CN111511199A - 改良蓝色糊粉及其他分离系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及形成并保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物品系的材料及方法，其包括例如但不限于使用蓝色糊粉(BLA)系统。

Description

改良蓝色糊粉及其他分离系统
背景技术
1、技术领域
本发明涉及形成并保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物品系的材料及方法，其包括例如但不限于使用蓝色糊粉(BLA)系统。
2、背景及相关技术
雄性不育雌性亲本的产生对于任何杂交系统都是必不可少的。来自太平洋种子私人有限公司(Pacific Seeds Pty.Ltd.)的WO 92/01366 A1公开了一种允许保持雄性不育的雄性不育系统，其可用于生产杂交谷类植物、尤其是杂交小麦植物(图1B)。可通过在小麦中的染色体4B的短臂上拥有纯合缺失来实现雄性不育。通常使用的缺失是众所周知的‘Probus’缺失(Fossati A、Ingold M.1970，普通小麦中的雄性不育突变体，Wheat InformServ 30：8–10)。近来，位于缺失所涉及的区域中的ms1基因已经被识别为致病基因。如果此基因在物理上缺失或者通过突变或定向修饰来敲除/敲低(例如WO 2016/048891 A1，其整体内容并入本文中以用于所有预期目的)，则可以建立可靠的雄性不育。当纯合地携带缺失或突变/修饰的小麦品系与任何正常的小麦杂交时，则可以容易地恢复可育性。所得后代或杂交植物是可育的，因为缺失或突变/修饰仅以杂合形式存在。因此，包括上述缺失或突变/修饰的植物或植物品系适用于生产杂交植物。然而，为了保持雄性不育雌性亲本，还需要另外的成分。正因如此，WO 92/01366教导了雄性亲本在与雌性亲本杂交中的使用以保持雄性不育雌性亲本，该雄性亲本与雌性同基因但具有异源附加染色体，该异源附加染色体在短臂上携带来自野生一粒小麦(俗名是沙达一粒小麦)的显性雄性可育性恢复基因并且在长臂上携带来自高冰草的蓝色糊粉(BLA)基因(图1A)，由此BLA基因如果表达的话会赋予后代种子特征性的蓝色。最近的研究表明，异源附加染色体还可以携带普通小麦的染色质(图1C)。从该杂交收获由这两个亲本的混合物组成的后代种子群体之后，可以基于颜色标记来物理地分离后代种子，由此理论上，由于ms1基因的缺陷(缺失或突变/修饰)并且无异源附加染色体，白色种子仍然是雄性不育的。这些白色种子可以在后续的杂交小麦生产中用作雌性亲本。所收获的蓝色种子可以用作用于保存育种的雄性亲本。
通常，面包小麦具有三个基因组，每一基因组在二倍体中包含七条单独的染色体，使得总共有42条染色体。由于上述BLA系统包含单个附加染色体，因此产生小麦植物的蓝色种子的染色体状态是42+1条染色体。WO 92/01366已经描述了异源附加染色体看来难以通过配子进行传递，这是因为该传递不是正常出现的并且不对应于对于传统孟德尔比率所预期的结果。因此，具有所需染色体状态的小麦种子的产生具有较低效率并需要增强的筛选工作量。为了避免所观察到的减数分裂不稳定性，期望具有42染色体系统。WO 93/13649公开了建立此种系统的不同方式，其中通过部分同源配对，小麦中染色体4B的一条同源染色体的部分已经由外源小麦染色质替代，该外源小麦染色质携带用于恢复雄性不育的基因以及来自例如高冰草、一粒小麦或沙达一粒小麦的一种或多种标记基因。为了推动部分同源配对，建议使用携带位于染色体5B的长臂上的突变基因的突变小麦品系，该突变基因针对配对抑制因子(ph1b)进行编码(Sears E.R.(1977)，普通小麦中具有部分同源配对的诱导突变体，Can.J.Genet.Cytol.19 585–593.；[登记号：TA3809堪萨斯州立大学WGRC])。在该申请中，呈现了关于如何可以建立此种系统的若干个实例；然而，所提出的育种步骤复杂并且依赖于使用非期望的缺对染色体及单体染色体。虽然已知由于这四条部分同源染色体明显补偿了缺失的一对同源物，因此面包小麦可以容忍缺对染色体，但是它们的外观及表型与正常六倍体明显不同并且此外，大多数缺对染色体生长较不旺盛并显示出其他发育缺陷。单体染色体互补体一般由于两个主要原因而是有害的。第一，缺失的染色体会扰乱染色体组中的整体基因平衡。第二，使染色体缺失允许单条染色体上的任何有害隐性等位基因为半合子基因并因此在表型上直接表达。应注意，这些是缺失所产生的相同效果。在若干个单独的杂交步骤中所提出的亲本植物中单体及缺体的扩展使用妨碍了实施用于产生42染色体系统的方法，该42染色体系统具有易位到基因组中的异源附加染色体。成功地应用所提出的方法似乎不大可能。因此，也不足为奇的是，迄今为止，通过该应用，从来没有实现过此种42染色体系统。
如上所述，包括异源附加染色体的WO 92/01366雄性亲本植物适合用于保持雄性不育雌性。根据所述杂交，白色种子可被选择以进一步用于杂交小麦生产中，并且蓝色种子可用于保存育种。为了使该42+1染色体系统在商业规模上工作，有必要使种子的白色与雄性不育严格关联。这是确保雄性不育雌性与最优化雄性亲本之间进行可靠杂交以实现小麦中杂种优势效应的最大利益的唯一方式。然而，外源且未配对的染色体是不稳定的。
关于异源附加染色体，错分裂以1-2％发生并产生两条端着丝粒染色体，一条携带蓝色糊粉基因且一条携带无蓝色标记的可育性恢复基因(图2)。错分裂的结果是出现雄性不育的蓝色种子以及可育的白色种子。结果是极端的，因为在为了保持而与雄性不育雌性的杂交中使用由不育蓝色种子长成的植物会产生不育植物，使得保持被中断，并且由于雌性植物的自花受精以及其他等基因雌性的非期望授粉，在与适当雄性亲本的杂交中使用由可育白色种子长成的植物会导致有缺陷的且不良的杂交。这两种情况均会导致在雌性亲本上生长的种子的量增加，显著大于1-2％，由此这些种子仅代表雌性亲本的基因型，而不是具有预期杂种优势效应的F1代。因此，农民将会遭受收率损失，这可抵消基于预期杂种优势的收率提高。颜色标记特征无法用于从种子群体中除去这些不期望的种子。唯一的方式是异源附加染色体的断裂的细胞遗传学测定。然而，目前这是非常费时且费力的。因此，现有的42+1染色体系统在商业实务中是不适用的。
正因如此，需要进一步改进42+1染色体系统，尤其是关于异源附加染色体的重排或易位。为此，需要用于系统产生的稳健方法，其可在商业规模上使用，即可从颜色标记BLA获得最优利益。
发明内容
如在背景部分中所述，在本领域中亟需找到形成并保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物品系的技术，并使用该理解来开发用于此种工程的新方法。本发明满足了此需要以及其他需要。本发明的实施方案大体上涉及用于改善当前42+1染色体系统的方法及材料，其包括，例如但不限于，异源附加染色体和/或异源染色体片段的重排或易位。在某些实施方案中，为了易于检测，该系统可以使用选择标记(例如颜色标记)。
为了改善42+1染色体系统，需要防止染色体的错分裂导致未标记的(例如白色的)可育种子以及在较小程度上来自标记的(例如蓝色)不育种子的植物。这可通过重排单体异源附加染色体来实现，使得雄性可育性恢复基因将与选择标记基因相关联并位于一个染色体臂上(参见图3)。错分裂仍会发生，但是这将不会导致未标记的可育种子。异源附加染色体在其自身内的重排可通过杀配子(Gc)基因、辐射和/或基因编辑来实现。
在替代系统中，重排将会导致在42染色体基因组内的具有上述特征的杂交系统，即异源附加染色体被易位到谷类植物的基因组中。选择标记基因是与可育性恢复基因相关联(即连锁)，并包括在基因组的42条染色体中(参见图4)。该易位可通过部分同源配对(例如ph1b辅助)和/或基因编辑来实现。
通过以下编号项[001]至[231]中的任一者或其中一个或多个与任何其他项和/或实施方案的任何组合来具体地描述本发明。
[001]一种用于生产杂交谷类植物的谷类植物，其中该谷类植物包括携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的单体异源附加染色体，其中该雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因位于该单体异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。在特定实施方案中，异源附加染色体包含谷类植物天然存在的染色质的一部分，其中所述染色质不携带雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因。
[002]根据[001]所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因是显性基因。
[003]根据[001]或[002]所述的谷类植物，其中该谷类植物是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[004]根据[003]所述的谷类植物，其中该谷类植物是黑小麦。
[005]根据[003]所述的谷类植物，其中该谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
[006]根据[005]所述的谷类植物，其中该谷类植物是硬粒小麦(Triticum durum)或普通小麦(Triticum aestivum)。
[007]根据[001]至[006]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦(Triticum boeoticum)或一粒小麦(Triticum monococcum)。
[008]根据[001]至[007]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[009]根据[001]至[008]中任一项所述的谷类植物，其中该选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
[010]根据[009]所述的谷类植物，其中该颜色标记基因能够赋予包括该颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
[011]根据[009]或[010]所述的谷类植物，其中该颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
[012]根据[011]所述的谷类植物，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草(Agropyronelongatum)、绒毛冰草(Agropyron trichophorum)或一粒小麦。
[013]根据[012]所述的谷类植物，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[014]根据[001]至[013]中任一项所述的谷类植物，其中该谷类植物纯合地包括雄性可育性基因突变。
[015]根据[014]所述的谷类植物，其中该雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
[016]根据[001]至[015]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[017]根据[001]至[016]中任一项所述的谷类植物，其中除了其整倍体数量的染色体之外，该谷类植物还包括一条附加染色体，其中该显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因位于该附加染色体上。
[018]根据[017]所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因位于异源附加染色体上的类似于谷类植物的突变雄性可育性基因的位置。
[019]根据[001]至[018]中任一项所述的谷类植物的种子或后代或其部分。
[020]根据[019]所述的种子或后代或其部分，其中该种子、后代或其部分至少包括位于单体异源附加染色体的着丝粒的同一侧上的该雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。
[021]根据[019]所述的种子、后代或其部分，其中除了其整倍体数量之外，该种子、后代或其部分还包括至少一条附加染色体，并且其中该雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因位于该附加染色体上。
[022]根据[019]所述的种子或后代或其部分，其中该种子、后代或其部分纯合地包括雄性可育性基因突变，其中优选地，该雄性可育性基因突变是ms1基因缺失、ms1基因敲低或ms1基因敲除。
[023]一种用于生产杂交谷类植物的谷类植物，其中该谷类植物包括至少一个部分同源染色体对，其中该对由第一及第二染色体组成，第一染色体是该谷类植物天然存在的，并且第二染色体包括异源染色体片段，该异源染色体片段包括显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，其中该谷类植物包括引起雄性不育的雄性可育性基因突变。
[024]根据[023]所述的谷类植物，其中该第一染色体包括高冰草的一段染色质，该一段染色质优选地易位到第一染色体的长臂的末端上，由此该一段染色质与异源染色体片段或其部分配对。
[025]根据[023]或[024]所述的谷类植物，其中该第二染色体进一步包括天然存在的DNA。
[026]根据[023]至[025]中任一项所述的谷类植物，其中该谷类植物由整倍体数量的染色体组成。
[027]根据[023]至[026]中任一项所述的谷类植物，其中该谷类植物是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[028]根据[027]所述的谷类植物，其中该谷类植物是黑小麦。
[029]根据[027]所述的谷类植物，其中该谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
[030]根据[029]所述的谷类植物，其中该谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
[031]根据[023]至[030]中任一项所述的谷类植物，其中该谷类植物包括突变的部分同源配对抑制基因。
[032]根据[031]所述的谷类植物，其中该部分同源配对抑制基因缺失。
[033]根据[031]或[032]所述的谷类植物，其中该部分同源配对抑制基因通过育种从该谷类植物消除。
[034]根据[023]至[030]中任一项所述的谷类植物，其中该谷类植物不包括突变的部分同源配对抑制基因。
[035]根据[031]至[033]中任一项所述的谷类植物，其中该突变的部分同源配对抑制基因纯合地存在于染色体5B或染色体3D上。
[036]根据[031]至[033]或[035]中任一项所述的谷类植物，其中该突变的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。
[037]根据[036]所述的谷类植物，其中该突变的部分同源配对抑制基因是ph1b。
[038]根据[023]至[037]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
[039]根据[023]至[037]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[040]根据[023]至[039]中任一项所述的谷类植物，其中该选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
[041]根据[040]所述的谷类植物，其中该颜色标记基因能够赋予包括该颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
[042]根据[040]或[041]所述的谷类植物，其中该颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
[043]根据[042]所述的谷类植物，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
[044]根据[043]所述的谷类植物，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[045]根据[023]至[044]中任一项所述的谷类植物，其中该谷类植物纯合地包括雄性可育性基因突变。
[046]根据[045]所述的谷类植物，其中该雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
[047]根据[023]至[046]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性基因是Ms1或选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[048]根据[023]至[047]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于着丝粒的相对侧上。
