TW201522374A - 抗ｃｒｔｈ２抗體及使用方法 - Google Patents

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Jo-Anne S Hongo
Tao Huang
Yonglei Shang
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Abstract

本發明提供抗CRTh2抗體及其使用方法。

Description

抗CRTH2抗體及使用方法 相關申請案之交叉參考
本申請案主張2013年3月15日提出申請之美國臨時申請案第61/786,370號之優先權益，其全部內容以引用方式併入本文中。
ASCII文字檔案上之序列表之提交
以下ASCII文字檔案上提交之內容其整體內容以引用的方式併入本文中：電腦可讀形式(CRF)之序列表(檔案名稱：146392017340SEQLIST.TXT，記錄日期：2014年3月6日，大小：115KB)。
本發明係關於抗CRTh2抗體及其使用方法。
表現於T輔助2細胞上之化學吸引因子受體同源分子(CRTh2)係G-蛋白偶聯受體(GPCR)家族之成員。CRTh2響應於前列腺素D2(PGD2)調介嗜酸性球、嗜鹼性球及T輔助2型(Th2)細胞之化學趨化性。一直認為該等細胞類型、尤其Th2細胞導致過敏性疾病(例如氣喘)之發病機制。在動物模型中已顯示，CRTh2抑制導致減弱之氣道高反應性及發炎。Lukacs等人；Am.J.Phsiol.Lung Cell.Mol.Physiol.295：L767-779,2008。舉例而言，雷馬曲班(ramatroban)(一種雙重凝血脂素A2受體及CRTh2受體拮抗劑)在活體外及在活體內阻抑嗜酸性球化學趨化性且在日本已批准用於治療過敏性鼻炎。Bosniak,B等人， Respiratory Research 12：114,2011。許多其他CRTh2拮抗劑(例如4-胺基四氫喹啉衍生物或吲哚乙酸衍生物)目前正在開發中。Pettipher；Br.J.Pharmacol.153(Suppl 1)：S191-199,2008；Royer等人；Eur.J.Clin.Invest.38：663-671,2008；Stebbins等人；Eur.J.Pharmacol.638：142-149,2010。
本發明提供抗CRTh2抗體及其使用方法。
在一個態樣中，本文提供經分離抗體，其當將治療有效量投與給人類個體時結合人類CRTh2且消耗CRTh2表現細胞。在一些實施例中，抗CRTh2抗體係經改造抗體。在一些實施例中，抗CRTh2抗體係藉由重組方法產生(例如，藉由在活體外(例如，在細胞培養物中)利用編碼抗體之一或多種核酸轉染或轉化宿主細胞)。在一些實施例中，宿主細胞係原核細胞(例如，細菌細胞)或真核細胞(例如，CHO細胞、淋巴樣細胞)。
在一些實施例中，抗體消耗以下類型之CRTh2表現細胞中之一或多者：Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。在一些實施例中，抗體經改造以改良ADCC及/或CDC活性。在一些實施例中，抗體經改造以改良ADCC及/或降低CDC活性。在一些實施例中，抗體經無岩藻糖基化。在一些實施例中，抗體係在具有α1,6-岩藻糖轉移酶(Fut8)敲除之細胞系中產生。在一些實施例中，抗體係在過表現β1,4-N-乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnT-III)之細胞系中產生。在一些實施例中，細胞系另外過表現高爾基體(Golgi)α-甘露糖苷酶II(ManII)。在一些實施例中，抗體包含至少一個在Fc區中改良ADCC及/或CDC活性之胺基酸取代。在一些實施例中，胺基酸取代係S298A/E333A/K334A。
在一些實施例中，抗體係裸抗體。在一些實施例中，抗體係嵌 合抗體。在一些實施例中，該抗體係人類化抗體。在一個實施例中，抗體係人類抗體。在一些實施例中，抗體係雙特異性抗體。在一些實施例中，抗體係IgG1抗體。
在一些實施例中，抗體結合至非人類靈長類動物之CRTh2。在一些實施例中，抗體結合至恒河猴及/或食蟹猴CRTh2。
在一些實施例中，抗體競爭性抑制以下抗體中之至少一者與人類CRTh2之結合：19A2、8B1、31A5、3C12及本文所述之任一人類化抗體。在一些實施例中，使用ELISA分析來測定競爭結合。在一些實施例中，抗體結合至與以下抗CRTh2抗體中之至少一者所結合之CRTh2表位相同或與其重疊之人類CRTh2之表位：19A2、8B1、31A5、3C12及本文所述之任一人類化抗體。在一些實施例中，抗體包含六個來自以下抗CRTh2抗體中之一者之高變區(HVR)：19A2、8B1、31A5、3C12及本文所述之任一人類化抗體。
在一些實施例中，抗體進一步阻斷CRTh2信號傳導。在一些實施例中，抗體阻止CRTh2表現細胞響應於前列腺素D2之募集。在一些實施例中，抗體阻斷CRTh2表現細胞中之Ca2+通量。在一些實施例中，抗體以約100nM或以下之Kd值結合人類CRTh2。
在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3及包含X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQ ID NO：5)之HVR-H2，其中X1為Y或R，且X2為Y或D。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列之HVR-H2。在一些實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-H2。
在另一態樣中，本文提供包含輕鏈及重鏈可變區之經分離之抗CRTh2抗體，其中該輕鏈及重鏈可變區包含六個高變區(HVR)序列：(i)包含RASENIYXNLA(SEQ ID NO：1)之HVR-L1，其中X為S、W或Y；(ii)包含AATQLAX(SEQ ID NO：2)之HVR-L2，其中X為D、E或S；(iii)包含QHFWITPWT(SEQ ID NO：3)之HVR-L3；(iv)包含X1YX2MS(SEQ ID NO：4)之HVR-H1，其中X1為S或F，且X2為S、L或K；(v)包含X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQ ID NO：5)之HVR-H2，其中X1為Y或R，且X2為Y或D；及(vi)包含HRTNWDFDY(SEQ ID NO：6)之HVR-H3。
在另一態樣中，本文提供包含輕鏈及重鏈可變區之經分離之抗CRTh2抗體，其中該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：7、8或9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10、11或12之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體進一步包含重鏈可變區，其包含包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一態樣中，本文提供包含輕鏈及重鏈可變區之經分離之抗CRTh2抗體，其包含重鏈可變區，該重鏈可變區包含包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，該抗體包含：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在一些實施例中，該抗體包含：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在另一態樣中，本文提供包含輕鏈及重鏈可變區之經分離之抗CRTh2抗體，其中該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。在另一態樣中，本文提供包含輕鏈及重鏈可變區之經分離之抗CRTh2抗體，其包含包含以下之重鏈可變區：包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。在一些實施例中，該抗體包含：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在另一態樣中，本文提供包含輕鏈及重鏈可變區之經分離之抗CRTh2抗體，其中該抗體包含選自由SEQ ID NO：38-53組成之群之VL序列。在一些實施例中，抗體進一步包含選自由SEQ ID NO：54-65組成之群之VH序列。在另一態樣中，本文提供包含輕鏈及重鏈可變區之經分離之抗CRTh2抗體，其中抗體包含選自由SEQ ID NO：54-65組 成之群之VH序列。在一些實施例中，本文提供經分離之抗CRTh2抗體，其包含包含選自由SEQ ID NO：38-48組成之群之VL序列之輕鏈可變區及包含選自由SEQ ID NO：54-60組成之群之VH序列之重鏈可變區。
在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：40之VL序列及SEQ ID NO：57之VH序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：39之VL序列及SEQ ID NO：55之VH序列。在一些實施例中，抗體包含SEQ ID NO：41之VL序列及SEQ ID NO：57之VH序列。
在一些實施例中，抗體係單株抗體。在一些實施例中，抗體係人類化抗體或嵌合抗體。在一些實施例中，抗體之框架序列之至少一部分係人類共有框架序列。在一些實施例中，抗體係選自Fab、Fab’-SH、Fv、scFc或(Fab’)2片段之抗體片段.
在另一態樣中，本文提供由本文所述之任一抗體編碼之經分離之核酸。在另一態樣中，本文提供包含本文所述核酸之宿主細胞。在另一態樣中，本文提供產生抗體之方法，其包含培養宿主細胞以便產生抗體。在一些實施例中，該方法進一步包含回收由宿主細胞產生之抗體。
在另一態樣中，本文提供免疫偶聯物，其包含本文所述之任一抗體及細胞毒性劑。在一些實施例中，免疫偶聯物係於醫藥組合物中。免疫偶聯物可用於本文所述之任一方法中。
在另一態樣中，本文提供醫藥組合物，其包含本文所述之任一抗CRTh2抗體及醫藥上可接受之載劑。
在另一態樣中，本文提供治療氣喘之方法，其包含將有效量之抗CRTh2抗體投與給個體，其中該抗體消耗個體中之CRTh2表現細胞。
在一些實施例中，抗體消耗以下類型之CRTh2表現細胞中之一或 多者：Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。在一些實施例中，抗CRTh2抗體來自肺組織之消耗CRTh2表現細胞。在一些實施例中，抗CRTh2抗體消耗來自支氣管肺泡灌洗液之CRTh2表現細胞。在一些實施例中，與在投與抗體之前之基線相比，抗CRTh2抗體消耗至少50%至少一種類型之來自肺之CRTh2表現細胞。在一些實施例中，與在投與抗體之前之基線相比，抗CRTh2抗體消耗至少80%至少一種類型之來自肺之CRTh2表現細胞。在一些實施例中，與在投與抗體之前之基線相比，抗CRTh2抗體消耗至少90%至少一種類型之來自肺之CRTh2表現細胞。在一些實施例中，個體患有顆粒球缺乏型氣喘(pauci granulocytic asthma)。在一些實施例中，在投與抗CRTh2抗體之後個體中一或多種細胞激素之含量降低。在一些實施例中，降低由以下細胞類型中之至少一者所產生之一或多種細胞激素之含量：Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。在一些實施例中，降低個體中之IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺或白三烯中之一或多者之含量。在一些實施例中，個體患有吸入之皮質類固醇、短效β2激動劑、長效β2激動劑或其組合控制不足之氣喘。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，抗CRTh2抗體係本文所述之抗體。
在另一態樣中，本文提供治療由CRTh2表現細胞介導之病症之方法，其包含將有效量之抗CRTh2抗體投與給個體，其中該抗體消耗個體中之CRTh2表現細胞。
在一些實施例中，該病症係選自由以下組成之群：氣喘、顆粒球缺乏型氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、急性或慢性氣道高敏感性、嗜酸性球增多症候群、嗜酸性球性食道炎、丘-施二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)、特發性肺纖維化、與細胞激素相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之惡 性腫瘤、慢性特發性蕁麻疹、慢性自發性蕁麻疹、物理性蕁麻疹、寒冷性蕁麻疹、壓力性蕁麻疹、大皰性類天皰瘡、鼻瘜肉、食物過敏及過敏性支氣管肺麴菌病(ABPA)。在一些實施例中，抗CRTh2抗體為本文所述之抗體。
在另一態樣中，本文提供降低個體中細胞激素的含量的方法，其包含將有效量之抗CRTh2抗體投與給個體，其中抗體消耗個體中的CRTh2表現細胞。在一些實施例中，降低個體中之一或多種IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺或白三烯之含量。在一些實施例中，抗CRTh2抗體為本文所述之抗體。
應理解，本文所述各實施例之性質中之一者、一些或全部可組合以形成本發明之其他實施例。本發明之該等及其他態樣將為熟悉此項技術者變得顯而易見。本發明之該等及其他實施例將由下文之詳細說明進一步闡述。
圖1顯示CRTh2係表現於人類「Th2」分子細胞上。CRTh2表現係藉由流式細胞術使用人類PBMC群體或培養之人類細胞上之抗人類CRTh2 Ab(BM16)來評估，如所指示。
圖2顯示CRTh2+記憶CD4+ T細胞在與CRTh2-記憶CD4+T細胞相比時產生多於95%之記憶CD4+ T細胞Th2細胞激素(I1-4、IL-5、IL13及IL-9)。藉由流式細胞術自人類PBMC分離出CRTh2+CD45RO+及CRTh2-CD45RO+記憶CD4+ T細胞並利用抗CD3及抗CD28抗體於37℃下刺激48小時。收集上清液並如Luminex所示進行細胞激素定量。
圖3A-F顯示小鼠或人類化抗CRTh2抗體之反應性，其係藉由流式細胞術利用於細胞系上表現之CRTh2或利用初代嗜鹼性球及嗜酸性球來實施。圖3A係顯示小鼠抗CRTh2融合瘤抗體(純系19A2、8B1、31A5及3C12)與對照Ab(20ug/ml，彩色直方圖)相比之反應性，其係 藉由流式細胞術於293細胞上表現之人類、恒河猴或食蟹猴CRTh2以及不表現CRTh2之野生型293細胞來實施。所用一級抗體濃度為20ug/ml(黑色線)、2ug/ml(灰色線)及0.2ug/ml(淺灰色線)。圖3B顯示藉由流式細胞術與同種型對照Ab(彩色直方圖)相比，小鼠抗CRTh2抗體(利用mIgG2a選殖之19A2及8B1)與在300.19細胞上表現之人類、恒河猴或食蟹猴胺基末端flag標記之CRTh2以及不表現CRTh2之野生型300.19細胞之反應性。所用一級抗體濃度為1ug/ml(人類，食蟹猴；黑色線)或5ug/ml(恒河猴，野生型；黑色線)及0.5ug/ml(恒河猴，野生型；灰色線)。抗Flag Ab係以0.7ug/ml使用。圖3C藉由流式細胞術顯示小鼠抗人類CRTh2抗體(19A2、8B1、31A5、3C12)對人類PBMC上之嗜鹼性球及嗜酸性球之反應性。PBMC係與抗CRTh2抗體以5ug/ml(黑色線)、0.5ug/ml(灰色線)或與同種型對照Ab以5ug/ml(淺灰色線)、0.5ug/ml(彩色直方圖)、隨後螢光標記之二級抗小鼠IgG、抗CD16、抗HLADR及抗CD123一起培育。圖3D及圖3E顯示與各別不表現CRTh2之野生型293或300.19細胞相比，人類化h19A2.v1及經改造之人類化h19A2.v12抗CRTh2抗體分別與在293細胞(圖3D)或300.19細胞(圖3E)上表現之胺基末端gD標記或flag標記之人類、恒河猴或食蟹猴CRTh2之反應性。所用一級抗CRTh2 Ab濃度係如下：10ug/ml(黑色線)、1ug/ml(灰色線)及0.1ug/ml(淺灰色線)；同種型對照Ab(2H7，彩色直方圖)係以10ug/ml使用，抗gD抗體係以2ug/ml使用且抗Flag Ab係以0.7ug/ml使用。圖3F顯示抗CRTh2抗體h19A2.v1及h19A2.v12在10ug/ml(黑色線)下對來自周邊血液之初代人類、食蟹猴及恒河猴嗜鹼性球以及初代人類嗜酸性球與同種型對照Ab(彩色直方圖)相比之FACS結合。
圖4A-B顯示抗CRTh2抗體(mIgG或hFab)對於293細胞或300.19細胞上表面表現之CRTh2之結合親和力的斯卡查德分析(Scatchard analysis)。圖4A顯示小鼠抗CRTh2全抗體19A2及8B1對於293細胞或300.19細胞上表現之人類CRTh2之放射性配體細胞結合分析，如所指示。圖4B顯示人類化h19A2.v12或h19A2.v60 Fab片段對於293細胞上表現之人類或食蟹猴CRTh2之放射性配體細胞結合分析。抗CRTh2 Ab之解離常數(KD)指示於圖表中。結合/總體指示結合之125I標記抗體與總體抗體之濃度比率；總體指示125I標記及未標記抗體之濃度。
圖5顯示抗CRTh2抗體8B1及3C12阻止PGD2誘導之鈣動員。藉由流式細胞術在抗CRTh2或同種型對照抗體之存在下監測來自活體外極化Th2細胞之Th2細胞子集(CD4+CCR4+CCR6-CXCR3-)響應於PGD2刺激之鈣通量。包括CRTh2受體拮抗劑CAY10471作為陽性對照。
圖6A-B顯示人類CRTh2 BAC轉基因小鼠之涉及及特徵。圖6A描繪在染色體11上之含有人類CRTh2基因之171 kb基因組區，將其引入到C57BL/6小鼠中以產生hCRTh2 BAC轉基因小鼠。圖6B藉由流式細胞術顯示於hCRTh2.Bac.Tg細胞系85中之血液嗜鹼性球(CD123+FceRI+)、血液嗜酸性球(CCR3+)、腹腔肥大細胞(FceRI+CD117+)、膕淋巴結CD4+CD44hi T細胞(由Th2極化劑木瓜酶誘導)及腸繫膜淋巴結先天T輔助型2細胞(Lin-CD117+藉由尾靜脈液壓注射小鼠IL-17E質粒強化)上之人類CRTh2表現(抗體BM16)。為進行比較，顯示於人類細胞上表現之人類CRTh2之流式細胞術分析。將來自PBMC、來自人類骨髓來源之肥大細胞之肥大細胞之嗜鹼性球、嗜酸性球及IT2細胞染色，且Th2細胞(CCR4+CXCR3-)係在Th2極化條件下自人類PBMC分離之CD4+ T細胞分化。
圖7A-B顯示在活體內在人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中抗CRTh2抗體消耗血液嗜鹼性球及嗜酸性球。於用抗CRTh2 Ab(19A2、3C12或8B1，如所指示)治療前之第-4天(圖7A)或4小時(圖7B)藉由流式細胞術測定血液之CRTh2+嗜鹼性球(CD123+FceRI+)及嗜酸性球(CCR3+)之 基線數量。將人類CRTh2.Bac.Tg小鼠用抗CRTh2或同種型對照抗體以200ug/小鼠i.v.(圖7A)或150ug/小鼠i.v.(圖7B)進行治療。藉由流式細胞術於第3天、第6天或第7天評估血液嗜鹼性球及嗜酸性球消耗，如所指示。抗CRTh2與抗豬草同種型對照抗體相比之消耗%指示於圖7B中。
圖8A-B顯示在CRTh2.Bac.Tg小鼠中之TNP-OVA誘導之慢性氣喘模型中抗CRTh2抗體19A2治療消耗先天免疫細胞且降低Th2支氣管肺泡灌洗(BAL)細胞激素產生。圖8A顯示在肺組織中藉由流式細胞術且在BAL中藉由類別細胞計數與流式細胞術組合所評估之嗜鹼性球、嗜酸性球及肥大細胞數量(圖8A)。抗CRTh2與抗豬草同種型對照抗體相比之消耗%指示於圖表中。圖8B顯示BAL中藉由ELISA所測定之IL-4及IL-13之濃度。藉由抗CRTh2治療與同種型對照抗體相比之降低%指示於圖表中。
圖9A-B顯示抗CRTh2抗體19A2消耗SCID小鼠中之人類產生IL-4之Th2細胞或人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中之先天型輔助2(IT2)細胞。圖9A：將來自PBMC之活體外極化人類Th2細胞轉移至SCID小鼠中且進一步在活體內藉由注射rhIL-4加抗IFN-g及抗IL-12 mAb在無岩藻糖基化抗CRTh2 19A2抗體或同種型對照抗體之存在下極化達7天。7天之後，測定產生IL-4或IFN-g之CD4 T細胞之百分數。出於此目的，使脾細胞饑餓並利用PdBu(50ng/mL)及離子黴素(500ng/mL)離體刺激4.5小時，其中在刺激之最後3小時期間添加佈雷菲德菌素A(brefeldin A,BFA)。細胞利用抗hCD4進行表面染色且譜系細胞利用抗mCD45、抗mTer119及抗hCD19進行染色；將細胞固定並利用抗hIFNg及抗hIL-4染色以檢測細胞激素陽性細胞。圖9B：用50ug小鼠IL-17E編碼質粒、隨後抗CRTh2或同種型對照Ab注射人類CRTh2.Bac.Tg小鼠。在治療後第3天，藉由流式細胞術測定腸系膜淋巴節中之IT2細胞之百分數 及總數量。抗CRTh2與抗豬草同種型對照抗體相比之消耗%指示於圖表中。
圖10顯示鼠科動物抗CRTh2抗體19A2之輕鏈(SEQ ID NO：49)及重鏈(SEQ ID NO：61)可變區的胺基酸序列。提供重鏈及輕鏈之Kabat CDR、Chothia CDR及Contact CDR序列。
圖11A-B顯示源自抗體19A2之人類化抗CRTh2抗體之輕鏈及重鏈可變區的胺基酸序列比對。圖11A顯示輕鏈可變區序列比對。提供每一抗體之輕鏈Kabat CDR、Chothia CDR及Contact CDR序列(hu19A2.v1(SEQ ID NO：38)、hu19A2.v12(SEQ ID NO：39)、hu19A2.v46(SEQ ID NO：39)、hu19A2.v52(SEQ ID NO：40)、hu19A2.v58(SEQ ID NO：42)、hu19A2.v60(SEQ ID NO：41)、hu19A2.v61(SEQ ID NO：42)、hu19A2.v62(SEQ ID NO：41)、hu19A2.v63(SEQ ID NO：43)、hu19A2.v64(SEQ ID NO：42)、hu19A2.v65(SEQ ID NO：43)、hu19A2.v66(SEQ ID NO：44)、hu19A2.v67(SEQ ID NO：45)、hu19A2.v68(SEQ ID NO：44)、hu19A2.v69(SEQ ID NO：45)、hu19A2.v70(SEQ ID NO：46)、hu19A2.v71(SEQ ID NO：47)、hu19A2.v72(SEQ ID NO：48))。圖11B顯示重鏈可變區序列比對。提供每一抗體之重鏈Kabat CDR、Chothia CDR及Contact CDR序列(hu19A2.v1(SEQ ID NO：54)、hu19A2.v12(SEQ ID NO：55)、hu19A2.v46(SEQ ID NO：57)、hu19A2.v52(SEQ ID NO：57)、hu19A2.v58(SEQ ID NO：57)、hu19A2.v60(SEQ ID NO：57)、hu19A2.v61(SEQ ID NO：55)、hu19A2.v62(SEQ ID NO：55)、hu19A2.v63(SEQ ID NO：55)、hu19A2.v64(SEQ ID NO：60)、hu19A2.v65(SEQ ID NO：60)、hu19A2.v66(SEQ ID NO：55)、hu19A2.v67(SEQ ID NO：55)、hu19A2.v68(SEQ ID NO：60)、hu19A2.v69(SEQ ID NO：60)、hu19A2.v70(SEQ ID NO：54)、hu19A2.v71(SEQ ID NO：54)、hu19A2.v72(SEQ ID NO：54))。
圖12顯示鼠科動物抗CRTh2抗體8B1與3C12及人類化抗CRTh2 hu8B1.v1之輕鏈及重鏈可變區的胺基酸序列比對(mu8B1-輕鏈可變區(SEQ ID NO：50)、mu8B1-重鏈可變區(SEQ ID NO：62)；mu3C12-輕鏈可變區(SEQ ID NO：51)、mu3C12-重鏈可變區(SEQ ID NO：63)；hu8B1.v1-輕鏈可變區(SEQ ID NO：52)、hu8B1.v1-重鏈可變區(SEQ ID NO：64))。提供每一抗體之輕鏈及重鏈Kabat CDR、Chothia CDR及Contact CDR序列。
圖13顯示鼠科動物抗CRTh2抗體31A5之胺基酸序列。提供抗體31A5之輕鏈及重鏈Kabat CDR、Chothia CDR及Contact CDR序列(mu31A5-輕鏈可變序列(SEQ ID NO：53)、mu31A5-重鏈可變序列(SEQ ID NO：65))。
圖14顯示人類化抗CRTh2抗體hu19A2.v1及hu19A2.v52之輕鏈及重鏈可變區的胺基酸序列比對。圖14A顯示輕鏈可變區序列比對(hu19A2.v1-輕鏈可變區(SEQ ID NO：38)；hu19A2.v52-輕鏈可變區(SEQ ID NO：40))。提供每一抗體之輕鏈Kabat CDR、Chothia CDR及Contact CDR序列。圖14B顯示重鏈可變區序列比對(hu19A2.v1-重鏈可變區(SEQ ID NO：54)；hu19A2.v52-重鏈可變區(SEQ ID NO：57))。提供每一抗體之重鏈Kabat CDR、Chothia CDR及Contact CDR序列。
圖15A-C顯示藉由流式細胞術人類化及人類化親和力成熟抗CRTh2抗體對於細胞系上表現之CRTh2或初代嗜鹼性球及嗜酸性球之反應性。圖15A顯示藉由流式細胞術19A2人類化(h19A2.v1)及人類化親和力成熟(h19A2.v46、h19A2.v52)抗CRTh2抗體於1ug/ml(黑色線)及0.1ug/ml(灰色線)下與對照Ab(於1ug/ml下，彩色直方圖)相比對 於293細胞上表現之人類CRTh2以及不表現CRTh2之野生型293細胞之反應性。圖15B顯示藉由流式細胞術人類化及人類化親和力成熟19A2抗CRTh2抗體(h19A2.v1、h19A2.v12、h19A2.V46、h19A2.v52)與對照Ab(於0.55ug/ml下，彩色直方圖)相比對於293細胞上表現之人類、食蟹猴或恒河猴CRTh2以及不表現CRTh2之野生型293細胞之反應性。所用一級抗體濃度為0.55ug/ml(黑色線)、0.18ug/ml(極深灰色線)、0.06ug/ml(深灰色線)、0.02ug/ml(灰色線)及0.006ug/ml(淺灰色線)。圖15C顯示藉由流式細胞術人類化親和力成熟抗人類CRTh2抗體h19A2.v52對人類、食蟹猴或恒河猴PBMC上之嗜鹼性球及嗜酸性球之反應性。將PBMC與螢光標記之抗CRTh2抗體一起於15ug/ml(黑色線)、5ug/ml(極深灰色線)、1.7ug/ml(深灰色線)、0.6ug/ml(灰色線)或0.2ug/ml(淺灰色線)或與同種型對照Ab一起於15ug/ml(彩色直方圖)下與譜系特異性抗體組合培養，以如材料及方法中所述檢測嗜鹼性球及嗜酸性球。
圖16顯示抗CRTh2抗體(Fab片段)對293細胞上之表面表現之CRTh2之結合親和力的斯卡查德分析。圖16A-B顯示人類化h19A2.v52Fab片段對於293細胞上表現之人類或食蟹猴CRTh2之同源性競爭放射性配體細胞結合分析。圖16C-D顯示人類化h19A2.v46 Fab片段對於293細胞上表現之人類或食蟹猴CRTh2之同源性競爭放射性配體細胞結合分析。抗CRTh2 Ab之解離常數(KD)指示於圖表中。結合/總體指示每一分析中所用結合125I標記之抗體及總體125I標記之抗體之比率。
圖17A-B顯示在表現人類CRTh2之293細胞中抗CRTh2抗體對福司柯林(forskolin)誘導之PGD2介導之抑制cAMP含量或對福司柯林誘導之cAMP含量之效應。圖17A顯示在表現人類CRTh2之293細胞中抗CRTh2抗體h19A2.v52並不影響福司柯林誘導之cAMP含量之PGD2介導之抑制。相比之下，人類化h8B1抗體以劑量依賴方式阻斷福司柯 林誘導之cAMP含量之PGD2介導之抑制。圖17B顯示在表現人類CRTh2之293細胞中在缺少PGD2之情況下抗CRTh2抗體h8B1及h19A2.v52並不影響福司柯林誘導之cAMP含量。相比之下，配體PGD2以劑量依賴方式降低福司柯林誘導之cAMP含量。
