KR101510778B1 - 알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에서는 징크핑거 단백질과 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인을 포함하는 융합 단백질을 이용하여, FUT8 유전자를 비활성화시키는 방법 및 조성물이 개시된다. 이들 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이들 폴리뉴클레오티드와 융합 단백질을 포함하는 세포 역시 개시된다.

Description

알파 1,6 당전이효소(ＦＵＴ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR INACTIVATING ALPHA 1,6 FUCOSYLTRANSFERASE (FUT8) GENE EXPRESSION}
연방정부에 의해 지원된 연구 하에 이루어진 발명에 대한 권리의 진술
해당사항 없음.
본 발명의 기술 분야
본 발명은 게놈 조작(genome engineering), 세포 배양 및 단백질 생산의 분야에 관한 것이다.
단클론 항체 요법(monoclonal antibody therapy)은 의학에서 점진적으로 증가하고 있는 치료 양식이다(Glennie et al. (2000) Immunol Today 21:403-10). 20가지 이상의 FDA-승인된 단클론 항체 치료제가 존재하고, 더욱 많은 수가 현재 임상 시험 단계에 있다. 가용성 인자(가령, 혈관 내피 성장 인자 또는 종양 괴사 인자)를 대상으로 하는 항체 요법은 단순하게, 면역복합체(immunocomplex) 형성에 의해서 유리 리간드(free ligand) 농도를 감소시키는 것을 목표로 한다. 대조적으로, 항체 요법이 세포 표면 항원을 대상으로 하는 경우에(항-신생물 면역요법의 경우에서처럼), 목표는 종종 세포 자체의 제거이다. 치료 항체(therapeutic antibody)는 직접적으로 아폽토시스(apoptosis)를 유도할 수도 있지만(Shan et al.(1998) Blood 91:1644-52; Shan (2000) Cancer Immunol Immunother 48:673-83), 더 대부분은 표적 세포를 파괴하기 위해서 환자의 면역계(immune system)를 동원해야 한다. Reff et al. (1994) Blood 83:435-45; Idusogie et al. (2000) J Immunol 164:4178-84; Golay et al. (2000) Blood 95:3900-8; Harjunpaa et al. (2000) Scand J Immunol 51:634-41; Anderson et al. (1997) Biochem Soc Trans 25, 705-8; Clynes et al. (1998) Proc Natl Acad Sci U S A 95:652-6; Clynes et al. (2000) Nat Med 6: 443-6; Sampson et al. (2000) Proc Natl Acad Sci U S A 97:7503-8을 참조한다.
항체-활성화된 면역계는 침해 세포를 2가지 주요 기전, 즉 보체-의존성 세포독성(complement-dependent cytotoxicity, CDC)과 항체-의존성 세포독성(antibody-dependent cell cytotoxicity, ADCC)에 의해 파괴할 수 있다. ADCC는 항체-코팅된 표적(antibody-coated target)에 대하여 자연 킬러(natural killer, NK) 세포에 의해서 일차적으로 산출되는 면역 반응이다. Lewis et al. (1993) Cancer Immunol Immunother 37:255-63을 참조한다. ADCC에서, NK 세포는 NK 세포의 FcγRIII 수용체와의 상호작용을 통하여 일차적으로 항체의 불변(Fc) 영역을 인식한다. 이들 NK 세포는 이후, 표적 세포 표면에 퍼포린(perforin)과 그랜자임(granzyme)을 침전시켜 각각, 세포 용해(cell lysis)와 아폽토시스를 유도한다. 이러한 Fc-FcγRIII 상호작용은 Fc 당화(glycosylation)에 극히 민감하다. 당화되지 않은 면역글로불린은 Fc 수용체에 결합하지 못한다. Leatherbarrow et al. (1985) Mol Immunol 22:407-15 (1985); Walker et al. (1989) Biochem J 259:347-53 (1989); Leader et al. (1991) Immunology 72:481-5를 참조한다. 이에 더하여, Fc 영역의 Asn297에 부착된 탄수화물 사슬의 푸코실화(fucosylation)는 FcγRIII와의 결합을 저해하고 시험관내 ADCC 활성을 감소시킨다. Shields et al. (2002) J Biol Chem 277:26733-40; Shinkawa et al. (2003) J Biol Chem 278:3466-73; Niwa et al. (2004) Cancer Res 64:2127-33을 참조한다.
중국 햄스터 난소세포(CHO 세포, Cricetulus griseus)에서 생산된 것들을 비롯하여 대부분의 포유동물 면역글로불린은 푸코실화된다. Jefferis et al. (1990) Biochem J 268:529-37; Hamako et al. (1993) Comp Biochem Physiol B 106:949-54; Raju et al. (2000) Glycobiology 10:477-86. Fc 코어 영역에 푸코오스 부착은 포유동물 세포에 존재하는 유일한 α-1,6 당전이효소(fucosyltransferase)로 보이는 α-1,6 당전이효소(Fut8) 단백질에 의해 산출된 α-1,6 결합을 통해서 이루어진다. Oriol et al. (1999) Glycobiology 9:323-34; Costache et al. (1997) J Biol Chem 272:29721-8. CHO 세포에서 FUT8 유전자의 붕괴는 항체의 코어 푸코실화를 소멸시키고 ADCC를 약 100배 증가시켰다. Yamane-Ohnuki et al.(2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22를 참조한다. 하지만, 상동성 재조합에 의한 이와 같은 전통적인 유전자 붕괴는 전형적으로 고된 작업이다. 특히, C. griseus FUT8의 경우에 그러한데, 그 이유는 3개의 건강한 FUT8 -/-클론을 발견하기 위하여 대략 120,000개의 클론 세포주(cell line)를 스크리닝(screening)하여야 했기 때문이다(Yamane-Ohnuki et al. (2004), supra).
따라서, Fut8 발현이 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주에 대한 요구가 여전히 존재하고 있다. 게놈 좌위(genomic locus)의 부위-특이적 절단(site-specific cleavage)이 전통적인 상동성 재조합에 대한 효과적인 보완책 및/또는 대안을 제공한다. 이중 가닥 파괴(double-strand break, DSB)의 생성은 표적화된 좌위에서 상동성 재조합의 빈도를 1000배 이상 증가시킨다. 더 간단하게는, 비-상동성 말단 결합(non-homologous end joining, NHEJ)에 의한 부위-특이적 DSB의 부정확한 복구 역시 유전자 붕괴를 유발할 수 있다. 2개의 이러한 DSB의 생성은 임의의 거대 영역의 결실을 유발할 수 있다. 징크핑거(zinc finger) 단백질의 모듈 DNA 인식 선호가 부위-특이적 멀티-핑거 DNA 결합 단백질의 합리적인 설계를 가능하게 한다. II형 제한 효소 FokI로부터의 뉴클레아제 도메인과 부위-특이적 징크핑거 단백질의 융합이 부위-특이적 뉴클레아제의 생성을 가능하게 한다. 미국 특허공보 2003 0232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231, 및 국제공보 WO 07/014275를 참조하며, 이들의 내용은 본원에 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명에서는 FUT8 유전자의 부분적 또는 완전한 비활성화를 위한 조성물이 개시된다. 또한, 본 발명에서는 예로써, 세포 내에서 FUT8을 비활성화시켜 FUT8 유전자가 비활성화된 세포주를 생산하기 위한, 이들 조성물(시약)의 제조 방법 및 사용 방법이 개시된다. FUT8 붕괴된 세포주는 예로써, 재조합 단백질, 예를 들면, α1-안티트립신(antitrypsin), 및 단클론 항체의 생산에 유용하며, Fut8 발현이 감소된 세포에서 생산된 항체는 향상된 ADCC 기능을 나타낸다.
한 양태에서, FUT8 유전자에서 결합하도록 조작된 징크핑거 단백질이 제공된다. 본원에서 설명된 징크핑거 단백질은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 징크핑거를 포함하고, 각 징크핑거는 FUT8 유전자 내의 표적 하위부위(target subsite)에 결합하는 인식 나선(recognition helix)을 보유한다. 특정 구체예에서, 징크핑거 단백질은 4개, 5개 또는 6개 핑거(여기서 각 징크핑거는 F1, F2, F3, F4, F5 및 F6으로 명명된다)를 포함하며, 표 1에 나타낸 인식 나선의 아미노산 서열을 포함한다.
특정 구체예에서, DNA-결합 도메인이 N-말단에서 C-말단 쪽으로 정렬된 4개의 징크핑거 인식 영역 F1 내지 F4를 포함하고, F1, F2, F3 및 F4가 다음 아미노산 서열: F1: QSSDLSR(SEQ ID NO:9); F2: TSGNLTR(SEQ ID NO:10); F3: RSDDLSK(SEQ ID NO:11); 및 F4: DRSALAR(SEQ ID NO:12)를 포함하는 조작된 징크핑거 단백질 DNA-결합 도메인이 본 발명에서 제공된다.
다른 구체예에서, DNA-결합 도메인이 N-말단에서 C-말단 쪽으로 정렬된 4개의 징크핑거 인식 영역 F1 내지 F4를 포함하고, F1, F2, F3 및 F4가 다음 아미노산 서열: F1:RSDVLSA(SEQ ID NO:14); F2: QNATRIN(SEQ ID NO:15); F3: DRSNLSR(SEQ ID NO:16); 및 F4: RLDNRTA(SEQ ID NO:17)를 포함하는 조작된 징크핑거 단백질 DNA-결합 도메인이 본 발명에서 제공된다.
다른 구체예에서, DNA-결합 도메인이 N-말단에서 C-말단 쪽으로 정렬된 6개의 징크핑거 인식 영역 F1 내지 F6을 포함하고, F1, F2, F4, F5 및 F6이 다음 아미노산 서열: F1: RSDNLSV(SEQ ID NO:19); F2: QNATRIN(SEQ ID NO:15); F4: QSATRTK (SEQ ID NO:21); F5 RSDNLSR(SEQ ID NO:22); 및 F6: RNDNRKT(SEQ ID NO:23)를 포함하는 조작된 징크핑거 단백질 DNA-결합 도메인이 본 발명에서 제공된다. 이들 구체예 중에서, F3은 RSDNLST(SEQ ID NO:20) 또는 RSDHLSQ(SEQ ID NO:24)를 포함할 수도 있다.
다른 구체예에서, DNA-결합 도메인이 N-말단에서 C-말단 쪽으로 정렬된 5개의 징크핑거 인식 영역 F1 내지 F5를 포함하고, F1, F2, F3, F4 및 F5가 다음 아미노산 서열: F1: RSDNLRE(SEQ ID NO:26); F2: NNTQLIE(SEQ ID NO:27); F3: TSSILSR (SEQ ID NO:28); F4 RSDNLSA(SEQ ID NO:29); 및 F5: RKDTRIT(SEQ ID NO:30)를 포함하는 조작된 징크핑거 단백질 DNA-결합 도메인이 본 발명에서 제공된다.
다른 양태에서, 본원에 설명된 징크핑거 단백질 중 어느 것과 적어도 하나의 절단 도메인 또는 적어도 하나의 절단 절반-도메인을 포함하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 특정 구체예에서, 절단 절반-도메인은 야생형 FokI 절단 절반-도메인이다. 다른 구체예에서, 절단 절반-도메인은 조작된 FokI 절단 절반-도메인이다.
또 다른 양태에서, 본원에 설명된 단백질 중 어느 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 분리된 세포가 또한 제공된다. 특정 구체예에서, Fut8은 세포에서 비활성화된다(부분적으로 또는 완전히). 본원에 설명된 세포 중 어느 것은 예로써, 선택된 유전자 내의 표적 부위와 결합하도록 설계된 징크핑거 뉴클레아제를 이용하여 비활성화된 추가 유전자를 보유할 수 있다. 특정 구체예에서, FUT8, 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 글루타민 합성효소(GS)가 비활성화된 세포 또는 세포주가 본 발명에서 제공된다.
이에 더하여, 세포 또는 세포주에서 FUT8을 비활성화시키는 방법에서 징크핑거 단백질 및 이의 융합체를 이용하는 방법이 제공된다. 특정 구체예에서, FUT8 유전자의 비활성화는 FUT8 유전자가 비활성화되지 않은 세포에서 생산된 단백질에 비하여, 더욱 높은 수준으로 재조합 단백질을 생산할 수 있거나, 또는 이들 단백질의 하나 이상의 활성(기능)이 증가한 세포주를 가져온다. 가령, 비활성화된 FUT8 유전자를 보유하는 본원에 설명된 바와 같은 세포주는 면역요법을 위한 향상된 ADCC 기능을 나타내는 단클론 항체를 생산하는데 이용될 수 있다. 본원에 설명된 바와 같은 세포주는 또한, 재조합 α1-안티트립신을 생산하는데 이용될 수 있다.
따라서, 다른 양태에서, 세포에서 세포 FUT8 유전자(가령, 내인성 FUT8 유전자)를 비활성화시키는 방법이 본 발명에서 제공되며, 상기 방법은 (a) 제1 폴리펩티드를 인코딩하는 제1 핵산을 세포 내로 도입하는 단계를 포함하고, 이때 제1 폴리펩티드는 (i) 내인성 FUT8 유전자 내의 제1 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크핑거 DNA-결합 도메인; 및 (ii) 절단 도메인을 포함하며, 이로써 폴리펩티드가 세포에서 발현됨으로써 폴리펩티드가 표적 부위에 결합하여 FUT8 유전자를 절단한다. 특정 구체예에서, 상기 방법은 제2 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하고, 이때 제2 폴리펩티드는 (i) FUT8 유전자 내의 제2 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크핑거 DNA-결합 도메인; 및 (ii) 절단 도메인을 포함하며, 이로써 제2 폴리펩티드가 세포에서 발현됨으로써 제1 및 제2 폴리펩티드가 그들 각각의 표적 부위에 결합하여 FUT8 유전자를 절단한다. 제1 및 제2 폴리펩티드는 제1 핵산 또는 상이한 핵산에 의해 인코딩된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드, 예를 들면, 추가적인 징크핑거 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입된다.
또 다른 양태에서, 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법이 본 발명에서 제공되며, 상기 방법은 (a) 내인성 FUT8 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 본 발명에 설명된 방법 중 어느 것에 의해서 숙주 세포의 내인성 FUT8 유전자를 비활성화시키는 단계; 및 (c) 목적하는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자(transgene)를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서, 목적하는 단백질은 항체, 예를 들면, 단클론 항체를 포함한다.
본원에 설명된 세포 및 방법 중 어느 것에서, 세포 또는 세포주는 COS, CHO (가령, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(가령, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 곤충 세포, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf), 또는 진균류 세포, 예를 들면, 사카로미세스(Sac -charomyces), 피치아(Pichia) 및 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces)일 수 있다.
도 1은 C. griseus FUT8 cDNA 서열의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:1)을 도시한다.
도 2는 C. griseus Fut8의 아미노산 서열(SEQ ID NO:2)을 도시한다.
도 3은 C. griseus FUT8 게놈 DNA의 엑손 9, 인트론 9, 엑손 10, 및 인트론 10의 부분 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:3)을 도시한다.
도 4의 패널 A와 B는 FUT8 엑손 10 내의 징크핑거 뉴클레아제(ZFN) 결합 및 절단 부위의 위치를 도시하는 개요도이다. 도 4A는 엑손 9-인트론 10 영역의 개요이다. 엑손은 검은색 화살표로 표시되고, 회색 선은 비-코딩 DNA를 보여준다. 도 4B에서는 당전이효소 모티프 II와 ZFN 결합 부위의 상세도를 보여준다. 당전이효소 모티프 II의 위치(밝은 회색 상자)는 Oriol et al. (1999) Glycobiology 9:323-34 (1999)에서 설명된 바와 같이 결정되었다. Fut 모티프 II의 해독은 DNA 서열 위에 도시된다. 상기 유전자의 센스 가닥(sense strand)에 관련하여 ZFN의 인식 서열의 위치는 어두운 회색 상자로서 표시된다. ZFN 12176(표 1)은 15bp 표적 부위를 인식하는 5개 Zn-핑거 단백질이고, ZFN 12170(표 1)은 18bp 표적 부위를 인식하는 6개 Zn-핑거 단백질이다. 도시된 마지막 2개의 뉴클레오티드(GT)는 인트론 10에 대한 5' 스플라이스 공여자 부위(splice donor site)이다.
도 5의 패널 A와 B에서는 내인성 FUT8 좌위에서 ZFN 활성에 대한 Cel-1 미스매치 분석(mismatch assay) 결과를 도시한다. 각 ZFN 쌍의 효능은 모 PCR 산물 아래 절단 산물의 총량에 반영된다. 도 5A는 올리고 GJC 71F: GCTTGGCTTCAAACATCCAG (SEQ ID NO:4)와 GJC 89R: GGACTTGTTCCGTGTGTTCT(SEQ ID NO:5)를 이용하여 PCR 증폭된, 표시된 플라스미드와 FUT8 좌위 일부의 형질감염 후 2일 시점에 수확된 DNA에 대한 Cel-1 분석 결과를 도시한다. 예측된 절단 산물의 크기는 264bp 및 216bp이다. 도 5B는 올리고 GJC 90F: CTGTTGATTCCAGGTTCCCA(SEQ ID NO:6)와 GJC 91R: TGTTACTTAAGCCCCAGGC(SEQ ID NO:7)를 이용하여 PCR 증폭된, 표시된 플라스미드와 FUT8 좌위 일부의 형질감염 후 2일 시점에 수확된 DNA의 결과를 도시한다. 예측된 절단 산물의 크기는 431bp 및 342bp이다. ZFN 조합은 적절한 레인 위에 표시된다; ZFN-특이적 절단 산물은 흰색 화살촉으로 표시된다. 비-상동성 말단 결합에 의해 변형된 염색체의 비율은 각 레인 아래에 기재된다. 분자량 마커 밴드의 크기는 겔의 왼쪽에 표시된다.