[049]根据[023]至[047]中任一项所述的谷类植物，其中该雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于着丝粒的同一侧上。
[050]根据[023]至[049]中任一项所述的谷类植物，其中该第一染色体是4A、4B、4D或5A。
[051]根据[023]至[050]中任一项所述的谷类植物，其中该第一染色体不是4B。
[052]根据[023]至[051]中任一项所述的谷类植物的种子、后代或其部分。
[053]一种产生用于对谷类植物进行基因组选择的蓝色糊粉(BLA)雄性不育系统的方法，包括：a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系，该谷类植物品系包括至少一条异源附加染色体，该至少一条异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因；b)重排至少一条异源附加染色体和/或诱导至少一条异源附加染色体的部分同源重组；以及c)获得包括重排和/或部分同源异源附加染色体的谷类植物。优选地，根据[001]至[018]或[023]至[051]中任一者的谷类植物是在步骤c)中获得。在特定实施方案中，异源附加染色体包含谷类植物天然存在的染色质的一部分，其中所述染色质不携带雄性可育性恢复基因和/或蓝色糊粉基因。
[054]根据[053]所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因是显性基因。
[055]根据[053]或[054]所述的方法，其中该雄性可育性基因突变是缺失、敲低或敲除。
[056]根据[053]至[055]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[057]根据[053]至[056]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性突变是ms1基因缺失、ms1基因敲低或ms1基因敲除。
[058]根据[053]至[057]中任一项所述的方法，其中该异源附加染色体是单体的。
[059]根据[053]至[057]中任一项所述的方法，其中该异源附加染色体是二体的。
[060]根据[053]至[059]中任一项所述的方法，其中重排步骤b)包括向步骤a)的谷类植物品系提供杀配子基因。
[061]根据[060]所述的方法，其中该杀配子基因作为单体附加染色体引入。
[062]根据[060]或[061]所述的方法，其中该杀配子基因诱导至少一条异源附加染色体的断裂及重排。
[063]根据[060]至[062]中任一项所述的方法，其中该杀配子基因是位于卵穗山羊草(Aegilops geniculate)的染色体4Mg或柱穗山羊草(Aegilops cylindrica)的染色体2Cc上的杀配子因子。
[064]根据[053]至[059]中任一项所述的方法，其中重排步骤b)包括辐射步骤a)的谷类植物品系的种子。
[065]根据[064]所述的方法，其中辐射种子诱导至少一条异源附加染色体的染色体重排。
[066]根据[064]或[065]所述的方法，其中使用175、200、225或250Gy的γ射线来辐射这些种子。
[067]根据[064]至[066]中任一项所述的方法，其中辐射这些种子约40分钟至约50分钟。
[068]根据[053]至[059]中任一项所述的方法，其中重排步骤b)包括对步骤a)的谷类植物品系进行基因编辑。
[069]根据[068]所述的方法，其中基因编辑包括在该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因相同的侧上插入相同或不同的蓝色糊粉基因。
[070]根据[069]所述的方法，其中插入包括将基因盒引入步骤a)的谷类植物品系的细胞中，该基因盒携带相同或不同的蓝色糊粉基因以及位点特异性核酸酶，该位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中在该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因相同的侧上的靶位点处作出链断裂，并且其中该相同或不同的蓝色糊粉基因在双链断裂的位点处被整合到谷类植物品系基因组中。
[071]根据[068]至[070]中任一项所述的方法，其中破坏位于该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因不同的侧上的蓝色糊粉基因。
[072]根据[068]所述的方法，其中基因编辑包括在该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与蓝色糊粉基因相同的侧上插入相同或不同的雄性可育性恢复基因。
[073]根据[072]所述的方法，其中插入包括将基因盒引入步骤a)的谷类植物品系的细胞中，该基因盒携带相同或不同的雄性可育性恢复基因以及位点特异性核酸酶，该位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中在该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与蓝色糊粉基因相同的侧上的靶位点处作出双链断裂，并且其中该相同或不同的雄性可育性恢复基因在双链断裂的位点处被整合到谷类植物品系基因组中。
[074]根据[068]或[072]至[074]中任一项所述的方法，其中破坏位于该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与蓝色糊粉基因不同的侧上的雄性可育性恢复基因。
[075]根据[068]所述的方法，其中基因编辑包括将至少两种不同的位点特异性核酸酶引入步骤a)的谷类植物品系的细胞中，其中至少一种位点特异性核酸酶在蓝色糊粉基因附近但在蓝色糊粉基因与异源附加染色体的染色体末端之间作出第一双链断裂以形成染色体的第一末端，并且至少一种其他位点特异性核酸酶在雄性可育性恢复基因附近但在雄性可育性恢复基因与异源附加染色体的着丝粒之间作出第二双链断裂以形成第二染色体末端，并且其中这些染色体末端被交换，使得蓝色糊粉基因位于该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因相同的侧上。
[076]根据[068]所述的方法，其中基因编辑包括将至少两种不同的位点特异性核酸酶引入步骤a)的谷类植物品系的细胞中，其中至少一种位点特异性核酸酶在雄性可育性恢复基因附近但在雄性可育性恢复基因与异源附加染色体的染色体末端之间作出第一双链断裂以形成染色体的第一末端，并且至少一种其他位点特异性核酸酶在蓝色糊粉基因附近但在蓝色糊粉基因与异源附加染色体的着丝粒之间作出第二双链断裂以形成第二染色体末端，并且其中这些染色体末端被交换，使得蓝色糊粉基因位于该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因相同的侧上。
[077]根据[075]或[076]所述的方法，其中第一及第二双链断裂同时地或在时间上非常接近地发生。
[078]根据[070]、[071]或[073]至[077]中任一项所述的方法，其中该位点特异性核酸酶是大范围核酸酶、TALEN、ZFN或CRISPR核酸酶。
[079]根据[078]所述的方法，其中通过编码用于位点特异性核酸酶活性的所需基因的至少一个DNA盒的转化、RNA分子的转化，或者通过纯化蛋白质或核糖核蛋白质复合物的转化来将位点特异性核酸酶递送到谷类植物品系细胞中。
[080]根据[070]、[071]、[073]至[080]中任一项所述的方法，其中该细胞包括雄性不育基因型。
[081]根据[070]、[071]、[073]至[080]中任一项所述的方法，其中该细胞来自未成熟胚或愈伤组织。
[082]根据[053]所述的方法，其中诱导部分同源重组步骤b)包括提供突变的部分同源配对抑制基因或引入抑制该部分同源配对抑制基因的基因，其中该部分同源配对抑制基因诱导包括显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记的异源附加染色体与至少一条部分同源染色体进的部分同源重组。
[083]根据[082]所述的方法，其中该至少一条部分同源染色体是4A、4B、4D或5A。
[084]根据[082]所述的方法，其中该至少一条部分同源染色体不是4B。
[085]根据[082]至[084]中任一项所述的方法，其中该突变的部分同源配对抑制基因纯合地存在于染色体5B或染色体3D上。
[086]根据[082]至[085]中任一项所述的方法，其中该突变的部分同源配对抑制基因缺失。
[087]根据[082]至[086]中任一项所述的方法，其中该突变的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。
[088]根据[053]至[087]中任一项所述的方法，其中该谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[089]根据[088]所述的方法，其中该谷类植物是黑小麦。
[090]根据[088]所述的方法，其中该谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
[091]根据[090]所述的方法，其中该谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
[092]根据[053]至[091]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
[093]根据[053]至[091]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[094]根据[093]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
[095]根据[094]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[096]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从根据[053]至[095]中任一项所述的步骤c)获得，并且其中该谷类植物不包括异源附加染色体的错分裂。
[097]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从根据[053]至[095]中任一项所述的步骤c)获得，并且其中该谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。
[098]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从根据[053]至[095]中任一项所述的步骤c)获得，并且其中该谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂以及ii)异源附加染色体的断裂。
[099]一种种子或后代或其部分，其得自从根据[053]至[095]中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括异源附加染色体的错分裂。
[100]一种种子或后代或其部分，其得自从根据[053]至[095]中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括异源附加染色体的断裂。
[101]一种种子或后代或其部分，其得自从根据[053]至[095]中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括i)异源附加染色体的错分裂以及ii)异源附加染色体的断裂。
[102]一种产生用于对谷类植物进行基因组选择的蓝色糊粉(BLA)雄性不育系统的方法，包括：a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系；b)将雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因整合到谷类植物品系的基因组中，其中该雄性可育性恢复基因与该蓝色糊粉基因遗传连锁并紧密靠近；以及c)获得包括遗传连锁的雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因的谷类植物。优选地，此种用于对谷类植物进行基因组选择的蓝色糊粉(BLA)雄性不育系统包括如步骤c)中所获得的根据[001]至[018]或[023]至[051]中任一项所述的谷类植物。
[103]根据[102]所述的方法，其中通过基因盒将该雄性可育性恢复基因以及该蓝色糊粉基因引入谷类植物品系的细胞中。
[104]根据[103]所述的方法，其中将该雄性可育性恢复基因与该蓝色糊粉基因在该基因盒中配置为5’对5’、3’对3’、5’对3’或3’对5’。
[105]根据[102]至[104]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因与该蓝色糊粉基因通过接头连接。
[106]根据[103]至[105]中任一项所述的方法，其中该细胞包括雄性不育基因型。
[107]根据[103]至[106]中任一项所述的方法，其中该细胞来自未成熟胚或愈伤组织。
[108]根据[102]至[107]中任一项所述的方法，其中整合步骤b)包括随机地整合连接的雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因。
[109]根据[108]所述的方法，其中通过对在二元质粒中的T-DNA边界内包含的雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因进行土壤杆菌介导转化来将基因盒引入细胞中。
[110]根据[108]所述的方法，其中通过对呈超螺旋、环状、松弛或线性构型的包括基因盒的质粒进行粒子轰击来将基因盒引入细胞中。
[111]根据[102]至[107]中任一项所述的方法，其中整合步骤b)包括使用位点特异性核酸酶来对连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因的整合进行靶向，该位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中的靶位点处作出双链断裂，并且其中在双链断裂的位点处将连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因整合到谷类植物品系基因组中。
[112]根据[111]所述的方法，其中该位点特异性核酸酶是大范围核酸酶、TALEN、ZFN或CRISPR核酸酶。
[113]根据[112]所述的方法，其中通过编码用于位点特异性核酸酶活性的所需基因的至少一个DNA盒的转化、RNA分子的转化，或者通过纯化蛋白质或核糖核蛋白质复合物的转化来将位点特异性核酸酶递送到谷类植物品系细胞中。
[114]根据[102]至[113]中任一项所述的方法，其中雄性可育性恢复基因是显性基因。
[115]根据[102]至[114]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因突变是缺失、敲低或敲除。
[116]根据[102]至[115]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[117]根据[102]至[114]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性突变是ms1基因缺失、ms1基因敲低或ms1基因敲除。
[118]根据[102]至[117]中任一项所述的方法，其中将连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因整合到染色体4A、4B、4D或5A中。
[119]根据[102]至[117]中任一项所述的方法，其中连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因不整合到染色体4B中。
[120]根据[102]至[119]中任一项所述的方法，其中该谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[121]根据[120]所述的方法，其中该谷类植物是黑小麦。
[122]根据[120]所述的方法，其中该谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
[123]根据[122]所述的方法，其中该谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
[124]根据[102]至[123]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
