KR101017336B1 - 안티트롬빈 ⅲ 조성물의 제조 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 포함하는 조성물로서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬을 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법을 제공한다.

Description

안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법{PROCESS FOR PRODUCING ANTITHROMBIN Ⅲ COMPOSITION}

본 발명은 N-글리코시드 결합 복합형 당(糖)사슬을 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 이루어지는 조성물로서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.

혈전의 형성은 혈류를 정지시키는 위험성을 동반한다. 혈전의 형성에 의한 혈류의 차단은 치사의 요인이 되기 때문에, 생체는 혈액 응고에 대한 몇 가지의 제어 조절 기구를 갖고 있다. 즉, 세린 프로테아제에 의한 활성화 응고 인자의 직접적인 불활성화 [The Thrombin Volume I (Machovich R., ed.) pp.1-21, CRC Press, Boca Raton, 1982], 활성화 프로테인 C 에 의한 제 V 및 제 Ⅷ 인자의 분해에 기초하는 조절 기구 (Progress in Hemostasis and Thrombosis Volume 7 (Spaet T.H., ed) pp 25-54, Grune & Stratton, New York, 1984) 및 혈중의 각종 세린 프로테아제 인히비터에 의한 활성화 응고 인자의 저해 기구이다. 또한, 활성화 제 X 인자 의존적으로 제 Ⅶ 인자의 활성화를 저해하는 조직 인자 인히비터의 존재도 명확해졌다 (일본 혈전 지혈 학회지, 2, 550, 1991). 이들 중에서 가장 중 요한 기구로는, 혈중의 각종 세린 프로테아제 인히비터에 의한 활성화 응고 인자의 저해 기구이다.

혈중에는 세린 프로테아제에 대한 여러 가지 인히비터가 존재하고, 그 양은 전체 혈장 단백질의 10% 에나 이르고 있다. 이들 인히비터 중, 안티트롬빈 Ⅲ (antithrombin Ⅲ), α1 프로테이나아제 인히비터 (α1 proteinase inhibitor), α2 매크로글로부린 (α2 macroglobulin) 및 헤파린　코팩터 Ⅱ (heparin cofactor Ⅱ) 의 4 개의 인히비터가 혈액 응고의 제어에 중요하다는 것이 알려져 있다. 이들 인히비터 중에서도, 안티트롬빈 Ⅲ 가 특히 중요하며, 혈장 중의 항트롬빈 활성의 70% 를 차지하고 있다. ㆍ

안티트롬빈 Ⅲ 는 432 아미노산으로 이루어지는 분자량 약 59,000∼65,000 의 당단백질로, 분자 내에 3 개의 디술피드 결합, Cys8-Cys128, Cys21-Cys95, Cys247-Cys430 을 갖고 있다 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 1845, (1983)]. 이 결합에 의해, C 말단측에 큰 루프 구조가 형성되어 있으며, 이 루프 구조 중에 활성 중심인 Arg393-Ser394 결합이 존재하고 있다 (도 1). 인간의 안티트롬빈 Ⅲ 의 등전점은 5.11 이다. 안티트롬빈 Ⅲ 에는, N 말단에서 96 번째, 135 번째, 155 번째 및 192 번째의 아스파라긴 (각각 Asn96, Asn135, Asn155, Asn192 라고 표기함) 의 4 개소에 N-글루코시드 결합 당사슬이 부가되어 있다. 인간 혈장 중에 존재하는 안티트롬빈 Ⅲ 는, 4 개의 N-글리코시드 결합 당사슬을 갖는 α 형, Asn135 로의 당사슬의 부가가 없이 3 개의 당사슬 밖에 갖지 않는 β 형의 2 종류의 이소폼이 존재하지만 [Pathophysiol Haemost Thromb 32, 143 (2002)], 인간 혈장 중의 안티트롬빈 Ⅲ 중 90∼95% 가 α 형, 나머지의 5∼10% 가 β 형이다.

안티트롬빈 Ⅲ 에 부가되어 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬은 N-아세틸글루코사민, 시알산, 갈락토오스 및 만노오스로 구성되어 있다 (도 2). 인간 혈장 중에 존재하는 안티트롬빈 Ⅲ 는, 그 당사슬 구조에 푸코스가 수식되지 않은 것이 하나의 특징으로 되고 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 는 혈액 응고 저해제로서 개발되어, 선천성 안티트롬빈 Ⅲ 결핍에 기초하는 혈전증 및 안티트롬빈 Ⅲ 의 저하를 동반하는 범발성 혈관내 혈액 응고 증후군의 치료에 세계적으로 널리 사용되고 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 등의 혈액 제제는, 풀(pool)된 인간 혈장을 원재료로 하여 제조되고 있다. 풀 혈장은, 일본 내에서는 일본 적십자사 혈장 분획 센터에서, 6 개월간의 저류 보관을 끝낸 약 5000 명 내지 10000 명분의 혈장을 혼합함으로써 제작, 공급되고 있다. 실제로, 혈액 제제, 예컨대 건조 농축 인혈액 응고 제 Ⅷ 인자 제제 크로스에이트 M (일본 적십자사) 의 1 로트분을 제조하기 위해서는, 상기 기술한 풀 혈장으로부터 얻어진 크리오프리시피테이티드(cryoprecipitated) 수 배치분이 필요하여, 약 80000 명분의 혈장이 사용되고 있다 (Japanese Journal of Transfusion Medicine 48, 27, 2002).

풀 혈장은 헌혈자로부터 제공되는 혈액을 원료로 하는데, 일본 헌혈자에 있어서의 인간 파보바이러스 B19 양성률은 추정 0.6 내지 0.8% 로 보고되어 있다 (닛폰 수혈 학회지 42, 231, 1996). 따라서, 상기 기술한 크로스에이트 M 의 1 로트분 중에는, 어림해서 480 내지 640 명분의 인간 파보바이러스 B19 양성의 혈액이 혼입되어 있게 된다. 인간 파보바이러스 B19 는 엔벨로프(envelope)를 갖지 않는 직계 18 내지 26㎚ 의 소형 바이러스로서, 6℃ 에서 30 분간의 가열 처리, pH 3 정도의 산 처리, 클로로포름 처리, 계면 활성제 처리 등을 실시해도 내성을 갖기 때문에 (Science 262, 114, 1993), 통상의 바이러스 제거 방법으로는 제거할 수 없다. 이 때문에, 인간 파보바이러스 B19 의 제거에는, 전용으로 개발된 구멍 직경 수 내지 수십 나노미터의 바이러스 제거막으로 여과하는 공정 등이 필요하게 된다. 그러나, 많은 혈장 분획 제제의 제조 공정에서는, 이러한 작은 막의 구멍 직경을 사용하는 여과 공정, 즉 나노 여과(filtration) 공정을 도입하는 것은 곤란하다고 되어 있다 (Japanese Journal of Transfusion Medicine 48, 27, 2002). 인간 파보바이러스 B19 는 전염성 홍반의 원인이 되어, 건강한 사람이고 항 B19 항체를 갖지 않는 경우, 일반적으로는 일과성의 감기와 같은 증상을 나타낼 뿐이지만, 경우에 따라 만성 용혈성 빈혈을 야기시키게 된다. 또, 면역 부전인 환자에서는, 때로는 병세가 매우 무거운 급성 순수 적혈구 무형성증(pure red cell aplasia)을 야기한다고 한다. 또한, 항 B19 항체를 갖지 않는 임산부라면 유산에 이르는 경우나, 태아가 수종을 일으키는 경우가 있어, 자궁내 사망 태아의 15% 가 B19 의 DNA 검사 결과가 양성이었다는 보고도 있다 (Lancet 357, 1494, 2001). 건조 농축 인혈액 응고 제 Ⅷ 인자 제제 크로스에이트 M (일본 적십자사) 에 있어서, 본 제제의 투여에 의한 일과성의 인간 파보바이러스 B19 감염이 의심된 사례가 일례로, 1997년 9월에 보고되어 있다 (일본 소아 혈액 학회지 11, 289, 1997).

노이아트 (미츠비시 웰파머사 제조) 나 안트로빈 P (Anthrobin P) (아벤티스 베어링사 제조) 등의 안티트롬빈 Ⅲ 혈액 제제의 제조 원료에는, B 형 간염 바이러스 음성, C 형 간염 바이러스 음성, 인간 면역 부전 바이러스 I 및 Ⅱ 형 음성인 풀 혈장을 사용하는데, 원료에 있어서의 인간 파보바이러스 B19 의 유무는 확인되지 않는다.

안티트롬빈 Ⅲ 혈액 제제의 제조 공정에서, 온도 60℃ 에서 10 시간의 바이러스 불활화 처리, 즉 파스퇴라이제이션(Pasteurization) 처리를 하고 있지만, 단백질인 안티트롬빈 Ⅲ 가 변성되는, AIDS 바이러스, 인간 파보바이러스, 변이형 크로이츠펠트 야콥병(Creutzfeld Jacob Disease)의 원인이 되는 프리온 등을 완전히 제거할 수 없는 등의 문제가 있다.

이상과 같이, 혈액 제제를 사용하는 경우, 바이러스 감염의 리스크가 있고, 현재의 기술로는 그 리스크를 완전히 배제할 수 없다는 등의 결점이 있다. 따라서, 안전성이 향상된 안티트롬빈 Ⅲ 제제가 요구되는 현상이다.

이 때문에, 인간 혈장을 원료로 하지 않고, 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 공급하기위해 유전자 재조합체로의 전환이 고려되고 있다. 그러나, 유전자 재조합 기술을 사용하여 제작한 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 활성은 혈장 등의 천연 재료로부터 얻어진 안티트롬빈 Ⅲ 의 활성에 미치지 못하고 있다. 이것은 유전자 재조합체에 부가되는 당사슬 구조가 혈장으로부터 취득된 안티트롬빈 Ⅲ 와 상이하기 때문인 것으로 생각되고 있으며, 구체적으로는, 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 에 부가하는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬에 푸코스가 결합되어 있기 때문에, 헤파린과의 친화성이 낮아져 충분한 항 혈액 응고 활성이 발휘되지 않는 것이 상정 되고 있다 [Journal of Biological Chemistry 268, 17588 (1993), Biochemistry 35, 8881, (1996)]. 지금까지, 베이비 햄스터 신장 유래의 BHK 세포 [Journal of Biological Chemistry 268, 17588 (1993), Biochemisry 35, 8881 (1996)], 차이니즈 햄스터 난소 유래의 CHO 세포 (WO02/02793), 또는 트랜스제닉 염소 (US 2003096974) 에서 생산된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 에 관한 보고가 있지만, 어느 경우에나 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 에 결합하는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 환원 말단측 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있다. 생산된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의, 푸코스가 결합되어 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬에서 차지하는 비율은 숙주 세포마다 상이하지만, 39∼95% 로 추측되고 있다. 배양 방법의 개량 등의 여러 가지 연구에 의해, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬로 푸코스가 결합되어 있는 당사슬의 비율을 낮추는 시도가 이루어지고 있는데, 천연 유래의 안티트롬빈 Ⅲ 와 동등한 당사슬 구조를 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 생산하는 데에는 아직 성공하지 못했다.

발명의 개시

본 발명은 이하의 (1)∼(24) 에 관한 것이다.

(1) 유전자 재조합에 의해 개변된 숙주에 안티트롬빈 Ⅲ 를 코드하는 DNA 를 도입하여 얻어진 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 이루어지는 조성물로서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생성하여 축적시키고, 이 배양물로부터 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 채취하는 것을 특징으로 하는, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법.

(2) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이, 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 결합되어 있지 않은 당사슬인, (1) 에 기재된 제조 방법.

(3) 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가 실활(失活)되도록 게놈이 개변된 숙주 세포인, (1) 또는 (2) 에 기재된 제조 방법.

(4) 숙주 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 상의 대립 유전자 전부가 녹아웃된 숙주 세포인, (1)∼(3) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(5) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 (GMP) 및 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 (Fx) 로 이루어지는 군에서 선택되는 효소인, (3) 또는 (4) 에 기재된 제조 방법.

(6) GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인, (5) 에 기재된 제조 방법.

(a) 서열 번호 7 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 7 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(7) GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, (5) 에 기재된 제조 방법.

(a) 서열 번호 8 로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 8 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질 ;

(c) 서열 번호 8 로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질.

(8) GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a) 및 (b) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인, (5) 에 기재된 제조 방법.

(a) 서열 번호 9 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(9) GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제가, 이하의 (a), (b) 및 (c) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, (5) 에 기재된 제조 방법.

(a) 서열 번호 10 으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 10 으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(c) 서열 번호 10 으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질.

(10) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제인, (3) 또는 (4) 에 기재된 제조 방법.

(11) α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a), (b), (c) 및 (d) 로 이루어지는 군에서 선택되는 DNA 가 코드하는 단백질인, (10) 에 기재된 제조 방법.

(a) 서열 번호 11 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 12 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 11 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(d) 서열 번호 12 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(12) α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가, 이하의 (a), (b), (c), (d), (e) 및 (f) 로 이루어지는 군에서 선택되는 단백질인, (10) 에 기재된 제조 방법.

(a) 서열 번호 13 으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(b) 서열 번호 14 로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(c) 서열 번호 13 으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(d) 서열 번호 14 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 13 으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(f) 서열 번호 14 로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질.

(13) 형질 전환체가 FERM BP-08472, FERM BP-10083, FERM BP-10084, FERM-10088 또는 FERM BP-10089 인, (1)∼(4) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(14) 숙주 세포가, 하기의 (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i) 및 (j) 로 이루어지는 군에서 선택되는 세포인 (1)∼(12) 의 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(a) 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포 ;

(b) 래트 미에로마 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 ;

(c) 마우스 미에로마 세포주 NS0 세포 ;

(d) 마우스 미에로마 세포주 SP2/0-Ag14 세포 ;

(e) 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포 ;

(f) 인간 백혈병 세포주 나말바 세포 ;

(g) 배아 줄기 세포 ;

(h) 수정란 세포 ;

(i) 식물 세포

(j) 효모.

(15) 안티트롬빈 Ⅲ 조성물이, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖고, 또한 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬인, (1)∼(14) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(16) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이, 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 결합되어 있지 않은 당사슬인, (1)∼(15) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(17) 안티트롬빈 Ⅲ 가, 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열로 나타나는 폴리펩티드인, (1)∼(16) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(18) 안티트롬빈 Ⅲ 가, 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드인, (1)∼(17) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(19) 안티트롬빈 Ⅲ 가, 서열 번호 4 에 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 폴리펩티드인, (1)∼(18) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(20) 안티트롬빈 Ⅲ 가, 이하의 (a) 또는 (b) 에서 선택되는 DNA 가 코드하는 폴리펩티드인, (1)∼(19) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(a) 서열 번호 1 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 1 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA.

(21) 안티트롬빈 Ⅲ 가 포유 동물 유래인, (1)∼(20) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법.

(22) (1)∼(21) 중 어느 1 항에 기재된 제조 방법에 의해 얻어지는, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물.

(23) (22) 에 기재된 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 유효 성분으로서 함유하는 의약.

(24) 의약이, 혈액 응고를 동반하는 질환에 대한 진단약, 예방약 또는 치료약인, (23) 에 기재된 의약.

이하에서, 본 발명을 상세히 설명한다. 본원은 2003년 10월 9일에 출원된 일본 특허출원 2003-350164호의 우선권을 주장하는 것으로서, 당해 특허출원의 명세서 및/또는 도면에 기재되는 내용을 포함한다.

본 발명은 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 이루어지는 조성물로서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법 및 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 함유하는 의약에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 안티트롬빈 Ⅲ 로는, 하기 (a), (b), (c), (d), (e) 또는 (f) 의 DNA 가 코드하는 단백질, 또는 하기 (g), (h), (i), (j), (k), (l), (m), (n) 또는 (o) 의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 1 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 2 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 3 으로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(d) 서열 번호 1 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(e) 서열 번호 2 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(f) 서열 번호 3 으로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(g) 서열 번호 4 로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(h) 서열 번호 5 로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(i) 서열 번호 6 으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(j) 서열 번호 4 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질 ;

(k) 서열 번호 5 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질 ;

(l) 서열 번호 6 으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질 ;

(m) 서열 번호 4 로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질 ;

(n) 서열 번호 5 로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질 ;

(o) 서열 번호 6 으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질.

또, 안티트롬빈 Ⅲ 의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는, 서열 번호 1, 2 또는 3 으로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 1, 2 또는 3 으로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 헤파린 결합 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA 란, 예컨대, 서열 번호 1, 2 또는 3 으로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 등의 DNA 또는 그 일부의 단편을 프로브로 하고, 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 플라크ㆍ하이브리다이제이션법 또는 서던 블롯 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 말하며, 구체적으로는, 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 를 고정화시킨 필터를 사용하여, 0.7∼1.0M 의 염화나트륨 존재 하, 65℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1∼2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산나트륨으로 이루어짐) 을 사용하여, 65℃ 조건 하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989) (이하에서, Molecular Cloning 제 2 판이라고 약기함), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, (1987-1997) (이하에서, Current Protocols in Molecular Biology 라고 약기함), DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University (1995) 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다. 하이브리다이즈 가능한 DNA 로는, 구체적으로는, 서열 번호 1, 2 또는 3 으로 나타나는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 서열 번호 4, 5 또는 6 으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 헤파린 결합 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 단백질이란, Molecularㆍcloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982) , Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 예컨대, 서열 번호 4, 5 또는 6 으로 나타나는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 에 부위 특이적 변이법법을 도입함으로써 취득할 수 있는 단백질을 말한다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1 개 이상이고, 그 수는 특별하게 한정되지 않지만, 상기의 부위 특이적 변이 도입법 등의 공지된 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이며, 예컨대 1∼몇십 개, 바람직하게는 1∼20 개, 보다 바람직하게는 1∼10 개, 더욱 바람직하게는 1∼5 개이다.

또, 본 발명에 있어서, 서열 번호 4, 5 또는 6 으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖고, 또한 헤파린 결합 활성과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 단백질이란, BLAST〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕나 FASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕등의 해석 소프트를 사용하여 계산했을 때, 서열 번호 4, 5 또는 6 에 기재된 아미노산 서열을 갖는 단백질과의 상동성이 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상인 단백질인 것을 말한다.

본 발명에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬란, 실질적으로 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬을 말하며, 바람직하게는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 결합되는 푸코스의 함유율이 0% 인 것을 말한다. 본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물로는, 구체적으로는, 후술하는 4 에 기재된 당사슬 분석에 있어서, 푸코스를 실질적으로 검출할 수 없을 정도인 경우를 말한다. 실질적으로 검출할 수 없다라는 것은, 측정의 검출 한계 이하인 것을 말한다.

안티트롬빈 Ⅲ 등의 당단백질에 결합되어 있는 N-글리코시드 결합 당사슬은 여러 가지 구조를 갖고 있지만, 어느 경우에나 이하의 구조식 (Ⅰ) 에 나타내는 공통되는 코어 구조를 갖는 것이 알려져 있다.

구조식 (Ⅰ) 에 있어서, 아스파라긴과 결합하는 당사슬의 말단이 환원 말단, 반대측이 비환원 말단이라고 한다.

N-글리코시드 결합 당사슬로는, 코어 구조의 비환원 말단에 만노오스만이 결합되는 하이 만노오스(high mannose)형 당사슬, 코어 구조의 비환원 말단측에 갈락토오스-N-아세틸글루코사민 (이하에서, Gal-GlcNAc 라고 표기함) 의 가지를 병행하여 1 내지는 복수 개 갖고, 또한 Gal-GlcNAc 의 비환원 말단측에 시알산, 바이섹팅의 N-아세틸글루코사민 등의 구조를 갖는 복합형 당사슬, 코어 구조의 비환원 말단측에 하이 만노오스형과 복합형의 양쪽의 가지를 갖는 하이브리드형 당사슬 등을 들 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 분자에는, N-글리코시드 결합 당사슬이 결합되는 아미노산 잔기로서 N 말단에서 96 번째, 135 번째, 155 번째 및 192 번째의 4 개소의 아스파라긴 잔기가 존재한다. 이들 모든 잔기에 N-글리코시드 결합 당사슬이 결합되어 있는 안티트롬빈 Ⅲ (α 형), 또는 96 번째, 155 번째 및 192 번째의 아스파라긴 잔기에 N-글리코시드 결합 당사슬이 결합되어 있는 안티트롬빈 Ⅲ (β 형) 가 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 에 결합되는 N-글리코시드 결합 당사슬로는, 구체적으로는, 상기 기술한 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 들 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 분자에 결합되는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬로는, 상기 구조식 (Ⅰ) 로 나타나는 코어 구조를 포함하는 어떠한 당사슬도 포함되기 때문에, 안티트롬빈 Ⅲ 에 결합하는 3 개 또는 4 개의 N-글리코시드 결합 당사슬에는 다수의 당사슬의 조합이 존재하게 된다.

따라서, 본 발명의 제조 방법으로 얻어지는 안티트롬빈 Ⅲ 조성물은, 천연 유래의 안티트롬빈 Ⅲ 의 생물 활성과 질적으로 동등하면, 단일의 당사슬 구조를 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 구성되어 있어도 되고, 복수의 상이한 당사슬 구조를 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 구성되어 있어도 된다. 천연 유래의 안티트롬빈 Ⅲ 란, 혈장 등의 천연 재료로부터 얻어진 안티트롬빈 Ⅲ 를 말한다.

그러한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물로는, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 이루어지는 조성물로서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 들 수 있다.

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬란, 푸코스의 1 위치가 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬의 환원 말단에 위치하는 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 α 결합하고 있지 않은 당사슬라면, 어떠한 것도 포함된다. 비환원 말단의 당사슬의 구조는 다양성이 있어도 상관없다.

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 이루어지는 조성물 중의 당사슬 구조의 해석은, 안티트롬빈 Ⅲ 분자로부터 히드라존 분해나 효소 소화 등의 공지된 방법 [생물 화학 실험법 23-당단백질 당사슬 연구법 (학회 출판 센터) 타카하시 레이코 편집 (1989)] 을 사용하여 당사슬을 유리시키고, 유리시킨 당사슬을 형광 표지 또는 동위 원소 표지하고, 표지한 당사슬을 크로마토그래피법으로 분리함으로써 결정할 수 있다. 또, 유리시킨 당사슬을 HPAED-PAD 법 [Journal of Liquid chromatography (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)] 로 분석함으로써 결정할 수도 있다.

본 발명의 제조 방법에 있어서는, 유전자 재조합에 의해 개변된 숙주 세포를 사용할 수 있다.

유전자 재조합에 의해 개변된 숙주 세포란, 인위적으로 유전자를 재조합하는 조작에 의해 세포의 성질을 변화시킨 숙주 세포를 말한다. 인위적으로 유전자를 재조합하는 조작으로는, 유전자를 표적한 유전자 파괴의 수법, 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체(dominant-negative mutant)를 도입하는 방법, 효소에 대한 돌연변이를 도입하는 수법, 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법 등을 들 수 있다. 또, 유전자가 재조합된 세포를 인위적으로 선택해 오는 방법도 인위적으로 유전자를 재조합하는 조작에 포함된다.

본 발명에 있어서 숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등을 들 수 있으며, 이들 세포의 구체적인 예로는, 후술하는 2. 에 기재된 것을 들 수 있다. 동물 세포의 구체예로는, 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래의 CHO 세포, 래트 미에로마 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag. 20 세포, 마우스 미에로마 세포주 NS0 세포, 마우스 미에로마 세포주 SP2/0-Ag14 세포, 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포, 인간 백혈병 세포주 나말바 세포, 배아 줄기 세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.

상기 기술한 숙주 세포로는, 이하의 (a) 또는 (b) 등의 성질을 갖는 숙주 세포를 들 수 있다.

(a) 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 활성이 결실되도록 게놈이 개변된 세포 ;

(b) N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 활성이 결실되도록 게놈이 개변된 세포.

세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로는, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 (GMD), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 (FX) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제로는, 하기 (a) 또는 (b) 의 DNA 가 코드하는 단백질, 또는 하기 (c), (d) 또는 (e) 의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 7 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 7 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(c) 서열 번호 8 로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 8 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 8 로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질.

본 발명에 있어서, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제로는, 하기 (a) 또는 (b) 의 DNA 가 코드하는 단백질, 또는 하기 (c), (d) 또는 (e) 의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 9 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 9 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(c) 서열 번호 10 으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(d) 서열 번호 10 으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(e) 서열 번호 10 으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질.

N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제로는, 하기 (a), (b), (c) 또는 (d) 의 DNA 가 코드하는 단백질, 또는 (e), (f), (g), (h), (i) 혹은 (j) 의 단백질 등을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 11 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(b) 서열 번호 12 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA ;

(c) 서열 번호 11 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(d) 서열 번호 12 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA ;

(e) 서열 번호 13 으로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(f) 서열 번호 14 로 나타나는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 ;

(g) 서열 번호 13 으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(h) 서열 번호 14 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서, 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(i) 서열 번호 13 으로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질 ;

(j) 서열 번호 14 로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질.

또, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는, 서열 번호 7 로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 7 로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.

GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는, 서열 번호 9 로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA, 서열 번호 9 로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.

α1,6-푸코실트랜스퍼라아제의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 로는, 서열 번호 11 또는 12 로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 서열 번호 11 또는 12 로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 와 엄격한 조건으로 하이브리다이즈하고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 DNA 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈하는 DNA 란, 예컨대, 서열 번호 7, 9, 11 또는 12 로 나타나는 염기 서열로 이루어지는 DNA 등의 DNA 또는 그 일부의 단편을 프로브로 하고, 콜로니ㆍ하이브리다이제이션법, 플라크ㆍ하이브리다이제이션법 또는 서던 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써 얻어지는 DNA 를 의미하며, 구체적으로는, 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA 를 고정시킨 필터를 사용하고, 0.7∼1.0M 의 염화나트륨 존재 하, 65℃ 에서 하이브리다이제이션을 실시한 후, 0.1∼2 배 농도의 SSC 용액 (1 배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mM 염화나트륨, 15mM 시트르산나트륨으로 이루어짐) 을 사용하고, 65℃ 조건 하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 DNA 를 들 수 있다. 하이브리다이제이션은 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 (이하에서, Molecular Cloning 제 2 판이라고 약기함), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, 1987-1997 (이하에서, Current Protocols in Molecular Biology 라고 약기함), DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition ; Oxford University (1995) 등에 기재되어 있는 방법에 준하여 실시할 수 있다. 엄격한 조건 하에서 하이브리다이즈 가능한 DNA 로서, 구체적으로는, 서열 번호 7, 9, 11 또는 12 로 나타나는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 특히 바람직하게는 95% 이상, 가장 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 DNA 를 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 서열 번호 8 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 활성을 갖는 단백질, 서열 번호 10 으로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성을 갖는 단백질, 및 서열 번호 13 또는 14 로 나타나는 아미노산 서열에 있어서 1 이상의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖는 단백질은, Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology, Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 82, 488 (1985) 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여, 예컨대, 서열 번호 8, 10, 13 또는 14 로 나타나는 염기 서열을 갖는 DNA 에 부위 특이적 변이를 도입함으로써 취득할 수 있다. 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1 개 이상으로, 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 상기의 부위 특이적 변이 도입법 등의 주지된 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이고, 예컨대, 1∼수십 개, 바람직하게는 1∼20 개, 보다 바람직하게는 1∼10 개, 더욱 바람직하게는 1∼5 개이다.

또, 본 발명에 있어서, 서열 번호 8, 10, 13 또는 14 로 나타나는 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, 또한 GDP-만노오스-4,6-데히드라타아제 활성, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 활성 또는 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 활성을 갖기 위해서는, 각각 서열 번호 8, 10, 13 또는 14 로 나타나는 아미노산 서열과 BLAST 〔J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)〕나 FASTA〔Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)〕등의 해석 소프트를 사용하여 계산했을 때, 적어도 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상, 특히 바람직하게는 97% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 상동성을 갖는 단백질인 것을 말한다.

또, 상기 기술한 효소 활성이 결실된 숙주 세포, 즉 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가 실활되도록 게놈이 개변된 숙주 세포에, 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 DNA 를 도입함으로써, 본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.

세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가 실활되도록 게놈이 개변되었다는 것은, 이 효소의 발현을 결실시키도록 이 유전자의 발현 조절 영역에 변이를 도입하거나, 또는 이 효소의 기능을 결실시키도록 이 유전자의 아미노산 서열에 변이를 도입하는 것을 말한다. 변이를 도입한다는 것은, 게놈 상의 염기 서열에 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가와 같은 염기 서열의 개변을 실시하는 것을 말하고, 개변된 게놈 유전자의 발현 또는 기능을 완전히 억제하는 것을 녹아웃한다고 한다. 게놈 유전자가 녹아웃된 구체적인 예로는, 표적이 되는 유전자 전부 또는 일부가 게놈으로부터 결실된 예를 들 수 있다. 표적이 되는 유전자의 개시 코돈을 포함하는 엑손의 게놈 영역을 염색체 상으로부터 제외함으로써 녹아웃 상태로 할 수 있다.

이러한 세포를 취득하는 방법으로는, 목적으로 하는 게놈의 개변을 실시할 수 있다면, 어느 방법이라도 사용할 수 있다. 상기 기술한 효소 활성을 결실시키는 수법으로서,

(a) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법 ;

(b) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법 ;

(c) 효소에 대한 돌연변이를 도입하는 수법 ;

(d) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법 ;

(e) N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법 ;

등을 들 수 있다.

N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴으로는, 이 당사슬 구조를 인식할 수 있는 렉틴이라면, 어느 렉틴이라도 사용할 수 있다. 그 구체적인 예로는, 렌즈콩 렉틴 LCA (Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin), 완두콩 렉틴 PSA (Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA (Vicia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL (Aleuria aurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.

렉틴에 내성인 세포란, 렉틴을 유효한 농도로 부여했을 때에도, 생육이 저해되지 않는 세포를 말한다. 유효 농도란, 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포 (이하에서,「친주 세포」라고도 칭함) 가 정상적으로 생육할 수 없는 농도 이상으로, 바람직하게는, 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포가 생육할 수 없는 농도와 동일 농도, 보다 바람직하게는 2∼5 배, 더욱 바람직하게는 10 배, 가장 바람직하게는 20 배 이상의 농도이다.

본 발명에 있어서, 생육이 저해되지 않는 렉틴의 유효 농도는, 세포주에 따라 적절하게 정하면 되지만, 통상적으로 10㎍/㎖∼10㎎/㎖, 바람직하게는 0.5㎎/㎖∼2.0㎎/㎖ 이다.

게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포, 즉 친주 세포란, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글루코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 유전자를 개변시키기 위한 수법을 실시하기 전의 세포를 포함한다. 게놈 유전자가 개변되기 이전의 세포로는 특별히 한정되지는 않지만, 예컨대, 이하의 세포를 바람직한 예로서 들 수 있다.

게놈 유전자가 개변되기 이전의 NS0 세포의 친주 세포로는, BIO/TECHNOLOGY, 10, 169 (1992), Biotechnol. Bioeng., 73, 261, (2001) 등의 문헌에 기재되어 있는 NS0 세포를 들 수 있다. 또, 이화학 연구소 세포 개발 은행에 등록되어 있는 NS0 세포주 (RCB0213), 또는 이들의 주를 여러 가지 무혈청 배지에 순화시킨 아주(亞株) 등을 들 수도 있다.

게놈 유전자가 개변되기 이전의 SP2/0-Ag14 세포의 친주 세포로는, Journal of Immunology (J. Immunol.), 126, 317, (1981), Nature, 276, 269, (1978), Human Antibodies and Hybridomas, 3, 129, (1992) 등의 문헌에 기재되어 있는 SP2/0-Ag14 세포를 들 수 있다. 또, American Type Culture Collection (이하에서, ATCC 라고 표기함) 에 등록되어 있는 SP2/0-Ag14 세포 (ATCC CRL-1581) 또는 이들의 주를 여러 가지 무혈청 배지에 순화시킨 아주 (ATCC CRL-1581.1) 등도 들 수 있다.

게놈 유전자가 개변되기 이전의 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포의 친주 세포로는, Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 60, 1275 (1968), Genetics, 55, 513 (1968), Chromosoma, 41, 129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. 60, 1275 (1968), Cell, 6, 121 (1975), Molecular Cell Genetics, Appendix Ⅰ, Ⅱ (p883-900), Somatic Cell and Molecular Genetics 12, 555 (1986) 등의 문헌에 기재되어 있는 CHO 세포를 들 수 있다. 또, ATCC 에 등록되어 있는 CHO-K1 주 (ATCC CCL-61), CHO/dhfr-주 (ATCC CRL-9096), Pro-5 주 (ATCC CRL-1781) 나, 시판되는 CHO-S 주 (Lifetechnologies 사 제조 Cat＃11619), 또는 이들의 주를 여러 가지 무혈청 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.

게놈 유전자가 개변되기 이전의 시리안 햄스터 신장 조직 유래 BHK 세포의 친주 세포로는, Proc R Soc Med. 56, 1062 (1963) 나, Nature. 203, 1355 (1964) 의 문헌에 기재되어 있는 BHK 세포를 들 수 있다. 또, ATCC 에 등록되어 있는 BHK-21 주 (ATCC CCL-10), 또는 이들의 주를 여러 가지 무혈청 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.

게놈 유전자가 개변되기 이전의 래트 미에로마 세포주 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포의 친주 세포로는, Y3/Ag1.2.3 세포 (ATCC CRL-1631) 로부터 수립된 주화 세포가 포함된다. 그 구체적인 예로는, J. Cell. Biol., 93, 576 (1982), Methods Enzymol. 73B, 1 (1981) 등의 문헌에 기재되어 있는 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포를 들 수 있다. 또, ATCC 에 등록되어 있는 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포 (ATCC CRL-1662) 또는 이들의 주를 여러 가지 무혈청 배지에 순화시킨 아주 등도 들 수 있다.

