반응성 항체 중 하나인 CD3-56-05는 인간 및 사이노 CD3 엡실론에 각각 67 및 107 nM 친화도로 결합한다. hCD3 엡실론 및 cCD3 엡실론 면역글로불린에 대한 서열은 표 20에 제시되어 있다.
Figure pct00031
Figure pct00032
CRTH2R 과다면역 면역글로불린 라이브러리가 생성되었다. 간단히 설명하면, 관심 표적을 안정적으로 과다발현하는 세포에 대해 5 라운드의 세포 기반 선택을 수행하였다. 108개의 세포가 각각의 선택 라운드에서 사용되었다. 표적 발현 세포에 대해 선택을 수행하기 전에, 각각의 라운드의 파지가 먼저 108개의 CHO 배경 세포에서 고갈되었다. 후속 선택 라운드에서 세척 횟수를 늘려 선택의 엄격도를 높였다. 그런 다음, 트립신을 사용하여 파지로부터 세포를 용출하고, 다음 라운드의 패닝을 위해 파지를 증폭하였다.
CRTH2R 면역글로불린을 PGD2-유도 cAMP의 결합 친화도 및 알로스테리 조절자 기능에 대해 평가하였다. 도 30a-30f에 도시된 바와 같이, 3개의 특이적 CRTH2R 면역글로불린이 hCRTH2R에 대한 나노몰 미만 내지 한 자릿수 나노몰의 세포 결합 친화도를 갖는 것으로 확인되었고, 알로스테리 cAMP 검정에서 억제 활성을 나타내었다. 3개의 CRTH2R 면역글로불린 CRTH2-48-3, CRTH2-48-21 및 CRTH2-48-27에 대한 서열은 표 21에서 볼 수 있다.
Figure pct00033
실시예 15. A2A 수용체에 대한 과다면역 면역글로불린 라이브러리
실시예 4 및 14에 기재된 방법과 유사한 방법을 사용하여 과다면역 면역글로불린(IgG) 라이브러리를 생성하였다. 간단히 설명하면, 과다면역 IgG 라이브러리는 3명의 건강한 기증자 각각으로부터의 3,700만 개 초과의 특유한 IgH 서열로 이루어진 인간 나이브 및 기억 B-세포의 데이터베이스에 대한 분석으로부터 생성되었다. 2백만 개 초과의 CDRH3 서열이 분석으로부터 수집되었고, 실시예 1-3과 유사한 방법을 사용하여 개별적으로 구축되었다. CDRH3 서열을 실시예 4에 기재된 VHH hShuffle 라이브러리 내로 통합하였다. 최종 라이브러리 다양성은 1.3 x 1010으로 결정되었다.
88개의 특유한 클론 중 73개가 모 세포에 비해 2배의 표적 세포 MFI 값을 가졌다. 88개의 특유한 클론 중 15개는 모 세포에 비해 20배의 표적 세포 MFI 값을 가졌다. 아데노신 A2A 수용체 변이체 A2AR-90-007에 대한 데이터는 도 31a-31b에서 볼 수 있다.
이 실시예는 나노몰 미만 범위에서 높은 친화도 및 KD 값을 갖는, A2AR에 대한 VHH 라이브러리의 생성을 보여준다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에서 제시되고 설명되었지만, 그러한 실시양태는 단지 예로서 제공된다는 것이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 본 개시내용을 벗어나지 않으면서 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 가능할 것이다. 본 명세서에서 설명되는 본 개시내용의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 개시내용을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해하여야 한다. 다음 청구범위가 본 개시내용의 범위를 정의하고, 이러한 청구범위 및 이들의 균등물의 범위 내의 방법 및 구조가 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.