圖18A-C顯示在活體內與人類CRTh2.Bac.Tg小鼠之血液、脾臟及骨髓中鼠科動物抗CRTh2抗體19A2(mIgG2a)消耗嗜鹼性球及嗜酸性球。藉由流式細胞術於用抗CRTh2 Ab 19A2治療前之第-7天(圖18A及圖18B)測定血液之CRTh2+嗜鹼性球(CD123+FceRI+)及嗜酸性球(CCR3+)之基線數量，如所指示。人類CRTh2.Bac.Tg小鼠用抗CRTh2或同種型對照抗體以20ug/小鼠或100ug/小鼠i.v進行治療。藉由流式細胞術如所指示於第3天劑第7天在血液中(圖18A及圖18B)或於第7天在脾臟及骨髓(BM)中(圖18C)評估嗜鹼性球及嗜酸性球消耗。符號代表來自個別小鼠之數據。
圖19A-C顯示在單一劑量之人類化抗CRTh2抗體h19A2.v52(hIgG1)之後於人類CRTh2.Bac.Tg小鼠之血液、脾臟及骨髓中之嗜鹼性球或嗜酸性球消耗之劑量反應及持續時間。藉由流式細胞術於用h19A2.v52治療前之第-3天(圖19A)測定血液之CRTh2+嗜酸性球(CCR3+)之基線數量，如所指示。人類CRTh2.Bac.Tg小鼠用抗CRTh2或同種型對照抗體以10ug/小鼠或200ug/小鼠i.v進行治療。藉由流式細胞術在2天、第7天及第14天評估血液(圖19A)、脾臟(圖19B)及骨髓(BM)(圖19C)中之嗜鹼性球及嗜酸性球消耗，如所指示。符號代表來自個別小鼠之數據。
圖20A-B顯示在hCRTh2.Bac.Tg小鼠中在TNP-OVA誘導之慢性氣喘模型中在先天免疫細胞消耗及Th2 BAL細胞激素產生之降低方面具有效應子功能之消耗性抗CRTh2 19A2 mIgG2a抗體比非消耗性抗CRTh2 19A2 mIgG2a_DANA Fc突變體抗體更有效。圖20A顯示在肺組 織中藉由流式細胞術且在BAL中藉由類別細胞計數與流式細胞術組合評估之嗜鹼性球、嗜酸性球及肥大細胞數量(圖20A)。抗CRTh2 19A2 mIgG2a抗體及Fc突變體19A2 mIgG2a_DANA抗體與抗豬草同種型對照抗體相比之消耗%指示於圖表中。圖20B顯示藉由ELISA所測定之BAL中之IL-4的濃度。抗CRTh2 19A2 mIgG2a抗體及Fc突變體19A2 mIgG2a_DANA抗體與抗豬草同種型對照抗體相比之降低%指示於圖表中。
I. 定義
出於本文目的，「受體人類框架」係包含源自人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之輕鏈可變結構域(VL)框架或重鏈可變結構域(VH)框架之胺基酸序列的框架，如下文所定義。「源自」人類免疫球蛋白框架或人類共有框架之受體人類框架可包含其相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數量為10或更小、9或更小、8或更小、7或更小、6或更小、5或更小、4或更小、3或更小或2或更小。在一些實施例中，VL受體人類框架之序列與VL人類免疫球蛋白框架序列或人類共有框架序列一致。
「親和力」係指分子(例如，抗體)之單一結合位點與其結合配偶體(例如，抗原)間之非共價相互作用之總和強度。除非另外指明，否則本文所用「結合親和力」係指固有結合親和力，其反映結合對之成員(例如，抗體及抗原)間之1：1相互作用。分子X對於其配偶體Y之親和力通常可由解離常數(Kd)表示。可藉由業內已知之常用方法(包括彼等本文所述者)來量測親和力。用於量測結合親和力之具體說明性及實例性實施例闡述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指與不具有改變之親代抗體相比在一或多個高變區(HVR)中具有一或多個改變的抗體，該等改變使得改良抗 體對抗原之親和力。
除非另外指明，否則本文所用之術語「CRTh2」係指來自任一脊椎動物(例如靈長類動物(例如人類、恒河猴、食蟹猴CRTh2)及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠))之任一天然CRTh2。該術語涵蓋「全長」未處理CRTh2以及自細胞之處理產生之任一形式的CRTh2。該術語亦涵蓋CRTh2之天然存在之變體，例如，剪接變體或對偶基因變體。實例性人類CRTh2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：84中。實例性恒河猴CRTh2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：85中。實例性食蟹猴CRTh2之胺基酸序列顯示於SEQ ID NO：86中。參見例如L.Cosmi等人，Eur.J.Immunol.30(10)：2972-9(2000)；K.Nagat等人，FEBS Lett.459(2)：195-9(1999)；及K.Nagata等人，J.Immunol.162(3)：1278-86(1999)。
人類CRTH2序列(SEQ ID NO：84)
恒河猴CRTH2序列(NCBI參考編號XM_001084746)(SEQ ID NO：85)
食蟹猴CRTH2序列(SEQ ID NO：86)
術語「抗CRTh2抗體」及「結合至CRTh2之抗體」係指能以足夠親和力結合CRTh2從而使得該抗體可用作靶向CRTh2之診斷劑及/或治療劑之抗體。在一個實施例中，抗CRTh2抗體對非相關非CRTh2蛋白之結合程度比該抗體對CRTh2之結合低約10%，如藉由(例如)放射免疫分析(RIA)所量測。在某些實施例中，結合至CRTh2之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗CRTh2抗體結合至來自不同物種之CRTh2中保守之CRTh2表位。
術語「抗體」在本文中係以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現期望抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外之分子，其包含完整抗體中結合完整抗體所結合之抗原的一部分。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、雙特異性抗體；直鏈抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及自抗體片段形成之多特異性抗體。
「結合至相同表位之抗體」(作為參考抗體)係指在競爭分析中將參考抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高的抗體，且相反地，參考抗體在競爭分析中將該抗體與其抗原之結合阻斷50%或更高。實例性競爭分析提供於本文中。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分源自特定來源或物種、而重鏈及/或輕鏈之其餘部分源自不同來源或物種的抗體。
抗體之「種類」係指重鏈所具有之恆定結構域或恆定區之類型。存在5種主要類型之抗體：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且該等類別中之若干種可進一步分成子類(同種型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白之重鏈恆定結構域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
本文所用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或防止細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如，At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤、阿黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(vinca alkaloid)(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、瘤克寧(chlorambucil)、道諾黴素(daunoruhicin)或其他嵌入劑)；生長抑制 劑；酶及其片段，例如溶核酶；抗生素；毒素，例如來自細菌、真菌、植物或動物源之小分子毒素或酶促活性毒素，包括其片段及/或變體；及下文所揭示之各種抗腫瘤劑或抗癌劑。
「效應子功能」係指彼等可歸因於抗體Fc區之生物活性，其隨抗體同種型而變。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
術語「Fc區」在本文中用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C-末端區。該術語包括天然序列Fc區及變體Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非在本文中另外指出，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係根據亦稱為EU指數之EU編號系統，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「框架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外之可變結構域殘基。可變結構域之FR通常由4個FR結構域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，HVR及FR序列通常出現於VH(或VL)中之下列序列中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用，其係指具有實質上與天然抗體結構類似之結構或具有含有如本文所定義Fc區之重鏈的抗體。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞系」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉化體」及「轉化細胞」，其包括初代轉化細胞及源自其之 子代，不考慮傳代次數。子代與親代細胞之核酸含量可不完全相同，但可含有突變。本文包括經篩選或選擇用於初始經轉化細胞之具有相同功能或生物活性的突變體子代。
「人類抗體」係具有對應於如下抗體之胺基酸序列的胺基酸序列者：其係由人類或人類細胞產生或源自利用人類抗體譜或其他編碼人類抗體之序列之非人類來源。此人類抗體之定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共有框架」係代表在人類免疫球蛋白VL或VH框架序列之選擇中最普遍存在之胺基酸殘基之框架。通常，人類免疫球蛋白VL或VH序列之選擇係來自可變結構域序列亞組。通常，序列亞組係如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，NIH出版91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一個實施例中，對於VL而言，亞組係如Kabat等人所述之亞組κI(見上文)。在一個實施例中，對於VH而言，亞組係如Kabat等人所述之III亞組(見上文)。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含實質上全部之至少一個且通常兩個可變結構域，其中全部或實質上全部之HVR(例如，CDR)對應於非人類之彼等HVR，且全部或實質上全部之FR對應於人類抗體之彼等FR。人類化抗體視情況可包含源自人類抗體之抗體恆定區的至少一部分。抗體之「人類化形式」(例如，非人類抗體)係指已經受人類化之抗體。
本文所用之術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變結構域之區中序列具有高變性及/或形成結構上經界定之環(「高變環」)中的每一者。通常，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR通常包含來自高變環 及/或來自「互補決定區」(CDR)之胺基酸殘基，後者具有最高序列可變性及/或涉及抗原識別。本文所用之HVR區包含位於位置24-36(對於L1)、46-56(對於L2)、89-97(對於L3)、26-35B(對於H1)、47-65(對於H2)及93-102(對於H3)內之任何數量之殘基。因此，HVR包括在先前所述位置中之殘基：
A)24-34(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))；
B)L1之24-34、L2之50-56、L3之89-97、H1之31-35B、H2之50-65及H3之95-102(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。
C)30-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35(H1)、47-58(H2)、93-100a-j(H3)(MacCallum等人，J.Mol.Biol.262：732-745(1996))。
除VH中之CDR1外，CDR通常包含形成高變環之胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其係接觸抗原之殘基。SDR包含於CDR中稱為縮短-CDR(abbreviated-CDR)或a-CDR之區內。實例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現於胺基酸殘基L1之31-34、L2之50-55、L3之89-96、H1之31-35B、H2之50-58及H3之95-102處。(參見Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)。)除非另外指明，否則可變結構域中之HVR殘基及其他殘基(例如，FR殘基)在本文中係根據Kabat等人所述編號(見上文)。
「免疫偶聯物」係偶聯至一或多個異源分子(包括(但不限於)細胞毒性劑)之抗體。
「個體(individual)」或「個體(subject)」係哺乳動物。哺乳動物 包括(但不限於)家養動物(例如，牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如，人類及非人類靈長類動物，例如猴)、兔及齧齒類動物(例如，小鼠及大鼠)。在某些實施例中，個體((individual)或(subject))係人類。
「經分離」抗體係自其天然環境之組份分離者。在一些實施例中，將抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由(例如)電泳(例如，SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如，離子交換或反相HPLC)所測定。關於評估抗體純度之方法之綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「經分離」核酸係指自其天然環境之組份分離之核酸分子。經分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於與其天然染色體位置不同之染色體位置處。
「編碼抗CRTh2抗體之經分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，其包括單一載體或單獨載體中之該(等)核酸分子及存在於宿主細胞中一或多個位置處之該(等)核酸分子。
本文所用之術語「單株抗體」係指自實質上同源抗體群體獲得的抗體，亦即，包含該群體之個別抗體相同及/或結合相同表位，可能之變體抗體除外，例如，含有天然突變或在產生單株抗體製劑期間產生之變體，該等變體通常以少量存在。與通常包括針對不同決定簇(表位)之不同抗體的多株抗體製劑相比，單株抗體製劑之每一單株抗體針對抗原上之單一決定簇。因此，修飾語「單株」指示抗體之特徵在於得自實質上同源之抗體群體，且不應解釋為需要藉由任一特定方法產生該抗體。例如，根據本發明欲使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤法、重組DNA法、噬菌體展示法及利用 含有所有或部分之人類免疫球蛋白基因座之轉基因動物之方法，該等方法及製備單株抗體之其他實例性方法闡述於本文中。
「裸抗體」係指未偶聯至異源部分(例如，細胞毒性部分)或放射性標記之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有不同結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體係約150,000道爾頓(dalton)之異四聚體糖蛋白，其由二硫鍵鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈組成。自N至C末端，每一重鏈具有可變區(VH)(亦稱為可變重鏈結構域或重鏈可變結構域)，隨後為三個恆定結構域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N至C末端，每一輕鏈具有可變區(VL)(亦稱為可變輕鏈結構域或輕鏈可變結構域)，隨後為恆定輕鏈(CL)結構域。基於抗體恆定結構域之胺基酸序列，可將該抗體之輕鏈指配為兩種類型中之一者，稱為卡帕(κ)及拉姆達(λ)。
術語「包裝插頁」用於指通常包括於治療產品之商業包裝內之說明書，其含有有關適應症、用法、劑量、投與、組合療法、禁忌及/或關於治療產品之使用之警告的資訊。
相對於參考肽序列，「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對序列並引入空位(若需要)以達成最大序列一致性百分比之後，候選序列中之胺基酸殘基與參考肽序列中之胺基酸殘基一致的百分比，且不將任何保守取代視為序列一致性之一部分。出於確定胺基酸序列一致性百分比之目的，比對可以熟習此項技術者所熟知之各種方式來達成，例如使用可公開獲得之電腦軟體，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。彼等熟習此項技術者可確定用於比對序列之合適參數，包括在所比較序列之全長範圍內達成最大比對所需要之任何演算法。然而，出於本文目的，使用序列對比電腦程式ALIGN-2來產生胺基酸序列一致性%之值。ALIGN-2序列對比電腦 程式係由Genentech公司創作，且原始碼與使用者文件已一起存檔於美國版權局(U.S.Copyright Office)，Washington D.C.,20559中，其中其以美國版權登記號TXU510087登記。ALIGN-2程式可自Genentech公司，South San Francisco,California公開獲得，或可自原始碼進行編譯。ALIGN-2程式應經編譯用於UNIX操作系統(包括數位UNIX V4.0D)中。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不改變。
在將ALIGN-2用於胺基酸序列對比之情形下，給定胺基酸序列A相對於(to)、與(with)或針對(against)給定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者可表達為給定胺基酸序列A相對於、與或對給定胺基酸序列B所具有或包含之某一胺基酸序列一致性%)係計算如下：100乘以分數X/Y，其中X係在A與B之程式比對中由序列比對程式ALIGN-2評定為一致性匹配之胺基酸殘基數，且其中Y係B中胺基酸殘基之總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度時，A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另外明確說明，否則本文所用之所有胺基酸序列一致性%值係如前面緊接段落中所述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指呈容許其中所含活性成份之生物活性有效之形式且不含對將投與該調配物之個體具有不可接受之毒性之其他組份之製劑。
「醫藥上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成份外對個體無毒之成份。醫藥上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝液、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
本文所用之術語「治療」係指經設計以改變所治療個體或所處理細胞在臨床病理學進程期間之天然進程之臨床幹預。期望治療效應包括降低疾病進展速率、改善或減輕疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，治療改良氣喘控制，減小氣喘加重，改良肺功能及/ 或改良患者報告之症狀。舉例而言，若一或多種與病症相關聯之症狀緩和或消除，則成功地「治療」個體。
如本文所用之「結合」係指投與一種治療形式與另一治療形式。同樣地，「結合」係指在向個體投與另一治療形式之間、期間或之後投與一種治療形式。
如本文所用之術語「預防」包括對個體中疾病之發生或復發提供預防。個體可易於患病症、對該病症敏感或具有患該病症之風險，但尚未診斷出該病症。在一些實施例中，本文所述之抗CRTh2抗體用於延遲病症之發展。在一些實施例中，本文所述之抗CRTh2抗體預防氣喘加重及/或使非功能或氣喘狀態衰弱。
如本文所用，「處於發展病症之風險」的個體可具有或可不具有可檢測疾病或疾病症狀，且在本文所述的治療方法之前可展示或不展示可檢測疾病或疾病症狀。「處於風險中」表示個體具有一或多種風險因子，該等因子為與病症之發展有關係之可量測參數，如此項技術中所知。具有該等風險因子中之一或多者之個體具有比不具有該等風險因子中之一或多者之個體高之發展該病症之概率。
「有效量」係指至少在所需時間段內以所需劑量有效達成期望或指示效應(包括治理或預防結果)之量。有效量可以一或多次投與來提供。
「治療有效量」係至少實現特定病症之可量測改良所需之最低濃度。本文中之治療有效量可根據諸如以下等因素而變化：患者之疾病狀態、年齡、性別及重量以及抗體在個體中誘發期望反應之能力。治療有效量亦為抗體之治療有益效應勝過其任何毒性或有害效應的量。「預防有效量」係指在所需時間段內以所需劑量有效達成期望預防效果之量。通常但非必須地，由於預防劑量係在患病之前或疾病之前期用於個體中，故預防有效量可小於治療有效量。
術語「可變區」或「可變結構域」係指抗體重鏈或輕鏈中參與抗體與抗原結合之結構域。天然抗體之重鏈及輕鏈之可變結構域(分別為VH及VL)通常具有相似結構，其中每一結構域包含4個保守框架區(FR)及三個高變區(HVR)。(參見例如Kindt等人，Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007)。)單一VH或VL結構域可足以賦予抗原結合特異性。此外，結合特定抗原之抗體可使用來自結合該抗原之抗體之VH或VL結構域分離以分別篩選互補VL或VH結構域文庫。例如，參見Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
本文所用之術語「載體」係指能夠轉運與其連接之另一核酸的核酸分子。術語包括呈自複製核酸結構之載體，以及納入引入其之宿主細胞基因組中的載體。某些載體能夠引導與其可操作連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱作「表現載體」。
「抗體依賴性細胞介導之細胞毒性」或「ADCC」係指一種形式之細胞毒性，其中分泌之Ig結合至某些細胞毒性細胞(例如，自然殺傷(NK)細胞、嗜中性球及巨噬細胞)上存在之受體(FcR)，此使得該等細胞毒性效應子細胞能夠特異性結合至承載抗原之靶細胞，且隨後用細胞毒素殺死靶細胞。抗體「武裝」細胞毒性細胞且要求藉由此機制殺死靶細胞。介導ADCC之初代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。Fc於造血細胞上之表現匯總於Ravetch及Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)之第464頁表3中。為評估所關注分子之ADCC活性，可實施活體外ADCC分析，例如美國專利第5,500,362號或第5,821,337號中所闡述者。可用於該等分析之效應子細胞包含周邊血液單核球(PBMC)及天然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如在諸如於Clynes等人，PNAS USA 95：652-656(1998)中所揭示者之動物模型中)評估所關注分子之ADCC 活性。
「補體依賴性細胞毒性」或「CDC」係指靶細胞在補體存在下之溶胞。典型補體途徑之活化係藉由補體系統之第一組份(C1q)結合至與其同源抗原結合之抗體(或適當子類)來引發。為評估補體活化，可實施CDC分析，例如如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所述。
術語「氣喘」係指以可變及復發之症狀、可逆之氣流阻塞(例如，藉由支氣管擴張劑)及支氣管高反應性為特徵之複雜病症，其可或可不與潛在之發炎相關聯。氣喘之實例包括阿司匹林(aspirin)敏感/加劇氣喘、異位性氣喘、嚴重氣喘、輕度氣喘、中度至嚴重氣喘、未經皮質類固醇治療之氣喘、慢性氣喘、皮質類固醇抗性氣喘、皮質類固醇難治性氣喘、新近診斷且未治療之氣喘、吸煙引起之氣喘、皮質類固醇應用時未能控制之氣喘及如J Allergy Clin Immunol(2010)126(5)：926-938中提及之其他氣喘。氣喘之症狀包括呼吸短促、咳嗽(痰液產生及/或痰液品質及/或咳嗽頻率之改變)、喘鳴、胸悶、支氣管收縮及歸咎於以上症狀中之一者或該等症狀之組合之夜間覺醒(Juniper等人(2000)Am.J.Respir.Crit.Care Med.,162(4),1330-1334.)。
術語「輕度氣喘」係指患者通常經歷症狀或加重每週少於二次、夜間症狀每月少於兩次，且在加重之間無症狀。輕度間歇性氣喘通常視需要利用以下治療：吸入性支氣管擴張劑(短效吸入性β2-激動劑)；避免已知之觸發劑；每年接種流感疫苗；每6至10年接種肺炎球菌，且在一些情形中，在暴露於已經鑑別之觸發劑之前施用吸入性β2-激動劑、可瑪林(cromolyn)或奈多羅米(nedocromil)。若患者對短效β2-激動劑之需要增加(例如，1天使用短效β2-激動劑多於3至4次用於急性加重或每月使用多於一個藥筒用於症狀)，則患者可需要遞增 治療。
術語「中毒氣喘」通常係指以下氣喘：患者經歷加重每週多於二次且加重影響睡眠及活動；患者由於氣喘而具有夜間覺醒每月多於兩次；患者具有需要短效吸入性β2-激動劑每天一次或每隔一天一次之慢性氣喘症狀；及患者之預治療基線峰值呼氣流量(PEF)或1秒鐘最大呼氣體積(FEV1)為預測之60%至80%且PEF變動性為20%至30%。
術語「嚴重氣喘」通常係指以下氣喘：患者具有幾乎持續之症狀、頻繁加重、由於氣喘而頻繁夜間覺醒、限制活動、PEF或FEV1基線小於預測之60%且PEF變動性為20%至30%。
術語「FEV1」係指在用力呼氣之第一秒鐘內所呼出空氣之體積。其係氣道阻塞之量度。FEV1可以其他類似方式記錄，例如FEV s ，且應理解所有該等類似變化形式具有相同含義。
術語「皮質類固醇」包括糖皮質激素及鹽皮質激素。舉例而言，皮質類固醇包括(但不限於)氟替卡松(fluticasone)(包括丙酸氟替卡松(FP))、倍氯米松(beclometasone)、布地奈德(budesonide)、環索奈德(ciclesonide)、莫美他松(mometasone)、氟尼縮松(flunisolide)、倍他米松(betamethasone)、氫可的松(hydrocortisone)、強的松(prednisone)、潑尼松龍(prednisolone)、甲基潑尼松龍(methylprednisolone)及去炎松(triamcinolone)。「可吸入皮質類固醇」意指適用於藉由吸入遞送之皮質類固醇。實例性可吸入皮質類固醇係氟替卡松、二丙酸倍氯米松、布地奈德、糠酸莫美他松、環索奈德、氟尼縮松、曲安奈德及目前可用或將來可用之任何其他皮質類固醇。可具吸入性且與長效β2-激動劑組合之皮質類固醇之實例包括(但不限於)：布地奈德/福莫特羅(formoterol)及氟替卡松/沙美特羅(salmeterol)。