본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 를 생산하는 세포로는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자가 녹아웃된 CHO 세포에 안티트롬빈 Ⅲ 를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환주인 Ms705 pKAN-ATⅢ 27 주, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자가 녹아웃된 CHO 세포에 안티트롬빈 Ⅲ 를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환주를 무혈청 배지에 순화시킨 주인 pKAN-ATⅢ AFMS705 주, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제를 코드하는 유전자가 녹아웃된 CHO 세포에 안티트롬빈 Ⅲ 를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환주를 무혈청 배지에 순화시킨 주인 pKAN-ATⅢ1 GMDKO 주 등을 들 수 있다.

Ms705 pKAN-ATⅢ 27 주는 2003년 9월 9일자로, pKAN-ATⅢ AFMS705 주 및 pKAN-ATⅢ1 GMDKO 주는 2004년 8월 10일자로, 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물기탁센터 (일본 이바라기켄 쯔꾸바시 히가시 1 쵸메 1 반찌 1 츄오 다이 6) 에 FERM BP-08472, FERM BP-10088 및 FERM BP-10083 으로서 각각 기탁되어 있다.

또, 본 발명의 천연 유래의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물과 동등한 생물 활성을 갖는 변이체 (이하에서, 안티트롬빈 Ⅲ 변이체라고 함) 인 서열 번호 4 로 나타나는 아미노산 서열의 135 번째의 아스파라긴을 글루타민으로 치환한 변이체를 생산하는 세포로는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제를 코드하는 유전자가 녹아웃된 CHO 세포에 서열 번호 40 기재의 안티트롬빈 Ⅲ 변이체를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환주를 무혈청 배지에 순화시킨 주인 pKAN-ATⅢN135Q AFMS705 주, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제를 코드하는 유전자가 녹아웃된 CHO 세포에 서열 번호 40 기재의 안티트롬빈 Ⅲ 변이체를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환주를 무혈청 배지에 순화시킨 주인 pKAN-ATⅢN135Q6 GMDKO 주를 들 수 있다.

pKAN-ATⅢN135Q AFMS705 주 및 pKAN-ATⅢN135Q6 GMDKO 주는 2004년 8월 10일자로, 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물기탁센터 (일본 이바라기켄 쯔꾸바시 히가시 1 쵸메 1 반찌 1 츄오 다이 6) 에 FERM BP-10089 및 FERM BP-10084 로서 각각 기탁되어 있다.

상기 기술한 형질 전환체를 사용하여 제조함으로써, 천연 유래의 안티트롬빈 Ⅲ 와 동등한 생물 활성을 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조할 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않다는 것은, 후술하는 당사슬 분석에 있어서, 푸코스를 실질적으로 검출할 수 없는 정도인 경우를 말한다. 실질적으로 검출할 수 없는 정도란, 측정의 검출 한계 이하인 것을 말한다.

안티트롬빈 Ⅲ 의 생물 활성으로는, 헤파린에 대한 결합 활성, 항혈액 응고 활성 등을 들 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 헤파린에 대한 결합 활성, 항혈액 응고 활성은, 공지된 항트롬빈 활성 측정법이나 헤파린 코팩터 활성 측정법 등의 생체외(in vitro) 시험 또는 범발성 혈관내 혈액 응고 증후군 (Disseminated intravascular coagulation syndrome) 모델 동물을 사용한 생체내(in vivo) 시험 등을 사용하여 측정할 수 있다 (The Second Series of Pharmaceutical Resesrch and Development Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japan, 1992 ; 의학의 변천, 120, 1147, 1982 ; 약리와 치료 17, 5843, 1989 ; 임상과 연구 62, 3573, 1985 ; 임상과 연구 62, 3688, 1985 ; 응용 약리 30, 589, 1985).

이하에서, 본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법을 구체적으로 설명한다.

1. 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생산하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생산하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 이하에 서술하는 수법에 의해 제작할 수 있다.

(1) 효소의 유전자를 표적으로 한 유전자 파괴의 수법

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 또는 N-글루코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소 (이하에서,「푸코스 수식에 관련된 여러 효소」라고 표기함) 가 유전자를 표적으로 하고, 유전자 파괴의 방법을 사용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로는, 구체적으로는, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 (이하에서,「GMD」라고 표기함), GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제 (이하에서,「Fx」라고 표기함) 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소로는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.

여기에서 말하는 유전자란, DNA 또는 RNA 를 포함한다.

유전자 파괴의 방법으로는, 표적으로 하는 효소의 유전자를 파괴할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법도 포함된다. 그 예로는, 안티센스법, 리보자임법, 상동 재조합법, RNA-DNA 올리고뉴클레오티드법 (이하에서,「RDO 법」이라고 표기함), RNA 인터피어런스법 (이하에서,「RNAi 법」이라고 표기함), 레트로바이러스를 사용한 방법, 트랜스포슨을 사용한 방법 등을 들 수 있다. 이하에서 이들을 구체적으로 설명한다.

(a) 안티센스법 또는 리보자임법에 의한 본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위한 숙주 세포의 제작

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소 유전자를 표적으로 하고, 세포 공학, 12, 239 (1993), BIO/TECHNOLOGY, 17, 1097 (1999), Human Molecular Genetics (Hum. Mol. Genet.), 5, 1083 (1995), 세포 공학, 13, 255 (1994), Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1886 (1999) 등에 기재된 안티센스법 또는 리보자임법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 cDNA 또는 게놈 DNA 를 조제한다.

조제한 cDNA 또는 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정한다.

결정한 DNA 의 서열에 기초하여, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 DNA 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 안티센스 유전자 또는 리보자임의 컨스트럭트를 설계한다.

이 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 세포 내에서 발현시키기 위해, 조제한 DNA 의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 전환 벡터를 제작한다.

이 전환 벡터를, 이 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다. 또, 세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조 또는 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택함으로써, 본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용되는 숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 푸코스 수식에 관련된 여러 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.

발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제가 가능하거나, 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 설계한 안티센스 유전자, 또는 리보자임을 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.

각종 숙주 세포로의 유전자의 도입 방법으로는, 후술하는 2 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 이하의 방법을 들 수 있다.

형질 전환제를 선택하는 방법

푸코스 수식에 관련된 여러 효소의 활성이 결실된 세포를 선택하는 방법으로는, 문헌［신생 화학 실험 강좌 3-당질Ⅰ, 당단백질 (도쿄 화학 동인) 일본 생화학회 편 (1988)], 문헌［세포 공학, 별책, 실험 프로토콜 시리즈, 글리코바이올로지 실험 프로토콜, 당단백질ㆍ당지질ㆍ프로테오글리칸 (슈우쥰사) 타니구치 나오유키, 스즈키 아사미, 후루가와 키요시, 스가하라 카즈유키 감수 (1996)], Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 생화학적인 방법 또는 유전자 공학적인 방법 등을 사용하여, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 측정하는 방법을 들 수 있다. 생화학적인 방법으로는, 예컨대, 효소 특이적인 기질을 사용하여 효소 활성을 평가하는 방법을 들 수 있다. 유전자 공학적인 방법으로는, 예컨대, 효소 유전자의 mRNA 양을 측정하는 노던(Northern) 해석이나 RT-PCR 법 등을 들 수 있다.

세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 cDNA 를 조제하는 방법으로는, 예컨대, 하기에 기재된 방법을 들 수 있다.

cDNA 의 조제 방법

각종 숙주 세포의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA 또는 mRNA 를 조제한다.

조제한 전체 RNA 또는 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 디제네레이티브 프라이머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리법을 주형으로 하여 PCR 법으로 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득한다.

취득한 유전자 단편을 프로브로서 사용하고, cDNA 라이브러리를 스크리닝하여, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 DNA 를 취득할 수 있다.

인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포의 mRNA 는 시판되는 것 (예컨대, Clontech 사 제조) 을 사용해도 되고, 이하와 같이 하여 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 조제해도 된다.

인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터 전체 RNA 를 조제하는 방법으로는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로아세트산세슘법 [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], 산성 티오시안산구아니딘ㆍ페놀ㆍ클로로포름 (AGPC) 법 [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987) ; 실험 의학, 9, 1937 (1991)] 등을 들 수 있다.

또, 전체 RNA 로부터 poly(A)⁺RNA 로서 mRNA 를 조제하는 방법으로는, 올리고 (dT) 고정화 셀룰로오스 칼럼법 (Molecular Cloning 제 2 판) 등을 들 수 있다.

또한, Fast Track mRNA Isolation Kit (Invitrogen 사 제조), Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia 사 제조) 등의 시판되는 키트를 사용함으로써 mRNA 를 조제할 수 있다.

다음으로, 조제한 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포 mRNA 로부터 cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리 제작법으로는, Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology, A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989) 등에 기재된 방법, 또는 시판되는 키트, 예컨대, SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning (Life Technologies 사 제조), ZAP-cDNA Synthesis Kit (STRATAGENE 사 제조) 를 사용하는 방법 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 클로닝 벡터로는, 대장균 K12 주 중에서 자립 복제할 수 있는 것이라면, 파지 벡터, 플라스미드 벡터 등 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, ZAP Express [STRATAGENE 사, Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript Ⅱ SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λZAP Ⅱ (STRATAGENE 사 제조), λgt10, λgt11 [DNA cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], λTriplEx (Clontech 사 제조), λExCell (Pharmacia 사 제조), pT7T318U (Pharmacia 사 제조), pcD2 [Molecular Cellular Biology (Mol. Cell. Biol.), 3, 280 (1983)] 및 pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)] 등을 들 수 있다.

cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 숙주 미생물로는, 미생물이라면 어느 것이나 사용할 수 있지만, 바람직하게는 대장균을 사용할 수 있다. 구체적으로는, Escherichia coli XL1-Blue MRF [STRATAGENE 사, Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coliY1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coliY1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coliNM522 [Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), 166, 1 (1983)], Escherichiacoli K802 [Journal of Molecular Biology (J. Mol. Biol.), 16, 118 (1966)] 및 Escherichiacoli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)] 등을 사용할 수 있다.

이 cDNA 라이브러리는 그대로 이후의 해석에 사용해도 되지만, 불완전 길이 cDNA 의 비율을 낮추고, 가능한 한 완전 길이 cDNA 를 효율적으로 취득하기 위해, 칸노 등이 개발한 올리고캡법 [Gene, 138, 171 (1994) ; Gene, 200, 149 (1997) ; 단백질 핵산 효소, 41, 603 (1996) ; 실험 의학, 11, 2491 (1993) ; cDNA 클로닝 (요오도사) (1996) ; 유전자 라이브러리의 제작법 (요오도사) (1994)] 을 사용하여 조제하여, 이하의 해석에 사용해도 된다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 아미노산 서열에 기초하여, 상기 아미노산 서열을 코드하는 것이 예측되는 염기 서열의 5' 말단 및 3' 말단의 염기 서열에 특이적인 디제너레이티브 프리머를 제작하고, 제작한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR 법 [PCR Protocols, Academic Press (1990)] 을 사용하여 DNA 의 증폭을 실시함으로써, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득할 수 있다.

취득한 유전자 단편이 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 DNA 인 것은, 통상적으로 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] 또는 ABI PRISM377DNA 시퀀서 (Applied Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써 확인할 수 있다.

이 유전자 단편을 프로브로 하여, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA 로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리로부터 콜로니 하이브리다이제이션이나 플라크 하이브리다이제이션 (Molecular Cloning 제 2 판) 등을 사용하여, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 DNA 를 취득할 수 있다.

또, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 유전자 단편을 취득하기 위해 사용한 프라이머를 사용하여, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포에 포함되는 mRNA 로 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하고, PCR 법을 이용하여 증폭함으로써, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 cDNA 를 취득할 수도 있다.

취득한 푸코스 수식에 관련된 여러 효소를 코드하는 DNA 의 염기 서열은, 통상적으로 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] 또는 ABI PRISM377DNA 시퀀서 (Applied Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 이 DNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.

결정한 cDNA 의 염기 서열을 바탕으로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA 가 데이터베이스 중의 유전자 중에서 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하고 있는 유전자인 것을 확인할 수도 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열로는, 예컨대, 서열 번호 7 또는 9 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소를 코드하는 유전자의 염기 서열로는, 예컨대, 서열 번호 11 또는 12 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.

결정된 DNA 의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 model 392 (Perkin Elmer 사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 cDNA 를 취득할 수도 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 예컨대, 이하에 기재된 방법을 들 수 있다.

게놈 DNA 의 조제 방법

게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, Molecular Cloning 제 2 판이나 Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 공지된 방법을 들 수 있다. 또, 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 사 제조) 이나 Universal Genome Walker^TM Kits (CLONTECH 사 제조) 등을 사용함으로써, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 게놈 DNA 를 취득할 수도 있다.

취득한 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 DNA 의 염기 서열은, 통상적으로 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] 또는 ABI PRISM377DNA 시퀀서 (Applied Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써, 이 DNA 의 염기 서열을 결정할 수 있다.

결정한 게놈 DNA 의 염기 서열을 바탕으로, BLAST 등의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, Genbank, EMBL 및 DDBJ 등의 염기 서열 데이터베이스를 검색함으로써, 취득한 DNA 가 데이터베이스 중의 유전자 중에서 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하고 있는 유전자인 것을 확인할 수도 있다.

결정된 DNA 의 염기 서열에 기초하여, 포스포아미다이트법을 이용한 DNA 합성기 model 392 (Perkin Elmer 사 제조) 등의 DNA 합성기로 화학 합성함으로써, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 게놈 DNA 를 취득할 수도 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로는, 예컨대, 서열 번호 15, 16, 17 및 18 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로는, 예컨대, 서열 번호 19 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.

또, 발현 벡터를 사용하지 않고, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임을 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 리보자임은, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기에 의해 조제할 수 있다. 구체적으로는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 cDNA 및 게놈 DNA 의 염기 서열 중, 연속된 5∼150 염기, 바람직하게는 5∼60 염기, 보다 바람직하게는 10∼40 염기에 상당하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드의 서열 정보에 기초하여, 이 올리고뉴클레오티드와 상보적인 서열에 상당하는 올리고뉴클레오티드 (안티센스 올리고뉴클레오티드) 또는 이 올리고뉴클레오티드의 서열을 포함하는 리보자임을 합성하여 조제할 수 있다.

올리고뉴클레오티드로는, 올리고 RNA 및 이 올리고뉴클레오티드의 유도체 (이하에서, 올리고뉴클레오티드 유도체라고 함) 등을 들 수 있다.

올리고뉴클레오티드 유도체로는, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 인산디에스테르 결합이 N3'-P5' 포스포아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스와 인산디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5티아졸우라실로 치환된 유도체 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 C-5프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 페녹사진 수식 시토신 (phenoxazine-modified cytosine) 으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스가 2'-O-프로필 리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 또는 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스가 2'-메톡시에톡시리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등을 들 수 있다 [세포 공학, 16, 1463 (1997)].

(b) 상동 재조합법에 의한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 표적으로 하고, 염색체 상의 표적 유전자를 상동 재조합법을 사용하여 개변함으로써 제작할 수 있다.

염색체 상의 표적 유전자의 개변은 Manipulating the Mouse Embryo A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (이하에서,「Manipulationg the Mouse Embryo a Laboratory Manual」이라고 약기함), Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작, 요오도사 (1995) (이하에서,「ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작」이라고 약기함) 등에 기재된 방법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 사용할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 게놈 DNA 를 조제한다.

게놈 DNA 의 염기 서열에도 기초하여, 개변하는 표적 유전자 (예컨대, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 구조 유전자, 또는 프로모터 유전자) 를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터를 제작한다.

제작한 타겟 벡터를 숙주 세포에 도입하고, 염색체 상의 표적 유전자와 타겟 벡터 사이에서 상동 재조합을 일으킨 세포를 선택함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.

숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 게놈 DNA 의 조제 방법 등을 들 수 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로서, 예컨대, 서열 번호 15, 16, 17 및 18 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.

상기의 방법으로 얻어지는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 DNA 의 염기 서열로서, 예컨대, 서열 번호 19 에 기재된 염기 서열을 들 수 있다.

염색체 상의 표적 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터는, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작 (요오도사) (1995) 등에 기재된 방법에 따라 제작할 수 있다. 타겟 벡터는 리플레이스먼트(replacement)형, 인서션(insertion)형 중 어느 것이나 사용할 수 있다.

각종 숙주 세포로의 타겟 벡터의 도입에는, 후술하는 2 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.

상동 재조합체를 효율적으로 선별하는 방법으로서, 예컨대, Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993), 바이오 매뉴얼 시리즈 8 진 타겟팅, ES 세포를 사용한 변이 마우스의 제작 (요오도사) (1995) 등에 기재된 포지티브 선택, 프로모터 선택, 네거티브 선택, 폴리 A 선택 등의 방법을 사용할 수 있다. 선별한 세포주 중에서 목적으로 하는 상동 재조합체를 선택하는 방법으로는, 게놈 DNA 에 대한 서던 하이브리다이제이션법 (Molecular Cloning 제 2 판) 이나 PCR 법 [PCR Protocols, Academic Press (1990)] 등을 들 수 있다.

(c) RDO 방법에 의한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 표적으로 하고, RDO 법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 cDNA 또는 게놈 DNA 를 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 사용하여 조제한다.

조제한 cDNA 또는 게놈 DNA 의 염기 서열을 결정한다.

결정한 DNA 의 서열에 기초하여, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 부분, 비번역 영역의 부분 또는 인트론 부분을 포함하는 적당한 길이의 RDO 의 콘트라스트를 설계하여 합성한다.

합성한 RDO 를 숙주 세포에 도입하여, 표적으로 한 효소, 즉 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소에 변이가 생긴 형질 전환체를 선택함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위한 숙주 세포를 제작할 수 있다.

숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.

각종 숙주 세포로의 RDO 의 도입에는, 후술하는 2 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 cDNA 를 조제하는 방법으로는, 예컨대, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 cDNA 의 조제 방법 등을 들 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 게놈 DNA 를 조제하는 방법으로는, 예컨대, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 게놈 DNA 의 조제 방법 등을 들 수 있다.

DNA 의 염기 서열은 적당한 제한 효소 등으로 절단 후, pBluescript SK(-) (Stratagene 사 제조) 등의 플라스미드에 서브클로닝하고, 통상적으로 사용되는 염기 서열 해석 방법, 예컨대, 생거 (Sanger) 등의 디데옥시법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 74, 5463 (1977)] 등의 반응을 실시하고, 염기 서열 자동 분석 장치, 예컨대, ABI PRISM377DNA 시퀀서 (Applied Biosystems 사 제조) 등의 염기 서열 분석 장치를 사용하여 분석함으로써 확인할 수 있다.

RDO 은, 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.

RDO 를 숙주 세포에 도입하여, 표적으로 한 효소, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자에 변이가 생긴 세포를 선택하는 방법으로는, Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 염색체 상의 유전자의 변이를 직접 검출하는 방법을 들 수 있다.

또, 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된, 도입한 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법, 후술하는 1 의 (5) 에 기재된 세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법, 또는, 후술하는 4 또는 후술하는 5 에 기재된 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법도 사용할 수 있다.

RDO 의 콘트라스트는, Science, 273, 1386 (1996) ; Nature Medicine, 4, 285 (1998) ; Hepatology, 25, 1462 (1997) ; Gene Therapy, 5, 1960 (1999) ; Gene Therapy, 5, 1960 (1999) ; Journal of Molecular Medicine (J. Mol. Med.), 75, 829 (1997) ; Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 8774 (1999) ; Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 8768 (1999) ; Nucleic Acids Research (Nuc. Acids. Res.), 27, 1323 (1999) ; Investigation of Dematology (Invest. Dematol.), 111, 1172 (1998) ; Nature Biotechnology (Nature Biotech.), 16, 1343 (1998) ; Nature Biotechnology (Nature Biotech.), 18, 43 (2000) ; Nature Biotechnology (Nature Biotech.), 18, 555 (2000) 등의 기재에 따라 설계할 수 있다.

(d) RNAi 법에 의한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 표적으로 하고, RNAi 법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 상기 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 사용하여 cDNA 를 조제한다.

조제한 cDNA 의 염기 서열을 결정한다.

결정한 cDNA 의 서열에 기초하여, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소를 코드하는 부분 또는 비번역 영역의 부분을 포함하는 적당한 길이의 RNAi 유전자의 콘트라스트를 설계한다.

이 RNAi 유전자를 세포 내에서 발현시키기 위해, 조제한 cDNA 의 단편, 또는 전체 길이를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입시킴으로써, 재조합 벡터를 제작한다.

이 재조합 벡터를, 이 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.

도입한 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성, 또는 생성 당단백질 분자 또는 세포 표면 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 얻을 수 있다.

숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.

발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체로의 삽입이 가능하고, 설계한 RNAi 유전자를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.

각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술하는 2 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 본항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다.

세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 본항 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 cDNA 를 조제하는 방법으로는, 예컨대, 본항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 cDNA 의 조제 방법 등을 들 수 있다.

또, 발현 벡터를 사용하지 않고, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 염기 서열에 기초하여 설계한 siRNA (short interfering RNA) 유전자를 직접 숙주 세포에 도입함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 얻을 수도 있다.

siRNA 유전자는 통상적인 방법 또는 DNA 합성기를 사용함으로써 조제할 수 있다.

siRNA 유전자의 콘트라스트는, [Nature, 391, 806 (1998) ; Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 15502 (1998) ; Nature, 395, 854 (1998) ; Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 96, 5049 (1999) ; Cell, 95, 1017 (1998) ; Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 96, 1451 (1999) ; Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 95, 13959 (1998) ; Nature Cell Biology (Nature Cell Biol.), 2, 70 (2000)] 등의 기재에 따라 설계할 수 있다.

(e) 트랜스포슨을 사용한 방법에 의한, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포의 제작

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, Nature Genetics (Nature Genet.), 25, 35 (2000) 등에 기재된 트랜스포슨의 시스템을 사용하여, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성, 또는 생성 당단백질 분자 또는 세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 돌연변이체를 선택함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.

트랜스포슨의 시스템이란, 외래 유전자를 랜덤하게 염색체 상에 삽입시킴으로써 돌연변이를 유발시키는 시스템으로서, 통상적으로 트랜스포슨에 끼워 넣어진 외래 유전자에 돌연변이를 유발시키는 벡터로서 사용하고, 이 유전자를 염색체 상에 랜덤하게 삽입시키기 위한 트랜스포사아제의 발현 벡터를 동시에 세포 속에 도입한다.

트랜스포사아제은 사용하는 트랜스포슨의 서열에 적합한 것이라면 어떠한 것도 사용할 수 있다.

외래 유전자로는, 숙주 세포의 DNA 에 변이를 야기시키는 것이라면 어떠한 유전자도 사용할 수 있다.

숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다. 각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술하는 2 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 본항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다.

세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 본항 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 돌연변이체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.

(2) 효소의 유전자의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 표적으로 하고, 이 효소의 도미넌트 네거티브체를 도입하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다. 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로는, 구체적으로는 GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소로는, 구체적으로는, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.

이들 효소는 기질 특이성을 갖는 어느 특정한 반응을 촉매하는 효소로, 이러한 기질 특이성을 가진 촉매 작용을 갖는 효소의 활성 중심을 파괴함으로써, 이들 효소의 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 표적으로 하는 효소 중, GMD 를 예로 하여, 그 도미넌트 네거티브체에 제작에 대하여 구체적으로 이하에 서술한다.

대장균 유래의 GMD 의 입체 구조를 해석한 결과, 4 개의 아미노산 (133 번째의 트레오닌, 135 번째의 글루타민산, 157 번째의 티로신, 161 번째의 리신) 이 효소 활성에 중요한 기능을 담당하고 있는 것이 밝혀져 있다 (Structure, 8, 2, 2000). 즉, 입체 구조의 정보에 기초하여 이들 4 개의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환한 변이체를 제작한 결과, 어느 변이체에서나 유의하게 효소 활성이 저하되어 있었던 것이 나타나 있다. 한편, GMD 의 조효소 NADP 이나 기질인 GDP-만노오스와의 결합능에 관해서는, 어느 변이체에서나 거의 변화가 관찰되지 않고 있다. 따라서, GMD 의 효소 활성을 담당하는 이들 4 개의 아미노산을 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 대장균 유래의 GMD 의 도미넌트 네거티브체의 제작 결과에 기초하여, 아미노산 서열 정보를 기초로 한 상동성 비교나 입체 구조 예측을 실시함으로써, 예컨대, CHO 세포 유래의 GMD (서열 번호 8) 에서는, 155 번째의 트레오닌, 157 번째의 글루타민산, 179 번째의 티로신, 183 번째의 리신을 다른 아미노산으로 치환함으로써 도미넌트 네거티브체를 제작할 수 있다. 이러한 아미노산 치환을 도입한 유전자의 제작은, Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology 등에 기재된 부위 특이적 변이 도입법을 사용하여 실시할 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 상기 기술한 바와 같이 제작한 표적 효소의 도미넌트 네거티브체를 코드하는 유전자 (이하에서, 도미넌트 네거티브체 유전자라고 약기함) 를 사용하여, Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology, Manipulating the Mouse Embryo 제 2 판 등에 기재된 유전자 도입의 방법을 따라, 예컨대, 이하와 같이 제작할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 도미넌트 네거티브체 유전자를 조제한다.

조제한 도미넌트 네거티브체 유전자의 전체 길이 DNA 를 기초로 하여, 필요에 따라, 이 단백질을 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.

이 DNA 단편, 또는 전체 길이 DNA 를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다.

이 재조합 벡터를, 이 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써 형질 전환체를 얻는다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성, 또는 생성 당단백질 분자 또는 세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 형질 전환체를 선택함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포를 제작할 수 있다.

숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 표적으로 하는 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 갖고 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 숙주 세포를 들 수 있다.

발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 목적으로 하는 도미넌트 네거티브체를 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것이 사용된다. 구체적으로는, 후술하는 2 에 기재된 발현 벡터를 들 수 있다.

각종 숙주 세포로의 유전자의 도입에는, 후술하는 2 에 기재된 각종 숙주 세포에 적합한 재조합 벡터의 도입 방법을 사용할 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다.

세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 형질 전환체를 선택하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5 에 기재된 방법을 들 수 있다.

(3) 효소에 돌연변이를 도입하는 수법

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자에 돌연변이를 도입하고, 이 효소에 돌연변이를 발생시킨 원하는 세포주를 선택하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다.

세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로는, 구체적으로는 GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소로는, 구체적으로는 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소에 돌연변이를 도입하는 방법으로는, 1) 돌연변이 유발 처리에서 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연 발생적으로 발생한 돌연변이체로부터, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 2) 돌연변이 유발 처리에서 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연 발생적으로 발생한 돌연변이체로부터, 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법, 3) 돌연변이 유발 처리에서 친주를 처리한 돌연변이체 또는 자연 발생적으로 발생한 돌연변이체로부터, 이 세포의 세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 지표로 하여 원하는 세포주를 선택하는 방법 등을 들 수 있다.

돌연변이 유발 처리로는, 친주 세포의 DNA 에 점돌연변이, 결실 또는 프레임 시프트 돌연변이를 유발시키는 것이라면 어떠한 처리도 사용할 수 있다.

구체적으로는, 에틸니트로소우레아, 니트로소구아니딘, 벤조피렌, 아크리딘 색소에 의한 처리, 방사선의 조사 등을 들 수 있다. 또, 여러 종류의 알킬화제나 발암 물질도 돌연변이 유발 물질로서 사용할 수 있다. 돌연변이 유발 물질을 세포에 작용시키는 방법으로는, 예컨대, 조직 배양의 기술 제 3 판 (아사쿠라 서점) 일본 조직 배양 학회 편 (1996), Nature Genetics (Nature Genet.), 24, 314, (2000) 등에 기재된 방법을 들 수 있다.

자연 발생적으로 발생한 돌연변이체로는, 특별한 돌연변이 유발 처리를 실시하지 않고, 일반적인 세포 배양의 조건으로 계대 배양을 계속함으로써 자연 발생적으로 발생하는 돌연변이체를 들 수 있다.

푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성을 측정하는 방법으로는, 예컨대, 본항 1 의 (1) 의 (a) 에 기재된 방법을 들 수 있다. 생성 당단백질 분자의 당사슬 구조를 식별하는 방법으로는, 예컨대, 후술하는 4 또는 후술하는 5 에 기재된 방법을 들 수 있다. 세포막 상의 당단백질의 당사슬 구조를 식별하는 방법으로는, 예컨대, 본항의 1 의 (5) 에 기재된 방법을 들 수 있다.

(4) 효소의 유전자의 전사 또는 번역을 억제하는 수법

본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 유전자를 표적으로 하고, 안티센스 RNA/DNA 기술 [바이오사이언스와 인더스트리, 50, 322 (1992), 화학, 46, 681 (1991), Biotechnology, 9, 358 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992), Trends in Biotechnology, 10, 152 (1992), 세포 공학, 16, 1463 (1997)], 트리플ㆍ헤릭스 기술 [Trends in Biotechnology, 10, 132 (1992)] 등을 사용하여, 표적으로 하는 유전자의 전사 또는 번역을 억제함으로써 제작할 수 있다.

세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소로는, 구체적으로는 GMD, Fx 등을 들 수 있다. N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α 결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소로는, 구체적으로는 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제, α-L-푸코시다아제 등을 들 수 있다.

(5) N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제작하기 위해 사용하는 숙주 세포는, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법을 사용함으로써 제작할 수 있다.

N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택하는 수법으로는, 예컨대, Somatic Cell and Molecular Genetics (Somatic Cell Mol. Genet.), 12, 51 (1986) 등에 기재된 렉틴을 사용한 방법을 들 수 있다.

렉틴으로는, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴이라면 어느 렉틴이나 사용할 수 있지만, 그 구체적인 예로는, 렌즈콩 렉틴 LCA (LensCulinaris 유래의 Lentil Agglutinin) 완두콩 렉틴 PSA (Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA (Vicia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL (Aleuriaaurantia 유래의 Lectin) 등을 들 수 있다.

구체적으로는, 1㎍/㎖∼1㎎/㎖ 농도의 상기 기술한 렉틴을 포함하는 배지에서 1 일∼2 주간, 바람직하게는 1 일∼1 주일 배양하고, 생존하고 있는 세포를 계대 배양 또는 콜로니를 픽업하여 다른 배양 용기에 옮기고, 또한 계속해서 렉틴을 포함하는 배지에서 배양을 계속함으로써, 본 발명의 N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴에 내성인 주를 선택할 수 있다.

2. 본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법

안티트롬빈 Ⅲ 조성물은, Molecular Cloning 제 2 판, Current Protocols in Molecular Biology, Antibodies, A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (이하에서, 안티바디즈라고 약기함), Monoclonal Antibodies : principles and practice, Third Edition, Acad. Press, 1993 (이하에서, 모노클로날 안티바디즈라고 약기함), Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (이하에서, Antibody Engineering이라고 약기함) 등에 기재된 방법을 사용하여, 예컨대, 이하와 같이 숙주 세포 중에서 발현시켜서 취득할 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 분자의 전체 길이 cDNA 를 조제하고, 이 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 조제한다.

이 DNA 단편, 또는 전체 길이 cDNA 를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써 재조합 벡터를 제작한다.

이 재조합 벡터를, 이 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 생산하는 형질 전환체를 얻을 수 있다.

숙주 세포로는 효모, 동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포 등, 목적으로 하는 유전자를 발현시킬 수 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 분자에 결합하는 N-글리코시드 결합 당사슬의 수식에 관련된 효소, 즉, 푸코스 수식에 관련된 여러 가지 효소의 활성이 결실된 세포를 선택하거나, 또는 상기 기술한 1 에 나타난 여러 가지의 인위적 수법에 의해 얻어진 세포를 숙주 세포로서 사용할 수도 있다.

발현 벡터로는, 상기 숙주 세포에 있어서 자립 복제 가능 내지는 염색체 중으로의 삽입이 가능하고, 목적으로 하는 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 DNA 를 전사할 수 있는 위치에 프로모터를 함유하고 있는 것을 사용할 수 있다.

cDNA 는 상기 1. 의 (1) 의 (a) 에 기재된 cDNA 의 조제 방법을 따라, 인간 또는 비인간 동물의 조직 또는 세포로부터, 목적으로 하는 안티트롬빈 Ⅲ 분자에 특이적인 프로브나 프라이머 등을 사용하여 조제할 수 있다.

효모를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) 등을 들 수 있다.

프로모터로는, 효모 균주 중에서 발현시킬 수 있는 것이라면 어느 것을 이용해도 되며, 예컨대, 헥소스키나아제 등의 해당계(解糖系)의 유전자의 프로모터, PHO5 프로모터, PGK 프로모터, GAP 프로모터, ADH 프로모터, gal 1 프로모터, gal 10 프로모터, 히트 쇼크 단백질 프로모터, MFα1 프로모터, CUP 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주 세포로는 사카로마이세스속, 시조사카로마이세스속, 클루이베로마이세스속, 트리코스포론속, 슈와니오마이세스속 등에 속하는 미생물, 예컨대, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로는, 효모에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 예컨대, 일렉트로포레이션법 [Methods in Enzymology (Methods Enzymol.), 194, 182 (1990)], 스페로플라스트법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 1929 (1978)], 아세트산리튬법 [Journal of Bacteriology (J. Bacteriology), 153, 163 (1983)], Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 75, 1929 (1978)] 에 기재된 방법 등을 들 수 있다.

동물 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, pcDNAI, pcDM8 (후나코시사로부터 시판), pAGE107 [일본 공개특허공보 평3-22979호 ; Cytotechnology, 3, 133, (1990)], pAS3-3 [일본 공개특허공보 평2-227075호], pCDM8 [Nature, 329, 840, (1987)], pcDNAI/Amp (Invitrogen 사 제조), pREP4 (Invitrogen 사 제조), pAGE103 [Journal of Biochemistry (J. Biochemistry), 101, 1307 (1987)], pAGE210 등을 들 수 있다.

프로모터로는, 동물 세포 중에서 발현시킬 수 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 예컨대, 사이트메갈로바이러스 (CMV) 의 IE (immediate early) 유전자의 프로모터, SV40 의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터 등을 들 수 있다. 또, 인간 CMV 의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 사용해도 된다.

