JP2022548783A - 単一ドメイン抗体のバリアント核酸ライブラリー - Google Patents

単一ドメイン抗体のバリアント核酸ライブラリー Download PDF

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Abstract

本明細書で提供されるのは、単一ドメイン抗体を含む抗体をコードするバリアント核酸ライブラリーに関連する方法および組成物である。本明細書に記載される方法を使用して生成されるライブラリーは、改善された結合親和性を含む改善された特性を有する。本明細書に記載されるライブラリーは、各々少なくとも１つの所定の参照核酸配列の所定のバリアントをコードする核酸を含む多彩なライブラリーを含む。本明細書にさらに記載されるのは、核酸ライブラリーが翻訳されるときに生成されるタンパク質ライブラリーである。本明細書にさらに記載されるのは、本明細書に記載される多彩な核酸ライブラリーを発現する細胞ライブラリーである。【選択図】図２９Ｄ

Description

相互参照
本出願は、２０１９年９月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／９０４，６２０号、２０１９年１１月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／９３５，６０３号、および２０１９年１２月９日に出願された米国仮特許出願第６２／９４５，７６１号の利益を主張し、これらの各々は参照によりその全体が組み込まれる。
抗体は、生物学的標的に高い特異性および親和性で結合する能力を有する。しかし、免疫学的効果の効力とのバランスに起因して、治療用抗体の設計は困難である。ＶＨＨ抗体などの単一ドメイン抗体は、いくつかの有益な特性を有する。したがって、治療における使用のためのＶＨＨ抗体などの抗体の生成のための組成物および方法を開発する必要性が存在している。
参照による組み込み
本明細書において引用されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、各々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書に提供されるのは、配列番号１５２または１５５に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５３または１５６に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１５４または１５７に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む抗体または抗体フラグメントである。さらに本明細書に提供されるのは、配列番号１５８または１６１に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５９または１６２に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６０または１６３に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３をさらに含む、抗体または抗体フラグメントである。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、癌を治療する方法である。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、ウイルス感染を治療する方法である。
本明細書に提供されるのは、翻訳されたときに抗体または抗体フラグメントをコードする核酸を含む複数の配列を含む核酸ライブラリーであって、ここで、複数の配列の各配列は、重鎖（ＶＨ）の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３、または軽鎖（ＶＬ）の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３をコードするバリアント配列を含み、前記ライブラリーは、少なくとも３０，０００個のバリアント配列を含み、前記抗体または抗体フラグメントは、１００ｎＭ未満のＫＤでその抗原に結合する。さらに本明細書に提供されるのは、前記抗体が単一ドメイン抗体である核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記抗体がＴＩＧＩＴに結合する核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号８４－１００に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記軽鎖の可変領域が、配列番号１０１－１１７に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記重鎖の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、配列番号６７－８３または１１８－１２８のいずれか１つに記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記軽鎖の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、配列番号１２９－１３７のいずれか１つに記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記抗体がＣＤ４７に結合する核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記抗体がＣＤ３イプシロンに結合する核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号１３８－１４１に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記軽鎖の可変領域が、配列番号１４２－１４５に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも５０，０００個のバリアント配列を含む核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも１００，０００個のバリアント配列を含む核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも１０５個の同一でない核酸を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも１０９配列の理論的多様性を有する核酸ライブラリーである。
本明細書に提供されるのは、翻訳されたときに単一ドメイン抗体をコードする核酸を含む複数の配列を含む核酸ライブラリーであって、前記複数の配列の各配列は、重鎖（ＶＨ）の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードするバリアント配列を含み、ここで、前記ライブラリーは少なくとも３０，０００個のバリアント配列を含み、前記抗体または抗体フラグメントは、１００ｎＭ未満のＫＤでその抗原に結合する。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記ＶＨの長さが約９０～約１００アミノ酸である、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記ＶＨの長さが約１００～約４００アミノ酸である、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記ＶＨの長さが約２７０～約３００塩基対である、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記ＶＨの長さが約３００～約１２００塩基対である、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記抗体がＴＩＧＩＴに結合する、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、配列番号６７－８３または１１８－１２８のいずれか１つに記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号８４－１００のいずれか１つに記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記重鎖の可変領域上のＣＤＲ３が、配列番号１０１－１１７のいずれか１つに記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記抗体がＣＤ４７に結合する、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、前記抗体がＣＤ３イプシロンに結合する、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号１３８－１４１に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも５０，０００個のバリアント配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも１００，０００個のバリアント配列を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも１０５個の同一でない核酸を含む、核酸ライブラリーである。さらに本明細書に提供されるのは、少なくとも１０９配列の理論的多様性を有する、核酸ライブラリーである。
本明細書に提供されるのは、単一ドメイン抗体をコードする核酸ライブラリーを生成するための方法であって、前記方法は、（ａ）所定の配列を提供する工程であって、前記所定の配列は、ｉ．第１の複数のポリヌクレオチドであって、前記第１の複数のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは、重鎖上のＣＤＲ１をコードする少なくとも１０００個のバリアント配列をコードする、第１の複数のポリヌクレオチド、ｉｉ．第２の複数のポリヌクレオチドであって、前記第２の複数のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは、重鎖上のＣＤＲ２をコードする少なくとも１０００個のバリアント配列をコードする、第２の複数のポリヌクレオチド、ｉｉｉ．第３の複数のポリヌクレオチドであって、前記第３の複数のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは、重鎖上のＣＤＲ３をコードする少なくとも１０００個のバリアント配列をコードする、第３の複数のポリヌクレオチドをコードする、所定の配列を提供する工程、（ｂ）前記第１の複数のポリヌクレオチド、前記第２の複数のポリヌクレオチド、および前記第３の複数のポリヌクレオチドを混合して、単一ドメイン抗体をコードするバリアント核酸の核酸ライブラリーを形成する工程であって、前記バリアント核酸の少なくとも約７０％は、１００ｎＭ未満のＫＤでその抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする工程を含む。さらに本明細書に提供されるのは、前記単一ドメイン抗体が１つの重鎖可変ドメインを含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記単一ドメイン抗体がＴＩＧＩＴに結合する、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記単一ドメイン抗体が、配列番号８４－１００または１３８－１４１のいずれか１つに記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記単一ドメイン抗体がＣＤ４７に結合する、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが少なくとも５０，０００個のバリアント配列を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが少なくとも１００，０００個のバリアント配列を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが少なくとも１０５個の同一でない核酸を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが、７５ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが、５０ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが、２５ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが、１０ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、核酸ライブラリーを生成するための方法である。さらに本明細書に提供されるのは、前記核酸ライブラリーが、少なくとも１０９配列の理論的多様性を有する、核酸ライブラリーを生成するための方法である。
本明細書に開示されるような遺伝子合成のための例示的なプロセスワークフローを実証する工程の図を提示する。 コンピュータシステムの例を例証する。 コンピュータシステムのアーキテクチャを示すブロック図である。 複数のコンピュータシステム、複数の携帯電話および個人データアシスタント、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）を組み込むように構成されたネットワークを実証する図である。 共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピュータシステムのブロック図である。 図６－７は、ＶＨＨライブラリーのＴＩＧＩＴ親和性分布のグラフを示し、２０から４０００までの親和性閾値（図６）または２０から１０００までの親和性閾値（図７）のいずれかを示す。１４０個のＶＨＨバインダーのうち、５１個のバリアントは＜１００ｎＭであり、９０個のバリアントは＜２００ｎＭであった。 図６－７は、ＶＨＨライブラリーのＴＩＧＩＴ親和性分布のグラフを示し、２０から４０００までの親和性閾値（図６）または２０から１０００までの親和性閾値（図７）のいずれかを示す。１４０個のＶＨＨバインダーのうち、５１個のバリアントは＜１００ｎＭであり、９０個のバリアントは＜２００ｎＭであった。 「ＶＨＨライブラリー」、「ＶＨＨシャッフル」ライブラリー、および「ＶＨＨ ｈＳｈｗｈｌｅライブラリー」の長さあたりのＣＤＲ３カウントのグラフを示す。 ＴＩＧＩＴ ＶＨＨ ＦｃバインダーについてのＴＩＧＩＴ：ＣＤ１５５遮断アッセイのグラフを示す。ナノモル濃度（ｎＭ）単位のＴＩＧＩＴ ＶＨＨ Ｆｃバインダーの濃度は、ｘ軸上にあり、相対ＨＲＰシグナルはｙ軸上にある。 ＣＤ４７ ＶＨＨ ＦｃバインダーのＣＤ４７親和性分布のグラフを示す。「ＶＨＨ ｒａｔｉｏ」ライブラリー（水平バー）、「ＶＨＨ ｓｈｕｆｆｌｅ」ライブラリー（黒いバー）、および「ＶＨＨ ｈＳｈｕｆｆｌｅ」ライブラリー（点線のバー）の親和性閾値（一価ＫＤ）はｘ軸上にあり、カウントはｙ軸上にある。 ＣＤ４７ ＶＨＨ ＦｃバインダーについてのＣＤ４７－ＳＩＲＰアルファ阻害アッセイのグラフを示す。ナノモル濃度（ｎＭ）単位のＣＤ４７ ＶＨＨ Ｆｃバインダーの濃度はｘ軸上にあり、相対ＨＲＰ信号はｙ軸上にある。 図１２Ａ－１２Ｂは、ＦＡＣＳ分析のグラフ（図１２Ａ）、ならびにＧＬＰ１Ｒ－４３－７７の用量曲線および特異性のグラフ（図１２Ｂ）を示す。 図１２Ａ－１２Ｂは、ＦＡＣＳ分析のグラフ（図１２Ａ）、ならびにＧＬＰ１Ｒ－４３－７７の用量曲線および特異性のグラフ（図１２Ｂ）を示す。 図１３Ａ－１３Ｂは、ＦＡＣＳ分析のグラフ（図１３Ａ）、ならびにＣＲＴＨ２－４１－５１の用量曲線およびｃＡＭＰ活性（図１３Ｂ）のグラフを示す。 図１３Ａ－１３Ｂは、ＦＡＣＳ分析のグラフ（図１３Ａ）、ならびにＣＲＴＨ２－４１－５１の用量曲線およびｃＡＭＰ活性（図１３Ｂ）のグラフを示す。 図１４Ａ－１４Ｂは、ＣＲＴＨ２－４４－５９の用量曲線（図１４Ａ）およびＦＡＣＳ分析（図１４Ｂ）のグラフを示す。 図１４Ａ－１４Ｂは、ＣＲＴＨ２－４４－５９の用量曲線（図１４Ａ）およびＦＡＣＳ分析（図１４Ｂ）のグラフを示す。 図１５Ａ－１５Ｅは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）対、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－２４、ＣＲＴＨ２－２８、ＣＲＴＨ２－３９、ＣＲＴＨ２－１９、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－８、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－４５、ＣＲＴＨ２－３５、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－６６、ＣＲＴＨ２－５７、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－１５、ＣＲＴＨ２－２５、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－６０、およびＣＲＴＨ２－７０を使用するＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧによる８点タイトレーションによって測定された細胞結合のＦＡＣＳ分析プロットを示す。 図１５Ａ－１５Ｅは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）対、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－２４、ＣＲＴＨ２－２８、ＣＲＴＨ２－３９、ＣＲＴＨ２－１９、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－８、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－４５、ＣＲＴＨ２－３５、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－６６、ＣＲＴＨ２－５７、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－１５、ＣＲＴＨ２－２５、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－６０、およびＣＲＴＨ２－７０を使用するＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧによる８点タイトレーションによって測定された細胞結合のＦＡＣＳ分析プロットを示す。 図１５Ａ－１５Ｅは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）対、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－２４、ＣＲＴＨ２－２８、ＣＲＴＨ２－３９、ＣＲＴＨ２－１９、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－８、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－４５、ＣＲＴＨ２－３５、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－６６、ＣＲＴＨ２－５７、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－１５、ＣＲＴＨ２－２５、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－６０、およびＣＲＴＨ２－７０を使用するＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧによる８点タイトレーションによって測定された細胞結合のＦＡＣＳ分析プロットを示す。 図１５Ａ－１５Ｅは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）対、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－２４、ＣＲＴＨ２－２８、ＣＲＴＨ２－３９、ＣＲＴＨ２－１９、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－８、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－４５、ＣＲＴＨ２－３５、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－６６、ＣＲＴＨ２－５７、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－１５、ＣＲＴＨ２－２５、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－６０、およびＣＲＴＨ２－７０を使用するＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧによる８点タイトレーションによって測定された細胞結合のＦＡＣＳ分析プロットを示す。 図１５Ａ－１５Ｅは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）対、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－２４、ＣＲＴＨ２－２８、ＣＲＴＨ２－３９、ＣＲＴＨ２－１９、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－８、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－４５、ＣＲＴＨ２－３５、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－６６、ＣＲＴＨ２－５７、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－１５、ＣＲＴＨ２－２５、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－６０、およびＣＲＴＨ２－７０を使用するＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧによる８点タイトレーションによって測定された細胞結合のＦＡＣＳ分析プロットを示す。 １００ｎＭでのＣＲＴＨ２－２７結合を示す例示的なゲートドットプロットを示す。 １００ｎＭでのＣＲＴＨ２－２７結合を示す例示的なＡＰＣヒストグラムを示す。 コンパレーター抗体ｇＰＣＲ－５１を使用した前の図と同様の結合分析を示す。 コンパレーター抗体ｇＰＣＲ－５２を使用した前の図と同様の結合分析を示す。 ｃＡＭＰアッセイにおいて機能的効果を有する、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－３２、およびＣＲＴＨ２－４２とのＩｇＧ結合曲線を示す。 ｃＡＭＰアッセイにおいて機能的効果を有する、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－３２、およびＣＲＴＨ２－４２とのＩｇＧ結合曲線を示す。 ３００、１００、および３３ｎＭで試験されたすべての抗体にわたるＣＲＴＨ２Ｒ ｃＡＭＰアッセイの結果を示す。 ３３ｎＭで試験されたすべての抗体にわたるＣＲＴＨ２Ｒ ｃＡＭＰアッセイの結果を示す。 ５つのＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ（ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－３２、およびＣＲＴＨ２－４２）に見られる負のアロステリック効果を示す。 図２１Ａ－２１Ｃは、アロステリックモジュレーターの対照実験を示しており、コンパレーター抗体５２が正のアロステリックモジュレーターであることを示す。 図２１Ａ－２１Ｃは、アロステリックモジュレーターの対照実験を示しており、コンパレーター抗体５２が正のアロステリックモジュレーターであることを示す。 図２１Ａ－２１Ｃは、アロステリックモジュレーターの対照実験を示しており、コンパレーター抗体５２が正のアロステリックモジュレーターであることを示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧのβ－アレスチン動員アッセイにおけるＣＲＴＨ２Ｒの活性を示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧのβ－アレスチン動員アッセイにおけるＣＲＴＨ２Ｒの活性を示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧのβ－アレスチン動員アッセイにおけるＣＲＴＨ２Ｒの活性を示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧのβ－アレスチン動員アッセイにおけるＣＲＴＨ２Ｒの活性を示す。 本発明で生成されたライブラリーのスキーマを示す。 は、本明細書で生成されたファージディスプレイされた過免疫ライブラリーの設計のスキーマを示す。 図２５Ａ－２５Ｂは、次世代配列決定によって評価された、過免疫ライブラリーの重鎖ＣＤＲ長さ分布を示している。図２５Ａは、長さごとのＣＤＲ３カウントのグラフを示す。図２５Ｂは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の長さのグラフを示す。 図２５Ａ－２５Ｂは、次世代配列決定によって評価された、過免疫ライブラリーの重鎖ＣＤＲ長さ分布を示している。図２５Ａは、長さごとのＣＤＲ３カウントのグラフを示す。図２５Ｂは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の長さのグラフを示す。 可溶性タンパク質標的の選択のワークフローのスキーマを示す。 パンニングの第３ラウンドおよび第４ラウンド後のｈＴＩＧＩＴ ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 パンニングの第３ラウンドおよび第４ラウンド後のｈＴＩＧＩＴ ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 パンニングの第３ラウンドおよび第４ラウンド後のｈＴＩＧＩＴ ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 パンニングの第３ラウンドおよび第４ラウンド後のｈＴＩＧＩＴ ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 ＣＤＲＨ３の長さ、収量、およびｈＴＩＧＩＴ免疫グロブリンに対する親和性（ＫＤ）のスキーマを示す。 ＣＤＲＨ３の長さ、収量、およびｈＴＩＧＩＴ免疫グロブリンに対する親和性（ＫＤ）のスキーマを示す。 パニングの第４ラウンドおよび第５ラウンド後のヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 パニングの第４ラウンドおよび第５ラウンド後のヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 パニングの第４ラウンドおよび第５ラウンド後のヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 パニングの第４ラウンドおよび第５ラウンド後のヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）ＥＬＩＳＡからのデータのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 交差反応性ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンのグラフを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ３－Ｔ細胞上のヒトＣＤ３のタイトレーションのグラフを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ３－Ｔ細胞上のヒトＣＤ３のタイトレーションのグラフを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ３－Ｔ細胞上のヒトＣＤ３のタイトレーションのグラフを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ３－Ｔ細胞上のヒトＣＤ３のタイトレーションのグラフを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ３－Ｔ細胞上のヒトＣＤ３のタイトレーションのグラフを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ３－Ｔ細胞上のヒトＣＤ３のタイトレーションのグラフを示す。 