KR20070060115A - 단백질 생산을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

Abstract

조작된 징크핑거 단백질을 사용하는 증진된 단백질 생산 및 과발현을 위한 방법 및 조성물이 본원에 개시된다.

단백질, 징크핑거, 도메인, 전사인자, 전사, 조절, 조작

Description

단백질 생산을 위한 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR PROTEIN PRODUCTION}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 미국 가 특허출원 제60/610,853호(2004년 9월 16일 제출) 및 제60 /661,841(2005년 3월 15일 제출)의 이익을 주장하며, 이들 명세서는 그 전문이 참고자료로서 본원에 포함된다.

기술분야

본 발명은 전사 조절, 특히 단백질 발현 및 초과생산, 예를 들어 치료 단백질의 대규모 생산의 분야에 속한다.

제어된 전사 조절은 연구, 진단학 및 치료학의 분야에서 유용하다. 예를 들어, 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 전사 조절은 치료제로서, 스크리닝, 선도물질 최적화 및 표적 유효화를 위해 사용되는 재조합 단백질의 대량 생산을 용이하게 할 수 있다.

전형적인 발현 시스템은 해당 유전자 산물을 암호화하는 cDNA에 작동가능하게 연결된 이종성 프로모터를 함유하는 발현 벡터를 포함하는 숙주 셀라인을 특징으로 한다. 한 그러한 단백질 발현(및 과발현) 시스템은 SRα 프로모터를 사용하 는데, 이것은 SV40 조기 프로모터와 R 세그먼트 간의 융합체로 이루어지며, U5 서열의 부분이 사람 T-세포 백혈병 바이러스 1형의 긴 말단 반복부를 형성하고 있다. Takebe 등 (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472. 다른 과발현 시스템은 사람 시토메갈로바이러스(CMV) 즉각 조기 프로모터를 이용한다. 미국특허 제5,168,062호 및 제5,385,839호. 이들 프로모터는 둘 다 내인성 자연발생 전사인자에 의해 조절되는데, 이들의 유용성 또는 활성이 전사의 양을 제한할 수 있고, 그에 따라 이들 시스템에서 생산되는 단백질의 양을 제한할 수 있다. 더욱이, 이들 프로모터를 조절하는 자연발생 전사인자의 과발현은 이들 인자에 의해 정상적으로 조절되는 유전자의 이상 발현을 가져올 수 있으며, 이것은 원하는 유전자 산물의 발현에 잠재적인 유해한 효과를 가진다.

단백질 생산을 위한 추가의 방법은 프로모터나 다른 조절 서열이, 발현이 조절되는 유전자에 인접한 염색체 내에 통합되는 것을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제5,272,071호; 제5,641,670호; 제5,733,761호; 제5,968,502호 및 제6,361,972호를 참조한다. 이들도 역시 내인성 전사인자의 작용에 의존하며, 따라서 SRα 및 CMV 시스템에 대해 상기 논의된 잠재적인 제한을 받게 된다. 더욱이, 이들은 또한 외인성 폴리뉴클레오티드의 정확하게 표적화된 염색체 통합을 달성하는데 어려움이 있다.

단백질의 수준을 SRα 및 CMV 프로모터를 이용하여 얻을 수 있는 것보다 높은 수준의 단백질을 획득하고, 외인성 폴리뉴클레오티드 서열의 무작위 통합에 의존하지 않는 발현 시스템이 바람직할 것이다. 더욱이, 외인성 전사인자를 이용하 는 발현 시스템은 맞춤제작 전사인자의 설계를 허용하고, 보다 큰 융통성을 제공하며, 해당 유전자 산물의 더 높은 수준의 발현을 얻을 수 있는 가능성을 제공한다.

발명의 개요

한 양태에서, 세포에서 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는 방법이 제공되며, 이 방법은 세포에서 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO:1을 포함하는 표적 부위에 결합하는 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 복수의 표적 부위가 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다.

다른 양태에서, 세포에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는 방법이 설명되며, 이 방법은 세포에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 SEQ ID NO:1을 포함하는 표적 부위에 결합하는 단백질을 발현하는 단계를 포함한다. 복수의 표적 부위가 제 1 뉴클레오티드 서열, 제 2 뉴클레오티드 서열, 또는 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두에 작동가능하게 연결될 수 있다.

본원에 설명된 이들 방법 중 어느 것에서, 단백질은, 예를 들어 SEQ ID NO: 25 또는 그의 동등물(예를 들어, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8)을 포함할 수 있다. 따라서, 세포에서 SEQ ID NO:25 또는 동등물을 발현함으로써 세포에서 제 1 (및/또는 제 2) 뉴클레오티드 서열(들)의 전사를 조절하는 방법이 본원에 설명된다. 어떤 구체예에서, 단백질은 또한 전사 활성화 도메인(예를 들어, VP16)을 포함한다.

본원에 설명된 방법 중 어느 것에서, 뉴클레오티드 서열은 번역됨으로써 하 나 이상의 단백질(들)을 획득하는 mRNA를 암호화할 수 있다. 또한, 본원에 설명된 방법 중 어느 것에서, 뉴클레오티드 서열(들)은 cDNA 서열, 예를 들어 항체 폴리펩티드(예를 들어, 항체 중쇄 또는 경쇄)를 암호화하는 하나 이상의 cDNA 서열을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 단백질로 번역되지 않는 RNA 분자, 예를 들어 siRNA, 마이크로 RNA, rRNA, snRNA 또는 scRNA를 암호화할 수 있다.

다른 양태에서, 세포에서 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는 방법이 설명되며, 이 방법은 세포에서 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 동등물을 포함하는 단백질을 발현하는 단계를 포함하며, 여기서 단백질은 표적 부위에 결합하고, 표적 부위는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 어떤 구체예에서, 표적 부위는 SEQ ID NO:1을 포함한다. 하나 이상의 표적 부위가 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열을 포함한다. 단백질은 또한 전사 활성화 도메인, 예를 들어 VP16 도메인을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 세포에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는 방법이 설명되며, 이 방법은 세포에서 SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8 또는 동등물을 포함하는 단백질을 발현하는 단계를 포함하고, 여기서 단백질은 표적 부위에 결합하며, 표적 부위는 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두에 작동가능하게 연결된다. 어떤 구체예에서, 표적 부위는 SEQ ID NO:1을 포함한다. 하나 이상의 표적 부위가 제 1 및/또는 제 2 뉴클레오티 드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 어떤 구체예에서는, 제 1 및/또는 제 2 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열, 예를 들어 항체 폴리펩티드(예를 들어, 항체 경쇄 및/또는 항체 중쇄)를 암호화하는 cDNA 서열을 포함한다. 단백질은 또한 전사 활성화 도메인, 예를 들어 VP16 도메인을 포함할 수 있다.

또 다른 양태에서, SEQ ID NO:25를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 어떤 구체예에서, 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:7 또는 이들의 동등물을 포함한다.

더 이상의 양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드 중 어느 것을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

또 다른 양태에서, 본원에 개시된 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드 중 어느 것을 포함하는 세포가 제공된다.

다른 양태에서, SEQ ID NO:1을 포함하는 벡터; 이들 벡터 중 어느 것을 포함하는 세포; 뿐만 아니라 세포 게놈에 통합된 SEQ ID NO:1의 하나 이상의 카피를 포함하는 세포가 제공된다.

이들 및 다른 구체예들이 본 명세서를 읽음으로써 당업자에게 쉽게 명백해질 것이다.

도 1은 실시예 1에 설명된 대로 합성된 하이브리드 SV40-R-U5 프로모터(SRα 프로모터)의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO:9)이다. 실시예 2에 설명된 여러 ZFP들에 대한 표적 부위에 밑줄이 쳐져 있다.

도 2는 2392/00 단백질(SEQ ID NO:10)의 아미노산 서열이다. 단백질 내 도메인은 다음과 같다. 아미노산 3-9: 핵 국지화 서열; 아미노산 15-109: 징크핑거 도메인; 아미노산 119-185: VP16 전사 활성화 도메인; 아미노산 196-203: FLAG 에피토프 택.

도 3은 2392/00 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO:11)의 서열이다. 단백질 내 여러 도메인을 암호화하는 서열 부분은 다음과 같다. 뉴클레오티드 7-27: 핵 국지화 서열; 뉴클레오티드 43-327: 징크핑거 도메인; 뉴클레오티드 355-555: VP16 전사 활성화 도메인; 뉴클레오티드 586-609: FLAG 에피토프 택.

도 4는 2392/10 단백질(SEQ ID NO:12)의 아미노산 서열이다. 단백질 내 도메인은 다음과 같다. 아미노산 3-9: 핵 국지화 서열; 아미노산 15-109: 징크핑거 도메인; 아미노산 119-185: VP16 전사 활성화 도메인; 아미노산 196-203: FLAG 에피토프 택.

도 5는 2392/10 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드(SEQ ID NO:13)의 서열이다. 단백질 내 여러 도메인을 암호화하는 서열 부분은 다음과 같다. 뉴클레오티드 7-27: 핵 국지화 서열; 뉴클레오티드 43-327: 징크핑거 도메인; 뉴클레오티드 355-555: VP16 전사 활성화 도메인; 뉴클레오티드 586-609: FLAG 에피토프 택.

도 6은 표적 서열 GCTGTGGAA(SEQ ID NO:1)을 인식하기 위한 2-하이브리드 선택 시스템으로부터 얻어진 여러 3-핑거 징크핑거 도메인의 아미노산 서열이다. 상세한 사항은 실시예 2를 참조한다.

도 7은 SRα 프로모터 및 카파 사슬 cDNA를 포함하는 통합 전사 유닛을 함유 하는 세포에서 면역글로불린 카파 사슬 mRNA의 수준을 나타낸다. 세포는 VP16 활성화 도메인(NVF) 또는 VP16 활성화 도메인에 융합된 2393/00 ZFP(2392-VP16)를 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙트되었다. 가로좌표의 숫자는 트랜스펙트된 DNA의 나노그램을 말한다. 상세한 사항은 실시예 3을 참조한다.

도 8은 VP16 활성화 도메인(NVF)을 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙트된 세포와 비교하여, 2392/00 ZFP-VP16 융합 단백질(2392)를 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙트된 두 셀라인(A 및 B)에서 분비된 항체의 수준을 나타낸다. GFP: 녹색-형광 단백질을 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙트된 세포; Mock: 모의-트랜스펙트된 세포; ntf: 비-트랜스펙트된 세포. 상세한 사항은 실시예 3을 참조한다.

도 9는 SRα 프로모터의 전사 제어하에서 증폭된 감마 및 카파 사슬 cDNA를 함유하는 세포에서 면역글로불린 감마 중쇄 및 면역글로불린 카파 경쇄 mRNA의 수준을 나타낸다(도면에서 "고 생산자 라인"). 2392/00-VP16 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙트된 세포로부터의 결과는 가로좌표에서 "ZFP"로 나타내고, 비트랜스펙트된 세포는 "NT"로 나타낸다. mRNA 수준은 GAPDH의 수준에 맞춰 정규화되었다. 상세한 사항은 실시예 3을 참조한다.

도 10은 2392/00-VP16 융합 단백질을 암호화하는 서열로 안정하게 트랜스펙트된 세포로부터 분비된 면역글로불린 G의 수준을 나타낸다(도면에서 "ZFP"로 표시함). 트랜스펙트되지 않은 세포로부터 분비된 IgG 수준("대조군"으로 표시)을 같이 나타낸다.

도 11은 중쇄-암호화 전사 유닛과 경쇄-암호화 전사 유닛을 둘 다 함유하는 두 상이한 플라스미드로 트랜스펙트된 세포에서 상대적 IgG 수준을 나타낸다. 플라스미드 중 하나에서 각 전사 유닛은 SRα 프로모터의 전사 제어하에 있다(도면에서 SRa로 표시함). 나머지 한 플라스미드에서 각 전사 유닛은 SEQ ID NO:1의 8개 추가 카피가 덧붙은 SRα 프로모터의 전사 제어하에 있다(도면에서 SRa로 표시함). 2392/10-7은 2392/10-VP16 융합 단백질을 암호화하는 핵산으로 안정하게 트랜스펙트된 CHO 세포의 클론 분리주를 말한다. DG44는 트랜스펙트되지 않은 모 CHO 셀라인을 말한다.

도 12는 ZFP-VP16 융합 단백질을 암호화하는 서열을 함유하는 2392/10-7 세포에서 녹색-형광 단백질 mRNA의 수준(GAPDH mRNA에 맞춰 정규화함)을 나타낸다. 세포는 녹색-형광 단백질(GFP)을 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 여러 변형된 CMV 프로모터를 함유하는 플라스미드로 트랜스펙트되었다. 삽입된 표적 부위의 배향과 함께, 각 구성물에서 CMV 프로모터에 인접하여 삽입된 표적 부위 SEQ ID NO:1의 카피 수를 그래프의 아래에 나타낸다. 각 쌍의 오른쪽에 있는 막대는 ZFP-함유 셀라인에서의 GFP mRNA 수준을 나타내고, 왼쪽에 있는 막대는 ZFP를 발현하지 않는 모 셀라인에서의 GFP mRNA 수준을 나타낸다.

도 13은 상이한 Epo 발현 구성물로 트랜스펙트된 세포로부터 분비된 에리트로포이에틴(Epo)의 수준을 나타낸다. SRαZ6은 SEQ ID NO:1의 7개 카피를 함유하는 SRα 프로모터에 의해 Epo 발현이 제어되는 구성물을 말한다. CMV는 CMV 프로모터에 의해 Epo 발현이 제어되는 구성물을 말한다. CMVz10은 SEQ ID NO:1의 10개 카피를 함유하는 CMV 프로모터에 의해 Epo 발현이 제어되는 구성물을 말한다. 각 쌍의 오른쪽에 있는 막대는 ZFP-함유 셀라인 2392/10-7로부터 분비된 Epo의 수준을 나타내고, 왼쪽에 있는 막대는 ZFP를 발현하지 않는 모 셀라인으로부터 분비된 Epo의 수준을 말한다.

일반적 설명

본 방법의 실시와 본원에 개시된 조성물의 제조 및 사용에는, 달리 지시되지 않는다면, 분자생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 전산화학, 세포 배양, 재조합 DNA, 및 본 분야의 기술범위 내에 속하는 관련 분야들의 종래 기술을 사용한다. 이들 기술은 문헌에 충분히 설명되며, 예를 들어 Sambrook 등, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 및 제3판, 2001; Ausubel 등, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 및 정기 개정판; METHODS IN ENZYMOLOGY 시리즈, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, 제3판, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, 제304권 "Chromatin" (P. M. Wassarman 및 A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; 및 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, 제119권 "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999를 참조한다.

정의

용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드" 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호 교환하여 사용되며, 선형 또는 환상의 입체구조이고, 단일- 또는 이중-가닥 형태의 디옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 말한다. 본 명세서의 목적에 있어서, 이들 용어는 중합체의 길이에 관하여 제한을 두지 않는다. 이들 용어는 자연발생 뉴클레오티드의 공지된 유사체들뿐만 아니라, 염기, 당 및/또는 인산염(예를 들어, 포스포로티오에이트 백본) 부분에서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍 특이성을 가지는데, 즉 A의 유사체는 T와 염기-쌍일 것이다.

용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호 교환하여 사용되며, 아미노산 잔기들의 중합체를 말한다. 또한, 이들 용어는 하나 이상의 아미노산이 해당하는 자연발생 아미노산의 화학적 유사체이거나 변형된 유도체인 아미노산 중합체에도 적용된다.

핵산 및 아미노산 서열 동일성을 측정하는 기술은 본 분야에 공지되어 있다. 전형적으로, 그러한 기술은 유전자 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 측정하고 및/또는 유전자 또는 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 측정하고, 이들 서열을 제 2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열 역시 이런 방식으로 측정되고 비교될 수 있다. 일반적으로, 동일성은 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 각 서열의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 상응성을 말한다. 2개 이상의 서열(폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)이 그들의 동일성 퍼센트를 측정함으로써 비교될 수 있다. 두 서열의 동일성 퍼센트는 핵산 서열이든 아미노산 서열이든 두 정렬된 서열들 사이에서 정확히 일치하는 수로서, 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 값이다. 핵산 서열의 근사 정렬이 Smith & Waterman(Advances in Applied Mathematics 2:482-489(1981))에 의한 국소 상동성 알고리듬에 의해 제공된다. 이 알고리듬은 Dayhoff(Atlas of Protein Sequences and Structure, M. O. Dayhoff ed., 제5차 증보판. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA)에 의해 개발된 점수화 매트릭스를 이용하여 아미노산 서열에 적용되고, Gribskow(Nucl.Acids Res. 14(6):6745-6763(1986))에 의해 정규화될 수 있다. 서열 동일성 퍼센트를 측정하기 위해 이 알고리듬을 행하는 전형적인 방식이 Genetics Computer Group(위스콘신 메디슨)에 의해 "BestFit" 실용서에 제공된다. 이 방법의 디폴트 파라미터는 위스콘신 서열분석 패키지 프로그램 매뉴얼, 버전 8(1995)(Genetics Computer Group(위스콘신 메디슨)로부터 입수가능함)에 설명된다. 본 명세서에 있어서 동일성 퍼센트를 확립하는 바람직한 방법은 John F. Collins 및 Shane S. Sturrok에 의해 개발되어 IntelliGenetics, Inc.(캘리포니아 마운틴뷰)에 의해 보급된 에든버러 대학에 판권이 있는 MPSRCH 프로그램 패키지를 사용하는 것이다. 이 한 벌의 패키지로부터 Smith-Waterman 알고리듬이 사용될 수 있는데, 이 경우 디폴트 파라미터는 점수화 표에 따라 사용된다(예를 들어, 갭 개방 패널티 12, 갭 확장 패널티 1, 갭 6). 데이타로부터 발생된 "Match" 값이 서열 동일성을 반영한다. 서열 간 동일성 또는 유사성 퍼센트를 계산하는 다른 적합한 프로그램이 일반적으로 본 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어 다른 정렬 프로그램으로는 디폴트 파라미터와 사용되는 BLAST가 있다. 예를 들어, BLASTN 및 BLASTP가 다음의 디폴트 파라미터를 이용하여 사용될 수 있다: 유전코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프 = 60; 예상치 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50 서열; 정렬 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-잉여, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + 스위스 단백질 + Spupdate + PIR. 이들 프로그램에 대한 상세한 사항은 인터넷 주소: http://www.ncbi.nlm. gov/cgibin/BLAST에서 찾을 수 있다. 본원에 설명된 서열들과 관련하여, 바람직한 정도의 서열 동일성 범위는 약 20% 내지 100%이며, 이들 사이의 어떤 정수 값이다. 전형적으로, 서열 간 동일성 퍼센트는 적어도 70-75%, 바람직하게는 80-82%, 더 바람직하게는 85-90%, 더욱더 바람직하게는 92%, 더욱더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성이다.

또는 달리, 상동성 영역 사이에 안정한 듀플렉스의 형성을 허용하는 조건 하에 폴리뉴클레오티드들를 혼성화하고, 그 다음 단일-가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 효소절단하고, 효소절단된 단편의 크기를 측정함으로써 폴리뉴클레오티드 간 서열 유사성 정도가 측정될 수 있다. 상기 방법을 사용하여 측정했을 때, 분자의 정해진 길이에 걸쳐 서열들이 적어도 약 70%-75%, 바람직하게는 80%-82%, 더 바람직하게는 85%-90%, 더욱더 바람직하게는 92%, 더욱더 바람직하게는 95%, 가장 바람직하게는 98% 서열 동일성을 나타낼 때, 두 핵산, 또는 두 폴리펩티드 서열은 실질적으로 서로 상동성이다. 본원에서 사용된 실질적으로 상동성은 또한 특정된 DNA 또는 폴리펩티드 서열과 완전한 동일성을 나타내는 서열들을 말한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열은, 특정 시스템에 맞춰 규정되는, 예를 들어 긴축 조건 하에서 서던 혼성화 실험으로 확인될 수 있다. 적합한 혼성화 조건의 규정은 본 분야의 기술범위 내에 속한다. 예를 들어, Sambrook 등, 상동; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 편저 B.D. Hames 및 S.J. Higgins(1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press).

두 핵산 단편의 선택적 혼성화는 다음과 같이 측정될 수 있다. 두 핵산 분자 간의 서열 동일성 정도는 그러한 분자들 간 혼성화 효능 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 완전히 동일한 서열과 표적 분자의 혼성화를 적어도 부분적으로 저해할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화의 저해가 본 분야에 잘 공지된 혼성화 분석을 이용하여 평가될 수 있다(예를 들어, 서던(DNA) 블롯, 노던(RNA) 블롯, 용액 혼성화 등, 예를 들어 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y. 참조). 이러한 분석은 선택성 정도를 변화시킴으로써, 예를 들어 저 긴축도에서 고 긴축도까지 변화하는 조건을 사용하여 수행될 수 있다. 저 긴축도 조건이 사용되는 경우, 서열 동일성이 부분 결여된 제 2 프로브(예를 들어, 표적 분자와의 서열 동일성이 약 30% 미만인 프로브)를 사용하여 비-특이적 결합의 부재가 평가될 수 있는데, 이때 비-특이적 결합이 없다면, 제 2 프로브는 표적과 혼성화하지 않을 것이다.

