CN102264915B - 失活谷氨酰胺合成酶基因表达的方法和组合物 - Google Patents

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Abstract

本文中披露了采用包含锌指蛋白和切割域或切割半域的融合蛋白使谷氨酰胺合成酶(GS)基因失活的方法和组合物。还提供编码所述融合蛋白的多核苷酸，是包含所述多核苷酸和融合蛋白的细胞。

Description

失活谷氨酰胺合成酶基因表达的方法和组合物
根据联邦政府资助的研究对发明权的声明
不适用。
技术领域
本发明涉及基因组工程、细胞培养、细胞系产生和蛋白制备的领域。
背景技术
谷氨酰胺合成酶(GS)是氨基酸L-谷氨酰胺合成中的关键酶。见，Meister，A.in Glutamine Metabolism，Enzymology and Regulation(eds.J.Mora & R.Palacios)1-40(Academic Press，N.Y.；1980)。因此，GS阴性细胞系对L-谷氨酰胺是营养缺陷型的。虽然缺乏GS阴性CHO细胞系情况下需要使用GS抑制剂甲硫氨酸磺基肟来实现选择，但GS常常被用作CHO细胞基重组蛋白表达系统的选择标记基因(Wurm et al.(2004)NatureBiotechnology 22：1393-1398)。
此外，二氢叶酸还原酶(DHFR，5，6，7，8-四氢叶酸：NADP+氧化还原酶)是真核生物和原核生物中的必需酶，并催化二氢叶酸NADPH依赖性还原为四氢叶酸，其是胸苷酸、嘌呤核苷酸、甘氨酸和甲基化合物生物合成中一碳单位的必需载体。
DHFR缺陷型细胞早已被用于重组蛋白的制备。DHFR缺陷型细胞只会在补充有包含叶酸代谢的某些因子或DHFR被提供给该细胞(例如作为转基因)的培养基中生长。通过在未补充培养基中培养细胞可以选择DHFR转基因已被稳定整合的细胞。此外，当使用单一多核苷酸引入细胞时，外源性序列一般是共整合的。因此，当DHFR转基因也包括编码目标蛋白的序列时，选定的细胞将都表达DHFR和目标蛋白。此外，在应对抑制剂，如甲氨蝶呤(MTX)时，DHFR基因的复制数可以被扩增。因此，与外源性DHFR共整合的编码目标蛋白的序列，可以通过逐步与该细胞接触被扩增，以增加甲氨蝶呤的浓度，从而造成目标重组蛋白的过度表达。然而，尽管重组蛋白表达的DHFR缺陷型细胞系统的广泛应用，当前可用的DHFR缺陷型细胞及其衍生的亲本DHFR感觉态细胞不会生长。
因此，单基因和多基因敲除的哺乳动物细胞在研究(药物研发和细胞疗法)中具有巨大的效用。然而，靶向删除研究者指定基因的传统方法依赖于同源重组或基因打靶的过程。Mansour et al.(1988)Nature 336：348-352；Vasquez et al.(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98：8403-8410；Rago et al.(2007)Nature Protocols 2：2734-2746；Kohli et al.(2004)Nucleic AcidsResearch 32，e3。虽然对多种细胞类型能够产生确定的等位基因敲除，这种技术已被证明效率太低，从而日常应用也很费力。见，例如，Yamane-Ohnukiet al.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-622。这些靶向基因删除方法需要同源重组及药物选择的连续循环，以隔离罕见的所需事件-这一过程相当费力，以限制应用于个别基因位点。因此，多个靶基因位点修饰的哺乳动物细胞系的产生还有待于开发。
锌指核酸酶(ZFN)已被用于靶向切割和基因失活。见，例如，美国专利公开20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060188987；20060063231；2008/0015164和美国序列No.12/218,035以及国际公开WO 07/014275，它们的全部内容通过引用并入本文。通过针对一个指定的靶序列和Fok I催化域(黄杆菌属okeanokoites的限制性内切酶)的工程锌指DNA结合域的融合形成，ZFN能够在选定的基因组地址置入双链DNA断裂(DSB)。当提供供体DNA或通过非同源末端重接(NHEJ)时，这种位点专一DSB的去除是通过细胞自身的DNA修复机制或通过同源定向修复方法进行的。见，例如，Urnov et al.(2005)Nature 435：646-651(2005)；Moehle et al.(2007)Proc Natl Acad Sci U S A 104：3055-3060(2007)；Bibikova，et al.(2001)Mol Cell Biol 21：289-297；Bibikova et al.(2003)Science 300：764；Porteus et al.(2005)Nature Biotechnology 23：967-973；Lombardo et al.(2007)Nature Biotechnology 25：1298-1306；Perez et al.(2008)Nature Biotechnology 26：808-816；Bibikova et al.(2002)Genetics161：1169-1175；Lloyd et al.(2005)Proc Natl Acad Sci U S A 102：2232-2237；Morton et al.(2006)Proc Natl Acad Sci U S A 103：16370-16375。
虽然同源定向修复和NHEJ方法都导致靶基因位点的修饰，NHEJ驱动方法避免了供体DNA工程化和合成的需要，但是导致高频率的等位基因破坏，可以利用NHEJ介导DSB修复的错误倾向性，以达到哺乳动物细胞中靶基因座的敲除，接着就是编码ZFN的DNA构建的简单瞬时转染。见，例如，Santiago et al.(2008)Proc Natl Acad Sci U S A 105：5809-5814。ZFN技术使得从不超过单细胞克隆的96孔板筛选努力中分离得到几种独立的敲除细胞系。由于没有采用供体DNA或选择策略，由此产生的单基因敲除细胞系是以后基因修饰的合适起始细胞系。
发明概述
此处披露GS基因部分或完全失活的组合物。此处还披露制备和使用这些组合物(试剂)的方法，例如，使GS基因在细胞中失活，以产生GS基因失活的细胞系。GS基因破坏细胞系是有用的，例如，在重组蛋白制备中。
一方面，提供了工程化以在GS基因中结合的锌指蛋白。此处所述的任何锌指蛋白可能包括1、2、3、4、5、6或多个锌指，每个锌指具有一种与GS基因中一个子目标位点结合的识别螺旋。在某些实施例中，锌指蛋白包括4、5或6个指(其中个别锌指被指定为F1、F2、F3、F4、F5和F6)，并包括表1所示的识别螺旋的氨基酸序列。
另一方面，提供了工程化以在DHFR基因中结合的锌指蛋白。此处所述的任何锌指蛋白可能包括1、2、3、4、5、6或多个锌指，每个锌指具有一种与DHFR基因中一个子目标位点结合的识别螺旋。在某些实施例中，锌指蛋白包括4、5或6个指(其中个别锌指被指定为F1、F2、F3、F4、F5和F6)，并包括表2所示的识别螺旋的氨基酸序列。
另一方面，还提供了包含此处所述的任何一种锌指蛋白和至少一种切割域或至少一种切割半域的融合蛋白。在某些实施例中，切割半域是一种野生型FokI切割半域。在其他实施例中，切割半域是一种工程FokI切割半域。
另一方面，提供了一种编码此处所述的任何蛋白的多核苷酸。
另一方面，还提供了包含此处所述的任何蛋白和/或多核苷酸的分离细胞。在某些实施例中，GS是在细胞内失活(部分或完全)。此处所述的任何细胞可以包括已失活(例如，使用工程化以能与选定基因中靶位点结合的锌指核酸酶)的其他基因。在某些实施例中，此处提供了细胞或细胞系，其中FUT8、二氢叶酸还原酶(DHFR)和谷氨酰胺合成酶(GS)已失活。
此外，提供了锌指蛋白和融合蛋白的使用方法及其在细胞或细胞系中使GS失活的方法。
因此，另一方面，此处提供一种使细胞GS基因(例如，内源性GS基因)失活的方法，所述方法包括：(a)将编码第一多肽的第一核酸引入细胞，其中所述第一多肽包括：(i)工程化以与内源性GS基因中的第一靶位点结合的锌指DNA结合域；以及(ii)切割域；使得所述多肽在细胞中表达，即多肽与靶位点结合，并切割GS基因。在某些实施例中，所述方法进一步包括引入编码第二多肽的核酸，其中所述第二多肽包括：(i)工程化以与GS基因中的第二靶位点结合的锌指DNA结合域，以及(ii)切割域；使得所述第二多肽在细胞中表达，即第一和第二多肽与各自的靶位点结合，并切割GS基因。第一和第二多肽可能由第一核酸或由不同的核酸编码。在某些实施例中，将一种或多种其他多核苷酸或多肽引入细胞中，例如，编码其他锌指蛋白的多核苷酸。
另一方面，本发明提供了一种在宿主细胞中制备目标重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供包含内源性GS基因的宿主细胞；(b)通过此处所述的任何方法使宿主细胞中的内源性GS基因失活，以及(c)将包含转基因的的表达载体引入宿主细胞，所述转基因包含编码目标蛋白的序列，从而制备重组蛋白。在某些实施例中，目标蛋白包含抗体，例如，单克隆抗体。
在此处所述的细胞和任何方法中，细胞或细胞系可以是(例如)，但不限于COS、CHO(例如CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、NIH3T3、perC6、昆虫细胞，如秋行虫(Sf)，或真菌细胞如啤酒酵母、毕赤酵母和裂殖酵母。
附图简要说明
图1，第A至E幅，显示了CHO细胞中谷氨酰胺合成酶基因的ZFN介导性破坏和GS-/-细胞系的单一敲除。图1A是一个描述含有7个外显子的正转录GS基因的示意图。起始密码子ATG是位于外显子2内。图1A还显示了ZFN对ZFN9372/ZFN9075的靶序列是位于所示的外显子6内，ZFN对8361/8365的靶序列是位于外显子2内。也显示了靶向外显子6的其他ZFN(9076、9179、7858、7889、9373)。图1B是显示内源性CHO GS基因的ZFN介导性破坏的凝胶，其中内源性CHO GS基因座使用ZFN对9372/9075与CHO-K1细胞(左幅)或CHO-S细胞(右幅)中Fok I催化域的野生型或专性异质二聚体EL/KK变体连接，通过SurveyorTM核酸检测确定。图1C描述了在外源性补充L-谷氨酰胺存在情况下显示的细胞系及其生长特性的靶向GS基因位点的典型DNA序列(“L-谷氨酸增长”；‘+’：在与野生型CHO难以区分的L-谷氨酰胺缺乏情况下生长；‘-’：在L-谷氨酰胺缺乏情况下不生长)。ZFN靶序列是加下划线的。蛋白翻译是在野生型序列下面显示。大写字母表示外显子序列，小写字母表示内含子序列，‘-’表示删除，粗体字母表示插入。图1D描述了使用抗GS单克隆抗体(上幅)的选定的CHO-S(左幅)和CHO-K1(右幅)细胞系的蛋白印迹分析。作为一个负载对照，使用抗DHFR抗体(下幅)对印迹进行再次探测。图1E显示了已增长约3个月的选定CHO-K1 GS-/-细胞系的生长和存活率曲线图。这些细胞系的存活率(图顶部的平滑线)和活细胞密度(锯齿状线)在最初的3个月后30天时显示，其中细胞在L-谷氨酰胺补充培养基中生长，每2-3天细胞进行分裂。箭头表示取出L-谷氨酰胺的时间。
图2，第A至F幅，描述了CHO细胞中DHFR基因的ZFN介导性破坏和双敲除DHFR-/-GS-/-细胞系的产生。图2A显示了CHO细胞中DHFR基因的基因组构造和ZFN对9461/7844(位于外显子1内，见，美国专利申请No.20080015164)和9476/9477(位于外显子1ZFN9461/7844切割位点的240-bp 3’的内含子1内)靶位点的位置。图2B描述了使用ZFN对9461/7844(左幅)和ZFN对9476/9477(右幅)的基因修饰水平，通过SurveyorTM核酸检测确定。图2c描述了编码两个ZFN配对的质粒共转染后2天的GS-/-克隆B3基因组的PCR分析，这导致DHFR基因位点约240bp的删除(位于泳道7的小箭头)。利用空载体(泳道1)、GFP对照载体(泳道2)、仅是外显子ZFN对((ZFN9461/ZFN7844，泳道3)、仅是内含子ZFN对(ZFN9461/ZFN7844，泳道4)转染的细胞是作为载体，涉及删除的“内部”ZFN(ZFN7844和ZFN9477，泳道5)和涉及删除的“外部”ZFN(ZFN9461和ZFN9476，泳道6)。图2D描述了单细胞系的DHFR基因型分析结果。对于纯合克隆，显示了两个等位基因的共同序列。对于复合的杂合克隆，显示了每个唯一的等位基因的序列。图2E描述了使用从上述每个泳道显示的细胞系所得全细胞裂解液的指示抗体(DHFR、GS和β-微管蛋白)的蛋白印迹分析。对细胞系1F1.6和2B12.8(DHFR/GS敲除)进行了分析，而亲本GS-/-细胞系B3、野生型CHO细胞(WT)和DHFR缺陷型CHO细胞系DG44(见Urlab et al.(1983)Cell 33：405-412)则作为对照。图2F描述了1F1.6和2B12.8细胞系的生长以及这些泳道对外源提供的次黄嘌呤、胸腺嘧啶和谷氨酰胺的依赖性。
