ES2383371T3

ES2383371T3 - Proceso para producir una composición de antitrombina III

Info

Publication number: ES2383371T3
Application number: ES04773775T
Authority: ES
Inventors: Tsuyoshi Yamada; Mitsuo Satoh; Yutaka Kanda; Kazuya Yamano
Original assignee: Kyowa Hakko Kirin Co Ltd
Current assignee: Kyowa Kirin Co Ltd
Priority date: 2003-10-09
Filing date: 2004-10-08
Publication date: 2012-06-20
Anticipated expiration: 2024-10-08
Also published as: ATE554097T1; KR101017336B1; JPWO2005035563A1; WO2005035563A1; ES2383371T9; CN1890262A; CA2542035A1; JP4263191B2; KR20060125732A; EP1676860B1; EP1676860A4; EP1676860A1; AU2004279741B2; CA2542035C; CN1890262B; HK1091500A1; CN103993056A; AU2004279741A1

Abstract

Un proceso para producir una composición de antitrombina III humana recombinante que comprende moléculasde antitrombina III humana recombinante que tiene cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo,en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa noestá unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas,que comprende cultivar, en un medio, un transformante obtenido introduciendo, en una célula CHO derivada de untejido de ovario de hámster chino, un ADN que codifica la antitrombina III en el que el genoma se modifica para teneruna actividad delecionada de una enzima relacionada con la síntesis de la GDP-fucosa, o una enzima relacionadacon la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosaminaen el extremo reductor a través de un enlace a en una cadena glucídica unida a N-glucósido detipo complejo para formar y acumular, en el cultivo, dicha antitrombina III; y recuperar del cultivo dicha composiciónde antitrombina III.

Description

Proceso para producir una composición de antitrombina III

5 Campo técnico

La presente invención se refiere a un proceso para producir una composición de antitrombina III que comprende una molécula de antitrombina III que tiene cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa no está unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas.

Antecedentes de la técnica

La formación de un trombo viene acompañada del riesgo de detener el flujo sanguíneo. Dado que la interrupción del

15 flujo sanguíneo por la formación de trombos se convierte en un factor letal, el organismo tiene diversos mecanismos para controlar y regular la coagulación sanguínea. Esto es, la inactivación directa de factores de coagulación activados por serina proteasa [The Thrombin; Volumen I (Machovich R., ed.), páginas 1-21, CRC Press, Boca Ratón (1982.)], un mecanismo regulador basado en la degradación del factor V y factor VIII por la proteína C activada [Progress in Hemostasis and Thrombosis, Volumen 7 (Spaet T. H., ed.), páginas 25-54, Grune & Stratton, Nueva York (1984)] y un mecanismo inhibidor de factores de coagulación activados por diversos inhibidores de serina proteasa en sangre. Además, también se ha encontrado la presencia de un inhibidor del factor tisular que inhibe la activación del factor VII de una manera dependiente del factor X activado [Journal of Japanese Society on Thrombosis and Hemostasis, 2,550. (1991)]. El mecanismo más importante entre estos es el mecanismo inhibidor de factores de coagulación activados por diversos inhibidores de serina proteasa en sangre.

25 En la sangre están presentes diversos inhibidores de serina proteasa, y su cantidad alcanza el 10% de la proteína plasmática total. Se sabe que, entre estos inhibidores, 4 inhibidores, en concreto la antitrombina III, un inhibidor de proteinasa, α2 macroglobulina y cofactor II de heparina son importantes en la regulación de la coagulación sanguínea. Entre tales inhibidores, la antitrombina III es particularmente importante y ocupa el 70% de la actividad de la antitrombina en plasma.

La antitrombina III es una glucoproteína que comprende 432 aminoácidos con un peso molecular de aproximadamente 59.000 a 65.000 y en su molécula tiene tres enlaces disulfuro, Cys8-Cys128, Cys21-Cys95 y Cys247-Cys430 [Proc. Natl. Acad Sci, USA, 80, 1845 (1983)]. Mediante estos enlaces, en el extremo C se forma una

35 gran estructura en bucle, y como centro activo en esta estructura en bucle existe un enlace Arg393-Ser394 (Fig. 1). La antitrombina III humana tiene un punto isoeléctrico de 5,11. Las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido se añaden a 4 posiciones, contando los restos 96, 135, 155 y 192 de asparagina desde el extremo N (en lo sucesivo en el presente documento denominados Asn96, Asn135, Asn155 y Asn192, respectivamente) de la antitrombina III. La antitrombina III en plasma humano existe en dos tipos de isoformas, un tipo α que tiene cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido y un tipo β que solo tiene tres cadenas glucídicas unidas a N-glucósido pero no tiene una cadena glucídica en la posición Asn135 [Pathophysiol. Haemost. Thromb., 32, 143 (2002)] y en la antitrombina III en plasma humano, del 90 al 95% es del tipo α y el restante 5 al 10% es del tipo β.

Las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo añadidas a la antitrombina III están constituidas por

45 N-acetilglucosamina, ácido siálico, galactosa y manosa (Fig. 2). Una de las características de la distribución de la antitrombina III en el plasma humano es que la estructura de cadena glucídica es libre a partir de la modificación de fucosa.

La antitrombina III se ha desarrollado como un inhibidor de la coagulación sanguínea y, a nivel mundial, se usa ampliamente para el tratamiento de la trombosis en base al síndrome congénito del déficit de antitrombina III y de coagulación sanguínea intravascular múltiple que viene acompañado por una disminución de antitrombina III.

Usando, como materia prima, muestras de plasma humano agrupado, se producen preparaciones sanguíneas tales como antitrombina III. En Japón, el plasma agrupado se prepara en el Plasma Fractionation Center, Japanese Red

55 Cross Society, mezclando muestras de plasma de aproximadamente 5.000 a 10.000 voluntarios y después de concluir los 6 meses de almacenaje se suministran. En realidad, para producir un lote de una preparación de sangre, tal como una preparación concentrada, deshidratada, del factor VIII humano de coagulación sanguínea, Cross Eight M (Japanese Red Cross Society), se necesitan varios lotes de crioprecipitados obtenidos de las muestras de plasma agrupado descritas anteriormente, y se usan aproximadamente muestras de plasma de aproximadamente 80.000 voluntarios [Japanese Journal of Transfusion Medicine, 48, 27 (2002)].

El plasma agrupado se produce usando, como materia prima, muestras de sangre proporcionadas por donantes de sangre, y se ha informado que, en Japón, la proporción de resultados positivos al parvovirus humano B19 en donantes de sangre se calcula que es del 0,6 al 0,8% [Journal of Japan Society of Blood Transfusion, 42, 231 65 (1996)]. Por tanto, se calcula que un lote equivalente al Cross Eight M, descrito anteriormente, está contaminado con muestras de sangre positivas a parvovirus humano B19 que, a grosso modo, corresponden a de 480 a 640 donantes. El parvovirus humano B19 es un virus pequeño de 18 a 26 nm de diámetro sin envuelta y mantiene su resistencia incluso después de realizar tratamiento térmico a 60 ºC durante 30 minutos, tratamiento ácido a un pH de aproximadamente 3, tratamiento con cloroformo, tratamiento con tensioactivos y similares [Science, 262,114 (1993)], de manera que no puede eliminarse por procedimientos de eliminación de virus generales. Por consiguiente, la 5 eliminación del parvovirus humano B19 requiere una etapa de filtración a través de una membrana exclusivamente desarrollada para la eliminación del virus que tiene un tamaño de poro de varios nanómetros a varias decenas de nanómetros. Sin embargo, se considera que una etapa de filtración, concretamente una etapa de nanofiltración , que usa un tamaño de poro de membrana pequeño de este tipo, es difícil de introducir en los procesos de producción de muchas preparaciones de fraccionamiento de plasma [Japanese Journal of Transfusion Medicine, 48, 27 (2002)]. Se considera que el parvovirus humano B19 es la causa de eritema infeccioso y generalmente solo muestra síntomas gripales transitorios en el caso de personas sanas sin anticuerpos anti-B19, lo que causa anemia hemolítica crónica en algunos casos. Además, se dice que algunas veces esto induce a aplasia eritrocitaria pura aguda grave en pacientes inmunodeficientes. Además, existe un informe que afirma que en las gestantes que no tienen anticuerpos anti-B19 algunas veces se produce edema que causa aborto o bebés nonatos, y el 15% de la muerte fetal

15 intrauterina fue positiva con respecto al resultado de un examen de ADN del B19 [Lancet, 357, 1494 (2001)]. En la preparación concentrada, deshidratada, del factor VIII humano de coagulación sanguínea, Cross Eight M (Japanese Red Cross Society), en septiembre de 1997, se informo de un caso en el que se sospechó de una infección transitoria con parvovirus humano B19 por la administración de esta preparación [Journal of Japanese Society of Child Hematology, 11, 289 (1997)].

Como materia para la producción de preparaciones de sangre de antitrombina III, tales como Neuart (fabricada por Mitsubishi Pharma Corporation) y antitrombina P (fabricada por Aventis Boehring), se usó plasma agrupado negativo al virus de la hepatitis B, negativo al virus de la hepatitis C y negativo al virus I y II de la inmunodeficiencia humana, pero no se confirmo la presencia o ausencia del parvovirus humano B19 en la materia prima.

25 Aunque en el proceso de producción de preparaciones de sangre de antitrombina III se realizó un tratamiento de inactivación de virus a 60 ºC durante 10 horas, concretamente pasteurización, existieron problemas tales como que, al ser la antitrombina III una proteína, esta se desnaturaliza y que el virus del SIDA, parvovirus y prión humanos que se convirtieron en la causa de la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob de tipo mutación no pudieron eliminarse completamente.

Como se ha descrito anteriormente, el uso de preparaciones de sangre tiene desventajas ya que existe un riesgo de infección viral, y las técnicas actuales no pueden excluirse completamente el riesgo. Por tanto, se requiere una preparación de antitrombina III que sea más inocua.

35 Por consiguiente, para proporcionar antitrombina III humana sin usar plasma humano como materia prima, se ha considerado su sustitución con un recombinante. Sin embargo, la actividad de la antitrombina III recombinante, preparada usando técnicas de recombinación genética, es inferior a la actividad de la antitrombina III obtenida a partir de materia natural tal como plasma. Esto es porque se considera que la estructura de la cadena glucídica a añadir al recombinante es diferente a la de la antitrombina III preparada a partir de plasma, y específicamente, se supone que dado que la fucosa se une a las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo de complejo a añadir a la antitrombina III recombinante, su afinidad con la heparina disminuye, y por lo tanto no puede obtenerse suficiente actividad anti-coagulación sanguínea [Journal of Biological Chemistry, 268, 17588 (1993), Biochemistry, 35, 8881 (1996)]. Hasta ahora, existen informes sobre antitrombina III recombinante producida por una célula BHK derivada

45 de riñón de cría de hámster [Journal of Biological Chemistry, 268,17588 (1993), Biochemistry, 15, 8881 (1996)], una celular CHO derivada de ovario de hámster chino (documento WO 02/02793) o una cabra transgénica (documento US 2003096974), pero en cada uno de estos casos, en la unión a la antitrombina III recombinante de las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, la fucosa está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor. La proporción de las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo a las que se une la fucosa con respecto al total de cadenas glucícidas unidas a N-glucósido de tipo complejo en la antitrombina III recombinante producida varía dependiendo de la célula hospedadora, pero se calcula que es del 39 al 95%. En la producción de una antitrombina III recombinante que tenga una estructura de cadena glucídica equivalente a la de la antitrombina III natural, se han realizado intentos, mediante diversos dispositivos, tales como mejorar el método de cultivo, para reducir la proporción de las cadenas glucídicas a las que se une la fucosa a las cadenas glucídicas

55 unidas a N-glucósido de tipo complejo, pero aún no han tenido éxito.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a los siguientes apartados (1) a (17).

[1]. Un proceso para producir una composición de antitrombina III humana recombinante que comprende moléculas de antitrombina III humana recombinante que tienen cuatro cadenas glucídicas unidas a Nglucósido de tipo complejo, en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que, en las cadenas glucídicas, la fucosa no se une a la N-acetilglucosamina en el extremo

65 reductor, que comprende cultivar en un medio un transformante obtenido introduciendo un ADN que codifica antitrombina III en una célula CHO, derivada de un tejido de ovario de hámster chino, en la que el genoma se modifica para eliminar la actividad de una enzima relacionada con la síntesis de GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor, en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo para formar y acumular, en el cultivo, dicha antitrombina III; y recuperar

5 dicha composición de antitrombina III del cultivo. [2]. El proceso de acuerdo con el apartado [1], en el que las cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo son cadenas glucídicas que se unen a cuatro restos de asparagina en las posiciones 96, 135, 155 y 192 en la secuencia de aminoácidos de la molécula de antitrombina III humana, respectivamente. [3]. El proceso de acuerdo con los apartados [1] o [2], en el que se han inactivado todos los alelos en el genoma que codifica una enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, GDPfucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α , la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo. [4]. El proceso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1] a [3], en el que la enzima relacionada con la

15 síntesis de GDP-fucosa es una enzima seleccionada del grupo que consiste en GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD) y GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa (Fx). [5]. El proceso de acuerdo con el apartado [4], en el que la GDP-manosa 4,6-deshidratasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 7. [6]. El proceso de acuerdo con el apartado [4], en el que la GDP-manosa 4,6-deshidratasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8. [7]. El proceso de acuerdo con el apartado [4], en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 9. [8]. El proceso de acuerdo con el apartado [4], en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa es

25 una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10. [9]. El proceso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1] a [3], en el que la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, es la α1,6-fucosiltransferasa. [10]. El proceso de acuerdo con el apartado [9], en el que la α1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 11. [11]. El proceso de acuerdo con el apartado [9], en el que la α1,6-fucosiltransferasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 13. [12]. El proceso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1] a [3], en el que el transformante es FERM

35 Bop-08472, FERM BP-10053 o FERM BP-10088. [13]. El proceso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1] a [12], en el que la antitrombina III es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos en la posiciones 33 a 464 de la SEC ID Nº: 4. [14]. El proceso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1] a [12], en el que la antitrombina III es un polipéptido codificado por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos en las posiciones 97 a 1392 de la SEC ID Nº: 1. [15]. Una composición de antitrombina III que se obtiene mediante el proceso de acuerdo con uno cualquiera de los apartados [1] a [14]. [16]. Un medicamento que, como ingrediente activo, comprende la composición de antitrombina de acuerdo con el apartado [15].

45 [17]. El medicamento de acuerdo con el apartado [16], que es un agente para el diagnóstico, prevención o tratamiento de enfermedades que vienen acompañadas con coagulación sanguínea.

La presente descripción también se refiere a los siguientes apartados (1) a (24):

(1) Un proceso para producir una composición de antitrombina III, que comprende cultivar, en un medio, un transformante obtenido introduciendo un ADN que codifica antitrombina III en una célula hospedadora modificada por recombinación genética para formar y acumular, en el cultivo, una composición de antitrombina III que comprende una molécula de antitrombina III que tiene cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la

55 que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas; y recuperar la composición de antitrombina III del cultivo.

(2) El proceso de acuerdo con el apartado (1), en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la posición 1 de la fucosa no está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas .

La presente invención se describe con detalle a continuación. Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud japonesa Nº 2003-350164 presentada el 9 de octubre del 2003 y todo el contenido de la memoria descriptiva y/o dibujos de la solicitud de patente se incorporan en el presente documento.

65 La presente invención se refiere a un proceso para producir una composición de antitrombina III que comprende una molécula de antitrombina III recombinante genética que tiene cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas, y a un medicamento que comprende la composición de antitrombina III.

5 En la presente descripción, la antitrombina III incluye una proteína codificada por un ADN de los siguientes apartados (a), (b), (c), (d), (e) o (f), una proteína de los siguientes apartados (g), (h), (i), (j), (k), (I) u (o), y similar:

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1;

(b): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 2;

(c): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 3;

(d): un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1 y que codifica una proteína que tiene actividad de unión a heparina;

(e) un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos 15 representada por la SEC ID Nº: 2 y que codifica una proteína que tiene actividad de unión a heparina;

(f): un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 3 y que codifica una proteína que tiene actividad de unión a heparina;

(g): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 4;

(h): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5;

(i): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 6;

(j): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 4 y que tiene actividad de unión a heparina;

(k): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos se

25 delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5 y que tiene actividad de unión a heparina;

(l): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos se delecionan, sustituyen, insertan y/o añaden en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 6 y que tiene actividad de unión a heparina;

(m): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 4 y que tiene actividad de unión a heparina;

(n): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 5 y que tiene actividad de unión a heparina;

(o) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la 35 secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 6 y que tiene actividad de unión a heparina;

Además, el ADN que codifica la secuencia de aminoácidos de la antitrombina III incluye un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 1, 2 ó 3, un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con el ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por las SEC ID Nº: 1, 2 ó 3 y que codifica una proteína que tiene actividad de unión a heparina.

En la presente descripción, el ADN que se hibrida en condiciones rigurosas se refiere a un ADN que se obtiene por hibridación de colonias, hibridación de placas, hibridación de Southern o similar usando, por ejemplo, un ADN que comprende, como sonda, la secuencia de nucleótidos representada por las SEC ID Nº: 1, 2 ó 3 o sus fragmentos. Un 45 ejemplo específico de un ADN de este tipo es un ADN que puede identificarse realizando hibridación a 65 ºC en presencia de 0,7 a 1,0 M de cloruro de sodio usando un filtro con ADN, derivado de colonias o de placas, inmovilizado sobre el mismo, y después lavando el filtro a 65 ºC con una solución de SSC a una concentración de 0,1 a 2 veces (solución de SSC a una concentración de 1 vez: cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM). La hibridación puede realizarse de acuerdo con los métodos descritos en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición, Cold .Spring Harbor Laboratory Press (1989) (en lo sucesivo en el presente documento denominado Molecular Cloning, segunda edición); Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (19871997) (en lo sucesivo en el presente documento denominado Current Protocols in Molecular Biology); DNA Cloning

1: Core Techniques, A Practical Approach, segunda edición, Oxford University (1995), etc. Específicamente, el ADN capaz de hibridación, en condiciones rigurosas, incluye ADN que tiene al menos un 60% o más de homología,

55 preferentemente un 70% o más de homología, más preferentemente un 80% o más de homología, aun más preferentemente un 90% o más de homología, particularmente de manera preferente un 95% o más de homología, más preferentemente un 98% o más de homología con la secuencia de nucleótidos representada por las SEC ID Nº: 1, 2 ó 3.

En la presente descripción, la proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID Nº: 4, 5 ó 6 y que tiene actividad sustancialmente similar a la actividad de unión a heparina es una proteína que puede obtenerse, por ejemplo, introduciendo una mutación dirigida, en un ADN que codifica una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 4, 5 ó 6 por la 65 mutagénesis dirigida descrita en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 79, 6409 (1982); Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids

Research, 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 82 488 (1985), etc. La cantidad de restos de aminoácidos que están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos es de uno o más, y no está específicamente limitada, pero está dentro del intervalo en el que es posible la deleción, sustitución o adición mediante métodos conocidos tales como la mutagénesis dirigida indicada anteriormente. La cantidad adecuada es de 1 a docenas,

5 preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10, de manera adicional preferentemente de 1 a 5.

La proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID Nº: 4, 5 ó 6 y que tiene actividad sustancialmente similar a la actividad de unión a heparina incluye una proteína que tiene al menos un 80% o más de homología, preferentemente un 85%

10 o más de homología, más preferentemente un 90% o más de homología, aún más preferentemente un 95% o más de homología, particularmente preferentemente un 97% o más de homología, más preferentemente un 99% o más de homología con la proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos representada por las SEC ID Nº: 4, 5 ó 6, respectivamente, calculada usando programas informáticos de análisis tal como BLAST [J. Mol. Biol., 215,403 (1990)] o FASTA /Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)].

15 En la presente invención, las cadenas glucídicas en las que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, como se usa en el presente documento, significa cadenas glucídicas en las que la fucosa no está sustancialmente unida a la Nacetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo,

20 preferentemente cadenas glucídicas en las que la proporción de contenido de fucosa unida a las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido en el extremo reductor en las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo es del 0%. La composición de antitrombina III de la presente invención se refiere específicamente a una composición en la que la fucosa no se detecta sustancialmente cuando se somete al análisis de cadena glucídica descrito más adelante en el apartado 4, y el contenido de fucosa que no se detecta sustancialmente significa que el contenido de

25 fucosa está por debajo del límite de detección.

Se sabe que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido que se unen a una glucoproteína, tal como antitrombina III, tienen diversas estructuras, aunque tienen una estructura núcleo común básica mostrada por la siguiente fórmula estructural (I):

En la fórmula (I), la cadena glucídica terminal que se une a la asparagina se denomina extremo reductor y el lado opuesto se denomina extremo no reductor.

35 La cadena glucídica unida a N-glucósido incluye un tipo de manosa superior en el que la manosa se une sola al extremo no reductor de la estructura núcleo; un tipo complejo en el que el extremo no reductor de la estructura núcleo tiene una o una pluralidad de ramas paralelas de galactosa-N-acetilglucosamina (en lo sucesivo en el presente documento denominada Gal-GlcNAc) y el extremo no reductor de Gal-GlcNAc tiene una estructura

40 bisegmentada de ácido siálico. La N-acetilglucosamina o similar; un tipo híbrido en el que el extremo no reductor de la estructura núcleo comprende ramas de los dos tipos de manosa superior y de tipo complejo; y similares.

Como restos de aminoácidos, a los cuales se une la cadena glucídica unida a N-glucósido en la molécula de antitrombina III, hay cuatro restos de asparagina en las posiciones 96, 135, 155 y 192 desde el extremo N. Los

45 ejemplos incluyen antitrombina III (tipo α) en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido están unidas a todos los restos de asparagina, y antitrombina III (tipo β) en la que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido están unidas a los restos asparagina en las posiciones 96, 155 y 192.

Las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido unidas a antitrombina III incluyen las cadenas glucídicas unidas a N50 glucósido de tipo complejo descritas anteriormente

Como cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo unidas a la molécula de antitrombina III, puede ser cualquier cadena glucídica que comprenda la estructura núcleo representada por la fórmula estructural descrita anteriormente (I). Por consiguiente, existe una gran cantidad de combinaciones en tres o cuatro cadenas glucídicas

55 unidas a N-glucósido unidas a antitrombina III.

Por lo tanto, la composición de antitrombina III obtenida mediante el proceso de la presente invención puede ser una composición que comprenda una molécula de antitrombina III que tenga la misma estructura de cadena glucídica o una composición que comprenda moléculas de antitrombina III que tenga diferentes estructuras de cadena glucídica, siempre que la composición tenga una actividad biológica cualitativamente similar a la de la antitrombina III natural.

5 La antitrombina III natural se refiere a antitrombina III derivada de una materia natural tal como plasma sanguíneo.

Tal composición de antitrombina III incluye una composición de antitrombina III que comprende una molécula de antitrombina III que tiene cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en la que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que a fucosa no está unida a la Nacetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas .

La cadena glucídica en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo puede ser cualquier cadena glucídica, siempre que esta sea una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa no esté unida a la posición 6 de la N

15 acetilglucosamina en el extremo reductor en la cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo. La estructura de cadena glucídica en el extremo no reductor puede tener diversidad.

La estructura de cadena glucídica de la composición que comprende una molécula de antitrombina III que tiene cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo puede determinarse liberando las cadenas glucídicas de las moléculas de antitrombina III por métodos conocidos tales como hidracinólisis y digestión enzimática [Seibutsukagaku Jikkenho (Biochemical Experimentation Methods) 23 -Totanpakushitsu Tosa Kenkyuho (Methods of Studies on Glycoprotein Sugar Chains), Gakkai Shuppan Center, editado por Reiko Takahashi (1989)], marcando las cadenas glucídicas liberadas con una sustancia fluorescente o un radioisótopo y separando por cromatografía las cadenas glucídicas marcadas. Como alternativa, las cadenas glucídicas liberadas pueden analizarse mediante

25 el método HPAED-PAD [J. Liq. Chromatogr., 6 1577 (1983)] para determinarlas.

En el proceso de la presente invención, puede usarse una célula hospedadora modificada por recombinación genética.

La célula hospedadora modificada por recombinación genética significa una célula hospedadora en la que se han modificado las propiedades de la célula mediante un proceso de recombinación genética artificial. El proceso de recombinación genética artificial incluye la alteración genética dirigida de un gen, la introducción de un mutante dominante-negativo de un gen que codifica la enzima, la introducción de una mutación en la enzima y la inhibición de la transcripción o traducción de un gen que codifica la enzima. Adicionalmente, en el proceso de recombinación

35 genética también se incluye un método en el que una célula recombinante genética se selecciona artificialmente.

En la presente descripción, la célula hospedadora incluye células de levadura, células de animales, células de insecto, células vegetales y similares. Como ejemplos de células se incluyen los descritos más adelante en el apartado 2. Específicamente, entre las células animales preferidas se encuentran una célula CHO derivada de tejido de ovario de hámster chino, una célula de la línea celular de mieloma de rata YB2/3HL P2.G11.16Ag.20, una célula de la línea celular de mieloma de ratón NSO, una célula de la línea celular de mieloma de ratón SP2/0-Ag14, una célula BHK derivada de tejido de riñón de hámster sirio, una célula de hibridoma productora de anticuerpos, una célula de línea celular leucémica humana Namalwa, una célula madre embrionaria y una célula huevo fertilizada.

45 Como ejemplos de células hospedadores se incluyen células hospedadoras que tienen las propiedades de los siguientes apartados (a) o (b):

(a): una célula en la que se modifica el genoma para tener actividad delecionada de una enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa;

(b): una célula en la que se modifica el genoma para tener actividad delecionada de una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena glucídica unida a Nglucósido de tipo complejo.

55 Como ejemplos de enzimas relacionadas con la síntesis del nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa, se incluyen GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD) y GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5-epimerasa (Fx).

En la presente invención, los ejemplos de la GDP-manosa 4,6-deshidratasa incluyen una proteína codificada por un ADN de los siguientes apartados (a) o (b), y una proteína de los siguientes apartados (c), (d) o (e):

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 7;

(b): un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 7 y que codifica una proteína que tiene actividad GDP-manosa 4,6deshidratasa;

65 (c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8;

(d): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos

están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8 y que tiene actividad GDP-manosa 4,6-deshidratasa;

(e): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la

secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8 y que tiene actividad GDP-manosa 4,65 deshidratasa.

En la presente invención, como ejemplos de la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5-epimerasa se incluyen una proteína codificada por un ADN de los siguientes apartados (a) o (b), y una proteína de los siguientes apartados (c),

(d) o (e):

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 9;

(b): un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº:9 y que codifica una proteína que tiene actividad GDP-4-ceto-6-desoxi-Dmanosa 3,5-epimerasa;

15 (c) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10;

(d): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10 y que tiene actividad GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5-epimerasa;

(e): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10 y que tiene actividad GDP-4-ceto-6-desoxi-Dmanosa 3,5-epimerasa.

Un ejemplo de enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena

25 glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, es la α1,6-fucosiltransferasa.

En la presente invención, como ejemplos de la α1,6-fucosiltransferasa se incluye una proteína codificada por un ADN de los siguientes apartados (a), (b), (c) o (d) y una proteína de los siguientes apartados (e), (f), (g), (h), (i) o (j):

(a): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 11;

(b): un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 12;

(c): un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 11 y que codifica una proteína que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa;

(d): un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos 35 representada por la SEC ID Nº: 12 y que codifica una proteína que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa;

(e): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 13;

(f): una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 14;

(g): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos, están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada la SEC ID Nº: 13 y que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa;

(h): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos, están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada la SEC ID Nº: 14 y que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa;

(i): una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la 45 secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 13 y que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa;

(j) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 14 y que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa;

Los ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de la GDP-manosa 4,6-deshidratasa incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 7, y un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 7 y que codifica una proteína que tiene actividad GDP-manosa 4,6-deshidratasa.

Los ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5-epimerasa

55 incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 9, y un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 9 y que codifica una proteína que tiene actividad GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5-epimerasa.

Los ADN que codifican las secuencias de aminoácidos de la α1,6-fucosiltransferasa incluyen un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por las SEC ID Nº: 11 ó 12 y un ADN que, en condiciones rigurosas, se hibrida con ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por las SEC ID Nº: 11 ó 12 y que codifica una proteína que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa.

En la presente descripción, el ADN que se hibrida en condiciones rigurosas se refiere a un ADN que se obtiene por 65 hibridación de colonias, hibridación de placas, hibridación de Southern o similar, usando, por ejemplo, como sonda, un ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos representada por las SEC ID Nº: 7, 9, 11 ó 12 o un fragmento de las mismas. Un ejemplo específico de un ADN de este tipo es un ADN que puede identificarse realizando hibridación a 65 ºC en presencia de 0,7 a 1,0 M de cloruro de sodio usando un filtro con un ADN derivado de placas

o colonias inmovilizado sobre el mismo, y después lavando el filtro a 65 ºC con una solución de SSC a una

5 concentración de 0,1 a 2 veces (solución de SSC a una concentración de 1 vez: cloruro de sodio 150 mM y citrato de sodio 15 mM). La hibridación puede realizarse de acuerdo con los métodos descritos en Molecular Cloning, A Laboratory Manual, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, segunda edición, Oxford University (1995), etc. Específicamente, el ADN capaz de hibridación, en condiciones rigurosas, incluye ADN que tiene al menos un 60% o más de homología, preferentemente un 70% o más de homología, más preferentemente un 80% o más de homología, aun más preferentemente un 90% o más de homología, particularmente de manera preferente un 95% o más de homología, más preferentemente un 98% o más de homología con la secuencia de nucleótidos representada por las SEC ID Nº: 7, 9, 11 ó 12.

En la presente descripción, la proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos

15 de aminoácidos están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8 y que tiene actividad GDP-manosa 4,6-deshidratasa, consistiendo la proteína en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10 y que tiene actividad GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5-epimerasa y consistiendo la proteína en una secuencia de aminoácidos en la que uno o más restos de aminoácidos están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos en la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 13 ó 14 y que tiene actividad α1,6-fucosiltransferasa, puede obtenerse, por ejemplo, introduciendo una mutación dirigida en el ADN que tiene la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 8, 10, 13 ó 14 por la mutagénesis dirigida descrita en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; Nucleic Adds Research, 10, 6487 (1982); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 79, 6409 (1982);

25 Gene, 34, 315 (1985); Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 82, 488 (1985), etc. La cantidad de restos de aminoácidos que están delecionados, sustituidos, insertados y/o añadidos es de uno o más y no está específicamente limitada, pero está dentro del intervalo en el que es posible la deleción, sustitución o adición mediante métodos conocidos tales como la mutagénesis dirigida mencionada anteriormente. La cantidad adecuada es de 1 a docenas, preferentemente de 1 a 20, más preferentemente de 1 a 10, aun más preferentemente de 1 a 5.

Además, la proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene un 80% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8, 10, 13 ó 14 y que tiene actividad GDP-manosa 4,6deshidratasa, actividad GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5-epimerasa o actividad α1,6-fucosiltransferasa incluye una proteína que tiene al menos un 80% o más de homología, preferentemente un 85% o más de homología, más

35 preferentemente un 90% o más de homología, aún más preferentemente un 95% o más de homología, particularmente de manera más preferente un 97% o más de homología, más preferentemente un 99% o más de homología con la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8, 10, 13 ó 14, respectivamente, calculada usando programas informáticos de análisis tal como BLAST [J. Mol. Biol, 215, 403 (1990)] o FASTA/Methods in Enzymology, 183, 63 (1990)].

Además, puede obtenerse un transformante capaz de producir la composición de antitrombina III de la presente invención introduciendo un ADN que codifica la molécula antitrombina III en una célula hospedadora en la que la actividad enzimática mencionada anteriormente está delecionada, es decir, una célula hospedadora en la que se modifica el genoma para tener actividad delecionada de la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido

45 glucídico intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo.

La modificación del genoma para tener actividad delecionada de la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo se refiere a la introducción de una mutación en una región de regulación de expresión de un gen para delecionar la expresión de la enzima o a la introducción de una mutación en la secuencia de aminoácidos de un gen para delecionar la función de la enzima. La

55 “introducción de una mutación” se refiere a realizar una modificación de la secuencia de nucleótidos sobre el genoma, tal como deleción, sustitución, inserción y/o adición, en la secuencia de nucleótidos. La inhibición completa de la expresión o función del gen genómico modificado de esta manera se refiere a "inactivar el gen genómico”. Los ejemplos de inactivación de gen genómico incluyen todo o una parte del gen diana delecionado del genoma. Las condiciones inactivadas pueden obtenerse delecionando la región genómica de un exón que contenga un codón de inicio del gen diana del cromosoma.

Como método para obtener tales células, puede usarse cualquier técnica, siempre que pueda modificarse el genoma de interés. Por ejemplo, para delecionar la actividad enzimática indicada anteriormente, pueden emplearse las siguientes técnicas:

(a): alteración genética dirigida en un gen que codifica la enzima;

(b): introducción de un mutante dominante-negativo de un gen que codifica la enzima;

(c): introducción de una mutación en la enzima;

(d): inhibición de la transcripción o traducción de un gen que codifica la enzima;

(e): selección de una línea celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena glucídica en

5 la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo.

Como lectina que reconoce una estructura de cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, puede usarse cualquier lecitina, siempre y cuando sea capaz de reconocer la estructura de cadena glucídica. Los ejemplos específicos incluyen lectina de lenteja LCA (derivada de aglutinina de lenteja de Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de guisante derivada de Pisum sativum), lectina de judía ancha VFA (aglutinina derivada de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina derivada de Aleuria aurantia).