혼성화-기초 검출 시스템을 이용할 때, 기준 핵산 서열에 상보하는 핵산 프로브가 선택되고, 그 다음 적합한 조건을 선택하여 프로브와 기준 서열을 서로 혼성화하거나 결합시켜 듀플렉스 분자를 형성한다. 중간 긴축 혼성화 조건 하에 기준 서열과 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자가, 전형적으로, 선택된 핵산 프로브 서열과 적어도 약 70% 서열 동일성을 갖는 적어도 약 10-14 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용하는 조건 하에서 혼성화된다. 긴축 혼성화 조건은 전형적으로 선택된 핵산 프로브 서열과 약 90-95% 이상의 서열 동일성을 갖는 적어도 약 10-14 뉴클레오티드 길이의 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브와 기준 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 본 분야에 공지된 바에 따라 결정될 수 있다(예를 들어, Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, 편저 B. D. Hames 및 S. J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press 참조).

혼성화 조건은 당업자들에게 잘 공지되어 있다. 혼성화 긴축도는 그 혼성화 조건이 불일치 뉴클레오티드를 함유하는 하이브리드의 형성을 배제하는 정도를 말하며, 긴축도가 높아질수록 불일치 하이브리드에 대한 관용은 낮아진다. 혼성화의 긴축도에 영향을 미치는 요인들이 당업자에게 잘 공지되어 있는데, 제한은 없지만, 온도, pH, 이온강도, 혼성화 반응 지속시간 및 포름아미드 및 디메틸술폭시드와 같은 유기용매의 농도를 포함한다. 당업자에게 알려진 대로, 혼성화 긴축도는 고온, 낮은 이온강도 그리고 낮은 용매 농도일수록 증가된다.

혼성화 긴축도 조건과 관련하여, 특정한 긴축도를 확립하기 위해 사용될 수 있는 많은 동등한 조건이 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 서열의 길이 및 성질, 여러 서열의 염기 조성, 염 및 다른 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액에 차단제의 존재 또는 부재(예를 들어, 덱스트란 황산염, 및 폴리에틸렌 글리콜), 혼성화 반응 온도 및 시간 변수를 변화시키는 것에 의해서뿐만 아니라, 세척 조건을 변화시키는 것에 의해서 달성된다. 특정 세트의 혼성화 조건의 선택은 본 분야의 표준 방법에 따라 선택된다(예를 들어, Sambrook, 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 제2판, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y. 참조).

"결합"은 거대분자들 간의(예를 들어, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적, 비-공유 상호작용을 말한다. 상호작용이 전체적으로 서열-특이적이라면, 결합 상호작용하는 모든 구성요소가 서열-특이적(예를 들어, DNA 백본의 인산염 잔기와의 접촉)일 필요는 없다. 이러한 상호작용은 일반적으로 10^-6/M 이하의 해리상수(K_d)를 특징으로 한다. "친화성"은 결합 강도를 말하며, 결합 강도가 증가할수록 K_d는 저하된다.

"결합 단백질"은 다른 분자와 비-공유 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어 DNA 분자(DNA-결합 단백질), RNA 분자(RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 분자(단백질-결합 단백질)와 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 그것은 자체적으로 결합할 수 있고(동종2량체, 동종3량체 등을 형성한다), 및/또는 하나 이상의 상이한 단백질 또는 단백질들의 분자들과 결합할 수 있다. 결합 단백질은 한 종류 이상의 결합 활성을 가질 수 있다. 예를 들어, 징크핑거 단백질은 DNA-결합, RNA-결합 및 단백질-결합 활성을 가진다.

"징크핑거 DNA 결합 단백질"(또는 징크핑거 결합 도메인)은 하나 이상의 징크핑거를 통해 서열-특이적 방식으로 DNA와 결합하는 큰 단백질 내에 있는 단백질, 또는 도메인이며, 징크핑거란 아연 이온의 배위를 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내 아미노산 서열 영역이다. 징크핑거 DNA 결합 단백질이란 용어는 주로 징크핑거 단백질 또는 ZFP로서 줄여 씌여진다.

징크핑거 결합 도메인은 정해진 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 "조작"하는 것이 가능하다. 징크핑거 단백질을 조작하는 방법의 비제한적인 예는 설계 및 선택이다.

설계된 징크핑거 단백질은 그 설계/조성이 주로 합리적 기준에 의해 도출된 자연상태에서는 발생하지 않는 단백질이다. 설계의 합리적 기준은 치환규칙 및 현존하는 ZFP 설계 및 결합 데이터의 정보를 유형화한 데이터베이트의 정보를 처리하는 전산화 알고리듬의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제6,140,081호; 제 6,453,242호; 및 제6,534,261호; 그리고 WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496 참조.

"선택된" 징크핑거 단백질은 자연상태에서 발견되지 않는 단백질로서, 주로 파지 디스플레이, 상호작용 트랩 또는 하이브리드 선택과 같은 실험적 과정으로부터 생산된다. 예를 들어, US 5,789,538; US 5,925,523; US 6,007,988; US 6,013, 453; US 6,200,759; WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/ 27878; WO 01/60970 WO 01/88197 및 WO 02/099084 참조.

따라서, "조작된 징크핑거 단백질"이란 서열-특이적 방식으로 정해진 뉴클레오티드 서열과 결합하도록 구성된 하나 이상의 징크핑거를 함유하는 단백질을 말한다. 일반적으로, 조작된 징크핑거 단백질은 비-자연발생 단백질이며, 및/또는 비-자연발생 배열 및/또는 조합 내에 자연발생 징크핑거를 함유한다. 징크핑거의 결합 특이성을 조작하고, 조작된 징크핑거 단백질을 구성하는 방법은 제한은 없지만 합리적 디자인, 무작위/선택 기술, 폴리리보솜 선택, 시스-디스플레이, 1- 및 2-하이브리드 시스템, 및 조작된 징크핑거와 자연발생 징크핑거의 무작위 라이브러리로부터의 선택을 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제5,789,538호; 제6,007,988호; 제6,013,453호; 제6,140,466호; 제6,242,568호; 제6,410,248호; 제6,453,242호; 제6, 479,626호; 제6,503,717호; 제6,534,261호; 제6,706,470호; 제6,733,970호; 및 제6,746,838호; 미국특허출원 공개 2003/0044957; 2003/0068675; 2003/0104526; 2003 /0108880; 2003/0166141 및 2004/0091991; PCT 공보 WO 98/53057; WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 01/53480; WO 01/88197; 및 WO 02/77227를 참조하며, 이들은 그 전문이 참고자료로서 본원에 포함된다. 용어 "조작된 징크핑거 단백질"은 클로닝된 자연발생 징크핑거 단백질을 말하지는 않는다.

"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조이다. 세포 염색질은 핵산, 주로 DNA, 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질을 포함하는 단백질을 포함한다. 대부분의 진핵생물 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하며, 뉴클레오솜의 중심부는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4 중 2개를 포함하는 8량체와 연합된 약 150 염기쌍의 DNA를 포함하고, 링커 DNA(유기체에 따라 가변적 길이를 가진다)가 뉴클레오솜 중심부들 사이에 뻗어 있다. 히스톤 H1 분자는 일반적으로 링커 DNA와 연합된다. 본 명세서의 목적에 있어서, 용어 "염색질"은 원핵생물과 진핵생물 모두에서 모든 종류의 세포 핵단백질을 포함하는 의미이다. 세포 세포질은 염색체 세포질과 에피솜 세포질을 모두 포함한다.

"염색체"는 세포 게놈의 전부 또는 일부를 포함하는 염색질 복합체이다. 세포 게놈은 주로 그것의 핵형에 의해 특징지어지는데, 핵형이란 세포 게놈을 포함하는 모든 염색체의 컬렉션이다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.

"에피솜"은 복제하는 핵산, 핵단백질 복합체 또는 세포 염색체 핵형의 부분이 아닌 핵산을 포함하는 다른 구조이다. 에피솜의 예는 플라스미드 및 어떤 바이러스 게놈을 포함한다.

"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합을 위한 충분한 조건이 존재할 때 결합 분자가 결합하는 핵산 부분을 정의하는 핵산 서열이다. 예를 들어 서열 5'-GAATTC -3'는 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제의 표적 부위이다.

"접근가능한 영역"은 표적 부위를 인식하는 외인성 분자에 의해 핵산에 존재하는 표적 부위가 결합될 수 있는 세포 염색질의 부위이다. 어떤 특정 이론과 관계되기를 바라지 않지만, 접근가능한 영역은 뉴클레오솜 구조에 일괄적으로 포함되지 않는 것이라고 여겨진다. 접근가능한 영역의 별도의 구조는 주로 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들어 뉴클레아제에 대한 그것의 감수성에 의해 검출될 수 있다.

"외인성" 분자는 세포에 정상적으로 존재하지 않지만, 하나 이상의 유전적, 생화학적 또는 그 외 다른 방법에 의해 세포로 도입될 수 있는 분자이다. "세포에 정상 존재한다"는 것은 세포의 특정 발생 단계 및 환경 조건과 관련하여 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배 발생 동안에만 존재하는 분자는 성인의 근육 세포와 관련해서는 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 비-열-충격 세포와 관련해서는 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어 기능장애 내인성 분자의 기능 양태 또는 정상 기능 내인성 분자의 기능장애 양태를 포함할 수 있다.

외인성 분자는 다른 것들 중에서도 특히, 조합화학법에 의해 생성되는 것들 같은 작은 분자, 또는 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지질단백질, 다당류, 상기 분자들의 어떤 변형 유도체, 또는 상기 분자들 중 하나 이상을 포함하는 어떤 복합체와 같은 거대분자일 수 있다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함하며, 이들은 단일- 또는 이중-가닥일 수 있고, 선형, 분기형 또는 환상일 수 있고, 어떤 길이를 가질 수 있다. 핵산은 듀플렉스를 형성할 수 있는 것들뿐만 아니라, 트리플렉스를 형성하는 핵산도 포함한다. 예를 들어, 미국특허 제5,176,996호 및 제5,422,251호 참조. 단백질은, 제한은 없지만, DNA-결합 단백질, 전사인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA-결합 단백질, 중합효소, 메틸라아제, 디메틸라아제, 아세틸라아제, 디아세틸라아제, 키나아제, 포스파타아제, 삽입효소, 재조합효소, 리가아제, 토포이소머라아제, 자이라아제 및 헬리카아제를 포함한다.

외인성 분자는 내인성 분자와 같은 종류의 분자일 수 있는데, 예를 들어 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 세포로 도입된 감염성 바이러스 게놈, 플라스미드 또는 에피솜, 또는 세포에 정상적으로 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 세포에 외인성 분자를 도입하는 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 제한은 없지만, 지질-매개 전달(즉, 중성 및 양이온성 지질을 포함하는 리포솜), 전기천공, 직접주입, 세포융합, 입자충격, 인산칼슘 공-침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함한다.

반대로, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에 특정 발생 단계에서 특정 세포에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아 게놈, 엽록체나 그 외의 다른 세포기관, 또는 자연발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가의 내인성 분자는 단백질, 예를 들어 전사인자 및 효소를 포함할 수 있다.

"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가 연결된 분자이며, 바람직하게는 공유 연결된다. 서브유닛 분자는 동일한 화학형의 분자일 수도 있고, 상이한 화학형의 분자일 수도 있다. 제 1 유형의 융합 분자의 예는, 제한은 없지만, 융합 단백질(예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 전사 조절 도메인 간 융합) 및 융합 핵산(예를 들어, 위에 설명한 융합 단백질을 암호화하는 핵산)을 포함한다. 제 2 유형의 융합 분자의 예는, 제한은 없지만, 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩티드 간 융합 및 마이너 그로브 바인더와 핵산 간 융합을 포함한다.

세포에서 단백질(예를 들어, 융합 단백질)의 발현은 단백질이 세포로 송달되거나, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 세포로 송달되어 일어나며, 폴리뉴클레오티드가 전사되고, 전사체가 번역되어 단백질을 생산한다. 또한, 후속 과정으로 세포에서 번역되는 RNA 분자의 세포 송달을 사용하여 세포에서 단백질을 발현할 수 있다. 또한, 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 리게이션이 세포에서의 단백질 발현 과정에 포함될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포로 송달하는 방법은 본 분야에 공지되어 있고, 전형적인 방법이 본 명세서에서 제시된다.

본 명세서의 목적에 있어서, "유전자"는 유전자 산물(아래 참조)을 암호화하는 DNA 영역, 뿐만 아니라 유전자 산물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함하며, 이러한 조절 서열이 코딩 및/또는 전사된 서열에 인접한지의 여부는 관계없다. 따라서, 반드시 제한되는 것은 아니지만, 유전자는 프로모터 서열, 터미네이터, 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 진입 부위와 같은 전사 조절 서열, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 위치 제어 영역을 포함한다.

"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보를 유전자 산물로 변환시키는 것을 말한다. 유전자 산물은 유전자의 직접적 전사 산물(예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스 RNA, dsRNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 어떤 다른 종류의 RNA), siRNA 같은 가공된 전사체, 또는 mRNA의 번역에 의해 생성된 단백질일 수 있다. 또한, 유전자 산물은 캡핑, 폴리아데닐화, 메틸화 및 에디팅과 같은 과정에 의하여 변형된 RNA와, 예를 들어 메틸화, 아세틸화, 포스포릴화, 유비퀴틴화, ADP-리보오스화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의하여 변형된 단백질을 포함한다.

유전자 발현의 "조정"은 유전자 활성의 변화를 말한다. 발현 조정은, 제한은 없지만, 유전자 활성화 및 유전자 억제를 포함한다.

"진핵생물" 세포는, 제한은 없지만, 진균 세포(효모 같은), 식물 세포, 동물 세포, 포유동물 세포 및 사람 세포를 포함한다.

"해당 영역"은 세포 염색질의 어떤 영역이며, 예를 들어 유전자 또는 유전자자 내의 또는 유전자에 인접한 비-코딩 서열로서, 여기에서 외인성 분자가 결합하는 것이 바람직하다. 결합은, 예를 들어 전사 조절을 목적으로 할 수 있다. 해당 영역은 염색체, 에피솜, 세포기관 게놈(예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체) 또는 감염성 바이러스 게놈에 존재할 수 있다. 해당 영역은 코딩 영역의 상류나 하류에서 유전자의 코딩 영역 내, 전사된 비-코딩 영역, 예를 들어 리더 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내, 또는 비-전사 영역 내에 있을 수 있다. 해당 영역은 단일 뉴클레오티드 쌍 정도로 작을 수도 있고, 또는 2,000개 이하의 뉴클레오티드 쌍 길이일 수도 있고, 또는 어떤 정수 값의 뉴클레오티드 쌍일 수도 있다.

용어 "작동성 연결" 및 "작동가능하게 연결된"(또는 "실시가능하게 연결된")은 2개 이상의 구성요소(서열 요소 같은)의 근접위치와 관련하여 상호 교환하여 사용되며, 이것은 구성요소들이, 그들이 정상적으로 기능하고, 구성요소 중의 적어도 하나가 나머지 구성요소 중의 적어도 하나에 의해 발휘되는 기능을 매개할 수 있는 가능성을 허용하도록 배열되는 것이다. 예를 들어, 프로모터 같은 전사 조절 서열은 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다는 것은, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 반응하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어할 수 있다는 것이다. 전사 조절 서열은 일반적으로 코딩 서열과 시스 방향으로 작동가능하게 연결되지만, 그것에 직접 인접할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서는 이들이 인접해 있지 않더라도 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 전사 조절 서열이다.

융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동가능하게 연결된"은 각 구성요소가 다른 구성요소와의 연결에 있어서, 그것이 그렇게 연결되지 않았을 경우 그것이 하는 것과 동일한 기능을 수행한다는 사실을 말하는 것일 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 전사 조절 도메인이 융합된 융합 폴리펩티드와 관련하여, 만일 이 융합 폴리펩티드에서, ZFP DNA-결합 도메인 부분은 표적 부위 및/또는 결합 부위와 결합할 수 있고, 조절 도메인은 전사를 조정(예를 들어, 활성화 또는 억제)할 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인과 조절 도메인은 작동성 연결 상태이다.

단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능 동등물" 또는 "기능 단편"은 그 서열이 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만, 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능 단편은 상응하는 천연 분자보다 더 많은, 더 적은 또는 동일한 수의 잔기를 지닐 수 있으며, 및/또는 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능(예를 들어, 코딩 기능, 다른 핵산과 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 본 분야에 잘 공지되어 있다. 마찬가지로, 단백질의 기능을 결정하는 방법도 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능은, 예를 들어 필터-결합, 전기영동 이동도-이동, 또는 면역침전 분석에 의해서 결정될 수 있다. DNA 절단은 겔 전기영동에 의해서 분석될 수 있다. Ausubel 등, 상동 참조. 다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력은, 유전적 및 생화학적 방법으로서, 예를 들어 공-면역침전, 2-하이브리드 분석 또는 상보성에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, Fields 등 (1989) Nature 340:245-246; 미국특허 제5,585,245호 및 PCT WO 98/ 44350 참조.

조작된 징크핑거 단백질 및 표적 서열

전사 조절을 위한 조성물 및 방법이 본원에 개시되며, 이것은 예를 들어 RNA 및/또는 단백질의 생산을 증진하는데 유용하다. 이들은 조작된 징크핑거 단백질과 및 전사 활성화 도메인 같은 기능 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 적합한 기능 도메인이 본 분야에 공지되어 있으며, 제한은 없지만, 전사 활성화 도메인, 예를 들어 VP16, VP64 및 p65를 포함한다. 더욱이, 하나 이상의 동일한 또는 상이한 기능 도메인(예를 들어, 전사 활성화 도메인)이 주어진 융합 단백질에 존재할 수도 있다. 참고자료로서 본원에 포함되는 공동 소유의 미국특허출원 공개 제2002/0160940호를 참조하며, 이것은 전형적인 기능 도메인을 설명하고 있다.

한 구체예에서, 징크핑거 단백질은 표적 서열 GCTGTGGAA(SEQ ID NO:1)을 포함하는 서열에 결합하도록 조작된다. 이 서열은 단백질 생산에 통상 사용되는 프로모터인 SRα 프로모터(Takebe 등, 상동)에 존재하며, SEQ ID NO:1의 하나 이상의 카피가 본 분야에 공지된 어떤 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)에 또는 그것에 인접하여 삽입될 수 있다.

SEQ ID NO:1과 결합하도록 조작된 대표적 3-핑거 징크핑거 단백질인 SBS2392 /00은 다음 아미노산 서열을 가진다:

KKKQHICHIOGCGKVYGQRSNLVRHLRWHTGERPFMCTWSYCGKRFTRSDALSRHKRTHTGEKKFACPECPKRFMQSSDLRRHIKTHQNK (SEQ ID NO:2).

SEQ ID NO:2에서 밑줄친 아미노산 잔기는 징크핑거의 알파-나선 부분의 출발점과 관련하여 잔기 -1에서 +6에 상응하며, 이들 잔기 중 하나 이상이 핵산 결합의 서열 특이성에 참여하기 때문에 "인식 영역"이라고 표시된다. 따라서, 상이한 폴리펩티드 백본 서열에 동일한 세 인식 영역을 포함하는 단백질은 동일한 DNA-결합 특이성을 가질 것이므로, SEQ ID NO:2로서 확인된 단백질의 동등물로서 고려된다.

따라서, 한 구체예에서, 세 인식 영역(상기 SEQ ID NO:2에서 밑줄친 부분)이 어떤 징크핑거 백본(예를 들어, 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호)에 위치될 수 있으며, 생산된 단백질은 전사 조절, 예를 들어 단백질 생산의 증진에 사용될 수 있다. 따라서, 다음 서열을 갖는 조작된 징크핑거 단백질이 개시된 방법에서 사용될 수 있다:

C-X_{2 -4}-C-X₅-QRSNLVR-H-X_{3 -5}-H-X₇-C-X_{2 -4}-C-X₅-RSDALSR-H-X_{3 -5}-H-X₇-C-X_{2 -4}-C-X₅-QSSDLRR-H-X_3-5-H (SEQ ID NO:3).

인식 영역 내에서 잔기 -1, +3 및 +6이 주로 단백질-뉴클레오티드 접촉을 일으킨다. 따라서, 추가의 동등물의 비제한적인 예는 징크핑거를 3개 포함하는 단백질을 포함하며, 여기서 제 1 핑거는 -1에 Q 잔기, +3에 N 잔기, +6에 R 잔기를 함유하고(QXXNXXR, SEQ ID NO:4); 제 2 핑거는 -1에 R 잔기, +3에 A 잔기, +6에 R 잔기를 함유하고(RXXAXXR, SEQ ID NO:5); 제 3 핑거는 -1에 Q 잔기, +3에 D 잔기, +6에 R 잔기를 함유한다(QXXDXXR, SEQ ID NO:6). 추가의 동등물은 표적 서열 GCTGTG GAA(SEQ ID NO:1)을 포함하는 서열과 결합하는 어떤 ZFP를 포함한다.