[125]根据[102]至[124]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[126]根据[102]至[125]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
[127]根据[126]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[128]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从根据[102]至[127]中任一项所述的步骤c)获得，并且其中该谷类植物包括连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因的单一拷贝插入。
[129]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从根据[102]至[127]中任一项所述的步骤c)获得，并且其中该谷类植物的天然基因序列未被破坏。
[130]一种种子或后代或其部分，其得自从根据[102]至[127]中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中该谷类植物包括连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因的单一拷贝插入。
[131]一种种子或后代或其部分，其得自从根据[102]至[127]中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中该谷类植物的天然基因序列未被破坏。
[132]一种制造用于生产杂交谷类植物的谷类植物、其种子或部分的方法，包括：a)使包括单体异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变的第一谷类植物与包括二体杀配子附加染色体的第二谷类植物杂交，该单体异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，该二体杀配子附加染色体携带杀配子基因；b)收获、选择并种植表达选择标记基因的通过步骤a)产生的至少一粒种子，其中该种子包括单体异源附加染色体以及单体杀配子附加染色体以产生第三谷类植物，其中该第三谷类植物包括杂合雄性可育性基因突变；c)使步骤b)中所产生的第三谷类植物与步骤a)的第一谷类植物杂交；d)收获、选择并种植表达选择标记基因的在步骤c)中产生的至少一粒种子，其中该种子包括单体异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变以产生包括纯合的雄性可育性基因突变的第一子代的后代谷类植物；e)使步骤d)中所产生的第一子代的后代谷类植物自花受精；f)收获、选择并种植表达选择标记基因的在步骤e)中产生的至少一粒种子，其中该种子包括单体异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变以产生第二子代的后代谷类植物；g)使步骤f)中所产生的第二子代的后代谷类植物自花受精；h)任选地重复步骤f)及g)以产生至少一个另外的子代；i)收获步骤g)中所产生的第三子代的种子，或如果执行步骤h)，则收获步骤h)中所产生的第三子代的种子；j)选择并种植不表达选择标记基因的第三子代的至少一粒种子以产生第四子代的后代谷类植物；k)对步骤j)中所产生的第四子代的谷类植物的穗进行表型分型；以及l)选择在步骤k)中显示完全不育的第四子代的谷类植物群体以产生用于生产杂交谷类植物的谷类植物。在特定实施方案中，异源附加染色体包含谷类植物天然存在的染色质的一部分，其中所述染色质不携带雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因。
[133]根据[132]所述的方法，其中步骤j)包括选择并种植至少25粒种子或至少100粒种子。
[134]一种制造用于生产杂交谷类植物的谷类植物、其种子或部分的方法，包括：a)辐射包括单体异源附加染色体的至少一粒种子，该单体异源附加染色体在着丝粒的不同侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因；b)种植在步骤a)中被辐射的该至少一粒种子以产生至少一个第一谷类植物；c)收获来自步骤b)中所产生的该至少一个第一谷类植物的基本上所有的种子以形成至少一个种子群体，其中每一种子群体均来自一个单独的植物，并且其中每一种子群体均包括表达该至少一个选择标记基因的种子以及不表达该至少一个选择标记基因的种子；d)种植来自步骤c)的群体的不表达选择标记基因的至少一粒种子；e)抛弃在步骤d)中产生可育植物的种子群体；f)使步骤e)中未被抛弃的表达选择标记基因的种子自花受精以形成下一个种子群体，其中每一种子群体均来自一个单独的植物，其中每一种子群体均包括表达该至少一个选择标记基因的种子以及不表达该至少一个选择标记基因的种子；g)任选地重复步骤d)及e)至少一次；h)种植不表达该至少一个选择标记的至少一粒种子；以及i)从显示完全不育的谷类植物群体选择种子群体以产生用于生产杂交谷类植物的谷类植物。在特定实施方案中，异源附加染色体包含谷类植物天然存在的染色质的一部分，其中所述染色质不携带雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因。
[135]根据[134]所述的方法，其中步骤a)包括辐射至少1000粒种子或至少8000粒种子。
[136]根据[134]或[135]所述的方法，其中步骤d)包括种植多达200粒种子。
[137]根据[134]至[136]中任一项所述的方法，其中步骤g)重复包括种植至少300粒种子的步骤d)。
[138]根据[132]至[137]中任一项所述的方法，进一步包括：检查来自根据[132]所述的步骤l)或根据[134]所述的步骤i)的群体的至少一粒表达选择标记基因的种子，以确认该种子包括重排单体异源附加染色体，该重排单体异源附加染色体包括位于其着丝粒的同一侧上的显性雄性可育性恢复基因以及选择标记基因。
[139]根据[138]所述的方法，其中检查步骤包括执行细胞学分析或分子分析。
[140]根据[139]所述的方法，其中检查步骤包括执行FISH(荧光原位杂交)或GISH(基因组原位杂交)显微镜观察以检测易位的位置。
[141]根据[132]至[140]中任一项所述的方法，进一步包括：选择包括重排单体异源附加染色体的来自根据[132]所述的步骤l)或根据[134]所述的步骤i)的群体的至少一个杂交谷类植物，并使其与未经根据[132]或[134]所述的其中一种方法处理的谷类植物杂交，以在后代中减少由于根据[132]或[134]所述的方法而被引入谷类基因组中的任何不需要的染色体重排或突变。
[142]根据[132]至[141]中任一项所述的方法，其中该谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[143]根据[142]所述的方法，其中该谷类植物是黑小麦。
[144]根据[142]所述的方法，其中该谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
[145]根据[144]所述的方法，其中该谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
[146]根据[132]至[145]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
[147]根据[132]至[145]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[148]根据[132]至[147]中任一项所述的方法，其中该选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
[149]根据[148]所述的方法，其中该颜色标记基因能够赋予包括该颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
[150]根据[148]或[149]所述的方法，其中该颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
[151]根据[150]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
[152]根据[151]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[153]根据[132]至[152]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
[154]根据[132]至[153]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[155]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从[132]至[154]中任一项获得，并且其中该谷类植物不包括异源附加染色体的错分裂。
[156]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从[132]至[154]中任一项获得，并且其中该谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。
[157]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从[132]至[154]中任一项获得，并且其中该谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂以及ii)异源附加染色体的断裂。
[158]一种种子或后代或其部分，其得自从[132]至[154]中任一项获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括异源附加染色体的错分裂。
[159]一种种子或后代或其部分，其得自从[132]至[154]中任一项获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括异源附加染色体的断裂。
[160]一种种子或后代或其部分，其得自从[132]至[154]中任一项获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括i)异源附加染色体的错分裂以及ii)异源附加染色体的断裂。
[161]一种制造用于生产杂交谷类植物品系的谷类植物品系、其种子或部分的方法，包括：a)使包括二体异源附加染色体的雄性可育性基因突变纯合的第一谷类植物与雄性可育性基因突变以及部分同源配对抑制基因突变纯合的第二谷类植物杂交，该二体异源附加染色体携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因；b)收获、选择并种植雄性可育性基因突变纯合的在步骤a)中所产生的至少一粒种子，该至少一粒种子包括单体异源染色体，其携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因以及单一拷贝的部分同源配对抑制基因突变；c)使步骤b)中所产生的谷类植物自花受精；d)收获、选择并种植雄性可育性基因突变以及部分同源配对抑制基因突变纯合的在步骤c)中所产生的至少一粒种子，该至少一粒种子包括整倍体数量的染色体以及单体异源附加染色体；e)使步骤d)中所产生的谷类植物自花受精；f)收获来自步骤e)的至少四粒种子；g)计算来自表达该至少一个选择标记的第一组以及不表达该至少一个选择标记的第二组的步骤f)的种子数量，以便确定分离比率；h)如果第一组：第二组的种子数量比率趋向于约3:1，则保留步骤f)的种子，并且如果第一组：第二组的种子数量比率趋向于约1:3，则抛弃步骤f)的种子。在特定实施方案中，异源附加染色体包含谷类植物天然存在的染色质的一部分，其中所述染色质不携带雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因。
[162]根据[161]所述的方法，其中该显性雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因位于异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
[163]根据[161]所述的方法，其中该显性雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因位于异源附加染色体的着丝粒的不同侧上。
[164]根据[161]至[163]中任一项所述的方法，其中该谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[165]根据[164]所述的方法，其中该谷类植物是黑小麦。
[166]根据[164]所述的方法，其中该谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
[167]根据[166]所述的方法，其中该谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
[168]根据[161]至[167]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
[169]根据[161]至[167]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[170]根据[161]至[169]中任一项所述的方法，其中该选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
[171]根据[170]所述的方法，其中该颜色标记基因能够赋予包括该颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
[172]根据[170]或[171]所述的方法，其中该颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
[173]根据[172]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
[174]根据[174]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[175]根据[161]至[174]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
[176]根据[161]至[175]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[177]根据[161]至[176]中任一项所述的方法，其中该部分同源配对抑制基因突变是来自染色体5B或染色体3B的基因缺失。
[178]根据[177]所述的方法，其中缺失的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。
[179]根据[161]至[178]中任一项所述的方法，其中该单体异源附加染色体与4A、4B、4D或5A染色体易位。
[180]根据[161]至[178]中任一项所述的方法，其中该单体异源附加染色体不与4B染色体易位。
[181]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从[161]至[180]中任一项获得，并且其中该谷类植物不包括异源附加染色体的错分裂。
[182]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从[161]至[180]中任一项获得，并且其中该谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。
[183]一种谷类植物或其部分，其中该谷类植物是从[161]至[180]中任一项获得，并且其中该谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂以及ii)异源附加染色体的断裂。
[184]一种种子或后代或其部分，其得自从[161]至[180]中任一项获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括异源附加染色体的错分裂。
[185]一种种子或后代或其部分，其得自从[161]至[180]中任一项获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括异源附加染色体的断裂。
[186]一种种子或后代或其部分，其得自从[161]至[180]中任一项获得的谷类植物，并且其中该种子或后代或其部分不包括i)异源附加染色体的错分裂以及ii)异源附加染色体的断裂。