도 6의 패널 A와 B는 내인성 FUT8 좌위에서 ZFN 활성을 도시한다. 도 6A에서는 2일 후에 수확된 게놈 DNA로 동시에 형질감염된 2개의 표시된 ZFN 쌍을 이용한, FUT8의 1.3kb의 뉴클레아제-매개 결실의 결과를 도시한다. ZFN 부위 사이에 ~ 1300 bp의 결실은 ~ 559bp 산물을 산출한다. 도 6B에서는 CHO 세포에서 Lens culinaris 응집소(LCA) 농축(enrichment)이 존재할 때, 그리고 이러한 농축이 존재하지 않을 때의 내인성 FUT8 좌위에서 ZFN 활성에 대한 Cel-1 미스매치 분석의 결과를 도시한다. ZFN 쌍은 상부 라인에 도시된다(레인 2 내지 4의 경우에 ZFN 쌍 12170과 12176 (왼쪽에서 오른쪽으로), 그리고 레인 5 내지 7의 경우에 ZFN 쌍 12172와 12176(왼쪽에서 오른쪽으로)). "pVAX"로 지정된 레인(ZFN 없음)은 빈 플라스미드로 형질감염된 대조 세포를 말한다. "2"와 "30"으로 지정된 레인은 감염 후 날짜를 말하고, "LCA"는 LCA 선별 대상 세포를 말한다.
도 7은 사전 ZFN 처리에 의해 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)와 글루타민 합성효소(GS) 유전자가 모두 붕괴된 CHO 세포에서 Lens culinaris 응집소(LCA) 농축이 존재할 때, 그리고 이러한 농축이 존재하지 않을 때의 내인성 FUT8 좌위에서 ZFN 활성에 대한 Cel-1 미스매치 분석의 결과를 도시한다. 이용된 ZFN 풀(1, 3, 5, 7)은 각 레인의 상부에 표시되고, 비-상동성 말단 결합에 의해 변형된 염색체의 비율은 각 레인 하부에 열거된다. "Cont."로 표시된 2개 레인은 세포가 GFP 발현 플라스미드로 감염되거나(좌측 "Cont." 레인), 또는 감염되지 않은(우측 "Cont." 레인) 음성 대조군을 나타낸다.
도 8은 LCA-농축 ZFN-처리된 풀 #1로부터 분리된 삼중 유전자(DHFR/GS/FUT8) 녹아웃 클론(knockout clone)의 확인된 특징을 도시한다.
도 9는 표시된 세포형에 대한 형광 LCA의 결합을 묘사하는 그래프이다. "미염색"은 야생형 Fut8을 함유하지만 형광 LCA에 노출되지 않은 CHO 세포를 말한다. "삼중 KO"는 ZFN을 이용하여 3개의 DHFR, GS 및 FUT8 유전자가 모두 붕괴된 세포를 말한다; "fut8 wt"는 야생형 FUT8을 함유하고 형광 LCA에 노출된 CHO 세포를 말한다.
도 10은 FUT8 저형질(hypomorph) 내의 내인성 FUT8 좌위에서 ZFN 활성에 대한 Cel-1 미스매치 분석의 결과를 도시한다. 클론 번호는 레인 위에 표시되고, 대립형질 붕괴는 각 레인 아래에 표시된다.
도 11은 표시된 세포형에 대한 형광 LCA의 결합을 묘사하는 그래프이다. "야생형 미염색"은 야생형 Fut8을 함유하지만 형광 LCA에 노출되지 않은 CHO 세포를 말한다. "저형질 클론(hypomorphic clone)"은 FUT8이 부분적으로 비활성화된 세포 집단(FUT8 저형질)을 말한다. "CHO-K1"은 야생형 FUT8을 함유하고 형광 LCA에 노출된 CHO 세포를 말한다.
본 발명에서는 FUT8 유전자의 부분적 또는 완전한 비활성화를 위한 조성물과 방법이 개시된다. 또한, 예로써, 표적 세포 내에서 FUT8 유전자를 비활성화시키기 위한, 이들 조성물(시약)의 제조 방법 및 사용 방법이 개시된다. 표적 세포 내에서 Fut8의 비활성화는 재조합 단백질, 특히 향상된 ADCC를 유도하는 단클론 항체의 발현을 위한 세포주를 생산하는데 이용될 수 있다.
포유동물 세포에서, Fut8은 항체의 Fc 영역 상에 존재하는 올리고당에 코어 푸코오스를 부착시키며, 이것은 항체-의존성 세포독성의 이펙터(effector) 기능에 매우 중요한 것으로 널리 인식되고 있다. 인간 Fut8 구조의 3차원 분석에서, 3개의 α2/α6 당전이효소 모티프는 상기 효소의 촉매 코어를 형성하는 것으로 밝혀졌다. Ihara et al. (2007) Glycobiology 17:455-66을 참조한다. 상기 영역에서, 많은 단일 잔기의 알라닌으로의 점 돌연변이(point mutation)는 상기 효소의 완전한 비활성화를 가져온다. Ihara et al. (2007) Glycobiology 17:455-66; Takahashi et al. (2000) Glycobiology 10:503-10을 참조한다. 앞서 언급된 바와 같이, FUT8 발현이 감소되거나 소멸된 세포(가령, 녹아웃 세포주, 또는 siRNA에 의해서)는 더욱 큰 이펙터 기능을 갖는 비-푸코실화된 항체를 생산한다. 예로써, Kanada et al. (2007) Biotechnol. 130(3):300-310; Kanada et al.(2007) Glycobiology 18:104-118; Mori et al. (2004) Biotechnol . Bioeng. 88:901-908을 참조한다.
따라서, 본원에 설명된 방법 및 조성물은 비-푸코실화된 단백질, 예를 들면, 항체를 생산하기 위한 세포주의 산출을 가능하게 하는, FUT8의 표적화된 유전자 놋아웃(부분적인 또는 완전한)을 위한 매우 효과적인 방법을 제공한다.
전반적인 내용
방법의 실시, 그리고 본 발명에 개시된 조성물의 제조와 이용에는 달리 지시되지 않는 경우에, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 당 분야의 통상적인 기술에 속하는 관련 분야의 종래 기술들이 활용된다. 이들 기술은 기존 문헌에 상세하게 설명된다. 예로써, Sambrook et al . MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al ., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 정례 업데이트; 연속 간행물 METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin"(P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols"(P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999를 참조한다.
정의
"핵산", "폴리뉴클레오티드", 및 "올리고뉴클레오티드"는 동의어로서 사용되고, 선형 또는 환형 형태의, 그리고 단일- 또는 이중-가닥 형태의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 명세서에서, 이들 용어는 중합체의 길이에 관한 제한으로서 간주되지 않는다. 이들 용어는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체, 그리고 염기, 당 및/또는 인산염 부분(가령, 포스포로티오에이트 골격)이 변형된 뉴클레오티드를 포괄할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기쌍 특이성을 가진다; 다시 말하면, A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은 동의어로서 사용되고, 아미노산 잔기의 중합체를 지칭한다. 상기 용어는 하나 이상의 아미노산이 상응하는 자연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.
"결합"은 거대분자 사이의(가령, 단백질과 핵산 사이의) 서열-특이적 비-공유 상호작용을 지칭한다. 이러한 상호작용이 전체로서 서열-특이적이면, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다(가령, DNA 골격의 인산염 잔기와의 접촉). 일반적으로, 이런 상호작용은 10-6 M-1 또는 그 이하의 해리 상수로서 특정된다. "친화성"(affinity)은 결합 강도를 말하며, 증가된 결합 친화성은 더 낮은 Kd와 상관된다.
"결합 단백질"은 또 다른 분자와 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예로써 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 그것은 자신과 결합할 수 있고(동종이합체, 동종삼합체 등을 형성) 및/또는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자와 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 가지 이상의 유형의 결합 활성을 보유할 수 있다. 가령, 징크핑거 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성을 보유한다.
"징크핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은 아연 이온의 배위를 통하여 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역인, 하나 이상의 징크핑거를 통하여 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 단백질, 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이다. 용어 징크핑거 DNA 결합 단백질은 종종, 징크핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
징크핑거 결합 도메인은 미리 정한 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "조작"될 수 있다. 징크핑거 단백질을 조작하는 방법의 비-제한적인 예는 설계 및 선별이다. 설계된 징크핑거 단백질은 논리적 기준으로부터 원칙적으로 디자인/조성이 정해지는 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 논리적 기준에는 치환 규칙 및 기존의 ZFP 설계와 결합 데이터의 정보가 저장된 데이터베이스의 정보를 처리하기 위한 전산화 알고리즘의 적용이 포함된다. 가령, U.S. 특허 No. 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261; 및 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496을 참조한다.
"선별된" 징크핑거 단백질은 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선별과 같은 경험적 과정의 결과로서 주로 생산되는 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예로써, US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013,453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970 WO 01/88197 및 WO 02/099084를 참조한다.
용어 "서열"은 임의의 길이의 뉴클레오티드 서열을 지칭하며, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 환형 또는 분지형일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 용어 "공여자 서열(donor sequecne)"은 게놈 내로 삽입되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 공여자 서열은 임의의 길이, 예를 들면, 2개 내지 10,000개 뉴클레오티드 길이(또는 그 사이의 또는 이것을 초과하는 임의의 정수 값), 바람직하게는, 대략 100개 내지 1,000개 뉴클레오티드(또는 그 사이의 임의의 정수), 더욱 바람직하게는, 대략 200개 내지 500개 뉴클레오티드 길이를 가질 수 있다.
"상동성, 비-동일 서열"은 제2 서열과 어떤 정도의 서열 동일성을 공유하지만, 그 서열이 제2 서열과 동일하지는 않은 제1 서열을 지칭한다. 가령, 돌연변이 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 상기 돌연변이 유전자의 서열과 상동성이지만 동일하지는 않다. 특정 구체예에서, 2개 서열 간의 상동성 정도는 정상적인 세포 메커니즘을 이용하여, 이들 사이에 상동성 재조합이 일어나도록 하는데 충분하다. 2개의 상동성 비-동일 서열은 임의의 길이일 수 있고, 이들의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 작거나(가령, 표적화된 상동성 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이를 보정하는 경우에), 또는 10 킬로베이스 이상만큼 클 수 있다(가령, 염색체 내의 미리 정한 이소 부위(ectopic site)에 유전자를 삽입하는 경우에). 상동성 비-동일 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드는 길이가 동일할 필요는 없다. 가령, 20개 내지 10,000개 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 외인성 폴리뉴클레오티드(즉, 공여자 폴리뉴클레오티드)가 이용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 이들 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하고 및/또는 이에 의해 인코딩되는 아미노산 서열을 결정하고, 그리고 이들 서열을 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열 역시 이러한 방식으로 결정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 대응을 말한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)은 그들의 동일성 %를 결정함으로써 비교할 수 있다. 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 2개 서열의 동일성 %는 2개의 정렬된 서열 간의 정확한 매치(match)의 수를 더욱 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열에 대한 근사적 정렬은 Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981)의 국소 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure. M.O. Dayhoff ed, 5suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington D.C. USA에 의해 개발되고 Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 표준화된 채점 매트릭스(scoring matrix)를 이용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 동일성 %를 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적 수행은 "BestFit" 유틸리티 적용시 Genetics Computer Group(Madison, WI)에 의해 제공된다. 서열 간의 동일성 또는 유사성 %를 계산하는데 적합한 다른 프로그램도 당 분야에 일반적으로 공지되어 있는데, 예시적인 다른 정렬 프로그램은 파라미터가 디폴트로 설정된 BLAST이다. 가령, 하기의 디폴트 파라미터를 이용한 BLASTN 및 BLASTP가 이용될 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개 서열; 분류 방식 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램에 관한 상세한 사항은 GenBank 웹사이트에서 확인할 수 있다. 본원에서 설명된 서열과 관련하여, 원하는 서열 동일성 정도의 범위는 대략 80% 내지 100% 및 그 사이에 임의의 정수 값이다. 전형적으로, 서열 간의 동일성 %는 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더욱 바람직하게는 85-90%, 이보다 더욱 바람직하게는 92%, 훨씬 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%이다.
대안으로, 폴리뉴클레오티드 간의 서열 유사성 정도는 상동성 영역 간 안정한 이중나선(duplex)의 형성을 가능하게 하는 조건하에서 폴리뉴클레오티드를 혼성화(hybridization)한 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 효소절단하고, 효소절단된 단편의 크기를 측정함으로써 결정할 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩티드 서열은 이들 서열이 상기 방법을 이용한 결정에서 적어도 대략 70%-75%, 바람직하게는 80%-82%, 더욱 바람직하게는 85%-90%, 이보다 더욱 바람직하게는 92%, 훨씬 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98%의 서열 동일성을 나타내는 경우에, 서로에 대하여 실질적으로 상동성이다. 본 명세서에서, 실질적으로 상동성은 또한 명시된 DNA 또는 폴리펩티드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은 예로써, 특정 시스템에 대해 정의되는 바와 같은 긴축 조건하에서의 서던 혼성화 실험으로 확인될 수 있다. 적합한 혼성화 조건을 규정하는 것은 당 분야의 통상적인 기술에 속한다. 예로써, Sambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press를 참조한다.
2개의 핵산 단편의 선택적인 혼성화는 하기와 같이 결정할 수 있다. 2개의 핵산 분자 간의 서열 동일성 정도는 이들 분자 간의 혼성화 현상의 효율 및 강도에 영향을 준다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자와 완전히 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로 저해할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화의 저해는 당 분야에 널리 공지된 혼성화 분석법(가령, 서던(DNA) 블롯, 노던(RNA) 블롯, 용액 혼성화 등; Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y. 참조)을 사용하여 평가할 수 있다. 다양한 정도의 선택성을 이용하여, 예를 들면, 저 긴축도(stringency)에서 고 긴축도까지 다양한 조건을 이용하여, 이런 분석을 수행할 수 있다. 저 긴축도의 조건이 사용되는 경우에, 비-특이적 결합의 부재는, 부분적인 정도의 서열 동일성조차도 결여하는 2차 프로브(가령, 표적 서열에 대략 30% 미만의 서열 동일성을 갖는 프로브)를 이용하여 평가할 수 있으며, 이로써 비-특이적 결합 현상이 없다면 2차 프로브는 표적과 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화-기반 검출 시스템을 이용하는 경우에, 기준 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브를 선택하고, 이후 적합한 조건을 선택하여 상기 프로브와 상기 기준 서열을 서로 선택적으로 혼성화하거나 결합시켜 이중나선 분자를 형성한다. 중간 정도의 긴축 혼성화 조건에서 기준 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 전형적으로, 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성을 갖는 적어도 약 10-14개 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용하는 조건에서 혼성화한다. 전형적으로, 긴축 혼성화 조건은 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90-95% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 약 10-14개 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브 및 기준 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 당 분야에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다(가령, Nucleic Acid Hybridization : A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press 참조).
혼성화 조건은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 혼성화 긴축도는, 혼성화 조건이 미스매치(mismatch) 뉴클레오티드를 함유하는 하이브리드의 형성을 꺼려하는 정도를 말하며, 긴축도가 높을수록 미스매치 하이브리드에 대한 관용도(tolerance)가 낮다. 혼성화 긴축도에 영향을 미치는 요인들은 당업자에게 널리 공지되어 있는데, 여기에는 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매, 예를 들면, 포름아미드 및 디메틸술폭시드의 농도가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 당업자에게 공지된 바와 같이, 혼성화 긴축도는 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록 그리고 용매 농도가 낮을수록 증가된다.
혼성화를 위한 긴축도 조건과 관련하여, 예로써 다음 요인들: 서열의 길이와 성질, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 다른 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 중 차단제의 존재 또는 부재(가령, 덱스트란 술페이트 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 파라미터를 변화시킴으로써, 그리고 세척 조건을 변화시킴으로써, 다수의 균등한 조건을 이용하여 특정 긴축도를 확립할 수 있다는 것이 당 분야에 공지되어 있다. 특정 세트의 혼성화 조건의 선택은 당 분야의 표준 방법을 따라 선택된다(가령, Sambrook, et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).