표적 서열 GCTGTGGAA(SEQ ID NO:1)과 결합하도록 조작된 추가의 대표적 3-핑거 징크핑거 단백질인 SBS2392/10은 다음 아미노산 서열을 가진다:

KKKQHICHIQGCGKVYGQSSNLARHLRWHTGERPFMCTWSYCGKRFTRSDALTRHKRTHTGEKKFACPECPKRFMQSCDLTRHIKTHQNK (SEQ ID NO:7).

SEQ ID NO:7에서 밑줄친 아미노산 잔기는 징크핑거의 알파-나선 부분의 출발점과 관련하여 잔기 -1에서 +6에 상응하며, 이들 잔기 중 하나 이상이 핵산 결합의 서열 특이성에 참여하기 때문에 "인식 영역"이라고 표시된다. 따라서, 상이한 폴리펩티드 백본 서열에 동일한 세 인식 영역을 포함하는 단백질은 동일한 DNA-결합 특이성을 가질 것이므로, SEQ ID NO:2로서 확인된 단백질의 동등물로서 고려된다.

따라서, 한 구체예에서, 세 인식 영역(상기 SEQ ID NO:7에서 밑줄친 부분)이 어떤 징크핑거 백본(예를 들어, 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호)에 위치될 수 있으며, 생산된 단백질은 전사 조절, 예를 들어 단백질 생산의 증진에 사용될 수 있다. 따라서, 다음 서열을 갖는 조작된 징크핑거 단백질이 개시된 방법에서 사용될 수 있다:

C-X_{2 -4}-C-X₅-QSSNLAR-H-X_{3 -5}-H-X₇-C-X_{2 -4}-C-X₅-RSDALTR-H-X_{3 -5}-H-X₇-C-X_{2 -4}-C-X₅-QSCDLTR-H-X_3-5-H (SEQ ID N0:8).

인식 영역 내에서 잔기 -1, +3 및 +6이 주로 단백질-뉴클레오티드 접촉을 일으킨다. 따라서, 추가의 동등물의 비제한적인 예는 징크핑거를 3개 포함하는 단백질을 포함하며, 여기서 제 1 핑거는 -1에 Q 잔기, +3에 N 잔기, +6에 R 잔기를 함유하고(QXXNXXR, SEQ ID NO:4); 제 2 핑거는 -1에 R 잔기, +3에 A 잔기, +6에 R잔기를 함유하고(RXXAXXR, SEQ ID NO:5); 제 3 핑거는 -1에 Q 잔기, +3에 D 잔기, +6에 R 잔기를 함유한다(QXXDXXR, SEQ ID NO:6). 따라서, 예를 들어, SEQ ID NO:25를 포함하는 단백질이 개시된 방법에서 사용되는 동등물로 고려된다:

C-X_{2 -4}-C-X₅-QXXNXXR-H-X_{3 -5}-H-X₇-C-X_{2 -4}-C-X₅-RXXAXXR-H-X_{3 -5}-H-X₇-C-X_{2 -4}-C-X₅-QXXDXXR-H-X_3-5-H (SEQ ID NO:25).

추가의 동등물은 표적 서열 GCTGTGGAA(SEQ ID NO:1)을 포함하는 서열과 결합하는 어떤 ZFP를 포함한다.

징크핑거의 인식 영역의 -1, +3 및 +6 접촉 잔기, 및 표적 부위의 뉴클레오티드에 자리한 아미노산들 간의 상응성이 설명되었다. 예를 들어, 미국특허 제6, 007,988호; 제6,013,453호 및 제6,746,838호; PCT 공보 WO 96/06166; WO 98/53058; WO 98/53059 및 WO 98/53060를 참조한다. 따라서, 제 1 핑거가 -1에 Q, +3에 N, +6에 R, K, S 또는 T를 함유하고; 제 2 핑거가 -1에 R, +3에 A, S 또는 V, +6에 R, K, S 또는 T를 함유하고; 제 3 핑거가 -1에 N, Q, H 또는 T, +3에 S, D, E, L, T, 또는 V, +6에 R, K, S 또는 T를 함유하는 3-핑거 징크핑거 단백질을 동등물로서 고려할 수 있다.

융합 단백질 및 암호화 폴리뉴클레오티드

이미 서술한 대로, 본원에 개시된 조작된 징크핑거 DNA-결합 도메인은 융합 단백질의 부분을 포함할 수 있으며, 여기서 융합 단백질은 또한 하나 이상의 기능 도메인(예를 들어, 전사 조절 도메인), 핵 국지화 서열, 에피토프 택 등을 함유할 수 있다. 예를 들어, 핵 국지화 서열(NLS), 징크핑거 결합 도메인(ZFP), VP16 전사 활성화 도메인(VP16) 및 FLAG 에피토프 택(FLAG)를 포함하는 2392/00으로 표시한 융합 단백질의 아미노산 서열이 도 2에 도시된다(SEQ ID NO:10). 이 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 도 3에 도시된다(SEQ ID NO:11).

추가의 전형적인 단백질(2392/10)은 도 4에 도시된 아미노산 서열을 가진다 (SEQ ID NO:12). 이 2392/10 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 도 5에 도시된다(SEQ ID NO:13).

기능 도메인

어떤 DNA-결합 도메인은 선택적으로, 예를 들어 DNA 가공(예를 들어, DNA 절단) 또는 유전자 발현의 조정을 촉진하는 하나 이상의 "기능 도메인" 또는 조절 도메인"과 연합될 수 있다. 결합 도메인은 하나 이상의 조절 도메인, 또는 둘 이상의 조절 도메인과 공유 또는 비-공유 연합될 수 있으며, 이때 둘 이상의 도메인은 동일한 도메인의 2개 카피이거나, 2개의 상이한 도메인이다. 조절 도메인은 융합 단백질의 부분으로서, 예를 들어 아미노산 링커에 의해, 결합 도메인에 공유 연결될 수 있다. DNA-결합 도메인은 또한 비-공유 2량체화 도메인, 예를 들어 류신 지퍼, STAT 단백질 N 말단 도메인, 또는 FK506 결합 단백질에 의하여 조절 도메인과 연합될 수 있다(예를 들어, O'Shea, Science 254:539 (1991), Barahmand-Pour 등, Curr.Top. Microbiol. Immunol. 211:121-128(1996); Klemm 등, Annu.Rev. Immunol. 16:569-592(1998); Klemm 등, Annu.Rev. Immunol. 16:569-592(1998); Ho 등 Nature 382:822-826(1996); 및 Pomeranz 등, Biochem. 37:965(1998) 참조). 조절 도메인은 결합 도메인의 C- 또는 N-말단을 포함하는 어떤 적합한 위치에서 결합 도메인과 연합될 수 있다.

통상의 조절 도메인은, 예를 들어 전사인자로부터의 이펙터 도메인(예를 들어, 활성화인자, 억제인자, 보조-활성화인자, 보조-억제인자), 사일런서, 핵 호르몬 수용체, 종양유전자(예를 들어, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 과의 구성원 등) 전사인자; DNA 수선 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형인자; DNA 재배열 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형인자; 염색질 관련 단백질 및 이들의 변형인자(예를 들어, 키나아제, 아세틸라아제 및 디아세틸라아제): 및 DNA 변형 효소(예를 들어, 메틸트랜스페라아제, 토포이소머라아제, 헬리카아제, 리가아제, 키나아제, 포스파타아제, 중합효소, 엔도뉴클레아제, 인테그라아제) 및 이들의 관련 인자 및 변형인자를 포함한다.

조절 도메인을 얻을 수 있는 전사인자 폴리펩티드는 조절된 전사 과정 및 기본적 전사 과정에 연루되는 것들을 포함한다. 그러한 폴리펩티드는 전사인자, 이들의 이펙터 도메인, 보조-활성화인자, 사일런서, 핵 호르몬 수용체를 포함한다(예를 들어, 전사에 연루되는 단백질 및 핵산 요소에 대한 고찰은 Goodrich 등, Cell 84:825-30 (1996)를 참조하고, 전사인자에 대해서는 일반적으로 Barnes & Adcock, Clin.Exp. Allergy 제25증보판 2:46-9(1995) 및 Roeder, Methods Enzymol. 273:165 -71(1996)를 참조한다). 전사인자의 데이터베이스는 공지이다(예를 들어, Science 269:630(1995) 및 TRANSFAC). 핵 호르몬 수용체 전사인자는, 예를 들어 Rosen 등, J. Med. Chem. 38:4855-74 (1995)에 설명된다. C/EBP 과의 전사인자는 Wedel 등, Immunobiology 193:171-85(1995)에서 고찰된다. 핵 호르몬 수용체에 의한 전사 조절을 매개하는 보조-활성화인자 및 보조-억제인자는, Meier, Eur. J. Endocrinol. 134(2):158-9(1996); Kaiser 등, Trends Biochem. Sci 21:342-5 (1996); 및 Utley 등, Nature 394:498-502(1998) 등에서 고찰된다. 조혈의 조절에 연루되는 GATA 전사인자는, 예를 들어 Simon, Nat. Genet. 11:9-11(1995); Weiss 등, Exp. Hematol. 23:99-107에 설명된다. TATA 상자 결합 단백질(TBP) 및 관련된 TAF 폴리펩티드(이것은 TAF30, TAF55, TAF80, TAF11O, TAF150, 및 TAF250을 포함한다)는 Goodrich & Tjian, Curr.Opin.Cell Biol. 6:403-9(1994) 및 Hurley, Curr.Opin. Struct. Biol. 6:69-75(1996)에 설명된다. STAT 과의 전사인자는, 예를 들어 Barahmand-Pour 등, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 211:121-8(1996)에서 고찰된다. 질환에 연루되는 전사인자는 Aso 등, J. CHn. Invest. 97:1561-9(1996)에서 고찰된다.

한 구체예에서, 사람 KOX-1 단백질로부터 유래한 KOX 억제 도메인 및/또는 KRAB 억제 도메인이 전사 억제인자로서 사용된다. Thiesen 등, New Biologist 2: 363-374 (1990); Margolin 등, PNAS 91:4509-4513 (1994); Pengue 등, Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall 등, PNAS 91:4514-4518 (1994). 다른 구체예에서는, KRAB 보조-억제인자인 KAP-1이 KRAB 또는 KOX와 같이 사용된다. Friedman 등, Genes Dev. 10:2067-2078 (1996). 또는 달리, KAP-1이 단독으로 기능 도메인으로 사용될 수도 있다. 전사 억제인자로서 작용하는 다른 바람직한 전사인자 및 전사인자 도메인은 MAD(예를 들어, Sommer 등, J.Biol.Chem. 273:6632-6642(1998); Gupta 등, Oncogene 16:1149-1159 (1998); Queva 등, Oncogene 16:967-977 (1998); Larsson 등, Oncogene 15:737-748(1997); Laherty 등, Cell 89:349-356(1997); 및 Cultraro 등, Mol. Cell Biol. 17:2353-2359(19977)); FKHR(랍도사르코마 유전자의 포크헤드; Ginsberg 등, Cancer Res. 15:3542-3546(1998); Epstein 등, Mol. Cell. Biol. 18:4118-4130(1998)); EGR-I(조기성장반응 유전자 산물-1; Yan 등, PNAS 95: 8298-8303(1998); 및 Liu 등, Cancer Gene Ther. 5:3-28(1998)); ets2 억제인자 인자 억제인자 도메인(ERD; Sgouras 등, EMBO J. 14:4781-4793((19095)); 그리고 MAD smSIN3 상호작용 도메인(SID; Ayer 등, Mol. Cell Biol. 16:5772-5781(1996))를 포함한다.

한 구체예에서, HSV VP16 활성화 도메인이 전사 활성화인자로 사용된다(예를 들어, Hagmann 등, J. Virol. 71:5952-5962(1997) 참조). 활성화 도메인이 얻어질 수 있는 다른 전사인자는, 핵 호르몬 수용체(예를 들어, Torchia 등, Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998) 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛(Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618(1998) 및 Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); 및 EGR-1(조기성장반응 유전자; Yan 등, PNAS 95:8298-8303(1998) 및 Liu 등, Cancer Gene Ther. 5:3-28(1998))을 포함한다. 추가의 합성 활성화 도메인은 VP64 활성화 도메인이다(Seipel 등, EMBO J. 11:4961-4968 (1996)).

키나아제, 포스파타아제, 메틸라아제, 디메틸라아제, 아세틸라아제, 디아세틸라아제, 및 유전자 조절에 연루된 폴리펩티드를 변형하는 다른 단백질이 또한 조절 도메인으로 유용하다. 그러한 변형인자는, 예를 들어 호르몬에 의해 매개되는 전사를 개시하거나 중단시키는데 주로 연루된다. 전사 조절에 연루되는 키나아제는 Davis, Mol.Reprod. Dev. 42:459-67(1995), Jackson 등, Adv. Second Messenger Phosphoprotein Res. 28:279-86 (1993), 및 Boulikas, Crit. Rev. Eukaryot. Gene Expr. 5:1-77(1995)에서 고찰되고, 포스파타아제는, 예를 들어 Schonthal & Semin, Cancer Biol. 6:239-48 (1995)에서 고찰된다. 핵 티로신 키나아제는 Wang, Trends Biochem. Sci. 19:373-6 (1994)에 설명된다.

설명된 대로, 유용한 도메인은 또한 종양유전자(예를 들어, myc, jun, fos, myb, max, mad, rel, ets, bcl, myb, mos 과의 구성원) 및 이들의 관련된 인자 및 변형인자들의 유전자 산물로부터 얻을 수 있다. 종양유전자는, 예를 들어 Cooper, Oncogenes, 제2판, The Jones and Bartlett Series in Biology, Boston, MA, Jones and Bartlett Publishers, 1995에 설명된다. ets 전사인자는 Waslylk 등, Eur. J. Biochem. 211:7-18(1993) 및 Crepieux 등, Crit. Rev. Oncog. 5:615-38(1994)에서 고찰된다. Myc 종양유전자는, 예를 들어 Ryan 등, Biochem. J. 314:713-21(1996)에서 고찰된다. jun 및 fos 전사인자는, 예를 들어 The Fos and Jun Families of Transcription Factors, Angel & Herrlich, eds. (1994)에 설명된다. max 종양유전자는 Hurlin 등, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59:109-16에 고찰된다. myb 유전자 과는 Kanei-Ishii 등, Curr.Top.Microbiol.Immunol. 211:89-98(1996)에서 고찰된다. mos 과는 Yew 등, Curr. Opin. Genet. Dev. 3:19-25(1993)에서 고찰된다.

또한, 조절 도메인은 DNA 수선 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형인자들로부터 얻어질 수 있다. 이들은, 예를 들어 뉴클레아제(엑소- 및 엔도-), 재조합효소, 헬리카아제, 인테그라아제, 중합효소 및 단일-가닥 DNA-결합 단백질(SSB)을 포함한다. DNA 수선 시스템은, 예를 들어 Vos, Curr. Opin. Cell Biol. 4:385-95(1992); Sancar, Ann. Rev. Genet. 29:69-105(1995); Lehmann, Genet. Eng. 17:1-19(1995); 및 Wood, Ami. Rev. Biochem. 65:135-67(1996)에 설명된다. 또한, DNA 재배열 효소 및 이들의 관련 인자 및 변형인자들이 조절 도메인으로 사용될 수 있다(예를 들어, Gangloff 등, Experientia 50:261-9(1994); Sadowski, FASEB J. 7:760-7(1993) 참조). 유사하게, 조절 도메인은 DNA 변형 효소(예를 들어, DNA 메틸트랜스페라아제, 토포이소머라아제, 헬리카아제, 리가아제, 키나아제, 포스파타아제, 중합효소) 및 이들의 관련된 인자 및 변형인자로부터 유래될 수 있다. 헬리카아제는 Matson 등, Bioessays, 16:13-22(1994)에서 설명되고, 메틸트랜스페라아제는 Cheng, Curr. Opin. Struct. Biol. 5:4-10(1995)에 설명된다. 염색질 관련 단백질 및 이들의 변형인자(예를 들어, 키나아제, 아세틸라아제 및 디아세틸라아제), 예를 들어 히스톤 디아세틸라아제(Wolffe, Science 272:371-2 (1996))가 또한 유용한 기능 도메인이다. 한 구체예에서, 조절 도메인은 전사 억제인자로 작용하는 DNA 메틸트랜스페라아제이다(예를 들어, Van den Wyngaert 등, FEBS Lett. 426:283-289(1998); Flynn 등, J.Mol. Biol. 279:101-116(1998); Okano 등, Nucleic Acids Res. 26:2536-2540 (1998); 및 Zardo & Caiafa, J. Biol Chem. 273:16517-16520 (1998) 참조). 다른 구체예에서, Fok1과 같은 엔도뉴클레아제가 표적 DNA 절단을 촉매하는 기능 도메인을 제공하며, 이것은 전사 억제 및 상동성 재조합과 같은 과정을 촉진한다. 예를 들어, 미국특허 제5,436,150호; 제5,792,640호 및 제6,265,196호; 미국특허출원 공개 2003/0232410 및 WO 03/87341를 참조한다.

또한, 염색질 및 DNA 구조, 이동 및 국지화를 제어하는 인자 및 이들의 관련 인자 및 변형인자; 미생물(예를 들어, 원핵생물, 진핵생물 및 바이러스)로부터 유래된 인자; 및 이들과 관련되거나 또는 변형시키는 인자를 사용하여 키메라 단백질 또는 융합 분자의 구성을 위한 기능 도메인을 얻을 수 있다. 한 구체예에서, 재조합 효소 및 인테그라아제가 조절 도메인으로서 사용된다. 다른 구체예에서, 히스톤 아세틸트랜스페라아제가 전사 활성화 도메인으로서 사용된다(예를 들어, Jin & Scotto, Mol.Cell Biol. 18:4377-4384(1998); Wolffe, Science 272:371-372(1996); Taunton 등, Science 272:408-411(1996); 및 Hassig 등, PNAS 95:3519-3524(1998) 참조). 다른 구체예에서, 히스톤 디아세틸라아제가 전사 억제 도메인으로서 사용된다(예를 들어, Jin & Scotto, Mol. Cell Biol. 18:4377-4384 (1998); Syntichaki & Thireos, J. Biol. Chem. 273:24414-24419(1998); Sakaguchi 등, Genes Dev. 12: 2831-2841(1998); 및 Martinez 등, J. Biol. Chem. 273:23781-23785(1998) 참조).

다른 적합한 억제 도메인은 메틸 결합 도메인 단백질 2B(MBD-2B)이다(예를 들어, MBD 단백질에 대해서는 Hendrich 등 (1999) Mamm Genome 10:906-912에 설명된 것을 참조한다). 다른 유용한 억제 도메인은 v-ErbA 단백질과 관련된 것이다. 예를 들어, Damm 등(1989) Nature 339:593-597; Evans (1989) Int. J. Cancer 증보판 4:26-28; Pain 등(1990) New Biol. 2:284-294; Sap 등 (1989) Nature 340:242-244; Zenke 등(1988) Cell 52:107-119; 및 Zenke 등 (1990) Cell 61:1035-1049 참조. 추가의 전형적인 억제 도메인들은, 제한은 없지만, 갑상선 호르몬 수용체(TR, 아래 참조), SID, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MBD-유사 단백질, DNMT 과의 구성원(예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, MeCP1, 및 MeCP2를 포함한다. 예를 들어, Bird 등 (1999) Cell 99:451-454; Tyler 등 (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler 등 (1999) Cell 99:447-450; 및 Robertson 등 (2000) Nature Genet. 25:338-342을 참조한다. 추가의 전형적인 억제 도메인은, 제한은 없지만, R0M2 및 AtHD2A를 포함한다. 예를 들어, Chern 등(1996) Plant Cell 8:305-321; 및 Wu 등(2000) Plant J. 22:19-27를 참조한다.