[187]一种保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物的雄性不育雌性亲本品系的方法，该方法包括：a.种植包括纯合的雄性可育性基因突变以及单体异源附加染色体的至少一粒种子，该单体异源附加染色体在其着丝粒的同一侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，由此可将具有该单体异源附加染色体的种子与不具有该单体异源附加染色体的种子分开以产生至少一粒后代种子；b.使步骤a)中所产生的谷类植物自花受精；c.选择不包括单体异源附加染色体的至少一粒种子以生长至少一个不育雌性亲本谷类植物，以便与可育雄性谷类植物杂交以用于杂交谷类植物及杂交种子生产；以及d.选择包括单体异源附加染色体的至少一粒种子以便保持该谷类植物。在特定实施方案中，异源附加染色体包含谷类植物天然存在的染色质的一部分，其中所述染色质不携带雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因。
[188]一种保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物的雄性不育雌性亲本品系的方法，该方法包括：a.种植包括纯合的雄性可育性基因突变以及携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的异源附加染色体的至少一部分的至少一粒种子，该异源附加染色体的该至少一部分易位到部分同源染色体对中的至少一条染色体中；b.使步骤a)中所产生的谷类植物自花受精；c.选择不包括易位到部分同源染色体对中的至少一条染色体中的异源附加染色体的至少一粒种子以生长至少一个不育雌性亲本谷类植物，以便与可育雄性谷类植物杂交以用于杂交谷类植物及杂交种子生产；d.选择包括易位到部分同源染色体对中的一条染色体中的异源附加染色体的至少一粒种子以保持该谷类植物，其中如优选地通过该至少一个选择标记基因的表达所指示，该种子对该易位是杂合的；以及e.抛弃包括易位到部分同源染色体对中的至少两条染色体中的异源附加染色体的任何种子以保持该谷类植物，其中如优选地通过该至少一个选择标记基因的表达所指示，该种子对该易位是纯合的。在特定实施方案中，异源附加染色体包含谷类植物天然存在的染色质的一部分，其中所述染色质不携带雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因。
[189]根据[187]或[188]所述的方法，其中该谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[190]根据[189]所述的方法，其中该谷类植物是黑小麦。
[191]根据[189]所述的方法，其中该谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
[192]根据[191]所述的方法，其中该谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
[193]根据[187]至[192]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
[194]根据[187]至[193]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[195]根据[187]至[194]中任一项所述的方法，其中该选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
[196]根据[195]所述的方法，其中该颜色标记基因能够赋予包括该颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
[197]根据[195]或[196]所述的方法，其中该颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
[198]根据[197]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
[199]根据[198]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[200]根据[196]至[199]中任一项所述的方法，其中淡蓝色种子指示该种子对该易位是杂合的。
[201]根据[196]至[199]中任一项所述的方法，其中深蓝色种子指示该种子对该易位是纯合的。
[202]根据[187]至[201]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
[203]根据[187]至[202]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[204]一种通过根据[187]至[203]中任一项所述的方法产生的谷类植物或其部分。
[205]一种通过根据[187]至[203]中任一项所述的方法产生的种子。
[206]一种制造包括至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体的雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系的方法，该方法包括：a)使包括至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体的谷类植物与对该重排的和/或部分同源的染色体在遗传学上相关的基因组缺体的谷类植物杂交；b)收获并选择包括异源染色体的种子并从所述种子产生植物；c)使b)的植物与谷类植物杂交；d)收获并选择包括异源染色体且不包括任何单体染色体的种子，优选通过使用qPCR和/或流式细胞术，并从所述种子产生植物；e)任选地，使d)的植物与谷类植物回交，并且从所述杂交收获并选择包括异源染色体的种子；f)使d)或e)的植物与雄性可育性基因突变纯合的谷类植物杂交；g)收获并选择包括异源染色体的种子并从所述种子产生植物；h)使g)的植物自交，收获并选择包括异源染色体的种子；i)从h)的种子产生植物并选择包括该至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体的雄性可育性基因突变纯合的谷类植物。
[207]根据[206]所述的方法，其中该方法进一步包括j)使步骤i)中所选择的植物自交以获得：I)雄性可育性基因突变纯合的谷类植物，其杂合地包括该至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体；II)雄性可育性基因突变纯合的谷类植物，其纯合地包括该至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体；和/或III)雄性可育性基因突变纯合的谷类植物，其不包括该至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体。
[208]根据[206]所述的方法，其中该至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体包括或者是携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的单体异源附加染色体，其中该雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因位于该单体异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
[209]根据[206]所述的方法，其中该至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体易位到至少一个部分同源染色体对，其中该对由第一及第二染色体组成，第一染色体是谷类植物天然存在的，并且第二染色体包括异源染色体或其片段，该异源染色体或其片段包括显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。
[210]根据[208]或[209]所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因是显性基因。
[211]根据[206]至[210]中任一项所述的方法，其中该谷类植物是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
[212]根据[206]至[211]中任一项所述的方法，其中该谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
[213]根据[206]至[212]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
[214]根据[206]至[213]中任一项所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ IDNO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[215]根据[206]至[214]中任一项所述的方法，其中该选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
[216]根据[215]所述的方法，其中该颜色标记基因能够赋予包括该颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
[217]根据[216]所述的方法，其中该颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
[218]根据[217]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
[219]根据[217]或[218]所述的方法，其中该蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)编码相对于SEQ IDNO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[220]根据[206]或[207]所述的方法，其中该雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
[221]根据[206]、[207]或[220]所述的方法，其中该雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
[222]根据[206]所述的方法，其中除了其整倍体数量的染色体之外，步骤a)的谷类植物还包括一条附加染色体，其中该显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因位于该附加染色体上。
[223]根据[208]或[209]所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因位于异源附加染色体上的类似于谷类植物的突变雄性可育性基因的位置。
[224]根据[209]所述的方法，其中该第一染色体包括高冰草的一段染色质，该一段染色质优选地易位到第一染色体的长臂的末端上，由此该一段染色质与异源染色体片段或其部分配对。
[225]根据[209]或[224]所述的方法，其中第二染色体进一步包括天然存在的DNA。
[226]根据[209]所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于着丝粒的相对侧上。
[227]根据[209]所述的方法，其中该雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于着丝粒的同一侧上。
[228]根据[209]所述的方法，其中第一染色体是4A、4B、4D或5A。
[229]根据[209]所述的方法，其中第一染色体不是4B。
[230]一种通过根据[206]至[229]中任一项所述的方法产生的谷类植物或其部分。
[231]一种通过根据[206]至[229]中任一项所述的方法产生的种子。
所公开的分离系统的一个优点是，允许有用于选择雄性不育和/或雄性可育谷类植物和/或种子的更稳健且精确的方法。在着丝粒的同一侧上携带与雄性可育性恢复基因相关联的选择标记基因的本文所公开的方法以及谷类植物品系具有改善的降低的收率损失。
本发明的这些以及其他目的、特征及优点在阅读下列结合详细描述和权利要求的说明书之后将变得更加显而易见。
附图说明
图1A-1B显示了BLA系统的基本原理。图1A：示出了异源附加染色体，其包含具有显性可育性恢复基因的来自野生一粒小麦(Bo)的染色质以及具有蓝色基因(BLA)的高冰草(Ag)染色质；图1B：示出了根据42+1染色体系统的正常不育杂交小麦的染色体构成。“4B”：小麦中基因组B的染色体4；“L’”：染色体的长臂；“S”：染色体的短臂。图1C：示出了异源附加染色体，其包含具有显性可育性恢复基因的来自野生一粒小麦(Bo)的染色质以及具有蓝色基因(BLA)的高冰草(Ag)染色质；另外，该异源附加染色体在染色体长臂上包含普通小麦的染色质。
图2示出了可如何进行异源附加染色体的错分裂。
图3示出了可如何进行单体染色体的重排。杜鹃基因也被称为杀配子(Gc)基因。
图4示出了可如何进行异源附加染色体的部分同源重组。“4A”：基因组A的染色体4；“4B”：基因组B的染色体4；“4C”：基因组C的染色体4；“5A”：基因组A的染色体5；“L’”：染色体的长臂。
图5示出了实现改良BLA系统的杀配子(Gc)基因方法，包括来自携带异源附加染色体(B)的小麦品系与弱杀配子小麦品系杂交的潜在结果以及获得重排品系的步骤。(‘’：染色体的二体外观，‘：染色体的单体外观，ms：由于缺少雄性可育性基因座而出现的雄性不育，‘例如‘Probus’缺失)，MS：存在雄性可育性基因座；2CC：位于染色体2C上的杀配子基因)。
图6示出了实现改良BLA系统的辐射诱导的单体染色体重排方法，包括来自以下的潜在结果：使用不同强度的辐射(175、200、225以及250Gy)使携带异源附加染色体(B)的小麦品系杂交以产生M0种子。
图7示出了实现改良BLA系统的两步部分同源配对方法，包括来自以下的潜在结果：携带异源附加染色体(B)的小麦品系与携带部分同源配对(ph)基因的纯合突变的小麦品系杂交。
图8示出了冰草属易位(箭头)。
图9示出了蓝色糊粉(Bla)亲本品系、ph1b突变品系以及来源于Bla品系与ph1b突变品系之间原始杂交的品系的荧光原位杂交(FISH)染色体扫描的结果。
图10示出了DB AR5的荧光原位杂交(FISH)照片。可识别44条染色体(21”+BoAg”)。星号表示两条Bla染色体。
图11示出了品系149-4-3的荧光原位杂交(FISH)照片。可识别42条染色体(20"+T4BS.4BL-4AgL'+BoAg')。星号表示异源染色体。箭头表示Bla染色体易位到来自小麦染色体4BS的染色质上。在B中，呈现了具有易位的另一测试品系T4DS-4BoS.4BoL-4AgL‘的荧光原位杂交(FISH)照片。
图12示出了品系149-4-7的荧光原位杂交(FISH)照片。可识别44条染色体(19"+4B'+3D"'+BoAg'+T4DS-4BoS.4BoL-4AgL')。星号表示异源染色体。带有箭头的星号表示Bla染色体易位到来自小麦染色体4DS的染色质上。
图13示出了品系E-2(149-4x AR23-6)的荧光原位杂交(FISH)照片。可识别42条染色体(18"+1B'+T1RS.1BL-1DL'+4B'+1D'+T1DS.1DL-1BL'+T4DS-4BoS.4BoL-4AgL')。带有箭头的星号表示Bla染色体易位到来自小麦染色体4DS的染色质上。
图14A-B示出了异源染色体的标记开发；图14A：通过筛选这些标记连同新易位品系中的可育性恢复标记以及蓝色基因标记(还参见表1)，可以将这些标记分配至小麦基因组中的不同基因组区域；图14B：不同小麦品系的RF标记(参见表1)的扩增产物的凝胶色谱。～1kb处的双条带中的顶部条带来自恢复基因；没有恢复基因的品系显示出单一条带&lt；1kb。
图15A示出了另外包括冰草属小段易位到小麦上的品系(T4B-4AgL')的荧光原位杂交(FISH)照片。可育性基因存在于正常4BS小麦臂上，其与蓝色品系杂交以促成与Bla染色体的配对。图15B示出了包括易位到小麦上的品系(42染色体系统)的荧光原位杂交(FISH)照片。带有箭头的星号表示Bla染色体易位到来自小麦染色体4DS的染色质上。已经确认了3蓝色：1白色的分离。
图16A-C示出了新易位染色体通过与缺体四体品系杂交而转移到42染色体背景中，示例为4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)-4DS(标记为D*)。(a)易位品系与缺体四体普通小麦中国春之间的第一杂交；(b)来自具有或不具有易位染色体的雌性的两个不同配子；(c)选择蓝色种子并与正常小麦杂交；(d)四个不同雌性配子，两个组合形成蓝色种子；(e)选择蓝色种子以与正常小麦杂交，使用qPCR来消除具有额外A染色体的品系；(f)与正常(优良)小麦品系回交；(g)使BC1F1品系杂交到纯合地包括ms1缺失突变的雄性不育小麦上；(h)选择蓝色种子；(i)种植蓝色种子并选择带有KASP标记的AABsBsDD*；(j)分离1：2：1(双蓝色：单一蓝色：白色)：白色种子的准备就绪的系统可用于杂交测交生产，可将单一蓝色种子用于产生更多白色种子或用于池发展，并且可抛弃双蓝色种子。
