KR101673566B1 - 글루타민 신테타제 유전자 발현을 불활성화시키기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

글루타민 신테타제 유전자 발현을 불활성화시키기 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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Abstract

본원에는 아연 핑거 단백질 및 분해 도메인 또는 분해 반-도메인을 포함하는 융합 단백질을 사용하여 글루타민 신테타제(GS) 유전자를 불활성화시키는 방법 및 조성물이 기재되어 있다. 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드도 또한 상기 폴리뉴클레오타이드 및 융합 단백질을 포함하는 세포와 함께 제공된다.

Description

글루타민 신테타제 유전자 발현을 불활성화시키기 위한 방법 및 조성물{Methods and compositions for inactivating glutamine synthetase gene expression}
본 기재내용은 게놈 조작(genome engineering), 세포 배양, 세포주의 생성 및 단백질 생산 분야에 관한 것이다.
글루타민 신테타제(GS)는 아미노산 L-글루타민의 합성에 있어 중요한 효소이다[참조: Meister, A. in Glutamine Metabolism, Enzymology and Regulation (eds. J. Mora & R. Palacios) 1-40 (Academic Press, N.Y.; 1980)]. 따라서, GS-음성 세포주는 L-글루타민에 대해 영양요구성이다. GS는, 비록 GS-음성 CHO 세포주의 부재가 선택을 달성하기 위한 GS 억제제 메티오닌 설폭시민의 사용을 필요로한다고 해도, CHO 세포계 재조합 단백질 발현 시스템에서 선택 마커 유전자로서 흔히 사용된다[참조: Wurm et al. (2004) Nature Biotechnology 22: 1393-1398].
또한, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR, 5,6,7,8-테트라하이드로폴레이트:NADP+옥시도리덕타제)는 진핵 및 원핵 세포 둘다에서 필수적인 효소이며 티미딜레이트, 푸린 뉴클레오타이드, 글리신 및 메틸 화합물의 생합성에서 1개-탄소 단위의 필수적인 담체인, 테트라하이드로폴레이트로의 디하이드로폴레이트의 NADPH-의존적 환원을 촉매한다.
DHFR-결핍성 세포는 재조합 단백질의 생산을 위해 오랫동안 사용되어 왔다. DHFR-결핍성 세포는, DHFR이 예를 들면, 이식 유전자로서 세포에 제공되는 경우, 또는 폴레이트 대사에 포함된 특정 인자가 보충된 배지에서만 성장할 것이다. DHFR 이식유전자가 안정하게 통합된 세포는 세포를 보충되지 않은 배지에서 성장시킴으로써 선택할 수 있다. 또한, 외인성 서열은 단일 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 세포내로 도입시키는 경우 통상적으로 함께 통합된다. 따라서, DHFR 이식유전자가 또한 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 경우, 선택된 세포는 DHFR 및 목적 단백질 둘다를 발현할 것이다. 또한, 메토트렉세이트(MTX)와 같은 억제제에 대한 반응시, DHFR 유전자 카피 수가 증폭될 수 있다. 따라서, 외인성 DHFR과 함께 통합되는 목적 단백질을 암호화하는 서열은 세포를 증가하는 농도의 메토트렉세이트에 점진적으로 노출시킴으로써 증폭시켜, 목적한 재조합 단백질의 과발현을 초래할 수 있다. 그러나, 재조합 단백질 발현을 위한 DHFR-결핍성 세포 시스템의 광범위한 사용에도 불구하고, 현재 이용가능한 DHFR-결핍성 세포주는, 이들이 기원하는 모 DHFR-적격성 세포(competent cell)와 같이 잘 성장하지 않는다.
따라서, 단일 및 다수-유전자 녹아웃(knockout)을 갖는 포유동물 세포는 조사, 약물 발견, 및 세포계 치료제에서 수 많은 용도를 가지고 있다. 그러나, 연구자 특이적인 유전자의 표적화된 제거를 위한 통상의 방법은 동종 재조합 또는 유전자 표적화의 과정에 의존한다[참조: Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352; Vasquez et al. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:8403-8410; Rago et al. (2007) Nature Protocols 2:2734-2746; Kohli et al. (2004) Nucleic Acids Research 32, e3]. 정의된 이중대립유전자(biallelic) 녹아웃을 생성할 수 있지만, 많은 세포 유형의 경우 당해 기술은 너무 불충분하므로 통상의 적용을 위해 많은 노동이 드는 것으로 입증되었다[참조: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-622]. 표적화된 유전자 결실에 대한 이들 방법은 순차적인 동종 재조합 라운드 및 드믄 바람직한 현상-개개의 유전자위치에 대한 적용을 제한하기에 매우 힘든 과정을 분리하기 위한 약물 선택을 필요로 한다. 결과적으로, 다중 표적 유전자위치에서 변형된 포유동물 세포주를 생성하는 것이 크게 탐구되지 않았다.
아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nuclease: ZFN)는 표적화된 절단(cleavage) 및 유전자 불활성화에 사용되어 왔다[참조: 예를 들면, 미국 특허 공보 20030232410; 20050208489; 20050026157; 20050064474; 20060188987; 20060063231; 2008/0015164 및 미국 일련번호 12/218,035 및 국제 공보 WO 07/014275, 이의 기재내용은 모든 목적을 위해 전문이 참조로 인용된다]. 지정된 표적 서열 및 FokI[플라보박테리움 오케아노코이테스(Flavobacterium okeanokoites)로부터의 제한 엔도뉴클레아제]의 촉매 도메인에 대해 특이적인 조작된 아연-핑거 DNA 결합 도메인의 융합을 통해 형성된, ZFN은 선택된 게놈 주소에서 이본쇄 DNA 파괴(DSB)를 위치시킬 능력을 제공한다. 이러한 부위 특이적인 DSB의 제거는 공여체 DNA가 제공되는 경우 동종-지시된 보수 과정을 통해서 또는 비-동종 말단 결합(non-homologous end joining: NHEJ)을 통해 세포 자체의 DNA 보수 기구에 의해 수행된다[참조: 예를 들면, Urnov et al. (2005) Nature 435:646-651 (2005); Moehle et al. (2007) Proc Natl Acad Sci U S A 104:3055-3060 (2007); Bibikova, et al. (2001) Mol Cell Biol 21:289-297; Bibikova et al. (2003) Science 300:764; Porteus et al. (2005) Nature Biotechnology 23:967-973; Lombardo et al. (2007) Nature Biotechnology 25:1298-1306; Perez et al. (2008) Nature Biotechnology 26:808-816; Bibikova et al. (2002) Genetics 161:1169-1175; Lloyd et al. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102:2232-2237; Morton et al. (2006) Proc Natl Acad Sci U S A 103:16370-16375].
동종-지시된 보수 및 NHEJ 과정 둘다는 표적 유전자위치의 변형을 초래한다고 해도, NHEJ-기원한 시도는, 공여체 DNA 설계 및 합성에 대한 필요성이 여전히 높은 빈도의 파괴된 대립형질을 초래하며 NHEJ-매개된 DSB 보수의 오류-발생 특성은 ZFN을 암호화하는 DNA 작제물의 단순한 일시적인 형질감염에 이은 포유동물 세포에서 표적화된 유전자의 녹아웃을 달성하기 위해 이용될 수 있다는 것을 제거한다[참조: 예를 들면, Santiago et al. (2008) Proc Natl Acad Sci U S A 105:5809-5814]. ZFN 기술은 단일-세포 기원한 클론의 하나의 96-웰 플레이트보다 적은 스크리닝 노력으로부터 몇개의 독립된 녹아웃(knockout) 세포주를 분리하도록 한다. 공여체 DNA 또는 선택 방법이 사용되지 않으므로, 수득되는 단일-유전자 녹아웃 주(line)는 후속적인 유전적 변형을 위한 적합한 출발 세포주이다.
본원에는 GS 유전자의 부분적이거나 완전한 불활성화를 위한 조성물이 기재되어 있다. 또한, 본원에는 예를 들면, 세포내에서 GS를 불활성화시켜 GS 유전자가 불활성화된 세포주를 생산하기 위한 이들 조성물(시약)의 제조 및 사용 방법이 기재되어 있다. GS 파괴된 세포주는 예를 들면, 재조합 단백질의 생산시 유용하다.
하나의 측면에서, GS 유전자내에서 결합하도록 조작된 아연 핑거 단백질이 제공된다. 본원에 기술된 아연 핑거 단백질 중의 어느 것도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 아연 핑거를 포함할 수 있으며, 각각의 아연 핑거는 GS 유전자내 표적 소부위에 결합하는 인지 나선을 갖는다. 특정 양태에서, 아연 핑거 단백질은 4, 5 또는 6개 핑거(여기서, 개개의 아연 핑거는 F1, F2, F3, F4, F5 및 F6로 지정되어 있다)를 포함하며 표 1에 나타낸 인지 나선의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, DHFR 유전자내에서 결합하도록 조작된, 아연 핑거 단백질이 제공된다. 본원에 기술된 아연 핑거 단백질 중의 어느 것도 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 아연 핑거를 포함할 수 있으며, 각각의 아연 핑거는 DHFR 유전자내에서 표적 소부위에 결합하는 인지 나선을 갖는다. 특정 양태에서, 아연 핑거 단백질은 4, 5 또는 6개 핑거(여기서, 개개의 아연 핑거는 F1, F2, F3, F4, F5 및 F6로 지정되어 있다)를 포함하고 표 2에 나타낸 인지 나선의 아미노산 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 특정의 본원에 기술된 아연 핑거 단백질 및 적어도 하나의 분해 도메인 또는 적어도 하나의 분해 반-도메인(cleavage half-domain)을 포함하는 융합 단백질이 또한 제공된다. 특정 양태에서, 분해 반-도메인은 야생형 FokI 분해 반-도메인이다. 다른 양태에서, 분해 반-도메인은 조작된 FokI 분해 반-도메인이다.
여전히 다른 측면에서, 특정의 본원에 기술된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다.
여전히 다른 측면에서, 특정의 본원에 기술된 바와 같은 단백질 및/또는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 세포가 제공된다. 특정 양태에서, GS는 세포내에서 부분적으로 또는 완전히 불활성화되어 있다. 본원에 기술된 세포중 어느 것도 예를 들면 선택된 유전자내 표적 부위에 결합하도록 설계된 아연 핑거 뉴클레아제를 사용하여 불활성화시킨 추가의 유전자를 포함할 수 있다. 특정 양태에서, FUT8, 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR) 및 글루타민 신테타제(GS)가 불활성화된 세포 또는 세포주가 제공된다.
또한, 세포 또는 세포주내에서 GS를 불활성화시키는 방법에서 아연 핑거 단백질 및 이의 융합체를 사용하는 방법이 제공된다.
따라서, 다른 측면에서, (a) 제1 폴리펩타이드(여기서, 제1 폴리펩타이드는 (i) 내인성 GS 유전자내 제1 표적 부위에 결합하도록 조작된 아연 핑거 DNA 결합 도메인; 및 (ii) 분해 도메인을 포함한다)를 암호화하는 제1 핵산을 세포내로 도입시켜 폴리펩타이드가 세포내에서 발현되도록 함으로써, 폴리펩타이드가 표적 부위에 결합하여 GS 유전자를 분해하는 것을 포함하는, 세포내에서 세포 GS 유전자(예를 들면, 내인성 GS 유전자)를 불활성화시키는 방법이 제공된다. 특정 양태에서, 당해 방법은 제2 폴리펩타이드(여기서, 제2 폴리펩타이드는 (i) GS 유전자내 제2 표적 부위에 결합하도록 조작된 아연 핑거 DNA 결합 도메인; 및 (ii) 분해 도메인을 포함한다)를 암호화하는 핵산을 도입함으로써, 제2 폴리펩타이드가 세포내에서 발현되도록 하여, 제1 및 제2 폴리펩타이드가 이들 각각의 표적 부위에 결합하여 GS 유전자를 분해하도록 하는 것을 추가로 포함한다. 제1 및 제2 폴리펩타이드는 제1 핵산에 의해 또는 상이한 핵산에 의해 암호화될 수 있다. 특정 양태에서, 하나 이상의 추가의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드, 예를 들면, 추가의 아연 핑거 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 세포내로 도입된다.
여전히 다른 측면에서, 본 기재내용은 (a) 내인성 GS 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계; (b) 숙주 세포의 내인성 GS 유전자를 본원에 기술된 특정의 방법으로 불활성화시키는 단계; 및 (c) 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입시켜, 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 숙주 세포내에서 목적한 재조합 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 목적 단백질은 항체, 예를 들면, 모노클로날 항체를 포함한다.
본원에 기술된 세포 및 방법 중 어느 것에서도, 세포 및 세포주는 예를 들면, COS, CHO(예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), NIH3T3, perC6, 스포도프테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda)(Sf)와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)와 같은 진균 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
도 1, 패널 A 내지 E는 CHO 세포에서 글루타민 신타제 유전자의 ZFN-매개된 파괴 및 단일 녹아웃 GS -/- 세포주의 생성을 나타낸다. 도 1a는 7개의 엑손을 함유하는 활성적으로 전사된 GS 유전자를 묘사하는 개략도이다. 출발 코돈 ATG는 엑손 2에 위치한다. 도 1a는 또한, ZFN 쌍 ZFN9372/ZFN9075에 대한 표적 서열이 나타낸 바와 같이 엑손 6내에 위치하며, ZFN 쌍 8361/8365의 표적 서열이 엑손 2에 위치함을 나타낸다. 엑손 6에 대해 표적화된 추가의 ZFN(9076, 9179, 7858, 7889, 9373)이 또한 나타나 있다. 도 1b는 SurveyorTM 뉴클레아제 검정에 의해 측정된 것으로서, 야생형 또는 CHO-K1 세포(좌측 패널) 또는 CHO-S 세포(우측 패널)내 Fok I의 촉매적 도메인의 절대 이종이합체 EL/KK 변이체에 연결된 ZFN 쌍 9372/9075를 사용한 내인성 CHO GS 유전자의 ZFN-매개된 파괴를 나타내는 겔이다. 도 1c는 외인성으로 가해진 L-글루타민의 부재하에서 세포주의 성장 특징과 함께 나타낸 세포주에 대한 표적 GS 유전자위치의 예시적인 DNA 서열을 나타낸다("L-Glu 성장": "+": 야생형 CHO로부터 구별가능하지 않은 L-글루타민의 부재하에서의 성장; "-": L-글루타민의 부재하에서의 비 성장). ZFN 표적 서열은 밑줄쳐져 있다. 단백질 해독은 야생형 서열 아래에 나타낸다. 대문자는 엑손 서열을 나타내며, 소문자는 인트론 서열을 나타내고, '-'는 결실을 나타내며, 굵은 문자는 삽입을 나타낸다. 도 1d는 항-GS 모노클로날 항체(상부 패널)을 사용하여 선택된 CHO-S(좌측 패널) 및 CHO-K1(우측 패널) 세포주의 웨스턴 블롯 분석을 묘사한다. 로딩 대조군으로서, 블롯을 항-DHFR 항체(하부 패널)로 재-프로브하였다. 도 1b는 대략 3개월의 기간 동안 성장한 선택된 CHO-K1 GS -/- 세포 주의 성장 및 생존능을 묘사하는 그래프를 나타낸다. 이들 세포주의 생존능(그래프의 상단의 매끈한 선) 및 생존 세포 밀도(들쭉날쭉한 선)는 초기 3개월 기간에 이어 30일 기간 동안 나타내며, 여기서, 세포는 L-글루타민-보충된 배지 속에서 성장되며, 세포를 매 2 내지 3일마다 나누었다. L-글루타민은 화살표로 나타낸 시기에 제거하였다.
도 2, 패널 A 내지 F는 CHO 세포내에서 DHFR 유전자의 ZFN-매개된 파괴 및 이중 녹아웃 DHFR-/-GS-/- 세포주의 생성을 묘사한다. 도 2a는 CHO 세포에서 DHFR 유전자의 게놈 조직화 및 ZFN 쌍 9461/7844(엑손 1 내, 참조: 미국 특허원 20080015164) 및 9476/9477(엑손 1 ZFN 9461/7844 분해 부위의 240-bp 3'에 위치한 인트론 1내)에 대한 표적 부위의 위치를 나타낸다. 도 2b는 SurveyorTM 뉴클레아제 검정을 사용하여 측정한 것으로서, ZFN 쌍 9461/7844 (좌측 패널) 및 ZFN 쌍 9476/9477(우측 패널)을 사용한 유전자 변형의 수준을 묘사한다. 도 2c는 DHFR 유전자위치내 대략 240bp의 결실(레인 7에서 작은 화살표)을 초래하는, ZFN 쌍 둘다를 암호화하는 플라스미드의 동시 형질감염 후 2일째에 GS -/- 클론 B3 게놈 DNA의 PCR 분석을 묘사한다. 대조군으로 제공된 것은 엠티 벡터(empty vector)(레인 1), GFP 대조군 벡터(레인 2), 엑손 ZFN 쌍 만(ZFN9461/ZFN7844, 레인 3), 인트론 ZFN 쌍 만(ZFN9476/ZFN9477, 레인 4), 결실에 대해 "내부" ZFN(ZFN7844 및 ZFN9477, 레인5), 및 결실에 대해 "외부" ZFN(ZFN9461 및 ZFN9476, 레인 6)으로 형질감염된 세포였다. 도 2d는 단일-세포주의 DHFR 유전형 분석의 결과를 묘사한다. 동종접합성 클론의 경우, 대립형질 둘다에 대한 일반적인 서열이 나타나 있다. 화합물 이종접합 클론의 경우, 각각의 유일한 대립형질의 서열이 나타나 있다. 도 2e는 상기 각각의 레인에 나타낸 세포주로부터의 전체 세포 분해물의 나타낸 항체(DHFR, GS 및 β-튜불린)을 사용한 웨스턴 블롯 분석을 묘사한다. 세포주 1F1.6 및 2B12.8(DHFR / GS 녹아웃)은 모 GS -/- 세포주 B3, 야생형 CHO Cell(WT), 및 DHFR-결핍성 CHO 세포주 DG44[참조: Urlab et al. (1983) 세포 33:405-412]가 대조군으로서 제공되는 동안 분석하였다. 도 2f는 1F1.6 및 2B12.8 세포주 및 하이폭산틴, 티미딘 및 글루타민이 외인성으로 제공된 이들 세포주의 독립성을 묘사한다.
도 3, 패널 A 내지 D는 CHO 세포내 FUT8 유전자의 ZFN-매개된 파괴 및 3중 녹아웃 FUT8 -/- DHFR -/- GS -/- 세포주의 생성을 나타낸다. 도 3a는 엑손 10에 위치하는 FUT8 Fut 모티프 II를 암호화하는 중요하고 고도로 보존된 영역에 대해 표적화된 ZFN을 묘사하는 개략도이다(참조: 미국 특허원 12/218,0135). 도 3b는 SurveyorTM 뉴클레아제 검정을 사용하여 측정된 것으로서, DHFR -/- GS -/- 클론 1F1.6내로 ZFN 쌍 12176/12172의 일시적인 형질감염 후 2일째에 유전자 변형 수준을 묘사한다. 도 3c는 FACS 분석에 의한 삼중-KO 클론 35F2 및 14C1(패널의 좌측 라인)의 형광성-LCA 결합 활성을 묘사한다. F-LCA 염색된 야생형 CHO-S 세포(패널의 우측 라인)은 양성 대조군으로서 제공되고, 염색되지 않은 세포(점선)은 음성 대조군으로 제공되었다. 도 3d는, 나타낸 서열이 둘다 대립형질에 대한 것인 FUT8 유전자위치에서 삼중 녹아웃 세포주 35F2 및 14C1의 유전형(대립형질 둘다에 대해)을 나타낸다. 대문자는 엑손 10 서열을 나타내고, 소문자는 인트론 서열을 나타내며, 이탤릭 문자는 Fut 모티프 II 서열을 나타내고, 굵은 문자는 서열 삽입체를 나타내며, '-'는 결실을 나타낸다. 단백질 해독은 또한 야생형 서열 아래에 나타낸다. 밑줄은 ZFN 결합 부위를 나타낸다.