핵 호르몬 수용체(NHR) 초과의 어떤 구성원, 예를 들어 갑상선 호르몬 수용체(TR) 및 레티노산 수용체(RAR)을 포함하는 구성원이 현재 알려진 가장 강력한 전사 조절인자이다. Zhang 등, Annu. Rev. Physiol. 62:439-466(2000) 및 Sucov 등, MolNeurobiol 10(2-3):169-184(1995). 이들의 동족 리간드의 부재하에, 이들 단백질은 조절 장소(예를 들어, 인핸서 및 프로모터) 내의 짧은 DNA 신장물(예를 들어, 12-17 염기쌍)과 높은 특이성 및 친화성으로 결합하여 인접 유전자의 강한 전사 억제를 행한다. 이들의 조절 작용의 효능은 유전자 사일런싱을 일으키는 두 분리된 기능 경로를 동시 사용함으로써 생기는데, 이것은 (i) 보조-억제인자 N-CoR과 히스톤 디아세틸라아제 HDAC3 간의 복합체의 표적화에 의하여 억제 염색질의 국소화 도메인을 만드는 것(Guenther 등, Genes Dev 14:1048-1057(2000); Urnov 등, EMBO J. 19:4074-4090(2000); Li 등, EMBO J. 19:4342-4350(2000) 및 Underhill 등 J. Biol Chem. 275:40463-40470(2000)) 및 (ii) 기본적 전사 기구의 기능을 직접 방해하는 것을 포함할 수 있는 염색질-의존성 경로(Urnov 등, 상동)이다(Fondell 등 Genes Dev 7(7B):1400-1410(1993) 및 Fondell 등, Mol. Cell Biol. 16:281-287(1996)).

이들의 리간드 농도가 매우 낮을 때(예를 들어, 나노몰), 이들 수용체는 입체구조적 변화를 겪고, 그 결과 보조-억제인자의 방출, 상이한 부류의 보조 분자(예를 들어, 보조-활성화인자)의 모집 및 강력한 전사 활성화가 야기된다. Colli-ngwood 등, J. Mol. Endocrinol 23(3):255-275 (1999).

전사 제어(예를 들어, 억제 및 활성화)를 초래하는 수용체 단백질의 부분은 DNA 결합을 초래하는 부분으로부터 물리적으로 분리될 수 있고, 다른 폴리펩티드, 예를 들어 다른 DNA-결합 도메인에 연결되었을 때 완전한 기능을 보유한다. 따라서, 핵 호르몬 수용체 전사 제어 도메인은 DNA-결합 도메인(예를 들어 징크핑거 단백질)과 융합될 수 있으며, 이로써 수용체의 전사 조절 활성이 DNA-결합 도메인에 의하여 해당 염색체 영역(예를 들어, 유전자)에 표적화될 수 있다.

더욱이, TR 및 다른 핵 호르몬 수용체의 구조는, 자연적으로 또는 재조합 기술을 통하여, 호르몬에 반응하는 모든 능력은 상실하고(이로써 전사 활성화를 일으키는 능력을 잃는다), 전사 억제를 행하는 능력은 보유하도록 변경될 수 있다. 이런 접근법은 종양 단백질 v-ErbA의 전사 조절성에 의해 예시된다. v-ErbA 단백질은 조류 적혈모구증 바이러스에 의해 어린 병아리에서 미성숙 적혈구 전구체가 백혈병 세포로 형질전환되는데 필요한 두 단백질 중 하나이다. TR은 적혈구 생성의 주요 조절인자인데(Beug 등, Biochim Biophys Acta 1288(3):M35-47 (1996)), 특히 리간드 비-결합 상태에서, 세포 사이클 정지 및 분화된 상태에 필요한 유전자를 억제한다. 따라서, 미성숙 적혈모구에 갑상선 호르몬의 투여는 빠른 분화를 가져온다. v-ErbA 종양단백질은 TR의 광범위하게 돌연변이된 양태인데, 이들 돌연변이는 (i) 12개 아미노-말단 아미노산의 결실; (ii) gag 종양단백질과의 융합; (iii) 모 TR에 비하여 단백질의 DNA 결합 특이성을 변경시키고, 레티노이드 X 수용체와 이종이량체화하는 능력을 손상시키는 DNA 결합 도메인 내의 수개 점 돌연변이; (iv) 갑상선 호르몬과 결합하는 능력을 효과적으로 제거하는 단백질의 리간드-결합 도메인 내의 다수 점 돌연변이; 및 (v) 전사 활성화에 필수적인 아미노산의 카르복시-말단 신장의 결실을 포함한다. Stunnenberg 등, Biochim Biophys Acta 1423(1):F15-33 (1999). 이들 돌연변이의 결과, v-ErbA는 자연발생 TR 표적 유전자와 결합하는 능력을 보유하고, 결합되었을 때는 효과적인 전사 억제인자가 된다(Urnov 등, 상동; Sap 등, Nature 340:242-244(1989); 및 Ciana 등 EMBO J. 17(24):7382-7394(1999). 그러나, TR과는 반대로, v-ErbA는 갑상선 호르몬에 완전히 비-감수성이며, 따라서 갑상선 호르몬이나 레이노이드의 존재하에서도 전사 억제를 유지한다.

따라서, 한 양태에서, v-ErbA 또는 그것의 기능 단편이 억제 도메인으로 사용된다. 추가의 구체예에서, TR 또는 그것의 기능 단편이 리간드의 부재하에 억제 도메인으로서, 및/또는 리간드(예를 들어 3,5,3'-트리요도-L-티로닌 또는 T3)의 존재하에 활성화 도메인으로서 사용된다. 따라서, TR은 전환형 기능 도메인(즉, 2-기능 도메인)으로 사용될 수 있으며, 그 활성(활성화 또는 억제)은 리간드의 존재 또는 부재(각각)에 의존한다.

추가의 전형적인 억제 도메인은 DAX 단백질 및 그것의 기능 단편으로부터 얻어진다. Zazopoulos 등, Nature 390:311-315 (1997). 특히, 아미노산 245-470을 포함하는 DAX-1의 C-말단 부분이 억제 활성을 지니는 것으로 밝혀졌다. Altincicek 등, J. Biol. Chem. 275:7662-7667 (2000). 추가의 전형적인 억제 도메인은 RBP1 단백질 및 그것의 기능 단편이다. Lai 등, Oncogene 18:2091-2100(1999); Lai 등, Mol. Cell Biol. 19:6632-6641(1999); Lai 등 Mol. Cell Biol. 21:2918-2932(2001) 및 WO 01/04296. 전장 RBP1 폴리펩티드는 1257 아미노산을 함유한다. RBP1의 전형적인 기능 단편은 아미노산 1114-1257을 포함하는 폴리펩티드, 및 아미노산 243-452을 포함하는 폴리펩티드이다.

TIEG 과의 전사인자 구성원은 R1, R2 및 R3라고 알려진 3개의 억제 도메인을 함유한다. TIEG 과의 단백질에 의한 억제는 적어도 부분적으로 mSIN3A 히스톤 디아세틸라제 복합체의 모집을 통해 달성된다. Cook 등 (1999) J. Biol. Chem. 274: 29, 500-29,504; Zhang 등 (2001) Mol. Cell Biol. 21:5041-5049. 이들 억제 도메인(또는 그들의 기능 단편) 전부 또는 그 중 어느 것은 단독으로, 또는 추가의 억제 도메인(또는 그들의 기능 단편)과 조합하여, DNA-결합 도메인과 융합되어 표적화된 외인성 억제인자 분자를 생성할 수 있다.

더욱이, 사람 시토메갈로바이러스(HCMV) UL34 오픈 리딩 프레임의 산물이 어떤 HCMV 유전자, 예를 들어 US3 유전자의 전사 억제인자로서 작용한다. LaPierre 등(2001) J. Virol. 75:6062-6069. 따라서, UL34 유전자 산물, 또는 그의 기능 단편이 징크핑거 결합 도메인을 또한 포함하는 융합 폴리펩티드의 성분으로서 사용될 수 있다. 그러한 융합체를 암호화하는 핵산이 또한 본원에 개시된 방법 및 조성물에 유용하다.

또 다른 전형적인 억제 도메인은 CDF-1 전사인자 및/또는 그것의 기능 단편이다. 예를 들어, WO 99/27092 참조.

Ikaros 과의 단백질이, 적어도 부분적으로는 전사억제에 의한, 림프구 발생의 조절에 연루된다. 따라서, Ikaros 과 구성원(예를 들어, Ikaros, Aiolos) 또는 그의 기능 단편이 억제 도메인으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, Sabbattini 등, (2001) EMBO J. 20:2812-2822 참조.

효모 Ash1p 단백질은 전사 억제 도메인을 포함한다. Maxon 등 (2001) Proc. Natl. Acad. Sci USA 98:1495-1500. 따라서, 예를 들어, 척추동물, 포유동물 및 식물 세포에서 발견되는 것들과 같은 Ash1p 단백질, 그것의 기능 단편, 및 Ash1p의 상동체가 본원에 개시된 방법 및 조성물에서 사용되는 억제 도메인으로 작용할 수 있다.

추가의 전형적인 억제 도메인은 히스톤 디아세틸라아제(HDAC, 예를 들어 I형HDAC, II형 HDAC, SIR-2 상동체), HDAC-상호작용 단백질(예를 들어, SIN3, SAP30, SAP15, NCoR, SMRT, RB, p1O7, p130, RBAP46/48, MTA, Mi-2, Brg1, Brm), DNA-시토신 메틸트랜스페라아제(예를 들어, Dnmt1, Dnmt3a, Dnmt3b), 메틸화 DNA와 결합하는 단백질(예를 들어, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MeCP2, DMAP1), 단백질 메틸트랜스페라아제(예를 들어, 리신 및 아르기닌 메틸라아제, Suv39H1과 같은 SuVar 상동체), polycomb(폴리콤)-형 억제인자(예를 들어, Bmi-1, eed1, RING1, RYBP, E2F6, Mel18, YY1 및 CtBP), 바이러스 억제인자(예를 들어, 아데노바이러스 E1b 55K 단백질, 시토메갈로바이러스 UL34 단백질, v-erbA와 같은 바이러스 종양유전자), 호르몬 수용체(예를 들어, Dax-1, 에스트로겐 수용체, 갑상선 호르몬 수용체), 및 자연발생 징크핑거 단백질과 관련된 억제 도메인(예를 들어, WT1, KAP1)으로부터 유래된 것들을 포함한다. 추가의 전형적인 억제 도메인은 폴리콤 복합체 및 그 상동체, HPH1, HPH2, HPC2, NC2, groucho, Eve, tramtrak, mHP1, SIP1, ZEB1, ZEB2, 및 Enx1/Ezh2의 구성원들을 포함한다. 이들 모든 경우에서, 전장 단백질이나 기능 단편 중 어느 하나가 징크핑거 결합 도메인과의 융합을 위한 억제 도메인으로서 사용될 수 있다. 더욱이, 전술한 단백질의 어떤 상동체가 또한 억제 도메인으로 사용될 수 있으며, 전술한 단백질 중 어느 것과 상호작용하는 단백질도 마찬가지이다(또는 그들의 기능 단편).

추가의 억제 도메인, 및 전형적인 기능 단편은 다음과 같다. Hes1은 초파리 hairy 유전자 산물의 사람 상동체이며, 아미노산 910-1014를 포함하는 기능 단편을 포함한다. 특히, WRPW(trp-arg-pro-trp) 모티프가 억제 도메인으로 작용할 수 있다. Fisher 등 (1996) Mol. Cell Biol. 16:2670-2677.

TLE1, TLE2 및 TLE3 단백질은 초파리 groucho 유전자 산물의 사람 상동체이다. 억제 활성을 지닌 이들 단백질의 기능 단편은 아미노산 1-400 사이에 있다.

Fisher 등, 상동.

Tbx3 단백질은 아미노산 524-721 사이에 기능적 억제 도메인을 지닌다. He 등(1999) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:10,212-10,217. Tbx2 유전자 산물은 p14/p16 유전자의 억제에 연루되며, Tbx3의 억제 도메인과 상동성인 아미노산 504-702 사이의 영역을 함유하므로, Tbx2 및/또는 이 기능 단편은 억제 도메인으로서 사용될 수 있다. Carreira 등 (1998) Mol. Cell Biol. 18:5,099-5,108.

사람 Ezh2 단백질은 초파리 제스트 인핸서(enhancer of zeste)의 상동체로서 eed1 폴리콤-형 억제인자를 모집한다. 아미노산 1-193을 포함하는 Ezh2 단백질 영역이 eed1과 상호작용하여 전사를 억제하므로, Ezh2 및/또는 이 기능 단편은 억제 도메인으로서 사용될 수 있다. Denisenko 등(1998) Mol.Cell Biol. 18:5634-5642.

RYBP 단백질은 폴리콤 복합체 구성원 및 YY1 전사인자와 상호작용하는 보조-억제인자이다. 아미노산 42-208을 포함하는 RYBP 영역이 기능적 억제 도메인으로서 확인되었다. Garcia 등 (1999) EMBO J. 18:3404-3418.

RING 핑거 단백질 RING1A는 두 상이한 척추동물 폴리콤-형 복합체의 구성원으로서, 폴리콤 복합체의 여러 구성요소를 위한 다수의 결합 부위를 함유한다. 따라서, RING1A 또는 그 기능 단편은 억제 도메인으로 작용할 수 있다. Satjin 등, (1997) Mol. Cell Biol. 17:4105-4113.

Bmi-1 단백질은 전사 사일런싱에 연루되는 척추동물 폴리콤 복합체의 구성원이다. 그것은 다양한 폴리콤 복합체 구성요소를 위한 다수의 결합 부위를 함유한다. 따라서, Bmi-1 및 그 기능 단편은 억제 도메인으로서 유용하다. Gunster 등, (1997) Mol. Cell Biol. 17:2326-2335; Hemenway 등(1998) Oncogene 16:2541-2547.

E2F6 단백질은 포유동물 Bmi-1-함유 폴리콤 복합체의 구성원이며 RYBP, Bmi-1 및 RING1A를 모집할 수 있는 전사 억제인자이다. 아미노산 129-281을 포함하는 E2F6의 기능 단편이 전사 억제 도메인으로 작용한다. 따라서, E2F6 및 그 기능 단편은 억제 도메인으로 사용될 수 있다. Trimarchi 등. (2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:1519-1524.

eed1 단백질은 적어도 부분적으로 히스톤 디아세틸라아제(예를 들어, HDAC2)의 모집을 통해 전사를 억제한다. 억제 활성은 이 단백질의 N- 및 C-말단 영역 모두에 있다. 따라서, eed1 및 그 기능 단편은 억제 도메인으로서 사용될 수 있다. van der Vlag 등 (1999) Nature Genet. 23:474-478.

CTBP2 단백질은 적어도 부분적으로 HPC2-폴리콤 복합체의 모집을 통해 전사를 억제한다. 따라서, CTBP2 및 그 기능 단편은 억제 도메인으로서 유용하다. 예를 들어, Richard 등 (1999) Mol. Cell Biol. 19:777-787 참조.

뉴론-제한성 사일런서 인자는 뉴론-특이적 유전자의 발현을 억제하는 단백질이다. 따라서, NRSF 또는 그 기능 단편은 억제 도메인으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 미국특허 제6,270,990호 참조.

추가의 억제 도메인은 PLZF, BCL-6, BAZF, ZNF274, PRH, TEL, TGIF, 및 G9A를 포함한다.

DNA-결합 도메인과 기능 도메인 사이의 융합 단백질(또는 그것을 암호화하는 핵산)의 형성에 있어서, 억제인자 또는 억제인자와 상호작용하는 분자가 기능 도메인으로서 적합하다는 것은 당업자에게 명백한 바이다. 본질적으로, 표적 유전자에 대해 억제성 복합체 및/또는 억제 활성을 모집할 수 있는 어떤 분자(예를 들어, 히스톤 디아세틸라아제)가 융합 단백질의 억제 도메인으로서 유용하다.

추가의 전형적인 활성화 도메인은, 제한되는 것은 아니나, p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, AtHD2A, 및 ERF-2를 포함한다. 예를 들어, Robyr 등 (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood 등 (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275; Leo 등 (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna 등 (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik 등 (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; 및 Lemon 등 (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504. 추가의 전형적인 활성화 도메인은, 제한은 없지만, OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7, 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1을 포함한다. 예를 들어, Ogawa 등 (2000) Gene 245:21-29; Okanami 등 (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff 등 (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho 등 (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason 등 (1999) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels 등 (2000) Plant J. 22:1-8; Gong 등 (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; and Hobo 등 (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353.

추가의 전사 활성화 도메인은 다음 단백질로부터 얻을 수 있다: ATF2, myc, GATA-1, GATA-3, NF-E2, Oct1, CTF1, Sp1, GR-AF1, zeste 결실, HSF-1, p53, myoD, 및 CARβ.

DNA-결합 도메인과 기능 도메인 사이의 융합 단백질(또는 그것을 암호화하는 핵산)의 정보에 있어서, 억제인자나 억제인자와 상호작용하는 분자가 기능 도메인으로서 적합하다는 것이 이 당업자에게 분명할 것이다. 본질적으로, 표적 유전자에 대하여 억제성 복합체 및/또는 억제 활성을 모집할 수 있는 어떤 분자(예를 들어, 히스톤 디아세틸화)가 기능 단백질의 억제 도메인으로서 유용하다.

융합 분자에서 기능 도메인으로서 사용되는 적합한 인슐레이터 도메인, 국지화 도메인, 및 염색질 리모델링 단백질, 예를 들어 ISWI-함유 도메인 및/또는 메틸 결합 도메인 단백질이, 예를 들어 공동 소유의 미국특허출원 2002/0115215 및 2003 /0082552 그리고 공동 소유의 WO 02/44376에 설명된다.

더 이상의 구체예에서, DNA-결합 도메인(예를 들어, 징크핑거 도메인)은 2-기능 도메인(BFD)과 융합된다. 2-기능 도메인은 전사 조절 도메인이며, 그 활성은 BFD와 제 2 분자 간 상호작용에 의존한다. 제 2 분자는 BFD의 기능성에 영향을 미칠 수 있는 어떤 종류의 분자일 수 있으며, 제한은 없지만, 화합물, 작은 분자, 펩티드, 단백질, 다당류 또는 핵산을 포함한다. 전형적인 BFD는 에스트로겐 수용체 (ER)의 리간드 결합 도메인이다. 에스트라디올의 존재하에, ER 리간드 결합 도메인은 전사 활성화인자로서 작용하지만, 에스트라디올이 부재하고 타목시펜 또는 4-히드록시-타목시펜이 존재할 경우, 그것은 전사 억제인자로서 작용한다. BFD의 다른 예는 갑상선 호르몬 수용체(TR) 리간드 결합 도메인인데, 이것은 리간드의 부재하에서는 전사 억제인자로서 작용하고, 갑상선 호르몬(T3)이 존재할 경우 전사 활성화인자로서 작용한다. 추가의 BFD는 글루코코르티코이드 수용체(GR) 리간드 결합 도메인이다. 덱사메타손의 존재하에 이 도메인은 전사 활성화인자로서 작용하고, RU486 존재하에서는 전사 억제인자로서 작용한다. 추가의 전형적인 BFD는 레티노산 수용체의 리간드 결합 도메인이다. 그것의 리간드인 전부 트랜스형인 레티노산의 존재하에서, 레티노산 수용체는 다수의 보조-활성화인자 복합체를 모집하여 전사를 활성화한다. 리간드가 부재하는 경우에, 레티노산 수용체는 전사 보조-활성화인자를 모집할 수 없다. 추가의 BFD들이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 미국특허 제5,834,266호 및 제5,994,313호 및 PCT WO 99/10508 참조.

핵 수용체로부터 유래된 다른 부류의 기능 도메인은 그 기능 활성이 비-자연적 리간드에 의해 조절되는 것들이다. 이들은 주로 돌연변이 또는 자연발생 수용체의 변형된 양태로서, 때로 "전환형" 도메인이라고 한다. 예를 들어, 프로게스테론 수용체(PR)의 어떤 돌연변들은 그들의 자연적 리간드와 상호작용할 수 없으며, 따라서 프로게스테론에 의해서 전사 활성화될 수 없다. 그러나, 이들 돌연변이 중 어떤 것은 프로게스테론 이외의 다른 작은 분자와 결합함으로써 활성화될 수 있다(이것의 한 예는 안티프로게스틴 미페프리스톤이다). 이러한 비-자연적이지만 기능적으로 능력 있는 리간드를 항-호르몬이라고 표시한다. 예를 들어, 미국특허 제5,364,791호; 제5,874,534호; 제5,935,934호; Wang 등, (1994) Proc. Natl. Acad. Sci USA 91:8180-8184; Wang 등 (1997) Gene Ther. 4:432-441 참조.

따라서, 선택된 유전자에서 또는 그 근처에서 결합하도록 DNA-결합 도메인을 설계하거나 선택함으로써, 표적화된 DNA-결합 도메인(예를 들어, ZFP), 기능 도메인, 및 이런 종류의 돌연변이 PR 리간드 결합 도메인을 포함하는 융합체가 선택된 내인성 유전자의 미페프리스톤-의존성 활성화 또는 억제에 사용될 수 있다. 이러한 융합체는 또한 degron 도메인을 포함할 수 있다. 만일 융합체가 활성화 도메인을 함유한다면, 유전자 발현의 미페프리스톤-의존성 활성화가 얻어지고, 융합체가 억제 도메인을 함유한다면, 유전자 발현의 미페프리스톤-의존성 억제가 얻어진다. 추가로, 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 제공되며, 마찬가지로 이러한 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터 및 이러한 폴리뉴클레오티드와 벡터를 포함하는 세포가 제공된다. PR 이외의 다른 수용체의 변형된 또는 돌연변이 양태가 전환형 도메인으로서 또한 사용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 예를 들어, Tora 등 (1989) EMSO J 8:1981-1986 참조.