序列
SEQ ID NO:1：大麦(Hordeum vulgare)Ms1基因的基因组DNA
SEQ ID NO:2：大麦Ms1基因的cDNA
SEQ ID NO:3：大麦Ms1蛋白质
SEQ ID NO:4：普通小麦(Triticum aestivum)Ms1基因的cDNA
SEQ ID NO:5：普通小麦Ms1蛋白质
SEQ ID NO:6：普通小麦Ms1基因的基因组DNA
SEQ ID NO:7：合成Ms1的DNA
SEQ ID NO:8：稻(Oryza sativa)Ms1基因的基因组DNA
SEQ ID NO:9：稻Ms1基因的cDNA
SEQ ID NO:10：二穗短柄草(Brachypodium distachyon)Ms1基因的基因组DNA
SEQ ID NO:11：二穗短柄草Ms1基因的cDNA
SEQ ID NO:12：长穗薄冰草(Thinopyrum ponticum)MYC4E(在普通小麦中控制相关联特性的候选蓝色糊粉1基因)的cDNA
SEQ ID NO:13：长穗薄冰草MYC4E蛋白质
SEQ ID NO:14：野生一粒小麦Ms1基因的cDNA
SEQ ID NO:15：野生一粒小麦Ms1蛋白质
SEQ ID NOs:16-41：根据表1的标记
SEQ ID NO:42：稻Ms1蛋白质
SEQ ID NO:43：二穗短柄草Ms1蛋白质
SEQ ID NO:44：长穗薄冰草MYC(蓝色糊粉基因的变体)的cDNA
SEQ ID NO:45：长穗薄冰草MYC蛋白质
具体实施方式
为了便于理解本发明的各种实施方案的原理及特征，下面将解释各种说明性实施方案。尽管详细解释了本发明的示例性实施方案，但是应理解，还设想了其他实施方案。因此，本发明的范围并不局限于在下面描述或实施例中列出的结构和部件布置的细节。本发明能够有其他的实施方案并且能够以各种方式实施或执行。而且，在描述示例性实施方案时，为了清楚，将使用特定术语。
还必须注意的是，如说明书以及随附权利要求书中所用，除非上下文另有明确规定，否则单数形式“一个”、“一条”以及“该”包括复数含义。例如，提及一个成分还旨在包括多个成分的组合物。提及包含“一个”成分的组合物旨在除了所指定的一个成分还包括其他成分。换句话说，术语“一个”、“一条”以及“该”并不指代量的限制，而是指代存在“至少一个”所提及的项目。
而且，在描述示例性实施方案时，为了清楚，将使用术语。每一术语旨在考虑了如本领域的技术人员所理解的其最广泛的意义，并且旨在包括采用类似方式实现类似目的的所有技术等同物。
范围可在本文中表达为从“约”或“大约”或“大体上”一个特定值和/或至“约”或“大约”或“大体上”另一个特定值。当表达此种范围时，其他示例性实施方案包括从所述一个特定值和/或至所述另一特定值。进一步，术语“约”是指如本领域的普通技术人员所确定的在特定值的可接受误差范围之内，这将部分地取决于如何测量或测定该值，即测量系统的限制。例如，依照本领域的惯例，“约”可以指在可接受的标准偏差之内。可选地，“约”可以指给定值的至多±20％、优选至多±10％、更优选至多±5％且更优选至多±1％的范围。可选地，特别是对于生物系统或过程，该术语可以指在某一值的一定数量级之内，优选在2倍之内。在申请以及权利要求书中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则术语“约”是隐含的且在该上下文中是指在该特定值的可接受误差范围内。
“包括”或“包含”或“含有”是指至少所指定的化合物、元件、微粒或方法步骤存在于组合物或制品或方法中，但并不排除其他化合物、材料、微粒、方法步骤的存在，即使其他这些化合物、材料、微粒、方法步骤具有与所指定者相同的功能。
在该整个描述中，各种成分可被识别为具有特定值或参数，然而这些项目被提供作为示例性实施方案。实际上，由于可以实施许多可比参数、尺寸、范围和/或值，因此示例性实施方案不限制本发明的各种方面及概念。术语“第一”、“第二”等以及“最初的”、“第二的”等不指代任何顺序、量或重要性，而是用于区分一个元件与另一元件。
应注意，比如“具体地”、“优选地”、“通常”、“一般地”以及“常常”之类的术语在本文中不用于限制要求保护的发明的范围或暗示某些特征对于要求保护的发明的结构或功能是关键的、必需的或甚至重要的。相反，这些术语仅旨在突出在本发明的具体实施方案中可以使用或可以不使用的可选或额外特征。还应注意，比如“大体上”以及“约”之类的术语在本文中用于表示可属于任何定量比较、值、量度或其他表示的不确定性的内在程度。
还应理解，提及一个或多个方法步骤不排除存在另外的方法步骤或者在清楚识别的那些步骤之间的介于中间的方法步骤。类似地，还应理解，提及组合物中的一个或多个成分不排除除了那些清楚识别的成分之外还存在另外的成分。
在下文中描述的用于构成本发明各种元件的材料旨在为例示性的而非限制性的。执行与本文所述的材料相同或类似功能的许多适宜材料旨在包括在本发明的范围内。本文中未描述的此种其他材料可包括但不限于，例如，在本发明的发展时间之后所开发的材料。
根据本发明，可以采用本领域内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这些技术在文献中全面地阐述。参见例如：Sambrook,Fritsch以及Maniatis，分子克隆：实验室手册，第二版(1989)纽约冷泉港，冷泉港实验室出版社(在本文中“Sambrook等人，1989”)；DNA克隆：实用方法，卷I及II(D.N.Glover编著1985)；寡核苷酸合成(M.J.Gait编著1984)；核酸杂交(B.D.Hames以及S.J.Higgins编著(1985)；转录与翻译(B.D.Hames以及S.J.Higgins编著(1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney编著(1986)；固定化细胞及酶(IRL出版社，(1986)；B.Perbal，分子克隆的实用指南(1984)；F.M.Ausubel等人(编著)，分子生物学实验室指南，约翰威立父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.)(1994)等等。
定义
如本文中所用，“核酸”是指多核苷酸并包括脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸碱基的单链或双链聚合物。核酸还可包括片断以及修饰核苷酸。因此，术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”以及“核酸片段”可互换使用以指代任选地包含合成的、非自然的或经改变的核苷酸碱基的单链或双链的RNA和/或DNA聚合物。核苷酸(它们通常呈5'-磷酸一酯的形式)是如下通过它们单个字母名称来引用：“A”表示腺苷或脱氧腺苷(分别对于RNA或DNA)；“C”表示胞嘧啶或脱氧胞苷；“G”表示鸟苷或脱氧鸟苷；“U”表示尿苷；“T”表示脱氧胸苷；“R”表示嘌呤(A或G)；“Y”表示嘧啶(C或T)；“K”表示G或T，“H”表示A或C或T；“I”表示肌苷；以及“N”表示任何核苷酸。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或多种类似物(例如改变的主链、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉寡聚核苷酸、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如与糖连锁的若丹明或荧光素)、包含巯基的核苷酸、与生物素连锁的核苷酸、荧光基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化核苷酸、肌苷、硫尿核苷、假尿嘧啶核苷、二氢尿嘧啶核苷、Q苷以及丫苷。
如本文中所用，“核苷酸”一般可以指碱基-糖-磷酸盐组合。核苷酸可以包括合成核苷酸。核苷酸可以包括合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列的单体单元(例如脱氧核糖核酸(DNA)以及核糖核酸(RNA))。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸、三磷酸腺苷(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、三磷酸胞嘧啶(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)以及脱氧核糖核苷三磷酸，诸如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。这些衍生物可包括，例如但不限于，[αS]dATP、7-脱氮-dGTP及7-脱氮-dATP，以及在包含核苷酸衍生物的核酸分子上赋予核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文中所用的术语核苷酸可以指三磷酸二脱氧核糖核酸(ddNTP)及其衍生物。三磷酸二脱氧核糖核酸的例示性实例可包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP以及ddTTP。核苷酸可以是未标记的，或者通过众所周知的技术进行可检测标记。标记也可以使用量子点进行。可检测标记可包括例如放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记以及酶标记。核苷酸的荧光标记可包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2'7'-二甲氧基-4'5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、若丹明、6-羧基若丹明(R6G)、N,N,N',N'-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、6-羧基-X-若丹明(ROX)、4-(4'二甲基氨基苯基唑)苯甲酸(DABCYL)、级联蓝、俄勒冈绿、特克斯红、青蓝以及5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。
如本文中所用，“异源附加染色体”可以指不是天然存在于谷类植物中的染色体，因为它来源于非天然染色体(即，来源于完全不同的植物或不同的植物物种，或者来源于谷类植物物种的野生亲缘植物)或者异源附加染色体的至少一部分来源于非天然核酸(例如至少选择标记基因)。关于本文所公开的方法及谷类植物，由于异源附加染色体携带雄性可育性恢复基因，因此它能向谷类植物赋予可育性。而且，由于异源附加染色体携带选择标记基因，因此它能赋予可测量的表型特征。在某些实施方案中，异源附加染色体是单体的，从而导致谷类植物具有奇数条染色体。在某些实施方案中，异源附加染色体易位到谷类植物的基因组中，这可导致谷类植物具有偶数条染色体。在某些实施方案中，异源附加染色体是二体的，从而导致谷类植物具有偶数条染色体。在某些实施方案中，外源物种的雄性可育性恢复基因位于与谷类植物的雄性可育性基因相似的位置中。
如本文中所用，术语“异源染色体片段”可以指来源于非天然核酸(例如至少选择标记基因)或在不同于其自然位置的位置中整合到基因组中的天然核酸的染色体的一部分。关于本文所公开的方法及谷类植物，由于异源染色体片段携带雄性可育性恢复基因，因此它能向谷类植物赋予可育性。而且，由于异源染色体片段携带选择标记基因，因此它能赋予可测量的表型特征。在某些实施方案中，异源染色体片段是谷类植物的基因组内的部分同源染色体对中的一部分。
如本文中所用，“非天然”可以指主题谷类植物的天然核酸或蛋白质中未被发现的核酸或多肽序列。非天然可以指包括突变、插入和/或缺失的自然出现的核酸或多肽序列。非天然的核酸或多肽序列可以通过遗传工程与自然出现的核酸或多肽序列(或其变体)连锁，以产生编码嵌合核酸和/或多肽的嵌合核酸和/或多肽序列。
如本文中所用，在核酸或多肽序列的上下文中的“序列一致性”或“一致性”是指当在指定比较窗口上进行比对来实现最大对应时相同的两个序列中的核酸碱基或氨基酸残基。
如本文中所用，术语“序列一致性百分比”是指通过在比较窗口上比较两个最佳比对序列而测定的值，其中与参考序列(其不包括添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸或多肽序列的部分可包括添加或缺失(即缺口)以实现这两条序列的最佳比对。通过下述方法计算百分比：测定两个序列中存在相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，将匹配位置的数量除以比较窗口中位置的总数，并且将结果乘以100以产生序列一致性百分比。百分比序列一致性的有用实例包括但不限于50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，或从50％至100％的任何整数百分比。
如本文中所用，术语“谷类植物”或“谷类植物品系”是指谷类植物品系、完整植物、植物器官、植物组织、种子、植物细胞，以及它们的种子及后代。谷类植物细胞包括但不限于来自种子、胚胎、合子、孢子体、花粉、小孢子、悬浮培养物、分生组织区、愈伤组织、叶子、根、嫩芽、配子体、原生质体以及质体的细胞。谷类植物部分包括分化和未分化组织，其包括但不限于根、茎、嫩芽、叶子、花粉、种子、花、消耗品(例如谷粒)、肿瘤组织、植物细胞以及植物细胞培养物。谷类植物组织包括植物细胞，并且可以位于植物中或位于植物器官、组织或细胞培养物中。谷类植物组织还指此种植物、种子、后代、不管是有性还是无性产生的繁殖体及其任一者的后代(诸如插条或种子)的任何克隆。谷类植物器官是指植物组织或构成在形态上及功能上不同的植物部分的各组织的群。
术语“基因组”是指生物体每个细胞、或病毒或细胞器中存在的遗传物质(基因以及非编码序列)的完整互补体。“后代”包括植物的任何下一代。
如本文中所用，术语“杂交”是指配子通过授粉进行融合以产生后代(即细胞、种子或植物)。该术语包括有性杂交(一个植物被另一植物授粉)以及自花受精(自交、自花授粉，即当花粉与胚珠(或小孢子与大孢子)来自同一植物或在遗传学上相同的植物)两者。
如本文中所用，术语“杂交植物”或“杂交谷类植物”是指来源于两个在遗传学上不同的亲本之间的杂交的第一代子代。在某些实施方案中，杂交植物或杂交谷类植物包括所有第一代后代，其被定义为F1或子代，成长于具有不同基因型的两个单独植物之间的杂交。
如本文中所用，术语“转基因植物”以及“转基因谷类植物”包括例如，在其基因组内包括通过转化步骤引入的异源多核苷酸的植物。异源多核苷酸可以稳定地整合在基因组中，使得多核苷酸被传递给连续世代。异源多核苷酸可以单独地或作为重组DNA构建体的一部分整合到基因组中。转基因植物还可以在其基因组内包括一种以上的异源多核苷酸。每一种异源多核苷酸均可向转基因植物赋予不同的特性。异源多核苷酸可包括来自外源物种的序列，或者如果来自相同物种，则可以由其天然形式被充分地修饰。转基因可包括基因型由于存在异源核酸而被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括最初被如此改变的那些转基因以及通过来自初始转基因的有性杂交或无性繁殖而形成的那些转基因。通过以下方式实现的基因组(染色体或染色体外)的改变并不旨在被视为转基因：常规植物育种方法；不会导致插入外源多核苷酸的本文所述的基因组编辑程序；或自然发生的事件，诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发性突变。
在本公开的某些实施方案中，“可育植物”是产生能存活的雄性及雌性配子且是自花可育的植物。此种自花可育的植物可以产生后代植物而无需来自配子的任何其他植物以及其中所包含的遗传物质的助力。本公开的其他实施方案可以包括使用如下的植物：因为该植物不会产生能存活的或以其他方式能够受精的雄性配子或雌性配子或这两者，因此该植物不是自花可育的。
如本文中所用，“雄性不育植物”是不会产生能存活的或以其他方式能够受精的雄性配子的植物。如本文中所用，“雌性不育植物”是不会产生能存活的或以其他方式能够受精的雌性配子的植物。人们认识到，雄性不育以及雌性不育植物可以分别是雌性可育的以及雄性可育的。人们进一步认识到，雄性可育(但雌性不育)植物在与雌性可育植物杂交时可以产生能存活的后代，并且雌性可育(但雄性不育)植物在与雄性可育植物杂交时可以产生能存活的后代。在某些实施方案中，雄性不育雌性亲本如果自花受精的话，则在其中无法产生能存活的雄性。
如本文中所用，术语“整倍体”是指正常的染色体互补体。在某些实施方案中，整倍体是指野生型植物中出现的染色体数量。
如本文中所用，术语“内源”、“天然”、“原始”或“野生型”是指自然出现的核酸或多肽/蛋白质。天然核酸或蛋白质可以通过物理方式采自其中该天然核酸或蛋白质自然出现的特定生物体，或者可以是与自然出现的核酸或蛋白质相同的通过人工合成方式构成的核酸或蛋白质。