SEQUENCE LISTING <110> TWIST BIOSCIENCE CORPORATION <120> VARIANT NUCLEIC ACID LIBRARIES FOR SINGLE DOMAIN ANTIBODIES <130> 44854-795.601 <140> PCT/US2020/052306 <141> 2020-09-23 <150> 62/945,761 <151> 2019-12-09 <150> 62/935,603 <151> 2019-11-14 <150> 62/904,620 <151> 2019-09-23 <160> 170 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 167 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Glu Tyr 20 25 30 Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Asn Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asn Gln His Phe Gly Pro Val Ala Gly Gly Ala Thr Pro 100 105 110 Ser Glu Glu Pro Gly Ser Gln Leu 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Gly Ile Ile Pro Ile Ser Gly Thr Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asn Gln His Phe Thr Arg Ile Phe Gly Asn Tyr Gln Ile 100 105 110 Tyr Phe Gly His Phe Gly Tyr His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly 115 120 125 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 11 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 11 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Leu Ser Trp Val Arg Lys Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Thr Ile Pro Ile Phe Gly Thr Val Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg 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Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys His 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Phe Ile Ser Tyr Glu Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Met Tyr Tyr Asp Phe His Tyr Ser Thr Val Gly Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Tyr Tyr Leu Gly Ser Glu Thr Glu Val Val Pro Ala Asp Asp 115 120 125 Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 15 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 15 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Thr Tyr 20 25 30 Ala Ile Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu 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Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 19 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Lys Asn Tyr 20 25 30 Ala Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Ile Ile Pro Lys Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Asn Gln His Phe Ser Ala Val Arg Gly Leu Ala Phe Gly 100 105 110 Tyr Gly Tyr Arg Ile Gly Gly Tyr His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 20 <211> 139 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 20 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asn His 20 25 30 Ala Ile 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Synthetic polypeptide <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Pro Thr Phe Asp Thr Tyr 20 25 30 Val Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Ala Ile Ser Met Ser Gly Asp Asp Thr Ala Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Asp Leu Arg Gly Arg Gly Asp Val Ser Glu Tyr Glu Tyr Asp 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 24 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Lys Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asp Asp Glu Arg Pro Ser Gly Ile 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110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 30 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Lys Asn 20 25 30 Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Asp Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln 65 70 75 80 Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Thr Ser Leu 85 90 95 Thr Ser Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 31 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 31 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Asn Asp Val Gly Ala Tyr 20 25 30 Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp 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of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 33 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr 20 25 30 Glu Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Gly Val Ser Arg Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu 65 70 75 80 Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ser Tyr Thr Ser Ser 85 90 95 Ser Thr Pro Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu 100 105 110 <210> 34 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 34 Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln 1 5 10 15 Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Ile Gly Gly Tyr 20 25 30 Asn Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 35 40 45 Met Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Gln Gly Val Ser Asn Arg Phe 50 55 60 Ser 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Sequence: Synthetic polypeptide <400> 51 Cys Ala Arg Asp Met Tyr Tyr Asp Phe Trp Leu Gly Asp Gln Ser Thr 1 5 10 15 Gly Ser Leu Ile Gly Ala Glu Val Val Pro Ala Asp Asp Ala Phe Asp 20 25 30 Ile Trp <210> 52 <211> 42 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 52 Cys Ala Arg Asp Met Tyr Tyr Asp Phe Ala Ala Gly Leu Glu Gly Thr 1 5 10 15 Ile Thr Glu Val Phe Asp Glu Glu Gly His Gln Gly Gly Thr Glu Val 20 25 30 Val Pro Ala Asp Asp Ala Phe Asp Ile Trp 35 40 <210> 53 <211> 34 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 53 Cys Ala Arg Asp Met Tyr Tyr Asp Phe Gly Ser Ile Tyr Gly Glu Asp 1 5 10 15 Val Val Gly Glu Leu Pro Glu Val Val Pro Ala Asp Asp Ala Phe Asp 20 25 30 Ile Trp <210> 54 <211> 48 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 54 Cys Ala Arg Asp Gly Arg Gly Ser Leu Pro Arg Pro Lys Gly 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Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Tyr Ser 85 90 95 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 144 <211> 107 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or cynomolgus monkey sequence <400> 144 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Asp Arg Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gly Ala Leu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 145 <211> 107 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Description of Unknown: Human or cynomolgus monkey sequence <400> 145 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Thr Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 146 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 146 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe Arg Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Asn Phe Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Val Arg Trp Gly Pro Arg Asn Asp Asp Arg Tyr Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 147 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 147 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Phe Phe Ser Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val 35 40 45 Ala Gly Ile Thr Arg Ser Gly Val Ser Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala His Arg Ile Val Val Gly Gly Thr Ser Val Gly Asp Trp Arg 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 148 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 148 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Phe