图3，第A至D幅，显示了CHO细胞中FUT8基因的ZFN介导性破坏和三敲除FUT8-/-DHFR-/-GS-/-细胞系的产生。图3A是描述位于外显子10内靶向编码FUT8Fut基序II的关键和高度保守区序列的ZFN的示意图。另见，美国专利申请No.12/218,0135。图3B描述了ZFN对12176/12172瞬时转染入DHFR-/-GS-/-克隆1F1.6后2天的基因修饰水平，通过SurveyorTM核酸检测确定。图3c描述了通过FACS分析的三KO克隆35F2和14C1(左幅的线)的荧光-LCA结合活性。F-LCA染色野生型CHO-S细胞(右幅的线)作为阳性对照，未染色细胞(虚线)作为阴性对照。图3D显示了三敲除细胞系35F2和14C1在FUT8基因位点的基因型(两个等位基因)，其中显示的序列是两个等位基因。大写字母表示外显子10序列，小写字母表示内含子序列，斜体字母表示Fut基序II序列，粗体字母表示序列插入，‘-’表示删除。蛋白翻译显示于野生型序列下面。下划线表示ZFN结合位点。
图4，第A至C幅，描述了CHO GS基因中的典型ZFN工程化及其靶位点。图4A是CHO细胞中功能内含子谷氨酰胺合成酶基因的代表示意图。它包含7个外显子，起始密码子ATG位于外显子2内，也显示了外显子6内ZFN对ZFN9372/ZFN9075的靶序列。显示了外显子6附近的目标区域的核苷酸序列。大写字母表示外显子6的序列，小写字母表示内含子序列。ZFN9372和ZFN9075的靶序列是加有下划线的。图4B是ZFN9372和ZFN9075结合于其双链靶序列的代表示意图(加有下划线的)。图4C描述了靶序列以及ZFN9372和ZFN9075的锌指工程化。显示了核心DNA靶序列(大写字母)和2个侧翼碱基(小写字母)。ZFN9075含有4个锌指DNA结合域，ZFN9372含有6个锌指结构域。显示了指定的靶DNA三联体的每个锌指DNA结合域的α-识别螺旋在位点‘-1’至‘+6’的氨基酸残基。
图5显示了ZFN转染细胞的基因组GS基因位点的典型测序结果。“C”是指计数(观察到指定序列的次数)，“G”是指基因型。ZFN靶序列是加有下划线的。粗体字表示序列插入，‘-’表示删除。
图6是描述纯合GS-/-细胞系(克隆B3)的L-谷氨酰胺依赖性生长。在L-谷氨酰胺存在情况下，CHO-S GS-/-克隆B3(三角形)以及野生型CHO-S(菱形)生长。在外源性L-谷氨酰胺存在情况下，克隆B3(圆形)停止生长，所有细胞在4天之内死亡，而野生型CHO细胞(方形)以降低的速率继续生长。
图7，第A至C幅，描述了CHO DHFR基因中的典型ZFN工程化及其靶位点。图7A显示的是CHO细胞中通过指定的ZFN对靶向的DHFR区域的核苷酸序列。大写字母表示外显子序列，小写字母表示内含子序列。图7B是当ZFN与其双链靶序列(加有下划线的)结合时ZFN靶向的DHFR的代表示意图。两个ZFN标记的“内部”靶序列是被删除区域内部的，而两个ZFN标记的“外部”靶序列是所需删除连接外部的。图7C显示了典型ZFN靶向的CHO DHFR基因的靶序列和锌指工程化。显示了核心DNA靶序列(大写字母)和2个侧翼碱基(小写字母)。所有ZFN含有4个锌指DNA结合域。显示了指定的靶DNA三联体的每个锌指DNA结合域的α-识别螺旋在位点‘-1’至‘+6’的氨基酸残基。
图8显示了ZFN转染细胞的基因组DHFR基因位点的典型测序结果。“C”是指计数(观察到指定序列的次数)，“G”是指基因型。ZFN靶序列是加有下划线的。粗体字表示序列插入，‘-’表示删除。粗体字表示序列插入。斜体字表示序列变化。大写字母表示外显子序列，小字母表示内含子序列。
图9，第A至C幅，描述了靶向CHO FUT8基因的ZFN靶位点和指工程化。图9A描述了FUT8基因外显子10内的ZFN结合位点以及外显子10内靶区的核苷酸序列的示意图。大写字母表示外显子10的序列，小写字母表示内含子序列。ZFN12176和ZFN12172的靶序列是加有下划线的。斜体字显示的是包含岩藻糖基转移酶基序II的核苷酸。图9B是ZFN12176和ZFN12172与其双链靶序列(下划线)结合的代表示意图。图9C描述了ZFN12176和ZFN12172的靶序列和锌指工程化。显示了核心DNA靶序列(大写字母)和2个侧翼碱基(小写字母)。ZFN12176含有5个锌指DNA结合域，ZFN12172含有6个锌指结构域。显示了指定的靶DNA三联体的每个锌指DNA结合域的α-识别螺旋在位点‘-1’至‘+6’的氨基酸残基。
图10，第A至C幅，显示了CCR5、GR和AAVS1基因位点的ZFN靶。图10A是分别显示C-C趋化因子受体5(CCR5)、糖皮质激素受体(GR)和腺相关病毒整合位点(AAVS1)基因位点中ZFN靶位点的位置示意图。图10B描述了ZFN介导性同步破坏，通过SurveyorTM核酸检测确定，在与Fok催化结构域的野生型、ZFN-Fok I(wt)或专性异质二聚体EL/KK变体、ZFN-Fok I(EL/KK)连接的ZFN对瞬时共转染入K562细胞后20天对CCR5(左幅)、GR(中幅)和AAVS1(右幅)的基因位点进行测量。每条泳道的处理方法如下：泳道1，CCR5 ZFN-FokI(wt)，泳道2，GR ZFN-Fok I(wt)，泳道3，AAVS1 ZFN-Fok I(wt)，泳道4，CCR5 ZFN-Fok I(EL/KK)，泳道5，GR ZFN-Fok I(EL/KK)，泳道6，AAVS1 ZFN-Fok I(EL/KK)，泳道7，CCR5ZFN-FokI(wt)+GR ZFN-FokI(wt)+AAVS 1ZFN-FokI(wt)，泳道8，CCR5ZFN-FokI(EL/KK)+GR ZFN-FokI(EL/KK)+AAVS 1ZFN-FokI(EL/KK)。图10C描述了一个三敲除克隆的基因型，其中显示了指定的细胞系的靶向CCR5、GR、AAVS1基因位点。ZFN靶序列是加有下划线的。‘-’表示删除，粗体字母表示插入。
图11，第A和B幅，显示了使用指定物种时此处测定CHO GS基因组序列的序列比对。图11A显示了外显子2的序列比对。ZFN8361和ZFN8365的靶位点是加有下划线的。图11B显示外显子6的序列比对。ZFN9075和ZFN9372的靶位点是加有下划线的。
图12，第A至D幅，显示了人类和小鼠细胞中的ZFN介导性破坏。图12A和B显示了通过CHO GS(图12A)外显子2及CHO GS(图12B)外显子6靶向的ZFN在人类K562中介导的GS破坏。图12C和D显示了通过CHO GS(图12C)的外显子2和CHO GS(图12D)外显子6靶向的ZFN在小鼠Neuro2a细胞中介导的GS破坏。
图13，第A至C幅，显示了CHO GS基因位点(SEQ ID NO：55)的完整基因组序列。内含子和外显子被指定为显示。
图14，第A至C幅，显示了HEK293细胞中GS专一性基因靶的结果。图14A描述了与GFP供体分子(标记GFP)转染的细胞比较，GS专一性ZFN(标记GS)处理的细胞中NHEJ活性的百分比。图14B显示了2个克隆，衍生自GS专一性ZFN处理的细胞池的g17和g52，通过蛋白印迹检测不表达GS。图14C显示了GS敲除克隆在7天内的生长曲线，并证明了生长需要补充谷氨酰胺。
发明详述
此处描述了GS基因部分或完全失活的组合物和方法。还披露了这些化合物(试剂)的制备和使用方法，例如，在靶细胞中使GS基因失活的方法。单独或与靶细胞中的其他基因(如DHFR和FUT8)结合使GS基因失活，可用于生产重组蛋白表达的细胞系，例如，得到抗体依赖性细胞毒性(ADCC)增强的单克隆抗体。
综述
方法的实践，以及此处披露的组合物的制备和用途，除非另有说明，分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA及相关领域的常规技术都属于本领域的技术范围之内。以下文献都充分说明了这些技术。见，例如，Sambrook et al.MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989 and Third edition，2001；Ausubel et al.，CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley & Sons，New York，1987并且定期更新；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，SanDiego，1999；以及METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，“Chromatin Protocols”(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用，并涉及直链或环结构以及单或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸聚合物。为了本发明的目的，这些术语不应该被解释为对聚合物长度的限制。该术语可以包括已知的天然核苷酸类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸基团(如硫代磷酸骨架)上进行修饰的核苷酸。一般而言，一个特定核苷酸类似物具有相同的碱基配对专一性，即，A的类似物与T是碱基对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白”是指交替使用的氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是相应的天然氨基酸的化学类似物或修饰衍生物。
“结合”是指大分子之间(例如，蛋白和核酸之间)的序列专一性的非共价相互作用。不是所有相互作用的成份需要是序列特异的(例如，在DNA骨架中与磷酸残基接触)，只要相互作用作为一个整体是序列专一性的。这种相互作用的一般是以10-6M-1或更低的解离常数为特点的。“亲和力”是指结合强度：增加的键合亲和力与降低的Kd值一一对应。
“结合蛋白”是一种能够与另一种分子非共价结合的蛋白。结合蛋白可以结合到，例如，DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白分子(蛋白结合蛋白)。至于蛋白结合蛋白，它可以结合自身(形成同二聚体、同三聚体等)和/或它可以结合到不同的蛋白或蛋白的一个或多个分子上。结合蛋白可以具有多种结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”(或结合域)是一种蛋白，或者是一种较大蛋白的结构域，即DNA通过一个或多个锌指(结合域内的氨基酸序列区域)以序列特定的方式结合，其结构是通过一个锌离子协调而稳定。术语锌指DNA结合蛋白一般缩写为锌指蛋白或ZFP。
锌指结合域可以“工程化”以结合到预定的核苷酸序列上。锌指蛋白构建方法的非限制性实例是工程化和选择。工程化的锌指蛋白是一种非天然生成的蛋白，其工程化/组合物主要是来自于合理条件。工程化的合理条件包括现有ZFP工程化和结合数据的数据库存储信息中处理信息的替代规则和计算算法的应用。见，例如，美国专利6,140,081、6,140,081和6,534,261；另见，WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。
“选定的”锌指蛋白是自然界未发现的蛋白，其生产主要是来自于经验方法，如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂种选择。见，例如，US 5,789,538；US 5,925,523；US 6,007,988；US 6,013,453；US 6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970；WO 01/88197和WO 02/099084。
术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，其可以是DNA或RNA；可以是直链、环或支链，可以是单链或双链。术语“供体序列”是指插入到基因组的核苷酸序列。供体序列可以是任意长度，例如2至10,000个核苷酸长(或任何整数值之间或以上)，优选为约100至1,000个核苷酸长(或任何整数之间)，较优选为约200至500个核苷酸长。
“同源的、不同序列”是指第一序列与第二序列共有一定程度的同源序列，但其序列与第二序列是非同一的。例如，包含一种突变基因的野生型序列的多核苷酸是同源的，且与突变基因序列是不同的。在某些实施例中，两个序列之间的同源程度足以使它们之间利用正常的细胞机制进行同源重组。两个同源的非同一序列可以是任何长度，它们的非同源性程度可以小到一个单核苷酸(例如，通过靶向同源重组进行基因点突变的纠正)或大到10个或更多个碱基(例如，在染色体的预定异位位点插入基因)。包含同源的非同一序列的两个核苷酸不一定是相同的长度。例如，20至10,000个核苷酸或核苷酸对之间的外源性核苷酸(即供体多核苷酸)都可以用到。