15 La “célula resistente a una lectina” se refiere a una célula en la que el crecimiento no está inhibido por la presencia de una lectina y una concentración eficaz. La “concentración eficaz” es una concentración mayor a la concentración que no permite el crecimiento normal de una célula antes de la modificación del genoma (en lo sucesivo en el presente documento también se denomina línea celular parental), preferentemente igual a la concentración que no permite el crecimiento normal de una célula antes de la modificación genómica, más preferentemente de 2 a 5 veces, adicionalmente preferentemente 10 veces, más preferentemente 20 veces o más la concentración que no permite el crecimiento normal de una célula antes de la modificación del gen genómico.

La concentración eficaz de lectina que no inhibe el crecimiento puede determinarse apropiadamente de acuerdo con 25 cada línea celular. Esta es normalmente de 10 μg/ml a 10 mg/ml, preferentemente de 0,5 mg/ml a 2,0 mg/ml.

La célula antes de la modificación del gen genómico, es decir, la célula parental, incluye una célula antes de la aplicación de la técnica para la modificación del gen genómico que codifica la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa, o la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo. La célula antes de la modificación del gen genómico no está particularmente limitada, e incluye, como ejemplos preferidos, las siguientes células.

35 La célula parental de la célula NS0, antes de la modificación del gen genómico, incluye células NS0 descritas en bibliografías tales como BIOTECHNOLOGY, 10 169 (1992) y Biotechnol. Bioeng., 73,261 (2001). Adicionalmente, esta incluye la línea celular NS0 (RCB 0213) registrada en el Banco de Células RIKEN, The Institute of Physical and Chemical Research, las sublíneas celulares obtenidas naturalizando estas líneas celulares frente a diversos medios aséricos, y similares.

La célula parental de la célula SP2/0-Ag14, antes de la modificación del gen genómico, incluye células SP2/0-Ag14 descritas en bibliografías tales como J. Immunol., 126, 317 (1981), Nature, 276, 269 (1978) y Human Antibodies and Hybridomas, 3, 129 (1992). Adicionalmente, esta incluye la célula SP2/0-Ag14 (ATCC CRL-1581) registrada en la American Type Culture Collection (Colección Americana de Cultivos Tipo) (en lo sucesivo en el presente documento

45 indicada con las siglas ATCC), las sublíneas celulares obtenidas naturalizando estas líneas celulares frente a diversos medios aséricos (ATCC CRL-1581.1) y similares.

La célula parental de la célula CHO derivada de tejido de ovario de hámster chino, antes de la modificación del gen genómico, incluye células CHO descritas en bibliografías tales como Journal of Experimental Medicine, 108, 945 (1958), Proc. Natl. Acad Sci. USA, 60,1275 (1968), Genetics, 55, 513(1968), Chromosoma, 41, 129 (1973), Methods in Cell Science, 18, 115 (1996), Radiation Research, 148, 260 (1997), Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77, 4216 (1980), Proc. Natl. Acad Sci. USA, 60, 1275 (1968), Cell, 6, 121 (1975), Molecular Cell Genetics, Appendix I, II (p. 883-900) and Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986). Adicionalmente, esta incluye la línea celular CHO-K1 (ATCC CCL-61), la línea celular CHO/dhfr-(ATCC CRL-9096) y la línea celular Pro-5 (ATCC CRL-1781) registrada

55 en la ATCC, las sublíneas celulares obtenidas naturalizando estas líneas celulares frente a diversos medios aséricos y similares.

La célula parental de la célula BHK derivada de tejido de riñón de hámster sirio, antes de la modificación del gen genómico, incluye células BHK descritas en bibliografías tales como Proc R Soc Med, 56,1062 (1963) y Nature, 203,1355 (1964). Adicionalmente, esta incluye la línea celular BHK-21 (ATCC CCL-10) registrada en la ATCC, la línea celular CHO-S disponible en el mercado (catálogo Nº 11619 de Life Technologies), las sublíneas celulares obtenidas naturalizando estas líneas celulares frente a diversos medios aséricos y similares.

La célula parental de la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 de la línea celular de mieloma de rata, antes de la

65 modificación del gen genómico, incluye líneas celulares establecidas de la célula Y3/Ag1.2.3 (ATCC CRL-1631). Los ejemplos específicos incluyen la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 descrita en bibliografías tales como J. Cell Biol.,

93, 576 (1982) and Methods Enzymol., 73B, 1 (1981). Adicionalmente, esta incluye la célula YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 (ATCC CRL-1662) registrada en la ATCC, las sublíneas obtenidas naturalizando estas líneas celulares frente a diversos medios aséricos y similares.

5 Para la producción de antitrombina III de la presente invención las células incluyen una línea celular MS705 pKAN-ATIII 27 que es un transformante en el que un gen que codifica la antitrombina III se introduce en una célula CHO en la que un gen que codifica la α1,6-fucosiltransferasa está inactivado, una línea celular pKAN-ATIII AFMS705 obtenida naturalizando, frente un a medio asérico, un transformante en el que un gen que codifica la antitrombina III se introduce en una célula CHO en el que un gen que codifica la α1,6-fucosiltransferasa está inactivado, una línea celular pKAN-ATIII GMDKO obtenida por naturalizando, frente un a medio asérico, un transformante en el que un gen que codifica la antitrombina III se introduce en una célula CHO en el que un gen que codifica la GDP-manosa 4,6-deshidratasa está inactivado y similares.

La línea celular MS705 pKAN-ATI 1127 se depositó el 9 de septiembre del 2003 y las líneas celulares pKAN-ATI

15 11AFMS705 y pKAN-ATIII GMDKO se depositaron el 10 de agosto del 2004 en el Banco de Organismos de Patente Internacional del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Central 6,1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón con los números de entrada FERM BP-08472, FERM BP-10088 y FERM BP-10083, respectivamente.

Asimismo, la célula capaz de producir una variante, en la que la secuencia de aminoácidos está representada por la SEC ID Nº: 4, en la que la asparagina en la posición 135 se ha sustituido con glutamina, con actividad biológica similar a la de la composición de antitrombina III natural de la presente descripción (en lo sucesivo en el presente documento denominada variante de antitrombina III), incluye una línea celular pKAN-ATI IIN135Q AFMS705 obtenida naturalizando, frente a un medio asérico, un transformante en el que un gen que codifica la variante de

25 antitrombina III, representada por la SEC ID Nº: 40, se introduce en una célula CHO en la que un gen que codifica la α1,6-fucosiltransferasa está inactivado, y una línea celular pKAN-ATIII N135Q GMDKO obtenida naturalizando, frente a un medio asérico, un transformante en el que un gen que codifica la variante de antitrombina III, representada por la SEC ID Nº: 40, se introduce en una célula CHO en la que un gen que codifica la GDP-manosa 4,6-deshidratasa está inactivado.

Ambas líneas celulares pK-AN-ATIIIN135Q AFMS705 y KAN-ATIII N135Q GMDKO se depositaron el 10 de agosto del 2004 en el Banco de Organismos de Patente Internacional del Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, Central 6,1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón con los números de entrada FERM BP-10089 y FERM BP-10084, respectivamente.

35 La composición de antitrombina III con actividad biológica similar a la de la antitrombina III natural puede producirse usando los transformantes anteriores.

La fucosa que, en la composición de antitrombina III, no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, significa que la fucosa no se detecta sustancialmente cuando se somete a análisis de cadena glucídica descrito más adelante. El contenido de fucosa, que no se detecta sustancialmente, significa que el contenido de fucosa está por debajo del límite de detección.

La actividad biológica de la antitrombina III incluye actividad de unión a heparina, actividad de anticoagulación 45 sanguínea y similares.

La actividad de unión a heparina y la actividad de anticoagulación sanguínea de la composición de antitrombina III puede medirse mediante un ensayo in vitro tal como el método de medición de la actividad de antitrombina o el método de medición de la actividad cofactora de la heparina conocidos, mediante un ensayo in vivo usando un animal modelo para el síndrome de coagulación intravascular diseminada o similar (The Second Series of Pharmaceutical Research and Development, Volumen 20, Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japón (1992); The Course of Medicine (Igaku no Ayumi), 120, 1147 (1982); Japanese Pharmacology and Therapeutics, 17, 5843 (1989); Clinic and Research (Rinsyo to Kenkyu), 62, 3573 (1985); Clinic and Research (Rinsyo to Kenkyu), 62, 3688, 1985; Parmacometrics, 30, 589, (1985).

55 El proceso de la composición de antitrombina III se explica con detalle a continuación

1. Preparación de una célula hospedadora que produce la composición de antitrombina III.

La célula hospedadora usada para producir la composición de antitrombina III puede prepararse mediante los siguientes métodos:

(1) Alteración génica dirigida a un gen que codifica una enzima

65 La célula hospedadora usada para la preparación de la composición de antitrombina III puede prepararse mediante una técnica de alteración génica dirigida a un gen que codifica una enzima relacionada con la síntesis de un

nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa o una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo (en lo sucesivo, en el presente documento denominadas, enzimas relacionadas con la modificación de fucosa). Los ejemplos de las enzimas 5 relacionadas con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa incluyen la GDP-manosa 4,6deshidratasa (en lo sucesivo en el presente documento denominada GMD) y la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa 3,5epimerasa (en lo sucesivo en el presente documento denominada Fx). Los ejemplos de las enzimas relacionadas con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena glucídica unida a N-glucósido de

10 tipo complejo, incluyen la α1,6-fucosiltransferasa y la α-L-fucosidasa.

El gen, como se usa en el presente documento, incluye ADN y ARN.

El método de alteración genética puede ser cualquier método capaz de alterar el gen diana que codifica la enzima.

15 Los métodos útiles incluyen el método antisentido, el método ribozima, el método de recombinación homóloga, el método de oligonucleótidos de ARN-ADN (en lo sucesivo en el presente documento denominado método RDO), el método del ARN de interferencia (en lo sucesivo en el presente documento denominado método ARNi), el método que usa un retrovirus y el método que usa un transposón. Estos métodos se describen específicamente más

20 adelante.

(a) Preparación de la célula hospedadora para la producción de la composición de antitrombina III de la presente invención mediante el método antisentido o el método ribozima.

25 La célula hospedadora usada para la preparación de la composición de antitrombina III puede prepararse por el método antisentido o el método ribozima descrito en Cell Technology, 12, 239 (1993); BIO/TECHNOLOGY, 17, 1097 (1999); Hum. Mol. Genet., 5, 1083 (1995); Cell Technology, 13, 255 (1994); Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 96, 1886 (1999); etc., dirigidos a un gen que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, por ejemplo, de la siguiente manera.

30 Se prepara un ADNc o ADN genómico que codifican las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

Se determina la secuencia de nucleótidos del ADNc o del ADN genómico preparados.

35 Basándose en la secuencia de ADN determinada, se diseña un gen antisentido o una ribozima de longitud apropiada que comprende un fragmento de ADN que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, regiones no traducidas e intrones.

Para expresar el gen antisentido o la ribozima en una célula, se prepara un vector recombinante insertando un 40 fragmento o la longitud completa del ADN preparado en un sitio cadena debajo de un promotor en un vector de expresión apropiado.

El vector recombinante se introduce en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión para obtener un transformante.

45 La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III de la presente invención puede obtenerse seleccionando un transformante usando, como marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa. La célula hospedadora usada para la producción de la composición antitrombina III de la presente invención puede también obtenerse seleccionando un transformante usando, como marcador, la

50 estructura de cadena glucídica de una glucoproteína sobre la membrana celular o la estructura de cadena glucídica de la molécula de glucoproteína producida.

Como célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III de la presente invención, puede usarse cualquier célula de levadura, célula de animal, célula de insecto, célula vegetal o similar siempre que 55 esta posea un gen diana que codifique las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa. Como ejemplos de células hospedadoras se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante.

Los vectores de expresión que pueden emplearse son aquellos que son capaces de replicación autónoma o de integración en el cromosoma en las células hospedadoras anteriores y que comprenden un promotor en una 60 posición apropiada para la transcripción del gen antisentido o ribozima diseñados. Como ejemplos de vectores de expresión se incluyen los descritos en el aparatado 2 más adelante.

La introducción de un gen en diversas células hospedadoras puede realizarse mediante los métodos adecuados para la introducción de un vector recombinante en diversas células hospedadoras descritos en el apartado 2 más 65 adelante.

La selección de un transformante usando, como marcador, la actividad de las encimas relacionadas con la modificación de glucosa puede realizarse, por ejemplo, mediante los siguientes métodos.

Métodos para seleccionar un transformante.

5 Determinando la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, puede seleccionarse una célula en la que la actividad de una enzima relacionada con la síntesis de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa está delecionada, usando métodos bioquímicos o técnicas de modificación por ingeniería genética descritas en Shin Seikagaku Jikken Koza (New Lectures on Experiments in Biochemistry) 3 -Saccharides I, Glycoprotein (Tokyo Kagaku Dojin), editado por The Japanese Biochemical Society (1988); Cell Technology, edición extra, Experimental Protocol Series, Glycobiology Experimental Protocol, Glycoprotein, Glycolipid and Proteoglycan (Shujunsha), editado por Naoyuki Taniguchi, Akemi Suzuki, Kiyoshi Furukawa and Kazuyuki Sugawara (1996); Molecular Cloning, Second Edition; Current Protocols in Molecular Biology; y similares. Como ejemplo de los métodos bioquímicos es un método en el que la actividad enzimática se evalúa usando un sustrato específico de

15 enzima. Los ejemplos de técnicas de modificación por ingeniería genética incluyen análisis de Northern y RT-PCR en los que se mide la cantidad de ARNm para un gen que codifica la enzima.

La selección de un transformante usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una glucoproteína sobre la membrana celular puede realizarse, por ejemplo, mediante el método descrito en el apartado 1(5) más adelante. La selección de un transformante usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida puede realizarse, por ejemplo, mediante los métodos descritos en los apartados 4 y 5 más adelante.

La preparación de un ADNc que codifica las enzimas relacionadas con la modificación con fucosa puede realizarse, 25 por ejemplo, mediante el siguiente método.

Preparación de ADNc

Se preparó ARN total o ARNm a partir de diverso tejido celular hospedador o célula hospedadora.

Se preparó una genoteca de ADNc a partir del ARN total o ARNm.

Se prepararon cebadores degenerativos basándose en la secuencia de aminoácidos de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa y por PCR se obtuvo un fragmento génico, que codificaba las enzimas relacionadas

35 con la modificación de fucosa, usando, como molde, la genoteca de ADNc preparada.

Explorando la genoteca de ADNc usando, como sonda, el fragmento génico obtenido, puede obtenerse un ADNc que codifique las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

Como ARNm puede usarse un tejido o una célula animal de ser humano o no humano, ARNm disponible en el mercado (fabricado, por ejemplo, por Clontech), o puede prepararse a partir de un tejido o célula animal de ser humano o no humano de la siguiente manera.

Los métodos para preparar ARN total, a partir de un tejido o una célula animal de ser humano o no humano,

45 incluyen el método de tiocianato de guanidina-trifluoroacetato de cesio [Methods in Enzymology, 154, 3 (1987)], el método de guanidinio ácido fenolcloroformo (AGPC) [Analytical Biochemistry, 162, 156 (1987); Experimental Medicine, 9 193 7 (1991)] y similares.

Los métodos para preparar ARNm como poli(A)+ARN a partir del ARN total incluyen el método de columna de oligo (dT) celulosa inmovilizado (Molecular Cloning, segunda edición).

También es posible preparar ARNm usando un kit disponible en el mercado tal como el Kit de Aislamiento de ARNm Fast Track (fabricado por Invitrogen) o el Kit de Purificación de ARNm Quick Prep (fabricado por Pharmacia).

55 A partir del ARNm obtenido de un tejido o una célula animal de ser humano o no humano se preparó una genoteca de ADNc. Los métodos para preparar la genoteca de ADNc incluyen los métodos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989); etc.; y los métodos que usan kits disponibles en el Mercado tales como Superscript Plasmid System y Plasmid Cloning (fabricado por Life Technologies) para la síntesis de ADNc y el kit de Síntesis de ADNc ZAP (fabricado por STRATAGENE).

Como vector de clonación, para preparar la genoteca de ADNc, puede usarse cualquiera vector, por ejemplo, vectores de fagos y vectores de plásmidos, siempre y cuando se repliquen de manera autónoma en Escherichia coli K12. Ejemplos de vectores adecuados incluyen ZAP Express [fabricado por STRATAGENE; Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+) [Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λZAP II (fabricado por STRATAGENE),

65 Xgt10, λgt11 [DNA Cloning, A Practical Approach, 1, 49 (1985)], λTriplEx (fabricado por Clontech), λExCell (fabricado por Pharmacia), pT7T318U (fabricado por Pharmacia), pcD2 [Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)] y pUC18 [Gene, 33, 103 (1985)].

Como microorganismo hospedador puede usarse cualquier microorganismo para preparar la genoteca de ADNc aunque se usa preferentemente Escherichia coli. Son ejemplos de microorganismos hospedadores adecuados

5 Escherichia coli XL1-Blue MRF’ [fabricado por STRATAGENE; Strategies, 5, 81 (1992)], Escherichia coli C600 [Genetics, 39, 440 (1954)], Escherichia coli Y1088 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli Y1090 [Science, 222, 778 (1983)], Escherichia coli NM522 [J. Mol Biol., 166, 1 (1983)], Escherichia coli K802 [J. Mol Biol., 16, 118 (1966)] y Escherichia coli JM105 [Gene, 38, 275 (1985)].

En el análisis posterior, la genoteca de ADNc puede usarse tal cual. Como alternativa, para obtener eficazmente los ADNc de longitud completa disminuyendo la proporción de los ADNc parciales, en el análisis posterior puede usarse una genoteca de ADNc preparada usando el método oligo-cap desarrollado por Sugano, et al. [Gene, 138, 171 (1994); Gene, 200 149 (1997); Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 41, 603 (1996); Experimental Medicine, 11 2491 (1993); clonación de ADNc (Yodosha) (1996); Methods for Preparing Gene Libraries (Yodosha) (1994)].

15 Puede obtenerse un fragmento génico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa preparando cebadores degenerativos específicos para las secuencias de nucleótidos del extremo 5’ y extremo 3’ que se supone que codifican la secuencia de aminoácidos de la enzima relacionada con la modificación de fucosa y amplificando ADN por PCR [PCR Protocols, Academic Press (1990)] usando, como molde, la genoteca de ADNc preparada.

Puede confirmarse que el fragmento génico obtenido es un ADN que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa analizando la secuencia de nucleótidos por métodos generalmente empleados, tales como el método didesoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad Scl. U.S.A., 74, 5463 (1977)] o usando secuenciadores

25 nucleotídicos tales como el Secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por Applied Blosystems).

Puede obtenerse un ADN que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa a partir de ADNc o de una genoteca de ADNc sintetizada a partir de ARNm contenido en un tejido o una célula animal de ser humano o no humano por hibridación de colonias o hibridación de placas (Molecular Cloning, segunda edición) usando, como sonda, el fragmento génico anterior.

También puede obtenerse un ADNc que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa por amplificación mediante PCR usando, como molde, el ADNc o la genoteca de ADNc sintetizada a partir del ARNm contenido en un tejido o una célula animal de ser humano o no humano y usando los cebadores usados para

35 obtener el fragmento génico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

La secuencia de nucleótidos del ADN obtenido que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa puede determinarse empleando generalmente métodos de secuenciación, tales como el método didesoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463 (1977)] o usando secuenciadores nucleotídicos tal como el Secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por Applied Biosystems).

Realizando una búsqueda de bases de datos de secuencias de nucleótidos tal como GenBank, EMBL o DDBJ usando un programa de búsqueda de homología tal como BLAST basado en la secuencia de nucleótidos determinada del ADNc, puede confirmarse que el ADN obtenido es un gen que codifica las enzimas relacionadas

45 con la modificación de fucosa entre los genes en la base de datos de secuencias de nucleótidos.

Son ejemplos de secuencias de nucleótidos de los genes que codifican la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa obtenidas mediante los métodos anteriores las que incluyen las secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 7 y 9.

Son ejemplos de secuencias de nucleótidos de los genes que codifican la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor, a través de un enlace α, en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, obtenidas mediante los métodos anteriores las que incluyen las secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID Nº:

55 11 y 12.

El ADNc que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa también puede obtenerse por síntesis química con un sintetizador de ADN, tal como el Sintetizador de ADN Modelo 392 (fabricado por Perkin Elmer) utilizando el método de fosforoamidita basándose en la secuencia de nucleótidos del ADN determinada.

La preparación de un ADN genómico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa puede realizarse, por ejemplo, mediante el siguiente método.

Método para preparar ADN genómico

65 El ADN genómico puede prepararse por métodos conocidos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; etc. Además, puede obtenerse el ADN genómico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa usando un kit tal como el kit para el Sistema de Exploración de genotecas de ADN genómico (fabricado por Genome Systems) o el kit Universal GenomeWalker™ (fabricado por CLONTECH).

5 La secuencia de nucleótidos del ADN obtenido que codifica la enzima relacionada con la modificación de fucosa puede determinarse empleando generalmente métodos de secuenciación tales como el método didesoxi de Sanger, et al. [Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 74, 5463 (1977)] o usando secuenciadores nucleotídicos tal como el Secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por Applied Biosystems).

10 Realizando una búsqueda de bases de datos de secuencias de nucleótidos tal como GenBank, EMBL o DDBJ usando un programa de búsqueda de homología tal como BLAST basado en la secuencia de nucleótidos determinada del ADN genómico, puede confirmarse que el ADN obtenido es un gen que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa entre los genes en la base de datos de secuencias de nucleótidos.

15 El ADN genómico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa también puede obtenerse por síntesis química con un sintetizador de ADN tal como el Sintetizador de ADN Modelo 392 (fabricado por Perkin Elmer) utilizando el método de fosfoamidita basado en la secuencia de nucleótidos de ADN determinada.

20 Son ejemplos de secuencias de nucleótidos de los ADN genómicos que codifican la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa obtenidas por los métodos anteriores las que incluyen las secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 15, 16, 17 y 18.

Un ejemplo de la secuencia de nucleótidos del ADN genómico que codifica la enzima relacionada con la

25 modificación de una cadena glucídica, en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor, a través de un enlace α , en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, obtenida por los métodos anteriores, es la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº:

19.

30 La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III también puede obtenerse sin usar ningún vector de expresión, introduciendo directamente en una célula hospedadora un oligonucleótido antisentido o una ribozima diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

35 El oligonucleótido antisentido o la ribozima pueden prepararse mediante métodos conocidos o usando un sintetizador de ADN.

Específicamente, basándose en la información de secuencia en un oligonucleótido que tiene una secuencia correspondiente a de 5 a 150, preferentemente de 5 a 60, más preferentemente de 10 a 40 nucleótidos en la

40 secuencia de nucleótidos del ADNc o ADN genómico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, puede sintetizarse un oligonucleótido que se corresponda con la secuencia complementaria con respecto al oligonucleótido anterior (oligonucleótido antisentido) o una ribozima que comprenda la secuencia de oligonucleótidos.

45 El oligonucleótido incluye oligo ARN y derivados del oligonucleótido (en lo sucesivo en el presente documento denominados derivados oligonucleotídicos).

Los derivados oligonucleotídicos incluyen un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, el enlace fosfodiéster se convierte en un enlace fosforotioato, un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, el 50 enlace fosfodiéster se convierte en un enlace N3’-P5’ fosfoamidato, un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, el enlace ribosa-fosfodiéster se convierte en un enlace péptido-ácido nucleico, un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, el uracilo se sustituye por propiniluracilo en C-5, un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, el uracilo se sustituye por tiazoliluracilo en C-5, un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, la citosina se sustituye por propinilcitosina en C-5, un derivado

55 oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, la citosina se sustituye por citosina modificada con fenoxazina, un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, la ribosa se sustituye por 2’-O-propilribosa y un derivado oligonucleotídico en el que, en el oligonucleótido, la ribosa se sustituye por 2’-metoxietoxiribosa [Cell Technology, 16, 1463 (1997)].

60 (b) preparación de la célula hospedadora para la producción de la composición de Antitrombina III mediante el método de recombinación homóloga

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse modificando, en el cromosoma, un gen diana que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, 65 usando el método de recombinación homóloga.

La modificación del gen diana en el cromosoma puede realizarse usando, por ejemplo, los métodos descritos en Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Segunda Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994) (en lo sucesivo, en el presente documento denominado Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual);Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8,

5 Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice Using ES Cells, Yodosha (1995) (en lo cucesivo, en el presente documento denominado Preparation of Mutant Mice Using ES Cells); etc., de la siguiente manera.

Se prepara un ADN genómico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

Basándose en la secuencia de nucleótidos del ADN genómico, se prepara un vector diana para modificar por recombinación homóloga un gen diana (por ejemplo, el gen estructural o el gen promotor para las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa).

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse

15 introduciendo, en una célula hospedadora, el vector diana preparado y seleccionando una célula en la que en el cromosoma se genere recombinación homóloga entre el gen diana y el vector diana.

Como célula hospedadora, puede usarse cualquier célula de levadura, de animal, de insecto, de planta o similar siempre que esta posea un gen diana que codifique las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa. Como ejemplos de células hospedadoras se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante.

El ADN genómico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa puede prepararse mediante los métodos de preparación de ADN genómico descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior o similar.

25 Como ejemplos de las secuencias de nucleótidos de los ADN genómicos que codifican la enzima relacionada con la síntesis del nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa obtenidas por los métodos anteriores se incluyen las secuencias de nucleótidos representadas por las SEC ID Nº: 15, 16, 17 y 18.

Un ejemplo de una secuencia de nucleótidos del ADN genómico que codifica la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica, en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor, a través de un enlace α, en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, obtenida por los métodos anteriores, es la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº:

19.

35 El vector diana para usar en la recombinación homóloga del gen diana en el cromosoma puede prepararse de acuerdo con los métodos descritos en Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Preparation of Mutant Mice Using ES Cells; etc. Como vector diana, puede usarse una sustitución tipo o una inserción tipo.

La introducción del vector diana en diversas células hospedadoras puede realizarse mediante los métodos adecuados para introducir un vector recombinante en diversas células hospedadoras descritos en el apartado 2 más adelante.

Para seleccionar eficazmente un recombinante homólogo, los métodos incluyen, selección positiva, selección de

45 promotor, selección negativa y selección poli A, descritos en Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Preparation of Mutant Mice Using ES Cells; etc. Los métodos para seleccionar el recombinante homólogo deseado a partir de líneas celulares seleccionadas incluyen hibridación de Southern (Molecular Cloning, segunda edición) y PCR [Protocolos PCR, Academic Press (1990)] con el ADN genómico.

(c) Preparación de la célula hospedadora para la producción de la composición de antitrombina III por el método RDO

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse, por ejemplo, mediante el método RDO dirigido a un gen que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de

55 fucosa, de la siguiente manera.

A través de los métodos descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior, se prepara un ADNc o un ADN genómico que codifica la enzima relacionada con la modificación de fucosa.

Se determina la secuencia de nucleótidos del ADNc o ADN genómico preparados.

Basándose en la secuencia de ADN determinada, se diseña y se sintetiza una construcción RDO de longitud apropiada que comprende un ADN que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, regiones no traducidas e intrones.

65 La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede obtenerse introduciendo la construcción de RDO sintetizada en una célula hospedadora y después seleccionando un transformante en el que se haya producido una mutación en la enzima diana, es decir, las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

5 Como célula hospedadora, puede usarse cualquier célula de levadura, célula de animal, célula de insecto, célula vegetal o similar siempre que esta posea un gen diana que codifique las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa. Como ejemplos de células hospedadoras se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante.

La introducción de la construcción de RDO en diversas células hospedadoras puede realizarse mediante los métodos adecuados para introducir un vector recombinante en diversas células hospedadoras descritos en el apartado 2 más adelante.

El ADNc que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa puede prepararse mediante los métodos para preparar un ADNc descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior, o similares

15 El ADN genómico que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa puede prepararse mediante los métodos para preparar un ADN genómico descrito en el apartado 1 (1) (a) anterior o similares.

Después de escindir ADN con enzimas de restricción apropiadas, la secuencia de nucleótidos del ADN puede determinarse subclonando los fragmentos de ADN en un plásmido, tal como pBluescript SK(-) (fabricado por Stratagene), sometiendo los clones a la reacción generalmente usada como un método para analizar una secuencia de nucleótidos, tal como el método de desoxi de Sanger et al. [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 74, 5463 (1977)] o similar, y después analizando los clones usando un analizador de secuencias de nucleótidos automático, tal como el Secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por Applied Biosystems) o similar.

25 La construcción RDO puede prepararse por métodos convencionales o usando un sintetizador de ADN.

Los métodos para seleccionar una célula en la que se produce una mutación introduciendo la construcción RDO en la célula hospedadora, en el gen que codifica la enzima diana, es decir, las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, incluyen los métodos para detectar directamente mutaciones en genes cromosómicos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols in Molecular Biology; etc.

Para la selección del transformante, también pueden emplearse los siguientes métodos: el método que usa, como marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, como se describe en el apartado

35 1 (1) (a) anterior; el método que usa, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una glucoproteína sobre la membrana celular descrito en el apartado 1 (5) más adelante; y el método que usa, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida, descrito en los apartados 4 y 5 más adelante.

La construcción de RDO puede diseñarse de acuerdo con las descripciones en Science, 273, 1386 (1996); Nature Medicine, 4, 285 (1998); Hepatology, 25, 1462 (1997); Gene Therapy, 5, 1960 (1999); J. Mol. Med., 75, 829 (1997); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 8774 (1999); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96, 8768 (1999); Nuc. Acids Res., 27, 1323 (1999); Invest. Dermatol., 111, 1172 (1998); Nature Biotech., 16, 1343 (1998); Nature Biotech., 18, 43 (2000); Nature Biotech., 18, 555 (2000); etc.

45 (d) Preparación de la célula hospedadora para la producción de la composición de antitrombina III mediante el método de ARNi.

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse, por ejemplo, mediante el método de ARNi dirigido a un gen que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, de la siguiente manera.

Mediante los métodos descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior, se prepara un ADNc que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

55 Se determina la secuencia de nucleótidos del ADNc preparado.

Basándose en la secuencia de ADNc determinada, se diseña la construcción de un gen de ARNi de longitud apropiada que comprende un ADN que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, o regiones no traducidas.

Para expresar el gen de ARNi en una célula, se prepara un vector recombinante insertando, en un vector de expresión apropiado, un fragmento o la longitud completa del ADNc preparado, en un sitio cadena debajo de un promotor.

65 Para obtener un transformante, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora, adecuada para el vector de expresión.

La célula hospedadora usada para la producción de una composición de antitrombina III puede obtenerse seleccionando un transformante usando, como marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa o la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida o una

5 glucoproteína en la membrana celular. Como célula hospedadora puede usarse cualquier célula de levadura, célula de animal, célula de insecto, célula vegetal o similar siempre que esta posea un gen que codifique las enzimas diana relacionadas con la modificación de fucosa. Como ejemplos de células hospedadoras se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante.

10 Pueden usarse los vectores de expresión capaces de replicación autónoma o de integración en el cromosoma en las células hospedadoras anteriores y que comprenden un promotor en una posición apropiada para la transcripción del gen de ARNi diseñado. Como ejemplos de vectores de expresión se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante.

15 La introducción de un gen en diversas células hospedadoras puede realizarse mediante los métodos adecuados para introducir un vector recombinante en diversas células hospedadoras descritos en el apartado 2 más adelante.

Los métodos para seleccionar el transformante usando, como marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa incluyen los métodos descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior.

20 Los métodos para seleccionar el transformante usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una glucoproteína en la membrana celular incluyen el método descrito en el apartado 1 (5). Los métodos para seleccionar el transformante usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida incluyen los métodos descritos en los apartados 4 ó 5 más adelante.

25 El ADNc que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa puede prepararse mediante los métodos para preparar un ADNc descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior o similares.

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III también puede obtenerse sin

30 usar ningún vector de expresión, introduciendo directamente, en una célula hospedadora, el ARNsi (ARN corto de interferencia) diseñado basándose en la secuencia de nucleótidos que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa.

El gen de ARNsi puede prepararse mediante métodos conocidos o usando un sintetizador de ADN.

35 La construcción del gen de ARNsi puede diseñarse de acuerdo con las descripciones en Nature, 391, 806 (1998); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95,15502 (1998); Nature, 395, 854 (1998); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96, 5049 (1999); Cell, 95,1017 (1998); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 96, 1451 (1999); Proc. Natl. Acad Sci. USA, 95, 13959 (1998); Nature Cell Biol., 2, 70 (2000); o similares.

(e) Preparación de la célula hospedadora para la producción de la composición de antitrombina III mediante el método que usa un transposón

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse usando el

45 sistema de transposón descrito en Nature Genet., 25, 35 (2000) o similar y después seleccionando un mutante, usando, como marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, o la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida o una glucoproteína en la membrana celular.

El sistema transposón es un sistema para inducir, por inserción al azar, una mutación de un gen exógeno dentro del

50 cromosoma, en el que normalmente un gen exógeno insertado en un transposón se usa como vector para inducir una mutación y al mismo tiempo, en la célula, se introduce un vector de expresión de transposasa para insertar al azar el gen dentro del cromosoma.

Puede usarse cualquier transposasa siempre que sea adecuada para la secuencia del transposón que vaya a 55 usarse.