His Ile Asn 20 25 30 Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val 35 40 45 Ala Ala Ile Asn Asn Phe Gly Thr Thr Lys Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asn Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr Leu 65 70 75 80 Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Ala Val Arg Trp Gly Pro Arg Asn Asp Asp Arg Tyr Asp Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 149 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 149 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Asp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 150 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 150 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Thr Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Leu Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 151 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 151 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Tyr 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Arg Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 152 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 152 Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 153 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 153 Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala 1 5 <210> 154 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 154 Cys Ala Arg Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 155 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 155 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala 1 5 <210> 156 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 156 Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr 1 5 <210> 157 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 157 Cys Ala Lys Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Phe Asp Tyr Trp 1 5 10 15 <210> 158 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 158 Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 1 5 <210> 159 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 159 Ala Ala Ser 1 <210> 160 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 160 Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn Thr Phe 1 5 10 <210> 161 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 161 Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr 1 5 <210> 162 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 162 Gly Ala Ser 1 <210> 163 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 163 Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Asn Thr Phe 1 5 10 <210> 164 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <220> <221> modified_base <222> (51)..(52) <223> Thymidine-succinyl hexamide CED phosphoramidite <400> 164 agacaatcaa ccatttgggg tggacagcct tgacctctag acttcggcat tttttttttt 60 tt 62 <210> 165 <211> 112 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <220> <221> modified_base <222> (101)..(102) <223> Thymidine-succinyl hexamide CED phosphoramidite <400> 165 cgggatcctt atcgtcatcg tcgtacagat cccgacccat ttgctgtcca ccagtcatgc 60 tagccatacc atgatgatga tgatgatgag aaccccgcat tttttttttt tt 112 <210> 166 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 166 atgcggggtt ctcatcatc 19 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic primer <400> 167 cgggatcctt atcgtcatcg 20 <210> 168 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Arg, Phe, Ser or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Thr or Ile <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Phe or Leu <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ser, Arg or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (6)..(6) <223> Ser, Thr, Asp, Ile or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Tyr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Ala, Gly, Thr or Val <400> 168 Gly Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Met 1 5 <210> 169 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Phe, Leu, Trp or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Ala or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(5) <223> Ala, Gly, Ser or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (7)..(7) <223> Ser, Thr or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (8)..(8) <223> Trp, Ser, Arg, Thr or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (9)..(9) <223> Ser, Gly, Asn or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (10)..(10) <223> Gly, Ser or Asp <220> <221> MOD_RES <222> (11)..(11) <223> Gly, Ser, Thr, Asp, Ala or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (12)..(12) <223> Gly, Ser, Thr, Asp or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (14)..(14) <223> Tyr, Asn, Ser or Asp <400> 169 Glu Xaa Val Xaa Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr Xaa Tyr 1 5 10 15 <210> 170 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <220> <221> MOD_RES <222> (2)..(2) <223> Ala, Thr or Val <220> <221> MOD_RES <222> (3)..(3) <223> Asp, Gly, Arg, Ala, Ser, Val, Asn or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (4)..(4) <223> Arg, Pro, Ser, Gly, Ala, Thr, Leu or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (5)..(17) <223> Any amino acid except Cys or Met <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(17) <223> This region may encompass 0-13 residues <220> <221> MOD_RES <222> (18)..(18) <223> Ser, Arg, Gly, Tyr, Ala, Thr, Asp or Asn <220> <221> MOD_RES <222> (19)..(19) <223> Glu, Asp, Gly, Ser, Arg, Ala, Asn or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (20)..(20) <223> Tyr, Phe or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (21)..(21) <223> Asp, Asn, Glu or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (22)..(22) <223> Tyr or Ser <400> 170 Ala Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Trp 20

Claims (51)

  1. 서열 번호 152 또는 155에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRH1, 서열 번호 153 또는 156에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRH2, 및 서열 번호 154 또는 157에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRH3을 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, 서열 번호 158 또는 161에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRL1, 서열 번호 159 또는 162에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRL2, 및 서열 번호 160 또는 163에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 CDRL3을 추가로 포함하는 항체 또는 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 암을 치료하는 방법.
  4. 제1항 또는 제2항의 항체 또는 항체 단편을 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하는 방법.
  5. 번역될 때 항체 또는 항체 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 서열을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서 복수의 서열의 각각의 서열은 중쇄의 가변 영역(VH) 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3 또는 경쇄의 가변 영역(VL) 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3을 코딩하는 변이체 서열을 포함하고; 라이브러리가 적어도 30,000개의 변이체 서열을 포함하고; 항체 또는 항체 단편이 100 nM 미만의 KD로 그의 항원에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  6. 제5항에 있어서, 항체가 단일 도메인 항체인 핵산 라이브러리.
  7. 제6항에 있어서, 단일 도메인 항체가 VHH 항체인 핵산 라이브러리.