숙주 세포로는, 인간의 세포인 나말바 (Namalwa) 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈ㆍ햄스터의 세포인 CHO 세포, HBT5637 (일본 공개특허공보 소63-299호), 래트 미에로마 세포, 마우스 미에로마 세포, 시리안 햄스터 신장 유래 세포, 배아 줄기 세포, 수정란 세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로는, 동물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 예컨대, 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법 [일본 공개특허공보 평2-227075호], 리포펙션법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)], 인젝션법 [Manipulating the Mouse Embryo a Laboratory Manual], 파티클 건 (유전자총) 을 사용하는 방법 [일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제2517813호], DEAE-덱스트란법 [바이오 매뉴얼 시리즈 4-유전자 도입과 발현ㆍ해석법 (요오도사) 요코타 타카시ㆍ아라이 켄이치 편 (1994)], 바이러스 벡터법 [Manipulating the Mouse Embryo 제 2 판] 등을 들 수 있다.

곤충 세포를 숙주로서 사용하는 경우에는, 예컨대, Current Protocols in Molecular Biology Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992), Bio/Technology, 6, 47 (1988) 등에 기재된 방법에 의해 단백질을 발현시킬 수 있다.

즉, 재조합 유전자 도입 벡터 및 바큐로바이러스를 곤충 세포에 함께 도입하여 곤충 세포 배양 상청 중에 재조합 바이러스를 얻은 후, 추가로 재조합 바이러스를 곤충 세포에 감염시켜서 단백질을 발현시킬 수 있다.

이 방법에서 사용되는 유전자 도입 벡터로는, 예컨대, pVL1392, pVL1393, pBlueBacⅢ (모두 Invitorogen 사 제조) 등을 들 수 있다.

바큐로바이러스로는, 예컨대, 밤도둑나방과 곤충에 감염되는 바이러스인 오토그래파ㆍ캘리포니카ㆍ뉴클레어ㆍ폴리헤드로시스ㆍ바이러스 (Autographa californica nuclear polyhedrosis virus) 등을 사용할 수 있다.

곤충 세포로는, Spodoptera frugiperda 의 난소 세포인 Sf9, Sf21 [Current Protocols in Molecular Biology Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, New York (1992)], Trichoplusiani 의 난소 세포인 High 5 (Invitrogen 사 제조) 등을 사용할 수 있다.

재조합 바이러스를 조제하기 위한, 곤충 세포로의 상기 재조합 유전자 도입 벡터와 상기 바큐로바이러스의 함께 도입하는 방법으로는, 예컨대, 인산칼슘법 (일본 공개특허공보 평2-227075호), 리포펙션법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.

식물 세포를 숙주 세포로서 사용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, Ti플라스미드, 담배 모자이크 바이러스 벡터 등을 들 수 있다.

프로모터로는, 식물 세포 중에서 발현시킬 수 있는 것이라면 어느 것을 사용해도 되고, 예컨대, 콜리플라워 모자이크 바이러스 (CaMV) 의 35S 프로모터, 벼 엑틴 1 프로모터 등을 들 수 있다.

숙주 세포로는 담배, 고구마, 토마토, 당근, 대두, 유채, 알팔파, 벼, 밀, 대맥, 피스코미트렐라 페이튼스, 부평초 등의 식물 세포 등을 들 수 있다.

재조합 벡터의 도입 방법으로는, 식물 세포에 DNA 를 도입하는 방법이라면 어느 것이나 사용할 수 있고, 예컨대, 아그로박테리아 (Agrobacterium) [일본 공개특허공보 소59-140885호, 일본 공개특허공보 소60-70080호, WO94/00977호], 일렉트로포레이션법 [일본 공개특허공보 소60-251887호], 파티클 건 (유전자총) 을 사용하는 방법 [일본 특허 제2606856호, 일본 특허 제2517813호] 등을 들 수 있다.

유전자의 발현 방법으로는, 직접 발현 이외에, Molecular Cloning 제 2 판에 기재되어 있는 방법 등에 준하여, 분비 생산, Fc 영역과 다른 단백질과의 융합 단백질 발현 등을 실시할 수 있다.

당사슬의 합성에 관여하는 유전자를 도입한, 효모, 동물 세포, 곤충 세포 또는 식물 세포에 의해 발현시킨 경우에는, 도입한 유전자에 의해 당 또는 당사슬이 부가된 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 얻을 수 있다.

이상과 같이 하여 얻어지는 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 생성 축적시키고, 이 배양물로부터 채취함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조할 수 있다. 형질 전환체를 배지에 배양하는 방법은, 숙주 세포의 배양에 사용할 수 있는 통상적인 방법에 따라 실시할 수 있다.

효모 등의 진핵 생물을 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 이 생물이 자화(資化)할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기 염류 등을 함유하고, 형질 전환체의 배양을 효율적으로 실시할 수 있는 배지라면 천연 배지, 합성 배지 중 어느 것을 사용해도 된다.

탄소원으로는, 이 생물이 자화할 수 있는 것이면 되고, 글루코오스, 프락토오스, 수크로오스, 이들을 함유하는 당밀, 전분 또는 전분 가수 분해물 등의 탄수화물, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산, 에탄올, 프로판올 등의 알코올류 등을 사용할 수 있다.

질소원으로는, 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 아세트산암모늄, 인산암모늄 등의 무기산 또는 유기산의 암모늄염, 그 밖의 질소 함유 화합물, 및, 펩톤, 고기 엑기스, 효모 엑기스, 콘스팁리커, 카세인 가수분해물, 콩깻묵 및 콩깻묵 가수 분해물, 각종 발효 균체 및 그 소화물 등을 사용할 수 있다.

무기 염류로는, 인산제1칼륨, 인산제2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제1철, 황산망간, 황산구리, 탄산칼슘 등을 사용할 수 있다.

배양은, 통상적으로 진탕 배양 또는 심부 통기 교반 배양 등의 호기적 조건 하에서 실시한다. 배양 온도는 15∼40℃ 가 바람직하고, 배양 시간은 통상적으로 16 시간∼7 일간이다. 배양 중의 pH 는 3.0∼9.0 로 유지한다. pH 의 조제는, 무기 또는 유기의 산, 알칼리 용액, 우레아, 탄산칼슘, 암모니아 등을 사용하여 실시한다.

또, 배양 중 필요에 따라, 암피실린이나 테트라시클린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

프로모터로서 유도성의 프로모터를 사용한 재조합 벡터에서 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가해도 된다. 예컨대, lac 프로모터를 사용한 재조합 벡터에서 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노사이드 등을, trp 프로모터를 사용한 재조합 벡터에서 형질 전환한 미생물을 배양할 때에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가해도 된다.

동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI1640 배지 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle 의 MEM 배지 [Science, 122, 501 (1952)], 둘베코 개변 MEM 배지 [Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)], Whitten 배지 [발생 공학 실험 매뉴얼-트랜스제닉ㆍ마우스를 만드는 방법 (코오단사) 카츠키 모토야 편 (1987)] 또는 이들 배지에 소 태아 혈청 등을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상적으로 pH 6∼8, 30∼40℃, 5% CO₂ 존재 하 등의 조건 하에서 1∼7 일간 실시한다.

또, 배양 중에 필요에 따라, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

곤충 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 TNM-FH 배지 (Pharmingen 사 제조), Sf-900 Ⅱ SFM 배지 (Life Technologies 사 제조), ExCell400, ExCell405 (모두 JRH Biosciences 사 제조), Grace's Insect Medium [Nature, 195, 788 (1962)] 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상적으로 pH 6∼7, 25∼30℃ 등의 조건 하에서, 1∼5 일간 실시한다.

또, 배양 중에 필요에 따라, 겐타마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

식물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질 전환체는, 세포로서, 또는 식물의 세포나 기관에 분화시켜서 배양할 수 있다. 이 형질 전환체를 배양하는 배지로는, 일반적으로 사용되고 있는 무라시게ㆍ앤드ㆍ스쿡 (MS) 배지, 화이트 (White) 배지, 또는 이들 배지에 옥신, 시토키닌 등, 식물 호르몬을 첨가한 배지 등을 사용할 수 있다.

배양은 통상적으로 pH 5∼9, 20∼40℃ 의 조건 하에서 3∼60 일간 실시한다.

또, 배양 중에 필요에 따라, 카나마이신, 하이그로마이신 등의 항생 물질을 배지에 첨가해도 된다.

상기와 같이, 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 DNA 를 삽입한 재조합체 벡터를 보유하는 미생물, 동물 세포, 또는 식물 세포 유래의 형질 전환체를 통상적인 배양 방법에 따라 배양하고, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생성 축적시켜, 이 배양물로부터 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 채취함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조할 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 생산 방법으로는, 숙주 세포 내에서 생산시키는 방법, 숙주 세포 밖으로 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포 외막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주 세포나, 생산시키는 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 구조를 변화시킴으로써 이 방법을 선택할 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물이 숙주 세포 내 또는 숙주 세포 외막 상에 생산되는 경우, 폴슨 등의 방법 [Journal of Biochemistry (J. Biol. Chem.), 264, 17619 (1989)], 로우 등의 방법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.), 86, 8227 (1989) ; Genes Development (Genes Develop.), 4, 1288 (1990)], 또는 일본 공개특허공보 평05-336963호, WO94/23021호 등에 기재된 방법을 준용함으로써, 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

즉, 유전자 재조합의 수법을 사용하여, 발현 벡터에 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 DNA, 및 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 발현에 적절한 시그널 펩티드를 코드하는 DNA 를 삽입하고, 이 발현 벡터를 숙주 세포에 도입한 후에 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 발현시킴으로써, 목적으로 하는 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 숙주 세포 밖으로 적극적으로 분비시킬 수 있다.

또, 일본 공개특허공보 평2-227075호에 기재되어 있는 방법에 준하여, 디히드로 엽산 환원 효소 유전자 등을 사용한 유전자 증폭계를 이용해서 생산량을 상승시킬 수도 있다.

또한, 유전자를 도입한 동물 또는 식물의 세포를 재분화시킴으로써, 유전자가 도입된 동물 개체 (트랜스제닉 비인간 동물) 또는 식물 개체 (트랜스제닉 식물) 를 조성하고, 이들 개체를 사용하여 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조할 수도 있다.

형질 전환체가 동물 개체 또는 식물 개체인 경우에는, 통상적인 방법에 따라 사육 또는 재배하고, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생성하여 축적시키고, 이 동물 개체 또는 식물 개체로부터 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 채취함으로써, 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조할 수 있다.

동물 개체를 사용하여 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조하는 방법으로는, 예컨대, 공지된 방법 [American Journal of Clinical Nutrition, 63, 639S (1996) ; American Journal of Clinical Nutritionutrition, 63, 627S (1996) ; Bio/Technology, 9, 830 (1991)] 에 준하여 유전자를 도입하여 조성한 동물 중에 목적으로 하는 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생산시키는 방법을 들 수 있다.

동물 개체의 경우에는, 예컨대, 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 비인간 동물을 사육하고, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 이 동물 중에 생성ㆍ축적시키고, 이 동물 중으로부터 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 채취함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조할 수 있다. 이 동물 중의 생성ㆍ축적 장소로는, 예컨대, 이 동물의 밀크 (일본 공개특허공보 소63-309192호), 달걀 등을 들 수 있다. 이 때 사용되는 프로모터로는, 동물에서 발현할 수 있는 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있는데, 예컨대, 유선 세포 특이적인 프로모터인 α 카세인 프로모터, β 카세인 프로모터, β 락토글로부린 프로모터, 훼이산성 프로테인 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

식물 개체를 사용하여 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조하는 방법으로는, 예컨대, 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 DNA 를 도입한 트랜스제닉 식물을 공지된 방법 [조직 배양, 20 (1994) ; 조직 배양, 21 (1995) ; Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)] 에 준하여 재배하고, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 이 식물 중에 생성ㆍ축적시키고, 이 식물 중으로부터 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 채취함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생산하는 방법을 들 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 분자를 코드하는 유전자를 도입한 형질 전환체에 의해 제조된 안티트롬빈 Ⅲ 조성물은, 예컨대 안티트롬빈 Ⅲ 조성물이, 세포 내에 용해 상태에서 발현된 경우에는, 배양 종료 후, 세포를 원심 분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치프레스, 맨톤 가울린 호모게나이저, 다이노밀 등에 의해 세포를 파쇄하여, 무세포 추출액을 얻는다. 이 무세포 추출액을 원심 분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상적인 효소의 단리 정제법, 즉, 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸 (DEAE)-세파로오스, DIAION HPA-75 (미츠비시 화학 (주) 제조) 등 레진을 사용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-Sepharose FF (Pharmacia 사 제조) 등의 레진을 사용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸세파로오스, 페닐세파로오스 등의 레진을 사용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 사용한 겔 여과법, 어피니티 크로마토그래피법, 크로마토 포커싱법, 등전점 전기 영동 등의 전기 영동법 등의 수법을 단독 또는 조합하여 사용하여, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다. 구체적으로는, 1974 년에 Miller-Anderson 등에 의해 개발된 고정화 헤파린 어피니티 크로마토그래피를 사용한 방법을 들 수 있다 (Thromb. Res. 5, 439, 1974 ; 속 생화학 실험 강좌 8, 혈액 하권 (일본 생화학회 편) pp.569-574, 도쿄 화학 동인, 1985).

또, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물이 세포 내에 불용체를 형성하여 발현된 경우에는, 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하여 원심 분리를 실시함으로써, 침전 획분으로서 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 불용체를 회수한다. 회수한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 이 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 정상인 입체 구조로 되돌린 후, 상기와 동일한 단리 정제법에 의해 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물이 세포 밖으로 분비된 경우에는, 배양 상청에 이 안티트롬빈 Ⅲ 조성물 또는 그 유도체를 회수할 수 있다. 즉, 이 배양물을 상기와 동일한 원심 분리 등의 수법에 의해 처리함으로써 배양 상청을 취득하고, 이 배양 상청으로부터, 상기와 동일한 단리 정제법을 사용함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 정제 표품을 얻을 수 있다.

이미 숙주 세포가 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 발현시키는 능력을 갖는 경우에는, 상기 1 에 기재한 방법을 사용하여 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 발현시키는 능력을 갖는 세포를 조제한 후에, 이 세포를 배양하고, 이 배양물로부터 목적으로 하는 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 정제함으로써, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 제조할 수 있다.

3. 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 활성 평가

정제한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 항혈액 응고 활성은, 이미 공지된 항트롬빈 활성 측정법이나 헤파린 코팩터 활성 측정법 등의 생체외 시험 또는 범발성 혈관 내 혈액 응고증 (Disseminated intravascular coagulation ; 이하에서,「DIC」라고 표기함) 병태 모델 동물을 사용한 생체내 시험 등을 사용하여 측정할 수 있다 (The Second Series of Pharmaceutical Research and Development Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japan, 1992 ; 의학의 변천, 120, 1147, 1982 ; 약리와 치료 17, 5843, 1989 ; 임상과 연구 62, 3573, 1985 ; 임상과 연구 62, 3688, 1985 ; 응용 약리 30, 589, 1985). 이하에, 그 구체적인 예를 나타낸다.

(1) 항트롬빈 활성 측정법

정제한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물 및 탈섬유소 혈장 등의 피검 물질을, 0.15 M NaCl 및 0.2% 인간 혈청 알부민을 함유하는 0.05M 트리스 염산 완충액 pH 8.3 을 사용하여 단계 희석한다.

희석 검체 100㎕ 에, 7.5 단위/mL 의 트롬빈액 500㎕ 를 첨가하여 37℃ 에서 10 분간 반응시킨 후, 베리크롬 안티트롬빈 Ⅲ (베링베르게사 제조) 에 첨부되어 있는 트롬빈 특이적 발색성 기질 (HD-CHA-But-Arg-pNA) 을 희석액으로 0.25M 으로 한 기질액 2mL 를 첨가하고 추가로 37℃ 에서 5 분간 반응시킨다. 그 후, 50% 아세트산 0.5mL 를 첨가하여 반응을 정지시킨다.

반응액 중의 흡광도를 405㎚ 에서 측정하고, 피검 물질인 안티트롬빈 Ⅲ 를 첨가하고 있지 않은 대조 반응 용액의 흡광도로부터 각 희석 단계의 피검 물질을 첨가한 반응 용액의 흡광도를 뺀 값을 얻는다. 이 값을 불활성화 트롬빈량으로서 종축으로, 피검 물질의 희석률을 횡축으로 하여 편대수(片對數) 그래프로 플롯한다. 플롯한 측정값으로부터 불활성화 트롬빈량과 피검 물질의 희석률의 관계를 직선에 근사하게 하여, 정제한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물과 탈섬유소 혈장의 측정 결과 구해진 근사식을 비교함으로써, 정제한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 탈섬유소 혈장에 대한 배율을 구할 수 있으며, 그 역가를 결정할 수 있다.

(2) 헤파린 코팩터 활성 측정법

정제한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물 및 탈섬유소 혈장 등의 피검 물질을, 0.15M NaCl 및 0.2% 인간 혈청 알부민을 함유하는 0.05M 트리스 염산 완충액 pH 8.3 을 사용하여 단계 희석한다.

희석 검체 50㎕ 에, 2.5 단위/mL 헤파린을 함유하는 0.3 단위의 트롬빈액 1.0mL 를 첨가하여 37℃ 에서 5 분간 반응시킨다. 다음으로, 2.0mM 로 조제한 상기 3 의 (1) 에 기재된 기질액을 100㎕ 첨가하여 37℃ 에서 2 분간 반응시킨다. 그 후, 50% 아세트산 0.5mL 를 첨가하여 반응을 정지시킨다.

반응 종료 후, 반응액 중의 흡광도를 405㎚ 에서 측정하고, 상기 3 의 (1) 에 기재한 방법과 동일한 방법에 의해, 정제한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 탈섬유소 혈장에 대한 역가를 결정할 수 있다.

(3) DIC 병태 모델 동물을 사용한 생체내 시험

정제한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 생체내에서의 항혈액 응고 활성은, 토끼를 사용한 급성 DIC 병태 모델 (임상과 연구 62, 3573, 1985), 래트를 사용한 급성 DIC 병태 모델 (임상과 연구 62, 3688, 1985), 임신 토끼를 사용한 급성 DIC 병태 모델 (응용 약리, 30, 589, 1985) 등을 사용하여 조사할 수 있다.

또, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 인간에서의 안전성, 치료 효과는, 게잡이 원숭이 등의 인간에게 비교적 가까운 동물종 모델을 사용하여 평가할 수도 있다.

4. 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 당사슬의 분석

각종 세포에서 발현시킨 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬 구조는, 통상의 당단백질의 당사슬 구조의 해석에 준하여 실시할 수 있다. 예컨대, 안티트롬빈 Ⅲ 분자에 결합되어 있는 당사슬은 갈락토오스, 만노오스, 푸코스 등의 중성당, N-아세틸글루코사민 등의 아미노당, 시알산 등의 산성당으로 구성되어 있으며, 당 조성 분석 및 이차원 당사슬 맵법 등을 사용한 당사슬 구조 해석 등의 수법을 사용하여 실시할 수 있다.

(1) 중성당ㆍ아미노당 조성 분석

안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬의 조성 분석은, 트리플루오로아세트산 등으로, 당사슬의 산 가수분해를 실시함으로써, 중성당 또는 아미노당을 유리하여, 그 조성비를 분석할 수 있다.

구체적인 방법으로서, Dionex 사 제조 당 조성 분석 장치를 사용하는 방법을 들 수 있다. BioLC 는 HPAEC-PAD (high performance anion-exchange chromatography-pulsed amperometric detection) 법 [Journal of Liquid Chromatography (J. Liq. Chromatogr.), 6, 1577 (1983)] 에 의해 당 조성을 분석하는 장치이다.

또, 2-아미노피리딘에 의한 형광 표지화법으로도 조성비를 분석할 수 있다. 구체적으로는, 공지된 방법 [Agricultural and Biological Chemistry (Agric. Biol. Chem.), 55(1), 283-284 (1991)] 에 따라 산 가수분해한 시료를 2-아미노피리딜화로 형광 라벨화하고, HPLC 분석하여 조성비를 산출할 수 있다.

(2) 당사슬 구조 해석

안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬의 구조 해석은, 2 차원 당사슬 맵법 [Analytical Biochemistry (Anal. Biochem.), 171, 73 (1988), 생물 화학 실험법 23-당단백질 당사슬 연구법 (학회 출판 센터) 다카하시 레이코 편 (1989 년)] 에 의해 실시할 수 있다. 2 차원 당사슬 맵법은, 예컨대, X 축에는 역상 크로마토그래피에 의한 당사슬의 유지 시간 또는 용출 위치를, Y 축에는 순상 크로마토그래피에 의한 당사슬의 유지 시간 또는 용출 위치를 각각 플롯하고, 이미 알려진 당사슬의 그들 결과와 비교함으로써 당사슬 구조를 추정하는 방법이다.

구체적으로는, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 히드라진 분해하여, 안티트롬빈 Ⅲ 분자로부터 당사슬을 유리하고, 2-아미노피리딘 (이하에서,「PA」라고 약기함) 에 의한 당사슬의 형광 표지 [Journal of Biochemistry (J. Biochem.), 95, 197 (1984)] 을 실시한 후, 겔 여과에 의해 당사슬을 과잉의 PA 화 시약 등과 분리하여, 역상 크로마토그래피를 실시한다. 이어서, 분취한 당사슬의 각 피크에 대하여 순상 크로마토그래피를 실시한다. 이들 결과를 바탕으로, 2 차원 당사슬 맵상에 플롯하고, 당사슬 스탠다드 (TaKaRa 사 제조), 문헌 [Analytical Biochemistry (Anal. Biochem.), 171, 73 (1988)] 과의 스폿의 비교로부터 당사슬 구조를 추정할 수 있다.

또한, 각 당사슬의 MALDI-TOF-MS 등의 질량 분석을 실시하여, 2 차원 당사슬 맵법에 의해 추정되는 구조를 확인할 수 있다.

5. 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬 구조를 식별하는 면역학적 정량 방법

안티트롬빈 Ⅲ 조성물은, 당사슬 구조가 상이한 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 구성되어 있다. 본 발명의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 조성물은, 결합되어 있는 전체 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 중, 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있는 당사슬의 비율이 0% 이고, 높은 항혈액 응고 활성을 나타내는 특징을 갖고 있다. 이러한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물은, 상기 4. 에 기재된 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬 구조의 분석법을 사용함으로써 식별할 수 있다. 또, 렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용함으로써도 식별할 수 있다.

렉틴을 사용한 면역학적 정량 방법을 사용한 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬 구조의 식별은, 문헌 [Monoclonal Antibodies : Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc., (1995) ; 효소 면역 측정법, 제 3 판, 의학 서원 (1987) ; 개정판, 효소 항체법, 학제 기획 (1985)] 등에 기재된 웨스턴 염색, RIA (Radioimmunoassay), VIA (Viroimmunoassay), EIA (Enzymoimmunoassay), FIA (Fluoroimmunoassay), MIA (Metalloimmunoassay) 등의 면역학적 정량 방법에 준하여, 예컨대, 이하와 같이 실시할 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 구성하는 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬 구조를 인식하는 렉틴을 표지하고, 표지한 렉틴과 시료인 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 반응시킨다. 다음으로, 표지한 렉틴과 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 복합체의 양을 측정한다.

안티트롬빈 Ⅲ 분자의 당사슬 구조를 식별에 사용되는 렉틴으로는, 예컨대, WGA (T. vulgaris 유래의 wheat-germ agglutinin), ConA (C. ensiformis 유래의 concanavalin A), RIC (R. communis 유래의 독소), L-PHA (P.vulgaris 유래의 leukoagglutinin), LCA (L. culinaris 유래의 lentil agglutinin), PSA (P. sativum 유래의 Pea lectin), AAL (Aleuria aurantia Lectin), ACL (Amaranthus caudatus Lectin), BPL (Bauhinia purpurea Lectin), DSL (Datura stramonium Lectin), DBA (Dolichos biflorus Agglutinin), EBL (Elderberry Balk Lectin), ECL (Erythrina cristagalli Lectin), EEL (Euonymus europaeus Lectin), GNL (Galanthus nivalis Lectin), GSL (Griffonia simplicifolia Lectin), HPA (Helix pomatia Agglutinin), HHL (Hippeastrum Hybrid Lectin), Jacalin, LTL (Lotus tetragonolobus Lectin), LEL (Lycopersicon esculentum Lectin), MAL (Maackia amurensis Lectin), MPL (Maclura pomifera Lectin), NPL (Narcissus pseudonarcissus Lectin), PNA (Peanut Agglutinin), E-PHA (Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin), PTL (Psophocarpus tetragonolobus Lectin), RCA (Ricinus communis Agglutinin), STL (Solanum tuberosum Lectin), SJA (Sophora japonica Agglutinin), SBA (Soybean Agglutinin), UEA (Ulex europaeus Agglutinin), VVL (Vicia villosa Lectin), WFA (Wisteria floribunda Agglutinin) 를 들 수 있다.

N-글루코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있는 당사슬 구조를 특이적으로 인식하는 렉틴을 사용하는 것이 바람직하고, 그 구체적인 예로는, 렌즈콩 렉틴 LCA (Lens Culinaris 유래의 Lentil Agglutinin) 완두콩 렉틴 PSA (Pisum sativum 유래의 Pea Lectin), 잠두콩 렉틴 VFA (Vcia faba 유래의 Agglutinin), 들주발버섯 렉틴 AAL (Aleuria aurantia 유래의 Lectin) 을 들 수 있다.

6. 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 이용

본 발명에서 얻어진 안티트롬빈 Ⅲ 조성물은, 천연 유래의 안티트롬빈 Ⅲ 동등의 높은 헤파린 결합 활성을 갖기 때문에, 혈액 응고를 동반하는 질환의 예방 및 치료에 있어서 유용하다.

혈액 응고를 동반하는 질환에서는, 혈액 응고가 일어나는 부위, 예컨대 혈관 내피 조직에 혈소판이 점착 응집하여 혈전이 형성되는 것이 알려져 있다. 혈전은 외상, 동맥 경화, 혈관염 등 여러 가지 원인으로 일어나는데, 이 혈전이 박리되어 혈류에 의해 이동하여, 다른 혈관을 막히게 한 경우에 색전을 일으킨다. 동맥이 혈전이나 색전으로 폐색되면, 폐색 부위로부터 하류의 관류 영역은 허혈 상태가 된다. 이와 같은 혈전이 원인으로 발증하는 각종 병태는 혈전증이라고 불린다. 따라서, 본 발명의 안티트롬빈 Ⅲ 조성물은 혈전증의 예방 및 치료에 있어서도 유용하다.

혈전증으로는, 뇌경색 (뇌혈관 장애), 심근경색, 사지 동맥 혈전 색전, 심부 정맥 혈전증 (혈전성 정맥염), DIC, 안티트롬빈 Ⅲ 결손증, 임신 중독증 등을 들 수 있다.

뇌경색 (뇌혈관 장애) 은, 2 개 내외의 주간 뇌동맥에 형성된 죽(粥) 형상 (아테롬) 경화성 병변에 의하여 야기되는 혈관의 폐색을 동반하는 질환이다. 뇌혈관이 혈전에 의하여 급격히 폐색하기 때문에, 편마비 등의 운동 장애, 반신의 지각 장애, 시야 장애, 실어, 구음 장애 등의 신경 증상이 비교적 급속히 출현한다. 뇌경색의 종류에는, 주간 뇌동맥으로부터 분지된 세동맥의 폐색에 의해 일어나는 비교적 작은 뇌동맥의 혈전증인 뇌의 라쿤 경색이나, 심근경색, 승모변 협착 등의 심장 변막증, 심방세동 등의 심질환이 원인이 되어 심장 내에서 형성된 혈전이 유리되고, 이것이 뇌혈관을 폐색하기 때문에 일어나는 심원성 뇌경색 등이 있다.

심근경색은 관동맥의 폐색에 의해 관류 영역의 심근에 혈류 장애가 일어나, 심근 세포가 괴사한 것이다. 흉통 또는 흉부 압박통 등의 협심 증상이 발증 이전부터 있는 환자도 있지만, 전조 증상 없이 돌연 발증하는 경우가 많다.

사지 동맥 혈전 색전에는, 하지의 동맥 경화증에 의한 폐색 병변인 폐색성 동맥 경화증 (arteriosclerosis obliterans : ASO) 이나, 사지의 동정맥에 혈전성 폐색을 초래하는 혈관염을 동반하는 병인 불명의 폐색성 혈전 혈관염 (thromboangitis obliterans : TAOㆍ바쟈 (뷰르거) 병) 등이 있다.

심부 정맥 혈전증 (혈전성 정맥염) 은 수술, 장기 와상, 감염, 임신, 외상 등에 의한 혈류 울체나 정맥 손상 등으로 발증하는 혈전증이다. 좌하지에 발증하기 쉽고, 주요 증상은 종창이지만, 피부 홍조, 정맥 노창, 동통 등의 증상도 나타난다. 장시간의 항공기 여행에서도 일어나기 쉽고, 이 경우에는, 특히 이코노미클래스 증후군이라고 불리고 있다.

DIC 는 급성 백혈병, 암, 감염증, 산과적 질환, 극증 간염, 대동맥류, 심장류, 거대 혈관종, 당뇨병성 혼수, 혈관내 용혈, 수술, 외상, 화상, 정형 수술 등을 기초 질환으로서, 생체 내에서 혈액 응고계가 과도하게 활성화되어 세소 혈관 내에 광범위하게 미소 혈전 형성이 일어나고, 허혈성 장기 장애가 일어난 결과 발생하는 질환이다. 병태는 기초 질환에서 크게 상이하고, 기초 질환의 치료와 함께 항응고 요법을 실시할 필요가 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 결손증은 안티트롬빈 Ⅲ 의 양적인 저하 또는 질적인 이상을 동반하는 질환이다. 안티트롬빈 Ⅲ 의 양적인 저하 또는 질적인 이상은, 활성화 혈액 응고 제 IX, X 인자 및 트롬빈 등에 대한 저해 저하를 초래하여 혈전증 발생의 한 원인이 된다. 안티트롬빈 Ⅲ 결손증은, 1965년에 혈전증이 다발하는 노르웨이의 가계에서 선천적 유전성 질환으로 발견되었다. 다발성 또는 재발성의 혈전증을 갖는 환자의 수% 에 안티트롬빈 Ⅲ 결손증이 발견된다. 안티트롬빈 Ⅲ 결손증의 환자는 연령과 함께 발증 빈도는 증가하고, 임신, 감염, 외과 수술, 외상, 경구 피임약의 내복 등이 계기로서 발증하는 경우가 많다. 혈전은 하지 심부 정맥에서 일어나는 경우가 많고, 폐색전증, 장간막 정맥, 뇌동 정맥 등의 부위에서의 발증도 관찰된다.

임신 중독증은 고혈압, 단백뇨, 부종을 주요 특징으로 하는 임신 중에 일어나는 질환이다. 분만 후에도 동일한 증상이 관찰되는 질환을 임신 중독 후유증이라고 하며, 넓은 의미로 임신 중독증에 포함된다. 임신 중독증인 성인에는 응고 선용계의 이상이 관여하고 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물은 혈전의 형성을 예방할 목적에서 질환 발증 이전의 환자에게 투여할 수도 있다. 그러한 환자의 구체적인 예로는, PTCA 후 혈관 재협착, 불안정 협심증, 말초 동맥 폐색증, 일과성 뇌허혈성 발작, 급성 심근경색, 비 Q 파 심근경색, DIC, 헤파린성 혈소판 감소증에 의한 혈전 합병증, 급성 폐혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 증후성 폐동맥 색전증, 안티트롬빈 Ⅲ 결손증 등의 질환을 발증할 위험성이 생각되는 환자 등을 들 수 있다.

안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 함유하는 의약은, 예방약 또는 치료약으로서 단독으로 투여하는 것도 가능하지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 또는 그 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술 분야에서 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.

투여 경로는, 치료시에 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강 내, 기도 내, 직장 내, 피하, 근육 내 및 정맥 내 등의 비경구 투여를 들 수 있으며, 안티트롬빈 Ⅲ 제제의 경우, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.

투여 형태로는, 분무제, 캡슐제, 정제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 테이프제 등을 들 수 있다.

경구 투여에 적당한 제제로는, 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등을 들 수 있다.

유제 및 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨, 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유, 대두유 등의 기름류, p-히드록시벤조산에스테르류 등의 방부제, 스트로베리 플레이버, 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.

캡슐제, 정제, 산제, 과립제 등은, 유당, 포도당, 자당, 만니톨 등의 부형제, 전분, 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘, 탤크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로오스, 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면 활성제, 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 사용하여 제조할 수 있다.

비경구 투여에 적당한 제제로는, 주사제, 좌제, 분무제 등을 들 수 있다.

주사제는 염용액, 포도당 용액, 또는 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 사용하여 조제된다. 또는, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 통상적인 방법에 따라 동결 건조시키고, 여기에 염화나트륨을 첨가함으로써 분말 주사제를 조제할 수도 있다.

좌제는 카카오지, 수소화 지방 또는 카르복실산 등의 담체를 사용하여 조제된다.

또, 분무제는 안티트롬빈 Ⅲ 조성물 그 자체, 내지는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 또한 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 미세한 입자로서 분산시켜 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 사용하여 조제된다.

담체로서 구체적으로는 유당, 글리세린 등이 예시된다. 안티트롬빈 Ⅲ 조성물 및 사용하는 담체의 성질에 따라, 에어로졸, 드라이파우더 등의 제제가 가능하다. 또, 이들 비경구제에 있어서도 경구제에서 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.

투여량 또는 투여 횟수는, 목적으로 하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 체중 등에 따라 상이하지만, 유효 성분의 양으로서, 통상적으로 성인 1 일당 10㎍/㎏∼20㎎/㎏ 이다.

또, 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 항혈액 응고 효과를 검토하는 방법은, 생체외 실험으로는, 항트롬빈 활성 측정법, 헤파린 코팩터 활성 측정법 등을 들 수 있으며, 생체내 실험으로는, 토끼 등의 실험 동물을 사용한 DIC 병태 모델 실험 등을 들 수 있다.