确定核酸和氨基酸序列同一性的方法是本领域已知的。一般而言，这些方法包括：确定一个基因的mRNA核苷酸序列和/或确定其编码的氨基酸序列，从而比较这些序列和第二核苷酸或者氨基酸序列。也可以确定基因组序列，并以这种方式进行比较。一般而言，同一性分别分别是指两个多核苷酸或多肽序列的准确的核苷酸-核苷酸或氨基酸-氨基酸一致性。两个或多个序列(核苷酸或氨基酸)可通过确定它们的同源度进行比较。两个序列的同源度，无论核酸还是氨基酸序列，是两个比对序列之间的完全匹配数除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对是由Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics 2：482-489(1981)提供的局部同源算法。这种算法可以通过使用由Dayhoff，Atlas of Protein Sequences andStructure，M.O.Dayhoff ed.，5 suppl.3：353-358，National BiomedicalResearch Foundation，Washington，D.C.，USA开发的打分矩阵应用于氨基酸序列，并通过Gribskov，Nucl.Acids Res.14(6)：6745-6763(1986)使其标准化。这种确定序列同源度的算法的典型实施是由“BestFit”实用工具应用程序中的遗传学计算机组(Madison，WI)提供的。计算序列间同源度或相似度的其他合适程序一般是本领域已知的，例如，另一种比对程序是BLAST，以默认参数方式使用。例如，BLASTn和BLASTp可使用下面的默认参数：遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两者；中断＝60；期望＝10；矩阵＝BLOSUM62；说明书50序列；排序方式＝最高分；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白+Spupdate+PIR。这些程序的细节，可在GenBank网站上找到。至于此处所述的序列，所需的序列同源度范围大约是80％-100％及其之间的任何整数。一般情况下，序列间的同源度至少是70-75％、优选为80-82％，较优选为85-90％，更优选为92％，甚至更优选为95％，最优选为98％的序列同一性。
可选择地，多核苷酸之间的序列相似度，可通过允许在同源区域之间形成稳定双链条件下的多核苷酸杂交确定，然后使用单链专一性核酸酶消化，确定酶切消化片段的大小。当序列在分子的指定长度内通过上述方法测定表现出至少约70％-75％，优选为80％-82％，较优选为85％-90％，甚至较优选为92％，更优选为95％，最优选为98％的序列同源性时，两个核酸或两个多肽序列彼此是大致同源的。此处所用的大致同源也是指专一性DNA或多肽序列显示出完全同一性。大致同源的DNA序列可以在(例如)严格的条件下通过原位杂交实验鉴定出，由特定系统所确定。确定适当的杂交条件是属于本领域的技术范围。见，例如，Sambrook et al.，supra；Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，editors B.D.Hames andS.J.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press)。
两个核酸片段的选择性杂交可确定如下。两个核酸分子间的序列同源度影响了这种分子间杂交事件的效率和强度。部分同源的核酸序列将至少部分抑制一个完全同源序列与目标分子的杂交。完全同源的序列杂交的抑制作用，可采用本领域已知的杂交检测进行评价，(例如，Southern(DNA)印迹杂交，Northern(RNA)印迹杂交，杂交溶液或类似溶液，见，Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Second Edition，(1989)ColdSpring Harbor，N.Y.)。这种检测可以采用不同程度的选择性，例如，采用从低到高的严格条件。如果采用低严格的条件，缺乏非专一性结合可以使用缺乏即使是部分同源度的次级探针(例如，与靶分子具有小于约30％序列同源性的探针)进行评价，这样，在非专一性结合作用的情况下，次级探针将不会与靶进行杂交。
当利用杂交检测系统时，先选择与内参核酸序列互补的一个核酸探针，然后选定探针与内参序列选择性杂交或结合的适当条件，以互相形成一个双链分子。核酸分子能够与内参序列在允许检测一个长度至少约10-14个核苷酸长的靶核酸序列与选定的核酸探针序列具有至少约70％序列同源性的适度严格条件下选择性杂交。严格的杂交条件一般允许检测与选定的核酸探针序列具有约90-95％以上序列同源性的一个长度至少约10-14个核苷酸长的靶核酸序列。用于探针/内参序列杂交的杂交条件，其中探针和内参序列具有特定的序列同源度，可以确定为本领域已知的(见，例如Nucleic Acid Hybridization：A Practical Approach，editors B.D.Hames and S.J.Higgins，(1985)Oxford；Washington，DC；IRL Press)。
杂交条件是本领域普通技术人员众所周知的。杂交严格度是指在不利于形成含有错配核酸杂交的杂交条件的程度，较高的严格度与较低的错配杂交公差一一对应。影响杂交严格度的因素是本领域普通技术人员众所周知的，包括但不限于，温度、pH、离子强度和有机溶剂(例如，甲酰胺和二甲基亚砜)的浓度。通过较高的温度、较低的离子强度和较低的溶剂浓度增加杂交严格度是本领域普通技术人员已知的。
至于杂交的严格条件，可以采用许多等价条件确定不同的特定严格度，例如，以下因素：序列的长度和性质、不同序列的碱基组成、盐及其他杂交溶液成分的浓度，杂交溶液中存在或缺乏阻滞剂(例如，硫酸葡聚糖和聚乙二醇)、杂交反应温度和时间参数以及不同的洗涤条件是本领域众所周知的。选定一组特定的杂交条件是根据以下本领域的标准方法选择(见，例如，Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，SecondEdition，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。
“重组”是指两个多核苷酸交换遗传信息的过程。为了本发明的目的，“同源重组(HR)”是指发生这种交换的特殊形式，例如，细胞中的双链断裂修复。这种过程需要核苷酸序列的同源性，采用“供体”分子作为模板修复“靶”分子(即，双链断裂的分子)，并分别称为“非交叉基因转换”或“短束基因转换”，因为它导致遗传信息从供体传送到靶。不愿被任何特定的理论束缚，这种传送可能涉及断裂靶和供体之间和/或“合成依赖性链退火，”形成异源双链DNA的错配纠正，其中供体用于重新合成将成为靶一部分和/或相关过程的遗传信息。这种特殊的HR往往引起靶分子序列的改变，使得部分或全部供体多核苷酸序列纳入靶多核苷酸中。
“切割”是指DNA分子的共价骨架的断裂。切割可以是通过各种方法进行，包括但不限于磷酸二酯键的酶或化学水解。两个单链切割和双链切割是可能的，双链切割可以由于两个不同的单链切割事件而出现。DNA切割可以导致钝圆末端或交错末端的产生。在某些实施例中，融合多肽用于双链DNA的靶向切割。
“切割半域”是一种与第二多肽(相同或不同的)结合形成具有切割活性(优选为双链切割活性)的复合物的多肽序列。术语“第一和第二切割半域；”“+和-切割半域”以及“右和左切割半域”是指交替使用的二聚切割半域对。
“工程化的切割半域”是已被修饰的切割半域，从而与另一个切割半域(例如，另一个工程化的切割半域)形成专性异质二聚体。另见，美国专利申请公开No.2005/0064474；2007/0218528和2008/0131962，它们的全部内容通过引用并入本文。
“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸，主要是DNA，以及包含组蛋白和非组蛋白染色体蛋白的蛋白。大部分真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体核心包含约150个碱基对的DNA，所述DNA与包含组蛋白H2A、H2B、H3和H4中两个的八聚物相关；以及在核小体核心之间延伸的DNA连接单链(取决于生物体的不同长度)。组蛋白H1的分子一般是与DNA连接单链相关的。为了本发明的目的，术语“染色质”是指包括原核和真核生物的各种细胞核蛋白。细胞染色质包括染色体和游离染色质。
“染色体”，是包含细胞基因组的全部或一部分的染色质复合物。细胞基因组的特点往往是它的核型，其是包含细胞基因组的所有染色体的集合。细胞基因组可以包含一种或多种染色体。
“游离基因”是复制的核酸、核蛋白复合物或包含一种核酸的其他结构，所述核酸不是细胞染色体核型的一部分。游离基因的实例包括质粒和某些病毒基因组。
“可进入区域”是细胞染色质中的位点，其中核酸中存在的靶位点可以通过识别靶位点的外源性分子结合。不愿被任何特定的理论束缚，相信可进入区域是不能组装到核小体结构的。可以通过化学和酶探针(例如，核酸)，常常检测可进入区域的不同结构的敏感性。
“靶位点”或“靶序列”是定义为一种在提供了结合存在的充分条件下将与结合分子结合的一部分核酸的核酸序列。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性核酸内切酶的靶位点。
“外源性”分子是一种正常不存在于细胞中的分子，但可以通过一种或多种基因、生化或其他方法引入细胞中。“细胞中的正常存在”是由细胞特定的发育阶段和环境条件所决定的。因此，例如，只在肌肉胚胎发育中存在的分子是成熟肌肉细胞的外源性分子。同样地，通过热休克诱导的分子是关于非热休克细胞的外源性分子。外源性分子可以包括，例如，出故障内源性分子的正常工作类型或正常工作内源性分子的出故障类型。
除其他外，外源性分子可以是，如由组合化学过程中产生的一个小分子，或者大分子，如蛋白、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何修饰衍生物或包含一种或多种上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链；可以是直链、支链或环；而且可以是任意长度。核酸包括能够形成双链的那些核酸，以及三链核酸。见，例如，美国专利No.5,176,996和5,422,251。蛋白包括但不限于，DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰酯酶、去乙酰酯酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和解旋酶。外源性分子也可以作为内源性分子的同类型分子，但来源于不同的物种而不是来自细胞。例如，人的核酸序列可以引入最初来源于小鼠或大鼠的细胞系。
外源性分子可以是作为内源性分子(例如，外源性蛋白或核酸)的同类型分子。例如，外源性核酸可以包含引入细胞的感染病毒基因组、质粒或游离基因或者不正常存在于细胞中的染色体。外源性分子引入细胞的方法是本领域普通技术人员已知的，包括但不限于，脂质介导转移(即，脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接喷射、细胞融合、粒子轰击，磷酸钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导转移和病毒载体介导转移。外源性分子也可以是指从异类的核酸，例如，插入仓鼠基因组的人类基因。
相比之下，“内源性”分子是指在特定的环境条件下正常存在于特定的细胞中或特定的发展阶段的分子。例如，内源性核酸可以包含染色体、线粒体基因组、叶绿体或其他细胞器，或天然的游离核酸。其他内源性分子可以包括蛋白(例如，转录因子和酶)。
“融合”分子是两个或多个亚基分子连接的分子，优选为共价连接的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或者可以是不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的实例包括，但不限于，融合蛋白(例如ZFPDNA结合域和切割域之间的融合)和融合核酸(例如，编码上述融合蛋白的核酸)。第二种类型的融合分子的实例包括但不限于，三链核酸和多肽之间的融合，以及小沟结合剂和核酸之间的融合。
细胞中的融合蛋白表达可导致融合蛋白向细胞的运送或编码融合蛋白的多核苷酸向细胞的运送，其中多核苷酸被转录，转录物被翻译，以产生融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽连接反应，也可以涉及到细胞中的蛋白表达。本发明在别处提出了多核苷酸和多肽运送到细胞的方法。