숙주세포, 벡터 및 프로모터

개시된 방법의 실시에 있어서, 상기 설명된 조작된 징크핑거 단백질은 세포에서 발현되며, 표적 부위와 결합하여 전사를 조절한다. 단백질은, 예를 들어 단백질을 세포로 송달하거나, 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포로 송달함으로써 세포에서 발현될 수 있다. 만일 단백질을 암호화하는 DNA 분자가 세포로 송달된다면, 그것은 mRNA 분자로 전사되며, mRNA가 번역되어서 단백질을 생산할 수 있다. 또는 달리, RNA 분자가 세포로 송달될 수 있고, 번역되어서 단백질을 생성할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포로 송달하는 방법은 본 분야에 공지되어 있으며, 전형적인 방법이 본 명세서에서 제시된다. 또한, 세포에서의 단백질 발현은 단백질을 암호화하는 핵산으로 세포를 트랜스펙트하고, 핵산이 염색체로 안정하게 통합되거나, 또는 그렇지 않다면 세포에 안정하게 대대로 유지된 셀라인을 선택함으로써 달성될 수 있다. 이들 경우에, 안정하게 유지된 서열에 의해서 암호화된 단백질의 발현은 유도성(예를 들어, 테트라시클린- 및 독시시클린-조절 시스템) 또는 구성성일 수 있다.

개시된 조성물 및 방법은, 배양 세포, 1차 세포, 유기체 내 세포 및 유기체로부터 분리된 다음 단백질 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 세포로 송달한 후에 유기체로 다시 되돌아가는 세포를 포함하는 어떤 세포에서 어떤 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는데 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 내인성 및 외인성 서열의 전사가 모두 조절될 수 있다. 내인성 서열의 전사를 조절하기 위해서, SEQ ID NO:1의 하나 이상의 카피가 조절될 내인성 서열에 또는 그 근처에 삽입될 수 있다. 세포 게놈으로 외인성 서열을 표적화 삽입하는 전형적인 방법이 미국특허출원 공개 2003/0232410(2003년 12월 18일), PCT 공보 WO 03/87341(2003 년 10월 23일) 및 공동 소유의 미국특허출원 10/912,932(2004년 8월 6일)에 설명되며, 이들은 그 전문이 참고자료로서 본원에 포함된다.

주지한 대로, 개시된 방법 및 조성물은 또한 외인성 서열(예를 들어, 세포로 도입되는 cDNA 서열을 포함하는 벡터)의 전사를 조절하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, cDNA는 프로모터, 예를 들어 SRα 프로모터를 함유하는 벡터로 클로닝될 수 있으며, 이로써 cDNA 서열의 전사가 프로모터에 의해 제어되게 된다. 이들 경우, cDNA-함유 벡터가 세포로 도입되고, 본원에 개시된 조작된 ZFP가 동일 세포로 도입된다. 또는 달리, cDNA가 본원에 개시된 조작된 ZFP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 통합 (또는 그렇지 않다면 안정하게 유지된) 카피를 함유하는 안정한 셀라인으로 도입된다. 다른 대안으로서, 조작된 ZFP 또는 조작된 ZFP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 cDNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열의 통합 (또는 그렇지 않다면 안정하게 유지된) 카피를 함유하는 세포로 도입된다.

조작된 ZFP를 암호화하는 안정하게 통합된 서열을 함유하는 세포에서, 각각이 하나 이상의 ZFP 표적 부위를 함유하는, 많은 외인성 전사 유닛이 도입되어(예를 들어, 트랜스펙션에 의해), 외인성 전사 유닛들의 동등한 조절이 얻어질 수 있다. 또한, 그러한 세포에서는, 하나 이상의 표적 부위가 내인성 전사 유닛의 상류에, 내부에 또는 인접하여 도입되어 다수 유전자의 동등한 조절이 얻어질 수 있다.

세포에 대해 외인성인 뉴클레오티드 서열의 증식을 위한 적합한 벡터, 및 이러한 외인성 뉴클레오티드 서열의 전사 조절을 위한 프로모터가 본 분야에 공지되어 있다. 전형적인 프로모터는 SRα 및 CMV 프로모터를 포함한다. SRα 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열의 전사 조절이 개시된 단백질을 직접 이용하여 달성될 수 있는데, 표적 부위 SEQ ID NO:1의 카피가 SRα 프로모터에 존재하기 때문이다. 높은 수준의 전사(예를 들어, 단백질을 과발현에 적합한)가 SEQ ID NO:1의 추가의 카피를 SRα 프로모터에 위치시킴으로써 달성된다. 더욱이, SEQ ID NO:1의 하나 이상의 카피를 삽입함에 의한 SRα 이외의 다른 프로모터(예를 들어, CMV 프로모터)의 변형이, 미변형 프로모터에서보다 더 높은 발현 수준을 초래한다.

개시된 방법 및 조성물은, 제한은 없지만 원핵생물 세포, 진균세포, 아케아 세포, 식물세포, 곤충세포, 동물세포, 척추동물 세포, 포유동물 세포 및 사람세포를 포함하는 어떤 종류의 세포에서 사용될 수 있다. 단백질 발현의 적합한 셀라인은 당업자에게 공지되어 있으며, 제한은 없지만, COS, CHO(예를 들어, CHO-S, CHO-K1, CHO-DG44, CHO-DUXB11), VERO, MDCK, WI38, V79, B14AF28-G3, BHK, HaK, NSO, SP2/0-Ag14, HeLa, HEK293(예를 들어, HEK293-F, HEK293-H, HEK293-T), perC6, 곤충세포, 예로 Spodoptera fugiperda(Sf), 및 진균세포, 예를 들어 Saccharomyces, Pischia 및 Schizosaccharomyces를 포함한다. 이들 세포의 자손, 변이체 및 유도체가 또한 사용될 수 있다.

전형적인 프로모터는 SRα, CMV, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK), 사람 유비퀴틴 C(UBC), 신장인자 1α(EF1α), 헤르페스 티미딘 키나아제(TK), SV40 조기 및 후기 프로모터, 사람 케라틴-14(K14) 및 Rous 육종 바이러스(RSV)를 포함한다. 한 구체예에서, ZFP의 하나 이상의 표적 부위가 각 프로모터에 또는 그 근처에 존재한다면, 둘 이상의 프로모터가 동일한 조작된 ZFP로 조절될 수 있다. 이것은 중쇄를 암호화하는 서열은 제 1 프로모터의 전사 제어하에 있게 되고, 경쇄를 암호화하는 서열은 제 2 프로모터의 제어하에 있게 될 수 있기 때문에, 재조합 항체 생산에 특히 유용하다. 두 프로모터는 동일할 수도 있고, 또는 상이한 프로모터일 수도 있다. 추가의 구체예에서, 각각이 상이한 수의 ZFP 표적 부위를 함유하는 동일한 프로모터의 2개 카피를 사용하여 각 프로모터에 작동가능하게 연결된 서열의 차등 발현을 얻을 수 있다. 또한, 각각 상이한 수의 표적 부위를 함유하는 2개의 상이한 프로모터가 사용될 수도 있다.

어떤 정해진 표적 서열에 결합하도록 ZFP를 디자인하는 것이 가능하며, 따라서 그러한 서열의 하나 이상의 카피를 사용하여, 그 서열에 결합하는 ZFP와 함께, 예를 들어 과발현을 위해, 전사를 조절할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

융합 핵산 및 발현 벡터

어떤 구체예에서, 융합 폴리펩티드는 융합 핵산에 의해 암호화된다. 그러한 경우, 핵산은 복제 및/또는 발현을 위해 원핵생물 또는 진핵생물 세포로 형질전환시키기 위해서 중간체 벡터로 클로닝될 수 있다. 융합 핵산의 저장이나 조작 또는 융합 단백질의 생산을 위한 중간체 벡터는, 예를 들어 원핵생물 벡터(예를 들어 플라스미드), 셔틀 벡터, 곤충 벡터 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 또한, 융합 핵산은 박테리아 세포, 진균세포, 원생동물 세포, 식물세포 또는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 더욱 바람직하게는 사람세포에의 투여를 위해 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.

융합 단백질을 암호화하는 핵산은 복제 및/또는 발현을 위해 원핵생물 또는 진핵생물 세포로 형질전환하기 위해서 벡터로 클로닝될 수 있다. 벡터는 원핵생물 벡터, 예를 들어 플라스미드, 또는 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 또는 진핵생물 벡터일 수 있다. 또한, ZFP를 암호화하는 핵산이 식물세포, 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포 또는 사람세포, 진균세포, 박테리아 세포, 또는 원생동물 세포에의 투여를 위해 발현 벡터로 클로닝될 수 있다.

클로닝된 유전자 또는 핵산의 발현을 얻기 위해서, 융합 단백질을 암호화하는 서열은 전형적으로 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터로 서브클로닝된다. 적합한 박테리아 및 진핵생물 프로모터는 본 분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들어 Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(제2판, 1989; 제3판,2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual(1990); 및 Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel 등, 상동)에 설명된다. ZFP를 발현하는 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어 E. coli , Bacillus sp., 및 살모넬라에서 이용할 수 있다(Palva 등, Gene 22:229-235(1983)). 그러한 발현 시스템용 키트는 상업적으로 이용할 수 있다. 포유동물 세포, 효모 및 곤충세포를 위한 진핵생물 발현 시스템은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 또한 상업적으로 이용할 수 있다.

단백질-암호화 핵산의 직접 발현에 사용되는 프로모터는 특정 용도에 의존한다. 예를 들어, 강한 구성성 프로모터는 전형적으로 단백질의 발현 및 정제에 사용된다. 반대로, 단백질이 유전자 조절을 위해 생체내 투여될 때는, 그 단백질의 특정 용도에 의존하여 구성성 또는 유도성 프로모터가 사용된다. 또한, 단백질의 투여에 바람직한 프로모터는 약한 프로모터, 예를 들어 HSV TK 또는 유사한 활성을 갖는 프로모터일 수 있다. 또한, 프로모터는 전형적으로 트랜스활성화에 반응하는 요소, 예를 들어 저산소증 반응 요소, Ga14 반응 요소, lac 반응 요소, 및 작은 분자 제어 시스템, 예를 들어 tet-조절 시스템 및 RU-486 시스템을 포함할 수 있다(예를 들어, Gossen & Bujard, PNAS 89:5547(1992); Oligino 등 Gene Ther. 5:491-496(1998); Wang 등, Gene Ther. 4:432-441(1997); Neering 등 Blood 88:1147-1155 (1996); 및 Rendahl 등 Nat. Biotechnol. 16:757-761(1998) 참조).

프로모터에 더하여, 발현 벡터는 전형적으로 원핵생물이든 진핵생물이든 숙주세포에서 핵산의 발현에 필요한 모든 추가적 요소를 함유하는 전사 유닛 또는 발현 카세트를 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카세트는, 예를 들어 ZFP를 암호화하는 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 전사체의 효과적인 폴리아데닐화, 전사종결, 리보솜 결합 부위, 또는 번역종결에 필요한 신호를 함유한다. 추가의 카세트 요소는, 예를 들어 인핸서 및 이종성 스플라이싱 신호를 포함할 수 있다.

세포로 유전정보를 수송하는데 사용되는 특정 발현 벡터가 식물, 동물, 박테리아, 진균, 원생동물 등에서의 단백질의 계획된 용도, 예를 들어 발현과 관련하여 선택된다(아래 설명된 발현 벡터 참조). 표준 박테리아 발현 벡터는 플라스미드, 예를 들어 pBR322-기반 플라스미드, pSKF, pET23D, 및 상업적으로 이용가능한 융합 발현 시스템, 예를 들어 GST 및 LacZ를 포함한다. 전형적인 융합 단백질은 말토오스 결합 단백질 "MBP"이다. 이러한 융합 단백질은 단백질 정제를 용이하게 한다. 또한, 에피토프 택, 예를 들어 c-myc, 헤마글루티닌(HA) 또는 FLAG가 재조합 단백질에 첨가되어 발현 모티터링 및 세포 및 하위세포 국지화 모니터링을 위한 편리한 분리 방법을 제공한다.

진핵생물 바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터는 주로 진행생물 발현 벡터, 예를 들어 SV40 벡터, 유두종 바이러스 벡터, 및 엡스타인-바르 바이러스로부터 유래된 벡터에서 사용된다. 다른 전형적인 진핵생물 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, 및 SV40 조기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방종양 바이러스 프로모터, Rous 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵생물 세포에서의 발현에 효과적이라고 알려진 다른 프로모터의 지시하에 단백질의 발현을 허용하는 어떤 다른 벡터를 포함한다.

어떤 발현 시스템은 티미딘 키나아제, 히그로마이신 B 포스포트랜스페라아제 및 디히드로폴레이트 환원효소와 같은 안정하게 트랜스펙트된 셀라인을 위한 마커를 가진다. 또한, 폴리헤드린 프로모터 또는 다른 강한 바큘로바이러스 프로모터의 지시하에 단백질 코딩 서열과 함께 곤충세포에서 바큘로바이러스 벡터를 사용하는 것과 같은 고수율 발현 시스템이 적합하다.

또한, 발현 벡터에 전형적으로 포함되는 요소는 E. coli 또는 다른 원핵생물 박테리아에서 기능하는 레플리콘, 항생제 내성을 암호화하여 재조합 플라스미드를 숨기고 있는 박테리아의 선택을 허용하도록 하는 유전자, 및 재조합 서열의 삽입을 허용하는 플라스미드의 비필수 영역에 있는 특정 제한 부위를 포함한다.

다량의 단백질을 발현하는 박테리아, 포유동물, 효모 또는 곤충 셀라인을 생산하기 위해서 표준 트랜스펙션법이 사용되며, 그 후 표준 기술을 사용하여 정제된다(예를 들어, Colley 등 J.Biol. Chem. 264:17619-17622(1989); Guide to Protein Purification, Methods in Enzymology, 제18권 (Deutscher 등 1990) 참조). 진핵생물 및 원핵생물 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행된다(예로, Morrison, J. Bad. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu 등, 1983) 참조).

숙주세포에 외래 뉴클레오티드 서열을 도입하기 위한 잘 공지된 과정 중 어느 것이 사용될 수 있다. 이들은 인산칼슘 트랜스펙션, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 리포솜, 미소주입, 네이키드 DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 에피솜 및 통합형, 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 다른 외래 유전 물질을 숙주세포로 도입하기 위한 다른 잘 공지된 방법 중 어느 것의 사용을 포함한다(예를 들어, Sambrook 등, 상동). 적어도 하나의 유전자를 선택된 단백질을 발현할 수 있는 숙주세포로 성공적으로 도입할 수 있는 특정한 유전조작 과정이 사용되는 것이 필요하다.

융합 단백질을 암호화하는 핵산 및 세포로의 송달

종래의 바이러스 및 비-바이러스 기초 유전자 전달법을 사용하여 세포(예를 들어, 표유동물 세포) 및 표적 조직에 융합 단백질 및/또는 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산을 도입할 수 있다. 이러한 방법은 또한 시험관내에서 세포에 융합 단백질을 암호화하는 핵산을 투여하는데 사용될 수 있다. 어떤 구체예서, 융합 단백질을 암호화하는 핵산은 생체내 또는 생체외 유전자 요법 용도를 위해 사용될 수 있다. 비-바이러스 벡터 송달 시스템은 DNA 플라스미드, 네이키드 핵산, 및 리포솜 또는 플록사머와 같은 송달 부형제와 복합체화된 핵산을 포함한다. 바이러스 벡터 송달 시스템은 DNA 및 RNA 바이러스를 포함하며, 이들은 세포로 송달된 후 에피솜 또는 통합된 게놈을 가진다. 유전자 요법 과정에 대해 Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel & Feigner, TIBTEOCH 11:211-217 (1993); Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Miller, Nature 357:455-460(1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154(1988); Vigne, Restorative Neurology & Neuroscience 8:35-36(1995); Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995); Haddada 등, in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Bohm(eds)(1995); 및 Yu 등 Gene Therapy 1:13-26 (1994)를 참조한다.

조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 비-바이러스 송달법은 전기천공, 리포픽션, 미소주입, 바이오리스틱스, 비로솜, 리포솜, 면역리포솜, 폴리캐티온 또는 지질:핵산 콘쥬게이트, 네이키드 DNA, 인공 비리온, 및 DNA의 제제-증진 흡수를 포함한다. 리포픽션에 대해서는 US 5,049,386, US 4,946,787 및 US 4,897,355를 참조하며, 리포펙션 시약은 시판된다(예로서 Transfectam™, Lipofectin™, Lipofectamine

). 폴리뉴클레오티드의 효과적인 수용체-인식 리포펙션에 적합한 양이온 및 중성 지질은 Feigner, WO 91/17424, WO 91/16024의 것들이다. 세포로(생체외 투여) 또는 표적 조직(생체내 투여)으로 송달될 수 있다.

면역지질 복합체 같은 표적화된 리포솜을 포함하는 지질/핵산 복합체의 제조가 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Crystal, Science 270:404-410(1995); Blaese 등, Cancer Gene Ther. 2:291-297(1995); Behr 등, Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy 등, Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao 등, Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad 등, Cancer Res. 52:4817-4820 (1992); 미국특허 제4,186,183호, 제4,217,344호, 제4,235,871호, 제4,261,975호, 제4,485,054호, 제4,501,728호, 제4,774,085호, 제4,837,028호, 및 제4,946,787호 참조).

융합 단백질 및/또는 조작된 ZFP를 암호화하는 핵산의 송달을 위한 RNA 또는 DNA 기초 시스템의 사용은 바이러스를 체내의 특정 세포에 표적화하고, 핵에 대한 바이러스 하중을 정리하기 위한 고도로 진화된 과정을 이용한다. 바이러스 벡터는 환자에게 직접 투여될 수 있거나(생체내), 또는 이들은 시험관내에서 세포를 처리하고, 변형된 세포를 환자에게 투여하는데(생체외) 사용될 수 있다. ZFP의 송달을 위한 종래의 바이러스-기초 시스템은, 제한은 없지만, 유전자 전달을 위한 레트로바이러스, 렌티바이럿, 아데노바이러스, 아데노-관련 우두 및 헤르페스 단순 바이러스 벡터를 포함하며, 주로 삽입된 트랜스 유전자의 장기적 발현을 야기한다. 추가로, 높은 변환 효율이 많은 상이한 세포 종류 및 표적 조직에서 관찰되었다.

레트로바이러스의 향성은 외래 외피 단백질을 통합함으로써 변경될 수 있는데, 이로써 잠재적 표적 세포 집단이 확장된다. 렌티바이러스 벡터는 비-분할 세포를 형질도입 또는 감염시키고, 전형적으로 높은 바이러스 역가를 야기할 수 있는 레트로바이러스 벡터이다. 레트로바이러스 유전자 전달 시스템의 선택은 표적 조직에 의존한다. 레트로바이러스 벡터는 시스-작용 긴 말단 반복부로 이루어지며, 이것의 패키지 용량은 6-10kb 이하의 외래 서열이다. 최소 시스-작용 LTR은 벡터의 복제 및 패키징으로 충분하며, 이것은 다음에 치료 유전자와 표적 세포를 통합하여 영구적인 트랜스유전자 발현을 제공한다. 광범위하게 사용되는 레트로바이러스 벡터는 뮤린 백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 사람 면역결핍 바이러스(HIV), 및 이들의 조합에 기초한 것들을 포함한다(예를 들어, Buchscher 등, J. Virol. 66:2731-2739 (1992); Johann 등, J Virol. 66:1635-1640(1992); Sommerfelt 등 Virol. 176:58-59(1990); Wilson 등, J. Virol. 63:2374-2378 (1989); Miller 등, J. Virol. 65:2220- 2224 (1991); PCT/US94/05700 참조).

융합 단백질의 일시적 발현이 바람직한 용도에서는 아데노바이러스 기초 시스템이 사용될 수 있다. 아데노바이러스 기초 벡터는 많은 세포 종류에서 매우 높은 변환 효율이 가능하지만 세포 분할을 필요로 하지는 않는다. 그러한 벡터를 사용하여 높은 역가 및 높은 수준의 발현이 얻어진다. 이 벡터는 비교적 간단한 시스템에서 대량 생산될 수 있다. 또, 아데노-관련 바이러스("AAV") 벡터를 사용하여, 예를 들어 핵산 및 펩티드의 시험관내 생산에서, 그리고 생체내 및 생체외 유전자 요법 과정을 위해서, 표적 핵산에 세포를 형질도입할 수 있다(예를 들어 West 등 Virology 160:38-47(1987); 미국특허 제4,797,368호; WO93/24641; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801(1994); Muzyczka, J. CHn. Invest. 94:1351(1994). 재조합 AAV 벡터의 구성은, 미국특허 제5,173,414호; Tratschin 등, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260(1985); Tratschin, 등 Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081(1984); Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984); 및 Samulski 등, J. Virol. 63:03822-3828 (1989)을 포함하는 많은 문헌에 설명된다.