"재조합"(recombination)은 2개 폴리뉴클레오티드 간의 유전자 정보의 교환 과정을 지칭한다. 본 명세서에서, "상동성 재조합(HR)"은 예로써, 세포 내에서 이중 가닥 파괴의 복구 동안 일어나는, 이런 교환의 특수한 형태를 지칭한다. 이러한 과정은 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자(즉, 이중 가닥 파괴를 경험한 분자)의 주형 복구에 "공여자" 분자를 이용하며, "비-교차 유전자 전환" (non-crossover gene conversion) 또는 "쇼트 트랙 유전자 전환"(short tract gene conversion)"으로서 다양하게 알려져 있는데, 그 이유는 이러한 과정이 공여자로부터 표적으로 유전자 정보의 전달을 야기하기 때문이다. 특정 이론에 한정됨 없이, 이런 전달은 파괴된 표적과 공여자 사이에 형성되는 이종이중나선(heteroduplex) DNA의 미스매치 보정, 및/또는 공여자를 이용하여 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는 "합성-의존성 가닥 어닐링"(synthesis-dependent strand annealing) 및/또는 관련된 프로세스를 수반할 수 있다. 이런 특수화된 HR은 종종, 표적 분자 서열의 변형을 유발함으로써 공여자 폴리뉴클레오티드 서열의 일부 또는 전체가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 통합(incorporation)되게 된다.
"절단"은 DNA 분자의 공유 골격의 파괴를 지칭한다. 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 국한되지는 않는 다양한 방법에 의해 절단이 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단이 모두 가능하고, 이중 가닥 절단은 2가지 별개의 단일 가닥 절단 현상의 결과로써 발생할 수 있다. DNA 절단의 결과, 블런트(blunt) 말단 또는 엇갈린(staggered) 말단이 생성될 수 있다. 특정 구체예에서, 융합 폴리펩티드가 표적화된 이중 가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 절반-도메인"은 제2 폴리펩티드(동일하거나 상이함)와 절단 활성(바람직하게 이중 가닥 절단 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 절단 절반-도메인", "+ 및 - 절단 절반-도메인" 및 "오른쪽 및 왼쪽 절단 절반-도메인"은 동의어로서 사용되고, 이합체가 되는 절단 절반-도메인 쌍을 지칭한다.
"조작된 절단 절반-도메인"은 다른 절단 절반-도메인(가령, 다른 조작된 절단 절반-도메인)과 필수적으로 이종이합체를 형성하도록 변형된 절단 절반-도메인이다. 미국 특허공보 No. 2005/0064474; 2007/0218528과 2008/0131962를 참조하는데, 이들은 본원에 순전히 참조로서 편입된다.
"염색질"(chromatin)은 세포 게놈을 구성하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA와 히스톤(histone)과 비-히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대다수의 진핵 세포 염색질은 뉴클레오솜(nucleosome)의 형태로 존재하며, 여기서 뉴클레오솜 코어는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 8량체와 결합된 대략 150개 염기쌍의 DNA를 포함하고, 링커 DNA(생물체에 따라 가변적 길이)가 뉴클레오솜 코어 사이에서 연장된다. 일반적으로, 히스톤 H1의 분자가 링커 DNA에 결합된다. 본 명세서에서, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포 핵단백질(원핵생물과 진핵생물 모두)을 포함하도록 의도된다. 세포 염색질은 염색체 염색질과 에피솜 염색질을 모두 포함한다.
"염색체"(chromosome)는 세포 게놈의 전체 또는 일부를 구성하는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 종종, 세포의 게놈을 구성하는 모든 염색체의 집합인 핵형(karyotype)에 의해서 특정된다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"(episome)은 세포의 염색체 핵형의 일부분이 아닌 핵산을 포함하는 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 다른 구조물이다. 에피솜의 예에는 플라스미드 및 어떤 바이러스 게놈이 포함된다.
"접근가능 영역"(accessible region)은 핵산 내에 존재하는 표적 부위에 상기 표적 부위를 인식하는 외인성 분자가 결합할 수 있는, 세포 염색질 내의 부위이다. 특정 이론에 한정됨 없이, 접근가능 영역은 뉴클레오솜 구조 내에 넣어지지 않은 영역인 것으로 간주된다. 접근가능 영역의 독특한 구조는 종종, 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들면, 뉴클레아제에 대한 감수성에 의해 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재하는 조건에서 결합 분자가 결합하게 되는 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다. 가령, 서열 5'-GAATTC-3'은 EcoRI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.
"외인성" 분자는 정상적으로는 세포에 존재하지 않지만 한 가지 이상의 유전학적, 생화학적 또는 다른 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내의 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예로써, 근육의 배아 발생(embryonic development) 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예로써, 기능부전 내인성 분자의 기능화 버전 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능부전 버전을 포함할 수 있다.
특히, 외인성 분자는 소 분자, 예를 들면, 조합 화학 과정에 의해 생성된 소 분자, 또는 거대 분자, 예를 들면, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 임의의 변형된 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있고, 선형, 분지형 또는 환형일 수 있으며, 임의의 길이를 가질 수 있다. 핵산에는 이중나선을 형성할 수 있는 것뿐만 아니라 삼중나선-형성 핵산도 포함된다. 가령, 미국특허 No. 5,176,996 및 5,422,251을 참조한다. 단백질에는 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 중합효소(polymerase), 메틸라아제(methylase), 데메틸라아제(demethylase), 아세틸라아제(acetylase), 키나아제(kinase), 데아세틸라아제(deacetylase), 토포이소머라아제(topoisomerase), 자이라아제(gyrase), 인테그라아제(integrase), 리컴비나아제(recombinase), 헬리카아제(helicase), 리가아제(ligase) 및 포스파타아제(phosphatase)가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 또한, 외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형일 수 있지만 그 세포가 유래된 종과는 상이한 종으로부터 유래될 수 있다. 가령, 서열화된 인간 핵산이 마우스 또는 햄스터로부터 최초 유래된 세포주 내로 도입될 수 있다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들면, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 가령, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 정상적으로는 세포 내에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있는데, 여기에는 지질-매개 전달(lipid-mediated transfer)(즉, 중성 및 양이온성 지질을 비롯한 리포좀), 전기천공(electroporation), 직접적인 주입(direct injection), 세포 융합(cell fusion), 입자 폭발(particle bombardment), 인산칼슘 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), DEAE-덱스트란-매개 전달(DEAE-dextran-mediated transfer), 및 바이러스 벡터-매개 전달(viral vector-mediated transfer)이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에 특정 발달 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 가령, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 다른 세포소기관의 게놈, 또는 자연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자에는 단백질, 예를 들면, 전사 인자와 효소가 포함될 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 아단위(subunit) 분자가 연결된, 바람직하게는 공유 연결된 분자이다. 이들 아단위 분자는 동일한 화학 유형의 분자이거나, 또는 상이한 화학 유형의 분자일 수 있다. 첫 번째 유형의 융합 분자의 실례에는 융합 단백질(가령, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합체) 및 융합 핵산(가령, 앞서 기술된 융합 단백질을 인코딩하는 핵산)이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 두 번째 유형의 융합 분자의 실례에는 삼중나선-형성 핵산과 폴리펩티드 간의 융합체, 및 좁은 그루브(minor groove) 결합제와 핵산 간의 융합체가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
세포 내에서 융합 단백질의 발현은 이러한 융합 단백질을 세포에 송달함으로써, 또는 이러한 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 송달함으로써 유도될 수 있는데, 세포 내에서 상기 폴리뉴클레오티드가 전사되고 전사체가 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-절단접합(trans-splicing), 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 결찰(ligation) 역시 세포 내에서 단백질의 발현에 관련될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포에 송달하는 방법은 본 명세서의 다른 곳에서 제시된다.
본 명세서에서, "유전자"는 유전자 산물(하기 참조)을 인코딩하는 DNA 영역뿐만 아니라, 이러한 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역(이런 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 인접하는지 여부에 상관없이)을 포함한다. 따라서, 유전자에는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열, 예를 들면, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 도입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 좌위 통제 영역이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
"유전자 발현"은 유전자에 내포된 정보의 유전자 산물로의 전환을 지칭한다. 유전자 산물은 유전자의 직접적인 전사 산물(가령, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 (antisense) RNA, shRNA, 마이크로 RNA(miRNA) 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 다른 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 산물에는 캡핑(capping), 폴리아데닐화(polyadenylation), 메틸화 및 편집(editing)과 같은 과정에 의해 변형된 RNA, 그리고 예로써, 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화(ADP-ribosylation), 미리스틸화 및 당화에 의해 변형된 단백질 역시 포함된다.
유전자 발현의 "조정"(modulation)은 유전자 활성의 변화를 지칭한다. 발현 조정에는 유전자 활성화 및 유전자 억제가 포함될 수 있지만 이들에 국한되지는 않는다. 유전자 비활성화는 본 발명에서 개시된 바와 같은 ZFP를 포함하지 않는 세포에 비하여 유전자 발현에서의 임의의 감소를 지칭한다. 따라서, 유전자 비활성화는 완전(녹아웃)하거나 또는 부분적일 수 있다(가령, 유전자가 정상보다 낮은 발현 수준을 보이는 저형질, 또는 영향을 받는 활성이 부분적으로 감소하는 돌연변이 유전자의 산물).
"진핵" 세포에는 진균류 세포(가령, 효모), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 인간 세포(가령, T-세포)가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다.
"목적하는 영역"은 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 세포 염색질의 임의의 영역, 예를 들면, 유전자 또는 유전자 내부에 또는 유전자에 인접한 비-코딩 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화 재조합을 목적으로 할 수 있다. 가령, 목적하는 영역은 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈(가령, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈 내에 존재할 수 있다. 목적하는 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비-코딩 영역, 예를 들면, 리더(leader) 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 비-전사 영역 내에 존재할 수 있다. 목적하는 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍만큼 작거나, 또는 최대 2,000개 뉴클레오티드 쌍 길이이거나 또는 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
용어 "작동가능한 연결" 및 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 성분(가령, 서열 요소)의 병렬(juxtaposition)과 관련하여 동의어로서 사용되고, 여기서 이들 성분은 양쪽 성분이 정상적으로 기능하고, 이들 성분 중에서 적어도 하나가 적어도 하나의 다른 성분에 의해 발휘되는 기능을 매개할 수 있도록 정렬된다. 예시로써, 전사 조절 서열, 예를 들면, 프로모터는 이러한 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 통제한다면, 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 전사 조절 서열은 코딩 서열과 시스(cis) 형태로 작동가능하게 연결되지만, 상기 서열에 직접적으로 인접할 필요는 없다. 가령, 인핸서와 코딩 서열은 연속하지 않는 경우에도, 인핸서는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 다른 성분에 연결된 상태에서 이렇게 연결되지 않았을 때와 동일한 기능을 각 성분이 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 가령, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드와 관련하여, 융합 폴리펩티드 내에서 ZFP DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있으면서 절단 도메인이 표적 부위의 인근에서 DNA를 절단할 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동가능하게 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능성 단편"(functional fragment)은 서열이 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능성 단편은 상응하는 자연 분자보다 많거나, 적거나 또는 동일한 숫자의 잔기를 보유할 수 있고 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 내포할 수 있다. 핵산의 기능(가령, 코딩 기능, 다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 유사하게, 단백질의 기능을 결정하는 방법은 공지되어 있다. 가령, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은 예로써, 필터-결합, 전기영동 이동도-변화, 또는 면역침전 분석법에 의해 결정할 수 있다. DNA 절단은 젤 전기영동으로 분석할 수 있다. Ausubel et al., supra를 참조한다. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은 예로써, 공동-면역침전, 2-하이브리드 분석법 또는 상보성(유전학적 및 생화학적)으로 결정할 수 있다. 예로써, Fields et al.(1989) Nature 340:245-246; U.S. 특허 No. 5,585,245와 PCT WO 98/44350을 참조한다.
본 명세서에서, "항체"는 다클론과 단클론 제조물로부터 획득된 항체뿐만 아니라 하이브리드(키메라) 항체 분자(예로써, Winter et al., Nature (1991) 349: 293-299; U.S. Pat. No. 4,816,567 참조); F(ab′)2와 F(ab) 단편; Fv 분자(비-공유 이종이합체; 예로써, Inbar et al., Proc Natl Acad Sci, USA (1972) 69:2659-2662; Ehrlich et al., Biochem (1980) 19:4091-4096 참조); 단일-사슬 Fv 분자 (sFv)(예로써, Huston et al., Proc Natl Acad Sci, USA (1988) 85:5879-5883 참조); 이합체와 삼합체 항체 단편 구조체; 미니바디(minibody)(예로써, Pack et al, Biochem (1992) 31:1579-1584; Cumber et al., J Immunology (1992) 149B: 120-126 참조); 인간화 항체 분자(예로써, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534-1536; 1994년 9월 21일 공개된 U.K. 특허공보 No. GB 2,276,169 참조); 그리고 이들 분자로부터 획득된 임의의 기능성 단편을 포함하며, 여기서 이들 단편은 모 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 유지한다.
본 명세서에서, "단클론 항체"(monoclonal antibody)는 상동한 항체 집단을 보유하는 항체 조성물을 지칭한다. 상기 용어는 항체의 종 또는 공급원과 관련하여 국한되지 않고, 항체가 만들어지는 방법에 의해 국한되지 않는다. 상기 용어는 전체 면역글로불린뿐만 아니라 단편, 예를 들면, Fab, F(ab′)2, Fv와 다른 단편, 그리고 부모 단클론 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 키메라와 인간화 상동성 항체 집단을 포괄한다.
징크핑거 뉴클레아제
본 발명에서는 FUT8 유전자의 비활성화에 이용될 수 있는 징크핑거 뉴클레아제(ZFN)가 개시된다. ZFN은 징크핑거 단백질(ZFP)과 뉴클레아제(절단) 도메인을 포함한다.
A. 징크핑거 단백질
징크핑거 결합 도메인은 선택되는 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예로써, Beerli et al . (2002) Nature Biotechnol . 20:135-141; Pabo et al . (2001) Ann. Rev . Biochem . 70:313-340; Isalan et al . (2001) Nature Biotechnol . 19: 656-660; Segal et al . (2001) Curr . Opin . Biotechnol . 12:632-637; Choo et al . (2000) Curr . Opin . Struct . Biol . 10:411-416을 참조한다. 조작된 징크핑거 결합 도메인은 자연-발생 징크핑거 단백질에 비하여 새로운 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법에는 합리적 설계와 다양한 유형의 선별이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 합리적 설계는 예로써, 삼중(또는 사중) 뉴클레오티드 서열과 개별적인 징크핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 이용하는 것을 포함하는데, 여기서 각 삼중 또는 사중 뉴클레오티드 서열은 특정의 삼중 또는 사중 서열에 결합하는 징크핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 연관된다. 예로써, U.S. 특허 No. 6,453,242 및 6,534,261을 참조하며, 이들의 내용은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다.
파지 디스플레이(phage display) 및 2-하이브리드 시스템을 비롯한 전형적인 선별 방법은 U.S. 특허 No. 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410, 248; 6,140,466; 6,200,759 및 6,242,568; 그리고 WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237에 기술된다. 이에 더하여, 징크핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 강화는 예로써, WO　02/077227에 기술된다.
표적 부위의 선별; ZFP 및 융합 단백질(그리고 이들을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 설계와 구축을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있고 U.S. 특허출원 공보 No. 20050064474 및 20060188987에 상세하게 기술되며, 이들 특허 출원의 내용은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다.
이에 더하여, 이들 참고문헌에서 기술된 바와 같이, 징크핑거 도메인 및/또는 멀티-핑거 징크핑거 단백질은 예로써, 5개 이상의 아미노산 길이를 갖는 링커(가령, TGEKP(SEQ ID NO:36), TGGQRP(SEQ ID NO:37), TGQKP(SEQ ID NO:38) 및/또는 TGSQKP(SEQ ID NO:39))를 비롯한 임의의 적절한 링커 서열을 이용하여 서로 연결될 수 있다. 6개 이상의 아미노산 길이를 갖는 전형적인 링커 서열은 U.S. 특허 No. 6,479,626; 6,903,185 및 7,153,949를 참조한다. 본 발명에 개시된 단백질은 단백질의 개별 징크핑거 사이에 적절한 링커의 임의의 조합을 포함할 수도 있다. 추가적인 링커 구조의 실례는 2008년 5월 28일 제출된 U.S. 가 출원 No. 61/130,099(발명의 명칭: "DNA-결합 도메인과 절단 도메인을 연결하기 위한 조성물"에서 확인된다.
표 1에서는 FUT8 유전자 내에 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 조작된 다수의 징크핑거 결합 도메인을 기술한다. 또한, 도 1과 도 3을 참조한다. 각 열은 독립된 징크핑거 DNA-결합 도메인을 기술한다. 각 도메인에 대한 DNA 표적 서열은 첫 번째 칼럼에 제시되고, 두 번째 칼럼 내지 다섯 번째 칼럼에는 단백질에서 각 징크핑거(F1 내지 F4, F5 또는 F6)의 인식 영역의 아미노산 서열(나선 출발 지점과 관련하여 아미노산 -1 내지 +6)을 제시한다. 또한, 첫 번째 칼럼에 이들 단백질에 대한 식별 번호(identification number)가 제시된다.