为了本发明的目的，“基因”，包括编码基因产物(见下文)的DNA区域，以及调控基因产物生产的所有DNA区域，不论这种调控序列是否邻近编码和/或转录序列。因此，基因包括，但不一定限于，启动子序列、终止子、翻译调控序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元素、复制起点、基质附着位点和基因位点控制区域。
“基因表达”是指基因中包含的信息转换为基因产物。基因产物可以是直接的基因转录产物(例如，信使RNA、转录RNA、核糖体RNA、反义RNA、短片断发夹RNA、微小RNA(miRNA)核酶、结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过信使RNA翻译生产的蛋白。基因产物还包括修饰(如覆盖、多聚腺苷酸化、甲基化和剪接处理)的RNA，以及修饰(例如，甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化)的蛋白。
基因表达的“调制”是指基因活性的变化。表达调制可以包括，但不限于，基因活化和基因抑制。基因失活是指相比于此处所述不包括ZFP的细胞，基因表达的任何下降。因此，基因失活可以是完整的(敲除)或部分的(例如，亚等位基因显示出低于正常表达水平或突变基因产物在其影响活性中显示出部分降低)。
“真核”细胞包括但不限于，真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人体细胞(例如，T细胞)。
“目标区”，是细胞染色质的任何区，例如，基因或者非编码序列内或邻近的基因，其中它与外源性分子结合是可取的。结合可用于定点DNA切割和/或靶向重组的目的。目标区可以存在于染色体、游离基因、细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)或感染病毒的基因组中。目标区，可以位于基因的编码区内，转录非编码区内，例如，前导顺序，追踪序列或内含子，或者非转录区内，编码区上游或下游。目标区，可以小到1个单核苷酸对长或达2000个核苷酸对长，或核苷酸对的任何整数值。
术语“可操作的连接”和“可操作地连接”(或“可操作地连接的”)是指交替使用的两个或多个部件(如序列元素)的毗邻，其中部件是排列的，这样不仅部件功能正常，而且允许至少一种部件可以调节至少一种其他部件的功能的可能性。举例而言，如果转录调控序列控制与一种或多种转录调控因子存在或不存在下相应的编码区的转录水平，转录调控序列(如启动子)是与编码区可操作地连接的。转录调控序列一般是与编码序列在原位可操作地连接的，但不一定直接毗邻。例如，增强子是一种与编码序列可操作地连接的转录调控序列，即使它们不是连续的。
至于融合多肽，术语“可操作地连接”可以是指每个部件与其他部件进行连接时执行相同的功能，犹如它没有这样连接。例如，至于融合多肽，其中ZFP DNA结合域是融合到切割域，ZFP DNA结合域和切割域是可操作地连接的，即使在融合多肽中，当切割域能够切割靶位点附近的DNA时，ZFP DNA结合域部分能够结合它的靶位点和/或它的结合位点。
蛋白、多肽或核酸的“功能片段”是一种蛋白、多肽或核酸，其序列是不完全相同的全长蛋白、多肽或核酸，但与全长蛋白、多肽或核酸依然保留着相同的功能。功能片段可以具有比相应的原始分子更多、更少或相同数目的残基，和/或可含有一种或多种氨基酸或核苷酸取代基。确定核酸功能的方法(例如，编码功能，与另一个核酸杂交的能力)在本领域是众所周知的。同样地，测定蛋白功能的方法是众所周知的。例如，可以确定多肽的DNA结合功能，例如，通过亲和力、电泳迁移率变动或免疫沉淀检测。DNA切割可通过凝胶电泳检测。见，Ausubel et al.，同上。可以确定一种蛋白与另一种蛋白相互作用的能力，例如，通过遗传和生物化学的免疫共沉淀、双杂交检测或互补作用。见，例如，Fields et al.(1989)Nature340：245-246；美国专利No.5,585,245和PCT WO 98/44350。
此处所用的术语“抗体”包括来自于多克隆和单克隆制备的抗体，以及下列各项：杂交(嵌合)抗体分子(见，例如，Winter et al.，Nature(1991)349：293-299；和美国专利No.4,816,567)；F(ab′)2和F(ab)片段；Fv分子(非共价异质二聚体，见，例如，Inbar et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1972)69：2659-2662；和Ehrlich et al.，Biochem(1980)19：4091-4096)；单链Fv分子(sFv)(见，例如，Huston et al.，Proc Natl Acad Sci USA(1988)85：5879-5883)；二聚和三聚抗体片段结构；微抗体(见，例如，Pack et al.，Biochem(1992)31：1579-1584；Cumber et al.，J Immunology(1992)149B：120-126)；人源化抗体分子(见，例如，Riechmann et al.，Nature(1988)332：323-327；Verhoeyan et al.，Science(1988)239：1534-1536；和英国专利公开No.GB 2,276,169，出版于1994年9月21日)；以及来自这些分子的任何功能片段，其中这些片段保留亲本抗体分子的免疫学结合特性。
此处所用的术语“单克隆抗体”是指一种具有均质抗体种群的抗体组合物。该术语不局限于关于抗体的物种或来源，也不通过其制备方式而限制。该术语包括整个免疫球蛋白以及片段，如Fab、F(ab′)2、Fv和其他片段，以及表现出亲本抗体分子的免疫学结合特性的嵌合和人源化抗体种群。
锌指核酸酶
此处所述的锌指核酸酶(ZFN)，可用于GS基因的失活。ZFN包含锌指蛋白(ZFP)和核酸(切割)域。
A.锌指蛋白
锌指结合域可以工程化为选择的序列。见，例如，Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20：135-141；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70：313-340；Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19：656-660；Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12：632-637；Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10：411-416。相比于天然的锌指蛋白，工程化的锌指结合域可以具有新的结合专一性。工程化方法包括但不限于，合理的工程化和不同类型的选择。合理工程化包括，例如，使用包含三联体(或四联体)核苷酸序列和个别锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列是与锌指的一种或多种氨基酸序列相关的，所述锌指结合于特定的三联体或四联体序列。见，例如，共有的美国专利6,453,242和6,534,261，它们的全部内容通过引用并入本文。
典型的选择方法，包括噬菌体展示和双杂交系统，在美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；和6,242,568；以及WO 98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237中有所披露。此外，已经描述了提高锌指结合域的结合专一性，例如，在共有WO 02/077227中。
靶位点的选择；融合蛋白(编码相同的核苷酸)工程化和构造的ZFPs和方法是本领域普通技术人员众所周知的，并在美国专利申请公开Nos.20050064474和20060188987中详细描述，它们的全部内容通过引用并入本文。
此外，这些和其他参考文献所披露的锌指结构域和/或多指锌指蛋白可以使用任何合适的连结子序列连接在一起，包括，例如，5个或多个氨基酸长的连结子。另见，美国专利No.6,479,626；6,903,185；和6个或多个氨基酸长的典型连结子序列的7,153,949。此处所述的蛋白可以包括个别锌指蛋白之间合适的连结子的任何组合。其他连结子结构的实例在2008年5月28日提交，标题为连接DNA结合域和切割域的组合物的美国临时申请No.61/130,099中找到。
表1描述了许多已被工程化为在GS基因中与核苷酸序列结合的锌指DNA结合域。另见图1和图3。每行描述了单独的锌指DNA结合域。每个域的DNA靶序列显示于第一列中，第二至第五列显示了蛋白中每个锌指(F1至F4、F5或F6)识别区域的(氨基酸-1至+6，关于螺旋的开始)的氨基酸序列。以大写字母显示的核苷酸表示通过锌指直接靶向的三联体，以小写字母显示的核苷酸表示通过锌指不直接靶向的碱基(例如，由于指间较长的连接子可导致碱基的“跳跃”)。第一列还提供了蛋白的识别号码。
表1：靶向GS的锌指核酸酶
Figure BPA00001389150800211
如下所述，在某些实施例中，如表1所示的4、5或6个指结合域融合到切割半域，例如，IIs型限制性核酸内切酶(如FokI)。一对或多对这种锌指/核酸酶半域融合用于靶向切割，例如，如美国专利申请No.20050064474和20070218528所披露。
对于靶向切割，结合位点的边缘附近可以通过5个或多个核苷酸对相隔，每个融合蛋白可以与DNA靶的相反链结合。表1所示的所有蛋白两两组合可用于GS基因的靶向切割。根据本发明，ZFN可以靶向GS基因中的任何序列。
B.切割域
ZFN还包括一种核酸酶(切割域、切割半域)。此处所披露的融合蛋白切割域部分，可以得自任何核酸内切酶和核酸外切酶。得自切割域的典型核酸内切酶包括，但不限于，限制性核酸内切酶和归巢核酸内切酶。见，例如，2002-2003 Catalogue，New England Biolabs，Beverly，MA；and Belfortet al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388。切割DNA的其他酶是已知的(例如，S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰脱氧核糖核酸酶I；微球菌核酸酶，酵母HO核酸内切酶，另见，Linn et al.(eds.)Nucleases，Cold Spring HarborLaboratory Press，1993)。这些酶(或其功能片段)的一种或多种可以用作切割域和切割半域的来源。
同样地，切割半域可以来自任何核酸或其部分，如上所述，即要求切割活性二聚化。一般而言，如果融合蛋白包含切割半域，则切割需要两个融合蛋白。另外，包含两个切割半域的单一蛋白可以用到。这两个分裂半域可以来自相同的核酸内切酶(或其功能片段)，或每个切割半域可以来自不同的核酸内切酶(或其功能片段)。此外，两个融合蛋白的靶位点优选为彼此是经处理的，这样两个融合蛋白及其相应的靶位点结合将切割半域置于允许切割半域的彼此定位空间内，以形成一个功能切割域，例如，通过二聚化。因此，在某些实施例中，靶位点的边缘附近是通过5-8个核苷酸或15-18个核苷酸相隔。但是任何整数的核苷酸或核苷酸对可以引入两个靶位点(例如，2至50个核苷酸对或更多)之间。一般而言，切割位点介于靶位点之间。
限制性核酸内切酶(限制酶)存在于许多物种中，并且能够序列专一性结合DNA(识别位点)，并切割结合位点或其接近的DNA。某些限制性内切酶(例如，IIS型)在远离识别位点的位点切割DNA，并具有可分离的结合和切割域。例如，远离DNA一条链识别位点9个核苷酸以及另一条链识别位点13个核苷酸的IIS型酶Fok I催化双链切割。见，例如，美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4275-4279；Li et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2764-2768；Kim et al.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：883-887；Kim et al.(1994b)J.Biol.Chem.269：31，978-31，982。因此，在一个实施例中，融合蛋白包含至少一种IIS型限制性内切酶的切割域(或切割半域)和一种或多种锌指结合域，这可能是或可能不是被工程化的。
典型IIS型限制性内切酶，从结合域可分离的其切割域是Fok I。这种特定的酶是作为一种活性二聚体。Bitinaite et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：10，570-10，575。因此，为了本发明的目的，用于所披露融合蛋白的Fok I酶部分被认为是一种切割半域。因此，使用锌指Fok I融合、每个包含一种FokI切割半域的两种融合蛋白的靶向双链切割和/或细胞序列的靶向替换，可用于重建一种催化活性切割域。另外，含有锌指结合域和两种Fok I切割半域的单一多肽分子也可以用到。本发明的别处提出了使用锌指Fok I融合的靶向切割和靶序列改变。