도 4, 패널 A 내지 C는 예시적인 ZFN 설계 및 CHO GS 유전자내 이의 표적 부위를 묘사한다. 도 4a는 CHO 세포내 작용적 인트론-함유 글루타민 신테타제 유전자의 개략적인 대표도이다. 이는 7개의 엑손을 함유하며, 출발 코돈 ATG는 엑손 2에 위치하고, 엑손 6에 위치하는, ZFN 쌍 ZFN9372/ZFN9075의 표적 서열이 또한 나타나 있다. 엑손 6 주변의 목적 영역의 뉴클레오타이드 서열이 나타나 있다. 대문자는 엑손 6 서열을 나타내고, 소문자는 인트론 서열을 나타낸다. ZFN9372 및 ZFN9075의 표적 서열은 밑줄그어져 있다. 도 4b는 이들의 이본쇄 표적 서열(밑줄)에 대한 ZFN9372 및 ZFN9075의 개략적인 대표도이다. 도 4c는 ZFN9372 및 ZFN9075의 표적 서열 및 아연-핑거 설계를 묘사한다. 코어 DNA 표적 서열(대문자) 및 2개의 플랭킹 염기(소문자)가 나타나 있다. ZFN9075은 4개의 아연-핑거 DNA 결합 도메인을 함유하고, ZFN9372은 6개의 아연-핑거 도메인을 함유한다. 나타낸 표적 DNA 삼본체에 대한 아연-핑거 DNA 결합 도메인 각각의 인지 α-나선의 '-1' 내지 '+6'번 위치에서의 아미노산 잔기가 나타나 있다.
도 5는 ZFN 형질감염된 세포로부터 게놈 GS 유전자위치의 서열분석의 예시적인 결과를 나타낸다. "C"는 수(나타낸 서열이 관측된 횟수)를 말하고 "G"는 유전형을 말한다. ZFN 표적 서열은 밑줄쳐져 있다. 대문자는 서열 삽입을 나타내고, '-'는 결실을 나타낸다.
도 6은 동종접합 GS -/- 세포주(클론 B3)의 L-글루타민-의존성 성장을 묘사하는 그래프이다. L-글루타민의 존재하에서, CHO-S GS -/- 클론 B3(삼각형) 및 야생형 CHO-S(다이아몬드 모양)이 성장한다. 외인성 L-글루타민의 부재하에서, 클론 B3(원형)은 성장을 멈추고 모든 세포가 4일내 사멸한 반면, 야생형 CHO 세포(사각형)는 감소된 비율로 성장을 지속하였다.
도 7, 패널 A 내지 C는 예시적인 ZFN 설계 및 CHO DHFR 유전자에서 이들의 표적 부위를 묘사한다. 도 7a는 CHO 세포내에서 나타낸 ZFN 쌍에 의해 표적화된 DHFR 영역의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 대문자는 엑손 서열을 나타내고, 소문자는 인트론 서열을 나타낸다. 도 7b는, ZFN이 이들의 이본쇄 표적 서열(밑줄)에 결합하는 경우 DHFR을 표적화하는 ZFN의 개략적인 대표도이다. "내부" 표적 서열로 표지된 2개의 ZFN은 결실될 영역에 대해 내부에 있는 반면, "외부" 표적서열로 표지된 2개의 ZFN은 예측된 결실 접합부의 외부에 있다. 도 7c는 CHO DHFR 유전자를 표적화하는 예시적인 ZFN의 표적 서열 및 아연-핑거 설계를 나타낸다. 코어 DNA 표적 서열(대문자) 및 2개의 플랭킹 염기(소문자)가 나타나 있다. 모든 ZFN은 4개의 아연-핑거 DNA 결합 도메인을 함유한다. 나타낸 표적 DNA 삼본체에 대한 아연-핑거 DNA 결합 도메인 각각에 대한 인지 α-나선의 '-1' 내지 '+6'번 위치에서의 아미노산 잔기가 나타나 있다.
도 8은 ZFN 형질감염된 세포로부터의 게놈성 DHFR 유전자위치의 서열분석의 예시적인 결과를 나타낸다. "C"는 수(나타낸 서열이 관측된 횟수)를 말하고 "G"는 유전형을 말한다. ZFN 표적 서열은 밑줄쳐져 있다. 대문자는 서열 삽입을 나타내고, '-'는 결실을 나타낸다. 대문자는 서열 삽입을 나타낸다. 이탤릭 문자는 서열 변화를 나타낸다. 대문자는 엑손 서열을 나타내고, 소문자는 인트론 서열을 나타낸다.
도 9, 패널 A 내지 C는 CHO FUT8 유전자에 대해 표적화된 ZFN 표적 부위 및 핑거 설계를 묘사한다. 도 9a는 FUT8 유전자의 엑손 10내 ZFN 결합 부위의 개략도 및 엑손 10내 표적 영역의 뉴클레오타이드 서열을 묘사한다. 대문자는 엑손 10 서열을 나타내고, 소문자는 인트론 서열을 나타낸다. ZFN12176 및 ZFN12172의 표적 서열은 밑줄쳐져 있다. 푸코실트랜스퍼라제 모티프 II를 포함하는 뉴클레오타이드는 이탤릭체로 나타낸다. 도 9b는 이들의 이본쇄 표적 서열(밑줄쳐짐)에 대한 ZFN12176 및 ZFN12172 결합의 개략적인 대표도이다. 도 9c는 ZFN12176 및 ZFN12172의 표적 서열 및 아연-핑거 설계를 묘사한다. 코어 DNA 표적 서열(대문자) 및 2개의 플랭킹 염기(소문자)가 나타나 있다. ZFN12176은 5개의 아연-핑거 DNA 결합 도메인을 함유하고, ZFN12172는 6개의 아연-핑거 도메인을 함유한다. 나타낸 표적 DNA 삼본체에 대한 아연-핑거 DNA 결합 도메인 각각에 대한 인지 α-나선의 '-1' 내지 '+6' 번 위치에서의 아미노산 잔기가 나타나 있다.
도 10, 패널 A 내지 C는 CCR5, GR 및 AAVS1 유전자위치의 ZFN 표적화를 나타낸다. 도 10a는 C-C 케모카인 수용체 5(CCR5), 글루코코르티코이드 수용체(GR) 및 아데노 관련 바이러스 통합 부위(AAVS1) 유전자위치 각각에서 ZFN 표적화 부위의 위치를 나타내는 개략도이다. 도 10b는 SurveyorTM 뉴클레아제 검정에 의해 측정된 것으로서, 야생형, ZFN-Fok I(wt) 또는 K562 세포내로 Fok의 촉매적 도메인의 절대 이종이합체 EL/KK 변이체, ZFN-Fok I(EL/KK)에 연결된 ZFN의 쌍의 일시적인 공-형질감염 후 20일째에 측정한 것으로서 CCR5(좌측 패널), GR(중간 패널), 및 AAVS1(우측 패널) 유전자위치의 ZFN-매개된 동시 파괴를 묘사한다. 각각의 래인에 대한 처리는 다음과 같다: 레인 1, CCR5 ZFN-FokI (wt); 레인 2, GR ZFN-Fok I(wt); 레인 3, AAVS1 ZFN-Fok I(wt); 레인 4, CCR5 ZFN-Fok I(EL/KK); 레인 5, GR ZFN-Fok I(EL/KK); 레인 6, AAVS1 ZFN-Fok I(EL/KK); 레인 7, CCR5 ZFN-FokI(wt) + GR ZFN-FokI(wt) + AAVS1 ZFN-FokI(wt); 레인 8, CCR5 ZFN-FokI(EL/KK) + GR ZFN-FokI(EL/KK) + AAVS1 ZFN-FokI(EL/KK). 도 10c는 단일의 삼중 녹아웃 클론의 유전형을 묘사하며, 여기서, 나타낸 세포주에 대한 표적 CCR5, GR, AAVS1 유전자위치가 나타나 있다. ZFN 표적 서열은 밑줄쳐져 있고, '-'는 결실을 나타내며, 굵은 문자는 삽입을 나타낸다.
도 11, 패널 A 및 B는 나타낸 종을 사용하여 본원에 측정된 것으로서 CHO GS 게놈 서열의 서열 정렬을 나타낸다. 도 11a는 엑손 2 서열의 정렬을 나타낸다. ZFN8361 및 ZFN8365에 대한 표적 부위는 밑줄쳐져 있다. 도 11b는 엑손 6 서열의 정렬을 나타낸다. ZFN9075 및 ZFN9372에 대한 표적 부위는 밑줄쳐져 있다.
도 12, 패널 A 내지 D는 사람 및 마우스 세포에서 ZFN-매개된 파괴를 나타낸다. 도 12a 및 b는 CHO GS(도 12a)의 엑손 2 및 CHO GS의 엑손 6(도 12b)에 대해 표적화된 ZFN에 의해 매개된 사람 K562에서 GS의 파괴를 나타낸다. 도 12c 및 d는 CHO GS(도 12c)의 엑손 2 및 CHO GS(도 12d)의 엑손 6에 표적화된 ZFN에 의해 매개된 마우스 Neuro2a 세포에서 GS의 파괴를 나타낸다.
도 13, 패널 A 내지 C는 CHO GS 유전자위치(서열 번호: 55)의 완전한 게놈 서열을 나타낸다.
도 14, 패널 A 내지 C는 HEK293 세포에서 GS 특이적인 유전자 표적화의 결과를 나타낸다. 도 14a는 GFP 공여체 분자(표지된 GFP)를 사용하여 형질감염시킨 세포와 비교하여 GS 특이적인 ZFN(표지된 GS)를 사용하여 처리한 세포에서 NHEJ 활성의 퍼센트를 묘사한다. 도 14b는 GS 특이적인 ZFN으로 처리한 세포의 혼주물로부터 기원한 2개 클론, g17 및 g52가 웨스턴 블롯에 의해 검정한 것으로서 GS를 발현하지 않음을 나타낸다. 도 14c는 GS 녹아웃 클론의 7일을 초과하는 성장을 나타내는 그래프이며 성장을 위한 글루타민 보충의 필요성을 입증하고 있다.
발명의 상세한 설명
본원에는 GS 유전자의 부분적이거나 완전한 불활성화를 위한 조성물 및 방법이 기술되어 있다. 또한, 예를 들면, 표적 세포내에서 GS 유전자를 불활성화시키기 위한 이들 조성물의 제조 및 사용 방법이 기재되어 있다. 표적 세포내에서 GS 단독 또는 DHFR 및 FUT8와 같은 다른 유전자와 조합된 GS의 불활성화를 사용하여 재조합 단백질, 예를 들면, 증가된 항체-의존성 세포 세포독성(ADCC)을 유발하는 모노클로날 항체의 발현을 위한 세포주를 생산할 수 있다.
개론
본원에 기재된 방법의 실시, 및 조성물의 제조 및 사용은 달리 나타내지 않는 한, 당해 분야의 기술내에 있는 것으로 분자생물학, 생화학, 크로마틴 구조 및 분석, 컴퓨터처리된 화학, 세포 배양, 재조합체 DNA 및 관련 분야에서의 통상의 기술을 사용한다. 이들 기술들은 문헌에 완전히 설명되어 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin"(P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols"(P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999].
정의
용어" 핵산", "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"는 상호교환적으로 사용되며 선형 또는 환형 구조 및 일본쇄 또는 이본쇄 형태의 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드 중합체를 말한다. 본 기재내용의 목적을 위해, 이들 용어들은 중합체의 길이와 관련하여 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다. 용어들은 천연 뉴클레오타이드, 및 염기, 당 및/또는 포스페이트 잔기(예를 들면, 포스포로티오에이트 골격)내에서 변형된 뉴클레오타이드의 공지된 유사체를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특수 뉴클레오타이드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 가지며, 즉, A의 유사체는 T와 염기-쌍을 이룰 것이다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다. 당해 용어는 또한, 하나 이상의 아미노산이 화학적 유사체이거나 상응하는 천연적으로 존재하는 아미노산의 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 적용된다.
"결합"은 거대분자사이(예를 들면, 단백질과 핵산사이)에 서열 특이적인, 비-공유 상호작용을 말한다. 전적으로 상호작용이 서열 특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분들이 서열-특이적일(예를 들면, DNA 골격내 포스페이트 잔기와 접촉할) 필요는 없다. 이러한 상호작용은 일반적으로 10-6　M-1 이하의 해리 상수(Kd)에 의해 일반적으로 특징화된다. "친화성"는 결합 강도: 보다 낮은 Kd와 비교하여 증가된 결합 친화성을 말한다.
"결합 단백질"은 다른 분자에 비-공유적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은 예를 들면, DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우에, 이는 자체에 결합하여 동종이합체, 동종삼합체 등을 형성할 수 있고/있거나 이는 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 하나 이상의 결합 활성 유형을 가질 수 있다. 예를 들면, 아연 핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 갖는다.
"아연 핑거 DNA 결합 단백질"(또는 결합 도메인)은, 이의 구조가 아연 이온의 배위를 통해 안정화된 결합 도메인내 아미노산 서열의 영역인, 하나 이상의 아연 핑거를 통해 서열 특이적인 방식으로 DNA에 결합하는, 보다 큰 단백질내 도메인 또는 단백질이다. 용어 아연 핑거 DNA 결합 단백질은 흔히 아연 핑거 단백질 또는 ZFP로 약칭된다.
아연 핑거 결합 도메인은 "조작"되어 예측된 뉴클레오타이드 서열에 결합할 수 있다. 아연 핑거 단백질을 조작하기 위한 방법의 비-제한적 예는 설계 및 선택이다. 설계된 아연 핑거 단백질은 이의 설계/조성이 원칙적으로 합리적인 범주로부터 생성되는 천연적으로 존재하지 않는 단백질이다. 설계를 위한 합리적인 범주는 치환 규칙 및 존재하는 ZFP 설계 및 결합 데이타의 데이타베이스 분류 정보에서 프로세싱 정보에 대해 컴퓨터처리한 알고리즘의 적용을 포함한다[참조: 예를 들면, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 및 6,534,261; 또한 WO　98/53058; WO　98/53059; WO　98/53060; WO　02/016536 및 WO　03/016496 참조].
"선택된" 아연 핑거 단백질은, 이의 생산이 주로 파아지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 실험 과정으로부터 초래되는 천연에서 발견되지 않는 단백질이다[참조: 예를 들면, US　5,789,538; US 5,925,523; US　6,007,988; US　6,013,453; US 6,200,759; WO　95/19431; WO　96/06166; WO　98/53057; WO　98/54311; WO　00/27878; WO　01/60970; WO　01/88197 및 WO　02/099084].
용어 "서열"은 DNA 또는 RNA일 수 있고, 선형, 환형 또는 측쇄일 수 있으며 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있는 특정 길이의 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 용어 "공여체 서열"은 게놈내로 삽입된 뉴클레오타이드 서열을 말한다. 공여체 서열은 예를 들면, 길이가 2 내지 10,000개 뉴클레오타이드(또는 이들 사이 또는 이들을 초과하는 특정 정수 값), 바람직하게는 약 100 내지 1,000개 뉴클레오타이드(또는 이들 사이의 특정 정수 값), 보다 바람직하게는 약 200 내지 500개 뉴클레오타이드일 수 있다.
"동종의, 동일하지 않은 서열"은 제2 서열과 서열 동종성 정도를 공유하지만, 이의 서열이 제2 서열과는 동일하지 않은 제1 서열을 말한다. 예를 들면, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드는 동종이며 돌연변이체 유전자의 서열과는 동일하지 않다. 특정 양태에서, 2개 서열간의 동종성 정도는 정상적인 세포 메카니즘을 이용하여 이들 사이에서 동종 재조합을 허용하기에 충분하다. 2개의 동종의 동일하지 않은 서열은 특정 길이일 수 있으며 이들의 비-동종성 정도는 단일 뉴클레오타이드와 같이 작거나(예를 들면, 표적화된 동종 재조합에 의한 게놈성 점 돌연변이의 교정의 경우) 10 킬로염기 이상으로 클 수 있다(예를 들면, 염색체내 예정된 외부 부위에서 유전자의 삽입의 경우). 동종의 동일하지 않은 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오타이드는 동일한 길이일 필요가 없다. 예를 들어, 20개 내지 10,000개의 뉴클레오타이드의 외인성 폴리뉴클레오타이드(즉, 공여체 폴리뉴클레오타이드) 또는 뉴클레오타이드 쌍이 사용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동질성을 측정하는 기술은 당해 분야에 공지되어 있다. 통상적으로, 이러한 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오타이드 서열을 측정하고/하거나 이에 의해 암호화된 아미노산 서열을 측정하고, 이들 서열을 제2 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열을 또한 측정하여 이러한 양식으로 비교할 수 있다. 일반적으로, 동질성은 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 각각의 정확한 뉴클레오타이드-대-뉴클레오타이드 또는 아미노산-대-아미노산 상응성을 말한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산)은 이들의 동질성 퍼센트를 측정함으로써 비교할 수 있다. 2개 서열의 동질성 퍼센트는, 핵산 또는 아미노산 서열에 상관없이, 보다 짧은 서열의 길이를 나누고 100을 곱한 2개의 정렬된 서열사이의 정확한 매치의 수이다. 핵산 서열의 대략적인 정렬은 문헌[참조: Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소 동종성 알고리즘으로 제공되어 있다. 당해 알고리즘은 문헌[참조: Dayhoff, Atlas of Protein Sequence and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA, 및 문헌: Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)에 의해 표준화됨]에서 개발된 점수매김 매트릭스(scoring matrix)를 사용함으로써 아미노산 서열에 적용할 수 있다. 서열의 동질성 퍼센트를 측정하기 위한 당해 알고리즘의 예시적인 시행은 "BestFit" 유틸리티 적용에서 Genetics Computer Group(위스콘신 매디슨 소재)에 의해 제공된다. 서열간의 동질성 또는 유사성 퍼센트를 계산하기에 적합한 다른 프로그램은 일반적으로 당해 분야에 알려져 있으며, 예를 들면, 다른 정렬 프로그램은 디폴트(default) 매개변수와 함께 사용하는 BLAST이다. 예를 들면, 디폴트 매개변수: 유전자 코드 = 표준; 여과기 = 없음; 쇄 = 양쪽; 컷오프(cutoff) = 60; 예측치(expect) = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 기술 = 50개 서열; 분류 기준 = 고 점수(HIGH SCORE); 데이타베이스 = 풍부하지 않음, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 해독 + 스위스(Swiss) 단백질 + Spupdate + PIR을 사용하는 BLASTN 및 BLASTP가 사용될 수 있다. 이들 프로그램의 세부사항은 GenBank 웹사이트에서 찾을 수 있다. 본원에 기술된 서열과 관련하여, 서열 동질성 정도의 바람직한 범위는 대략 80% 내지 100% 및 이들 사이의 특정 정수 값이다. 대표적으로 서열간의 동질성 퍼센트는 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 보다 바람직하게는 85-90%, 심지어 보다 바람직하게는 92%, 여전히 보다 바람직하게는 95%, 및 가장 바람직하게는 98% 서열 동질성이다.