항트롬빈 활성 측정법, 헤파린 코팩터 활성 측정법, DIC 병태 모델 실험은, 문헌 [The Second Series of Pharmaceutical Research and Development Volume 20 Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japan, 1992 ; 의학의 변천, 120, 1147, 1982 ; 약리와 치료 17, 5843, 1989 ; 임상과 연구 62, 3573, 1985 ; 임상과 연구 62, 3688, 1985 ; 응용 약리 30, 589, 1985] 등에 기재된 방법에 따라 실시할 수 있다.

이하의 실시예에 의해 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 실시예는 본 발명의 단순한 예시를 나타내는 것에 불과하고, 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

도 1 은 인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다.

도 2 는 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 에 부가되어 있는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 모식적으로 나타낸 도면이다.

도 3 은 플라스미드 pKOFUT8Neo 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 4 는 플라스미드 pBS-ATⅢ 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 5 는 플라스미드 pKAN-ATⅢ 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 6 은 플라스미드 pKAN-ATⅢN135Q 의 구축을 나타낸 도면이다.

도 7 은 안티트롬빈 Ⅲ 의 헤파린 어피니티-크로마토그래피에 있어서의 용출 패턴을 나타낸 도면이다.

도 8 은 안티트롬빈 Ⅲ 의 헤파린 코팩터 활성을 나타낸 도면이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

실시예 1 게놈 상에 존재하는 모든 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 (FUT8) 유전자를 파괴한 CHO/DG44 세포의 조성

α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 (이하에서,「FUT8」이라고도 칭함) 양 대립 유전자의 번역 개시 코돈을 함유하는 게놈 영역을 결실한 CHO/DG44 세포주를 이하의 순서로 조성하였다.

1. 차이니즈 햄스터 FUT8 유전자 엑손 2 타겟팅 벡터 플라스미드 pKOFUT8Neo 의 구축

WO02/31140호의 실시예 13 의 1 항에 기재된 방법에 의해 구축한 차이니즈 햄스터 FUT8 유전자 엑손 2 타겟팅 벡터 플라스미드 pKOFUT8Puro 및 플라스미드 pKOSelectNeo (Lexicon 사 제조) 를 사용하여, 이하와 같이 하여 플라스미드 pKOFUT8Neo 를 구축하였다.

플라스미드 pKOSelectDT (Lexicon 사 제조) 1.0㎍ 을 16 단위의 제한 효소 AscI (New England Biolabs 사 제조) 를 사용하여 37℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 이 반응액을 아가로오스 겔 전기 영동한 후, QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여, 네오마이신 내성 유전자 발현 유닛을 함유하는 약 1.6Kb 의 AscI 단편을 회수하였다.

다음으로, 플라스미드 pKOFUT8Puro 1.0㎍ 을 16 단위의 제한 효소 AscI (New England Biolabs 사 제조) 를 사용하여 37℃ 에서 2 시간 반응시켰다. 소화 반응 후, 대장균 C15 주 유래 Alkaline Phosphatase (다카라 주조사 제조) 를 사용하여, 첨부의 설명서에 따라 DNA 말단을 탈인산화시켰다. 반응 후, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 사용하여, DNA 단편을 회수하였다.

상기에서 얻은 플라스미드 pKOSelectNeo 유래의 AscI 단편 (약 1.6Kb) 0.1㎍ 과 플라스미드 pKOFUT8Puro 유래의 AscI 단편 (약 10.1Kb) 0.1㎍ 을 Ligation High (토요보사 제조) 존재 하에서 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5α 주 (토요보사 제조) 를 코엔 등의 방법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 69, 2110 (1972)] 에 의해 형질 전환하였다. 각 형질 전환주로부터 플라스미드 DNA 를 조제하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 과 DNA 시퀀서 ABI PRISM 377 (Applied Biosystems 사 제조) 을 사용하여 염기 서열을 해석하였다. 이렇게 하여 목적으로 하는 염기 서열을 갖는 도 3 에 나타낸 플라스미드 pKOFUT8Neo 를 얻었다. 이 플라스미드는 CHO 세포의 FUT8 유전자 녹아웃 세포를 제작하기 위한 타겟팅 벡터로서 사용하였다.

2. 게놈 상의 FUT8 유전자의 1 카피를 파괴한 CHO 세포의 제작

(1) 타겟팅 벡터 pKOFUT8Neo 도입주의 취득

디히드로폴산 환원 효소 유전자 (dhfr) 를 결손시킨 차이니즈 햄스터 난소 유래 CHO/DG44 세포 [Somatic Cell and Moleculer Genetics, 12, 555, 1986] 에 대해, 실시예 1 의 1 항에서 구축한 차이니즈 햄스터 FUT8 게놈 영역 타겟팅 벡터 pKOFUT8Neo 를 이하와 같이 하여 도입하였다.

플라스미드 pKOFUT8Neo 280㎍ 을 400 단위의 제한 효소 SalI (New England Biolabs 사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 5 시간 반응시켜 선 형상화한 후, 선 형상화한 4㎍ 의 pKOFUT8Neo 를 1.6×10⁶ 개의 CHO/DG44 세포에 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 의해 도입한 후, IMDM-dFBS(10)-HT(1) [투석 FBS (인비트로젠사 제조) 를 10%、HT supplement (인비트로젠사 제조) 를 1 배 농도로 함유하는 IMDM 배지 (인비트로젠사 제조)] 에 현탁시키고, 접착 세포 배양용 10㎝ 디쉬 (Falcon 사 제조) 에 파종하였다. 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 24 시간 배양 후, G418 (나카라이테스크사 제조) 을 600㎍/mL 의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) [투석 FBS 를 10% 로 함유하는 IMDM 배지] 10mL 에 배지 교환하였다. 이 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하면서 15 일간의 배양을 실시하여, G418 내성 클론을 취득하였다.

(2) 게놈 PCR 에 의한 상동 재조합의 진단

본 항 (1) 에서 취득한 G418 내성 클론에 대해, 게놈 PCR 에 의한 상동 재조합의 진단을 이하와 같이 하여 실시하였다.

96 웰 플레이트에 얻은 G418 내성 클론에 대해 트립신 처리를 실시한 후, 2 배량의 동결 배지 [20% DMSO, 40% 소 태아 혈청, 40% IMDM] 를 각 웰에 첨가하여 현탁시켰다. 각 웰 중의 세포 현탁액의 절반의 양을 접착 세포용 평평한 바닥 96 웰 플레이트 (아사히테크노글라스사 제조) 에 파종하여 레플리카 플레이트로 하는 한편, 나머지 절반의 양을 마스터 플레이트로 하여 동결 보존하였다.

레플리카 플레이트 상의 네오마이신 내성 클론은, 600㎍/mL G418 을 함유하는 IMDM-dFBS(10) 를 사용하여 1 주간 배양한 후, 세포를 회수하고, 회수한 세포로부터 공지된 방법 [Analytical Biochemistry, 201, 331 (1992)] 을 따라 각 클론의 게놈 DNA 를 조제하고, 각각 TE-RNase 완충액 (pH 8.0) [10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, 200㎍/mL RNase A] 30㎕ 에 하룻밤 동안 용해시켰다.

게놈 PCR 에 사용하는 프라이머는 이하와 같이 설계하였다. 먼저, WO03/31140 의 실시예 12 에 기재된 방법에 의해 취득한 FUT8 게놈 영역 (서열 번호 13) 중, 타겟팅 벡터 상동 영역을 초과한 부분의 서열에 결합하는 프라이머 (서열 번호 20 또는 서열 번호 21) 및 벡터 내 서열에 결합하는 프라이머 (서열 번호 22 또는 서열 번호 23) 를 조제하였다. 이들을 사용하여, 이하의 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 실시하였다. 즉, 상기에서 조제한 게놈 DNA 용액을 각각 10㎕ 함유하는 25㎕ 의 반응액 [DNA 폴리머라아제 ExTaq (다카라 주조사 제조), ExTaq buffer (다카라 주조사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 0.5μmol/L 상기 유전자 특이적 프라이머 (포워드 프라이머는 서열 번호 20 또는 서열 번호 21, 리버스 프라이머는 서열 번호 22 또는 서열 번호 23)] 를 조제하고, 94℃ 에서 3 분간의 가열 후, 94℃ 에서 1 분간, 60℃ 에서 1 분간, 72℃ 에서 2 분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 조건으로 PCR 을 실시하였다.

PCR 후, 반응액을 0.8% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, CHO 세포 게놈 영역과 타겟팅 벡터 상동 영역의 경계부를 포함하는 약 1.7Kb 의 특이적 증폭이 관찰되는 것을 양성 클론으로 판정하였다.

(3) 게놈 서던 블롯에 의한 상동 재조합의 진단

본 항 (2) 에서 양성이 확인된 클론에 대해, 게놈 서던 블롯에 의한 상동 재조합의 진단을 이하와 같이 하여 실시하였다.

본 항 (2) 에서 동결 보존한 마스터 플레이트 중, 본 항 (2) 에서 발견된 양성 클론을 함유하는 96 웰 플레이트를 선택하고, 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 10 분간 정치 후, 양성 클론에 해당하는 웰로부터 세포를 접착 세포용 평평한 바닥 24 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 에 파종하였다. 600㎍/mL 의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10) 를 사용하여 1 주간 배양한 후, 접착 세포용 평평한 바닥 6 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 에 파종하였다. 이 플레이트로부터 공지된 방법 [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)] 을 따라 각 클론의 게놈 DNA 를 조제하고, 각각 TE-RNase 완충액 (pH 8.0) [10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA, 200㎍/mL RNase A] 150㎕ 에 하룻밤 동안 용해시켰다.

상기에서 조제한 게놈 DNA 12㎍ 을 25 단위의 제한 효소 BamHI (New England Biolabs 사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 동안 소화 반응을 실시하였다. 이 반응액으로부터 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 후, TE 완충액 (pH 8.0) [10mmol/L Tris-HCl, 1mmol/L EDTA] 20㎕ 에 용해시켜, 0.6% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하였다. 영동 후, 공지된 방법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979) 에 따라, 나일론막에 게놈 DNA 를 전사하였다. 전사 종료 후, 나일론막에 대해 80℃ 에서 2 시간의 열 처리를 실시하여, 고정화시켰다.

한편, 서던 블롯에 사용하는 프로브를 이하와 같이 조제하였다. 먼저, WO02/31140호의 실시예 12 에 기재된 방법에 의해 취득한 FUT8 게놈 영역 (서열 번호 13) 중, 타겟팅 벡터 상동 영역을 초과한 부분의 서열에 결합하는 프라이머 (서열 번호 24 및 서열 번호 25) 를 사용하여, 이하의 PCR 을 실시하였다. 즉 WO02/31140호의 실시예 12 에 기재된 방법에 의해 구축한 플라스미드 pFUT8fgE2-2 4.0ng 을 함유하는 20㎕ 의 반응액 [DNA 폴리머라아제 ExTaq (다카라 주조사 제조), ExTaq buffer (다카라 주조사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 0.5μmol/L 상기 유전자 특이적 프라이머 (서열 번호 24 및 서열 번호 25)] 를 조제하고, 94℃ 에서 1 분간의 가열 후, 94℃ 에서 30 초간, 55℃ 에서 30 초간, 74℃ 에서 1 분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 25 사이클의 조건으로 PCR 을 실시하였다. PCR 후, 반응액을 1.75% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 230bp 의 프로브 DNA 단편을 정제하였다. 얻어진 프로브 DNA 용액 5㎕ 에 대해, [α-³²P] dCTP 1.75MBq 및 Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 를 사용하여 방사 표지하였다.

하이브리다이제이션은 이하와 같이 실시하였다. 먼저, 상기의 나일론막을 롤러 보틀(bottle)에 밀봉하고, 하이브리다이제이션액 [5×SSPE, 50×Denhaldt's 액, 0.5% (w/v) SDS, 100㎍/mL 연어 정자 DNA] 15mL 를 첨가하여 65℃ 에서 3 시간의 프레하이브리다이제이션을 실시하였다. 다음으로, ³²P 표지한 프로브 DNA 를 열 변성하여 보틀에 투입하고, 65℃ 에서 하룻밤 동안 가온하였다.

하이브리다이제이션 후, 나일론막을 2×SSC-0.1% (w/v) SDS 50mL 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 상기의 세정 조작을 2 회 반복한 후, 막을 0.2×SSC-0.1% (w/v) SDS 50mL 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 세정 후, 나일론막을 X 선 필름에 -80℃ 에서 노출시켜 현상하였다.

친주인 CHO/DG44 세포, 및 본 항 (2) 에서 취득한 양성 클론인 50-10-104 주 의 게놈 DNA 를 본 방법에 의해 해석하였다. CHO/DG44 세포에서는, 야생형 FUT8 대립 유전자 유래의 약 25.5Kb 의 단편만이 검출되었다. 한편, 양성 클론 50-10-104 주에서는, 야생형 FUT8 대립 유전자 유래의 약 25.5Kb 의 단편에 추가하여, 상동 재조합된 대립 유전자에 특이적인 약 20.0Kb 의 단편이 검출되었다. 양 단편의 양의 비는 1:1 이었기 때문에, 50-10-104 주는, FUT8 대립 유전자 중 1 카피가 파괴된 헤미녹아웃 클론인 것이 확인되었다.

3. 게놈 상의 FUT8 유전자를 더블 녹아웃시킨 CHO/DG44 세포의 제작

(1) 타겟팅 벡터 pKOFUT8Puro 도입주의 취득

실시예 1 의 2 항 (2) 에서 얻은 FUT8 헤미녹아웃 클론의 다른 일방의 FUT8 대립 유전자를 파괴하기 위해, WO02/31140호의 실시예 13 의 1 항에 기재된 방법에 의해 구축한 차이니즈 햄스터 FUT8 유전자 엑손 2 타겟팅 벡터 플라스미드 pKOFUT8Puro 를 이하와 같이 하여 도입하였다.

플라스미드 pKOFUT8Puro 440㎍ 을 800 단위의 제한 효소 SalI (New England Biolabs 사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 5 시간 반응시켜 직선 형상화한 후, 4㎍ 을 1.6×10⁶ 세포에 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 의해 도입 후, IMDM-dFBS(10)-HT(1) 에 현탁시키고, 접착 세포 배양용 10㎝ 디쉬 (Falcon 사 제조) 에 파종하였다. 5% CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃, 24 시간 배양 후, 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 15㎍/mL 의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10)-HT(1) 10mL 에 배지 교환하였다.

이 배지 교환 작업을 7 일마다 반복하면서 5% CO₂ 15 일간의 배양을 실시하여, 퓨로마이신 내성 클론을 취득하였다.

(2) 게놈 서던 블롯에 의한 상동 재조합의 진단

본 항 (1) 에서 얻은 약제 내성 클론에 대해, 이하의 순서로 게놈 서던 블롯에 의한 상동 재조합의 진단을 실시하였다.

퓨로마이신 내성 클론이 출현한 10㎝ 디쉬로부터 배양 상청을 제거하고, 인산 완충액 7mL 를 주입한 후, 실체 현미경 아래로 옮겼다. 다음으로, 피펫맨 (GILSON 사 제조) 을 사용하여 콜로니를 긁어모아 흡입하고, 둥근 바닥 96 웰 플레이트 (Falcon 사 제조) 에 채취하였다. 트립신 처리를 실시한 후, 접착 세포용 평평한 바닥 96 웰 플레이트 (아사히테크노글라스사 제조) 에 각 클론을 파종하고, 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 15㎍/mL 의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10)-HT(1) 을 사용하여 1 주간 배양하였다.

배양 후, 상기 플레이트의 각 클론에 대해 트립신 처리를 실시하여, 접착 세포용 평평한 바닥 24 웰 플레이트 (Greiner 사 제조) 에 파종하였다. 퓨로마이신 (SIGMA 사 제조) 을 15㎍/mL 의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10)-HT(1) 을 사용하여 1 주간 배양한 후, 접착 세포용 평평한 바닥 6 웰 플레이트 (Greiner 사 제조) 에 파종하였다. 이 플레이트로부터 공지된 방법 [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)] 을 따라 각 클론의 게놈 DNA 를 조제하고, 각각 TE-RNase 완충액 (pH 8.0) 150㎕ 에 하룻밤 동안 용해시켰다.

상기에서 조제한 게놈 DNA 12㎍ 을 25 단위의 제한 효소 BamHI (New England Biolabs 사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 동안 소화 반응을 실시하였다. 이 반응액으로부터 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 후, TE 완충액 (pH 8.0) 20㎕ 에 용해시켜, 0.6% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하였다. 영동 후, 공지된 방법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 76, 3683, (1979)] 을 따라, 나일론막에 게놈 DNA 를 전사하였다. 전사 종료 후, 나일론막에 대해 80℃ 에서 2 시간의 열 처리를 실시하였다.

한편, 서던 블롯에 사용하는 프로브를 이하와 같이 조제하였다. 먼저, FUT8 게놈 영역 중 타겟팅 벡터 상동 영역을 초과한 부분의 서열에 결합하는 프라이머 (서열 번호 26 및 서열 번호 27) 를 사용하여, 이하의 PCR 을 실시하였다. 즉, WO02/31140호의 실시예 12 에 기재된 방법에 의해 구축한 플라스미드 pFUT8fgE2-2 4.0ng 을 함유하는 20㎕ 의 반응액 [DNA 폴리머라아제 ExTaq (다카라 주조사 제조), ExTaq buffer (다카라 주조사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 0.5μmol/L 상기 유전자 특이적 프라이머 (서열 번호 26 및 서열 번호 27)] 을 조제하고, 94℃ 에서 1 분간의 가열 후, 94℃ 에서 30 초간, 55℃ 에서 30 초간, 74℃ 에서 1 분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 25 사이클의 조건으로 PCR 을 실시하였다. PCR 후, 반응액을 1.75% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 230bp 의 프로브 DNA 단편을 정제하였다. 얻어진 프로브 DNA 용액 5㎕ 에 대해, [α-³²P] dCTP 1.75MBq 및 Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 를 사용하여 방사선 표지하였다.

하이브리다이제이션은 이하와 같이 실시하였다. 먼저, 상기의 나일론막을 롤러 보틀에 밀봉하고, 하이브리다이제이션액 [5×SSPE, 50×Denhaldt's 액, 0.5% (w/v) SDS, 100㎍/mL 연어 정자 DNA] 15mL 를 첨가하여 65℃ 에서 3 시간의 프레하이브리다이제이션을 실시하였다. 다음으로, ³²P 표지한 프로브 DNA 를 열 변성하여 보틀에 투입하고, 65℃ 에서 하룻밤 동안 하이브리다이제이션을 실시하였다.

하이브리다이제이션 후, 나일론막을 2×SSC-0.1% (w/v) SDS 50mL 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 상기의 세정 조작을 2 회 반복한 후, 막을 0.2×SSC-0.1% (w/v) SDS 50mL 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 세정 후, 나일론막을 X 선 필름에 -80℃ 에서 노출시켜 현상하였다.

50-10-104 주로부터 본 항 (1) 에 기재된 방법에 의해 취득한 퓨로마이신 내성 클론의 하나인 WK704 주의 게놈 DNA 를 본 방법에 의해 해석하였다. WK704 주에서는, 야생형 FUT8 대립 유전자 유래의 약 25.5Kb 의 단편이 소실되고, 상동 재조합된 대립 유전자에 특이적인 약 20.0Kb 의 단편만이 검출되었다. 이 결과로부터 WK704 주는, FUT8 양 대립 유전자가 파괴된 클론인 것이 확인되었다.

4. FUT8 유전자를 더블 녹아웃시킨 세포로부터의 약제 내성 유전자의 제거

(1) Cre 레콤비나제(recombinase) 발현 벡터의 도입

실시예 1 의 3 항에서 제작한 FUT8 더블 녹아웃 클론에 대해, Cre 레콤비나제 발현 벡터 pBS185 (Life Technologies 사 제조) 를 이하와 같이 하여 도입하였다.

플라스미드 pBS185 4㎍ 을 1.6×10⁶ 세포에 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 의해 도입 후, IMDM-dFBS(10)-HT(1) 10mL 에 현탁시키고, 추가로 동 배지를 사용하여 2 만배 희석하였다. 이 희석액을 접착 세포 배양용 10㎝ 디쉬 (Falcon 사 제조) 7 장에 파종 후, 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 10 일간의 배양을 실시하여, 콜로니를 형성시켰다.

(2) Cre 레콤비나제 발현 벡터 도입주의 취득

실시예 1 의 3 항에서 제작한 FUT8 더블 녹아웃 클론에 대해 유전자 도입을 실시함으로써 취득한 콜로니로부터, 임의의 클론을 이하의 순서로 채취하였다. 먼저, 10㎝ 디쉬로부터 배양 상청을 제거하고, 인산 완충액 7mL 를 주입한 후, 실체 현미경 아래로 옮겼다. 다음으로, 피펫맨 (GILSON 사 제조) 을 사용하여 콜로니를 긁어모아 흡입하고, 둥근 바닥 96 웰 플레이트 (Falcon 사 제조) 에 채취하였다. 트립신 처리를 실시한 후, 접착 세포용 평평한 바닥 96 웰 플레이트 (이와키가라스사 제조) 에 각 클론을 파종하고, IMDM-dFBS(10)-HT(1) 을 사용하여 1 주간 배양하였다.

배양 후, 상기 플레이트의 각 클론에 대해 트립신 처리를 실시하고, 2 배량의 동결 배지 [20% DMSO, 40% 소 태아 혈청, 40% IMDM] 와 혼화하였다. 이 중 절반의 양을 접착 세포용 평평한 바닥 96 웰 플레이트 (이와키가라스사 제조) 에 파종하여 레플리카 플레이트를 제작하는 한편, 나머지 절반의 양을 마스터 플레이트로 하여 동결 보존하였다.

다음으로, 레플리카 플레이트를, G418 을 600㎍/mL, 퓨로마이신을 15㎍/mL 의 농도로 함유하는 IMDM-dFBS(10)-HT(1) 을 사용하여 7 일간 배양하였다. Cre 레콤비나제의 발현에 의해 loxP 서열로 협지된 양 대립 유전자 상의 약제 내성 유전자가 제거된 양성 클론은, G418 및 퓨로마이신 존재 하에서 사멸한다. 본 네거티브 선택법에 의해 양성 클론을 선택하였다.

(3) 게놈 서던 블롯에 의한 약제 내성 유전자 제거의 진단

본 항 (2) 에서 발견된 양성 클론에 대해, 이하의 순서로 게놈 서던 블롯에 의한 약제 내성 유전자 제거의 진단을 실시하였다.

본 항 (2) 에서 동결 보존한 마스터 플레이트 중, 상기 양성 클론을 함유하는 96 웰 플레이트를 선택하고, 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 10 분간 정치하였다. 정치 후, 상기 클론에 해당하는 웰로부터 세포를 접착 세포용 평평한 바닥 24 웰 플레이트 (Greiner 사 제조) 에 파종하였다. 10% 소 태아 혈청 (Invitrogen 사 제조) 및 1 배 농도의 HT supplement (Invitrogen 사 제조) 를 첨가한 IMDM 배지 (Invitrogen 사 제조) 를 사용하여 1 주간 배양한 후, 접착 세포용 평평한 바닥 6 웰 플레이트 (Greiner 사 제조) 에 파종하였다. 이 플레이트로부터 공지된 방법 [Nucleic Acids Research, 3, 2303, (1976)] 을 따라 각 클론의 게놈 DNA 를 조 제하고, 각각 TE-RNase 완충액 (pH 8.0) 150㎕ 에 하룻밤 동안 용해시켰다.

상기에서 조제한 게놈 DNA 12㎍ 을 20 단위의 제한 효소 NheI (New England Biolabs 사 제조) 를 첨가하여 37℃ 에서 하룻밤 동안 소화 반응을 실시하였다. 이 반응액으로부터 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 후, TE 완충액 (pH 8.0) 20㎕ 에 용해시켜, 0.6% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하였다. 영동 후, 공지된 방법 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A), 76, 3683, (1979)] 을 따라, 나일론막에 게놈 DNA 를 전사하였다. 전사 종료 후, 나일론막에 대해 80℃ 에서 2 시간의 열 처리를 실시하여, 고정화시켰다.

한편, 서던 블롯에 사용하는 프로브를 이하와 같이 조제하였다. 먼저, FUT8 게놈 영역 중 타겟팅 벡터 상동 영역을 초과한 부분의 서열에 결합하는 프라이머 (서열 번호 26 및 서열 번호 27) 를 사용하여, 이하의 PCR 을 실시하였다. 즉, WO02/31140호의 실시예 12 에 기재된 방법에 의해 구축한 플라스미드 pFUT8fgE2-2 4.0ng 을 함유하는 20㎕ 의 반응액 [DNA 폴리머라아제 ExTaq (다카라 주조사 제조), ExTaq buffer (다카라 주조사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 0.5μmol/L 상기 유전자 특이적 프라이머 (서열 번호 26 및 서열 번호 27)] 을 조제하고, 94℃ 에서 1 분간의 가열 후, 94℃ 에서 30 초간, 55℃ 에서 30 초간, 74℃ 에서 1 분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 25 사이클의 조건으로 PCR 을 실시하였다. PCR 후, 반응액을 1.75% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하여, 약 230bp 의 프로브 DNA 단편을 정제하였다. 얻어진 프로브 DNA 용액 5㎕ 에 대해, [α-³²P] dCTP 1.75MBq 및 Megaprime DNA Labelling system, dCTP (Amersham Pharmacia Biotech 사 제조) 를 사용하여 방사선 표지하였다.

하이브리다이제이션은 이하와 같이 실시하였다. 먼저, 상기의 나일론막을 롤러 보틀에 밀봉하고, 하이브리다이제이션액 [5×SSPE, 50×Denhaldt's 액, 0.5% (w/v) SDS, 100㎍/mL 연어 정자 DNA] 15mL 를 첨가하여 65℃ 에서 3 시간의 프레하이브리다이제이션을 실시하였다. 다음으로, ³²P 표지한 프로브 DNA 를 열 변성하여 보틀에 투입하고, 65℃ 에서 하룻밤 동안 가온하였다.

하이브리다이제이션 후, 나일론막을 2×SSC-0.1% (W/V) SDS 50mL 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 상기의 세정 조작을 2 회 반복한 후, 막을 0.2×SSC-0.1% (W/V) SDS 50mL 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 세정 후, 나일론막을 X 선 필름에 -80℃ 에서 노출시켜 현상하였다.

상기 기술한 제한 효소 NheI 처리에 의해, 야생형 FUT8 대립 유전자로부터 약 8.0Kb 의 DNA 단편이 생긴다. 또, 동일한 제한 효소 처리에 의해, 타겟팅 벡터와의 상동 재조합이 일어난 대립 유전자로부터 약 9.5Kb 의 DNA 단편이 생겼다. 또한, 상동 재조합이 일어난 대립 유전자로부터 네오마이신 내성 유전자 (약 1.6Kb) 또는 퓨로마이신 내성 유전자 (약 1.5Kb) 가 제거된 경우에는, 동일한 처리에 의해 약 8.0Kb 의 DNA 단편이 생겼다.

친주인 CHO/DG44 세포, 본 실시예의 2 항에 기재된 50-10-104 주, 본 실시예 의 3 항에 기재된 WK704 주, 및 WK704 주로부터 본 항 (2) 에 기재된 방법에 의해 취득한 약제 감수성 클론의 하나인 4-5-C3 주의 게놈 DNA 를, 본 방법에 의해 해석하였다. CHO/DG44 세포에서는, 야생형 FUT8 대립 유전자로부터 유래하는 약 8.0Kb 의 DNA 단편만이 검출되었다. 또, 50-10-104 주나 WK704 주에서는, 상동 재조합이 일어난 대립 유전자에 유래하는 약 9.5Kb 의 DNA 단편이 관찰되었다. 한편, 4-5-C3 주에서는, 상동 재조합이 일어난 대립 유전자로부터 추가로 네오마이신 내성 유전자 (약 1.6Kb) 및 퓨로마이신 내성 유전자 (약 1.5Kb) 가 제거되어 생기는 약 8.0Kb 의 DNA 단편만이 검출되었다. 이 결과로부터 4-5-C3 주는, Cre 레콤비나제에 의해 약제 내성 유전자가 제거된 것이 확인되었다.

약제 내성 유전자가 제거된 FUT8 유전자 더블 녹아웃 클론 (이하에서, FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포라고 표기함) 은, 4-5-C3 주 이외에도 복수 주 취득되었다.

실시예 2. FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포에 의한 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 발현

유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포주를 이하에 나타내는 방법으로 제작하였다.

1. 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR)

인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 유전자 서열 (UniGene : Hs. 75599) 로부터 2 종류의 프라이머 (서열 번호 28 및 서열 번호 29) 를 제작하고, 이하의 PCR 을 실시하였다. 즉, 인간 간 유래 cDNA (인비트로젠사 제조) 를 템플릿으로서 함유하는 20 ㎕ 의 반응액, 즉 Pyrobest^® DNA polymerase (다카라 바이오사 제조), 10×Pyrobest^® buffer, 0.2mmol/L dNTP 혼합물, 0.5μmol/L 상기 유전자 특이적 프라이머 (서열 번호 28 및 서열 번호 29) 를 함유하는 반응액을 조제하고, 94℃ 에서 1 분간의 가열 후, 94℃ 에서 30 초간, 55℃ 에서 1 분간, 74℃ 에서 2 분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 30 사이클의 조건으로 PCR 을 실시하였다. PCR 후, 반응액을 1.5% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 약 1400bp 의 인간 안티트롬빈 Ⅲ 유전자를 함유하는 DNA 단편이 특이적으로 증폭된 사실을 확인하였다.

2. 플라스미드 pBS-ATⅢ 의 제작

상기 항 1 에서 제작한 PCR 산물에 대해 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하고, 회수한 정제 DNA 단편을 17㎕ 의 멸균수에 용해시켰다. 이 액에 10 단위의 제한 효소 EcoRI (다카라 바이오사 제조) 와 10 단위의 BamHI (다카라 바이오사 제조), 2㎕ 의 10×H buffer (다카라 바이오사 제조) 를 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간의 소화 반응을 실시하였다. 다음으로, 플라스미드 pBluescriptIIKS(+) (Strategene 사 제조) 3㎍ 을 17.5㎕ 의 멸균수에 용해시켰다. 이 액에 10 단위의 EcoRI, 2㎕ 의 10×H buffer 를 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다. 반응 후, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하고, 회수한 플라스미드를 17.5㎕ 의 멸균수에 용해시켰다. 또, 이 액에 10 단위의 BamHI 와 2㎕ 의 10×K buffer 를 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다. 상기에서 얻어진 인간 안티트롬빈 Ⅲ 유전자를 함유하는 PCR 산물 단편 (EcoRI-BamHI) 및 pBluescriptIIKS(+) 단편 (EcoRI-BamHI) 을, 1.5% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 각각 약 1.4Kb, 3.0Kb 의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제 PCR 산물 단편 (EcoRI-BamHI) 20ng 과 정제 pBluescriptIIKS(+) (EcoRI-BamHI) 단편 80ng 을 Ligation High (토요보사 제조) 존재 하에서 연결하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5α 주 (토요보사 제조) 를 형질 전환하였다. 각 형질 전환주로부터 플라스미드 DNA 를 조제하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems 사 제조) 과 DNA 시퀀서 ABI PRISM 377 (Applied Biosystems 사 제조) 을 사용하여 염기 서열을 해석하였다. 이 결과, 인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 번역 영역 전체 길이의 유전자 서열을 포함하는 플라스미드 pBS-ATⅢ 를 얻었다 (도 4).

3. 플라스미드 pKAN-ATⅢ 의 제작

상기 항 2 에서 제작한 pBS-ATⅢ 3㎍ 을 17㎕ 의 멸균수에 용해시키고, 10 단위의 EcoRI (다카라 바이오사 제조), 10 단위의 BamHI (다카라 바이오사 제조), 2㎕ 의 10×H buffer 를 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다.

다음으로, 플라스미드 pKANTEX93 (WO97/10354) 3㎍ 을 17.5㎕ 의 멸균수에 용해시켰다. 이 액에 10 단위의 EcoRI 와 2㎕ 의 10×H buffer 를 첨가하여 20 ㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다. 반응 후, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하고, 회수한 플라스미드를 17.5㎕ 의 멸균수에 용해시켰다. 또, 이 액에 10 단위의 BamHI 와 2㎕ 의 10×K buffer 를 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다. 상기에서 얻어진 pBS-ATⅢ 단편 (EcoRI-BamHI) 및 pKANTEX93 단편 (EcoRI-BamHI) 을 1.5% (w/v) 아가로오스 겔 전기 영동에 제공하고, 각각 약 1.4Kbp, 9.0Kbp 의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제 pBS-ATⅢ 단편 (EcoRI-BamHI) 50ng 과 정제 pKANTEX93 (EcoRI-BamHI) 단편 30ng 을 Ligation High (토요보사 제조) 존재 하에서 연결시켜, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA 를 사용하여 대장균 DH5α 주 (토요보사 제조) 를 형질 전환하였다. 각 형질 전환주로부터 플라스미드 DNA 를 조제하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 과 DNA 시퀀서 ABI PRISM 377 (Applied Biosystems 사 제조) 을 사용하여 염기 서열을 해석하였다. 이 결과, 인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 번역 영역 전체 길이의 유전자 서열을 포함하는 동물 세포 발현용 플라스미드 pKAN-ATⅢ 를 얻었다 (도 5).