  8. 제5항에 있어서, 항체가 TIGIT에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  9. 제5항에 있어서, 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 84-100에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  10. 제5항에 있어서, 번역될 때 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 101-117에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  11. 제5항에 있어서, 중쇄의 가변 영역 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이 서열 번호 67-83 또는 118-128 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  12. 제5항에 있어서, 경쇄의 가변 영역 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3이 서열 번호 129-137 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  13. 제5항에 있어서, 항체가 CD47에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  14. 제5항에 있어서, 항체가 CD3 엡실론에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  15. 제5항에 있어서, 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 138-141에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  16. 제5항에 있어서, 번역될 때 경쇄의 가변 영역이 서열 번호 142-145에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  17. 제5항에 있어서, 적어도 50,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리.
  18. 제5항에 있어서, 적어도 100,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리.
  19. 제5항에 있어서, 적어도 105개의 동일하지 않은 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리.
  20. 제5항에 있어서, 적어도 109개의 서열의 이론적 다양성을 갖는 핵산 라이브러리.
  21. 번역될 때 단일 도메인 항체를 코딩하는 핵산을 포함하는 복수의 서열을 포함하는 핵산 라이브러리로서, 여기서 복수의 서열의 각각의 서열은 중쇄의 가변 영역(VH) 상의 CDR1, CDR2, 또는 CDR3을 코딩하는 변이체 서열을 포함하고; 라이브러리가 적어도 30,000개의 변이체 서열을 포함하고; 항체 또는 항체 단편이 100 nM 미만의 KD로 그의 항원에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  22. 제21항에 있어서, 번역될 때 VH의 길이가 약 90 내지 약 100개의 아미노산인 핵산 라이브러리.
  23. 제21항에 있어서, 번역될 때 VH의 길이가 약 100 내지 약 400개의 아미노산인 핵산 라이브러리.
  24. 제21항에 있어서, VH의 길이가 약 270 내지 약 300개의 염기쌍인 핵산 라이브러리.
  25. 제21항에 있어서, VH의 길이가 약 300 내지 약 1200개의 염기쌍인 핵산 라이브러리.
  26. 제21항에 있어서, 단일 도메인 항체가 VHH 항체인 핵산 라이브러리.
  27. 제21항에 있어서, 항체가 TIGIT에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  28. 제21항에 있어서, CDR1, CDR2, 또는 CDR3이 서열 번호 67-83 또는 118-128 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  29. 제21항에 있어서, 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 84-100 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  30. 제21항에 있어서, 중쇄의 가변 영역 상의 CDR3이 서열 번호 101-117 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  31. 제21항에 있어서, 항체가 CD47에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  32. 제21항에 있어서, 항체가 CD3 엡실론에 결합하는 것인 핵산 라이브러리.
  33. 제21항에 있어서, 번역될 때 중쇄의 가변 영역이 서열 번호 138-141에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 핵산 라이브러리.
  34. 제21항에 있어서, 적어도 50,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리.
  35. 제21항에 있어서, 적어도 100,000개의 변이체 서열을 포함하는 핵산 라이브러리.
  36. 제21항에 있어서, 적어도 105개의 동일하지 않은 핵산을 포함하는 핵산 라이브러리.
  37. 제21항에 있어서, 적어도 109개의 서열의 이론적 다양성을 갖는 핵산 라이브러리.
  38. 단일 도메인 항체를 코딩하는 핵산 라이브러리를 생성하는 방법으로서,
    (a) i. 제1의 복수의 폴리뉴클레오타이드의 각각의 폴리뉴클레오타이드가 중쇄 상의 CDR1을 코딩하는 적어도 1000개의 변이체 서열을 코딩하는 것인 제1의 복수의 폴리뉴클레오타이드;
    ii. 제2의 복수의 폴리뉴클레오타이드의 각각의 폴리뉴클레오타이드가 중쇄 상의 CDR2를 코딩하는 적어도 1000개의 변이체 서열을 코딩하는 것인 제2의 복수의 폴리뉴클레오타이드;
    iii. 제3의 복수의 폴리뉴클레오타이드의 각각의 폴리뉴클레오타이드가 중쇄 상의 CDR3을 코딩하는 적어도 1000개의 변이체 서열을 코딩하는 것인 제3의 복수의 폴리뉴클레오타이드
    를 코딩하는 미리 결정된 서열을 제공하는 단계; 및
    (b) 제1의 복수의 폴리뉴클레오타이드, 제2의 복수의 폴리뉴클레오타이드 및 제3의 복수의 폴리뉴클레오타이드를 혼합하여 단일 도메인 항체를 코딩하는 변이체 핵산의 핵산 라이브러리를 형성하는 단계로서, 변이체 핵산의 적어도 약 70%는 100 nM 미만의 KD로 그의 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 것인 단계
    를 포함하는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 단일 도메인 항체가 하나의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 것인 방법.