切割域或切割半域可以是保持切割活性或者保持多聚化(如二聚化)能力的蛋白的任何部分，以形成功能切割域。
典型IIS型限制酶在国际专利公开WO 07/014275中描述，其全部内容通过引用并入本文。其他限制性内切酶还含有可分离的结合和切割域，这些都是本发明预期的。见，Roberts et al.(2003)Nucleic Acids Res.31：418-420。
在某些实施例中，切割域包含一种或多种最小化或防止同二聚化的工程化的切割半域(也称为二聚域突变体)，例如，美国专利申请No.20050064474；20060188987和20080131962所述，它们的全部披露内容通过引用并入本文。Fok I在446、447、479、483、484、486、487、490、491、496、498、499、500、531、534、537和538位点的氨基酸残基，全是影响Fok I切割半域二聚化的靶。
形成专性异质二聚体的Fok I的典型工程化的切割半域包括一对第一切割半域和第二切割半域，其中第一切割半域包括Fok I在位点490和538的氨基酸残基突变，第二切割半域包括位点486和499的氨基酸残基突变。
因此，在一个实施例中，赖氨酸(K)在490位点取代谷氨酸(E)的突变；赖氨酸(K)在538位点取代异基因(I)的突变；谷氨酸(E)在486位点突变取代谷氨酰胺(Q)的突变；以及赖氨酸(K)在499位点取代异基因(I)的突变。具体来说，此处所述的工程化的切割半域是通过一个切割半域中490(E→K)和538(I→K)的位点突变制得一个指定为“E490K:I538K”的工程化的切割半域，并通过另一个切割半域中486(Q→E)和499(I→L)的位点突变制得一个指定为“Q486E:I499L”的工程化的切割半域。如实例所述的一对ZFN，其中一个ZFN包含“E490K:I538K”切割域，其他包含“Q486E:I499L”切割域，也被称为“EL/KK”ZFN对。此处所述的工程化的切割半域是专性异质二聚体突变体，其中当含有这些切割半域的一对或多对核酸酶用于切割时，异常切割是最小化或消失的。见，例如，美国专利申请公开No.20080131962，它们的全部披露内容通过引用并入本文。
此处所述的工程化的切割半域可以采用任何合适的方法制得，例如，如美国专利申请公开No.20050064474(例子5)和20070134796(例子38)所述通过野生型切割半域(Fok I)的定点突变。
C.GS中靶向切割的其他方法
GS基因中具有靶位点的任何核酸可用于此处所披露的方法。例如，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶具有很长的识别序列，其中一些在统计上有可能曾存在于人类基因组。GS基因中具有唯一靶位点的任何这种核酸，可以用来代替(或除了)锌指核酸酶在GS基因中靶向切割。
典型归巢核酸内切酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII。它们的识别序列是已知的。另见美国专利No.5,420,032；美国专利No.5,420,032；美国专利No.6,833,252；Belfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3379-3388；Dujon et al.(1989)Gene 82：115-118；Perler et al.(1994)Nucleic Acids Res.22，1125-1127；Jasin(1996)Trends Genet.12：224-228；Gimble et al.(1996)J.Mol.Biol.263：163-180；Argast et al.(1998)J.Mol.Biol.280：345-353和New England Biolabs catalogue。
虽然大部分归巢核酸内切酶切割专一性相对于它们的识别位点不是绝对的，但是每个哺乳动物基因组中单一切割事件的足够长度的位点，可通过在含有其单拷贝识别位点的细胞中表达归巢核酸内切酶得到。另据报道，归巢核酸内切酶和大范围核酸酶的专一性可以被工程化为结合非天然的靶位点。见，例如，Chevalier et al.(2002)Molec.Cell 10：895-905；Epinat etal.(2003)Nucleic Acids Res.31：2952-2962；Ashworth et al.(2006)Nature441：656-659；Paques et al.(2007)Current Gene Therapy 7：49-66。因此，工程化的归巢核酸内切酶和/或大范围核酸酶被工程化为专一性结合所需的靶基因位点，如GS，也可以用到。
传送
此处所述的ZFN可以通过任何合适的方法被传送到靶细胞。合适的细胞包括但不限于真核和原核细胞和/或细胞系。这种细胞或细胞系的非限制性实例包括COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB11、CHO-DUKX、CHOK1SV)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)和perC6细胞以及昆虫细胞，如秋行虫(Sf)，或真菌细胞，如啤酒酵母、毕赤酵母和裂殖酵母。
对包含锌指的蛋白传送方法进行了描述，例如，在美国专利No.6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692；6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，它们的全部披露内容通过引用并入本文。
此处所述的ZFN也可以采用含有编码一种或多种ZFN的序列的载体传送。任何载体系统可用于包括，但不限于，质粒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等。另见，美国专利No.6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，它们的全部披露内容通过引用并入本文。此外，显然地，任何这些载体可以包含一种或多种ZFN编码序列。因此，当一对或多对ZFN引入细胞时，ZFN可以携带相同或不同的载体。当使用多种载体时，每种载体可以包含编码一种或多种ZFN的序列。
常规病毒和非病毒基因转移的方法可用于将编码工程化的ZFP的核酸引入细胞(例如，哺乳动物细胞)和靶组织中。这种方法也可用于在体外细胞施用编码ZFP的核酸。在某些实施例中，编码ZFP的核酸在体内或体外通过基因疗法施用。非病毒载体传送系统，包括DNA质粒、裸核酸、核酸与传送载体(如脂质体或泊洛沙姆)复合。病毒载体传送系统，包括DNA和RNA病毒，在传送到细胞后，其具有游离或整合基因组。对于基因治疗过程的评论，见，Anderson，Science 256：808-813(1992)；Nabel &Felgner，TIBTECH 11：211-217(1993)；Mitani & Caskey，TIBTECH11：162-166(1993)；Dillon，TIBTECH 11：167-175(1993)；Miller，Nature357：455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology 6(10)：1149-1154(1988)；Vigne，Restorative Neurology and Neuroscience 8：35-36(1995)；Kremer &Perricaudet，British Medical Bulletin 51(1)：31-44(1995)；Haddada et al.，inCurrent Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and
Figure BPA00001389150800261
(eds.)(1995)；和Yu et al.，Gene Therapy 1：13-26(1994)。
编码工程化的ZFP的核酸的非病毒传送方法包括电击、脂质体、显微注射、基因枪法、病毒颗粒、脂质体，免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸轭合物、裸DNA、人工病毒粒子和DNA的促药剂吸收。使用声孔效应(例如，声孔效应2000系统(Rich-Mar))也可用于核酸传送。
其他典型核酸传送系统包括Amaxa生物系统(Cologne，Germany)，Maxcyte，Inc.(Rockville，Maryland)和BTX分子传送系统(Holliston，MA)和Copernicus Therapeutics Inc.，(见，例如，No.6,008,336)。
脂质体在(例如)US 5,049,386，US 4,946,787；和US 4,897,355中描述，脂质体转染试剂是市售(例如，TransfectamTM和LipofectinTM)的。适合于多核苷酸转染的高效受体识别的阳离子和中性脂质包括Felgner，WO91/17424、WO 91/16024。可以传送到细胞(体外给药)或靶组织(体内给药)。
脂质的制备：核酸复合物，包括靶向脂质体，如免疫脂质复合物，是本领域普通技术人员众所周知的(见，例如，Crystal，Science 270：404-410(1995)；Blaese et al.，Cancer Gene Ther.2：291-297(1995)；Behr et al.，Bioconjugate Chem.5：382-389(1994)；Remy et al.，Bioconjugate Chem.5：647-654(1994)；Gao et al.，Gene Therapy 2：710-722(1995)；Ahmad et al.，Cancer Res.52：4817-4820(1992)；美国专利No.4,186,183，4,217,344，4,235,871，4,261,975，4,485,054，4,501,728，4,774,085，4,837,028和4,946,787)。
用于编码工程化的ZFP的核酸的RNA或DNA传送系统，利用了体内针对特定细胞的病毒和将该病毒有效负荷运输到细胞核的高度演化过程。病毒载体可以直接施用给病人(体内)，或者可用于治疗体外细胞以及将修饰细胞施用给病人(间接体内)。ZFP传送的常规病毒系统包括但不限于，逆转录病毒、慢病毒，腺病毒、腺相关病毒、牛痘和基因转移的单纯性疱疹病毒载体。宿主基因组中逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法的整合是可能的，往往导致插入转基因的长期表达。此外，已观察到许多不同类型的细胞和靶组织的高转导率。
逆转录病毒的趋性可以通过结合外源包膜蛋白、扩展靶细胞的潜在靶种群而改变。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞或一般产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移系统的选择依赖于靶组织。逆转录病毒载体是由包装容量达6-10kb外源性序列的顺式作用长末端重复组成的。最小的顺式作用LTR足够于复制和载体的包装，然后再用于将治疗基因整合到靶细胞中，以提供不变的转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于小鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，人类免疫缺陷病毒(HIV)及其组合的那些载体(例如，见Buchscher et al.，J.Virol.66：2731-2739(1992)；Johann et al.，J.Virol.66：1635-1640(1992)；Sommerfelt et al.，Virol.176：58-59(1990)；Wilson et al.，J.Virol.63：2374-2378(1989)；Miller et al.，J.Virol.65：2220-2224(1991)；PCT/US94/05700)。