ＣＤ８＋、ＣＤ３＋、およびＣＤ３－Ｔ細胞上のヒトＣＤ３のタイトレーションのグラフを示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ａ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｂ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｃ）についての結合親和性のグラフ、ならびにＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ｄ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｅ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｆ）についてのｃＡＭＰアッセイのグラフを示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ａ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｂ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｃ）についての結合親和性のグラフ、ならびにＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ｄ）、ＣＲＴＨＨ２－４８－２１（図３０Ｅ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｆ）についてのｃＡＭＰアッセイのグラフを示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ａ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｂ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｃ）についての結合親和性のグラフ、ならびにＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ｄ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｅ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｆ）についてのｃＡＭＰアッセイのグラフを示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ａ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｂ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｃ）についての結合親和性のグラフ、ならびにＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ｄ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｅ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｆ）についてのｃＡＭＰアッセイのグラフを示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ａ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｂ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｃ）についての結合親和性のグラフ、ならびにＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ｄ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｅ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｆ）についてのｃＡＭＰアッセイのグラフを示す。 ＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ａ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｂ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｃ）についての結合親和性のグラフ、ならびにＣＲＴＨ２－４８－０３（図３０Ｄ）、ＣＲＴＨ２－４８－２１（図３０Ｅ）、およびＣＲＴＨ２－４８－２７（図３０Ｆ）についてのｃＡＭＰアッセイのグラフを示す。 Ａ２ＡＲ－９０－００７の用量曲線（図３１Ａ）およびＦＡＣＳ分析（図３１Ｂ）のグラフを示す。 Ａ２ＡＲ－９０－００７の用量曲線（図３１Ａ）およびＦＡＣＳ分析（図３１Ｂ）のグラフを示す。
詳細な説明
本開示は、他に示されない限り、当業者の技術の範囲内である従来の分子生物学技術を使用する。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
定義
本開示を通して、様々な実施形態が範囲形式で提示される。範囲形式での記載は、単に便宜上および簡潔にするためのものであり、任意の実施形態の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではないことを理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、文脈で明確に別段の指示がない限り、すべての可能なサブ範囲と、その範囲内の下限の単位の１０分の１までの個々の数値を具体的に開示すと見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのサブ範囲およびその範囲内の個々の値（１．１、２、２．３、５、および５．９など）を具体的に開示すると見なされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。これらの介在する範囲の上限および下限は、独立して、より小さな範囲に含まれ得、これらはまた本開示にも含まれ、言及された範囲内の任意の具体的に除外された制限に供される。言及された範囲が制限の一方または両方を含む場合、文脈が明確に別段の指示をしない限り、それらの含まれる制限のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた本開示に含まれる。
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、任意の実施形態を限定することを意図するものではない。本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形も含むことを意図している。さらに、「含む」および／または「含むこと」という用語は、本明細書で使用される場合、言及される特徴、整数、工程、操作、要素、および／または構成要素の存在を指定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、構成要素、および／またはそれらの群の存在または追加を排除するものではないことが理解される。本明細書で使用される場合、「および／または」という用語は、関連する列挙された品目の１つ以上の任意のおよびすべての組み合わせを含む。
本明細書で使用される場合、具体的に述べられていないか、または文脈から明らかでない限り、数または数の範囲に関する「約」という用語は、言及された数およびその数＋／－１０％、または範囲について列挙されている値の列挙されている下限の１０％下と、列挙されている上限の１０％上を意味すると理解される。
特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、二本鎖または三本鎖核酸、ならびに一本鎖分子を包含する。二本鎖または三本鎖核酸では、核酸鎖は同一の広がりを有する必要はない（すなわち、二本鎖核酸は、両方の鎖の全長に沿って二本鎖である必要はない）。核酸配列は、提供される場合、特に明記されていない限り、５’’から３’の方向に記載されている。本明細書に記載の方法は、単離された核酸の生成を提供する。本明細書に記載の方法はさらに、単離および精製された核酸の生成を提供する。本明細書で言及される「核酸」は、少なくとも５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、またはそれ以上の塩基長を含み得る。さらに、本明細書に提供されるのは、非リボソームペプチド（ＮＲＰ）をコードする配列、非リボソームペプチドシンテターゼ（ＮＲＰＳ）モジュールおよび合成バリアントをコードする配列を含む、ヌクレオチド配列をコードする任意の数のポリペプチドセグメント、抗体などの他のモジュラータンパク質のポリペプチドセグメント、非コードＤＮＡまたはＲＮＡ、例えば、プロモーター、転写因子、エンハンサーなどの調節配列、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡに由来する核小体低分子ＲＮＡ、または関心対象の機能的または構造的ＤＮＡまたはＲＮＡ単位を含む他のタンパク質ファミリーからのポリペプチドセグメントの合成のための方法である。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子断片のコーディング領域または非コーディング領域、遺伝子間ＤＮＡ、連鎖分析から規定された遺伝子座（ｌｏｃｉ）（複数の遺伝子座（ｌｐｃｕｓ））、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ、リボザイム、通常はメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の逆転写によってまたは増幅によって得られる、ｍＲＮＡのＤＮＡ表現である相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）；合成または増幅によって生成されるＤＮＡ分子、ゲノムＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。本明細書で言及される遺伝子または遺伝子断片をコードするｃＤＮＡは、ゲノム等価配列中に介在するイントロン配列を伴わずに、エキソン配列をコードする少なくとも１つの領域を含み得る。
抗体ライブラリー
本明細書に提供されるのは、抗体を生成するための方法、組成物、およびシステムである。いくつかの場合において、抗体は単一ドメイン抗体である。抗体を最適化するための本明細書に記載の方法、組成物、およびシステムは、抗体配列の自然の多様性を反映する比率バリアントアプローチを含む。いくつかの場合において、最適化された抗体のライブラリーは、バリアント抗体配列を含む。いくつかの場合において、バリアントＣＤＲ領域を含むバリアント抗体配列が設計される。いくつかの場合において、バリアントＣＤＲ領域を含むバリアント抗体配列は、ラマ、ヒト化、またはキメラのフレームワークにおいて天然のＣＤＲ配列をシャッフルすることによって生成される。いくつかの場合において、そのようなライブラリーが合成され、発現ベクターにクローニングされ、翻訳産物（抗体）の活性が評価される。いくつかの場合において、配列の断片が合成され、続いて組み立てられる。いくつかの場合において、発現ベクターを使用して、ファージディスプレイなどの所望の抗体を表示および富化する。いくつかの場合において、ファージベクターはＦａｂファージミドベクターである。富化の間に使用される選択圧には、いくつかの場合において、結合親和性、毒性、免疫学的寛容、安定性、またはその他の要因が含まれる。そのような発現ベクターは、特定の特性を有する抗体が選択されることを可能にし（「パニング」）、そのような配列のその後の増殖または増幅は、これらの配列を有するライブラリーを富化する。パニングラウンドは、１、２、３、４、５、６、７ラウンド、または７ラウンド以上などの、任意の回数繰り返すことができる。いくつかの場合において、パニングの各ラウンドは多数回の洗浄を含む。いくつかの場合において、パンニングの各ラウンドには、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６回、または１６回を超える洗浄が含まれる。
本明細書に記載されているのは、インシリコライブラリー設計の方法およびシステムである。本明細書に記載のライブラリーは、いくつかの場合において、様々な抗体配列を含むデータベースに基づいて設計される。いくつかの場合において、データベースは、様々な標的に対する複数のバリアント抗体配列を含む。いくつかの場合において、データベースは、少なくとも１００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、または５０００を超える抗体配列を含む。例示的なデータベースは、ｉＣＡＮデータベースである。いくつかの場合において、データベースはナイーブおよび記憶Ｂ細胞受容体配列を含む。いくつかの場合において、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞受容体配列は、ヒト、マウス、または霊長類の配列である。いくつかの場合において、ナイーブおよび記憶Ｂ細胞受容体配列はヒト配列である。いくつかの場合において、データベースは位置特異的な変動について分析される。いくつかの場合において、本明細書に記載の抗体は、ＣＤＲ領域における位置特異的な変動を含む。いくつかの場合において、ＣＤＲ領域は変動のために複数の位置を含む。
本明細書に記載されているのは、ＣＤＲ領域のバリエーションを含むライブラリーである。いくつかの場合において、ＣＤＲは可変重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３である。いくつかの場合において、ＣＤＲは可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３である。いくつかの場合において、ライブラリーは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードする複数のバリアントを含む。いくつかの場合において、本明細書に記載のライブラリーは、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１２００、１５００、１７００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００個、または５０００個より多くのＣＤＲ１配列をコードする。いくつかの場合において、本明細書に記載のライブラリーは、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１２００、１５００、１７００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００個、または５０００個より多くのＣＤＲ２配列をコードする。いくつかの場合において、本明細書に記載のライブラリは、少なくとも５０、１００、２００、３００、４００、５００、１０００、１２００、１５００、１７００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００個、または５０００個より多くのＣＤＲ３配列をコードする。インシリコ抗体ライブラリーは、いくつかの場合において、合成され、組み立てられ、所望の配列に富化される。
ＣＤＲ１バリアント、ＣＤＲ２バリアント、およびＣＤＲ３バリアントの合成に続いて、いくつかの場合において、ＣＤＲ１バリアント、ＣＤＲ２バリアント、およびＣＤＲ３バリアントは、多様なライブラリーを生成するためにシャッフルされる。いくつかの場合において、本明細書に記載の方法によって生成されるライブラリーの多様性は、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、または１０１８より多くの配列の理論的多様性を有する。いくつかの場合において、ライブラリーは、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、または１０１８より多くの配列の最終的なライブラリー多様性を有する。
バリアント配列に対応する生殖系列配列もまた、ライブラリー中で配列を生成するように改変され得る。例えば、本明細書に記載の方法によって生成された配列は、生殖細胞系列の配列から、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１６より多くの変異を含む。いくつかの場合において、生成された配列は、生殖細胞系列配列から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または１８以下の変異を含む。いくつかの場合において、生成された配列は、生殖細胞系列配列に対して、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、または約１８の変異を含む。
抗体ライブラリー
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法から生成されたライブラリーである。本明細書に記載の抗体は、改善された機能的活性、構造的安定性、発現、特異性、またはそれらの組み合わせをもたらす。いくつかの場合において、抗体は単一ドメイン抗体であるす。いくつかの場合において、単一ドメイン抗体は、１つの重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、単一ドメイン抗体はＶＨＨ抗体である。
本明細書で使用される場合、抗体という用語は、典型的な抗体分子の特徴的な二腕のＹ字型、ならびに抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上のフラグメントを有するタンパク質を含むと理解される。例示的な抗体には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二重特異性抗体、多重特異性抗体、グラフト化抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、合成抗体、キメラ抗体、ラクダ化抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（ＶＬおよびＶＨ領域が対となって単鎖ＦａｂおよびｓｃＦａｂを含む一価分子を形成する、単一のタンパク質鎖としてフラグメントを作ることを可能にする、合成または天然リンカーによる組換え法を使用してＶＬとＶＨが結合されるフラグメントを含む）、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨ１ドメインを含む一価フラグメントを含む）、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント）、Ｆｄフラグメント（ＶＨおよびＣＨ１フラグメントを含むフラグメントを含む）、Ｆｖフラグメント（抗体のシングルアームのＶＬおよびＶＨドメインを含むフラグメントを含む）、単一ドメイン抗体（ｄＡｂまたはｓｄＡｂ）（ＶＨドメインを含むフラグメントを含む）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ダイアボディ（互いに結合し、２つの異なる抗原を認識する２つのＶＬおよびＶＨドメインなどの二価二量体を含むフラグメントを含む）、単一の単量体可変ドメインのみから構成されるフラグメント、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、イントラボディ、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、またはそれらのａｂ抗原結合フラグメントが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、本明細書に開示されるライブラリーは、抗体をコードする核酸を含み、抗体は、完全な抗原認識および抗原結合部位を含む最小の抗体フラグメントから構成されるＦｖ抗体を含むＦｖ抗体である。いくつかの実施形態において、Ｆｖ抗体は、緊密な非共有結合的結合における１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、各可変ドメインの３つの超可変領域は、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位を規定するように相互作用する。いくつかの実施形態において、６つの超可変領域は、抗体に抗原結合特異性を付与する。いくつかの実施形態において、単一可変ドメイン（または、ＶＨＨ抗体もしくはナノボディなどの１つの重鎖の可変ドメインを含むラクダ動物から単離された単一ドメイン抗体を含む、抗原に特異的な３つの超可変領域のみを含むＦｖの半分）は、抗原を認識および結合する能力を有する。いくつかの場合において、本明細書に開示されるライブラリーは、抗体をコードする核酸を含み、抗体は、ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨドメインとＶＬドメインの両方を含む抗体フラグメントを含む単鎖ＦｖまたはｓｃＦｖであり、両方のドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態において、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、ｓｃＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にする。いくつかの場合において、ｓｃＦｖがＦｃフラグメントに連結されているか、またはＶＨＨがＦｃフラグメント（ミニボディを含む）に連結されている。いくつかの場合において、抗体は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性なフラグメント、例えば、抗原結合部位を含む分子を含む。免疫グロブリン分子は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ １、ＩｇＧ ２、ＩｇＧ ３、ＩｇＧ ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスである。
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、意図された治療標的の種に適合された免疫グロブリンを含む。一般に、これらの方法は「哺乳動物化」を含み、ドナー抗原結合情報を免疫原性のより低い哺乳動物抗体受容体に伝達して有用な治療的処置を生成するための方法を含む。いくつかの場合において、哺乳動物は、マウス、ラット、ウマ、ヒツジ、ウシ、霊長類（例えば、チンパンジー、ヒヒ、ゴリラ、オランウータン、サル）、イヌ、ネコ、ブタ、ロバ、ウサギ、およびヒトである。いくつかの場合において、本明細書に提供されるのは、抗体のネコ化およびイヌ化のためのライブラリーおよび方法である。
非ヒト抗体の「ヒト化」型は、非ヒト抗体に由来する最小の配列を含むキメラ抗体であり得る。ヒト化抗体は、一般に、１つ以上のＣＤＲからの残基が非ヒト抗体（ドナー抗体）の１つ以上のＣＤＲからの残基によって置き換えられているヒト抗体（レシピエント抗体）である。ドナー抗体は、所望の特異性、親和性、または生物学的効果を有する、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、または非ヒト霊長類抗体などの任意の適切な非ヒト抗体であり得る。いくつかの場合において、レシピエント抗体の選択されたフレームワーク領域残基が、ドナー抗体からの対応するフレームワーク領域残基によって置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体またはドナー抗体のいずれにも見出されない残基も含み得る。いくつかの場合において、これらの変更は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。
「イヌ化」は、イヌの治療薬として有用な治療剤を生成するために、非イヌ抗原結合情報をドナー抗体から、より免疫原性の低いイヌ抗体アクセプターに移すための方法を含むことができる。いくつかの場合において、本明細書で提供される非イヌ抗体のイヌ化型は、非イヌ抗体に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。いくつかの場合において、イヌ化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、サメ、非ヒト霊長類、ヒト、ヒト化、組換え配列、または所望の特性を有する操作された配列などの非イヌ種（「ドナー」抗体）からの超可変領域残基によって置き換えられているイヌ抗体配列（「アクセプター」または「レシピエント」抗体）である。いくつかの場合において、イヌ抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非イヌＦＲ残基によって置き換えられる。いくつかの場合において、イヌ化抗体には、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基が含まれる。いくつかの場合において、これらの変更は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。イヌ化抗体はまた、イヌ抗体の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。
「ネコ化」は、ネコの治療薬として有用な治療剤を生成するために、非ネコ抗原結合情報をドナー抗体から、より免疫原性の低いネコ抗体アクセプターに移すための方法を含むことができる。いくつかの場合において、本明細書で提供される非ネコ抗体のネコ化型は、非ネコ抗体に由来する最小限の配列を含むキメラ抗体である。いくつかの場合において、ネコ化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ニワトリ、ウシ、ウマ、ラマ、ラクダ、ヒトコブラクダ、サメ、非ヒト霊長類、ヒト、ヒト化、組換え配列、または所望の特性を有する操作された配列などの非ネコ種（「ドナー」抗体）からの超可変領域残基によって置き換えられているネコ抗体配列（「アクセプター」または「レシピエント」抗体）である。いくつかの場合において、ネコ抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）残基が、対応する非ネコＦＲ残基によって置き換えられる。いくつかの場合において、ネコ化抗体には、レシピエント抗体またはドナー抗体には見出されない残基が含まれる。いくつかの場合において、これらの変更は、抗体の性能をさらに向上させるために行われる。ネコ化抗体はまた、ネコ抗体の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部を含み得る。
本明細書で提供される方法は、非免疫グロブリンをコードするライブラリーの生成のために使用され得る。いくつかの場合において、抗体ライブラリーは抗体模倣物を含む。例示的な抗体模倣物には、アンチカリン、アフィリン、アフィボディ分子、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アビマー、アトリマー、ＤＡＲＰイン、フィノマー、Ｋｕｎｉｔｚドメインベースのタンパク質、モノボディ、アンチカリン、ノッチン、アルマジロリピートタンパク質ベースのタンパク質、および二環式ペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
抗体をコードする核酸を含む本明細書に記載のライブラリーは、抗体の少なくとも１つの領域のバリエーションを含む。バリエーションのための抗体の例示的な領域には、相補性決定領域（ＣＤＲ）、可変ドメイン、または定常ドメインが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ＣＤＲは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３である。いくつかの場合において、ＣＤＲは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含むがこれらに限定されない重鎖ドメインである。いくつかの場合において、ＣＤＲは、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含むがこれらに限定されない軽鎖ドメインである。いくつかの場合において、可変ドメインは、可変ドメイン、軽鎖（ＶＬ）または可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）である。いくつかの場合において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３は、可変ドメイン、軽鎖（ＶＬ）である。可変ドメイン、軽鎖（ＶＬ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３は、それぞれＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、またはＣＤＲＬ３と称され得る。可変ドメイン、重鎖（ＶＨ）のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３は、それぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、またはＣＤＲＨ３と称され得る。いくつかの場合において、ＶＬドメインはカッパ鎖またはラムダ鎖を含む。いくつかの場合において、定常ドメインは、定常ドメイン、軽鎖（ＣＬ）または定常ドメイン、重鎖（ＣＨ）である。