  40. 제38항에 있어서, 단일 도메인 항체가 VHH 항체인 방법.
  41. 제38항에 있어서, 단일 도메인 항체가 TIGIT에 결합하는 것인 방법.
  42. 제38항에 있어서, 단일 도메인 항체가 서열 번호 84-100 또는 138-141 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열에 대해 적어도 약 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
  43. 제38항에 있어서, 단일 도메인 항체가 CD47에 결합하는 것인 방법.
  44. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 50,000개의 변이체 서열을 포함하는 것인 방법.
  45. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 100,000개의 변이체 서열을 포함하는 것인 방법.
  46. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 105개의 동일하지 않은 핵산을 포함하는 것인 방법.
  47. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 75 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 방법.
  48. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 50 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 방법.
  49. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 25 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 방법.
  50. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 10 nM 미만의 KD로 항원에 결합하는 단일 도메인 항체를 코딩하는 적어도 하나의 서열을 포함하는 것인 방법.
  51. 제38항에 있어서, 핵산 라이브러리가 적어도 109개의 서열의 이론적 다양성을 갖는 것인 방법.
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Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102160389B1 (ko) 2013-08-05 2020-09-28 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
US9981239B2 (en) 2015-04-21 2018-05-29 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
WO2017049231A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Twist Bioscience Corporation Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
CN113604546A (zh) 2015-09-22 2021-11-05 特韦斯特生物科学公司 用于核酸合成的柔性基底
EP3516528A4 (en) 2016-09-21 2020-06-24 Twist Bioscience Corporation NUCLEIC ACID BASED DATA STORAGE
CN110892485B (zh) 2017-02-22 2024-03-22 特韦斯特生物科学公司 基于核酸的数据存储
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
EP3638782A4 (en) 2017-06-12 2021-03-17 Twist Bioscience Corporation SEALLESS NUCLEIC ACID ASSEMBLY METHODS
EP3681906A4 (en) 2017-09-11 2021-06-09 Twist Bioscience Corporation GPCR-BINDING PROTEINS AND THEIR SYNTHESIS
KR20240024357A (ko) 2017-10-20 2024-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 폴리뉴클레오타이드 합성을 위한 가열된 나노웰
GB2590196A (en) 2018-05-18 2021-06-23 Twist Bioscience Corp Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
EP3938506A4 (en) 2019-02-26 2022-12-14 Twist Bioscience Corporation VARIANT NUCLEIC ACID LIBRARIES FOR OPTIMIZATION OF ANTIBODIES
EP3987019A4 (en) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation BARCODE-BASED NUCLEIC ACID SEQUENCE ARRANGEMENT
CA3155629A1 (en) * 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for crth2
CA3177030A1 (en) 2020-04-27 2021-11-04 Aaron Sato Variant nucleic acid libraries for coronavirus
TW202216778A (zh) 2020-07-15 2022-05-01 美商安進公司 Ｔｉｇｉｔ及ｃｄ１１２ｒ阻斷
WO2022086866A1 (en) 2020-10-19 2022-04-28 Twist Bioscience Corporation Methods of synthesizing oligonucleotides using tethered nucleotides
WO2022204316A2 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for cd3
US20230340461A1 (en) * 2022-02-14 2023-10-26 Twist Bioscience Corporation Combinatorial dna assembly for multispecific antibodies

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2010567A2 (en) * 2006-04-07 2009-01-07 The Government of the United States of America as Represented by The Department of Health and Human Services Antibody compositions and methods for treatment of neoplastic disease
JP2012508017A (ja) * 2008-11-07 2012-04-05 ファブラス エルエルシー 抗ｄｌｌ４抗体及びその使用
WO2010141249A2 (en) * 2009-06-02 2010-12-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-notch3 antibodies
MX2012001741A (es) * 2009-08-19 2012-03-21 Merck Patent Gmbh Anticuerpos para la deteccion de complejos de integrina en material incrustado en parafina fijado con formalina (ffpe).
JP2016517441A (ja) * 2013-03-15 2016-06-16 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗ＣＲＴｈ２抗体及び使用方法
WO2016076345A1 (ja) * 2014-11-11 2016-05-19 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ
US20180282721A1 (en) * 2017-03-15 2018-10-04 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized combinatorial nucleic acid libraries
RS61825B1 (sr) * 2018-01-26 2021-06-30 Regeneron Pharma Anti-tmprss2 antitela i fragmenti koji vezuju antigen
CA3155629A1 (en) * 2019-09-23 2021-04-01 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for crth2

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