대안적으로, 폴리뉴클레오타이드사이의 서열 유사성의 정도는 동종성 영역 사이의 안정한 이본체(duplex)의 형성을 허용하는 조건하에서 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화에 이은, 일본쇄 특이적인 뉴클레아제(들)을 사용한 분해, 및 분해된 단편의 크기 측정에 의해 측정할 수 있다. 2개의 핵산 또는 2개의 폴리펩타이드 서열은, 이들 서열이 상기 방법을 사용하여 측정된 것으로서, 분자의 정의된 길이에 걸쳐 적어도 약 70% 내지 75%, 바람직하게는 80% 내지 82%, 보다 바람직하게는 85% 내지 90%, 심지어 보다 바람직하게는 92%, 여전히 보다 바람직하게는 95%, 및 가장 바람직하게는 98% 서열 동질성을 나타내는 경우 서로에 대해 실질적으로 동종성이다. 본원에 사용된 것으로서, 실질적으로 동종성은 또한 규정된 DNA 또는 폴리펩타이드 서열에 대해 완전한 동질성을 나타내는 서열을 말한다. 실질적으로 동종성인 DNA 서열은 예를 들면, 특수 시스템에 대해 정의된 바와 같은, 스트링전트 조건(stringent condition)하에서 서던 하이브리드화 실험에서 확인할 수 있다. 적절한 하이브리드화 조건의 정의는 당해 분야의 기술내에 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al., 상기 참조; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press].
2개의 핵산 단편의 선택적인 하이브리드화는 다음과 같이 측정할 수 있다. 2개의 핵산 분자사이의 서열 동질성 정도는 이러한 분자 사이에 하이브리드화 현상의 효능 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 적어도 부분적으로 표적 분자에 대한 완전히 동일한 서열의 하이브리드화를 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 하이브리드화의 억제는 당해 분야에 잘 공지된 하이브리드화 검정[예를 들면, 서던(DNA) 블롯, 노던(RNA) 블롯, 용액 하이브리드화 등, 참조: Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.]을 사용하여 평가할 수 있다. 이러한 검정은 예를 들면, 낮은 스트링전시(stringency)로부터 높은 스트링전시로 변하는 조건을 사용하여 수행할 수 있다. 낮은 스트링전시의 조건을 사용하는 경우, 비 특이적인 결합의 부재는 심지어 부분적인 서열 동질성 정도를 결여함으로써, 비 특이적인 결합 현상의 부재하에서, 제2 프로브가 표적에 하이브리드화하지 않게 될 제2 프로브(예를 들면, 표적 분자와 약 30% 미만의 서열 동질성을 갖는 프로브)를 사용하여 평가할 수 있다.
하이브리드화-계 검출 시스템을 사용하는 경우, 참조 핵산 서열에 대해 상보성인 핵산 프로브를 선택한 후, 적절한 조건을 선택함으로써 프로브 및 참조 서열을 서로에 대해 선택적으로 하이브리드화시키거나 결합시켜 이본체 분자를 형성한다. 온화한 스트링전트 하이브리드화 조건하에서 참조 서열에 선택적으로 하이브리드화할 수 있는 핵산 분자는 통상적으로 선택된 핵산 프로브의 서열과 적어도 대략 70% 서열 동질성을 갖는, 길이가 적어도 약 10 내지 14개 뉴클레오타이드인 표적 핵산 서열의 검출을 허용하는 조건하에 통상적으로 하이브리드화한다. 스트링전트 하이브리드화 조건은 통상적으로 선택된 핵산 프로브의 서열과 약 90 내지 95% 초과의 서열 동질성을 갖는, 길이가 적어도 약 10 내지 14개 뉴클레오타이드인 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브 및 참조 서열이 특수한 정도의 서열 동질성을 가지는 경우, 프로브/참조 서열 하이브리드화에 유용한 하이브리드화 조건은 당해 분야에 공지된 바와 같이 측정할 수 있다[참조: 예를 들면, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press].
하이브리드화 조건은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 하이브리드화 스트링전시는, 하이브리드화 조건이 미스매치된 하이브리드에 대해 보다 낮은 내성과 관련된 보다 높은 스트링전시로, 미스매치된 뉴클레오타이드를 함유하는 하이브리드의 형성을 선호하지 않는 정도를 말한다. 하이브리드화의 스트링전시에 영향을 미치는 인자들은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며 온도, pH, 이온 강도 및 예를 들면, 포름아미드 및 디메틸설폭사이드와 같은 유기 용매의 농도를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있는 바와 같이, 하이브리드화 스트링전시는 보다 높은 온도, 보다 낮은 이온 강도 및 보다 낮은 용매 농도에 의해 증가된다.
하이브리드화용 스트링전시 조건과 관련하여, 다수의 등가 조건들을 사용하여 예를 들면 다음 인자들을 변화시키고 세척 조건을 변화시킴으로써 특수 스트링전시를 확립할 수 있음이 당해 분야에 잘 공지되어 있다: 서열의 길이 및 특성, 각종 서열의 염기 조성, 염 및 기타 하이브리드화 용액 성분의 농도, 하이브리드화 용액(예를 들면, 덱스트란 설페이트 및 폴리에틸렌 글리콜) 중 차단제의 존재 또는 부재, 하이브리드화 반응 온도 및 시간 매개변수. 특수 하이브리드화 조건 세트의 선택은 당해 분야에서 표준 방법에 따라 선택된다[참조: 예를 들면, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.).
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오타이드사이의 유전 정보의 교환 과정을 말한다. 당해 기재내용의 목적을 위해, "동종 재조합(HR)"은 예를 들면, 세포내에서 이본쇄 파괴의 보수동안 일어나는 이러한 변화의 특수화된 형태를 말한다. 당해 과정은 뉴클레오타이드 서열 동종성을 필요로하며, "표적" 분자(즉, 이본쇄 파괴가 일어난 것)의 주형 보수에 대해 "공여체" 분자를 사용하고, 이것이 공여체로부터 표적으로 유전 정보의 전달을 가져오기 때문에, "비-교차 유전자 전환" 또는 "짧은 트랙 유전자 전환"으로 다양하게 공지되어 있다. 어떠한 특수 이론에 얽메이지 않더라고, 이러한 전달은 파괴된 표적 및 공여체 사이에서 형성하는 이종이본체 DNA의 미스매치 교정 및/또는 공여체를 사용하여 표적의 일부가 될 유전 정보를 재합성하는 "합성-의존성 쇄 어닐링" 및/또는 관련 과정을 포함할 수 있다. 이러한 특수화된 HR은 흔히 표적 분자의 서열의 변경을 초래함으로써 공여체 폴리뉴클레오타이드의 서열의 일부 또는 모두는 표적 폴리뉴클레오타이드내로 혼입된다.
"분해"는 DNA 분자의 공유결합성 골격의 파괴를 말한다. 분해는 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하나, 이에 한정되지 않는 각종 방법에 의해 개시될 수 있다. 일본쇄 분해 및 이본쇄 분해 둘다 가능하며, 이본쇄 분해는 2개의 명백한 일본쇄 분해 현상의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 분해는 평활 말단 또는 엇갈림(stagger) 말단의 생산을 초래할 수 있다. 특정 양태에서, 융합 폴리펩타이드는 표적화된 이본쇄 DNA 분해에 사용된다.
"분해 반-도메인"은 제2 폴리펩타이드(동일하거나 상이한)와 함께 분해 활성(바람직하게는 이본쇄 분해 활성)을 갖는 복합체를 형성하는 폴리펩타이드 서열이다. 용어 "제1 및 제2 분해 반-도메인"; "+ 및 - 분해 반 도메인" 및 "우측 및 좌측 분해 반-도메인"은 이합체화되는 분해 반-도메인의 쌍을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용된다.
"조작된 분해 반-도메인"은 다른 분해 반-도메인(예를 들면, 다른 조작된 분해 반-도메인)과 절대 이종이합체를 형성하도록 변형된 분해 반-도메인이다(참조: 또한 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, 미국 특허 공보 2005/0064474; 2007/0218528 및 2008/0131962).
"크로마틴"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포성 크로마틴은 핵산, 주로, DNA 및, 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵 세포 크로마틴은 뉴클레오솜의 형태로 존재하며, 여기서, 뉴클레오솜 코어는 2개의 각각의 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 포함하는 옥타머와 관련된 DNA의 대략 150개 염기 쌍을 포함하며; 링커 DNA(유기체에 의존한 가변 길이의)는 뉴클레오솜 코어사이에 연장된다. 히스톤 H1의 분자는 링커 DNA와 유전적으로 관련되어 있다. 본 기재내용의 목적을 위해, 용어 "크로마틴"은 원핵 및 진핵 세포 둘다의 모든 유형의 세포 핵단백질을 포함한다. 세포 크로마틴은 염색체 및 에피소옴 크로마틴 둘다를 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈 전부 또는 일부를 포함하는 크로마틴 복합체이다. 세포의 게놈은 흔히 세포의 게놈을 포함하는 모든 염색체의 총칭인 핵형(karyotype)으로 특징화된다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피소옴"은 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포의 염색체 핵형의 부분이 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조물이다. 에피소옴의 예는 플라스미드 또는 특정 바이러스 게놈을 포함한다.
"허용되는 영역(accessible region)"은, 핵산내 존재하는 표적 부위가 표적 부위를 인지하는 외인성 분자에 의해 결합될 수 있는 세포 크로마틴내 부위이다. 어떠한 특수 이론에 얽메이지 않더라고, 허용되는 영역은 뉴클레오소옴 구조내로 패키지되지 않는 것으로 여겨진다. 허용되는 영역의 명백한 구조는 흔히 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들면, 뉴클레아제에 대한 이의 민감성에 의해 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은, 결합 분자가 결합할 핵산의 일부를 정의하는 핵산 서열이며, 단, 결합을 위한 충분한 조건이 존재하여야 한다. 예를 들면, 서열 5'-GAATTC-3'는 Eco　RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.
"외인성" 분자는 세포내에 일반적으로 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포내에서 정상적인 존재"는 세포의 특수한 발달 단계 및 환경 조건과 관련하여 측정된다. 따라서, 예를 들면, 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성인 근육 세포와 관련하여 외인성 분자이다. 유사하게, 열 쇼크에 의해 도입된 분자는 열-쇼크받지 않은 세포와 관련하여 외인성 분자이다. 외인성 분자는 예를 들면 기능부전 외인성 분자의 작용 버젼 또는 일반적으로 작용하는 내인성 분자의 기능부전 버젼을 포함할 수 있다.
외인성 분자는 다른 것들 중에서, 단백질, 핵산, 탄수화물, 지방, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 특정의 변형된 유도체 또는 하나 이상의 상기 분자를 포함하는 특정 복합체와 같은 거대 분자 또는 조합 화학 과정에 의해 생성된 것과 같은 소 분자일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 일본쇄 또는 이본쇄일 수 있고; 직쇄, 측쇄 또는 환형일 수 있으며; 어떠한 길이일 수 있다. 핵산은 이본체를 형성할 수 있는 것, 및 삼본체-형성 핵산을 포함한다(참조: 예를 들면, 미국 특허 5,176,996 및 5,422,251). 단백질은 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 크로마틴 재모델화 인자, 메틸화된 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 리컴비나제, 리가제, 토포이소머라제, 기라제 및 헬리카제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 외인성 분자는 또한 내인성 분자와 동일한 유형의 분자일 수 있으나 세포가 기원한 것 외의 다른 종으로부터 기원할 수 있다. 예를 들면, 서열분석된 사람 핵산은 마우스 또는 햄스터로부터 원래 기원한 세포주내로 도입될 수 있다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들면, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들면, 외인성 핵산은 세포내로 도입된 감염성 바이러스 게놈, 플라스미드 또는 에피소옴, 또는 세포내에 일반적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포내로 외인성 분자를 도입시키는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 지질-매개된 전달(즉, 천연 또는 양이온성 지질을 포함하는 리포좀), 전기천공(electroporation), 직접적인 주사, 세포 융합, 입자 충격(particle bombardment), 칼슘 포스페이트 공-침전, DEAE-덱스트란- 매개된 전달 및 바이러스 벡터-매개된 전달을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 외인성 분자는 또한 상이한 종으로부터의 핵산, 예를 들면, 햄스터 유전자내로 삽입된 사람 유전자를 언급할 수 있다.
대조적으로, "내인성" 분자는 특수 환경 조건하에서 특수 발달 단계의 특수 세포내에 일반적으로 존재하는 분자이다. 예를 들면, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 기타 소기관의 게놈, 또는 천연적으로 존재하는 에피소옴 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들면, 전사 인자 및 효소를 포함할 수 있다.
"융합" 분자는, 2개 이상의 소단위 분자가 바람직하게는 공유결합으로 연결된 분자이다. 소단위 분자는 동일한 화학적 유형의 분자일 수 있거나, 상이한 화학적 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 분자의 예는 융합 단백질(예를 들면, ZFP DNA 결합 도메인 및 분해 도메인사이의 융합) 및 융합 핵산(예를 들면, 상기 기술된 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 제2 유형의 융합 단백질의 예는 삼본체-형성 핵산 및 폴리펩타이드사이의 융합, 및 소 그루브 결합제(minor groove binder) 및 핵산사이의 융합을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
세포내에서 융합 단백질의 발현은 세포내로 융합 단백질의 전달 또는 세포내로 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 전달에 의해 초래될 수 있으며, 여기서, 폴리뉴클레오타이드가 전사되고, 전사체가 해독되어 융합 단백질을 생성한다. 트랜스-스플라이싱(trans-splicing), 폴리펩타이드 분해 및 폴리펩타이드 연결은 또한 세포내 단백질의 발현에 관여할 수 있다. 세포내로의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 전달 방법은 또한 본 기재내용에 있다.
본 기재내용의 목적을 위한 "유전자"는, 유전자 생성물을 암호화하는 DNA 영역(상기 참조), 및 조절 서열이 암호화 서열 및/또는 전사된 서열 근처에 있는지의 여부와 상관없이, 유전자 생성물의 생산을 조절하는 DNA 영역을 포함한다. 따라서, 유전자는 프로모터 서열, 터미네이터, 리보소옴 결합 부위 및 내부 리보소옴 도입 부위와 같은 해독 조절 서열, 인핸서, 사일런서(silencer), 인슐레이터(insulator), 경계 성분, 복제 오리진, 매트릭스 부착 부위 및 유전자부위 조절 영역을 포함하나, 필수적으로 이에 한정되지 않는다.
"유전자 발현"은 유전자내에 함유된 정보의 유전자 생성물내로의 전환을 말한다. 유전자 생성물은 유전자[예를 들면, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, shRNA, 마이크로 RNA(miRNA) 리보소옴, 구조 RNA 또는 어떠한 다른 유형의 RNA]의 직접적인 전사 생성물 또는 mRNA의 해독에 의해 생산된 단백질일 수 있다. 유전자 생성물은 또한 캡핑(capping), 폴리아데닐화, 메틸화 및 에디팅(editing)과 같은 방법에 의해 변형된 RNA 및 예를 들면, 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화 및 글리코실화에 의해 변형된 단백질을 포함한다.
유전자 발현의 "조절"은 유전자의 활성에 있어서의 변화를 말한다. 발현의 조절은 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 유전자 불활성화는 본원에 기술된 바와 같이 ZFP를 포함하지 않는 세포와 비교하여 유전자 발현에 있어 특정의 감소를 말한다. 따라서, 유전자 불활성화는 완전(녹-아웃)하거나 부분적(예를 들면, 유전자가 정상의 발현 수준 미만을 나타내는 저차형유전자(hypomorph) 또는 이것이 영향을 미치는 활성에 있어서 부분적인 감소를 나타내는 돌연변이체 유전자의 생성물)일 수 있다.
"진핵" 세포는 진균 세포(효모와 같은), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 사람 세포(예를 들면, T-세포)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"목적 영역"은 예를 들면, 유전자, 또는 유전자내에 또는 유전자에 인접한 비-암호화 서열과 같은 세포 크로마틴의 특정 영역이며, 여기서, 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직하다. 결합은 표적화된 DNA 분해 및/또는 표적화된 재조합의 목적을 위해서일 수 있다. 목적 영역은 염색체, 에피소옴, 소기관 게놈(예를 들면, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 예를 들면, 감염 바이러스 게놈내에 존재할 수 있다. 목적 영역은 유전자의 암호화 영역내, 예를 들면, 리더 서열, 트레일러 서열(trailer sequence) 또는 인트론과 같은 전사된 비-암호화 영역내 또는 암호화 영역의 상부 또는 하부의 비-전사된 영역내에 존재할 수 있다. 목적 영역은, 단일 뉴클레오타이드 쌍 또는 길이가 2,000개 이하인 뉴클레오타이드 쌍과 같이 작거나 뉴클레오타이드 쌍의 특정의 정수 값일 수 있다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된"(또는 "작동적 연결된")은 2개 이상의 성분(예를 들면, 서열 성분)의 병렬과 관련하여 상호교환적으로 사용되며, 여기서, 성분들은 성분들 둘다가 정상적으로 작용하여 성분들 중 적어도 하나가 다른 성분들중 적어도 하나에 대해 발휘하는 작용을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 정렬된다. 나열의 방법으로, 프로모터와 같은 전사 조절 서열은, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 대한 반응시 암호화 서열의 전사 수준을 조절하는 경우 암호화 서열에 작동적으로 연결된다. 전사 조절 서열은 일반적으로 암호화 서열과 시스(cis) 방향으로 작동적으로 연결되지만 이에 직접적으로 근접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는, 이들이 연속적으로 존재하지 않는 경우에서 조차, 암호화 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩타이드와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결된"은, 연결되어 있지 않은 경우에도 수행하는 것과 같이 성분들 각각이 다른 성분에 연결시 동일한 작용을 수행하는 것을 말할 수 있다. 예를 들면, ZFP DNA 결합 도메인이 분해 도메인에 융합된 융합 폴리펩타이드와 관련하여, ZFP DNA 결합 도메인 및 분해 도메인은 융합 폴리펩타이드내에 있는 경우, 작동적 연결되어 있으며, ZFP DNA 결합 도메인 부위는 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있는 반면, 분해 도메인은 표적 부위 부근에서 DNA를 분해할 수 있다.
단백질의 "작용성 단편"은, 이의 서열이 완전한 길이의 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일하지 않지만, 여전히 완전한 길이의 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산과 동일한 작용을 보유하는 단백질, 폴리펩타이드 또는 핵산이다. 작용성 단편은 상응하는 천연 분자보다 더 많거나, 더 적거나 또는 동일한 수의 잔기를 소유할 수 있고/있거나 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 작용(예를 들면, 암호화 작용, 다른 핵산에 하이브리드화하는 능력)을 측정하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다. 유사하게, 단백질 작용을 측정하는 방법은 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드의 DNA-결합 작용은 예를 들면, 여과-결합, 전기영동 운동성-이동(mobility-shift) 또는 면역침전 검정에 의해 측정할 수 있다. DNA 분해는 겔 전기영동으로 검정할 수 있다(참조: Ausubel et al., supra). 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은 예를 들면, 공-면역침전, 2개의 하이브리드 검정 또는 유전적 및 생화학적 둘다의 상보성으로 측정할 수 있다[참조: 예를 들면, Fields et al. (1989) Nature 340:245-246; 미국 특허 5,585,245 및 PCT WO 98/44350].