本明細書に提供されるのは、抗体の少なくとも１つの領域におけるバリエーションを含む抗体をコードする核酸を含むライブラリーであり、その領域はＣＤＲ領域である。いくつかの場合において、抗体は、ＶＨＨ抗体などの１つの重鎖可変ドメインを含む単一ドメイン抗体である。いくつかの場合において、ＶＨＨ抗体は１つ以上のＣＤＲ領域のバリエーションを含む。いくつかの場合において、本明細書に記載のＶＨＨライブラリーは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２０００、２４００、２６００、２８００、３０００の配列、または３０００を超える配列を含む。例えば、ライブラリーは、ＣＤＲ１の少なくとも２０００の配列、ＣＤＲ２の少なくとも１２００の配列、およびＣＤＲ３の少なくとも１６００の配列を含む。いくつかの場合において、各配列は同一ではない。
本明細書に記載のライブラリーは、翻訳されたとき、様々な長さのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはこれらのアミノ酸の組み合わせを含み得る。いくつかの場合において、翻訳されたときのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはそれらのアミノ酸の組み合わせの長さは、少なくともまたは約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸、または３０を超えるアミノ酸である。
本明細書に記載のバリアントＣＤＲ配列を有する抗体をコードする核酸を含むライブラリーは、翻訳されたときに、様々な長さのアミノ酸を含む。いくつかの場合において、アミノ酸フラグメントのそれぞれの長さまたは合成されたアミノ酸の平均長さは、少なくともまたは約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０アミノ酸、または１５０を超えるアミノ酸であり得る。いくつかの場合において、アミノ酸の長さは、約１５～１５０、２０～１４５、２５～１４０、３０～１３５、３５～１３０、４０～１２５、４５～１２０、５０～１１５、５５～１１０、６０～１１０、６５～１０５、７０～１００、または７５～９５アミノ酸である。いくつかの場合において、アミノ酸の長さは約２２アミノ酸～約７５アミノ酸である。いくつかの場合において、抗体は、少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００アミノ酸、または５０００を超えるアミノ酸を含む。いくつかの場合において、ライブラリーはＶＨＨライブラリーである。いくつかの場合において、ライブラリーは抗体ライブラリーである。
ＶＨＨ抗体をコードする本明細書に記載のライブラリーは、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個の配列、または１０１８個を超える配列の理論的多様性を有するライブラリーを生成するためにシャッフルされるバリアントＣＤＲ配列を含む。いくつかの場合において、ライブラリーは、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個の配列、または１０１８個を超える配列の最終的なライブラリー多様性を有する。
抗体または免疫グロブリンをコードする本明細書に記載のライブラリーは、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個の配列、または１０１８個を超える配列の理論的多様性を有するライブラリーを生成するためにシャッフルされるバリアントＣＤＲ配列を含む。いくつかの場合において、ライブラリーは、少なくともまたは約１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８個の配列、または１０１８個を超える配列の最終的なライブラリー多様性を有する。
本明細書に記載の方法は、抗体または免疫グロブリンをコードする核酸を含むライブラリーの合成を提供し、ここで、各核酸は、少なくとも１つの所定の参照核酸配列の所定のバリアントをコードする。いくつかの場合において、所定の参照配列は、タンパク質をコードする核酸配列であり、バリアントライブラリーは、少なくとも単一のコドンのバリエーションをコードする配列を含み、その結果、合成された核酸によってコードされる後続のタンパク質における単一残基の複数の異なるバリアントが、標準的な翻訳プロセスによって生成される。いくつかの場合において、抗体ライブラリーは、複数の位置でバリエーションを集合的にコードする様々な核酸を含む。いくつかの場合において、バリアントライブラリーは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＶＬ、またはＶＨドメインの少なくとも単一のコドンのバリエーションをコードする配列を含む。いくつかの場合において、バリアントライブラリーは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＶＬ、またはＶＨドメインの複数のコドンのバリエーションをコードする配列を含む。いくつかの場合において、バリアントライブラリーは、フレームワークエレメント１（ＦＷ１）、フレームワークエレメント２（ＦＷ２）、フレームワークエレメント３（ＦＷ３）、またはフレームワークエレメント４（ＦＷ４）の複数のコドンのバリエーションをコードする配列を含む。バリエーションのための例示的な数のコドンには、少なくともまたは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２２５、２５０、２７５、３００、または３００を超えるコドンが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの場合において、バリエーションのための抗体の少なくとも１つの領域は、重鎖Ｖ遺伝子ファミリー、重鎖Ｄ遺伝子ファミリー、重鎖Ｊ遺伝子ファミリー、軽鎖Ｖ遺伝子ファミリー、または軽鎖Ｊ遺伝子ファミリーに由来する。いくつかの場合において、軽鎖Ｖ遺伝子ファミリーは、免疫グロブリンカッパ（ＩＧＫ）遺伝子または免疫グロブリンラムダ（ＩＧＬ）を含む。
本明細書に提供されるのは、抗体をコードする核酸を含むライブラリーであり、ライブラリーは、様々な数のフラグメントで合成される。いくつかの場合において、フラグメントは、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＶＬ、またはＶＨドメインを含む。いくつかの場合において、フラグメントは、フレームワークエレメント１（ＦＷ１）、フレームワークエレメント２（ＦＷ２）、フレームワークエレメント３（ＦＷ３）、またはフレームワークエレメント４（ＦＷ４）を含む。いくつかの場合において、抗体ライブラリーは、少なくともまたは約２つのフラグメント、３つのフラグメント、４つのフラグメント、５つのフラグメント、または５つを超えるフラグメントで合成される。合成された核酸フラグメントのそれぞれの長さまたは平均長さは、少なくともまたは約５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、５２５、５５０、５７５、６００、または６００を超える塩基対であり得る。いくつかの場合において、長さは、約５０～６００、７５～５７５、１００～５５０、１２５～５２５、１５０～５００、１７５～４７５、２００～４５０、２２５～４２５、２５０～４００、２７５～３７５、または３００～３５０塩基対である。
本明細書に記載の抗体または免疫グロブリンをコードする核酸を含むライブラリーは、翻訳されたときに様々な長さのアミノ酸を含む。いくつかの場合において、合成されるアミノ酸フラグメントのそれぞれの長さまたは平均長さは、少なくともまたは約１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０アミノ酸、または１５０を超えるアミノ酸であり得る。いくつかの場合において、アミノ酸の長さは、約１５～１５０、２０～１４５、２５～１４０、３０～１３５、３５～１３０、４０～１２５、４５～１２０、５０～１１５、５５～１１０、６０～１１０、６５～１０５、７０～１００、または７５～９５アミノ酸である。いくつかの場合において、アミノ酸の長さは約２２アミノ酸から約７５アミノ酸である。いくつかの場合において、抗体は、少なくともまたは約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００アミノ酸、または５０００を超えるアミノ酸を含む。
バリエーションのための抗体の少なくとも１つの領域の多数のバリアント配列は、本明細書に記載の方法を使用してデノボ合成される。いくつかの場合において、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＶＬ、ＶＨ、またはそれらの組み合わせに対して、多数のバリアント配列がデノボ合成される。いくつかの場合において、フレームワークエレメント１（ＦＷ１）、フレームワークエレメント２（ＦＷ２）、フレームワークエレメント３（ＦＷ３）、またはフレームワークエレメント４（ＦＷ４）に対して、多数のバリアント配列がデノボ合成される。バリアント配列の数は、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、または５００を超える配列であり得る。いくつかの場合において、バリアント配列の数は、少なくともまたは約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、または８０００を超える配列である。いくつかの場合において、バリアント配列の数は、約１０～５００、２５～４７５、５０～４５０、７５～４２５、１００～４００、１２５～３７５、１５０～３５０、１７５～３２５、２００～３００、２２５～３７５、２５０～３５０、または２７５～３２５配列である。
抗体の少なくとも１つの領域のバリアント配列は、いくつかの場合において、長さまたは配列が変動する。いくつかの場合において、デノボ合成される少なくとも１つの領域は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＶＬ、ＶＨ、またはそれらの組み合わせのためのものである。いくつかの場合において、デノボ合成される少なくとも１つの領域は、フレームワークエレメント１（ＦＷ１）、フレームワークエレメント２（ＦＷ２）、フレームワークエレメント３（ＦＷ３）、またはフレームワークエレメント４（ＦＷ４）のためのものである。いくつかの場合において、バリアント配列は、野生型と比較して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、または５０を超えるバリアントヌクレオチドまたはアミノ酸を含む。いくつかの場合において、バリアント配列は、野生型と比較して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を含む。いくつかの場合において、バリアント配列は、野生型と比較して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０少ないヌクレオチドまたはアミノ酸を含む。いくつかの場合において、ライブラリーは、少なくともまたは約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１０を超えるバリアントを含む。
抗体ライブラリーの合成に続いて、抗体ライブラリーをスクリーニングおよび分析のために使用し得る。例えば、抗体ライブラリーは、ライブラリーの表示可能性およびパニングについてアッセイされる。いくつかの場合において、表示可能性は選択可能なタグを使用して分析される。例示的なタグには、放射性標識、蛍光標識、酵素、化学発光タグ、比色定量タグ、親和性タグ、または当該技術分野で知られている他の標識またはタグが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、タグはヒスチジン、ポリヒスチジン、ｍｙｃ、血球凝集素（ＨＡ）、またはＦＬＡＧである。例えば、図２Ｂに見られ得るようなものである。いくつかの場合において、抗体ライブラリーは、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）配列決定、Ｐｏｌｏｎｙ配列決定、ライゲーションによる配列決定、リバーシブルターミネーター配列決定、プロトン検出配列決定、イオン半導体配列決定、ナノポア配列決定、電子配列決定、パイロ配列決定、Ｍａｘａｍ－Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、チェーンターミネーション（例えば、Ｓａｎｇｅｒ）配列決定、＋Ｓ配列決定、または合成による配列決定を含むがこれらに限定されない様々な方法を使用する配列決定によってアッセイされる。いくつかの場合において、抗体ライブラリーが細胞またはファージの表面に表示される。いくつかの場合において、ファージディスプレイを使用して、抗体ライブラリーが所望の活性を有する配列について富化される。
いくつかの場合において、抗体ライブラリーは、機能的活性、構造的安定性（例えば、熱安定性またはｐＨ安定性）、発現、特異性、またはこれらの組み合わせについてアッセイされる。いくつかの場合において、抗体ライブラリーは、折り畳むことができる抗体についてアッセイされる。いくつかの場合において、抗体の領域は、機能的活性、構造的安定性、発現、特異性、折り畳み、またはそれらの組み合わせについてアッセイされる。例えば、ＶＨ領域またはＶＬ領域は、機能的活性、構造安定性、発現、特異性、折り畳み、またはこれらの組み合わせについてアッセイされる。
本明細書に記載の方法によって生成された抗体またはＩｇＧは、改善された結合親和性を含む。いくつかの場合において、抗体は、１ｎＭ未満、１．２ｎＭ未満、２ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１１ｎＭ未満、１３．５ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、または３０ｎＭ未満の結合親和性（例えば、ＫＤ）を含む。いくつかの場合において、抗体は、４００ｎＭ未満、３５０ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎｍ未満、１００ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は１ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は１．２ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は２ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は５ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は１０ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は１３．５ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は１５ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は２０ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は２５ｎＭ未満のＫＤを含む。いくつかの場合において、抗体は３０ｎＭ未満のＫＤを含む。
いくつかの場合において、本明細書に記載の方法によって生成される抗体またはＩｇＧの親和性は、コンパレーター抗体と比較して、少なくともまたは約１．５倍、２．０倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、または２００倍を超えて、結合親和性が改善した。いくつかの場合において、本明細書に記載の方法によって生成された抗体またはＩｇＧの親和性は、はコンパレーター抗体と比較して、少なくともまたは約１．５倍、２．０倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、また２００倍を超えて、機能が改善した。いくつかの場合において、コンパレーター抗体は、類似の構造、配列、または抗原標的を有する抗体である。
本明細書に記載される方法は、いくつかの場合において、抗体またはＩｇＧの収量の増加をもたらす。いくつかの場合において、収量は、少なくともまたは約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０マイクログラム（μｇ）であるか、または８０マイクログラム（μｇ）を超える。いくつかの場合において、収量は、約５～約８０、約１０～約７５、約１５～約６０、約２０～約５０、または約３０～約４０マイクログラム（μｇ）の範囲にある。
発現系
本明細書に提供されるのは、結合ドメインを含む抗体をコードする核酸を含むライブラリーであり、ライブラリーは、改善された特異性、安定性、発現、フォールディング、または下流の活性を有する。いくつかの場合において、本明細書に記載のライブラリーはスクリーニングおよび分析に使用される。
マイクログラム（μｇ）の範囲にある。
本明細書に提供されるのは、結合ドメインを含む抗体をコードする核酸を含むライブラリーであり、ここで、核酸ライブラリーは、スクリーニングおよび分析のために使用される。いくつかの場合において、スクリーニングおよび分析は、インビトロ、インビボ、またはエキソビボアッセイを含む。スクリーニング用の細胞には、生きている対象または細胞株から採取した一次細胞が含まれる。細胞は、原核生物（例えば、細菌および真菌）または真核生物（例えば、動物および植物）に由来し得る。例示的な動物細胞には、マウス、ウサギ、霊長類、および昆虫からのものが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、スクリーニング用の細胞には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞株、またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞株を含むがこれらに限定されない細胞株が含まれる。いくつかの場合において、本明細書に記載の核酸ライブラリーはまた、多細胞生物に送達され得る。例示的な多細胞生物には、植物、マウス、ウサギ、霊長類、および昆虫が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の核酸ライブラリーは、様々な薬理学的または薬物動態学的特性についてスクリーニングすることができる。いくつかの場合において、ライブラリーは、インビトロアッセイ、インビボアッセイ、またはエキソビボアッセイを使用してスクリーニングされる。例えば、スクリーニングされるインビトロの薬理学的または薬物動態学的特性には、結合親和性、結合特異性、および結合アビディティが含まれるが、これらに限定されない。スクリーニングされる本明細書に記載のライブラリーの例示的なインビボの薬理学的特性または薬物動態学的特性には、治療効果、活性、前臨床毒性特性、臨床有効性特性、臨床毒性特性、免疫原性、効力、および臨床安全特性が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に提供されるのは、核酸ライブラリーであって、ここで、核酸ライブラリーは、ベクター中で発現され得る。本明細書に開示される核酸ライブラリーを挿入するための発現ベクターは、真核生物または原核生物の発現ベクターを含み得る。例示的な発現ベクターには、哺乳動物発現ベクター：ｐＳＦ－ＣＭＶ－ＮＥＯ－ＮＨ２－ＰＰＴ－３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ－ＣＭＶ－ＮＥＯ－ＣＯＯＨ－３ＸＦＬＡＧ、ｐＳＦ－ＣＭＶ－ＰＵＲＯ－ＮＨ２－ＧＳＴ－ＴＥＶ、ｐＳＦ－ＯＸＢ２０－ＣＯＯＨ－ＴＥＶ－ＦＬＡＧ（Ｒ）－６Ｈｉｓ、ｐＣＥＰ４ ｐＤＥＳＴ２７、ｐＳＦ－ＣＭＶ－Ｕｂ－ＫｒＹＦＰ、ｐＳＦ－ＣＭＶ－ＦＭＤＶ－ｄａＧＦＰ、ｐＥＦ１ａ－ｍＣｈｅｒｒｙ－Ｎ１ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＥＦ１ａ－ｔｄＴｏｍａｔｏ Ｖｅｃｔｏｒ、ｐＳＦ－ＣＭＶ－ＦＭＤＶ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＳＦ－ＣＭＶ－ＰＧＫ－Ｐｕｒｏ、ｐＭＣＰ－ｔａｇ（ｍ）、およびｐＳＦ－ＣＭＶ－ＰＵＲＯ－ＮＨ２－ＣＭＹＣ；細菌発現ベクター：ｐＳＦ－ＯＸＢ２０－ＢｅｔａＧａｌ、ｐＳＦ－ＯＸＢ２０－Ｆｌｕｃ、ｐＳＦ－ＯＸＢ２０、およびｐＳＦ－Ｔａｃ；植物発現ベクター：ｐＲＩ １０１－ＡＮ ＤＮＡおよびｐＣａｍｂｉａ２３０１；ならびに酵母発現ベクター：ｐＴＹＢ２１およびｐＫＬＡＣ２、ならびに昆虫ベクター：ｐＡｃ５．１／Ｖ５－Ｈｉｓ ＡおよびｐＤＥＳＴ８が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、ベクターはｐｃＤＮＡ３またはｐｃＤＮＡ３．１である。
本明細書に記載されているのは、抗体を含む構築物を生成するためにベクター中で発現される核酸ライブラリーである。いくつかの場合において、構成のサイズは変動する。いくつかの場合において、構築物は、少なくともまたは約５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、２０００、２４００、２６００、２８００、３０００、３２００、３４００、３６００、３８００、４０００、４２００、４４００、４６００、４８００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００塩基、または１００００を超える塩基を含む。いくつかの場合において、構築物は、約３００～１，０００、３００～２，０００、３００～３，０００、３００～４，０００、３００～５，０００、３００～６，０００、３００～７，０００、３００～８，０００、３００～９，０００、３００～１０，０００、１，０００～２，０００、１，０００～３，０００、１，０００～４，０００、１，０００～５，０００、１，０００～６，０００、１，０００～７，０００、１，０００～８，０００、１，０００～９，０００、１，０００～１０，０００、２，０００～３，０００、２，０００～４，０００、２，０００～５，０００、２，０００～６，０００、２，０００～７，０００、２，０００～８，０００、２，０００～９，０００、２，０００～１０，０００、３，０００～４，０００、３，０００～５，０００、３，０００～６，０００、３，０００～７，０００、３，０００～８，０００、３，０００～９，０００、３，０００～１０，０００、４，０００～５，０００、４，０００～６，０００、４，０００～７，０００、４，０００～８，０００、４，０００～９，０００、４，０００～１０，０００、５，０００～６，０００、５，０００～７，０００、５，０００～８，０００、５，０００～９，０００、５，０００～１０，０００、６，０００～７，０００、６，０００～８，０００、６，０００～９，０００、６，０００～１０，０００、７，０００～８，０００、７，０００～９，０００、７，０００～１０，０００、８，０００～９，０００、８，０００～１０，０００塩基、または９，０００～１０，０００塩基の範囲を含む。
本明細書に提供されるのは、抗体をコードする核酸を含むライブラリーであって、ここで、核酸ライブラリーは細胞内で発現される。いくつかの場合において、ライブラリーは、レポーター遺伝子を発現するように合成される。例示的なレポーター遺伝子には、アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、セルリアン蛍光タンパク質、シトリン蛍光タンパク質、オレンジ蛍光タンパク質、チェリー蛍光タンパク質、ターコイズ蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、オクトピンシンターゼ（ＯＣＳ）、ルシフェラーゼ、およびこれらの誘導体が含まれるが、それらに限定されない。レポーター遺伝子の調節を決定する方法は当該技術分野において周知であり、蛍光分析法（例えば、蛍光分光法、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡法）、および抗生物質耐性決定が含まれるが、これらに限定されない。
疾患および障害
本明細書に提供されるのは、治療効果を有し得るＶＨＨ抗体を含む抗体または免疫グロブリンをコードする核酸を含むライブラリーである。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリンは、翻訳されると、疾患または障害を治療するために使用されるタンパク質をもたらす。例示的な疾患には、癌、炎症性疾患または障害、代謝性疾患または障害、心血管疾患または障害、呼吸器疾患または障害、疼痛、消化器疾患または障害、生殖性疾患または障害、内分泌疾患または障害、あるいは神経学的疾患または障害が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの場合において、癌は固形癌または血液癌である。いくつかの場合において、対象は哺乳動物である。いくつかの場合において、対象は、マウス、ウサギ、イヌ、またはヒトである。本明細書に記載の方法によって治療される対象は、乳児、成人、または小児であり得る。本明細書に記載の抗体または抗体フラグメントを含む医薬組成物は、静脈内または皮下に投与され得る。
いくつかの場合において、疾患または障害は、ＴＩＧＩＴ機能不全に関連する。いくつかの場合において、疾患または障害は、ＴＩＧＩＴを介した異常なシグナル伝達に関連する。いくつかの場合において、疾患または障害はＣＤ３機能障害に関連する。いくつかの場合において、疾患または障害は、ＣＤ３を介した異常なシグナル伝達に関連する。いくつかの場合において、病気や障害は癌である。いくつかの場合において、病気や障害はウイルス感染症である。
タンパク質標的
本明細書に提供されるのは、様々なタンパク質標的のために設計され得るＶＨＨ抗体を含む抗体または免疫グロブリンをコードする核酸を含むライブラリーである。いくつかの場合において、タンパク質は、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体、チロシンキナーゼ受容体、免疫受容体、膜タンパク質、またはこれらの組み合わせである。いくつかの場合において、タンパク質は受容体である。いくつかの場合において、タンパク質はグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）受容体である。いくつかの場合において、タンパク質はプロスタグランジンＤ２受容体２（ＤＰ２またはＣＲＴＨ２）受容体である。いくつかの場合において、タンパク質はアデノシンＡ２Ａ受容体である。いくつかの場合において、タンパク質はＩｇおよびＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）を有するＴ細胞免疫受容体である。いくつかの場合において、タンパク質はＣｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ４７（ＣＤ４７）である。いくつかの場合において、タンパク質はＣｌｕｓｔｅｒ ｏｆ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ３イプシロン（ＣＤ３ε）である。