Figure 112010008547661-pct00001
하기에 기술된 바와 같이, 특정 구체예에서, 표 1에 제시된 바와 같은 4개-, 5개-, 또는 6개-핑거 결합 도메인은 절단 절반-도메인, 예를 들면, FokI와 같은 II형 제한 엔도뉴클레아제의 절단 도메인에 융합된다. 이런 징크핑거/뉴클레아제 절반-도메인 융합체의 하나 이상의 쌍은 예로써, U.S. 특허공보 No. 20050064474 및 20070218528에 기술된 바와 같이, 표적화된 절단에 이용된다.
표적화된 절단을 위하여, 결합 부위의 인접 가장자리는 5개 이상의 뉴클레오티드 쌍에 의해 분리될 수 있고, 각 융합 단백질은 DNA 표적의 마주보는 가닥에 결합할 수 있다. 표 1에 제시된 단백질의 모든 쌍별 조합(pairwise combination)(가령, ZFN 12029와 ZFN 12030 그리고 ZFN 12170과 ZFN 12172 또는 ZFN 12176)이 FUT8 유전자의 표적화된 절단에 이용될 수 있다. 본 발명에 따라서, ZFN은 FUT8 유전자 내에 임의의 서열에 표적화될 수 있다.
B. 절단 도메인
ZFN은 또한 뉴클레아제(절단 도메인, 절단 절반-도메인)를 포함한다. 본 발명에 개시된 융합 단백질의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적 엔도뉴클레아제에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성(homing) 엔도뉴클레아제가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 예로써, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; Belfort et al ., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388을 참조한다. DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지되어 있다(가령, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNaseI; 마이크로코커스 뉴클레아제(micrococcal nuclease); 효모 HO 엔도뉴클레아제; Linn et al .(eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993을 또한 참조). 이들 효소(또는 이들의 기능성 단편) 중에서 하나 이상이 절단 도메인과 절단 절반-도메인의 공급원으로서 이용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은 절단 활성을 위해 이합체화를 필요로 하는, 앞서 열거된 바와 같은 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부분으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함하면, 절단을 위하여 2개의 융합 단백질이 필요하다. 대안으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 이용될 수 있다. 이들 2개의 절단 절반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)로부터 유래되거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 기능성 단편)로부터 유래될 수 있다. 이에 더하여, 2개의 융합 단백질이 그들의 개별 표적 부위에 결합하면 절단 절반-도메인이 예로써, 이합체화에 의해 기능성 절단 도메인을 형성할 수 있도록 하는 서로에 대한 공간적 배향(spatial orientation)으로 이들 절단 절반-도메인이 배치되도록, 이들 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 서로 관련되게 배치되는 것이 바람직하다. 따라서, 특정 구체예에서, 표적 부위의 인접 가장자리는 5-8개 뉴클레오티드 또는 15-18개 뉴클레오티드에 의해서 분리된다. 하지만, 임의의 정수 값의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍(가령, 2개 내지 50개의 뉴클레오티드 또는 그 이상)이 2개의 표적 부위 사이에 개재될 수 있다. 일반적으로, 절단 부위는 표적 부위 사이에 존재한다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에 존재하고, DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있고(인식 부위에서), 결합 부위에서 또는 결합 부위 인근에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(가령, IIS형)는 인식 부위로부터 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합과 절단 도메인을 보유한다. 가령, IIS형 효소 FokI은 한쪽 가닥 상에서 인식 부위로부터 9개 뉴클레오티드, 그리고 다른 가닥 상에서 인식 부위로부터 13개 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉진한다. 예로써, U.S. 특허 No. 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 그리고 Li et al, (1992) Proc . Natl . Acad . Sci. USA 89:4275-4279; Li et al., (1993) Proc . Natl . Acad. Sci . USA 90:2764-2768]; Kim et al ., (1994a) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91:883-887; Kim et al., (1994b) J. Biol . Chem. 269:31,978-31,982를 참조한다. 따라서, 한 구체예에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 IIS형 제한 효소로부터의 절단 도메인(또는 절단 절반-도메인)과 조작되거나 조작되지 않은 하나 이상의 징크핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이합체로서 활성을 나타낸다. Bitinaite et al., (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95:10,570-10,575를 참조한다. 따라서, 본 발명에서, 개시된 융합 단백질에서 이용된 FokI 효소의 일부분은 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 징크핑거-FokI 융합체를 이용한 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 세포 서열의 표적화된 교체를 위하여, 각각 FokI 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적 활성 절단 도메인을 재구성하는데 이용될 수 있다. 대안으로, 징크핑거 결합 도메인과 2개의 FokI 절단 절반-도메인을 내포하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 이용될 수 있다. 징크핑거-FokI 융합체를 이용한 표적화된 절단과 표적화된 서열 변경을 위한 파라미터는 본 명세서의 다른 곳에서 제공된다.
절단 도메인 또는 절단 절반-도메인은 절단 활성을 유지하거나, 또는 기능성 절단 도메인을 형성하기 위해 다합체화(가령, 이합체화)되는 능력을 유지하는 단백질의 임의의 일부분일 수 있다.
예시적인 IIS형 제한 효소는 본 발명에서 순전히 참조로서 편입되는 국제공보 WO 07/014275에 기술된다. 추가적인 제한 효소 역시 분리가능한 결합과 절단 도메인을 내포하며, 이들은 본 발명에서 고려된다. 예로써, Roberts et al., (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420을 참조한다.
특정 구체예에서, 절단 도메인에는 예로써, U.S. 특허공보 No. 20050064474; 20060188987 및 20080131962에서 기술된 바와 같이, 동종이합화(homodimerization)를 최소화시키거나 예방하는 하나 이상의 조작된 절단 절반-도메인(이합체화 도메인 돌연변이체(dimerization domain mutant)로 지칭)이 포함되는데, 상기 특허 출원의 내용은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다. FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537 및 538에서 아미노산 잔기는 FokI 절단 절반-도메인의 이합체화에 영향을 주기 위한 표적이다.
필수적 이종이합체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 절단 절반-도메인은 첫 번째 절단 절반-도메인이 FokI의 위치 490과 538에서 아미노산 잔기에 돌연변이를 포함하고, 두 번째 절단 절반-도메인이 아미노산 잔기 486과 499에서 돌연변이를 포함하는 하나의 쌍을 포함한다.
따라서, 한 구체예에서, 위치 490에서 돌연변이는 Glu(E)를 Lys(K)로 치환한다; 위치 538에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환한다; 위치 486에서 돌연변이는 Gln(Q)을 Glu(E)로 치환한다; 위치 499에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환한다. 구체적으로, 본 발명에 개시된 조작된 절단 절반-도메인은 한쪽 절단 절반-도메인에서 위치 490(E→K) 및 538(I→K)을 돌연변이시켜 "E490K:I538K"로 명명된 조작된 절단 절반-도메인을 산출하고, 다른 절단 절반-도메인에서 위치 486(Q→E) 및 499(I→L)를 돌연변이시켜 "Q486E:I499L"로 명명된 조작된 절단 절반-도메인을 산출함으로써 제조하였다. 본 발명에 개시된 이들 조작된 절단 절반-도메인은 이들 절단 절반-도메인을 내포하는 뉴클레아제의 하나 이상의 쌍이 절단에 이용될 때 비정상적 절단이 최소화되거나 소멸되는 필수적 이종이합체 돌연변이체이다. 예로써, U.S. 특허공보 No. 20080131962를 참조하는데, 상기 특허 출원의 내용은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명에 개시된 조작된 절단 절반-도메인은 임의의 적절한 방법을 이용하여, 예를 들면, U.S. 특허공보 No. 20050064474(실시예 5) 및 20070134796(실시예 38)에 기술된 바와 같이 야생형 절단 절반-도메인(Fok I)의 특정부위 돌연변이유발에 의해 제조될 수 있다.
C. FUT8 내에서 표적화된 절단을 위한 추가적인 방법
FUT8 유전자 내에 표적 부위를 보유하는 임의의 뉴클레아제가 본 발명에 개시된 방법에 이용될 수 있다. 가령, 귀소성 엔도뉴클레아제와 메가뉴클레아제는 매우 긴 인식 서열을 보유하는데, 이들 중에서 일부는 통계에 기초하면 인간-크기 게놈 내에 1회 존재하는 것으로 보인다. FUT8 유전자 내에 독특한 표적 부위를 보유하는 임의의 이와 같은 뉴클레아제는 FUT8 유전자 내에서 표적화된 절단을 위하여 징크핑거 뉴클레아제 대신에, 또는 징크핑거 뉴클레아제에 추가하여 이용될 수 있다.
예시적인 귀소성 엔도뉴클레아제에는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII이 포함된다. 이들의 인식 서열은 공지이다. U.S. 특허 No. 5,420,032; U.S. 특허 No. 6,833,252; Belfort et al ., (1997) Nucleic Acids Res . 25:3379-3388; Dujon et al . (1989) Gene 82:115-118; Perler et al . (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-1127; Jasin (1996) Trends Genet . 12:224-228; Gimble et al., (1996) J. Mol . Biol . 263:163-180; Argast et al , (1998) J. Mol . Biol . 280:345-353 및 New England Biolabs 카탈로그를 참조한다.
비록 대부분의 귀소성 엔도뉴클레아제의 절단 특이성이 그들의 인식 부위에 관련하여 절대적이진 않지만, 이들 부위는 포유동물-크기 게놈에 대해 단일 절단 현상이 인식 부위의 단일 사본을 내포하는 세포에서 귀소성 엔도뉴클레아제를 발현함으로써 달성될 수 있을 만큼 충분한 길이를 갖는다. 또한, 귀소성 엔도뉴클레아제와 메가뉴클레아제의 특이성은 비-자연 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있는 것으로 보고되었다. 예로써, Chevalier et al ., (2002) Molec . Cell 10:895-905; Epinat et al ., (2003) Nucleic Acids Res . 31:2952-2962; Ashworth et al . (2006) Nature 441:656-659; Paques et al ., (2007) Current Gene Therapy 7:49-66을 참조한다.
송달
본 발명에 개시된 ZFN은 임의의 적절한 수단에 의해 표적 세포에 전달될 수 있다. 적절한 세포는 진핵과 원핵 세포 및/또는 세포주가 포함하지만 이들에 국한되지는 않는다. 이런 세포 또는 세포주의 비-제한적인 예에는 COS, CHO(가령, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(가령, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T) 및 perC6 세포, 그리고 곤충 세포, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf), 또는 진균류 세포, 예를 들면, 사카로미세스(Sac -charomyces), 피치아(Pichia) 및 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces)가 포함된다.
징크핑거를 포함하는 단백질을 송달하는 방법은, 예를 들면, U.S. 특허 No. 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219 및 7,163,824에 기술되는데, 이들 문헌의 내용은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다.
본 발명에 개시된 바와 같은 FUT8 ZFN은 또한, 하나 이상의 ZFN을 인코딩하는 서열을 함유하는 벡터를 이용하여 송달될 수도 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 포진바이러스 벡터 및 아데노-연관된 바이러스 벡터 등이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는 임의의 벡터 시스템이 이용될 수 있다. 또한, U.S. 특허 No. 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219와 7,163,824를 참조하며, 이들은 본 발명에서 순전히 참조로서 편입된다. 게다가, 이들 벡터가 하나 이상의 ZFN 인코딩 서열을 포함할 수 있다는 것이 명백할 것이다. 따라서, ZFN의 하나 이상의 쌍이 세포 내로 도입될 때, ZFN은 동일한 벡터에 또는 상이한 벡터에 실려 운반될 수 있다. 복수의 벡터가 이용될 때, 각 벡터는 하나 또는 복수의 ZFN을 인코딩하는 서열을 포함할 수 있다.
조작된 ZFP를 인코딩하는 핵산을 세포(가령, 포유동물 세포)와 표적 조직 내로 도입하기 위하여 종래의 바이러스 및 비-바이러스에 기초한 유전자 전달 방법이 이용될 수 있다. 이들 방법은 또한, ZFP를 인코딩하는 핵산을 시험관내에서 세포에 투여하는 데에도 이용될 수 있다. 특정 구체예에서, ZFP를 인코딩하는 핵산은 생체내 또는 생체외 유전자 요법 용도를 위해 투여된다. 비-바이러스 벡터 송달 시스템에는 DNA 플라스미드, 나신(naked) 핵산, 그리고 송달 운반체(delivery vehicle), 예를 들면, 리포좀(liposome) 또는 폴록사머(poloxamer)와 복합체화된 핵산이 포함된다. 바이러스 벡터 송달 시스템에는 세포로 전달 이후에 에피솜 게놈 또는 통합된 게놈으로 존재하는 DNA 및 RNA 바이러스가 포함된다. 유전자 요법 절차의 검토를 위하여, Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11: 211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175(1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm(eds.) (1995); Yu et al ., Gene Therapy 1:13-26 (1994)을 참조한다.
조작된 ZFP을 인코딩하는 핵산의 비-바이러스 송달 방법에는 전기천공, 리포펙션(lipofection), 마이크로주입, 바이오리스틱스(biolistics), 비로좀, 리포좀, 면역리포좀, 다가양이온 또는 지질:핵산 배합체, 나신 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 작용제-향상된 흡수가 포함된다. 예로써, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 이용한 음향천공(sonoporation) 역시 핵산의 송달에 이용될 수 있다.
추가의 예시적인 핵산 송달 시스템은 Amaxa Biosystems(Cologne, Germany), Maxcyte, Inc.(Rockville, Maryland), BTX Molecular Delivery Systems(Holliston, MA)와 Copernicus Therapeutics Inc.에 의해 제공된 것들을 포함한다(예로써, U.S. 특허 No. 6,008,336 참조).
리포펙션은 예로써, US 5,049,386, US 4,946,787 및 US 4,897,355에 기술되며, 리포펙션 시약은 상업적으로 판매된다(가령, Transfectam™ 및 Lipofectin™). 폴리뉴클레오티드의 효과적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온성 및 중성 지질에는 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024에 기술된 것들이 포함된다. 송달은 세포(체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)으로 수행될 수 있다.
표적화된 리포좀, 예를 들면, 면역지질 복합체를 비롯한 지질:핵산 복합체의 제조는 당업자에게 공지되어 있다(예로써, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al ., Cancer Gene Ther . 2:291-297 (1995); Behr et al ., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al ., Bioconjugate Chem . 5:647-654 (1994); Gao et al ., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al ., Cancer Res . 52:4817-4820 (1992); U.S. Pat. No. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028 및 4,946,787 참조).
조작된 ZFP을 인코딩하는 핵산의 송달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스에 기초한 시스템의 이용은 바이러스를 체내에서 특정 세포에 표적화하고 바이러스 유효하중(viral payload)을 핵으로 밀입하는 고도로 진화된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자(생체내)에 직접적으로 투여되거나, 또는 시험관내에서 세포를 처리하는데 이용되고, 이들 변형된 세포가 환자에게 투여될 수 있다(체외). ZFP의 전달을 위한 전통적인 바이러스에 기초한 시스템에는 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 우두 및 단순포진 바이러스 벡터가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 숙주 게놈 내로의 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노-연관된 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하고, 종종 삽입된 이식유전자의 장기적인 발현을 가져온다. 부가적으로, 많은 상이한 세포형과 표적 조직에서 높은 형질도입(transduction) 능력이 관찰되었다.
레트로바이러스의 주성(tropism)은 외래 외피 단백질을 통합하고, 표적 세포의 잠재적 표적 집단을 확대함으로써 변경될 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포(non-dividing cell)를 형질도입 또는 감염시킬 수 있고, 전형적으로 높은 바이러스 역가(viral titer)를 산출하는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 최대 6-10 kb의 외래 서열에 대한 패키징 능력(packaging capacity)을 갖는 cis-작용 긴 말단 반복부(long terminal repeat)로 구성된다. 이러한 최소 cis-작용 LTR은 벡터의 복제와 포장에 충분하고, 이들 벡터는 이후, 치료 유전자를 표적 세포 내로 통합하여 영구적인 이식유전자 발현을 제공하는데 이용된다. 광범위하게 이용되는 레트로바이러스 벡터에는 뮤린 백혈병 바이러스(murine leukemia virus, MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(gibbon ape leukemia virus, GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합에 기초한 것들이 포함된다(예로써, Buchscher et al ., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al ., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al, Virol . 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol . 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol . 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700 참조).
ZFP 융합 단백질의 일시적인 발현이 선호되는 사례에서, 아데노바이러스 기초 시스템이 이용될 수 있다. 아데노바이러스에 기초한 벡터는 많은 세포형에서 매우 높은 형질도입 효율이 가능하며 세포 분열을 요구하지 않는다. 이런 벡터로, 높은 역가와 높은 수준의 발현이 달성되었다. 상기 벡터는 상대적으로 간단한 시스템에서 대량으로 생산될 수 있다. 아데노-연관된 바이러스("AAV") 벡터 역시 예로써, 핵산과 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내와 체외 유전자 요법 절차를 위하여 표적 핵산에 세포를 형질도입하는데 이용된다(예로써, West et al, Virology 160:38-47 (1987); U.S. Pat. No. 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin . Invest . 94:1351 (1994) 참조). 재조합 AAV 벡터의 구축은 U.S. Pat. No. 5,173,414; Tratschin et al ., Mol . Cell . Biol. 5:3251-3260(1985); Tratschin et al, Mol . Cell . Biol . 4:2072-2081(1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al ., J. Virol . 63:03822-3828 (1989)을 비롯한 다수의 간행물에 기술된다.