4. 게놈 상의 FUT8 유전자를 더블 녹아웃시킨 CHO/DG44 세포주로의 인간 안티트롬빈 Ⅲ 발현 플라스미드의 안정적 도입

실시예 1 에서 제작한 FUT8 유전자를 더블 녹아웃시킨 CHO/DG44 세포주에, 상기 항에서 제작한 플라스미드 pKAN-ATⅢ 를 안정적으로 도입하여 형질 전환주를 제작하였다. 플라스미드 pKAN-ATⅢ 의 유전자 도입은 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 준하여 이하의 순서로 실시하였다. 먼저, 플라스미드 pKAN-ATⅢ 100㎍ 을 NEBuffer 3 (New England Biolabs 사 제조) 60㎕ 와 120 단위의 제한 효소 MluI (New England Biolabs 사 제조) 를 함유하는 600㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 5 시간 소화 반응을 실시함으로써 선 형상화하였다. 반응 후, 이 반응액에 대해 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전에 의해 정제를 실시하고, 선 형상화 플라스미드를 회수하였다. 다음으로, 실시예 1 에서 취득한 FUT8 유전자 더블 녹아웃 CHO/DG44 세포 클론 중 1 주를, K-PBS 완충액 (137mmol/L KCl, 2.7mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na₂HPO₄, 1.5mmol/L KH₂PO₄, 4.0mmol/L MgCl₂) 에 현탁시켜 8×10⁷ 세포/mL 의 액을 조제하였다. 세포 현탁액 200㎕ (1.6×10⁶ 개) 와 상기의 선 형상화 플라스미드 9㎍ 을 혼화한 후, 세포-DNA 혼화액의 전체량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2mm) (BIO-RAD 사 제조) 로 옮기고, 일렉트로포레이션 장치 Gene Pulser II (BIO-RAD 사 제조) 를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250μF 의 조건으로 유전자 도입을 실시하였다. 동일하게 하여 큐벳 4 개분에 대해 유전자 도입을 실시한 후, 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청 (Life Technologies 사 제조) 및 50㎍/mL gentamicin (나카라이테스크사 제조) 을 첨가한 IMDM 배지 (Life Technologies 사 제조) 120mL 에 현탁시키고, 접착 세포 배양용의 96 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 12 장에 100㎕/웰로 파종하였다. 배양은 CO₂ 인큐베이터 (TABAI 사 제조) 에서, 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에 서 실시하였다.

5. 500nM MTX 내성주의 취득

상기 항에서 얻은 pKAN-ATⅢ 를 안정적으로 도입한 세포를 6 일간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL gentamicin 및 50nM methotrexate (MTX) (시그마사 제조) 를 첨가한 IMDM 배지를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 이 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하면서 9 일간의 배양을 실시하였다. 이어서, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL gentamicin 및 200nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 동일하게 3∼4 일마다 반복하면서 18 일간 배양하고, 최종적으로 형성된 콜로니를 24 웰 플레이트 (시그마사 제조) 에 옮겨 심었다. 또한, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ gentamicin 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하고, 적절히 확대하면서 19 일간 배양을 실시하여, 500nM MTX 에 내성의 형질 전환주를 취득하였다.

6. 안티트롬빈 Ⅲ 고생산주의 선별

상기 항에서 취득한 복수의 500nM MTX 내성주로부터, 각 1.5×10⁶ 세포를 5mL 의 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ gentamicin 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지에 현탁시키고, 조직 배양용 플라스크 (배양 면적 25㎠, 그라이너사 제조) 에 파종하여 배양을 실시하였다. 배양 3 일 후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중에 함유되는 인간 안티트롬빈 Ⅲ 양을 ELISA for antithrombin(ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 방법은 키트에 첨부한 메뉴얼에 따르고, 표준품에는 시판되는 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ (시그마사 제조) 를 사용하였다. 복수의 500nM MTX 내성주 중, Ms705 pKAN-ATⅢ 27 주의 배양 상청 중에 304㎍/mL 의 농도에서 인간 안티트롬빈 Ⅲ 가 발현되고 있다는 것을 확인하였다. Ms705 pKAN-ATⅢ 27 주는 2003년 9월 9일자로, 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물기탁센터 (일본 이바라기켄 쯔꾸바시 히가시 1 쵸메 1 반찌 1 츄오 다이 6) 에 FERM BP-08472 로서 기탁되어 있다.

실시예 3. CHO/DG44 세포에 의한 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 발현

1. CHO/DG44 세포주에의 인간 안티트롬빈 Ⅲ 발현 플라스미드의 도입

먼저, 실시예 2 제 3 항에서 제작한 플라스미드 pKAN-ATⅢ 100㎍ 을 NEBuffer 3 (New England Biolabs 사 제조) 60㎕ 와 120 단위의 제한 효소 MluI (New England Biolabs 사 제조) 를 함유하는 600㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 5 시간 소화 반응을 실시함으로써 선 형상화하였다. 반응 후, 이 반응액에 대해 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전에 의해 정제를 실시하고, 선 형상화 플라스미드를 회수하였다.

다음으로, CHO/DG44 세포주 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)] 를 K-PBS 완충액 (137mmol/L KCl, 2.7mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na₂HPO₄, 1.5mmol/L KH₂PO₄, 4.0mmol/L MgCl₂) 에 현탁하여 8×10⁷ 세포/mL 로 하였다. 세포 현탁액 200㎕ (1.6×10⁶ 개) 와 상기의 선 형상화 플라스미드 9㎍ 을 혼화한 후, 세포-DNA 혼화액의 전량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2mm) (BIO-RAD 사 제조) 에 옮기고, 일렉트로포레이션 장치 Gene Pulser (BIO-RAD 사 제조) 를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250μF 의 조건으로 유전자 도입을 실시하였다. 일렉트로포레이션의 방법은, 문헌 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 을 따랐다. 유전자 도입을 실시한 후, 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청 (Life Technologies 사 제조) 및 50㎍/mL 젠타마이신 (나카라이테스크사 제조) 을 첨가한 IMDM 배지 (Life Technologies 사 제조) 30mL 에 현탁시키고, 접착 세포 배양 96 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 3 장에 100㎕/웰로 파종하였다. 배양은 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 실시하였다.

2. MTX 내성주의 취득

상기 항에서 얻은 pKAN-ATⅢ 도입 세포를 6 일간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL 젠타마이신 및 50nM 메토트렉사트 (MTX) (시그마사 제조) 를 첨가한 IMDM 배지를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 이 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하면서 9 일간의 배양을 실시하였다. 이어서, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL 젠타마이신 및 200nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 동일하게 3∼4 일마다 반복하면서 18 일간 배양하고, 최종적으로 형성된 콜로니를 24 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 에 옮겨 심었다. 또한, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하고, 적절히 확대하면서 19 일간 배양을 실시하고, 500nM MTX 에 내성의 형질 전환주를 취득하였다.

3. 안티트롬빈 Ⅲ 고생산주의 선별

상기 항에서 취득한 복수의 500nM MTX 내성주로부터, 각 1.0×10⁶ 세포를 5mL 의 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지에 현탁시키고, 조직 배양용 플라스크에 파종하여 배양을 실시하였다. 배양 3 일 후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중에 함유되는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 양을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용하여 측정하고, 그 결과로부터 고생산주의 선별을 실시하였다. 방법은 ELISA 키트에 첨부한 메뉴얼을 따르고, 표준품에는 인간 혈장 유래 제제인 노이아트 (미츠비시 웰파머사 제조) 를 사용하였다. 배양 상청 중에 유전자 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 축적이 관찰된 1 주의 형질 전환주를, pKAN-ATⅢ DG44 라고 명명하였다.

실시예 4. 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 정제와 당사슬 구조의 해석

1. 무혈청 배지에의 순화

실시예 2 와 3 에서 제작된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 발현 FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포주와, 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 발현 CHO/DG44 세포주를 이하의 방법으로 무혈청 배지에 순화하였다. 각 세포주를 4mM 의 L-Glutamine (인비트로젠사 제조), 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 EX-CELL302 배 지 (JRH 사 제조) (이하에서, 무혈청 배지라고 칭함) 15㎖ 에 5×10⁵ 세포/㎖ 로 현탁하여 125㎖ 삼각 플라스크 (코닝사 제조) 에 파종하여, 회분 배양을 실시하였다. 배양은 35℃, 회전 속도는 90∼100rpm 으로 실시하고, 계대시에는 배양 용기 용적의 4 배량 이상의 5% CO₂ 를 함유하는 공기를 배지 상면에 통기시키고, 삼각 플라스크 중의 공기를 치환하였다. 3 일 후에 배지 교환을 실시하고, 6 일째에 5×10⁵ 세포/㎖ 로 계대를 실시하였다. 이후, 3∼4 일마다 계대를 2 주간 반복하여, 무혈청 배지에 순화시켰다. 이 배양에 의해, FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포주로부터 유래하고, 무혈청 배지 중에서의 증식 능력을 갖는 형질 전환주 pKAN-ATⅢ AFMS705 주와, CHO/DG44 세포주로부터 유래하고, 무혈청 배지 중에서의 증식 능력을 갖는 형질 전환주 pKAN-ATⅢ AFDG44 가 얻어졌다. 얻어진 주를 3.0×10⁵ 세포/mL 의 농도로 15mL 의 무혈청 배지에 현탁시키고, 125mL 플라스크에 파종하여 배양을 실시하였다. 배양 3 일 후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중에 함유되는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 양을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용하여 측정한 결과, pKAN-ATⅢ AFMS705 주의 배양 상청 중에 18㎍/mL, pKAN-ATⅢ AFDG44 주의 배양 상청 중에는 28㎍/mL 와, 양방의 형질 전환주에서, 거의 동등한 농도에서 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 가 발현되고 있는 것을 확인하였다. 또한, pKAN-ATⅢ AFMS705 주는 pKAN-ATⅢ AFMS705 의 주 이름으로, 2004년 8월 10일자로 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허 생물기탁센터 (일본 이바라기켄 쯔꾸바시 히가시 1 쵸메 1 반찌 1 츄오 다이 6) 에 FERM BP-10088 로서 기탁되어 있다.

2. 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 함유 배양 상청의 취득

상기 항에서 얻어진 2 종의 무혈청 순화 세포주인 pKAN-ATⅢ AFMS705 주 및 pKAN-ATⅢ AFDG44 주를 각각 3×10⁵ 세포/㎖ 로 무혈청 배지 450㎖ 에 현탁하여 2L 롤러 보틀 (벡톤디킨슨사 제조) 에 파종하고, 배양 용기 용적의 4 배량 이상의 5% CO₂ 를 함유하는 공기를 배지 상면에 통기시키고, 삼각 플라스크 중의 공기를 치환하였다. 배양은 35℃, 회전 속도는 5∼10rpm 으로 실시하고, 배양 5 일째에 아미노산 등의 소비된 영양소를 보충할 목적으로, 피드 배지를 37.5㎖ 및 50% 글루코오스 용액을 1.8㎖ 첨가하였다. 피드 배지는 아미노산 (L-알라닌 0.22g/L, L-아르기닌1염산 0.74g/L, L-아스파라긴1수화물 0.22g/L, L-아스파라긴산 0.26g/L, L-시스틴2염산 0.80g/L, L-글루타민산 0.66g/L, L-글루타민 7.3g/L, 글리신 0.26g/L, L-히스티딘1염산2수화물 0.37g/L, L-이소로이신 0.92g/L, L-로이신 0.92g/L, L-리신1염산 1.29g/L, L-메티오닌 0.26g/L, L-페닐알라닌 0.58g/L, L-프롤린 0.35g/L, L-세린 0.37g/L, L-트레오닌 0.84g/L, L-트립토판 0.14g/L, L-티로신2나트륨2수화물 0.92g/L, L-발린 0.83g/L), 비타민 (d-비오틴 0.0001g/L, D-판토텐산칼슘 0.035g/L, 염화콜린 0.035g/L, 엽산 0.035g/L, myo-이노시톨 0.063g/L, 나이아신아미드 0.035g/L, 피리독살염산 0.035g/L, 리보플라빈 0.0035g/L, 티아민염산 0.035g/L, 시아노코바라민 0.0001g/L), 리콤비넌트 인간 인슐린 0.31g/L (JRH 사 제조), 에탄올아민 0.025g/L (시그마-알드리치사 제조), 2-메르캅토에탄올 0.0098g/L (시그마-알드리치사 제조), 대두 가수분해물 HY-SOY 8g/L (퀘스트인터내셔널사 제조), 아셀렌산나트륨 16.8gμ/L (시그마-알드리치사 제조), 콜레스테롤 지질 농축 용액 2mL/L (250×수용액, 인비트로젠사 제조), 에틸렌디아민4아세트산제2철나트륨염 0.05g/L (시그마-알드리치사 제조) 로 이루어지는 배지이다. 피드 이후에는 배양 종료까지 매일 통기시켜, 공기 치환을 실시하였다. 생존률은, 80% 이상을 유지시키면서, 9∼10 일간의 배양을 실시하였다. 배양 종료 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 인간 안티트롬빈량을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 을 사용하여 측정하였다. 그 결과, pKAN-ATⅢ AFMS705 주 및 pKAN-ATⅢ AFDG44 주 각각의 배양 상청에는, 68㎍/㎖ 및 87㎍/㎖ 의 농도로 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 가 함유되어 있는 것이 확인되었다. 이하에서, pKAN-ATⅢ AFMS705 주가 생성된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 ATⅢ MS705, pKAN-ATⅢ AFDG44 주가 생성된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 ATⅢ DG44 로 각각 약기한다.

3. 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 정제

상기 항에서 얻어진 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 함유하는 배양 상청으로부터, 문헌 [Meth. Enzymol., 222, 525, 1993] 에 기재된 방법에 따라 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 이하와 같이 하여 정제하였다. 상기 항에서 얻어진 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 함유하는 배양 상청 중, 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 약 250mg 상당의 배양 상청을 50mM 트리스, 14mM 시트르산, 0.15M NaCl (pH 7.4) 로 이루어지는 완충액으로 평형화한 헤파린 칼럼 (Heparin Sepharose 6 Fast Flow, 250㎖, 아마샴 바이오 사이언스사 제조) 에 전개시켰다. 계속해서, 평형화 완충액 10CV 로 헤파린 칼럼을 세정 후, 3M NaCl 농도까지의 직선 형상 구배 용출법 (12CV) 을 사용하여, 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 용출시켰다. 장치는 Hiload 크로마토시스템 (아마샴 바이오 사이언스사 제조) 을 사용하고, 유속은 21㎖/분으로 하고, 유전자 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 용출 획분은 50㎖ 마다 분획하였다. 각 획분의 인간 안티트롬빈 Ⅲ 양을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용하여 측정한 결과, 도 7 에서 나타내는 바와 같이, 용출 패턴에는 크게 나누어 3 종의 피크가 관찰되지만, ATⅢ MS705 와 ATⅢ DG44 의 용출 패턴은 상이한 패턴을 나타냈다. 이하에서, 빨리 용출된 피크 획분으로부터, 피크 ① 획분, 피크 ② 획분, 피크 ③ 획분이라고 칭한다. 안티트롬빈 Ⅲ 를 헤파린 어피니티로 정제를 실시했을 때, 복수의 피크가 관찰되는 경우에는, 이하의 문헌 [J. Biol. Chem., 268, 17588 (1993), Biochem. J., 286, 793 (1992), J. Biol. Chem., 264, 21153 (1989)] 등에서 보고되어 있다. 또, 마찬가지로 노이아트의 용출 패턴을 검토한 결과, 피크 ② 획분에 국한하여 용출이 관찰되었다. 주요 피크인 ATⅢ MS705 피크 ② 획분, ③ 획분, ATⅢ DG44 피크 ① 획분, ② 획분에 상당하는 각 피크 획분은, 페리콘 XL (미리포아사 제조) 과 Biomax10 (미리포아사 제조) 을 사용하고, 다이아필트레이션법에 의해 5mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.4) 에 탈염하였다. 탈염한 각 피크 획분을, DEAE Sepharose Fast Flow 칼럼 (아마샴사 제조, 480㎖) 에 전개하여 흡착시켰다. 계속해서, 12CV 의 20mM 인산나트륨 완충액 (pH 7.4) 으로 세정한 후, 1.0M NaCl 농도까지의 직선 형상 구배 용출법 (8.6CV) 을 사용하고, 유속 40㎖/min 로 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 용출시켰다. 용출 패턴은, 흡광도 (A280㎚) 로 측정하였다. 다음으로, 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 함유하는 용출 획분을 합하여, 페리콘 XL (미리포아사 제조) 과 Biomax10 (미리포아사 제조) 을 사용하여 다이아필트레이션법에 의해 완충액을 PBS 로 치환하고, 평가용 샘플을 조제하였다. 평가용 샘플의 흡광도 (A280㎚) 를 측정하고, A280㎚ 1.0=0.64㎎/㎖ 로 하여 단백질 농도를 산출하였다. 또, ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용한 정량도 실시하여, 흡광도법과 ELISA 법에서 농도가 동일한 것을 확인하였다. 또, 파제르 SPG520L (아토사 제조) 을 사용하여 환원 SDS-PAGE 를 실시하였다. 전기 영동에는 각각 2-메르캅토에탄올로 환원한 2㎍ 의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 사용하고, 염색은 CBB 염색으로 실시하였다. 그 결과, 모든 평가용 샘플에서, 분자량 약 60kD 의 ATⅢ 밴드 이외의 밴드는 확인되지 않았다.

4. 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 중성당ㆍ아미노당 조성 분석

실시예 4 제 3 항에서 얻어진 평가용 샘플에 대하여, 중성당ㆍ아미노당 조성 분석을 실시하였다. 각각의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 평가용 샘플을 4.0mol/ℓ 트리플루오로아세트산 존재 하에서 100℃, 2 시간 가수분해하고, 단백질로부터 중성당ㆍ아미노당을 유리시켰다. 유리된 당은, Michael Weitzhandler 등의 문헌 [Analytical Biochemistry 241, 128-134 (1996)], 및 DIONEX Application Note 92 (The Determination of Sugars in Molasses by High-Performance Anion Exchange with Pulsed Amperometric Detection) 에 기재된 방법을 참고로 하여, DX-500 당 분석 장치 (Dionex 사 제조) 를 사용하여 분석하였다. 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 의 당사슬 구조는, 푸코스를 함유하지 않는 복합 이중쇄형 당사슬인 것이 알려져 있다 [Arch. Biochem. Biophys., 203, 458 (1980)] (도 2). 중성당ㆍ아미노당 조성 분석 결과의 해석에서는, N-아세틸글루코사민의 조성비를 4 로 하여, 각 단당 성분 (푸코스, 갈락토오스, 만노오스) 의 조성비를 산출하였다. 해석의 결과, ATⅢ DG44 의 당사슬 성분에는 푸코스가 검출된 데 대해, ATⅢ MS705 의 당사슬 성분에 있어서의 푸코스의 함량은, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 인 노이아트와 동일하게 검출 한계 이하였다. 또, 각 단당 성분의 조성비로부터, 모든 샘플의 주요한 당사슬 구조는, 하이 만노오스형이나 하이브리드형이 아니라, 복합 이중쇄형 당사슬인 것이 시사되었다.

5. 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 분석

실시예 4 제 3 항에서 얻어진 평가용 샘플의 α 형과 β 형의 조성비를, Goran Karlsson 및 Stefan Winge 의 방법 [Protein Expression and Purification 28, 196-201 (2003)] 을 참고로 하여, 하이드록시아파타이트 크로마토그래피로 분석하였다. 그 결과, ATⅢ MS705 피크 ② 획분, ATⅢ DG44 피크 ① 획분에서는, 인간 혈장 유래의 노이아트와 마찬가지로, 주로 α 형이 함유되어 있었다. 또, ATⅢ MS705 피크 ③ 획분에서는, 주로 β 체가 함유되어 있었다. 또, ATⅢ DG44 피크 ② 획분에는 α 형과 β 형이 거의 동일한 비율로 함유되어 있었다. 이상, 중성당ㆍ아미노당 분석과 하이드록시아파타이트 크로마토그래피 분석의 결과를 표 1 에 정리하였다.

	당사슬 구조	푸코스	주요한 분자 종류
ATⅢ MS705 피크 ② ATⅢ MS705 피크 ③ ATⅢ DG44 피크 ① ATⅢ DG44 피크 ② 노이아트	복합 이중쇄형 복합 이중쇄형 복합 이중쇄형 복합 이중쇄형 복합 이중쇄형	- - + + -	α β α α & β α

ATⅢ DG44 는 당사슬에 푸코스를 갖고 있고, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 와는 당사슬 구조가 상이하였다. 한편, ATⅢ MS705 피크 ② 획분과 ATⅢ MS705 피크 ③ 획분의 당사슬 구조는, 각각 인간 혈장 유래의 α 형, β 형 안티트롬빈 Ⅲ 에 근사한 당사슬 구조인 것이 밝혀졌다. 또, ATⅢ MS705 는, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 에 있어서 문헌 [J. Biol. Chem., 268, 17588 (1993)] 에서 보고되어 있는 바와 같이, 헤파린 어피니티를 이용한 정제 방법으로 α 형과 β 형을 분리할 수 있었다. 그러나, ATⅢ DG44 피크 ② 획분은 동일한 정제를 실시하여도 분리할 수 없었다. 이상의 사실로부터, ATⅢ MS705 는, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 와 동등한 성질을 갖는다는 것이 분명해졌다.

실시예 5. 정제한 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 생물 활성의 비교

1. 헤파린 해리 상수의 측정

헤파린 해리 상수는, 안티트롬빈 Ⅲ 와 헤파린의 결합에 의해, 안티트롬빈 Ⅲ 분자의 입체 구조가 변화되기 때문에, 안티트롬빈 Ⅲ 단백질을 구성하는 트립토판 잔기의 형광 강도가 변화하는 것을 이용하여 측정할 수 있다. 안티트롬빈 Ⅲ 농도와 트롬빈 농도 사이에는 이하의 관계식 1) 이 성립한다 (Meth. Enzymol., 222, 525, 1993).

식 1)

△F : 형광 변화량

△Fmax : 최대 형광 변화량

F₀ : 헤파린 비첨가시의 형광 강도

[AT]₀ : 안티트롬빈 Ⅲ 농도

[H]₀ : 헤파린 농도

Kd : 해리 상수

n : 화학양론(stoichiometry)

실시예 4 제 3 항에서 얻어진 헤파린 어피니티로 분획한 안티트롬빈 Ⅲ 의 각 평가용 샘플의 헤파린 해리 상수를 이하의 방법으로 측정하였다. 먼저, 20mM Na₂HPO₄, 0.1M NaCl, 0.1mM EDTAㆍ2H₂O, 0.1% PEG6000 으로 이루어지는 완충액 (pH 7.4) 을 조제하였다. 본 완충액은 샘플의 희석에 사용하였다. 50nM 안티트롬빈 Ⅲ 에 대해, 헤파린 (시그마사 제조) 을 0∼20 당량 첨가하고, 각 용액의 형광 강도를 여기 파장 280㎚, 형광 파장 340㎚ 로 측정하였다. 해리 상수는 식 1) 을 사용하여 해석 소프트웨어 GraphPad prism 4 (그래프패드사 제조) 로 해석하였다. 실시예 4 제 3 항에서 얻어진 평가용 샘플의 헤파린 해리 상수 (Kd 값, 단위 nM) 를 측정한 결과를 표 2 에 나타냈다. ATⅢ 의 헤파린에 대한 결합력은, Kd 값이 작을수록 강하다. 따라서, 가장 결합력이 강한 것은 ATⅢ MS705 피크 ③ 획분, 다음으로, ATⅢ MS705 피크 ② 획분 및 ATⅢ DG44 피크 ② 획분, 결합력이 가장 약했던 것은 ATⅢ DG44 피크 ① 획분이었다.

	Kd nM
ATⅢ/MS705 peak ② ATⅢ/MS705 peak ③	9.87±1.09 3.06±0.07
ATⅢ/DG44 peak ① ATⅢ/DG44 peak ②	59.71±2.11 9.84±0.97
노이아트	20.09±3.60

2. 헤파린 코팩터 활성의 측정

안티트롬빈 Ⅲ 의 트롬빈 저해 속도는, 헤파린 존재 하에서 현저하게 상승하는 것이 알려져 있다. 또, 트롬빈과 안티트롬빈 Ⅲ 의 결합 반응은 몰비 1:1 로 일어나고, 반응 후에는 서로 활성을 잃어버리기 때문에, 헤파린 존재 하에서는, 안티트롬빈의 항트롬빈 반응은, 매우 단시간에 종료되고 만다. 헤파린 코팩터 활성은, 항트롬빈 반응 종료시의 잔존 트롬빈 활성에서 나타나기 때문에, 바꾸어 말하면, 헤파린 코팩터 활성은, 항트롬빈 반응 종료시의 활성체 안티트롬빈 Ⅲ 양을 측정하고 있게 된다 [속 의약품의 개발, 20, 185, 1992].

헤파린 코팩터 활성을 측정하기 위해, 먼저, 0.15M NaCl, 0.05M Tris-HCl, 0.2% 알부민으로 이루어지는 완충액 (pH 8.3) 을 조제하였다. 본 완충액은 샘플의 희석, 효소액의 조제에 사용하였다. 안티트롬빈 Ⅲ 용액에 대해 2.5 단위/㎖ 의 트롬빈 (Enzyme Research Laboratories 사 제조) 과 0.6 단위/㎖ 의 헤파린 (시그마사 제조) 으로 이루어지는 효소액 1.0㎖ 를 첨가하고, 37℃ 에서 5 분간 반응시켰다. 또한, 트롬빈의 특이적 기질인 2.0mM 의 S-2238 (다이이치 화학 약품사 제조) 을 100㎕ 첨가하고, 2 분간 발색시킨 후, 50% 아세트산으로 반응을 정지시켰다. 잔존 트롬빈 활성은, 반응액 중의 S-2238 이 분해되어 생긴 p-니트로아닐린의 흡광도 (A405㎚) 로부터 구하였다. 또한, 안티트롬빈 Ⅲ 는 0.15∼4㎍/mL 의 범위가 되도록 희석하여, 측정에 사용하였다. 검량선의 제작에는, 표준품으로서 노이아트를 사용하고, 단위 체적 (액량) 당 활성 (단위/㎖) 으로 헤파린 코팩터 활성을 산출하였다. 실시예 4 제 3 항에서 얻어진 평가용 샘플의 헤파린 코팩터 활성을 측정하고, 얻어진 활성값을 단위 질량당의 활성 (단위/g) 으로 나타낸 결과를 도 8 에 나타냈다. ATⅢ MS705 의 피크 ② 획분, ATⅢ MS705 의 피크 ③ 획분은 인간 혈장 유래의 노이아트 (미츠비시 웰파머사 제조) 와 동등한 활성을 갖고 있었지만, ATⅢ DG44 피크 ① 획분과 ATⅢ DG44 피크 ② 획분은 노이아트보다도 낮은 값을 나타냈다.

3. 헤파린 비존재 하에 있어서의 트롬빈 저해 2 차 속도 상수의 측정

트롬빈 저해 2 차 속도 상수의 측정 방법은, 문헌 (J. Biol. Chem., 277, 24460, 2002) 에 준하여 실시하였다.

트롬빈량에 대해 과잉량의 안티트롬빈 Ⅲ 가 존재하는 조건 하에서는, 헤파린 비존재하에 있어서의 ATⅢ 의 트롬빈 저해 반응은 유사 1 차 반응에 근사시켜 생각할 수 있기 때문에, 이하의 식 2) 가 성립한다.

식 2) In[T]_t= -kobs*t + 1n[T]_O

[T]_t : t 시간 후의 트롬빈 농도

[T]_O : 트롬빈의 처음 농도

kobs : 유사 1 차 속도 상수

t : 시간

식 3) kobs= k[AT]

k : 2 차 속도 상수

[AT] : 안티트롬빈 Ⅲ 농도

여기에서, 먼저 트롬빈 저해 2 차 속도 상수를 측정하기 위해, 먼저, 20mM Na₂HPO₄, 0.1M NaCl, 0.1mM EDTAㆍ2H₂O, 0.1% PEG8000 으로 이루어지는 완충액 (pH7.4) 을 조제하였다. 본 완충액은, 샘플의 희석, 효소액의 조제에 사용하였다. 100nM 안티트롬빈 Ⅲ 와 10nM 트롬빈으로 이루어지는 산소액을 조제하고, 25℃ 에서 1∼40 분간 반응시켰다. 각 시간마다, 트롬빈의 특이적 기질인 0.15mM 의 S-2238 (다이이치 화학 약품사 제조) 을 100㎕ 첨가하고, 약 2 분간의 흡광도 (A405㎚) 를 측정하였다. 각 시간에 있어서의 흡광도 변화로부터 잔존하는 트롬빈 농도를 구하고, 상기 2) 식을 사용하여, 유사 1 차 속도 상수를 구하였다. 또한, 상기 3) 식을 사용하여 헤파린 비존재하에서의 트롬빈 저해 2 차 속도 상수 (단위/M/초) 를 산출하였다. 실시예 4 의 제 3 항에서 얻어진 평가용 샘플의 2 차 속도 상수를 표 3 에 나타냈다. S.D. 는 표준 편차를 나타낸다. 헤파린 비존재하에서의 트롬빈 저해 2 차 속도 상수는, ATⅢ DG44 피크 ① 획분이 약간 낮은 값을 나타냈지만, 다른 모든 평가용 샘플에서는, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 노이아트와 동등한 활성을 나타내는 것이 나타났다.

	2 차 속도 상수(-hep) /M/sec S.D.
ATⅢ MS705 peak② ATⅢ MS705 peak③ ATⅢ DG44 peak① ATⅢ DG44 peak② 노이아트	8.5E+03 1.9E+02 8.8E+03 3.7E+02 7.7E+03 1.8E+02 8.6E+03 1.6E+02 8.2E+03 8.8E+01

4. 헤파린 존재하에 있어서의 트롬빈 저해 2 차 속도 상수의 측정

실시예 4 의 제 3 항에서 얻어진 평가용 샘플의 헤파린 존재하에 있어서의 트롬빈 저해 2 차 속도 상수를, 문헌 [Biochem. J., 286, 793, 1992] 에 준하여, 이하의 방법으로 측정하였다. 먼저, 20mM Na₂HPO₄, 0.1M NaCl, 0.1mM EDTAㆍ2H₂O, 0.1% PEG8000 으로 이루어지는 완충액 (pH 7.4) 을 조제하였다. 본 완충액은 샘플의 희석, 효소액의 조제에 사용하였다. 100nM 안티트롬빈 Ⅲ 에 대해 0.5∼1nM 의 트롬빈과 5∼25pM 헤파린 (시그마사 제조) 으로 이루어지는 효소액을 첨가하고, 25℃ 에서 1∼30 분간 반응시킨 후, 트롬빈의 특이적 기질인 0.15mM 의 S-2238 (다이이치 화학 약품사 제조) 을 100㎕ 첨가하고, 약 2 분간의 흡광도 (A405㎚) 를 측정하였다. 각 시간에 있어서의 흡광도의 변화로부터 잔존 트롬빈 농도를 구하고, 상기 식 2) 를 사용하여, 유사 1 차 속도 상수를 구하였다. 또한, 하기 식 4) 를 사용하여 헤파린 존재 하에 있어서의 트롬빈 저해 2 차 속도 상수를 산출하였다.

식 4)

Kobs : 유사 1 차 속도 상수

k : 2 차 속도 상수

[H]_O : 헤파린의 농도

kd : 헤파린 해리 상수

[AT]_O : 안티트롬빈 Ⅲ 농도 K_uncat : 헤파린 비존재하에서의 2 차 속도 상수

실시예 4 의 제 3 항에서 얻어진 각 평가용 샘플의 헤파린 존재하에 있어서의 트롬빈 저해 2 차 속도 상수 (단위/M/초) 를 측정한 결과를 표 4 에 나타냈다. 수치의 표기는, 예컨대, 2.5E+07 은 2.5×10⁷ 을 나타낸다. 또, S.D. 는 표준 편차를 나타낸다. 2 차 속도 상수는, ATⅢ MS705 의 피크 ② 획분과 ATⅢ MS705 의 피크 ③ 획분은, 노이아트와 동등한 활성을 나타냈지만, ATⅢ DG44 피크 ① 획분으로 현저히 낮은 값을 나타내고, ATⅢ DG44 피크 ② 획분도 약간 낮은 값을 나타냈다. 이 결과로부터, CHO/DG44 세포주를 사용하여 생산된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 에는, 헤파린 존재하에서의 항트롬빈 활성이 낮은 획분이 포함된다는 것이 명백해졌다. 한편, FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포주를 사용하여 생산한 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 에는, 주로 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 와 동등한 활성을 나타내는 획분이 얻어진다는 것이 명백해졌다.

	2 차 속도 상수(+hep) /M/sec S.D.
ATⅢ MS705 peak② ATⅢ MS705 peak③ ATⅢ DG44 peak① ATⅢ DG44 peak② 노이아트	2.5E+07 1.6E+06 2.6E+07 8.7E+05 8.7E+06 1.1E+04 2.0E+07 8.1E+05 2.3E+07 2.9E+05

실시예 4 및 5 에서의 해석의 결과, 당사슬 구조 및 생물 활성에 있어서, FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포로 생산된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 는, CHO/DG44 세포주에서 생산된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 와 비교하여, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 와 동등한 성질을 갖는 단백질이라는 것으로 나타난다. 이 결과로부터, FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포에서 생산된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 는, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 의 대체 물질로서 적당하다는 것으로 나타난다.

실시예 6 FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포에 의한 아미노산 개변된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 발현

성숙형 인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 N 말단에서 135 번째에 위치하는 아스파라긴 잔기를 글루타민 잔기에 아미노산 치환한 변이형 인간 안티트롬빈 Ⅲ (이하에서, ATⅢ N135Q 라고 함) 를 발현시키는 FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포를, 이하에 나타내는 방법으로 제조하였다. 또한, ATⅢN135Q 조성물은, N 결합형 당사슬의 부가 부위가 3 개소가 되기 때문에, 발현된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 모두 β 형이 된다.