本明細書に提供されるのは、抗体または免疫グロブリンであり、抗体または免疫グロブリンは、配列番号１－１５１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する配列を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－１５１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－１５１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－１５１のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－１５１のいずれか１つに対して少なくともまたは約１００％の配列同一性を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－１５１のいずれか１つの、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００アミノ酸、または４００を超えるアミノ酸を有する部分を少なくとも含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、表１Ａ、表１４Ｂ、表１７、および表２０に記載されるような配列を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１１８－１３７、または１５３－１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１１８－１３７、または１５３－１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５％の相同性を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１１８－１３７、または１５３－１６３のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の相同性を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１１８－１３７、または１５３－１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の相同性を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１１８－１３７、または１５３－１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１００％の相同性を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１１８－１３７、または１５３－１６３のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、または１６個を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含む相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
Figure 2022548783000002
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１１８－１２０、１２９－１３１、１５２、１５５、１５８、または１６１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲ１を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１１８－１２０、１２９－１３１、１５２、１５５、１５８、または１６１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５の％相同性を含むＣＤＲ１を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１１８－１２０、１２９－１３１、１５２、１５５、１５８、または１６１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の相同性を含むＣＤＲ１を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１１８－１２０、１５２、１５５、１５８、または１６１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の相同性を含むＣＤＲ１を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１１８－１２０、１２９－１３１、１５２、１５５、１５８、または１６１のいずれか１つに対して、１００％の相同性を含むＣＤＲ１を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫オグロブリン配列は、配列番号１１８－１２０、１２９－１３１、１５２、１５５、１５８、または１６１のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲ１を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１２１－１２３、１３２－１３４、１５３、１５６、１５９、または１６２のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲ２を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１２１－１２３、１３２－１３４、１５３、１５６、１５９、または１６２のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５の％相同性を含むＣＤＲ２を含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１２１－１２３、１３２－１３４、１５３、１５６、１５９、または１６２のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の相同性を含むＣＤＲ２を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１２１－１２３、１３２－１３４、１５３、１５６、１５９、または１６２のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の相同性を含むＣＤＲ２を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１２１－１２３、１３２－１３４、１５３、１５６、１５９、または１６２のいずれか１つに対して、１００％の相同性を含むＣＤＲ２を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１２１－１２３、１３２－１３４、１５３、１５６、１５９、または１６２のいずれか１つの少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲ２を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１２４－１２８、１５４、１５７、１６０、または１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１２４－１２８、１２５－１３７、１５４、１５７、１６０、または１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５％の相同性を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１２４－１２８、１２５－１３７、１５４、１５７、１６０、または１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の相同性を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１２４－１２８、１２５－１３７、１２４－１２８、１５４、１５７、１６０、または１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の相同性を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１２４－１２８、１２５－１３７、１２４－１２８、１５４、１５７、１６０、または１６３のいずれか１つに対して、１００％の相同性を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号４６－８３、１２４－１２８、１２５－１３７、１２４－１２８、１５４、１５７、１６０、または１６３のいずれか１つに対して、少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列を含むＣＤＲＨ２の同一性を含み；配列番号１５４に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５４に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５４の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５６に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５７に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５６に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５７に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５６の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５７の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５８に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１５９に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６０に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５８に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１５９に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６０に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５８の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５９の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ２を含み；配列番号１６０の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１６１に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６３に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１６１に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６３に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１６１の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６３の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ２を含み；そして配列番号１５４に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ３を含み、配列番号１５８に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１５９に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ２を含み；配列番号１６０に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５４に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ３を含み；配列番号１５８に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１５９に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６０に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５４の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ３を含み；配列番号１５８の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１５９の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ２を含み；配列番号１６０の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５４に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ３を含み、配列番号１６１に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６３に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の配列相同性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５４に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ３を含み；配列番号１６１と少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６３に対して少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５２の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５３の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５４の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ３を含み；配列番号１６１の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ２を含み；および配列番号１６３の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５６に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５７に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ３を含み、配列番号１５８に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１５９に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ２を含み；および配列番号１６０に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５６に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５７に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ３を含み；配列番号１５８に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１５９に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ２を含み；そして配列番号１６０に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ１；配列番号１５６の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ２；配列番号１５７の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ３；配列番号１５８の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ１；配列番号１５９の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ２；および配列番号１６０の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ３を含む。
いくつかの実施形態において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５６に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５７に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＨ３を含み、配列番号１６１に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ２を含み；配列番号１６３に対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ１を含み；配列番号１５６に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ２を含み；配列番号１５７に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＨ３を含み；配列番号１６１に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ１を含み；配列番号１６２に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ２を含み；および配列番号１６３に対して、少なくともまたは約９５％、９７％、９９％、または１００％の相同性を含むＣＤＲＬ３を含む。いくつかの場合において、抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１５５の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ１；配列番号１５６の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ２；配列番号１５７の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＨ３；配列番号１６１の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ１；配列番号１６２の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ２；および配列番号１６３の少なくともまたは約３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６アミノ酸、または１６を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含むＣＤＲＬ３を含む。
本明細書に記載されているのは、いくつかの実施形態において、ＣＲＴＨ２Ｒに結合する抗体または免疫グロブリンである。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－２３または１２６－１４８のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－２３または１２６－１４８のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－２３または１２６－１４８のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－２３または１２６－１４８のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－２３または１２６－１４８のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１００％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１－２３または１２６－１４８のいずれか１つの、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００アミノ酸、または４００を超えるアミノ酸を有する部分を少なくとも含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号２４－４５または１４９－１５１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号２４－４５または１４９－１５１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号２４－４５または１４９－１５１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号２４－４５または１４９－１５１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号２４－４５または１４９－１５１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１００％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＲＴＨ２Ｒ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号２４－４５または１４９－１５１のいずれか１つの、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００アミノ酸、または４００を超えるアミノ酸を有する部分を少なくとも含む軽鎖可変ドメインを含む。
本明細書に提供されるのは、様々なタンパク質標的に対する抗体または免疫グロブリンである。いくつかの場合において、タンパク質はＴＩＧＩＴである。本明細書に記載されているのは、いくつかの実施形態において、ＴＩＧＩＴに結合する抗体または免疫グロブリンである。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号８４－１００のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号８４－１００のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号８４－１００のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号８４－１００のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号８４－１００のいずれか１つに対して少なくともまたは約１００％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号８４－１００のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００アミノ酸、または４００を超えるアミノ酸を有する部分を少なくとも含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１０１－１１７のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１０１－１１７のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１０１－１１７のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１０１－１１７のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１０１－１１７のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１００％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＴＩＧＩＴ抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１０１－１１７のいずれかに対して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００アミノ酸、または４００を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含む軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの場合において、タンパク質はＣＤ３イプシロンである。本明細書に記載されているのは、いくつかの実施形態において、ＣＤ３に結合する抗体または免疫グロブリンである。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１３８－１４１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１３８－１４１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９５％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１３８－１４１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９７％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１３８－１４１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約９９％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１３８－１４１のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１００％の配列同一性を含む重鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１３８－１４１のいずれかに対して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００アミノ酸、または４００を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含む重鎖可変ドメインを含む。
いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１４２－１４５のいずれか１つに対して、少なくともまたは約７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１４２－１４５のいずれか１つに対して少なくともまたは約９５％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１４２－１４５のいずれか１つに対して少なくともまたは約９７％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１４２－１４５のいずれか１つに対して少なくともまたは約９９％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１４２－１４５のいずれか１つに対して少なくともまたは約１００％の配列同一性を含む軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの場合において、ＣＤ３抗体または免疫グロブリン配列は、配列番号１４２－１４５のいずれか１つに対して、少なくともまたは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００アミノ酸、または４００を超えるアミノ酸を有する少なくとも一部を含む軽鎖可変ドメインを含む。
バリアントライブラリー
コドンのバリエーション