術語「細胞激素」係關於由一個細胞群體所釋放作為細胞間介 質作用於另一細胞之蛋白質之通用術語。該等細胞激素之實例係淋巴因子、單核因子；介白素(IL)，例如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15，包括PROLEUKIN® rIL-2；腫瘤壞死因子，例如TNF-α或TNF-β；及其他多肽因子，包括LIF及kit配體(KL)。如本文所用，術語細胞激素包括來自天然來源或重組細胞培養物之蛋白及天然序列細胞激素之生物活性等效物，包括以合成方式產生之小分子實體及其醫藥上可接受之衍生物及鹽。
除非上下文另外明確指明，否則本文及在隨附申請專利範圍中所使用單數形式「一(a、an)」及「該(the)」皆包括複數個指示物。舉例而言，提及「抗體」係提及一至多個抗體(例如莫耳量)且包括熟悉此項技術者已知之等效物等。
應理解，本文所述本發明之態樣及實施例包括「包含態樣及實施例」、「由其組成」及「基本上由其組成」。
II. 組合物及方法 在一個態樣中，本文提供結合CRTh2之抗體。在某些實施例中，在將有效量投與至個體(例如，人類個體)時，抗CRTh2結合至人類CRTh2且消耗CRTh2表現細胞。在一些實施例中，抗CRTh2抗體亦結合至非人類靈長類動物之CRTh2(例如，恒河猴或食蟹猴CRTh2)。本發明之抗體可用於(例如)診斷或治療由CRTh2表現細胞介導之病症。
實例性抗CRTh2抗體
在一個態樣中，本發明提供結合至CRTh2之經分離抗體。在某些實施例中，抗CRTh2抗體具有以下特性中之一或多者：(1)在將有效量投與給個體時，結合CRTh2(例如，人類CRTh2)且消耗CRTh2表現細胞(例如，Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球及/或先天性2型(IT2)細胞)；(2)經改造以改良ADCC；(3)經無岩藻糖基化或具有降低 之岩藻糖基化；(4)競爭性抑制以下抗體中之至少一者與人類CRTh2之結合：19A2、8B1、31A5、3C12及本文所述之任一人類化抗體；(5)結合至與以下抗CRTh2抗體中之至少一者所結合之CRTh2表位相同或與其重疊之人類CRTh2之表位：19A2、8B1、31A5、3C12及本文所述之任一人類化抗體；(6)結合至人類及非人類靈長類動物之CRTh2(例如，恒河猴及/或食蟹猴CRTh2)；(7)阻斷CRTh2信號傳導；(8)阻止CRTh2表現細胞響應於前列腺素D2之募集；(9)阻斷CRTh2表現細胞中之Ca2+通量；(10)不展現激動活性；(11)不降低CRTh2表現細胞(例如，表現人類CRTh2之293細胞)中之福司柯林誘導之cAMP含量；及(12)阻斷CRTh2表現細胞(例如，表現人類CRTh2之293細胞)中福司柯林誘導之cAMP含量之前列腺素D2觸發之抑制。
在另一態樣中，本發明提供經分離之抗CRTh2抗體，其包含(a)輕鏈可變區，其包含至少一個、兩個或三個選自以下之HVR：鼠科動物抗體19A2、8B1、31A5及3C12中之任一者及本文所述之人類化抗體(例如，hu8B1.v1、hu19A2.v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58及v60-v72)之HVR-L1、HVR-L2及HVR-L3；及/或(b)重鏈可變區包含至少一個、兩個或三個選自以下之HVR：鼠科動物抗體19A2、8B1、3C12及31A5中之任一者及本文所述之人類化抗體(例如，hu8B1.v1、hu19A2.v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58及v60-v72)之HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3。在一些實施例中，HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2及HVR-H3包含Kabat CDR、Chothia CDR或Contact CDR序列，如圖10、11A、11B、12、13及14中所示。
在另一態樣中，本發明提供抗CRTh2抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29或30之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列；(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供抗CRTh2抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供抗CRTh2抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下之HVR：(i)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASENIYXNLA(SEQ ID NO：1)，其中X為S、W或Y；(ii)HVR-L2，其包含胺基酸序列AATQLAX(SEQ ID NO：2)，其中X為D、E或S；(iii)HVR-L3，其包含胺基酸序列QHFWITPWT(SEQ ID NO：3)；(iv)HVR-H1，其包含胺基酸序列X1YX2MS(SEQ ID NO：4)，其中X1為S或F，且X2為S、L或K；(v)HVR-H2，其包含胺基酸序列X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQ ID NO：5)，其中X1為Y或R，且X2為Y或D；(vi)HVR-H3，其包含胺基酸序列HRTNWDFDY(SEQ ID NO：6)。
在一個態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29或30之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序 列之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列之HVR-H2。在又一實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29或30之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體包含(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-L3。在又一實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-H2。在又一實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列； 及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體包含(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。
在一個態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。在另一實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3及HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在又一實施例中，抗體包含包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3、HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列及包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列之HVR-H2。在又一實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列；及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供抗體，其包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR：(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：7、8或9之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10、11或12之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在一個實施例中，抗體包含(a)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：7、8 或9之胺基酸序列；(b)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10、11或12之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29或30之胺基酸序列、(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列，及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列、(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29或30之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列、(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：37之胺基酸序列；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列、(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VH HVR序列之VH結構域：(i)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列、(ii)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列及(iii)HVR-H3，其包含選自SEQ ID NO：6之胺基酸序列；及(b)包含至少一個、至少兩個或所有三個選自以下之VL HVR序列之VL結構域：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：7、8或9之胺基酸序列、(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10、11或12之胺基酸序列及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供包含以下之抗體：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：7、8或9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10、11、12之胺基酸序列之；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序 列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；及(f) HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在一些實施例中，抗體包含(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列；(d)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(e)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；及(f)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。
在以上實施例中之任一者中，抗CRTh2抗體係經分離抗體。在以上實施例中之任一者中，抗CRTh2抗體經人類化。在一個實施例中，抗CRTh2抗體包含如以上實施例中任一者中之HVR及圖10、11、12、13及14中所示之HVR(包括包含Kabat CDR、Chothia CDR或Contact CDR序列之HVR)，且進一步包含受體人類框架，例如人類免疫球蛋白框架或人類共有框架。在另一實施例中，抗CRTh2抗體包含如以上實施例中之任一者中之HVR，且進一步包含如圖11A、12及14A中所示包含FR(例如，FR1、FR2、FR3或FR4)序列之VL。在另一實施例中，抗CRTh2抗體包含如以上實施例中任一者中之HVR及圖10、11、12、13及14中所示之HVR(包括包含Kabat CDR,Chothia CDR或Contact CDR序列之HVR)，且進一步包含如圖11B、12及14B中所示之包含FR(例如，FR1、FR2、FR3或FR)序列之VH。
在某些實施例中，本文所述之抗CRTh2抗體包含由Kabat所定義之HVR，例如抗CRTh2抗體包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中每一CDR係由Kabat定義，如本文進一步闡述。在某些實施例中，本文所述之抗CRTh2抗體包含由Chothia所定義之HVR，例如抗CRTh2抗體包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中每一CDR係由Chothia定義，如本文進一步闡述。在某些實施例中，本文所述之抗CRTh2抗體包含由Contact CDR序列所定義之HVR，例如抗CRTh2抗體包含CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3、CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，其中每一CDR係由Contact CDR序列定義，如本文進一步闡述。
在另一態樣中，提供抗CRTh2抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：38-53之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性之輕鏈可變結構域(VL)。在某些實施例中，相對於參考序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VL序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗CRTh2抗體保留結合CRTh2之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO：38-53中之任一者，總共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(即，在FR中)。視情況，抗CRTh2抗體包含選自由SEQ ID NO：38-53組成之群之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在具體實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(i)HVR-L1，其包含選自由SEQ ID NO：7-9組成之群之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含選自由SEQ ID NO：10-12組成之群之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列。在具體實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：22或23之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列；及(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列。在具體實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列；及(c)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：28之胺基酸序列。
在另一態樣中，抗CRTh2抗體包含與SEQ ID NO：54-65之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變結構域(VH)序列。在某些實施例中，相對於參考序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之VH序列含有取代(例如，保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗CRTh2抗體保持結合CRTh2之能力。在某些實施例中，在SEQ ID NO 54-65中之任一者中，總共1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個胺基酸經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR以外之區域中(即，在FR中)。視情況，抗CRTh2抗體包含SEQ ID NO：54-65之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在具體實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含選自由SEQ ID NO：13-17組成之群之胺基酸序列，(b)HVR-H2，其包含選自由SEQ ID NO：18-21組成之群之胺基酸序列，及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。在具體實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：29或30之胺基酸序列，(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列，及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列。在具體實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列，(b)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序 列，及(c)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
在另一態樣中，提供抗CRTh2抗體，其中該抗體包含如上文所提供實施例中任一者之VH及如上文所提供實施例中任一者之VL。在一些實施例中，抗體包含鼠科動物抗體8B1、3C12、31A5及19A2中之任一者及人類化抗體hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58及v60-v72)之VH序列。在一些實施例中，抗體包含鼠科動物抗體8B1、3C12、31A5及19A2中任一者及人類化抗體hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58及v60-v72)之VL序列。在一個實施例中，抗體包含選自由SEQ ID NO：54-60組成之群之VH序列及選自由SEQ ID NO：38-48組成之群之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：55之VH序列及SEQ ID NO：39之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：57之VH序列及SEQ ID NO：41之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：61之VH序列及SEQ ID NO：49之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：62之VH序列及SEQ ID NO：50之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：63之VH序列及SEQ ID NO：51之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：64之VH序列及SEQ ID NO：52之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：65之VH序列及SEQ ID NO：53之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，抗體包含SEQ ID NO：57之VH序列及SEQ ID NO：40之VL序列，包括該等序列之轉譯後修飾。
在又一態樣中，本發明提供與本文所提供抗CRTh2抗體結合至相同表位之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與鼠科動物抗體 8B1、3C12、31A5及19A2及人類化抗體hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58及v60-v72)結合至相同表位之抗體。
在又一態樣中，提供結合至人類CRTh2及至少一個非人類靈長類動物CRTh2二者之抗CRTh2抗體。在某些實施例中，抗CRTh2抗體結合至人類CRTh2及食蟹猴CRTh2。在某些實施例中，抗CRTh2抗體結合至人類CRTh2及恒河猴CRTh2。在某些實施例中，抗CRTh2抗體結合至人類CRTh2、恒河猴CRTh2及食蟹猴CRTh2。在某些實施例中，抗CRTh2抗體以小於100nM之KD結合至人類CRTh2及至少一個非人類靈長類動物CRTh2二者(例如，抗CRTh2抗體以小於100nM之KD結合至人類CRTh2且以小於100nM之KD結合至至少一個非人類靈長類動物CRTh2)。在某些實施例中，抗CRTh2抗體以小於75nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM或10nM之KD結合至人類CRTh2及至少一個非人類靈長類動物CRTh2二者。在某些實施例中，結合至人類CRTh2及至少一個非人類靈長類動物CRTh2二者之抗CRTh2抗體係消耗性抗體，例如如本文進一步闡述消耗CRTh2表現細胞之抗體。
在本發明之另一態樣中，以上實施例中任一者之抗CRTh2抗體係單株抗體，包括嵌合、人類化或人類抗體。在一個實施例中，抗CRTh2抗體係抗體片段，例如Fv、Fab、Fab’、scFv、雙鏈抗體或F(ab’)2片段。在另一實施例中，抗體係全長抗體，例如完整IgG1抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同種型(例如，IgG2、IgG3或IgG4)。在一些實施例中，抗體包含選自由SEQ ID NO：77-83組成之群之重鏈序列；及/或選自由SEQ ID NO：66-76組成之群之輕鏈序列。
在又一態樣中，以上實施例中任一者之抗CRTh2抗體可單獨或組合納入如下文部分中所述特徵中之任一者：
抗體親和力
在某些實施例中，本文所提供之抗體之解離常數(Kd)1μM、150nM、100nM、50nM、10nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或以下，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一個實施例中，Kd係藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)來量測，該分析係使用所關注抗體之Fab形式及其抗原如下列分析中所述來實施。藉由如下方式來量測Fab對抗原之溶液結合親和力：在滴定系列之未經標記抗原存在下使Fab與最小濃度之經(125I)標記之抗原達到平衡，然後使用抗Fab抗體塗佈之板捕獲已結合之抗原(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為建立分析之條件，將MICROTITER®多孔板(Thermo Scientific)用5μg/ml存於50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之捕獲用抗Fab抗體(Cappel Labs)塗佈過夜，且隨後在室溫下(大約23℃)利用存於PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2小時至5小時。在非吸收性板(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與系列稀釋之所關注Fab混合(例如，與Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體Fab-12之評估一致)。然後將所關注之Fab培育過夜；然而，可繼續培育較長時間(例如，約65小時)以確保達到平衡。然後，將混合物轉移至捕獲板中以在室溫下進行培育(例如，1小時)。然後去除溶液且使用存於PBS中之0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN-20®)將板洗滌8次。在板已乾燥時，添加150μl/孔之閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對該等板計數達10分鐘。選擇獲得小於或等於20%之最大結合之每一Fab的濃度用於競爭性結合分析。在一些實施例中，亦可針對抗體與在細胞表面上所表現CRTh2之結合量測Kd。
根據另一實施例，使用表面電漿子共振分析使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore公司，Piscataway，NJ)在25℃下以 約10個反應單位(RU)之固定化抗原CM5晶片來量測Kd。簡言之，根據供應商說明書使用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)來活化羧甲基化之葡聚糖生物感測器晶片(CM5，BIACORE公司)。使用10mM乙酸鈉(pH 4.8)將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，然後以5μl/分鐘之流速注射以達成約10個反應單位(RU)之偶聯蛋白。注射抗原後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下以約25μl/min之流速注射存於含有0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性劑(PBST)之PBS中之Fab兩倍連續稀釋物(0.78nM至500nM)。締合速率(kon)及解離速率(koff)係使用簡單一對一Langmuir結合模型(BIACORE®評估軟體3.2版)藉由同時擬合結合及解離感測圖來計算。平衡解離常數(Kd)以比率koff/kon之形式來計算。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由上述表面電漿子共振分析測得之締合速率超過106M-1 S-1，則締合速率可藉由使用螢光猝滅技術進行測定，該技術在25℃下於增加濃度之抗原存在下量測存於PBS(pH 7.2)中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)之螢光發射強度的增加或降低(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)，如在諸如配備斷流之分光光度計(Aviv Instruments)或帶有攪拌比色杯之8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic)之分光光度計中所量測。
抗體片段