본원에 사용된 것으로서, 용어 "항체"는 폴리클로날 및 모노클로날 제제 둘다, 및 다음으로부터 수득된 항체를 포함한다: 하이브리드(키메라) 항체 분자[참조: 예를 들면, Winter et al., Nature (1991) 349:293-299; 및 미국 특허 4,816,567]; F(ab')2 및 F(ab) 단편; Fv 분자(비-공유결합성 이종이합체, 참조: 예를 들면, Inbar et al., Proc Natl Acad Sci USA (1972) 69:2659-2662; 및 Ehrlich et al., Biochem (1980) 19:4091-4096]; 일본쇄 Fv 분자(sFv)[참조: 예를 들면, Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85:5879-5883]; 이합체성 및 삼합체성 항체 단편 작제물; 미니보디[참조: 예를 들면, Pack et al., Biochem (1992) 31:1579-1584; Cumber et al., J Immunology (1992) 149B: 120-126]; 사람화된 항체 분자[참조: 예를 들면, Riechmann et al., Nature (1988) 332:323-327; Verhoeyan et al., Science (1988) 239:1534-1536; 및 1994년 9월 21일 발표된, 영국 특허 공보 GB 2,276,169]; 및 이러한 분자로부터 수득된 특정의 작용성 단편(여기서, 이러한 단편은 모 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 보유한다).
본원에 사용된 것으로서, 용어 "모노클로날 항체"는 동종 항체 집단을 갖는 항체 조성물을 말한다. 당해 용어는 항체의 종 또는 공급원과 관련하여 제한되지 않거나, 이것이 제조되는 방식에 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 당해 용어는 면역글로불린 및 F(ab')2, Fv, 및 기타 단편과 같은 단편, 및 모 모노클로날 항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타내는 키메라 및 사람화된 동종 항체 집단을 포함한다.
아연 핑거 뉴클레아제
본원에는 GS 유전자의 불활성화에 사용될 수 있는 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN)가 기술되어 있다. ZFN은 아연 핑거 단백질(ZFP) 및 뉴클레아제(분해) 도메인을 포함한다.
A. 아연 핑거 단백질
아연 핑거 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다[참조: 예를 들면, Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]. 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 천연적으로 존재하는 아연 핑거 단백질과 비교하여 신규 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 비례적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비례적 설계는 예를 들면, 삼중항(또는 사중항) 뉴클레오타이드 서열 및 개개의 아연 핑거 아미노산 서열을 포함하는 데이타베이스를 사용하는 것을 포함하며, 여기서, 각각의 삼중항 또는 사중항 뉴클레오타이드 서열은 특수한 삼중항 또는 사중항 서열에 결합하는 아연 핑거의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다(참조: 예를 들면, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된, 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261).
파아지 디스플레이 및 2개-하이브리드 시스템을 포함하는 예시적인 선택 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 및 WO　98/37186; WO　98/53057; WO　00/27878; WO　01/88197 및 GB 2,338,237에 기술되어 있다. 또한, 아연 핑거 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 향상이 예를 들면, 공동-소유의 WO　02/077227에 기술되어 있다.
표적 부위의 선택; ZFP 및 융합 단백질(및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 설계 및 작제 방법은, 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있고 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 미국 특허원 공보 20050064474 및 20060188987에 상세히 기술되어 있다.
또한, 이들 및 다른 참고문헌에 기재되어 있는 바와 같이, 아연 핑거 도메인 및/또는 다중-핑거 아연 핑거 단백질은 예를 들면, 길이가 5개 이상인 아미노산의 링커를 포함하는 어떠한 적합한 링커 서열을 사용하여서도 함께 연결시킬 수 있다. 또한 길이가 6개 이상의 아미노산인 예시적인 링커 서열에 대해서는 미국 특허 6,479,626; 6,903,185; 및 7,153,949를 참조한다. 본원에 기술된 단백질은 단백질의 개개의 아연 핑거사이에 적합한 링커의 특정 조합을 포함할 수 있다. 추가의 링커 구조물의 예는 2008년 5월 28일 출원되고 발명의 명칭이 DNA 결합 도메인 및 분해 도메인을 연결시키기 위한 조성물인 미국 가 특허원 61/130,099에서 찾을 수 있다.
표 1은 GS 유전자내 뉴클레오타이드 서열에 결합하도록 조작된 다수의 아연 핑거 결합 도메인을 기술하고 있다(참조: 또한, 도 1 및 도 3). 각각의 열은 별개의 아연 핑거 DNA 결합 도메인을 기술한다. 각각의 도메인에 대한 DNA 표적 서열은 제1 컬럼에 나타내고, 제2 내지 제5 컬럼은 단백질내 각각의 아연 핑거(F1 내지 F4, F5 또는 F6)의 인지 영역의 아미노산 서열(나선의 출발과 관련하여 아미노산 -1 내지 +6)을 나타낸다. 대문자로 나타낸 뉴클레오타이드는 아연 핑거에 의해 직접적으로 표적화된 삼본체를 나타내고 소문자로 나타낸 뉴클레오타이드는 아연 핑거에 의해 예를 들면, "스키핑(skipping)" 염기를 초래할 수 있는 핑거사이의 보다 긴 링커로 인해) 직접적으로 표적화되지 않는 염기를 나타낸다. 제1 컬럼에는 단백질에 대한 확인 번호를 제공한다.
Figure 112011036361645-pct00001
하기 기술된 바와 같이, 특정 양태에서, 표 1에 나타낸 4-, 5-, 또는 6-핑거 결합 도메인은 예를 들면 FokI과 같은 제II형 제한 엔도뉴클레아제의 분해 도메인과 같은 분해 반-도메인에 융합된다. 이러한 아연 핑거/뉴클레아제 반-도메인 융합체의 하나 이상의 쌍은 예를 들면, 미국 특허 공보 20050064474 및 20070218528에 기재된 것으로서, 표적화된 분해에 사용된다.
표적화된 분해의 경우, 결합 부위의 근처 가장자리는 5개 이상의 뉴클레오타이드 쌍으로 분리될 수 있으며, 융합 단백질 각각은 DNA 표적의 반대쪽 쇄에 결합할 수 있다. 표 1에 나타낸 단백질의 모든 쌍을 이룬 조합은 GS 유전자의 표적화된 분해에 사용될 수 있다. 본 기재내용에 이어서, ZFN은 GS 유전자내 특정 서열을 표적화할 수 있다.
B. 분해 도메인
ZFN은 또한 뉴클레아제(분해 도메인, 분해 반-도메인)을 포함한다. 본원에 기재된 융합 단백질의 분해 도메인 부위는 특정의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 분해 도메인이 기원할 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 호밍(homing) 엔도뉴클레아제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다[참조: 예를 들면, 2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388]. DNA를 분해하는 추가의 효소는 공지되어 있다[예를 들면, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 미구균 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; 또한 참조: Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993]. 하나 이상의 이들 효소(또는 이의 작용성 단편)는 분해 도메인 및 분해 반-도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
유사하게, 분해 반-도메인은 분해 활성을 위한 이합체화를 필요로 하는, 위에 설정된 바와 같은, 특정의 뉴클레아제 또는 이의 부위로부터 기원할 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 분해 반-도메인을 포함하는 경우, 2개의 융합 단백질이 분해에 요구된다. 달리는, 2개의 분해-반 도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 분해 반-도메인은 동일한 엔도뉴클레아제(또는 이의 작용성 단편)으로부터 기원할 수 있거나, 각각의 분해 반-도메인은 상이한 엔도뉴클레아제(또는 이의 작동성 단편)로부터 기원할 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위는 바람직하게는 서로와 관련하여 배치됨으로써 이들 각각의 표적 부위에 대한 2개의 융합 단백질의 결합은, 분해 반-도메인이 예를 들면, 이합체화에 의해 작용성 분해 도메인을 형성하도록 서로에 대해 부분적인 배향으로 분해 반-도메인에 위치한다. 따라서, 특정 양태에서, 표적 부위의 근처 가장자리는 5 내지 8개의 뉴클레오타이드 또는 15 내지 18개의 뉴클레오타이드에 의해 분리된다. 그러나, 어떠한 정수의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 쌍도 2개의 표적 부위(예를 들면, 2 내지 50개 뉴클레오타이드 쌍 이상)사이에 개재될 수 있다. 일반적으로, 분해 부위는 표적 부위 사이에 존재한다.
제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 많은 종에 존재하며 DNA(인지 부위에서), 및 결합 부위에서 또는 근처에서 분해 DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있다. 특정의 제한 효소(예를 들면, 제IIS형)는 제한 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 분해하며 별개의 결합 및 분해 도메인을 갖는다. 예를 들면, 제IIS형 효소 FokI은 하나의 쇄상의 이의 인지 부위로부터 9개 뉴클레오타이드에서 및 다른 쇄상의 이의 인지 부위로부터 13개 뉴클레오타이드에서 DNA의 이본쇄 분해를 촉매한다[참조: 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 및 Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982]. 따라서, 하나의 양태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 제IIS형 제한 효소로부터의 분해 도메인(또는 분해 반-도메인) 및 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
이의 분해 도메인이 결합 도메인으로부터 분리될 수 있는, 예시적인 제IIS형 제한 효소는 Fok　I이다. 특수 효소는 이합체로서 활성이다[참조: Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 본 기재내용의 목적을 위해, 기재된 융합 단백질에 사용된 Fok　I 효소의 일부는 분해 반-도메인으로 고려된다. 즉, 아연 핑거-Fok　I 융합체를 사용한 세포 서열의 표적화된 이본쇄 분해 및/또는 표적화된 치환을 위해, 각각 FokI 분해 반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매적으로 활성인 분해 도메인을 재구성할 수 있다. 달리는, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 Fok　I 분해 반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자를 또한 사용할 수 있다. 아연 핑거-Fok　I 융합체를 사용한 표적화된 분해 및 표적화된 서열 변경을 위한 매개변수는 또한 본 기내내용에 제공된다.
분해 도메인 또는 분해 반-도메인은 분해 활성을 보유하거나, 다합체화(예를 들면, 이합체화)하는 능력을 보유하여 작용성 분해 도메인을 형성하는 단백질의 특정 부위일 수 있다.
예시적인 제IIS형 제한 효소는, 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 국제 공보 WO 07/014275에 기술되어 있다. 추가의 제한 효소는 또한 별개의 결합 및 분해 도메인을 함유하며, 이들은 본 기내내용에서 고려된다[참조: 예를 들면, Roberts et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:418-420].
특정 양태에서, 분해 도메인은 이의 모든 기재내용이 본원에 이의 전문으로 참조로 인용된, 미국 특허 공보 20050064474; 20060188987 및 20080131962에 기술된 바와 같은, 동종이합체화를 최소화하거나 방지하는 하나 이상의 조작된 분해 반-도메인(또한 이합체화 도메인 돌연변이체로 언급됨)을 포함한다. FokI의 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538번 위치에서 아미노산 잔기는 Fok I 분해 반-도메인의 이합화에 영향을 미치는 모든 표적이다.
절대 이종이합체를 형성하는 FokI의 예시적인 조작된 분해 반-도메인은, 제1 분해 반-도메인이 FokI의 490 및 538번 위치의 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함하고 제2 분해 반-도메인은 486 및 499번 아미노산 잔기에서 돌연변이를 포함한다.
따라서, 하나의 양태에서, 490번에서의 돌연변이는 Glu (E)를 Lys(K)로 치환하고; 538번에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환하며; 486번에서 돌연변이는 Gln(Q)를 Glu(E)로 치환하고; 499번에서 돌연변이는 Iso(I)를 Lys(K)로 치환한다. 상세하게는, 본원에 기술된 조작된 분해 반-도메인은 하나의 분해 반-도메인에서 490번 위치(E→K) 및 538번 위치(I→K)를 돌연변이시켜 "E490K:I538K"로 지정된 조작된 분해 반-도메인을 생성하고 다른 분해 반-도메인에서 486번 위치(Q→E) 및 499번 위치(I→L)의 돌연변이에 의해 "Q486E:I499L"로 지정된 조작된 분해 반-도메인을 생성함으로써 제조하였다. 실시예에 기술된 바와 같이, 하나의 ZFN이 "E490K:I538K" 분해 도메인을 포함하고 다른 것이 "Q486E:I499L" 분해 도메인을 포함하는 AFN의 쌍을 또한 "EL/KK" ZFN 쌍으로 언급한다. 본원에 기술된 조작된 분해 반-도메인은, 이들 분해 반-도메인을 함유하는 하나 이상의 뉴클레아제의 쌍이 분해에 사용되는 경우 이상 분해가 최소화되거나 소멸되어 있는 절대 이종이합체 돌연변이체이다(참조: 이의 기재내용의 모든 목적을 위해 이의 전문으로 본원에 참조로 인용된, 미국 특허 공보 20080131962).
본원에 기술된 조작된 분해 반-도메인은 예를 들면, 미국 특허 공보 20050064474(실시예 5) 및 20070134796(실시예 38)에 기술된 바와 같이 야생형 분해 반-도메인(FokI)의 부위-지시된 돌연변이유발에 의해 어떠한 적합한 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
C. GS에서 표적화된 분해를 위한 추가의 방법
GS 유전자내 표적 부위를 갖는 어떠한 뉴클레아제도 본원에 기재된 방법에 사용할 수 있다. 예를 들면, 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제는 매우 긴 인지 서열을 가지며, 이들 중 일부는 통계적 기준으로, 사람-크기 게놈내에 1회 존재하는 것으로 여겨진다. GS 유전자내 유일한 표적 부위를 갖는 어떠한 이러한 뉴클레아제도 GS 유전자내에서 표적화된 분해를 위한 아연 핑거 뉴클레아제 대신 또는 외에 추가로 사용될 수 있다.
예시적인 호밍 엔도뉴클레아제는 I-SceI, I-CeuI, PI-PspI, PI-Sce, I-SceIV, I-CsmI, I-PanI, I-SceII, I-PpoI, I-SceIII, I-CreI, I-TevI, I-TevII 및 I-TevIII를 포함한다. 이들의 인지 서열은 공지되어 있다[참조: 미국 특허 5,420,032; 미국 특허 6,833,252; Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388; Dujon et al. (1989) Gene 82:115-118; Perler et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 1125-127; Jasin (1996) Trends Genet. 12:224-28; Gimble et al. (1996) J. Mol. Biol. 263:163-80; Argast et al. (1998) J. Mol. Biol. 280:345-353 및 the New England Biolabs catalogue].
비록 대부분의 호밍 엔도뉴클레아제의 분해 특이성이 이들의 인지 부위와 관련하여 절대적이지 않다고 해도, 당해 부위는, 포유동물-크기 게놈 당 단일 분해 현상이 이의 인지 부위의 단일 카피를 함유하는 세포내에서 호밍 엔도뉴클레아제를 발현함으로써 수득될 수 있기에 충분한 길이이다. 호밍 엔도뉴클레아제 및 메가뉴클레아제의 특이성을 조작하여 비-천연 표적 부위에 결합시킬 수 있음은 또한 보고되어 있다[참조: 예를 들면, Chevalier et al. (2002) Molec. Cell 10:895-905; Epinat et al. (2003) Nucleic Acids Res. 31:2952-2962; Ashworth et al. (2006) Nature 441:656-659; Paques et al. (2007) Current Gene Therapy 7:49-66]. 따라서, GS와 같이 바람직한 표적 위치에 특이적으로 결합하도록 설계된 조작된 호밍 엔도뉴클레아제 및/또는 메가뉴클레아제를 또한 사용할 수 있다.
전달
본원에 기술된 ZFN은 어떠한 적합한 수단에 의해서도 표적 세포에 전달될 수 있다. 적합한 세포는 진핵 및 원핵 세포 및/또는 세포주를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이러한 세포 또는 세포주의 비-제한적 예는 COS, CHO(예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11, CHO-DUKX, CHOK1SV), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), 및 perC6 세포 및 스포도프테라 푸기페르다(Spodoptera fugiperda)(Sf)와 같은 곤충 세포, 또는 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia) 및 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces)와 같은 진균 세포를 포함한다.
아연 핑거를 포함하는 단백질을 전달하는 방법은 예를 들면, 이의 모든 기재내용이 이의 전문으로 본원에 참조로 인용된 미국 특허 6,453,242; 6,503,717; 6,534,261; 6,599,692; 6,607,882; 6,689,558; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824에 기술되어 있다.
본원에 기술된 것으로서 ZFN은 또한 하나 이상의 ZFN을 암호화하는 서열을 함유하는 벡터를 사용하여 전달할 수 있다. 플라스미드 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터; 헤르페스바이러스 벡터 및 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 벡터 시스템도 사용할 수 있다(참조: 본원에 이의 전문이 참조로 인용된 미국 특허 6,534,261; 6,607,882; 6,824,978; 6,933,113; 6,979,539; 7,013,219; 및 7,163,824). 또한, 이들 벡터 중의 어느 것도 하나 이상의 ZFN 암호화 서열을 포함할 수 있음은 명백할 것이다. 따라서, 하나 이상의 ZFN의 쌍이 세포내로 도입되는 경우, ZFN은 동일한 벡터 또는 상이한 벡터상에서 운반될 수 있다. 다중 벡터가 사용되는 경우, 각각의 벡터는 1개 또는 다수의 ZFN을 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
통상의 바이러스 및 비-바이러스계 유전자 전달 방법을 사용하여 세포(예를 들면, 포유동물 세포) 및 표적 조직내에서 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법을 또한 사용하여 시험관내에서 세포로 ZFP를 암호화하는 핵산을 투여할 수 있다. 특정 양태에서, ZFP를 암호화하는 핵산은 생체내 또는 생체외 유전자 치료요법 용도로 투여된다. 비-바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이크드(naked) 핵산 및 리포좀 또는 폴록사머와 같은 전달 비히클과 복합화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 전달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이는 세포로 전달된 후 에피소옴 또는 통합된 게놈을 가진다. 유전자 치료요법 공정의 고찰을 위해서는 문헌[참조: Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm (eds.) (1995); 및 Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)]을 참조한다.
조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 비-바이러스성 전달 방법은 전기천공, 지질감염, 미세주사, 바이오리스틱(biolistic), 비로소옴(virosome), 리포좀, 면역리포좀, 다가양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이크드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 흡수 증진제를 포함한다. 예를 들면, Sonitron 2000 시스템(Rich-Mar)을 사용한 소노포레이션(sonoporation)도 또한 핵산 전달에 사용할 수 있다.
추가의 예시적인 핵산 전달 시스템은 Amaxa Biosystems(독일 콜로긴 소재), Maxcyte, Inc.(매릴랜드 록크빌 소재) 및 BTX Molecular Delivery Systems(매사츄세츠 홀리스톤 소재) 및 Copernicus Therapeutics Inc.(참조: 예를 들면, 미국 특허 6,008,336)에서 제공된 것들을 포함한다.