本明細書に記載のバリアント核酸ライブラリーは、複数の核酸を含み得、ここで、各核酸は、参照核酸配列と比較して、バリアントコドン配列をコードする。いくつかの場合において、第１の核酸集団の各核酸は、単一のバリアント部位にバリアントを含む。いくつかの場合において、第１の核酸集団は、単一のバリアント部位に複数のバリアントを含み、その結果、第１の核酸集団は、同じバリアント部位に複数のバリアントを含む。第１の核酸集団は、同じバリアント部位において複数のコドンバリアントを集合的にコードする核酸を含み得る。第１の核酸集団は、同じ位置に最大１９個以上のコドンを集合的にコードする核酸を含み得る。第１の核酸集団は、同じ位置で最大６０個のバリアントトリプレットを集合的にコードする核酸を含み得るか、または第１の核酸集団は、同じ位置に最大６１個の異なるコドンのトリプレットを集合的にコードする核酸を含み得る。各バリアントは、翻訳の間に異なるアミノ酸を生じるコドンをコードし得る。表１Ｂは、バリアント部位において可能な各コドン（および代表的なアミノ酸）のリストを示す。
Figure 2022548783000003
核酸集団は、複数の位置で最大２０個のコドンバリエーションを集合的にコードする変動した核酸を含み得る。このような場合、集団内の各核酸は、同じ核酸内の１つより多くの位置にあるコドンのバリエーションを含む。いくつかの場合において、集団内の各核酸は、単一の核酸中の、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上のコドンにおいてコトンのバリエーションを含む。いくつかの場合において、各バリアント長核酸は、単一の長い核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれ以上のコドンにおいてコドンのバリエーションを含む。いくつかの場合において、バリアント核酸集団は、単一の核酸中の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０以上のコドンにおいてコドンのバリエーションを含む。いくつかの場合において、バリアント核酸集団は、単一の長い核酸中の少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００またはそれ以上のコドンにおいてコドンのバリエーションを含む。
高度に並列する核酸合成
本明細書に提供されるのは、革新的な合成プラットフォームを作成するための、ポリヌクレオチド合成からシリコン上の、ナノウェル内での遺伝子アセンブリまでのエンドツーエンドプロセスの小型化、並列化、および垂直統合を利用するプラットフォームアプローチである。本明細書に記載のデバイスは、９６ウェルプレートと同じフットプリントを提供し、シリコン合成プラットフォームは、従来の合成方法と比較して最大１，０００倍以上のスループットの増大が可能であり、１回の高度に並列化された実行で、最大約１，０００，０００以上のポリヌクレオチド、または１０，０００以上の遺伝子の生成を伴う。
次世代配列決定の出現により、高解像度のゲノムデータは、正常な生物学および疾患の病因の両方における様々な遺伝子の生物学的役割を掘り下げる研究にとって重要な要因となった。この研究の中核となるのは、分子生物学のセントラルドグマと「配列情報の残基ごとの移動」の概念である。ＤＮＡ中にコード化されたゲノム情報はメッセージに転写され、メッセージは所定の生物学的経路内の活性産物であるタンパク質に翻訳される。
研究の別の刺激的な領域は、高度に特異的な細胞標的に焦点を合わせた治療用分子の発見、開発、および製造に関するものである。多様性の高いＤＮＡ配列ライブラリーは、標的治療薬の開発パイプラインの中核にある。遺伝子変異体は、治療標的に対して高い親和性を有するタンパク質の高発現のために最適化された遺伝子に理想的に到達する、タンパク質工学サイクルの設計、構築、およびテストにおいてタンパク質を発現するために使用される。例として、受容体の結合ポケットを考えてみる。結合ポケット内のすべての残基のすべての配列順列を同時にテストする能力は、徹底的な調査を可能にし、成功の確率を増大させる。研究者が、受容体内の特定の部位におけるすべての可能な変異を生成させるように試みる飽和変異誘発は、この開発課題への１つのアプローチを表す。費用と時間と労力がかかるが、これは、各バリアントを各位置に導入することができる。対照的に、いくつかの選択された位置またはＤＮＡの短いストレッチが広範囲に修飾され得るコンビナトリアル変異誘発は、偏った表現を伴うバリアントの不完全なレパートリーを生成する。
薬剤開発パイプラインを加速するために、試験のために利用可能な正しい位置で意図された頻度で利用可能な所望のバリアントを有するライブラリー、すなわち、精密ライブラリーは、スクリーニングのコストならびに所要時間の削減を可能にする。本明細書に提供されるのは、所望の頻度で意図される各バリアントの正確な導入を提供する、核酸合成バリアントライブラリーを合成するための方法である。エンドユーザーにとって、これは、配列スペースを完全にサンプリングするだけでなく、これらの仮説を効率的な方法で問い合わせできることを意味し、コストとスクリーニング時間を削減する。ゲノムワイドな編集は、重要な経路、各バリアントと配列順列が最適な機能についてテストできるライブラリーを解明でき、数千の遺伝子を使用して経路全体とゲノムを再構築して、創薬のための生物学的システムを再設計できる。
第１の例では、薬物自体は、本明細書に記載の方法を使用して最適化することができる。例えば、抗体の特定の機能を改善するために、抗体の一部をコードするバリアントポリヌクレオチドライブラリーが設計および合成される。次に、抗体のバリアント核酸ライブラリーを、本明細書に記載のプロセス（例えば、ＰＣＲ変異誘発とそれに続くベクターへの挿入）によって生成することができる。次に、抗体は生産細胞株で発現され、増強された活性についてスクリーニングされる。スクリーニングの例には、抗原への結合親和性、安定性、またはエフェクター機能（例えば、ＡＤＣＣ、補体、またはアポトーシス）の調節を調べることが含まれる。抗体を最適化するための例示的な領域には、Ｆｃ領域、Ｆａｂ領域、Ｆａｂ領域の可変領域、Ｆａｂ領域の定常領域、重鎖または軽鎖（ＶＨまたはＶＬ）の可変ドメイン、およびＶＨまたはＶＬの特異的相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書に記載の方法によって合成された核酸ライブラリーは、病状に関連する様々な細胞において発現され得る。病状に関連する細胞には、細胞株、組織サンプル、対象からの初代細胞、対象から拡大された培養細胞、またはモデルシステム内の細胞が含まれる。例示的なモデルシステムには、疾患状態の植物および動物モデルが含まれるが、これらに限定されない。
疾患状態の予防、軽減または治療に関連するバリアント分子を同定するために、本明細書に記載のバリアント核酸ライブラリーは、病状に関連する細胞、または細胞に病状を誘導することができる細胞で発現される。いくつかの場合において、細胞に病状を誘発するために薬剤が使用される。病状誘発のための例示的なツールには、Ｃｒｅ／Ｌｏｘ組換えシステム、ＬＰＳ炎症誘発、および低血糖を誘発するためのストレプトゾトシンが含まれるが、これらに限定されない。病状に関連する細胞は、モデルシステムまたは培養細胞からの細胞、ならびに特定の病状を有する対象からの細胞であり得る。例示的な疾患状態には、細菌性、真菌性、ウイルス性、自己免疫性、または増殖性障害（例えば、癌）が含まれる。いくつかの場合において、バリアント核酸ライブラリーは、モデルシステム、細胞株、または対象に由来する一次細胞で発現され、少なくとも１つの細胞活性の変化についてスクリーニングされる。例示的な細胞活動には、増殖、サイクル進行、細胞死、接着、遊走、生殖、細胞シグナル伝達、エネルギー産生、酸素利用、代謝活性、および老化、フリーラジカル損傷への応答、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
基材
ポリヌクレオチド合成のための表面として使用されるデバイスは、均質なアレイ表面、パターン化されたアレイ表面、チャネル、ビーズ、ゲルなどを含むがこれらに限定されない基材の形態であり得る。本明細書に提供されるのは、複数のクラスターを含む基質であり、各クラスターは、ポリヌクレオチドの付着および合成を支持する複数の遺伝子座を含む。いくつかの場合において、基材は均質なアレイ表面を含む。例えば、均質なアレイ表面は均質なプレートである。本明細書で使用される「遺伝子座」という用語は、表面から延びる単一の所定の配列をコードするポリヌクレオチドの支持を提供する構造上の別個の領域を指す。いくつかの場合において、遺伝子座は二次元表面、例えば実質的に平面の表面上にある。いくつかの場合において、遺伝子座は、ウェル、マイクロウェル、チャネル、またはポストなどの三次元表面上にある。いくつかの場合において、遺伝子座の表面は、ポリヌクレオチド合成のために少なくとも１つのヌクレオチド、または好ましくは、ポリヌクレオチドの集団の合成のための同一のヌクレオチドの集団に付着するように能動的に機能化される材料を含む。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドは、同じ核酸配列をコードするポリヌクレオチドの集団を指す。いくつかの場合において、基材の表面は、基材の１つまたは複数の表面を含めている。提供されるシステムおよび方法を使用して本明細書に記載のライブラリー内で合成されたポリヌクレオチドの平均エラー率は、多くの場合、エラー修正なしで、多くの場合、１０００分の１未満、約２０００分の１未満、約３０００分の１未満、またはそれ以下である。
本明細書に提供されるのは、共通の支持体上のアドレス可能な位置で異なる所定の配列を有する複数のポリヌクレオチドの並行合成を支持する表面である。いくつかの場合において、基材は、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，２００，０００、１，４００，０００、１，６００，０００、１，８００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、３，０００，０００、３，５００，０００、４，０００，０００、４，５００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上の同一でないポリヌクレオチドを超える合成のサポートを提供する。いくつかの場合において、表面は、５０、１００、２００、４００、６００、８００、１０００、１２００、１４００、１６００、１８００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，２００，０００、１，４００，０００、１，６００，０００、１，８００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、３，０００，０００、３，５００，０００、４，０００，０００、４，５００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、またはそれ以上を超える別個の配列をコードするポリヌクレオチドの合成のサポートを提供する。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドの少なくとも一部が同一の配列を有するか、または同一の配列を伴って合成されるように構成される。いくつかの場合において、基材は、少なくとも８０、９０、１００、１２０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００塩基またはそれ以上を有するポリヌクレオチドの成長のための表面環境を提供する。
本明細書に提供されるのは、基材の別個の遺伝子座でのポリヌクレオチド合成のための方法であって、ここで、各遺伝子座は、ポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの場合において、各遺伝子座は、別の遺伝子座で増殖したポリヌクレオチドの集団とは異なる配列を有するポリヌクレオチドの集団の合成を支持する。いくつかの場合において、各ポリヌクレオチド配列は、ポリヌクレオチド合成のための表面上の遺伝子座の同じクラスター内の異なる遺伝子座にわたって、１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の冗長性で合成される。いくつかの場合において、基材の遺伝子座は複数のクラスター内に位置している。いくつかの場合において、基材は、少なくとも１０、５００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、またはそれ以上のクラスターを含む。いくつかの場合において、基材は、２，０００、５，０００、１０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，１００，０００、１，２００，０００、１，３００，０００、１，４００，０００、１，５００，０００、１，６００，０００、１，７００，０００、１，８００，０００、１，９００，０００、２，０００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１，０００，０００、１，２００，０００、１，４００，０００、１，６００，０００、１，８００，０００、２，０００，０００、２，５００，０００、３，０００，０００、３，５００，０００、４，０００，０００、４，５００，０００、５，０００，０００、または１０，０００，０００、またはそれ以上の別個の遺伝子座を超えるものを含む。いくつかの場合において、基材は約１０，０００の別個の遺伝子座を含む。単一クラスター内の遺伝子座の量は、異なる場合で変動する。いくつかの場合において、各クラスターには、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１３０、１５０、２００、３００、４００、５００、またはそれ以上の遺伝子座が含まれる。いくつかの場合において、各クラスターには約５０～５００の遺伝子座が含まれる。いくつかの場合において、各クラスターには約１００～２００の遺伝子座が含まれる。いくつかの場合において、各クラスターには約１００～１５０の遺伝子座が含まれる。いくつかの場合において、各クラスターには約１０９、１２１、１３０、または１３７の遺伝子座が含まれる。いくつかの場合において、各クラスターには、約１９、２０、６１、６４、またはそれ以上の遺伝子座が含まれる。代替的に、または組み合わせて、ポリヌクレオチド合成は均質なアレイ表面で起こる。
いくつかの場合において、基材上で合成される別個のポリヌクレオチドの数は、基材で利用可能な別個の遺伝子座の数に依存する。いくつかの場合において、クラスターまたは基材の表面内の遺伝子座の密度は、１ｍｍ２あたり、少なくともまたは約１、１０、２５、５０、６５、７５、１００、１３０、１５０、１７５、２００、３００、４００、５００、１，０００、またはそれ以上の遺伝子座である。いくつかの場合において、基材は１０～５００、２５～４００、５０～５００、１００～５００、１５０～５００、１０～２５０、５０～２５０、１０～２００、または５０～２００ｍｍ２を含む。いくつかの場合において、クラスターまたは表面内の２つの隣接する遺伝子座の中心間の距離は、約１０～５００、約１０～２００、または約１０～１００μｍである。いくつかの場合において、隣接する遺伝子座の２つの中心間の距離が、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｍよりも大きい。いくつかの場合において、２つの隣接する遺伝子座の中心間の距離は、約２００、１５０、１００、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０μｍ未満である。いくつかの場合において、各遺伝子座の幅は、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００μｍである。いくつかの場合において、各遺伝子座の幅は、約０．５～１００、０．５～５０、１０～７５、または０．５～５０μｍである。
いくつかの場合において、基材内のクラスターの密度は、少なくともまたは約１００ｍｍ２あたり１クラスター、１０ｍｍ２あたり１クラスター、５ｍｍ２あたり１クラスター、４ｍｍ２あたり１クラスター、３ｍｍ２あたり１クラスター、２ｍｍ２あたり１クラスター、１ｍｍ２あたり１クラスター、１ｍｍ２あたり２クラスター、１ｍｍ２あたり３クラスター、１ｍｍ２あたり４クラスター、１ｍｍ２あたり５クラスター、１ｍｍ２あたり１０クラスター、１ｍｍ２あたり５０クラスター、またはそれ以上である。いくつかの場合において、基材は、１０ｍｍ２あたり約１クラスターから１ｍｍ２あたり約１０クラスターまでを含む。いくつかの場合において、２つの隣接するクラスターの中心間の距離は、少なくともまたは約５０、１００、２００、５００、１０００、２０００、または５０００μｍである。いくつかの事例において、２つの隣接するクラスターの中心間の距離は、約５０～１００、５０～２００、５０～３００、５０～５００、および１００～２０００μｍである。いくつかの事例において、２つの隣接するクラスターの中心間の距離は、約０．０５～５０、０．０５～１０、０．０５～５、０．０５～４、０．０５～３、０．０５～２、０．１～１０、０．２～１０、０．３～１０、０．４～１０、０．５～１０、０．５～５、または０．５～２ｍｍの間である。いくつかの事例において、各クラスターは、約０．５～約２、約０．５～約１、または約１～約２ｍｍの断面を有する。いくつかの場合において、各クラスターの断面積は約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍである。いくつかの事例において、各クラスターの内部断面は、約０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．１５、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２ｍｍである。
いくつかの場合において、基材は、ほぼ標準的な９６ウェルプレートのサイズ、例えば、約１００～約２００ｍｍ×約５０～約１５０ｍｍである。いくつかの場合において、基材は、約１０００、５００、４５０、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００または５０ｍｍ以下の直径を有する。いくつかの場合において、基材の直径は、約２５～１０００、２５～８００、２５～６００、２５～５００、２５～４００、２５～３００、または２５～２００ｍｍの間である。いくつかの場合において、基材は少なくとも約１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、１２，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００ｍｍ２、またはそれ以上の平面表面積を有する。いくつかの場合において、基材の厚さは、約５０～２０００、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、または２５０～１０００ｍｍの間である。
表面材料
本明細書で提供される基材、デバイス、および反応器は、本明細書に記載される方法、組成物、およびシステムに適した任意の様々な材料から製造される。特定の例において、基材材料は、低レベルのヌクレオチド結合を示すように製造される。いくつかの場合において、基材材料は、高レベルのヌクレオチド結合を示す別個の表面を生成するように修飾される。いくつかの場合において、基材材料は可視光および／またはＵＶ光に対して透明である。いくつかの場合において、基材材料は十分に導電性であり、例えば、基材の全部または一部にわたって均一な電界を形成することができる。いくつかの場合において、導電性材料は電気アースに接続される。いくつかの場合において、基材は熱伝導性または断熱性である。いくつかの場合において、材料は、化学的または生化学的反応、例えば、ポリヌクレオチド合成反応プロセスをサポートするために、耐薬品性および耐熱性である。いくつかの場合において、基材は柔軟な材料を含む。柔軟な材料の場合、材料には、修飾と非修飾の両方である、ナイロン、ニトロセルロース、ポリプロピレンなどが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、基材は剛性材料を含む。剛性材料の場合、材料には、ガラス、フューズシリカ、シリコン、プラスチック（例えば、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、およびそれらのブレンドなど）、金属（例えば、金、プラチナなど）が含まれ得るが、これらに限定されない。基材、固体支持体または反応器は、シリコン、ポリスチレン、アガロース、デキストラン、セルロース系ポリマー、ポリアクリルアミド、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、およびガラスからなる群より選択される材料から製造することができる。基材／固体支持体またはその中の微細構造、反応器は、本明細書に列挙される材料または当該技術分野において知られている他の任意の適切な材料の組み合わせで製造され得る。
表面構造
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される方法、組成物、およびシステムのための基材であり、基材は、本明細書に記載される方法、組成物、およびシステムに適した表面構造を有する。いくつかの場合において、基材は、隆起したおよび／または下降した特徴を含む。そのような特徴を有することの１つの利点は、ポリヌクレオチド合成をサポートするための表面積の増加である。いくつかの場合において、隆起および／または下降した特徴を有する基材は、三次元基材と呼ばれる。いくつかの事例において、三次元基材は１つ以上のチャネルを含む。いくつかの場合において、１つ以上の遺伝子座がチャネルを構成する。いくつかの事例において、チャネルは、材料沈着装置などの沈着装置を介して試薬沈着にアクセス可能である。いくつかの事例において、試薬および／または流体は、流体通信の１つ以上のチャネルのより大きなウェルに集まる。例えば、基材は、クラスターを伴う複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、複数のチャネルは、クラスターの１つのウェルと流体連結している。いくつかの方法において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、複数の遺伝子座のクラスターにおいて合成される。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載の方法、組成物、およびシステムのための基材であり、ここで、基材は、ポリヌクレオチド合成のために構成される。いくつかの場合において、構造は、表面でのポリヌクレオチド合成のための制御された流れおよび物質移動経路を可能にするように構成される。いくつかの場合において、基材の構成により、ポリヌクレオチド合成中の、制御されかつ均一な物質移動経路の分布、化学的曝露時間、および／または洗浄効率が可能になる。いくつかの場合において、基材の構成は、例えば、増殖ポリヌクレオチドによる排除体積が、ポリヌクレオチドを増殖させるために利用可能または適切である初期の利用可能な体積の５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１％、またはそれ以下を超えないように、増殖しているポリヌクレオチドのために十分な体積を提供することによって、掃引効率の増加を可能にする。いくつかの場合において、三次元構造により、流体の管理された流れが可能になり、化学物質曝露の迅速な交換が可能になる。
本明細書に提供されるのは、本明細書に記載される方法、組成物、およびシステムのための基材であり、基材は、本明細書に記載される方法、組成物、およびシステムに適した構造を含む。いくつかの場合において、分離は物理的構造によって実現される。いくつかの場合において、分離は、ポリヌクレオチド合成のための活動領域および受動領域を生成する表面の異なる機能化によって達成される。いくつかの場合において、示差的な機能化は、基材表面全体の疎水性を交互にすることによって達成され、それによって、沈着した試薬のビーディングまたは湿潤を引き起こす水接触角効果を生み出す。より大きな構造を採用することで、隣接するスポットの試薬による別個のポリヌクレオチド合成位置の飛散および相互汚染を減らすことができる。いくつかの事例において、材料沈着装置などの装置を使用して、別個のポリヌクレオチド合成位置に試薬を沈着させる。三次元の特徴を有する基材は、低いエラー率（例えば、約１：５００未満、１：１０００、１：１５００、１：２，０００、１：３，０００、１：５，０００、または１：１０，０００）で非常に多数のポリヌクレオチド（例えば、約１０，０００を超える）の合成を可能にするように構成される。いくつかの事例において、基材は、約１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、３００、４００、または５００特徴／ｍｍ２の密度を有する特徴を含む。
基材のウェルは、基材の別のウェルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または容積を有し得る。基材のチャネルは、基材の別のチャネルと同じまたは異なる幅、高さ、および／または容積を有し得る。いくつかの場合において、クラスターの直径またはクラスターを含むウェルの直径、あるいはその両方は、約０．０５～５０、０．０５～１０、０．０５～５、０．０５～４、０．０５～３、０．０５～２、０．０５～１、０．０５～０．５、０．０５～０．１、０．１～１０、０．２～１０、０．３～１０、０．４～１０、０．５～１０、０．５～５、または０．５～２ｍｍの間である。いくつかの場合において、クラスターまたはウェル、あるいはその両方の直径は、５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、または０．０５ｍｍ未満または約５、４、３、２、１、０．５、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、または０．０５ｍｍである。いくつかの場合において、クラスターまたはウェル、あるいはその両方の直径は、約１．０～１．３ｍｍである。いくつかの場合において、クラスターまたはウェル、あるいはその両方の直径は約１．１５０ｍｍである。いくつかの場合において、クラスターまたはウェル、あるいはその両方の直径は約０．０８ｍｍである。クラスターの直径は、２次元または三次元の基材内のクラスターを指す。
いくつかの場合において、ウェルの高さは、約２０～１０００、５０～１０００、１００～１０００、２００～１０００、３００～１０００、４００～１０００、または５００～１０００μｍである。いくつかの場合において、ウェルの高さは、約１０００、９００、８００、７００、または６００μｍ未満である。
いくつかの場合において、基材は、クラスター内の複数の遺伝子座に対応する複数のチャネルを含み、チャネルの高さまたは深さは、５～５００、５～４００、５～３００、５～２００、５～１００、５～５０、または１０～５０μｍである。いくつかの場合において、チャネルの高さは、１００、８０、６０、４０、または２０μｍ未満である。
いくつかの場合において、チャネル、遺伝子座（例えば、実質的に平面の基材内）、またはチャネルと遺伝子座の両方（例えば、遺伝子座がチャネルに対応する三次元基材内）の直径は、約１～１０００、１～５００、１～２００、１～１００、５～１００、または１０～１００μｍ、例えば、約９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０μｍである。いくつかの場合において、チャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の両方の直径は、約１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０μｍ未満である。いくつかの場合において、２つの隣接するチャネル、遺伝子座、またはチャネルと遺伝子座の中心間の距離は、約１～５００、１～２００、１～１００、５～２００、５～１００、５～５０、または５～３０、例えば、約２０μｍである。
表面修飾
本明細書に提供されるのは、表面上でのポリヌクレオチド合成のための方法であり、ここで、表面は、様々な表面修飾を含む。いくつかの場合において、表面修飾は、基材表面、または基材表面の選択された部位もしくは領域の１つ以上の化学的および／もしくは物理的特性を変更するための加法または減法プロセスによる表面の化学的および／または物理的変更に使用される。例えば、表面修飾には、（１）表面の濡れ特性の変更、（２）表面の機能化、すなわち、表面官能基の提供、修飾、または置換、（３）表面の非機能化、すなわち、表面官能基の除去、（４）他の方法で、例えば、エッチングを通して表面の化学組成を変化させること、（５）表面粗さを増加または減少させること、（６）表面にコーティングを提供すること、例えば、表面の濡れ特性とは異なる濡れ特性を示すコーティングを提供すること、および／または（７）表面に粒子を沈着させることが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの事例において、表面（接着促進剤と称する）の上部に化学層を追加することにより、基材の表面上の遺伝子座の構造化されたパターン形成が容易になる。接着促進を適用するための例示的な表面には、ガラス、シリコン、二酸化ケイ素、および窒化ケイ素が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの事例において、接着促進剤は表面エネルギーの高い化学物質である。いくつかの場合において、第２の化学層が基材の表面に沈着される。いくつかの場合において、第２の化学層は低い表面エネルギーを有する。いくつかの場合において、表面にコーティングされた化学層の表面エネルギーが、表面上の液滴の局在化をサポートする。選択されたパターン配置に応じて、遺伝子座の近接性および／または遺伝子座での流体接触の領域は変更可能である。