Como gen exógeno, puede usarse cualquier gen siempre y cuando este pueda inducir una mutación en el ADN de una célula hospedadora.

60 Como célula hospedadora, puede usarse cualquier célula de levadura, célula de animal, célula de insecto, célula vegetal o similar siempre y cuando esta posea un gen que codifique las enzimas dianas relacionadas con la modificación de fucosa. Como ejemplos de células hospedadoras se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante. La introducción del gen en diversas células hospedadoras puede realizarse mediante los métodos adecuados para introducir un vector recombinante en diversas células hospedadoras descritos en el apartado 2 más

65 adelante.

Los métodos para seleccionar el mutante usando, como marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa incluye los métodos descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior.

Los métodos para seleccionar el mutante usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una

5 glucoproteína en la membrana celular incluye el método descrito en el apartado 1 (5). Los métodos para seleccionar el mutante usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida incluyen los métodos descritos en 4 y 5 más adelante.

(2) Técnica de introducción de un mutante dominante-negativo de un gen que codifica una enzima.

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse usando el método de introducción de un mutante dominante-negativo de un gen diana, es decir, un gen que codifica una enzima relacionada con la modificación de fucosa. Como ejemplos de enzimas relacionadas con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular GDP-fucosa se incluyen la GMD y la Fx. Como ejemplos de enzimas relacionadas

15 con la modificación de una cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, se incluyen la α1,6-fucosiltransferasa y α-L-fucosidasa.

Estas enzimas tienen especificidad de sustrato y catalizan reacciones específicas. Alterando el centro activo de tales enzimas, con especificidad de sustrato y acción catalítica, pueden prepararse sus mutantes dominantes-negativos. La preparación de un mutante dominante -negativo se describe con detalle más adelante, usando para un ejemplo GMD entre las enzimas diana.

Como resultado del análisis de la estructura terciaria de la GMD derivada de Escherichia coli, se ha revelado que

25 cuatro aminoácidos (la treonina en la posición 133, el ácido glutámico en la posición 135, la tirosina en la posición 157 y la lisina en la posición 161) tienen una importante función para la actividad enzimática (Structure, 8, 2, 2000). Esto es, todos los mutantes preparados sustituyendo los cuatro aminoácidos anteriores con otros aminoácidos, basándose en la información de la estructura terciaria, presentarán una actividad enzimática significativamente disminuida. Por otro lado, se observó un pequeño cambio en la capacidad de los mutantes para unirse a la coenzima NADP de la GMD o a la GDP manosa sustrato. Por consiguiente, puede prepararse un mutante dominante-negativo sustituyendo los cuatro aminoácidos, que son responsables de la actividad enzimática de la GMD. Basándose en el resultado de la preparación de un mutante dominante-negativo de la GMD derivada de Escherichia coli, pueden prepararse mutantes dominantes-negativos de otras GMD realizando comparación de homología y predicción de estructura terciaria usando la información de las secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, en el caso de la GMD

35 derivada de células CHO (SEC ID Nº: 8), puede prepararse un mutante dominante negativo sustituyendo la treonina en la posición 155, el ácido glutámico en la posición 157, la tirosina en la posición 179 y la lisina en la posición 138 con otros aminoácidos. La preparación de tal gen introduciendo sustituciones de aminoácidos puede realizarse por la mutagénesis dirigida a sitio descrita en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocolos in Molecular Biology; etc.

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse de acuerdo con el método de introducción de genes descrito en Molecular Cloning, segunda edición, Current Protocolos in Molecular Biology; Manipulating the Mouse Embryo, segunda edición; etc. usando un gen que codifica un mutante dominante-negativo de una enzima diana (en lo sucesivo, en el presente documento, para abreviar se denominará

45 gen mutante dominante-negativo) preparado, por ejemplo, como se ha indicado anteriormente, de la siguiente manera.

Se prepara un gen mutante dominante-negativo que codifica las enzimas relacionadas con las modificaciones de fucosa.

Basándose en el ADN de longitud completa del gen mutante dominante-negativo preparado, de acuerdo con las necesidades, se prepara un fragmento de ADN de longitud apropiada que contenga una región que codifique la proteína.

55 Insertando el fragmento de ADN, o el ADN de longitud completa, en un sitio cadena abajo de un promotor, en un vector de expresión apropiado, se prepara un vector recombinante

Para obtener un transformante, el vector recombinante se introduce en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede obtenerse seleccionando un transformante usando, como marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, o la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida o una glucoproteína en la membrana celular.

65 Como célula hospedadora, puede usarse cualquier célula de levadura, célula de animal, célula de insecto, célula vegetal o similar siempre que esta posea un gen que codifique las enzimas diana relacionadas con la modificación de fucosa. Como ejemplos de células hospedadoras se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante.

Pueden usarse los vectores de expresión capaces de replicación autónoma o integración en el cromosoma en las

5 células hospedadoras anteriores y que comprenden un promotor en una posición apropiada para la transcripción del ADN que codifica el mutante dominante-negativo deseado. Como ejemplos de vectores de expresión se incluyen los descritos en el apartado 2 más adelante.

La introducción de un gen en diversas células hospedadoras puede realizarse mediante los métodos adecuados para introducir un vector recombinante en diversas células hospedadoras descritos en el apartado 2 más adelante.

Los métodos para seleccionar el transformante usando, como un marcador, la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa incluyen los métodos descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior.

15 Los métodos para seleccionar el transformante, usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una glucoproteína en la membrana celular incluyen el método descrito en el apartado 1 (5) más adelante. Los métodos para seleccionar el transformante usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida incluyen los métodos descritos en los apartados 4 y 5 más adelante.

(3) Técnicas para introducir una mutación en una enzima

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III puede prepararse introduciendo una mutación en un gen que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa y después seleccionando una línea celular deseada en la que la mutación se haya generado en la enzima.

25 Como ejemplos de enzimas relacionadas con la síntesis del nucleótido glucídico intracelular, GDP-fucosa se incluyen la GMD y la Fx. Como ejemplos de enzimas relacionadas con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo reductor, a través de un enlace α, en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, se incluyen la α1,6-fucosiltransferasa y la α-L-fucosidasa.

Los métodos para introducir una mutación en las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa incluyen: 1) un método en el que se selecciona una línea celular deseada a partir de mutantes obtenidos sometiendo una línea celular parental a mutagénesis o por mutación espontánea usando, como marcador la actividad de las enzimas

35 relacionadas con la modificación de fucosa; 2) un método en el que se selecciona una línea celular deseada a partir de mutantes obtenidos sometiendo una línea celular parental a mutagénesis o por mutación espontánea usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida; y 3) un método en el que se selecciona una línea celular deseada a partir de mutantes obtenidos sometiendo una línea celular parental a mutagénesis o por mutación espontánea usando, como marcador, la estructura de cadena glucídica de una glucoproteína en la membrana celular.

La mutagénesis puede realizarse mediante cualquier método que sea capaz de inducir una mutación puntual, una mutación por deleción o una mutación por desplazamiento de fase en el ADN de una célula de una línea celular parental.

45 Como ejemplos de métodos adecuados se incluye el tratamiento con etil nitrosourea, nitrosoguanidina, benzopireno

o un colorante de acridina y tratamiento con radiación. Como mutágenos pueden usarse diversos agentes alquilantes y carcinógenos. Un mutágeno se deja actuar sobre una célula mediante los métodos descritos en Soshiki Baiyo no Gijutsu (Tissue Culture Techniques), tercera edición (Asakura Shoten), editado por The Japanese Tissue Culture Association (1996), Nature Genet., 24, 314 (2000); o similares.

Como ejemplos de mutantes generados por mutación espontánea se incluyen mutantes espontáneos obtenidos por subcultivo permanente en condiciones de cultivo celulares normales sin ningún tratamiento particular para mutagénesis.

55 Como métodos para medir la actividad de las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa se incluyen los métodos descritos en el apartado 1 (1) (a) anterior. Como métodos para determinar la estructura de cadena glucídica de una molécula de glucoproteína producida se incluyen los métodos descritos en los apartados 4 y 5 más adelante. Como métodos para determinar la estructura de cadena glucídica de una glucoproteína en la membrana celular se incluye el método descrito en el apartado 1 (5).

(4) Técnicas de supresión de la transcripción o la traducción de un gen que codifica una enzima

La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III de la presente invención

65 puede prepararse suprimiendo la transcripción o la traducción de un gen diana, es decir, un gen que codifica las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, usando la técnica de ARN/ADN antisentido [Bioscience and Industry, 50, 322 (1992); Chemistry, 46, 681 (1991); Biotechnology, 9, 358 (1992); Trends in Biotechnology, 10, 87 (1992); Trends in Biotechnology, 10, 152(1992); Cell Technology, 16, 1463 (1997)], la técnica de la triple hélice [Trends in Biotechnology, 10, 132(1992)], o similares.

5 Como ejemplos de enzimas relacionadas con la síntesis del nucleótido glucídico intracelular CDG-fucosa se incluyen la GMD y la Fx. Como ejemplos de enzimas relacionadas con la modificación de una cadena glucídica, en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de N-acetilglucosamina en el extremo reductor, a través de un enlace α, en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo, se incluyen la α1,6-fucosiltransferasa y la α-L-fucosidasa.

(5) Técnicas de selección de una línea celular resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de Nacetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo.

15 La célula hospedadora usada para la producción de la composición de antitrombina III de la presente invención puede prepararse seleccionando una línea celular resistente a una lectina que reconozca una estructura de cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de Nacetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo.

20 El método de selección de una línea celular resistente a una lectina que reconozca una estructura de cadena glucídica en la que, a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor de una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo puede realizarse, por ejemplo, mediante el método que usa una lectina descrito en Somatic Cell Mol. Genet., 12, 51 (1986), etc.

25 Como lectina, puede usarse cualquier lectina, siempre y cuando esta reconozca una estructura de cadena glucídica en la que , a través de un enlace α, la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo. Como ejemplos específicos de incluyen lectina de lenteja LCA (aglutinina de lenteja derivada de Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de

30 guisante derivada Pisum sativum), lectina de judía ancha VFA (aglutinina derivada de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia AAL (lectina derivada de Aleuria aurantia).

Específicamente, la línea celular de la presente invención resistente a una lectina que reconoce una estructura de cadena glucídica en la que, a través de un enlace α , la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N

35 acetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo puede seleccionarse cultivando células en un medio que contenga la lectina anterior a una concentración de 1μg/ml a 1 mg/ml durante un día a 2 semanas, preferentemente durante un día a una semana, subcultivando células supervivientes o recogiendo una colonia y transfiriéndola a un recipiente de cultivo y posteriormente continuando el cultivo usando el medio que contenga la lectina.

2. Proceso para producir la composición de antitrombina III de la presente invención

La composición de antitrombina III de la presente invención puede obtenerse expresándola en una célula hospedadora usando, por ejemplo, los métodos descritos en Molecular Cloning, segunda edición; Current Protocols

45 in Molecular Biology; Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 (en lo sucesivo en el presente documento denominado Antibodies); Monoclonal Antibodies:Principles and Practice, tercera edición, Acad. Press, 1993 (en lo sucesivo en el presente documento denominado Monoclonal Antibodies); Antibody Engineering, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, 1996 (en lo sucesivo en el presente documento denominado Antibody Engineering); etc., de la siguiente manera.

50 Se prepara un ADNc de longitud completa que codifique una molécula de antitrombina III y se prepara un fragmento de ADN de longitud apropiada que comprenda una región que codifique la molécula de antitrombina III.

Se prepara un vector recombinante insertando, en un vector de expresión apropiado, el fragmento de ADN o el 55 ADNc de longitud completa en un sitio cadena abajo de un promotor.

Para obtener un transformante que produzca la molécula de antitrombina III, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora adecuada para el vector de expresión.

60 Como célula hospedadora puede usarse cualquier célula de levadura, célula de animal, célula de insecto, célula vegetal, etc., que sea capaz de expresar el gen deseado.

También son útiles células que se obtienen seleccionando células en las que la actividad de una enzima, relacionada con la modificación de una cadena glucídica unida a N-glucósido unida a la molécula antitrombina III, es 65 decir, las enzimas relacionadas con la modificación de fucosa, está delecionada o células obtenidas por diversas

técnicas artificiales descritas en el apartado 1 anterior.

Los vectores de expresión que pueden emplearse son aquellos que son capaces de replicación autónoma o integración en el cromosoma en las células hospedadoras anteriores y que comprendan un promotor en una

5 posición apropiada para la transcripción del ADN que codifica la molécula antitrombina III deseada. El ADNc puede prepararse a partir de un tejido o una célula animal de ser humano o no humano de acuerdo con los métodos de preparación de un ADNc descritos en el apartado I (1) (a) anterior usando, por ejemplo, una sonda o cebadores específicos para la molécula de antitrombina III deseada.

Cuando como célula hospedadora se usa una levadura, como vector de expresión puede usarse YEP13 (ATCC 37115), YEp24 (ATCC 37051), YCp50 (ATCC 37419) o similares.

Como promotor, puede usarse cualquier promotor que sea capaz de expresarse en cepas de levadura. Los promotores adecuados incluyen promotores de genes de la ruta glucolítica tales como hexoquinasa, el promotor

15 PH05, promotor PGK, promotor GAP, promotor ADH, promotor gal 1, promotor gal 10, promotor de proteína de choque térmico, promotor Meal y promotor CUP 1.

Ejemplos de células hospedadoras adecuadas son los microorganismos que pertenecen a los géneros Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Kluyveromyces, Trichosporon y Schwanniomyces, y específicamente, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Kluyveromyces lactis, Trichosporon pullulans, Schwanniomyces alluvius y similares.

La introducción del vector recombinante puede realizarse mediante cualquiera de los métodos de introducción de ADN en levaduras, por ejemplo, el método de electroporación [Methods Enzymol., 194, 182 (1990)], el método de

25 esferoplasto [Proc. Natl Acad Sci. USA, 84,1929 (1978)], el método de acetato de litio [J. Bacteriology, 153, 163 (1983)] y el método descrito en Proc. Natl. Acad Sci. USA, 75, 1929 (1978).

Cuando como célula hospedadora se usa una célula animal, como vector de expresión puede usarse pcDNAI, pcDM8 (disponible en el mercado de Funakoshi Co., Ltd.), pAGE107 [Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 22979/91; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3 (Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 227075/90), pCDM8 [Nature, 329, 840 (1987)], pcD-NAI/Amp (fabricado por Invitrogen Corp.), pREP4 (fabricado por Invitrogen Corp.), pAGE103 [J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, etc.

Como promotor, puede usarse cualquiera de los promotores capaces de expresarse en células animales. Los

35 promotores adecuados incluyen el promotor del gen (temprano inmediato) IE (por las siglas Inmediate Early, en inglés) de citomegalovirus (CMV), el promotor temprano de SV40, el promotor de un retrovirus, el promotor de metalotioneina, el promotor de choque térmico, el promotor SRα, etc. En combinación con el promotor puede usarse el potenciador del gen IE del CMV humano.

Son ejemplos de células hospedadoras adecuadas las células Namalwa derivadas de ser humano, células COS derivadas de mono, células CHO derivadas de hámster chino, HBT5637 (Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 299/88), células de mieloma de rata, células de mieloma de ratón, células derivadas de riñón de hámster sirio, células madre embrionarias, células huevo fertilizadas y similares.

45 La introducción del vector recombinante puede realizarse mediante cualquiera de los métodos de introducción de ADN en células animales, por ejemplo, electroporación [Cytotechnology, 3,133 (1990)], el método de fosfato de calcio (Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 227075/90), lipofección [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84, 7413 (1987)], el método de inyección (Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual), el método que usa balística de partículas (balística génica) (Patentes Japonesas Nos 2606856 y 2517813), el método de DEAE-dextrano [Biomanual Series. 4 -Methods of Gene Transfer, Expression and Analysis (Yodosha), editado por Takashi Yokota and Kenichi Arai (1994)] y el método del vector viral (Manipulating the Mouse Embryo, segunda edición).

Cuando como célula hospedadora se usa una célula de insecto, la proteína puede expresarse mediante los métodos

55 descritos en Current Protocols in Molecular Biology; Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H. Freeman and Company, Nueva York (1992); Bio/Technology, 6, 47 (1988) o similares.

Esto es, el vector recombinante y un baculovirus se cotransfectan en células de insecto para obtener un virus recombinante en el sobrenadante del cultivo de las células de insecto y después las células de insecto se infectan con el virus recombinante, mediante el cual la proteína puede expresarse.

Los vectores de transferencia de genes útiles en este método incluyen pvl1392, pvl1393 y pBlueBacI II (fabricados por Invitrogen Corp.).

65 Un ejemplo de baculovirus es el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica, que es un virus que infecta insectos pertenecientes a la familia Barathra.

Son ejemplos de células de insecto las células Sf9 y Sf21 de ovario de Spodoptera frugiperda [Current Protocols in Molecular Biology; Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual, W. H: Freeman and Company, Nueva York (1992)] y las células High 5 de ovario de Trichoplusia ni (fabricadas por Invitrogen Corp.).

5 La cotransfección del vector recombinante anterior y los baculovirus anteriores dentro de células de insecto para la preparación del virus recombinante puede realizarse mediante el método de fosfato de calcio (Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 227075/90), lipofección [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 84, 7413 (1987)] y similares.

Cuando como célula hospedadora se usa una célula vegetal, como vector de expresión puede usarse el plásmido Ti, el vector del virus del mosaico del tabaco o similares.

Como promotor, puede usarse cualquiera de los promotores capaces de expresarse en células vegetales. Los

15 promotores adecuados incluyen el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (VMCa), el promotor 1 de la actina de arroz, etc.

Son ejemplos de células hospedadoras adecuadas las células de plantas tales como tabaco, patata, tomate, zanahoria, soja, colza, alfalfa, arroz, trigo, cebada, Physcomitrella patens y Spirodela polyrhiza.

La introducción del vector recombinante puede realizarse mediante cualquiera de los métodos de introducción de ADN en células vegetales, por ejemplo, el método que usa Agrobacterium (Solicitudes de Patente Japonesa no Examinadas Publicadas Nos 140885/84 y 70080/85, y el documento W094/00977), electroporación (Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 251887/85) y el método que usa balística de partículas (balística de

25 genes) (Patentes Japonesas Nos 2606856 y 2517813).

La expresión del gen anticuerpo puede realizarse no solo por expresión directa sino también por producción secretora, por expresión de una proteína de fusión en la región Fc y otra proteína y similar de acuerdo con los métodos descritos en Molecular Cloning, segunda edición y similares.

Cuando el gen se expresa en una célula de levadura, una célula de animal, una célula de insecto o una célula vegetal portadora de un gen introducido relacionado con la síntesis de una cadena glucídica, puede obtenerse una molécula de antitrombina III a la cual se añade un azúcar o una cadena glucídica mediante el gen introducido.

35 La composición de antitrombina III puede producirse cultivando el transformante obtenido, como se ha indicado anteriormente, en un medio que permita que las moléculas de antitrombina III se formen y acumulen en el cultivo, y recuperarlas del mismo. El cultivo del transformante en un medio puede realizarse mediante métodos convencionales para cultivar la célula hospedadora.

Para el cultivo del transformante obtenido, usando una célula eucariota, tal como una levadura como hospedador, puede usarse cualquier medio natural y sintético, siempre y cuando este sea un medio adecuado para el cultivo eficaz del transformante que contenga fuentes de carbono, de nitrógeno, sales inorgánicas y similares que el hospedador usado pueda asimilar.

45 Como fuente de carbono, puede usarse cualquier fuente de carbono que pueda asimilar el hospedador. Los ejemplos de fuentes de carbono adecuadas incluyen hidratos de carbono, tales como glucosa, fructosa, sacarosa, melazas que los contengan, almidón e hidrolizado de almidón, ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido propiónico; y alcoholes tales como etanol y propanol.

Como fuente de nitrógeno, puede usarse amoníaco, sales de amonio de ácidos orgánicos o de inorgánicos, tales como cloruro de amonio, sulfato de amonio, acetato de amonio y fosfato de amonio, u otros compuestos que contengan nitrógeno así como peptona, extracto de carne, extracto de levadura, agua de macerado de maíz, hidrolizado de caseína, pastel de soja, hidrolizado de pastel de soja y diversas células microbianas fermentadas y sus productos digeridos.

55 Como ejemplos de sales inorgánicas se incluyen dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato dipotásico, fosfato de magnesio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, sulfato de cobre y carbonato de calcio.

El cultivo normalmente se realiza en condiciones aerobias, por ejemplo, cultivo en agitación o cultivo centrifugado sumergido con aireación. La temperatura del cultivo es preferentemente de 15 a 40 ºC y el periodo de cultivo es normalmente de 16 horas a 7 días. El pH se mantiene a un pH de 3,0 a 9,0 durante el cultivo. El ajuste del pH se realiza usando un ácido orgánico o inorgánico, una solución alcalina, urea, carbonato cálcico, amoníaco, etc.

65 Si fuera necesario, durante el cultivo, al medio pueden añadirse antibióticos, tales como, ampicilina y tetraciclina.

Cuando se cultiva un microorganismo transformado con un vector recombinante que comprende un promotor inducible, puede añadirse un inductor al medio si fuera necesario. Por ejemplo, en el caso de un microorganismo transformado con un vector recombinante que comprenda el promotor lac, al medio puede añadirse isopropil-β-Dtiogalactopiranósido o similar; y en el caso de un microorganismo transformado con un vector recombinante que

5 comprenda el promotor trp, puede añadirse ácido indol acrílico o similar. Para el cultivo del transformante obtenido usando, como célula hospedadora, una célula animal, pueden usarse medios generalmente empleados tales como medio RPMI1640 [The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], medio MEM modificado por Eagle [Science, 122, 501 (1952)], medio MEM modificado por Dulbecco [Virology, 8, 396 (1959)], medio 199 [Proceeding of the Society for the Biological Medicine, 73, 1 (1950)] y medio de Whitten [Developmental Engineering Experimentation Manual-Preparation of Transgenic Mice (Kodansha), editado por Motoya Katsuki (1987)], medio preparado añadiendo, a estos medios, suero de ternero fetal o similar etc.

El cultivo normalmente se realiza en condiciones de pH de 6,0 a 8,0 a una temperatura de 30 a 40 ºC durante 1 a 7 15 días en presencia de CO2 al 5%.

Si fuera necesario, durante el cultivo, al medio pueden añadirse antibióticos tales como kanamicina y penicilina.

Para el cultivo del transformante, obtenido usando como célula hospedadora una célula de insecto, pueden usarse medios generalmente empleados tales como medio TNM-FH (fabricado por Pharmigen, Inc.), medio SFM Sf-900 (fabricado por Life Technologies, Inc), medio ExCell 400 y ExCell 405 (fabricados por JRH Biosciences, Inc.) y Medio para Insecto de Grace [Nature, 195, 788 (1962)].

El cultivo normalmente se realiza en condiciones de pH de 6,0 a 7,2 a una temperatura de 25 a 30 ºC durante 1 a 5 25 días.

Si fuera necesario, durante el cultivo, al medio pueden añadirse antibióticos tales como gentamicina.

El transformante obtenido usando, como célula hospedadora, una célula vegetal puede cultivarse en forma de células tal cual o después de la diferenciación en células u órganos vegetales. Para el cultivo de tal transformante, como medio puede usarse los medios generalmente empleados tales como medio de Murashige-Skoog (MS) y medio White, medio preparado añadiendo fitohormonas, tales como auxina y citoquinina a estos medios, etc.

El cultivo normalmente se realiza en condiciones de pH de 5,0 a una temperatura de 9,0 de 20 a 40 ºC durante 3 a 35 60 días.

Si fuera necesario, durante el cultivo, al medio pueden añadirse antibióticos tales como kanamicina e higromicina.

Como se ha descrito anteriormente, la composición de antitrombina III puede producirse cultivando, de acuerdo con un método de cultivo convencional, el transformante derivado de un microorganismo, una célula animal o una célula vegetal y transportando un vector de expresión en el que se ha insertado el ADN que codifica la molécula de antitrombina III, permitiendo que la composición de antitrombina III se forme y se acumule y recuperando la composición de antitrombina III del cultivo.

45 El proceso de la composición de antitrombina III incluye un método de producción intracelular por las células hospedadoras, un método de secreción extracelular por las células hospedadoras y un método de producción de membranas externas por las células hospedadoras. Puede adoptarse un método de producción deseado cambiando el tipo de células hospedadoras usadas o la estructura de la molécula de antitrombina III a producir.

Cuando la composición de antitrombina III se produce en células hospedadoras o en la membrana externa de las células hospedadoras, es posible obligar a que la composición de antitrombina III se secrete fuera de las células hospedadoras aplicando el método de Paulson, et al. [J. Biol. Chem., 264, 1761.9 (1989)], el método de Lowe, et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 8227 (1989); Genes Develop., 4,1288 (1990)], los métodos descritos en la Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 336963/93, en el documento WO 94/23021 o similares.

55 Esto es, es posible obligar a que la molécula de antitrombina III deseada se secrete fuera de las células hospedadoras insertando ADN que codifique la molécula antitrombina III y ADN que codifique un péptido de señal adecuado para la expresión de la molécula antitrombina III en un vector de expresión, introduciendo el vector de expresión en las células hospedadoras y después expresando la molécula antitrombina III usando técnicas de ADN recombinante.

También es posible aumentar la producción de la composición de antitrombina III utilizando un sistema de amplificación de genes usando un gen de dihidrofolato reductasa o similar de acuerdo con el método descrito en la Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 227075/90.

65 Adicionalmente, la composición de antitrombina puede producirse usando un animal que tenga un gen introducido (animal transgénico no humano) o una planta que tenga un gen introducido (planta transgénica) construido por rediferenciación de células animales o vegetales que lleven el gen introducido.

Cuando el transformante es un animal o una planta, la composición de antitrombina puede producirse generando o 5 cultivando el animal o la planta de una manera normal, permitiendo que la composición de antitrombina III se forme y se acumule en su interior y recuperando la composición de antitrombina III del animal o de la planta.

El método para preparar la composición de antitrombina III usando un animal puede realizarse, por ejemplo, produciendo la composición de antitrombina III deseada en un animal construido introduciendo el gen de acuerdo con métodos conocidos [American Journal of Clinical Nutrition, 63,639S (1996); American Journal of Clinical Nutrition, 63, 627S (1996); Bio/Technology, 9, 830 (1991)].

En el caso de un animal, la composición de antitrombina III puede producirse, por ejemplo, generando un animal transgénico no humano que lleve el ADN introducido que codifique la molécula de antitrombina III, permitiendo que

15 la composición de antitrombina III se forme y se acumule en un animal y recuperando la composición de antitrombina III del animal. Los lugares donde la composición de antitrombina III se forma y se acumula incluyen leche (Solicitud de Patente Japonesa no Examinada Publicada Nº 309192188), huevos, etc. del animal. Como promotor en este proceso, puede usarse cualquiera de los promotores capaces de expresarse en un animal. Los promotores preferidos incluyen promotores específicos de células de glándulas mamarias, tales como el promotor de α caseína, el promotor de β caseína, el promotor de β lactoglobulina y el promotor de la proteína ácida del suero.

El método para preparar la composición de antitrombina III usando una planta puede realizarse, por ejemplo, cultivando una planta transgénica que lleve el ADN introducido que codifique la molécula de antitrombina III de acuerdo con métodos conocidos [Soshiki Baiyo (Tissue Culture), 20 (1994); Soshiki Baiyo (Tissue Culture), 21

25 (1995); Trends in Biotechnology, 15, 45 (1997)], permitiendo que la composición de antitrombina III se forme y se acumule en la planta y recuperando la composición de antitrombina III de la planta.

Cuando la composición de antitrombina III, producida por el transformante que lleva el gen introducido que codifica la molécula de antitrombina III, se expresa en las células en una forma soluble, las células se recuperan por centrifugación después de completar el cultivo y se suspenden en un tampón acuoso, seguido de modificación usando un baño de ultrasonidos, una prensa francesa, un homogeneizador Manton Gaulin, un Dynomill o similares para obtener un extracto acelular. Puede obtenerse una preparación purificada de la composición de antitrombina III centrifugando el extracto acelular para obtener el sobrenadante y después sometiendo el sobrenadante a medios habituales para aislar y purificar enzimas, por ejemplo, extracción con un disolvente, desalación con sulfato de

35 amonio, etc., desalinización, precipitación con un disolvente orgánico, cromatografía de intercambio aniónico, usando resinas tales como dietilaminoetil (DEAE)-Sefarosa y DIAION HPA-75 (fabricadas por Mitsubishi Chemical Corporation), cromatografía de intercambio catiónico usando resinas tales como S-Sefarosa FF (fabricada por Pharmacia), cromatografía hidrófoba usando resinas tales como butil -Sefarosa y fenil Sefarosa, filtración en gel usando un tamiz molecular, cromatografía de afinidad, cromatoenfoque, y electroforesis tal como isoelectroenfoque, en solitario o en combinación.

Los ejemplos específicos incluyen un método que usa cromatografía de afinidad de heparina inmovilizada desarrollado por Miller-Anderson en 1974. (Thromb. res., 5,439 (1974); Zoku Seikagaku Jikken Koza (A Sequel to Lectures on Experiments in Biochemistry), 8, Blood, segundo volumen, páginas 569-574 (Tokyo Kagaku Dojin),

45 editado por Tokyo Kagaku Dojin (1985)).

Cuando la composición de antitrombina III se expresa en las células como un cuerpo de inclusión, las células se recuperan y se modifican de manera similar, después se centrifuga para recuperar, como una fracción precipitada, la composición de antitrombina III del cuerpo de inclusión. La composición de antitrombina III recuperada de los cuerpos de inclusión se disuelve con un agente desnaturalizante de proteínas. La solución de anticuerpo disuelto se diluye o dializa, por lo que la composición de antitrombina III se renaturaliza para tener una conformación normal. Después, puede obtenerse una preparación purificada de la composición de antitrombina III mediante las mismas etapas de aislamiento y purificación como se ha descrito anteriormente.

55 Cuando la composición de antitrombina III se segrega extracelularmente, la composición de antitrombina III o su derivado puede recuperarse en el sobrenadante del cultivo. Es decir, el cultivo se trata mediante el mismo medio al indicado anteriormente, por ejemplo, centrifugación, para obtener el sobrenadante del cultivo. Una preparación purificada de la composición de antitrombina III puede obtenerse del sobrenadante del cultivo usando los mismos métodos de aislamiento y purificación a los descritos anteriormente.

Cuando la célula hospedadora ya ha tenido una capacidad de expresar una molécula de antitrombina III, se prepara una célula capaz de expresar la molécula de antitrombina III usando el método del apartado 1 descrito anteriormente, la célula se cultiva y una composición objetivo de antitrombina III se purifica del cultivo para preparar de esta manera la composición de antitrombina III.

3. Evaluación de la actividad de la composición de antitrombina III La actividad de la anticoagulación sanguínea de la composición de antitrombina III purificada puede medirse mediante un ensayo in vitro tal como el método de medición de la actividad de antitrombina o el método de medición de la actividad cofactora de la heparina conocidos, un ensayo in vivo usando un animal modelo en estado mórbido

5 de coagulación intravascular diseminada (en lo sucesivo, en el presente documento, denominada DIC por las siglas Disseminated Intravascular Coagulation, en inglés ) (The Second Series of Pharmaceutical Research and Development, Volúmen 20, Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japón (1992); The Course of Medicine (Igaku no Ayumi), 120,1147 (1982); Japanese Pharmacology and Therapeutics, 17, 5843 (1989); Clinic and Research (Rinsyo to Kenkyu), 62, 3573 (1985); Clinic and Research (Rinsyoto Kenkyu), 62, 3688 (1985); Parmacometrics, 30,589 (1985) o similar. Más adelante se describen ejemplos específicos.

(1) Método de medición de la actividad de antitrombina

Una composición de antitrombina III purificada y una sustancia a someter a ensayo, tal como plasma desfibrinado,

15 se diluyeron en serie usando tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 8,3 que contenía NaCl 0,15 M y albúmina de suero humana al 0,2%.

A 100 μl de cada una de las muestras diluidas, se añadieron 500 μl de solución de trombina 7,5 U/ml y la reacción se realizó a 37 ºC durante 10 minutos. Después, a esto se añadieron 2 ml de una solución sustrato preparada diluyendo el sustrato colorante específico de trombina (HD-CHA-But-Arg-pNA) fijada a Antitrombina III Berichrome (fabricada por Boehring Berge) a 0,25 M con un diluyente y la reacción se realizó a 37 ºC durante 5 minutos. Después de esto, la reacción se detuvo añadiendo 0,5 ml de ácido acético al 50%.

Midiendo la absorbancia en la solución de reacción a 405 nm, se obtuvo un valor restando la absorbancia de una

25 solución de reacción, a la cual se añadió la sustancia para someter a ensayo a cada etapa de dilución, de la absorbancia de una solución de reacción de control a la cual no se añadió la antitrombina III como la sustancia a someter a ensayo. Este valor se representa gráficamente en un papel milimetrado semilogarítmico como la cantidad de trombina inactivada en ordenadas y la proporción de dilución de la sustancia a someter a ensayo en abscisas. Por relación de aproximación lineal entre la cantidad de trombina inactivada y la proporción de dilución de la sustancia a someter a ensayo a partir de los valores medidos representados gráficamente y comparándolos con una expresión aproximada obtenida como resultado de la medición de la composición de antitrombina III purificada y plasma desfibrinado, puede calcularse la proporción de la composición de antitrombina III purificada en plasma desfibrinado y su titulación puede determinarse.