6개 이상의 바이러스 벡터 접근법이 임상시험에서 유전자 전달을 위해 현재 이용가능한데, 이들은 형질도입 제제를 발생시키기 위해 헬퍼 셀라인에 삽입된 유전자에 의한 결함 벡터의 상보성을 포함하는 접근법을 이용한다. pLASN 및 MFG-S가 임상 시험에서 사용된 레트로바이러스 벡터의 예이다(Dunbar 등 Blood 85:3048-305 (1995); Kohn 등, Nat. Med. 1:1017-102(1995); Malech 등, PNAS 94:22 12133-12138 (1997)). PA317/pLASN는 유전자 요법 시험에서 사용된 최초의 치료 벡터였다(Blaese 등, Science 270:475-480(1995)). 50% 이상의 변환 효율이 MFG-S 패키지 벡터에서 관찰되었다(Ellem 등 Immunol Immunother.44(1):10-20(1997); Dranoff 등, Hum. Gene Ther. 1:111-2(1997)).

재조합 아데노-관련 바이러스 벡터(rAAV)가 결함 및 비병원성 파보바이러스 아데노-관련 2형 바이러스에 기초한 유망한 대안적 유전자 송달 시스템이다. 모든 벡터는 트랜스유전자 발현 카세트의 양 옆으로 단지 AAV 145bp 역 말단 반복부만을 보유한 플라스미드로부터 유래된다. 형질도입된 세포 게놈에의 통합으로 인한 효과적인 유전자 전달 및 안정한 트랜스유전자 송달이 이 벡터 시스템의 중요한 특징이다(Wagner 등, Lancet 351:9117 1702-3(1998), Kearns 등, Gene Ther. 9:748-55 (1996)).

복제-결함 재조합 아데노바이러스 벡터(Ad)가 높은 역가에서 생산될 수 있으며, 이들은 많은 상이한 세포 종류를 쉽게 감염시킬 수 있다. 대부분의 아데노바이러스 벡터는 트랜스유전자가 Ad, E1a, E1b 및/또는 E3 유전자를 대체하도록 조작되고, 그 후 이 복제 결함 벡터가 사람 293 세포에서 증식되어 트랜스로 결실된 유전자 기능을 제공한다. Ad 벡터는 생체내에서 간, 신장 및 근육에서 발견되는 것들과 같은 비-분할 분화 세포를 포함하는 많은 종류의 조직을 변환할 수 있다. 종래의 Ad 벡터는 큰 운반 용량을 가진다. 임상시험에서 Ad 벡터의 사용예는 근육내 주입에 의한 항-종양 면역화를 위한 폴리뉴클레오티드 요법을 포함했다(Sterman 등 Hum. Gene Ther. 7:1083-9(1998)). 임상시험에서 유전자 요법을 위한 아데노바이러스 벡터의 추가의 사용예는 Rosenecker 등 Infection 24:1 5-10 (1996); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 9:7, 1083-1089 (1998); Welsh 등, Hum. Gene Ther. 2:205-18 (1995); Alvarez 등, Hum.Gene Ther. 5:597-613(1997); Topf 등 Gene Ther. 5:507-513 (1998); Sterman 등, Hum. Gene Ther. 7:1083-1089 (1998)을 포함한다.

패키징 세포를 사용하여 숙주세포를 감염시킬 수 있는 바이러스 입자를 형성한다. 이러한 세포는 아데노바이러스를 패키지하는 293 세포, 및 레트로바이러스를 패키지하는 Ψ2 세포 또는 PA317 세포를 포함한다. 유전자 요법에 사용된 바이러스 벡터는 통상 바이러스 입자에 핵산 벡터를 패키지하는 생산자 셀라인에 의해 발생된다. 벡터는 전형적으로 패키징과 이어진 숙주(이용가능하다면)로의 통합에 필요한 최소한의 바이러스 서열을 함유하며, 다른 바이러스 서열은 발현될 단백질을 암호화하는 발현 카세트에 의해 대체된다. 바이러스 기능 상실은 패키징 셀라인에 의해 트랜스로 제공된다. 예를 들어, 유전자 요법에 사용된 AAV 벡터는 전형적으로 패키징 및 숙주 게놈으로의 통합에 필요한 AAV 게놈에서 유래한 역 말단 반복부(ITR) 서열만을 지닌다. 바이러스 DNA는 다른 AAV 유전자, 즉 rep와 cap를 암호화하는 헬퍼 플라스미드를 함유하며 ITR 서열을 결여하고 있는 셀라인에 패키지된다. 셀라인은 또한 헬퍼로서 아데노바이러스로 감염된다. 헬퍼 바이러스는 AAV 벡터의 복제 및 헬퍼 플라스미드로부터 AAV 유전자의 발현을 촉진한다. 헬퍼 플라스미드는 ITR 서열의 결여로 인해 유의한 양으로 패키지되지 않는다. 아데노바이러스로의 오염은, 예를 들어 AAV에 비해 아데노바이러스가 더 민감한 열 처리에 의해 감소될 수 있다. 또는, 아데노바이러스 헬퍼 기능은 플라스미드에 의해서 제공될 수도 있다.

많은 유전자 요법 용도에서, 유전자 요법 벡터는 특정 조직 종류에 높은 정도의 특이성으로 송달되는 것이 바람직하다. 따라서, 바이러스 벡터는 바이러스의 외부 표면 상의 바이러스 코팅 단백질과의 융합 단백질로서 리간드를 발현시킴으로써 주어진 세포 종류에 대해 특이성을 갖도록 변형될 수 있다. 리간드는 해당 세포 종류 상에 존재하는 기지의 수용체에 대해 친화성을 갖도록 선택된다. 예를 들어, Han 등, Proc. Natl Acad. Sd. USA 92:9747-9751(1995)에 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스가 gp70에 융합된 사람 heregulin을 발현하도록 변형될 수 있으며, 이 재조합 바이러스가 사람 상피 성장인자 수용체를 발현하는 어떤 사람 유방암 세포를 감염시킬 수 있음이 보고되었다. 이 원리는, 표적 세포는 수용체를 발현하고, 바이러스는 세포-표면 수용체에 대한 리간드를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 다른 바이러스-표적 세포 쌍까지 확장될 수 있다. 예를 들어, 실 모양 파지는 실제로 어떤 선택된 세포 수용체에 대해 특이적 결합 친화성을 갖는 항체 단편(예를 들어, Fab 또는 Fv)을 나타내도록 조작될 수 있다. 상기 설명은 주로 바이러스 벡터에 적용되지만, 동일한 원리가 비-바이러스 벡터에도 적용될 수 있다. 그러한 벡터는 특이적 표적 세포에 의한 흡수를 선호하는 특이적 흡수 서열을 함유하도록 조작될 수 있다.

유전자 요법 벡터는 각 환자에게의 투여에 의해, 전형적으로는 전신 투여(예를 들어, 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 또는 두개내 주입) 또는 국소 적용에 의해 생체내 송달될 수 있으며, 이것은 이후 설명된다. 또는 달리, 벡터는 각 환자로부터 외식된 세포(예를 들어, 림프구, 골수 흡인물, 조직생검편) 또는 보편적 제공자의 조혈줄기세포와 같은 생체외 세포로 송달될 수 있으며, 그 후 벡터가 통합된 세포를 선택한 후, 환자에게 세포를 재이식한다.

진단학, 연구, 또는 유전자 요법(예를 들어, 숙주 유기체에 트랜스펙트된 세포의 재주입에 의한)을 위한 생체외 세포 트랜스펙션은 당업자에게 잘 공지되어 있다. 한 구체예에서, 세포가 해당 유기체로부터 분리되고, 핵산(유전자 또는 cDNA)으로 트랜스펙트되고, 해당 유기체(예를 들어, 환자)에 다시 재주입된다. 생체외 트랜스펙션에 적합한 다양한 세포 종류가 당업자에게 잘 공지되어 있다(예를 들어, Freshney 등 Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique(제3판, 1994)을 참조하며, 거기에 인용된 참고문헌들은 환자로부터 어떻게 세포를 분리하고 배양하는지에 대해 논의하고 있다).

한 구체예에서, 줄기세포가 세포 트랜스펙션 및 유전자 요법을 위한 생체외 과정에 사용된다. 줄기세포를 사용하는 것의 이점은 이들이 시험관내에서 다른 세포 종류로 분화될 수 있거나, 또는 이들이 골수에 이식될 경우 포유동물(세포의 제공자 같은)로 도입될 수 있다는 점이다. GM-CSF, IFN-γ 및 TNF-α와 같은 시토카인을 이용하여 CD34+ 세포를 임상적으로 중요한 면역세포 종류로 시험관내 분화시키는 방법이 공지되어 있다(Inaba 등, J. Exp. Med. 176:1693-1702(1992) 참조).

줄기세포는 공지된 방법을 사용하여 형질도입 및 분화를 위해 분리된다. 예를 들어, 줄기세포는 CD4+ 및 CD8+(T 세포), CD45+(panB 세포), GR-1(과립구), 및 Iad(분화된 항원 제시 세포)와 같은 원치 않는 세포와 결합하는 항체로 골수세포를 가려냄으로써 골수세포로부터 분리된다(Inaba 등, J.Exp.Med. 176:1693-1702(1992) 참조).

또한, 치료 핵산을 함유하는 벡터(예를 들어, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 리포솜 등)가 세포의 생체내 형질도입을 위해 유기체에 직접 투여될 수 있다. 또는 달리, 네이키드 DNA가 투여될 수 있다. 투여는 분자를 도입하여 혈액세포 또는 조직세포와 궁극적으로 접촉시키기 위해 통상 사용되는 경로 중 어느 것에 의해서이며, 제한은 없지만, 주사, 주입, 국소 적용 및 전기천공을 포함한다. 이러한 핵산을 투여하는 적합한 방법을 이용할 수 있고, 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 한 가지 이상의 경로를 사용하여 특정 조성물을 투여할 수 있고, 특정 경로는 주로 다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있는 경로이다.

제약학적으로 허용되는 담체는 부분적으로 투여될 특정 조성물에 의해, 그리고 조성물을 투여하는데 사용된 특정 방법에 의해 결정된다. 따라서, 제약학적 조성물의 광범위한 적합한 제제가 이용될 수 있으며, 이들은 이후 설명된다(예를 들어, Remington's Pharmaceutical Sciences, 제17판, 1989 참조).

DNA 구성물이 종래의 다양한 기술에 의해 원하는 식물 숙주의 게놈에 도입될 수 있다. 그러한 기술에 대한 고찰은, 예를 들어 Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology(1988, Academic Press, N. Y.) Section VIII, pp. 421-463; 및 Grierson & Corey, Plant Molecular Biology(1988, 제2판), Blackie, London, Ch. 7-9를 참조한다. 예를 들어, DNA 구성물은 식물세포 원형질체의 전기천공 및 미소주입과 같은 기술을 사용하여 식물세포의 게놈 DNA로 직접 도입될 수 있거나, 또는 DNA 구성물은 DNA 입자 충격과 같은 바이오리스틱법을 사용하여 식물조직에 직접 도입될 수 있다(예를 들어, Klein 등(1987) Nature 327:70-73 참조). 또는 달리, DNA 구성물은 적합한 T-DNA 측면영역과 조합되어 종래의 Agrobacterium tumefaciens 숙주 벡터로 도입될 수 있다. 무력화 및 바이너리 벡터의 사용을 포함하는 종래의 Agrobacterium tumefaciens-매개 형질전환 기술이 과학문헌에 잘 설명된다. 예를 들어, Horsch 등 (1984) Science 233:496-498, 및 Fraley 등 (1983) Proc.Nat'l.Acad.Sci USA 80:4803를 참조한다. 바이너리 T-DNA 벡터(Bevan (1984) Nuc.Acid Res.12:8711-8721) 또는 공-배양 과정(Horsch 등(1985) Science 227:1229 -1231)을 사용함으로써 식물세포가 박테리아에 의해 감염되었을 때, Agrobacterium tumefaciens 숙주의 균력 기능은 DNA 구성물 및 인접 마커가 식물세포 DNA로 삽입되는 것을 지시할 것이다. 일반적으로, Agrobacterium 형질전환 시스템은 쌍떡잎식물을 조작하기 위해 사용된다(Bevan 등(1982) Ann.Rev.Genet 16:357-384; Rogers 등 (1986) Methods Enzymol. 118:627-641). 또한, Agrobacterium 형질전환 시스템은 DNA를 형질전환할 뿐만 아니라, DNA를 외떡잎식물 또는 식물세포로 전달하기도 한다. Hernalsteen 등 (1984) EMBO. J. 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren 등 (1984) Nature 311:763-764; Grimsley 등 (1987) Nature 325:1677-179; Boulton 등 (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40; 및 Gould 등(1991) Plant Physiol. 95:426-434 참조.

다른 유전자 전달 및 형질전환 방법은, 제한은 없지만, 네이키드 DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-, 또는 전기천공-매개 흡수를 통한 원형질체 형질전환 (Paszkowski 등(1984) EMBO J 3:2717-2722, Potrykus 등(1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm 등(1985) Proc.Nat.Acad.Sci USA 82:5824-5828; 및 Shimamoto (1989) Nature 338:274-276 참조), 및 식물조직의 전기천공(D'Halluin 등, (1992) Plant Cell 4:1495-1505)을 포함한다. 식물세포 형질전환의 추가의 방법은 미소주입, 탄화규소 매개 DNA 흡수(Kaeppler 등 (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418), 및 유전자총 충격(Klein 등 (1988) Proc. Nat. Acad. Sci USA 85:4305-4309; 및 Gordon-Kamm 등 (1990) Plant Cell 2:603-618 참조)을 포함한다.

상기 형질전환 기술 중 어느 것에 의해 생산된 형질전환된 식물세포를 배양하여 형질전환 유전자형과 그에 따른 바람직한 표현형을 지닌 전체 식물을 다시 만들 수 있다. 그러한 재생 기술은 조직배양 성장배지 중에서 어떤 식물성장 호르몬의 조작에 의존하며, 전형적으로는 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생물제 및/또는 제초 마커에 의존한다. 배양된 원형질체로부터 식물의 재생은 Evans 등 "Protoplasts Isolation and Culture" in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985에 설명된다. 또한, 재생은 식물 유합조직, 외식편, 기관, 화분, 배 또는 이들의 부분으로부터 얻어질 수도 있다. 이러한 재생 기술은 일반적으로 Klee 등(1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486에 설명된다.

식물세포에 도입된 핵산을 이용하여 본질적으로 어떤 식물에 대한 원하는 특질을 부여할 수 있다. 광범위한 식물 및 식물세포 시스템이 본 명세서의 핵산 구성물 및 상기 언급된 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본원에 설명된 원하는 생리학적 및 작물학적 특성을 위해 조작될 수 있다. 어떤 구체예에서, 조작을 위한 표적 식물 및 식물세포는, 제한은 없지만, 외떡잎식물 및 쌍떡잎식물, 예를 들어 농작물(예를 들어, 밀, 옥수수, 벼, 기장, 보리), 과일 작물(예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 목초 작물(예를 들어, 알팔파), 구근채소 작물(예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 잎채소 작물(예를 들어, 상추, 시금치)를 포함하는 작물; 현화 식물(예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무류(예를 들어, 소나무, 전나무, 가문비나무); 식물학적 오염토양 정화방법에 사용되는 식물(예를 들어, 중금속 축적 식물); 유료 작물(예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험 목적으로 사용되는 식물(예를 들어, Arabidopsis(애기장대))를 포함한다. 따라서, 개시된 방법 및 조성물은, 제한은 없지만, 아스파라거스속, 아베나속, 브라시카속, 시트러스속, 시트룰러스속, 캡시쿰속, 쿠쿠르비타속, 다우쿠스속, 글리신속, 호르데움속, 락투카속, 리코페르시콘속, 말루스속, 마니호트속, 니코티아나속, 오리자속, 페르세아속, 피슘속, 피루스속, 프루누스속, 랍하누스속, 세칼레속, 솔라눔속, 소르훔속, 트리티쿰속, 비티스속, 비그나속 및 제아속으로부터의 종들을 포함하는, 광범위한 식물에 걸쳐 사용된다.

발현 카세트가 트랜스젠 식물에 안정하게 통합되어 작동가능한 것을 확인한 후, 그것이 자웅교배에 의해 다른 식물로 도입될 수 있다는 것을 당업자는 인정할 것이다. 많은 표준 품종개량 기술 중 어느 것이 교배될 종에 따라서 사용될 수 있다.

형질전환된 식물세포, 유합조직, 조직 또는 식물은 형질전환 DNA 상에 나타난 마커 유전자에 의해 암호화된 특질에 맞도록 조작된 식물 물질을 선택 또는 스크리닝함으로써 확인 및 분리될 수 있다. 예를 들어, 선택은 형질전환 유전자 구성물이 내성을 부여하는 항생제 또는 제초제의 저해량을 함유하는 배지에서 조작된 식물 물질을 성장시킴으로써 수행될 수 있다. 더 나아가, 형질전환된 식물 및 식물세포는 또한 재조합 핵산 구성물 상에 나타날 수 있는 어떤 보이는 마커 유전자(예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, B 또는 C1 유전자)의 활성을 스크리닝함으로써 확인될 수 있다. 이러한 선택 및 스크리닝 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.

또한, 물리적 및 생화학적 방법을 사용하여 삽입된 유전자 구성물을 함유하는 식물 또는 식물세포 형질전환체를 확인할 수 있다. 이들 방법은, 제한은 없지 만 다음을 포함한다: 1) 재조합 DNA 삽입체의 구조를 검출 및 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구성물의 RNA 전사체를 검출 및 시험하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-확장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소분석, 여기서 이러한 유전자 산물은 유전자 구성물에 의해 암호화된다; 4) 단백질 겔 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전, 또는 효소-연결 면역분석, 여기서 유전자 구성물 산물은 단백질이다. 또한, 인시튜 혼성화, 효소염색, 및 면역염색과 같은 추가의 기술을 사용하여 특정 식물 기관 및 조직에서 재조합 구성물의 존재나 발현을 검출할 수 있다. 이들 모든 분석을 행하는 방법은 당업자에게 잘 공지되어 있다.

본원에 개시된 방법을 사용한 유전자 조작 효과는, 예를 들어 해당 조직으로부터 분리된 RNA(예를 들어, mRNA)의 노던 블롯에 의해 관찰될 수 있다. 전형적으로, mRNA의 양이 증가한다면, 상응하는 내인성 유전자가 이전보다 더 큰 비율로 발현된 것이라고 가정할 수 있다. 유전자 활성을 측정하는 다른 방법이 사용될 수도 있다. 사용된 기질 및 반응 산물이나 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라 상이한 종류의 효소분석이 사용될 수 있다. 게다가, 발현된 단백질 수준이 면역화학적으로, 즉 ELISA, RIA, EIA 및 당업자에게 잘 알려진 다른 항체 기반 분석, 예를 들어 전기영동 검출 분석(염색 또는 웨스턴 블롯팅)에 의해서 측정될 수 있다. 트랜스유전자가 식물의 어떤 조직에서 또는 어떤 발생 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스유전자는 실질적으로 모든 식물 조직에서, 실질적으로 그것의 전체 라이프 사이클을 따라 발현될 수 있다. 그러나, 어떤 조합발현 방식도 적용가능하다.

또한, 본 명세서는 상기 설명된 트랜스젠 식물의 종자를 포함하는데, 여기서 이 종자는 트랜스유전자 또는 유전자 구성물을 가진다. 더욱이, 본 명세서는 상기 설명된 트랜스젠 식물의 자손, 클론, 셀라인, 또는 세포를 포함하며, 여기서 상기 자손, 클론, 셀라인, 또는 세포는 트랜스유전자 또는 유전자 구성물을 포함한다.

송달 부형제

융합 단백질과 같은 폴리펩티드 화합물의 투여에 있어서 중요한 요인은 폴리펩티드가 세포 원형질막, 또는 핵과 같은 세포내 격막을 가로질러 가는 능력을 가지도록 확보하는 것이다. 세포막은 지질-단백질 이중층으로 이루어지며, 작은 비이온성 친지질성 화합물은 이것을 자유롭게 투과할 수 있고, 극성 화합물, 거대분자 및 치료제 또는 진단제는 본래 투과하지 못한다. 그러나, 단백질 및 리포솜 같은 다른 화합물은 폴리펩티드를 세포막을 가로질러 전위시키는 능력을 가진다고 설명되었다.