在某些實施例中，本文所提供抗體係抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段及下文所述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見 WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含補救受體結合表位殘基且具有增加之活體內半衰期之Fab及F(ab’)2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙特異性抗體係具有兩個抗原結合位點之可為二價或雙特異性之抗體片段。例如，參見EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三鏈抗體及四鏈抗體亦闡述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單一結構域抗體係包含抗體之重鏈可變結構域之全部或一部分或輕鏈可變結構域之全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單一結構域抗體係人類單一結構域抗體(Domantis公司，Waltham,MA；例如，參見美國專利第6,248,516 B1號)。
可藉由各種技術來製備抗體片段，包括(但不限於)蛋白水解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌(E.coli)或噬菌體)來產生，如本文所述。
嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係嵌合抗體。某些嵌合抗體闡述於(例如)美國專利第4,816,567號及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如，源自小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類動物(例如猴)之可變區)及人類恆定區。在又一實例中，嵌合抗體係類別或亞類已自親代抗體發生變化之「類別轉換」抗體。嵌合抗體包含其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體係人類化抗體。通常，將非人類抗體人類化以降低對人類之免疫原性，而保持親代非人類抗體之特異性及親和力。通常，人類化抗體包含一或多個可變結構域，其中HVR (例如，CDR)(或其部分)係源自非人類抗體，且FR(或其部分)係源自人類抗體序列。人類化抗體視情況亦可包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如，產生HVR殘基之抗體)之相應殘基取代以(例如)恢復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製備方法綜述於(例如)Almagro及Fransson，Front.Biosci.13：1619-1633(2008)中，且進一步闡述於(例如)以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(闡述SDR(a-CDR)接枝)；Padlan，Mol.Immunol.28：489-498(1991)(闡述「表面重塑」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(闡述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer，83：252-260(2000)(闡述「導向選擇」方法以進行FR改組)中。
可用於人類化之人類框架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之框架區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；源自輕鏈或重鏈可變區之特定亞組之人類抗體之共有序列的框架區(參見例如Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(經體突變)框架區或人類種系框架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及自篩選FR文庫獲得之框架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
人類抗體
在某些實施例中，本文所提供抗體係人類抗體。可使用業內已 知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體通常闡述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
可藉由向轉基因動物投與免疫原來製備人類抗體，該轉基因動物已經改良以產生完整人類抗體或具有響應抗原性激發之人類可變區的完整抗體。該等動物通常含有人類免疫球蛋白基因座之全部或一部分，該等基因座代替內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在該等轉基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座通常已經不活化。關於自轉基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。例如，亦可參見美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，其闡述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，其闡述HUMAB®技術；美國專利第7,041,870號，其闡述K-M MOUSE®技術；及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，其闡述VELOCIMOUSE®技術。可進一步(例如)藉由與不同人類恆定區組合來修飾由該等動物產生之完整抗體的人類可變區。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法來製備。已闡述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類異源骨髓瘤細胞系。(例如，參見Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker公司，New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦闡述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。額外方法包括彼等闡述於(例如)美國專利第7,189,826號(闡述單株人類IgM抗體自融合瘤細胞系之產生)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(闡述人類-人類融合瘤)中者。人類融合瘤技術(三體瘤(Trioma) 技術)亦闡述於Vollmers及Brandlein，Histology and Histopathology，20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein，Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
亦可藉由分離選自人類源噬菌體展示文庫之Fv純系可變結構域序列來產生人類抗體。然後，該等可變結構域序列可與期望之人類恆定結構域組合。自抗體文庫選擇人類抗體之技術闡述於下文中。
源自文庫之抗體
可藉由自組合文庫篩選具有一或多種期望活性之抗體來分離本發明抗體。舉例而言，業內已知用於產生噬菌體展示文庫及自該等文庫篩選具有期望結合特性之抗體的各種方法。該等方法論述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)中，且進一步闡述於(例如)以下中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury，Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體展示方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)來單獨選殖VH及VL譜且將其於噬菌體文庫中隨機重組，然後可篩選抗原結合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常展示呈單鏈Fv(scFv)片段或呈Fab片段之抗體片段。來自免疫化來源之文庫可為免疫原提供高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖天然譜(例如，來自人類)以為各種無任何免疫之非 自體抗原亦及自體抗原提供單一抗體源，如由Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最後，亦可藉由以下以合成方式製得天然文庫：選殖來自幹細胞之未重排V-基因片段，及使用含有隨機序列之PCR引物編碼高度可變CDR3區並在活體外實現重排，如由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)所述。闡述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括(例如)：美國專利第5,750,373號、及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段可視為本文中之人類抗體或人類抗體片段。
多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體係多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體係對至少兩個不同位點具有結合特異性之單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中之一者係關於CRTh2且另一者係關於任一其他抗原。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合至CRTh2之兩個不同表位。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑局域化至表現CRTh2之細胞。雙特異性抗體可以全長抗體或抗體片段形式製得。
製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)重組共表現兩個具有不同特異性之免疫球蛋白重鏈-輕鏈對(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))、WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「隆凸於孔洞中(knob-in-hole)」改造(例如，參見美國專利第5,731,168號)。亦可藉由以下方式來製備多特異性抗體：改造靜電轉向效應(electrostatic steering effect)用於製備抗體Fc-異源二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(例如， 參見美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈以產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙鏈抗體」技術用於製備雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(例如，參見Gruber等人，J.Immunol.152：5368(1994))；及製備三特異性抗體，如(例如)Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所述。
本文亦包括具有三個或更多個功能抗原結合位點之經改造抗體(包括「章魚抗體」)(例如，參見US 2006/0025576A1)。
本文之抗體或片段亦包括包含結合至CRTh2以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙重作用FAb」或「DAF」(例如，參見US 2008/0069820)。
抗體變體
在某些實施例中，本發明涵蓋本文提供抗體之胺基酸序列變體。例如，可能期望改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變體可藉由將適宜修飾引入至編碼抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。該等修飾包括(例如)抗體之胺基酸序列內殘基之缺失及/或插入及/或取代。可實施缺失、插入及取代之任一組合以達成最終構築體，前提為最終構築體具有期望特性，例如抗原結合性。
取代、插入及缺失變體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變體。用於取代誘變之所關注位點包括HVR及FR。保守取代係顯示於表1中之「保守取代」標題下。其他實質性變化顯示於表1中之「實例性取代」標題下，且參照胺基酸側鏈類別進一步闡述於下文中。可將胺基酸取代引入所關注抗體及針對期望活性進行篩選之產物中，該期望活 性係(例如)保持/改良之抗原結合、降低之免疫原性或經改良之ADCC或CDC。
可根據常見側鏈性質對胺基酸進行分組：a.疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile； b.中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；c.酸性：Asp、Glu；d.鹼性：His、Lys、Arg；e.影響鏈定向之殘基：Gly、Pro；f.芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性取代將使得需要將該等種類中之一種之成員與另一種類交換。
一種類型之取代變體涉及取代親代抗體(例如人類化或人類抗體)之一或多個高變區殘基。通常，選擇用於進一步研究之所得變體相對於親代抗體在某些生物學性質(例如，增加之親和力、降低之免疫原性)中具有修飾(例如，改良)及/或實質上保持親代抗體之某些生物學性質。實例性取代變體係親和力成熟抗體，其可方便地(例如)使用基於噬菌體展示之親和力成熟技術(例如彼等本文所述者)產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且將變體抗體展示於噬菌體上並針對特定生物學活性(例如結合親和力)進行篩選。
可在HVR中作出改變(例如，取代)以(例如)改良抗體親和力。該等改變可在HVR「熱點」(亦即，由在體細胞成熟過程期間以高頻率經歷突變之密碼子編碼的殘基)(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或SDR(a-CDR)中進行，其中測試所得變體VH或VL之結合親和力。藉由構築及自二級文庫重新選擇來達成親和力成熟已闡述於(例如)Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,(2001))中。在親和力成熟之一些實施例中，藉由各種方法中之任一者(例如，易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之誘變)將多樣性引入至所選用於成熟之可變基因中。然後產生二級文庫。然後篩選文庫以鑑別具有期望親和力之任一抗體變體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導 法，其中將若干HVR殘基(例如，一次4-6個殘基)隨機化。可(例如)使用丙胺酸掃描誘變或建模特定鑑別參與抗原結合之HVR殘基。特定而言，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生於一或多個HVR內，只要該等改變不會實質上降低抗體結合抗原之能力即可。例如，可在HVR中作出不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，本文所提供之保守取代)。該等改變可位於HVR「熱點」或SDR以外。在上文所提供變體VH及VL序列之某些實施例中，每一HVR未經改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
用於鑑別抗體中可經靶向用於誘變之殘基或區域的有用方法稱為「丙胺酸掃描誘變」，如由Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所述。在此方法中，鑑別殘基或目標殘基之群(例如，諸如arg、asp、his、lys及glu等帶電殘基)，並由中性或帶負電荷胺基酸(例如，丙胺酸或聚丙胺酸)代替以測定是否影響抗體與抗原之相互作用。可在證實對初始取代功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合體之晶體結構以鑑別抗體與抗原間之接觸點。可靶向該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物或將其排除。可篩選變體以確定其是否含有期望性質。
胺基酸序列插入包括長度在一個殘基至含有上百或更多殘基之多肽範圍內之胺基及/或羧基末端融合以及單一或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N-末端甲硫胺醯殘基之抗體。抗體分子之其他插入變體包括抗體之N端或C末端融合至酶(例如用於ADEPT)或增加抗體血清半衰期之多肽。
糖基化變體
在某些實施例中，改變本文所提供抗體以增加或降低抗體糖基化之程度。可藉由改變胺基酸序列以產生或去除一或多個糖基化位點 來方便地實現糖基化位點至抗體之添加或缺失。
若抗體包含Fc區，則其所附接之碳水化合物可有所改變。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含具支鏈、二分枝寡糖，其通常藉由N-連接附接至Fc區之CH2結構域的Asn297。例如，參見Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡糖可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接至雙天線寡糖結構之「主幹」中之GlcNAc之岩藻糖。在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡糖以產生具有某些改良性質之抗體變體。
在一個實施例中，提供包含Fc區之抗體變體，其中附接至Fc區之碳水化合物結構具有減少之岩藻糖或缺少岩藻糖，此可改良ADCC功能。特定地，本文涵蓋相對於野生型CHO細胞中所產生之同種抗體上之岩藻糖量具有降低之岩藻糖的抗體。換言之，其特徵在於具有比若由天然CHO細胞(例如，產生天然糖基化模式之CHO細胞，例如含有天然FUT8基因之CHO細胞)產生原本將具有之岩藻糖量低之岩藻糖量。在某些實施例中，抗體係其中小於約50%、40%、30%、20%、10%或5%之N連接聚糖上包含岩藻糖者。例如，該抗體中之岩藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。在某些實施例中，抗體係其中沒有N連接聚糖上包含岩藻糖者，即，其中抗體完全不含岩藻糖，或不具有岩藻糖或經無岩藻糖基化。岩藻糖之量係藉由計算糖鏈內Asn297處之岩藻糖相對於附接至Asn 297之所有糖結構(例如複雜、雜合及高甘露糖結構)之總和的平均量來測定，如藉由MALDI-TOF質譜法所量測，如(例如)WO 2008/077546中所闡述。Asn297係指位於Fc區中大約297位處之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，因抗體中具有微小序列變化，故Asn297亦可位於297位上游或下游大約±3個胺基酸處，即，在294位與300位之間。該等岩藻糖基化變體可具有經改良之ADCC功能。例如，參見美國專利公開案 第US 2003/0157108號(Presta,L.)；US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo有限公司)。涉及「去岩藻糖基化」或「缺乏岩藻糖」抗體變體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能產生去岩藻糖基化抗體之細胞系之實例包括缺乏蛋白質岩藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其在實例11中)及基因敲除細胞系，例如α-1,6-岩藻糖基轉移酶基因FUT8敲除CHO細胞(例如，參見Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡糖之抗體變體，例如，其中附接至抗體Fc區之雙天線寡糖由GlcNAc二等分。該等抗體變體可具有降低之岩藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變體之實例闡述於(例如)WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；US 2005/0123546(Umana等人)及Ferrara等人，Biotechnology and Bioengineering,93(5)：851-861(2006)中。亦提供在附接至Fc區之寡糖中具有至少一個半乳糖殘基之抗體變體。該等抗體變體可具有經改良之CDC功能。該等抗體變體闡述於(例如)WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
在某些實施例中，本文所述包含Fc區之抗體變體能夠結合至FcγRIII。在某些實施例中，本文所述包含Fc區之抗體變體在人類效應子細胞之存在下具有ADCC活性或與包含人類野生型IgG1Fc區之其他方面相同之抗體相比在人類效應子細胞之存在下具有增加之ADCC活性。
Fc區變體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供抗體之Fc區中，由此產生Fc區變體。Fc區變體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，該序列在一或多個胺基酸位置包含胺基酸修飾(例如取代)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些(但非全部)效應子功能之抗體變體，此使其成為許多應用之合意候選物，在該等應用中抗體之活體內半衰期較為重要，但某些效應子功能(例如補體及ADCC)體係不必要或有害的。可實施活體外及/或活體內細胞毒性分析來確認CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可實施Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合能力(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初代細胞NK細胞僅表現FcγRIII，然而單核球表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR於造血細胞中之表現匯總於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol 9：457-492(1991)之第464頁表3中。評估所關注分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例闡述於美國專利第5,500,362號(例如，參見Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；5,821,337(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))中。或者，可使用非放射性分析方法(例如，參見用於流式細胞術之ACTITM非放 射性細胞毒性分析(CellTechnology公司，Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。可用於該等分析之效應細胞包括周邊血液單核球(PBMC)及自然殺傷(NK)細胞。或者或另外，可在活體內(例如)在諸如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示之動物模型中評估所關注分子之ADCC活性。亦可實施C1q結合分析來確認抗體不能與C1q結合且因此缺少CDC活性。例如，參見WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可實施CDC分析(例如，參見Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用業內已知方法來實施FcRn結合及活體內清除/半衰期測定(例如，參見Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低效應子功能之抗體包括彼等具有Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者的取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者處具有取代之Fc突變體，包括殘基265及297經丙胺酸取代之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
闡述具有改良或降低之與FcR之結合的某些抗體變體。(例如，參見美國專利第6,737,056號、WO 2004/056312及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變體包含具有一或多個改良ADCC之胺基酸取代之Fc區，例如，在Fc區之位置298、333及/或334處之取代(殘基之EU編號)。在實例性實施例中，抗CRTh2抗體在其Fc區中包含以下胺基酸取代：S298A、E333A及K334A。
在一些實施例中，Fc區有所改變，從而改變(亦即，改良或減小) C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所述。
具有增加之半衰期及改良之與新生兒Fc受體(FcRn)(其負責將母體IgG轉移至胎兒中)之結合(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之抗體闡述於US2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個改良Fc區與FcRn之結合之取代之Fc區。該等Fc變體包括彼等在以下Fc區殘基之一或多者處具有取代者：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如，取代Fc區殘基434(美國專利第7,371,826號)。
亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351，其關於Fc區變體之其他實例。
半胱胺酸改造之抗體變體
在某些實施例中，可能期望產生半胱胺酸改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代殘基於抗體之可及位點處出現。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基團由此位於抗體之可及位點處且可用於將抗體偶聯至其他部分(例如藥物部分或連接體-藥物部分)以產生免疫偶聯物，如本文進一步所述。在某些實施例中，下列殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)、重鏈之A118(EU編號)及重鏈Fc區之S400(EU編號)。半胱胺酸改造之抗體可如(例如)美國專利第7,521,541號中所述來產生。
抗體衍生物