35 (2) Método de medición de la actividad cofactora de la heparina

Una composición de antitrombina III purificada y una sustancia a someter a ensayo, tal como plasma desfibrinado, se diluyeron en serie usando tampón Tris-HCl 0,05 M, pH 8,3 que contenía NaCl 0,15 M y albúmina de suero humana al 0,2%.

A 50 μl de cada una de las muestras diluidas, se añadió 1,0 ml de la solución de trombina de 0,3 unidades que contenía heparina 2,5 U/ml y la reacción se realizó a 37 ºC durante 5 minutos. Después, 100 μl de la solución sustrato descrita en el aparatado 3(1) anterior ajustada a 2,0 mM y se añadieron a esta y la reacción se realizó a 37 ºC durante 2 minutos. Después de esto la reacción se detuvo añadiendo 0,5 ml de ácido acético al 50%.

45 Después de finalizar la reacción, se midió la absorbancia en la mezcla de reacción a 405 nm, y después pudo determinarse la titulación de la composición de antitrombina III purificada en plasma desfibrinado mediante el mismo método descrito en el aparatado 3(1) anterior.

(3) Ensayo in vivo usando un animal modelo en estado mórbido DIC

La actividad anticoagulación sanguínea de la composición de antitrombina III purificada puede examinarse in vivo usando un modelo de estado mórbido DIC agudo de conejo [Clinic and Research (Rinsyo to Kenkyu), 62, 3573 (1985)], un modelo de estado mórbido DIC agudo de rata [Clinic and Research (Rinsyo to Kenkyu), 62, 3688 (1985)],

55 un modelo de estado mórbido DIC agudo de conejo gestante [Parmacometrics, 30, 589 (1985)] o similar.

Además, la seguridad y el efecto terapéutico de la composición de antitrombina III en seres humanos también puede evaluarse usando un modelo de especie animal relativamente cercano al ser humano, tal como Macaca fascicularis.

4. Análisis de cadenas glucídicas en la composición de antitrombina III

La estructura de cadena glucídica de la molécula de antitrombina III expresada en diversas células puede analizarse de acuerdo con métodos generales de análisis de la estructura de cadena glucídica de glucoproteínas. Por ejemplo, una cadena glucídica unida a una molécula de antitrombina III consiste en azúcares neutros tales como galactosa, 65 manosa y fucosa, amino azúcares tales como N-acetilglucosamina y azúcares ácidos tales como ácido siálico y puede analizarse por técnicas tales como análisis de composición de azúcares y análisis de estructura de cadenas

glucídica usando la creación de un mapa de la cadena glucídica bidimensional.

(1) Análisis de composiciones de azúcares neutros y amino azúcares

5 La composición de cadena glucídica de una molécula de antitrombina III puede realizarse realizando hidrólisis ácida de cadenas glucídicas con ácido trifluoroacético o similar para liberar los azúcares neutros o amino azúcares y analizar la proporción de la composición.

Específicamente, el análisis puede realizarse mediante un método usando un sistema de análisis de hidratos de carbono (BioLC; producto de Dionex). BioLC es un sistema para analizar la composición glucídica mediante HPAEC-PAD (cromatografía de intercambio aniónico de alto rendimiento-detección amperométrica impulsada) [J. Lig. Chromatogr., 6, 1577 (1983)].

La proporción de la composición también puede analizarse por el método de marcado por fluorescencia usando 2

15 aminopiridina. Específicamente, la proporción de la composición puede calcularse marcando con fluorescencia una muestra hidrolizada con ácido por 2-aminopiridilación de acuerdo con un método conocido [Agric. Biol. Chem., 55(1), 283-284 (1991)] y después analizando la composición por HPLC.

(2) Análisis de estructura de cadena glucídica

La estructura de cadena glucídica de una molécula de antitrombina III puede analizarse usando la creación de un mapa de cadena glucídica bidimensional [Anal. Biochem., 171, 73 (1988); Seibutsukagaku Jikkenho (Biochemical Experimentation Methods) 23 -To-tanpakushitsu Tosa Kenkyuho (Methods of Studies on Glycoprotein Sugar Chains), Gakkai Shuppan Center, editado por Reiko Takahashi (1989)]. La creación de un mapa de cadena glucídica

25 bidimensional es un método para deducir una estructura de cadena glucídica, por ejemplo, representando gráficamente el tiempo de conservación o la posición de elución de una cadena glucídica por cromatografía de fase inversa como el eje X y el tiempo de conservación o la posición de elución de la cadena glucídica por cromatografía de fase normal como el eje Y, y comparándolas con los resultados de cadenas glucídicas conocidas.

Específicamente, una cadena glucídica se libera de una molécula de antitrombina III por hidrazinólisis de la composición de antitrombina III y se somete a marcado con fluorescencia con 2-aminopiridina (en lo sucesivo, en el presente documento, denominada PA) [J. Biochem., 95, 197 (1984)]. Después de separarse, por filtración en gel, de un reactivo de tratamiento con PA en exceso, la cadena glucídica se somete a cromatografía de fase inversa. Después, cada pico de la cadena glucídica se somete a cromatografía de fase normal. La estructura de cadena

35 glucídica puede deducirse representado gráficamente los resultados obtenidos sobre un mapa de cadena glucídica bidimensional y comparándolos con las manchas de un patrón de cadena glucídica (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.) o los indicados en la bibliografía [Anal. Biochem., 171, 73 (1988)].

La estructura deducida mediante la creación de un mapa de cadena glucídica bidimensional puede confirmarse realizando espectrometría de masas, por ejemplo MALDI-TOF-MS, de cada cadena glucídica.

5. Inmunoensayo para determinar la estructura de la cadena glucídica de una molécula de antitrombina III

Una composición de antitrombina III consiste en moléculas de antitrombina III que difieren en cuanto a la estructura

45 de la cadena glucídica. La composición de antitrombina III recombinante de la presente invención, en la que la proporción de cadenas glucídicas que tiene una estructura en la que la fucosa está unida a la N-acteilglucosamina en el extremo reductor a todas las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo unidas a la región Fc es del 0%, tiene una actividad ADCC (citotoxicidad dependiente de anticuerpos medida por células) elevada. Tal composición de antitrombina III puede identificarse el método para analizar la estructura de cadena glucídica de una molécula de antitrombina III descrita en el apartado anterior 4. Adicionalmente, también puede identificarse por inmunoensayos usando lectinas.

La discriminación de la estructura de la cadena glucídica de una molécula antitrombina III mediante inmunoensayos usando lectinas puede realizarse de acuerdo con inmunoensayos tales como, por ejemplo, tinción de Western, RIA

55 (radioinmunoensayo), VIA (viroinmunoensayo), EIA (inmunoensayo enzimático), FIA (fluoroinmunoensayo) y MIA (metaloinmunoensayo) descritos en la bibliografía [Monoclonal Antibodies: Principles and Applications, Wiley-Liss, Inc. (1995); Enzyme Immunoassay, 3ª Ed., Igaku Shoin (1987); Enzyme Antibody Technique, edición revisada, Crakusai Kikaku (1985); etc.], de la siguiente manera.

Se marca una lectina que reconoce la estructura de cadena glucídica de una molécula de antitrombina III y la lectina marcada se somete a reacción con una muestra de la composición de antitrombina III, y después se mide la cantidad de complejo de la lectina marcada con la molécula de antitrombina III.

Los ejemplos de lectinas útiles para determinar la estructura de la cadena glucídica de una molécula de antitrombina

65 III incluyen WGA (aglutinina de germen de trigo derivada de T. vulgaris), ConA (concavalina A derivada de C. ensiformis), RIC (una toxina derivada de R. communis), L-PHA (leucoaglutinina derivada de P. vulgaris), LCA (aglutinina de lenteja derivada de L. culinaris), PSA (lectina de guisante derivada de P. sativum), AAL (lectina de Aleuria aurantia), ACL (lectina de Amaranthus caudatus), BPL (lectina de Bauhinia purpurea), DSL (lectina de Datura stramonium), DBA (aglutinina de Dolichos biflorus), EBL (lectina de madera de sauco), ECL (lectina de Erythrina cristagalli), EEL (lectina de Euonymus europaeus), GNL (lectina de Galanthus nivalis), GSL (lectina de Griffonia

5 simplicifolia), HPA (aglutinina de Helix pomatia), HHL (lectina híbrida de Hippeastrum), Jacalin, LTL (lectina de Lotus tetragonolobus), LEL (lectina de Lycopersicon esculentum), MAL (lectina de Maackia amurensis), MPL (lectina de Maclura pomifera), NPL (lectina de Narcissus pseudonarcissus), PNA (aglutinina de cacahuete), E-PHA (eritoaglutinina de Phaseolus vulgaris), PTL (lectina de Psophocarpus tetragonolobus), RCA (aglutinina de Ricinus communis), STL (lectina de Solanum tuberosum), SJA (aglutinina de Sophora japonica), SBA (aglutinina de semilla de soja), UEA (aglutinina de Ulex europaeus), VVL (lectina de Vicia villosa) y WFA (aglutinina de Wisteria floribunda).

Se prefiere usar lectinas que reconozcan especialmente una estructura de cadena glucídica en el que la fucosa está unida a la N-actetilglucosamina en el extremo reductor en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo

15 complejo. Los ejemplos de tales lectinas incluyen lectina de lenteja LCA (aglutinina de lenteja derivada del Lens culinaris), lectina de guisante PSA (lectina de guisante derivada de Pisum sativum), lectina de judía ancha VFA (aglutinina derivada de Vicia faba) y lectina de Aleuria aurantia ALL (lectina derivada de Aleuria aurantia).

6. Utilización de la composición de antitrombina III

Dado que la composición de antitrombina III obtenida en la presente invención posee una alta afinidad de unión a la heparina, equivalente a la de la antitrombina III de origen natural, esta es útil en la prevención y en el tratamiento de enfermedades que acompañan a la coagulación sanguínea.

25 Se sabe que las plaquetas se adhieren y se coagulan en una región en la que se forma la coagulación sanguínea, tal como un tejido endotelial vascular, para formar trombos en enfermedades que acompañan a la coagulación sanguínea. El trombo se forma por diversas causas tales como heridas, arteriosclerosis e inflamación vascular y cuando los trombos se liberan y se transfieren por flujo sanguíneo se genera un émbolo que tapona otros vasos sanguíneos. Cuando una arteria se obstruye por un trombo o un émbolo, la región de perfusión descendente del área obstruida se convierte en un estado isquémico. Tales estados mórbidos diversos causados por trombos se denominan trombosis. Por consiguiente, la composición de antitrombina III de la presente invención es también útil para prevenir y tratar la trombosis.

Los ejemplos de trombosis incluyen infarto cerebral (accidentes cerebrovasculares), infarto de miocardio,

35 tromboembolismo arterial apendicular, trombosis venosa profunda (tromboflebitis), DIC, enfermedad de deficiencia de antitrombina III, toxicosis gestacional y similares.

El infarto cerebral (accidente cerebrovascular) es una enfermedad que acompaña a la obstrucción de vasos sanguíneos inducida por lesiones ateroescleróticas formadas en las arterias cerebrales principales dentro y fuera del cráneo. Dado que los trombos obstruyen rápidamente los vasos sanguíneos cerebrales, aparecen de manera relativamente rápida dificultades en cuanto al movimiento tal como hemiplejia y síntomas neuróticos tales como molestias sensoriales de un lado, molestias del campo visual, afasia y disartria. Los tipos de infarto cerebral incluyen infarto cerebral lacunar que es una trombosis de una arteria cerebral relativamente pequeña generada por obstrucción de la arteriola ramificada de la arteria cerebral principal, e infarto cerebral cardiogénico que se produce

45 debido a una obstrucción de los vasos sanguíneos cerebrales por trombos liberados una vez formados en el corazón causados por enfermedades cardíacas incluyendo infarto de miocardio, enfermedad valvular del corazón tal como estenosis mitral, fibrilación articular y similares.

El infarto de miocardio es un resultado de la necrosis de células miocárdicas causado por un trastorno en el flujo sanguíneo en un músculo cardíaco de la región de perfusión debido a obstrucción de la arteria coronaria. Aunque hay pacientes que presentan síntomas anginales, tales como, dolor de pecho y dolor por compresión torácica antes de la aparición de la enfermedad, esta aparece rápidamente sin síntomas prodrómicos en la mayoría de los casos.

Los ejemplos de tromboembolismo de la arteria apendicular incluyen arterioesclerosis obliterante (ASO) que es una

55 lesión obstructiva causada por arterioesclerosis en las piernas y produce tromboangeítis obliterante (enfermedad de Burger, TAO) de etiología desconocida que acompaña una inflamación vascular que produce obstrucción trombótica en arterias y venas de las extremidades.

La trombosis venosa profunda (tromboflebitis) es una trombosis que se genera por operación quirúrgica, reposo prolongado en cama, infección, embarazo, estancamiento del flujo sanguíneo por heridas o similar o lesión venosa. Con tendencia se produce en la pierna izquierda y su síntoma principal es una hinchazón, pero también pueden producirse síntomas, tales como, enrojecimiento de la piel, sobre-hinchazón de venas y dolor. Con tendencia se produce a consecuencia de un viaje prolongado en avión y tal caso en concreto se denomina síndrome de la clase turista.

65 La CID (coagulación intravascular diseminada) es una enfermedad que se produce como resultado de un trastorno orgánico isquémico causado por la amplia variedad de formación de microtrombos en micro vasos sanguíneos debido a un exceso de activación del sistema de coagulación sanguíneo en el organismo, y sus enfermedades basales incluyen leucemia aguda, cáncer, enfermedades infecciosas, enfermedades obstétricas, hepatitis fulminante, aneurisma aórtico, aneurisma cardíaco, hemangioma gigante, coma diabético, hemólisis intravascular,

5 cirugía, heridas, quemaduras, cirugía plástica y similares. Dado que su estado mórbido generalmente varía dependiendo de la enfermedad basal, es necesario realizar terapia de anticoagulación junto con el tratamiento de la enfermedad basal.

La enfermedad defectuosa en antitrombina III es una enfermedad que acompaña una reducción cuantitativa o una anomalía cualitativa de la antitrombina III. La reducción cuantitativa o anomalía cualitativa de la antitrombina III causa una reducción de inhibición después de que se activen factores de coagulación sanguínea IX y X y trombina y similares y se convierte en una causa de aparición de trombosis. La enfermedad defectuosa en antitrombina III se descubrió en 1965 como una enfermedad hereditaria congénita en familias noruegas frecuentemente generando trombosis. La enfermedad defectuosa en antitrombina III se observa en varios porcentajes de pacientes que

15 padecen trombosis múltiple o recurrente. En los pacientes con enfermedad defectuosa de antitrombina III, la aparición de la frecuencia aumenta con la edad y esta enfermedad, al comienzo, se genera en muchos casos por embarazo, infección, operación quirúrgica, heridas, toma oral de anticonceptivos y similar. Dado que en muchos casos los trombos se forman en venas profundas de la pierna, su aparición también se observa en regiones de embolismo pulmonar, vena mesentérica, arteria y vena intracraneal y similares.

La toxicosis gestacional es una enfermedad que se produce durante el embarazo y sus principales síntomas son hipertensión, proteinuria y edema. Una enfermedad en la que se observan síntomas similares incluso después del parto se denomina enfermedad de toxicosis gestacional secundaria y se incluye en la toxicosis gestacional en un sentido amplio. Las anomalías del sistema fibrinolítico de coagulación están relacionadas con el origen de la

25 toxicosis gestacional.

La composición de la antitrombina III también puede administrarse a los pacientes antes de la aparición de enfermedades con la finalidad de prevenir la formación de trombos. Los ejemplos específicos de pacientes de este tipo incluyen los pacientes que poseen un posible peligro de padecer enfermedades tales como restenosis vascular después de PTCA, angina de pecho inestable, obstrucción arterial periférica, ataque isquémico cerebral transitorio, infarto agudo de miocardio, infarto de miocardio sin onda Q, CID, complicación de trombosis debido a trombocitopenia inducida por heparina, tromboembolismo pulmonar agudo, trombosis de vena profunda, embolismo pulmonar sintomático y enfermedades defectuosas en antitrombina III.

35 Una composición farmacéutica que comprende la antitrombina en la composición de la presente invención puede administrarse sola como un agente terapéutico. Sin embargo, preferentemente se mezcla con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y se administra como una preparación farmacéutica producida mediante un método arbitrario bien conocido en el campo técnico farmacéutico.

Es deseable administrar la composición farmacéutica mediante la vía que sea más eficaz para el tratamiento. Las vías de administración adecuadas incluyen administración oral y administración parenteral tal como administración intraoral, administración intratraqueal, administración intrarectal, administración subcutánea, administración intramuscular y administración intravenosa. En el caso de una preparación de antitrombina III, es preferible la administración intravenosa.

45 La preparación farmacéutica puede estar en forma de pulverización, cápsulas, comprimidos, gránulos, jarabe, emulsión, supositorio, inyección, pomada, cinta adhesiva y similar.

Las preparaciones farmacéuticas adecuadas para administración oral incluyen emulsiones, jarabes, cápsulas, comprimidos, polvos y gránulos.

Las preparaciones líquidas, tales como, emulsiones y jarabes pueden prepararse usando, como aditivos, agua, azúcares, tales como, sacarosa, sorbitol y fructosa, glicoles, tales como, polietilenglicol y propilenglicol, aceites, tales como, aceite de sésamo, aceite de oliva y aceite de semilla de soja, antisépticos, tales como, p-hidroxibenzoatos,

55 saporíferos, tales como, fresa y menta y similares.

Las cápsulas, comprimidos, polvos, gránulos o similares pueden preparase usando, como aditivos, excipientes, tales como, lactosa, glucosa, sacarosa y manitol, disgregantes, tales como, almidón y alginato de sodio, lubricantes, tales como, estearato de magnesio y talco, aglutinantes, tales como, alcohol polivinílico, hidroxipropilcelulosa y gelatina, tensioactivos, tales como, ésteres de ácidos grasos, plastificantes, tales como, glicerina y similares.

Las preparaciones farmacéuticas adecuadas para administración parenteral incluyen inyecciones, supositorios y pulverizaciones.

65 Las inyecciones pueden prepararse usando vehículos que comprenden una solución salina, una solución de glucosa

o una mezcla de las mismas o similar. También es posible preparar inyecciones en polvo liofilizando la composición de antitrombina III de acuerdo con un método convencional y añadir a ello cloruro de sodio.

Los supositorios pueden prepararse usando vehículos, tal como, manteca de cacao, grasa hidrogenada y ácido carboxílico.

5 La composición de antitrombina puede administrarse como tal en forma de pulverización, pero los pulverizadores pueden prepararse usando vehículos que no estimulan las membranas de la mucosa oral o de las vías respiratorias de un receptor y que pueden dispersar la composición de antitrombina III como partículas finas para facilitar su absorción.

Los vehículos adecuados incluyen lactosa y glicerina. También es posible preparar aerosoles, polvos secos o similares de acuerdo con las propiedades de la composición de antitrombina III y los vehículos usados. En la preparación de estas preparaciones parenterales, también pueden añadirse los aditivos mencionados anteriormente para las preparaciones orales.

15 La dosis y frecuencia de administración variarán dependiendo del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración, del periodo de tratamiento, de la edad y peso corporal del paciente o similares. Sin embargo, una dosis diaria apropiada del principio activo para una persona adulta es generalmente de 10 μg/k a 20 mg/kg.

Además, la actividad anticoagulación sanguínea de la composición de antitrombina III puede examinarse mediante un ensayo in vitro, tal como el método de medición de la actividad de antitrombina o el método de medición de la actividad cofactora de heparina, un ensayo in vivo usando un modelo CID de estado mórbido con un animal experimental tal como un conejo o similar.

25 El método para medir la actividad de antitrombina, el método para medir la actividad cofactora de la heparina y el ensayo usando un modelo CID de estado mórbido se realizan por métodos descritos en la bibliografía (The Second Series of Pharmaceutical Research and Development, Volume 20, Blood Product, Ikuo Suzuki, ed., Hirokawa Publishing Company, Tokyo, Japón (1992); The Course of Medicine (Igaku no Ayumi), 120, 1147 (1982); Japanese Pharmacology and Therapeutics, 17, 5843 (1989); Clinic and Research (Rinsyo to Kenkyu), 62, 3573 (1985); Clinic and Research (Rinsyo to Kenkyu), 62, 3688 (1985); Parmacometrics, 30, 589 (1985) o similar.

La presente invención se explica a continuación con más detalle basándose en ejemplos; sin embargo, los ejemplos son simple ilustraciones y el ámbito de la presente invención no se limita a los mismos.

35 Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 muestra esquemáticamente una estructura de la antitrombina III humana. La Figura 2 muestra esquemáticamente cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo añadidas a la antitrombina III derivada de plasma humano. La Figura 3 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKOFUT8Neo. La Figura 4 muestra las etapas para la construcción del plásmido pBS-ATIII. La Figura 5 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKAN-ATIII. La Figura 6 muestra las etapas para la construcción del plásmido pKAN-ATIIIN135Q. La Figura 7 muestra el patrón de elución de la antitrombina III por cromatografía de afinidad con heparina.

45 La Figura 8 muestra la actividad cofactora de la heparina de la trombina III.

Mejor modo para realizar la invención

Ejemplo 1

Construcción de la línea celular CHO/DG44 en la que se han modificado los dos alelos de la α1,6-fucosiltransferasa (fut8) en el genoma.

Se construyó la línea celular CHO/DG44 que comprendía la deleción de una región genómica para los dos alelos de 55 la α1,6-fucosiltranferasa (en lo sucesivo en el presente documento denominada FUT8), incluyendo los codones de inicio de la traducción, de acuerdo con las siguientes etapas.

1. Construcción del plásmido vectorial pKOFUT8Neo que dirige el gen FUT8 de hámster chino que comprende el exón 2

El plásmido pKOFUT8Neo se construyó de la siguiente manera usando el plásmido vectorial conductor pKOFUT8Puro del exón 2 del gen FUT8 de hámster chino construido por el método descrito en el Ejemplo 13-1 del documento WO 02/31140 y el plásmido pKOSelectNeo (fabricado por Lexicon).

65 Usando 16 unidades de una enzima de restricción Ascl (New England Biolabs), se dejó que 1,0 μg del plásmido pKOSelectNeo (fabricado por Lexicon) reaccionase a 37 ºC durante 2 horas. La solución de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa y, usando el kit de extracción en Gel QIAquick (fabricado por QIAGEN), se recuperó un fragmento de AscI de aproximadamente 1,6 kb que comprendía la unidad de expresión del gen de resistencia a neomicina.

5 A continuación, 1,0 μg del plásmido pKOFUT8Puro se dejó reaccionar a 37 ºC durante 2 horas usando 16 unidades de una enzima de restricción AscI (fabricada por New England Biolabs). Después de la reacción de digestión, el extremo del fragmento de ADN se desfosforiló con fosfatasa alcalina derivada de Escherichia coli C15 (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.) de acuerdo con las instrucciones adjuntas. Después de la reacción, se recuperó el fragmento de ADN por extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol.

En presencia de Ligation High (fabricado por Toyobo Co., Ltd.), se ligaron 0,1 μg del plásmido pKOSelectNeo derivado del fragmento AscI (de aproximadamente 1,6 Kb) y 0,1 μg del plásmido pKOFUT8Puro derivado del fragmento AscI (de aproximadamente 10,1 Kb) obtenido anteriormente y DHSα de Escherichia coli (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) se transformó usando el ADN del plasmido recombinante resultante de acuerdo con el método de

15 Cohen, y col. [Proc. Natl. Acad Sci. U.S.A., 69, 2110 (1972)]. Se preparó un plásmido de ADN de cada transformante y cada secuencia de nucleótidos se analizó usando el Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction v2.0 y el Secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por Applied Biosystems). Se obtuvo el plásmido pKOFUT8Ned que tenía la secuencia de nucleótidos objetivo mostrada en la Figura 3 y se usó como un vector diana para la preparación de células CHO con el gen FUT8 inactivado.

2. Preparación de células CHO en las que se ha alterado una copia del gen FUT8 en el genoma.

(1) Obtención de una línea celular en la que se ha introducido el vector diana pKOFUT8Neo

25 El vector diana de la región del genoma FUT8 de hámster chino pKOFUT8Neo, construido en el Ejemplo 1-1, se introdujo en células CHO/DG44 derivadas de ovario de hámster chino deficientes en el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) [Somataic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)] de la siguiente manera.

Después, 280 μg del plásmido pKOFUT8Neo se dejaron reaccionar a 37 ºC durante 5 horas añadiendo 400 unidades de una enzima de restricción SalI (fabricada por New England Biolabs) para la linealización, 4 μg del pKOFUT8Neo linealizado se introdujeron en 1,6 x 106 células CHO/DG44 por electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Las células resultantes se suspendieron en IMDM-dFBS (10)-HT(1) [medio IMDM (fabricado por Invitrogen) que contenía FBS de diálisis al 10% (Invitrogen) y complementado con HT a una concentración de 1 vez (fabricado por Invitrogen)] y después se inocularon en un disco de 10 cm para cultivo de células adherente

35 (fabricado por Falcon). Después de cultivar en una incubadora con CO2 al 5% a 37 ºC durante 24 horas, el medio se sustituyó con 10 ml de IMDM-dFBS (10) (medio IMDM que contenía FBS de diálisis al 10%) que contenía 600 μg/ml de G418 (fabricado por Nacalai Tesque, Inc.). El cultivo se realizó en una incubadora con CO2 al 5% a 37 ºC durante 15 días al mismo tiempo que la sustitución del medio anterior se repetía cada 3 a 4 días para obtener clones resistentes a G418.

(2) Confirmación de recombinación homóloga por PCR genómica

La confirmación de la recombinación homóloga en los clones resistentes a G418, obtenidos en el aparatado anterior (1), se realizó por PCR genómica de la siguiente manera.

45 En una placa de 96 pocillos, los clones resistentes a G418 se sometieron a digestión con tripsina y, para suspender las células, a cada pocillo se le añadió un volumen de 2 veces de un medio congelado (DMSO al 20%, suero de ternero fetal al 40% e IMDM al 40%). Para preparar una placa de réplica, la mitad de la suspensión celular en cada pocillo se inoculó en una placa de 96 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricado por Asahi Techno Glass) mientras que la otra mitad se guardó mediante crioconservación como una placa maestra.

Los clones resistentes a neomicina, en la placa de replica, se cultivaron durante una semana usando IMDM-dFBS(10) que contenía G418 600 μg/ml, seguido de la recuperación de las células. El ADN genómico de cada clon se preparó a partir de las células recuperadas de acuerdo con un método conocido [Analytical Biochemistry, 201,

55 331 (1992)] y después se disolvió durante una noche en 30 μl de tampón TE-RNasa (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, RNasa A 200 μ/ml).

Los cebadores usados en la PCR genómica se diseñaron de la siguiente manera. Se prepararon los cebadores que se unían a la secuencia de una parte que superaba una región homóloga del vector diana (SEC ID Nº: 20 ó 21) y los cebadores que se unían a la secuencia dentro del vector (SEC ID Nº: 22 ó 23) en la región genómica FUT8, obtenida por el método descrito en el Ejemplo 12 del documento WO 03/31140 (SEC ID Nº: 13). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) posterior se realizó usándolos. Específicamente, se preparó una mezcla de reacción [25 μl; ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), tampón ExTaq (preparado por Takara Shuzo Co., Ltd.), dNTP 0,2 mmol/l, 0,5 μmol/l cada uno de los cebadores específicos genéticos anteriores (cebador directo: SEC ID 65 Nº: 20 ó 21; cebador inverso: SEC ID Nº: 22 ó 23)] que contenía 10 μl de cada solución de ADN genómico preparado

anteriormente y se realizó la PCR, después de calentar, por ciclos, a 94 ºC durante 3 minutos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94 ºC durante un minuto, una reacción a 60 ºC durante un minuto y una reacción a 72 ºC durante 2 minutos.

5 Después de la PCR, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,8% (p/v) y se determinó que eran clones positivos las líneas celulares en las que se observó una amplificación específica (de aproximadamente 1,7 kb) que contenía una parte limítrofe de la región genómica de las células CHO y la región homóloga del vector diana.

(3) Confirmación de recombinación homóloga mediante transferencia de Southern genómica

La confirmación de la recombinación homóloga en los clones positivos obtenidos en el apartado anterior (2) se realizó por transferencia de Southern de la siguiente manera.

15 A partir de las placas maestro guardadas por crioconservación en el apartado anterior (2), se seleccionó una placa de 96 pocillos que contenía los clones positivos observados en el apartado (2). Después la placa se dejó permanecer con CO2 al 5% y a 37 ºC durante 10 minutos, las células en los pocillos correspondientes a los clones positivos se inocularon en una placa de 24 pocillos de fondo plano para las células adherentes (fabricado por Grenier). Después del cultivo, usando IMDM-dFBS (10) que contenía una concentración de 600 μg/ml, durante una semana, las células se inocularon en una placa de 6 pocillos de fondo plano para células adherentes (Grenier). El ADN genómico de cada clon se preparó a partir de las células recuperadas de la placa de acuerdo con un método conocido [Nucleic Acids Research, 3, 2303 (1976)] y después se disolvieron durante una noche en 150 μl de tampón TE-RNasa (pH 8,0) (Tris-HCI 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, RNasa A 200 μg/ml).

25 El ADN genómico preparado anteriormente (12 μg) se sometió a digestión con 25 unidades de una enzima de restricción BamHI (fabricada por New England Biolabs) a 37 ºC durante la noche. De la mezcla de reacción, se recuperó un fragmento de ADN por precipitación con etanol. El fragmento recuperado se disolvió en 20 μl de tampón TE (pH 8,0) (Tris-HCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l) y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,6% (p/v). Después de la electroforesis, el ADN genómico se transfirió a una membrana de nylon de acuerdo con un método conocido [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 76, 3683 (1979)], seguido de calentamiento térmico de la membrana de nylon a 80 ºC durante 2 horas para la inmovilización.

Por separado, se usó una sonda en la transferencia de Southern preparada de la siguiente manera. En primer lugar, la PCR se realizó de la siguiente manera usando los cebadores que se unían a la secuencia de una parte que 35 excedía la región homóloga del vector diana (SEC ID Nº: 24 y 25) en la región genómica FUT8 (SEC ID Nº: 13) obtenida por el método descrito en el Ejemplo 2 del documento WO 02/31140. Es decir, se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción [ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), dNTP 0,2, 0,5 μmol/l de cada uno de los cebadores específicos de genes anteriores (SEC ID Nº: 24 y 25)] que contenía 4,0 ng del plásmido pFUT8fgE2-2 descrito en el Ejemplo 12 del documento WO 02/31140 y la PCR se realizó, después de calentar a 94 ºC durante un minuto, por 25 ciclos, consistiendo un ciclo en una reacción a 94 ºC durante 30 segundos, una reacción a 55 ºC durante 30 segundos y una reacción a 74 ºC durante un minuto. Después de la PCR, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% (p/v) y aproximadamente se purificaron 230 pb de un fragmento de ADN de sonda. Después, 5 μl de la solución de ADN sonda obtenida se sometieron a radiomarcado usando el sistema de marcaje con [α-32P] dCTP

45 1,75 MBq y Megaprime ADN, dCTP (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

La hibridación se realizó de la siguiente manera. La membrana de nylon anterior se introdujo en un frasco rotativo y dentro del mismo se añadieron 15 ml de una solución de hibridación [5 x SSPE, 50 x solución de Denhaldt, SDS al 0,5% (p/v), ADN de esperma de salmón 100 μg/ml]. La prehibridación se realizó a 65 ºC durante 3 horas. Después, la sonda de ADN marcada con 32P se desnaturalizó con calor y se introdujo en el frasco, seguido de calentamiento a 65 ºC durante una noche.

Después de la hibridación, la membrana de nylon se sumergió en 50 ml de 2 x SSC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65 ºC durante 15 minutos. Después, se repetir dos veces una etapa de lavado, la membrana de nylon se sumergió

55 en 50 ml de 0,2 x SSC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65 ºC durante 15 minutos. Después de lavar, la membrana de nylon se expuso a una película de rayos X a -80 ºC para el desarrollo.

Los ADN genómicos de la línea celular parental CHO/DG44 y la línea celular 50-10-104, que es el clon positivo obtenido en el apartado anterior (2) se analizaron de acuerdo con el presente método. En la línea celular CHO/DG44, solo se detectó un fragmento de aproximadamente 25,5 Kb derivado del alelo FUT8 de tipo silvestre. Por otro lado, en el clon positivo, es decir, la línea celular 50-10-104, se detectó un fragmento de aproximadamente 20,0 kb específico para el alelo que experimentó recombinación homóloga, además de un fragmento de aproximadamente 25,5 Kb derivado del alelo FUT8 de tipo silvestre. La proporción cuantitativa de estos dos tipos de fragmentos fue de 1:1, mediante lo cual se confirmó que la línea celular 50-10-104, en la que se alteró una copia del

65 alelo FUT8, era un clon semi-inactivado.

3. Preparación de la línea celular CHO/DG44 en la que el gen FUT8 en el genoma se ha inactivado dos veces

(1) Obtención de una línea celular en la que se ha introducido el vector diana pKOFUT8Puro

5 Para alterar el otro alelo FUT8 en el clon semi-inactivado del gen FUT8, obtenido en el Ejemplo 1-2(2), el plásmido pKOFUT8Puro vectorial diana del exón 2 del gen FUT8 de hámster chino, construido mediante el método descrito en el Ejemplo 13-1 del documento WO 02/31140, se introdujo en el clon de la siguiente manera.