根据本公开的术语“相关联”或“与……相关联”应被广泛地解释并且因此根据本发明暗指，核酸或基因被提供成与另一核酸或基因在物理上相关联，例如在同一染色体内，并且更优选地，在同一染色体的着丝粒的同一侧上。在某些实施方案中，相关联或与……相关联可以指，核酸或基因遗传连锁和/或紧密靠近。如本文中所用，术语“遗传连锁”可以指位于同一染色体上的两个基因。在某些实施方案中，“遗传连锁”可以指两个基因以其中在两个标记/特性之间不会出现重组的方式连锁。如本文中所用，术语“紧密靠近”可以指两个基因存在于同一染色体臂上并且正常地传递并保持相关联/在一起。
术语“基因组编辑”、“基因编辑”以及“基因组工程”在本文中可互换使用并且是指用于在至少一个位置处对活生物体(例如谷类植物)的任何遗传信息或基因组进行定向特异性修饰的策略及技术。正因如此，这些术语不仅包括基因编辑，而且包括除了基因组的基因编码区域之外的区域的编辑。
如本文中所用，术语“盒”、“质粒”以及“载体”是指如下的染色体外元件：其通常携带不是细胞的天然基因组的一部分的基因，且通常呈双链DNA的形式。此种元件可以是来源于任何来源的单链或双链DNA或RNA的呈线性或环状形式的自主复制序列、基因组整合序列、噬菌体或核苷酸序列，其中许多核苷酸序列已经加入或重组到独特的构建体中，该独特的构建体能够将目的多核苷酸引入细胞中。
如本文中所用，术语“表达”是指呈前体或成熟形式的功能性最终产物(例如DNA、基因、mRNA、指导RNA或蛋白质)的产生。
本发明的谷类植物、雄性可育性基因以及选择标记基因
本发明涉及形成并保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物品系的材料及方法。本文所公开的杂交生产系统是由雄性不育雌性亲本的产生而得到。雄性不育是通过拥有雄性可育性基因的纯合突变和/或有效地使雌性亲本谷类植物绝育或导致产生用来使雌性亲本谷类植物绝育的蛋白质的基因的表达来实现。本文所公开的方法形成了杂交生产系统，其是稳健的且能从作为雄性可育谷类植物(即保持系)的那些中精确地识别出作为雄性不育谷类植物(即雌系)的谷类植物和/或种子。雄性不育雌性植物可以用于产生新的杂交谷类植物。雄性可育谷类植物可以自花受精以形成下一个种子群体。
在本发明之前，异源附加染色体的错分裂和/或断裂可以使得雄性可育性恢复基因与选择标记解除关联(参见图2)，从而得到不表达选择标记基因的雄性可育谷类植物和/或种子以及表达选择标记基因但实际上是雄性不育的谷类植物和/或种子。在某些实施方案中，如本文所公开的谷类植物未表现出异源附加染色体的错分裂。在某些实施方案中，谷类植物未表现出异源附加染色体的断裂。在某些实施方案中，如果发生错分裂，则将不会导致假阳性/阴性结果。在某些实施方案中，如果如本文所公开的谷类植物经历了异源附加染色体的错分裂和/或断开，则不会破坏雄性可育性恢复基因与选择标记基因的关联。因此，在所公开的谷类植物中与选择标记基因相关联的雄性可育性恢复基因在异源附加染色体的着丝粒的同一侧上的排列使得收率损失降低。所述排列确保了通过自花受精得到的所有植物均是纯种的。换句话说，不具有选择标记的所有植物均是不育的，并且具有选择标记的所有植物均是可育的。
包含异源附加染色体的谷类植物
本文公开了用于生产杂交谷类植物的谷类植物(如上所述，其包括谷类植物的种子、后代或其部分等等)，其中雄性可育保持谷类植物包括异源附加染色体，该异源附加染色体携带雄性可育性恢复基因(例如显性雄性可育性恢复基因)以及至少一个选择标记基因，并且其中该雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因位于该异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。例如，雄性可育性恢复基因在异源附加染色体的着丝粒的同一侧上与该至少一个选择标记基因相关联。在某些实施方案中，存在一个选择标记基因，并且其在异源附加染色体的着丝粒的同一侧上与雄性可育性恢复基因相关联。在某些实施方案中，存在两个、三个、四个或五个选择标记基因，其中每一个选择标记基因均在异源附加染色体的着丝粒的同一侧上与雄性可育性恢复基因相关联。在某些实施方案中，选择标记基因中的至少一个是颜色标记基因，如下文所述。
在某些实施方案中，谷类植物纯合地包括雄性可育性基因突变，如下文所述。在某些实施方案中，谷类植物包括有效地使谷类植物的天然雄性可育性基因绝育的基因或基因产物，如下文所述。
在某些实施方案中，除了其整倍体数量的染色体之外，谷类植物还包括一条附加染色体(即单体异源附加染色体)，其中显性雄性可育性恢复基因以及该至少一个选择标记基因位于该附加染色体上。
在某些实施方案中，除了其整倍体数量的染色体之外，谷类植物还包括成一对的两条附加染色体(即二体异源附加染色体)，其中显性雄性可育性恢复基因以及该至少一个选择标记基因位于这些附加染色体中的至少一者上。
在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因是与谷类植物的天然雄性可育性基因相同的基因。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因是与谷类植物的天然雄性可育性基因直系同源。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因如谷类植物的天然雄性可育性基因一样位于异源附加染色体上的直系同源位置中(即，如同天然雄性可育性基因位于谷类植物的基因组中，雄性可育性恢复基因位于异源附加染色体上的相同或类似位置中)。
包含异源附加染色体的谷类植物可以通过如本文所公开的任一方法来产生。例如，包含异源附加染色体的谷类植物可以通过如下方式来产生：重排异源附加染色体，使得雄性可育性恢复基因在异源附加染色体的着丝粒的同一侧上与选择标记基因相关联。
已知杀配子(Gc)基因(也被称为杜鹃基因)能导致配子败育以及染色体断裂。Gc基因通过异源附加染色体而被引入作物中以实现育种目的。一些Gc基因通过使未携带这些Gc基因的配子选择性败育而牢固地存在于宿主中；因此，这些Gc基因优先被传递给子代。在某些实施方案中，如本文所公开的包含异源附加染色体的谷类植物可以通过Gc基因方法来产生。在某些实施方案中，Gc基因诱导至少一条异源附加染色体的断裂及重排。在某些实施方案中，谷类植物包括Gc基因。在某些实施方案中，使用Gc基因来产生谷类植物，但是通过使用谷类植物的连锁遗传标记而将Gc基因通过育种消除，或者Gc基因不存在于谷类植物中。在某些实施方案中，Gc基因来源于山羊草属(Aegilops)。在某些实施方案中，Gc基因来源于不同的基因组，诸如但不限于C、S、Sl、Ssh以及Mg。参见Endo，2007，Chromosome Res.15(1)：67-75，以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。在某些实施方案中，Gc基因是位于以下染色体上的Gc因子：卵穗山羊草(Ae.geniculata)的染色体4Mg(Kynast等人，2000，Chromosome Res.8：133-139)；柱穗山羊草(Ae.cylindrica)的染色体2Cc；尾状山羊草(Ae.caudata)的染色体3C和/或钩刺山羊草(Ae.triuncialis)的3Ct；长山羊草(Ae.longissimi)的染色体2S和/或4S；或沙融山羊草(Ae.sharonensis)的Gc2(Maan 1975，Crop Sci.15：287-292；Endo 1985，Jpn.J.Genet.60：125-135)；还参见上文Endo 2007，每一参考均以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。在某些实施方案中，Gc基因是位于卵穗山羊草的4Mg或柱穗山羊草的2Cc上的Gc因子。
在某些实施方案中，包含异源附加染色体的谷类植物可以通过辐射方法来产生。在某些实施方案中，辐射诱导至少一条异源附加染色体的断裂及重排。
在某些实施方案中，包含单体异源附加染色体的谷类植物可以通过基因编辑方法来产生。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因靠近该至少一个选择标记基因被整合到异源附加染色体上。在某些实施方案中，该至少一个选择标记基因靠近雄性可育性恢复基因被整合到异源附加染色体中。在某些实施方案中，核酸酶诱导异源附加染色体的重排，使得雄性可育性恢复基因与至少一个选择标记基因彼此相关联。在某些实施方案中，基因编辑方法将雄性可育性恢复基因与至少一个选择标记基因遗传连锁。在某些实施方案中，基因编辑方法使雄性可育性恢复基因与至少一个选择标记基因彼此紧密靠近。包含部分同源染色体的谷类植物
同源染色体包含相同顺序的相同基因，尽管它们可以具有不同的等位基因。部分同源(即相关)染色体可以具有类似的基因含量及顺序，但是在重复DNA含量方面不同。部分同源配对是在不同基因组中的或在同一基因组内但在通常不配对的染色体之间的相关/等效染色体的配对。
本文公开了用于生产杂交谷类植物的谷类植物(如上所述，其包括谷类植物的种子、后代或其部分等等)，其中雄性可育保持谷类植物包括至少一个部分同源染色体对，该对由第一及第二染色体组成，其中第一染色体是该谷类植物天然存在的，并且第二染色体是异源附加染色体或包括异源染色体片段，该异源染色体片段包括雄性可育性恢复基因(例如显性雄性可育性恢复基因)以及至少一个选择标记基因。在某些实施方案中，第二染色体进一步包括天然DNA。在某些实施方案中，第一染色体是4A、4B、4D或5A。在某些实施方案中，第一染色体不是染色体4B。在某些实施方案中，避开染色体4B，因为这也是Probus缺失(即雄性可育性基因突变)所在的位置，其可使将来的育种复杂化。
在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于部分同源对的第二染色体的着丝粒的不同侧上。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于部分同源对的第二染色体的着丝粒的同一侧上。例如，可以将雄性可育性恢复基因与选择标记基因重排到附加染色体的一侧，并随后易位到谷类植物的正常基因组中或者可以使用基因组编辑来将它们引入。
通过Ph(部分同源配对抑制)基因来控制部分同源配对。例如，Ph1基因座是小麦中的染色体配对及重组的主要调节器。Ph1确保了在减数分裂期间，重组仅发生在同源染色体对之间，而不会发生在来自相关(部分同源)亚基因组的染色体之间。来源于普通小麦中国春的已知突变小麦品系ph1b允许发生部分同源配对。在某些实施方案中，本文所公开的谷类植物(其包括谷类植物的种子、后代或其部分等等)包括突变的部分同源配对抑制基因。普通小麦中国春ph1b突变体是表达突变部分同源配对抑制基因的谷类植物的非限制性实例(堪萨斯州立大学WGRC(小麦遗传资源中心)，登记号为TA3809)。在某些实施方案中，部分同源配对可以通过表达抑制部分同源抑制基因的基因来进行，这些基因诸如但不限于来自拟斯卑尔脱山羊草(T.speltoides)的那些。
在某些实施方案中，部分同源配对抑制基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。在某些实施方案中，部分同源配对抑制基因突变是来自染色体5B或染色体3B的基因缺失。在某些实施方案中，缺失的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。在某些实施方案中，突变的部分同源配对抑制基因是ph1b。
在某些实施方案中，部分同源配对抑制基因突变可以用于产生谷类植物，并通过育种从谷类植物消除(即，谷类植物不包括突变的部分同源配对抑制基因)。
在某些实施方案中，谷类植物(如上所定义，其包括谷类植物的种子、后代或其部分等等)包括整倍体数量的染色体，由整倍体数量的染色体组成，或基本上由整倍体数量的染色体组成。
在某些实施方案中，谷类植物纯合地包括雄性可育性基因突变，如下文所述。在某些实施方案中，谷类植物包括有效地使谷类植物的天然雄性可育性基因绝育的基因或基因产物，如下文所述。
包含整合外源核酸的谷类植物
本文公开了用于生产杂交谷类植物的谷类植物(如上所述，其包括谷类植物的种子、后代或其部分等等)，其中雄性可育保持谷类植物包括与至少一个选择标记基因相关联的雄性可育性恢复基因(例如显性雄性可育性恢复基因)，其中该雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因一起整合到谷类植物基因组中。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因和/或至少一个选择标记基因对于谷类植物品系来说是外源的(即非天然的)。
在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于它们被整合到的染色体的着丝粒的同一侧上。
谷类植物类型
如本文中所用的“谷类植物”是指为了实现其谷粒的食用价值而栽培的禾本科(即，禾本科(Graminaceae或Poaceae))的作物植物，诸如但不限于小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦、燕麦、黑麦、高粱、粟、荞麦、福尼奥米(funio)以及奎奴亚藜(quino)。在某些实施方案中，谷类植物是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。在某些实施方案中，谷类植物是小麦(例如，小麦属(Triticum)的任何物种，包括其祖先，以及通过与其他物种杂交而产生的其后代)。在某些实施方案中，谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。六倍体小麦(例如，AABBDD的基因组组织)是由42条染色体构成，并包括例如普通小麦(T.aestivum)、斯佩耳特小麦(T.spelta)、摩卡小麦(T.mocha)、密穗小麦(T.compaction)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)，及其种间杂交。四倍体小麦(例如，AABB的基因组组织)是由28条染色体构成，并包括例如硬粒小麦(也被称为硬质小麦或硬粒小麦(Triticum turgidum ssp.durum))、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T polonicum)，及其种间杂交。小麦还可以包括六倍体或四倍体小麦属的可能的祖先，诸如用于A基因组的乌拉尔图小麦(T.uartu)、一粒小麦或野生一粒小麦，用于B基因组的拟斯卑尔脱山羊草，以及用于D基因组的节节麦(T.tauschii)(也被称为方穗山羊草(Aegilops squarrosa)或粗山羊草(Aegilops tauschii))。在某些实施方案中，谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
这些方法在自花受精的所有物种中应该都能起作用。可以使用另外的植物，包括单子叶植物和双子叶植物。可以使用的单子叶植物的实例包括但不限于：甘蔗(甘蔗属(Saccharum spp.))、玉米(Zea mays)、水稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、高粱(Sorghum bicolor,Sorghum vulgare)、粟(例如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、燕麦(Avena)、大麦(Hordeum)、柳枝稷(Panicum virgatum)、菠萝(Ananas comosus)、香蕉(Musaspp.)、棕榈、观赏植物、草皮草以及其他草。可以使用的双子叶植物的实例包括但不限于：大豆(Glycine max)、芥花籽油作物(甘蓝型油菜(Brassica napus)以及油菜(B.campestris))、苜蓿(Medicago sativa)、烟草(Nicotiana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、向日葵(Helianthus annuus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、棉花(Gossypium arboreum)、以及花生(Arachis hypogaea)、蕃茄(Solanum lycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)等。可以使用的另外的单子叶植物包括油棕(Elaeisguineensis)、苏丹草(Sorghum×drummondii)以及黑麦(Secale cereale)。可以使用的另外的双子叶植物包括红花(Carthamus tinctorius)、咖啡(小果咖啡(Coffea arabica)和中果咖啡(Coffea canephora))、苋(Amaranthus spp.)，以及油菜(欧洲油菜(Brassicanapus)和甘蓝型油菜(Brassica napobrassica)；高芥酸及芥花籽油作物)。