在某些實施例中，可進一步修飾本文所提供抗體以含有業內已知且易於獲得之額外非蛋白質性部分。適用於衍生抗體之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇之共聚物、羧甲基纖維素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯基吡咯啶酮、聚-1,3-二氧戊環、聚-1,3,6-三氧環己烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)、及葡聚糖或聚(n-乙烯基基吡咯啶酮)聚乙二醇、聚丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化之多元醇(例如，甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可因其在水中具有穩定性而在製造方面具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為具支鏈或不具支鏈。附接至抗體之聚合物的數量可有所變化，且若附接一個以上之聚合物，則其可為相同或不同分子。一般而言，衍生所用聚合物之數量及/或類型可根據包括(但不限於)以下在內之考慮因素來確定：擬改良抗體之特定性質或功能、抗體衍生物是否將於界定條件下用於療法等。
在另一實施例中，提供抗體及非蛋白質性部分之偶聯物，其可藉由暴露於輻射來選擇性加熱。在一個實施例中，非蛋白性部分係碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。輻射可具有任一波長，且包括(但不限於)如下波長之輻射：其不會危害正常細胞，但將非蛋白性部分加熱至可將鄰近抗體-非蛋白性部分之細胞殺死的溫度。
重組方法及組合物
可使用重組方法及組合物來產生抗體，例如，如美國專利第4,816,567號中所述。在一個實施例中，提供本文所述之編碼抗CRTh2抗體之經分離核酸。此核酸可編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及/或包含VH之胺基酸序列(例如，抗體之輕鏈及/或重鏈)。在又一實施例中，提供一或多個包含此核酸之載體(例如，表現載體)。在又一實施 例中，提供包含此核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含以下物質(例如，已經該等物質轉化)：(1)包含如下核酸之載體：其編碼包含抗體之VL之胺基酸序列及包含抗體之VH之胺基酸序列，或(2)包含編碼包含抗體之VL之胺基酸序列之核酸的第一載體，及包含編碼包含抗體之VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞係真核細胞，如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供製備抗CRTh2抗體之方法，其中該方法包含在適於表現抗體之條件下培養包含編碼如上文所提供抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
對於抗CRTh2抗體之重組產生，分離(例如)如上文所述之編碼抗體之核酸並將其插入一或多個載體中以供進一步選殖及/或在宿主細胞中表現。此核酸可使用習用程序容易地分離出來並定序(例如，藉由使用能特異性結合至編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)。
用於選殖或表現編碼抗體之載體之適宜宿主細胞包括本文所述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可在細菌中產生，尤其在無需糖基化及Fc效應子功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其闡述抗體片段在大腸桿菌中之表現)。表現後，可自呈可溶部分之細菌細胞膏糊分離抗體且可將其進一步純化。
除原核生物外，真核微生物(例如絲狀真菌或酵母菌)亦係用於抗體編碼載體之適宜選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已「人類化」從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株。參 見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表現糖基化抗體之適宜宿主細胞亦源自多細胞有機體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別處多種可與昆蟲細胞聯合使用之桿狀病毒株，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞。
亦可利用植物細胞培養物作為宿主。例如，參見美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(闡述於轉基因植物中產生抗體之PLANIBODIESTM技術)。
亦可使用脊椎動物細胞作為宿主。例如，可使用適於懸浮液生長之哺乳動物細胞系。有用哺乳動物宿主細胞系之其他實例係由SV40(COS-7)轉化之猴腎CV1細胞系；人類胚胎腎臟細胞系(293或293細胞，如(例如)Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠賽特利細胞(mouse sertoli cell)(TM4細胞，如(例如)Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；大腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；TRI細胞，如(例如)Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他有用哺乳動物宿主細胞系包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞系，例如Y0、NS0及Sp2/0。關於適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞系之綜述，參見例如Yazaki及Wu，Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第 255-268頁(2003)。
分析
可藉由業內已知之各種分析來鑑別、篩選本文所提供之抗CRTh2抗體，或表徵其物理/化學性質及/或生物活性。
結合分析及其他分析
在一個態樣中，舉例而言，藉由已知方法(例如ELISA、西方墨點(Western blot)等)測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與鼠科動物抗體8B1、3C12、31A5及19A2及人類化抗體hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、V47、v51-v53、v57、v58及v60-v72)競爭結合至CRTh2之抗體。在某些實施例中，此一競爭抗體結合至鼠科動物抗體8B1、3C12、31A5及19A2及人類化抗體hu19A2(包括v1、v12、v38、v46、v47、v51-v53、v57、v58及v60-v72)所結合之相同表位(例如，線性或構象表位)。映射抗體所結合之表位之詳細實例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在實例性競爭分析中，將固定化CRTh2或於細胞表面上表現CRTh2之細胞於包含結合至CRTh2之第一標記抗體(例如，人類或非人類靈長類動物)及測試其與第一抗體競爭結合至CRTh2之能力的第二未標記抗體的溶液中培育。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但不包含第二未經標記抗體之溶液中培育固定化CRTh2或表現CRTh2之細胞。在允許第一抗體與CRTh2結合之條件下培育後，去除過量未結合抗體，並量測與固定化CRTh2或表現CRTh2之細胞締合之標記的量。若與固定化CRTh2或表現CRTh2之細胞締合之標記之量在測試試樣中相對於對照試樣實質上減小，則此指示第二抗體與第一抗體競爭結合CRTh2。參見Harlow及Lane(1988) Antibodies：A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
活性分析
可使用此項技術已知且本文所闡述(例如，實例1)之分析來鑑別及測試抗CRTh2抗體之生物活性。在一些實施例中，提供用於測試消耗CRTh2表現細胞(例如，Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球及/或先天性2型(IT2)細胞)之抗CRTh2抗體的分析。生物活性之實例性測試可包括(例如)提供於免疫細胞(例如嗜鹼性球及嗜酸性球)上表現人類CRTh2之轉基因小鼠，將抗CRTh2抗體投與轉基因小鼠，並量測小鼠之血液或組織中之人類CRTh2陽性細胞之含量(例如，數量或百分數)或小鼠之血液或組織中已知表現CRTh2之細胞類型之含量(例如，數量或百分數)。另一實例性測試可包括(例如)提供表現人類CRTh2之小鼠，利用TNP-OVA使用已知方法敏感化/挑戰小鼠，隨後投與抗CRTh2抗體。可針對CRTh2陽性細胞之存在或已知表現CRTh2之細胞類型之存在評估TNP-OVA挑戰之小鼠肺組織、血液、BAL及BALF。在一些實施例中，提供用於檢測Th2細胞激素產生細胞被抗CRTh2抗體消耗之分析。舉例而言，可將活體外極化人類Th2細胞腹膜腔內注射至SCID小鼠中，並將抗CRTh2抗體投與該等小鼠。在用PMA及離子黴素離體刺激之後分析細胞激素產生細胞之含量。在一些實施例中，在該等分析之任一者中，抗CRTh2抗體可消耗至少約50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100% CRTh2表現細胞中之任一者。
亦提供抗測試CRTh2抗體用於阻斷CRTh2信號傳導之分析。用於評估CRTh2信號傳導之實例性方法可包括提供CRTh2陽性細胞，將細胞與抗CRTh2抗體一起培育，隨後利用諸如PGD2之配體刺激(在存在或不存在福司柯林下)，且最後藉由此項技術中已知之任一方法量測 細胞內cAMP或Ca2+含量之變化。
亦提供抗CRTh2抗體阻止CRTh2表現細胞響應於TNP-OVA、木瓜酶或前列腺素D2之募集之分析。CRTh2表現細胞響應於PGD2之募集的實例性測試可包括在存在或不存在抗CRTh2抗體下將PGD2投與至在免疫細胞(例如嗜鹼性球及嗜酸性球)上表現人類CRTh2之轉基因小鼠的氣道中評估CRTh2陽性細胞至肺組織及支氣管肺泡灌洗液中之隨後流入量。評估可以許多途徑來完成，包括染色CRTh2之切除組織並經由流式細胞術或此項技術中已知之任何其他方法測定細胞流入量。
亦提供測定抗CRTh2抗體阻斷CRTh2表現細胞中之Ca2+通量之分析。實例性測試可包括使用流式細胞術監測響應於配體(例如PGD2)之Ca2+通量之細胞，隨後利用indo-1/AM染料及抗CRTh2單株抗體進行培育。
免疫偶聯物
本發明亦提供包含偶聯至一或多種細胞毒性劑之本文抗CRTh2抗體的免疫偶聯物，該等細胞毒性劑係(例如)化學治療劑或藥物、生長抑制劑、毒素(例如，蛋白質毒素、細菌、真菌、植物或動物起源之酶促活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫偶聯物係抗體-藥物偶聯物(ADC)，其中抗體偶聯至一或多種藥物，該等藥物包括(但不限於)類美登素(maytansinoid)(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；奧裏斯他汀(auristatin)，例如單甲基奧裏斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號及第5,780,588號及第7,498,298號)；多拉司他汀(dolastatin)；卡裏奇黴素(calicheamicin)或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res. 53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環黴素(anthracycline)，例如道諾黴素(daunomycin)或多柔比星(doxorubicin)(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲蝶呤(methotrexate)；長春地辛(vindesine)；紫杉烷(taxane)，例如多西他賽(docetaxel)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、拉羅他塞(larotaxel)、特西他塞(tesetaxel)及奧他賽(ortataxel)；新月毒素(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，免疫偶聯物包含與酶促活性毒素或其片段偶聯之本文所述抗體，該酶促活性毒素或其片段包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿假單胞桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思豆毒蛋白A鏈、蒴蓮根毒素A鏈、α-八疊球菌、油桐(Aleurites fordii)蛋白質、石竹素蛋白質、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白質(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、瀉果素、巴豆毒素、皂草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素、絲裂吉菌素(mitogellin)、侷限麴菌素(restrictocin)、酚黴素(phenomycin)、依諾黴素(enomycin)及新月毒素。
在另一實施例中，免疫偶聯物包含偶聯至放射性原子以形成放射性偶聯物的本文所述抗體。多種放射性同位素可用於產生放射性偶聯物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當偶聯物用於檢測時，其可包含用 於閃爍法研究之放射性原子，例如tc99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記，例如碘-123(再次)、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之偶聯物可使用多種雙功能蛋白質偶合劑製得，例如3-(2-吡啶基二硫代)丙酸N-琥珀醯亞胺酯(SPDP)、4-(N-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-甲酸琥珀醯亞胺酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、亞胺酸酯之雙功能衍生物(例如己二醯亞胺二甲酯HCl)、活性酯(例如辛二酸二琥珀醯亞胺酯)、醛(例如戊二醛)、雙-疊氮基化合物(例如雙(對-疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙-重氮衍生物(例如雙-(對-重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(例如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙-活性氟化合物(例如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，蓖麻毒素免疫毒素可如Vitetta等人，Science,238：1098(1987)中所述來製備。經碳-14標記之1-異硫氰酸根合苄基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)係用於放射性核苷酸與抗體偶聯的實例性螯合劑。參見WO94/11026。連接體可係促進細胞毒性藥物在細胞中釋放之「可裂解連接體」。例如，可使用酸不穩定連接體、肽酶敏感性連接體、光不穩定連接體、二甲基連接體或含有二硫化物之連接體(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文之免疫偶聯物或ADC明確地涵蓋(但不限於)使用以下交聯劑試劑製備之該等偶聯物：BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB以及SVSB((4-乙烯基碸)苯甲酸琥珀醯亞胺酯)，以上試劑可自市面購得(例如，購自Pierce Biotechnology公司，Rockford,IL.,U.S.A)。
用於診斷及檢測之方法及組合物
在某些實施例中，本文所提供抗CRTh2抗體中之任一者皆可用於檢測生物試樣中CRTh2之存在。本文所用之術語「檢測」涵蓋定量或定性檢測。在某些實施例中，生物試樣包含細胞或組織，例如Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。
在一個實施例中，提供用於診斷或檢測方法中之抗CRTh2抗體。在又一態樣中，提供檢測生物試樣中CRTh2之存在之方法。在某些實施例中，該方法包含在容許抗CRTh2抗體結合CRTh2之條件下使生物試樣與本文所述抗CRTh2抗體接觸，及檢測抗CRTh2抗體與CRTh2之間是否形成複合體。此方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，使用抗CRTh2抗體來選擇適用於使用抗CRTh2抗體之療法的個體，例如，其中CRTh2係用於選擇患者之生物標記物。
可使用本發明之抗體診斷之實例性病症包括氣喘、顆粒球缺乏型氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、急性或慢性氣道高敏感性、嗜酸性球增多症候群、嗜酸性球性食道炎、丘-施二氏症候群、特發性肺纖維化、與細胞激素相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之發炎或惡性腫瘤、慢性特發性蕁麻疹、慢性自發性蕁麻疹、物理性蕁麻疹(包括寒冷性蕁麻疹及壓力性蕁麻疹)、大皰性類天皰瘡、鼻瘜肉、食物過敏及伴隨有或不伴隨有囊性纖維化之過敏性支氣管肺麴菌病(ABPA)。
在某些實施例中，提供經標記抗CRTh2抗體。標記包括(但不限於)直接檢測之標記或部分(例如螢光標記、發色標記、電子密度標記、化學發光標記及放射性標記)以及經由(例如)酶反應或分子相互作用間接檢測之部分(例如酶或配體)。實例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I、螢光團(例如稀土螯合物或螢光黃及其衍生物)、若丹明(rhodamine)及其衍生物、丹醯(dansyl)、傘形酮、螢光素酶(例如，螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶)(美國專利第 4,737,456號)、螢光素、2,3-二氫酞嗪二酮、辣根過氧化物酶(HRP)、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖澱粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環氧化酶(例如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與諸如HRP、乳過氧化物酶或微過氧化物酶等採用過氧化氫來氧化染料前體之酶偶聯)、生物素/抗生物素蛋白、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及諸如此類。
醫藥調配物
本文所述抗CRTh2抗體之醫藥調配物係藉由混合具有期望純度之該抗體與一或多種可選醫藥上可接受之載劑(Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980))以凍乾之調配物或水溶液形式製得。醫藥上可接受之載劑通常在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子表面活性劑，例如聚乙二醇(PEG)。本文之實例性醫藥上可接受之載劑進一步包含間質性藥物分散劑，例如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如，人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，例如rHuPH20(HYLENEX®， Baxter International公司)。某些實例性HASEGP及使用方法(包括rHuPH20)闡述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種額外糖胺多糖酶(例如軟骨素酶)組合。
實例性凍乾抗體調配物闡述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括彼等闡述於美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中者，後面的調配物包含組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文之調配物亦可視需要含有一種以上用於所治療特定適應症之活性成份，較佳為彼等具有不會不利地彼此影響之補充活性者。舉例而言，可期望進一步提供以下(但不限於以下)：IL4抑制劑(例如，AER-001、IL4/IL13誘捕劑或抗IL4抗體)、IL5抑制劑(例如，美泊利珠單抗(Mepolizumab)，CAS No.196078-29-2；瑞斯珠單抗(resilizumab)或另一抗IL5抗體)、IL9抑制劑(例如，MEDI-528或另一抗IL9抗體)、IL13抑制劑(例如，IMA-026、IMA-638(亦稱為安蘆珠單抗(anrukinzumab)，INN No.910649-32-0；QAX-576；IL4/IL13誘捕劑)、川魯克單抗(tralokinumab)(亦稱為CAT-354，CAS No.1044515-88-9)；AER-001、ABT-308(亦稱為人類化13C5.5抗體)或另一抗IL13抗體)、抗IL17抗體、抗IL25抗體、抗IL33抗體、抗TSLP抗體、抗OX40L抗體、抗OX40抗體、IL-4-受體α抑制劑(例如，AMG-317、AIR-645或另一抗IL4Ra抗體)、抗IL5Ra抗體、抗17RA抗體或抗CCR4抗體。該等活性成份適宜以對欲達成目的有效之量以組合形式存在。
活性成份亦可分別截留於藉由(例如)凝聚技術或界面聚合製備之微膠囊(例如，羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊)中、膠質藥物遞送系統(例如，脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米顆粒及奈米膠囊)或巨乳液中。該等技術揭示於Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
亦可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適宜實例包括含有抗體之固體疏水性聚合物之半滲透性基質，該等基質呈成形物件形式，例如薄膜或微膠囊。
欲用於活體內投與之調配物通常為無菌的。無菌可藉由(例如)使用無菌過濾膜過濾來容易地達成。
治療方法及組合物
本文所提供任一抗CRTh2抗體可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供用作藥劑之抗CRTh2抗體。在又一態樣中，提供用於治療由CRTh2介導之病症之抗CRTh2抗體。在某些實施例中，提供用於治療方法中之抗CRTh2抗體。在某些實施例中，本發明提供用於治療患有由CRTh2介導之病症之個體之方法中的抗CRTh2抗體，該方法包含向該個體投與有效量之抗CRTh2抗體。在一此實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如如下文所述。在一些實施例中，病症選自由以下組成之群：氣喘、顆粒球缺乏型氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、急性或慢性氣道高敏感性、嗜酸性球增多症候群、嗜酸性球性食道炎、丘-施二氏症候群、特發性肺纖維化、與細胞激素相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之發炎或惡性腫瘤、慢性特發性蕁麻疹、慢性自發性蕁麻疹、物理性蕁麻疹(包括寒冷性蕁麻疹及壓力性蕁麻疹)、大皰性類天皰瘡、鼻瘜肉、食物過敏及伴有或不伴有囊性纖維化之過敏性支氣管肺麴菌病(ABPA)。在其他實施例中，本發明所提供之抗CRTh2抗體用於消耗個體中之CRTh2表現細胞(例如，Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球及/或先天性2型(IT2)細胞)或降低個體中之一或多種細胞激素、酶或其他發炎性介質(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺、中性蛋白酶及/或白三烯)之含量。在一些實施例中，由以下細胞類型中之至少一者所產生之一或多種細胞激素減少：Th2細 胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。在某些實施例中，本發明提供用於消耗個體中之CRTh2表現細胞(例如，Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球及/或先天性2型(IT2)細胞)及/或降低個體中之一或多種細胞激素、酶或其他發炎性介質(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺、中性蛋白酶及/或白三烯)之含量之方法中的抗CRTh2抗體，該方法包含向個體投與有效量之抗CRTh2抗體以消耗CRTh2表現細胞及/或減少一或多種細胞激素。上述實施例中之任一者之「個體」較佳係人類。
在另一態樣中，本發明提供抗CRTh2抗體在製造或製備藥劑中之用途。在一個實施例中，該藥劑係用於治療CRTh2介導之病症。在又一實施例中，該藥劑係用於治療CRTh2介導之病症之方法，該方法包含向患有該病症之個體投與有效量之該藥劑。在一此實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如如下文所述。在一些實施例中，該病症選自由以下組成之群：氣喘、顆粒球缺乏型氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、急性或慢性氣道高敏感性、嗜酸性球增多症候群、嗜酸性球性食道炎、丘-施二氏症候群、特發性肺纖維化、與細胞激素相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之發炎或惡性腫瘤、慢性特發性蕁麻疹、慢性自發性蕁麻疹、物理性蕁麻疹(包括寒冷性蕁麻疹及壓力性蕁麻疹)、大皰性類天皰瘡、鼻瘜肉、食物過敏及伴有或不伴有囊性纖維化之過敏性支氣管肺麴菌病(ABPA)。在又一實施例中，藥劑係用於消耗個體中之CRTh2表現細胞(例如，Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球及/或先天性2型(IT2)細胞)及/或降低個體中之一或多種細胞激素、酶或其他發炎性介質(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺、中性蛋白酶及/或白三烯)之含量。在又一實施例中，藥劑係用於消耗個體中之CRTh2表現細胞(例如，Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球及/ 或先天性2型(IT2)細胞)及/或降低個體中之一或多種細胞激素、酶或其他發炎性介質(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺、中性蛋白酶及/或白三烯)之含量之方法中，該方法包含向個體投與有效量之藥劑以消耗CRTh2表現細胞及/或以減少一或多種細胞激素。任一上述實施例之「個體」可為人類。