いくつかの場合において、例えば、ポリヌクレオチド合成のために、核酸または他の部分が沈着される基材表面または分解された遺伝子座は、滑らかであるかもしくは実質的に平面（例えば、二次元）であるか、または隆起したもしくは下降した特徴などの不規則性（例えば、三次元特徴）を有する。いくつかの場合において、基材表面は、１つ以上の異なる層の化合物で修飾される。関心のあるそのような修飾層には、金属、金属酸化物、ポリマー、有機小分子などの無機層および有機層が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの場合において、基材の分解された遺伝子座は、表面エネルギーを増加および／または減少させる１つ以上の部分で機能化される。いくつかの事例において、部分が化学的に不活性である。いくつかの事例において、部分は、所望の化学反応、例えば、ポリヌクレオチド合成反応における１つ以上のプロセスをサポートするように構成される。表面の表面エネルギー、または疎水性は、表面に付着するヌクレオチドの親和性を決定するための要因である。いくつかの場合において、基材の機能化のための方法は、（ａ）二酸化ケイ素を含む表面を有する基材を提供すること、および（ｂ）本明細書に記載されているか、またはさもなくば当該技術分野で知られている適切なシラン化剤、例えば、有機官能性アルコキシシラン分子を使用して、表面をシラン化することを含む。方法および官能化剤は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第５４７４７９６号に記載されている。
いくつかの場合において、基材表面は、典型的には基材表面上に存在する反応性親水性部分を介して、シランを基材表面に結合するために有効な反応条件下で、シランの混合物を含む誘導体化組成物との接触によって機能化される。シラン化は一般に、有機官能性アルコキシシラン分子との自己組織化によって表面を被覆する。様々なシロキサン官能化試薬を、例えば、表面エネルギーを低下または増加させるために、当該技術分野で現在知られているようにさらに使用することができる。有機官能性アルコキシシランは、それらの有機機能に従って分類される。
ポリヌクレオチド合成
ポリヌクレオチド合成のための現在の開示の方法は、ホスホルアミダイト化学を含むプロセスを含み得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド合成は、塩基をホスホルアミダイトとカップリングすることを含む。ポリヌクレオチド合成は、カップリング条件下でのホスホルアミダイトの沈着による塩基のカップリングを含み得、ここで、同じ塩基が、任意選択で、ホスホルアミダイトと共に１回より多く沈着され、すなわち、二重カップリングである。ポリヌクレオチド合成は、未反応部位のキャッピングを含み得る。いくつかの場合において、キャッピングは任意選択である。ポリヌクレオチド合成はまた、酸化または１回の酸化工程または複数の酸化工程を含み得る。ポリヌクレオチド合成は、脱ブロック化、脱トリチル化、および硫化を含み得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド合成は、酸化または硫化のいずれかを含む。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド合成反応中の１つまたは各工程の間に、例えば、テトラゾールまたはアセトニトリルを使用して、デバイスを洗浄する。ホスホルアミダイト合成法の任意の１工程の時間枠は、約２分、１分、５０秒、４０秒、３０秒、２０秒、および１０秒未満であり得る。
ホスホルアミダイト法を使用するポリヌクレオチド合成は、ホスファイトトリエステル結合の形成のために、成長しているポリヌクレオチド鎖へのホスホルアミダイトビルディングブロック（例えば、ヌクレオシドホスホルアミダイト）のその後の付加を含み得る。ホスホルアミダイトポリヌクレオチド合成は、３’から５’の方向で進行する。ホスホルアミダイトポリヌクレオチド合成は、合成サイクルごとに成長している核酸鎖への１つのヌクレオチドの制御された付加を可能にする。いくつかの場合において、各合成サイクルはカップリング工程を含む。ホスホルアミダイトカップリングは、活性化されたヌクレオシドホスホルアミダイトと、例えばリンカーを介して基材に結合したヌクレオシドとの間のホスファイトリエステル結合の形成を伴う。いくつかの場合において、ヌクレオシドホスホルアミダイトが、活性化されたデバイスに提供される。いくつかの場合において、ヌクレオシドホスホルアミダイトが、活性剤とともにデバイスに提供される。いくつかの場合において、ヌクレオシドホスホルアミダイトは、基材に結合したヌクレオシドの、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００倍以上過剰でデバイスに提供される。いくつかの場合において、ヌクレオシドホスホルアミダイトの添加は、無水環境、例えば、無水アセトニトリル中で行われる。ヌクレオシドホスホルアミダイトの添加に続いて、デバイスは任意選択で洗浄される。いくつかの場合において、カップリング工程をさらに１回以上繰り返し、任意選択で、基材へのヌクレオシドホスホルアミダイト添加の間に洗浄工程を伴う。いくつかの場合において、本明細書で使用されるポリヌクレオチド合成方法は、１、２、３、またはそれ以上の連続的なカップリング工程を含む。カップリングの前に、多くの場合、デバイスに結合したヌクレオシドは、保護基の除去によって脱保護され、保護基は重合を防ぐように機能する。一般的な保護基は４，４’－ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）である。
カップリングに続いて、ホスホルアミダイトポリヌクレオチド合成方法は、任意選択でキャッピング工程を含む。キャッピング工程では、成長しているポリヌクレオチドはキャッピング剤で処理される。キャッピング工程は、カップリング後に未反応の基材結合５’－ＯＨ基をブロックして、内部の塩基が欠失したポリヌクレオチドの形成を防ぐのに役立つ。さらに、１Ｈ－テトラゾールで活性化されたホスホルアミダイトは、グアノシンのＯ６位置とわずかに反応する可能性がある。理論に拘束されることはないが、Ｉ２／水で酸化すると、この副産物は、おそらくＯ６－Ｎ７の移動を介して、脱プリンを受ける可能性がある。ポリヌクレオチドの最終的な脱保護の過程で、脱プリン塩基の部位が切断されて、完全長の生成物の収量が減少する可能性がある。Ｏ６修飾は、Ｉ２／水で酸化する前にキャッピング試薬で処理することで除去され得る。いくつかの場合において、ポリヌクレオチド合成中にキャッピング工程を含めると、キャッピングなしの合成と比較して、エラー率が低下する。一例として、キャッピング工程は、基材に結合したポリヌクレオチドを、無水酢酸と１－メチルイミダゾールの混合物で処理することを含む。キャッピング工程に続いて、デバイスは任意選択で洗浄される。
いくつかの場合において、ヌクレオシドホスホルアミダイトの添加後、および任意選択でキャッピングおよび１回以上の洗浄工程の後、デバイスに結合した成長中の核酸が酸化される。酸化工程は、亜リン酸トリエステルが、天然に存在するリン酸ジエステルヌクレオシド間結合の保護された前駆体である四配位リン酸トリエステルに酸化されることを含む。いくつかの場合において、成長しているポリヌクレオチドの酸化は、任意選択で弱塩基（例えば、ピリジン、ルチジン、コリジン）の存在下で、ヨウ素および水で処理することによって達成される。酸化は、無水条件下で、例えば、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドまたは（１Ｓ）－（＋）－（１０－カンファースルホニル）－オキサジリジン（ＣＳＯ）を使用して、実施し得る。いくつかの方法では、酸化に続いてキャッピング工程が実行される。持続する可能性のある酸化による残留水がその後のカップリングを阻害する可能性があるため、第２のキャッピング工程でデバイスの乾燥が可能になる。酸化に続いて、デバイスおよび成長しているポリヌクレオチドは、任意選択で洗浄される。いくつかの場合において、酸化の工程は、ポリヌクレオチドホスホロチオエートを得るために硫化工程で置き換えられ、ここで、任意のキャッピング工程は、硫化後に実行することができる。Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬としても知られる３－（ジメチルアミノメチリデン）アミノ）－３Ｈ－１，２，４－ジチアゾール－３－チオン、ＤＤＴＴ、３Ｈ－１，２－ベンゾジチオール－３－オン １，１－ジオキシド、およびＮ，Ｎ，Ｎ’Ｎ’－テトラエチルチウラムジスルフィド（ＴＥＴＤ）を含むがこれらに限定されない多くの試薬は、効率的な硫黄移動が可能である。
カップリングを介してヌクレオシド取り込みの次のサイクルが起こるために、デバイスに結合した成長中のポリヌクレオチドの保護された５’末端が除去され、その結果、一次ヒドロキシル基が次のヌクレオシドホスホルアミダイトと反応する。いくつかの場合において、保護基はＤＭＴであり、ジクロロメタン中のトリクロロ酢酸で脱ブロック化が起こる。長時間または推奨される酸溶液よりも強い脱トリチル化を行うと、固体支持体に結合したポリヌクレオチドの脱プリンの増加をもたらし、したがって、所望の全長生成物の収量が減少する可能性がある。本明細書に記載の本開示の方法および組成物は、望ましくない脱プリン反応を制限する制御された脱ブロック化条件を提供する。いくつかの場合において、デバイスに結合したポリヌクレオチドは、脱ブロック化後に洗浄される。いくつかの場合において、脱ブロック化後の効率的な洗浄は、エラー率の低いポリヌクレオチドの合成に寄与する。
ポリヌクレオチドの合成のための方法は、典型的には、以下の工程の反復配列を含む：活性化表面、リンカー、または以前に脱保護されたモノマーのいずれかと連結するための、活性に官能化された表面（例えば、遺伝子座）への保護されたモノマーの適用；後に適用される保護されたモノマーと反応するように、適用されたモノマーの脱保護；および結合のための別の保護されたモノマーの適用。１つ以上の中間工程には、酸化または硫化が含まれる。いくつかの場合において、１つ以上の洗浄工程が、１つまたはすべての工程の前または後になる。
ホスホルアミダイトベースのポリヌクレオチド合成のための方法は、一連の化学的工程を含む。いくつかの場合において、合成方法の１つ以上の工程は、試薬サイクリングを含み、この方法の１つ以上の工程は、その工程のために有用な試薬のデバイスへの適用を含む。例えば、試薬は一連の液体沈着および真空乾燥工程によってサイクルされる。ウェル、マイクロウェル、チャネルなどのような三次元特徴を含む基材の場合、試薬は、任意選択で、ウェルおよび／またはチャネルを介してデバイスの１つ以上の領域を通過する。
本明細書に記載の方法およびシステムは、ポリヌクレオチドを合成するためのポリヌクレオチド合成デバイスに関する。合成は並行して行うことができる。例えば、少なくともまたは約少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１００００、５００００、７５０００、１０００００またはそれ以上のポリヌクレオチドを並行して合成することができる。並行して合成され得るポリヌクレオチドの総数は、２～１０００００、３～５００００、４～１００００、５～１０００、６～９００、７～８５０、８～８００、９～７５０、１０～７００、１１～６５０、１２～６００、１３～５５０、１４～５００、１５～４５０、１６～４００、１７～３５０、１８～３００、１９～２５０、２０～２００、２１～１５０、２２～１００、２３～５０、２４～４５、２５～４０、３０～３５であり得る。当業者は、並行して合成されるポリヌクレオチドの総数が、これらの値のいずれかによって制限される任意の範囲、例えば、２５～１００内に入る可能性があることを理解している。並行して合成されるポリヌクレオチドの総数は、範囲の終点として機能する値のいずれかによって定義される任意の範囲内に入る可能性がある。デバイス内で合成されたポリヌクレオチドの総モル質量または各ポリヌクレオチドのモル質量は、少なくともまたは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２５０００、５００００、７５０００、１０００００ピコモル以上であり得る。デバイス内の各ポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの平均長さは、少なくともまたは約少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００ヌクレオチド、またはそれ以上であり得る。デバイス内の各ポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの平均長さは、最大で、または最大で約５００、４００、３００、２００、１５０、１００、５０、４５、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０ヌクレオチド、またはそれ以下であり得る。デバイス内の各ポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの平均長さは、１０～５００、９～４００、１１～３００、１２～２００、１３～１５０、１４～１００、１５～５０、１６～４５、１７～４０、１８～３５、１９～２５の範囲であり得る。当業者は、デバイス内の各ポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの平均長が、これらの値のいずれかによって制限される任意の範囲、例えば、１００～３００内に入る可能性があることを理解している。デバイス内の各ポリヌクレオチドの長さまたはポリヌクレオチドの平均長さは、範囲の終点として機能する値のいずれかによって定義される任意の範囲内に入る可能性がある。
本明細書で提供される表面でのポリヌクレオチド合成のための方法は、高速での合成を可能にする。例として、１時間あたり、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２５、１５０、１７５、２００ヌクレオチド、またはそれ以上が合成される。ヌクレオチドには、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ウリジンビルディングブロック、またはそれらの類似体／修飾バージョンが含まれる。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドのライブラリーが基材上で並行して合成される。例えば、約または少なくとも約１００、１，０００、１０，０００、３０，０００、７５，０００、１００，０００、１，０００，０００、２，０００，０００、３，０００，０００、４，０００，０００、または、５，０００，０００の分解された遺伝子座を含むデバイスは、少なくとも同じ数の別個のポリヌクレオチドの合成をサポートすることができ、別個の配列をコードするポリヌクレオチドは、分解された遺伝子座上で合成される。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドのライブラリーは、本明細書に記載のエラー率が低いデバイス上で、約３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、３週間、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日、２４時間以内、またはそれ以下で合成される。いくつかの場合において、本明細書に記載の基材および方法を使用して低エラー率で合成されたポリヌクレオチドライブラリーから組み立てられたより大きな核酸は、約３ヶ月、２ヶ月、１ヶ月、３週間、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２日、２４時間以内、またはそれ以下で調製される。
いくつかの例において、本明細書に記載の方法は、複数のコドン部位で異なるバリアント核酸を含む核酸のライブラリーの生成を提供する。いくつかの場合において、核酸は、１部位、２部位、３部位、４部位、５部位、６部位、７部位、８部位、９部位、１０部位、１１部位、１２部位、１３部位、１４部位、１５部位、１６部位、１７部位１８部位、１９部位、２０部位、３０部位、４０部位、５０部位、またはそれ以上のバリアントコドン部位を有し得る。
いくつかの場合において、バリアントコドン部位の１つ以上の部位が隣接していてもよい。いくつかの場合において、バリアントコドン部位の１つ以上の部位が隣接しておらず、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコドンによって分離されていなくてもよい。
いくつかの場合において、核酸は、バリアントコドン部位の複数の部位を含み得、ここで、すべてのバリアントコドン部位は互いに隣接し、バリアントコドン部位のストレッチを形成する。いくつかの場合において、核酸は、バリアントコドン部位の複数の部位を含み得、ここで、バリアントコドン部位はどれも互いに隣接していない。いくつかの場合において、核酸は、バリアントコドン部位の複数の部位を含み得、ここで、いくつかのバリアントコドン部位は互いに隣接し、バリアントコドン部位のストレッチを形成し、そしていくつかのバリアントコドン部位は互いに隣接しない。
図面を参照すると、図７は、より短い核酸から核酸（例えば、遺伝子）を合成するための例示的なプロセスワークフローを示す。ワークフローは、一般的にフェーズに分けられる：（１）一本鎖核酸ライブラリーのデノボ合成、（２）核酸を結合してより大きなフラグメントの形成、（３）エラー修正、（４）品質管理、および（５）出荷。デノボ合成の前に、目的の核酸配列または核酸配列のグループが事前に選択される。例えば、遺伝子のグループが生成のために事前に選択される。
生成のための大きな核酸が選択されると、所定の核酸ライブラリーがデノボ合成のために設計される。高密度ポリヌクレオチドアレイを生成するための様々な適切な方法が知られている。ワークフローの例では、デバイスの表面層が提供されている。この例では、ポリヌクレオチド合成プロセスを改善するために、表面の化学的性質が変更されている。表面エネルギーの低い領域は液体をはじくために生成され、表面エネルギーの高い領域は液体を引き付けるために生成される。表面自体は、平面の形であるか、または表面積を増加させる突起またはマイクロウェルなどの形状の変化を含み得る。ワークフローの例では、選択された高表面エネルギー分子は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開ＷＯ／２０１５／０２１０８０に開示されているように、ＤＮＡ化学をサポートする二重の機能を果たす。
ポリヌクレオチドアレイのインサイチュ調製は、固体支持体上で生成され、単一ヌクレオチド伸長プロセスを利用して、複数のオリゴマーを並行して伸長する。材料沈着装置などの沈着装置は、複数のポリヌクレオチドが一度に１つの残基を並行して伸長して、所定の核酸配列１０２を有するオリゴマーを生成するように、段階的な様式で試薬を放出するように設計される。いくつかの場合において、ポリヌクレオチドはこの段階で表面から切断される。開裂には、例えば、アンモニアまたはメチルアミンによるガス開裂が含まれる。
生成されたポリヌクレオチドライブラリーは、反応チャンバーに配置される。この例示的なワークフローでは、反応チャンバー（「ナノリアクター」とも呼ばれる）は、ＰＣＲ試薬を含み、ポリヌクレオチドライブラリー１０３上で下げられたシリコンコーティングされたウェルである。ポリヌクレオチドのシーリング１０４の前または後に、試薬を添加して、ポリヌクレオチドを基材から放出する。例示的なワークフローでは、ポリヌクレオチドは、ナノリアクター１０５のシーリングに続いて放出される。一旦放出されると、一本鎖ポリヌクレオチドのフラグメントは、ＤＮＡの長距離配列全体にまたがるためにハイブリダイズする。部分的ハイブリダイゼーション１０５が可能であるのは、合成された各ポリヌクレオチドが、プール内の少なくとも１つの他のポリヌクレオチドと重複する小さな部分を有するように設計されているからである。
ハイブリダイゼーション後、ＰＣＡ反応が開始される。ポリメラーゼサイクルの間に、ポリヌクレオチドは相補的なフラグメントにアニーリングし、ギャップはポリメラーゼによって埋められる。各サイクルは、どのポリヌクレオチドがお互いを見つけるかに応じて、様々なフラグメントの長さをランダムに増加させる。フラグメント間の相補性は、二本鎖ＤＮＡ１０６の完全に大きなスパンを形成することを可能にする。
ＰＣＡが完了した後、ナノリアクターはデバイスから分離され１０７、ＰＣＲ用のプライマーを有するデバイスとの相互作用のために配置される１０８。シーリング後、ナノリアクターはＰＣＲに供され１０９、より大きな核酸が増幅される。ＰＣＲ１１０の後、ナノチャンバーが開かれ１１１、エラー修正試薬が追加され１１２、チャンバーがシールされ１１３、エラー修正反応が起こり、二本鎖ＰＣＲ増幅産物から不一致の塩基対および／または相補性の低い鎖が除去される１１４。ナノリアクターが開かれ、分離される１１５。エラー修正された生成物は、次にＰＣＲや分子バーコーディングなどの追加の処理工程の対象となり、出荷１２３用にパッケージされる１２２。
いくつかの場合において、品質管理措置が取られる。エラー修正後、品質管理工程は、例えば、エラー修正された生成物の増幅のための配列決定プライマーを有するウェーハとの相互作用１１６、エラー修正された増幅産物を含むチャンバーへのウェーハシーリング１１７、および増幅の追加ラウンドの実行を含む１１８。ナノリアクターが開かれ１１９、製品はプールされ１２０、そして配列決定される１２１。許容可能な品質管理決定がなされた後、包装された製品１２２は出荷１２３が承認される。
いくつかの場合において、図１のようなワークフローによって生成された核酸は、本明細書に開示される重複プライマーを使用する変異誘発の対象となる。いくつかの場合において、プライマーのライブラリーは、固体支持体上でのインサイチュ調製によって生成され、単一ヌクレオチド伸長プロセスを利用して、複数のオリゴマーを並行して伸長する。材料沈着装置などの沈着装置は、複数のポリヌクレオチドが一度に１つの残基を並行して伸長して、所定の核酸配列を有するオリゴマーを生成するように、段階的な様式で試薬を放出するように設計される１０２。
コンピュータシステム
本明細書に記載されるシステムのいずれかは、コンピュータに動作可能に連結され得、ローカルまたはリモートのいずれかでコンピュータを介して自動化され得る。様々な例において、本開示の方法およびシステムは、コンピュータシステム上のソフトウェアプログラムおよびその使用をさらに含み得る。したがって、材料沈着装置の動き、分配動作、および真空作動の調整および同期化などの分配／真空／補充機能の同期化のためのコンピュータ制御は、本開示の範囲内である。コンピュータシステムは、基材の指定された領域に正しい試薬を送達するために、ユーザが指定した塩基配列と材料沈着装置の位置との間のインターフェースをとるようにプログラムすることができる。
図２に図示されるコンピュータシステム２００は、媒体２１１および／またはネットワークポート２０５から命令を読み取ることができる論理装置として理解することができ、ネットワークポート２０５は、固定媒体２１２を有するサーバ２０９に任意選択で接続することができる。図２に示されるようなシステムは、ＣＰＵ２０１、ディスクドライブ２０３、キーボード２１５および／またはマウス２１６などのオプションの入力デバイス、およびオプションのモニタ２０７を含むことができる。データ通信は、示された通信媒体を介してローカルまたはリモートの場所にあるサーバに達成することができる。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含むことができる。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であり得る。このような接続は、ワールドワイドウェブを介した通信を提供できる。本開示に関連するデータは、図２に図示されるように、当事者２２２による受信および／またはレビューのために、そのようなネットワークまたは接続を介して送信され得ることが想定される。
図３に示されるように、高速キャッシュ３０４は、プロセッサ３０２に接続または組み込まれて、プロセッサ３０２によって最近使用されたか、または頻繁に使用される命令またはデータのための高速メモリを提供することができる。プロセッサ３０２は、プロセッサバス３０８によってノースブリッジ３０６に接続される。ノースブリッジ３０６は、メモリバス３１２によってランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）３１０に接続され、プロセッサ３０２によってＲＡＭ３１０へのアクセスを管理する。ノースブリッジ３０６はまた、チップセットバス３１６によってサウスブリッジ３１４にも接続される。次に、サウスブリッジ３１４は、周辺バス３１８に接続される。周辺バスは、例えば、ＰＣＩ、ＰＣＩ－Ｘ、ＰＣＩ Ｅｘｐｅｒｅｓｓ、または他の周辺バスであり得る。ノースブリッジおよびサウスブリッジは、プロセッサチップセットと呼ばれることが多く、プロセッサ、ＲＡＭ、および周辺バス３１８上の周辺コンポーネント間のデータ転送を管理する。一部の代替アーキテクチャでは、別のノースブリッジチップを使用する代わりに、ノースブリッジの機能をプロセッサに組み込むことができる。いくつかの場合において、システム３００は、周辺バス３１８に接続されたアクセラレータカード３２２を含むことができる。アクセラレータは、特定の処理を加速するためのフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）または他のハードウェアを含むことができる。例えば、アクセラレータは、適応型データの再構築や、拡張セット処理で使用される代数式の評価に使用できる。
ソフトウェアおよびデータは、外部ストレージ３２４に格納され、プロセッサによる使用のために、ＲＡＭ３１０および／またはキャッシュ３０４にロードすることができる。システム３００は、システムリソースを管理するためのオペレーティングシステムを含むみ、オペレーティングシステムの非限定的な例には、Ｌｉｎｕｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（商標）、ＭＡＣＯＳ（商標）、ＢｌａｃｋＢｅｒｒｙ ＯＳ（商標）、ｉＯＳ（商標）、およびその他の機能的に同等のオペレーティングシステム、ならびに本開示の事例に従ってデータストレージと最適化を管理するためのオペレーティングシステム上で実行されるアプリケーションソフトウェアが含まれる。この事例では、システム３００はまた、分散並列処理に使用できるネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）および他のコンピュータシステムなどの外部ストレージにネットワークインタフェースを提供するために周辺バスに接続されたネットワークインターフェースカード（ＮＩＣ）３２０および３２１も含む。
図４は、複数のコンピュータシステム４０２ａおよび４０２ｂ、複数の携帯電話およびパーソナルデータアシスタント４０２ｃ、ならびにネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）４０４ａおよび４０４ｂを備えたネットワーク４００を示す図である。例示的な事例において、システム４０２ａ、４０２ｂ、および４０２ｃは、データストレージを管理でき、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）４０４ａおよび４０４ｂに保存されているデータのデータアクセスを最適化できる。数学的モデルをデータに使用することができ、コンピュータシステム４０２ａおよび４０２ｂ、ならびに携帯電話および携帯情報端末システム４０２ｃにわたる分散並列処理を使用して評価することができる。コンピュータシステム４０２ａおよび４０２ｂ、ならびに携帯電話および携帯情報端末システム４０２ｃはまた、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）４０４ａおよび４０４ｂに格納されたデータの適応データ再構築のための並列処理を提供することができる。図４は一例のみを図示しており、本開示の様々な例と併せて、多種多様な他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムを使用することができる。例えば、ブレードサーバーを使用して並列処理を提供できる。プロセッサブレードは、バックプレーンを介して接続して、並列処理を提供できる。ストレージは、バックプレーンに接続することも、別のネットワークインタフェースを介してネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）として接続することもできる。いくつかの事例では、プロセッサは、別個のメモリ空間を維持し、他のプロセッサによる並列処理のために、ネットワークインタフェース、バックプレーン、または他のコネクタを介してデータを送信できる。他の例では、一部またはすべてのプロセッサが共有仮想アドレスメモリ空間を使用できる。