예를 들어, "막 전위 폴리펩티드"는 막-전위 운반체로서 작용하는 능력을 가진 양쪽성 또는 소수성 아미노산 부분서열을 가진다. 한 구체예에서, 호메오도메인 단백질이 세포막을 가로질러 전위시키는 능력을 가진다. 호메오도메인 단백질의 가장 짧은 내재 펩티드인 Antennapedia는 아미노산 위치 43 내지 58에서 단백질의 제 3 나선을 형성하는 것으로 밝혀졌다(예를 들어 Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6:629-634(1996) 참조). 또 다른 부분서열인 신호 펩티드의 h(소수성)도메인는 유사한 세포막 전위 특성을 가지는 것으로 밝혀졌다(예를 들어, Lin 등, J. Biol. Chem. 270:1 4255-14258 (1995) 참조).

세포에의 단백질 흡수를 촉진하기 위해 단백질에 연결될 수 있는 펩티드 서열의 예는, 제한은 없지만, HIV의 tat 단백질의 11개 아미노산 펩티드; p16 단백질 아미노산 84-103에 상응하는 20개 잔기 펩티드 서열(Fahraeus 등, Current Biology 6:84(1996)); Antennapedia의 긴 60개 아미노산 호메오도메인의 제 3 나선(Derossi 등, J. Biol. Chem. 269:10444(1994)); Kaposi 섬유아세포 성장인자(K-FGF) h 영역과 같은 신호 펩티드 h 영역(Lin 등, 상동); 또는 HSV의 VP22 전위 도메인(Elliot & O'Hare, Cell 88:223-233 (1997))을 포함한다. 또한, 증진된 세포 흡수를 제공하는 다른 적합한 화학적 부분이 ZFP에 화학적으로 연결될 수 있다. 막 전위 도메인(즉, 내재 도메인)은 또 무작위 펩티드 서열 라이브러리로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, Yeh 등 (2003) Molecular Tlierapy 7(5):S461, 요약 #1191 참조.

또한, 독소분자가 세포막을 가로질러 폴리펩티드를 수송하는 능력을 가진다. 대체로, 이러한 분자("바이너리 독소"라고 한다)는 적어도 2개 부분, 즉 전위/결합 도메인 또는 폴리펩티드와 별개의 독소 도메인 또는 폴리펩티드로 이루어진다. 전형적으로, 전위 도메인 또는 폴리펩티드가 세포 수용체와 결합한 다음, 독소가 세포로 수송된다. Clostridium perfringens 미량 독소, 디프테리아 독소(DT), 슈도모나스 엑소독소 A(PE), 백일해 독소(PT), Bacillus anthracis 독소, 및 백일해 아데닐화 시클라제(CYA)를 포함하는 몇몇 박테리아 독소가 내부 또는 아미노-말단 융합체로서 세포 시토졸로 펩티드를 송달하는데 사용되었다(Arora 등 J. Biol. Chem. 268:3334-3341(1993); Perelle 등, Infect. Immun., 61:5147-5156(1993); Stenmark 등, J. Cell Biol. 113:1025-1032(1991); Donnelly 등, PNAS 90:3530-3534 (1993); Carbonetti 등, Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295 (1995); Sebo 등, Infect. Immun. 63:3851-3857 (1995); Klimpel 등, PNAS U.S.A. 89:10277-10281 (1992); 및 Novak 등, J. Biol. Chem. 267:17186-17193 1992)).

이러한 펩티드 서열을 이용하여 ZFP 및 다른 종류의 융합 단백질이 세포막을 가로질러 전위될 수 있다. 폴리펩티드 서열이 이러한 전위 서열과 편리하게 융합되거나 또는 전위 서열로 유도체화된다. 전형적으로, 전위 서열은 융합 단백질의 부분으로서 제공된다. 선택적으로, 링커를 이용해 전위 서열과 융합 단백질의 나머지 부분을 연결할 수 있다. 어떤 적합한 링커, 예를 들어 펩티드 링커가 사용될 수 있다. 상동 참조.

또한, 융합 단백질은 리포솜 또는 면역리포솜과 같은 리포솜 유도체에 의해 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포로 도입될 수 있다. 용어 "리포솜"은 하나 이상의 동심 정렬된 지질 이중층으로 이루어진 부형제를 말하는데, 이것은 수성상을 감싸고 있다. 수성상은 전형적으로 세포로 송달되는 화합물, 예를 들어 degron 도메인과 ZFP DNA-결합 도메인을 포함하는 융합 단백질을 함유한다.

리포솜은 원형질막과 융합함으로써 시토졸로 단백질을 방출한다. 또는, 리포솜은 수송 부형제에 있는 세포에 의해 포식되거나 흡수된다. 엔도솜 또는 파고솜에서 일단 리포솜이 분해되거나 수송 부형제의 막과 융합하여 그 내용물을 방출한다.

현재의 리포솜에 의한 약물 송달 방법에서, 리포솜은 궁극적으로 투과성이며 감싸고 있는 화합물(이 경우에는 융합 단백질)을 표적 조직 또는 세포에 방출한다. 전신적 또는 조직 특이적 송달에 있어서, 이것은, 예를 들어 체내의 다양한 제제의 작용을 통해 리포솜 이중층이 시간 경과에 따라 분해하는 피동적 방식으로 달성될 수 있다. 또는 달리, 활성 약물 방출은 리포솜 부형제의 투과성 변화를 유도하는 제제의 사용을 포함한다. 리포솜 막은 리포솜 막 근처의 환경이 산성화될 때 불안정화되도록 구성될 수 있다(예를 들어, PNAS 84:7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989) 참조). 예를 들어, 리포솜이 표적 세포에 의해 세포내 이입될 때, 이들은 불안정화되어 그 내용물을 방출한다. 이런 불안정화를 푸소지네시스(fusogenesis)라고 한다. 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE)가 많은 "푸소젠" 시스템의 기초를 이룬다.

이러한 리포솜은 전형적으로 단백질 및 지질 성분, 예를 들어 중성 및/또는 양이온성 지질을 포함하며, 선택적으로 정해진 세포 표면 수용체 또는 리간드(예를 들어, 항원)과 결합하는 항체와 같은 수용체-인식 분자를 포함한다. 리포솜을 제조하기 위한 다양한 방법이 이용가능하며, 예를 들어 Szoka 등 Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467(1980), 미국특허 No. 4,186,183, 4,217,344, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,235,871, 4,261,975, 4,485,054, 4,501,728, 4,774,085, 4,837,028, 4,946,787, PCT 공보 No. WO 91/17424, Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629-634(1976); Fraley, 등 PNAS 76:3348-3352(1979); Hope 등 Biochim. Biophys. Acta 812:55-65(1985); Mayer 등 Biochim. Biophys. Acta 858:161-168(1986); Williams 등 PNAS 85:242-246(1988); Liposomes (Ostro(ed.) 1983 Chapter 1); Hope 등 Chem.Phys.Lip. 40:89(1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) 및 Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993))에 설명된다. 적합한 방법은, 예를 들어 초음파처리, 추출, 고압/균일화, 미세유동화, 계면활성제 투석, 작은 리포솜 부형제들의 칼슘-유도 융합 및 에테르-융합법을 포함하며, 이들 모두는 당업자에게 공지되어 있다. ㅇ

어떤 구체예에서, 특정 세포 종류, 조직 등에 특이적인 표적화 부분을 이용하여 리포솜을 표적화하는 것이 바람직하다. 다양한 표적화 부분(예를 들어, 리간드, 수용체 및 모노클론 항체)를 이용한 리포솜의 표적화가 설명되었다. 예를 들어, 미국특허 No. 4,957,773 및 4,603,044 참조.

표적화 부분의 예는 전립선암 특이적 항원 및 MAGE와 같은 신생물과 연관된 항원에 특이적인 모노클론 항체를 포함한다. 또한, 종양은 ras 또는 c-erbB2와 같은 종양유전자의 활성화 또는 과발현으로 생긴 유전자 산물을 검출함으로써 표적화될 수 있다. 게다가, 많은 종양은 알파페토프로테인(AFP) 및 암배아 항원(CEA)와 같은, 태아 조직에 의해 정상적으로 발현되는 항원을 발현한다. 바이러스 감염 부위가 다양한 바이러스 항원, 예를 들어 B형 간염 중심 및 표면 항원(HBVc, HBVs), C형 간염 항원, 엡스타인-바르 바이러스 항원, 사람 면역결핍 1형 바이러스(HIV1) 및 유두종 바이러스 항원을 사용하여 표적화될 수 있다. 염증은 인테그린(예를 들어, VCAM-1), 셀렉틴 수용체(예를 들어, ELAM-1) 등과 같은 염증 부위에서 발현되는 표면 분자에 의해 특이적으로 인식되는 분자를 사용하여 검출될 수 있다.

표적화 제제와 리포솜을 결합시키는 표준 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로 지질 성분, 예를 들어 포스파티딜에탄올아민의 리포솜으로의 통합을 포함하며, 이것이 표적화 제제의 부착을 위해 활성화되거나, 또는 지질 유도체화 블레오마이신 같은 친지질 화합물로 유도체화된다. 항체 표적화 리포솜은, 예를 들어 단백질 A에 통합되는 리포솜을 사용하여 구성될 수 있다(Renneisen 등, J. Biol. Chem., 265:16337-16342(1990) 및 Leonetti 등, PNAS 87:2448-2451(1990) 참조).

용량

치료 용도를 위해서, 본 명세서와 관련하여 환자에게 투여되는 용량은 시간의 경과에 따라 환자에게서 유리한 치료 반응을 행하는데 충분해야 한다. 게다가, 특정 용량 섭생은 실험 세팅에서, 예를 들어 기능 게놈 연구에서, 그리고 세포 또는 동물 모델에서 표현형적 변화를 측정하는데 유용할 수 있다. 용량은 사용된 특정 ZFP의 효능 및 K_d, 표적 세포의 핵 부피 및 환자의 상태, 뿐만 아니라 치료될 환자의 체중 및 표면적에 의해 결정될 것이다. 또한, 용량의 크기는 특정 환자에 특정 화합물 또는 벡터의 투여에 동반되는 어떤 부작용의 존재, 성질 및 범위에 의해 결정될 것이다.

예로서, 표적 부위와 약 99% 결합을 위한 최대 치료적 유효량의 ZFP는 세포 당 특정 ZFP 분자의 약 1.5x10⁵ 내지 1.5x10⁶ 카피 미만의 범위에 있도록 계산된다. 이 결합 수준을 위한 세포 당 ZFP 수는 HeLa 세포 핵 부피(약 1000㎛³ 또는 10¹²L; Cell Biology(Altman & Katz, (1976))를 사용하여 다음과 같이 계산된다. HeLa 핵이 상대적으로 커짐에 따라, 표적 세포 핵의 부피를 사용할 필요에 따라서 이 용량 값은 다시 계산된다. 또한, 이 계산은 다른 부위에 의한 ZFP 결합 경쟁을 고려하지 않는다. 또한, 이 계산은 본질적으로 모든 ZFP가 핵에 국지화된다고 가정한다. 100xK_d 값을 사용하여 표적 부위와의 약 99% 결합을 계산하고, 10xK_d 값을 사용하여 표적 부위와의 약 90% 결합을 계산한다. 이 예에서 K_d = 25nM이다.

ZFP + 표적 부위 ↔ 복합체

즉, DNA + 단백질 ↔ DNA:단백질 복합체

Kd = [DNA][단백질]/[DNA:단백질 복합체]

ZFP의 50%가 결합될 때, K_d = [단백질]

그래서, [단백질] = 25nM이고, 핵 부피가 10^-12L일 때

[단백질] = (25x10⁹moles/L)(10^-12L/핵)(6x10²³분자/mole)

= 15,000 분자/핵, 50% 결합에 대해

99% 표적이 결합될 때; 100xK_d = [단백질]

100xK_d = [단백질] = 2.5μM

(2.5x10⁶moles/L)(10^-12L/핵)(6x10²³분자/mole)

= 핵 당 약 1,500,000 분자, 표적 부위의 99% 결합에 대해

또한, ZFP 융합 단백질을 암호화하는 발현 벡터의 적합한 용량이 프로모터로부터의 평균 ZFP 발현 비율 및 세포에서 ZFP의 평균 분해 비율을 고려하여 계산될 수 있다. 한 구체예에서, 야생형 또는 돌연변이 HSV TK 프로모터 같은 약한 프로모터가 상기 설명된 대로 사용된다. 미생물에서 융합 단백질의 용량은 사용된 특정 단백질의 분자량을 고려하여 계산된다.

질환의 치료 또는 예방에서 투여될 단백질의 유효량을 결정하는데 있어서, 치료자는 단백질 또는 단백질을 암호화하는 핵산의 순환 혈장 수준, 단백질로 인한 잠재적 독성, 질환의 진행, 및 단백질에 대한 항체 생성을 평가한다. 투여는 단일 용량 또는 분리된 용량에 의해 달성될 수 있다.

제약학적 조성물 및 투여

융합 단백질 및 이러한 단백질을 암호화하는 발현 벡터는, 표적화된 유전자 조절, 표적화된 DNA 절단 및/또는 조합, 그리고 예를 들어 암, 허혈, 당뇨병, 망막병증, 반상변성, 류마티스 관절염, 건선, HIV 감염, 낫적혈구 빈혈증, 알쯔하이머병, 근위축증, 신경변성질환, 혈관질환, 낭성섬유증, 뇌졸중 등의 치료 또는 예방 용도를 위해 환자에게 직접 투여될 수 있다. ZFP 유전자 요법에 의해 저해될 수 있는 미생물의 예는 병원성 박테리아, 예를 들어 클라디미아, 리케차 박테리아, 미코박테리아, 스타필로코시, 스트렙토코시, 뉴모코시, 메닌고코시 및 코노코시, 클레브시엘라, 프로테우스, 세라티아, 슈도모나스, 레지오넬라, 디프테리아, 살모넬라, 바실리, 콜레라, 테타누스, 보툴리즘, 안트락스, 플라그, 렙토스피로시스, 및 라임 질환 박테리아; 감염성 진균, 예를 들어, 아스페르길루스, 칸디다 종; 원생동물, 예를 들어 종충(예를 들어, 플라스모디아), 근족충(예를 들어, 엔타모에바) 및 편모충(트립파노소마, 레이슈마니아, 트리코모나스, 가르디아 등); 바이러스 질환, 예를 들어 간염(A, B 또는 C형), 헤르페스 바이러스(예를 들어 VZV, HSV-1, HSV-6, HSV-II, CMV, 및 EBV), HIV, 에볼라, 아데노바이러스, 인플루엔자 바이러스, 플라비바이러스, 에코바이러스, 리노바이러스, 콕사키 바이러스, 코로나바이러스, 호흡기 합포체 바이러스, 이하선염 바이러스, 로타바이러스, 홍역 바이러스, 풍진 바이러스, 파보바이러스, 우두 바이러스, HTLV 바이러스, 뎅그열 바이러스, 유두종 바이러스, 소아마비 바이러스, 광견병 바이러스 및 아르보바이러스 뇌염 바이러스 등을 포함한다.

치료적 유효량의 투여는 단백질 또는 핵산을 도입하여 치료될 조직과 궁극적으로 접촉하도록 하는데 통상 사용되는 경로들 중 어느 것에 의해 달성된다. 융합 단백질 또는 암호화 핵산은, 바람직하게는 제약학적으로 허용되는 담체와 함께 어떤 적합한 방식으로 투여된다. 이러한 조정인자를 투여하는 적합한 방법이 이용가능하고, 이들은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 한 가지 이상의 경로를 사용하여 특정 조성물을 투여할 수 있고, 특정 경로란 주로 다른 경로보다도 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공할 수 있는 경로이다.

제약학적으로 허용되는 담체는 투여될 특정 조성물에 의해서 부분적으로 결정되며, 뿐만 아리나 조성물을 투여하는데 사용된 특정 방법에 의해서도 결정된다. 따라서, 제약학적 조성물에 대한 광범위한 적합한 제제가 이용가능하다(예를 들어, Remington 's Pharmaceutical Sciences, 제17판, 1985 참조).

융합 단백질 또는 그 암호화 핵산은 단독으로 또는 다른 적합한 성분과 조합하여, 흡입에 의해 투여되는 에어로졸 제제로 만들어질 수 있다(즉, 이들은 "분무"될 수 있다). 에어로졸 제제는, 디클로로디플루오로메탄, 프로판, 질소 등과 같은 압력이 가해지는 허용되는 추진제에 넣어질 수 있다.

예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내 및 피하 경로에 의한 것과 같은 비경구 투여에 적합한 제제는, 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제제를 수용자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비-수성 등장 멸균 주사액, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비-수성 멸균 현탁액을 포함한다. 개시된 조성물은, 예를 들어 정맥내 주입, 경구, 국소, 복강내, 방광내 또는 경막내 경로에 의해 투여될 수 있다. 화합물의 제제는 단위-용량 또는 다수-용량 밀봉 용기, 예를 들어 앰풀 및 바이알에 존재할 수 있다. 주사액 및 현탁액은 멸균 분말, 과립, 및 이전에 설명된 종류의 정제로부터 제조될 수 있다.

용도

개시된 단백질은 또한 시험관내 사용될 수 있다. 예를 들어, 조작된 ZFP(또는 전사/번역 세포용해물)는 폴리뉴클레오티드(예를 들어, 플라스미드)와 함께 시험관내 단백질 생산을 위한 결합된 전사/번역 시스템에서 인큐베이션될 수 있다.

추가의 구체예에서, 조작된 ZFP의 표적 부위는 내인성 또는 외인성 코딩 서열의 한쪽에 있을 수 있다. 이 상황에서, 조작된 ZFP(선택적으로, 예를 들어 인슐레이터 도메인과 융합된; 예를 들어, WO 01/02553; WO 02/44376 참조)의 표적 부위와의 결합은, 예를 들어 위치 효과 및 이염색질 형성의 영향으로부터 코딩 서열을 보호할 수 있다.

개시된 방법은 현존하는 방법(예를 들어, 디히드로폴레이트 환원효소 유전자에 인접한 서열의 증폭을 위한 메토트렉세이트-기초 선택)과 함께 사용될 수 있으며, 이로써 증가된 주형 수 및 더 높은 수준의 전사에 기초한 단백질 발현의 증가된 수준을 얻을 수 있다.

추가의 구체예에서, 조작된 ZFP의 표적 서열은 다른 전사 조절 분자의 결합 부위에 인접하거나 또는 그것과 중첩하여 도입될 수 있으며, 이로써 조작된 ZFP에 의해 조절이 더 이상 조정될 수 있다. 전사 활성화 도메인 또는 전사 억제 도메인에 융합된 조작된 ZFP가 사용될 수 있으며, 마찬가지로 다른 조절 분자의 결합을 입체적으로 조정할 수 있는 기능 도메인과 융합되지 않은 ZFP도 사용될 수 있다.

단백질 생산을 촉진하는 내인성 유전자의 비활성화

어떤 구체예에서, 하나 이상의 세포 유전자 산물의 기능이 본원에 개시된 방법 및 조성물을 이용하여 생산되는 단백질의 수준 및/또는 양을 증진시키기 위하여 비활성화된다. 유전자 기능은, 예를 들어 유전자 산물을 암호화하는 내인성 세포 유전자의 하나 이상의 대립형질을 파괴함으로써(예를 들어, 유전자 "녹아웃"에 의해), 및/또는 예를 들어 공동 소유의 미국특허 제6,534,261에 설명된 내인성 세포 유전자의 전사를 억제함으로써 비활성화될 수 있다.

내인성 세포 유전자의 파괴는 돌연변이(예를 들어 화학적 또는 방사선-유도)하거나, 또는 세포 게놈으로 외인성 DNA 서열을 삽입하고, 그 후 선택적으로 원하는 돌연변이 세포를 선택함으로써 달성될 수 있다. 외인성 서열의 삽입은 무작위적일 수 있거나(예를 들어 레트로바이러스 감염 또는 세포와 DNA 분자의 접촉에 따른), 또는 표적화될 수도 있다(예를 들어, 미국특허 제5,614,396호). 또, 외인성 서열의 표적화된 삽입은 외인성 DNA의 도입과 함께 게놈 DNA를 표적화 절단함으로써 달성될 수 있다. 본원에 참고자료로 포함되는 공동 소유의 PCT WO 2005/014791 및 미국 가 특허출원 60/702,394(2005년 7월 26일 제출)에 외인성 서열의 표적화된 삽입을 위한 상동성-의존성 및 상동성-독립적 방법을 위한 방법 및 조성물이 각각 설명된다. 게다가, PCT WO 2005/014791에는 표적화 DNA 절단 후 비-상동성 단부-결합에 의해 표적화 돌연변이하는 방법이 개시된다.