在又一態樣中，本發明提供治療CRTh2介導之病症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此病症之個體投與有效量之抗CRTh2抗體。在一此實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種額外治療劑，如下文所述。在一些實施例中，該病症選自由以下組成之群：氣喘、顆粒球缺乏型氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、急性或慢性氣道高敏感性、嗜酸性球增多症候群、嗜酸性球性食道炎、丘-施二氏症候群、特發性肺纖維化、與細胞激素相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之發炎或惡性腫瘤、慢性特發性蕁麻疹、慢性自發性蕁麻疹、物理性蕁麻疹(包括寒冷性蕁麻疹及壓力性蕁麻疹)、大皰性類天皰瘡、鼻瘜肉、食物過敏及伴有或不伴有囊性纖維化之過敏性支氣管肺麴菌病(ABPA)。任一上述實施例之「個體」可為人類。
在又一態樣中，本發明提供用於消耗個體中之CRTh2表現細胞(例如，Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球及/或先天性2型(IT2)細胞)及/或降低個體中之一或多種細胞激素、酶或其他發炎性介質(例如，IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺、中性蛋白酶及/或白三烯)之含量的方法。在一個實施例中，該方法包含向個體投與有效量之抗CRTh2抗體以消耗CRTh2表現細胞及/或減少一或多種細胞激素。在一個實施例中，「個體」係人類。在一些實施例中，該個體患有選自由以下組成之群之病症：氣喘、顆粒球缺乏型氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、急性或慢性氣道高敏感性、嗜酸性球增多症候 群、嗜酸性球性食道炎、丘-施二氏症候群、特發性肺纖維化、與細胞激素相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之發炎或惡性腫瘤、慢性特發性蕁麻疹、慢性自發性蕁麻疹、物理性蕁麻疹(包括寒冷性蕁麻疹及壓力性蕁麻疹)、大皰性類天皰瘡、鼻瘜肉、食物過敏及伴有或不伴有囊性纖維化之過敏性支氣管肺麴菌病(ABPA)。
在某些實施例中，本文所述之方法可用於治療患有氣喘之個體，其中該個體係嗜酸性球炎症陽性(EIP)，如US 2012/0156194中所定義。在某些實施例中，本文所述之方法可用於治療患有氣喘之個體，其中該個體係嗜酸性球炎症陰性(EIN)，如US 2012/0156194中所定義。亦參見DF Choy等人，J Immunol.186(3)：1861-9(2011)；Arron等人(2013)Adv Pharmacol 66：1-49；及G.Jia等人，J Allergy Clin Immunol.130(3)：647-654(2012)。
在某些實施例中，患有氣喘之患者顯示高含量之總血清或血漿骨膜蛋白(periostin)。在某些實施例中，EIP患者係指已測定血清或血漿骨膜蛋白含量之患者，其中血清或血漿骨膜蛋白含量等於或多於患者群體之中值或平均血清或血漿骨膜蛋白含量(亦可稱為高骨膜蛋白)。在某些實施例中，已如本文所述使用(例如)ELISA或三明治免疫分析測定血清或血漿骨膜蛋白含量之患者將具有20ng/m或更高之總骨膜蛋白含量(嗜酸性球陽性)。根據某些實施例，為EIP之患者在血清或血漿中之總骨膜蛋白含量可選自由以下組成之群：21ng/ml或更高、22ng/ml或更高、23ng/ml或更高、24ng/ml或更高、25ng/ml或更高、26ng/ml或更高、27ng/ml或更高、28ng/ml或更高、29ng/ml或更高、30ng/ml或更高、31ng/ml或更高、32ng/ml或更高、33ng/ml或更高、34ng/ml或更高、35ng/ml或更高、36ng/ml或更高、37ng/ml或更高、38ng/ml或更高、39ng/ml或更高、40ng/ml或更高、41ng/ml或更高、42ng/ml或更高、43ng/ml或更高、44ng/ml 或更高、45ng/ml或更高、46ng/ml或更高、47ng/ml或更高、48ng/ml或更高、49ng/ml或更高、50ng/ml或更高、51ng/ml或更高、52ng/ml或更高、53ng/ml或更高、54ng/ml或更高、55ng/ml或更高、56ng/ml或更高、57ng/ml或更高、58ng/ml或更高、59ng/ml或更高、60ng/ml或更高、61ng/ml或更高、62ng/ml或更高、63ng/ml或更高、64ng/ml或更高、65ng/ml或更高、66ng/ml或更高、67ng/ml或更高、68ng/ml或更高、69ng/ml或更高及70ng/ml或更高。
在某些實施例中，患有氣喘之患者顯示低含量之總血清或血漿骨膜蛋白。在某些實施例中，EIN患者係指已經測試血清或血漿骨膜蛋白含量之患者，其中血清或血漿骨膜蛋白含量小於20ng/ml。
應瞭解，EIP狀態代表患者之狀況，且並不依賴於用於測定該狀態之分析類型。因此，可使用或開發其他嗜酸性球發炎診斷分析(包括其他骨膜蛋白分析，例如ELISA分析及US2012/0156194中所示之ELECSYS®骨膜蛋白分析)來測試嗜酸性球發炎狀態及量測總骨膜蛋白含量。亦參見Jia等人，2012,J.Allergy Clin.Immunol.130：647-654及US2012/0156194，其整體內容以引用的方式併入本文中。
如本文所用之術語「總骨膜蛋白」係指至少骨膜蛋白之同功型1、2、3及4。此項技術已得知根據NCBI數據庫，人類骨膜蛋白同功型1、2、3及4分別包含以下胺基酸序列：NP_006466(SEQ ID NO：87)；NP_001129406(SEQ ID NO：88)、NP_001129407(SEQ ID NO：89)及NP_001129408(SEQ ID NO：90)，且同功型5已經部分定序。同功型5包含SEQ ID NO：91之胺基酸序列。在一個實施例中，骨膜蛋白之同功型係人類骨膜蛋白。在又一實施例中，術語總骨膜蛋白除以同功型1-4外包括人類骨膜蛋白之同功型5。在另一實施例中，總骨膜蛋白係總血清骨膜蛋白或總血漿骨膜蛋白(即，分別來自全血獲得之血清試樣或自全血獲得之血漿試樣之總骨膜蛋白，該全血係自患者獲 得)。
在一些實施例中，投與給個體之抗CRTh2抗體消耗該個體中之CRTh2表現細胞。在一些實施例中，抗體消耗來自肺組織及/或支氣管肺泡灌洗液之CRTh2表現細胞。在一些實施例中，個體中至少一種類型之CRTh2表現細胞(例如來自肺)與在投與抗體前之基線相比被消耗至少約50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%中之任一者。在一些實施例中，個體中至少一種類型之細胞激素Th2產生細胞(例如來自肺)與在投與抗體前之基線相比被消耗至少約50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%及100%中之任一者。如本文所用，「基線」係指在將本文所述之抗CRTh2抗體投與給個體前之含量。CRTh2表現細胞在投與抗體之前及之後之含量可使用此項技術中已知及本文所述之方法測試。
在又一態樣中，本發明提供醫藥調配物，其包含本文所提供抗CRTh2抗體中之任一者以供(例如)用於上述治療方法中之任一者中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文所提供抗CRTh2抗體中之任一者及醫藥上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文所提供抗CRTh2抗體中之任一者及至少一種額外治療劑，例如如下文所述。
本發明抗體可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明抗體可與至少一種額外治療劑共同投與。在某些實施例中，額外治療劑係吸入之皮質類固醇、短效β2激動劑、長效β2激動劑、長效毒蕈鹼激動劑、白三烯受體拮抗劑、肥大細胞抑制劑(例如，可瑪林)、CRTh2小分子抑制劑或其組合。
上文提及之該等組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或兩種以上治療劑包括於同一或單獨調配物中)及單獨投與(在此情形下，本發明抗體之投與可在投與額外治療劑及/或佐劑之前、同時及/或之後進行)。
本發明抗體(及任一額外治療劑)可藉由任何適宜方式投與，包括非經腸、肺內及鼻內、以及(若期望用於局部治療)病灶內投與。非經腸輸注包括肌內、靜脈內、動脈內、腹膜腔內或皮下投與。可藉由任一適宜途徑給藥，例如藉由注射，例如靜脈內或皮下注射，此部分地端視投與時間長短而定。本文涵蓋各種投藥時間表，包括(但不限於)在不同時間點單次或多次投與、濃注投與及脈衝輸注。
本發明抗體應以符合良好醫療實踐之方式調配、計量及投與。在此上下文中需考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個體患者之臨床病狀、病因、藥劑之遞送位點、投與方法、投與之時間表及從業醫師所知之其他因素。抗體不必(但視情況)與一或多種當前用於預防或治療所討論病症之藥劑一起調配。該等其他藥劑之有效量取決於調配物中所存在抗體之量、病症或治療之類型以及上文所討論之其他因素。該等藥劑通常以相同劑量且以本文所述之投與途徑、或約1%至99%之本文所述劑量、或以經驗/臨床確定為合適之任一劑量及任一途徑使用。
對於疾病之預防或治療，本發明抗體之適宜劑量(在單獨使用或與一或多種其他治療劑組合使用時)將取決於欲治療疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重性及病程、投與抗體係用於預防還是治療目的、先前療法、患者之臨床史及對抗體之反應以及主治醫師之判斷。抗體係一次性或經一系列治療以適當方式投與患者。端視疾病之類型及嚴重程度，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg至10mg/kg)抗體可為投與患者之初始候選劑量，不論(例如)係藉由一或多次單獨投與、或藉由連續輸注。端視上述因素而定，一種典型日劑量可介於約1μg/kg至100mg/kg之間或更高。對於經若干天或更長時間重複投與，端視病狀而定，治療通常將持續至對疾病症狀之期望阻抑出現為止。抗體之一種實例性劑量可在約0.05mg/kg至約10mg/kg範圍內。因此，可 將約0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其組合)之一或多個劑量投與患者。該等劑量可間歇性投與，例如每週一次或每三週一次(例如，以使患者接受約2個至約20個或例如約6個劑量之抗體)。可在開始時投與較高負荷劑量，隨後投與一或多個較低劑量。然而，可使用其他劑量方案。此療法之進展可容易地藉由習用技術及分析來監測。
應理解，可使用本發明之免疫偶聯物代替抗CRTh2抗體或與抗CRTh2抗體一起實施上述調配物或治療方法中之任一者。
製品及套組
在本發明之另一態樣中，提供包含一或多種抗CRTh2抗體之可用於治療、預防及/或診斷以上所述病症之製品或套組。該製品或套組可進一步包含容器及位於該容器上或與該容器相觀瀾之標記或包裝插頁。適宜容器包括(例如)瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由諸如玻璃或塑膠等多種材料形成。容器容納有自身或與另一組合物組合時有效治療、預防及/或診斷病狀之組合物，且可具有無菌存取口(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之塞子的小瓶)。該組合物中之至少一種活性劑係本發明抗體。標記或包裝插頁指示該組合物用於治療選定病狀。此外，該製品或套組可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明抗體；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或相反治療劑。本發明之此實施例中之製品或套組可進一步包含包裝插頁，該包裝插頁指示該組合物可用於治療特定病狀。或者或另外，製品或套組可另外包含第二(或第三)容器，其包含醫藥上可接受之緩衝液，例如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)及右旋糖溶液。其可另外包括自商業及使用者角度來看期望之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、濾膜、針及注 射器。
應理解，上述製品或套組中之任一者可包括本發明之免疫偶聯物來代替抗CRTh2抗體或與抗CRTh2抗體一起使用。
實例
以下係本發明方法及組合物之實例。應理解，鑒於上文所提供之一般說明可實踐各種其他實施例。
實例1. 鼠科動物抗人類CRTh2抗體之生成 材料及方法 選殖及細胞系
恒河猴及食蟹猴CRTh2 cDNA係藉由RT-PCR自恒河猴及食蟹猴血液提取之總RNA獲得並選殖於哺乳動物表現載體含胺基末端Flag標籤、gD標籤或無標籤之pRK5載體中。將來自Origene(基因庫(Gene Bank)NM_004778)人類全長cDNA選殖於具有胺基末端Flag標籤、gD標籤或無標籤之載體pRK5中。在序列確認時，CRTh2純系在204位含有丙胺酸而非纈胺酸，如基因庫NM_004778中所指示(例如，相對於基因庫參考序列具有V204A取代之SEQ ID NO：84)。
使用Fugene 6(Roche)將含CRTh2之質粒轉染於293細胞中並利用單株抗Flag抗體(純系M2,Sigma)、抗gD Ab(純系952,Genentech)或利用針對人類CRTh2之包括大鼠抗CRTh2抗體BM16(BD Pharmingen)之特異性抗CRTh2 Ab確認經標記或未經標記CRTh2之表面表現。亦藉由電穿孔將含CRTh2之質粒引入300.19細胞(小鼠前B細胞系)中，並利用Flag標籤表現確認表面CRTh2表現。亦藉由針對人類CRTh2之包括純系BM16(BD Pharmingen)之抗CRTh2單株抗體測定CRTh2於300.19細胞表面上之表現。
抗人類CRTh2抗體之生成
為生成抗人類CRTh2抗體，將Balb/c小鼠(查理斯河(Charles River))用兩種方法中之一者進行免疫：DNA免疫及細胞免疫。對於DNA免疫，Balb/c小鼠藉由尾靜脈液壓注射利用50ug於pRK5載體中之人類CRTh2 DNA加小鼠Flt3-L以及GM-CSF作為佐劑每週一次進行免疫。對於細胞免疫，Balb/c小鼠(查理斯河，Hollister,CA)藉由腹膜腔內利用5百萬個稀釋於PBS中之經人類CRTh2穩定轉染之300.19細胞每週兩次經由i.p.注射進行免疫。小鼠接受10個劑量，隨後在融合前3天用20百萬個細胞i.v.連同40百萬個細胞i.p.進行預融合加強。
融合瘤係藉由標準方法生成。脾細胞與X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤細胞(美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection),Rockville,MD)經由電融合(BTX,Hawthorne,NY)進行融合並於37℃,7% CO2下在補充有以下之中培育過夜杜貝克氏改良鷹氏培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Medium,DMEM；Lonza,Basel,Switzerland)：10%胎牛血清(FBS)、4.5g/L葡萄糖、25mM HEPES、0.15mg/ml草醯乙酸、100μg/ml丙酮酸、0.2U/ml胰島素、2mM L-麩胺醯胺、100U/ml盤尼西林(penicillin)、100μg/ml鏈黴素(盤尼西林-鏈黴素，Invitrogen,Carlsbad,CA)、NCTC-109(Lonza)、NEAA(Invitrogen)，然後平鋪於96孔板如所述補充有5.7μM偶氮絲胺酸及100μM次黃嘌呤(HA,Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)之培養基中。將細胞培養10天，隨後進行ELISA及FACS分析。使來自孔且藉由FACS證實表現小鼠IgG且顯示強特異性結合之細胞擴展並藉由有限稀釋亞選殖。使在第二輪亞選殖之後證實最強FACS結合之最終純系擴展用於在生物反應器(Integra Biosciences,Chur,Switzerland)中大規模生產。然後如先前所述藉由蛋白質A親和層析純化上清液(Hongo等人，Hybridoma 19：303,2000)。藉由流式細胞術針對結合於293細胞或300.19細胞上所表現之人類CRTh2之能力篩選來自融合瘤之純化抗體。亦測試對來自人類周邊血液之嗜鹼性球及嗜酸性球之結合反應 性。將純系19A2、8B1、31A5及3C12之輕鏈及重鏈亞選殖於pRK5載體中。所有重鏈均經選殖以含有小鼠IgG2a Fc區。使用標準程序在CHO細胞中產生抗CRTh2抗體。自FUT8-/- CHO細胞系產生無岩藻糖基化19A2及8B1抗體。
流式細胞術
自健康供體獲得人類全血並在利用EL緩衝液(Qiagen)進行紅血球溶胞之後周邊血液單核球(PBMC)用於染色程序。將血液細胞與A467偶聯抗CRTh2抗體於各種濃度下一起或與抗CRTh2抗體加二級抗小鼠IgG-PE抗體(Jackson ImmunoResearch Laboratory)一起培育。用於染色白血球群體之抗體係如下：FITC-抗人類CD15、CD16、PerCP-抗人類HLADR及CD4、APC-抗人類CD123、CXCR3、CD14、BDCA1、生物素-抗人類CCR6及PE-抗人類CCR4。所用Ab係自BD Pharmingen購得。為測定CRTh2於調節性T細胞上之表現，藉由MACS分離(Miltenyi Biotec)自人類PBMC富集CD4+CD25+ T細胞，利用抗CRTh2(抗體BM16)進行表面染色，隨後利用抗FoxP3(BD Bioscience)進行細胞內染色。為評估CRTh2於人類肥大細胞上之表現，藉由在具有200ng/mL rhIL-6、100ng/mL rhSCF(PeproTech)及30ng/mL rhIL-3(R&D system)之StemPro-34 SFM完全培養基(Gibco)中培養新鮮人類骨髓CD34+細胞(AllCells)達3-4週生成肥大細胞。肥大細胞用抗CD117、抗CD123及抗FceRI(BD Bioscience)進行染色。為測定人類CRTh2於人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中之Th2細胞上之表現，將50ug於50ul PBS中之木瓜酶注射於小鼠右後足墊中，3天後收集膕淋巴結細胞並用抗mCD4-PerCP、抗mCD44-FITC及BM16-A647染色。為檢查人類CRTh2於人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中之先天T輔助型(IT)2細胞上的表現，將50ug於pRK5載體中之小鼠IL-17E以流體動力學方式注射於尾靜脈中。3天後，收集腸繫膜淋巴結細胞並用抗mCD117-PE、BM16-A647、碘化 丙啶及譜系標記物(FITC標記：CD3、CD4、CD8、B220、FceRI、CD11c、Gr1、NK1.1、F4/80、DX5及PerCP標記：CCR3)染色。FITC-抗人類CD15、CD16、PerCP-抗人類HLADR及CD4、APC-抗人類CD123、CXCR3、CD14、BDCA1、生物素-抗人類CCR6及PE-抗人類CCR4係自BD Pharmingen購得。自健康猴子獲得食蟹猴及恒河猴血液並在利用EL緩衝液(Qiagen)進行紅血球溶胞之後周邊血液單核球(PBMC)用於染色程序。血液細胞與A467偶聯抗CRTh2抗體在各種濃度下一起培育。用於染色白血球群體之抗體係如下：FITC-抗人類CD123(BD Pharmingen)、PE-抗人類CD125(BD Pharmingen)及PerCP-eFluor710抗人類FceRI(eBioscience)。在FACSCalibur流式細胞儀上使用CellQuest Pro軟體(BD Biociences)捕獲試樣並使用Flowjo(Tree Star,Inc)實施數據分析。
CRTh2+記憶CD4+ T細胞分離及細胞激素產生之定量
自特異性供體之人類PBMC藉由MACS分離(Miltenyi Biotec)分離出未觸碰記憶CD4+ T細胞，隨後利用CD45RO-FITC、CD4-PerCP(BD Pharmingen)及BM16-PE(Miltenyi Biotec)抗體於37℃下染色20分鐘。CRTh2+CD45RO+CD4+及CRTh2-CD45RO+CD4+記憶T細胞藉由FacsAria分選器(BD)進行分選。CRTh2+及CRTh2-記憶CD4+ T細胞之純度高於98%。將相同數量之經分選細胞利用10ug/mL板結合抗hCD3 mAb及1ug/mL可溶性抗hCD28於37℃下刺激48小時。收集上清液並使用人類Bio-Plex(Bio-Rad)抗體固定之珠粒分析IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17A、TNFα、IFNγ及GM-CSF且使用Luminex 100儀器(Luminex)根據製造商方案讀取板。
放射性配體細胞結合分析(斯卡查德分析)
使用放射性配體細胞結合分析來測定抗CRTH2抗體結合表現重組CRTh2受體之細胞之平衡解離常數(KD)。使用Iodogen方法碘化抗 CRTh2抗體且經標記抗體之特異性活性在對於Fab抗體19-22μCI/μg與對於IgG抗體10-14μCI/μg之範圍內。將表現CRTh2受體之細胞於室溫下與固定濃度之經碘化抗CRTh2抗體與濃度增加之未標記抗CRTh2抗體且包括零添加僅緩衝劑試樣之組合一起培育2小時。2小時培育之後，將競爭反應轉移至Millipore Multiscreen過濾板並用結合緩衝液洗滌4次以分離游離之經碘化抗體與結合之經碘化抗體。於Wallac Wizard 1470 γ計數器上對過濾器進行計數。使用NewLigand軟體(Genentech)評價結合數據，該軟體使用Munson及Rodbard之擬合演算法以測定抗CRTh2抗體之結合親和力(Munson及Rodbard,Anal.Biochem,1980；107：220-239)。
表位映射
使用EZ-Link Sulfo-NHS-Biotin套組(Pierce/Thermo-Fisher,Rockford,IL)生物素化經純化小鼠抗CRTh2單株抗體19A2及大鼠抗CRTh2單株抗體BM16。藉由對經人類CRTh2或恒河猴CRTh2之穩定轉染293細胞進行FACS滴定證實活性。將50ul經轉染293細胞以10個百萬個細胞/ml之濃度添加於96孔U型底部板(BD Falcon,Franklin Lakes,NJ)中懸浮於含1% FBS之PBS中，隨後以20ug/ml之濃度添加50μl未標記抗體，並將板於4℃下培育30分鐘。將如藉由先前FACS滴定試驗所測定，生物素化抗體以2ug/ml之濃度(19A2及BM16)添加於板，並將板於4℃下培育30分鐘。使用離心將細胞洗滌兩次以沉降細胞，隨後添加200μl含1% FBS之PBS。然後將細胞與藻紅素偶聯鏈黴抗生物素蛋白(steptavidin)(Zymed/Life Technologies,Grand Island,NY)一起於4℃下培育30分鐘。將細胞洗滌，於含有1%福爾馬林(formalin)之PBS固定，並藉由流式細胞術於FACSCalibur流式細胞儀(BD Biosciences,San Jose,CA)上分析。
人類T細胞極化
藉由MACS分離(Miltenyi Biotec)自健康供體之PBMC分離未觸碰未處理之CD4+ T細胞。將細胞於補充有10% FBS、2mM L-麩胺醯胺、50uM 2-ME、1mM丙酮酸鈉、100U/mL盤尼西林、100ug/mL鏈黴素及1mM非必需胺基酸之完全DMEM培養基中在10ug/mL板結合之抗CD3 mAb及1ug/mL可溶性抗CD28 mAb(BD Biociences)之存在下培養。人類Th子集極化條件係如下：Th1：10ng/mL rhIL12及2ug/mL抗hIL-4；Th2：20ng/mL rhIL-4(R&D System)、2ug/mL抗hIL-12及5ug/mL抗hIFNγ(BD Biosciences)。實施兩輪極化，其中每一輪由激活期、隨後休息期組成且第二再刺激係在1ug/mL板結合抗CD3 mAb及1ug/ml可溶性抗CD28 mAb之存在下實施。
鈣動員分析
將活體外極化Th2細胞與5μM indo-1/AM及0.2%普朗尼克F127(pluronic F127)(Molecular Probe)一起於37℃下培育30分鐘，洗滌且隨後用抗CCR6、抗CCR4、抗CD4及抗CXCR3 mAb於37℃下染色15分析；洗滌之後，將細胞與1uM抗CRTh2 mAb或同種型對照抗體一起於37℃下培育30分鐘，且然後用100nM PGD2(Sigma)刺激。藉由流式細胞術監測鈣釋放。
CRTh2功能cAMP阻斷分析
在抗CRTh2與重組細胞系cAMP HunterTM CHO-K1 CRTh2 Gi(DiscoveRx；Fremont,CA)一起培育之後，藉由在福司柯林及PGD2(Sigma；St.Louis,MO)之存在下量測細胞cAMP含量分析抗CRTh2抗體在PGD2-CRTh2信號傳導中之阻斷活性。簡言之，將細胞以10,000個細胞/孔於384孔組織培養板(Corning Cat# 3707；Corning,NY)中培養過夜。移除培養基之後，將10μL測試抗體(連續稀釋於PBS中)添加於每一孔並於37℃下培育30分鐘。然後將福司柯林及PGD2添加至每一孔以分別達到12.5μM及4nM之最終濃度。於37℃下再培育30分鐘之 後，根據製造商方案使用HitHunter® cAMP XS+套組(DiscoveRx)對板進行cAMP分析，其中Envison(Perkin Elmer；Waltham,MA)作為化學發光讀取器。然後分析數據並使用Prism(GraphPad Software；La Jolla,CA)繪製曲線。
人類CRTh2 BAC轉基因小鼠之生成
自Invitrogen購得在BAC載體骨架中含有人類CRTh2基因之171 Kb片段(RPCI human BAC library 11；純系ID RP11-68H20)。藉助重組工程獲得28 Kb之較短形式。將171 Kb或28 Kb BAC構築體微注射於自C57BL/6小鼠收穫之受精卵母細胞中。藉由小鼠尾部DNA之RT-PCR測定人類CRTh2轉基因之存在。在經鑑別之9只首建者中，7只對藉由流式細胞術所測試之免疫細胞類型給出相似人類CRTh2表現模式。在該等品系中，與來自人類PBMC之初代人類嗜鹼性球及嗜酸性球上之人類CRTh2含量相比，藉由流式細胞術證實品系85在小鼠嗜鹼性球及嗜酸性球上具有相似之人類CRTh2表現含量。
人類CRTh2 BAC轉基因小鼠中血液嗜鹼性球及嗜酸性球經抗CRTh2抗體消耗之量測
在第0天將小鼠或人類化抗人類CRTh2抗體或同種型對照抗體(mIgG1：抗gp120抗體；mIgG2a：抗豬草抗體；hIgG1：抗gD抗體)以所示劑量靜脈注射於6-8週齡人類CRTh2 BAC tg小鼠中。3天、6天或7天之後獲得眼部血液以如所示藉由流式細胞術分析嗜鹼性球及嗜酸性球數量。或者，將一組小鼠在第2天、第3天、7天或第14天處死並收穫血液、脾臟及骨髓並經處理藉由流式細胞術用於計算嗜酸性球及嗜鹼性球。紅血球利用EL緩衝液(Qiagen)進行溶胞。白血球、脾細胞或骨髓細胞利用抗CD123-FITC、抗FcεRI-PE及抗CCR3-PerCP染色以檢測嗜鹼性球及嗜酸性球。藉由流式細胞術使用CaliBRITE FITC珠粒(BD Biosciences)測定絕對細胞數量。
人類CRTh2 BAC轉基因小鼠中TNP-OVA誘導之肺發炎