Después de dejar que 440 μg del plásmido pKOFUT8Puro reaccionase a 37 ºC durante 5 horas añadiendo 800 unidades de una enzima de restricción SalI (fabricado por New England Biolabs) para la linealización, 4 μg del pKOFUT8Puro linealizado se introdujeron en 1,6 x 106 células del clon semi-inactivado del gen FUT8 por electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Las células resultantes se suspendieron en IMDM-dFBS(10)-HT(1) y después se inocularon en un disco de 10 cm para cultivo celular adherente (fabricado por Falcon). Después de cultivar en una incubadora con CO2 al 5% a 37 ºC durante 24 horas, el medio se sustituyó con 10 ml de IMDM

15 dFBS(10)-HT(1) que contenía puromicina 15 μg/ml (fabricado por SIGMA).

El cultivo se realizó con CO2 al 5% durante 15 días al mismo tiempo que la sustitución del medio anterior se repetía cada 7 días para obtener clones resistentes a puromicina.

(2) Confirmación de recombinación homóloga mediante transferencia de Southern genómica

La confirmación de la recombinación homóloga de los clones resistentes a fármacos obtenidos en el apartado anterior (1) se realizó por transferencia de Southern genómica de la siguiente manera.

25 Un sobrenadante del cultivo se extrajo de un disco de 10 cm en el que se expresaban los clones resistentes a puromicina, se vertieron 7 ml de un tampón fosfato y el disco se colocó en un microscopio estereoscópico. Después, se arrancaron las colonias y se aspiraron usando PIPETMAN (fabricado por GILSON) y se recogieron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (fabricada por Falcon). Después de digestión con tripsina, cada clon se inoculó en una placa de 96 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricada por Asahi Techno Glass), seguido de cultivo, durante una semana, usando IMDM-dFBS(10)-HT(1) que contenía puromicina 15 μg/ml (fabricado por SIGMA).

Después del cultivo, cada clon sobre la placa anterior se sometió a digestión con tripsina y las células resultantes se inocularon en una placa de 24 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricada por Greiner). Después de

35 cultivar usando IMDM-dFBS(10)-HT(l) que contenía puromicina 15 μg/ml (fabricado por SIGMA) durante una semana, las células se inocularon en una placa de 6 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricada por Creiner). El ADN genómico de cada clon se preparó a partir de cada placa de acuerdo con un método conocido [Nucleic Acids Research, 3, 2303 (1976)] y después se disolvió durante una noche en 150 μl de tampón TE-RNasa (pH 8,0).

El ADN genómico preparado anteriormente (12 μg) se sometió a digestión con 25 unidades de una enzima de restricción BamHI (fabricada por New England Biolabs) a 37 ºC durante una noche para la reacción de digestión y un fragmento de ADN se recuperado por precipitación con etanol se disolvió en 20 μl del tampón TE (pH 8,0) y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,6% (p/v). Después de la electroforesis, el ADN genómico se

45 transfirió a una membrana de nylon de acuerdo con un método conocido [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 76, 3683 (1979)], seguido de tratamiento térmico de la membrana de nylon a 80 ºC durante 2 horas.

Por separado, se preparó una sonda usada en la transferencia de Southern de la siguiente manera. En primer lugar, se realizó la siguiente PCR usando cebadores que se unían a la secuencia de una parte que excedía la región homóloga del vector diana en la región genómica FUT8 (SEC ID Nº: 25 y 27). Es decir, se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción [ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), dNTP 0,2 mmol/l, 0,5 μmol/l cada uno de los cebadores específicos de los genes anteriores (SEC ID Nº: 26 y 27)] que contenía 4,0 ng del plásmido pFUT8fgE2-2 construido por el método descrito en el Ejemplo 12 del documento WO 02/31140 y se realizó la PCR, después de calentar a 94 ºC durante un minuto, por 25

55 ciclos, consistiendo un ciclo de reacción a 94 ºC durante 30 segundos, reacción a 55 ºC durante 30 segundos y reacción a 74 ºC durante un minuto. Después de la PCR, la mezcla de la reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% (p/v) y se purificó un fragmento de ADN sonda de aproximadamente 230 pb. Después, 50 μl de la solución de ADN sonda obtenida se sometió a radiomarcado usando [α-32P] dCTP 1,75 MBq y el sistema de marcado de ADN Megaprime, dCTP (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

La hibridación se realizó de la siguiente manera. La membrana de nylon anterior se introdujo en un frasco rotativo y en su interior se añadieron 15 ml de una solución de hibridación [5 x SSPE, 50 x solución de Denhaldt, SDS al 0,5% (p/v), ADN de esperma de salmón 100 μg/ml]. La prehibridación se realizó a 65 ºC durante 3 horas. Después, el ADN sonda marcado con 32P se desnaturalizó con calor y se introdujo en el frasco, seguido de calentamiento a 65

65 ºC durante una noche.

Después de la hibridación, la membrana de nylon se sumergió en 50 ml de 2 x SSC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 75 ºC durante 15 minutos. Después de esto, se repitió dos veces una etapa de lavado, la membrana de nylon se sumergió en 50 ml de 0,2 x SSC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65 ºC durante 15 minutos. Después de lavar, la membrana de nylon se expuso a una película de rayos X a -80 ºC para el desarrollo.

5 El ADN genómico de la línea celular WK704, que es uno de los clones resistentes a puromicina obtenido a partir de la línea celular 50-10-104, de acuerdo con el método descrito en el apartado anterior (1), se analizó de acuerdo con el presente método. En la línea celular WK704, se eliminó un fragmento de aproximadamente 25,5 kb derivado del alelo FUT8 de tipo silvestre y solo se detectó un fragmento de aproximadamente 20,0 kb específico para el alelo que se sometió a recombinación homóloga. A partir de este resultado, se confirmó que la línea celular WK704 era un clon en el que los dos alelos FUT8 estaban alterados.

4. Extracción de genes de resistencia a fármacos de células con doble inactivación del gen FUT8

15 (1) Introducción del vector de expresión Cre recombinasa

Dentro del clon doble-inactivado del gen FUT8 obtenido en el apartado anterior 3 del Ejemplo 1, se introdujo el vector de expresión Cre recombinasa pBS185 (fabricado por Life Technologies) de la siguiente manera.

Después de introducir 4 μg del plásmido pBS185 en 1,6 x 106 células por electroporación [Cytotechrrology, 3,133 (1990)], las células resultantes se suspendieron en 10 ml de IMDM-dFBS(10)-HT(1) y la suspensión se diluyó 20000 veces con el mismo medio. La suspensión diluida se inoculó en 11 discos de 10 cm para cultivo celular adherente (fabricados por Falcon), seguido de cultivo en CO2 al 5% a 37 ºC durante 10 días para formar colonias.

25 (2) Obtención de una línea celular en la que había introducido el vector de expresión Cre recombinasa

Se recogieron clones arbitrarios de las colonias obtenidas por la introducción del gen en clones doble-inactivados del gen FUT8 preparados en el apartado anterior 3 del Ejemplo 1 de la siguiente manera. En primer lugar, se extrajo un sobrenadante de cultivo de un disco de 10 cm, se vertieron 7 ml de un tampón fosfato y el disco se puso en un microscopio estereoscópico. A continuación, las colonias se arrancaron y se aspiraron usando PIPETMAN (fabricado por GILSON) y se recogieron en una placa de 96 pocillos de fondo redondo (fabricada por Falcon). Después de la digestión con tripsina, cada clon se inoculó en una placa de 96 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricada por Iwaki Glass), seguido de cultivo usando IMDM-dFBS(10)-HT(1) durante una semana.

35 Después del cultivo, cada clon de la placa anterior se sometió a digestión con tripsina y con ello se mezcló un volumen de 2 veces de un medio congelado (DMSO al 20%, suero de ternero fetal al 40% e IMDM al 40%). Una mitad del mismo se inoculó en una placa de 96 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricada por Iwaki Glass) para preparar una placa de réplica, mientras que la otra mitad se guardó por crioconservación como una placa maestra.

La placa replica se cultivó durante 7 días usando IMDM-dFBS(10)-HT(1) que contenía 600 μg/ml de G418 y 15 μg/ml de puromicina. Los clones positivos en los que los genes de resistencia a fármacos, en ambos alelos, se habían extraído entre las secuencias loxP mediante la expresión de Cre recombinasa, murieron en presencia de G418 y puromicina. Los clones positivos se seleccionaron de acuerdo con este método de selección negativo.

(3) Confirmación de la extracción de los genes de resistencia a fármacos por transferencia de Southern genómica

La confirmación de la extracción de los genes de resistencia a fármacos en los clones positivos recuperados en el apartado anterior (2) se realizó por transferencia de Southern genómica de la siguiente manera.

A partir de la placas maestras guardas por crioconservación del apartado anterior (2), se seleccionó una placa de 96 pocillos que contenía los clones positivos indicados anteriormente. Después de dejar la placa con CO2 al 5% y a 37 ºC durante 10 minutos, se inocularon las células en los pocillos correspondientes a los clones anteriores en una placa de 24 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricada por Greiner). Después de cultivar durante

55 una semana usando IMDM (fabricado por Invitrogen) al cual se había añadido suero bovino fetal al 10% (fabricado por Invitrogen) y HT complementario a una concentración de 1 x (fabricado por Invitrogen) las células se inocularon en una placa de 6 pocillos de fondo plano para células adherentes (fabricada por Greiner). El ADN genómico de cada clon se preparó a partir de la placa de acuerdo con un método conocido [Nucleic Acids Research, 3, 2303 (1976)] y después se disolvió durante una noche en 150 μl de tampón TE-RNasa (pH 8,0).

El ADN genómico preparado anteriormente (12 μg) se sometió a digestión con 20 unidades de una enzima de restricción NheI (New England Biolabs) a 37 ºC durante una noche. De la mezcla de reacción un fragmento de ADN recuperado por precipitación con etanol se disolvió en 20 ml de tampón TE (pH 8,0) y después se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 0,6% (p/v). Después de la electroforesis, el ADN genómico se transfirió a una

65 membrana de nylon de acuerdo con un método conocido [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 76, 3683 (1979)], seguido de tratamiento térmico de la membrana de nylon a 80 ºC durante 2 horas para inmovilización.

Por separado, se preparó una sonda usada en la transferencia de Southern de la siguiente manera. A continuación, se realizó la siguiente PCR usando cebadores que se unían a la secuencia como una parte que excedía la región homóloga del vector diana en la región genómica FUT8 (SEC ID Nº: 26 y 27). Es decir, como molde, se preparó una 5 mezcla de reacción (20 μl; ADN polimerasa ExTaq (fabricada por Takara Shuzo Co., Ltd.), tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo Co., Ltd.), 0,2 mmol/l de los dNTP, 0,5 μmol/l de cada uno de los cebadores específicos de los genes anteriores (SEC ID Nº: 26 y 27)] que contenía 4,0 ng del plásmido pFUT8fgE2-2, descrito en el Ejemplo 12 del documento WO 02/31140, y la PCR se realizó, después de calentar a 94 ºC durante un minuto, por 25 ciclos, consistiendo un ciclo de reacción a 94 ºC durante 30 segundos, reacción a 55 ºC durante 30 segundos y reacción a

10 74 ºC durante un minuto. Después de la PCR, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,75% (p/v) y se purificó un fragmento de ADN sonda de aproximadamente 230 pb. Después, 5 μl de la solución de ADN obtenida se sometió a radiomarcado usando [α-32P] dCTP 1,75 MBq y el sistema de marcado de ADN Megaprime de dCTP (fabricado por Amersham Pharmacia Biotech).

15 La hibridación se realizó de la siguiente manera. La membrana de nylon anterior se introdujo en un frasco rotativo y se añadieron al mismo 15 ml de una solución de hibridación [5 x SSPE, 50 x de solución de Denhaldt, SDS al 0,5% (p/v), ADN de esperma de salmón 100 μg/ml]. La prehibridación se realizó a 65 ºC durante 3 horas. Después, el ADN sonda marcado con 32P se desnaturalizó con calor y se introdujo en el frasco, después se calentó a 65 ºC durante una noche.

20 Después de la hibridación, la membrana de nylon se sumergió en 50 ml de 2 x SCC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65 ºC durante 15 minutos. Después de esto la etapa de lavado se repitió dos veces, la membrana de nylon se sumergió en 50 ml de 0,2 x SSC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65 ºC durante 15 minutos. Después del lavado, la membrana de nylon se expuso a una película de rayos X a -80 ºC para el desarrollo.

25 Mediante el tratamiento descrito anteriormente con la enzima de restricción NheI, un fragmento de ADN de aproximadamente 8,0 kb derivó del alelo FUT8 de tipo silvestre. Además, mediante el tratamiento similar con la enzima de restricción, se obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 9,5 kb a partir del alelo que experimentó recombinación homóloga con el vector diana. Adicionalmente, mediante el tratamiento similar, se

30 obtuvo un fragmento de ADN de aproximadamente 8,0 kb cuando el gen de resistencia a neomicina (de aproximadamente 1,6 kb) y el gen de resistencia a puromicina (de aproximadamente 1,5 kb) se extrajeron del alelo que experimentó recombinación homóloga.

Los ADN genómicos de la línea celular parental CHO/DG44, la línea celular 50-10-104 descrita en el apartado

35 anterior 2, la línea celular WK704 descrita en el apartado anterior 3 y la línea celular 4-5-C3, que es uno de los clones sensibles a fármacos obtenidos a partir de la línea celular WK704 mediante el método descrito en el apartado anterior (2), se analizaron de acuerdo con el presente método. En la línea celular CHO/DG44, solo se detectó un fragmento de ADN de aproximadamente 8,0 kb procedente del alelo FUT8 de tipo silvestre. En la línea celular 50-10104 y en la línea celular WK704, se observó un fragmento de ADN de aproximadamente 9,5 kb procedente del alelo

40 que experimentó recombinación homóloga. Por otro lado, en la línea celular 4-5-C3, solo se detectó un fragmento de ADN de aproximadamente 8,0 kb resultante de la extracción del gen de resistencia a neomicina (de aproximadamente 1,6 kb) y el gen de resistencia a puromicina (de aproximadamente 1,5 kb) del alelo que experimentó recombinación homóloga. A partir de los resultados anteriores, se confirmó que los genes de resistencia a fármacos se habían extraído por la Cre recombinasa en la línea celular 4-5-C3.

45 Además de la línea celular 4-5-C3 se obtuvieron varios clones doble-inactivados del gen FUT8 en los que el gen de resistencia a fármacos se había extraído (en lo sucesivo en el presente documento denominado como células doble inactivadas para el gen FUT8).

50 Ejemplo 2

Expresión de antitrombina III recombinante por células doble inactivadas para el gen FUT8:

Se preparó una línea celular doble inactivada para el gen FUT8 que expresaba una antitrombina III recombinante 55 mediante el método mostrado a continuación.

1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Preparando dos cebadores (SEC ID Nº: 28 y 29) se realizó la siguiente PCR de una secuencia del gen de

60 antitrombina III humana (UniGene: Hs.75599). Es decir, se prepararon 25 μl de una mezcla de reacción que consistía en ADN polimerasa Pyrobest® (fabricado por Takara Bio), tampón Pyrobest® 10x, mezcla de dNTP 0,2 mmol/l y 0,5 μmol/l de los cebadores específicos de genes descritos anteriormente (SEC ID Nº: 28 y 29), que contenía, como molde, un ADNc derivado de hígado humano (fabricado por Invitrogen) y la PCR se realizó, después de calentar a 94 ºC durante un minuto, por 30 ciclos, consistiendo un ciclo de reacción a 94 ºC durante 30 segundos,

65 reacción a 55 ºC durante un minuto y reacción a 74 ºC durante 2 minutos. Después de la PCR, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v) para confirmar que un fragmento de ADN que contenía un gen de antitrombina III humana de aproximadamente 1400 pb se amplificó específicamente.

2. Preparación del plásmido pBS-ATIII

5 Sobre el producto de PCR preparado en el apartado anterior 1 se realizó un tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y el fragmento de ADN purificado recuperado de esta manera se disolvió en 17 μl de agua estéril. A continuación, se preparó una mezcla de reacción de 20 μl añadiendo 10 unidades de una enzima de restricción EcoRI (fabricada por Takara Bio), 10 unidades de BamHI (fabricada por Takara Bio) y 2 μl de tampón H 10 x (fabricado por Takara Bio) a la solución y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 16 horas. A continuación, se disolvieron 3 μg de un plásmido, pBluescript II KS(+) (fabricado por Stratagene), en 17,5 μl de agua estéril. A continuación, se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción añadiendo 10 unidades de EcoRI y 2 μl de tampón H 10 x a la solución, y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 16 horas. Después de la reacción, se realizó tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y el plásmido así

15 recuperado se disolvió en 17,5 μl de agua estéril. A continuación, se prepararon otros 20 μl de una mezcla de reacción añadiendo 10 unidades de BamHI y 2 μl de tampón K 10 x a la solución, y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 16 horas. El fragmento del producto de la PCR (EcoRI-BamHI) que contenía el gen de antitrombina III humana y el fragmento pBluescript II KS(+) (EcoRI-BamHI), ambos obtenidos en el apartado anterior, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v) y los fragmentos de ADN respectivos de aproximadamente 1,4 kb y 3,0 kb se purificaron usando el Kit de Extracción en Gel QIAquick (fabricado por QIAGEN). Después, 20 ng del fragmento del producto de PCR purificado (EcoRI-BamHI) y 80 ng del fragmento de pBluescript II KS(+) purificado (EcoRI-BamHI) se ligaron en presencia de Ligation High (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) y una cepa de Escherichia coli, DH5α (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se transformó usando el ADN del plásmido recombinante obtenido de esta manera. El ADN del plásmido se preparó a partir de cada transformante, y

25 su secuencia de nucleótidos se analizó usando el Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction v2.0 (fabricado por Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por Applied Biosystems). Como resultado, se obtuvo un plásmido pBS-ATIII que contenía una secuencia génica de una región de traducción completa de la antitrombina III humana (Fig. 4).

3. Preparación del plásmido pKAN-ATIII

En 17 μl de agua estéril, se disolvieron 3 μg del pBS-ATIII preparado en el apartado anterior, y se añadieron 10 unidades de EcoRI (fabricado por Takara Bio), 10 unidades de BamHI (fabricado por Takara Bio) y 2 μl de tampón H 10 x al mismo para obtener 20 μl de una mezcla de reacción y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 16

35 horas.

A continuación, se disolvieron 3 μg de un plásmido pKANTEX93 (documento WO 97/10354) en 17,5 μl de agua estéril. A continuación, se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción añadiendo 10 unidades de EcoRI y 2 μl de tampón H 10 x a la solución y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 16 horas. Después de la reacción, se realizó el tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y el plásmido así recuperado se disolvió en 17, 5 μl de agua estéril. A continuación, también se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción añadiendo a la solución 10 unidades de BamHl y 2 μl de tampón K 10 x y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 16 horas. El fragmento pBS-ATIII (EcoRI-BamHI) y el fragmento pKANTEX93 (EcoHI-BamHl), ambos obtenidos en el apartado anterior, se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1,5% (p/v) y se purificaron

45 fragmentos de ADN respectivos de aproximadamente 1,4 kb y 9,0 kb usando el Kit de Extracción en Gel QIAquick (fabricado por QIAGEN). A continuación, 50 ng del fragmento pBS-ATIII (EcoHI-BamHI) purificado y 30 ng del fragmento pKANTEX93 (EcoHI-BamHI) purificado se ligaron en presencia de High Ligation (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) y la cepa de E. coli, DH5α (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se transformó usando el ADN del plásmido recombinante obtenido de esta manera. El ADN del plásmido se preparó a partir de cada transformante y su secuencia de nucleótidos se analizó usando Kit BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction v2.0 (fabricado por Applied Biosystems). Como resultado, se obtuvo un plásmido pKAN-ATIII para expresión de células animales que contenía una secuencia génica de una región de traducción completa de antitrombina III humana (Fig. 5).

55 4. Introducción estable del plásmido de expresión de antitrombina III humana en la línea celular CHO/DG44 en el que el gen FUT8 genómico estaba doblemente inactivado.

Se prepararon transformantes introduciendo de manera estable el plásmido pKAN-ATIII, preparado en el apartado anterior, en la línea celular CHO/DG44 en la que el gen FUT8, preparado en el Ejemplo 1, estaba doblemente inactivado. La introducción del gen del plásmido pKAN-ATIII se realizó mediante el siguiente procedimiento de acuerdo con la electroporación [Cytotechnology, 3 133 (1990)]. En primer lugar, 100 μg del plásmido pKAN-ATIII se linealizaron preparando 600 μl de una mezcla de reacción que contenía 60 μl de Tampón NE 3 (fabricado por New England Biolabs) y 120 unidades de una enzima de restricción MluI (fabricada por New England Biolabs) y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 5 horas. Después de la reacción, la mezcla de reacción se purificó 65 por tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol para recuperar de esta manera el

plásmido lineal. Después, para preparar una suspensión de 8 x 107 células/ml, se suspendió una línea celular entre los clones de las células CHO/DG44 en las que el gen FUT8 estaba doblemente inactivado, preparada en el Ejemplo 1, en tampón un K-PBS (KCl 137 mmol/l, NaCl 2,7 mmol/l, Na2HPO4 8,1 mmol/l, KH2PO4 1,5 mmol/l, MgCl2 4,0 mmol/l). Después de mezclar 200 μl de la suspensión celular (1,6x106 células) con 9 μg del plásmido lineal descrito

5 anteriormente, se transfirió un volumen completo de la mezcla de ADN-células a una cubeta Gene Pulser (2 mm de distancia ínter electrodo, fabricada por BIO-RAD) y la introducción genética se realizó usando un dispositivo de electroporación Gene Pulser II (fabricado por BIO-RAD) en condiciones de 350 V de voltaje de impulso y 250 μF de capacidad eléctrica. Después de realizar la introducción genética en 4 cubetas de la misma manera, la suspensión celular se suspendió en 120 ml de medio IMDM (fabricado por Life Technology) complementado con suero bovino fetal al 10% (fabricado por Life Technology) y 50 μg/ml de gentamicina (fabricado por Nacalai Tesque) y se inoculó a 100 μl/pocillo en 12 placas de 96 pocillos para células adherentes (fabricada por Greiner). El cultivo se realizó en una incubadora con CO2 (fabricado por TABAI) en condiciones de CO2 al 5% y 37 ºC.

5. Obtención de la línea celular resistente a MTX 500 nM

15 Las células en las que pKAN-ATIII se introdujo establemente obtenidas en el apartado anterior se cultivaron durante 6 días y después los sobrenadantes del cultivo se desecharon y el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, 50 μg/ml de gentamicina y metotrexato (MTX) 50 nm (fabricado por SIGMA) se dispensó a 100 μl/pocillo. El cultivo continuó durante 9 días repitiendo al mismo tiempo esta labor de intercambio de medio a un intervalo de 3 a 4 días. A continuación, el cultivo continuó durante 18 días repitiendo al mismo tiempo la labor de intercambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 200 nM a un intervalo de 3 a 4 días y las colonias finalmente formadas se inocularon en una placa de 96 pocillos (fabricada por SIGMA). Posteriormente, el cultivo continuó durante 19 días mientras que se repetía la labor de intercambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, 50

25 μg/ml de gentamicina y MTX 500 nM a un intervalo de 3 a 4 días, ampliando opcionalmente el cultivo, obteniendo de esta manera el transformante, resistente a MTX 500 nM.

6. Selección de líneas celulares altamente productoras de antitrombina III

Para cada una de las diversas líneas celulares resistentes a MTX 500 nM obtenidas en el apartado anterior, se recogieron 1,5 x 106 células, se suspendieron en 5 ml de medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, 50 μg/ml de gentamicina y MTX 500 nM y después se cultivaron inoculando en un matraz de cultivo tisular (área de cultivo 25 cm2, fabricado por Greiner). Tres días después del cultivo, el sobrenadante del cultivo se recuperó y la cantidad de antitrombina III humana contenida en el sobrenadante se midió usando el kit de

35 ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological). El método se realizó de acuerdo con las instrucciones incluidas en el kit, y se usó una antitrombina III derivada de plasma humana disponible en el mercado (fabricada por SIGMA) como preparación patrón. Entre las diversas líneas celulares resistentes a MTX 500 nM, se confirmó que la antitrombina III humana se expresaba a una concentración de 304 μg/ml en el sobrenadante de cultivo de una línea celular MS705 de pKAN-ATIII 27. La línea celular MS705 de pKAN-ATIII 27 se depositó el 9 de septiembre de 2003, como FERM BP-08472 en el Banco Internacional de Organismos de Patentes del National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6,1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón).

Ejemplo 3

45 Expresión de la antitrombina III recombinante por células CHO/DG44:

1. Introducción del plásmido de expresión de antitrombina III humana en la línea celular CHO/DG44

En primer lugar, 100 μg del plásmido pKAN-ATIII, preparado en el Ejemplo 2-3, se linealizó preparando 600 μl de una mezcla de reacción que contenía 60 μl de tampón NE 3 (preparado por New England Biolabs) y 120 unidades de una enzima de restricción MluI (fabricada por New England Biolabs) y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 5 horas. Después de la reacción, la mezcla de reacción se purificó por tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol para así recuperar el plásmido lineal.

55 A continuación, una línea celular CHO/DG44 [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77, 4216 (1980)] se suspendió en tampón K-PBS (KCl 137 mmol/l, NaCl 2,7 mmol/l, Na2HPO4 8,1 mmol/l, KH2PO4 1,5 mmol/l, MgCI2 4,0 mmol/l) para proporcionar una densidad de 8 x 107 células/ml. A continuación, 200 μl de la suspensión celular (1,6 x 106 células) se mezclaron con 9 μg del plásmido lineal descrito anteriormente, se transfirió un volumen completo de la mezcla de ADN-célula en una cubeta Gene Pulse (distancia inter-electrodo de 2 mm, fabricada por BIO-RAD) y la introducción del gen se realizó usando un dispositivo de electroporación Gene Pulser (fabricado por BIO-RAD) en condiciones de 350 V de voltaje de impulso y 250 μF de capacidad eléctrica. La electroporación se realizó de acuerdo con una referencia bibliográfica [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. Después de la introducción del gen, la suspensión celular se suspendió en 30 ml de medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10%

65 (fabricado por Life Technologies) y 50 μg/ml de gentamicina (fabricado por Nacalai Tesque) y se inoculó a 100 μl/pocillo en 3 placas de 96 pocillos para células adherentes (fabricadas por Greiner). El cultivo se realizó en condiciones de CO2 al 5% y a 37 ºC

2. Obtención de una línea celular resistente a MTX

5 Las células con pKAN-ATIII introducido, obtenidas en el apartado anterior se cultivaron durante 6 días y después los sobrenadantes del cultivo se desecharon y el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, 50 μl/ml de gentamicina y metotrexato (MTX) 50 nM (fabricado por SIGMA) se dispensó a 100 μl/pocillo. El cultivo continuó durante 9 días repitiendo al mismo tiempo esta labor de intercambio de medio usando el medio IMDM

10 complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 200 nM a un intervalo de 3 a 4 días y las colonias finalmente formadas se inocularon en una placa de 24 pocillos (fabricada por Greiner). Posteriormente, el cultivo continuó durante 19 días repitiendo al mismo tiempo la labor de intercambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500 nM a un intervalo de 3 a 4 días, ampliando opcionalmente el cultivo, obteniendo así transformantes resistentes a

15 MTX 500 nM.

3. Selección de una línea celular altamente productora de antitrombina III

A partir de cada una de las diversas líneas celulares resistentes a MTX 500 nM obtenidas en el apartado anterior, se

20 recogieron 1,0 x 106 células, se suspendieron en 5 ml de medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500 nM y después se cultivaron inoculando en un matraz de cultivo tisular. Tres días después del cultivo, el sobrenadante del cultivo se recuperó y la cantidad de antitrombina III recombinante contenida en el sobrenadante se midió usando el kit de ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological) y, a partir del resultado, se seleccionó una línea celular altamente productora. El método se realizó

25 de acuerdo con las instrucciones adjuntas en el kit de ELISA y como preparación patrón se usó una preparación de Neuart derivada de plasma humano (fabricada por Mitsubishi Pharma Corporation). En este sobrenadante de cultivo se encontró un transformante en el que había una acumulación de antitrombina III recombinante humana que se denominó pKAN-ATIII DG44.

30 Ejemplo 4

Purificación de antitrombina III recombinante y análisis de estructura de cadena glucídica:

1. Naturalización frente a medio asérico

35 La línea celular doble-inactivada del gen FUT8, que expresa antitrombina III recombinante, y la línea celular CHO/DG44, que expresa antitrombina III recombinante, preparadas en los Ejemplos 2 y 3 se naturalizaron frente a un medio asérico mediante el siguiente método. Cada línea celular se suspendió en 15 ml de medio EX-CELL 302 (fabricado por JRH) complementado con 4 mM de L-glutamina (fabricada por Invitrogen), 50 μg/ml de gentamicina y

40 500 nM de MTX (en lo sucesivo en el presente documento denominado medio asérico) para proporcionar una densidad de 5 x 105 células/ml y se inocularon en un matraz cónico de 125 ml para realizar un cultivo en lote. El cultivo se realizó a 35 ºC y a una velocidad de rotación de 90 a 100 rpm, y cuando se realizó el subcultivo, el aire en el matraz cónico se sustituyó por aire soplado que contenía CO2 al 5% sobre la superficie del medio, en un volumen de 4 veces o más del volumen del recipiente de cultivo. Tres días después de esto, el medio se intercambió y el

45 subcultivo se realizó con 5 x 105 células/ml el 6º día. Después de esto, el subcultivo se repitió a un intervalo de 3 a 4 días durante 2 semanas para naturalizar las células frente al medio asérico. Mediante este cultivo, se obtuvo un transformante pKAN-ATIII AFMS705 derivado de la línea celular doble-inactivada del gen FUT8 y que tenía la capacidad de crecer en medio asérico y un transformante pKAN-ATIII AFDG44 derivado de la línea celular CHO/DG44 y que tenía la capacidad de crecer en medio asérico. Cada una de las líneas celulares obtenidas de esta

50 manera se suspendió en 15 ml del medio asérico para proporcionar una densidad de 3,0 x 105 células/ml y se cultivó inoculando en un matraz de 125 ml. Tres días después del cultivo, el sobrenadante del cultivo se recuperó y la cantidad de antitrombina III recombinante contenida en el sobrenadante se midió usando el Kit de ELISA para antitrombina III (ATIII) (fabricado por Affinity Biological) para confirmar que la antitrombina III recombinante se expresaba en ambos transformantes en casi la misma concentración, concretamente 18 μg/ml en el sobrenadante

55 de cultivo de pKAN-ATIII AFMS705 y 28 μg/ml en el sobrenadante de cultivo de pKAN-ATIII AFDG44. Con respecto a esto, la línea celular pKAN-ATIII AFMS705 se depositó como una línea celular denominada pKAN-ATIII AFMS705 el 10 de agosto de 2004, como FERM BP-10088 en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón).

60 2. Obtención del sobrenadante de cultivo que contiene la antitrombina III recombinante

Cada una de las líneas celulares pKAN-ATIII AFMS705 y pKAN-ATIII AFDG44 obtenidas en el apartado anterior como líneas celulares naturalizadas aséricas se suspendieron en 450 ml de medio asérico para proporcionar una densidad de 3 x 105 células/ml y se inocularon en un frasco rotativo de una capacidad de 2 litros (fabricado por

65 Becton Dickinson) y el aire en el matraz cónico se sustituyó por aire soplado que contenía CO2 al 5% sobre la

superficie del medio, en un volumen de 4 veces o más el volumen del recipiente de cultivo. El cultivo se realizó a 35 ºC a una velocidad de rotación de 5 a 10 rpm y en su interior se añadieron 37,5 ml de un medio de alimentación y 1,8 ml de solución de glucosa al 50% el 5º día del cultivo con objeto de complementar las sustancias nutrientes consumidas tales como aminoácidos. El medio de alimentación es un medio que comprende aminoácidos (L-alanina 5 0,22 g/l, monoclorhidrato de L-arginina 0,74 g/l, monohidrato de L-asparagina 0,22 g/l, ácido L-aspártico 0.,6 g/l, diclorhidrato de L-cistina 0,80 g/l, ácido L-glutámico 0,66 g/l, L-glutamina 7,3 g/l, glicina 0,26 g/l, dihidrato de monoclorhidrato de L-histidina 0,37 g/l, L-isoleucina 0,92 g/l, L-leucina 0,92 g/l, monoclorhidrato de L-lisina 1,29 g/l, L-metionina 0,26 g/l, L-fenilalanina 0,58 g/l, L-prolina 0,35 g/l, L-serina 0,37 g/l, L-treonina 0,84 g/l, L-triptófano 0,14 g/l, dihidrato disódico de L-tirosina 0,92 g/l y L-valina 0,83 g/l), vitaminas (d-biotina 0,0001 g/l, D-pantotenato cálcico 0,035 g/l, cloruro de colina 0,035 g/l, ácido fólico 0,035 g/l, mioinositol 0,063 g/l, niacin amida 0,035 g/l, clorhidrato de piridoxal 0,035 g/l, riboflavina 0,0035 g/l, clorhidrato de tiamina 0,035 g/l y cianocobalamina 0,0001 g/l),insulina humana recombinante 0,31 g/l (fabricada por JRH), etanolamina 0,025 g/l (fabricada por Sigma-Aldrich), 2mercaptoetanol 0,0098 g/l (fabricado por Sigma-Aldrich), un hidrolizado de semilla de soja HY-SOY 8 g/l (fabricado por Quest International), selenita sódica 16,8 μg/l (fabricada por Sigma-Aldrich), solución concentrada lipídica de

15 colesterol 2 ml/l (250 x solución acuosa, fabricada por Invitrogen) y sal sódica férrica de etilendiaminatetraacetato 0,05 g/l (fabricada por Sigma-Aldrich). Durante y después de la alimentación, se realizó la sustitución de aire por oxigenación cada día hasta completar el cultivo. Manteniendo una proporción de supervivencia del 80% o más, el cultivo se realizó durante 9 a 10 días. Después de completar el cultivo, la cantidad de antitrombina humana recombinante en el sobrenadante de cultivo se midió usando el kit de ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological). Como resultado, se confirmó que la antitrombina III recombinante está dentro de los sobrenadantes de cultivo de pKAN-ATIII AFMS705 y pKAN-ATIII AFDG44 a concentraciones respectivas de 68 μg/ml y 87 μg/ml. En lo sucesivo en el presente documento, la antitrombina III recombinante producida por pKAN-ATIII AFMS705 se denomina ATIII MS705 y la antitrombina III recombinante producida por pKAN-ATIII AFDG44 se denomina ATIII DG44, respectivamente.