1. 플라스미드 pBS-ATⅢN135Q 의 제조

먼저, 안티트롬빈 Ⅲ 유전자 서열 (UniGene : Hs.75599, 서열 번호 1) 에 대해, N 말단에서 167 번째의 아스파라긴 잔기를 글루타민 잔기로 치환하는 2 종류의 부위 돌연 변이 도입용 올리고 DNA 프라이머를 제조하였다 (서열 번호 30 및 서열 번호 31). 실시예 2 의 제 2 항에서 제조한 pBS-ATⅢ 를 주형으로 하여, 상기의 프라이머 및 Quick Change^® Site-Directed mutagenesis Kit (STRATAGENE사 제조) 를 사용하여, 안티트롬빈 ⅢcDNA 서열에 부위 특이적 변이를 도입하였다. 방법은 키트에 첨부한 매뉴얼에 따랐다. 얻어진 형질 전환주로부터 QIAprep^®Spin Miniprep Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 조제하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit v2.0 (Applied Biosystems 사 제조) 과 DNA 시퀀서 ABI PRISM 377 (Applied Biosystems 사 제조) 을 사용하여 염기 서열을 해석하였다. 이 결과, 변이형 안티트롬빈 Ⅲ (ATⅢ N135Q) 의 번역 영역 전체 길이의 cDNA 서열을 포함하는 플라스미드 pBS-ATⅢN135Q 를 얻었다 (도 6).

2. 발현 벡터 pKAN-ATⅢN135Q 의 제조

상기 항에서 제조한 pBS-ATⅢN135Q 3㎍ 을 17㎕ 의 멸균수에 용해시키고, 10 단위의 EcoRI (다카라바이오사 제조), 10 단위의 BamHI (다카라바이오사 제조), 2㎕ 의 10×H buffer 를 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다. 다음으로, 플라스미드 pKANTEX93 (특허 WO97/10354호에 기재) 3㎍ 을 17.5㎕ 의 멸균수에 용해시켰다. 이 액에 10 단위의 EcoRI 와 2㎕ 의 10×H buffer 을 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다. 반응 후, 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전을 실시하고, 회수한 플라스미드를 17.5㎕ 의 멸균수에 용해시켰다. 또한, 이 액에 10 단위의 BamHI 와 2㎕ 의 10×K buffer 를 첨가하여 20㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시하였다. 상기에서 얻어진 pBS-ATⅢN135Q 단편 (EcoRI-BamHI) 및 pKANTEX93 단편 (EcoRI-BamHI) 을 1.5% (w/v) 아가로오스 젤 전기 영동에 제공하고, 각각 약 1.4Kbp, 9.0Kbp 의 DNA 단편을 QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 정제하였다. 이어서, 정제 pBS-ATⅢN135Q 단편 (EcoRI-BamHI) 50ng, 정제 pKANTEX93 (EcoRI-BamHI) 단편 30ng, Ligation High (토요보사 제조) 를 함유하는 반응액 20㎕ 을 조제하고, 16℃ 에서 16 시간의 연결 반응을 실시하였다. 얻어진 플라스미드 DNA 를 사용하고, 히트 쇼크법에 의해 대장균 DH5α주 (토요보사 제조) 를 형질 전환하였다. 형질 전환주로부터 QIAprep^® Spin Miniprep Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 플라스미드 DNA 를 조제하고, 동물 세포용 변이형 AT 안티트롬빈 Ⅲ 발현 플라스미드 pKAN-ATⅢN135Q 를 얻었다 (도 6).

3. FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포로의 ATⅢN135Q 발현 플라스미드의 도입

실시예 1 에서 제조한 FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포에, 실시예 6 의 제 2 항에서 제조한 플라스미드 pKAN-ATⅢN135Q 를 안정적으로 도입하였다. 유전자 도입법은, 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 의해 이하의 순서로 실시하였다. 먼저, 플라스미드 pKAN-ATⅢN135Q 를 30㎍ 을 NEBuffer 3 (New England Biolabs 사 제조) 20㎕ 과 100 단위의 제한 효소 MluI(New England Biolabs 사 제조) 를 함유하는 200㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간의 소화 반응을 실시함으로써, 플라스미드를 선 형상화하였다. 반응 후, 이 반응액에 대해 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전에 의해 정제를 실시하고, 선 형상화 플라스미드를 회수하였다. 다음으로, 실시예 1 에서 취득한 FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포를 K-PBS 완충액 (137mmol/ℓ KCl, 2.7mmol/ℓ NaCl, 8.1mmol/ℓ Na₂HPO₄, 1.5mmol/ℓ KH₂PO₄, 4.0mmol/ℓ MgCl₂) 에 현탁하여 8×10⁷ 세포/㎖ 로 하였다. 세포 현탁액 200㎕ (1.6×10⁶개) 와 상기의 선 형상화 플라스미드 9㎍ 을 혼화한 후, 세포-DNA 혼화액의 전량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2mm) (BIO-RAD 사 제조) 로 옮기고, 일렉트로포레이션 장치 Gene Pulser Ⅱ (BIO-RAD 사 제조) 를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250㎌ 의 조건으로 유전자 도입을 실시하였다. 유전자 도입을 실시한 후, 세포 현탁액을 10% (v/v) 소 태아 혈청 (Life Technologies 사 제조) 및 50㎍/㎖ 젠타마이신 (나카라이테스크사 제조) 을 첨가한 IMDM 배지 (Life Technologies 사 제조) 30㎖ 에 현탁시키고, 접착 세포 배양 96 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 3 장으로 100㎕/웰로 파종하였다. 배양은 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 실시하였다.

4. MTX 내성주의 취득

상기 항에서 얻은 pKAN-ATⅢN135Q 도입 세포를 6 일간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ gentamicin 및 50nM methotrexate (MTX) (시그마사 제조) 를 첨가한 IMDM 배지를 10㎕/웰씩 첨가하였다. 이 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하면서 9 일간의 배양을 실시하였다. 이어서, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ gentamicin 및 200nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 동일하게 3∼4 일마다 반복하면서 18 일간 배양하고, 최종적으로 형성된 콜로니를 24 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 로 옮겨 심었다. 또한, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하고, 적당히 확대하면서 19 일간 배양을 실시하여, 500nM MTX 내성주를 취득하였다.

5. ATⅢN135Q 고생산주의 선별

상기 항에서 취득한 복수의 500nM MTX 내성주로부터, 각 1.0×10⁶ 세포를 5㎖ 의 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ gentamicin 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지에 현탁시키고, 조직 배양용 플라스크 (그라이너사 제조) 로 파종하여 배양을 실시하였다. 배양 3 일 후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중에 함유되는 ATⅢN135Q 양을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용하여 측정하고, 고생산주를 선별하였다. 방법은 ELISA 키트에 첨부된 매뉴얼에 따라, 표준품에는 노이아트 (미츠비시 웰퍼머사 제조) 를 사용하였다.

6. 무혈청 배지로의 순화

상기 항에서 제조한 ATⅢN135Q 발현 FUT8 유전자 더블 녹아웃 세포주를, 실시예 4 의 제 1 항과 동일한 방법으로, 무혈청 배지로 순화하였다. 실시예 4 의 제 1 항에 기재된 무혈청 배지 15㎖ 에, 세포 5×10⁵cells/㎖ 로 현탁하여 125㎖ 삼각 플라스크 (코닝사 제조) 로 파종하고, 회분 배양을 실시하였다. 배양은 35℃, 회전 속도는 90∼100rpm 으로 실시하고, 계대시에는 배양기 용적의 4 배량 이상의 5% CO₂ 를 함유하는 공기를 배지 상면에 통기시키고, 삼각 플라스크 중의 공기를 치환하였다. 3 일 후에 배지 교환을 실시하고, 6 일째에 파종 밀도 5×10⁵ 세포/㎖ 로 계대를 실시하였다. 이후, 3∼4 일마다 계대를 2 주간 반복하여, 세포를 무혈청 배지로 순화시켰다. 이 배양에 의해 무혈청 배지 중에서 증식시키고, 또한 응집을 일으키지 않는 세포주 pKAN-ATⅢN135Q AFM705 를 얻었다. 얻어진 주를 3.0×10⁵ 세포/㎖ 의 농도로 15㎖ 의 무혈청 배지에 현탁시키고, 125㎖ 플라스크로 파종하여 배양을 실시하였다. 배양 3 일후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중에 함유되는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 양을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용하여 측정한 결과, 배양 상청 중에 6㎍/㎖ 의 농도로 발현된다는 것을 확인하였다. 또한, pKAN-ATⅢN135Q AFMS705 주는 pKAN-ATⅢN135Q AFMS705 의 주 이름으로, 2004년 8월 10일자로 독립행정법인 산업기술 종합연구소 특허생물 기탁센터 (일본 이바라키캔 츠쿠바시 히가시 1 쵸메 1 반찌 1 츄오 다이 6) 에 FERM BP-10089 로서 기탁되어 있다.

이하에서, 실시예 4 에 기재한 방법으로, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되지 않는 복합형 당사슬을 갖는 변이형의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 취득하고, N-글리코시드 결합형 당사슬의 개수가 3 개라는 것을 확인하였다. 또한, 실시예 5 에 기재된 방법으로 이 안티트롬빈 Ⅲ 의 생물 활성을 측정한 결과, CHO/DG44 세포에서 발현시킨 변이형의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 에 비교하여 헤파린 해리 상수가 유의하게 작고, 헤파린 코팩터 활성 및 트롬빈 저해 2 차 속도 상수가 유의하게 높은 것이 확인되었다.

실시예 7 GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환시키는 탈수 반응을 촉매하는 효소의 유전자가 발현되지 않는 세포주의 취득

1. 렉틴 내성 CHO/DG44 주의 취득

CHO/DG44 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)) 를, IMDM-FBS(10)-HT(1) 배지 [소 태아 혈청 (FBS) (인비트로젠사 제조) 를 10%, HT supplement (인비트로젠사 제조) 를 1 배 농도로 함유하는 IMDM 배지 (인비트로젠사 제조)] 로 접착 배양용 플라스크 75㎠ (그라이너사 제조) 중에서 배양하여, 콘플루엔트 직전까지 증식시켰다. 5㎖ 의 둘베코 PBS (이하에서, PBS 라고 표기함) (인비트로젠사 제조) 로 세포를 세정한 후, PBS 로 희석한 0.05% 트립신 (인비트로젠사 제조) 을 1.5㎖ 첨가하여 37℃ 에서 5 분간 방치하고, 세포를 배양기 바닥면으로부터 박리시켰다. 박리시킨 세포를 통상적인 세포 배양으로 실시되는 원심 분리 조작에 의해 회수하고, 1×10⁵ 세포/㎖ 의 밀도가 되도록 IMDM-FBS(10)-HT(1) 배지를 첨가하여 현탁 후, 미첨가 또는 0.1㎍/㎖ 의 알킬화제인 MNNG (시그마사 제조) 를 첨가하였다. CO₂ 인큐베이터 (TABAI 제조) 내에서 37℃ 에서 3 일간 방치 후, 배양 상청을 제거하고, 다시 상기 기술한 조작과 동일한 조작으로 세포를 세정, 박리, 회수하여, IMDM-FBS(10)-HT(1) 배지에 현탁 후, 접착 배양용 96 웰 플레이트 (아사히 테크노글라스사 제조) 에 1000 세포/웰의 밀도로 파종하였다. 각 웰에는, 배지 중 종농도로서 1㎎/㎖ 의 렌즈콩 렉틴 (Lens culinaris agglutinin ; 이하에서, LCA 라고 표기, Vector 사 제조) 을 첨가하였다. CO₂ 인큐베이터 내에서 37℃ 에서 2 주간 배양 후, 출현한 콜로니를 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주로서 취득하였다.

2. 취득한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주의 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 mRNA 의 정량

상기 항에서 취득한 각 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주에 있어서의, GDP-만노오스를 GDP-4-케토,6-데옥시-GDP-만노오스로 변환시키는 탈수 반응을 촉매하는 효소인 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제의 발현량을 RT-PCR 법을 사용하여 이하와 같이 해석하였다.

(1) 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주로부터의 RNA 조제와 단일쇄 cDNA 의 조제

신주(新株)인 CHO/DG44 세포, 및 본 실시예의 제 1 항에서 취득한 각 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주 각각 1×10⁷ 세포로부터, Rneasy Protect Mini kit (키아겐사 제조) 를 사용하여, 첨부한 사용 설명서에 따라 RNA 를 조제하였다. 계속하여, SuperScript First-Strand synthesis system for RT-PCR (인비트로젠사 제조) 을 사용하고, 첨부한 사용 설명서에 따라 각 RNA 5㎍ 내지 20㎕ 의 반응액 중에서 단일쇄의 cDNA 를 합성하였다.

(2) RT-PCR 법을 사용한 β-액틴 유전자의 발현량 해석

본 항의 (1) 에서 제조한 각 세포주 유래의 단일쇄 cDNA 의 품질을 확실하게 하는 목적으로, β-액틴 cDNA 가 PCR 법에 의해 증식되는지를 이하와 같이 검토하였다.

본 항의 (1) 에서 제조한 각 세포주 유래의 단일쇄 cDNA 0.5㎕ 를 주형으로서 함유하는 20㎕ 의 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라 주조사 제조), 0.2mM 의 dNTP'S, 0.5 단위의 EX Taq Polymerase (다카라 주조사 제조), 0.5μM 의 서열 번호 32 와 33 의 합성 올리고 DNA 프라이머] 을 조제하고, DNA 써멀사이클러 480 (퍼킨 엘마사 제조) 을 사용하여, 94℃ 에서 5 분간 가열한 후, 94℃ 에서 1 분간, 68℃ 에서 2 분간의 사이클을 14 사이클 실시하였다. 상기의 이 PCR 반응액 10㎕ 를 아가로오스 전기 영동한 후, 사이버 그린 (BMA 사 제조) 을 사용하여 DNA 단편을 염색하고, 예상되는 약 800bp 의 DNA 단편량을 Fluor Imager SI (몰레큘러 다이너믹스사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 조제한 어느 세포주 유래의 단일쇄 cDNA 를 사용해도, 동일한 정도의 β-엑틴의 발현을 검출할 수 있었다.

(3) RT-PCR 법을 사용한 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 유전자의 발현량 해석

다음으로, 본 항 (1) 에서 취득한 각각의 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주의 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 유전자의 발현량 해석을 실시하였다. GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 유전자의 cDNA 를 PCR 법에 의해 증폭시키기 위해, 서열 번호 38 로 표시되는 CHO 세포 유래의 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제의 cDNA 서열로부터, 서열 번호 34 로 나타나는 염기 서열을 갖는 26mer 의 합성 올리고 DNA 프라이머와, 서열 번호 35 로 나타나는 염기 서열을 갖는 28mer 의 합성 올리고 DNA 프라이머를 제작하였다. 계속해서, 본 항 (1) 에서 제작한 각 세포주 유래의 단일쇄 cDNA 0.5㎕ 를 주형으로서 함유하는 20㎕ 반응액 [1×EX Taq Buffer (다카라 주조사 제조), 0.2mM 의 dNTP mixture, 0.5 단위의 Ex Taq polymerase (다카라 주조사 제조), 0.5㎛ 서열 번호 34 와 35 의 합성 DNA 프라이머] 를 조제하고, DNA 서멀 사이클러 480 (퍼킨 엘마사 제조) 을 사용하여, 94℃ 에서 5 분간 가열한 후, 94℃ 에서 1 분간, 68℃ 에서 2 분간의 사이클을 30 사이클 실시하였다. 상기의 이 PCR 반응액 10㎕ 를 아가로오스 전기 영동 후, 사이버 그린 (BMA 사 제조) 을 사용하여 DNA 단편을 염색하고, 예상되는 약 430bp 의 DNA 단편량을 Fluor Imager SI (몰레큘러 다이나믹스사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 취득한 렉틴 내성 CHO/DG44 세포주 중에, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 유전자의 발현이 관찰되지 않는 세포주가 존재하는 것을 확인하였다. 이 GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제 유전자의 발현이 관찰되지 않는 주를 CHO SM 주라고 명명하였다. 또한, 취득한 CHO SM 주의 각종 렉틴에 대한 내성을 조사한 결과, CHO SM 주는, LCA 가 인식하는 당사슬 구조와 동일한 당사슬 구조를 인식하는 렉틴, 즉, N-글리코시드 결합 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민 잔기의 6 위치와 푸코스의 1 위치가 α 결합으로 부가된 당사슬 구조를 인식하는 것 외의 렉틴에 대해서도 내성을 나타냈다. 구체적으로는, 최종 농도 1㎎/mL 의 완두콩 렉틴 (Pisum sativum Agglutinin ; 이하에서, PSA 라고 표기, Vector 사 제조) 이 첨가된 배지, 또는 최종 농도 1㎎/mL 의 들주발버섯 렉틴 (Aleuria aurantia Lectin ; 이하에서, AAL 이라고 표기, Vector 사 제조) 이 첨가된 배지에서도 내성을 갖고 있었다.

3. GDP-만노오스를 GDP-4-케토, 6-데옥시-GDP-만노오스로 변환시키는 탈수 반응을 촉매하는 효소의 유전자가 발현되어 있지 않은 세포주의 게놈 해석

CHO/DG44 세포, 및 상기 항에서 취득한 CHO SM 주를 IMDM-FBS(10)-HT(1) 배지를 사용하여 접착 세포 배양용 T75 플라스크 (그라이너사 제조) 로 콘플루엔트에 도달하기 직전까지 배양한 후, 문헌 [Nucleic Acids Research, 3, 2303,(1976)] 에 기재된 방법에 따라 게놈 DNA 를 조제하고, 취득한 게놈 DNA 를 TE-RNase 완충액 (pH 8.0)[10mmol/ℓ Tris-HCl, 1mmol/ℓ EDTA, 200㎍/㎖ RNase A] 300㎕ 에 하룻밤 동안 용해시켰다. 상기에서 조제한 게놈 DNA 12㎍ 을, 3 종의 다른 제한 효소, EcoRI (다카라 주조사 제조), HindⅢ (다카라 주조사 제조), BglⅡ (다카라 주조사 제조) 로 각각 소화시키고, 에탄올 침전법을 사용하여 DNA 단편을 회수한 후, TE 완충액 (pH 8.0) [10mmol/ℓ Tris-HCl, 1mmol/ℓ EDTA] 20㎕ 에 용해시키고, 0.8% (w/v) 아가로오스 젤 전기 영동에 제공하였다. 영동 후, 문헌 [Proceeding of the National Academy of Science (Proc. Natl. Acad. Sci. USA), 76, 3683, (1979)] 에 기재된 방법에 따라, 나일론막에 게놈 DNA 를 전사하였다. 전사 종료 후, 나일론막에 대해 80℃ 에서 2 시간의 열 처리를 실시하였다. 다음으로, 나일론 멤브레인에 전사된 게놈 DNA 의 품질을 확인할 목적으로, 세포주를 막론하고 게놈 중에 균등하게 존재한다고 생각되는 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제 (FUT8) 유전자를 프로브로 한 서던 하이브리다이제이션을 실시하였다. FUT8 유전자를 검출하기 위한 프로브는 이하와 같이 조제하였다. 먼저, WO02/31140호의 실시예 11 에 기재된 마우스 FUT8 cDNA 를 포함하는 플라스미드 mfFUT8-pCR2.1 10㎍ 을 50㎕ 의 M buffer (다카라 주조사 제조) 에 용해시키고, 제한 효소 HindⅢ (다카라 주조사 제조) 로 하룻밤 동안 소화시킨 후, 반응액을 H buffer (다카라 주조사 제조) 로 치환하고, 제한 효소 EcoRI (다카라 주조사 제조) 로 추가로 하룻밤 동안 소화 반응을 실시하였다. 반응 종료 후, 상기 반응액을 2% 아가로오스 전기 영동에 제공하여, FUT8 유전자 엑손 2 를 포함하는 156bp 의 EcoRI-HindⅢ 단편을 정제하였다. 얻어진 DNA 단편 25ng 에 대해, [α-³²P]dCTP 1.75MBq 및 Megaprime DNA labeling system, dCTP (아마샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용하여 방사 표지하였다. 다음으로, 하이브리다이제이션을 이하와 같이 실시하였다. 먼저, 상기 나일론막을 롤러 보틀에 밀봉하고, 하이브리다이제이션액 [4×SSPE, 5×Denhaldt's 액, 0.5% (w/v) SDS, 0.1㎎/㎖ 연어 정자 DNA] 15㎖ 를 첨가하여 65℃ 에서 3 시간의 프레하이브리다이제이션을 실시하였다. 다음으로, ³²P 표지한 프로브 DNA 를 열 변성하여 보틀에 투입하고, 65℃ 에서 하룻밤 동안 가온하였다. 하이브리다이제이션 후, 나일론막을 2×SSC-0.1% (w/v) SDS 50㎖ 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 상기의 세정 조작을 2 회 반복한 후, 막을 0.2×SSC-0.1% (w/v) SDS 50㎖ 에 침지시키고, 65℃ 에서 15 분간 가온하였다. 세정 후, 나일론막을 X 선 필름에 -80℃ 에서 이틀밤 노출시켜서 현상하였다. 현상 후, 나일론막을 스트립핑액 [1% SDS, 0.1×SSC] 중에서 끓임으로써 프로브를 박리시키고, 다시 다른 프로브에서의 하이브리다이제이션에 제공하는 것으로 하였다. 상기의 방법에 의해, CHO/DG44 주 및 CHO SM 주 중 어느 게놈 DNA 에서도, FUT8 유전자 엑손 2 에 특이적인 단편이 검출되었다. 이상의 결과로부터 나일론막 상에 전사된 CHO SM 주 및 CHO/DG44 주 유래의 게놈 DNA 는 동일한 품질을 갖고 있는 것이 나타났다.

한편, GMD 유전자 엑손 5 에 특이적인 프로브를 이하와 같이 조제하였다. 먼저, 공지된 인간 GMD 게놈 DNA 서열 (NCBI 액세션 번호 NT_034880) 을 기초로, 엑손 5 에 특이적으로 결합하는 올리고 DNA 프라이머 (서열 번호 36 및 서열 번호 37) 를 설계하였다. 상기 영역은 서열 번호 39 에 기재된 인간 GMD cDNA 서열의 염기 번호 346 내지 염기 번호 538 에 상당한다. 다음으로, WO02/31140호의 실시예 15 에 기재된 플라스미드 pAGE249GMD 를 10ng 함유하는 100㎕ 의 반응액 [ExTaq buffer (다카라 주조사 제조), 0.2mmol/L dNTPs, 2.5㎛ol/L 상기 유전자 특이적 프라이머 (서열 번호 36 및 서열 번호 37)] 를 조제하고, 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 을 실시하였다. PCR 은 94℃ 에서 5 분간의 가열 후, 94℃ 에서 1 분간, 58℃ 에서 2 분간, 72℃ 에서 3 분간으로 이루어지는 반응을 1 사이클로 한 30 사이클의 조건으로 실시하였다. PCR 후, 반응액을 2% 아가로오스 전기 영동에 제공하고, 약 200bp 의 DNA 단편을 정제하였다. 얻어진 DNA 단편 25ng 에 대해, [α-³²P]dCTP 1.75MBq 및 Megaprime DNA labeling system, dCTP (아마샴 바이오사이언스사 제조) 를 사용하여 방사 표지하였다. 이 프로브를 상기에서 나타낸 나일론막에 대해 하이브리다이제이션을 실시하였다. 그 결과, CHO/DG44 세포 유래의 게놈 DNA 에서는 GMD 유전자 엑손 5 의 특이적 단편이 발견된 데 반해, CHO SM 주 유래의 게놈 DNA 에서는 GMD 유전자 엑손 5 의 특이적 단편이 전혀 검출되지 않았다. 이상의 결과로부터 CHO SM 주는 GMD 를 코드하는 게놈 영역 중, 적어도 엑손 5 를 포함하는 영역을 결손시킨 GMD 녹아웃 세포인 것이 나타났다.

실시예 8 CHO SM 주로의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 발현

1. CHO SM 주로의 ATⅢ 발현 플라스미드의 도입

실시예 7 에서 제조된 CHO SM 주에, 실시예 2 의 제 3 항에서 제조한 플라스미드 pKAN-ATⅢ 를 안정적으로 도입하였다. 이들의 유전자 도입은 공지된 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 의해 이하의 순서로 실시하였다. 먼저, 플라스미드 pKAN-ATⅢ 30㎍ 을 NEBuffer 3 (New England Biolabs 사 제조) 20㎕ 와 100 단위의 제한 효소 MluI (New England Biolabs 사 제조) 를 포함하는 200㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시함으로써 선 형상화하였다. 반응 후, 상기 반응액에 대해 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전에 의해 정제를 실시하여, 선 형상화 플라스미드를 회수하였다. 다음으로, 실시예 7 에서 취득한 CHO SM 주를 K-PBS 완충액 (137mmol/L KCl, 2.7mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na₂HPO₄, 1.5mmol/L KH₂PO₄, 4.0mmol/L MgCl₂) 에 현탁하여 8×10⁷ 세포/mL 로 하였다. 세포 현탁액 200㎕ (1.6×10⁶개) 와 상기의 선 형상화 플라스미드 9㎍ 을 혼화한 후, 세포-DNA 혼화액의 전량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2mm) (BIO-RAD 사 제조) 로 옮기고, 일렉트로포레이션 장치 Gene Pulser (BIO-RAD 사 제조) 를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250㎌ 의 조건으로 유전자 도입을 실시하였다. 유전자 도입을 실시한 후, 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청 (Life Technologies 사 제조) 및 50㎍/㎖ 젠타마이신 (나카라이테스크사 제조) 을 첨가한 IMDM 배지 (Life Technologies 사 제조) 30㎖ 에 현탁시키고, 접착 세포 배양 96 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 3 장에 100㎕/웰에 파종하였다. 배양은 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 실시하였다.

2. MTX 내성주의 취득

상기 항에서 얻은 pKAN-ATⅢ 도입 세포를 6 일간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL 젠타마이신 및 50nM MTX (시그마사 제조) 를 첨가한 IMDM 배지를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 이 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하면서 9 일간의 배양을 실시하였다. 이어서, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL gentamicin 및 200nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 동일하게 3∼4 일마다 반복하면서 18 일간 배양하고, 최종적으로 형성된 콜로니를 24 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 에 옮겨 심었다. 또한, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL gentamicin 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하여 적당하게 확대하면서 19 일간 배양을 실시하여, 500nM MTX 내성주를 취득하였다.

3. 안티트롬빈 Ⅲ 고생산주의 선별

상기 항에서 취득한 복수의 500nM MTX 내성주로부터, 각 1.0×10⁶ 세포를 5mL 의 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/mL gentamicin 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지에 현탁시키고, T25 플라스크에 파종하여 배양을 실시하였다. 배양 3 일 후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중에 포함되는 ATⅢ 양을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 를 사용하여 측정하였다. 그 결과, 배양 상청 중에 513ng/mL 의 농도로 유전자 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 가 발현되어 있는 것을 확인하고, 이 형질 전환주를 pKAN-ATⅢ1 GMDKO 주라고 명명하였다.

이하에서, 실시예 4 에 기재한 방법으로, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬을 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 취득하였다. 또한, 실시예 5 에 기재한 방법에 의해 이 안티트롬빈 Ⅲ 의 생물 활성을 측정하고, GMD 녹아웃 세포로 발현시킨 유전자 재조합 안티트롬빈은, CHO/DG44 세포로 발현시킨 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 와 비교하여 헤파린 해리 상수가 유의하게 작고, 헤파린 코팩터 활성과 트롬빈 저해 2 차 속도 상수가 유의하게 높은 것을 확인하였다.

실시예 9 CHO SM 주에 의한 아미노산 개변된 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 발현

1. CHO SM 주로의 ATⅢN135Q 발현 플라스미드의 도입

실시예 7 에서 제조한 CHO SM 주에, 실시예 6 의 제 2 항에서 제조한 플라스미드 pKAN-ATⅢN135Q 를 도입하였다. 이들의 유전자 도입은 공지된 일렉트로포레이션법 [Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 에 의해 이하의 순서로 실시하였다. 먼저, 플라스미드 pKAN-ATⅢN135Q 30㎍ 을 NEBuffer 3 (New England Biolabs 사 제조) 20㎕ 와 100 단위의 제한 효소 MluI (New England Biolabs 사 제조) 를 포함하는 200㎕ 의 반응액을 조제하고, 37℃ 에서 16 시간 소화 반응을 실시함으로써 선 형상화하였다. 반응 후, 이 반응액에 대해 페놀/클로로포름 추출 처리 및 에탄올 침전에 의해 정제를 실시하고, 선 형상화 플라스미드를 회수하였다. 다음으로, 실시예 7 에서 취득한 CHO SM 주를 K-PBS 완충액 (137mmol/L KCl, 2.7mmol/L NaCl, 8.1mmol/L Na₂HPO₄, 1.5mmol/L KH₂PO₄, 4.0mmol/L MgCl₂) 에 현탁하여 8×10⁷ 세포/㎖ 로 하였다. 세포 현탁액 200㎕ (1.6×10⁶개) 과 상기의 선 형상화 플라스미드 9㎍ 을 혼화한 후, 세포-DNA 혼화액의 전량을 Gene Pulser Cuvette (전극간 거리 2mm) (BIO-RAD 사 제조) 에 옮기고, 일렉트로포레이션 장치 Gene Pulser (BIO-RAD 사 제조) 를 사용하여 펄스 전압 350V, 전기 용량 250㎌ 의 조건으로 유전자 도입을 실시하였다. 유전자 도입을 실시한 후, 세포 현탁액을 10% 소 태아 혈청 (Life Technologies 사 제조) 및 50㎍/㎖ gentamicin (나카라이테스크사 제조) 을 첨가한 IMDM 배지 (Life Technologies 사 제조) 30㎖ 에 현탁시키고, 접착 세포 배양 96 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 3 장에 100㎕/웰로 파종하였다. 배양은 5% CO₂, 37℃ 의 조건 하에서 실시하였다.

2. MTX 내성주의 취득

상기 항에서 얻은 pKAN-ATⅢN135Q 도입 세포를 6 일간 배양한 후, 배양 상청을 제거하고, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 50nM MTX (시그마사 제조) 를 첨가한 IMDM 배지를 100㎕/웰씩 첨가하였다. 이 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하면서 9 일간의 배양을 실시하였다. 이어서, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 200nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지교환 작업을 동일하게 3∼4 일마다 반복하면서 18 일간 배양하고, 최종적으로 형성된 콜로니를 24 웰 플레이트 (그라이너사 제조) 에 옮겨 심었다. 또한, 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지를 사용한 배지 교환 작업을 3∼4 일마다 반복하고, 적당하게 확대하면서 19 일간 배양을 실시하여, 500nM MTX 내성주를 취득하였다.

3. ATⅢN135Q 고생산주의 선별

상기 항에서 취득한 복수의 500nM MTX 내성주로부터, 각 1.0×10⁶ 세포를 5㎕ 의 10% 투석 소 태아 혈청, 50㎍/㎖ 젠타마이신 및 500nM 의 MTX 를 첨가한 IMDM 배지에 현탁시키고, T25 플라스크에 파종하여 배양을 실시하였다. 배양 3 일후에 배양 상청을 회수하고, 상청 중에 함유되는 ATⅢN135Q 양을 ELISA for antithrombin (ATⅢ) kit (Affinity Biological 사 제조) 을 사용하여 측정하여, 고생산주를 수립하였다. 방법은 첨부 메뉴얼을 따르고, 표준품에는 노이아트 (미츠비시 웰퍼머사 제조) 를 사용하였다. 그 결과, 얻어진 안티트롬빈 Ⅲ 발현주의 배양 상청 중에 45.4ng/mL 의 농도로 안티트롬빈 Ⅲ 가 발현되고 있는 것을 확인하고, 이 형질 전환주를 pKAN-ATⅢN135Q GMDKO 주라고 명명하였다.

이하에서, 실시예 4 에 기재한 방법으로, 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬을 갖는 변이형의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 취득하고, N 결합형 당사슬의 개수가 3 개인 것을 확인하였다. 또한, 실시예 5 에 기재한 방법으로 이 안티트롬빈 Ⅲ 의 생물 활성을 측정하고, GMDKO 세포로 발현시킨 변이형의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 는, CHO/DG44 세포로 발현시킨 변이형의 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 와 비교하여 헤파린 해리 상수가 유의하게 작고, 헤파린 코팩터 활성과 트롬빈 저해 2 차 속도 상수가 유의하게 높은 것을 확인하였다.

실시예 10. 효모에 의한 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 의 발현

효모에는 많은 종류가 알려져 있지만, 재조합 단백질을 발현시키는 숙주로서 종종 사용되는 대표적인 효모로서, 피키아 (Pichia) 속과 사카로마이세스 (Saccaromyces) 속의 효모를 들 수 있다. 통상적으로 이들의 효모가 발현되는 재조합 단백질에 부가되는 N-결합형 당사슬의 주요한 구조는, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측의 분기 부분에 9 개 내지 몇십 개의 만노오스 잔기와, 몇 개 내지 몇십 개의 만노오스 6-인산 잔기를 갖는 하이 만노오스형 당사슬인 것이 알려져 있다 (Yeast 19, 1191 (2002)). 또, 이러한 구조를 갖는 하이 만노오스형 당사슬은, 종종 하이퍼 만노오스형 당사슬라고도 불린다.

이하에 기재하는 실시예에서는 우선, 주로 부가되는 N-결합형 당사슬의 구조로서, 하이 만노오스형 당사슬와 복합형 당사슬의 중간의 구조인, 하이브리드형 당사슬이 주로 부가된 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 피키아 효모주와 사카로마이세스 효모주의 제조 방법에 대하여 기재한다.

1. 게놈 상에 존재하는 PNO1 효소 유전자를 파괴한 피키아 효모주의 제조

피키아 효모주, 예컨대 Pichia pastoris GTS115 주 (인비토로젠사 제조) 등의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, PCR 법에 의해, 피키아 효모의 PNO1 (phosphomannosylation of N-linked oligosaccharides 1) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : AB099514) 의 번역 영역 전체 길이의 서열을 증폭시킨다. 증폭시킨 약 3200 염기 길이의 PNO1 유전자 서열은, 그 5' 말단측 절반 정도의 서열을, 효모 유래의 orotidine-5'-phosphate decarboxylase (URA3) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : AF321098) 로 치환한 후, pCR2.1-TOPO 벡터 (인비트로젠사 제조) 등의 벡터에 삽입함으로써, PNO1 유전자 파괴용 플라스미드를 제조한다. 다음으로, 이 플라스미드 100㎍ 을 제한 효소로 선 형상화한 후, Pichia Expression Kit (인비트로젠사 제조) 에 기재된 일렉트로포레이션법에 의해, 예컨대, GTS115 주 등의 피키아 효모에 안정적으로 유전자 도입을 실시한다. 다음으로, 유전자를 도입한 효모를, 우라실을 결손시킨 YPD 배지 (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 실온에서 배양하고, 증식한 각 콜로니로부터 게놈 DNA 를 추출한다. 다음으로, 이 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 효모 PNO1 유전자 자리의 서열을 증폭시킴으로써, 상동 재조합에 의해 PNO1 유전자 자리가 파괴된 효모 클론을 선택한다. 상기의 방법에 의해, 피키아 효모가 발현되는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측에 9 개 내지 몇십 개의 만노오스 잔기가 결합된 구조를 가진 하이 만노오스형 당사슬로 개변할 수 있다.