在第0天藉由腹膜腔內注射50ug於100ul無菌PBS中之2mg氫氧化鋁中之TNP-OVA(Biosearch Technologies)敏化人類CRTh2 BAC tg小鼠。在敏化後第35天開始，將小鼠經由噴霧器利用PBS中之霧化1% TNP-OVA挑戰30分鐘，連續7天。小鼠於第38天至第41天每天一次利用於100uL生理鹽水中之200ug抗人類CRTh2抗體純系19A2 mIgG2a(無岩藻糖基化或wt)、Fc突變體Ab 19A2 mIgG2a_DANA或抗豬草對照抗體(mIgG2a)腹膜腔內治療。在第42天對所有小鼠實施安樂死。小鼠藉助右心室灌注20ml PBS來清洗肺之周邊血液，並移除整個肺用於流式細胞術。心臟穿刺收集血液用於藉由流式細胞術進行評價。收集BAL用於細胞計數及細胞激素分析。藉由ELISA(R&D)根據製造商方案測定BAL流體IL-4及IL-13細胞激素濃度。藉由使廢除Fcγ受體結合之2個殘基(D265A、N297A)突變產生效應子功能缺乏形式之19A2抗體19A2_DANA。
人類SCID模型以評估抗人類CRTh2 Ab消耗Th2細胞之潛力
在第-7天，藉由白血球分離術及Ficoll密度梯度離心(GE Healthcare)自具有315ng/mL之血清IgE含量之特異性供體分離人類PBMC。將來自同一供體之PBMC等份試樣冷凍用於隨後轉移至小鼠中。藉由使用未處理之CD4+ T細胞分離套組II(Miltenyi Biotec 130-094-131)消耗非-CD4+ T細胞及記憶T細胞進一步自PBMC分離未觸碰未處理之CD4+ T輔助型細胞。經純化之未處理CD4+ T細胞用板結合抗CD3以10ug/mL(BD 555329)及1ug/mL之可溶性抗CD28(BD 555725)在針對Th2之扭曲條件下：5ug/mL抗人類IFNg(BD 554698)、2ug/mL抗IL12(BD 554659)及20ng/mL重組人類IL-4(R&D System 204-IL)刺激3天。將在Th2條件下刺激之CD4+ T細胞用於至SCID灰棕色小鼠中之轉移試驗。
在第0天，將SCID灰棕色小鼠(查理斯河)以亞致死劑量用3.5 Gy銫137源輻照。將於100ul PBS中之人類T細胞於以下混合物中經由腹膜腔內注射轉移至小鼠中：來自同一供體之6×107個經極化T細胞(如上所述)及4×107個活的先前冷凍之人類PBMC。在第0天及第3天將於100ul PBS中之100ug抗人類IFNg及100ug抗人類IL-12抗體經腹膜腔內注射於小鼠。在第1天、第2天及第3天將100ng重組人類IL-4經腹膜腔內注射於小鼠中。在細胞轉移前之第0天及第3天將小鼠用於100uL PBS中之200ug抗人類CRTh2抗體(純系19A2，無岩藻糖基化)或抗豬草同種型對照抗體治療。在第7天對所有小鼠實施安樂死並收集脾臟。將脾細胞離體利用PdBu(50ng/mL)及離子黴素(500ng/mL)於37℃下刺激4.5小時用於藉由FACS評估細胞內細胞激素含量。將細胞利用抗hCD4進行表面染色及利用抗mCD45、抗mTer119及抗hCD19在同一通道中染色以排除該等譜系陽性細胞。將細胞固定並用抗hIFNg及抗hIL-4染色。
用於IT2細胞消耗之模型
為增加人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中之先天型T輔助型(IT)2細胞之數量，將於pRK5載體中之50ug/小鼠IL-17E於1.6ml林格氏溶液中以流體動力學方式注射於尾靜脈中。3天後，收集腸繫膜淋巴結並藉由流式細胞術利用抗mCD117-PE、BM16-A647染色並排除譜系陽性以及死細胞(品系：CD3、CD4、CD8、B220、FceRI、CD11c、Gr1、NK1.1、F4/80、DX5及CCR3)測定IT2細胞百分數及數量。
結果
CRTh2在與氣喘相關聯之細胞上表現
藉由流式細胞術利用抗人類CRTh2抗體(純系BM16)評估CRTh2於來自人類PBMC或培養之人類細胞之細胞上之表現(圖1)。CRTh2選擇性表現於人類血液嗜鹼性球、嗜酸性球、經極化Th2細胞、骨髓源肥 大細胞以及先天型T輔助型2(IT2)細胞上，如最近所報告(Mjosberg,Nat.Imm.12(11)：1055-62(2011))。CRTh2不表現於經極化Th1細胞、嗜中性球、樹突細胞、單核球及調節性T細胞上。在B細胞、NK細胞、NK T細胞及血小板上亦未檢測到CRTh2表現(數據未顯示)。
CRTh2細胞與Th2細胞激素產生相關聯
為評估CRTh2在與Th2細胞激素產生相關聯之T細胞子集上之表現，將CRTh2+及CRTh2-記憶CD4 T細胞進行FACS分選並利用抗CD3及抗CD28抗體刺激以評估Th2細胞激素產生。CRTh2+記憶CD4 T細胞產生比CRTh2-記憶CD4 T細胞群體多95%之記憶T細胞Th2細胞激素(圖2)。所測試之其他供體顯示類似結果。
抗人類CRTh2抗體之生成及活體外表徵
抗人類CRTh2抗體係自無佐劑利用過表現人類CRTh2之300.19細胞免疫之Balb/c小鼠生成。
如本文所述生成之抗CRTh2抗體以劑量依賴方式結合至過表現人類CRTh2之293細胞或300.19細胞，但未結合至293或300.19野生型細胞(圖3A及3B)。測試抗人類CRTh2 Ab與在293或300.19細胞中過表現之食蟹猴(cyno)或恒河猴CRTh2之交叉反應性。除純系19A2以外所有Ab均未顯示與食蟹猴或恒河猴CRTh2之反應性，純系19A2與293細胞上表現之食蟹猴CRTh2顯示微小交叉反應性。抗人類CRTh2抗體亦以劑量依賴方式與來自人類全血之初代人類嗜鹼性球及嗜酸性球。候選物抗人類CRTh2抗體係基於其結合在293細胞或300.19細胞表面上過表現之人類CRTh2之能力以及其與來自人類周邊血液單核球(PBMC)之初代嗜鹼性球及嗜酸性球的相對反應性來選擇(圖3)。自上述免疫生成之所有其他抗體均結合至人類CRTh2，但與恒河猴或食蟹猴CRTh2無交叉反應(數據未顯示)。亦測試人類化純系h19A2.v1及純系h19A2.v12與在293細胞或300.19細胞上表現之CRTh2以及與初代血液 嗜鹼性球及嗜酸性球上之CRTh2之反應性。類似於19A2，人類化h19A2.v1與在293細胞(圖3D)、300.19細胞(圖3E)上表現之人類CRTh2及在初代血液嗜鹼性球及嗜酸性球上之CRTh2(圖3F)反應，與在293或300.19細胞上過表現之食蟹猴CRTh2具有微小交叉反應性。人類化h19A2.v1與在293或300.19細胞及初代恒河猴血液嗜鹼性球上過表現之值河猴CRTh2不反應。與此相比，人類化及基因工程化抗體h19A2.v12以劑量依賴方式與在293細胞(圖3D)或300.19細胞(圖3E)上表現之人類、食蟹猴及恒河猴CRTh2以及與初代血液嗜鹼性球上之人類、食蟹猴及恒河猴CRTh2(圖3F)反應。此外，於初代人類血液嗜酸性球上之CRTh2亦檢測到抗體h19A2.v12。
利用同源性競爭實施放射性標記之配體分析以評估抗CRTh2抗體對293細胞及300.19細胞上之表面表現之人類CRTh2的解離常數(KD)。小鼠抗人類CRTh2純系19A2及8B1(全IgG)對表現人類CRTh2之293細胞之KD值分別為2nM及2.6nM。抗體19A2對300.19細胞之KD值為10.2nM(圖4A)。為獲得人類化抗體h19A2.v12及h19A2.v60之KD值的直接量測，產生該等抗體之Fab片段並經受放射性配體細胞結合分析(圖4B)。h19A2.v12及h19A2.v60(IgG之Fab片段)對表現人類CRTh2之293細胞的KD值分別為51nM及56nM。h19A2.v12及h19A2.v60(IgG之Fab片段)對表現食蟹猴CRTh2之293細胞的KD值分別為152nM及39nM。基於該等量測值，人類對食蟹猴CRTh2對於h19A2.12之相對結合親和力在3倍內且對於h19A2.v60似乎等效(圖4B)。
為獲得人類化抗體h19A2.v52及h19A2.v46之KD值的直接量測，生成該等抗體之Fab片段並經歷放射性配體細胞結合分析(圖15)。h19A2.v52及h19A2.v46(IgG之Fab片段)對表現人類CRTh2之293細胞的KD值分別為13.7nM及6.4nM。h19A2.v52及h19A2.v46(IgG之Fab片段)對表現食蟹猴CRTh2之293細胞的KD值分別為21.3nM及8.6nM。
為評估抗CRTh2抗體之阻斷功能，在抗CRTh2或同種型對照抗體之存在下檢查活體外經極化Th2細胞對配體前列腺素(PGD2)之鈣動員。藉由將細胞與8B1及3C12一起預培育完全阻止至PGD2之鈣通量，同時31A5顯示部分效應。與抗CRTh2 19A2抗體一起培育並未顯著影響CA2+通量(圖5)，此指示與可阻斷CRTh2之功能的8B1及3C12相比，19A2係CRTh2之非阻斷抗體。
人類CRTh2之轉基因小鼠模型之生成
為表徵抗CRTh2抗體在活體內之消耗能力，藉由將BAC載體上之人類CRTh2基因引入至C57BL/6受精卵母細胞中產生轉基因小鼠模型(人類CRTh2.Bac.Tg小鼠)(圖6A)。儘管在7只首建者上證實人類CRTh2於血液嗜鹼性球及嗜酸性球上之表現，但未能檢測到hCRTh2在hCRTh2.Bac.tg品系中之小鼠Th2細胞上之表現。對三個代表性首建者品系進行更詳細的分析(數據未顯示)。分別與初代人類血液嗜鹼性球及嗜酸性球以及骨髓源人類肥大細胞(圖6B)相比，人類CRTh2.Bac.Tg小鼠之首建者品系85經證實在小鼠血液嗜鹼性球及嗜酸性球以及腹腔肥大細胞上之人類CRTh2之表現含量類似。因此，所有首建者85 hCRTh2.Bac.Tg小鼠均用於隨後活體內消耗研究中。此外，在小鼠先天型T輔助型(IT)2細胞上表現人類CRTh2之首建者品系85(圖6B)儘管表現，但含量與在來自PBMC之人類IT2細胞上之表現相比似乎降低。
抗CRTh2抗體在人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中消耗血波嗜鹼性球及嗜酸性球
為測試抗CRTh2抗體在活體內是否可消耗CRTh2+嗜鹼性球及嗜酸性球，將一個劑量之19A2或3C12抗體投與CRTh2.Bac.Tg小鼠，如所指示(圖7A)。單一劑量之19A2或3C12在治療後第3天完全消耗人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中周邊血液中之嗜鹼性球及嗜酸性球，如藉由流式 細胞術所測定(圖7A)。在治療後第7天仍觀察到嗜鹼性球及嗜酸性球之顯著消耗。在單一劑量抗體之後如所評估在治療後第6天8B1及19A2抗體亦消耗來自血液之嗜鹼性球及嗜酸性球(圖7B)。
在人類CRTh2.Bac.Tg小鼠之TNP-OVA誘導之慢性氣喘模型中抗CRTh2抗體消耗肺中之嗜酸性球及嗜鹼性球
為評估抗CRTh2抗體是否可消耗組織內之CRTh2+細胞，在TNP-OVA誘導之慢性氣喘模型中檢查抗CRTh2抗體治療之效應。在i.p.200ug/小鼠之治療方案中，4個劑量之抗體19A2完全消耗肺嗜酸性球及嗜鹼性球，且肺肥大細胞亦被消耗掉80%(圖8)。此外，支氣管肺泡灌洗液(BALF)中之嗜酸性球被消耗掉100%。此外，支氣管肺泡灌洗液(BALF)中之Th2細胞激素IL-4及IL-13分別降低100%及48%(圖8B)。
抗CRTh2抗體消耗SCID小鼠中產生Th2細胞激素之細胞
由於在人類CRTh2.Tg小鼠中之Th2細胞(CD4+CD44hi)上未檢測到人類CRTh2表現，因此不可能在人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中評估Th2細胞消耗。為評價抗CRTh2抗體是否可在活體內消耗產生Th2細胞激素之細胞，將活體外經極化人類Th2細胞轉移至SCID小鼠，用抗CRTh2或同種型對照Ab每週治療兩次，並在開始投藥後第7天用PMA及離子黴素離體刺激之後評估IL-4產生細胞。細胞內IL-4染色指示92%之IL-4產生細胞因19A2抗CRTh2抗體治療而消耗，而IFNg產生細胞未減少(圖9A)。
抗CRTh2消耗人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中之先天性2型細胞
為評估抗CRTh2抗體消耗先天性2型(IT2)細胞(亦稱為先天型類淋巴型2細胞或ILC2細胞)之能力，藉由將含IL-17E之質粒注射於hCRTh2.Bac.Tg小鼠中增加IT2細胞數量。將小鼠用單一劑量之抗hCRTh2或同種型對照抗體i.v.治療且在治療後第3天藉由流式細胞術檢測腸系膜淋巴節中之IT2細胞百分數及數量。抗hCRTh2治療使 hCRTh2.Bac.Tg小鼠中腸系膜淋巴結IT2細胞之百分數及數量顯著降低超過50%。
實例2. 抗體人類化及親和力成熟 生物素化CRTh2在哺乳動物細胞中之表現
將人類、食蟹猴及值河猴CRTh2 cDNA以及具有Q16E或R19H突變之人類CRTh2選殖於在框架中在3’末端融合至編碼之序列及連接體以及Avitag序列(GSGGLNDIFEAQKIEWH)之哺乳動物表現載體pRK5中。來自大腸桿菌(Escherichia coli)之BirA生物素連接酶基因亦選殖於哺乳動物表現載體pRK5中。將編碼來自每一物種之CRTh2之質粒與BirA表現質粒以9：1之比率混合並使用Lipofectamine2000試劑(Invitrogen)於含10%胎牛血清且補充有10μM生物素之杜貝克氏改良鷹氏培養基中共轉染於293T細胞中。轉染後使細胞饑餓24小時並純化含有生物素化之CRTh2之質膜部分。
質膜部分之純化
將轉染細胞(2.5×108)在含有蛋白酶抑制劑雞尾酒混合物(Roche)之PBS(150mM NaCl、10mM磷酸鈉，pH 7.4)中洗滌兩次並將細胞沈澱於-80℃下冷凍。將細胞解凍並重新懸浮於4ml溶胞緩衝液(1mM EDTA、50mM HEPES緩衝液中，pH7.4，含有蛋白酶抑制劑混合物)中並在Dounce均質器中利用緊密配合杵以8次拍打來溶胞。在初始溶胞之後，添加含有500mM蔗糖之4ml溶胞緩衝液並進一步利用緊密配合杵以8次拍打來溶胞。藉由以770×g離心10分鐘移除細胞碎片並藉由以17,000×g離心使上清液中之膜物質沈澱。在Dounce均質器中利用鬆散配合杵之8次拍打將經沈澱之膜重新懸浮於含有250mM蔗糖之6ml溶胞緩衝液。藉由以770×g離心10分鐘移除大的碎片。於透明SW40離心管中將上清液仔細地鋪含有1.12M蔗糖之4ml溶胞緩衝液上並在SW40Ti旋轉器(Beckman)中以25,000rpm於4℃下旋轉1小時。 藉由移液管收集高濃度與低濃度蔗糖部分之間之界面處的物質，與等體積之無蔗糖溶胞緩衝液混合並藉由以16,000×g在4℃下離心10分鐘沈澱。將經沈澱質膜重新懸浮於1ml溶胞緩衝液並在-80℃下儲存。所有均質步驟均在冰上實施。
來自昆蟲細胞之CRTh2之表現及純化
蛋白質表現：將編碼智人(Homo sapiens)及食蟹猴(Macaca fascicularis)CRTh2之Ala3-Asp330的DNA選殖於含有C末端Avi-標籤及His8-標籤之經修飾pAcGP67桿狀病毒轉移載體(BD Biosciences)中。重組桿狀病毒係藉由利用pAcGP67構築體及線性化桿狀病毒DNA於ESF 921培養基(Expression Systems)中使用BaculoGold表現系統(BD Biosciences)共轉染Sf9細胞來生成。藉助三輪擴增生成病毒。以類似方式生成表現未經標記之大腸桿菌BirA(Met1-Lys321)之重組桿狀病毒。使用40mL兩種病毒(CRTh2及BirA)以2×106個細胞/mL之密度共感染10L Tni.PRO細胞。使細胞進一步於27℃下生長48小時並藉由離心自培養基移除。
蛋白質純化：將收穫之細胞沈澱重新懸浮於含完全無EDTA之蛋白酶抑制劑混合物(Roche)之50mM Tris pH 8、200mM NaCl(TBS)中並藉由三遍通過微流化器溶胞。溶胞產物澄清之後，藉由以40K在45 Ti超離心旋轉器(Beckman)中於4℃下離心2小時收穫膜。將30克膜沈澱物重新懸浮於TBS(10g/L)中並利用1%(wt/vol)月桂基麥芽糖新戊二醇(LMNG,Affymetrix)於4℃下溶解2小時。澄清之後，使試樣分批結合於Ni-NTA樹脂(Qiagen)上並用含15mM咪唑之含0.12%(wt/vol)毛地黃皂苷(EMD Biosciences)之TBS洗滌。蛋白質利用含300mM咪唑之相同緩衝液溶析，並濃縮並在4℃下在無咪唑之TBS-毛地黃皂苷(0.12%)緩衝液中使用100 MWKO旋轉濃縮器(Vivaspin,GE Healthcare)稀釋5倍。藉由與蛋白質標準物相比較來估計生物素化- CRTh2蛋白質濃度；將試樣分成等份試樣並在液氮中快速冷凍。
利用增溶之CRTh2的ELISA
將中性親和素(Neutravidin)(Pierce)塗佈於96孔Maxisorp ELISA板(2μg/ml於10mM碳酸鹽緩衝液中，pH 9.6,100μl/孔)上於4℃下過夜並用含0.5%牛血清白蛋白之PBS(封阻緩衝液)進行封阻。將含有CRTh2或對照膜蛋白或經純化CRTh2之質膜稀釋於封阻緩衝液中並於1%十二烷基麥芽糖苷(DDM)中於冰上溶胞15分鐘並藉由以16,000×g在4℃下離心30分鐘移除不可溶物質。將增溶CRTh2或對照膜蛋白稀釋於含0.2% DDM之封阻緩衝液中並添加至中性親和素塗佈之板。將蛋白質培育10分鐘並將板用含0.05% DDM之PBS洗滌，將抗體連續稀釋於含0.2% DDM之封阻緩衝液中並與所捕獲之抗原一起於4℃下培育1小時。將板如上所述洗滌並將稀釋於含0.2% DDM之封端緩衝液中之偶聯至過氧化物酶之抗人類或抗小鼠IgG添加至板。於4℃下培育30分鐘之後，將板如上所述洗滌並將TMB受質添加至板。過氧化物酶反應用等體積之1M磷酸終止並在450nm下讀取光學吸光度。所用CRTh2蛋白質之量足以達到孔之飽和，如藉由ELISA使用結合重組人類、食蟹猴及恒河猴CRTh2之抗CRTh2 Mab所測定。
抗體人類化
藉由寡核苷酸引導之定點誘變將Mab 19A2之CDR序列(圖10)接枝於共有kappa 1(共有K1)及共有VH3(共有H3)框架上(Dennis,M.S.(2010).CDR repair：A novel approach to antibody humanization.於Current Trends in Monoclonal Development and Manufacturing,S.J.Shire、W.Gombotz、K.Bechtold-Peters及J.Andya編輯，(Springer,New York)，第9-28頁中)。將親代鼠科動物19A2抗體中存在之輕鏈之71位(Kabat編號系統)及重鏈之49位之框架殘基亦併入人類化抗體hu19A2.v1之框架位置中(圖11A及11B)。藉由寡核苷酸引導之定點誘 變將Mab 8B1之CDR序列(圖12)接枝於共有K1及共有VH1(共有H1)框架上。亦將親代鼠科動物8B1抗體中存在輕鏈之46位、66位、69及71位以及重鏈之37位、67位、69位、71位及91位之框架殘基併入人類化抗體hu8B1.v1之框架位置中(圖12)。將所有抗體選殖於pRK5載體中。人類化抗體在293T細胞中表現為人類IgG1並藉由在蛋白質A-瓊脂糖上親和層析進行純化。藉由ELISA利用人類、食蟹猴及恒河猴CRTh2測定Mab之結合。
親和力成熟
將hu19A2.v1之重鏈及輕鏈可變區選殖於展示融合至細菌噬菌體M13之p3蛋白質之Fab片段的噬菌體展示載體中。製備兩組「終止」模板載體，其中移除輕鏈或重鏈之所有3個CDR並用編碼終止密碼子之序列代替。藉由寡核苷酸引導之定點誘變產生具有隨機化重鏈或輕鏈CDR之文庫。合成針對CDR之寡核苷酸，其中每一寡核苷酸具有隨機化為NNK(N=A、T、C或G；K=T或G)之一個密碼子。利用一組24個寡核苷酸將輕鏈之Kabat位置27至34、50至56及89至97隨機化及利用一組28個寡核苷酸將Kabat位置26至35、49至58及95至100a隨機化。將隨機化文庫電穿孔於大腸桿菌XL1-Blue細胞(Agilent technologies)中，用突變體輔助型噬菌體KO7+(Lamboy等人，ChemBioChem 9：2846-2852(2008))以10粒子形成單位/孔之感染重複度進行感染，允許覆蓋並在含50μg/ml羧苄西林(Carbenicillin)及100μg/ml卡那黴素(Kanamycin)於37℃下之2YT肉湯中生長過夜。藉由離心移除細胞並將上清液中之噬菌體展示Fabn濃縮並藉由PEG沈澱(ref)純化。將噬菌體提交至4輪選擇。在每一輪中，將於含有0.2% DDM之封阻緩衝液中之噬菌體在4℃下與具有野生型序列或具有Q16E或R19H突變且結合至中性親和素塗佈之ELISA板之DDM增溶之人類CRTh2一起培育1小時。將板用含有0.05% DDM之PBS洗滌且噬菌體 用100μl 0.1N HCl溶析10分鐘。收集噬菌體並藉由添加1/8體積之1M Tris鹼中和pH。如上所述將噬菌體用於感染大腸桿菌XL1-Blue並繁殖。使用來自第四輪之噬菌體感染大腸桿菌XL1-Blue並平鋪於含50μg/ml羧苄西林之LB上以獲得分離之純系。藉由雙去氧鏈終止子方法對純系進行定序並將每一位置中之突變製成表格。將有利之突變引入至人類化hu19A2.v1人類IgG1純系中並使IgG在人類293T細胞中表現並藉由親和層析純化。藉由ELISA測試IgG至人類、恒河猴及食蟹猴CRTh2之結合。基於包括輕鏈突變S31W及重鏈突變Y58D之hu19A2.v12產生第二代文庫。此第二代文庫係如上所述選擇，只是在選擇中，經純化人類及食蟹猴CRTh2抗原係表現於Sf9細胞中並用0.12%毛地黃皂苷代替DDM。另外，重鏈之31位利用兩個在彼位置處具有簡併密碼子NHK及VNK之寡核苷酸隨機化，該等密碼子經組合編碼除色胺酸及半胱胺酸以外之所有胺基酸。使人類化19A2.v58、19A2.v60及19A2.v52中之輕鏈31位之色胺酸變為酪胺酸。19A2.v46之序列與19A2.52一致，只是其在31位含有色胺酸而非酪胺酸。使19A2.v60及其他純系中56位之天冬胺酸變為麩胺酸以移除異構化位點。
小鼠及人類化抗人類CRTh2抗體之生成劑活體外表徵
測試人類化純系h19A2.v1、h19A2.v46及h19A2.v52與在293細胞上表現之人類CRTh2之反應性。類似於19A2，人類化抗CRTh2抗體與在293細胞上表現之人類CRTh2以劑量依賴方式反應(圖15A)。另外，人類化親和力成熟純系h19A2.v12、h19A2.v46及h19A2.v52亦顯示與在293細胞上表現之食蟹猴及恒河猴CRTh2之劑量依賴反應性，而人類化抗體h19A2.v1顯示與在293細胞上表現之食蟹猴及恒河猴恒河猴CRTh2無反應性(圖15B)。此外，人類化及親和力成熟抗體h19A2.v52與來自全血之初代人類、食蟹猴及恒河猴嗜鹼性球及嗜酸性球以劑量 依賴方式反應(圖15C)。
利用同源性競爭實施放射性標記之配體分析以評估抗CRTh2抗體對293細胞上之表面表現之人類及食蟹猴CRTh2的解離常數(KD)。為獲得人類化抗體h19A2.v52及h19A2.v46之KD值的直接量測，產生該等抗體之Fab片段(圖16)。人類化抗CRTh2純系19A2.v52及19A2.v46(IgG之Fab片段)對表現人類CRTh2之293細胞的KD值分別為13.7nM及6.4nM。h19A2.v52及h19A2.v46(IgG之Fab片段)對表現食蟹猴CRTh2之293細胞的KD值分別為21.3nM及8.6nM。基於該等量測值，人類對食蟹猴CRTh2對於h19A2.52之相對結合親和力在2倍內(圖16A及B)且對於h19A2.v46似乎等效(圖16C及D)。
為評估人類化及親和力成熟抗CRTh2抗體之阻斷功能，測試在表現人類CRTh2之293細胞中抗CRTh2抗體對福司柯林誘導之cAMP含量之PGD2介導之抑制的效應。福司柯林加PGD2刺激之hCRTh2表現293細胞利用8B1抗體進行治療以劑量依賴方式使cAMP含量增加(圖17A)。因此，8B1抗體以劑量依賴方式阻斷福司柯林誘導之cAMP含量之PGD2介導之降低，此指示8B1具有類似於其響應於PGD2抑制Th2細胞中之鈣通量能力的PGD2功能阻斷能力。相比之下，h19A2.v52在福司柯林誘導之cAMP人類CRTh2 293細胞分析中並未顯示PGD2功能阻斷能力。亦測試抗CRTh2抗體在不存在PGD2下對福司柯林誘導之cAMP含量是否具有直接效應。如圖17B中所示，各種濃度之抗CRTh2抗體在人類CRTh2 293細胞中未顯示對福司柯林誘導之cAMP含量之效應，此指示該等抗體在此分析中並未展現激動活性。相比之下，PGD2降低福司柯林誘導之cAMP含量。
為測試抗CRTh2抗體19A2是否可在活體內消耗血液、脾臟及骨髓中之CRTh2+嗜鹼性球及嗜酸性球，將單一劑量之19A2抗體投與CRTh2.Bac.Tg小鼠，如所指示(圖18A及B)。單一劑量之20ug/小鼠或 100ug/小鼠之19A2在治療後第3天完全消耗人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中周邊血液及脾臟中之嗜鹼性球及嗜酸性球，且在治療後第7天消耗血液、脾臟及骨髓中之嗜酸性球，如藉由流式細胞術所測定(圖18A、B及C)。在治療後第7天在脾臟中在兩個劑量量下仍觀察到嗜鹼性球之顯著消耗，而骨髓中之嗜鹼性球消耗利用100ug/小鼠劑量更為顯著。血液中嗜鹼性球之消耗在治療後第7天有所變化。
為測試人類化及親和力成熟抗CRTh2抗體h19A2.v52是否可在活體內消耗血液、脾臟及骨髓中之CRTh2+嗜鹼性球及嗜酸性球，將單一劑量之0.5mg/kg或10mg/kg 19A2.v52 hIgG1抗體投與人類CRTh2.Bac.Tg小鼠(圖19A)。在第2天單一劑量之0.5mg/kg或10mg/kgh19A2.v52完全消耗人類CRTh2.Bac.Tg小鼠中周邊血液、脾臟或骨髓中之嗜酸性球，如藉由流式細胞術所測定。在第7天及第14天，在10mg/kg劑量下仍消耗脾臟(圖19B)及骨髓(圖19C)以及在很大程度上血液(圖19A)中之嗜酸性球。相比之下，在0.5mg/kg劑量下，血液、脾臟及骨髓中之嗜酸性球在第7天部分地且在第14天完全返回至基線。此外，在第2天在兩個劑量量下且在第7天在10mg/kg劑量下在脾臟中觀察到嗜鹼性球之顯著消耗，而骨髓中之嗜鹼性球消耗利用兩個劑量在第2天及第7天均較不明顯。在0.5mg/kg劑量下在第7天脾臟中之嗜鹼性球含量返回至基線且在兩個劑量下在第14天脾臟及骨髓中均返回至基線。
為評估抗CRTh2抗體之效應子功能是否係組織內CRTh2+細胞之充分消耗所需的，在hCRTh2.Bac.Tg小鼠中在TNP-OVA誘導之慢性氣喘模型中針對先天免疫細胞消耗及Th2 BAL細胞激素產生之降低比較Fc突變體抗CRTh2 19A2_DANA抗體與抗CRTh2 19A2。在i.p.200ug/小鼠之治療方案中，4個劑量之抗體19A2分別消耗96%、86%及72%之肺嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞(圖20A)；相比之下，19A2_DANA 治療僅部分地使肺中之嗜酸性球、嗜鹼性球及肥大細胞分別降低26%、34%及31%(圖20A)。此外，利用19A2治療消耗99%支氣管肺泡灌洗(BAL)流體中之嗜酸性球，但利用19A2_DANA治療僅消耗16%。此外，BAL流體中之Th2細胞激素IL-4在19A2治療後減少100%，而19A2_DANA治療僅導致BAL IL-4之20%降低(圖16B)。
鼠科動物抗體可變序列
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人類化8B1可變區序列
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人類化19A2可變區序列
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人類化19A2全長序列
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hu19A2.v57-重鏈 (SEQ ID NO：82)
hu19A2.v58-重鏈 (SEQ ID NO：80)
hu19A2.v60-重鏈 (SEQ ID NO：80)
hu19A2.v61-重鏈 (SEQ ID NO：78)
hu19A2.v62-重鏈 (SEQ ID NO：78)
hu19A2.v63-重鏈 (SEQ ID NO：78)
hu19A2.v64-重鏈 (SEQ ID NO：83)
hu19A2.v65-重鏈 (SEQ ID NO：83)
hu19A2.v66-重鏈 (SEQ ID NO：78)
hu19A2.v67-重鏈 (SEQ ID NO：78)
hu19A2.v68-重鏈 (SEQ ID NO：83)
hu19A2.v69-重鏈 (SEQ ID NO：83)
hu19A2.v70-重鏈 (SEQ ID NO：77)
hu19A2.v71-重鏈 (SEQ ID NO：77)
hu19A2.v72-重鏈 (SEQ ID NO：77)
骨膜蛋白序列