在应用中，其中ZFP融合蛋白的瞬时表达是优选的，腺病毒系统可以用到。腺病毒载体能够在许多细胞类型中高效转导，而且不需要细胞分裂。这种载体已获得高滴度和高水平的表达。这种载体可以在相对简单的系统中大量地生产。腺相关病毒(“AAV”)载体也用于靶核酸转导细胞，例如，核酸和多肽类的体外生产以及体外和体内基因治疗过程(见，例如，West etal.，Virology 160：38-47(1987)；美国专利No.4,797,368；WO 93/24641；Kotin，Human Gene Therapy 5：793-801(1994)；Muzyczka，J.Clin.Invest.94：1351(1994)。重组AAV载体的构建在多个公开文献中有所描述，包括：美国专利No.5,173,414；Tratschin et al.，Mol.Cell.Biol.5：3251-3260(1985)；Tratschin，et al.，Mol.Cell.Biol.4：2072-2081(1984)；Hermonat & Muzyczka，PNAS 81：6466-6470(1984)；和Samulski et al.，J.Virol.63：03822-3828(1989)。
至少6个病毒载体的方法目前可用于临床试验的基因转移，使用方法涉及到通过将基因插入到辅助细胞系以产生转导剂的缺陷型载体互补作用。
pLASN和MFG-S是逆转录病毒载体已被用于临床试验的实例(Dunbaret al.，Blood 85：3048-305(1995)；Kohn et al.，Nat.Med.1：1017-102(1995)；Malech et al.，PNAS 94：2212133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因治疗试验的第一个治疗载体(Blaese et al.，Science 270：475-480(1995))。MFG-S包装载体已观察到50％或更高的转导率(Ellem et al.，ImmunolImmunother.44(1)：10-20(1997)；Dranoff et al.，Hum.Gene Ther.1：111-2(1997)。
重组腺相关病毒载体(rAAV)是一种基于缺陷性和非致病性细小病毒腺相关2型病毒的很有前途的替代基因传送系统。所有载体是来自只保留AAV 145bp末端反向重复侧翼转基因表达试剂盒的质粒。高效的基因转移和稳定的转基因传送是由于转导细胞整合到基因组是这种载体系统的主要特点(Wagner et al.，Lancet 351：91171702-3(1998)，Kearns et al.，GeneTher.9：748-55(1996))。
复制缺陷型重组的腺病毒载体(AD)可以高滴度生产，而且容易感染许多不同的细胞类型。大多数腺病毒载体是被工程化的，以使得转基因替代Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后，复制缺陷型载体在供应反式删除基因功能的人类293细胞中传送。Ad载体可以转导体内多种类型的组织，包括不分裂、分化型细胞，如肝、肾和肌肉中发现的细胞。常规的Ad载体具有大的载运容量。临床试验使用的Ad载体实例涉及抗肿瘤免疫与肌肉注射的多核苷酸治疗(Sterman et al.，Hum.Gene Ther.7：1083-9(1998))。临床试验中基因转移使用的腺病毒载体的其他实例包括Rosenecker et al.，Infection 24：15-10(1996)；Sterman et al.，Hum.Gene Ther.9：71083-1089(1998)；Welsh et al.，Hum.Gene Ther.2：205-18(1995)；Alvarez et al.，Hum.Gene Ther.5：597-613(1997)；Topf et al.，Gene Ther.5：507-513(1998)；Sterman et al.，Hum.Gene Ther.7：1083-1089(1998)。
包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这些细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。用于基因治疗的病毒载体一般是由将核酸载体包成病毒颗粒的生产者细胞系产生的。载体一般含有需要包装以及随后进入宿主(如果适用)的最小病毒序列，通过编码所要表达的蛋白的表达试剂盒替代的其他病毒序列。缺少的病毒功能是通过包装细胞系反式提供的。例如，基因疗法中使用的AAV载体一般只具有需要包装和整合到宿主基因组的AAV基因组的末端反向重复(ITR)序列。病毒DNA是在细胞系中包装，其中含有一个编码其他AAV基因的辅助质粒，即蛋白和盖，但缺乏ITR序列。细胞系也被腺病毒感染作为辅助者。辅助病毒促进了辅助质粒的AAV载体复制和AAV基因表达。辅助质粒是不大量包装的，由于缺乏ITR序列。腺病毒污染可通过(例如)热处理的腺病毒较AAV敏感而降低。
在许多基因治疗的应用中，将基因治疗载体高度专一性地传送到某一特定组织类型是可取的。因此，病毒载体可以通过在病毒外表面表达含有病毒外壳蛋白的配体融合蛋白而修饰为对某一给定细胞类型具有专一性。配体被选择为对目标的细胞类型中已知存在的受体具有亲和力。例如，Hanet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：9747-9751(1995)报道，小鼠白血病病毒可以被修饰为表达人类调蛋白融合gp70，重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人类乳腺癌细胞。这个原则可以推广到其他病毒靶细胞对，其中靶细胞表达受体，病毒表达包含细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可以被工程化为对几乎任何选择的细胞受体具有特定结合亲和力的展示抗体片段(例如，FAB或Fv)。虽然上述说明主要适用于病毒载体，同样的原则可以适用于非病毒载体。这些载体可以被工程化为有利于特定靶细胞吸收的含有特定吸收序列载体。
基因治疗载体可以通过施用到个别病人体内传送，一般情况下，通过全身给药(例如，静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下或颅内注射)或局部施用，如下所述。另外，载体可以传送到细胞体外，如从个别病人(如淋巴细胞、骨髓抽吸、组织活检)外植的细胞或普通供血者造血干细胞，一般在已和载体合并的细胞选择后，接着将该细胞再植入病人。
诊断学、研究或基因治疗(例如，通过转染细胞重新输入到宿主生物体中)的间接体内细胞转染是本领域普通技术人员众所周知的。在一个优选实施例中，细胞是从易患的生物体分离，采用ZFP核酸(基因或cDNA)转染，并重新输入到易患的生物体(例如，病人)中。适合于间接体内转染的各种细胞类型是本领域普通技术人员众所周知的(见，例如，Freshneyet al.，Culture of Animal Cells，A Manual of Basic Technique(3rd ed.1994))及其对于如何从病人分离和培养细胞的讨论引用的参考文献)。
在一个实施例中，干细胞被用于细胞转染和基因治疗的间接体内过程。采用干细胞的优点是它们可以在体外分化成其他类型的细胞，或者可以引入哺乳动物(如细胞供体)，其中它们将被灌注入骨髓中。采用细胞因子的方法(如GM-CSF、IFN-γ和TNF-α)将CD34阳性细胞在体外分化为临床上重要的免疫细胞类型是已知的(见Inaba et al.，J.Exp.Med.176：1693-1702(1992))。
采用已知方法将干细胞分离为转导和分化。例如，干细胞是通过使用结合不必要细胞(如CD4+和CD8+(T细胞)、CD45+(panB细胞)、GR-1(粒细胞)和IAD(分化抗原递呈细胞))的抗体淘选骨髓细胞而从骨髓细胞中分离的(见Inaba et al.，J.Exp.Med.176：1693-1702(1992))。
含有治疗ZFP核酸的载体(如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)也可以直接施用到体内细胞转导的生物体中。另外，裸DNA可以施用。施用是通过正常用于将分子引入最终与血液或组织细胞接触的分子的任何路径，包括但不限于，注射、输液、局部施用和电穿孔。这种核酸施用的合适方法是可利用的，且对本领域普通技术人员是众所周知的，而且，虽然多种路径可用于施用一种特定的组合物，一条特定的路径往往能比另一条路径提供更直接、更有效的反应。
披露了将DNA引入造血干细胞的方法，例如，在美国专利No.5,928,638中。用于将转基因引入造血干细胞的载体，例如，CD34阳性细胞，包括35型腺病毒。
适合于将转基因引入免疫细胞(如T细胞)的载体，包括非整合慢病毒载体。见，例如，Ory et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA93：11382-11388；Dull et al.(1998)J.Virol.72：8463-8471；Zuffery et al.(1998)J.Virol.72：9873-9880；Follenzi et al.(2000)Nature Genetics25：217-222。
药学上可接受的载体在某种程度上是通过正在施用的特定组合物以及用于施用组合物的特定方法确定的。因此，有可利用的种类繁多的药物组合物的合适配方，如下所述，(见，例如，Remington’s PharmaceuticalSciences，17th ed.，1989)。
如上所述，已披露的方法和组合物可用于任何类型的细胞，包括，但不限于，原核细胞、真菌细胞、古细菌细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物细胞、脊椎动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞。蛋白表达的合适细胞系是本领域普通技术人员众所周知的，包括，但不限于COS、CHO(例如，CHO-S、CHO-K1、CHO-DG44、CHO-DUXB 11)、VERO、MDCK、WI38、V79、B14AF28-G3、BHK、HaK、NS0、SP2/0-Ag14、HeLa、HEK293(例如，HEK293-F、HEK293-H、HEK293-T)、perC6、昆虫细胞，如秋行虫(Sf)和真菌细胞，如啤酒酵母、毕赤酵母和裂殖酵母。这些细胞系的后代、变体和衍生物也可以用到。
应用
所披露的方法和组合物可用于GS基因组序列的失活。如上所述，失活包括细胞中的GS基因表达的部分或完全失活。可以实现GS基因的失活，例如，通过单一切割事件，随后通过非同源末端连接切割，连接后通过在两个位点的切割以删除两个切割位点之间的序列，通过将错义或无义密码子靶向重组入编码区，通过将不相关的序列(即“填充”序列)靶向重组入基因或其调控区以破坏该基因或调控区，或通过将剪接受体序列靶向重组入内含子以造成转录物的不适当剪接。
因此，此处所述的方法和组合物考虑到用于重组蛋白生产的GS缺陷型细胞系，例如α1-抗胰蛋白酶和/或单克隆抗体的生产。其他基因，如FUT8和细胞一样也可以失活，其中失活FUT8产生表现出更好效应功能的抗体，特别是在ADCC诱导中。
实例
实施例1：ZFN的工程化和结构
A.谷氨酰胺合成酶(GS)ZFN
因为CHO基因组的全序列是不可用的，对CHO GS基因进行克隆和测序，以产生ZFN工程化的靶向DNA序列。图13显示了完整的CHO GS序列，还指定了内含子和外显子。
CHO GS基因外显子6内的ZFN靶位点是选择的，是因为这种区域编码对基于可用的晶体结构的GS蛋白催化功能关键的氨基酸(见，例如，Almassy et al.(1986)Nature 323：304-309；Gill et al.(2002)Biochem.41：9863-9872；Liaw et al.(1994)Biochem.33：675-681)，同样地，预计这个位点的ZFN介导突变造成功能GS活性的减少。CHO GS外显子6的部分序列如下所示。大写字母表示外显子序列；小写字母表示内含子序列；ZFN靶位点9372/9075(表1，图1A和图4A)是加有下划线的：
5’-atggcactattctgttccttttcctcccctctgaagacttggcacatggggactttggttaacaagggtgatgacttaaaagtggttcagggtagaggtaagtagaacaagctaggagcttgagttggcctgaacagttagttggccttattctaaaggtcaacatgttctttctagTGGGAATTCCAAATAGGACCCTGTGAAGGAATCCGCATGGGAGATCATCTCTGGGTGGCCCGTTTCATCTTGCATCGAGTATGTGAAGACTTTGGGGTAATAGCAACCTTTGACCCCAAGCCCATTCCTGGGAACTGGAATGGTGCAGGCTGCCATACCAACTTTAGCACCAAGGCCATGCGGGAGGAGAATGGTCTGAAgtaagtagcttcctctggagccatctttattctcatggggtggaagggctttgtgttagggttgggaaagttggacttctcacaaactacatgccatgctcttcgtgtttgtcataagcctatcgttttgtacccgttggagaagtgacagtactctaggaatagaattacagctgtgatatgggaaagttgtcacgtaggttcaagcatttaaaggtctttagtaagaactaaatacacatacaagcaagtgggtgacttaattcttactgatgggaagaggccagtgatgggggtcttcccatccaaaagataattggtattacatgttgaggactggtctgaagcacttgagacataggtcacaaggcagacacagcctgcatcaagtatttattggtttcttatggaactcatgcctgctcctgcccttgaaggacag-3’(SEQ ID NO：30)