3. Purificación de la antitrombina III recombinante

A partir del sobrenadante de cultivo, que contenía la antitrombina III recombinante obtenida en el apartado anterior, esta se purificó de acuerdo con un método descrito en la referencia bibliográfica [Meth. Enzymol., 222, 525, 1993] de la siguiente manera. Una parte del sobrenadante de cultivo, que contenía la antitrombina III recombinante obtenida en el apartado anterior, correspondiente a aproximadamente 250 mg de la antitrombina III recombinante, se aplicó a una columna de heparina (Heparin Sepharose 6 Fast Flow, 250 ml, fabricada por Amersham Bioscience) que se había equilibrado con una solución tampón que consistía en Tris 50 mM, ácido cítrico 14 mM y NaCI 0,15 M (pH 7,4). Posteriormente, la columna de heparina se lavó con 10 VC del tampón de equilibrio y después la antitrombina 35 III recombinante se eluyó usando un método de elución en gradiente lineal (12 VC) hasta una concentración de NaCl 3 M. El equipo usado fue el Sistema de Cromatografía Hiload (fabricado por Amersham Bioscience), el caudal fue de 21 ml/min y las fracciones de la elución de la antitrombina III humana recombinante se fraccionaron a 50 ml. Cuando en cada fracción se midió la cantidad de antitrombina III humana usando el kit de ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological), en el patrón de elución se observaron tres tipos generalmente divididos, como se muestra en la Figura 7, y MS705 ATIII y DG44 ATIII mostraron diferentes patrones de elución. A continuación, estas fracciones se denominarán fracción pico (1), fracción pico (2) y fracción pico (3) en este orden comenzando desde la fracción más rápidamente eluida. Se describió que la pluralidad de picos se encontraba cuando la antitrombina III se purificaba mediante cromatografía de afinidad con heparina en las siguientes referencias bibliográficas [por ejemplo,

J. Biol. Chem., 268, 17588 (1993), Biochem. J., 286, 793 (1992), J. Biol. Chem., 264, 21153 (1989), etc.]. Además

45 cuando se examinó el patrón de elución de Neuart, su elución se observó limitante con respecto a la fracción pico (2). Cada una de las fracciones pico principales correspondían a la fracción pico (2) y a la fracción pico (3) de MS705 ATIII y la fracción pico (1) y fracción de pico (2) de DG44 ATIII se desalinizaron con tampón fosfato de sodio 5 mM (pH 7,4) mediante un método de diafiltración usando Pericon XL (fabricado por Millipore) y Biomax 10 (fabricado por Millipore). Cada una de las fracciones pico desalinizadas de esta manera se aplicaron a una columna de DEAE Sepharose Fast Flow (fabricada por Amersham 480 ml) y se adsorbieron a la misma. Posteriormente, la columna se lavó con 12 VC de tampón de fosfato sodio 20 mM (pH 7,4) y después la antitrombina III recombinante se eluyó a un caudal de 40 ml/min usando un método de elución de gradiente lineal (8,6 VC) hasta una concentración de NaCl 1,0

M. El modelo de elución se midió por su absorbancia (A280 nm). Después, las fracciones de elución que contenían la antitrombina III recombinante se combinaron y la solución tampón se sustituyó por PBS mediante un método de

55 diafiltración usando Pericon XL (fabricado por Millipore) y Biomax 10 (fabricado por Millipore), preparando de esta manera muestras para la evaluación. Midiendo la absorbancia (A280 nm) de las muestras para la evaluación, la concentración de la proteína se calculó basándose en A280 nm 1,0 = 0,64 mg/ml. Además, también se realizó la determinación usando el kit de Elisa para la antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological) para confirmar que la concentración era idéntica mediante el método de absorbancia y el método ELISA. Además, se realizó reducción de SDS-PAGE usando PAGEL SPG520L (fabricado por Atto). En la electroforesis, se usaron 2 μg de antitrombina III recombinante reducida con 2-mercaptoetanol, y la tinción se realizó mediante tinción CBB. Como resultado, en todas las muestras para evaluación no se confirmaron bandas distintas a la banda de ATIII de aproximadamente 60 kD de peso molecular.

65 4. Análisis de la composición glucídica neutra y aminoglucídica de la antitrombina III recombinante

Las composiciones glucídica neutra y aminoglucídica se analizaron sobre las muestras para la evaluación obtenida en el Ejemplo 4-3. Cada una de las muestras de evaluación de antitrombina III recombinante se hidrolizaron a 100 ºC durante 2 horas en presencia de ácido trifluoroacético 4,0 mol/l para liberar los glúcidos neutros y los aminoglucidos de la proteína. Los glúcidos liberados de esta manera se analizaron usando el analizador glucídico 5 DX-500 (fabricado por Dionex) con referencia al método descrito en la referencia bibliográfica de Michael Weitzhandler et al. [Analytical Biochemistry, 241, 128-134 (1996)] y DIONEX Application Note 92 (The Determination of Sugars in Molasses by High-Performance Anion Exchange with Pulsed Amperometric Detection). Se sabe que la estructura de la cadena glucídica de la antitrombina III derivada de plasma humano es una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo que no contiene fucosa [Arch. Biochem. Biophys., 203, 458 (1980)] (Fig. 2). En el 10 análisis de los resultados de la composición glucídica neutra y aminoglucídica, las proporciones composicionales de los componentes monosacáridos respectivos (fucosa, galactosa y manosa) se calcularon como 4 con respecto a la proporción composicional de la N-acetilglucosamina. Como resultado del análisis, se detectó fucosa en los componentes de la cadena glucídica de DG44 ATIII mientras que el contenido de fucosa en los componentes de la cadena glucídica de MS705 ATIII estaba en el límite de detección o inferior, similar al caso de Neuart que es una

15 antitrombina III derivada de plasma humano. Además, basándose en las proporciones composicionales de los componentes monosacáridos respectivos, se sugirió que la estructura de cadena glucídica principal de todas las muestras no era de tipo manosa superior o de tipo híbrido sino una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo.

5. Análisis por cromatografía con hidroxiapatita

20 La proporción composicional de las muestras de tipo α y de tipo β para la evaluación obtenida en el Ejemplo 4-3 se analizó por cromatografía con hidroxiapatita, con referencia al método de Goran Karlsson y Stefan Winge [Protein Expression and Purification, 28, 196-201 (2003)]. Como resultado, similar al caso de Neuart, derivada de plasma humano, el tipo α se encontraba principalmente en la fracción pico de MS705 ATIII (2) y en la fracción pico de DG44

25 ATIII (1). Además, el tipo α y tipo β se encontraban en la fracción pico de DG44 ATIII (2) casi a la misma proporción. En la Tabla 1 se resumen los resultados del análisis de la composición glucídica neutra y aminoglucídica y del análisis por cromatografía con hidroxiapatita.

Tabla 1

Estructura de cadena glucídica: Fucosa Tipo de molecula principal

pico MS705 ATIII (2) pico MS705 ATIII (3) pico DG44 ATIII (1) pico DG44 ATIII (2) Neuart: bicatenaria de tipo complejo bicatenaria de tipo complejo bicatenaria de tipo complejo bicatenaria de tipo complejo bicatenaria de tipo complejo --+ + - α β α α y β α

30 Puesto que la DG44 ATIII contenía fucosa en la cadena glucídica, su estructura de cadena glucídica fue diferente de la de la antitrombina III derivada en plasma humano. Por otro lado, se observó que las estructuras de cadena glucídica de la fracción pico de MS705 ATIII (2) y la fracción pico de MS705 ATIII (3) eran estructuras de cadena glucídica próximas a las de la antitrombina III de tipo α y de tipo β derivadas de plasma humano, respectivamente.

35 Además, fue posible separar el tipo α y el tipo β de MS705 ATIII por un método de purificación asistido por afinidad por heparina, como se indica en una referencia bibliográfica [J. Biol. Chem., 268, 17588 (1993)], en la antitrombina III derivada de plasma humano. Sin embargo, no fue posible separar la fracción pico de DG44 ATIII (2) cuando se realizó el mismo método de purificación. Basándose en lo anterior, se reveló que MS705 ATIII pose propiedades equivalentes a las de la antitrombina III derivada de plasma humano.

Ejemplo 5

Comparación de actividades biológicas de muestras de antitrombina III recombinante purificada:

45 1. Medición de la constante de disociación de la heparina

Dado que la estructura tridimensional de la molécula de antitrombina III cambia debido a la unión de la antitrombina III con la heparina, la constante de disociación de la heparina puede medirse usando el cambio de intensidad de fluorescencia del resto de triptófano que constituye la proteína de antitrombina III. Entre la concentración de

50 antitrombina III y la concentración de trombina se forma la siguiente ecuación 1) (Meth Enzymol., 222, 525, 1993).

Ecuación 1)

5 ΔF: cambio en cuanto a la cantidad de fluorescencia ΔFmax: cambio máximo en cuanto a la cantidad de fluorescencia F0: intensidad de fluorescencia cuando no se añade heparina [AT]0: concentración de antitrombina III [H]0: concentración de heparina

10 Kd: constante de disociación

n: estequiometria

La constante de disociación de la heparina de cada una de las muestras fraccionadas por cromatografía de afinidad con heparina para usar en la evaluación de la antitrombina III obtenidas en el Ejemplo 4-3 se midió mediante el 15 siguiente método. En primer lugar, se preparó una solución tampón (pH 7,4) que contenía Na2HPO4 20 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 0,1 mM -2H2O y PEG 6000 al 0,1%. Esta solución tampón se usó en la dilución de las muestras. Se añadió de 0 a 20 equivalentes de heparina (fabricada por SIGMA) a 50 nM de antitrombina III y se midió la intensidad de fluorescencia de cada solución a una longitud de onda de excitación de 280 nm y a una longitud de onda de fluorescencia de 340 nm. La constate de disociación se analizó mediante un programa informático de 20 análisis GraphPad prism 4 (fabricado por Graphpad) usando la ecuación 1). En la Tabla 2 se muestran los resultados de la medición de la constante de disociación de la heparina (valor Kd, unidad nM) de las muestras para la evaluación obtenida en el Ejemplo 4-3. La fuerza de unión de la ATIII a la heparina se fortalece a medida que el valor Kd disminuye. Por tanto, la fracción pico de MS705 ATIII (3) mostró la mayor fuerza de unión, seguido de la fracción de pico de MS705 ATIII (2) y la fracción pico de DG44 ATIII (2), y la fracción pico de DG44 ATIII (1) mostró

25 la fuerza de unión más débil.

Tabla 2

Kd (nM)

pico MS705 ATIII (2): 9,87 ± 1,09

pico MS705 ATIII (3): 3,06 ± 0,07

pico DG44 ATIII (1): 59,71 ± 2,11

pico DG44 ATIII (2): 9,84 ± 0,97

Neuart: 20,09 ± 3,60

2. Medición de la actividad cofactora de la heparina

30 Se sabe que la tasa de inhibición de trombina de la antitrombina III aumenta considerablemente en presencia de heparina. Además, la reacción de unión de la trombina con la antitrombina III se produce a una proporción molar de 1:1, y estas pierden mutuamente sus actividades después de la reacción, de manera que, en presencia de heparina, la reacción antitrombina de la antitrombina se completa en un periodo de tiempo notablemente corto. La actividad

35 cofactora de la heparina viene representada por la actividad de la trombina residual en el momento de la finalización de la reacción de antitrombina, o en otras palabras, la actividad cofactora de la heparina puede medir la cantidad de antitrombina III activada en el momento de finalizar la reacción de antitrombina [Zoku lyakuhin No Kaihatsu (A Sequel to Medicines, Continued), 20, 185 (1992)].1

40 Para medir la actividad cofactora de la heparina, se preparó primero una solución tampón (pH 8,3) que consistía en NaCl 0,15 M, Tris-HCl 0,05 M y albúmina al 0,2%. Esta solución tampón se usó en la dilución muestras y en la preparación de una solución enzimática. A una solución de antitrombina III, se añadieron 1,0 ml de una solución enzimática que comprendía 2,5 unidades/ml de trombina (fabricada por Enzyme Research Laboratories) y 0,6 unidades/ml de heparina (fabricada por SIGMA), seguido de reacción a 37 ºC durante 5 minutos. Posteriormente, a

45 ello, se añadieron 100 μl de S-2238 2,0 mM (fabricado por Daiichi Pure Chemicals) como un sustrato específico de trombina y durante 2 minutos se permitió el revelado del color, después la reacción se detuvo con ácido acético al 50%. La actividad de la trombina residual se calculó a partir de la absorbancia (A405 nm) de la p-nitroanilina formada por la degradación de S-2238 en la mezcla de reacción. En este caso, en la medición, se usó antitrombina III diluyéndola en el intervalo de 0,15 a 4 μg/ml. Se usó Neuart como sustancia patrón para la preparación de una curva

50 de calibración y la actividad cofactora de la heparina se calculó como la actividad (unidad/ml) por unidad de volumen (volumen líquido). Se midió la actividad cofactora de la heparina en cada una de las muestras para la evaluación obtenida en el Ejemplo 4-3 y los valores de actividad obtenidos se expresaron mediante la actividad (unidad/g) por unidad de masa, mostrando los resultados en la Figura 8. La fracción pico de MS705 ATIII (2) y la fracción pico de MS705 ATIII (3) mostraron una actividad similar a la de la preparación Neuart derivada de plasma humano

55 (fabricada por Mitsubishi Pharma Corporation), pero la fracción pico DG44 ATIII (1) y la fracción pico DG44 ATIII (2) mostraron valores inferiores a los de Neuart.

3. Medición de la constante de velocidad secundaria de inhibición de la trombina en ausencia de heparina La constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina se midió de acuerdo con una referencia bibliográfica

(J. Biol. Chem., 277, 24460 (2002)).

La reacción de inhibición de trombina de la ATIII en ausencia de heparina puede considerarse por aproximación a una reacción pseudo-primaria en condiciones en las que la antitrombina III está presente en una cantidad en exceso basándose en la cantidad de trombina, de manera que se forma la siguiente ecuación 2)

Ecuación 2)

15: [T]1: [T]0: Kobs: t: concentración de trombina después de t horas concentración inicial de trombina constante de velocidad pseudo-primaria tiempo

Ecuación 3)

k: constante de velocidad secundaria [AT]: concentración de antitrombina III

25 Por consiguiente, para medir la constante de velocidad secundaria de la inhibición de la trombina, se preparó primero una solución tampón (pH 7,4) que comprendía Na2HPO4 20 mM, NaCl 0,1 M, EDTA 0,1 mM-2H2O y PEG 8000 al 0,1%. Esta solución tampón se usó en la dilución de muestras y en la preparación de una solución enzimática. Se preparó una solución enzimática que comprendía antitrombina III 100 nM y antitrombina 10 nM y se dejó reaccionar a 25 ºC durante un periodo de 1 a 40 minutos. A ello, a cada periodo, se añadieron 100 μl de S-2238 0,15 mM (fabricado por Daiichi Pure Chemicals) como un sustrato específico de trombina y se midió la absorbancia (A405 nm) durante aproximadamente 2 minutos. La concentración de trombina residual se calculó a partir del cambio en absorbancia a cada periodo y la constante de velocidad pseudo-primaria se calculó usando la ecuación 2) descrita anteriormente. Además, se calculó la constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina (unidad/M/segundo) en ausencia de heparina usando la fórmula 3) descrita anteriormente. La constante de velocidad

35 secundaria de las muestras para la evaluación obtenida en el Ejemplo 4-3 se muestra en la Tabla 3. D. T. representa la desviación típica. En lo que respecta a la constante de velocidad secundaria de inhibición de la trombina en ausencia de heparina, la fracción pico DG44 ATIII (1) mostró un valor ligeramente más bajo, pero todas las muestras restantes para la evaluación mostraron una actividad similar a la de la antitrombina III Neuart derivada de plasma humano.

Tabla 3

Constante de velocidad secundaria (-hep)

/M/seg: D.T.

pico MS705 ATIII (2) pico MS705 ATIII (3) pico DG44 ATIII (1) pico DG44 ATIII (2) Neuart: 8,5E + 03 8,8E + 03 7,7E + 03 8,6E + 03 8,2E + 03 1,9 E + 02 3,7 E + 02 1,8 E + 02 1,6 E + 02 8,8 E + 01

4. Medición de la constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina en presencia de heparina

45 En presencia de heparina, se midió la constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina de las muestras para la evaluación obtenida en el Ejemplo 4-3, mediante el siguiente método de acuerdo con una referencia bibliográfica [Biochem. J., 286, 793]. En primer lugar, se preparó una solución tampón (pH 7,4) que comprendía Na2HPO4 20 mM, NaCI 0,1 M, EDTA 0,1 M-2H2O y PEG 8000 al 0,1%. Esta solución tampón se usó en la dilución de muestras y para preparar una solución enzimática. A 100 nM de antitrombina III, se añadió una solución enzimática, que comprendía de 0,5 a 1 nM de trombina y de 5 a 25 pM de heparina (fabricada por SIGMA) seguido de reacción a 25 ºC durante 1 a 30 minutos y después a ello se añadieron 100 μl de 0,15 mM de S-2238 (fabricado por Daiichi Pure Chemicals) como un sustrato específico de trombina, y durante aproximadamente 2 minutos se midió la absorbancia (A405 nm). La concentración de trombina residual se calculó a partir del cambio en cuanto a la absorbancia a cada periodo y la constante de velocidad pseudo-primaria se calculó usando la ecuación 2) descrita anteriormente. Además, usando la siguiente ecuación 4), se calculó la constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina en presencia de heparina

Ecuación 4)

k: constante de velocidad secundaria [H]0: concentración de heparina Kd: constante de disociación de la heparina

10 [AT]0: concentración de antitrombina III Kuncat: constante de velocidad secundaria en ausencia de heparina

En presencia de heparina, se midió la constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina (unidad/M/seg) de las muestras para la evaluación obtenida en el Ejemplo 4-3, mostrando los datos en la Tabla 4. En lo que

15 respecta a los valores numéricos, por ejemplo, 2,5 E + 07 significa 2,5 X 107. Además, D.T. significa desviación típica. En lo que respecta a la constante de velocidad secundaria, la fracción pico de MS705 ATIII (2) y la fracción pico de MS705 ATIII (3) mostraron una actividad similar a la de Neuart, pero la fracción pico de DG44 ATIII (1) mostró un valor considerablemente bajo y la fracción pico de DG44 ATIII (2) también mostró un valor ligeramente más bajo. Basándose en este resultado, se observó que, la antitrombina III recombinante producida usando la línea

20 celular CHO/DG44, contenía una fracción que tenía una actividad antitrombina baja en presencia de heparina. Por otro lado, se observó que, a partir de la antitrombina III recombinante producida usando la línea celular dobleinactivada del gen FUT8, se obtenía una fracción que mostraba principalmente una actividad similar a la de la antitrombina III derivada de plasma humano.

25 Tabla 4

Constante de velocidad secundaria (+ hep)

/M/seg.: D.T

pico MS705 ATIII (2) pico MS705 ATIII (3) pico DG44 ATIII (1) pico DG44 ATIII (2) Neuart: 2,5E + 07 2,6E + 07 8,7E + 06 2,0E + 07 2,3E + 07 1,6E + 06 8,7E + 05 1,1E + 04 8,1 E + 05 2,9E + 05

Como resultado de los análisis en los Ejemplos 4 y 5, se demostró que la antitrombina III recombinante producida por la línea celular doble-inactivada del gen FUT8 es una proteína que tiene propiedades similares a las de la antitrombina III derivada de plasma humano, en cuanto a estructuras de cadena glucídica y actividades biológicas,

30 en comparación con la antitrombina III recombinante producida por la línea celular CHO/DG44. A partir de este resultado, se demostró que la antitrombina III recombinante producida por la línea celular doble-inactivada del gen FUT8 es adecuada como un sustituto para la antitrombina III derivada de plasma humano.

Ejemplo 6

35 Expresión de antitrombina III recombinante modificada con aminoácidos en células doble-inactivadas del gen FUT8:

Se preparó una célula doble-inactivada del gen FUT8 capaz de expresar una antitrombina III humana de tipo mutante (en lo sucesivo en el presente documento denominada "ATIIIN135Q"), en la que el resto de asparagina en

40 la posición 135, contando desde el extremo N de la antitrombina III humana de tipo maduro, se sustituyó con un resto de glutamina, mediante el método mostrado a continuación. En ese sentido, dado que la composición ATIIIN135Q tiene 3 sitios de adición para las cadenas glucídicas de tipo unión a N, toda la antitrombina III recombinante expresada se convierte en el tipo β.

45 1. Preparación del plásmido pBS-ATIIIN135Q

En primer lugar, se prepararon dos cebadores oligo ADN para mutagénesis dirigida a sitio (SEC ID Nº: 30 y 31) para sustituir el resto de asparagina 167, contando desde el extremo N, por un resto de glutamina para la secuencia génica de la antitrombina III (UniGene: Hs.75599, SEC ID Nº: 1). Usando como molde el pBS-ATIII preparado en el 50 Ejemplo 2-2, a la secuencia de ADNc de antitrombina III se la aplicó mutagénesis dirigida a sitio usando los cebadores descritos anteriormente y el Kit de Mutagénesis Dirigida a Sitio Quick Change® (fabricado por STRATAGENE). El método se realizó de acuerdo con el manual adjunto en el kit. Se prepararon muestras de ADN de plásmido a partir de los transformantes así obtenidos usando el Kit QIAprep® Spin Miniprep (fabricado por QIAGEN), y se analizaron sus secuencias de nucleótidos usando el Kit de Reacción BigDye Terminator Cycle 55 Sequencing v2.0 (fabricado por Applied Biosystems) y un secuenciador de ADN ABI PRISM 377 (fabricado por

Applied Biosystems). Como resultado, se obtuvo un plásmido, pBS-ATIIIN135Q, que comprendía una secuencia de

ADNc de una región de traducción completa de una antitrombina III de tipo mutante (ATIIIN135Q) (Fig. 6)

2. Preparación del vector de expresión pKAN-ATIIIN135Q

5 En 17 μl de agua estéril, se disolvieron 3 μg del pBS-ATIIIN135Q preparado en el apartado anterior, y a ello se añadieron 10 unidades de EcoRI (fabricado por Takara Bio), 10 unidades de BamHl (fabricado por Takara Bio) y 2 μl de tampón H 10 X para preparar 20 μl de una mezcla de reacción y después se realizó la reacción de digestión a 37 ºC durante 16 horas. A continuación, en 17,5 μl de agua estéril se disolvieron 3 μg de un plásmido pKANTEX93

10 (descrito en el documento WO 97/10354). Añadiendo 10 unidades de EcoRI y 2 μl de tampón H 10 X a la solución, se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción para realizar la reacción de digestión a 37 ºC durante 16 horas. Después de la reacción, se realizó tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol y el plásmido recuperado se disolvió en 17,5 μl de agua estéril. Añadiendo adicionalmente 10 unidades de BamHl y 2 μl de tampón K 10 X a la solución, se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción para realizar la reacción de

15 digestión a 37 ºC durante 16 horas. Los fragmentos pBS-ATIIIN135Q (EcoRI-BamHI) y pKANTEX93 (EcoRI-BamHI) obtenidos en el apartado anterior se sometieron a electroforesis con gel de agarosa al 1,5% (p/v) y se purificaron fragmentos de ADN de aproximadamente 1,4 kpb y 9,0 kpb respectivamente usando el Kit de Extracción en Gel QIAquick (fabricado por QIAGEN). A continuación, se prepararon 20 μl de una mezcla de reacción que contenía 50 ng del fragmento pBS-ATIIIN135Q purificado (EcoRI-BamHI), 30 ng del fragmento pKANTEX93 purificado (EcoRI

20 BamHI) y Ligation High (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) y la reacción de ligamiento se realizó a 16 ºC durante 16 horas. Usando el ADN de plásmido así obtenido, se transformó una cepa de E coli, DH5α (fabricada por Toyobo Co., Ltd.). Preparando un ADN de plásmido a partir del transformante resultante usando el Kit QIAprep® Spin Miniprep (fabricado por QIAGEN), se obtuvo un plásmido de expresión de antitrombina III AT de tipo mutante para células animales, pKAN-ATIIIN135Q, (Fig. 6).

3. Introducción del plásmido de expresión ATIIIN135Q en la célula doble-inactivada del gen FUT8

El plásmido pKAN-ATIIIN135Q, preparado en el Ejemplo 6-2, se introdujo de manera estable en la célula dobleinactivada del gen FUT8 preparada en el Ejemplo 1. La introducción del gen se realizó siguiendo el procedimiento 30 de acuerdo con el método de electroporación [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. En primer lugar, se linealizaron 30 μg del plásmido pKAN-ATIIIN135Q preparando 200 μl de una mezcla de reacción que contenía 20 μl de tampón NE 3 (fabricado por New England Biolabs) y 100 unidades de una enzima de restricción MluI (fabricada por New England Biolabs) y la reacción de digestión se realizó a 37 ºC durante 16 horas. Después de la reacción, la mezcla de reacción se purificó por tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol para recuperar así 35 el plásmido lineal. A continuación, la línea doble-inactivada del gen FUT8, obtenida en el Ejemplo 1, se suspendió en un tampón K-PBS (KCl 137 mmol/l, NaCl 2,7 mmol/l, Na2HPO4 8,1 mmol/l, KH2PO4 1,5 mmol/l, MgCI2 4,0 mmol/l) para preparar una suspensión de 8 x 107 células/ml. Después de mezclar 200 μl de la suspensión celular (1,6 x 106 células) con 9 μg del plásmido lineal descrito anteriormente, se transfirió un volumen completo de la mezcla de ADN -célula a una cubeta Gene Pulser (distancia inter-electrodo de 2mm, fabricada por BIO-RAD) y usando un 40 dispositivo de electroporación Gene Pulser (fabricado por BIO-RAD) se realizó la introducción del gen en condiciones de 350 V de voltaje de impulso y 250 μF de capacidad eléctrica. Después de realizar la introducción del gen, la suspensión celular se suspendió en 30 ml de medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (v/v) (fabricado por Life Technologies) y 50 μg/ml de gentamicina (fabricada por NacalaiTesque) y se inoculó a 100 μl/pocillo en 3 placas de 96 pocillos para células adherentes (fabricado por

45 Greiner). El cultivo se realizó con CO2 al 5% y a una temperatura de 37 ºC.

4. Obtención de una línea celular resistente a MTX

Las células con pKAN-ATIIIN135Q introducido, obtenidas en el apartado anterior, se cultivaron durante 6 días y

50 después de desechar el sobrenadante del cultivo se dispensó medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, 50 μl/ml de gentamicina y metotrexato (MTX) 50 nM (fabricado por SIGMA) a 100 μl/pocillo. El cultivo continuó durante 9 días repitiendo al mismo tiempo esta labor de intercambio de medio a un intervalo de 3 a 4 días. Posteriormente, el cultivo continuó durante 18 días repitiendo al mismo tiempo la labor de intercambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX

55 200 nM a un intervalo de 3 a 4 días, y las colonias finalmente formadas se inocularon a una placa de 24 pocillos (fabricada por SIGMA). Posteriormente, el cultivo continuó durante 19 días repitiendo al mismo tiempo la labor de intercambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500 nM a un intervalo de 3 a 4 días, ampliando opcionalmente el proceso, obteniendo así transformantes resistentes a MTX 500 nM.

5. Selección de una línea celular altamente productora de ATIIIN135Q

A partir de cada una de las diversas líneas celulares resistentes a MTX 500 nM obtenidas en el apartado anterior, se recogieron 1,0 x 106 células, se suspendieron en 5 ml de medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500 nM y después se cultivaron inoculando en un matraz de cultivo tisular (fabricado por Greiner). Tres días después del cultivo, para seleccionar una línea celular altamente productora, el sobrenadante del cultivo se recuperó y se midió la cantidad de antitrombina III recombinante contenida en el sobrenadante usando el kit de ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological). El

5 método se realizó de acuerdo con el manual adjunto en el kit de ELISA y, como preparación patrón, se usó una preparación de Neuart (fabricada por Mitsubishi Pharma Corporation).

6. Naturalización frente a medio asérico

10 La línea celular doble-inactivada del gen FUT8 que expresaba ATIIIN135Q, preparada en el apartado anterior, se naturalizó frente a un medio asérico de la misma manera que en el Ejemplo 4-1. La línea celular se suspendió en 15 ml del medio asérico descrito en el Ejemplo 4-1 para proporcionar una densidad de 5 x 105 células/ml y se inoculó en un matraz cónico de 125 ml (fabricado por Coming) para realizar un cultivo en lote. El cultivo se realizó a 35 ºC a una velocidad de rotación de 90 a 100 rpm y cuando el subcultivo se realizó, el aire dentro de los matraces cónicos

15 se sustituyó por aire soplado que contenía CO2 al 5% sobre la superficie del medio, en un volumen de 4 veces o más del volumen del recipiente de cultivo. Tres días después de esto, el medio se cambió y el subcultivo se realizó a una densidad de inoculación de 5x105 células/ml el 6º día. Después de esto, el subcultivo se repitió a un intervalo de 3 a 4 días durante 2 semanas para naturalizar las células frente al medio asérico. Mediante este cultivo, se obtuvo una línea celular, pKAN-ATIIIN135Q AFMS705, que podía crecer en medio asérico y que no producía

20 agregación. La línea celular así obtenida se suspendió en 15 ml de medio asérico para proporcionar una densidad de 3,0 X 105 células/ml y de cultivó inoculando en un matraz de capacidad de 125 ml. Tres días después del cultivo, el sobrenadante de cultivo se recuperó y se midió la cantidad de antitrombina III recombinante contenida en el sobrenadante usando el kit de ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological) para confirmar que este se expresaba en una concentración de 6μg/ml en el sobrenadante de cultivo. En este sentido, la línea celular

25 pKAN-ATIIIN135Q AFMS705 se depositó como una línea celular con el nombre pKAN-ATIIIN135Q AFMS705 el 10 de agosto de 2004, como FERM BP-10089 en el International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Central 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón).

Después de esto, mediante el método descrito en el Ejemplo 4 se obtuvo una antitrombina III recombinante de tipo

30 mutante que tenía una cadena glucídica de tipo complejo en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor y se confirmó que el número de cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo era de tres. Además, como resultado de la medición de las actividades biológicas de la antitrombina III, mediante el método descrito en el Ejemplo 5, se confirmó que la constante de disociación de la heparina es significativamente más pequeña y que la actividad cofactora de la heparina y la velocidad secundaria de inhibición de la trombina son

35 significativamente mayores que las de la antitrombina III recombinante de tipo mutante expresada por las células CHO/DG44:

Ejemplo 7

40 La obtención de una línea celular que no expresa el gen de una enzima capaz de catalizar la deshidrogenación para convertir GDP-manosa en GDP-4-ceto,6-desoxi-GDP-manosa:

Obtención de una línea celular CHO/DG44 resistente a lectina

45 La célula CHO/DG44 (Proc. Natl. Acad Sci. USA, 77, 4216 (1980)) se cultivó en un medio IMDM-FBS(10)-HT(1) [medio IMDM (fabricado por Invitrogen) que contenía suero bovino fetal al 10% (FBS) (fabricado por Invitrogen) y concentración 1 x de complemento de HT (fabricado por Invitrogen)] usando un matraz de 75 cm2 para cultivo adherente (fabricado por Greiner), y se dejó proliferar hasta justo antes de alcanzar el estado de confluencia. Después de lavar las células con 5 ml con PBS Dulbecco (en lo sucesivo en el presente documento denominado

50 PBS) (fabricado por Invitrogen), a ello se añadieron 1,5 ml de tripsina al 0,05% (fabricada por Invitrogen) diluidos con PBS y las células se dejaron en reposo a 37 ºC durante 5 minutos para desprenderse del fondo del envase del cultivo. Las células desprendidas se recuperaron por una operación de centrifugación generalmente realizada en cultivo celular y se suspendieron para dar una densidad de 1 x 105 células/ml añadiendo el medio IMDM-FBS-(10)HT(1) y después a esto se añadieron o no 0,1 μg/ml de un agente de alquilación, MNNG (fabricado por SIGMA).