2. 게놈 상에 존재하는 α-1,6-만노오스 전이 효소 유전자를 파괴한 피키아 효모주의 제조

피키아 효모주, 예컨대 Pichia pastoris X-33 주 (인비트로젠사 제조) 등의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, PCR 법에 의해, 피키아 효모의 α-1,6-만노오스 전이 효소 (OCH1) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : AF540063) 를 증폭시킨다. 증폭시킨 약 2800 염기 길이의 OCH1 유전자 서열은, 그 5' 말단측 절반 정도의 서열을, 효모 유래의 orotidine-5'-phosphate decarboxylase (URA3) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : AF321098) 로 치환한 후, pCR2.1-TOPO 벡터 (인비트로젠사 제조) 등의 벡터에 삽입 함으로써, OCH1 유전자 파괴용 벡터가 제조된다. 다음으로, 이 벡터 100㎍ 을 제한 효소 Sfi I (New England Biolabs 사 제조) 로 선 형상화한 후, Pichia Expression Kit (인비트로젠사 제조) 에 기재된 일렉트로포레이션법에 의해, 피키아 효모주, 예컨대 앞의 항에 기재된 PNO1 유전자 파괴주나, Pichia pastoris JC308 주 등에 대해 안정적인 유전자 도입을 실시한다. 다음으로, 유전자를 도입한 효모를, 우라실을 결손시킨 YPD 배지 (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 실온에서 배양하고, 증식한 각 콜로니로부터 게놈 DNA 를 추출한다. 다음으로, 이 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 효모 OCH1 유전자 자리의 서열을 증폭시킴으로써, 상동 재조합에 의해 OCH1 유전자 자리가 파괴된 효모 클론주를 선택한다. 상기의 방법에 의해, 피키아 효모가 발현되는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측에 8 개의 만노오스 잔기가 결합된 구조를 가진 Man8 형 하이 만노오스형 당사슬로 개변할 수 있다.

3. 재조합 키메라형 α-1,2-만노시다아제 유전자를 도입한 피키아 효모주의 제조

선충 (Caenorhabditis elegans) 으로부터 RNeasy Mini Kit (키아겐사 제조) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출하고, 다음으로, 이 RNA 를 주형으로 하여 Superscript^TM first-strand cDNA synthesis kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 first-strand cDNA 를 조제한다. 다음으로, 이 cDNA 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, 선충 α-1,2-만노시다아제 (GenBank 액세션 넘버 : NM_073594) 의 활성 도메인을 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 그 5' 말단측에, 효모의 α 만노시다아제 (MNS1) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : M63598) 의 리더 펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터 pPICZ (인비트로젠사 제조) 등의 벡터에 삽입하고, 효모의 소포체 내에 α-1,2-만노시다아제를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를 앞서의 항에 기재한 PNO1 유전자와 OCH1 유전자의 쌍방의 유전자를 상동 재조합으로 파괴한 피키아 효모주에 대해, 일렉트로포레이션법에 의해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 우라실을 결손하여 제오신 (인비트로젠사 제조) 을 함유하는 YPD 배지 (인비트로젠사 제조) 로 실온에서 배양하고, 증식한 각 콜로니로부터 전체 RNA 를 추출한다. 다음으로, 이 전체 RNA 로부터 조제한 first-strand cDNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 재조합 키메라형 α-1,2-만노시다아제의 발현이 관찰된 효모 클론주를 선택한다. 상기의 방법에 의해, 피키아 효모가 발현되는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측에 5 개의 만노오스 잔기가 결합된 구조를 가진 Man5 형 하이 만노오스형 당사슬로 개변할 수 있다.

4. 재조합 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터 유전자를 도입한 피키아 효모주의 제조

효모 (Kluyveromyces lactis) 로부터 RNeasy Mini Kit (키아겐사 제조) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출하고, 다음으로, 이 RNA 를 주형으로 하여 Superscript^TM first-strand cDNA synthesis kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 cDNA 를 조제한다. 다음으로, 이 cDNA 를 주형으로 하여, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, 효모 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터의 번역 영역 전체 길이를 코드하는 cDNA (GenBank 액세션 넘버 : AF106080) 를 특이적으로 증폭시킨다. 다음으로, 증폭시킨 약 3700 염기 길이의 cDNA 를, 효모용의 발현 벡터 pPIC3.5K (인비트로젠사 제조) 등의 벡터의 알코올옥시게나아제 프로모터 서열의 하류에 위치하는 제한 효소 EcoR I 절단 부위와 Not I 절단 부위 사이에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 앞서의 항에 기재한 α-1,2-만노시다아제 유전자를 도입한 피키아 효모주에 대해, 일렉트로포레이션법에 의해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 약제 G418 (나카라이테스크사 제조) 을 함유하는 YPD 배지로 실온에서 배양하고, 증식한 각 콜로니로부터 전체 RNA 를 추출한다. 다음으로, 이 전체 RNA 로부터 조제한 cDNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 재조합 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터의 발현이 관찰된 효모 클론주를 선택한다.

5. 재조합 키메라형 N-아세틸글루코사민 전이 효소-I 유전자를 도입한 피키아 효모주의 제조

인간 간장 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, N-아세틸글루코사민 전이 효소-I (GenBank 액세션 넘버 : M55621) 의 활성 도메인을 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 그 5' 말단측에, 효모의 만노오스 전이 효소 (MNN9) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : L23752) 의 리더 펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터 pAUR123 (다카라 바이오사 제조) 등의 벡터의 알코올데히드로게나아제 프로모터 서열의 하류에 위치하는 제한 효소 Kpn I 절단 부위와 Xba I 절단 부위 사이에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 N-아세틸글루코사민 전이 효소-I 를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 앞서의 항에 기재한, UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터 유전자를 도입한 피키아 효모주에 대해, 발현 벡터 pAUR123 에 첨부된 메뉴얼에 게재된 아세트산리튬법에 따라서 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 약제 오로브러시딘 A (다카라 바이오사 제조) 를 함유하는 YPD 배지로 실온에서 배양하고, 증식한 각 콜로니로부터 전체 RNA 를 추출한다. 다음으로, 이 전체 RNA 로부터 조제한 cDNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 재조합 N-아세틸글루코사민 전이 효소-I 의 발현이 관찰된 효모 클론주를 선택한다. 상기의 방법에 의해, 피키아 효모가 발현되는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측에 5 개의 만노오스 잔기가 결합된 Man5 형 하이 만노오스형 당사슬의 비환원 말단측에, N-아세틸글루코사민 잔기가 1 개 부가된 구조를 갖는 하이브리드형 당사슬로 개변할 수 있다.

이상, N-결합형 당사슬로서, 하이 만노오스형 당사슬와 복합형 당사슬의 중간의 구조인, 하이브리드형 당사슬을 주요하게 발현시키는 피키아 효모주의 제작 방법에 대하여 기재하였다. 상기 기술한 피키아 효모 이외에, 재조합 단백질을 발현시키는 숙주로서 종종 사용할 수 있는 효모로서, 사카로마이세스 (Saccharomyces) 속의 효모를 들 수 있다. 이하에서, N-결합형 당사슬로서 하이브리드형 당사슬을 주요하게 발현시키는 사카로마이세스 효모주의 제조 방법에 대하여 서술한다.

6. 게놈 상에 존재하는 α-1,6-만노오스 전이 효소 유전자와 α-1,3-만노오스 전이 효소 유전자를 파괴한 사카로마이세스 효모주의 제조

Nakayama 등의 방법 (EMBO Journal, 11, 2511 (1992)) 에 따라, 상동 재조합에 의해 OCH1 유전자 자리가 파괴된 효모 클론을 선택한다. 얻어진 OCH1 유전자가 파괴된 사카로마이세스 효모주는, Sherman 등의 방법 (Methods in Enzymology 194, 21 (1991)) 에 따라, 반수체 세포를 유도한 후, α-1,3-만노오스 전이 효소(MNN1) 유전자가 파괴된 변이 효모주 LB1-10B (캘리포니아 대학 Yeast Genetic Stock Center) 의 반수체 세포와 혼합하고, 질소가 결핍된 조건으로 배양함으로써, 2 배체의 접합자를 형성시킨다. 다음으로, 얻어진 접합자를, 우라실과 로이신을 결손시킨 YPD 배지로 실온에서 배양하고, 증식된 각 콜로니로부터 게놈 DNA 를 추출한다. 다음으로, 이 게놈 DNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 효모 OCH1 유전자 자리의 서열 (GenBank 액세션 넘버 : AF540063) 과, MNN1 유전자 자리의 서열 (GenBank 액세션 넘버 : AF540063L23753) 을 각각 증폭시킴으로써, OCH1 유전자 자리와 MNN1 유전자 자리의 쌍방이 파괴된 효모 클론주를 선택한다. 상기의 방법에 의해, 사카로마이세스 효모가 발현되는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측에 8 개의 만노오스 잔기가 결합된 구조를 갖는 Man8 형 하이 만노오스형 당사슬로 개변할 수 있다.

7. 재조합 키메라형 α-1,2-만노시다아제 유전자를 도입한 사카로마이세스 효모주의 제조

곰팡이 (Aspergillus saitoi) 로부터 RNeasy Mini Kit (키아겐사 제조) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출하고, 다음으로, 이 RNA 를 주형으로 하여 Superscript^TM first-strand cDNA synthesis kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 cDNA 를 조제한다. 다음으로, 이 cDNA 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, 곰팡이α-1,2-만노시다아제의 번역 영역 전체 길이를 코드하는 cDNA (GenBank 액세션 넘버 : D49827) 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 약 1500 염기 길이의 cDNA 는, 그 번역 종지 코돈을 삭제한 3' 말단측에 효모의 소포체 국재(局在) 시그널 펩티드 (엠보저널 7,913 (1988)), 즉 히스티딘-아스파라긴산-글루타민산-루신을 코드하는 cDNA 서열과 번역 종지 코돈을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터 pPICZ (인비트로젠사 제조) 등의 벡터에 삽입하고, 효모의 소포체 내에 α-1,2-만노시다아제를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 앞서의 항에 기재한, α-1,6-만노오스 전이 효소 유전자와 α-1,3-만노오스 전이 효소 유전자를 파괴한 사카로마이세스 효모주에 대해, 일렉트로포레이션법에 의해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 우라실을 결손하고 제오신 (인비트로젠사 제조) 을 함유하는 YPD 배지 (인비트로젠사 제조) 로 실온에서 배양하고, 증식한 각 콜로니로부터 전체 RNA 를 추출한다. 다음으로, 이 전체 RNA 로부터 조제한 cDNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 재조합 키메라형 α-1,2-만노시다아제의 발현이 관찰된 효모 클론주를 선택한다. 상기의 방법에 의해, 사카로마이세스 효모가 발현되는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측에 5 개의 만노오스 잔기가 결합된 구조를 갖는 Man5 형 하이 만노오스형 당사슬로 개변할 수 있다.

8. 재조합 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터 유전자를 도입한 사카로마이세스 효모주의 제조

효모 (Kluyveromyces lactis) 로부터 RNeasy Mini Kit (키아겐사 제조) 를 사용하여 전체 RNA 를 추출하고, 다음으로, 이 RNA 를 주형으로 하여 Superscript^TM first-strand cDNA synthesis kit (인비트로젠사 제조) 를 사용하여 cDNA 를 조제한다. 다음으로, 이 cDNA 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, 효모 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터의 번역 영역 전체 길이를 코드하는 cDNA (GenBank 액세션 넘버 : AF106080) 를 특이적으로 증폭시킨다. 다음으로, 증폭시킨 약 3700 염기 길이의 cDNA 를, 효모용의 발현 벡터 pPIC3.5K (인비트로젠사 제조) 등의 벡터의 알코올옥시게나아제 프로모터 서열의 하류에 위치하는 제한 효소 EcoR I 절단 부위와 Not I 절단 부위 사이에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를 앞서의 항에 기재한 α-1,2-만노시다아제 유전자를 도입한 사카로마이세스 효모주에 대해, 일렉트로포레이션법에 의해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 약제 G418 (나카라이테스크사 제조) 을 함유하는 YPD 배지로 실온에서 배양하고, 증식한 각 콜로니로부터 전체 RNA 를 추출한다. 다음으로, 이 전체 RNA 로부터 조제한 cDNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 재조합 UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터의 발현이 관찰된 효모 클론주를 선택한다.

9. 재조합 키메라형 N-아세틸글루코사민 전이 효소-I 유전자를 도입한 사카로마이세스 효모주의 제조

인간 간장 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, N-아세틸글루코사민 전이 효소-I (GenBank 액세션 넘버 : M55621) 의 활성 도메인을 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 그 5' 말단측에, 효모의 만노오스 전이 효소 (MNN9) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : L23752) 의 리더 펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터 pAUR123 (다카라 바이오사 제조) 등의 벡터의 알코올데히드로게나아제 프로모터 서열의 하류에 위치하는 제한 효소 Kpn I 절단 부위와 Xba I 절단 부위 사이에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 N-아세틸글루코사민 전이 효소-I 를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 앞서의 항에 기재한, UDP-N-아세틸글루코사민 트랜스포터 유전자를 도입한 사카로마이세스 효모주에 대해, 발현 벡터 pAUR123 에 첨부한 메뉴얼에 게재된 아세트산리튬법에 의해 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 약제 오로브러시딘 A (다카라 바이오사 제조) 를 함유하는 YPD 배지로 실온에서 배양하고, 증식된 각 콜로니로부터 전체 RNA 를 추출한다. 다음으로, 이 전체 RNA 로부터 조제한 cDNA 를 주형으로 한 PCR 법에 의해, 재조합 N-아세틸글루코사민 전이 효소-I 의 발현이 관찰된 효모 클론주를 선택한다. 상기의 방법에 의해, 사카로마이세스 효모가 발현되는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 비환원 말단측에 5 개의 만노오스 잔기가 결합된 구조를 갖는 Man5 형 하이 만노오스형 당사슬의 비환원 말단측에, N-아세틸글루코사민 잔기가 1 개 부가된 하이브리드형 당사슬로 개변할 수 있다.

이상과 같이, N-결합형 당사슬로서 Man5 형 하이 만노오스형 당사슬의 비환원 말단측에 N-아세틸글루코사민 잔기가 1 개 부가된, 하이브리드형 당사슬을 주요하게 발현시키는 피키아 효모주 또는 사카로마이세스 효모주의 제작 방법에 대하여 서술하였다. 다음으로, 이들의 효모주를 숙주로서 사용하고, N-결합형 당사슬로서 하이브리드형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 조제 방법에 대하여 서술한다.

10. 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 발현 벡터의 제작

Yamauchi 등의 방법 (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 56, 600 (1992)) 에 따라, 인간 간장 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 증폭용 효소로서 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 반응에 의해, 성숙형 인간 안티트롬빈 Ⅲ 의 전체 길이를 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 다음으로, 얻어진 cDNA 를, 효모용의 발현 벡터 pPIC6α (인비트로젠사 제조) 등의 벡터의 알코올옥시게나아제 프로모터 서열의 하류에 위치하는 제한 효소 ClaI 절단 부위와 XbaI 절단 부위 사이에 삽입하고, 성숙형 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 분비 발현시키는 벡터 pPIC6α/hATⅢ 를 제조한다.

11. 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 유전자를 도입한 효모주의 제조

상기 기술한 성숙형 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 분비 발현시키는 벡터 pPIC6α/hATⅢ 100㎍ 을 제한 효소 SalI (New England Biolabs 사 제조) 로 HIS4 유전자 내를 절단하고, 페놀 클로로포름 추출과 에탄올 침전에 의해, 선 형상화 벡터를 조제한다. 다음으로, Mochizuki 등의 방법 (Protein Expression and Purification 23, 55 (2001)) 에 따라, 이 선 형상화한 안티트롬빈 Ⅲ 발현 벡터를, 상기 기술한 본 실시예의 제 5 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 주로 하이브리드형 당사슬을 발현시키는 피키아 효모주, 또는 본 실시예의 제 9 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 주로 하이브리드형 당사슬을 발현시키는 사카로마이세스 효모주에 대해, 아세트산 리튬법에 의해 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 약제 블라스토시딘 (인비트로젠사 제조) 을 함유하는 YPD 배지 (인비트로젠사 제조) 로 실온에서 배양하고, 블라스토시딘 내성 콜로니를 취득한다. 다음으로, 블라스토시딘 내성 콜로니를 액체 YPD 배지 (인비트로젠사 제조) 에 이식하고, 30℃ 에서 24 시간 이상의 회분 배양을 실시한다. 배양 후에 얻어지는 배양 상청은, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 의약품 노이아트 (미츠비시 웰퍼머사 제조) 등을 표준품으로 하고, 인간 안티트롬빈 Ⅲ 에라이저 키트 (어피니티 바이오로디컬즈사 제조) 를 사용하여 분석한다. 이 분석에 의해, 배양 상청 중에 포함되는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 검출하고, 그 농도를 측정하는 것이 가능하다. 이 효모 배양 상청 중에 분비된 N-결합형 당사슬로서 푸코스를 함유하지 않는 하이브리드형 당사슬을 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 는, 실시예 4 에 기재한 방법으로 정제가 가능하다. 또, 정제된 안티트롬빈 Ⅲ 단백질은, 상기 실시예 4 에 기재한 방법으로, 당사슬 구조의 해석이 가능하다.

이상과 같이, N-결합형 당사슬로서, Man5 형 하이 만노오스형 당사슬의 비환원 말단측에 N-아세틸글루코사민 잔기가 1 개 부가된 하이브리드형 당사슬을 주요하게 발현시키는 피키아 효모주, 또는 동일하게 개변된 사카로마이세스 효모주를 숙주로서 사용하고, N-결합형 당사슬로서 푸코스를 함유하지 않는 하이브리드형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 조제할 수 있는 것을 기술하였다. 다음으로, 이 N-결합형 당사슬로서 하이브리드형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주를 사용하여, N-결합형 당사슬로서 푸코스를 함유하지 않는 복합 이중쇄형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주를 제조하는 방법에 대해서 이하에 기재한다.

12. 재조합 키메라형 α 만노시다아제 II 유전자를 도입한 효모주의 제조

인간 조직 유래, 예컨대 간장 유래의 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, α 만노시다아제 Ⅱ (GenBank 액세션 넘버 : U31520) 의 활성 도메인을 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 그 5' 말단측에 효모의 만노오스 전이 효소 (MNN9) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : L23752) 의 리더 펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터의 프로모터 서열의 하류에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 α 만노시다아제 Ⅱ 를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 본 실시예의 제 11 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 하이브리드형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주에 대해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 영양 요구성과 약제 내성을 지표로 하여 클론을 선발한 후, RT-PCR 에 의해 키메라형 α 만노시다아제 Ⅱ 의 발현을 확인한다.

13. 재조합 키메라형 N-아세틸글루코사민 전이 효소-Ⅱ 유전자를 도입한 효모주의 제작

인간 조직 유래, 예컨대, 간장 유래의 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, N-아세틸글루코사민 전이 효소-Ⅱ (GenBank 액세션 넘버 : U15128) 의 활성 도메인을 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 그 5' 말단측에, 효모의 만노오스 전이 효소 (MNN9) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : L23752) 의 리더 펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터의 프로모터 서열의 하류에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 N-아세틸글루코사민 전이 효소-Ⅱ 를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 앞서의 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 하이브리드형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주에 키메라형 α 만노시다아제 Ⅱ 를 안정적으로 도입한 효모주에 대해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 영양 요구성과 약제 내성을 지표로 하여 클론을 선발한 후, RT-PCR 에 의해, 키메라형 N-아세틸글루코사민 전이 효소-Ⅱ 의 발현을 확인한다. 상기의 방법에 의해, 키메라형 N-아세틸글루코사민 전이 효소-Ⅱ 가 안정적으로 삽입된 효모주가 발현되는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 가 갖는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 그 비환원 말단측에 3 개의 만노오스 잔기가 2 분기하는 구조로 결합하고, 2 개의 비환원 말단의 각각 N-아세틸글루코사민 잔기가 1 개씩 부가된, 푸코스를 함유하지 않는 복합 이중쇄형 당사슬로 개변할 수 있다.

14. 재조합 UDP-갈락토오스 트랜스포터 유전자를 도입한 효모주의 제조

인간 조직 유래, 예컨대, 간장 유래의 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, UDP-갈락토오스 트랜스포터 (GenBank 액세션 넘버 : AB042425) 의 번역 영역 전체 길이를 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 효모용의 발현 벡터의 프로모터 서열의 하류에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 UDP-갈락토오스 트랜스포터를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를 앞서의 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 미숙한 복합 이중쇄형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주에 대해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 영양 요구성과 약제 내성을 지표로 하여 클론을 선발한 후, RT-PCR 에 의해, UDP-갈락토오스 트랜스포터의 발현을 확인한다.

15. 재조합 키메라형 β-1,4갈락토오스 전이 효소 유전자를 도입한 효모주의 제조

인간 조직 유래, 예컨대, 간장 유래의 cDNA (크론텍사 제조) 을 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, β1,4갈락토오스 전이 효소 (GenBank 액세션 넘버 : M22921) 의 활성 도메인을 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 그 5' 말단측에, 효모의 만노오스 전이 효소 (MNN9) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : L23752) 의 리더 펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터의 프로모터 서열의 하류에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 β1,4갈락토오스 전이 효소를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 상기 기술한 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 미숙한 복합 이중쇄형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주에 키메라형 β-1,4갈락토오스 전이 효소를 안정적으로 도입한 효모주에 대해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 영양 요구성과 약제 내성을 지표로 하여 클론을 선발한 후, RT-PCR 에 의해, 키메라형 β1,4갈락토오스 전이 효소의 발현을 확인한다. 이상의 방법에 의해, 키메라형 β1,4갈락토오스 전이 효소가 안정적으로 삽입된 효모주가 발현되는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 가 갖는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 그 비환원 말단측에 3 개의 만노오스 잔기가 2 분기하는 구조로 결합하고, 2 개의 비환원 말단 각각에 N-아세틸글루코사민 잔기와 갈락토오스 잔기가 1 개씩 부가된 미숙한 복합 이중쇄형 당사슬로 개변할 수 있다.

16. 재조합 CMP-시알산 트랜스포터 유전자를 도입한 효모주의 제조

인간 조직 유래, 예컨대, 간장 유래의 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, CMP-시알산 트랜스포터 (GenBank 액세션 넘버 : D87969) 의 번역 영역 전체 길이를 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 효모용 발현 벡터의 프로모터 서열의 하류에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 CMP-시알산 트랜스포터를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 상기 기술한 앞서의 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 미숙한 복합 이중쇄형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주에 대해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 영양 요구성과 약제 내성을 지표로 하여 클론을 선발한 후, RT-PCR 에 의해, CMP-시알산 트랜스포터의 발현을 확인한다.

17. 재조합 키메라형 시알산 전이 효소 유전자를 도입한 효모주의 제조

인간 조직 유래, 예컨대, 간장 유래의 cDNA (크론텍사 제조) 를 주형으로 하고, 특이적 프라이머와 KOD 폴리머라아제 (토요보사 제조) 를 사용한 PCR 을 실시함으로써, α2,3시알산 전이 효소 (GenBank 액세션 넘버 : L23768) 또는 α2,6시알산 전이 효소 (GenBank 액세션 넘버 : X62822) 의 활성 도메인을 코드하는 cDNA 를 특이적으로 증폭시킨다. 증폭시킨 cDNA 는, 그 5' 말단측에, 효모의 만노오스 전이 효소 (MNN9) 유전자 (GenBank 액세션 넘버 : L23752) 의 리더 펩티드를 코드하는 cDNA 서열을 연결한 후에, 효모용의 발현 벡터의 프로모터 서열의 하류에 삽입하고, 효모의 골지체 내에 시알산 전이 효소를 발현시키는 벡터를 제조한다. 다음으로, 이 벡터를, 앞서의 항에 기재한, N-결합형 당사슬로서 미숙한 복합 이중쇄형 당사슬을 주요하게 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주에 키메라형 시알산 전이 효소를 안정적으로 도입한 효모주에 대해 안정적으로 도입한다. 유전자를 도입한 후의 효모는, 영양 요구성과 약제 내성을 지표로 하여 클론을 선발한 후, RT-PCR 에 의해, 키메라형 시알산 전이 효소의 발현을 확인한다. 상기의 방법에 의해, 키메라형 시알산 전이 효소가 안정적으로 삽입된 효모주가 발현되는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 가 갖는 주요한 N-결합형 당사슬의 구조를, 환원 말단측의 코어 부분에 2 잔기의 N-아세틸글루코사민을 갖고, 그 비환원 말단측에 3 개의 만노오스 잔기가 2 분기하는 구조로 결합하고, 2 개의 비환원 말단의 각각에 N-아세틸글루코사민 잔기, 갈락토오스 잔기와 시알산이 1 개씩 부가된 성숙된 복합 이중쇄형 당사슬로 개변하는 것이 가능하다.

18. 효모를 사용한 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 단백질의 조제

앞서의 항에서 제조한, 환원 말단측에 푸코스 잔기를 갖지 않고 비환원 말단측에 시알산이 부가된 복합 이중쇄형 당사슬을 주로 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주는, 액체 YPD 배지 (인비트로젠사 제조) 에 파종하고, 30℃ 에서 24 시간 이상의 회분 배양을 실시함으로써, 배양 상청 중에 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 분비하게 하는 것이 가능하다. 배양 후에 얻어지는 배양 상청은, 인간 혈장 유래 안티트롬빈 Ⅲ 노이아트 (미츠비시 웰퍼머사 제조) 등을 표준품으로 하고, 인간 안티트롬빈 Ⅲ 에라이저 키트 (어피니티 바이오디컬즈사 제조) 를 사용하여 분석한다. 이 분석에 의해, 배양 상청 중에 함유되는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 를 검출하고, 그 농도를 측정하는 것이 가능하다. 또, 이 효모 배양 상청 중에 분비된, N-결합형 당사슬로서 푸코스를 함유하지 않는 복합 이중쇄형 당사슬을 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 는, 실시예 4 에 기재한 방법으로 정제가 가능하다. 또, 정제된 안티트롬빈 Ⅲ 단백질은, 실시예 4 에 기재한 방법으로, 당사슬 구조의 해석이 가능하다.

이상과 같이, N-글리코시드 결합 당사슬로서 푸코스를 함유하지 않는 복합형 당사슬을 주요하게 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 발현시키는 효모주를 제조하고, 그 효모의 배양에 의해, N-글리코시드 결합 당사슬로서 푸코스를 함유하지 않는 복합형 당사슬을 주요하게 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 를 조제 가능한 것을 나타냈다. 또한, 본 실시예에 있어서 효모로 발현시킨 상기 안티트롬빈 Ⅲ 는, FUT8 더블 녹아웃 세포로 발현시킨 그 안티트롬빈 Ⅲ 나, 인간 혈장 유래의 안티트롬빈 Ⅲ 와 비교하여, 동등한 생물 활성을 갖는 단백질이다.

본 발명에 의해, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖는 유전자 재조합 안티트롬빈 Ⅲ 분자로 이루어지는 조성물로서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬을 갖는 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법이 제공된다.

[서열표 프리텍스트]

서열 번호 20-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 21-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 22-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 23-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 24-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 25-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 26-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 27-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 28-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 29-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 30-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 31-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 32-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 33-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 34-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 35-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 36-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