ZFN9372和ZFN9075的结合位点如图4B所示，图4C则描述了这些ZFN的靶和指工程化。
此外，还工程化了靶向外显子2内位点的ZFN。CHO外显子2的部分序列如下所示。大写字母表示外显子序列；小写字母表示内含子序列；ZFN靶位点8365/8361(表1，图1A)是加有下划线的。
5’-ggctggcagatctccgagttcgaggctgacctggtctgaatagcaaggaaattaaggggtgaggcgtatgtctgttaaagcaagaataaaaggcaaaggaacactccacagtcaattattcaagtcttgatggcagtaatgtagttgtattgggtggattaagacattctaataatgaatttttttgtctttttgttccctcttttcagctttctcaaaattaatggatattaaaaatccccttagccgggcgttggtggcacacacctttaatcccagcactcgggaggcagaggcaggcagatctctgtgagttcgaggccagcctggtctccagattgagtgccaggataggctccaaagctacacagaaaccgtgtctcgaaaaacaaaacaaaaaaataaaaaaaaaaatcccttaactagcccaacctacaagggatgatctttgtctaactatgaactttaaacctcttgaaagcagagtgaataatgcacttcaataatgttgacttccaaaggagagaccaccacaccgttccctgtgcctcttacgcaattcctgcaggggacccccttcagagtagatgttaatgaaatgacttttgtctctcCAGAGCACCTTCCACCATGGCCACCTCAGCAAGTTCCCACTTGAACAAAAACATCAAGCAAATGTACTTGTGCCTGCCCCAGGGTGAGAAAGTCCAAGCCATGTATATCTGGGTTG ATGGTACTGGAGAAGGACTGCGCTGCAAAACCCGCACCCTGGACTGTGAGCCCAAGTGTGTAGAAGgtgagcatgggcaggagcaggacatgtgcctggaagtgggcaagcagcctgagatttgaccttccttctgttttgtttgcaaagtctttcaaaagcaggtctcttcaggcctcagtcagtcacccgtaagctgccgagtagtctggaggcatagaaaacaatggaggcctttatttagatggaatcttgtgtgtgctggtacactgaagaaaaatattgggtcatatttgtagggggtgggaggttggagtattgctaacctagccaaccccaggaacctagtttgaaagacctgtaactagaatatgctatcaagtttatagagcagtggttctcaacctttcaaatgctttacacttgaatacaactcctcatgttctggtgattacccccatcccaaccattgctaacttcttaactgaaatttcactactgctacgaatcataatgtatctgtgtttttggatggtcttaggtgacccctgtgaaagggttgtgagaccatcctcaaaggggttgtgacctacaggttgagacccttttgagtgctgtgtttattagtatttatacagtggaattctgggtgcaaagcacatgctccaaagtagtttctctgggactggccatttgttttcgatggggatcttttaaaacttgcaaaggaaccaaaaaaaaaaaaatgcagaaaaaaggaggtgggggagtgcacgcctttaatcccagtacttgggaggcagaggcaggcggatctctgtgagtttgagaccagcctggtctacaagagctagttccaggacagcctccaaagccacagagaaaccctgtctcaaaacaaacaaacaaacaaaaaaattaaaaaaaaaaaaaactttcaaaggagacctgttttattttagttgtggcctttgttttggtaggaagggcagctagtttaggatgagtttttattattctaagatgttgccgtttg-3’(SEQ ID NO：31)
将ZFN靶向的CHO GS序列(例如，如表1所示)，组装成美国专利申请No.12/218,035中所述的哺乳动物表达载体，并通过瞬时转染入CHO细胞进行测试。
B.DHFR ZFN
如美国专利申请公开No2008/0015164所述，工程化和生产了靶向DHFR的ZFN。对于此处所述的实验，使用了9461/7844和9476/9477(个别ZFN如表2所示)指定的DHFR ZFN对。
表2：靶向DHFR的典型锌指核酸酶
Figure BPA00001389150800341
C.FUT8 ZFN
如美国专利No.12/218,035所述，工程化和制备靶向FUT8的ZFN。对于此处所述的实验，使用了12176和12172(如表3所示)指定的FUT8ZFN。
表3：靶向FUT8的典型锌指核酸酶
Figure BPA00001389150800351
包含编码上述ZFN的序列的质粒基本上被构建为如Urnov et al.(2005)Nature 435(7042)：646-651所述通过融合美国专利申请公开No.2008/0131962和Miller et al.(2007)Nature Biotech.25：778-785所述的野生型FokI切割域或专性异质二聚体FokI切割域。
实施例2：内源性GS的GS-ZFN修饰
为了确定GS靶向ZFN修饰的内源性GS基因位点是否正如预期，按照制造商说明(Trangenomic SURVEYORTM)基本地进行了CEL-1错配检测。简单地说，将适当的ZFN质粒对分别转染含血清培养基中粘附生长的CHO K-I细胞或者无血清化学限定培养基中悬浮生长的CHO-S细胞。
CHO K-I细胞，得自美国菌种保藏中心，并推荐在补充有10％的合格胎牛血清(FCS，Hyclone)的F-12培养基(Invitrogen)中成长。CHO-S细胞购自Invitrogen(Carlsbad，CA)，并在保持悬浮培养的化学限定无蛋白和动物成分的CD-CHO培养基中生长，必要时在温度为37℃、含有5％二氧化碳、转速为125rpm的湿度控制振荡培养箱(ATR，inc.，Laurel，Maryland)中补充8mM L-谷氨酰胺和HT补充物(100μM次黄嘌呤钠和16μM胸腺嘧啶)(全都得自Invitrogen，Carlsbad，CA)。
粘连细胞是采用TrypLE SelectTM蛋白酶(Invitrogen)从塑料器具中分离的。对于转染，将一百万CHO细胞与1μg锌指核酸酶以及100μL Amaxa溶液T混合。使用方案U-23对细胞在Amaxa Nucleofector IITM中进行转染，并重新获得1.4mL温的F-12培养基+10％FCS。
采用Qiagen DNeasyTM试剂盒(Qiagen，Inc.)从ZFN处理细胞中提取基因组DNA，通过PCR采用ZFN靶向的GS基因位点区的适当引物扩增靶基因位点，将PCR产物经过融化/退火一步，导致通过突变体和野生型DNA的随机重新退火形成扭曲的双链DNA。然后将CEL-I酶(SurveyorTMmutation detection kit，Transgenomic，Inc.)添加到专一性切割DNA双链的错配位点上。将CEL-I切割样品使用溴化乙锭染色，进行10％TBE聚丙烯酰胺凝胶电泳，并使用显微测密术对DNA条带进行量化。基本上如Miller etal.(2007)所述计算NHEJ的频率。
如图1A和1B所示，GS ZFN修饰内源性GS基因位点。特别是，包括ZFN9372和ZFN 9075的ZFN对，造成CHO-KI细胞中26％(野生型切割域)和24％(工程专性异质二聚体形成切割域)的染色体修饰以及CHO-S细胞中25％的染色体修饰(图1b)。同样地，包括ZFN8361和8365的ZFN对(靶向外显子2)造成7％的染色体修饰。
与SurveyorTM核酸检测(图1A)的结果一致，直接测序证实34％(91/266)的等位基因具有NHEJ介导型DNA修复的典型ZFN靶位点(见，例如，Weterings et al.(2004)DNA repair(Amst)3：1425-1435)。重要的是，81％的测序突变导致框移动(图5)。
实施例3：GS阴性细胞系的制备
为了制备缺乏GS的CHO细胞系，通过限制稀释实施例2所述的CHO-K1和CHO-S转染池分离单细胞系。ZFN靶区的测序显示，54个中的17个CHO-S细胞系(31％)具有至少一种破坏GS基因，54个中的8个(15％)是突变等位基因的纯合子，2个是复合杂合子，而其余7个是杂合子(野生型等位基因)。对于CHO-K1细胞系，50个中的18个(36％)的序列分析具有至少一种破坏GS等位基因，5个(10％)是给定突变的纯合子，另见，图1C显示纯合突变系的基因型。
全部纯合突变系具有导致关键氨基酸(如细胞系B4、KA2和KA4)的开放框移动或同框敲除的GS突变，因此，预计不会制备活性GS酶。据预测，相对于野生型CHO细胞系(图1C)，没有一个纯合突变细胞系在缺乏外源性L-谷氨酰胺的情况下生长。
采用抗-GS的单克隆抗体(BD Biosciences)的蛋白印迹分析证实，含有框移动或大敲除的所有细胞系表达不可检测出的GS蛋白(例如，B3克隆，图1D)。具有小同框敲除的细胞系(B4和KA2)表达可通过蛋白印迹检测出的GS蛋白，并表示政府总部采用Western印迹检测，但是与GS催化活性的关键氨基酸的删除一致，并不支持细胞在缺乏L-谷氨酰胺的情况下生长(图1C)。细胞系B3的生长也表明取决于谷氨酰胺补充(见图6)。
为了进一步验证它们的GS-/-表型，对3个CHO-K1克隆在化学限定无血清培养基中的悬浮生长在3个月内进行了调整。然后进一步在4周内对细胞的生长和细胞存活率进行监测(图1E)。
在L-谷氨酰胺(24-27小时倍增时间类似于在类似条件下行业标准CHOK1SV的生长)存在情况下，Z FN GS-/-系在无血清悬浮培养基中正常生长。随后，L-谷氨酰胺的去除导致细胞生长的立即停止和存活率的迅速丧失(见图1E中箭头)。人IgG抗体表达结构的瞬时转染证实了所有3个GS-/-系的转基因表达水平与CHOK1SV系所得那些是可比较的。
总的来说，这些数据证实了经遗传和表型验证的GS敲除CHO细胞系的成功制备。
实施例4：GS-DHFR双敲除细胞系的制备
为了制备双敲除细胞系，以CHO-S GS-/-细胞系B3为背景采用了靶向DHFR基因的ZFN。采用上述GS策略的ZFN介导型敲除在美国专利申请公开No.2008/0015164中描述。
在这个实例中，将两对ZFN同时靶向传送至DHFR基因两个不同的区域，以达到通过NHEJ切割染色体末端的修复删除间隔基因组片段的目标。据预计，ZFN专一性间隔序列的删除将导致消除较小同框突变可能的较大和较好的确定突变，以恢复蛋白表达，例如图1D(左幅标记为“B4”)。
除了靶向CHO DHFR基因外显子1(美国专利申请公开No.2008/0015164)的前述ZFN对9461/7844之外，制备了紧跟着外显子1以距离内含子～240bp的位点为靶的第二ZFN对(图2A和图7A)。
如实施例3所述进行瞬时转染，并使用靶向外显子1的ZFN9461/ZFN7844对或只是靶向内含子位点的ZFN9476/ZFN9477(见图7B和7C)进行转染，分别导致GS-/-细胞系B3中内源性DHFR基因位点15％和18％的等位基因突变频率(图2B)。两个ZFN对共转染入GS-/-细胞系B3，导致与ZFN结合位点之间序列预期～240bp的删除一致的较短PCR扩增产物的出现(图2C)。这种删除所有等位基因的频率估计为～8％，只有当两对ZFN引入细胞时能观察到(图2C)。
PCR框推定删除的克隆和测序揭示了ZFN靶位点之间序列的预期删除(图8)。重接染色体末端的接点序列所观察到的一些变化与NHEJ修复过程特有的预期小插入和删除相一致。