지질감염은 예를 들면, US 5,049,386, US 4,946,787; 및 US 4,897,355에 기술되어 있으며 지질감염 시약은 시판되고 있다(예를 들면, TransfectamTM 및 LipofectinTM). 폴리뉴클레오타이드의 충분한 수용체-인지 지질감염에 적합한 양이온성 및 중성 지질은 Felgner, WO 91/17424, WO 91/16024의 것들을 포함한다. 전달은 세포(생체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)일 수 있다.
면역지질 복합체와 같은 표적화된 리포좀을 포함하는, 지질:핵산 복합체의 제조는 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국 특허 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 및 4,946,787].
조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 전달을 위한 RNA 또는 DNA 바이러스계 시스템의 사용은 체내에서 특이적인 세포에 대한 바이러스의 표적화하고 핵에 대한 바이러스 페이로드(payload)를 수송(trafficking)하기 위한 고도로 발달된 방법의 장점을 취한다. 바이러스 벡터는 환자(생체내)에게 직접 투여되거나 이들을 사용하여 시험관내에서 세포를 치료할 수 있고 변형된 세포는 환자(생체외)에게 투여된다. ZFP를 전달하기 위한 통상의 바이러스계 시스템은 유전자 전달용 레트로바이러스, 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노 관련, 박시니아 및 헤르페스 단성 바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 숙주 게놈내에서 통합은 레트로바이러스, 렌티바이러스 및 아데노 관련 바이러스 유전자 전달 방법으로 가능하며, 흔히 삽입된 이식 유전자의 장기간 발현을 초래한다. 또한, 높은 형질도입 효능이 많은 상이한 세포 유형 및 표적 조직에서 관측되었다.
레트로바이러스 친화성은 외부 엔벨로프 단백질을 혼입시키고, 표적 세포의 강력한 표적 집단을 확장시킴으로써 변경할 수 있다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 형질도입하거나 감염시켜 통상적으로 고 바이러스 역가를 생산할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 외부 서열 6 내지 10kb이하의 패키징 능력을 갖는 시스-작용의 긴 말단 반복단위로 구성된다. 최소의 시스-작용 LTR로도 벡터의 복제 및 패키징에 충분하며, 이후에 이는 치료학적 유전자를 표적 세포내로 통합하여 영구적인 이식유전자 발현을 제공한다. 광범위하게 사용된 레트로바이러스 벡터는 쥐 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 유인원 백혈병 바이러스(GaLV), 시미안 면역결핍성 바이러스(SIV), 사람 면역결핍성 바이러스(HIV), 및 이의 조합을 포함한다[참조: 예를 들면, Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990); Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700].
ZFP 융합 단백질의 일시적인 발현이 바람직한 적용에 있어서, 아데노바이러스계 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스계 벡터는 많은 세포 유형에서 매우 높은 형질도입 효능을 지닐 수 있으며 세포 분열을 필요로 하지 않는다. 이러한 벡터를 사용하여, 고 역가 및 고 수준의 발현을 수득하였다. 당해 벡터는 비교적 간단한 시스템으로 대량 생산할 수 있다. 아데노 관련 바이러스("AAV") 벡터를 또한 사용하여 예를 들면, 핵산 및 펩타이드의 시험관내 생산 및 생체내 및 생체외 유전자 치료요법 과정[참조: 예를 들면, West et al., Virology 160:38-47 (1987); 미국 특허 4,797,368; WO 93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994); Muzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)]을 위해 표적 핵산으로 세포를 형질도입시킬 수 있다 재조합체 AAV 벡터의 작제는 미국 특허 5,173,414; Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985); Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)를 포함하는, 다수의 공보에 기술되어 있다.
적어도 6개의 바이러스 벡터 시도가 현재 임상 시도에서 유전자 전달에 이용가능하며, 이는 헬퍼 세포주내로 삽입된 유전자에 의해 결손 벡터의 상보성을 포함하는 시도를 이용함으로써 형질도입제를 생성한다.
pLASN 및 MFG-S가 임상 시도에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다[참조: Dunbar et al., Blood 85:3048-305 (1995); Kohn et al., Nat. Med. 1:1017-102 (1995); Malech et al., PNAS 94:22 12133-12138 (1997)]. PA317/pLASN은 유전자 치료요법 시도에서 사용된 제1 치료학적 벡터였다[참조: Blaese et al., Science 270:475-480 (1995)]. 50% 이상의 형질도입 효능이 MFG-S 패키지된 벡터에서 관측되었다[참조: Ellem et al., Immunol Immunother. 44(1):10-20 (1997); Dranoff et al., Hum. Gene Ther. 1:111-2 (1997)].
재조합체 아데노 관련 바이러스 벡터(rAAV)는 결손 및 비병원성 파르보바이러스 아데노 관련 제2형 바이러스를 기초로하는 촉망되는 대체 유전자 전달 시스템이다. 모든 벡터는 이식유전자 발현 카세트를 플랭킹하는 AAV 145 bp 역전된 말단 반복단위 만을 보유한다. 형질도입된 세포의 게놈내로의 통합으로 인한 효율적인 유전자 전달 및 안정한 이식유전자 전달은 당해 벡터 시스템을 위한 중요한 특징이다[참조: Wagner et al., Lancet 351:9117 1702-3 (1998), Kearns et al., Gene Ther. 9:748-55 (1996)].
복제 결손 재조합체 아데노바이러스 벡터(Ad)는 고 역가로 생산될 수 있으며 다수의 상이한 세포 유형을 용이하게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 조작됨으로써 이식유전자가 Ad E1a, E1b, 및/또는 E3 유전자를 치환시킨 고; 후속적으로 복제 결손 벡터가 트랜스 배향으로 결실된 유전자 작용을 보충하는 사람 293 세포내에서 증식된다. Ad 벡터는 간, 신장 및 근육에서 발견된 것들과 같은 분열하지 않는, 분화된 세포를 포함하는, 생체내 다수 유형의 조직을 형질도입시킬 수 있다. 통상의 Ad 벡터는 큰 운반능력을 갖는다. 임상 시도에서 Ad 벡터의 사용의 예는 근육내 주사를 사용한 항종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오타이드 치료요법을 포함하였다[참조: Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-9 (1998)]. 임상 시도에서 유전자 전달용 아데노바이러스 벡터의 사용의 추가의 예는 문헌[참조: Rosenecker et al., Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 9:7 1083-1089 (1998); Welsh et al., Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez et al., Hum. Gene Ther. 5:597-613 (1997); Topf et al., Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman et al., Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)]을 포함한다.
패키징 세포를 사용하여 숙주 세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성시킨다. 이러한 세포는 레트로바이러스를 패키징하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키징하는 Ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 치료요법에 사용된 바이러스 벡터는 일반적으로 핵산 벡터를 바이러스 입자내로 패키징하는 생산인자 세포주에 의해 생성된다. 당해 벡터는 통상적으로 패키징 및 후속적인 숙주내로의 통합(경우에 따라)에 요구되는 최소의 바이러스 서열, 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 치환되는 다른 바이러스 서열을 함유한다. 빠진 바이러스 감염은 패키징된 세포주에 의해 트랜스 배향으로 공급된다. 예를 들면, 유전자 치료요법에 사용된 AAV 벡터는 통상적으로 단지 패키징 및 숙주 게놈내로의 통합에 요구되는 AAV 게놈으로부터의 역전된 말단 반복단위(ITR) 서열을 소유한다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep 및 cap를 암호화하나, ITR 서열을 결실하고 있는 헬퍼 플라스미드를 함유하는 세포주내로 패키징된다. 세포주는 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 충분한 양으로 패키징되지 않는다. 아데노바이러스에 의한 오염은 예를 들면, 아데노바이러스가 AAV보다 더 민감성인 열 처리에 의해 감소시킬 수 있다.
많은 유전자 치료요법 적용에서, 유전자 치료요법 벡터를 고도의 특이성으로 특수 조직 유형에 전달하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 바이러스 벡터는 변형되어 바이러스의 외부 표면상의 바이러스 피복 단백질과의 융합 단백질로서의 리간드를 발현함에 의해 제공된 세포 유형에 대해 특이성을 가질 수 있다. 리간드는 목적한 세포 유형상에 존재하는 것으로 공지된 수용체에 대한 친화성을 가지도록 선택한다. 예를 들면, 문헌[참조: Han et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:9747-9751 (1995)]은, 몰로니 쥐 백혈병 바이러스가 변형되어 gp70에 융합된 사람 헤레굴린을 발현할 수 있으며, 재조합체 바이러스는 사람 상피 성장 인자 수용체를 발현하는 특정의 사람 유방암 세포를 감염시킨다. 당해 원리는 다른 바이러스-표적 세포 쌍에도 확장시킬 수 있으며, 여기서, 표적 세포는 수용체를 발현하고 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현한다. 예를 들면, 섬유상 파아지는 조작되어 사실상 특정의 선택된 세포 수용체에 대해 특이적인 결합 친화성을 갖는 항체 단편(예를 들면, FAB 또는 Fv)를 나타낼 수 있다. 비록 상기 기술이 전적으로 바이러스 벡터에 적용된다고 해도, 동일한 원리를 비바이러스 벡터에 적용시킬 수 있다. 이러한 벡터는 특이적인 표적 세포에 의한 흡수를 촉진하는 특이적인 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.
유전자 치료요법 벡터는 생체내에서 개개 환자에게 통상적으로 하기 기술한 바와 같이, 전신계적 투여(예를 들면, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하 또는 두개내 주입)에 의해 또는 국소 적용으로 생체내 전달할 수 있다. 달리는, 벡터를 개개 환자(예를 들면, 림프구, 골수 흡인물, 조직 생검) 또는 공통의 공여자 조혈 줄기 세포로부터 체외이식한 후 일반적으로 벡터가 혼입된 세포를 선택한 후, 환자에게 세포를 재이식시킨 세포와 같은 세포로 생체외로 전달할 수 있다.
진단, 조사 또는 유전자 치료요법을 위한 생체외 세포 형질감염(예를 들면, 형질감염된 세포의 숙주 유기체로의 재-주입을 통한)은 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있다. 바람직한 양태에서, 세포는 ZFP 핵산(유전자 또는 cDNA)로 형질감염된 대상체 유기체로부터 분리하여, 대상체 유기체(예를 들면, 환자)내로 다시 재-주입한다. 생체외 형질감염에 적합한 다양한 세포 유형이 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있으며[참조: 예를 들면, Freshney et al., Culture of Animal Cell, A Manual of Basic Technique (3rd ed. 1994) 및 환자로부터 세포를 분리하여 배양하는 방법에 대한 논의에 대해서는 상기 문헌에 인용된 참고문헌].
하나의 양태에서, 줄기 세포는 세포 형질감염 및 유전자 치료요법을 위한 생체외 공정에서 사용된다. 줄기 세포를 사용하는 것에 대한 잇점은, 이들이 시험관내에서 다른 세포 유형으로 분화될 수 있거나, 이들이 골수로 이식될 경우 포유동물(세포의 공여자와 같은)내로 도입될 수 있다는 것이다. 시험관내에서 CD34+ 세포를 임상적으로 중용한 면역 세포 유형내로 GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 사이토킨을 사용하여 분화시키는 방법은 공지되어 있다[참조: Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)].
줄기 세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위해 분리된다. 예를 들면, 줄기 세포는 골수 세포로부터 골수 세포를 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+ (panB 세포), GR-1(과립구), 및 Iad(분화된 항원 제시 세포)와 같은 원치않는 세포에 결합하는 항체를 사용하여 패닝(panning)시킴으로써 분리한다[참조: Inaba et al., J. Exp. Med. 176:1693-1702 (1992)].
치료학적 ZFP 핵산을 함유하는 벡터(예를 들면, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포좀 등)을 또한 생체내에서 세포의 형질도입을 위한 유기체에 직접 투여할 수 있다. 달리는, 네이크드(naked) DNA를 투여할 수 있다. 투여는 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함하나, 이에 한정되지 않는 혈액 또는 조직 세포와의 친밀한 접촉으로 분자를 도입시키기 위해 일반적으로 사용된 특정한 경로에 의한다. 이러한 핵산을 투여하기에 적합한 방법은 이용가능하며 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지되어 있고, 비록 하나 이상의 경로를 사용하여 특수 조성물을 투여할 수 있다고 해도, 특수 경로가 흔히 다른 경로보다 보다 즉각적이고 보다 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
DNA를 조혈 줄기 세포내로 도입시키는 방법은 예를 들면, 미국 특허 5,928,638에 기술되어 있다. 이식유전자를 조혈 줄기 세포, 예를 들면, CD34+ 세포내로 도입시키는데 유용한 벡터는 아데노바이러스 제35형을 포함한다.
이식유전자를 면역 세포(예를 들면, T-세포)내로 도입시키는데 적합한 벡터는 비-통합성 렌티바이러스 벡터를 포함한다[참조: 예를 들면, Ory et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:11382-11388; Dull et al. (1998) J. Virol. 72:8463-8471; Zuffery et al. (1998) J. Virol. 72:9873-9880; Follenzi et al. (2000) Nature Genetics 25:217-222].
약제학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여되는 특수 조성물, 및 조성물을 투여하는데 사용된 특수 방법으로 측정한다. 따라서, 하기 기술된 바와 같이, 이용가능한 약제학적 조성물의 다양한 적합한 제형이 존재한다(참조: 예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989).
위에 주목한 바와 같이, 기재된 방법 및 조성물은 원핵 세포, 진균 세포, 아라키온 세포, 식물 세포, 곤충 세포, 동물 세포, 척추동물 세포, 포유동물 세포 및 사람 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는 어떠한 유형의 세포에서도 사용될 수 있다. 단백질 발현에 적합한 세포주는 당해 분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, COS, CHO(예를 들면, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NS0, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들면, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 스포도프테라 푸기페르다(Sf)와 같은 곤충 세포, 및 사카로마이세스, 피키아 및 스키조사카로마이세스와 같은 진균 세포를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이들 세포의 후대, 변이체 및 유도체도 또한 사용될 수 있다.
적용
기재된 방법 및 조성물은 GS 게놈 서열의 불활성화에 사용할 수 있다. 위에서 주목한 바와 같이, 불활성화는 세포내에서 GS 유전자 발현의 부분적이거나 완전한 억제를 포함한다. GS 유전자의 불활성화는 예를 들면, 단일 분해 현상에 의해, 분해에 이은 비-동종 말단 결합에 의해, 2개 부위에서의 분해에 이어 2개의 분해 부위사이의 서열을 결실시키기 위한 결합에 의해, 암호화 영역내로 미스센스 또는 넌센스 코돈의 표적화된 재조합에 의해, 유전자 또는 조절 영역을 파괴하기 위한, 비관련성 서열[즉, "셔플러(stuffer)" 서열]의 유전자 또는 이의 조절 영역내로의 표적화된 재조합에 의해, 또는 전사체의 미스-스플라이싱을 유발하기 위한 인트론내로 스플라이스 수용체 서열의 재조합의 표적화에 의해 달성할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 방법 및 조성물은 예를 들면, α1-항트립신 및/또는 모노클로날 항체 생산을 위한 재조합 단백질 생산에 사용하기 위한 GS-결핍성 세포주의 생산을 허용한다. FUT8과 같은 추가의 유전자를 또한 FUT8이 불활성된 세포와 같이 불활성시켜, 특히 ADCC의 도입시, 보다 큰 효과기 작용을 나타내는 항체를 생산할 수 있다.
실시예
실시예 1: ZFN의 설계 및 작제
A. 글루타민 신테타제(GS) ZFN
CHO 게놈의 완전한 서열은 이용가능하지 않지만, CHO GS 유전자는 ZFN 설계용 표적 DNA 서열을 생성하기 위해 클로닝 및 서열분석되었다. 완전한 CHO GS 서열은 도 13에 나타내며, 이는 또한 인트론 및 엑손을 지정하고 있다.
CHO GS 유전자의 엑손 6내 ZFN 표적 부위는, 당해 영역이 이용가능한 결정 구조를 기초로 한 GS 단백질의 촉매 작용에 중요한 아미노산을 암호화하므로[참조: 예를 들면, Almassy et al. (1986) Nature 323:304-309; Gill et al. (2002) Biochem. 41:9863-9872; Liaw et al. (1994) Biochem. 33:675-681], 자체로서, 당해 부위의 ZFN-매개된 돌연변이는 작용성 GS 활성의 손실을 초래하는 것으로 예측되었다. CHO GS 엑손 6에 대한 부분 서열은 하기 나타낸다. 대문자는 엑손 서열을 나타내고; 소문자는 인트론 서열을 나타내며; ZFN 표적 부위 9372/9075(표 1, 도 1a 및 도 4a)는 밑줄쳐져 있다:
5'-atggcactattctgttccttttcctcccctctgaagacttggcacatggggactttggttaacaagggtgatgacttaaaagtggttcagggtagaggtaagtagaacaagctaggagcttgagttggcctgaacagttagttggccttattctaaaggtcaacatgttctttctagTGGGAATTCCAAATAGGACCCTGTGAAGGAATCCGCATGGGAGATCATCTCTGGGTGGCCCGTTTCATCTTGCATCGAGTATGTGAAGACTTTGGGGTAATAGCAACCTTTGACCCCAAGCCCATTCCTGGGAACTGGAATGGTGCAGGCTGCCATACCAACTTTAGCACCAAGGCCATGCGGGAGGAGAATGGTCTGAAgtaagtagcttcctctggagccatctttattctcatggggtggaagggctttgtgttagggttgggaaagttggacttctcacaaactacatgccatgctcttcgtgtttgtcataagcctatcgttttgtacccgttggagaagtgacagtactctaggaatagaattacagctgtgatatgggaaagttgtcacgtaggttcaagcatttaaaggtctttagtaagaactaaatacacatacaagcaagtgggtgacttaattcttactgatgggaagaggccagtgatgggggtcttcccatccaaaagataattggtattacatgttgaggactggtctgaagcacttgagacataggtcacaaggcagacacagcctgcatcaagtatttattggtttcttatggaactcatgcctgctcctgcccttgaaggacag-3'(서열 번호:30)
ZFN9372 및 ZFN9075에 대한 결합 부위는 도 4b에 나타나 있고, 도 4c는 이들 ZFN의 표적 및 핑거 설계를 묘사한다.
또한, 엑손 2내 부위들에 표적화된 ZFN을 또한 설계하였다. CHO 엑손 2에 대한 부분 서열은 하기 나타낸다. 대문자는 엑손 서열을 나타내고; 소문자는 인트론 서열을 나타내며; ZFN 표적 부위 8365/8361(표 1, 및 도 1a)은 밑줄쳐져 있다.