用于本发明方法及组合物的另外的非限制性示例性植物包括大麦(Hordeumvulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbusom)、双色高粱(Sorghum bicolor)、甘蔗(Saccharumofficinarium)、玉米(Zea may)、小米(Setaria italica)、小粒野生稻(Oryza minuta)、水稻(Oriza sativa)、澳洲野生稻(Oryza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、黑小麦(Triticale)、苹果(Malusdomestica)、二穗短柄草、海滨大麦(Hordeum marinum)、粗山羊草(Aegilops tauschii)、胡萝卜(Daucus glochidiatus)、甜菜(Beta vulgaris)、小胡萝卜(Daucus pusillus)、莫里亚特胡萝卜(Daucus muricatus)、野胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptusgrandis)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、茸毛烟草(Nicotiana tomentosiformis)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、本氏烟草(Nicotiana benthamiana)、番茄(Solanumlycopersicum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、中果咖啡(Coffea canephora)、葡萄(Vitisvinifera)、Erythrante guttata、螺旋狸藻(Genlisea aurea)、小黄瓜(Cucumissativus)、桑树(Morus notabilis)、大沙叶拟南芥(Arabidopsis arenosa)、琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、喜马拉雅鼠耳芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalaya wallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursapastoris)、无苞芥(Olmarabidopsis pumila)、硬毛南芥(Arabis hirsute)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜菁(Brassica rapa)、萝卜(Raphanus sativus)、芥菜(Brassicajuncacea)、黑芥菜(Brassica nigra)、芝麻菜(Eruca vesicaria subsp.sativa)、甜橙(Citrus sinensis)、麻疯树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)、蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)、山下鹰嘴豆(Cicer yamashitae)、野生鹰嘴豆(Cicerbijugum)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、网状鹰嘴豆(Cicer reticulatum)、鹰嘴豆(Cicerjudaicum)、木豆(Cajanus cajanifolius)、蔓草虫豆(Cajanus scarabaeoides)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypium sp.)、紫云英(Astragalussinicus)、百脉根(Lotus japonicas)、蓝猪耳(Torenia fournieri)、洋葱(Allium cepa)、大葱(Allium fistulosum)、大蒜(Allium sativum)、向日葵(Helianthus annuus)、菊芋(Helianthus tuberosus)以及韭菜(Allium tuberosum)，或属于上述植物中的一者的任何种类或亚种。
还包括使用小麦属作为与非小麦物种进行有性杂交的亲本来通过常规技术产生的植物，所述小麦属诸如黑麦(Secale cereal)，包括但不限于黑小麦。在某些实施方案中，谷类植物是黑小麦。
雄性可育性基因
本文所公开的谷类植物包括核酸及肽，它们影响雄性可育性。在某些方面，影响雄性可育性的核酸是雄性可育性基因，其对于谷类植物是内源的或“天然的”。在某些实施方案中，雄性可育性基因是突变的，因此形成雄性不育谷类植物。导致基因功能抑制的内源基因的突变可以通过，例如但不限于，以下方式来产生：通过将一种或几种核苷酸删除或插入到基因的核苷酸序列中(例如，启动子、编码序列或内含子中)；通过使用其他不同的核苷酸来替代基因中的一种或几种核苷酸；或通过将基因敲除(例如，通过使用合适的定向载体进行同源重组)。在两个等位基因中均具有突变的谷类植物可以通过，例如但不限于，使用本领域中已知的杂交方法来获得。在某些实施方案中，突变可以是基因缺失、基因敲低或基因敲除的结果。
在某些实施方案中，雄性可育性基因是Ms1，包括Ms1的同源物和同系物。在某些实施方案中，雄性可育性基因包括核酸，或由核酸组成或基本上由核酸组成，核酸包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。普通小麦的另外的突变体包括如Pugsley的(ms1a)中所公开的突变体：参见Pugsley,A.T.以及R.N.Oram(1959)Aust.Pl.Breed.Genet.Newsl.编号14：10-11；Suneson,C.A.(1962)Crop Sci.2：534-535；以及Waninge,J.以及Zeven,A.C.(1968)Euphytica 17：378-380；Probus(ms1b)：参见Fossati,A.以及M.Ingold(1970)Wheat Information Service(京都)30：3-10；Cornerstone(ms1c)：参见Driscoll,C.J.以及K.K.Barlow(1976)Induced Mutation inCross-Breeding，奥地利维也纳，IAEA，第123-131页；还参见Endo等人(1991)The JapaneseJournal of Genetics 66(3)：291-295；Klindworth等人(2002)Crop Sci.42：1447-1450；Cenci等人(2003)Theor.Appl.Genet 107(5)：931-9；美国5,478,369；以及US20160201084，其中每一者均以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。还包括Ms1突变体ms1d、ms1e以及ms1f及其变体，Klindworth等人，2002，Crop Sci.42：1447-1450；ET0487、ET0488、ET0489、ET0490、ET0491、ET0495、007-0033.1及007-0046.1，以及在Tucker等人的NatureCommunications 8，文章编号：869(2017)中所公开的ms1突变体，其中每一者均以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。在某些实施方案中，突变是Probus缺失(ms1b)。
在某些方面，雄性可育性可以通过有效地使谷类植物绝育或导致产生用来使谷类植物绝育的蛋白质的基因的表达来除去；参见EP0329308、EP0737749、WO1990/08828以及WO1990/08829，其中每一者均以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。例如，导致基因功能抑制的内源基因的失活还可以通过以下方式来实现：向植物的细胞中引入转基因，该转基因抑制内源基因的表达或从内源基因表达的产物(例如编码多肽)；或引入编码产物(例如RNA)的转基因，该产物在谷类植物的细胞(其中基因被正常表达)中抑制内源基因的表达或由内源基因编码的产物。在某些实施方案中，不育基因可以是MS26(参见例如美国专利7,098,388；7,517,975；以及7,612,251)、MS45(参见例如美国专利5,478,369以及6,265,640)或MSCA1(参见例如美国专利7,919,676)。例如但不限于，内源可育性基因的失活可以通过表达植物生殖器官(例如花丝、花药、绒毡层以及花粉)的细胞中的发夹型RNA分子(hpRNA)来实现；参见例如Matzke等人(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.11：221-227；Scheid等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.，美国99：13659-13662；Waterhouse以及Helliwell(2003)Nature Reviews Genetics 4：29-38；Aufsaftz等人(2002)Proc.Nat'l.Acad.Sci.99(4)：16499-16506；Sijen等人(2001)Curr.Biol.11：436-440)；Kenn等人(1986)J.Bacteriol.168：595；McLean等人(1987)J.Bacteriol.169：1017(1987)；以及美国专利第4,918,006号，其中每一者均以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。
雄性可育性基因突变体的表型可以使用本领域中已知的技术来进行。例如，可以对谷类植物进行遗传筛选。还可以通过例如以下方式来使用定量可育性评分：通过在开花之前覆盖每株植物的至少三个穗(例如，通过用纸夹固定的纸袋)来阻止自由传粉的种子形成。为了确定定量可育性得分，计算每个穗的小花数量以及每个穗的种子数量，并将其表示为所形成的每朵小花的种子数量。
本文还提供了雄性可育性恢复基因，其用于恢复雄性不育植物的可育性。将雄性可育性恢复基因选择成能够补偿雄性可育性基因的突变或能够抵消任何不育基因或蛋白质。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因是隐性的。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因是显性的。雄性可育性恢复基因可以是上文所公开的雄性可育性基因的功能形式。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因是Ms1，包括Ms1的同源物和同系物。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因包括核酸，或由核酸组成或基本上由核酸组成，核酸包括选自由以下组成的组的核酸序列：(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(iv)具有相对于如SEQID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦、沙达一粒小麦(T.thaouder)或乌拉尔图小麦(T.urartu)。
选择标记基因
本文还提供了选择标记基因，其可以用于识别雄性可育谷类植物和/或种子。选择标记基因编码可评分的或可筛选的标记。为了精确地识别雄性可育植物，选择标记必须与雄性可育性恢复基因相关联。由于本文所公开的方法使得选择标记基因与雄性可育性恢复基因位于同一染色体的着丝粒的同一侧上，因此白色可育种子及植物明显少于蓝色不育种子。这是因为发生错分裂的机会减少，错分裂会导致选择标记基因与雄性可育性恢复基因分离或解除关联(即，导致两条端着丝点染色体，其中一条仅携带选择标记基因，而另一条仅携带雄性可育性恢复基因)。正因如此，所公开的方法以及在着丝粒的同一侧上携带与雄性可育性恢复基因相关联的选择标记基因的谷类植物品系具有改善的减少的收率损失。
例如但不限于，选择标记基因可以是颜色标记基因(例如，种子、须、外皮、穗、花和/或谷粒)、植物高度基因、质地基因、香气基因、微卫星(例如，短串联重复(STR)或简单序列重复(SSR))、限制性片段长度多态性(RFLP)、多态性DNA随机扩增(RAPD)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单核苷酸多态性(SNP)或其组合。
在某些方面，选择标记是颜色标记(例如，可视和/或荧光)。当选择标记是颜色标记时，根据如何表达颜色表型以确定哪些植物或种子具有雄性可育性恢复基因，可以分离谷类植物或种子。例如，如果颜色标记使得种子具有特化(例如，蓝色糊粉或其他胚乳着色特性)，则可以将种子分成着色种子(例如蓝色种子)以及天然着色(例如红色/白色)种子，雄性可育植物(即保持系)从这些着色种子成长，雄性不育植物(即雌系)从这些天然着色种子成长。直接将雄性不育雌系的种子从后代区分出来的可能性简化了系统，并且在很大程度上降低了杂交种子的生产成本。例如，种子精选机将能够检测天然颜色与表达颜色标记的种子之间的差别。
在某些实施方案中，颜色选择标记基因可来自，例如但不限于，蓝色糊粉基因(例如，来自高冰草、绒毛冰草、沙达一粒小麦或一粒小麦)。
在某些实施方案中，选择标记可以是例如但不限于：β-葡萄糖醛酸酶；uidA基因(GUS)(编码已知各种显色底物的酶(例如，美国专利第5,268,463号以及第5,599,670号))；氯霉素乙酰转移酶；碱性磷酸酶；花青苷/类黄酮多核苷酸(例如，R基因座多核苷酸(编码调节植物组织中的花青苷色素(红色)的产生的产物))；控制类黄酮色素的生物合成的基因(例如，玉米C1及C2、B基因、p1基因以及bronze基因座基因)；青色萤光蛋白质(CYP)基因；黄色荧光蛋白质基因(YFP)；红色荧光蛋白质基因(RFP)、黄绿色荧光蛋白质(mNeonGreen)、lux基因(编码荧光素酶)；绿色荧光蛋白质(GFP)以及DsRed2(Clontech Laboratories公司，美国加利福尼亚州山景城)；编码已知各种显色底物的酶的p-内酰胺酶基因(例如，PADAC，显色头孢菌素)；xylE基因(编码可以转化显色儿茶酚的儿茶酚双加氧酶)；以及酪氨酸酶基因(编码能够将酪氨酸氧化成DOPA及多巴胺(其继而浓缩形成可易于检测的黑色素)的酶)。还包括任何选择标记，这些选择标记的存在可以使用例如X射线胶片、闪烁计数、荧光分光光度法、低光度摄影机、光子计数探测器(例如照相机)和/或多孔发光计来检测。
在以下文献中可发现另外的标记：Yarranton，Curr Opin Biotech(1992)3：506-11；Christopherson等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1992)89：6314-8；Yao等人，Cell(1992)71：63-72；Reznikoff，Mol Microbiol(1992)6：2419-22；Hu等人，Cell(1987)48：555-66；Brown等人，Cell(1987)49：603-12；Figge等人，Cell(1988)52：713-22；Deuschle等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1989)86：5400-4；Fuerst等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1989)86：2549-53；Deuschle等人，Science(1990)248：480-3；Gossen，Ph.D.Thesis，德国海德堡大学(1993)；Reines等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1993)90：1917-21；Labow等人，Mol Cell Biol(1990)10：3343-56；Zambretti等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1992)89：3952-6；Bairn等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1991)88：5072-6；Wyborski等人，Nucleic Acids Res(1991)19：4647-53；Hillen和Wissman，Topics Mol Struc Biol(1989)10：143-62；Degenkolb等人，Antimicrob Agents Chemother(1991)35：1591-5；Kleinschnidt等人，Biochemistry(1988)27：1094-104；Bonin，Ph.D.Thesis，德国海德堡大学(1993)；Gossen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.美国(1992)89：5547-51；Oliva等人，Antimicrob Agents Chemother(1992)36：913-9；Hlavka等人，Handbook of ExperimentalPharmacology(1985)，第78卷(Springer-Verlag，柏林)；Gill等人，Nature(1988)334：721-4；所有这些均以引用的方式全文并入本文中以用于所有预期目的。