서열 번호 37-인공 서열의 설명 : 합성 DNA

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. <120> Process for producing Antithrombin III composition <130> 11618WO1 <150> JP2003-350164 <151> 2003-10-09 <160> 40 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1395 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1395) <400> 1 atg tat tcc aat gtg ata gga act gta acc tct gga aaa agg aag gtt 48 Met Tyr Ser Asn Val Ile Gly Thr Val Thr Ser Gly Lys Arg Lys Val 1 5 10 15 tat ctt ttg tcc ttg ctg ctc att ggc ttc tgg gac tgc gtg acc tgt 96 Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Leu Ile Gly Phe Trp Asp Cys Val Thr Cys 20 25 30 cac ggg agc cct gtg gac atc tgc aca gcc aag ccg cgg gac att ccc 144 His Gly Ser Pro Val Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp Ile Pro 35 40 45 atg aat ccc atg tgc att tac cgc tcc ccg gag aag aag gca act gag 192 Met Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 50 55 60 gat gag ggc tca gaa cag aag atc ccg gag gcc acc aac cgg cgt gtc 240 Asp Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 65 70 75 80 tgg gaa ctg tcc aag gcc aat tcc cgc ttt gct acc act ttc tat cag 288 Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gln 85 90 95 cac ctg gca gat tcc aag aat gac aat gat aac att ttc ctg tca ccc 336 His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser Pro 100 105 110 ctg agt atc tcc acg gct ttt gct atg acc aag ctg ggt gcc tgt aat 384 Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 115 120 125 gac acc ctc cag caa ctg atg gag gta ttt aag ttt gac acc ata tct 432 Asp Thr Leu Gln Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile Ser 130 135 140 gag aaa aca tct gat cag atc cac ttc ttc ttt gcc aaa ctg aac tgc 480 Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 145 150 155 160 cga ctc tat cga aaa gcc aac aaa tcc tcc aag tta gta tca gcc aat 528 Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 165 170 175 cgc ctt ttt gga gac aaa tcc ctt acc ttc aat gag acc tac cag gac 576 Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gln Asp 180 185 190 atc agt gag ttg gta tat gga gcc aag ctc cag ccc ctg gac ttc aag 624 Ile Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe Lys 195 200 205 gaa aat gca gag caa tcc aga gcg gcc atc aac aaa tgg gtg tcc aat 672 Glu Asn Ala Glu Gln Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn 210 215 220 aag acc gaa ggc cga atc acc gat gtc att ccc tcg gaa gcc atc aat 720 Lys Thr Glu Gly Arg Ile Thr Asp Val Ile Pro Ser Glu Ala Ile Asn 225 230 235 240 gag ctc act gtt ctg gtg ctg gtt aac acc att tac ttc aag ggc ctg 768 Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly Leu 245 250 255 tgg aag tca aag ttc agc cct gag aac aca agg aag gaa ctg ttc tac 816 Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 260 265 270 aag gct gat gga gag tcg tgt tca gca tct atg atg tac cag gaa ggc 864 Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gln Glu Gly 275 280 285 aag ttc cgt tat cgg cgc gtg gct gaa ggc acc cag gtg ctt gag ttg 912 Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu Leu 290 295 300 ccc ttc aaa ggt gat gac atc acc atg gtc ctc atc ttg ccc aag cct 960 Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys Pro 305 310 315 320 gag aag agc ctg gcc aag gtg gag aag gaa ctc acc cca gag gtg ctg 1008 Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 325 330 335 cag gag tgg ctg gat gaa ttg gag gag atg atg ctg gtg gtt cac atg 1056 Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 340 345 350 ccc cgc ttc cgc att gag gac ggc ttc agt ttg aag gag cag ctg caa 1104 Pro Arg Phe Arg Ile Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu Gln 355 360 365 gac atg ggc ctt gtc gat ctg ttc agc cct gaa aag tcc aaa ctc cca 1152 Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 370 375 380 ggt att gtt gca gaa ggc cga gat gac ctc tat gtc tca gat gca ttc 1200 Gly Ile Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 385 390 395 400 cat aag gca ttt ctt gag gta aat gaa gaa ggc agt gaa gca gct gca 1248 His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 405 410 415 agt acc gct gtt gtg att gct ggc cgt tcg cta aac ccc aac agg gtg 1296 Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 420 425 430 act ttc aag gcc aac agg ccc ttc ctg gtt ttt ata aga gaa gtt cct 1344 Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile Arg Glu Val Pro 435 440 445 ctg aac act att atc ttc atg ggc aga gta gcc aac cct tgt gtt aag 1392 Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 450 455 460 taa 1395 465 <210> 2 <211> 1398 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(1398) <400> 2 atg tat tcc cct ggg gca gga agt ggg gct gct ggt gag agg aag ctt 48 Met Tyr Ser Pro Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Gly Glu Arg Lys Leu 1 5 10 15 tgt ctc ctc tct ctg ctc ctc atc ggt gcc ttg ggc tgt gct atc tgt 96 Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu Ile Gly Ala Leu Gly Cys Ala Ile Cys 20 25 30 cac gga aac cct gtg gac gac atc tgc ata gcg aag ccc cga gac atc 144 His Gly Asn Pro Val Asp Asp Ile Cys Ile Ala Lys Pro Arg Asp Ile 35 40 45 ccc gtg aat ccc ttg tgc att tac cgc tcc cct ggg aag aag gcc acc 192 Pro Val Asn Pro Leu Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Gly Lys Lys Ala Thr 50 55 60 gag gag gat ggc tca gag cag aag gtt cca gaa gcc acc aac cgg cgg 240 Glu Glu Asp Gly Ser Glu Gln Lys Val Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg 65 70 75 80 gtc tgg gaa ctg tcc aag gcc aat tcg cga ttt gcc act aac ttc tac 288 Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Asn Phe Tyr 85 90 95 cag cac ctg gca gac tcc aag aat gac aac gac aac att ttc ctg tca 336 Gln His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser 100 105 110 ccc ttg agc atc tcc act gct ttt gct atg acc aag ctg ggt gcc tgt 384 Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys 115 120 125 aac gac act ctc aag cag ctg atg gag gtt ttt aaa ttt gat acc atc 432 Asn Asp Thr Leu Lys Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile 130 135 140 tcc gag aag aca tcc gac cag atc cac ttc ttc ttt gcc aaa ctg aac 480 Ser Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn 145 150 155 160 tgc cga ctc tat cga aaa gcc aac aag tcc tct gac ttg gta tca gcc 528 Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Asp Leu Val Ser Ala 165 170 175 aac cgc ctt ttt gga gac aaa tcc ctc acc ttc aac gag agc tat caa 576 Asn Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Ser Tyr Gln 180 185 190 gat gtt agt gag gtt gtc tat gga gcc aag ctc cag ccc ctg gac ttc 624 Asp Val Ser Glu Val Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe 195 200 205 aag gag aat ccg gag caa tcc aga gtg acc atc aac aac tgg gta gct 672 Lys Glu Asn Pro Glu Gln Ser Arg Val Thr Ile Asn Asn Trp Val Ala 210 215 220 aat aag act gaa ggc cgc atc aaa gat gtc atc cca cag ggc gcc att 720 Asn Lys Thr Glu Gly Arg Ile Lys Asp Val Ile Pro Gln Gly Ala Ile 225 230 235 240 aac gag ctc act gcc ctg gtt ctg gtt aac acc att tac ttc aag ggc 768 Asn Glu Leu Thr Ala Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly 245 250 255 ctg tgg aag tca aag ttc agc cct gag aac aca agg aag gaa ccg ttc 816 Leu Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Pro Phe 260 265 270 tat aag gtc gat ggg cag tca tgc cca gtg cct atg atg tac cag gaa 864 Tyr Lys Val Asp Gly Gln Ser Cys Pro Val Pro Met Met Tyr Gln Glu 275 280 285 ggc aaa ttc aaa tac cgg cgc gtg gca gag ggc acc cag gtg cta gag 912 Gly Lys Phe Lys Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu 290 295 300 ctg ccc ttc aag ggg gat gac atc acc atg gtg ctc atc ctg ccc aag 960 Leu Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys 305 310 315 320 cct gag aag agc ctg gcc aag gtg gag cag gag ctc acc cca gag ctg 1008 Pro Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Gln Glu Leu Thr Pro Glu Leu 325 330 335 ctg cag gag tgg ctg gat gag ctg tca gag act atg ctt gtg gtc cac 1056 Leu Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Ser Glu Thr Met Leu Val Val His 340 345 350 atg ccc cgc ttc cgc acc gag gat ggc ttc agt ctg aag gag cag ctg 1104 Met Pro Arg Phe Arg Thr Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu 355 360 365 caa gac atg ggc ctc att gat ctc ttc agc cct gaa aag tcc caa ctc 1152 Gln Asp Met Gly Leu Ile Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Gln Leu 370 375 380 cca ggg atc gtt gct gga ggc agg gac gac ctc tat gtc tcc gac gca 1200 Pro Gly Ile Val Ala Gly Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala 385 390 395 400 ttc cac aaa gca ttt ctt gag gta aat gag gaa ggc agt gaa gca gca 1248 Phe His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala 405 410 415 gcg agt act tct gtc gtg att act ggc cgg tca ctg aac ccc aat agg 1296 Ala Ser Thr Ser Val Val Ile Thr Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg 420 425 430 gtg acc ttc aag gcc aac agg ccc ttc ctg gtt ctt ata agg gaa gtt 1344 Val Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Leu Ile Arg Glu Val 435 440 445 gca ctg aac act att ata ttc atg ggg aga gtg gct aat cct tgt gtg 1392 Ala Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val 450 455 460 aac taa 1398 Asn <210> 3 <211> 687 <212> DNA <213> Sus scrofa <220> <221> CDS <222> (65)..(687) <400> 3 ttcagaggga ttgcctcaga ccacactatc tccactcgcc cagacctgtg gaagattagc 60 gacc atg ttt tcc agt ggg ata gga act gta gct gct aga aaa agg 106 Met Phe Ser Ser Gly Ile Gly Thr Val Ala Ala Arg Lys Arg 1 5 10 agg gag tgt ctt ctc tcc ttg ctg att att ggc ctc tgg ggc tgt gtg 154 Arg Glu Cys Leu Leu Ser Leu Leu Ile Ile Gly Leu Trp Gly Cys Val 15 20 25 30 acc tgt cat tgg agc cct gtg gag gac atc tgc aca gcc aag cct cgg 202 Thr Cys His Trp Ser Pro Val Glu Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg 35 40 45 gac att ccc gtg aat ccc atg tgc att tac cgt tcc cca gag aag aag 250 Asp Ile Pro Val Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys 50 55 60 gcc act gag ggc gag ggc tca gag cag aag atc cct gag gcc acc aac 298 Ala Thr Glu Gly Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn 65 70 75 cgg cgg gtc tgg gaa ctg tcc aag gcc aat tcc cac ttt gtc acc atc 346 Arg Arg Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser His Phe Val Thr Ile 80 85 90 ttc tat cag cac ttg gca gac tcc aag aat gac aat gac aac att ttc 394 Phe Tyr Gln His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe 95 100 105 110 ctg tca ccc ctg agt atc tcc aca gct ttt gct atg acc aag ctg ggt 442 Leu Ser Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly 115 120 125 gcc tgt gac aac acc ctc aag cag ctg atg gag gtg ttt aag ttt gat 490 Ala Cys Asp Asn Thr Leu Lys Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp 130 135 140 acc atc tct gag aaa aca tct gat cag gtc cac ttt ttc ttt gcc aaa 538 Thr Ile Ser Glu Lys Thr Ser Asp Gln Val His Phe Phe Phe Ala Lys 145 150 155 ctg aac tgc cga ctc tat cga aaa gcc aac aag tcc tct gag ttg gtg 586 Leu Asn Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Glu Leu Val 160 165 170 tca gcc aac cgc ctt ttt gga gac aaa tcc ctt acc ttc aat gag acc 634 Ser Ala Asn Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr 175 180 185 190 tac cag gaa atc agt gag gtg gta tat gga gcc aag ctc cag ccc ctg 682 Tyr Gln Glu Ile Ser Glu Val Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu 195 200 205 gac tt 687 Asp <210> 4 <211> 464 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4 Met Tyr Ser Asn Val Ile Gly Thr Val Thr Ser Gly Lys Arg Lys Val 1 5 10 15 Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Leu Ile Gly Phe Trp Asp Cys Val Thr Cys 20 25 30 His Gly Ser Pro Val Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp Ile Pro 35 40 45 Met Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 50 55 60 Asp Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 65 70 75 80 Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gln 85 90 95 His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser Pro 100 105 110 Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 115 120 125 Asp Thr Leu Gln Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile Ser 130 135 140 Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 145 150 155 160 Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 165 170 175 Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gln Asp 180 185 190 Ile Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe Lys 195 200 205 Glu Asn Ala Glu Gln Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn 210 215 220 Lys Thr Glu Gly Arg Ile Thr Asp Val Ile Pro Ser Glu Ala Ile Asn 225 230 235 240 Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly Leu 245 250 255 Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 260 265 270 Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gln Glu Gly 275 280 285 Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu Leu 290 295 300 Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys Pro 305 310 315 320 Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 325 330 335 Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 340 345 350 Pro Arg Phe Arg Ile Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu Gln 355 360 365 Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 370 375 380 Gly Ile Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 385 390 395 400 His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 405 410 415 Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 420 425 430 Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile Arg Glu Val Pro 435 440 445 Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 450 455 460 <210> 5 <211> 464 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Met Tyr Ser Pro Gly Ala Gly Ser Gly Ala Ala Gly Glu Arg Lys Leu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Ser Leu Leu Leu Ile Gly Ala Leu Gly Cys Ala Ile Cys 20 25 30 His Gly Asn Pro Val Asp Asp Ile Cys Ile Ala Lys Pro Arg Asp Ile 35 40 45 Pro Val Asn Pro Leu Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Gly Lys Lys Ala Thr 50 55 60 Glu Glu Asp Gly Ser Glu Gln Lys Val Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg 65 70 75 80 Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Asn Phe Tyr 85 90 95 Gln His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser 100 105 110 Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys 115 120 125 Asn Asp Thr Leu Lys Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile 130 135 140 Ser Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn 145 150 155 160 Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Asp Leu Val Ser Ala 165 170 175 Asn Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Ser Tyr Gln 180 185 190 Asp Val Ser Glu Val Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe 195 200 205 Lys Glu Asn Pro Glu Gln Ser Arg Val Thr Ile Asn Asn Trp Val Ala 210 215 220 Asn Lys Thr Glu Gly Arg Ile Lys Asp Val Ile Pro Gln Gly Ala Ile 225 230 235 240 Asn Glu Leu Thr Ala Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly 245 250 255 Leu Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Pro Phe 260 265 270 Tyr Lys Val Asp Gly Gln Ser Cys Pro Val Pro Met Met Tyr Gln Glu 275 280 285 Gly Lys Phe Lys Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu 290 295 300 Leu Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys 305 310 315 320 Pro Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Gln Glu Leu Thr Pro Glu Leu 325 330 335 Leu Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Ser Glu Thr Met Leu Val Val His 340 345 350 Met Pro Arg Phe Arg Thr Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu 355 360 365 Gln Asp Met Gly Leu Ile Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Gln Leu 370 375 380 Pro Gly Ile Val Ala Gly Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala 385 390 395 400 Phe His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala 405 410 415 Ala Ser Thr Ser Val Val Ile Thr Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg 420 425 430 Val Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Leu Ile Arg Glu Val 435 440 445 Ala Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val 450 455 460 <210> 6 <211> 207 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 6 Met Phe Ser Ser Gly Ile Gly Thr Val Ala Ala Arg Lys Arg Arg Glu 1 5 10 15 Cys Leu Leu Ser Leu Leu Ile Ile Gly Leu Trp Gly Cys Val Thr Cys 20 25 30 His Trp Ser Pro Val Glu Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp Ile 35 40 45 Pro Val Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr 50 55 60 Glu Gly Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg 65 70 75 80 Val Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser His Phe Val Thr Ile Phe Tyr 85 90 95 Gln His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser 100 105 110 Pro Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys 115 120 125 Asp Asn Thr Leu Lys Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile 130 135 140 Ser Glu Lys Thr Ser Asp Gln Val His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn 145 150 155 160 Cys Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Glu Leu Val Ser Ala 165 170 175 Asn Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gln 180 185 190 Glu Ile Ser Glu Val Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp 195 200 205 <210> 7 <211> 1504 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <220> <221> CDS <222> (1)..(1119) <400> 7 atg gct cac gct ccc gct agc tgc ccg agc tcc agg aac tct ggg gac 48 Met Ala His Ala Pro Ala Ser Cys Pro Ser Ser Arg Asn Ser Gly Asp 1 5 10 15 ggc gat aag ggc aag ccc agg aag gtg gcg ctc atc acg ggc atc acc 96 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac 144 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca ggt cga 192 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg 240 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta aaa atc 288 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc cag agc 336 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat gtt gat 384 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt ggc ctt 432 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg tat gga 480 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat cca agg 528 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta gtg aac 576 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc ttc aat 624 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc 672 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc 768 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc 816 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag aaa tca 864 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat 912 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act gtg gat 960 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga gac tgc 1008 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc ttt gac 1056 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg aga acc 1104 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 aac ccc aac gcc tga gcacctctac aaaaaaattc gcgagacatg gactatggtg 1159 Asn Pro Asn Ala 370 cagagccagc caaccagagt ccagccactc ctgagaccat cgaccataaa ccctcgactg 1219 cctgtgtcgt ccccacagct aagagctggg ccacaggttt gtgggcacca ggacggggac 1279 actccagagc taaggccact 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Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 Asn Pro Asn Ala 370 <210> 9 <211> 1316 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 9 gccccgcccc ctccacctgg accgagagta gctggagaat tgtgcaccgg aagtagctct 60 tggactggtg gaaccctgcg caggtgcagc aacaatgggt gagccccagg gatccaggag 120 gatcctagtg acagggggct ctggactggt gggcagagct atccagaagg tggtcgcaga 180 tggcgctggc ttacccggag aggaatgggt gtttgtctcc tccaaagatg cagatctgac 240 ggatgcagca caaacccaag ccctgttcca gaaggtacag cccacccatg tcatccatct 300 tgctgcaatg gtaggaggcc ttttccggaa tatcaaatac aacttggatt tctggaggaa 360 gaatgtgcac atcaatgaca acgtcctgca ctcagctttc gaggtgggca ctcgcaaggt 420 ggtctcctgc ctgtccacct gtatcttccc tgacaagacc acctatccta ttgatgaaac 480 aatgatccac aatggtccac cccacagcag caattttggg tactcgtatg ccaagaggat 540 gattgacgtg cagaacaggg cctacttcca gcagcatggc tgcaccttca ctgctgtcat 600 ccctaccaat gtctttggac ctcatgacaa cttcaacatt gaagatggcc atgtgctgcc 660 tggcctcatc cataaggtgc atctggccaa gagtaatggt tcagccttga ctgtttgggg 720 tacagggaaa ccacggaggc 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600 gatgagtctt gtgaccttag tttctttaaa aacacaaaat tcttggaatg tgttttcatg 660 ttcctcccag gtggatagga gtgagtttat ttcagattat ttattacaac tggctgttgt 720 tacttgtttc tatgtcttta tagaaaaaca tatttttttt gccacatgca gcttgtcctt 780 atgattttat acttgtgtga ctcttaactc tcagagtata aattgtctga tgctatgaat 840 aaagttggct attgtatgag acttcagccc acttcaatta ttggcttcat tctctcagat 900 cccaccacct ccagagtggt aaacaacttg aaccattaaa cagactttag tctttatttg 960 aatgatagat ggggatatca gatttatagg cacagggttt tgagaaaggg agaaggtaaa 1020 cagtagagtt taacaacaac aaaaagtata ctttgtaaac gtaaaactat ttattaaagt 1080 agtagacaag acattaaata ttccttggga ttagtgcttt ttgaattttg ctttcaaata 1140 atagtcagtg agtatacccc tcccccattc tatattttag cagaaatcag aataaatggt 1200 gtttctggta cattcttttg tagagaattt attttctttg ggtttttgtg catttaaagt 1260 caataaaaat taaggttcag taatagaaaa aaaactctga tttttggaat cccctttctt 1320 cagcttttct atttaatctc ttaatgataa tttaatttgt ggccatgtgg tcaaagtata 1380 tagccttgta tatgtaaatg ttttaaccaa cctgccttta cagtaactat ataattttat 1440 tctataatat atgacttttc ttccatagct ttagagttgc ccagtcactt taagttacat 1500 tttcatatat gttctttgtg ggaggagata attttatttc taagagaatc ctaagcatac 1560 tgattgagaa atggcaaaca aaacacataa ttaaagctga taaagaacga acatttggag 1620 tttaaaatac atagccaccc taagggttta actgttgtta gccttctttt ggaattttta 1680 ttagttcata tagaaaaatg gattttatcg tgacatttcc atatatgtat ataatatatt 1740 tacatcatat ccacctgtaa ttattagtgt ttttaaatat atttgaaaaa ataatggtct 1800 ggtttgatcc atttgaacct tttgatgttt ggtgtggttg ccaattggtt gatggttatg 1860 ataacctttg cttctctaag gttcaagtca gtttgagaat atgtcctcta aaaatgacag 1920 gttgcaagtt aagtagtgag atgacagcga gatggagtga tgagaatttg tagaaatgaa 1980 ttcacttata ctgagaactt gttttgcttt tagataatga acatattagc ctgaagtaca 2040 tagccgaatt gattaattat tcaaagatat aatcttttaa tccctataaa agaggtatta 2100 cacaacaatt caagaaagat agaattagac ttccagtatt ggagtgaacc atttgttatc 2160 aggtagaacc ctaacgtgtg tggttgactt aaagtgttta ctttttacct gatactgggt 2220 agctaattgt ctttcagcct cctggccaaa gataccatga aagtcaactt acgttgtatt 2280 ctatatctca aacaactcag ggtgtttctt actctttcca cagcatgtag agcccaggaa 2340 gcacaggaca agaaagctgc ctccttgtat caccaggaag atctttttgt aagagtcatc 2400 acagtatacc agagagacta attttgtctg aagcatcatg tgttgaaaca acagaaactt 2460 attttcctgt gtggctaact agaaccagag tacaatgttt ccaattcttt gagctccgag 2520 aagacagaag ggagttgaaa ctctgaaaat gcgggcatgg actggttcct ggcgttggat 2580 tatgctcatt ctttttgcct gggggacctt attgttttat ataggtggtc atttggttcg 2640 agataatgac caccctgacc attctagcag agaactctcc aagattcttg caaagctgga 2700 gcgcttaaaa caacaaaatg aagacttgag gagaatggct gagtctctcc ggtaggtttg 2760 aaatactcaa ggatttgatg aaatactgtg cttgaccttt aggtataggg tctcagtctg 2820 ctgttgaaaa atataatttc tacaaaccgt ctttgtaaaa ttttaagtat tgtagcagac 2880 tttttaaaag tcagtgatac atctatatag tcaatatagg tttacatagt tgcaatctta 2940 ttttgcatat gaatcagtat atagaagcag tggcatttat atgcttatgt tgcatttaca 3000 attatgttta gacgaacaca aactttatgt gatttggatt agtgctcatt aaattttttt 3060 attctatgga ctacaacaga gacataaatt ttgaaaggct tagttactct taaattctta 3120 tgatgaaaag caaaaattca ttgttaaata gaacagtgca tccggaatgt gggtaattat 3180 tgccatattt ctagtctact aaaaattgtg gcataactgt tcaaagtcat cagttgtttg 3240 gaaagccaaa gtctgattta aatggaaaac ataaacaatg atatctattt ctagatacct 3300 ttaacttgca gttactgagt ttacaagttg tctgacaact ttggattctc ttacttcata 3360 tctaagaatg atcatgtgta cagtgcttac tgtcacttta aaaaactgca gggctagaca 3420 tgcagatatg aagactttga cattagatgt ggtaattggc actaccagca agtggtatta 3480 agatacagct gaatatatta ctttttgagg aacataattc atgaatggaa agtggagcat 3540 tagagaggat gccttctggc tctcccacac cactgtttgc atccattgca tttcacactg 3600 cttttagaac tcagatgttt catatggtat attgtgtaac tcaccatcag ttttatcttt 3660 aaatgtctat ggatgataat gttgtatgtt aacactttta caaaaacaaa tgaagccata 3720 tcctcggtgt gagttgtgat ggtggtaatt gtcacaatag gattattcag caaggaacta 3780 agtcagggac aagaagtggg cgatactttg ttggattaaa tcattttact ggaagttcat 3840 cagggagggt tatgaaagtt gtggtctttg aactgaaatt atatgtgatt cattattctt 3900 gatttaggcc ttgctaatag taactatcat ttattgggaa tttgtcatat gtgccaattt 3960 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acg ggc atc acc 96 Gly Asp Lys Gly Lys Pro Arg Lys Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 ggc cag gat ggc tca tac ttg gca gaa ttc ctg ctg gag aaa gga tac 144 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 gag gtt cat gga att gta cgg cga tcc agt tca ttt aat aca ggt cga 192 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 att gaa cat tta tat aag aat cca cag gct cat att gaa gga aac atg 240 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 aag ttg cac tat ggt gac ctc acc gac agc acc tgc cta gta aaa atc 288 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 atc aat gaa gtc aaa cct aca gag atc tac aat ctt ggt gcc cag agc 336 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 cat gtc aag att tcc ttt gac tta gca gag tac act gca gat gtt gat 384 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 gga gtt ggc acc ttg cgg ctt ctg gat gca att aag act tgt ggc ctt 432 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Ile Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 ata aat tct gtg aag ttc tac cag gcc tca act agt gaa ctg tat gga 480 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 aaa gtg caa gaa ata ccc cag aaa gag acc acc cct ttc tat cca agg 528 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 tcg ccc tat gga gca gcc aaa ctt tat gcc tat tgg att gta gtg aac 576 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 ttt cga gag gct tat aat ctc ttt gcg gtg aac ggc att ctc ttc aat 624 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 cat gag agt cct aga aga gga gct aat ttt gtt act cga aaa att agc 672 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 gga aat ctg gac gcc aaa cga gac tgg ggc cat gcc aag gac tat gtc 768 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 gag gct atg tgg ctg atg tta caa aat gat gaa cca gag gac ttt gtc 816 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 ata gct act ggg gaa gtt cat agt gtc cgt gaa ttt gtt gag aaa tca 864 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 ttc atg cac att gga aag acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat 912 Phe Met His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa att cat gtg act gtg gat 960 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Ile His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 ctg aaa tac tac cga cca act gaa gtg gac ttc ctg cag gga gac tgc 1008 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 tcc aag gcg cag cag aaa ctg aac tgg aag ccc cgc gtt gcc ttt gac 1056 Ser Lys Ala Gln Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 gag ctg gtg agg gag atg gtg caa gcc gat gtg gag ctc atg aga acc 1104 Glu Leu Val Arg Glu Met Val Gln Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 aac ccc aac gcc tga gcacctctac aaaaaaattc gcgagacatg gactatggtg 1159 Asn Pro Asn Ala 370 cagagccagc caaccagagt ccagccactc ctgagaccat cgaccataaa ccctcgactg 1219 cctgtgtcgt ccccacagct aagagctggg ccacaggttt gtgggcacca ggacggggac 1279 actccagagc taaggccact tcgcttttgt caaaggctcc tctcaatgat tttgggaaat 1339 caagaagttt aaaatcacat actcatttta cttgaaatta tgtcactaga caacttaaat 1399 ttttgagtct tgagattgtt tttctctttt cttattaaat gatctttcta tgacccagca 1459 aaaaaaaaaa aaaaaaggga tataaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 1504 <210> 39 <211> 1119 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1119) <400> 39 atg gca cac gca ccg gca cgc tgc ccc agc gcc cgg ggc tcc ggg gac 48 Met Ala His Ala Pro Ala Arg Cys Pro Ser Ala Arg Gly Ser Gly Asp 1 5 10 15 ggc gag atg ggc aag ccc agg aac gtg gcg ctc atc acc ggt atc aca 96 Gly Glu Met Gly Lys Pro Arg Asn Val Ala Leu Ile Thr Gly Ile Thr 20 25 30 ggc cag gat ggt tcc tac ctg gct gag ttc ctg ctg gag aaa ggc tat 144 Gly Gln Asp Gly Ser Tyr Leu Ala Glu Phe Leu Leu Glu Lys Gly Tyr 35 40 45 gag gtc cat gga att gta cgg cgg tcc agt tca ttt aat acg ggt cga 192 Glu Val His Gly Ile Val Arg Arg Ser Ser Ser Phe Asn Thr Gly Arg 50 55 60 att gag cat ctg tat aag aat ccc cag gct cac att gaa gga aac atg 240 Ile Glu His Leu Tyr Lys Asn Pro Gln Ala His Ile Glu Gly Asn Met 65 70 75 80 aag ttg cac tat ggc gat ctc act gac agt acc tgc ctt gtg aag atc 288 Lys Leu His Tyr Gly Asp Leu Thr Asp Ser Thr Cys Leu Val Lys Ile 85 90 95 att aat gaa gta aag ccc aca gag atc tac aac ctt gga gcc cag agc 336 Ile Asn Glu Val Lys Pro Thr Glu Ile Tyr Asn Leu Gly Ala Gln Ser 100 105 110 cac gtc aaa att tcc ttt gac ctc gct gag tac act gcg gac gtt gac 384 His Val Lys Ile Ser Phe Asp Leu Ala Glu Tyr Thr Ala Asp Val Asp 115 120 125 gga gtt ggc act cta cga ctt cta gat gca gtt aag act tgt ggc ctt 432 Gly Val Gly Thr Leu Arg Leu Leu Asp Ala Val Lys Thr Cys Gly Leu 130 135 140 atc aac tct gtg aag ttc tac caa gcc tca aca agt gaa ctt tat ggg 480 Ile Asn Ser Val Lys Phe Tyr Gln Ala Ser Thr Ser Glu Leu Tyr Gly 145 150 155 160 aaa gtg cag gaa ata ccc cag aag gag acc acc cct ttc tat ccc cgg 528 Lys Val Gln Glu Ile Pro Gln Lys Glu Thr Thr Pro Phe Tyr Pro Arg 165 170 175 tca ccc tat ggg gca gca aaa ctc tat gcc tat tgg att gtg gtg aac 576 Ser Pro Tyr Gly Ala Ala Lys Leu Tyr Ala Tyr Trp Ile Val Val Asn 180 185 190 ttc cgt gag gcg tat aat ctc ttt gca gtg aac ggc att ctc ttc aat 624 Phe Arg Glu Ala Tyr Asn Leu Phe Ala Val Asn Gly Ile Leu Phe Asn 195 200 205 cat gag agt ccc aga aga gga gct aat ttc gtt act cga aaa att agc 672 His Glu Ser Pro Arg Arg Gly Ala Asn Phe Val Thr Arg Lys Ile Ser 210 215 220 cgg tca gta gct aag att tac ctt gga caa ctg gaa tgt ttc agt ttg 720 Arg Ser Val Ala Lys Ile Tyr Leu Gly Gln Leu Glu Cys Phe Ser Leu 225 230 235 240 gga aat ctg gat gcc aaa cga gat tgg ggc cat gcc aag gac tat gtg 768 Gly Asn Leu Asp Ala Lys Arg Asp Trp Gly His Ala Lys Asp Tyr Val 245 250 255 gag gct atg tgg ttg atg ttg cag aat gat gag ccg gag gac ttc gtt 816 Glu Ala Met Trp Leu Met Leu Gln Asn Asp Glu Pro Glu Asp Phe Val 260 265 270 ata gct act ggg gag gtc cat agt gtc cgg gaa ttt gtc gag aaa tca 864 Ile Ala Thr Gly Glu Val His Ser Val Arg Glu Phe Val Glu Lys Ser 275 280 285 ttc ttg cac att gga aaa acc att gtg tgg gaa gga aag aat gaa aat 912 Phe Leu His Ile Gly Lys Thr Ile Val Trp Glu Gly Lys Asn Glu Asn 290 295 300 gaa gtg ggc aga tgt aaa gag acc ggc aaa gtt cac gtg act gtg gat 960 Glu Val Gly Arg Cys Lys Glu Thr Gly Lys Val His Val Thr Val Asp 305 310 315 320 ctc aag tac tac cgg cca act gaa gtg gac ttt ctg cag ggc gac tgc 1008 Leu Lys Tyr Tyr Arg Pro Thr Glu Val Asp Phe Leu Gln Gly Asp Cys 325 330 335 acc aaa gcg aaa cag aag ctg aac tgg aag ccc cgg gtc gct ttc gat 1056 Thr Lys Ala Lys Gln Lys Leu Asn Trp Lys Pro Arg Val Ala Phe Asp 340 345 350 gag ctg gtg agg gag atg gtg cac gcc gac gtg gag ctc atg agg aca 1104 Glu Leu Val Arg Glu Met Val His Ala Asp Val Glu Leu Met Arg Thr 355 360 365 aac ccc aat gcc tga 1119 Asn Pro Asn Ala 370 <210> 40 <211> 1299 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1299) <400> 40 cac ggg agc cct gtg gac atc tgc aca gcc aag ccg cgg gac att ccc 48 His Gly Ser Pro Val Asp Ile Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp Ile Pro 1 5 10 15 atg aat ccc atg tgc att tac cgc tcc ccg gag aag aag gca act gag 96 Met Asn Pro Met Cys Ile Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 20 25 30 gat gag ggc tca gaa cag aag atc ccg gag gcc acc aac cgg cgt gtc 144 Asp Glu Gly Ser Glu Gln Lys Ile Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 35 40 45 tgg gaa ctg tcc aag gcc aat tcc cgc ttt gct acc act ttc tat cag 192 Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gln 50 55 60 cac ctg gca gat tcc aag aat gac aat gat aac att ttc ctg tca ccc 240 His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn Ile Phe Leu Ser Pro 65 70 75 80 ctg agt atc tcc acg gct ttt gct atg acc aag ctg ggt gcc tgt aat 288 Leu Ser Ile Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 85 90 95 gac acc ctc cag caa ctg atg gag gta ttt aag ttt gac acc ata tct 336 Asp Thr Leu Gln Gln Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr Ile Ser 100 105 110 gag aaa aca tct gat cag atc cac ttc ttc ttt gcc aaa ctg aac tgc 384 Glu Lys Thr Ser Asp Gln Ile His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 115 120 125 cga ctc tat cga aaa gcc cag aaa tcc tcc aag tta gta tca gcc aat 432 Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Gln Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 130 135 140 cgc ctt ttt gga gac aaa tcc ctt acc ttc aat gag acc tac cag gac 480 Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gln Asp 145 150 155 160 atc agt gag ttg gta tat gga gcc aag ctc cag ccc ctg gac ttc aag 528 Ile Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gln Pro Leu Asp Phe Lys 165 170 175 gaa aat gca gag caa tcc aga gcg gcc atc aac aaa tgg gtg tcc aat 576 Glu Asn Ala Glu Gln Ser Arg Ala Ala Ile Asn Lys Trp Val Ser Asn 180 185 190 aag acc gaa ggc cga atc acc gat gtc att ccc tcg gaa gcc atc aat 624 Lys Thr Glu Gly Arg Ile Thr Asp Val Ile Pro Ser Glu Ala Ile Asn 195 200 205 gag ctc act gtt ctg gtg ctg gtt aac acc att tac ttc aag ggc ctg 672 Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr Ile Tyr Phe Lys Gly Leu 210 215 220 tgg aag tca aag ttc agc cct gag aac aca agg aag gaa ctg ttc tac 720 Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 225 230 235 240 aag gct gat gga gag tcg tgt tca gca tct atg atg tac cag gaa ggc 768 Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gln Glu Gly 245 250 255 aag ttc cgt tat cgg cgc gtg gct gaa ggc acc cag gtg ctt gag ttg 816 Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gln Val Leu Glu Leu 260 265 270 ccc ttc aaa ggt gat gac atc acc atg gtc ctc atc ttg ccc aag cct 864 Pro Phe Lys Gly Asp Asp Ile Thr Met Val Leu Ile Leu Pro Lys Pro 275 280 285 gag aag agc ctg gcc aag gtg gag aag gaa ctc acc cca gag gtg ctg 912 Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 290 295 300 cag gag tgg ctg gat gaa ttg gag gag atg atg ctg gtg gtt cac atg 960 Gln Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 305 310 315 320 ccc cgc ttc cgc att gag gac ggc ttc agt ttg aag gag cag ctg caa 1008 Pro Arg Phe Arg Ile Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gln Leu Gln 325 330 335 gac atg ggc ctt gtc gat ctg ttc agc cct gaa aag tcc aaa ctc cca 1056 Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 340 345 350 ggt att gtt gca gaa ggc cga gat gac ctc tat gtc tca gat gca ttc 1104 Gly Ile Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 355 360 365 cat aag gca ttt ctt gag gta aat gaa gaa ggc agt gaa gca gct gca 1152 His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 370 375 380 agt acc gct gtt gtg att gct ggc cgt tcg cta aac ccc aac agg gtg 1200 Ser Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 385 390 395 400 act ttc aag gcc aac agg ccc ttc ctg gtt ttt ata aga gaa gtt cct 1248 Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe Ile Arg Glu Val Pro 405 410 415 ctg aac act att atc ttc atg ggc aga gta gcc aac cct tgt gtt aag 1296 Leu Asn Thr Ile Ile Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 420 425 430 taa 1299

Claims (30)

1. 삭제
2. 삭제
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17. 인간 안티트롬빈 Ⅲ 폴리펩티드의 아미노산 서열의 96, 135, 155, 및 192 위치의 아스파라긴 잔기에 결합하는, 4개의 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬을 갖는 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 분자를 포함하는 조성물로서, 상기 모든 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬이 이 당사슬의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민에 푸코스가 결합되어 있지 않은 당사슬인 재조합 인간 안티트롬빈 Ⅲ 조성물의 제조 방법으로서,

    세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가 실활되도록 게놈이 개변된 차이니즈 햄스터 난소 조직 유래 CHO 세포에 인간 안티트롬빈 Ⅲ를 코딩하는 DNA를 도입하여 얻어진 형질 전환체를 배지에 배양하고, 배양물 중에 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 생성 축적시키며, 그 배양물로부터 상기 안티트롬빈 Ⅲ 조성물을 단리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
18. 삭제
19. 제17항에 있어서, CHO 세포가, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소, 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소의 게놈 상의 대립 유전자 전부가 녹아웃된 세포인 제조 방법.
20. 제17항에 있어서, 세포내 당 뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소가, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제(GMD) 및 GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제(Fx)로 이루어지는 군에서 선택되는 효소인 제조 방법.
21. 제20항에 있어서, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제가 서열 번호 7로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 코딩하는 단백질인 제조 방법.
22. 제20항에 있어서, GDP-만노오스 4,6-데히드라타아제가 서열 번호 8로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인 제조 방법.
23. 제20항에 있어서, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제가 서열 번호 9로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 코딩하는 단백질인 제조 방법.
24. 제20항에 있어서, GDP-4-케토-6-데옥시-D-만노오스-3,5-에피머라아제가 서열 번호 10으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인 제조 방법.
25. 제17항에 있어서, N-글리코시드 결합 복합형 당사슬 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6 위치에 푸코스의 1 위치가 α결합하는 당사슬 수식에 관여하는 효소가 α1,6-푸코실트랜스퍼라아제인 제조 방법.
26. 제25항에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가 서열 번호 11로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 DNA가 코딩하는 단백질인 제조 방법.
27. 제25항에 있어서, α1,6-푸코실트랜스퍼라아제가 서열 번호 13으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질인 제조 방법.
28. 제17항에 있어서, 형질 전환체가 FERM BP-08472, FERM BP-10083 또는 FERM-10088인 제조 방법.
29. 제17항에 있어서, 인간 안티트롬빈 Ⅲ가, 서열 번호 4로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 33∼464번째의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩티드인 제조 방법.
30. 제17항에 있어서, 인간 안티트롬빈 Ⅲ가, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 있어서, 97∼1392번째의 염기 서열로 이루어지는 DNA가 코딩하는 폴리펩티드인 제조 방법.

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