5'-ggctggcagatctccgagttcgaggctgacctggtctgaatagcaaggaaattaaggggtgaggcgtatgtctgttaaagcaagaataaaaggcaaaggaacactccacagtcaattattcaagtcttgatggcagtaatgtagttgtattgggtggattaagacattctaataatgaatttttttgtctttttgttccctcttttcagctttctcaaaattaatggatattaaaaatccccttagccgggcgttggtggcacacacctttaatcccagcactcgggaggcagaggcaggcagatctctgtgagttcgaggccagcctggtctccagattgagtgccaggataggctccaaagctacacagaaaccgtgtctcgaaaaacaaaacaaaaaaataaaaaaaaaaatcccttaactagcccaacctacaagggatgatctttgtctaactatgaactttaaacctcttgaaagcagagtgaataatgcacttcaataatgttgacttccaaaggagagaccaccacaccgttccctgtgcctcttacgcaattcctgcaggggacccccttcagagtagatgttaatgaaatgacttttgtctctcCAGAGCACCTTCCACCATGGCCACCTCAGCAAGTTCCCACTTGAACAAAAACATCAAGCAAATGTACTTGTGCCTGCCCCAGGGTGAGAAAGTCCAAGCCATGTATATCTGGGTTGATGGTACTGGAGAAGGACTGCGCTGCAAAACCCGCACCCTGGACTGTGAGCCCAAGTGTGTAGAAGgtgagcatgggcaggagcaggacatgtgcctggaagtgggcaagcagcctgagatttgaccttccttctgttttgtttgcaaagtctttcaaaagcaggtctcttcaggcctcagtcagtcacccgtaagctgccgagtagtctggaggcatagaaaacaatggaggcctttatttagatggaatcttgtgtgtgctggtacactgaagaaaaatattgggtcatatttgtagggggtgggaggttggagtattgctaacctagccaaccccaggaacctagtttgaaagacctgtaactagaatatgctatcaagtttatagagcagtggttctcaacctttcaaatgctttacacttgaatacaactcctcatgttctggtgattacccccatcccaaccattgctaacttcttaactgaaatttcactactgctacgaatcataatgtatctgtgtttttggatggtcttaggtgacccctgtgaaagggttgtgagaccatcctcaaaggggttgtgacctacaggttgagacccttttgagtgctgtgtttattagtatttatacagtggaattctgggtgcaaagcacatgctccaaagtagtttctctgggactggccatttgttttcgatggggatcttttaaaacttgcaaaggaaccaaaaaaaaaaaaatgcagaaaaaaggaggtgggggagtgcacgcctttaatcccagtacttgggaggcagaggcaggcggatctctgtgagtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccacagagaaaccctgtctcaaaacaaacaaacaaacaaaaaaattaaaaaaaaaaaaaactttcaaaggagacctgttttattttagttgtggcctttgttttggtaggaagggcagctagtttaggatgagtttttattattctaagatgttgccgtttg-3'(서열 번호:31)
CHO GS 서열을 표적화하는 ZFN(예를 들면, 표 1에 나타낸 바와 같은)은 미국 특허원 12/218,035에 기술된 바와 같이 포유동물 발현 벡터내로 조립하여 CHO 세포내로 일시적인 형질감염에 의해 시험하였다.
B. DHFR ZFN
DHFR에 표적화된 ZFN을 설계하여 미국 특허 공보 2008/0015164에 기술된 바와 같이 생산하였다. 본원에 기술된 시험을 위해, 9461/7844 및 9476/9477로 지정된 DHFR ZFN 쌍(표 2에 나타낸 개개의 ZFN)을 사용하였다.
Figure 112011036361645-pct00002
C. FUT8 ZFN
FUT8 에 대해 표적화된 ZFN을 설계하고 미국 일련번호 12/218,035에 기술된 바와 같이 생산하였다. 본원에 기술된 시험을 위해, 12176 및 12172로 지정하고 표 3에 나타낸 FUT8 ZFN을 사용하였다.
Figure 112011036361645-pct00003
상기 ZFN을 암호화하는 서열을 포함하는 플라스미드를 문헌[참조: Urnov et al. (2005) Nature 435(7042):646-651]에 기술된 바와 같이 야생형 FokI 분해 도메인 또는 미국 특허 공보 2008/0131962 및 Miller et al. (2007) Nature Biotech. 25:778-785에 기술된 절대 이종이합체 FokI 분해 도메인에 대한 융합을 통해 필수적으로 작제하였다.
실시예 2: 내인성 GS의 GS-ZFN 변형
GS-표적화된 ZFN이 예측한 바와 같이 내인성 GS 유전자위치로 변형되었는지를 측정하기 위해, GEL-1 미스매치 검정을 제조업자의 지시(Trangenomic SURVEYORTM)에 따라 필수적으로 수행하였다. 요약하면, 적절한 ZFN 플라스미드 쌍을 혈청-함유 배지에서 부착하여 성장하는 CHO K-I 세포 또는 혈청-유리된 화학적으로 정의된 배지에서 현탁액 속에서 성장하는 CHO-S 세포내로 형질감염시켰다.
CHO K-I 세포를 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션으로부터 수득하고 10% 정성된 태아 송아지 혈청(FCS, Hyclone)이 보충된 F-12 배지(Invitrogen) 속에서 추천한 바와 같이 성장시켰다. CHO-S 세포는 Invitrogen(캘리포니아 칼스바드 소재)로부터 입수하였으며 경우에 따라 8mM L-글루타민 및 HT 보충물(100μM 나트륨 하이폭산틴 및 16μM 티미딘)(모두 Invitrogen로 부터 입수, 캘리포니아 칼스바드 소재)이 보충된 화학적으로 정의된 단백질-유리되고 동물 성분-유리된 CD-CHO 배지 속에서 습도-조절된 진탕기 항온처리기(ATR, inc., 매릴랜드 라우렐 소재) 속에서 125 rpm 으로 5% CO2와 함께 37℃로 성장시키고 현탁 배양물로 유지하였다.
부착성 세포를 TrypLE SelectTM 프로테아제(Invitrogen)를 사용하여 플라스틱웨어로부터 해리시켰다. 형질감염을 위해, 1 밀리온의 CHO K-I 세포를 1㎍의 각각의 아연 핑거 뉴클레아제 및 100μL의 Amaxa 용액 T와 혼합하였다. 세포를 Amaxa nucleofector IITM 속에서 프로그램 U-23을 사용하여 형질감염시키고 1.4mL의 온화한 F-12 배지 + 10% FCS내로 회수하였다.
게놈 DNA를 ZFN-처리된 세포로부터 Qiagen DNeasyTM 키트(Qiagen, Inc.)를 사용하여 추출하고, 표적 유전자위치를 ZFN에 의해 표적화된 GS 유전자위치의 영역에 대해 적절한 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭시키고, PCR 생성물을 용융/어닐링 단계에 적용시켜 돌연변이체 및 야생형 DNA의 무작위적인 재-어닐링을 통해 왜곡된 이본체 DNA를 형성시켰다. 이후에, CEL-I 효소(SurveyorTM 돌연변이 검출 키트, Transgenomic, Inc.)를 가하여 미스매치의 부위에서 DNA 이본체를 특이적으로 분해하였다. CEL-I 분해된 시료를 10% TBE 폴리아크릴아미드 겔 상에 용해하고, 에티디움 브로마이드로 염색하여 DNA 밴드를 밀도측정법을 사용하여 정량하였다. NHEJ의 빈도를 문헌[참조: Miller et al. (2007), supra]에 필수적으로 기술된 바와 같이 계산하였다.
도 1a 및 1b에 나타낸 바와 같이, GS ZFN은 내인성 GS 유전자위치를 변형시켰다. 특히, ZFN 9372 및 ZFN 9075를 포함하는 ZFN 쌍은 CHO-KI 세포에서 염색체 중의 26%(야생형 분해 도메인 포함) 및 24%(조작된 절대 이종이합체 형성 분해 도메인 포함)의 변형 및 CHO-S 세포에서 염색체 중의 25%의 변형을 초래하였다(도 1b). 유사하게, ZFN 8361 및 8365(엑손 2에 표적화된)을 포함하는 ZFN 쌍은 염색체 중의 7%의 변형을 초래하였다.
SurveyorTM 뉴클레아제 검정의 결과(도 1a)와 일치하게, 직접적인 서열분석은 NHEJ-매개된 DNA 복구의 대표적인 ZFN 표적 부위에서 돌연변이를 지닌 대립형질 중의 34%((91/266)를 확인하였다[참조: 예를 들면, Weterings et al. (2004) DNA re쌍 (Amst) 3:1425-1435]. 중요하게는, 서열분석된 돌연변이의 81%가 판독 프레임 이동을 초래하였다(도 5).
실시예 3: GS-음성 세포주의 생성
GS를 결여하고 있는 CHO 세포를 생성시키기 위하여, 단일-세포 기원한 세포주를 실시예 2에 기술된 CHO-K1 및 CHO-S 형질감염된 혼주물로부터의 제한 희석으로 분리하였다. ZFN 표적 영역의 서열분석은, 54개의 CHO-S 기원한 세포주 중의 17개(31%)가 적어도 하나의 파괴된 GS 유전자를 가졌으며, 54개 중의 8개(15%)가 돌연변이체 대립형질에 대해 동종접합성이었고, 2개가 이종접합성 화합물이었으며, 나머지 7개가 이종접합성(하나의 야생형 대립형질 포함)이었음을 나타내었다. CHO-K1-기원한 세포주의 경우, 서열분석 분석은 50개 중의 18(36%)가 적어도 하나의 파괴된 GS 대립형질을 가졌으며, 5개(10%)가 제공된 돌연변이에 대해 동종접합성이었다. 또한 동종접합성 돌연변이체 세포주의 유전형을 나타내는 도 1c를 참조한다.
모든 동종접합성 돌연변이체 세포주는 개방 판독 프레임내에서 이동 또는 중요한 아미노산의 프레임내 결실(예를 들면, 세포주 B4, KA2, 및 KA4)을 생성하는 GS 돌연변이를 지니므로, 활성 GS 효소를 생산하지 않는 것으로 예측되었다. 예측한 바와 같이, 동종접합성 돌연변이 세포주 중 어느 것도 야생형 CHO 세포와는 대조적으로, 외인성 L-글루타민의 부재하에 성장하지 않았다(도 1c).
항-GS 모노클로날 항체(BD Biosciences)를 사용하는 웨스턴 블롯 분석은, 프레임 이동 또는 거대한 결실을 갖는 모든 세포가 검출가능한 GS 단백질(예를 들면, 클론 B3, 도 1d)을 발현하지 않았음을 입증하였다. 작은 프레임내 결실(B4 및 KA2)을 지닌 세포주는 웨스턴 블롯에 의해 검출가능한 GS 단백질을 발현하였으나, GS 촉매 활성에 중요한 아미노산 제거와 일치하여, L-글루타민의 부재하에서 세포의 성장을 지지하지 않았다(도 1c). 세포주 B3의 성장은 또한 글루타민 보충에 의존적인 것으로 나타났다(참조: 도 6).
이들의 GS -/- 표현형을 추가로 확인하기 위하여, 3개의 CHO-K1-기원한 클론을 3개월의 기간에 걸쳐 화학적으로 정의된 혈청 유리된 배지 속에서 현탁액으로 성장시키기 위해 채택하였다. 이후에, 당해 세포의 성장 및 생존능을 추가로 4주 동안 강도높게 모니터링하였다(도 1e).
ZFN-생성된 GS -/- 세포주를 L-글루타민의 존재하에 혈청-유리된 현탁 배양물 속에서 일반적으로 성장시켰다(유사한 조건하에서 성장한 산업 표준 CHOK1SV와 유사한 24 내지 27시간의 2배로 되는 시간). L-글루타민의 후속적인 제거는 세포 성장의 즉각적인 중지 및 생존능의 급속한 손실을 초래하였다(참조: 도 1e에서 화살표). 사람 IgG 항체 발현 작제물의 일시적인 형질감염은, 모든 3개의 GS -/- 세포주가 CHOK1SV 세포주를 사용하여 수득된 것들과 비교가능한 이식유전자 발현 수준을 지지하였다.
종합하여, 이들 데이타는 유전적으로 및 표현형적으로 유효한 GS 녹아웃 CHO 세포주의 성공적인 생성을 입증한다.
실시예 4: GS-DHFR 이중 녹아웃 세포주의 생성
이중-녹아웃 세포주를 생성시키기 위해, DHFR 유전자에 표적화된 ZFN를 CHO-S GS -/- 세포주 B3의 배경으로 사용하였다. 상기 GS에 대해 기술된 방법을 사용한 DHFR의 ZFN-매개된 녹아웃은 미국 특허 공보 2008/0015164에 기술되어 있다.
당해 실시예에서는, DHFR 유전자의 2개의 명백한 영역을 표적화하는 ZFN의 2개 쌍을 VHEJ를 통해 분해된 염색체 말단의 보수를 통해 개재 게놈성 단편을 제거할 목적으로 동시 전달하였다. ZFN 특이적인 유전자내 서열의 결실은 단백질 발현, 예를 들면, 도 1d("B4"로 표지된 좌측 패널)을 회복하기 위한 보다 작은 프레임내 돌연변이를 위한 잠재능을 제거하는 보다 크고 보다 우수하게 정의된 돌연변이를 생성하는 것으로 예측되었다.
CHO DHFR 유전자(미국 특허 공보 2008/0015164)의 엑손 1을 표적화하는 앞서 기술된 ZFN 쌍 9461/7844 외에, 엑손 1에 이어 즉시 인트론내 ~240bp 떨어진 부위를 표적화하는 제2 ZFN 쌍을 생성하였다(도 2a 및 도 7a).
일시적인 형질감염을 실시예 3에 기술된 바와 같이 수행하고 엑손 1을 표적화하는 ZFN9461/ZFN7844 쌍, 또는 인트론 부위만을 표적화하는 ZFN9476/ZFN9477(참조: 도 7b 및 7c) 쌍을 사용한 형질감염으로 GS -/- 세포주 B3 중의 각각 15% 및 18%의 내인성 DHFR 유전자위치에서 대립형질 돌연변이 빈도가 수득되었다(도2B). GS -/- 세포주 B3내로 ZFN 쌍 둘다의 동시-형질감염으로 ZFN 결합 부위사이에 예측된 서열의 ~240bp 결실과 일치하는 보다 짧은 PCR 증폭 생성물의 존재가 수득되었다(도 2c). 당해 결실 현상의 빈도는 모든 대립형질 중의 ~8%로 추정되었고 ZFN의 쌍 둘다가 세포내로 도입된 경우에만 관측되었다(도 2c).
추정되는 결실 PCR 단편의 클로닝 및 서열분석은 ZFN 표적 부위사이의 서열의 예측된 절단을 나타내었다(도 8). 재결합된 염색체 말단의 연결부위에서 서열내 관측된 약간의 변화는 NHEJ 보수 방법의 예측된 작은 삽입 및 결실 특성과 일치한다.
단일-세포 기원한 세포주를 도 2c 레인 7에서 ZFN-처리된 혼주물로 부터 제한 희석에 의해 분리하였다. PCR-증폭 및 서열분석은 예측된 ~240bp 결실을 지닌 세포주 중의 9%(200개 중의 18개)를 나타내었다. 이들 세포주 중의 4개(스크리닝된 모든 세포주 중의 2%, 결실을 함유하는 모든 세포주 중의 22%)는 DHFR 유전자 내에 이중대립형질 돌연변이를 지니는 것으로 밝혀졌다(도 2d). 세포주 2B12.8은 엑손 1 및 인트론 1 ZFN 분해 부위 사이에서 개재 영역의 244bp 결실에 대해 동종접합성이다. 세포주 중의 나머지는 240-bp 결실을 지닌 단지 하나의 대립형질을 가진 반면 다른 것은 엑손 및/또는 인트론 ZFN 표적 부위에서 전통적으로 보다 작은 NHEJ 기원 돌연변이를 나타내었다. 예를 들면, 세포주 1F1.6는 대립형질내에서 ~240-bp 결실을 함유하였으나(이중 ZFN 분해 및 결실 현상과 일치), 다른 대립형질은 엑손 1에서 4-bp 결실을 함유함으로써 프레임 이동을 초래하였다.
세포주 1F1.6 및 2B12.8은 완전한 유전자 녹아웃과 일치한 유전형을 가지므로 추가의 특성화를 위해 선택하였다. 웨스턴 블롯 분석은, 이들 단일-세포 기원한 세포주 중 어느 것에서도 완전한 길이의 DHFR 또는 GS 단백질이 존재하지 않음을 나타내었다(도 2e). 또한, 세포주 어느 것도 모 GS -/- 세포주 B3 또는 야생형 CHO 세포와는 대조적으로, DHFR 단백질의 활성 부위에 결합하는 플루오레세인-표지된 메토트렉세이트로 염색되지 않았다. 가장 중요하게는, 1F1.6 및 2B12.8 세포주의 성장은 베양 배지에 하이포크산틴 및 티미딘(HT) 및 L-글루타민의 첨가에 의존적이었다. 대조적으로 모 GS -/- 세포주 B3는 L-글루타민을 필요로하였으나 HT는 필요로 하지 않은 반면, DHFR-음성 CHO 세포주 DG44 (GSWT)는 HT에만을 필요로하였으나 L-글루타민은 필요로하지 않았고 야생형 CHO-S는 성장을 위한 보충물을 필요로 하지 않았다(도 2f).
외인성 HT 및 L-글루타민에 대한 의존성은 세포주 1F1.6 및 2B12.8에서 GS 및 DHFR 활성 둘다의 작용성 손실을 입증한다.
따라서, 종합하면, 이들 데이타는, 유전적으로 및 표현형적으로 입증된 GS-/-/DHFR-/- 이중 녹아웃 CHO 세포주의 성공적인 생성을 입증한다.
실시예 5: GS-DHFR-FUT8 삼중 녹아웃 세포주이 생성
GS, DHFR 및 FUT8의 삼중 녹아웃을 또한 GS-/-DHFR-/-CHO 세포주 IF1.6을 사용하여 생성시켰다. 미국 일련번호 12/218,035에 기술된 바와 같이, 단백질 치료제의 발현시 비-사람 세포, 예를 들면, CHO의 사용으로부터 수득된 비정상적인 글리코실화는 단백질 생성물의 효능, 반감기 및 심지어 면역원성을 변경시킬 수 있다. 따라서, 비-사람 발현 시스템에서 단백질의 글리코실화를 사람화하기 위한 방법이 매우 바람직하다. CHO FUT8 유전자는 GDP-푸코즈로부터의 푸코즈를 N-결합된 올리고사카라이드의 코어 GlcNAc로 이전하는 것을 촉매하는 α1,6-푸코실트랜스퍼라제를 암호화하는 표적이다. 엑손 10내에 암호화된 고도로 보존된 Fut 모티프 II내 아미노산 잔기의 점 돌연변이는 FUT8 효소의 불활성화를 초래한다.
따라서, 본 발명자는 CHO-K1 게놈으로부터 FUT8 엑손 10을 스패닝하고 CHO-K1 게놈으로부터의 인트론을 플랭킹하는 영역을 클로닝하고 서열분석하여 엑손 10을 표적화하는 ZFN을 설계하였다(미국 특허원 12/218,035; 도 3a 및 도 9). ZFN12172/ZFN12176의 세포주 1F1.6내로의 일시적인 전달은 FUT8 대립형질 중의 7.5%의 변형을 초래하였으며(도 3b), 단일-세포 기원한 세포주는 당해 혼주물로부터 제한 희석에 의해 수득되었다.
씨, 그리세우스( C. griseus) FUT8은 시판되는 항체를 사용하여 검출할 수 없으므로, 본 발명자들은 문헌[참조: Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-622]에 기술된 바와 같은, FACS-계 형광성 랜스 쿨리나리스 아글루틴(F-LCA)를 사용하여 α1,6-푸코실트랜스퍼라제 활성을 검정하였다. LCA는 이들의 세포 표면에 코어 푸코실화된 올리고사카라이드를 제시하는 세포에 선택적으로 결합한다. FUT8 활성의 완전한 손실로 인하여 코어 푸코실화를 결실하고 있는 세포는 LCA에 결합하지 않는다. F-LCA에 결합하는 이들의 능력에 대한 ZFN-생성된 세포주의 스크리닝은 세포주 중의 2%(200개 중의 4개)에서 F-LCA 결합이 없음을 나타내었으며 이는, FUT8 효소 활성의 완전한 부재를 나타낸다(도 3c).