通过限制稀释图2C的泳道7中的ZFN处理池分离单细胞系。PCR扩增和测序揭示9％(200分之18)的细胞系具有预期的～240bp删除。这4个细胞系(所有细胞系的2％筛选，所有细胞系的22％含有删除)被发现在DHFR基因中具有等位基因突变(图2D)。细胞系2B12.8是外显子1和内含子1ZFN切割位点之间的间隔区的244-bp删除的纯合子。剩余的细胞系只有一种含240bp删除的等位基因，而其他提供了外显子和/或内含子ZFN靶位点的传统较小的NHEJ驱动突变。例如，细胞系1F1.6含有一种～240bp删除的等位基因(与双ZFN切割和删除事件一致)，但其他等位基因含有导致框移动的外显子1内的4-bp删除。
细胞系1F1.6和2B12.8具有与完整基因敲除一致的基因型，因此被选作进一步鉴定。蛋白印迹分析表明在这些单细胞系中没有全长DHFR或GS蛋白(图2E)。此外，相对于亲本GS-/细胞系B3或野生型CHO细胞，细胞系也都不用与DHFR蛋白活性位点结合的荧光素标记的甲氨蝶呤进行染色。最重要的是，1F1.6和2B12.8细胞系的生长依赖于外源性次黄嘌呤和胸腺嘧啶(HT)和L-谷氨酰胺向培养基的添加。相比之下，亲本GS-/-细胞系B3需要L-谷氨酰胺，但不需要HT，而DHFR阴性CHO细胞系DG44(GSW)只需要HT，但不需要生长补充的L-谷氨酰胺和野生型CHO-S(图2F)。
外源性HT和L-谷氨酰胺的依赖证实了细胞系1F1.6和2B12.8中GS和DHFR活性的功能型丧失。
因此，总的来说，这些数据表明了经遗传和表型验证GS-/-/DHFR-/-双敲除CHO细胞系的成功制备。
实施例5：GS-DHFR-FUT8三敲除细胞系的制备
使用GS-/-DHFR-/-CHO细胞系IF1.6也制备了GS、DHFR和FUT8的三敲除。如美国专利No.12/218.035描述，使用非人类细胞(例如CHO)在蛋白疗法中表达造成的异常糖基化，可以改变蛋白产物的效用、半衰期以及甚至免疫原性。因此，非人类表达系统中蛋白糖基化的人性化方法是非常可取的。CHO FUT8基因是一种编码能催化岩藻糖从GDP-岩藻糖转移到N-连接寡糖GlcNAc核心的α1，6-岩藻糖转移酶的靶。以高度保守的Fut基序II在外显子10中编码的氨基酸残基的点突变导致FUT8酶的失活。
因此，我们克隆和测序CHO-K1基因组的跨越FUT8外显子10和侧翼内含子的区域，并工程化靶向外显子10的ZFN(美国专利申请No.12/218,035；图3A和图9)。ZFN12172/ZFN12176瞬时传送到细胞1F1.6，造成了FUT8等位基因7.5％的修饰(图3B)，通过限制稀释从这个池得到单细胞系。
使用市售抗体没有检测出三霉菌FUT8，因此，如Yamane-Ohnuki et al.(2004)Biotechnol Bioeng 87：614-622所述，我们使用FACS荧光透镜凝集素(F-LCA)结合试验进一步检测α1，6-岩藻糖转移酶的活性。LCA有选择性地结合于它们细胞表面上提供核心荧光化寡糖的细胞。由于FUT8活性完全丧失，缺乏核岩藻糖基化的细胞不与LCA结合。ZFN细胞系与F-LCA结合能力的筛选显示在2％完全缺乏FUT8酶活性(图3C)的细胞系中缺乏F-LCA结合(200分之4)。
基因组DNA的PCR扩增测序证实，这两个克隆在FUT8靶基因位点具有等位基因化合物杂合突变(图3D)，其编码这个功能关键区的阅读框移动。因此，这两个细胞系的基因型与所观察到F-LCA结合(图3C)的缺乏一致，并证明了细胞系35F2和14C1中FUT8的ZFN驱动基因和功能敲除。贯穿多轮ZFN转染和单细胞克隆中，两个FUT8-/-克隆也稳定地保留了它们的GS-/-和DHFR-/-基因型及表型。事实上，以补充有HT和L-谷氨酰胺的血清培养基的生长率测量，制备的三敲除细胞系耐受性良好，其中HT和L-谷氨酰胺分别给出了克隆35F2和14C1的21.8和21.6小时倍增时间的平均数。总的来说，这些数据表明使用工程化的ZFN成功制备了CHO细胞中的单、双和三基因敲除。
实施例6：GR-CCR5-PPP1R12C三敲除细胞系的制备
通过失活ZFN的同时施用也制备了三敲除细胞系。特别是，CCR5、糖皮质激素受体(GR)和PPP1R12C(也称为腺相关病毒整合位点或“AAVS1”)失活的K562细胞系，也是通过靶向这些基因位点的ZFN的同时施用制备。
如美国专利公开No.20080159996(CCR5)；20080188000(GR)和美国专利公开No.12/150,103(PPP1R12C/AAVS1)所述，制备了靶向CCR5、GR和AAVS1 ZFN的ZFN。显示这些基因中部分ZFN结合位点的示意图如图10A所示。CCR5基因含有3个外显子，编码序列(CDS)是位于外显子3内，CCR5 ZFN靶序列是位于所示的CDS内。GR基因含有9个外显子，GR ZFN靶序列是位于外显子3内。AAVS1 ZFN靶序列是位于AAVS1区的中间。
将与野生型、ZFN-Fok I(wt)或专性异质二聚体EL/KK
变体、Fok I催化域的ZFN-Fok I(EL/KK)连接的编码ZFN对的质粒，瞬时共同转染入K562细胞，并在转染后10天通过SurveyorTM核酸检测确定CCR5(左)、GR(中)，AAVS1(右)基因位点的修饰频率。如图10B所示，靶基因在ZFN处理后是受到NHEJ影响的。
通过上述PCR和基因组DNA测序，对这些三敲除细胞的单细胞系也进行了评价。特别是，对图10B中使用CCR5 ZFN-Fok I(EL/KK)+GRZFN-Fok I(EL/KK)+AAVS 1ZFN-Fok I(EL/KK)处理的泳道8样品进行了检测。PCR引物被工程化为专一性扩增未修饰野生型(wt)序列，而不是删除序列。
结果如下表4所示。含有野生型序列(wt或杂合)的所有克隆具有预测大小的可见PCR条带，而基因敲除(KO)克隆具有不可见PCR条带。在通过CCR5 PCR筛选的144个单细胞克隆之中，5个克隆含有CCR5 KO。9个克隆通过GR PCR被鉴定为GR KO。2个克隆人同时含有CCR5 KO和GR KO。所有12个克隆，是基于CCR5 PCR或GR PCR的KO克隆，通过AAVS1 PCR进行了筛选。在筛选的144个克隆之中，1个CCR5单KO克隆被鉴定出，7个GR单KO克隆被鉴定出，但没有试图尝试鉴定AAVS1单KO克隆。1个CCR5/GR双KO克隆被鉴定出。2个CCR5/AAVS1双KO克隆被鉴定出。在144个克隆之中，没有GR/AAVS1双KO克隆被鉴定出，尽管很可能GR/AAVS1双KO克隆可能已被鉴定出，如果对更多的克隆进行筛选。1个CCR5/GR/AAVS1三KO克隆(B17)被鉴定出。
表4：推定三敲除细胞的单细胞克隆的评价
  CCR5   GR   AAVS1
  筛选的全部克隆   144   144   12*
  全部KO克隆   5   9   3
  单KO克隆   1   7   N/A
  CCR5/GR双KO克隆   1   1   N/A
  CCR5/AAVS1双KO克隆   2   N/A   2
  GR/AAVS1双KO克隆   N/A   0   0
  CCR5/GR/AAVS1三KO克隆   1   1   1
*12个克隆被鉴定为CCR5或GR KO克隆
三敲除克隆B17的典型测序数据如图10C所示。ZFN靶序列是加有下划线的。′-′表示删除，粗体字母表示插入。
实施例7：GS靶向的ZFN在多个物种和细胞类型中是具有活性的
此处所述的GS专一性ZFN(工程化为人CHO细胞GS序列)也在老鼠细胞中进行了评价。如图11A和11B所示，GS中的ZFN靶位点在不同物种间高度保守。
如实施例2所述，对ZFN对8361/8365(靶向外显子2)和9075/9372(靶向外显子6)在人体K562GS和鼠标Neuro2a细胞中切割GS的能力进行了评价。
如图12所示，工程化为CHO ZFN序列的ZFN在人类其他细胞类型和其它物种中是具有功能性的。
如实施例2所述，对GS专一性ZFN(ZFN9075和ZFN9372)也在人类胚胎肾293细胞中进行了测试。如图14A所示，CEL-I酶(SurveyorTM突变检测试剂盒，Transgenomic，Inc.)显示了21％发生率的NHEJ。
GS敲除细胞系是在HEK293细胞背景下，采用与在CHO细胞中使用相同GS ZFN(见实施例3)的同样方法制得。对两个敲除克隆(克隆g17和g52)进一步进行表征。克隆g52是一种在GS基因位点11bp删除的纯合子。克隆17具有在GS等位基因的一种169bp删除，在其他等位基因的4bp插入。如图14B所示，通过蛋白印迹检测，克隆都不表达Gs蛋白。重要的是，克隆都需要生长的外源性补充L-谷氨酰胺(见图14C)。
因此，通过靶基因连续或同时的失活，ZFN可用于迅速敲除单一哺乳动物细胞系中的多个基因。此处提供的结果并不依赖于细胞系或ZFN的选择。每个单个基因(＞1％)中ZFN驱动等位基因敲除事件结合缺乏选择标记依赖的频率，导致这种遗传病变的能力迅速“堆叠”，并制备先前考虑认为不切实际的复合多基因敲除细胞系。只是瞬时ZFN表达和真核细胞中多种特性堆叠后的高效率基因敲除，使得基本上任何细胞类型的自定义基因工程是可行的。
此处提及的所有专利、专利申请和出版物，它们的全部内容通过引用并入本文。
为了解清楚的目的，虽然已通过图解和实例的方法对本发明进行了详细说明，可以实施而不背离本发明精神或范围的各种变化和修饰对本领域的普通技术人员来说将是显而易见的。因此，上述说明书和实例不应被理解为限制。

Claims (16)

1.一种包含下表中单一行所示锌指识别区域中的4或6个锌指识别区域的锌指DNA结合域蛋白。
Figure FSB0000117100860000011
2.一种包含根据权利要求1所述锌指DNA结合域蛋白和至少一种切割域或至少一种切割半域的融合蛋白。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其中所述切割半域是野生型或工程化FokI切割半域。
4.一种编码根据权利要求1所述的锌指DNA结合域蛋白或根据权利要求2或3所述的融合蛋白的多核苷酸。
5.一种包含根据权利要求1所述的锌指DNA结合域蛋白或根据权利要求2或3所述的融合蛋白或根据权利要求4所述多核苷酸的分离的细胞。
6.一种细胞系，其中谷氨酰胺合成酶(GS)是通过权利要求2或3所述的融合蛋白或编码所述融合蛋白的多核苷酸部分或全部失活的。
7.一种使细胞中内源性细胞GS基因失活的方法，所述方法包括：
(a)将编码第一多肽的第一核酸引入细胞，其中所述第一多肽包含：
(i)权利要求1-3中任一项所定义的能与内源性GS基因中的第一靶位点结合的锌指DNA结合域；以及
(ii)切割域；使得所述多肽在所述细胞中表达，从而所述多肽与所述靶位点结合，并切割所述GS基因。
8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括引入编码第二多肽的核酸，其中所述第二多肽包含：
(i)工程化以与所述GS基因中的第二靶位点结合的锌指DNA结合域；以及
(ii)切割域；使得所述第二多肽在所述细胞中表达，从而所述第一和第二多肽与它们各自的靶位点结合，并切割所述GS基因。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述第一和第二多肽是由相同核酸或不同核酸编码的。
10.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，进一步包括使所述细胞中DHFR基因失活。
11.根据权利要求7至9中任一项所述的方法，进一步包括使所述细胞中FUT8基因失活。
12.根据权利要求10所述的方法，进一步包括使所述细胞中FUT8基因失活。
13.一种在宿主细胞中制备目标重组蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)提供包含内源性GS基因的宿主细胞；
(b)通过权利要求7至10中任一项所述的方法使所述宿主细胞的所述内源性GS基因失活；以及
(c)将包含转基因的表达载体引入所述宿主细胞，所述转基因包含编码目标蛋白的序列，从而制备所述重组蛋白。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述目标蛋白包含α1抗胰蛋白酶或单克隆抗体。
15.一种其中GS基因部分或完全失活的细胞系，其中所述细胞系是通过以下步骤制备的：
(a)根据权利要求7至10中任一项所述的方法使细胞中所述GS基因失活；以及
(b)在适于产生其中所述GS基因部分或完全失活的细胞系的条件下培养所述细胞。
16.根据权利要求15所述的细胞系，其中所述细胞是选自由COS细胞、CHO细胞、VERO细胞、MDCK细胞、WI38细胞、V79细胞、B14AF28-G3细胞、BHK细胞、HaK细胞、NS0细胞、SP2／0-Ag14细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、和perC6细胞组成的组的哺乳动物细胞。
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