임상 시험에서 유전자 전달을 위하여 적어도 6가지 바이러스 벡터 접근법이 현재 이용 가능한데, 이들은 형질도입 인자(transducing agent)를 생산하기 위하여 헬퍼 세포주(helper cell line) 내로 삽입된 유전자에 의한 결함성 벡터의 상보화를 수반하는 접근법을 이용한다.
pLASN 및 MFG-S가 임상 시험에 이용되고 있는 레트로바이러스 벡터의 실례이다(Dunbar et al ., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al ., Nat . Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al ., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)).
PA317/pLASN은 유전자 요법 시험에 이용된 최초의 치료 벡터였다(Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)). 50% 또는 그 이상의 형질도입 효율이 MFG-S 패키징 벡터에서 관찰되었다(Ellem et al , Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al ., Hum . Gene Ther . 1:111-2 (1997).
재조합 아데노-연관된 바이러스 벡터(rAAV)는 결함성과 비-병원성 파보바이러스(parvovirus) 아데노-연관된 2형 바이러스에 기초한 유망한 대안적 유전자 송달 시스템이다. 모든 벡터는 이식유전자 발현 카세트의 측면에 접하는 AAV 145 bp 반전 말단 반복부(inverted terminal repeat)만을 보유하는 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포의 게놈 내로 통합에 기인한 효율적인 유전자 전달과 안정적인 이식유전자 전달이 이러한 벡터 시스템의 핵심 특징이다(Wagner et al ., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al ., Gene Ther . 9:748-55 (1996)).
복제-결함성 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)는 높은 역가로 생산되며 다수의 상이한 세포형을 용이하게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 이식유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작된다; 이어서, 복제 결함성 벡터는 결손된 유전자 기능을 트랜스(trans)에서 제공하는 인간 293 세포에서 증식된다. Ad 벡터는 생체내에서 비-분열, 분화된 세포, 예를 들면, 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것들을 비롯한 복수 유형의 조직을 형질도입할 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 대량 운반 능력을 갖는다. 임상 시험에서 Ad 벡터의 이용의 실례는 근육내 주사에 의한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 요법을 수반했다 (Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 7:1083-9(1998)). 임상 시험에서 유전자 전달에 아데노바이러스 벡터를 이용하는 다른 실례에는 Rosenecker et al ., Infection 24: 1 5-10 (1996); Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum . Gene Ther . 2:205-18 (1995); Alvarez et al ., Hum . Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al ., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al ., Hum . Gene Ther . 7:1083-1089 (1998)가 포함된다.
패키징 세포(packaging cell)는 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성하는데 이용된다. 이런 세포에는 아데노바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 ψ2 세포 또는 PA317 세포가 포함된다. 유전자 요법에 이용되는 바이러스 벡터는 통상적으로, 핵산 벡터를 바이러스 입자 내로 집어넣는 프로듀서 세포주(producer cell line)에 의해 산출된다. 전형적으로, 이들 벡터는 패키징과 이어서, 숙주 내로의 통합(가능하면)을 위해 요구되는 최소의 바이러스 서열을 내포하고, 다른 바이러스 서열은 발현되는 단백질을 인코딩하는 발현 카세트로 대체된다. 이들 상실되는 바이러스 기능은 패키징 세포주(packaging cell line)에 의해 트랜스(trans)에서 제공된다. 가령, 유전자 요법에 이용되는 AAV 벡터는 전형적으로, 포장과 숙주 게놈 내로 통합을 위해 요구되는 AAV 게놈으로부터 반전 말단 반복부(ITR) 서열만을 보유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 다시 말하면, rep 및 cap을 인코딩하지만 ITR 서열이 부재하는 헬퍼 플라스미드(helper plasmid)를 함유하는 세포주에 패키징된다. 상기 세포주는 또한, 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 이러한 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제와 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 부재로 인하여 유의한 양으로 패키징되지는 않는다. 아데노바이러스로 오염은 예로써, AAV보다 아데노바이러스가 더욱 민감하게 반응하는 열 처리에 의해 감소될 수 있다.
많은 유전자 요법 용도에서, 유전자 요법 벡터는 특정 조직 유형에 높은 특이성으로 송달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외부 표면 상에 바이러스 외피 단백질을 포함하는 융합 단백질로서 리간드를 발현함으로써 소정의 세포형에 대한 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 이러한 리간드는 목적하는 세포형 상에 존재하는 것으로 알려져 있는 수용체에 대한 친화성을 갖도록 선택된다. 가령, Han et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 92:9747-9751 (1995)에서는 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 인간 헤레굴린(human heregulin)을 발현하도록 변형될 수 있고, 이들 재조합 바이러스가 인간 상피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정한 인간 유방암 세포를 감염시킨다고 보고하였다. 이러한 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍으로 확대될 수 있는데, 여기서 표적 세포는 수용체를 발현하고, 상기 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 가령, 섬유형 파지(filamentous phage)는 실질적으로 모든 선택된 세포 수용체에 대하여 특이적인 결합 친화성을 갖는 항체 단편(가령, FAB 또는 Fv)을 전시하도록 조작될 수 있다. 상기 설명이 바이러스 벡터에 일차적으로 적용되긴 하지만, 동일한 원리가 비-바이러스 벡터에 적용될 수 있다. 이들 벡터는 특정 표적 세포에 의한 흡수에 호의적인 특정 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
유전자 요법 벡터는 하기에 기술된 바와 같이, 개별 환자에게 투여함으로써, 전형적으로 전신 투여(가령, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해서 생체내 송달될 수 있다. 대안으로, 벡터는 체외 세포, 예를 들면, 개별 환자로부터 외식된 세포(가령, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 보편 공여자 조혈 줄기 세포로 전달되고, 이후에 이들 세포가 통상적으로, 벡터를 통합한 세포에 대한 선별후 환자 내로 재이식(reimplantation)될 수 있다.
진단, 연구, 또는 유전자 요법을 위한 체외 세포 형질감염(transfection)(가령, 숙주 생물체 내로 형질감염된 세포의 재-주입을 통하여)은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 바람직한 구체예에서, 세포는 대상 생물체로부터 분리되고, ZFP 핵산(유전자 또는 cDNA)으로 형질감염되고, 대상 생물체(가령, 환자) 내로 재-주입된다. 체외 형질감염에 적합한 다양한 세포형이 당업자에게 널리 공지되어 있다(환자로부터 세포를 분리하고 배양하는 방법에 관한 논의는 예로써, Freshney et al ., Culture of Animal Cells , A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994)) 및 여기에 언급된 참고문헌 참조).
한 구체예에서, 줄기 세포는 세포 형질감염과 유전자 요법을 위한 체외 과정에 이용된다. 줄기 세포를 이용하는 이점은 이들이 시험관내에서 다른 세포형으로 분화되거나, 또는 포유동물(가령, 이들 세포의 공여자) 내로 도입될 수 있다는 점인데, 이들 줄기 세포는 골수 내로 융합될 것이다. 시험관내에서 GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토킨을 이용하여 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역 세포형(immune cell type)으로 분화시키는 방법이 공지되어 있다(Inaba et al , J. Exp . Med. 176:1693-1702 (1992) 참조).
줄기 세포가 공지된 방법을 이용한 형질도입 및 분화를 위하여 분리된다. 가령, 줄기 세포는 원치 않는 세포, 예를 들면, CD4+와 CD8+(T 세포), CD45+(panB 세포), GR-1(과립구), 및 Iad(분화된 항원 제시 세포)에 결합하는 항체로 골수 세포를 패닝(panning)함으로써 골수 세포로부터 분리된다(Inaba et al ., J. Exp . Med. 176:1693-1702 (1992) 참조).
치료 ZFP 핵산을 내포하는 벡터(가령, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)가 생체내에서 세포의 형질도입을 위하여 생물체에 직접적으로 투여될 수도 있다. 대안으로, 나신 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공이 포함되지만 이들에 국한되지는 않는, 혈액 또는 조직 세포와 궁극적으로 접촉하도록 분자를 도입하는데 정상적으로 이용되는 임의의 경로에 의해 수행된다. 이런 핵산을 투여하는데 적합한 방법은 이용가능하고 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 특정 조성물을 투여하는데 한 가지 이상의 경로가 이용될 수 있긴 하지만, 종종 특정 경로가 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
조혈 줄기 세포 내로 DNA를 도입하는 방법은 예로써, U.S. 특허 No. 5,928, 638에 기술된다. 이식유전자를 조혈 줄기 세포, 예를 들면, CD34+ 세포 내로 도입하는데 유용한 벡터에는 아데노바이러스 타입 35가 포함된다.
이식유전자를 면역 세포(가령, T-세포) 내로 도입하는데 적합한 벡터에는 비-통합성(non-integrating) 렌티바이러스 벡터가 포함된다. 예로써, Ory et al ., (1996) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 93:11382-11388; Dull et al ., (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al ., (1998) J. Virol . 72:9873-9880; Follenzi et al ., (2000) Nature Genetics 25:217-222를 참조한다.
제약학적으로 허용되는 담체는 투여되는 특정 조성물, 그리고 상기 조성물을 투여하는데 이용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 하기에 기술된 바와 같이, 제약학적 조성물의 매우 다양한 적절한 제제가 이용 가능하다(예로써, Remington ’s Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989 참조).
앞서 언급된 바와 같이, 본 발명에 개시된 방법과 조성물은 원핵 세포, 진균류 세포, 고세균(Archaeal) 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 척추동물 세포, 포유동물 세포와 인간 세포가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는 임의 유형의 세포에 이용될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 세포주는 당업자에게 공지되어 있고, 여기에는 COS, CHO(가령, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(가령, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 곤충 세포, 예를 들면, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)(Sf), 및 진균류 세포, 예를 들면, 사카로미세스(Sacch -aromyces), 피치아(Pichia) 및 쉬조사카로미세스(Schizosaccharomyces)가 포함되지만 이들에 국한되지는 않는다. 이들 세포주의 자손, 변이체 및 유도체 역시 이용될 수 있다.
적용
본 발명에 개시된 방법과 조성물은 FUT8 게놈 서열의 비활성화에 이용될 수 있다. 앞서 언급된 바와 같이, 비활성화는 세포 내에서 FUT8 유전자 발현의 부분적인 또는 완전한 억제를 포함한다. FUT8 유전자의 비활성화는 예로써, 단일 절단 현상(single cleavage event)에 의해, 절단과 그 이후에, 비-상동성 말단 결합에 의해, 두 부위에서 절단과 그 이후에, 이들 두 절단 부위 사이에 서열을 결실시키기 위한 연결에 의해, 코딩 영역 내로 미스센스(missense) 또는 난센스(nonsense) 코돈의 표적화 재조합에 의해, 유전자 또는 조절 영역을 붕괴시키기 위하여 상기 유전자 또는 이의 조절 영역 내로 무관한 서열(즉, "선전물"(stuffer) 서열)의 표적화 재조합에 의해, 또는 전사체(transcript)의 미스-절단접합(mis-splicing)을 유도하기 위하여 인트론 내로 스플라이스 수용자 서열의 표적화 재조합에 의해 달성될 수 있다.
FUT8의 ZFN-매개된 비활성화(녹아웃 또는 녹다운(knockdown))에 대한 다양한 용도가 있다. 가령, 본 발명에 개시된 방법과 조성물은 재조합 단백질 생산, 예를 들면, α1-안티트립신 및/또는 단클론 항체 생산에 이용을 위한 Fut8-결함성 세포주의 산출을 가능하게 한다. Fut8이 비활성화되는 세포는 특히, ADCC의 유도에서 더욱 큰 이펙터 기능을 보이는 항체를 생산한다.
유사하게, Fut8이 부분적으로 또는 완전하게 비활성화되는 세포는 푸코실화된 세린 프로테아제 저해물질 알파 1-안티트립신 또는 α1-안티트립신(A1AT)을 생산하는데 이용될 수도 있다. A1AT는 암 전이의 억제에서 일정한 역할을 할 수 있으며(Goodarzi and Turner (1995) Chim Acto 236(2): 161-171), 다양한 암으로 고통받는 환자는 정상 개체군에서 관찰되는 것에 비하여 더욱 심하게 푸코실화된 A1AT를 나타내는데(Saitoh et al., (1993) Archives Biochem . & Biophysics 303:281-287), 이는 내인성 A1AT의 푸코실화가 감소된 기능성으로 이어진다는 것을 암시한다. 이에 더하여, 난소암 환자에서 푸코실화된 A1AT의 존재는 화학요법에 대한 둔감함(unresponsiveness)의 전조가 되는 것으로 밝혀졌다(Thompson et al., (1988) Br. J. Cancer 58(5):89-93). 혈장으로부터 분리된 알파 1-안티트립신은 A1AT의 결핍에 의해 유발된 폐 퇴행(lung degradation)(가령, 폐기종(pulmonary emphysema))의 치료에 이용되고 있다. fut8 적중 또는 녹다운 세포주에서 A1AT의 생산은 더욱 높은 일관성(consistency)과 활성을 갖는 단백질을 산출할 수 있다. 따라서 본 발명에 개시된 세포와 세포주는 또한, A1AT의 효율적인 생산을 가능하게 한다.
본 발명에 개시된 Fut8 결함성 세포와 세포주에서 추가의 유전자가 비활성화될 수도 있다. 단백질 과다발현(overexpression)에 관여하는 추가의 유전자, 및 이들 유전자를 비활성화시키기 위한 조성물과 방법은 U.S. 특허공보 No. 20060063231과 20080015164에 기술되며, 이들 문헌의 내용은 본 발명에 순전히 참조로서 편입된다. 가령, 실시예 5에 기술된 바와 같이, Fut8 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR)와 글루타민 합성효소(GS)가 비활성화되는 세포는 본 발명에 개시된 방법을 이용하여 산출될 수 있다. 실시예 5를 참조한다. 이들 세포는 목적하는 단백질을 과다발현하는데 유용하다.
실시예
실시예 1: FUT8 ZFN 의 설계와 구축
α-2 및 α-6 당전이효소에서 공통적으로 보존된 3가지 모티프는 Fut8의 효소 활성과 차후에, 재조합 방식으로 생산되는 항체 치료제의 푸코실화를 담당한다. Ihara et al.(2007) Glycobiology 17:455-66을 참조한다. 이들 모티프는 햄스터(C. griseus) 서열에서 쉽게 확인되었다. Oriol et al. (1999) Glycobiology 9:323-34; Javaud et al. (2000) Mol Biol Evol 17:1661-72를 참조한다. 특히, 햄스터 FUT8 Fut 모티프 II(도 4)는 소와 인간 모티프에 동일하고, 돼지와 생쥐로부터 모티프와 단지 하나의 아미노산만 상이하다. Javaud et al. (2000) Mol Biol Evol 17:1661-72를 참조한다. 이에 더하여, M. musculus와 R. norvegicus FUT8 게놈 DNA 서열의 정렬은 C. griseus FUT8 유전자의 인트론 9가 용이하게 클로닝될 만큼 작다는 것을 암시하였다.
C. griseus FUT8 cDNA를 아래와 같이 클로닝하였다. CHO-S 세포로부터 유래된 10 나노그램의 cDNA 라이브러리를 프라이머 GJC 119F: AACAGAAACTTATTTTCCTGTGT (SEQ ID NO:31)와 GJC 106R: GGTCTTCTGCTTGGCTGAGA(SEQ ID NO:32)을 이용하여 PCR 증폭하고 TOPO™(Invitrogen)을 이용하여 클로닝한 다음 서열화하였다. 유사하게, FUT8 인트론9는 EasyA™ 중합효소(Stratagene)와 올리고뉴클레오티드 프라이머 GJC 71F: GCTTGGCTTCAAACATCCAG(SEQ ID NO:4)와 GJC 72R: CACTTTGTCAGTGCGTCTGA(SEQ ID NO:33)를 이용하여 C. griseus 게놈 DNA로부터 PCR 증폭하였다. PCR 산물을 클로닝하고 서열화하였다. 인트론 10의 부분적인 서열은 EasyA™ 중합효소(Stratagene)와 올리고뉴클레오티드 GJC 75F: AGTCCATGTCAGACGCACTG(SEQ ID NO:34)와 GJC 77R: CAGAACTGTGAGACATAAACTG(SEQ ID NO:35)를 이용하여 C. griseus 게놈 DNA의 PCR 증폭에 의해 획득하였다.
앞서 기술된 바와 같이 클로닝된 FUT8 cDNA, 인트론 9와 인트론 10 서열은 이후, FUT8 내에서 ZFN 결합의 설계에 이용하였다. 특히, FUT8 cDNA(도 1) 서열은 징크핑거 뉴클레아제에 의한 인식에 호의적인 부위에 대하여 자세히 조사하고, Fut8 효소 모티프와 중복되는 1개의 이와 같은 위치를 확인하였다(도 4). 이에 더하여, 인트론 DNA(도 3)는 또한, 잠재적 ZFN 결합 부위에 대하여 자세히 조사하였다.