55 Después de dejar que las células reposasen a 37 ºC durante 3 días en una incubadora con CO2 (fabricada por TABAI), el sobrenadante de cultivo se desechó y las células se lavaron, se desprendieron, se recuperaron y se suspendieron en el medio IMDM-FBS(10)-HT(1), de una manera similar a la descrita anteriormente, y después se inoculó en una placa de 96 pocillos para cultivo adherente (fabricada por Asahi Techno Glass) a una densidad de 1000 células/pocillo. A cada pocillo, se añadieron 1 mg/ml aglutinina de Lens culinaris (en lo sucesivo en este

60 documento denominada LCA, fabricada por Vector) como una concentración final en el medio. Después de cultivar a 37 ºC durante 2 semanas en una incubadora con CO2, las colonias formadas de esta manera se obtuvieron como líneas celulares CHO/DG44 resistentes a lectina.

2. Determinación del ARNm de la GDP-manosa 4,6-dehidratasa de las líneas celulares CHO/DG44 resistentes a 65 lectina

Usando el método de RT-PCR, se analizó la cantidad de GDP-manosa 4,6-dehidratasa expresada como una enzima capaz de catalizar la deshidrogenación para convertir la GDP-manosa en GDP-4-ceto,6-desoxi-GDPmanosa, en cada una de las líneas celulares CHO/DG44 resistentes a lectina, obtenidas en el apartado anterior, de la siguiente manera.

(1) Preparación de ARN a partir de la línea celular CHO/DG44 resistente a lectina y preparación de ADNc monocatenario

Se prepararon muestras de ARN respectivamente de 1 X 107 células de la línea celular parental de células CHO/DG44 y de cada una de las líneas celulares CHO/DG44 resistentes a lectina obtenidas en el apartado 1 de este Ejemplo, usando el Kit RNeasy Protect Mini (fabricado por fabricado por QIAGEN) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo. Posteriormente, se sintetizó ADNc monocatenario a partir de 5 μg de cada ARN en 20 μl de una mezcla de reacción usando el sistema de síntesis de Primera Cadena SUPER SCRIPT para RT-PCR (fabricado por Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones adjuntas al mismo.

(2) Análisis de la cantidad de expresión del gen de β-actina usando RT-PCR

Para verificar la calidad de cada una de las muestras de ADNc monocatenario derivado de la línea celular respectiva, preparada en el apartado anterior (1), la amplificación del ADNc de β-actina se examinó mediante PCR de la siguiente manera.

Después de preparar 20 μl de una mezcla de reacción [1 x Tampón EX Taq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mM de los dNTP, 0,5 unidades de EX Taq polimerasa (fabricado por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores oligo ADN sintéticos de las SEC ID Nº: 32 y 33] que contenía, como molde, 0,5 μl de cada una de las muestras de ADNc

25 monocatenario derivado de la línea celular respectiva, preparada en el apartado anterior (1), la mezcla de reacción se calentó a 94 ºC durante 5 minutos y después se realizaron 14 ciclos de reacción, consistiendo un ciclo de reacción a 95 ºC durante un minuto y reacción a 68 ºC durante 2 minutos, usando el Ciclador Térmico de ADN 480 (fabricado por Perkin Elmer). Después de someter 10 μl de la mezcla de reacción de la PCR resultante a electroforesis con agarosa, los fragmentos de ADN se tiñeron usando Cyber Green (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN esperado, de aproximadamente 800 pb, usando Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics). Como resultado, usando cada ADNc monocatenario derivado de la línea celular, pudo detectarse la expresión de la β-actina a un nivel similar.

(3) Análisis de la cantidad del gen de GDP-manosa 4,6-dehidratasa expresada usando el método de RT-PCR

35 Después, se analizó la cantidad del gen de GDP-manosa 4,6-dehidratasa expresada en las líneas celulares CHO/DG44 respectivas resistentes a lectina obtenidas en el apartado anterior (1). Para amplificar el ADNc del gen de la GDP-manosa 4,6-dehidratasa por PCR, se preparó un cebador oligo ADN sintético de 26 oligómeros que tenía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 34 y un cebador oligo ADN sintético de 28 oligómeros que tenía la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 35 a partir de la secuencia de ADNc de la GDP-manosa 4,6-dehidratasa derivada de células CHO representada por la SEC ID Nº: 38. Después de preparar 20 μl de una mezcla de reacción [1 x Tampón EX Taq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mM de mezcla de dNTP, 0,5 unidades de EX Taq polimerasa (fabricado por Takara Shuzo) y 0,5 μM de los cebadores de oligo ADN sintéticos de las SEC ID Nº: 34 y 35] que contenía, como molde, 0,5 μl de cada una de las muestras de ADNc monocatenario

45 derivadas de las líneas celulares respectivas, preparadas en el apartado anterior (1), la mezcla de reacción se calentó a 94 ºC durante 5 minutos y después se realizaron 30 ciclos de reacción, consistiendo un ciclo de reacción a 94 ºC durante un minuto y una reacción a 68 ºC durante 2 minutos, usando el Ciclador de ADN Térmico 480 (fabricado por Perkin Elmer). Después de someter 10 μl de la mezcla de reacción de PCR resultante a electroforesis con agarosa, los fragmentos de ADN se tiñeron usando Cyber Green (fabricado por BMA) y después se midió la cantidad del fragmento de ADN esperado, de aproximadamente 430 pb, usando Fluor Imager SI (fabricado por Molecular Dynamics). Como resultado, se confirmó que, en las líneas celulares CHO/DG44 resistentes a lectina obtenidas, estaba presente una línea celular en la que no se observó la expresión del gen de GDP-manosa-4,6dehidratasa. La línea celular en la que no se observó la expresión del gen de GDP-manosa 4,6-dehidratasa se denominó línea celular CHO SM. En relación con esto, cuando se examinó la resistencia de la línea celular CHO

55 SM obtenida de esta manera, frente a diversas especies de lectina, la línea celular CHO SM mostró una resistencia también a la lectina que reconoce la misma estructura de cadena glucídica que la estructura de cadena glucídica que reconoce la LCA, concretamente otra lectina que reconoce una estructura de cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 del resto de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en la cadena glucídica unida a N-glucósido. Específicamente, demostró resistencia a un medio complementado con 1 mg/ml en una concentración final de aglutinina de Pisum sativum (en lo sucesivo en el presente documento denominada PSA, fabricada por Vector) o a un medio complementado con 1 mg/ml en una concentración final de lectina de Aleuria aurantia (en lo sucesivo en el presente documento denominada AAL, fabricada por Vector).

65 3. Análisis genómico de una línea celular en la que no se expresa el gen de una enzima capaz de catalizar la

deshidrogenación para convertir la GDP-manosa en GDP-4-ceto,6-desoxi-GDP-manosa

Usando un matraz T75 para cultivo adherente (fabricado por Greiner), cada una de las células CHO/DG44 y la línea celular CHO SM obtenida en el apartado anterior se cultivaron en medio IMDM-FBS(10)-HT(1) hasta justo antes de 5 alcanzar la fase de confluencia, y después se preparó ADN genómico de acuerdo con el método descrito en una referencia bibliográfica [Nucleic Acid Research, 3, 2303 (1976)], y el ADN genómico obtenido de esta manera se disolvió durante una noche en 300 μl de una solución tampón de TE-RNasa (pH 8,0) [Tris-HCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l, RNasa 200 μg/l]. Después de someter a digestión 12 μg del ADN genómico, preparado en el apartado anterior, con tres enzimas de restricción diferentes, EcoRI (fabricada por Takara Shuzo), HindIII (fabricada por Takara Shuzo) y BglII (fabricada por Takara Shuzo), respectivamente, los fragmentos de ADN se recuperaron usando el método de precipitación con etanol y después se disolvieron en 20 μl de tampón TE (pH 8,0) [Tris-HCl 10 mmol/l, EDTA 1 mmol/l] y se sometió a electroforesis con gel de agarosa al 0,8% (p/v). Después de la electroforesis, los fragmentos de ADN genómico se transfirieron a una membrana de nylon de acuerdo con el método descrito en una bibliografía [Proc. Natl. Acad Sci. USA, 76, 3683 (1979)]. Después de la transferencia, se realizó calentamiento 15 térmico de la membrana de nylon a 80 ºC durante 2 horas. Después, para examinar la calidad del ADN genómico transferido sobre la membrana de nylon, se realizó hibridación Southern usando, como sonda, el gen de la α1,6fucosiltransferasa (FUT8) que se consideraba que estaba presente de manera uniforme en el genoma de cada línea celular. La sonda para detectar el gen FUT8 se preparó de la siguiente manera. En primer lugar, 10 μg de un plásmido, mfFUT8-pCR2.1, que contenía ADNc de FUT8 de ratón, como se describe en el Ejemplo 11 del documento WO 02/31140, se disolvieron en 50 μl de tampón M (fabricado por Takara Shuzo), se sometieron a digestión durante una noche con una enzima de restricción HindIII (fabricada por Takara Shuzo) y después la mezcla de reacción se sustituyó con tampón H (fabricado por Takara Shuzo) y adicionalmente se realizó la reacción de digestión con una enzima de restricción EcoRI (fabricada por Takara Shuzo) durante una noche. Después de finalizar la reacción, la mezcla de reacción de sometió a electroforesis con gel de agarosa al 2% y se purificó un 25 fragmento de EcoRI-Hindlll de 156 pb que contenía el exón 2 del gen FUT8. Una parte de 25 ng del fragmento de ADN obtenido de esta manera se marcó con radiación usando el sistema de marcaje de ADN con 1,75 MBq de [α-32P]dCTP y Megaprime, dCTP (fabricado por Amersham Bioscience). Después la hibridación se realizó de la siguiente manera. El primer lugar, la membrana de nylon descrita anteriormente se introdujo herméticamente en un frasco rotativo y la prehibridación se realizó a 65 ºC durante 3 horas añadiendo 15 ml de una solución de hibridación [4 x SSPE, 5 x solución de Denhaldt, SDS al 0,5% (p/v), ADN de esperma de salmón 0,1 mg/ml]. Después, el ADN sonda marcado con 32P se desnaturalizó con calor, se introdujo en el frasco y se calentó durante una noche a 65 ºC. Después de la hibridación, la membrana de nylon se sumergió en 50 ml de 2 x SSC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65 ºC durante 15 minutos. Después de repetir dos veces la etapa de lavado anterior, la membrana de nylon se sumergió en 50 ml de 0,2 x SSC-SDS al 0,1% (p/v) y se calentó a 65 ºC durante 15 minutos. Después de lavar, la

35 membrana de nylon se expuso a una película de rayos X a 80 ºC durante dos noches para el revelado. Después del revelado, la membrana de nylon se hirvió en una solución separadora [SDS al 1%, 0,1 x SSC] para liberar la sonda y de nuevo se sometió a hibridación con una sonda diferente. Mediante el método descrito anteriormente, se detectó un fragmento específico para el exón 2 del gen FUT8 en el ADN genómico de cada una de las líneas celulares CHO/DG44 y la línea celular CHO SM. Basándose en los resultados anteriores, se demostró que las muestras de ADN genómico transferidas sobre la membrana de nylon, derivadas de la línea celular CHO SM y la línea celular CHO/DG44, tenían idéntica calidad.

Por otro lado, se preparó una sonda específica para el exón 5 del gen GMD de la siguiente manera. En primer lugar, basándose en una secuencia de ADN genómica del GMD humano conocida convencionalmente (Nº de acceso NCBI 45 NT-034880) se diseñaron cebadores oligo ADN (SEC ID Nos: 36 y 37) que se unían específicamente al exón 5. La región corresponde a una región del nucleótido número 346 al nucleótido número 538 de la secuencia de ADNc del GMD humano representada por la SEC ID Nº: 39. Después, se realizó reacción en cadena de la polimerasa (PCR) preparando 100 μl de una mezcla de reacción [tampón ExTaq (fabricado por Takara Shuzo), 0,2 mmol/l de los dNTP y 2,5 (μmol/l de los cebadores específicos del gen descrito anteriormente (SEC ID Nos: 36 y 37)] que contenía 10 ng del plásmido pAGE249GMD, descrito en el Ejemplo 15 del documento WO 02/31140. La PCR se realizó calentando a 94 ºC durante 5 minutos y a 30 ciclos, consistiendo un ciclo de reacción a 94 ºC durante un minuto, reacción a 58 ºC durante 2 minutos y reacción 72 ºC durante 3 minutos. Después de la PCR, la mezcla de reacción se sometió a electroforesis con agarosa al 2% y se purificó un fragmento de ADN de aproximadamente 200 pb. Después, 25 ng del fragmento de ADN obtenido de esta manera se marcó por radiación usando el sistema de

55 marcaje de ADN con 1,75 MBq de [α-32P]dCTP y Megaprime, dCTP (fabricado por Amersham Bioscience). Usando la sonda, la hibridación se realizó sobre la membrana de nylon descrita anteriormente. Como resultado, en el ADN genómico derivado de las células CHO/DG44 se encontró un fragmento específico para el exón 5 del gen GMD mientras que en el ADN genómico derivado de la línea celular CHO SM no se detectó ningún fragmento específico para el exón 5 del gen GMD. Basándose en los resultados anteriores, se demostró que la línea celular CHO SM es una célula inactivada para el gen GMD en la que al menos una región que contiene el exón 5 en el interior de la región genómica que codifica GMD estaba delecionada.

Ejemplo 8

65 Expresión de la antitrombina III recombinante en la línea celular CHO SM:

1. Introducción del plásmido de expresión ATIII en la línea celular CHO SM

El plásmido pKAN-ATIII preparado en el Ejemplo 2-3 se introdujo de manera estable en la línea celular CHO SM preparada en el Ejemplo 7. La introducción del gen se realizó mediante el siguiente procedimiento de acuerdo con el 5 método de electroporación convencionalmente conocido [Cytotechnology, 3,133 (1990)]. En primer lugar, se linealizaron 30 μg del plásmido pKAN-ATIII preparando 200 μl de una mezcla de reacción que contenía 20 μl de tampón NE 3 (fabricado por New England Biolabs) y 100 unidades de una enzima restricción MluI (fabricada por New England Biolabs) y la digestión se realizó a 37 ºC durante 16 horas. Después de la reacción, la mezcla de reacción se purificó por tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol para así recuperar el plásmido lineal. A continuación, la línea celular CHO SM obtenida en el Ejemplo 7 se suspendió en un tampón K-PBS (KCl 137 mmol/l, NaCl 2,7 mmol/l, Na2HPO4 8,1 mmol/l, KH2PO4 1,5 mmol/l, MgCI2 4,0 mmol/l) para preparar una suspensión de 8 X 107 células/ml. Después de mezclar 200 μl de la suspensión celular (16 X 106 células) con 9 μg del plásmido lineal descrito anteriormente, un volumen total de la mezcla de ADN -célula se transfirió a una cubeta Gene Pulser (distancia inter-electrodo de 2 mm, fabricada por BIO-RAD), y la introducción del gen se realizó

15 usando un dispositivo de electroporación Gene Pulser (fabricado por BIO-RAD) en condiciones de 350 V de voltaje de impulso y 250 μF de capacidad eléctrica. Después de realizar la introducción del gen, la suspensión celular se suspendió en 30 ml de medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (fabricado por Life Technologies) y 50 μg/ml de gentamicina (fabricado por Nacalai Tesque) y se inoculó a 100 μl/pocillo en 3 placas de 96 pocillos para células adherentes (fabricada por Greiner). El cultivo se realizó en condiciones de CO2 al 5% y a 37 ºC.

2. Obtención de una línea celular resistente a MTX

Las células con el pKAN-ATIII introducido obtenidas en el apartado anterior se cultivaron durante 6 días y después el

25 sobrenadante de cultivo se desechó y se dispensó medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, 50 μg/ml de gentamicina y MTX 50 nM (fabricado por SIGMA) a 100 μl/pocillo. El cultivo continuó durante 9 días repitiendo al mismo tiempo esta labor de cambio de medio a un intervalo de 3 a 4 días. A continuación, el cultivo continuó durante 18 días repitiendo al mismo tiempo la labor de cambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 200 a un intervalo de 3 a 4 días, y las colonias finalmente formadas se inocularon a una placa de 24 pocillos (fabricada por SIGMA). Posteriormente, el cultivo continuó durante 19 días repitiendo al mismo tiempo la labor de cambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500 nM a un intervalo de 3 a 4 días, ampliando opcionalmente el proceso para obtener así líneas celulares resistentes a MTX 500 nM.

3. Selección de una línea celular altamente productora de antitrombina III

A partir de cada una de las diversas líneas celulares resistentes a MTX 500 nm, obtenidas en el apartado anterior, se recogieron 1,0 x 106 células, se suspendieron en 5 ml de medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500 y después se cultivó inoculando en un matraz T25. Tres días después del cultivo, se recuperó el sobrenadante del cultivo y la cantidad de ATIII contenida en el sobrenadante se midió usando el kit de ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological). Como resultado, se confirmó que la antitrombina III recombinante humana se expresaba en el sobrenadante de cultivo a una concentración de 513 ng/ml y este transformante se denominó línea celular pKAN-ATIIM GMDKO.

45 Después de esto, mediante el método descrito en el Ejemplo 4 se obtuvo una antitrombina III recombinante que tenía una cadena glucídica en la que la fucosa no estaba unida a N-acetilglucosamina en el extremo reductor. Además, midiendo las actividades biológicas de la antitrombina III, por el método descrito en el Ejemplo 5, se confirmó que la antitrombina recombinante expresada en células inactivadas para el gen GMD tenía una constante de disociación de heparina significativamente menor y una actividad cofactora de la heparina y una constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina significativamente mayor que la de la antitrombina III recombinante expresada en células CHO/DG44.

Ejemplo 9

55 Expresión de la antitrombina III recombinante modificada con aminoácidos en la línea celular CHO SM:

1. Introducción del plásmido de expresión ATIIIN135Q en la línea celular CHO SM

El plásmido pKAN-ATIIIN135Q preparado en el Ejemplo 6-2 se introdujo en la línea celular CHO SM preparada en el Ejemplo 7. La introducción del gen se realizó mediante el siguiente procedimiento de acuerdo con el método de electroporación convencionalmente conocido [Cytotechnology, 3, 133 (1990)]. En primer lugar, se linealizaron 30 μg del plásmido pKAN-ATIIIN135Q preparando 200 μl de una mezcla de reacción que contenía 20 μl de tampón NE 3 (fabricado por New England Biolabs) y 100 unidades de una enzima de restricción MluI (fabricada por New England

65 Biolabs) y digestión a 37 ºC durante 16 horas. Después de la reacción, la mezcla de reacción se purificó mediante el

tratamiento de extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol para recuperar así el plásmido lineal. A continuación, la línea celular CHO SM obtenida en el Ejemplo 7 se suspendió en un tampón K-PBS (KCl 137 mmol/l. NaCl 2,7 mmol/l, Na2HPO4 8,1 mmol/l, KH2PO4 1,5 mmol/l, MgCI2 4,0 mmol/l) para preparar una suspensión de of 8 x 107 células/ml. Después de mezclar 200 μl de la suspensión celular (1,6 x 106 células) con 9 μg del plásmido lineal 5 descrito anteriormente, un volumen completo de la mezcla de ADN -célula se introdujo en una cubeta Gene Pulser (distancia inter-electrodo de 2 mm, fabricada por BIO-RAD), y la introducción del gen se realizó usando un dispositivo de electroporación Gene Pulser (fabricado por BIO-RAD) en condiciones de 350 V de voltaje de impulso y 250 μF de capacidad eléctrica. Después de realizar la introducción del gen, la suspensión celular se suspendió en 30 ml de medio IMDM (fabricado por Life Technologies) complementado con suero bovino fetal al 10% (fabricado por

10 Life Technologies) y 50 μg/ml de gentamicina (fabricado por Nacalai Tesque) y se inoculó a 100 μl/pocillo en 3 placas de 96 pocillos para células adherentes (fabricado por Greiner). El cultivo se realizó en condiciones de CO2 al 5% y a una temperatura de 37 ºC.

2. Obtención de líneas celulares resistentes a MTX

15 Las células con pKAN-ATIIIN135Q introducido obtenidas en el apartado anterior se cultivaron durante 6 días y después el sobrenadante de cultivo se desechó y se dispensó medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, 50 μg/ml de gentamicina y MTX 50 nM (fabricado por SIGMA) a 100 μl/pocillo. El cultivo continuó durante 9 días repitiendo al mismo tiempo esta labor de cambio de medio a un intervalo de 3 a 4 días. A

20 continuación, el cultivo continuó durante 18 días repitiendo al mismo tiempo esta labor de cambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 200 a un intervalo de 3 a 4 días, y las colonias finalmente formadas se inocularon en una placa de 24 pocillos (fabricada por SIGMA). Posteriormente, el cultivo continuó durante 19 días repitiendo al mismo tiempo la labor de cambio de medio usando el medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500

25 nM a un intervalo de 3 a 4 días, ampliando opcionalmente el proceso para obtener así líneas celulares resistentes a MTX 500 nM.

3. Selección de líneas celulares altamente productoras de ATIIIN135Q

30 De cada una de las diversas líneas celulares resistentes a MTX 500 nm obtenidas en el apartado anterior, se recogieron 1,0 x 106 células, se suspendieron en 5 ml de medio IMDM complementado con suero bovino fetal dializado al 10%, gentamicina 50 μg/ml y MTX 500 y después se cultivó inoculando en un matraz de tipo T25. Tres días después del cultivo, el sobrenadante del cultivo se recuperó y la cantidad de ATIIIN135Q contenida en el sobrenadante se midió usando el kit de ELISA para antitrombina (ATIII) (fabricado por Affinity Biological), para

35 establecer una línea celular altamente productora. El método se realizó de acuerdo con el manual adjunto al mismo y como preparación patrón se usó la preparación Neuart. Como resultado, se confirmó que la antitrombina III se expresaba en el sobrenadante de cultivo a una concentración de 45,4 ng/ml y este transformante se denominó línea celular pKAN-ATIIM135Q GMDKO.

40 Después de esto, se obtuvo una antitrombina III recombinante de tipo mutante que tenía una cadena glucídica en la que la fucosa no se unía a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor mediante el método descrito en el Ejemplo 4 y se confirmó que el número de cadenas glucídicas de tipo unido a N era de 3. Además, midiendo la actividad biológica de la antitrombina III mediante el método descrito en el Ejemplo 5 se confirmó que la antitrombina III recombinante de tipo mutante en las células GMDKO tenía una constate de disociación de la heparina

45 significativamente menor y una actividad cofactora de la heparina y una constante de velocidad secundaria de inhibición de trombina significativamente mayor que la de la antitrombina III recombinante de tipo mutante expresada en las células CHO/DG44.

Ejemplo 10

50 Expresión de la antitrombina III recombinante en levaduras:

Aunque se conocen muchos tipos de levadura, las levaduras pertenecientes al género Pichia y al género Saccharomyces pueden ilustrarse como levaduras típicas frecuentemente usadas como hospedadores para 55 expresar proteínas recombinantes. En general, se sabe que la estructura principal de las cadenas glucídicas de tipo unido a N para añadir a las proteínas recombinantes expresadas por estas levaduras es una cadena glucídica de tipo manosa superior que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en el resto núcleo del extremo reductor y que tiene de 9 a varias decenas de restos de manosa y de algunos a más de 10 restos de manosa 6-fosfato en la región ramificada en el extremo no reductor (Yeast, 19, 1191 (2002)). Además, una cadena glucídica de tipo manosa

60 superior que tiene tal estructura con frecuencia se denomina cadena glucídica de tipo hipermanosa.

En los ejemplos descritos a continuación, primero se describen métodos de preparación de cepas de Pichia y cepas de Saccharomyces capaces de expresar una antitrombina III a la cual, como cadena glucídica de tipo unido a N, se añade principalmente una cadena glucídica de tipo híbrido, que tiene una estructura intermedia de cadena glucídica

65 de tipo manosa superior y una cadena glucídica de tipo complejo.

1. Preparación de una cepa de levadura de Pichia en la que el gen genómico de la enzima PNO 1 está alterado

Usando, como molde, ADN genómico de una cepa de levadura de Pichia, tal como la cepa GTS 115 de Pichia pastoris (fabricada por Invitrogen), se amplificó por PCR una secuencia completa de la región de traducción del gen 5 PNO 1 (fosfomanosilación de oligosacáridos 1 unidos a N) (número de acceso al GenBank: AB099514) de la levadura Pichia. La secuencia del gen PNO 1, de aproximadamente 3200 pb, amplificada de esta manera, después de sustituir su secuencia media en el extremo 5’ por un gen de orotidina-5’-fosfato descarboxilasa (URA 3) derivado de levadura (número de acceso al GenBank: AF321098), se insertó en un vector tal como el vector pCR2.1-TOPO (fabricado por Invitrogen) para preparar un plásmido para usar en la alteración del gen PNO 1. A continuación, se linealizaron 100 μg de este plásmido usando una enzima de restricción y se después introdujo de manera estable en la levadura Pichia tal como GTS 115 por el método de electroporación descrito en el Kit de Expresión para Pichia (fabricado por Invitrogen). Después, la levadura con el gen introducido se cultivo a temperatura ambiente usando medio YPD sin uracilo (fabricado por Invitrogen), y se extrajo ADN genómico de cada una de las colonias de cultivo. Posteriormente, amplificando por PCR la secuencia del locus PNO 1 de la levadura usando, como molde, este ADN

15 genómico, se seleccionó un clon de levadura en el que el locus de PNO 1 estaba alterado por recombinación homóloga. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N expresada por la levadura Pichia puede modificarse en una cadena glucídica de tipo manosa superior que tiene 2 restos de Nacetilglucosamina en el resto núcleo del extremo reductor y tiene una estructura en la que de 9 a diez docenas de restos de manosa se unen al extremo no reductor.

2. Preparación de una cepa de levadura de Pichia en la que el gen genómico de la α-1,6-manosiltransferasa genómico está alterado

Usando como molde ADN genómico de una cepa de levadura de Pichia, tal como la cepa X-33 de Pichia pastoris

25 (fabricada por Invitrogen), se amplificó por PCT el gen α-1,6-manosiltransferasa (OCH 1) (número de acceso al GenBank: AF540063) de la levadura Pichia. La secuencia del gen OCH 1, de aproximadamente 2800 pb, amplificada de esta manera, después de sustituir su secuencia media en el extremo 5’ por un gen de orotidina-5’fosfato descarboxilasa (URA 3) derivado de levadura (número de acceso al GenBank: AF321098) se insertó en un vector, tal como el vector pCR2.1-TOPO (fabricado por Invitrogen), para preparar un vector para la modificación del gen OCH 1. A continuación, usando una enzima de restricción Sfil (fabricada por New England Biolabs) se linealizaron 100 μg de este vector, y después se introdujo de manera estable en una cepa de Pichia, tal como la cepa alterada del gen PNO 1, descrita en el apartado anterior o la cepa JC308 de Pichia pastoris, por el método de electroporación descrito en el Kit de Expresión de Pichia (fabricado por Invitrogen). A continuación, la levadura con el gen introducido, se cultivó a temperatura ambiente usando medio YPD sin uracilo (fabricado por Invitrogen), y se

35 extrajo ADN genómico de cada una de las colonias de cultivo. Posteriormente, amplificando por PCR la secuencia del locus OCH 1 de la levadura usando, como molde, este ADN genómico, se seleccionó una cepa del clon de levadura en la que el locus OCH 1 estaba alterado por recombinación homóloga. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unido a N expresada por la levadura Pichia puede modificarse en una cadena glucídica de tipo manosa superior Man8 que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en la parte del núcleo del extremo reductor y que tiene una estructura en la que 8 restos de manosa están unidos al extremo no reductor.

3. Preparación de una cepa de levadura de Pichia en la que se introduce un gen α-1,2-manosidasa quimérico recombinante

45 Usando el Kit RNeasy Mini (fabricado por QIAGEN) se extrajo ARN total de un gusano redondo (Caenorhabditis eiegans) y después se preparó la primera cadena de ADNc usando este ARN como el molde y usando el kit de síntesis de primera cadena de ADNc Superscript™ (fabricado por Invitrogen). Después, realizando PCR usando este ADNc como molde y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó específicamente un ADNc que codifica el dominio activo de la α-1,2-manosidasa del gusano redondo (número de acceso a GenBank: NM-073594). El ADNc amplificado de esta manera, tras ligarse a una secuencia de ADNc que codificaba el péptido líder de un gen de α-manosidasa (MNS 1) de levadura (número de acceso a GenBank: M63598) a su extremo 5’, se insertó en un vector, tal como el vector de expresión pPICZ para levadura (fabricado por Invitrogen), para preparar de esta manera un vector para la expresión de la α-1,2-manosidasa en el retículo

55 endoplásmico de la levadura. Después, este vector se introdujo de manera estable por electroporación en la cepa de levadura de Pichia descrita anteriormente en la que tanto el gen PNO 1 como el gen OCH 1 estaban alterados por recombinación homóloga. Después de la introducción del gen, la levadura se cultivó a temperatura ambiente usando medio YPD (fabricado por Invitrogen) que carecía de uracilo y que contenía zeosina (fabricada por Invitrogen), un ARN total se extrajo de cada una de las colonias en cultivo. Después, mediante PCR, se seleccionó una cepa del clon de levadura en la que se encontró expresión de la α-1,2-manosidasa quimérica recombinante, usando, como molde, una primera cadena de ADNc preparada a partir de este ARN total. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N expresada por la levadura de Pichia puede modificarse en una cadena glucídica de tipo manosa superior, Man5 que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en el resto núcleo del agente reductor y tiene una estructura en la que 5 restos de manosa están unidos al extremo no reductor.

65 4. Preparación de una cepa de levadura de Pichia en la que se introduce un gen transportador de UDP-Nacetilglucosamina recombinante

Usando el Kit RNeasy (fabricado por QIAGEN) se extrajo ARN total de una levadura (Kluyveromyces lactis) y

5 después se preparó ADNc usando este ARN como molde y usando el kit de síntesis de primera cadena de ADNc Superscript™ (fabricado por Invitrogen). A continuación, realizando PCR, usando este ADNc como molde y usando cebadores específicos y KOD de polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó específicamente un ADNc que codificaba una región de traducción completa del transportador de UDP-N-acetilglucosamina de levadura (número de acceso a GenBank: AF106080). A continuación, el ADNc de aproximadamente 3700 pb amplificado de esta manera se insertó entre las enzimas de restricción en el sitio de escisión de EcoRI y el sitio de escisión de Notl en posición aguas abajo de la secuencia promotora de la alcohol oxigenasa de un vector, tal como un vector de expresión pPIC3.5K para levaduras (fabricado por Invitrogen), para preparar de esta manera un vector que expresase el transportador de UDP-N-acetilglucosamina en el aparato de Golgi de la levadura. Después, este vector se introdujo de manera estable por electroporación en la cepa de levadura de Pichia con el gen α-1,2-manosidasa

15 introducido, descrito en el apartado anterior. Después de la introducción del gen, la levadura se cultivó a temperatura ambiente usando medio YPD que contenía un agente G418 (fabricado por Nacalai Tesque) y se extrajo ARN total de cada una de las colonias de cultivo. Después de esto, mediante PCR se seleccionó una cepa del clon de levadura en la que se encontró expresión de un transportador de UDP-N-acetilglucosamina, usando, como molde, el ADNc preparado a partir de este ARN total.

5. Preparación de una cepa de levadura de Pichia en la que se introduce un gen de N-acetilglucosaminiltransferasa recombinante quimérico

Realizando PCR usando como molde un ADNc de hígado humano (fabricado por Clontech) y usando cebadores

25 específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó un ADNc que codificaba el dominio activo de la N-acetilglucosaminiltransferasa-I (número de acceso a GenBank: M55621). El ADNc amplificado de esta manera, después de ligar una secuencia de ADN que codificaba el péptido líder de un gen de manosiltransferasa (MNN 9) de levadura (número de acceso a GenBank: L23752) a su extremo 5’, se insertó entre las enzimas de restricción en el sitio de escisión de KpnI y el sitio de escisión de Xbal en posición aguas abajo de la secuencia promotora de la alcohol deshidrogenasa de un vector, tal como un vector de expresión pAUR123 para levaduras (fabricado por Takara Bio), para preparar de esta manera un vector que expresase la Nacetilglucosaminiltransferasa-I en el aparato de Golgi de la levadura. Después, este vector se introdujo en la cepa de levadura de Pichia en la que se había introducido el gen transportador UDP-N-acetilglucosamina descrito en el apartado anterior, por el método de acetato de litio descrito en el manual adjunto al vector de expresión pAUR123.

35 Después de la introducción del gen, la levadura se cultivo a temperatura ambiente usando medio YPD que contenía un agente aureobasidin A (fabricado por Takara Bio) y se extrajo ARN total de cada una de las colonias de cultivo. Después, mediante PCR, se seleccionó una cepa del clon de levadura en la que se encontró expresión de la Nacetilglucosaminiltransferasa-I recombinante, usando, como molde, un ADNc preparado a partir de este ARN total. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N expresada por la levadura de Pichia puede modificarse en una cadena glucídica de tipo híbrido que tiene una estructura en la que un resto de N-acetilglucosamina se añade al extremo no reductor de una cadena glucídica de tipo manosa superior, de tipo Man5, que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en el resto núcleo del extremo reductor y tiene 5 restos de manosa unidos al extremo no reductor.