人類骨膜蛋白同功型1 NP_006466 (SEQ ID NO：87)
人類骨膜蛋白同功型2 NP_001129406 (SEQ ID NO：88)
人類骨膜蛋白同功型3 NP_001129407 (SEQ ID NO：89)
人類骨膜蛋白同功型4 NP_001129408 (SEQ ID NO：90)
人類骨膜蛋白同功型5 (SEQ ID NO：91)
雖然已出於理解清楚之目的藉由圖解說明及實例相當詳細地對上述發明進行闡述，但說明及實例不應解釋為限制本發明之範圍。本 文所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容皆全文以引用方式明確併入本文中。
<110> 凱琳 瑞福 伊西得洛 赫尼爾 喬安 S 宏格 陶 黃 永磊 商 米瑞迪斯 海森
<120> 抗CRTH2抗體及使用方法
<130> 146392017340
<140> Not Yet Assigned
<141> Concurrently Herewith
<150> US 61/786,370
<151> 2013-03-15
<160> 91
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<221> VARIANT
<222> (1)...(11)
<223> Xaa=Ser或Trp或Tyr
<400> 1
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<221> VARIANT
<222> (1)...(7)
<223> Xaa=Asp或Glu或Ser
<400> 2
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 3
<210> 4
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa=Ser或Phe
<221> VARIANT
<222> 3
<223> Xaa=Ser或Leu或Lys
<400> 4
<210> 5
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<221> VARIANT
<222> 1
<223> Xaa=Typ或Arg
<221> VARIANT
<222> 10
<223> Xaa=Tyr或Asp
<400> 5
<210> 6
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 6
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 7
<210> 8
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 8
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 9
<210> 10
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 10
<210> 11
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 11
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 12
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 13
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 14
<210> 15
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 15
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 16
<210> 17
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 17
<210> 18
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 18
<210> 19
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 19
<210> 20
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 20
<210> 21
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 21
<210> 22
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 22
<210> 23
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 23
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 24
<210> 25
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 25
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 26
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 27
<210> 28
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 28
<210> 29
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 29
<210> 30
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 30
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 31
<210> 32
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 32
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 33
<210> 34
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 34
<210> 35
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 35
<210> 36
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 36
<210> 37
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 37
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 38
<210> 39
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 39
<210> 40
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 40
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 41
<210> 42
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 42
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 43
<210> 44
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 44
<210> 45
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 45
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 46
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 47
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
<210> 49
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 49
<210> 50
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 50
<210> 51
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 51
<210> 52
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 52
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 53
<210> 54
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 54
<210> 55
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 55
<210> 56
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 56
<210> 57
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 57
<210> 58
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 58
<210> 59
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 59
<210> 60
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 60
<210> 61
<211> 118
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 61
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 62
<210> 63
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 63
<210> 64
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 64
<210> 65
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠
<400> 65
<210> 66
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 66
<210> 67
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 67
<210> 68
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 68
<210> 69
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 69
<210> 70
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 70
<210> 71
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 71
<210> 72
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 72
<210> 73
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 73
<210> 74
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 74
<210> 75
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 75
<210> 76
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 76
<210> 77
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 77
<210> 78
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 78
<210> 79
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成構築體
<220>
<400> 79
<210> 80
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 80
<210> 81
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 81
<210> 82
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<223> 合成構築體
<220>
<400> 82
<210> 83
<211> 448
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 83
<210> 84
<211> 395
<212> PRT
<213> 智人
<400> 84
<210> 85
<211> 396
<212> PRT
<213> 恆河獼猴
<400> 85
<210> 86
<211> 396
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 86
<210> 87
<211> 836
<212> PRT
<213> 智人
<400> 87
<210> 88
<211> 779
<212> PRT
<213> 智人
<400> 88
<210> 89
<211> 781
<212> PRT
<213> 智人
<400> 89
<210> 90
<211> 751
<212> PRT
<213> 智人
<400> 90
<210> 91
<211> 695
<212> PRT
<213> 智人
<400> 91

Claims (72)

  1. 一種經分離之抗體，其在將治療有效量投與給人類個體時結合人類CRTh2並消耗CRTh2表現細胞。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體消耗以下類型之CRTh2表現細胞中之一或多者：Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。
  3. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體已經改造以改良ADCC及/或CDC活性。
  4. 如請求項1或2之抗體，其中該抗體已經改造以改良ADCC及/或降低CDC活性。
  5. 如請求項1至4中任一項之抗體，其中該抗體經無岩藻糖基化。
  6. 如請求項5之抗體，其中該抗體係在具有α1,6-岩藻糖轉移酶(Fut8)敲除之細胞系中產生。
  7. 如請求項5之抗體，其中該抗體係在過表現β1,4-N-乙醯基葡糖胺轉移酶III(GnT-III)之細胞系中產生。
  8. 如請求項7之抗體，其中該細胞系另外過表現高爾基體(Golgi)α-甘露糖苷酶II(ManII)。
  9. 如請求項3之抗體，其中該抗體在Fc區中包含至少一個改良ADCC及/或CDC活性之胺基酸取代。
  10. 如請求項9之抗體，其中該等胺基酸取代係S298A/E333A/K334A。
  11. 如請求項1至10中任一項之抗體，其中該抗體係裸抗體。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體，其中該抗體係嵌合抗體。
  13. 如請求項1至11中任一項之抗體，其中該抗體係人類化抗體。
  14. 如請求項1至11中任一項之抗體，其中該抗體係人類抗體。
  15. 如請求項1至14中任一項之抗體，其中該抗體係雙特異性抗體。
  16. 如請求項1至14中任一項之抗體，其中該抗體係IgG1抗體。
  17. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中該抗體競爭性抑制以下抗體中之至少一者與人類CRTh2之結合：19A2、8B1、31A5及3C12。
  18. 如請求項17之抗體，其中使用ELISA分析來測定競爭結合。
  19. 如請求項1至18中任一項之抗體，其中該抗體結合至與以下抗CRTh2抗體中之至少一者所結合之CRTh2表位相同或與其重疊之人類CRTh2之表位：19A2、8B1、31A5及3C12。
  20. 如請求項1至19中任一項之抗體，其中該抗體包含六個來自以下抗CRTh2抗體中之一者之高變區(HVR)：19A2、8B1、31A5及3C12。
  21. 如請求項1至16中任一項之抗體，其中該抗體結合至非人類靈長類動物之CRTh2。
  22. 如請求項21之抗體，其中該抗體結合至恒河猴及/或食蟹猴CRTh2。
  23. 如請求項1至22中任一項之抗體，其中該抗體進一步阻斷CRTh2信號傳導。
  24. 如請求項1至22中任一項之抗體，其中該抗體阻止CRTh2表現細胞響應於前列腺素D2之募集。
  25. 如請求項1至22中任一項之抗體，其中該抗體阻斷CRTh2表現細胞中之Ca2+通量。
  26. 如請求項1至25中任一項之抗體，其中該抗體以約100nM或以下之Kd值結合人類CRTh2。
  27. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3及包 含X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQ ID NO：5)之HVR-H2，其中X1為Y或R，且X2為Y或D。
  28. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含包含SEQ ID NO：35或36之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：27之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：32或33之胺基酸序列之HVR-H2。
  29. 一種經分離之抗CRTh2抗體，其包含輕鏈及重鏈可變區，其中該輕鏈及重鏈可變區包含六個高變區(HVR)序列：(i)HVR-L1，其包含RASENIYXNLA(SEQ ID NO：1)，其中X為S、W或Y；(ii)HVR-L2，其包含AATQLAX(SEQ ID NO：2)，其中X為D、E或S；(iii)HVR-L3，其包含QHFWITPWT(SEQ ID NO：3)；(iv)HVR-H1，其包含X1YX2MS(SEQ ID NO：4)，其中X1為S或F，且X2為S、L或K；(v)HVR-H2，其包含X1ISNGGSTTX2YPGTVEG(SEQ ID NO：5)，其中X1為Y或R，且X2為Y或D；及(vi)HVR-H3，其包含HRTNWDFDY(SEQ ID NO：6)。
  30. 一種經分離之抗CRTh2抗體，其包含輕鏈及重鏈可變區，其中該輕鏈可變區包含包含SEQ ID NO：7、8或9之胺基酸序列之HVR-L1、包含SEQ ID NO：10、11或12之胺基酸序列之HVR-L2及包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列之HVR-L3。
  31. 如請求項29之抗體，其進一步包含包含以下之該重鏈可變區：包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
  32. 一種經分離之抗CRTh2抗體，其包含輕鏈及重鏈可變區，其包含 包含以下之該重鏈可變區：包含SEQ ID NO：13、14、15、16或17之胺基酸序列之HVR-H1、包含SEQ ID NO：18、19、20或21之胺基酸序列之HVR-H2及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H3。
  33. 如請求項29至32中任一項之抗體，其中該抗體包含：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
  34. 如請求項29至32中任一項之抗體，其中該抗體包含：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：19之胺基酸序列；及(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
  35. 如請求項29至32中任一項之抗體，其中該抗體包含：(i)HVR-L1，其包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列；(ii)HVR-L2，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；(iii)HVR-L3，其包含SEQ ID NO：3之胺基酸序列；(iv)HVR-H1，其包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列；(v)HVR-H2，其包含SEQ ID NO：20之胺基酸序列；及(vi)HVR-H3，其包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列。
  36. 一種經分離之抗CRTh2抗體，其包含輕鏈及重鏈可變區，其中該 抗體包含選自由SEQ ID NO：38-53組成之群之VL序列。
  37. 如請求項36之抗體，其中該抗體進一步包含選自由SEQ ID NO：54-65組成之群之VH序列。
  38. 一種經分離之抗CRTh2抗體，其包含輕鏈及重鏈可變區，其中該抗體包含選自由SEQ ID NO：54-65組成之群之VH序列。
  39. 如請求項36至38中任一項之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：40之VL序列及SEQ ID NO：57之VH序列。
  40. 如請求項36至38中任一項之抗體，該抗體包含SEQ ID NO：39之VL序列及SEQ ID NO：55之VH序列。
  41. 如請求項36至38中任一項之抗體，其中該抗體包含SEQ ID NO：41之VL序列及SEQ ID NO：57之VH序列。
  42. 如請求項29至41中任一項之抗體，其中該抗體係單株抗體。
  43. 如請求項29至41中任一項之抗體，其中該抗體係人類化或嵌合抗體。
  44. 如請求項29至41中任一項之抗體，其中框架序列之至少一部分係人類共有框架序列。
  45. 如請求項29至44中任一項之抗體，其中該抗體係選自Fab、Fab’-SH、Fv、scFc或(Fab’)2片段之抗體片段。
  46. 一種如請求項1至44中任一項之抗體之抗原結合片段。
  47. 一種經分離之核酸，其編碼如請求項1至45中任一項之抗體及如請求項46之抗原結合片段。
  48. 一種宿主細胞，其包含如請求項47之核酸。
  49. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項48之宿主細胞以使得產生該抗體。
  50. 如請求項49之方法，其進一步包含回收由該宿主細胞所產生之該抗體。
  51. 一種免疫偶聯物，其包含如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之抗原結合片段及細胞毒性劑。
  52. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之抗原結合片段及醫藥上可接受之載劑。
  53. 一種治療氣喘之方法，其包含將有效量之抗CRTh2抗體投與給個體，其中該抗體消耗該個體中之CRTh2表現細胞。
  54. 如請求項53之方法，其中該抗體消耗以下類型之CRTh2表現細胞中之一或多者：Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。
  55. 如請求項53或54之方法，其中該抗CRTh2抗體消耗來自肺組織之CRTh2表現細胞。
  56. 如請求項53至55中任一項之方法，其中該抗CRTh2抗體消耗來自支氣管肺泡灌洗液之CRTh2表現細胞。
  57. 如請求項53至55中任一項之方法，其中與在投與該抗體之前之基線相比，該抗CRTh2抗體消耗至少50%至少一種類型之來自肺之CRTh2表現細胞。
  58. 如請求項57之方法，其中與在投與該抗體之前之基線相比，該抗CRTh2抗體消耗至少80%至少一種類型之來自肺之CRTh2表現細胞。
  59. 如請求項57之方法，其中與在投與該抗體之前之基線相比，該抗CRTh2抗體消耗至少90%至少一種類型之來自肺之CRTh2表現細胞。
  60. 如請求項53至59中任一項之方法，其中該個體患有顆粒球缺乏型氣喘。
  61. 如請求項53至60中任一項之方法，其中在投與該抗CRTh2抗體之後該個體中之一或多種細胞激素之含量降低。
  62. 如請求項61之方法，其中由以下細胞類型中之至少一者所產生之一或多種細胞激素之含量降低：Th2細胞、肥大細胞、嗜酸性球、嗜鹼性球或先天性2型(IT2)細胞。
  63. 如請求項61之方法，其中該個體中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺或白三烯中之一或多者之含量降低。
  64. 如請求項53至59中任一項之方法，其中該個體患有吸入之皮質類固醇、短效β2激動劑、長效β2激動劑或其組合控制不足之氣喘。
  65. 如請求項53至64中任一項之方法，其中該個體係人類。
  66. 如請求項53至65中任一項之方法，其中該抗CRTh2抗體係如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之抗原結合片段。
  67. 一種治療由CRTh2表現細胞介導之病症之方法，其包含將有效量之抗CRTh2抗體投與給個體，其中該抗體消耗該個體中之CRTh2表現細胞。
  68. 如請求項67之方法，其中該病症選自由以下組成之群：氣喘、顆粒球缺乏型氣喘、異位性皮膚炎、過敏性鼻炎、急性或慢性氣道高敏感性、嗜酸性球增多症候群、嗜酸性球性食道炎、丘-施二氏症候群(Churg-Strauss syndrome)、特發性肺纖維化、與細胞激素相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之發炎、與CRTh2表現細胞相關聯之惡性腫瘤、慢性特發性蕁麻疹、慢性自發性蕁麻疹、物理性蕁麻疹、寒冷性蕁麻疹、壓力性蕁麻疹、大皰性類天皰瘡、鼻瘜肉、食物過敏及過敏性支氣管肺麴菌病(ABPA)。
  69. 如請求項67或68之方法，其中該抗CRTh2抗體係如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之抗原結合片段。
  70. 一種降低個體中細胞激素之含量的方法，其包含將有效量之抗 CRTh2抗體投與給該個體，其中該抗體消耗該個體中之CRTh2表現細胞。
  71. 如請求項70之方法，其中該個體中IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、IL-17、組織胺或白三烯中之一或多者之含量降低。
  72. 如請求項70或71之方法，其中該抗CRTh2抗體係如請求項1至45中任一項之抗體或如請求項46之抗原結合片段。
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