FUT8 내에 서열을 인식하는 징크핑거 뉴클레아제(ZFN)의 여러 쌍이 설계되었다. FUT8 유전자 내에서 2개의 ZFN 부위의 대략적 위치는 도 4에 도시된다. 징크핑거 인식 나선의 서열과 이들이 인식하도록 설계되는 DNA 서열은 표 1에 열거된다. FUT8 ZFN을 인코딩하는 서열을 포함하는 플라스미드는 Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651에서 기술된 바와 본질적으로 동일하게 구축되었다.
실시예 2: Cel -1 미스매치 분석
FUT8-표적화된 ZFN이 예상된 바와 같이 내인성 FUT8 좌위를 변형시키는지 결정하기 위하여, 제조업체의 사용설명서(Trangenomic SURVEYOR™)와 본질적으로 동일하게 Cel-1 미스매치 분석을 수행하였다. 간단히 말하면, 적절한 ZFN 플라스미드 쌍은 CHO K-I 세포 내로 형질감염시켰다. CHO K-I 세포는 American Type Culture Collection로부터 입수하고, 10% 적격 소 태아 혈청(FCS, Hyclone)으로 보충된 F-12 배지(Invitrogen)에서 권장된 바와 같이 성장시켰다. 세포는 TrypLE Select™ 프로테아제(Invitrogen)를 이용하여 플라스틱 실험용기(plastic ware)로부터 분리시켰다. 형질감염을 위하여, 1 백만개 CHO K-I 세포를 1㎍의 각 징크핑거 뉴클레아제 및 100㎕ Amaxa 용액 T와 혼합하였다. 세포를 프로그램 U-23을 이용하여 Amaxa Nucleofector II™에서 형질감염시키고, 1.4㎖의 따뜻한 F-12 배지 + 10% FCS 중에서 회수하였다.
세포를 형질감염 후 2일 시점에서 회수하고, 염색체 DNA를 Masterpure™ DNA 정제 키트(Epicentre)를 이용하여 준비하였다. Accuprime™ 고성능 DNA 중합효소 (Invitrogen)를 이용하여 FUT8 좌위의 적절한 영역을 PCR 증폭하였다. PCR 반응물을 94℃로 가열하고 실온으로 점진적으로 냉각시켰다. 대략 200ng의 어닐링된 DNA를 0.33㎕ CEL-I™ 효소(Transgenomic)와 혼합하고, 42℃에서 20분 동안 배양하였다. 반응 산물은 1X Tris-붕산염-EDTA 완충액에서 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다.
도 5A와 5B에 도시된 바와 같이, FUT8 ZFN은 내인성 FUT8 좌위를 변형시켰다. 특히, ZFN 12029와 ZFN 12030의 ZFN 쌍은 염색체의 3.3%의 변형을 가져왔다(도 5A). ZFN 쌍 12170/12176 및 12172/12176은 각각 염색체를 3.0% 및 4.4% 변형시켰다(도 5B).
실시예 3: 유전형 확인 분석
FUT8 결실 클론을 또한, 유전자 수준에서 분석하였다. 이중-돌연변이체 클론(double-mutant clone)을 신속하게 확인하기 위하여, 레시틴 Lens culinaris 응집소(LCA, Vector Laboratories)에 대한 푸코실화-결함성 CHO 세포의 내성에 기초한 표현형 스크리닝을 이용하였다. CHO 세포주 Lec13은 야생형 CHO 세포보다 50-배 높은 LCA 농도로 성장을 가능하게 하는, 푸코오스 생합성 유전자 GMD에 돌연변이를 함유한다. 예로써, Ripka et al., (1986) Somat Cell Mol Genet 12: 51-62; Ohyama et al., (1998) J Biol Chem 273:14582-7을 참조한다. FUT8 -/- 세포는 형광-표지된 LCA에 결합하지 못한다. Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22를 참조한다. 따라서, FUT8 -/- 세포는 LCA에서의 성장에 대해 내성을 나타낼 것으로 추론되었다.
형질감염 후 6일 내지 30일 사이에, ZFN-처리된 세포를 제한 희석으로, 대략 0.4개 세포/웰로 96-웰 포맷(format)에 평판한 점을 제외하고, ZFN 쌍 12170/12176을 이용하여 실시예 2에서 기술된 바와 같이 세포를 형질감염시켰다. 2주 성장 후, 웰 당 클론 숫자를 기록하고, 세포를 1X PBS에서 세척하고, 20㎕ TrypLE Select™ (InVitrogen)을 첨가하였다. 10㎕의 분리된 세포는 F-12 배지 + 10% FCS + 50㎍/㎖ LCA를 함유하는 병렬 96-웰 플레이트로 이전하였다. 100㎕의 F-12 배지 + 10% FCS를 최초 96-웰 플레이트의 10㎕의 남아있는 세포에 첨가하였다. 18시간 후, LCA-함유 플레이트 중의 세포의 형태를 기록하였다. LCA의 존재하에 둥글지 않은 야생형 CHO-KI 형태를 유지하는 클론을 주목하고, 비-LCA-처리된 플레이트로부터 상응하는 콜로니는 확장시켰다. 최초 웰이 하나 이상의 클론을 함유하는 것으로 밝혀지면(따라서 LCA에서 성장되었을 때 둥근 세포와 야생형-외형 세포의 혼합물을 산출하는), 상기 웰의 내용물을 상기와 같이 재희석 클로닝(redilution cloning)하였다.
게놈 DNA를 비-LCA-처리된 LCA-내성 세포로부터 수확하고, 올리고 GJC 75F: AGTCCATGTCAGACGCACTG(SEQ ID NO:34)와 GJC 91R:TGTTACTTAAGCCCCAGGC(SEQ ID NO:7)를 이용하여 FUT8 좌위의 일부분을 PCR 증폭하였다.
PCR 산물의 절반(~200ng)은 앞서 기술된 바와 같이 CEL-I 분석법을 이용하여 분석하고, 다른 절반은 겔 정제하였다. CEL-I-음성인 정제된 밴드(동종접합체)를 직접로 서열화하였다. CEL-I-양성 밴드는 Topo® 클로닝(Invitrogen)을 수행하고, 클론은 2개의 대립형질이 회수될 때까지 서열화하였다.
이러한 방식으로 분석된 600개 클론 중에서 28개는 LCA에 내성이었다(4.7%). 28개의 LCA-내성 세포주 중에서 15개는 단일-세포 클론(single-cell clone)이었다. 세포주는 LCA에 노출되지 않은 배양액의 절반으로부터 확장시켰다. 이들 클론의 FUT8 유전형이 표 2에 제시된다. 여기에 제시된 서열의 영역은 도 4에서 도시된 영역과 동일하다. 일부 클론에서 발견된 작은 삽입을 함유하는 대립형질 서열을 수용하기 위하여, 야생형 서열의 설명에 5개 염기쌍 갭(base pair gap)을 삽입하였다. 대립형질은 A와 B로 지명된다; 대립형질 지명이 없는 클론은 동종접합성이다. 클론 12-B는 C. griseus 리보솜 DNA(rDNA) 서열의 148bp 삽입뿐만 아니라 지정된 결실을 함유한다.
Figure 112010008547661-pct00002
서열화된 모든 클론에서, FUT8의 양쪽 대립형질이 모두 변형되었다. 이들 클론 중에서 5개는 동종접합성이었다. 유전자형 확인에서 2개 내지 38개 염기쌍의 결실과 1개 내지 5개 염기쌍의 작은 삽입을 함유하는 클론이 또한 확인되었다. 클론 12의 대립형질 B는 12개 염기쌍 결실뿐만 아니라 C. griseus rDNA 서열의 148개 염기쌍 삽입을 내포하였다.
실시예 4: 이중- ZFN -변형을 통한 FUT8 의 붕괴
인트론 ZFN 쌍 ZFN 12029/12030과 엑손 쌍 ZFN 12172/12176의 동시 형질감염에 의해 FUT8에서 더욱 큰 결실(엑손 10을 대부분 포함하는 FUT8의 1300bp,)을 또한 생성하였다. 특히, 각각 1㎍의 ZFN 12029, 12030, 12172 및 12176을 앞서 기술된 바와 같이 CHO K-I 세포 내로 형질감염시켰다. 세포를 형질감염 후 2일 시점에 수확하고 게놈 DNA를 정제하였다. 야생형 염색체를 파괴하기 위하여 DNA를 EcoRI과 XmnI로 효소절단하고, 올리고 GJC 71F: GCTTGGCTTCAAACATCCAG(SEQ ID NO:4)와 GJC 91R: TGTTACTTAAGCCCCAGGC(SEQ ID NO:7)로 PCR 증폭하였다.
결과를 도 6A에 도시하며, 예상된 크기의 단편이 산출되었음이 증명된다.
또한, 이어서 CHO 세포주를 LCA 농축의 존재하에, 또는 이러한 농축의 부재하에 FUT8 유전자를 표적화하는 ZFN의 상이한 쌍으로 처리하였다. CEL-I 분석은 형질감염 후 2일 및 30일 시점에, 실시예 2에서 앞서 기술된 바와 같이 ZFN 플라스미드로 수행하였다.
도 6B에 도시된 바와 같이, LCA 처리는 FUT8-/- 세포 비율에 유의한 증가를 가져왔다.
실시예 5: 추가적인 유전자의 비활성화
FUT8 및 추가 유전자가 비활성화되는 세포주를 또한 생성하였다. 특히, U.S. 특허공보 No. 2006/0063231 및 U.S. 2008/015164에 기술된 바와 같이, DHFR과 GS에 관한 징크핑거 뉴클레아제를 설계하고 구축하였다. DHFR- 및 GS-표적화된 ZFN을 인코딩하는 플라스미드를 실시예 2에 기술된 바와 같이 CHO 세포 내로 도입하여 GS-/-/DHFR-/- CHO 세포주를 산출하였다.
이어서 이들 GS-/-/DHFR-/- CHO 세포주를 FUT8 유전자를 표적화하는 ZFN의 4가지 상이한 쌍(풀 1, 3, 5 및 7)으로 처리하였다. 각 풀은 FUT8 발현이 파괴된 집단(도 7, LCA 농축 있음)에 대하여 LCA 선별하였다. CEL-I 분석은 앞서 기술된 바와 같이 LCA-선별된 풀과 선별되지 않은 풀(도 7, LCA 농축 없음) 둘 모두에서 수행하였다.
도 7에 도시된 바와 같이, LCA-선별된 풀에서 FUT8 유전자의 붕괴된 카피의 빈도는 34% 정도로 높았다(LCA 농축이 존재하는 풀 1). 또한, 풀 #1 또는 풀 #5로부터 분리된 다양한 삼중 녹아웃 클론의 유전형 확인 분석을 본질적으로 상기 실시예 3에서 기술된 바와 동일하게 수행하였다. 도 8에 도시된 바와 같이, 풀 #1로부터 선별된 75개 클론 중에서 33개(또는 ~44%)가 FUT8 유전자의 양쪽 카피에서 변형되었다.
최종적으로, ZFN 처리에 의해서 DHFR, GS 및 FUT8이 붕괴된 CHO 세포를 형광 LCA에 결합하는 능력에 대하여 조사하였다. 대략 100,000개의 세포를 트립신 처리하고 1X PBS에서 세척한 다음, 2㎍/㎖ 플루오레세인-LCA(F-LCA)와 혼합하였다. F-LCA 결합은 유세포분석법으로 분석하였다(Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotech . Bioeng. 87:614). 도 9에 도시된 바와 같이, 형광 LCA는 GS, DHFR 및 FUT8 유전자가 붕괴된 세포에 결합하지 않는다. 따라서, FUT8과 1개, 2개(또는 그 이상)의 유전자가 비활성화되는 세포는 목적하는 재조합 단백질의 발현(과다-발현)에 사용된다.
이들 결과는 FUT8 유전자를 절단하기 위하여 표적화되는 ZFN을 이용한 Fut8-결함성 세포주의 신속한 생성을 증명한다. 절단 부위에서 NHEJ의 오차-허용 과정을 통한 DNA 복구는 기능적으로 유해한 돌연변이를 가져왔다. NHEJ-유래된 돌연변이가 때때로 전통적인 유전자 붕괴에 의해서 발생된 것들에 비하여 작긴 하지만, FUT8의 결정적인 촉매 영역을 코딩하는 DNA에 이들 돌연변이를 표적화하는, 본 발명에 개시된 ZFN의 능력은 심지어 작은 인-프레임 대립형질(in-frame allele)도 효소 활성에 심각한 결함을 야기하도록 담보하였다. 가령, 단지 루이신 413의 동종접합성 결실(클론 5, 8, 9 및 15)은 LCA에 내성인 세포를 가져왔다.
더 나아가, CHO 세포주의 많은 상이한 아형(subtype)이 존재하긴 하지만, 종종 맞춤 유전적 또는 표현형적 변화를 이용하여 본 발명에 개시된 ZFN를 임의의 세포주 또는 아형에서 FUT8을 신속하게 붕괴시키는데 이용할 수 있다. 이에 더하여, 포유동물 종간에 보존된 징크핑거 단백질 결합 부위를 선별할 수 있기 때문에, ZFN은 임의의 종으로부터 유래된 세포주에서 FUT8을 비활성화시키도록 설계될 수도 있다.
실시예 6: Fut8 저형질
FUT8의 ZFN 변형을 갖는 일부 CHO 세포는 그들의 야생형 Fut8 활성의 단편을 보유할 수 있다. 이러한 세포는 최초 스크리닝을 수행하는데 사용된 상대적으로 낮은 농도의 LCA(50㎍/㎖)에는 내성일 수도 있지만, 더 높은 농도의 LCA에는 여전히 민감하다.
세포를 실시예 2에 기술된 바와 같이 형질감염시키고 50㎍/㎖ LCA에 대한 내성에 대하여 선별한 다음, 실시예 3에 기술된 바와 같이 유전형 확인 분석을 수행하였다. 개별 클론의 CEL-I 분석과 이들 클론 중 일부의 유전형을 도 10에 도시한다. 50㎍/㎖ LCA를 사용하여 일차 스크리닝한 후, 더 높은 농도의 LCA로 이들 최초 ZFN-변형된 LCA-내성 세포주의 이차 스크리닝을 수행하여 저형질을 확인하였다. 50㎍/㎖ LCA에 내성인 세포주를 100, 200, 400 및 800㎍/㎖ LCA 중에서의 성장에 대하여 분석하였다. 이러한 방식으로 조사된 16개의 세포주 중에서 11개는 800㎍/㎖ LCA에서 야생형 성장 및 세포 형태를 보였다. 조사된 16개의 세포주 중 5개는 800㎍/㎖ 미만의 LCA 농도에서만 야생형 성장 및 세포 형태를 보였다. 이런 이유로 중간 LCA 내성을 갖는 이들 5개의 클론은 Fut8 활성에 대해 저형질성(hypomorphism)이다. Fut8 저형질성은 ZFN 결합 부위 사이에 3개의 뉴클레오티드(ATT) 삽입의 존재와 완벽하게 상관되었다. 이러한 삽입은 위치 415에서 C. griseus Fut8 단백질에 1개의 루이신 잔기를 추가한다. 이들 각 클론에서 다른 대립형질은 효소 활성을 소멸시킬 것으로 예상된다. 이들 5개 클론 중 2개는 클론 14와 클론 19이며, 도 10에 도시된다.
LCA-내성 적정에서 발견된 이들 저형질은 세포 표면-노출된 α1-6-연결된 푸코오스에 형광-LCA(F-LCA) 결합의 분석에 의해 확증되었다. 분석된 각 세포주에 대하여, 대략 100,000개 세포를 트립신 처리하고, 1XPBS에서 세척하고, 2㎍/㎖ 플루오레세인-LCA(F-LCA)와 혼합하였다. 유세포분석법(Guava Technologies)으로 F-LCA 결합을 분석하였다. F-LCA 결합에 의해서 검사된 모든 저형질성 클론은 야생형보다 ~5배 적은 F-LCA 결합을 보였다; 800㎍/㎖ LCA에 내성인 모든 클론은 F-LCA에 결합하는 능력을 보이지 않았다. 야생형 CHO-KI 세포와 1개의 이와 같은 저형질성 클론의 착색은 도 11에 도시된다.
본 명세서에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 순전히 참조로서 본 발명에 편입된다.