예로서, 세포자살(또는 그 기능) 과정에 연루된 하나 이상의 유전자가 비활성화된다. 세포자살에 연루된 전형적인 유전자를 표 1에 나타낸다.

caspase1 caspase2 caspase3 caspase4 caspase5 caspase6 caspase7 caspase8 caspase9 caspase10 caspase11 caspase12 caspase13 caspase14 bax bak bik APAF-1 (아폽토좀 관련 인자 1) c-jun 락테이트 디히드로지나제 시토크롬 c

그 산물이 세포 사이클 진행을 역으로 조절하는 유전자가 비활성화될 수 있다. 세포 사이클의 조절에 연루된 전형적인 유전자를 표 2에 나타낸다.

p16 p19 Rb (망막모세포종 단백질) p53 p73 텔로머라아제

어떤 단백질의 생물활성은 이들의 글리코실화 패턴에 의해 영향받을 수 있기 때문에, 어떤 환경에서는 그 산물이 단백질 글리코실화에 연루되는 어떤 유전자를 비활성화하는 것이 바람직할 수 있다. 글리코실화에 연루되는 전형적인 유전자를 표 3에 나타낸다.

a-1,6-푸코실트랜스페라아제 CMP-N-아세틸뉴라민산 히드록실라아제 CMP-시알산 히드록실라아제 글루코사민-6-포스파타제 이소머라아제

감염에 대한 수용체(예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 수용체)를 암호화하는 유전자가 단백질 생산을 증진시키기 위해 비활성화될 수 있다. 예를 들어, 마우스 미소 바이러스(MVM) 수용체를 암호화하는 유전자가 비활성화될 수 있다.

어떤 경우에, 트랜스유전자를 암호화하는 외인성 DNA 분자와 선택 마커(예를 들어, 통합된 트랜스유전자를 함유하는 세포를 선택하기 위한)를 통합하는 것이 바람직할 수 있다. 만일 선택 마커가 외인성 DNA 분자와 통합되는 것이 바람직한 세포의 게놈에 의해 암호화된다면, 이것은 그 선택 마커를 암호화하는 내인성 유전자를 비활성화하는데 유용할 수 있다. 비활성화는 부분적(감소된 수준의 마커가 생성된다)이거나 또는 완전(마커가 생성되지 않는다)할 수 있다. 그렇게 비활성화될 수 있는 전형적인 마커 유전자를 표 4에 나타낸다.

디히드로폴레이트 환원효소 글루타민 합성효소 히포크산틴 포스포리보실 트랜스페라아제

프로테아제를 암호화하는 유전자가 단백질 생산을 증진시키기 위해서 비활성화될 수 있다. 전형적인 프로테아제를 표 5에 나타낸다.

세린 프로테아제 엘라스타아제 콜라게나아제 플라스미노겐 활성화인자

안정성 및 조절 요건에 대한 순응을 위해서, 프리온(PRP) 및/또는 슈도-프리온을 암호화하는 유전자가 비활성화될 수 있다. 슈도-프리온은, 예를 들어 PRNP/ PRP, 프리온-유사 단백질 Doppel(PRND) 및 셰도우 프리온(SPRN)을 포함한다. 예를 들어, Liao 등(1986) Science 233:364-367 (PRNP); Lu 등 (2000) Biochemistry 39:13575-13583 (PRND) 및 Premzl 등 (2003) Gene 314:89-102 (SPRN) 참조.

항체 분자의 생산에 사용되는 세포에서는, 생산될 항체 또는 항체들에 의해 결합되는 단백질을 암호화하는 유전자를 비활성화하는 것이 유용할 수 있다. 예를 들어, 항체 또는 항체들에 의해 인식되는 항원(들)을 암호화하는 유전자가 본원에 개시된 방법들 중 어느 것에 의해 비활성화될 수 있다. 단백질 수율 및 질에 영향을 미칠 수 있는 추가의 세포 과정은, 예를 들어 복제, 전사, RNA 가공, 번역, 아미노산 생합성, 세포 대사, 단백질 폴딩, 단백질 변성, 단백질 수송, 스트레스 반응 및 플라스미드 카피 수 제어를 포함한다. 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 발현되는 단백질의 수율 및/또는 질을 증진시키기 위하여, 상술된 과정 중 어느 것에 연루된 유전자의 양성 또는 음성 조절(비활성화 또는 유전자 "녹아웃"을 포함하는)이 사용될 수 있음이 이해되어야 한다.

다음의 실시예들은 본 발명을 예시하고자 하는 것이며, 청구된 본 발명의 범위를 제한하지 않는다.

실시예 1

SRα 프로모터의 구성

플라스미드 pRL-SV40(Promega)로부터 PCR에 의해 SV40 조기 프로모터를 생성했으며, 여기에는 pRL-SV40 서열로부터의 염기쌍 80-499가 포함되고, 3' 단부에 이 프로모터의 HindIII 부위가 통합되어 있다. 염기 80-88은 2392/00 및 2392/10 ZFP를 위한 9bp 표적 부위를 포함한다. Bpu10I 제한 부위를 ZFP 결합 부위의 바로 상류에서 PCR 프라이머에 부가하여, 원래 CMV 프로모터가 제거된 백본 벡터 pcDNA3.1 /zeo로의 후속 클로닝을 촉진시켰다.

R-U5 복합 서열을 플라스미드 pDrive01-NSE(r)-RU5vO2(Invivogen)로부터 PCR 에 의해 생성했으며, 여기에는 플라스미드 서열로부터의 염기쌍 1774-2066이 포함되고, 5' 프라이머 결합 부위 내에 HindIII 제한 부위를 포함한다. EcoRI 제한 부위를 3' PCR 프라이머에 부가하여 백본 벡터로의 클로닝을 촉진시켰다.

SV40 및 RU5 서열을 각각의 HindIII 부위에 연결하여 SV40-RU5 융합체를 형성했다. 이 하이브리드 프로모터(SEQ ID NO:9)의 서열을 도 1에 도시하며, ZFP 표적 부위에는 밑줄이 쳐져 있다.

실시예 2

SRα 프로모터에서 표적 부위에 결합하도록 조작한 징크핑거 단백질

코딩 영역이 SRα 프로모터의 제어하에 있는 단백질의 발현을 증가시키기 위해서, 3-핑거 징크핑거 단백질 SBS2392/00을 (공동 소유의 미국특허 제6,453,242호 및 제6,534,261호에 설명된 방법에 따라서) 합성하여 SRα 프로모터에 9개 뉴클레오티드 표적 서열을 결합시켰다. 표적 부위는 서열 GCTGTGGAA(SEQ ID NO:1)이며, 이것은 도 1에 도시된 위치와 같다. 단백질 서열은 다음과 같고, 징크핑거의 인식 영역에 밑줄을 쳤다:

KKKQHICHIQGCGKVYGQRSNLVRHLRWHTGERPFMCTWSYCGKRFTRSDALSRHKRTHTGEKKFACPECPKRFMQSSDLRRHIKTHONK (SEQ ID N0:2).

SEQ ID NO:1과 결합할 수 있는 추가의 징크핑거 도메인을 2-하이브리드 선택 시스템을 이용하여 얻었다. 예를 들어, 미국특허출원 공개 No. 2003/0044787(2003년 3월 6일) 및 Joung 등. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:7382-7287를 참조한다. 이들의 아미노산 서열을 도 6에 도시한다.

이들 징크핑거 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 VP16 활성화 도메인, 핵 국지화 신호(NLS) 및 FLAG 에피토프 택을 암호화하는 뉴클레오티드 서열과 융합하여 조작된 전사인자를 생성했다. 전형적인 폴리뉴클레오티드 서열을 도 3 및 도 5에 도시하며, 이들의 암호화된 아미노산 서열은 도 2 및 도 4에 각각 도시한다.

실시예 3

조작된 징크핑거 단백질에 의한 면역글로불린 유전자의 SRα 프로모터-유도 발현의 증진

SRα 프로모터에 의해 유도된 통합된 항체 발현 구성물을 함유하는 DG44 CHO 셀라인을 VP16 활성화 도메인(NVF), 또는 VP16에 연결된 ZFP 2392/00(SEQ ID NO:2) (2392-VP16)를 암호화하는 플라스미드 20-250ng으로 일시적으로 트랜스펙트했다. 면역글로불린 카파 사슬 mRNA 발현을 실시간 PCR(Taqman

)에 의해 측정했다. 그 결과를 도 7에 나타내며, 이것은 카파 사슬 mRNA의 SRα-유도 전사가 2392/00 전사인자에 의해 4-5배 증가한 것을 나타낸다.

단백질 수준에 대한 2392/00-VP16 융합체의 효과를 측정하기 위한 실험에서, 둘 다 SRα 프로모터에 의해 유도된 발현인 감마 중쇄 및 카파 경쇄를 안정하게 발현하는 두 상이한 DG44 CHO 세포-유래 셀라인(라인 A 및 라인 B)을 VP16 활성화 도메인(NVF) 또는 VP16 활성화 도메인에 연결된 ZFP 2392/00(2392)를 암호화하는 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙트했다. 분비된 면역글로불린 G의 발현을 ELISA로 측정했다. 그 결과를 도 8에 나타내며, 이것은 두 셀라인 모두에서 IgG의 발현이 2392/00 ZFP-VP16 융합체에 의해 증가한 것을 나타낸다.

2392/00-VP16 융합 단백질이 최적화된 발현 시스템에서 발현을 증가시키는지의 여부를 측정하기 위하여, 메토트렉세이트 선택에 의해 얻어진 증폭된 감마 중쇄 및 카파 경쇄 cDNA를 함유하는 셀라인을 이 "고 생산자" 라인(ZFP)의 세포로 도입하고, mRNA 발현 수준을 ZFPR 없는 동일한 세포(NT)와 비교했다. 도 9는 2392/00-VP16 단백질이 세포로 도입되었을 때, 감마 사슬 및 카파 사슬 mRNA 모두에서 최적화 수준이 3배 이상 증가될 수 있음을 나타낸다.

SRα 프로모터의 전사 제어하에, 면역글로불린 G에서 감마 중쇄 및 카파 경쇄 구성요소를 암호화하는 통합된 cDNA를 하는 셀라인을 2392/00-VP16 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙트했다. 트랜스펙트된 세포를 안정한 ZFP 발현에 대해 선택했다. 2392/00-VP16 융합 단백질을 안정하게 발현하는 클론 라인으로부터 선택된 IgG를 ELISA에 의해 측정했다. 그 결과를 도 10에 나타내며, 이로써 대조 비트랜스펙션 세포와 비교하여, 2392/00-VP16 단백질로 안정하에 트랜스펙트된 세포에서 IgG 분비가 약 4배 증가하는 것으로 밝혀졌다.

실시예 4

2392/10- VP16 융합 단백질을 암호화하는 통합 서열을 함유하는 안정한 셀라인의 선택 및 특성

6-웰 플레이트 상에서 유착 성장시킨 중국 햄스터 난소(CHO) DG44 세포를 다음과 같이 2392/10-VP16 융합 단백질을 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙트했다. 세포를 4시간 동안 1mL 혈청-무함유 성장배지에서 1㎍ DNA 및 4㎕ 리포펙타민 2000 과 함께 인큐베이션한 다음, 배지를 흡입하고, 일반 성장배지 2mL를 가했다. 3일 후, 세포를 다양하게 희석하여 25cm 디쉬에 분배하고 Zeocin 선택했다. 선택을 완료했을 때, 각 콜로니를 적합한 희석 평판으로부터 수집하고, 24-웰 디쉬로 옮겨서 성장시켰다. 선택 완료의 기준은 각 세포 콜로니가 출현하는 것과 새로운 세포사가 발생하지 않는 것이었으며, 동일한 시간에서 선택했던 비트랜스펙트 DG44 세포에서는 완전한 세포사가 관찰되었다. 22개의 콜로니 라인을 ZFP 발현, 세포 성장 특성 및 다량체화된 ZFP 결합 부위를 함유하는 리포터 구성물의 활성화에 대해 분석했다.

이들 라인 중 하나를 하위 클로닝했고, 게놈 DNA를 하위 클론 2개로부터 추출했다. DNA를 BamHI 제한 엔도뉴클레아제로 완전히 효소절단했고, 0.9% TAE 아가로스 겔 상에서 재용해시킨 후, Nytran+ 멤브레인으로 옮기고, 멤브레인을 VP16 활성화 도메인을 암호화하는 290bp 방사성 표지된 DNA 단편으로 프로브했다. 이 두 ZFP-함유 셀라인에서 약 12kbp의 단일 밴드가 검출되었는데, 이것은 융합 단백질을 암호화하는 DNA의 단일 카피가 존재함을 시사하는 것이다. 이 밴드는 야생형 DG44 CHO 세포로부터의 DNA에서는 검출되지 않았다.

실시예 5

ZFP - VP16 융합 단백질의 표적 부위의 다수 카피를 함유하는 SRα 프로모터의 구성

"SRαZ6"이라고 표시한 프로모터를 2392/00 및 2392/10 ZFP(SEQ ID NO:1)의 표적 부위의 6개 카피를 함유하는 DNA 단편과 SRα 프로모터-함유 DNA 단편을 결합 시킴으로써 구성했다. 따라서, Z6 프로모터는 SEQ ID NO:1의 7개 카피를 함유한다. 이들 추가의 표적 부위는 이 프로모터의 ZFP-매개 활성화를 훨씬 더 높은 수준으로 이끈다. 아래 참조.

추가의 6개 결합 부위를 함유하는 삽입체를 SRα 프로모터의 SV40 부분의 상류의 제한 부위(아래에 굵은 글씨로 나타냄)를 먼저 삽입한 후 BamHI/NdeI로서 삽입했다. 7번 반복되는 표적 부위에 밑줄을 쳐서 표시한다. NdeI 부위의 하류 표적 부위는 SRα 프로모터의 SV40 부분에 원래 존재하는 부위이다.

ZFP 표적 부위를 함유하는 SRαZ6 프로모터의 부분의 서열은 다음과 같다:

실시예 6

ZFP - VP16 융합 단백질의 표적 부위의 다수 카피를 함유하는 CMV 프로모터의 구성

"CMVz10"이라고 표시한 프로모터를 CMV 프로모터의 바로 상류의 MluI 제한 부위에, 2392/00 및 2392/10 조작된 ZFP의 표적 부위(SEQ ID NO:1)의 다수 카피를 포함하는 DNA 단편을 삽입함으로써 구성했다. CMVz10 프로모터는 9번 완벽히 반복되는 표적 부위에 더하여 10번째의 반복부에 단일 8/9 일치(C에서 T로의 치환)를 함유한다. CMVz10 프로모터의 서열을 아래 나타내며, MluI 제한 부위는 굵게 표시 하고, 표적 부위는 밑줄을 쳐서 표시한다. 이 서열은 역방향으로 삽입되었으므로, 나타낸 서열은 각 결합 부위의 보체를 반영한다는 것을 유념한다.

프로모터에 관하여 상이한 수의 결합 부위 및 상이한 방향을 결합 부위를 포함하는 추가의 프로모터 구성물을 또한 구성하여 시험했다.

실시예 7

ZFP - VP16 융합 단백질의 표적 부위의 다수 카피를 함유하는 SRα 프로모터로부터 증진된 단백질의 생산

안정하게 통합된 2392/10 ZFP(실시예 4)를 함유하는 DG44 CHO 셀라인, 및 모 DG44 세포의 클론 분리주(2392/10-7)를 두 상이한 항체-발현 구성물로 트랜스펙션했다. 하나에서는, 중쇄 및 경쇄 전사 유닛이 각각 SRα 프로모터의 제어하에 있었고(SRa); 나머지 하나에서는, 중쇄 및 경쇄 전사 유닛이 모두 프로모터의 바로 상류에 ZFP의 추가 8개 표적 부위를 함유하는 SRα 프로모터의 제어하에 있었다(SRα2393BS). 트랜스펙션 3일 후 IgG 분비를 ELISA로 측정했다.

그 결과를 도 11에 나타내며, 이것은 IgG 발현 수준이 2392/10 ZFP의 존재에 의존하며, 2392/10 표적 부위의 카피가 많을수록 IgG의 수준이 더욱 높아진다는 것을 나타낸다.

실시예 8

ZFP - VP16 융합 단백질의 표적 부위의 다수 카피를 함유하는 CMV 프로모터로부터의 증진된 전사

CMV 프로모터의 전사 활성에 대한 2392/10-VP16 융합 단백질의 효과를 시험하기 위하여, CMV 프로모터가 녹색 형광 단백질(GFP)를 암호화하는 서열에 작동가능하게 연결된 리포터 구성물을 구성했다. 다음에, 이 리포터 구성물의 변이체를 구성했는데, 이것은 중심 CMV 프로모터 서열의 상류에 2392/10 ZFP의 표적 부위의 다수 카피를 함유했다. 상이한 방향으로 상이한 수의 표적 부위를 함유하는 프로모터를, 이들을 2392/10-7 셀라인으로 트랜스펙션하고, 그 다음 GFP mRNA의 수준을 실시간 PCR(Taqman

)로 분석하여 시험했다. 대표적인 결과를 도 12에 나타낸다. 이 결과는, 표적 부위의 카피가 더 많을수록 정류상태 mRNA 수준이 더 높아지고, 그 효과는 CMV 프로모터 서열의 나머지 부분과 관련한 표적 부위 방향에는 독립적이라는 것을 나타낸다. 2392/10 ZFP를 발현하지 않는 모 셀라인에서는 표적 부위의 수나 방향의 효과가 관찰되지 않았다.

실시예 9

2392/10 표적 부위의 다수 카피를 함유하는 SRα 및 CMV 프로모터로부터 유 래된 2392/10- VP16 융합 단백질에 의해 매개된 , 에리트로포이에틴의 증진된 발현

3개의 상이한 에리트로포이에틴(Epo)-발현 구성물을 구성했다. 제 1 구성물에서 Epo 발현은 β-글로빈인트론과 융합된 CMV 프로모터에 의해 제어되었다(CMV). 제 2 구성물에서 Epo 발현은 β-글로빈 인트론과 융합된, 2392/10 결합 부위의 10 개 상류 카피를 함유하는 CMV 프로모터에 의해 제어되었다(CMVz10, 실시예 6). 제 3 구성물에서 Epo 발현은 프로모터의 바로 상류에 2392/10 결합 부위의 6개 추가 카피를 갖는 SRα 프로모터에 의해 제어되었다(SRαZ6, 실시예 5). 이 3개 구성물을 모 DG44 CHO 세포 또는 ZFP-발현 2392/10-7 셀라인으로 일시적으로 트랜스펙션했다. 24시간 후에 Epo 분비를 ELISA로 측정했다.

그 결과를 도 13에 나타내며,2392/10-VP16 ZFP의 부재하에서는 CMV 프로모터가 SRα 프로모터보다 더 강하다는 이전의 관찰이 확인되었다. 그러나, 2392/10-VP16 단백질에 의한 SRαZ6 프로모터의 활성화는 그 활성을 증가시키며, 이로써 그것은 CMV 프로모터와 비슷하게 된다. 더욱이, CMV 프로모터에 인접한 2392/10 표적 부위의 삽입은 2392/10-VP16-발현 세포에서 이미 강한 그 활성을 3배 더 증가시킨다. 따라서, 가장 강하다고 알려진 자연발생 프로모터의 활성이 조작된 ZFP 전사 활성화인자의 사용에 의해 개선되었다.

본원에서 언급된 모든 특허, 특허출원 및 공보는 그 전문이 참고자료로서 본원에 포함된다.

본 명세서는 명확한 이해를 제공할 목적으로 예시 및 실시예로서 어떤 상세한 설명을 제공하였지만, 다양한 변화 및 변형이 본 명세서의 정신이나 범위를 벗어나지 않고 실시될 수 있다는 것이 당업자에게 인정될 것이다. 따라서, 전술한 설명 및 실시예는 제한으로서 구성되지 않아야 한다.

Claims (18)

1. 세포에서 SEQ ID NO:7을 포함하는 단백질을 발현하는 단계를 포함하며, 이 단백질은 표적 부위와 결합하고, 표적 부위는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 세포에서 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 표적 부위는 SEQ ID NO:1을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 복수의 표적 부위가 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 1 항에 있어서, 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 1 항에 있어서, 단백질은 또한 전사 활성화 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서, 전사 활성화 도메인은 VP16 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 세포에서 SEQ ID NO:7을 포함하는 단백질을 발현하는 단계를 포함하며, 이 단백질은 표적 부위와 결합하고, 표적 부위는 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는, 세포에서 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열의 전사를 조절하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 표적 부위는 SEQ ID NO:1을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제 8 항에 있어서, 복수의 표적 부위가 제 1 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제 8 항에 있어서, 복수의 표적 부위가 제 2 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 8 항에 있어서, 복수의 표적 부위가 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열 모두에 작동가능하게 연결된 것을 특징으로 하는 방법.
12. 제 7 항에 있어서, 제 1 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 제 7 항에 있어서, 제 2 뉴클레오티드 서열은 cDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
14. 제 7 항에 있어서, 제 1 및 제 2 뉴클레오티드 서열은 모두 cDNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, cDNA 서열은 항체 폴리펩티드를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
16. 제 15 항에 있어서, 제 1 cDNA 서열은 항체 중쇄를 암호화하고, 제 2 cDNA 서열은 항체 경쇄를 암호화하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제 7 항에 있어서, 단백질은 또한 전사 활성화 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 전사 활성화 도메인은 VP16 도메인인 것을 특징으로 하는 방법.

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