図５は、例示的な事例による、共有仮想アドレスメモリ空間を使用するマルチプロセッサコンピュータシステム５００のブロック図である。このシステムは、共有メモリサブシステム５０４にアクセスすることができる複数のプロセッサ５０２ａ～ｆを含む。システムは、メモリサブシステム５０４に複数のプログラム可能なハードウェアメモリアルゴリズムプロセッサ（ＭＡＰ）５０６ａ～ｆを組み込む。各ＭＡＰ５０６ａ～ｆは、メモリ５０８ａ～ｆおよび１つ以上のフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）５１０ａ～ｆを含むことができる。ＭＡＰは構成可能な機能ユニットを提供し、特定のアルゴリズムまたはアルゴリズムの一部をＦＰＧＡ ５１０ａ～ｆに提供して、それぞれのプロセッサと緊密に連携して処理することができる。例えば、ＭＡＰを使用して、データモデルに関する代数式を評価したり、例示的な事例において適応型データ再構築を実行したりできる。この例では、これらの目的のために、すべてのプロセッサが各ＭＡＰにグローバルにアクセスできる。１つの構成では、各ＭＡＰは、ダイレクトメモリアクセス（ＤＭＡ）を使用して、関連するメモリ５０８ａ～ｆにアクセスすることができ、それぞれのマイクロプロセッサ５０２ａ～ｆから独立して、そして非同期にタスクを実行することを可能にする。この構成では、ＭＡＰは、アルゴリズムのパイプライン化と並列実行のために、結果を別のＭＡＰに直接フィードできる。
上記のコンピュータアーキテクチャおよびシステムは単なる例であり、他の多種多様なコンピュータ、携帯電話、および携帯情報端末のアーキテクチャおよびシステムを、一般的なプロセッサ、コプロセッサ、ＦＰＧＡおよびその他のプログラム可能な論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、およびその他の処理および論理要素の任意の組み合わせを使用するシステムを含む、例示的な事例に関連して使用することができる。いくつかの場合において、コンピュータシステムの全部または一部をソフトウェアまたはハードウェアで実装できる。ランダムアクセスメモリ、ハードドライブ、フラッシュメモリ、テープドライブ、ディスクアレイ、ネットワーク接続ストレージ（ＮＡＳ）、およびその他のローカルまたは分散データストレージデバイスやシステムを含む、任意の様々なデータストレージメディアを例示的な事例に関連して使用できる。
例示的な事例では、コンピュータシステムは、上記または他のコンピュータアーキテクチャおよびシステムのいずれかで実行されるソフトウェアモジュールを使用して実装することができる。他の例では、システムの機能は、ファームウェア、図３に参照されるようなフィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）などのプログラム可能な論理デバイス、システムオンチップ（ＳＯＣ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、またはその他の処理および論理要素で部分的または完全に実装することができる。例えば、セットプロセッサおよびオプティマイザは、図３に図示されるアクセラレータカード３２２などのハードウェアアクセラレータカードを使用することにより、ハードウェアアクセラレーションで実装することができる。
以下の実施例は、本明細書に開示される実施形態の原理および実施を当業者に対してより明確に説明するために示され、特許請求される実施形態の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。特に明記されていない限り、すべての部とパーセンテージは重量ベースである。
以下の実施例は、本開示の様々な実施形態を説明する目的で与えられており、いかなる方法でも本開示を限定することを意味するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法とともに、現在好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、本開示の範囲を制限することを意図するものではない。特許請求の範囲によって定義される開示の精神に含まれるその中の変更および他の使用は、当該技術分野の当業者が理解する。
実施例１：デバイス表面の機能化
ポリヌクレオチドのライブラリーの結合および合成をサポートするようにデバイスを機能化した。デバイスの表面は、最初に９０％Ｈ２ＳＯ４と１０％Ｈ２Ｏ２を含むピラニア溶液を使用して２０分間ウェットクリーニングした。デバイスをいくつかのビーカーでＤＩ水を用いてすすぎ、ＤＩ水がん首蛇口の下に５分間保持し、そしてＮ２で乾燥させた。続いて、デバイスをＮＨ４ＯＨ（１：１００；３ｍＬ：３００ｍＬ）に５分間浸し、ハンドガンを使用してＤＩ水であるすぎ、３つの連続するビーカーにＤＩ水でそれぞれ１分間浸し、次にハンドガンを使用してＤＩ水で再度すすいだ。次に、デバイスの表面をＯ２にさらすことにより、デバイスをプラズマ洗浄した。ＳＡＭＣＯ ＰＣ－３００機器を使用して、ダウンストリームモードで２５０ワットで１分間、Ｏ２プラズマエッチングを行った。
洗浄されたデバイス表面は、以下のパラメータを有するＹＥＳ－１２２４Ｐ蒸着オーブンシステムを使用して、Ｎ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチラミドを含む溶液で能動的に機能化された：０．５～１ｔｏｒｒ、６０分、７０℃、１３５℃の気化器。デバイスの表面は、Ｂｒｅｗｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００Ｘスピンコーターを使用してレジストコーティングした。ＳＰＲ（商標）３６１２フォトレジストを、２５００ｒｐｍで４０秒間デバイス上にスピンコーティングした。デバイスは、Ｂｒｅｗｅｒホットプレート上で９０℃にて３０分間プリベークした。デバイスは、Ｋｕｒｌ Ｓｕｓ ＭＡ６マスクアライナ装置を使用してフォトリソグラフィーに供した。デバイスは２．２秒間露光され、ＭＳＦ ２６Ａで１分間現像した。残りの現像液をハンドガンで洗い流し、デバイスを５分間水に浸した。デバイスをオーブン内で１００℃にて３０分間ベーキングした後、Ｎｉｋｏｎ Ｌ２００を使用してリソグラフィの欠陥を目視検査しました。デスカムプロセスを使用して、ＳＡＭＣＯ ＰＣ－３００装置を使用して残留レジストを除去し、２５０ワットで１分間Ｏ２プラズマエッチングを行った。
デバイス表面は、１０μＬの軽質鉱油と混合されたパーフルオロオクチルトリクロロシランの１００μＬ溶液で受動的に機能化された。デバイスをチャンバーに入れ、１０分間ポンプで送った後、バルブをポンプに対して閉じて、１０分間放置した。チャンバーは空気にベントされた。最大出力（Ｃｒｅｓｔシステムでは９）で超音波処理を用いて、７０℃で５００ｍＬｎＭＰに５分間２回浸漬することにより、デバイスのレジストストリッピングを行った。次に、デバイスを室温で５００ｍＬのイソプロパノールに５分間浸し、最大出力で超音波処理した。デバイスを３００ｍＬの２００プルーフエタノールに浸し、Ｎ２を吹き付けて乾燥させた。機能化された表面は、ポリヌクレオチド合成のための支持体として機能するように活性化された。
実施例２：オリゴヌクレオチド合成デバイスでの５０量体配列の合成
二次元オリゴヌクレオチド合成デバイスは、フローセルに組み立てられ、これは、フローセル（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ３９４ ＤＮＡシンセサイザー））に接続された。二次元オリゴヌクレオチド合成デバイスは、Ｎ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチラミド（Ｇｅｌｅｓｔ）で均一に官能化し、これを使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチド合成法を使用して、５０ｂｐの例示的なポリヌクレオチド（「５０量体ポリヌクレオチド」）を合成した。
５０量体の配列は、配列番号２に記載されている通りであった。
５’ＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＡＴＴＴＧＧＧＧＴＧＧＡＣＡＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＣＴＡＧＡＣＴＴＣＧＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号２）、ここで＃はチミジン－スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ－２２４４）を示し、これは脱保護中に表面からオリゴを放出できるようにする切断可能なリンカーである。
合成は、表３のプロトコルおよびＡＢＩシンセサイザーに従って、標準的なＤＮＡ合成化学（カップリング、キャッピング、酸化、および脱ブロッキング）を使用して行った。
Figure 2022548783000004
Figure 2022548783000005
ホスホルアミダイト／アクチベータの組み合わせは、フローセルを介したバルク試薬の送達と同様に送達された。環境は常に試薬で「濡れている」ため、乾燥工程は実行しなかった。
より速い流れを可能にするために、流れ制限器がＡＢＩ ３９４シンセサイザーから取り外された。流れ制限器がない場合、アミダイト（ＡＣＮ中０．１Ｍ）、アクチベータ（ＡＣＮ中０．２５Ｍベンゾイルチオテトラゾール（「ＢＴＴ」；ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈの３０－３０７０－ｘｘ）、およびＯｘ（２０％ピリジン、１０％水および７０％ＴＨＦ中０．０２Ｍ Ｉ２）の場合、流量はおよそ～１００μＬ／秒であり、アセトニトリル（「ＡＣＮ」）およびキャッピング試薬（ＣａｐＡとＣａｐＢの１：１混合、ＣａｐＡはＴＨＦ／ピリジン中の無水酢酸であり、ＣａｐＢはＴＨＦ中１６％ １－メチルイミジゾールである）の場合、およそ～２００μＬ／秒であり、そしてＤｅｂｌｏｃｋ（トルエン中の３％ジクロロ酢酸）の場合、およそ～３００μＬ／秒であった（流れ制限器付きのすべての試薬の約５０μＬ／秒と比較して）。酸化剤を完全に押し出す時間を観察し、それに応じて化学薬品の流れ時間のタイミングを調整し、異なる化学薬品の間に追加のＡＣＮ洗浄を導入した。ポリヌクレオチド合成後、チップをガス状アンモニアで７５ｐｓｉにて一晩脱保護した。ポリヌクレオチドを回収するために、５滴の水を表面に適用した。次に、回収されたポリヌクレオチドをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ ｓｍａｌｌ ＲＮＡチップで分析した。
実施例３：オリゴヌクレオチド合成デバイスでの１００量体配列の合成
５０量体配列の合成について実施例２に記載されたのと同じプロセスを、１００量体ポリヌクレオチド（「１００量体ポリヌクレオチド」；５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＣＧＡＣＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＣＡＧＴＣＡＴＧＣＴＡＧＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧＣＡＴ＃＃ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ３’）の合成に使用し、＃は２つの異なるシリコンチップ上のチミジン－スクシニルヘキサミドＣＥＤホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓのＣＬＰ－２２４４、配列番号１０５）を示し、１つ目はＮ－（３－トリエトキシシリルプロピル）－４－ヒドロキシブチラミドで均一に官能化され、２つ目は１１－アセトキシウンデシルトリエトキシシランとｎ－デシルトリエトキシシランの５／９５混合物で官能化され、そして表面から抽出されたポリヌクレオチドをＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ装置で分析した。
２つのチップからの１０個のサンプルすべてを、５０μＬ ＰＣＲミックス（２５μＬ ＮＥＢ Ｑ５マスターミックス、２．５μＬ １０μＭ フォワードプライマー、２．５μＬ １０μＭ リバースプライマー、表面から抽出された１μＬポリヌクレオチド、および最大５０μＬの水）中のフォワードプライマー（５’ＡＴＧＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＴＣＡＴＣ３’；配列番号１０６）およびリバースプライマー（５’ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＣＧＴＣＡＴＣＧ３’；配列番号１０７）プライマーを使用して、以下のサーマルサイクリングプログラム：
９８℃、３０秒
９８℃、１０秒；６３℃、１０秒；７２℃、１０秒；１２サイクル繰り返す
７２℃、２分。
を使用して、さらにＰＣＲ増幅した。
ＰＣＲ産物はまた、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で泳動され、１００量体の位置に鋭いピークを示した。次に、ＰＣＲ増幅サンプルをクローニングし、Ｓａｎｇｅｒの配列決定を行った。表３は、チップ１からのスポット１～５から取得したサンプルと、チップ２からのスポット６～１０から取得したサンプルのサンガー配列決定の結果をまとめたものである。
Figure 2022548783000006
したがって、合成されたポリヌクレオチドの高品質および均一性は、異なる表面化学特徴を有する２つのチップ上で繰り返された。全体として、配列決定された１００量体の８９％はエラーのない完全な配列であり、２６２のうちの２３３に相当する。
表４は、スポット１～１０からのポリヌクレオチドサンプルから得られた配列のエラー特性を要約する。
Figure 2022548783000007
Figure 2022548783000008
実施例４：ＶＨＨライブラリー
合成ＶＨＨライブラリーが開発された。調整されたＣＤＲ多様性を備えた「ＶＨＨ Ｒａｔｉｏ」ライブラリーの場合、２３９１個のＶＨＨ配列（ｉＣＡＮデータベース）がＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して整列され、各位置でのコンセンサスが決定され、フレームワークは各位置でのコンセンサスから導出された。２３９１個の配列のすべてのＣＤＲは、位置固有の変動について分析され、この多様性はライブラリー設計に導入された。シャッフルされたＣＤＲ多様性を備えた「ＶＨＨ Ｓｈｕｆｆｌｅ」ライブラリーの場合、ナノボディ配列内のユニークなＣＤＲについて、ｉＣＡＮデータベースをスキャンした。１２３９個のユニークなＣＤＲ１、１６００個のユニークなＣＤＲ２、および１６０８個のユニークなＣＤＲ３が識別され、フレームワークは、ｉＣＡＮデータベースの２３９１個の配列内の各フレームワーク位置でのコンセンサスから導出された。ユニークなＣＤＲのそれぞれは、コンセンサスフレームワーク中で個別に合成およびシャッフルされ、理論上の多様性が３．２×１０＾９のライブラリーを生成した。次に、制限酵素消化を使用して、ライブラリーをファージミドベクターにクローニングした。「ＶＨＨ ｈＳｈｕｆｆｌｅ」ライブラリー（シャッフルされたＣＤＲ多様性を備えた合成「ヒト」ＶＨＨライブラリー）の場合、ｉＣＡＮデータベースをスキャンしてナノボディ配列内のユニークなＣＤＲを探した。１２３９個のユニークなＣＤＲ１、１６００個のユニークなＣＤＲ２、および１６０８個のユニークなＣＤＲ３が識別され、フレームワーク１、３、および４がヒト生殖細胞系列ＤＰ－４７フレームワークから導出された。フレームワーク２は、ｉＣＡＮデータベースの２３９１個の配列内の各フレームワーク位置でのコンセンサスから導出された。ユニークなＣＤＲはそれぞれ、ＮΜＧＥツールを使用して部分的にヒト化されたフレームワークで個別に合成およびシャッフルされ、理論上の多様性が３．２×１０＾９のライブラリーを生成した。次に、ＮΜＧＥツールを使用してライブラリーをファージミドベクターにクローニングした。
Ｃａｒｔｅｒｒａ ＳＰＲシステムを使用して、ＶＨＨ－Ｆｃバリアントの結合親和性および親和性分布を評価した（データ示さず）。表５Ａは、ＥＬＩＳＡ、プロテインＡ（ｍｇ／ｍｌ）、およびＫＤ（ｎＭ）についてのＶＨＨ－Ｆｃクローンの特定の値を提供する。図７Ａおよび図７Ｂは、２０～４０００の親和性閾値（図７Ａ；一価のＫＤ）および２０～１０００の親和性閾値（図７Ｂ；一価のＫＤ）をわたる、ＶＨＨライブラリーのＴＩＧＩＴ親和性分布を示す。テストした１４０個のＶＨＨバインダーのうち、５１のバリアントの親和性は１００ｎＭ未満で、９０のバリアントの親和性は２００ｎＭ未満であった。図８は、「ＶＨＨ比率」ライブラリー、「ＶＨＨ ｓｈｕｆｆｌｅ（シャッフル）ライブラリー」、および「ＶＨＨ ｈＳｈｕｆｆｌｅライブラリー」の長さあたりのＣＤＲ３カウントのデータを示す。表５Ｂは、「ＶＨＨ ｒａｔｉｏ（比率）」ライブラリー、「ＶＨＨ Ｓｈｕｆｆｌｅライブラリー」、および「ＶＨＨ ｈＳｈｕｆｆｌｅライブラリー」についてのＴＩＧＩＴユニーククローンとＴＩＧＩＴバインダーの数を示す。
Figure 2022548783000009
Figure 2022548783000010
ＶＨＨ－Ｆｃ ＴＩＧＩＴクローンの熱安定性および競合分析が図９および表６に見られる。競合アッセイでは、４μｇ／ｍＬ ＴＩＧＩＴを固定化し、０．０５～１００ｎＭ ＶＨＨ－Ｆｃとともにインキュベートした後、２μｇ／ｍＬビオチン－ＣＤ１５５および１：５０００ストレプトアビジン－ＨＲＰとともにインキュベートした。
Figure 2022548783000011
ＣＤ４７ ＶＨＨ変異体もまた生成され、分析された。図１０は、ＣＤ４７親和性分布を示す。表７は、「ＶＨＨ比率ｒａｔｉｏ」ライブラリー、「ＶＨＨ ｓｈｕｆｆｌｅシャッフルライブラリ」、および「ＶＨＨ ｈＳｈｕｆｆｌｅライブラリー」のＣＤ４７固有のクローンおよびＴＩＧＩＴバインダーの数を示す。表８は、ＣＤ４７ ＶＨＨバリアントの結合親和性を示す。表８に見られるように、８つのＣＤ４７ＶＨＨバインダーはｈＣＤ４７に対して１００ｎＭ未満の親和性を有し、６つのＣＤ４７ＶＨＨバインダーはｃＣＤ４７に対して１００ｎＭ未満の親和性を有した。
Figure 2022548783000012
Figure 2022548783000013
ＶＨＨ－Ｆｃ ＣＤ４７クローンの阻害および熱安定性分析が図１１および表９に見られる。阻害アッセイのために、３μｇ／ｍＬのＣＤ４７を固定化し、０．３～１３２ｎＭのＶＨＨ－Ｆｃとインキュベートした後、０．２５μｇ／ｍＬのビオチン－ＳＩＲＰアルファおよび１：５０００ストレプトアビジン－ＨＲＰとともにインキュベートした。
Figure 2022548783000014
実施例５．ＧＬＰ１ＲのためのＶＨＨライブラリー
ＧＬＰ１ＲのためのＶＨＨライブラリーは、実施例４に記載された方法と同様に開発された。簡単に言えば、ＧＬＰ１Ｒを発現する安定な細胞株が生成され、標的発現がＦＡＣＳによって確認された。次に、標的の８０％を超えて発現する細胞を、細胞ベースの選択のために使用した。目的の標的を安定して過剰発現している細胞に対して、５ラウンドの細胞ベースの選択を行った。選択の各ラウンドに１０８個の細胞を使用した。標的発現細胞で選択する前に、各ラウンドからのファージを最初に１０８個のＣＨＯバックグラウンド細胞で枯渇させた。選択のストリンジェンシーは、選択の後続のラウンドでの洗浄の数を増やすことによって増加させた。次に、トリプシンを使用して細胞をファージから溶出させ、次のパニングのラウンドのためにファージを増幅させた。ラウンド４とラウンド５からの合計１０００個のクローンがＮＧＳによって配列決定され、ＶＨＨ－Ｆｃとして再フォーマットするためのユニークなクローンが同定される。
１５６個のユニークなＧＬＰ１Ｒ ＶＨＨ Ｆｃバインダーのうちの５３個は、親細胞に対して２倍の標的細胞平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を有していた。バリアントＧＬＰ１Ｒ－４３－７７のデータを図１２Ａ－１２Ｂおよび表１０－１１に示す。表１１はＲＬ１－Ａチャネルで検出されたフローサイトメトリーデータを示す。
Figure 2022548783000015
Figure 2022548783000016
実施例６．ＣＲＴＨ２ＲのためのＶＨＨライブラリー
ＣＲＴＨ２ＲのためのＶＨＨライブラリーは、実施例４に記載された方法と同様に開発された。簡単に述べると、ＣＲＴＨ２Ｒを発現する安定な細胞株が生成され、標的発現がＦＡＣＳによって確認された。次に、標的の８０％より多くを発現する細胞を、細胞ベースの選択のために使用した。目的の標的を安定して過剰発現している細胞に対して、５ラウンドの細胞ベースの選択を実行した。選択の各ラウンドに１０８個の細胞を使用した。標的発現細胞で選択する前に、各ラウンドからのファージを最初に１０８個のＣＨＯバックグラウンド細胞で枯渇させた。選択のストリンジェンシーは、選択の後続のラウンドでの洗浄の数を増やすことによって増加した。次に、トリプシンを使用して細胞をファージから溶出し、次のパニングラウンドのためにファージを増幅した。ラウンド４とラウンド５からの合計１０００個のクローンがＮＧＳによって配列決定され、ＶＨＨ－Ｆｃとして再フォーマットするためのユニークなクローンが識別される。
１７５個のユニークなＣＲＴＨ２Ｒ ＶＨＨ Ｆｃバインダーのうちの２６個のバインダーは、親細胞の２倍である標的細胞平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を有していた。バリアントＣＲＴＨ２－４１－５１のデータを図１３Ａ－１３Ｂおよび表１２－１３に示す。表１３は、ＲＬ１－Ａチャネルで検出されたフローサイトメトリーデータを示す。バリアントＣＲＴＨ２－４４－５９のデータは図１４Ａ－１４Ｄに見られる。
Figure 2022548783000017
Figure 2022548783000018
実施例７．ＣＲＴＨ２ＲのためのＩｇＧの同定
抗ＣＲＴＨ２Ｒ抗体の細胞結合は、ＣＨＯ ＣＲＴＨ２Ｒ陽性細胞（ＧＦＰ＋）および親ＣＨＯ細胞（ＧＦＰ－）で試験し、親陰性細胞と標的陽性細胞とを比較して偽陽性を除外することによって決定された。表１４Ａに列挙されている抗体は、１００ｎＭ（１５μｇ／ｍＬ）から開始し、合計８点について、３倍のタイトレーションを行った。ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体の重鎖および軽鎖配列を表１４Ｂに示す。濃度による平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって検出される結合を図１５Ａ－１５Ｅに示す。ＣＲＴＨ２－２７を用いる１００ｎＭでの例示的なゲートドットプロットとＡＰＣヒストグラムを図１６Ａ－１６Ｂに示す。２つの抗体（ｇＰＣＲ－５１およびｇＰＣＲ－５２）を陽性対照として使用した。２つの陽性対照の結合プロファイルを図１７Ａ－１７Ｂに示す。
Figure 2022548783000019
Figure 2022548783000020

Figure 2022548783000021

Figure 2022548783000022
後続の実施例において、５つの抗体、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－３２、およびＣＲＴＨ２－４２は、ｃＡＭＰアッセイにおいて機能的効果を有することが示された。これらの抗体の結合曲線は、図１８Ａ－１８Ｂで比較される。
実施例８．ｃＡＭＰアッセイを使用するアンタゴニスト活性
ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体のライブラリーをアッセイして、ＰＧＤ２誘導性ｃＡＭＰシグナルにおけるアンタゴニスト機能を決定した。簡単に説明すると、細胞をＩｇＧ（タイトレーション１：３）と室温で１時間プレインキュベートした。続いて、ＣＲＴＨ２ＲはGαｉ共役しているため、フォルスコリンの存在下、細胞をＰＧＤ２（０．５９ｎＭ）で３７℃にて３０分間刺激した。
相対光単位（ｒｌｕ）で検出されたシグナルに対する抗体の効果を決定した（データ示さず）。試験された最高濃度（３００ｎＭ）で、いくつかのＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧは、シグナルの上方偏向を引き起こし、ＰＧＤ２刺激によって誘発されるｃＡＭＰシグナルの阻害を示した。比較のために、ＩｇＧ処理対試験された３つの最高のＩｇＧ濃度について処理された対照の比を示す棒グラフが図１９Ａに示される。図１９Ｂに示される抗体は、３３ｎＭで２０％を超えるアンタゴニスト活性をもたらしたＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体を、具体的には、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－２４、ＣＲＴＨ２－２８、ＣＲＴＨ２－１９、ＣＲＴＨ２－４５、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－８、ＣＲＴＨ２－１５、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－６０、およびＣＲＴＨ２－７０を示す。
実施例９．ＰＧＤ２誘導性ｃＡＭＰシグナルのアロステリック調節
ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体をアロステリック活性についてアッセイした。アロステリック調節は、ＰＧＤ２誘導ｃＡＭＰシグナルにおけるＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体をアッセイすることによって決定された。簡単に説明すると、細胞をＩｇＧ抗体なしまたは１００ｎＭのＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体とともに再インキュベートした。続いて、フォルスコリンの存在下で細胞を様々な濃度のＰＧＤ２で刺激し、続いてｃＡＭＰ活性をアッセイした。
ｃＡＭＰアッセイの結果は、図２０に見られる。ＰＧＤ２用量反応曲線の右方向へのシフト（およびＩＣ５０値の増加）は、負のアロステリック効果を示す。図２０に示すように、ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧの５つ（ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－３２、およびＣＲＴＨ２－４２）は、ＰＧＤ２単独と比較して＞２．０のＩＣ５０倍差を引き起こし、それらが負のアロステリックモジュレーターであることを示唆している。
実施例１０．ＰＧＤ２誘導性ｃＡＭＰシグナルのアゴニスト活性
ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体をアゴニスト機能についてアッセイした。アゴニスト活性は、ＰＧＤ２誘導ｃＡＭＰシグナルにおいて実施例７に記載されているＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体をアッセイすることによって決定された。
簡単に述べると、細胞を、フォルスコリンの存在下で、ＰＧＤ２またはＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体の両方で処理した。ＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体には、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－２４、ＣＲＴＨ２－２８、ＣＲＴＨ２－３９、ＣＲＴＨ２－１９、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－８、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－４５、ＣＲＴＨ２－３５、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－６６、ＣＲＴＨ２－５７、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－１５、ＣＲＴＨ２－２５、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－６０、およびＣＲＴＨ２－７０が含まれた。治療刺激は３７℃で３０分間行った。次に、ｃＡＭＰアッセイを実施した（データ示さず）。