명료한 이해를 위하여 예시와 실례의 방식으로 명세서가 다소간 상세하게 제공되긴 했지만, 본 발명의 사상 또는 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서 상기한 상세한 설명과 실시예는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR INACTIVATING ALPHA 1,6 FUCOSYLTRANSFERASE (FUT8) GENE EXPRESSION <130> 8325-0055.40 <140> PCT/US2008/008455 <141> 2008-07-10 <150> US 06/959,202 <151> 2007-07-12 <150> US 60/993,624 <151> 2007-09-13 <160> 66 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1890 <212> DNA <213> C. griseus <400> 1 aacagaaact tattttcctg tgtggctaac tagaaccaga gtacaatgtt tccaattctt 60 tgagctccga gaagacagaa gggagttgaa actctgaaaa tgcgggcatg gactggttcc 120 tggcgttgga ttatgctcat tctttttgcc tgggggacct tattgtttta tataggtggt 180 catttggttc gagataatga ccaccctgac cattctagca gagaactctc caagattctt 240 gcaaagctgg agcgcttaaa acaacaaaat gaagacttga ggagaatggc tgagtctctc 300 cgaataccag aaggccctat tgatcagggg acagctacag gaagagtccg tgttttagaa 360 gaacagcttg ttaaggccaa agaacagatt gaaaattaca agaaacaagc taggaatgat 420 ctgggaaagg atcatgaaat cttaaggagg aggattgaaa atggagctaa agagctctgg 480 ttttttctac aaagtgaatt gaagaaatta aagaaattag aaggaaacga actccaaaga 540 catgcagatg aaattctttt ggatttagga catcatgaaa ggtctatcat gacagatcta 600 tactacctca gtcaaacaga tggagcaggt gagtggcggg aaaaagaagc caaagatctg 660 acagagctgg tccagcggag aataacatat ctgcagaatc ccaaggactg cagcaaagcc 720 agaaagctgg tatgtaatat caacaaaggc tgtggctatg gatgtcaact ccatcatgtg 780 gtttactgct tcatgattgc ttatggcacc cagcgaacac tcatcttgga atctcagaat 840 tggcgctatg ctactggagg atgggagact gtgtttagac ctgtaagtga gacatgcaca 900 gacaggtctg gcctctccac tggacactgg tcaggtgaag tgaaggacaa aaatgttcaa 960 gtggtcgagc tccccattgt agacagcctc catcctcgtc ctccttactt acccttggct 1020 gtaccagaag accttgcaga tcgactcctg agagtccatg gtgatcctgc agtgtggtgg 1080 gtatcccagt ttgtcaaata cttgatccgt ccacaacctt ggctggaaag ggaaatagaa 1140 gaaaccacca agaagcttgg cttcaaacat ccagttattg gagtccatgt cagacgcact 1200 gacaaagtgg gaacagaagc agccttccat cccattgagg aatacatggt acacgttgaa 1260 gaacattttc agcttctcga acgcagaatg aaagtggata aaaaaagagt gtatctggcc 1320 actgatgacc cttctttgtt aaaggaggca aagacaaagt actccaatta tgaatttatt 1380 agtgataact ctatttcttg gtcagctgga ctacacaacc gatacacaga aaattcactt 1440 cggggcgtga tcctggatat acactttctc tcccaggctg acttccttgt gtgtactttt 1500 tcatcccagg tctgtagggt tgcttatgaa atcatgcaaa cactgcatcc tgatgcctct 1560 gcaaacttcc attctttaga tgacatctac tattttggag gccaaaatgc ccacaaccag 1620 attgcagttt atcctcacca acctcgaact aaagaggaaa tccccatgga acctggagat 1680 atcattggtg tggctggaaa ccattggaat ggttactcta aaggtgtcaa cagaaaacta 1740 ggaaaaacag gcctgtaccc ttcctacaaa gtccgagaga agatagaaac agtcaaatac 1800 cctacatatc ctgaagctga aaaatagaga tggagtgtaa gagattaaca acagaattta 1860 gttcagacca tctcagccaa gcagaagacc 1890 <210> 2 <211> 575 <212> PRT <213> C. griseus <400> 2 Met Arg Ala Trp Thr Gly Ser Trp Arg Trp Ile Met Leu Ile Leu Phe 1 5 10 15 Ala Trp Gly Thr Leu Leu Phe Tyr Ile Gly Gly His Leu Val Arg Asp 20 25 30 Asn Asp His Pro Asp His Ser Ser Arg Glu Leu Ser Lys Ile Leu Ala 35 40 45 Lys Leu Glu Arg Leu Lys Gln Gln Asn Glu Asp Leu Arg Arg Met Ala 50 55 60 Glu Ser Leu Arg Ile Pro Glu Gly Pro Ile Asp Gln Gly Thr Ala Thr 65 70 75 80 Gly Arg Val Arg Val Leu Glu Glu Gln Leu Val Lys Ala Lys Glu Gln 85 90 95 Ile Glu Asn Tyr Lys Lys Gln Ala Arg Asn Asp Leu Gly Lys Asp His 100 105 110 Glu Ile Leu Arg Arg Arg Ile Glu Asn Gly Ala Lys Glu Leu Trp Phe 115 120 125 Phe Leu Gln Ser Glu Leu Lys Lys Leu Lys Lys Leu Glu Gly Asn Glu 130 135 140 Leu Gln Arg His Ala Asp Glu Ile Leu Leu Asp Leu Gly His His Glu 145 150 155 160 Arg Ser Ile Met Thr Asp Leu Tyr Tyr Leu Ser Gln Thr Asp Gly Ala 165 170 175 Gly Glu Trp Arg Glu Lys Glu Ala Lys Asp Leu Thr Glu Leu Val Gln 180 185 190 Arg Arg Ile Thr Tyr Leu Gln Asn Pro Lys Asp Cys Ser Lys Ala Arg 195 200 205 Lys Leu Val Cys Asn Ile Asn Lys Gly Cys Gly Tyr Gly Cys Gln Leu 210 215 220 His His Val Val Tyr Cys Phe Met Ile Ala Tyr Gly Thr Gln Arg Thr 225 230 235 240 Leu Ile Leu Glu Ser Gln Asn Trp Arg Tyr Ala Thr Gly Gly Trp Glu 245 250 255 Thr Val Phe Arg Pro Val Ser Glu Thr Cys Thr Asp Arg Ser Gly Leu 260 265 270 Ser Thr Gly His Trp Ser Gly Glu Val Lys Asp Lys Asn Val 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ttatgaagct 480 ccttggtttt atttttatat ttcctattcc acaaatttct tcatctctta atctttatat 540 gtagagttgt tactgacccc tcttctaaat gttagaggta acgaaagtac atagtgaaac 600 cagaatatta aatagtgttc atctcctcag acttcattga aattcagtgt ggcacattct 660 ccctgcctca cttcatttgt atagaacaca cggaacaagt ccaatttcct gagagaaaca 720 gtgattaaga ggaatgtagg aaagaaaaga tgactgcata gttattcctg tggtcaaatc 780 cacaactgga ctatagtctg ggatgcaaag gaaacagtag catgaaggtg gcacagttac 840 cccagtgtgc tacagccctg actccagatt caagacataa ccctgtcttt ggcaacacta 900 agatgcagga gagtgctggg aagtcagtga cttggccatt gcaggtcagt gtaagtctgt 960 attccttgct ttataacatt gtgacttttc ttcaaaatga gaaaatgagg tctgtttctg 1020 tttgcagttg atagagaaaa aaaatgcaaa aaaagtctgt agtaacttca tgaacataaa 1080 ataaccaaca tctttaaaag gctagcttgt cttaaactac aggaaaagtt catatggatc 1140 tttgttttct tagatgactt taaattctat gaactgaagt ggtagtaact ttacagggta 1200 aaatgaaaga aaaaaattaa taaactttgg cataagaatg ttacaagcat tatctttaag 1260 ctttgaattc tgttatgatt ttggtctcaa aaaccaaaaa acttaaatct gttgattcca 1320 ggttcccata tattcttgga tatgccaatt actttttctg taagcaagtg tttcataaaa 1380 cttttactta actttcatat tgacctgtac tattcaacat tcagctatgt taaagtattt 1440 gtgaagtgtt ttgaaatgat tttatatttt ctaaggtgag aataaatgag aaaatgtttt 1500 aatatgtctc cagtgccccc atgactaggg atactaattg agtaccagta cattatcagt 1560 gtgctctcca cttctcccca gagtccatgt cagacgcact gacaaagtgg gaacagaagc 1620 agccttccat cccattgagg aatacatggt acacgttgaa gaacattttc agcttctcga 1680 acgcagaatg aaagtggata aaaaaagagt gtatctggcc actgatgacc cttctttgtt 1740 aaaggaggca aagacaaagt aagttagacc aacaagtggt tctgtatggg attatctctt 1800 agttgaagaa aatccttaat tctgggaact tgtggttctt gttgctaact aataggttcc 1860 aaaatcaaag actacatgtg caaatattaa tctaatcaag tcatacctta ctagctgtat 1920 ctgatgcaaa ttaagaagtc taaaatgaat tagactgctg atttgtgtag catcactagc 1980 agtcatcatt caacacagta ccacacttct tagtaccaaa atctgtttaa catactagag 2040 tttccataaa tcaaattttg tagcctgggg cttaagtaac agaagtttat gtctcacagt 2100 tctg 2104 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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Leu Ser Arg 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 29 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Ala 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 30 Arg Lys Asp Thr Arg Ile Thr 1 5 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 31 aacagaaact tattttcctg tgt 23 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 32 ggtcttctgc ttggctgaga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 33 cactttgtca gtgcgtctga 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 34 agtccatgtc agacgcactg 20 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 35 cagaactgtg agacataaac tg 22 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 36 Thr Gly Glu Lys Pro 1 5 <210> 37 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 37 Thr Gly Gly Gln Arg Pro 1 5 <210> 38 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 38 Thr Gly Gln Lys Pro 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 39 Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 <210> 40 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 40 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttaaagg aggcaaagac aaagtaagt 59 <210> 41 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 41 agagtgtatc tggccactga tgacccttta aggaggcaaa gacaaagtaa gt 52 <210> 42 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 42 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttataaa ggaggcaaag acaaagtaag 60 t 61 <210> 43 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 43 agagtgtatc tggccactga aagacaaagt aagt 34 <210> 44 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 44 agagtgtatc tggccactga tgaccgttaa aggaggcaaa gacaaagtaa gt 52 <210> 45 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 45 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttatgtt aaaggaggca aagacaaagt 60 aagt 64 <210> 46 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 46 agagtgtatc tggccactga tgacccttct tttgttaaag gaggcaaaga caaagtaagt 60 <210> 47 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 47 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttaaaggagg caaagacaaa gtaagt 56 <210> 48 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (50)..(52) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (56)..(56) <223> n is a, c, g, or t <400> 48 agagtgnatc tggccactga tgacccttct ttaaaggagg caaagacaan nnangn 56 <210> 49 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 49 agagtgtatc tggccactga tgagacaaag taagt 35 <210> 50 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 50 agagtgtatc tggccactga tgacccttct gttaaaggag gcaaagacaa agtaagt 57 <210> 51 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 51 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttaaggaggc aaagacaaag taagt 55 <210> 52 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (11)..(11) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (48)..(49) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (52)..(52) <223> n is a, c, g, or t <400> 52 agagtgtatc nggccactga tgacccttct ttaaaggagg caaagacnna gnaagt 56 <210> 53 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 53 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttaaaggagg caaagacaaa gtaagt 56 <210> 54 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 54 agagtgtatc tgagcaaaga caaagtaagt 30 <210> 55 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 55 agagtgtatc tggccactga aaggaggcaa agacaaagta agt 43 <210> 56 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 56 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttataaa ggaggcaaag acaaagtaag 60 t 61 <210> 57 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 57 agagtgtatc tggccactga tgacccttta aggaggcaaa gacaaagtaa gt 52 <210> 58 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 58 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttatggt aaaggaggca aagacaaagt 60 aagt 64 <210> 59 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 59 agagtgtatc tggccactga ttaaaggagg caaagacaaa gtaagt 46 <210> 60 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 60 agagtgtatc tggccactga tgacccttag taagt 35 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 61 agagtgtatc tggccactga t 21 <210> 62 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 62 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttatgtt aaaggaggca aagacaaagt 60 aagt 64 <210> 63 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 63 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttataaa ggaggcaaag acaaagtaag 60 t 61 <210> 64 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <220> <221> misc_feature <222> (42)..(42) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> (54)..(54) <223> n is a, c, g, or t <400> 64 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttaaaggagg cnaagacaga gtangt 56 <210> 65 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic peptide <400> 65 Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu 1 5 10 <210> 66 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide <400> 66 agagtgtatc tggccactga tgacccttct ttgttaaagg aggcaaagac aaagt 55

Claims (36)

  1. 뉴클레아제 도메인 및 Fut8 유전자 내의 서열을 표적화하는 징크핑거 DNA-결합 단백질을 포함하는 융합 단백질로서,
    상기 DNA-결합 단백질은 F1 내지 F4, F1 내지 F5 또는 F1 내지 F6로 명명되고 정렬되는 4개, 5개 또는 6개의 징크핑거를 포함하고, 각각의 징크핑거는 인식 나선 영역을 포함하고,
    상기 징크핑거 DNA-결합 단백질은 표 1의 단일 행에 나타난 순서와 서열의 인식 나선 영역을 포함하는 단백질로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질:
    [표 1]
    Figure 112014113073510-pct00015
    .
  2. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레아제 도메인은 적어도 하나의 절단 도메인 또는 적어도 하나의 절단 절반-도메인을 포함하는 융합 단백질.
  3. 제2항에 있어서, 상기 절단 절반-도메인은 야생형 FokI 절단 절반-도메인인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  4. 제2항에 있어서, 상기 절단 절반-도메인은 조작된 FokI 절단 절반-도메인인 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 중 어느 것을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 포함하는 분리된 세포.
  7. 제6항에 있어서, Fut8이 부분적으로 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  8. 제6항에 있어서, Fut8이 완전히 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  9. 제6항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  10. 제9항에 있어서, 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 글루타민 합성효소 (GS)가 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  11. 제5항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 분리된 세포.
  12. 제11항에 있어서, Fut8이 부분적으로 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  13. 제11항에 있어서, Fut8이 완전히 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  14. 제11항에 있어서, 하나 이상의 추가적인 유전자가 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  15. 제14항에 있어서, 디히드로폴레이트 환원효소(DHFR) 및 글루타민 합성효소 (GS)가 비활성화된 것을 특징으로 하는 세포.
  16. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나에 따른 융합 단백질에 의해서 Fut8이 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주.
  17. 세포에서 내인성 세포 FUT8 유전자를 비활성화시키는 방법으로서, (a) 제5항에 따른 제1 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 단계를 포함하며, 제1 폴리뉴클레오티드에 의해서 발현된 단백질은 표적 부위에 결합하고 FUT8 유전자를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17 항에 있어서, 제2 단백질을 인코딩하는 핵산을 도입하는 단계를 더 포함하며, 이때 제2 단백질은
    (i) FUT8 유전자 내의 제2 표적 부위에 결합하도록 조작된 징크핑거 DNA-결합 단백질; 및
    (ii) 절단 도메인
    을 포함하고; 따라서 제2 단백질이 세포에서 발현되고, 이로써 제1 단백질과 제2 단백질이 그들 각각의 표적 부위에 결합하여 FUT8 유전자를 절단하는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18 항에 있어서, 제1 및 제2 단백질은 동일한 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제18 항에 있어서, 제1 및 제2 단백질은 상이한 핵산에 의해 인코딩되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    (a) 내인성 FUT8 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제17항의 방법에 의해 숙주 세포의 내인성 FUT8 유전자를 비활성화시키는 단계; 및
    (c) 목적하는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 재조합 단백질을 생산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 목적하는 단백질은 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    (a) 내인성 FUT8 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제18항의 방법에 의해 숙주 세포의 내인성 FUT8 유전자를 비활성화시키는 단계; 및
    (c) 목적하는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 재조합 단백질을 생산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제23항에 있어서, 목적하는 단백질은 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    (a) 내인성 FUT8 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제19항의 방법에 의해 숙주 세포의 내인성 FUT8 유전자를 비활성화시키는 단계; 및
    (c) 목적하는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 재조합 단백질을 생산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 목적하는 단백질은 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 숙주 세포에서 목적하는 재조합 단백질을 생산하는 방법으로서,
    (a) 내인성 FUT8 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 제20항의 방법에 의해 숙주 세포의 내인성 FUT8 유전자를 비활성화시키는 단계; 및
    (c) 목적하는 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포 내로 도입하여 재조합 단백질을 생산하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 목적하는 단백질은 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. Fut8이 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주로서,
    (a) 제17항의 방법에 따라서 세포에서 Fut8을 비활성화시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 배양하는 단계
    에 의해서 생산된 것을 특징으로 하는 세포주.
  30. 제29항에 있어서, 세포는 COS 세포, CHO 세포, VERO 세포, MDCK 세포, WI38 세포, V79 세포, B14AF28-G3 세포, BHK 세포, HaK 세포, NS0 세포, SP2/0-Ag14 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, 및 perC6 세포로 구성된 군에서 선택된 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포주.
  31. Fut8이 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주로서,
    (a) 제18항의 방법에 따라서 세포에서 Fut8을 비활성화시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 배양하는 단계
    에 의해서 생산된 것을 특징으로 하는 세포주.
  32. 제31항에 있어서, 세포는 COS 세포, CHO 세포, VERO 세포, MDCK 세포, WI38 세포, V79 세포, B14AF28-G3 세포, BHK 세포, HaK 세포, NS0 세포, SP2/0-Ag14 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, 및 perC6 세포로 구성된 군에서 선택된 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포주.
  33. Fut8이 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주로서,
    (a) 제19항의 방법에 따라서 세포에서 Fut8을 비활성화시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 배양하는 단계
    에 의해서 생산된 것을 특징으로 하는 세포주.
  34. 제33항에 있어서, 세포는 COS 세포, CHO 세포, VERO 세포, MDCK 세포, WI38 세포, V79 세포, B14AF28-G3 세포, BHK 세포, HaK 세포, NS0 세포, SP2/0-Ag14 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, 및 perC6 세포로 구성된 군에서 선택된 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포주.