게놈성 DNA의 PCR 암플리콘의 서열분석은, 클론 둘다가 FUT8 표적 유전자위치에서 이러한 작용적으로 중요한 영역내에서 판독 프레임내 이동을 암호화하는 이중대립유전자 화합물 이종접합성 돌연변이를 지님을 입증하였다(도 3d). 따라서, 세포주 둘다의 유전형은, 관측된 F-LCA 결합의 결여와 일치하였고(도 3c), 세포주 35F2 및 14C1에서 FUT8의 ZFN 기원한 유전적 및 작용적 녹아웃을 입증한다. FUT8-/- 클론 둘다는 또한 이들의 GS-/- 및 DHFR-/- 유전형 및 표현형을 다수 라운드의 ZFN 형질감염 및 단일-세포 클로닝 전체에서 안정하게 유지하였다. 또한, 삼중 녹아웃 세포주의 생성은 클론 35F2 및 14C1에 대해 각각 21.8 및 21.6 시간의 집단이 2배로 되는 평균 시간을 제공하는 HT 및 L-글루타민이 보충된 혈청-함유 배지에서의 성장 속도 연구에 의해 측정된 바와 같이 매우-내성이었다. 총괄하여 이들 데이타는, 조작된 ZFN을 사용한 CHO 세포내에서 단일, 이중 및 삼중 유전자 녹아웃의 성공적인 생성을 입증한다.
실시예 6: GR-CCR5-PPP1R12C 삼중 녹아웃 세포주의 생성
삼중 녹아웃 세포주를 또한 불활성화 ZFN의 동시 투여로 생성시켰다. 특히, CCR5, 글루코코르티코이드 수용체(GR) 및 PPP1R12C(또한 아데노 관련 바이러스 통합 부위 또는 "AAVS1"으로서 공지됨)가 불활성화된 K562 세포주를 또한 이들 유전자위치에 표적화된 ZFN을 동시 적용시켜 생성하였다.
CCR5, GR 및 AAVS1에 대해 표적화된 ZFN을 미국 특허 공보 20080159996(CCR5); 20080188000(GR) 및 미국 특허원 12/150,103(PPP1R12C/AAVS1)에 기술된 바와 같이 생성시켰다. 이들 유전자의 일부에서 ZFN 결합 부위를 나타내는 개략도를 표 10A에 나타낸다. CCR5 유전자는 3개의 엑손을 함유하며, 암호화 서열(CDS)은 엑손 3내에 위치하고, CCR5 ZFN 표적 서열은 나타낸 바와 같이 CDS내에 위치한다. GR 유전자는 9개의 엑손을 함유하며, GR ZFN 표적 서열은 엑손 3내에 위치한다. AAVS1 ZFN 표적 서열은 AAVS1 영역의 중간에 위치한다.
야생형, ZFN-Fok I(wt) 또는 Fok I의 촉매 도메인의 절대 이종이량체 EL/KK 변이체, ZFN-Fok I(EL/KK)에 연결된 ZFN의 쌍을 암호화하는 플라스미드를 K562 세포내로 일시에 동시-형질감염시키고, CCR5(좌측), GR(중간), AAVS1(우측) 유전자위치에서 변형 빈도를 SurveyorTM 뉴클레아제 검정에 의해 형질감염 후 10일 째에 각각 측정하였다. 도 10b에 나타낸 바와 같이, 표적 유전자는 NHEJ에 이은 ZFN 처리에 적용시켰다.
이들 삼중-녹아웃 세포의 단일-세포 기원한 세포주를 또한 PCR 및 위에서 기술한 게놈성 DNA의 서열분석으로 평가하였다. 특히, CCR5 ZFN-Fok I(EL/KK) + GR ZFN-Fok I(EL/KK) + AAVS1 ZFN-Fok I(EL/KK)로 처리한, 도 10b에서 레인 8 시료들을 시험하였다. PCR 프라이머를 설계하여 결실이 있는 서열이 아닌, 변형되지 않은 야생형(wt) 서열을 특이적으로 증폭시켰다.
결과는 다음 표 4에서 하기 나타낸다. wt 서열(wt 또는 이종접합성)을 함유하는 모든 클론은 예측된 크기의 가시성 PCR 밴드를 가졌으나, 녹-아웃(KO) 클론은 가시성 PCR 밴드를 갖지 않았다. CCR5 PCR로 스크리닝한 144개 단일 세포 클론 중에서 5개 클론이 CCR5 KO를 함유한다. 9개의 클론이 GR PCR에 의해 GR KO로서 확인되었다. 이들 클론중 2개는 CCR5 KO 및 GR KO 둘다를 함유한다. CCR5 PCR 또는 GR PCR을 기초로 한 KO 클론인, 모든 12개의 클론을 AAVS1 PCR로 스크리닝하였다. 스크리닝된 144개의 클론 중에서, 1개의 CCR5 단일 KO 클론이 확인되었으며, 7개의 GR 단일 KO 클론이 확인되었으나, AAVS1 단일 KO 클론을 확인하기 위한 시도는 하지 않았다. 하나의 CCR5/GR 이중 KO 클론이 확인되었다. 2개의 CCR5/AAVS1 이중 KO 클론이 확인되었다. GR/AAVS1 이중 KO 클론은 보다 많은 클론을 스크리닝하는 경우 확인될 가능성이 매우 높다해도, 144개 클론중에서는 GR/AAVS1 이중 KO 클론이 확인되지 않았다. 하나의 CCR5/GR/AAVS1 삼중 KO 클론(B17)은 확인되었다.
Figure 112011036361645-pct00004
삼중 녹아웃 클론 B17의 예시적인 서열분석 데이타는 도 10c에 나타낸다. ZFN 표적 서열은 밑줄쳐져 있다. '-'는 결실을 나타내고, 굵은 문자는 삽입을 나타낸다.
실시예 7: 다수 종 및 세포 유형에서 활성인 GS-표적화된 ZFN
본원에 기술된 GS 특이적인 ZFN(사람 CHO 세포 GS 서열로 지정)을 또한 마우스 세포내에서 평가하였다. 도 11a 및 11b에 나타낸 바와 같이, GS내 ZFN 표적 부위는 종간에 잘 보존되어 있었다.
ZFN 쌍 8361/8365(엑손 2에 표적화됨) 및 9075/9372(엑손 6에 표적화됨)를 상기 실시예 2에서 기술한 바와 같이 사람 K562 및 마우스 Neuro2a 세포에서 GS를 분해하는 이들의 능력에 대해 평가하였다.
도 12에 나타낸 바와 같이, CHO GS 서열로 지정된 ZFN는 다른 사람 세포 유형 및 다른 종에서 작용성이었다.
GS 특이적인 ZFN(ZFN 9075 및 ZFN 9372)을 또한 사람 배아 신장 HEK293 세포에서 실시예 2에 기술한 바와 같이 시험하였다. 도 14a에 나타낸 바와 같이, CEL-I 효소(SurveyorTM 돌연변이 검출 키트, Transgenomic, Inc.)는 21%의 NHEJ 발생율을 나타내었다.
GS 녹아웃 세포주를 동일한 GS ZFN을 사용하는 CHO 세포에서와 동일한 시도를 사용하여 HEK293 세포를 배경으로 제조하였다(참조: 실시예 3). 2개의 녹아웃 클론, 클론 g17 및 g52를 추가로 특성화하였다. 클론 g52는 GS 유전자위치에서 11개 bp-결실에 대해 동종접합성이다. 클론 17은 하나의 GS 대립형질에서 169bp-결실 및 다른 대립형질에서 4 bp-삽입을 가지고 있다. 도 14b에 나타낸 바와 같이, 어느 클론도 웨스턴 블롯팅에 의해 측정된 것으로서 GS 단백질을 발현하지 않았다. 중요하게는, 클론들 둘다는 성장을 위해 외인성으로 보충된 L-글루타민을 필요로하였다(참조: 도 14c).
따라서, ZFN을 사용하여 표적 유전자의 연속적인 또는 동시 불활성화에 의해 단일 포유동물 세포주에서 다수의 유전자를 신속하게 녹아웃시킬 수 있다. 본원에 나타낸 결과들은 세포주 또는 ZFN의 선택에 의존적이지 않다. 선택 마커에 있어서의 의존성 결여와 결합된, 각각의 개개 유전자에서 ZFN-기원한 이중대립형질성 녹아웃 현상의 빈도(>1%)는 이러한 유전자 병변을 신속하게 "다량화(stack)"하는 능력을 초래하며 앞서 실제적이지 않은 것으로 고려된 복잡한 다중-유전자 녹아웃 세포주를 생성한다. 단지 일시적인 ZFN 발현에 이은 유전자 녹아웃의 높은 효능 및 진핵 세포에서 다중 특성을 다량화하는 능력은, 이를 필수적으로 어떠한 세포 유형의 통상의 유전적 조작을 수행하기에 용이하도록 한다.
본원에 언급된 모든 특허, 특허원 및 공보는 이의 전문이 본원에 참조로 인용되어 있다.
비록 기재내용이 명확한 이해 목적을 위해 나열 및 실시예의 방식으로 일부 상세히 제공되어 있다 하더라도, 당해 분야의 숙련가에게는 다양한 변화 및 변형이 본 기재내용의 취지 또는 영역을 벗어남이 없이 실시될 수 있음이 명백할 것이다. 따라서, 앞서의 기술 및 실시예는 제한하는 것으로 고려되어서는 안된다.
SEQUENCE LISTING <110> SANGAMO BIOSCIENCES, INC. <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR INACTIVATING GLUTAMINE SYNTHETASE GENE EXPRESSION <130> 8325-0066.40 <140> PCT/US2009/005865 <141> 2009-10-29 <150> 61/197,600 <151> 2008-10-29 <160> 185 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger target sequence: ZFN 9075/ZFN 7858 <400> 1 gaatggtgca ggctgc 16 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger binding domain <400> 2 Gln Ser Ser Asp Leu Ser Arg 1 5 <210> 3 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger binding domain <400> 3 Arg Ser Asp Asn Leu Arg Glu 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger binding domain <400> 4 Arg Ser Asp Thr Leu Ser Asn 1 5 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Chemically synthesized zinc finger binding domain <400> 5 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acttgaatac aactcctcat 2040 gttctggtga ttacccccat cccaaccatt gctaacttct taactgaaat ttcactactg 2100 ctacgaatca taatgtatct gtgtttttgg atggtcttag gtgacccctg tgaaagggtt 2160 gtgagaccat cctcaaaggg gttgtgacct acaggttgag acccttttga gtgctgtgtt 2220 tattagtatt tatacagtgg aattctgggt gcaaagcaca tgctccaaag tagtttctct 2280 gggactggcc atttgttttc gatggggatc ttttaaaact tgcaaaggaa ccaaaaaaaa 2340 aaaaatgcag aaaaaaggag gtgggggagt gcacgccttt aatcccagta cttgggaggc 2400 agaggcaggc ggatctctgt gagtttgaga ccagcctggt ctacaagagc tagttccagg 2460 acagcctcca aagccacaga gaaaccctgt ctcaaaacaa acaaacaaac aaaaaaatta 2520 aaaaaaaaaa aaactttcaa aggagacctg ttttatttta gttgtggcct ttgttttggt 2580 aggaagggca gctagtttag gatgagtttt tattattcta agatgttgcc gtttgagtga 2640 atgaatgacc agatgacagc atataacatg tacttgttac ttggcagaag taggtaggtc 2700 gttctgtttc tgccttcagc tcataggtaa ctggggagac aaactggccc caaaacaagg 2760 aaaaggaaca agtggtagga gagcaactgt ttcctcatct acaagagcac agcctgagct 2820 acaacagtca ggcccggaga gggatgagag aagggagggg atgaggtggc ctagtgaggg 2880 agtcagtttt gctctgtgcc atgagtgtct cactcactgg aagtggtgtc agaatgactg 2940 gtgcacagta gacttacaga gaggactcat ctgtttgttg cttgggtggt tcttgtgatg 3000 cagtgctctt gggaacctca gaaggaggaa catagggata ggtgggcata gacatcaggt 3060 tgtccctaat taatgatgat acatttacat acatgccact cagaagacac agtagatttt 3120 cagtgatgga aatatgatga gaggctagct gtcttgtgtg tatattttta ataaattttt 3180 aataaatttc atgtgtgtga gtcagtgcgt gtgtgcgttt gctcgcccag tgctgtgcca 3240 gcagaggtct gaggagggtg tgagaatccc aggaactgaa gttaacagtt gtggttaaga 3300 gtacttatca ctcagttacc agcacctaca tggtggctca caaccatctg taactccaat 3360 ttcaggggct ccaaccccct cttctgcagg catacacttg cacagatata catgcaagta 3420 aaacacccct acacacataa aaataaatac gtcttcttaa aagttaattt tccatcttta 3480 tttggcccag agttacctga gtggaatttt gatggctcta gtacctttca gtctgagggc 3540 tccaacagtg acatgtatct cagccctgtt gccatgtttc gggacccctt ccgcagagat 3600 cccaacaagc tggtgttctg tgaagttttc aagtacaacc ggaagcctgc aggtgtgtat 3660 ggggtgggcg tgaatgtctt aagaatctag ggatggatga tcagatgtcc atccttctac 3720 cctgaacttg cctgctgaaa aacagtgtgg tccgcccctc catggtccct tttattggtt 3780 gtataaacag tgttgaatct tccatctgtt tgctgatagg ggtccccagt gacagtcttg 3840 atctgcttct acatttaaaa agctgtaatt cgtacttaag cgttttgggg tttaactact 3900 agatctgcca tttattgcca gtgaccttgg catactttgc cccatgcttc tattttgctg 3960 aattatgtgt agagagagac gagacagagc atgcttgaac tgagggcgta ctgtgctctg 4020 tgtggaagtc aaccgacaac ctgtggaatc agttctctcc tgctgtattt gtagattctg 4080 gaggtggaac tcaggttgcc atgagcatta tgattcctgg ctaagctgtt tgcccatgaa 4140 gccttctgta cctgctcata gaattttgtt tatgccgtgc tatccatact cagttttcag 4200 atagcttctt aaacccaggg aactctaatt tacataaact ctcttccagt actgccagta 4260 aggcttggtg gccctatacc ttcagtacct ctgttttgaa aaggaagtat tgttggtcaa 4320 gggtatgtac ctcagcatgg cagccatggg gttcctggct gtgccgcttg ccctataacc 4380 tgggcacgtc accaaacacc ctctctcagg gcttcatttt ctcatttgtg aaagtgaaga 4440 ttgctaacac tcatctcaaa ctcagttaaa tgataaattg cttttctagc ttgggaattg 4500 ttttcagtta cactcacctc tccctcgctt tctctctctt ttttgtacca gccaatactg 4560 tgtaatttag cactcagact cacctggaat gtaaacctaa tggacaaatt attctcagta 4620 aaatgacagc tctggcctta agtgcctacg aaactaggga atacgtttga caagcaggag 4680 cagctgtctt gtgaatagag ggtggaagtg tctggcatgt ggtacttgga aagtggccag 4740 cgtgcagata ggatgaacac ttgttttgct ctcactccat tcccatgaga tttcatagct 4800 gactttaatt ataaaaagtc tctcagcctt ttcctgcaaa tgtactatca ttgcttcttc 4860 acagtggttg ggcctgagta ggtccagcct atgatgactt cagctgtgta agagttgagg 4920 acactactcc ttacagcatg ttgatgcttt attcctagag accaatttaa ggcactcgtg 4980 taaacggata atggacatgg tgagcaacca gcacccctgg tttggaatgg aacaggagta 5040 tactctgatg ggaacagatg ggcacccttt tggttggcct tccaatggct ttcctgggcc 5100 ccaaggtaag ttccccaggt gaaataaaag cttcctcccc ataagttctt actgtccaga 5160 gacaggagca gctcccaaat cagcaaacag actggcagct gaaaataaca gactgtcctt 5220 gcatccctca aatccagatg tgctttgaat ttaaagtgac aggatggtga tgagatggct 5280 cagtgggtaa aggtgcttgc caccaggctt gacagcccga gtttatccct gagacccata 5340 taagttattc tctgaccatc tgcacatgca tgcatataca 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Synthetic oligonucleotide used in FUT8 gene analysis <400> 82 aaaagagtgt atctggccac tgatgaccct tctttgttaa aggaggcaaa gacaaagtaa 60 gtt 63 <210> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic peptide used in FUT8 gene analysis <400> 83 Lys Arg Val Tyr Leu Ala Thr Asp Asp Pro Ser Leu Leu Lys Glu Ala 1 5 10 15 Lys Thr <210> 84 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide used in FUT8 gene analysis <400> 84 aaaagagtgt atctggccac tgatgaccct tcttaaagga ggcaaagaca aagtaagtt 59 <210> 85 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide used in FUT8 gene analysis <400> 85 aaaagagtgt atctggccac tgatgaccct tttaaaggag gcaaagacaa agtaagtt 58 <210> 86 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide used in FUT8 gene analysis <400> 86 aaaagagtgt atctggccac tgatgaccct tctttggtta aaggaggcaa agacaaagta 60 agtt 64 <210> 87 <211> 67 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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caactttagc accaaggcca tgcgggac 88 <210> 94 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 94 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaaca atggtgcagg ctgccatacc 60 aactttagca ccaaggccat gcgggag 87 <210> 95 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 95 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaata atggtgcagg ctgccatacc 60 aactttagca ccaaggccat gcgggag 87 <210> 96 <211> 87 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 96 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggggtgcagg ctgccatacc 60 aactttagca ccaaggccat gcgggac 87 <210> 97 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 97 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact gggtgcaggc tgccatacca 60 actttagcac caaggccatg cgggag 86 <210> 98 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 98 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgctggaa tggtgcaggc tgccatacca 60 actttagcac caaggccatg cgggag 86 <210> 99 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 99 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaatt tggtgcaggc tgccatacca 60 actttagcac caaggccatg cgggag 86 <210> 100 <211> 86 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 100 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaaaa tggtgcaggc tgccatacca 60 actttagcac caaggccatg cgggag 86 <210> 101 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 101 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggtgcaggct gccataccaa 60 ctttagcacc aaggccatgc gggag 85 <210> 102 <211> 85 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 102 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaaat ggtgcaggct gccataccaa 60 ctttagcacc aaggccatgc gggag 85 <210> 103 <211> 84 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 103 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaatg gtgcaggctg ccataccaac 60 tttagcacca aggccatgcg ggag 84 <210> 104 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 104 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggatgg tgcaggctgc cataccaact 60 ttagcaccaa ggccatgcgg gag 83 <210> 105 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 105 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctggaatgg tgcaggctgc cataccaact 60 ttagcaccaa ggccatgcgg gag 83 <210> 106 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 106 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt ctggaatggt gcaggctgcc ataccaactt 60 tagcaccaag gccatgcggg ag 82 <210> 107 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 107 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggtggt gcaggctgcc ataccaactt 60 tagcaccaag gccatgcggg ag 82 <210> 108 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 108 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctggtggtg caggctgcca taccaacttt 60 agcaccaagg ccatgcggga g 81 <210> 109 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 109 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggggctgcca taccaacttt 60 agcaccaagg ccatgcggga g 81 <210> 110 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 110 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaacc aggctgccat accaacttta 60 gcaccaaggc catgcgggag 80 <210> 111 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 111 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctggtgcag gctgccatac caactttagc 60 accaaggcca tgcgggag 78 <210> 112 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 112 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccaaa atggtgcagg ctgccatacc aactttagca 60 ccaaggccat gcgggag 77 <210> 113 <211> 75 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 113 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccaat ggtgcaggct gccataccaa ctttagcacc 60 aaggccatgc gggag 75 <210> 114 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 114 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggctgc cataccaact ttagcaccaa 60 ggccatgcgg gag 73 <210> 115 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 115 gtaatagcaa cctttgaccc ctggaatggt gcaggctgcc ataccaactt tagcaccaag 60 gccatgcggg ag 72 <210> 116 <211> 70 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 116 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt aggctgccat accaacttta gcaccaaggc 60 catgcgggag 70 <210> 117 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 117 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccgca ggctgccata ccaactttag caccaaggcc 60 atgcgggag 69 <210> 118 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 118 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctggccata ccaactttag caccaaggcc 60 atgcgggag 69 <210> 119 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 119 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt ccaactttag caccaaggcc atgcgggag 59 <210> 120 <211> 59 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 120 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgctttag caccaaggcc atgcgggag 59 <210> 121 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 121 gtaatagcaa cctttgaccc caagccatac caactttagc accaaggcca tgcgggag 58 <210> 122 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 122 gtaatagcaa cctttgaccc caagccaagg ccatgcggga g 41 <210> 123 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 123 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaacg tggaatggtg caggctgcca 60 taccaacttt agcaccaagg ccatgcggga 90 <210> 124 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 124 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact gggaatggtg caggctgcca 60 taccaacttt agcaccaagg ccatgcggga 90 <210> 125 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 125 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggtaatggtg caggctgcca 60 taccaacttt agcaccaagg ccatgcggga 90 <210> 126 <211> 90 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 126 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggaaatggtg caggctgcca 60 taccaacttt agcaccaagg ccatgcggga 90 <210> 127 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 127 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggtggaatgg tgcaggctgc 60 cataccaact ttagcaccaa ggccatgcgg gag 93 <210> 128 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 128 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggctggaatg gtgcaggctg 60 ccataccaac tttagcacca aggccatgcg ggag 94 <210> 129 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 129 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact ggactggaat ggtgcaggct 60 gccataccaa ctttagcacc aaggccatgc ggga 94 <210> 130 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 130 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaatg ggatgggaat ggtgcaggct 60 gccataccaa ctttagcacc aaggccatgc ggga 94 <210> 131 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 131 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggcttt cactggtgag ccatggtgca 60 ggctgccata ccaactttag caccaaggcc atgc 94 <210> 132 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic GS locus from ZFN transfected cells <400> 132 gtaatagcaa cctttgaccc caagcccatt cctgggaact gggggcccca taagccctgt 60 ctcatggtgc aggctgccat accaacttta gcac 94 <210> 133 <211> 572 <212> DNA <213> Cricetulus longicaudatus <400> 133 gggaagcagc gccgggcgac tgcaatttcg cgccaaactt gggggaagca cagcgtacag 60 gctgcctagg tgatcgctgc tgctgccatg gttcgaccgc tgaactgcat cgtcgccgtg 120 tcccagaata tgggcatcgg caagaacgga gaccttccct ggccaatgct caggtactgg 180 ctggattggg ttagggaaac cgaggcggtt cgctgaatcg ggtcgagcac ttggcggaga 240 cgcgcgggcc aactacttag ggacagtcat gaggggtagg cccgccggct gcagcccttg 300 cccatgcccg cggtgatccc catgctgtgc cagcctttgc ccagaggcgc tctagctggg 360 agcaaagtcc ggtcactggg cagcaccacc ccccggactt gcatgggtag ccgctgagat 420 ggagcctgag cacacgtgac agggtccctg ttaacgcagt gtttctctaa ctttcaggaa 480 cgaattcaag tacttccaaa gaatgaccac cacctcctca gtggaaggta atttggggtt 540 aagatgagga ttctagggtt tgtatgaagc aa 572 <210> 134 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence containing ZFN7844 <400> 134 gtcgccgtgt cccagaatat gggcatcggc aagaacggag accttccctg gccaatgctc 60 aggtactggc tggattgggt ta 82 <210> 135 <211> 82 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence containing ZFN9461 <400> 135 taacccaatc cagccagtac ctgagcattg gccagggaag gtctccgttc ttgccgatgc 60 ccatattctg ggacacggcg ac 82 <210> 136 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence containing ZFN9476 <400> 136 gcaaagtccg gtcactgggc agcaccaccc cccggacttg catgggtagc cgctgagatg 60 gagcctgagc acacgtgaca g 81 <210> 137 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence containing ZFN9477 <400> 137 ctgtcacgtg tgctcaggct ccatctgagc ggctacccat gcaagtccgg ggggtggtgc 60 tgcccagtga ccggactttg c 81 <210> 138 <211> 114 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 138 atcggcaaga acggagacct tccctggcca atgctcaggt actggctgga ttgggcactg 60 ggcagcacca ccccccggac ttgcatgggt agccgctgag atggagcctg agca 114 <210> 139 <211> 63 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 139 atcggcaaga acggagacct tccctggcct tgcatgggta gccgctgaga tggagcctga 60 gca 63 <210> 140 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 140 atcggcaaga acggagacct tccctggctt gcatgggtag ccgctgagat ggagcctgag 60 ca 62 <210> 141 <211> 62 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 141 atcggcaaga acggagacct tccctggctt gcatgggtag ccgctgagat ggagcctgag 60 ca 62 <210> 142 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 142 atcggcaaga acggagacct tccctggcat gggtagccgc tgagatggag cctgagca 58 <210> 143 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 143 atcggcaaga acggagacct tccctggcgg gtagccgctg agatggagcc tgagca 56 <210> 144 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 144 atcggcaaga acggagacct tcccttgcgg gtagccgctg agatggagcc tgagca 56 <210> 145 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 145 atcggcaaga acggagacct tccctggcgt agccgctgag atggagcctg agca 54 <210> 146 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 146 atcggcaaga acggagacct tccctgagcc gctgagatgg agcctgagca 50 <210> 147 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 147 atcggcaaga acggagacct tccccgctga gatggagcct gagca 45 <210> 148 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 148 atcggcaaga acggagacct tcttgcatgg gtagccgctg agatggagcc tgagca 56 <210> 149 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 149 atcggcaaga acggagacct tgcatgggta gccgctgaga tggagcctga gca 53 <210> 150 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from sequencing of genomic DHFR locus from ZFN transfected cells <400> 150 atcggcaaga acggagacct tatggggcct gagca 35 <210> 151 <211> 484 <212> DNA <213> Cricetulus longicaudatus <400> 151 aacattcagc tatgttaaag tatttgtgaa gtgttttgaa atgattttat attttctaag 60 gtgagaataa atgagaaaat gttttaatat gtctccagtg cccccatgac tagggatact 120 aattgagtac cagtacatta tcagtgtgct ctccacttct ccccagagtc catgtcagac 180 gcactgacaa agtgggaaca gaagcagcct tccatcccat tgaggaatac atggtacacg 240 ttgaagaaca ttttcagctt ctcgaacgca gaatgaaagt ggataaaaaa agagtgtatc 300 tggccactga tgacccttct ttgttaaagg aggcaaagac aaagtaagtt agaccaacaa 360 gtggttctgt atgggattat ctcttagttg aagaaaatcc ttaattctgg gaacttgtgg 420 ttcttgttgc taactaatag gttccaaaat caaagactac atgtgcaaat attaatctaa 480 tcaa 484 <210> 152 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence containing ZFN12172 <400> 152 ataaaaaaag agtgtatctg gccactgatg acccttcttt gttaaaggag gcaaagacaa 60 agtaagtt 68 <210> 153 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence containing ZFN12176 <400> 153 aacttacttt gtctttgcct cctttaacaa agaagggtca tcagtggcca gatacactct 60 ttttttat 68 <210> 154 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger target sequence: ZFN 12176 <400> 154 caaagaaggg tcatcagtg 19 <210> 155 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic zinc finger target sequence: ZFN 12172 <400> 155 taaaggaggc aaagacaaag ta 22 <210> 156 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 156 ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcatcctg ataaactgca aaaggctgaa 60 gagcatgact gacatctacc 80 <210> 157 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 157 ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcctgata aactgcaaaa ggctgaagag 60 catgactgac atctacc 77 <210> 158 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 158 ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcatcaaa aggctgaaga gcatgactga 60 catctacc 68 <210> 159 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 159 ctttggtttt gtgggcaaca tgctggtcat cctcatcctg atctgataaa ctgcaaaagg 60 ctgaagagca tgactgacat 80 <210> 160 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 160 gaccagatgt aagctctcct ccatccagct cctcaacagc aacaacagga ccacctccca 60 aactctgcct ggtgtgctct 80 <210> 161 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 161 gaccagatgt aagctctcct ccatccagct cctcaagcaa caacaggacc acctcccaaa 60 ctctgcctgg tgtgctct 78 <210> 162 <211> 71 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 162 gaccagatgt aagctctcct ccatccagct cctcaacagg accacctccc aaactctgcc 60 tggtgtgctc t 71 <210> 163 <211> 68 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 163 gaccagatgt aagctctcct ccatccagct cctcaggacc acctcccaaa ctctgcctgg 60 tgtgctct 68 <210> 164 <211> 80 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 164 ctgggtactt ttatctgtcc cctccacccc acagtggggc cactagggac aggattggtg 60 acagaaaagc cccatcctta 80 <210> 165 <211> 61 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic sequence resulting from knockout clone analysis <400> 165 ctgggtactt ttatctgtcc cctccacccc acagattggt gacagaaaag ccccatcctt 60 a 61 <210> 166 <211> 70 <212> DNA <213> Cricetulus longicaudatus <400> 166 tttgcagcgc agtccttctc cagtaccatc aacccagata tacatggctt ggactttctc 60 accctggggc 70 <210> 167 <211> 70 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 cttgcagcgc agtccttctc cagtaccatc gatccagata tacatggcct ggactttctc 60 accctgaggc 70 <210> 168 <211> 70 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 168 cttgcagcgc agtccttctc cggtaccatc aacccagata tacatggctt ggactttctc 60 accctggggc 70 <210> 169 <211> 69 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 169 attgcagcat agtccttctc cagcaccatt gacctagata tacatggctt ggatttctca 60 ccctaagcc 69 <210> 170 <211> 70 <212> DNA <213> Canine sp. <400> 170 cttgcaacgt aatccttctc cagtcccgtc aatccaaata tacatagctt gcactttctc 60 gccctgaggc 70 <210> 171 <211> 70 <212> DNA <213> Didelphis sp. <400> 171 tttacagcgc agaccctcat cagtgccatc aatccagata tacatagcct ggactttgtt 60 gccttgaggc 70 <210> 172 <211> 70 <212> DNA <213> Gallus sp. <400> 172 tttgcagcgg aggtgctccc cagtcccgtc gatccagatg tacatggctt ggaccttctc 60 cccctgcggc 70 <210> 173 <211> 70 <212> DNA <213> X. tropicalis <400> 173 cttgcagcga agaccctccc cggtcccatc aacccagatg tacatagcct gcaccttatc 60 tccctgtggc 70 <210> 174 <211> 70 <212> DNA <213> Tetraodon sp. <400> 174 tttgcagcgt agtccttctc ctgttccatc aatccaaata tacatggcct gaactttatc 60 cccctgtggg 70 <210> 175 <211> 70 <212> DNA <213> Cricetulus longicaudatus <400> 175 gctaaagttg gtatggcagc ctgcaccatt ccagttccca ggaatgggct tggggtcaaa 60 ggttgctatt 70 <210> 176 <211> 70 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 176 gctgaagttg gtatggcagc ctgcaccatt ccagttccca ggaatgggct taggatcaaa 60 ggttgctatc 70 <210> 177 <211> 70 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 177 gctgaagttg gtatggcagc ctgcaccatt ccagttccct ggaatgggct tggggtcaaa 60 ggttgctatc 70 <210> 178 <211> 70 <212> DNA <213> Rattus sp. <400> 178 gctaaaattg atttatcagc ctgcactatc accattctca agactcagtc ttggatcaaa 60 ggtcactatt 70 <210> 179 <211> 70 <212> DNA <213> Canine sp. <400> 179 gctgaagttg gtgtggcagc ctgcaccatt ccagtttccg ggaatgggct taggatcaaa 60 ggttgctatc 70 <210> 180 <211> 70 <212> DNA <213> Didelphis sp. <400> 180 actgaagtta gtgtggcaac cagctccatt ccagttccca gggattggct tgggatcaaa 60 tgatacaatc 70 <210> 181 <211> 70 <212> DNA <213> Gallus sp. <400> 181 gctgaagttg gtgtgacagc cagcaccgtt ccagttccca gggatgggtt tgggatcgaa 60 ggacacaatg 70 <210> 182 <211> 70 <212> DNA <213> X. tropicalis <400> 182 actgtagttg gtatggcaac cagcgccgtt ccagtttccg gtcatgggct tggggtccag 60 cgtggccacc 70 <210> 183 <211> 70 <212> DNA <213> Tetraodon sp. <400> 183 gctgaagttt gtatggcagc cagcaccgtt ccagttccct gggattggct tggggtcaaa 60 tgaggcaatg 70 <210> 184 <211> 70 <212> DNA <213> Fugu rubripes <400> 184 gctgaagttg gtatggcagc cggcgccgtt ccagttcccg gagatcggtt tggggtcgaa 60 ggaggcgacg 70 <210> 185 <211> 70 <212> DNA <213> Danio rerio <400> 185 gttgaagtta gtgtggcaac cagcaccatt ccagttgcct gggatcggct taggatcaaa 60 tgaagctacc 70

Claims (15)

  1. 포유동물 세포에서 내인성 글루타민 신테타제(GS)의 부분적 또는 완전한 불활성화에 사용하기 위하여 글루타민 신테타제의 엑손 2 또는 엑손 6 내의 표적 부위에 결합하는 아연 핑거 DNA-결합 도메인으로서,
    (i) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 1인,
    서열 번호: 2로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 3으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 4로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 및 서열 번호: 5로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4;
    (ii) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 6인,
    서열 번호: 7로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 8로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 9로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 서열 번호: 10으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4, 서열 번호: 11로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 5, 및 서열 번호: 12로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 6;
    (iii) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 13인,
    서열 번호: 14로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 15로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 16으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 및 서열 번호: 17로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4;
    (iv) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 18인,
    서열 번호: 7로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 8로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 19로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 및 서열 번호: 20으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4;
    (v) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 21인,
    서열 번호: 2로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 3으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 22로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 및 서열 번호: 15로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4;
    (vi) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 23인,
    서열 번호: 2로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 3으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 24로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 및 서열 번호: 25로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4;
    (vii) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 1인,
    서열 번호: 2로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 3으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 26으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 및 서열 번호: 15로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4;
    (viii) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 27인,
    서열 번호: 9로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 10으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 11로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 및 서열 번호: 12로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4; 또는
    (ix) 아연 핑거 DNA-결합 도메인의 표적 서열은 서열 번호: 28인,
    서열 번호: 9로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 1, 서열 번호: 29로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 2, 서열 번호: 9로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 3, 서열 번호: 10으로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 4, 서열 번호: 11로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 5, 및 서열 번호: 12로 이루어진 인지 나선 영역을 포함하는 아연 핑거 6
    을 포함하는 것을 특징으로 하는 아연 핑거 DNA-결합 도메인.
  2. 청구항 1에 따른 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 적어도 하나의 분해 도메인 또는 적어도 하나의 분해 반-도메인(cleavage half-domain)을 포함하는 융합 단백질.
  3. 청구항 2에 있어서, 상기 분해 반-도메인이 야생형 또는 조작된 FokI분해 반-도메인인 융합 단백질.
  4. 청구항 1에 따른 아연 핑거 DNA 결합 도메인 또는 청구항 2 또는 3에 따른 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 청구항 1에 따른 아연 핑거 DNA 결합 도메인 또는 청구항 2 또는 3에 따른 단백질 또는 청구항 4에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 분리된 세포.
  6. 글루타민 신테타제(GS)가 청구항 2 또는 3에 따른 융합 단백질에 의해 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 세포주.
  7. (a) (i) 내인성 GS 유전자내 제1 표적 부위에 결합하도록 조작된 청구항 1에 따른 아연 핑거 DNA 결합 도메인; 및
    (ii) 분해 도메인을 포함하는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 세포내로 도입시켜 폴리펩타이드가 세포내에서 발현되도록 함으로써, 폴리펩타이드가 표적 부위에 결합하여 GS 유전자를 분해하는 것을 포함하는, 세포내에서 내인성 세포 GS 유전자를 불활성화시키는 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    (i) GS 유전자내 제2 표적 부위에 결합하도록 조작된 청구항 1에 따른 아연 핑거 DNA 결합 도메인; 및
    (ii) 분해 도메인을 포함하는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 도입함으로써, 제2 폴리펩타이드가 세포내에서 발현되도록 하여, 제1 및 제2 폴리펩타이드가 이들 각각의 표적 부위에 결합하여 GS 유전자를 분해하도록 하는 것을 포함하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드가 동일한 핵산에 의해 또는 상이한 핵산에 의해 암호화된 방법.
  10. 청구항 7 내지 9 중의 어느 한 항에 있어서, 세포내에서 DHFR 유전자를 불활성화시킴을 추가로 포함하는 방법.
  11. 청구항 7 내지 9 중의 어느 한 항에 있어서, 세포내에서 FUT8 유전자를 불활성화시킴을 추가로 포함하는 방법.
  12. (a) 내인성 GS 유전자를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 단계;
    (b) 숙주 세포의 내인성 GS 유전자를 청구항 7 내지 청구항 9 중의 어느 한 항의 방법에 의해 불활성화시키는 단계; 및
    (c) 목적 단백질을 암호화하는 서열을 포함하는 이식유전자를 포함하는 발현 벡터를 숙주 세포내로 도입시켜, 재조합 단백질을 생산하는 단계를 포함하는, 숙주 세포내에서 목적한 재조합 단백질을 생산하는 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 목적 단백질이 α1-안티트립신 또는 모노클로날 항체를 포함하는 방법.
  14. (a) 청구항 7 내지 청구항 9 중의 어느 한 항의 방법에 따라 세포내에서 GS 유전자를 불활성화시키는 단계; 및
    (b) GS 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화되는 세포주를 생성하기에 적합한 조건하에서 세포를 배양하는 단계에 의해 생산된, GS 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 세포주.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 세포가 COS 세포, CHO 세포, VERO 세포, MDCK 세포, WI38 세포, V79 세포, B14AF28-G3 세포, BHK 세포, HaK 세포, NS0 세포, SP2/0-Ag14 세포, HeLa 세포, HEK293 세포 및 perC6 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 포유동물 세포인 세포주.
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