実施例１１．アロステリックモジュレーターを示す対照実験
アロステリック調節は、既知のＣＲＴＨ２Ｒアンタゴニスト（小分子ＯＣ０００４５９）および２つの対照抗体について決定された。実験は、実施例９に記載されたものと同様に実施された。簡単に言えば、細胞を、ＯＣ０００４５９、コンパレーターＣＲＴＨ２Ｒ ＡＢ５１抗体、またはコンパレーターＣＲＴＨ２Ｒ ＡＢ５２抗体で処理した。次に、フォルスコリンの存在下で細胞をＰＧＤ２で刺激した。
結果を図２１Ａ－２１Ｃに示す。ＯＣ０００４５９は、曲線の右方向への強いシフトとＩＣ５０値の４５９倍の増加を引き起こす（図２１Ａ）。ＣＲＴＨ２Ｒ ＡＢ５１とのインキュベーションは、ＩＣ５０値に変化を引き起こさなかった（図２１Ｂ）。コンパレーター抗体＃５２とのインキュベーションは、ＩＣ５０値の３．５倍の減少を引き起こし、これが正のアロステリックモジュレーターであること、すなわち、アゴニスト効果を有することを示す（図２１Ｃ）。
実施例１２．アンタゴニスト調節のためのＣＲＴＨ２Ｒ β－アレスチン動員アッセイ
９個のＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体によるアンタゴニスト調節が決定された。９個のＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧ抗体には、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－２８、およびＣＲＴＨ２－３９が含まれた。ＯＣ０００４５９と比較したこれらの９個の抗体のアンタゴニスト機能は、ＰＧＤ２によって誘導されるβ－アレスチン動員を使用して決定された。小分子ＯＣ０００４５９を使用したポジティブ対照を含む結果を図２２Ａ－２２Ｄに示す。
実施例１３．アロステリック調節のためのＣＲＴＨ２Ｒ β－アレスチン動員アッセイ
９個のＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧによるアロステリック調節が決定された。９個のＣＲＴＨ２Ｒ ＩｇＧには、ＣＲＴＨ２－９、ＣＲＴＨ２－２７、ＣＲＴＨ２－５０、ＣＲＴＨ２－３２、ＣＲＴＨ２－４２、ＣＲＴＨ２－７４、ＣＲＴＨ２－５５、ＣＲＴＨ２－２８、およびＣＲＴＨ２－３９が含まれた。ＯＣ０００４５９と比較したこれらの９個の抗体のアロステリック調節は、ＰＧＤ２によって誘導されるβ－アレスチンの動員を使用して決定された。
簡単に説明すると、細胞をＩｇＧ（１００ｎＭ）と共に室温で１時間プレインキュベートし、続いて３７℃で９０分間ＰＧＤ２刺激した。データは、各グラフの最初のデータポイント（最低のＰＧＤ２とゼロのＡｂ）に対して正規化された。
実施例１４．過免疫免疫グロブリンライブラリー
過免疫免疫グロブリン（ＩｇＧ）ライブラリーは、実施例４に記載されたのと同様の方法を使用して作製された。簡単に説明すると、過免疫ＩｇＧライブラリーは、３人の健康なドナーのそれぞれからの３７００万を超えるユニークなＩｇＨ配列からなるヒトナイーブおよび記憶Ｂ細胞受容体配列のデータベースの分析から生成された。２００万を超えるＣＤＲＨ３配列がこの分析から収集され、実施例１～３と同様の方法を使用して個別に構築された。重複するＣＤＲＨ３と、開発において頻繁に問題を引き起こす可能性のある不利な原因となる（ｌｉａｂｉｌｉｔｙ）モチーフは、ライブラリー合成工程で削除された。次に、これらのＣＤＲＨ３配列の多様性をコンビナトリアルに組み立て、ＤＰ４７ヒトフレームワークに組み込んで、１×１０１０サイズの高機能抗体Ｆａｂライブラリーを構築した。設計の概略図は図２４に見ることができる。
過免疫抗体ライブラリーの重鎖ＣＤＲ長分布は、次世代配列決定（ＮＧＳ）によって評価された。ＣＤＲの長さ分布のデータを図２５Ａ－２５Ｂに示す。一般に、可溶性タンパク質標的の選択は、ラウンド１で３回のＰＢＳＴ洗浄、ラウンド２で５回のＰＢＳＴ洗浄、ラウンド３で７回のＰＢＳＴ洗浄、ラウンド４で９回のＰＢＳＴ洗浄、およびラウンド５で１２回のＰＢＳＴ洗浄を含む５ラウンドの選択を受ける。脱脂乳ブロックを使用した。図２６を参照されたい。
ヒトＴＩＧＩＴ（ｈＴＩＧＩＴ）の場合、１μＭのビオチン化抗原を、１０ｍｇ／ｍＬである３００μｌのＤｙｎａｂｅａｄ Ｍ－２８０と混合して、１００μｌあたり１００ｐｍｏｌの濃度を生成した。さまざまな選択ラウンドの詳細は表１５に見られる。
Figure 2022548783000023
様々なラウンドの選択の後、ｈＴＩＧＩＴ ＩｇＧを分析した。データは図２７Ａ～２７Ｆおよび表１６に見られる。図２７Ａ－２７Ｄは、ラウンド３およびラウンド４からのＥＬＩＳＡデータを示す。図２７Ｅ－２７Ｆは、分析されたｈＴＩＧＩＴ ＩｇＧのＣＤＲＨ３の長さ、収量（μｇ）、およびＫＤ（ｎＭ）のデータを示す。
Figure 2022548783000024
１７個の同一でないｈＴＩＧＩＴ免疫グロブリンが、１６ｎＭから３００ｎＭを超える範囲の一価の親和性で同定された。これらの免疫グロブリンのほとんどはよく発現し、１ｍｌの発現量で２０μｇを超える精製タンパク質を産生した。ｈＴＩＧＩＴ免疫グロブリンの配列を表１７に示す。
Figure 2022548783000025
Figure 2022548783000026

Figure 2022548783000027
ヒトＣＤ３イプシロン（ｈＣＤ３）およびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン（ｃＣＤ３）免疫グロブリンの同定を行った。さまざまな選択ラウンドの詳細を表１８に示す。
Figure 2022548783000028
様々なラウンドの選択の後、ＣＤ３イプシロン（ＣＤ３ε）ＩｇＧを分析した。データは図２８Ａ－２８Ｌおよび表１９Ａ－１９Ｂに見られる。図２８Ａ－２８Ｆは、ラウンド４およびラウンド５からのＥＬＩＳＡデータを示す。図２８Ｇ－２８Ｌは、ヒトＣＤ３イプシロンとｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン免疫グロブリンの交差反応性のデータを示す。
Figure 2022548783000029
ヒト／ｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン交差反応性免疫グロブリンである５つを含む、１９個の非同一のｈＣＤ３イプシロンおよびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン免疫グロブリンが同定された。 ヒト／ｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロン交差反応性抗体の１つであるＣＤ３－５６－０５は、ヒトおよびｃｙｎｏ ＣＤ３イプシロンにそれぞれ６７および１０７ｎＭの親和性で結合する。ｈＣＤ３イプシロンおよびｃＣＤ３イプシロン免疫グロブリンの配列を表２０に示す。
Figure 2022548783000030
Figure 2022548783000031
ＣＲＴＨ２Ｒ過免疫免疫グロブリンライブラリーが生成された。簡単に説明すると、目的の標的を安定して過剰発現している細胞に対して、５ラウンドの細胞ベースの選択を行った。選択の各ラウンドに１０８個の細胞を使用した。標的発現細胞で選択する前に、各ラウンドからのファージを最初に１０８個のＣＨＯバックグラウンド細胞で枯渇させた。選択のストリンジェンシーは、選択の後続のラウンドでの洗浄の数を増やすことによって増加させた。次に、トリプシンを使用して細胞をファージから溶出させ、次のパニングラウンドのためにファージを増幅させた。
ＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンは、ＰＧＤ２誘導性ｃＡＭＰの結合親和性およびアロステリックモジュレーター機能について評価した。図３０Ａ－３０Ｆに見られるように、３つの特定のＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリンは、ｈＣＲＴＨ２Ｒへのサブナノモルから１桁のナノモル濃度細胞結合親和性で同定され、アロステリックｃＡＭＰアッセイにおいて阻害活性を示した。３つのＣＲＴＨ２Ｒ免疫グロブリン、ＣＲＴＨ２－４８－３、ＣＲＴＨ２－４８－２１、およびＣＲＴＨ２－４８－２７の配列を表２１に示す。
Figure 2022548783000032
実施例１５．Ａ２Ａ受容体のための過免疫免疫グロブリンライブラリー
過免疫免疫グロブリン（ＩｇＧ）ライブラリーは、実施例４および１４に記載されているのと同様の方法を使用して作成された。簡単に言えば、過免疫ＩｇＧライブラリーは、３人の健康なドナーのそれぞれからの３７００万を超えるユニークなＩｇＨ配列からなるヒトナイーブおよび記憶Ｂ細胞受容体配列のデータベースの分析から生成された。分析から２００万を超えるＣＤＲＨ３配列が収集され、実施例１－３と同様の方法を使用して個別に構築された。ＣＤＲＨ３配列は、実施例４に記載したＶＨＨ ｈＳｈｕｆｆｌｅライブラリーに組み込まれた。最終的なライブラリーの多様性は１．３×１０１０であると決定された。
８８個のユニークなクローンのうちの７３個は、親細胞の２倍の標的細胞ＭＦＩ値を有していた。８８個のユニークなクローンのうち１５個が、標的細胞のＭＦＩ値が親細胞の２０倍であった。アデノシンＡ２Ａ受容体バリアントＡ２ＡＲ－９０－００７のデータを図３１Ａ－３１Ｂに示す。
この実施例は、ナノモル以下の範囲の高い親和性およびＫＤ値を有するＡ２ＡＲについてのＶＨＨライブラリーの生成を示す。
本開示の好ましい実施形態が本明細書に示され、説明されてきたが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることは当業者には明らかであろう。多数の変形、変更、および置換が、本開示から逸脱することなく、当該技術分野の当業者に行われるであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な代替案が、本開示の実施において使用され得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲は、開示の範囲を定義し、これらの特許請求の範囲内の方法および構造、ならびにそれらの同等物は、それによってカバーされることが意図されている。

Claims (51)

  1. 配列番号１５２または１５５に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号１５３または１５６に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、および配列番号１５４または１５７に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３を含む抗体または抗体フラグメント。
  2. 配列番号１５８または１６１に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１５９または１６２に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および配列番号１６０または１６３に記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３をさらに含む、請求項１に記載の抗体または抗体フラグメント。
  3. 請求項１－２のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、癌を治療する方法。
  4. 請求項１－２のいずれか一項に記載の抗体または抗体フラグメントを投与する工程を含む、ウイルス感染を治療する方法。
  5. 翻訳されたときに抗体または抗体フラグメントをコードする核酸を含む複数の配列を含む核酸ライブラリーであって、ここで、複数の配列の各配列は、重鎖（ＶＨ）の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３、または軽鎖（ＶＬ）の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、もしくはＣＤＲ３をコードするバリアント配列を含み、前記核酸ライブラリーは、少なくとも３０，０００個のバリアント配列を含み、前記抗体または抗体フラグメントは、１００ｎＭ未満のＫＤでその抗原に結合する、核酸ライブラリー。
  6. 前記抗体が単一ドメイン抗体である、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  7. 前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、請求項６に記載の核酸ライブラリー。
  8. 前記抗体がＴＩＧＩＴに結合する、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  9. 翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号８４－１００に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  10. 翻訳されたときの前記軽鎖の可変領域が、配列番号１０１－１１７に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  11. 前記重鎖の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、配列番号６７－８３または１１８－１２８のいずれか１つに記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  12. 前記軽鎖の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、配列番号１２９－１３７のいずれか１つに記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  13. 前記抗体がＣＤ４７に結合する、請求項５記載の核酸ライブラリー。
  14. 前記抗体がＣＤ３イプシロンに結合する、請求項５記載の核酸ライブラリー。
  15. 翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号１３８－１４１に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  16. 翻訳されたときの前記軽鎖の可変領域が、配列番号１４２－１４５に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  17. 少なくとも５０，０００個のバリアント配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  18. 少なくとも１００，０００個のバリアント配列を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  19. 少なくとも１０５個の同一でない核酸を含む、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  20. 少なくとも１０９配列の理論的多様性を有する、請求項５に記載の核酸ライブラリー。
  21. 翻訳されたときに単一ドメイン抗体をコードする核酸を含む複数の配列を含む核酸ライブラリーであって、前記複数の配列の各配列は、重鎖（ＶＨ）の可変領域上のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３をコードするバリアント配列を含み、ここで、前記核酸ライブラリーは少なくとも３０，０００個のバリアント配列を含み、前記抗体または抗体フラグメントは、１００ｎＭ未満のＫＤでその抗原に結合する、核酸ライブラリー。
  22. 翻訳されたときの前記ＶＨの長さが約９０～約１００アミノ酸である、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  23. 翻訳されたときの前記ＶＨの長さが約１００～約４００アミノ酸である、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  24. 前記ＶＨの長さが約２７０～約３００塩基対である、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  25. 前記ＶＨの長さが約３００～約１２００塩基対である、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  26. 前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  27. 前記抗体がＴＩＧＩＴに結合する、請求項２１記載の核酸ライブラリー。
  28. 前記ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３が、配列番号６７－８３または１１８－１２８のいずれか１つに記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  29. 翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号８４－１００のいずれか１つに記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  30. 前記重鎖の可変領域上のＣＤＲ３が、配列番号１０１－１１７のいずれか１つに記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  31. 前記抗体がＣＤ４７に結合する、請求項２１記載の核酸ライブラリー。
  32. 前記抗体がＣＤ３イプシロンに結合する、請求項２１記載の核酸ライブラリー。
  33. 翻訳されたときの前記重鎖の可変領域が、配列番号１３８－１４１に記載されるものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  34. 少なくとも５０，０００個のバリアント配列を含む、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  35. 少なくとも１００，０００個のバリアント配列を含む、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  36. 少なくとも１０５個の同一でない核酸を含む、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  37. 少なくとも１０９配列の理論的多様性を有する、請求項２１に記載の核酸ライブラリー。
  38. 単一ドメイン抗体をコードする核酸ライブラリーを生成するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）所定の配列を提供する工程であって、前記所定の配列は、
    ｉ．第１の複数のポリヌクレオチドであって、前記第１の複数のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは、重鎖上のＣＤＲ１をコードする少なくとも１０００個のバリアント配列をコードする、第１の複数のポリヌクレオチド、
    ｉｉ．第２の複数のポリヌクレオチドであって、前記第２の複数のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは、重鎖上のＣＤＲ２をコードする少なくとも１０００個のバリアント配列をコードする、第２の複数のポリヌクレオチド、
    ｉｉｉ．第３の複数のポリヌクレオチドであって、前記第３の複数のポリヌクレオチドの各ポリヌクレオチドは、重鎖上のＣＤＲ３をコードする少なくとも１０００個のバリアント配列をコードする、第３の複数のポリヌクレオチド
    をコードする、所定の配列を提供する工程、
    （ｂ）前記第１の複数のポリヌクレオチド、前記第２の複数のポリヌクレオチド、および前記第３の複数のポリヌクレオチドを混合して、単一ドメイン抗体をコードするバリアント核酸の核酸ライブラリーを形成する工程であって、前記バリアント核酸の少なくとも約７０％は、１００ｎＭ未満のＫＤでその抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする、工程
    を含む、方法。
  39. 前記単一ドメイン抗体が１つの重鎖可変ドメインを含む、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記単一ドメイン抗体がＶＨＨ抗体である、請求項３８に記載の方法。
  41. 前記単一ドメイン抗体がＴＩＧＩＴに結合する、請求項３８に記載の方法。
  42. 前記単一ドメイン抗体が、配列番号８４－１００または１３８－１４１のいずれか１つに記載されているものと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  43. 前記単一ドメイン抗体がＣＤ４７に結合する、請求項３８に記載の方法。
  44. 前記核酸ライブラリーが少なくとも５０，０００個のバリアント配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  45. 前記核酸ライブラリーが少なくとも１００，０００個のバリアント配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  46. 前記核酸ライブラリーが少なくとも１０５個の同一でない核酸を含む、請求項３８に記載の方法。
  47. 前記核酸ライブラリーが、７５ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  48. 前記核酸ライブラリーが、５０ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  49. 前記核酸ライブラリーが、２５ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  50. 前記核酸ライブラリーが、１０ｎＭ未満のＫＤで抗原に結合する単一ドメイン抗体をコードする少なくとも１つの配列を含む、請求項３８に記載の方法。
  51. 前記核酸ライブラリーが、少なくとも１０９配列の理論的多様性を有する、請求項３８に記載の方法。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102291045B1 (ko) 2013-08-05 2021-08-19 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 유전자 라이브러리
CA2975852A1 (en) 2015-02-04 2016-08-11 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
KR20180050411A (ko) 2015-09-18 2018-05-14 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 올리고핵산 변이체 라이브러리 및 그의 합성
CN113604546A (zh) 2015-09-22 2021-11-05 特韦斯特生物科学公司 用于核酸合成的柔性基底
KR102217487B1 (ko) 2016-09-21 2021-02-23 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 기반 데이터 저장
CA3054303A1 (en) 2017-02-22 2018-08-30 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
KR20240013290A (ko) 2017-06-12 2024-01-30 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 심리스 핵산 어셈블리를 위한 방법
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
GB2581620A (en) 2017-09-11 2020-08-26 Twist Bioscience Corp GPCR binding proteins and synthesis thereof
CN111565834B (zh) 2017-10-20 2022-08-26 特韦斯特生物科学公司 用于多核苷酸合成的加热的纳米孔
CA3100739A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Twist Bioscience Corporation Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
KR20210144698A (ko) 2019-02-26 2021-11-30 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 항체 최적화를 위한 변이 핵산 라이브러리
CN114729342A (zh) 2019-06-21 2022-07-08 特韦斯特生物科学公司 基于条形码的核酸序列装配
US20210102192A1 (en) * 2019-09-23 2021-04-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for crth2
TW202216778A (zh) 2020-07-15 2022-05-01 美商安進公司 Ｔｉｇｉｔ及ｃｄ１１２ｒ阻斷
WO2022204316A2 (en) * 2021-03-24 2022-09-29 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for cd3
US20230340461A1 (en) * 2022-02-14 2023-10-26 Twist Bioscience Corporation Combinatorial dna assembly for multispecific antibodies

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007118214A2 (en) * 2006-04-07 2007-10-18 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Antibody compositions and methods for treatment of neoplastic disease
WO2010054007A1 (en) * 2008-11-07 2010-05-14 Fabrus Llc Combinatorial antibody libraries and uses thereof
WO2010141249A2 (en) * 2009-06-02 2010-12-09 Merck Sharp & Dohme Corp. Generation, characterization and uses thereof of anti-notch3 antibodies
EA032728B1 (ru) * 2009-08-19 2019-07-31 Мерк Патент Гмбх Антитела для выявления комплексов интегрина в ffpe материале
AR095517A1 (es) * 2013-03-15 2015-10-21 Genentech Inc ANTICUERPOS CONTRA EL RECEPTOR QUIMIOATRAYENTE EXPRESADO EN CÉLULAS T HELPER 2 (ANTI-CRTh2) Y MÉTODOS DE USO
WO2016076345A1 (ja) * 2014-11-11 2016-05-19 中外製薬株式会社 改変された抗体可変領域を含む抗原結合分子のライブラリ
AU2018234624B2 (en) * 2017-03-15 2023-11-16 Twist Bioscience Corporation De novo synthesized combinatorial nucleic acid libraries
HUE054403T2 (hu) * 2018-01-26 2021-09-28 Regeneron Pharma TMPRSS2 elleni antitestek és antigénkötõ fragmentumok
US20210102192A1 (en) * 2019-09-23 2021-04-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for crth2

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