  35. Fut8이 부분적으로 또는 완전히 비활성화된 세포주로서,
    (a) 제20항의 방법에 따라서 세포에서 Fut8을 비활성화시키는 단계; 및
    (b) 상기 세포를 배양하는 단계
    에 의해서 생산된 것을 특징으로 하는 세포주.
  36. 제35항에 있어서, 세포는 COS 세포, CHO 세포, VERO 세포, MDCK 세포, WI38 세포, V79 세포, B14AF28-G3 세포, BHK 세포, HaK 세포, NS0 세포, SP2/0-Ag14 세포, HeLa 세포, HEK293 세포, 및 perC6 세포로 구성된 군에서 선택된 포유동물 세포인 것을 특징으로 하는 세포주.
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Families Citing this family (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101510778B1 (ko) † 2007-07-12 2015-04-10 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물
EP2282773B1 (en) * 2008-05-02 2014-01-15 Seattle Genetics, Inc. Methods and compositions for making antibodies and antibody derivatives with reduced core fucosylation
US9273296B2 (en) * 2008-09-08 2016-03-01 Cellectis Meganuclease variants cleaving a DNA target sequence from a glutamine synthetase gene and uses thereof
AU2009311697B2 (en) * 2008-10-29 2014-12-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression
WO2010127939A1 (en) * 2009-04-23 2010-11-11 Crucell Holland B.V. Recombinant human alpha1-antitrypsin
US10087236B2 (en) 2009-12-02 2018-10-02 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
US11377485B2 (en) 2009-12-02 2022-07-05 Academia Sinica Methods for modifying human antibodies by glycan engineering
FR2956122A1 (fr) * 2010-02-08 2011-08-12 Lfb Biotechnologies Utilisation d'un represseur d'un gene codant une enzyme possedant une activite glycosyltrasferase
US20120258496A1 (en) * 2010-09-27 2012-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Production of low fucose antibodies in h4-ii-e rat cells
CA2814143C (en) * 2010-10-12 2020-09-08 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions for treating hemophilia b
ES2668895T3 (es) 2011-03-16 2018-05-23 Amgen Inc. Variantes de Fc
AU2012283858C1 (en) 2011-07-20 2020-01-23 Zepteon, Incorporated Polypeptide separation methods
WO2013112595A2 (en) * 2012-01-23 2013-08-01 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for gene editing of a pathogen
RU2650819C2 (ru) 2012-05-07 2018-04-17 Сангамо Терапьютикс, Инк. Способы и композиции для опосредованной нуклеазой направленной интеграции трансгенов
WO2014004549A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Amgen Inc. Anti-mesothelin binding proteins
UA118090C2 (uk) 2012-09-07 2018-11-26 ДАУ АГРОСАЙЄНСІЗ ЕлЕлСі Спосіб інтегрування послідовності нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, у ген fad2 у клітині сої та специфічний для локусу fad2 білок, що зв'язується, здатний індукувати спрямований розрив
AU2014218621B2 (en) 2013-02-25 2019-11-07 Sangamo Therapeutics, Inc. Methods and compositions for enhancing nuclease-mediated gene disruption
US9670081B2 (en) 2013-03-15 2017-06-06 Food Safety Technology, Llc Method and systems for controlling microorganisms and turbidity in retort cooling water using an aqueous ozone solution
US11060083B2 (en) 2013-07-19 2021-07-13 Larix Bioscience Llc Methods and compositions for producing double allele knock outs
CN105392885B (zh) * 2013-07-19 2020-11-03 赖瑞克斯生物科技公司 用于产生双等位基因敲除的方法和组合物
CA2923579C (en) 2013-09-06 2023-09-05 Academia Sinica Human inkt cell activation using glycolipids with altered glycosyl groups
JP6606088B2 (ja) 2014-02-24 2019-11-13 サンガモ セラピューティクス， インコーポレイテッド ヌクレアーゼ媒介性標的化組み込みのための方法および組成物
EP3149037A4 (en) 2014-05-27 2018-01-10 Academia Sinica Anti-her2 glycoantibodies and uses thereof
KR20230033737A (ko) * 2014-05-27 2023-03-08 아카데미아 시니카 증진된 항체 효능을 위한 범용 당형태에 관한 조성물 및 방법
KR20220151036A (ko) 2014-05-27 2022-11-11 아카데미아 시니카 항-ｃｄ20 글리코항체 및 이의 용도
KR102494193B1 (ko) 2014-05-28 2023-01-31 아카데미아 시니카 항-ｔｎｆ-알파 글리코항체 및 이의 용도
US10077434B2 (en) 2014-07-30 2018-09-18 Zumutor Biologics Inc. Non-fucosylated protein and methods thereof
US10858671B2 (en) 2014-12-12 2020-12-08 University Of Copenhagen N-glycosylation
CN107760650B (zh) * 2016-08-22 2020-07-24 厦门大学 一种改造的cho细胞及其用途
CN109963946B (zh) * 2016-12-21 2023-04-11 上海津曼特生物科技有限公司 用于失活fut8基因的复合物和方法
CN107034234B (zh) * 2017-05-19 2018-04-10 四川丰讯科技发展有限公司 一种用于敲除cho细胞中fut8和dhfr两种基因的试剂盒
CN107881160A (zh) * 2017-08-11 2018-04-06 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种由基因组被编辑的cho宿主细胞产生的具有独特糖谱的重组抗体及其制备方法
WO2019105770A1 (en) 2017-11-28 2019-06-06 Danmarks Tekniske Universitet Glycosylation of proteins
JP7292377B2 (ja) * 2018-08-29 2023-06-16 ユナイテッド バイオファーマ インコーポレイテッド アフコシル化抗体およびその製造法
US20220033519A1 (en) * 2018-09-21 2022-02-03 National Research Council Of Canada Intrabodies for reducing fut8 activity
MX2021003543A (es) 2018-09-27 2021-06-23 Xilio Dev Inc Polipeptidos de citocinas enmascaradas.
GB202007578D0 (en) 2020-05-21 2020-07-08 Univ Oxford Innovation Ltd Hdr enhancers
US20230183751A1 (en) 2020-05-21 2023-06-15 Oxford Genetics Limited Hdr enhancers
WO2021234388A1 (en) 2020-05-21 2021-11-25 Oxford Genetics Limited Hdr enhancers
GB202007577D0 (en) 2020-05-21 2020-07-08 Oxford Genetics Ltd Hdr enhancers
AR126089A1 (es) 2021-06-07 2023-09-13 Amgen Inc Uso de fucosidasa para controlar el nivel de afucosilación de proteínas glucosiladas

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060039019A (ko) * 2003-08-08 2006-05-04 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 표적화된 절단과 재조합을 위한 방법 및 그 조성물

Family Cites Families (77)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4217344A (en) 1976-06-23 1980-08-12 L'oreal Compositions containing aqueous dispersions of lipid spheres
US4235871A (en) 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4186183A (en) 1978-03-29 1980-01-29 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Liposome carriers in chemotherapy of leishmaniasis
US4261975A (en) 1979-09-19 1981-04-14 Merck & Co., Inc. Viral liposome particle
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4501728A (en) 1983-01-06 1985-02-26 Technology Unlimited, Inc. Masking of liposomes from RES recognition
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5049386A (en) 1985-01-07 1991-09-17 Syntex (U.S.A.) Inc. N-ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)Alk-1-YL-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4946787A (en) 1985-01-07 1990-08-07 Syntex (U.S.A.) Inc. N-(ω,(ω-1)-dialkyloxy)- and N-(ω,(ω-1)-dialkenyloxy)-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US4774085A (en) 1985-07-09 1988-09-27 501 Board of Regents, Univ. of Texas Pharmaceutical administration systems containing a mixture of immunomodulators
US5422251A (en) 1986-11-26 1995-06-06 Princeton University Triple-stranded nucleic acids
US4837028A (en) 1986-12-24 1989-06-06 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5176996A (en) 1988-12-20 1993-01-05 Baylor College Of Medicine Method for making synthetic oligonucleotides which bind specifically to target sites on duplex DNA molecules, by forming a colinear triplex, the synthetic oligonucleotides and methods of use
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
WO1991017424A1 (en) 1990-05-03 1991-11-14 Vical, Inc. Intracellular delivery of biologically active substances by means of self-assembling lipid complexes
GB2276169A (en) 1990-07-05 1994-09-21 Celltech Ltd Antibodies specific for carcinoembryonic antigen
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5420032A (en) 1991-12-23 1995-05-30 Universitge Laval Homing endonuclease which originates from chlamydomonas eugametos and recognizes and cleaves a 15, 17 or 19 degenerate double stranded nucleotide sequence
US5356802A (en) * 1992-04-03 1994-10-18 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoites (FokI) restriction endonuclease
US5436150A (en) 1992-04-03 1995-07-25 The Johns Hopkins University Functional domains in flavobacterium okeanokoities (foki) restriction endonuclease
US5487994A (en) * 1992-04-03 1996-01-30 The Johns Hopkins University Insertion and deletion mutants of FokI restriction endonuclease
US5792632A (en) 1992-05-05 1998-08-11 Institut Pasteur Nucleotide sequence encoding the enzyme I-SceI and the uses thereof
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
US6242568B1 (en) * 1994-01-18 2001-06-05 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
US6140466A (en) * 1994-01-18 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger protein derivatives and methods therefor
CA2181548C (en) 1994-01-18 2009-11-03 Carlos F. Barbas, Iii Zinc finger protein derivatives and methods therefor
EP0752005B1 (en) 1994-03-23 2008-10-08 Ohio University Compacted nucleic acids and their delivery to cells
US5585245A (en) 1994-04-22 1996-12-17 California Institute Of Technology Ubiquitin-based split protein sensor
GB9824544D0 (en) 1998-11-09 1999-01-06 Medical Res Council Screening system
USRE45795E1 (en) * 1994-08-20 2015-11-10 Gendaq, Ltd. Binding proteins for recognition of DNA
US5789538A (en) 1995-02-03 1998-08-04 Massachusetts Institute Of Technology Zinc finger proteins with high affinity new DNA binding specificities
DE69736261T2 (de) † 1996-01-24 2007-06-06 Toyo Boseki K.K. Alpha-1-6-fucosyltransferasen
US5928638A (en) 1996-06-17 1999-07-27 Systemix, Inc. Methods for gene transfer
US5925523A (en) * 1996-08-23 1999-07-20 President & Fellows Of Harvard College Intraction trap assay, reagents and uses thereof
GB2338237B (en) 1997-02-18 2001-02-28 Actinova Ltd In vitro peptide or protein expression library
GB9703369D0 (en) 1997-02-18 1997-04-09 Lindqvist Bjorn H Process
US6342345B1 (en) 1997-04-02 2002-01-29 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Detection of molecular interactions by reporter subunit complementation
GB9710809D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
GB9710807D0 (en) 1997-05-23 1997-07-23 Medical Res Council Nucleic acid binding proteins
US6410248B1 (en) 1998-01-30 2002-06-25 Massachusetts Institute Of Technology General strategy for selecting high-affinity zinc finger proteins for diverse DNA target sites
AU746454B2 (en) 1998-03-02 2002-05-02 Massachusetts Institute Of Technology Poly zinc finger proteins with improved linkers
US6140081A (en) † 1998-10-16 2000-10-31 The Scripps Research Institute Zinc finger binding domains for GNN
US6599692B1 (en) 1999-09-14 2003-07-29 Sangamo Bioscience, Inc. Functional genomics using zinc finger proteins
US6453242B1 (en) 1999-01-12 2002-09-17 Sangamo Biosciences, Inc. Selection of sites for targeting by zinc finger proteins and methods of designing zinc finger proteins to bind to preselected sites
US6534261B1 (en) 1999-01-12 2003-03-18 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US7013219B2 (en) * 1999-01-12 2006-03-14 Sangamo Biosciences, Inc. Regulation of endogenous gene expression in cells using zinc finger proteins
US6794136B1 (en) * 2000-11-20 2004-09-21 Sangamo Biosciences, Inc. Iterative optimization in the design of binding proteins
ATE309536T1 (de) 1999-12-06 2005-11-15 Sangamo Biosciences Inc Methoden zur verwendung von randomisierten zinkfingerprotein-bibliotheken zur identifizierung von genfunktionen
WO2001059450A2 (en) 2000-02-08 2001-08-16 Sangamo Biosciences, Inc. Cells expressing zinc finger protein for drug discovery
US20020061512A1 (en) 2000-02-18 2002-05-23 Kim Jin-Soo Zinc finger domains and methods of identifying same
US20030044787A1 (en) 2000-05-16 2003-03-06 Joung J. Keith Methods and compositions for interaction trap assays
JP2002060786A (ja) 2000-08-23 2002-02-26 Kao Corp 硬質表面用殺菌防汚剤
CA2785941C (en) * 2000-10-06 2017-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
US6946292B2 (en) * 2000-10-06 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells producing antibody compositions with increased antibody dependent cytotoxic activity
EP1353941B1 (en) * 2001-01-22 2013-03-13 Sangamo BioSciences, Inc. Modified zinc finger binding proteins
GB0108491D0 (en) 2001-04-04 2001-05-23 Gendaq Ltd Engineering zinc fingers
US20040224385A1 (en) 2001-08-20 2004-11-11 Barbas Carlos F Zinc finger binding domains for cnn
CA2474486C (en) 2002-01-23 2013-05-14 The University Of Utah Research Foundation Targeted chromosomal mutagenesis using zinc finger nucleases
US20030232410A1 (en) 2002-03-21 2003-12-18 Monika Liljedahl Methods and compositions for using zinc finger endonucleases to enhance homologous recombination
JPWO2003085107A1 (ja) * 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 ゲノムが改変された細胞
EP2806025B1 (en) * 2002-09-05 2019-04-03 California Institute of Technology Use of zinc finger nucleases to stimulate gene targeting
US7888121B2 (en) † 2003-08-08 2011-02-15 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
US8409861B2 (en) 2003-08-08 2013-04-02 Sangamo Biosciences, Inc. Targeted deletion of cellular DNA sequences
WO2005035563A1 (ja) † 2003-10-09 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. アンチトロンビンⅲ組成物の製造方法
US7972854B2 (en) * 2004-02-05 2011-07-05 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for targeted cleavage and recombination
AU2005233550B2 (en) † 2004-04-08 2010-11-18 Sangamo Therapeutics, Inc. Treatment of neuropathic pain with zinc finger proteins
CA2561565C (en) † 2004-04-08 2013-11-26 Sangamo Biosciences, Inc. Methods for repression of phospholamban gene and modulating cardiac contractility
CA2579677A1 (en) * 2004-09-16 2006-03-30 Sangamo Biosciences, Inc. Compositions and methods for protein production
CA2599004C (en) † 2005-02-28 2015-05-26 Sangamo Biosciences, Inc. Anti-angiogenic methods and compositions
EP1888638A2 (en) * 2005-06-03 2008-02-20 Genentech, Inc. Method of producing antibodies with modified fucosylation level
KR101419729B1 (ko) * 2005-07-26 2014-07-17 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 외래 핵산 서열의 표적화된 통합 및 발현
US20080015164A1 (en) 2006-05-19 2008-01-17 Sangamo Biosciences, Inc. Methods and compositions for inactivation of dihydrofolate reductase
WO2007139898A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 Sangamo Biosciences, Inc. Variant foki cleavage half-domains
KR101510778B1 (ko) * 2007-07-12 2015-04-10 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 알파 1,6 당전이효소(ｆｕｔ8) 유전자 발현을 비활성화시키기 위한 방법 및 조성물
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20060039019A (ko) * 2003-08-08 2006-05-04 상가모 바이오사이언스 인코포레이티드 표적화된 절단과 재조합을 위한 방법 및 그 조성물

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Expert Opin. Biol. Ther., Vol. 6, No. 11, pp. 1161-1173 (2006.11.01.) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2527435B2 (en) 2021-10-13
US20090042250A1 (en) 2009-02-12
US20160194665A1 (en) 2016-07-07
AU2008275649A1 (en) 2009-01-15
US9890395B2 (en) 2018-02-13
US8772025B2 (en) 2014-07-08
EP2527435A9 (en) 2013-09-04
JP2015172081A (ja) 2015-10-01
AU2008275649B2 (en) 2013-09-05
CA2692453A1 (en) 2009-01-15
US9322036B2 (en) 2016-04-26
WO2009009086A2 (en) 2009-01-15
US7919313B2 (en) 2011-04-05
CN101883850A (zh) 2010-11-10
CN101883850B (zh) 2014-11-12
EP2527435A2 (en) 2012-11-28
EP2527435B1 (en) 2014-12-17
JP2010532995A (ja) 2010-10-21
US20110159541A1 (en) 2011-06-30
EP2527435A3 (en) 2013-02-13
WO2009009086A3 (en) 2009-08-27
KR20100052474A (ko) 2010-05-19
CA2692453C (en) 2018-01-09
EP2171052A2 (en) 2010-04-07
JP5770471B2 (ja) 2015-08-26
US20140273097A1 (en) 2014-09-18
EP2171052B1 (en) 2014-08-27

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