45 Por tanto, se han descrito métodos de preparación de cepas de levadura de Pichia que principalmente expresan una cadena glucídica de tipo híbrido, concretamente una estructura intermedia de cadena glucídica de tipo manosa superior y una cadena glucídica de tipo complejo, como la cadena glucídica de tipo unida a N. Además de las cepas de Pichia descritas anteriormente, como levaduras frecuentemente usadas como hospedador para expresar proteínas recombinantes pueden ilustrarse cepas pertenecientes al género Saccharomyces. A continuación se describen métodos de preparación de una cepa de levadura de Saccharomyces que principalmente expresa la cadena glucídica de tipo híbrido como la cadena glucídica de tipo unida a N.

6. Preparación de una cepa de levadura de Saccharomyces en la que, en el genoma, se altera el gen de α-1,6manosiltransferasa y el gen de α-1,3-manosiltransferasa

55 De acuerdo con el método de Nakayama et al. (EMBO Journal, 11, 2511 (1992)), se seleccionó un clon de levadura en el que el locus OCH 1 estaba alterado por recombinación homóloga. Se indujeron células haploides de acuerdo con el método de Sherman et al. (Methods in Enzymology, 194, 21 (1991)) de la cepa de levadura de Saccharomyces en la que se alteró el locus del gen OCH 1 y después se mezcló con las células haploides de una cepa de levadura mutante LB1-10B en la que el gen de α-1,3-manosiltransferasa (MNN 1) estaba alterado (Universidad de California), seguido de cultivo en condiciones deficientes en nitrógeno para formar zigotos diploides. A continuación, los zigotos obtenidos de esta manera se cultivaron a temperatura ambiente usando medio YPD carente de uracilo y leucina y se extrajo ADN genómico de cada una de las colonias en cultivo. Posteriormente, una cepa del clon de la levadura en la que tanto el locus del gen OCH 1 como el locus del gen MNN 1 estaban alterados,

65 se seleccionó amplificando, por PCR, la secuencia del locus OCH 1 (número de acceso a GenBank: AF540063) y la secuencia del locus de MNN 1 (número de acceso GenBank: AF540063L23753) respectivamente de la levadura usando este ADN genómico como molde. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N expresada por la levadura de Saccharomyces puede modificarse en una cadena glucídica de tipo manosa superior, de tipo Man8, que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en el resto núcleo del extremo reductor y

5 tiene una estructura en la que 8 restos de manosa están unidos al extremo no reductor.

7. Preparación de una cepa de levadura de Saccharomyces en la que se introduce un gen de α-1,2-manosidasa recombinante quimérico

Usando el Kit RNeasy Mini (fabricado por QIAGEN) se extrajo ARN total de un hongo (Aspergillus saitoi) y después, usando este ARN como molde y usando el kit de síntesis de primera cadena de ADNc Superscript™ (fabricado por Invitrogen) se preparó ADNc. A continuación, realizando PCR usando este ADNc como molde y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó específicamente un ADNc que codificaba la región de traducción completa de la α-1,2-manosidasa fúngica (número de acceso a GenBank: D49827). Después de ligar un péptido de señal específico del retículo endoplásmiso de levadura (FMBO Journal, 7, 15 913 (1988)), concretamente una secuencia de ADNc que codifica histidina-ácido aspártico-ácido glutámico-leucina y un codón de terminación de la traducción, al extremo 3’ del ADNc de aproximadamente 1500 pb amplificado de esta manera, del cual se había eliminado su codon de terminación de la traducción, se insertó en un vector, tal como el vector pPICZ para levaduras (fabricado por Invitrogen) o similar, para preparar así un vector para la expresión de la α-1,2-manosidasa en el retículo endoplásmico de la levadura. A continuación, este vector se introdujo de manera estable por electroporación en la cepa de levadura de Saccharomyces descrita anteriormente en la que el gen de α1,6-manosiltransferasa y el gen de α-1,3-manosiltransferasa estaban alterados. Después de la introducción del gen, la levadura se cultivó a temperatura ambiente usando medio YPD (fabricado por Invitrogen) que carecía de uracilo y que contenía zeosina (fabricada por Invitrogen) y se extrajo ARN total de cada una de las colonias de cultivo. Posteriormente, mediante PCR, se seleccionó una cepa del clon de levadura en la que se encontró expresión de la

25 α-1,2-manosidasa quimérica recombinante, usando, como molde, un ADNc preparado a partir de este ARN total. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N expresada por la levadura Saccharomyces puede modificarse en una cadena glucídica de tipo manosa superior, de tipo Man5, que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en el resto núcleo del extremo reductor y tiene una estructura en la que 5 restos de manosa están unidos al extremo no reductor.

8. Preparación de una cepa de levadura de Saccharomyces en la que se introduce un gen transportador de UDP-Nacetilglucosamina recombinante

Usando el kit RNeasy Mini (fabricado por QIAGEN) se extrajo ARN total de una levadura (Kluyveromyces lactis) y

35 después usando como molde este ARN y usando el kit de síntesis de primera cadena de ADNc Superscript™ (fabricado por Invitrogen) se preparó ADNc. A continuación, realizando PCR usando este ADNc como molde y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó específicamente un ADNc que codificaba una región de traducción completa del transportador UDP-N-acetilglucosamina de levadura (número de acceso a GenBank: AF106080). Después, el ADNc, de aproximadamente 3700 pb, amplificado de esta manera, se insertó entre el sitio de escisión de EcoRI y el sitio de escisión de Notl de las enzimas de restricción en posición aguas abajo de la secuencia promotora de la alcohol oxigenasa de un vector, tal como, un vector de expresión pPIC3.5K para levaduras (fabricado por Invitrogen), para preparar de esta manera un vector que expresase el transportador de UDP-N-acetilglucosamina en el aparato de Golgi de la levadura. Después, este vector se introdujo de manera estable por electroporación en la cepa de Saccharomyces con el gen α-1,2-manosidasa

45 introducido descrita en el aparado anterior. Después de la introducción del gen, la levadura se cultivó a temperatura ambiente usando medio YPD que contenía un agente G418 (fabricado por Nacalai Tesque) y se extrajo ARN total de cada una de las colonias en cultivo. Después de esto, mediante PCR, se seleccionó una cepa de clon de levadura en la que se encontró expresión del transportador de UDP-N-acetilglucosamina usando, como molde, ADNc preparado a partir de este ARN total.

9. Preparación de una cepa de levadura de Saccharomyces en la que se introduce un gen de Nacetilglucosaminiltransferasa-l recombinante quimérico.

Realizando PCR usando, como molde, un ADNc de hígado humano (fabricado por Clontech) y usando cebadores

55 específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplifico específicamente un ADNc que codificaba el dominio activo de la N-acetilglucosaminiltransferasa-l (número de acceso a GenBank: M55621). El ADNc amplificado de esta manera, después de ligarse a una secuencia de ADNc que codificaba el péptido líder de un gen de manosiltransferasa (MNN 9) de levadura (número de acceso s GenBank: L23752) a su extremo 5’, se insertó entre el sitio de escisión de KpnI y el sitio de escisión de Xbal de las enzimas de restricción, en posición aguas abajo de la secuencia promotora de la alcohol deshidrogenasa de un vector, tal como, un vector pAUR123 para levaduras (fabricado por Takara Bio), para preparar así un vector que expresase la Nacetilglucosaminiltransferasa-l en el aparato de Golgi de la levadura. A continuación, este vector se introdujo en la cepa de levadura de Saccharomyces con el gen transportador de UDP-N-acetilglucosamina introducido, descrita en el apartado anterior, mediante el método de acetato de litio descrito en el manual adjunto al vector de expresión

65 pAUR123. Después de la introducción del gen, la levadura se cultivó a temperatura ambiente usando medio YPD que contenía un agente aureobasidin A (fabricado por Takara Bio) y se extrajo ARN total de cada una de las colonias en cultivo. A continuación, mediante PCR, se seleccionó una cepa del clon de levadura en la que se encontró expresión de la N-acetilglucosaminiltransferasa, usando como molde un ADNc preparado a partir de este ARN total. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N expresada

5 por la levadura Saccharomyces puede modificarse en una cadena glucídica de tipo híbrido que tiene una estructura en la que se añade un resto de N-acetilglucosamina al extremo no reductor de una cadena glucídica de tipo manosa superior, de tipo Man5, que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en el resto núcleo del extremo reductor y tiene 5 restos de manosa unidos al extremo no reductor.

De esta manera, se han descrito métodos de preparación de cepas de levadura de Pichia o de Saccharomyces que expresan principalmente una cadena glucídica de tipo híbrido en la que un resto de N-acetilglucosamina se añade al extremo no reductor de una cadena glucídica de tipo manosa superior, de tipo Man5, como la cadena glucídica de tipo unida a N. A continuación se describen los métodos de preparación de una antitrombina III humana recombinante que tiene principalmente una cadena glucídica de tipo híbrido como la cadena glucídica de tipo unida

15 a N.

10. Preparación de un vector de expresión de antitrombina III humana recombinante

De acuerdo con el método de Yamauchi et al. (Bioscience, Biotechnology and Biochemistry, 56,600 (1992)), se amplificó específicamente, por PCR, un ADNc que codificaba la antitrombina III humana de tipo madura de longitud completa, usando como molde un ADNc de hígado humano (fabricado por Clontech) y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.) como enzima para amplificación. Después de esto, el ADNc obtenido de esta manera se insertó entre el sitio de escisión de ClaI y el sitio de escisión de XbaI de las enzimas de restricción en posición aguas abajo de la secuencia promotora de la alcohol oxigenasa de un vector, tal como, un vector de expresión pPIC6α

25 para levadura (fabricado por Invitrogen), para preparar de esta manera un vector pPIC6α/hATIII que exprese y segregue la antitrombina III humana de tipo madura.

11. Preparación de una cepa de levadura en la que se introduce un gen de antitrombina III humana recombinante

Se preparó un vector linealizado a partir de 100 μg del vector pPIC6α/hATIII que expresaba y segregaba la antitrombina III humana de tipo madura descrita en el apartado anterior, realizando digestión dentro del gen HIS4 con una enzima de restricción SalI (fabricada por New England Biolabs) y sometiendo los fragmentos resultantes a extracción con fenol/cloroformo y precipitación con etanol. A continuación, de acuerdo con el método de Mochizuki et al. (Protein Expression and Purification, 23, 55 (2001)), este vector de expresión de antitrombina III linealizado se 35 introdujo por el método de acetato de litio en la cepa de levadura de Pichia capaz de expresar principalmente una cadena glucídica de tipo híbrido como la cadena glucídica de tipo unida a N, descrita en el apartado 5 de este Ejemplo, descrito anteriormente, o la cepa de levadura de Saccharomyces capaz de expresar principalmente una cadena glucídica de tipo híbrido como la cadena glucídica de tipo unida a N, descrita en el apartado 9 de este Ejemplo, descrito anteriormente. Después de la introducción del gen, la levadura se cultivó a temperatura ambiente usando medio YPD (fabricado por Invitrogen) que contenía un agente de blasticidina (fabricado por Invitrogen) para obtener colonias resistentes a blasticidina. Después, cada una de las colonias resistentes a blasticidina se inoculó en el medio YPD líquido (fabricado por Invitrogen) para realizar un cultivo en lotes a 30 ºC durante 24 horas o más. El sobrenadante del cultivo obtenido después del cultivo se analizó usando Neuart, como sustancia patrón, una preparación médica de antitrombina III derivada de plasma humano (fabricada por Mitsubishi Pharma Corporation) o

45 similar y usando el kit de ELISA para antitrombina III humana (fabricado por Affinity Biologicals). Mediante este análisis, es posible detectar la antitrombina III humana recombinante contenida en el sobrenadante del cultivo y medir su concentración. Esta antitrombina III recombinante que tiene una cadena glucídica de tipo híbrido que no contiene fucosa como cadena glucídica de tipo unida a N, secretada en el sobrenadante del cultivo de levadura, puede purificarse por el método descrito en el Ejemplo 4. Además, la estructura de cadena glucídica de la proteína de antitrombina III purificada puede analizarse mediante el método descrito en el Ejemplo 4.

Por tanto, se ha descrito que, usando como huésped, una cepa de levadura de Pichia que principalmente expresa una cadena glucídica de tipo híbrido en la que se añade un resto de N-acetilglucosamina al extremo reductor de una cadena glucídica de tipo manosa superior, de tipo Man 5, como la cadena glucídica de tipo unida a N, o una cepa de

55 levadura de Saccharomyces modificada de la misma manera, puede prepararse una antitrombina III humana recombinante que tiene principalmente una cadena glucídica de tipo híbrido que no contiene fucosa como cadena glucídica de tipo unida a N. A continuación, se describen métodos para preparar cepas de levaduras que expresen una antitrombina III humana recombinante que principalmente tenga una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo, como la cadena glucídica de tipo unida a N que no contiene fucosa, usando esta cepa de levadura que expresa una antitrombina III humana recombinante que principalmente tiene una cadena glucídica de tipo híbrido como cadena glucídica de tipo unido a N.

12. Preparación de una cepa de levadura en la que se introduce un gen de α-manosidasa II quimérico recombinante

65 Realizando PCR, usando como molde un ADNc derivado de un tejido humano, por ejemplo, de hígado (fabricado por Clontech) y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó

específicamente un ADNc que codificaba el dominio activo de la α-manosidasa III (número de acceso a GenBank: U31520). El ADNc amplificado de esta manera, después de ligarse a una secuencia de ADNc que codificaba el péptido líder de un gen de manosiltransferasa (MNN 9) de levadura (número de acceso a GenBank: L23752) a su extremo 5’, se insertó aguas abajo en la secuencia promotora de un vector de expresión para levadura, para 5 preparar de esta manera un vector que expresase α-manosidasa II en el aparato de Golgi de la levadura. Después, este vector se introdujo de manera estable en la cepa de levadura descrita en el apartado 11 anterior de este Ejemplo, que expresaba una antitrombina III humana recombinante que tenía principalmente una cadena glucídica de tipo híbrido como cadena glucídica de tipo unida a N. Después de la introducción del gen, basándose en su auxotrofia y resistencia a fármacos, se seleccionó un clon de la levadura y posteriormente, mediante RT-PCR, se

10 confirmó la expresión de la α-manosidasa II quimérica.

13. Preparación de una cepa de levadura en la que se introduce un gen de N-acetilglucosaminiltransferasa II quimérico recombinante

15 Realizando PCR, usando como molde un ADNc derivado de un tejido humano, por ejemplo, de hígado (fabricado por Clontech) y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó específicamente un ADNc que codificaba el dominio activo de la N-acetilglucosaminiltransferasa II (número de acceso a GenBank: U15128). Tras ligar el ADNc, amplificado de esta manera, a una secuencia de ADNc que codificaba el péptido líder de un gen de manosiltransferasa (MNN 9) de levadura (número de acceso a GenBank:

20 L23752) en su extremo 5’, se insertó aguas abajo en la secuencia promotora de un vector de expresión para levadura, para preparar de esta manera un vector que expresase la N-acetilglucosaminiltransferasa II en el aparato de Golgi de la levadura. Después, este vector se introdujo de manera estable en la cepa de levadura descrita en el apartado anterior en la que se había introducido de manera estable una α-manosidasa II quimérica en una cepa de levadura que expresaba una antitrombina III humana recombinante que principalmente tenía una cadena glucídica

25 de tipo híbrido como cadena glucídica de tipo unida a N. Después de la introducción del gen, basándose en su auxotrofia y resistencia a fármacos, se seleccionó un clon de la levadura y posteriormente, mediante RT-PCR, se confirmó la expresión de la N-acetilglucosaminiltransferasa-II quimérica. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N, que poseía el gen de antitrombina III recombinante expresado por la cepa de levadura en la que se introdujo de manera estable la N-acetilglucosaminiltransferasa II quimérica, puede

30 modificarse en una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo que no contiene fucosa, que tiene dos restos de Nacetilglucosamina en la región núcleo del extremo reductor y que tiene una estructura en la que tres restos de manosa se unen a su extremo no reductor mediante una estructura birramificada y a cada uno de los dos extremos no reductores se añade un resto de N-acetilglucosamina.

35 14. Preparación de una cepa de levadura en la que se introduce un gen transportador de UDP-galactosa recombinante

Realizando PCR, usando como molde un ADNc derivado de un tejido humano, por ejemplo, de hígado (fabricado por Clontech) y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó 40 específicamente un ADNc que codificaba la región de traducción completa del transportador de UDP-galactosa (número de acceso a GenBank: AB042425). El ADNc amplificado de esta manera se insertó aguas abajo de la secuencia promotora de un vector de expresión para levadura, para preparar de esta manera un vector que expresase el transportador de UDP-galactosa en el aparato de Golgi de la levadura. A continuación, este vector se introdujo de manera estable en la cepa de levadura descrita anteriormente, que expresaba una antitrombina III

45 humana recombinante que tenía principalmente una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo inmadura. Después de la introducción del gen, basándose en su auxotrofia y resistencia a fármacos, se seleccionó un clon de la levadura y posteriormente, mediante RT-PCR, se confirmó la expresión del transportador de UDP-galactosa.

15. Preparación de una cepa de levadura en la que se introduce un gen de β-1,4-galactosiltransferasa quimérico 50 recombinante

Realizando PCR, usando como molde un ADNc derivado de un tejido humano, por ejemplo, de hígado (fabricado por Clontech) y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricada por Toyobo Co., Ltd.), se amplificó específicamente un ADNc que codificaba la β-1,4-galactosiltransferasa (número de acceso a GenBank: M22921). 55 Tras ligar el ADNc amplificado de esta manera, con una secuencia de ADNc que codificaba el péptido líder de un gen de manosiltransferasa (MNN 9) de levadura (número de acceso a GenBank: L23752) en su extremo 5’, se insertó aguas abajo en la secuencia promotora de un vector de expresión para levaduras, para preparar así un vector que expresase la β-1,4-galactosiltransferasa en el aparato de Golgi de la levadura. A continuación, este vector se introdujo de manera estable en la cepa de levadura descrita en el apartado anterior en la que se introdujo de 60 manera estable la β-1,4-galactosiltransferasa quimérica en una cepa de levadura que expresaba una antitrombina III humana recombinante que tiene principalmente una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo inmadura como cadena glucídica de tipo unida a N. Después de la introducción del gen, basándose en su auxotrofia y resistencia a fármacos, se seleccionó un clon de la levadura y posteriormente, mediante RT-PCR, se confirmó la expresión de la β-1,4-galactosiltransferasa quimérica. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de 65 tipo unida a N que posee el gen de antitrombina III recombinante expresado por la cepa de levadura en la que se

introdujo la α-1,4-galactosiltransferasa quimérica, puede modificarse en una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo inmadura que tiene 2 restos de N-acetilglucosamina en la región núcleo del extremo reductor y que tiene una estructura en la que tres restos de manosa están unidos a su extremo no reductor a través de una estructura birramificada y a cada uno de los dos extremos no reductores se añade un resto de N-acetilglucosamina.

16. Preparación de una cepa de levadura en la que se introduce un gen transportador de ácido CMP-siálico recombinante.

Realizando PCR, usando como molde un ADNc derivado de un tejido humano, por ejemplo, de hígado (fabricado por Clontech) y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) se amplificó específicamente un ADNc que codificaba la región de traducción completa del transportador de ácido CMP-siálico (número de acceso a GenBank: D87969). El ADNc amplificado de esta manera se insertó aguas abajo en la secuencia promotora de un vector de expresión para levadura, para preparar de esta manera un vector que expresase el transportador de ácido CMP-siálico en el aparato de Golgi de la levadura. Después, este vector se

15 introdujo de manera estable en la cepa de la levadura descrita en el apartado anterior, que expresaba una antitrombina III humana recombinante que tenía principalmente una cadena glucídica bicatenaria inmadura como la cadena glucídica de tipo unida a N. Después de la introducción del gen, basándose en su auxotrofia y resistencia a fármacos, se seleccionó un clon de la levadura y posteriormente, mediante RT-PCR, se confirmó la expresión del transportador de ácido CMP-siálico.

17. Preparación de una cepa de levadura en la que se introduce un gen de sialiltransferasa quimérico recombinante

Realizando PCR, usando como molde un ADNc derivado de un tejido humano, por ejemplo, de hígado (fabricado por Clontech) y usando cebadores específicos y KOD polimerasa (fabricado por Toyobo Co., Ltd.) se amplificó 25 específicamente un ADNc que codificaba el dominio activo de la α2,3-sialiltransferasa (número de acceso a GenBank: L23768) o de la α2,6-sialiltransferasa (número de acceso a GenBank: X62822). Tras ligar el ADNc amplificado de esta manera, con una secuencia de ADNc que codificaba el péptido líder de un gen de manosiltransferasa (MNN 9) de levadura (número de acceso a GenBank: L23752) en su extremo 5’, se insertó aguas abajo en la secuencia promotora de un vector de expresión para levadura, para preparar de esta manera un vector que expresase la sialiltranferasa en el aparato de Golgi de la levadura. Después, este vector se introdujo de manera estable en la cepa de levadura descrita en el apartado anterior en la que se había introducido de manera estable una sialiltransferasa quimérica en una cepa de levadura que expresaba una antitrombina III humana recombinante que tenía principalmente una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo como la cadena glucídica de tipo unida a N. Después de la introducción del gen, basándose en su auxotrofia y resistencia a fármacos, se seleccionó un clon de

35 la levadura y posteriormente, mediante RT-PCR, se confirmó la expresión de la sialiltransferasa quimérica. Mediante el método anterior, la estructura principal de la cadena glucídica de tipo unida a N, que poseía el gen recombinante de antitrombina III expresado por la cepa de levadura, en la que se había integrado de manera estable una sialiltransferasa quimérica, puede modificarse en una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo madura que tiene dos restos de N-acetilglucosamina en la región núcleo del extremo reductor y que tiene una estructura en la que tres restos de manosa se unen a su extremo no reductor a través de una estructura birramificada y un resto de N-acetilglucosamina, un resto de galactosa y un ácido siálico se añaden, respectivamente, a cada uno de los dos extremos no reductores.

18. Preparación de una proteína de antitrombina III recombinante usando levadura

45 La cepa de levadura que expresaba una antitrombina III recombinante, que tenía principalmente una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo, en la que ningún resto de fucosa estaba unido al extremo reductor y se añadía ácido siálico al extremo no reductor, preparada en el apartado anterior, se inoculó en medio YPD líquido (fabricado por Invitrogen) y se sometió a cultivo en lotes a 30 ºC durante 24 horas o más para segregar la antitrombina III recombinante en el sobrenadante de cultivo. El sobrenadante del cultivo obtenido después de cultivar se analizó mediante el Kit de ELISA para Antitrombina III Humana (fabricado por Affinity Biologicals) usando, como sustancia patrón, Neuart, una antitrombina III derivada de plasma humano (fabricada por Mitsubishi Pharma Corporation), o similar. Mediante este análisis, se puede detectar la antitrombina III recombinante contenida en el sobrenadante del cultivo y medir su concentración. Adicionalmente, la antitrombina III recombinante que tiene

55 principalmente una cadena glucídica bicatenaria de tipo complejo, como cadena glucídica unida a N que no contiene fucosa, segregada en el sobrenadante de cultivo de levadura, puede purificarse mediante el método descrito en el Ejemplo 4. Además, la estructura de cadena glucídica de la proteína de antitrombina III purificada puede analizarse mediante el método descrito en el Ejemplo 4.

Por tanto, se demuestra que, preparando una cepa de levadura que expresa una antitrombina III recombinante que tiene principalmente una cadena glucídica de tipo complejo, como cadena glucídica unida a N-glucósido, que no contiene fucosa y cultivando la levadura, puede prepararse una antitrombina III recombinante que tiene principalmente una cadena glucídica de tipo complejo, como cadena glucídica unida a N-glucósido, que no contiene fucosa. En este sentido, la antitrombina III expresada por la levadura en este Ejemplo es una proteína que tiene

65 actividades biológicas equivalentes en comparación con las de la antitrombina III expresada por la célula doble inactivada de FUT8 y la antitrombina III derivada de plasma humano.

Aplicabilidad industrial

La presente invención proporciona un proceso para producir una composición de antitrombina que comprende una molécula de antitrombina que tiene cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en el que las cadenas 5 glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa no está unida a la Nacetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas.

Texto Libre del Listado de Secuencias:

10 SEC ID Nº: 20 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 21 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 22 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 23 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 24 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético

15 SEC ID Nº: 25 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 26 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 27 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 28 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 29 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético

20 SEC ID Nº: 31 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 32 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 33 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 34 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético SEC ID Nº: 35 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético

25 SEC ID Nº: 36 -Explicación para la secuencia sintética: ADN Sintético

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD. 30

<120> Método para producir una composición de antitrombina III

<130> 11618WO1

35 <150> JP2003-350164

<151>

<160> 40 40

<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1

<211> 1395 45 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 50 <222> (1).. (1395)

<400> 1

<210> 2

<211> 1398

<212> ADN

<213> Mus musculus

5 <220>

<221> CDS

<222> (1).. (1398)

<400> 2 10

<210> 3

<211> 687 5 <212> ADN

<213> Sus scrofa

<220>

<221> CDS 10 <222> (65).. (687)

<400> 3

<210> 4

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 464

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6

<211> 207

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 6

<210> 7 <211> 1504

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

5 <220>

<221> CDS

<222> (1).. (1119)

<400> 7 10

<210> 8

<211> 372

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 8

<210> 9

<211> 1316

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 9

<210> 10

<211> 321

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 10

<210> 11

<211> 2008

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 11

<210> 12

<211> 1728

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 12

<210> 13

<211> 575

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 13

<210> 14

<211> 575

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

<210> 15

<211> 383

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 15

<210> 16 10 <211> 564

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 16 15

<210> 17

<211> 120

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 17

<210> 18

<211> 274

<212> ADN 15 <213> Cricetulus griseus

<400> 18

<210> 19

<211> 9196

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 19

<210> 20

<211> 28 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético 10

<400> 20 gagacttcag cccacttcaa ttattggc 28

<210> 21

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 21 cttgtgtgac tcttaactct cagag 25

<210> 22

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 22 gaggccactt gtgtagcgcc aagtg 25

<210> 23

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 23 ccctcgagat aacttcgtat agc 23

<210> 24

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 24 ggtaggcctc actaactg 18

<210> 25

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 25 catagaaaca agtaacaaca gccag 25

<210> 26

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 26 gtgagtccat ggctgtcact g 21

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 27 cctgacttgg ctattctcag 20

<210> 28

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 28 cggaattcgc caccatgtat tccaatgtga taggaactgt aac

<210> 29

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 29 cgggatcctt acttaacaca agggttggct actctg 36

<210> 30

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 30 ctctatcgaa aagcccagaa atcctccaag ttag 34

<210> 31

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 31 ctaacttgga ggatttctgg gcttttcgat agag

<210> 32

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 32 gatatcgctg cgctcgttgt cgac 24

<210> 33

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 33 caggaaggaa ggctggaaaa gagc

<210> 34

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 34 aagcccagga aggtggcgct catcac

<210> 35

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 35 cactagttga ggcctggtag aacttcac

<210> 36

<211> 25

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<213> Secuencia artificial

<400> 36 tcctttgact tagctgagta caccg 25

<210> 37

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 37 catagggtga cctcggatag aaagg

<210> 38

<211> 1504

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1119)

<400> 38

<210> 39

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<213> Homo sapiens

<220>

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<211> 1299 5 <212> ADN

<213> -Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1299)

<400> 40

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> KYOWA HAKKO KOGYO CO., LTD.

<120> Método para producir una composición de antitrombina III

<130> 11618WO1

<150> JP2003-350164

<151>

<160> 40

<170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1

<211> 1395

<212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (1395)

<400> 1

<210> 2

<211> 1398

<212> ADN

<213> Mus musculus 5

<220>

<221> CDS

<222> (1).. (1398)

10 <400> 2

<210> 3

<211> 687 5 <212> ADN

<213> Sus scrofa

<220>

<221> CDS 10 <222> (65).. (687)

<400> 3

<210> 4

<211> 464

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

<210> 5

<211> 464

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 5

<210> 6

<211> 207

<212> PRT

<213> Sus scrofa

<400> 6

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<211> 1504 5 <212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<220>

<221> CDS 10 <222> (1).. (1119)

<400> 7

<210> 8

<211> 372

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 8

<210> 9

<211> 1316

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 9

<210> 10

<211> 321

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 10

<210> 11

<211> 2008

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 11

<210> 12

<211> 1728

<212> ADN

<213> Mus musculus

<400> 12

<210> 13

<211> 575

<212> PRT

<213> Cricetulus griseus

<400> 13

<210> 14

<211> 575

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 14

<210> 15

<211> 383

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 15

10 <210> 16

<211> 564

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

15 <400> 16

<210> 17

<211> 120

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 17

<210> 18

<211> 274

<212> ADN 15 <213> Cricetulus griseus

<400> 18

<210> 19

<211> 9196

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<400> 19

<210> 20

<211> 28 5 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético 10 <400> 20 gagacttcag cccacttcaa ttattggc 28

<210> 21

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 21 cttgtgtgac tcttaactct cagag 25

<210> 22

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 22 gaggccactt gtgtagcgcc aagtg 25

<210> 23

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 23 ccctcgagat aacttcgtat agc 23

<210> 24

<211> 18

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 24 ggtaggcctc actaactg 18

<210> 25

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 25 catagaaaca agtaacaaca gccag 25

<210> 26

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético <400> 26 gtgagtccat ggctgtcact g 21

<210> 27

<211> 20

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 27 cctgacttgg ctattctcag 20

<210> 28

<211> 43

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 28 cggaattcgc caccatgtat tccaatgtga taggaactgt aac

<210> 29

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 29 cgggatcctt acttaacaca agggttggct actctg 36

<210> 30

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 30 ctctatcgaa aagcccagaa atcctccaag ttag 34

<210> 31

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de secuencia artificial: ADN sintético

<400> 31 ctaacttgga ggatttctgg gcttttcgat agag

<210> 32

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 32 gatatcgctg cgctcgttgt cgac 24

<210> 33

<211> 24

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 33 caggaaggaa ggctggaaaa gagc

<210> 34

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 34 aagcccagga aggtggcgct catcac

<210> 35

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 35 cactagttga ggcctggtag aacttcac

<210> 36

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 36 tcctttgact tagctgagta caccg 25

<210> 37

<211> 25

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 37 catagggtga cctcggatag aaagg

<210> 38

<211> 1504

<212> ADN

<213> Cricetulus griseus

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(1119)

<400> 38

<210> 39

<211> 1119 5 <212> ADN

<213> Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1119)

<400> 39

<210> 40

<211> 1299 5 <212> ADN

<213> -Homo sapiens

<220>

<221> CDS 10 <222> (1)..(1299)

<400> 40

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un proceso para producir una composición de antitrombina III humana recombinante que comprende moléculas de antitrombina III humana recombinante que tiene cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo, en el que las cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo tienen una estructura en la que la fucosa no está unida a la N-acetilglucosamina en el extremo reductor en las cadenas glucídicas, que comprende cultivar, en un medio, un transformante obtenido introduciendo, en una célula CHO derivada de un tejido de ovario de hámster chino, un ADN que codifica la antitrombina III en el que el genoma se modifica para tener una actividad delecionada de una enzima relacionada con la síntesis de la GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo para formar y acumular, en el cultivo, dicha antitrombina III; y recuperar del cultivo dicha composición de antitrombina III.
2.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las cuatro cadenas glucídicas unidas a N-glucósido de tipo complejo son cadenas glucídicas que se unen a cuatro restos asparagina en las posiciones 96, 135, 155 y 192 respectivamente, en la secuencia de aminoácidos de la molécula antitrombina III humana.
3.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que se han inactivado todos los alelos sobre el genoma que codifica la enzima relacionada con la síntesis de un nucleótido glucídico intracelular, la GDP-fucosa, o una enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la N-acetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo.
4.

El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la enzima relacionada con la síntesis de la GDP-fucosa es una enzima seleccionada del grupo que consiste en GDP-manosa 4,6-deshidratasa (GMD) y GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa (Fx).
5.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que la GDP-manosa 4,6-deshidratasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 7.
6.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 4 en el que la GDP-manosa 4,6-deshidratasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 8.
7.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 9.
8.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la GDP-4-ceto-6-desoxi-D-manosa-3,5-epimerasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 10.
9.

El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la enzima relacionada con la modificación de una cadena glucídica en la que la posición 1 de la fucosa está unida a la posición 6 de la Nacetilglucosamina en el extremo reductor a través de un enlace α en una cadena glucídica unida a N-glucósido de tipo complejo es una α1,6-fucosiltransferasa.
10.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la α1,6-fucosiltransferasa es una proteína codificada por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos representada por la SEC ID Nº: 11.
11.

El proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la α1,6-fucosiltransferasa es una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEC ID Nº: 13.
12.

El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el transformante es FERM BP08472, FERM BP-10083 o FERM BP-10088.
13.

El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la antitrombina III es un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos desde las posiciones 33 a 464 de la SEC ID Nº: 4.
14.

El proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la antitrombina III es un polipéptido codificado por un ADN que comprende la secuencia de nucleótidos desde las posiciones 97 1392 de la SEC ID Nº: 1.
15.

Una composición de antitrombina III que se obtiene mediante el proceso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14.
16.

Un medicamento que comprende, como ingrediente activo, la composición de antitrombina III de acuerdo con la

reivindicación 15.
17.

El medicamento de acuerdo con la reivindicación 16, que es un agente para el diagnóstico, prevención o tratamiento de enfermedades acompañadas con coagulación sanguínea.