形成并保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物品系的方法
本发明涉及形成并保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物品系的材料及方法。本文所公开的杂交生产系统是由雄性不育雌性亲本的产生得到。雄性不育是通过拥有雄性可育性基因的纯合突变和/或有效地使雌性亲本谷类植物绝育或导致产生用来使雌性亲本谷类植物绝育的蛋白质的基因的表达来实现。本文所公开的方法形成了杂交生产系统，其是稳健的且能从作为雄性可育谷类植物(即保持系)的那些中精确地识别出作为雄性不育谷类植物(即雌系)的谷类植物和/或种子。雄性不育雌性植物可以用于产生新的杂交谷类植物。雄性可育谷类植物可以自花受精以形成下一个种子群体(即，保持谷类植物品系)。
本发明的实施方案大体上涉及用于改善当前42+1染色体系统的方法及材料，其包括，例如但不限于，异源附加染色体的重排或易位。在某些实施方案中，为了易于检测，该系统使用雄性可育性恢复基因以及选择标记(例如颜色标记)。异源附加染色体在其自身内的重排可通过杀配子(Gc)基因、辐射和/或基因编辑来实现。异源染色体片段的易位可通过部分同源配对(例如ph1b辅助)和/或基因编辑来实现。
杀配子(Gc)基因方法
在某些实施方案中，根据本发明的各个方面，该方法可包括将杀配子(Gc)基因引入包括在着丝粒的不同侧上携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的异源附加染色体的谷类植物品系中，以诱导异源附加染色体的重排，使得雄性可育性恢复基因与至少一个选择标记基因位于着丝粒的同一侧上。参见例如图5。在某些实施方案中，方法包括：a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系(如上所述)，该谷类植物品系包括至少一条异源附加染色体，该至少一条异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因；b)重排该至少一条异源附加染色体；以及c)获得包括重排异源附加染色体的谷类植物。在上文更详细地描述了雄性可育性基因、雄性可育性恢复基因以及该至少一个选择标记基因。
在某些实施方案中，重排步骤b)是由至少一个Gc基因的存在而实现。在上文中更详细地公开了合适的Gc基因的实例。Gc基因诱导该至少一条异源附加染色体的断裂及重排。断裂及重排导致雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因彼此相关联并位于该至少一条异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
Gc基因可以作为单体附加染色体来引入。在某些实施方案中，将Gc基因通过育种从谷类植物品系消除(breed out)。这可以通过抛弃表达Gc基因的种子来实现。例如，可以通过本领域中的技术人员通常已知的分子和/或细胞遗传技术来直接检测Gc基因。还可以通过识别包含43条染色体(即，Gc基因位于异源附加染色体上；参见图5)的未标记(例如白色)的种子来检测Gc基因。还可以通过识别包含44条染色体(即，种子包含两条异源附加染色体：一条包括Gc基因且另一条包括雄性可育性恢复基因以及选择标记基因；参见图5)的被标记用于选择的种子和/或植物(例如，在蓝色糊粉基因的情况下，蓝色种子)来检测Gc基因。。
在某些实施方案中，Gc基因已经存在于谷类植物的基因组中，并且一旦出现了异源附加染色体的重排，Gc基因便会任选地发生突变。
在某些实施方案中，异源附加染色体是单体的。在某些实施方案中，异源附加染色体是二体的。
作为举例而并非限制，用于生产杂交谷类植物的Gc基因方法可以通过如下的步骤(还参见如实施例1中所概述的；图5)来实现：
步骤a)：使包括至少一条异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变的第一谷类植物与包括携带杀配子基因的至少一条杀配子附加染色体、优选携带杀配子基因的两条附加染色体的第二谷类植物杂交，该至少一条异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。该第一杂交将Gc基因引入携带异源附加染色体的谷类植物品系中。在某些实施方案中，异源附加染色体是单体的。在某些实施方案中，杀配子附加染色体是二体的。在某些实施方案中，杀配子附加染色体是单体的。在某些实施方案中，第一谷类植物表达可育性抑制基因而不是纯合的雄性可育性基因突变，并且雄性可育性恢复基因能够阻挡可育性抑制基因的影响。
步骤b)：收获、选择并种植表达选择标记基因的通过步骤a)产生的至少一粒种子，其中该种子包括该至少一条异源附加染色体以及单体杀配子附加染色体以产生第三谷类植物。第三谷类植物包括杂合雄性可育性基因突变以及Gc染色体的单一拷贝，或者不包括Gc染色体。例如，抛弃不表达选择标记的由杂交产生的种子和/或谷类植物，同时保留表达选择标记的种子和/或谷类植物以用于进一步杂交。
步骤c)：使步骤b)中所产生的第三谷类植物与步骤a)的第一谷类植物杂交。在该步骤中，两个亲本均表达异源附加染色体。第一谷类植物用于保持msms状态。
步骤d)：收获、选择并种植表达选择标记基因的在步骤c)中产生的至少一粒种子，其中该种子包括单体异源附加染色体(即总共43条染色体)以及纯合的雄性可育性基因突变以产生包括纯合的雄性可育性基因突变的第一子代的后代谷类植物。分子标记可以用于选择纯合的msms并去除Msms类型。
步骤e)：使步骤d)中所产生的第一子代的后代谷类植物自花受精；
步骤f)：收获、选择并种植表达选择标记基因的在步骤e)中产生的至少一粒种子，其中该种子包括单体异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变以产生第二子代的后代谷类植物。保留表达选择标记的种子和/或谷类植物，同时抛弃不表达选择标记的那些种子和/或谷类植物。
步骤g)：使步骤f)中所产生的第二子代的后代谷类植物自花受精。
步骤h)：任选地重复步骤f)及g)以产生至少一个另外的子代。
步骤i)：收获步骤g)中所产生的第三子代的种子，或如果执行步骤h)，则收获步骤h)中所产生的第三子代的种子。
步骤j)：选择并种植不表达选择标记基因的第三子代的至少一粒种子以产生第四子代的后代谷类植物。在某些实施方案中，选择并种植至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300粒种子。
步骤k)：对步骤j)中所产生的第四子代的谷类植物的穗进行表型分型。在种植时，未表现出可育穗的不表达选择标记的所有种子可以具有重排的异源附加染色体，并且表达选择标记的对应种子可以进行细胞学检查以确认是否已发生有利的重排。
步骤l)：选择在步骤k)中显示完全不育的第四子代的谷类植物群体以产生用于生产杂交谷类植物的谷类植物。可以基于该至少一个选择标记基因的表达来进行选择处理。抛弃不具有完全不育的任何群体。在某些实施方案中，选择并种植至少25、至少30、至少35、至少40、至少45、至少50、至少55、至少60、至少65、至少70、至少75、至少80、至少85、至少90、至少95、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290或至少300粒种子。
用于雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因的特异性标记可以用于确认重排。
在某些实施方案中，方法包括：选择包括重排单体异源附加染色体的至少一个杂交谷类植物，并使其与未经本文所公开的其中一种方法处理的谷类植物杂交，以在后代中减少被引入谷类植物基因组中的任何不需要的染色体重排或突变。
在某些实施方案中，具有重排的异源附加染色体的谷类品系可以与优良的谷类品系回交。在某些实施方案中，与优良谷类品系的回交消除了天然谷类植物基因组中的任何其他无意的染色体突变和/或重排。例如，优良谷类品系可以使用发育良好的遗传物质有效地替代表达Gc基因的谷类植物中的任何无意突变和/或重组的基因组区域。在某些实施方案中，优良谷类品系是适合的谷类品系。在某些实施方案中，优良谷类品系是全国范围内所列出的品种。
在某些实施方案中，方法包括：检查来自群体的至少一粒选择标记基因表达种子，以确认该种子包括重排单体异源附加染色体，该重排单体异源附加染色体包括位于其着丝粒的同一侧上的显性雄性可育性恢复基因以及选择标记基因。在某些实施方案中，检查步骤包括执行细胞学分析或分子分析。在某些实施方案中，检查步骤包括执行FISH(荧光原位杂交)或GISH(基因组原位杂交)显微镜观察以检测易位的位置。
在某些实施方案中，谷类植物(如上文所定义，其至少包括种子、后代或其部分)不包括异源附加染色体的错分裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂，也不包括ii)异源附加染色体的断裂。
辐射方法
在某些实施方案中，根据本发明的各个方面，该方法可包括辐射包括在着丝粒的不同侧上携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的异源附加染色体的雄性不育雌性植物，并且检验异源附加染色体的重排，使得雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因位于着丝粒的同一侧上。参见例如图6。在某些实施方案中，方法包括：a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系(如上所述)，该谷类植物品系包括至少一条异源附加染色体，该至少一条异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因；b)重排该至少一条异源附加染色体；以及c)获得包括重排异源附加染色体的谷类植物。在上文更详细地描述了雄性可育性基因、雄性可育性恢复基因以及该至少一个选择标记基因。
在某些实施方案中，重排步骤b)是由辐射步骤a)的谷类植物品系的种子而实现。在某些实施方案中，辐射种子会诱导至少一条异源附加染色体的染色体重排。
辐射处理可以在种子发育的任何阶段进行。在某些实施方案中，辐射未发芽的种子。
用于实现染色体断裂及重排的辐射处理可以包括但不限于X射线、快中子、伽马射线、紫外线、混合高能量粒子以及离子束。辐射处理的选择可以与欲处理的材料类型以及预期/所需的突变频率及频谱有关。快中子可以诱导相对小的段缺失或易位。X射线及伽马射线允许有良好的穿透、高再现性、高易位频率和/或较少的处理(放射性废物)问题。
X射线诱导的诱变需要使样品在x射线束中转动。在某些实施方案中，将种子放置在罐子中，该罐子环绕x射线源的轨道运行。在某些实施方案中，该罐子沿着轴线纵向地转动。所发射的这种能量通常是50-300keV。X射线穿透植物组织几毫米(mm)至许多厘米(cm)。
伽马射线诱导的诱变是通过放射性同位素产生。所发射的这种能量高达若干MeV。伽马射线可以完全穿透植物。
中子能量有快、慢及热的形式，并通过核反应堆或加速器产生。所发射的这种能量为小于1eV至若干MeV。中子可以穿透到植物组织中许多厘米。
在某些实施方案中，使用约100Gy至约500Gy的辐射能来辐射种子。在某些实施方案中，使用约150Gy至约400Gy的辐射能来辐射种子。在某些实施方案中，使用约175Gy至约250Gy的辐射能来辐射种子。在某些实施方案中，使用约200Gy至约250Gy的辐射能来辐射种子。在某些实施方案中，使用约200Gy至约225Gy的辐射能来辐射种子。在某些实施方案中，以至少约100Gy、至少约110Gy、至少约120Gy、至少约125Gy、至少约130Gy、至少约140Gy、至少约150Gy、至少约160Gy、至少约170Gy、至少约175Gy、至少约180Gy、至少约190Gy、至少约200Gy、至少约210Gy、至少约220Gy、至少约225Gy、至少约230Gy、至少约240Gy、至少约250Gy、至少约260Gy、至少约270Gy、至少约275Gy、至少约280Gy、至少约290Gy、至少约300Gy来辐射种子。在某些实施方案中，以175、200、225或250Gy来辐射种子。
在某些实施方案中，辐射种子约20至约90分钟。在某些实施方案中，辐射种子约25至约85分钟、约30至约80分钟、约35至约75分钟、约40至约70分钟、约41至约65分钟、约42至约60分钟、约43至约59分钟、约44至约58分钟、约45至约57分钟、约46至约56分钟、约47至约55分钟、约48至约54分钟、约49至约53分钟或约50至约52分钟。在某些实施方案中，辐射种子约40至约50分钟、约41至约50分钟、约42至约50分钟、约43至约50分钟、约44至约49分钟、约45至约48分钟或约46至约47分钟。
作为举例而并非限制，用于生产杂交谷类植物的辐射方法可以通过如下的步骤(还参见如实施例2中所概述的；图6)来实现：
步骤a)辐射包括异源附加染色体的至少一粒种子(如上概述)，该异源附加染色体在着丝粒的不同侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。在某些实施方案中，异源附加染色体是单体的。在某些实施方案中，异源附加染色体是二体的。该辐射步骤允许有不同水平的异源附加染色体的断裂。在某些实施方案中，辐射至少约500、至少约750、至少约1000、至少约1250、至少约1500、至少约1750、至少约2000、至少约2250、至少约2500、至少约2750、至少约3000、至少约3250、至少约3500、至少约3750、至少约4000、至少约4250、至少约4500、至少约4750、至少约5000、至少约5250、至少约5500、至少约5750、至少约6000、至少约6250、至少约6500、至少约6750、至少约7000、至少约7250、至少约7500、至少约7750、至少约8000、至少约8250、至少约8500、至少约8750或至少约9000粒种子。
步骤b)：种植在步骤a)中辐射的该至少一粒种子以产生至少一个第一谷类植物。
步骤c)：收获来自步骤b)中所产生的该至少一个第一谷类植物的基本上所有的种子以形成至少一个种子群体，其中每一种子群体均来自一个单独的植物，并且其中每一种子群体均包括表达该至少一个选择标记基因的种子以及不表达该至少一个选择标记基因的种子。
步骤d)：种植来自步骤c)的群体的不表达选择标记基因的至少一粒种子。该步骤用于证明该种子是否包括不需要的错分裂(即，不会出现雄性可育性恢复基因重排到着丝粒的与选择标记基因相同的一侧)。在某些实施方案中，种植步骤c)的基本上所有的种子。在某些实施方案中，种植来自步骤c)的种子中的至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约81％、至少约82％、至少约83％、至少约84％、至少约85％、至少约86％、至少约87％、至少约88％、至少约89％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％。在某些实施方案中，种植至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290或至少约300粒种子。
步骤e)：抛弃在步骤d)中产生可育植物的种子群体。
步骤f)：使步骤e)中未被抛弃的表达选择标记基因的种子自花受精以形成下一个种子群体，其中每一种子群体均来自一个单独的植物，其中每一种子群体均包括表达该至少一个选择标记基因的种子以及不表达该至少一个选择标记基因的种子。在某些实施方案中，对种子进行细胞学检查以确定异源附加染色体的染色体组成。
步骤g)：任选地重复步骤d)及e)至少一次。在某些实施方案中，种植至少约10、至少约20、至少约30、至少约40、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90、至少约100、至少约110、至少约120、至少约130、至少约140、至少约150、至少约160、至少约170、至少约180、至少约190、至少约200、至少约210、至少约220、至少约230、至少约240、至少约250、至少约260、至少约270、至少约280、至少约290、至少约300、至少约310、至少约320、至少约330、至少约340、至少约350、至少约360、至少约370、至少约380、至少约390或至少约400粒种子。
步骤h)：种植不表达该至少一个选择标记的至少一粒种子。
步骤i)：选择显示完全不育的谷类植物群体的种子群体以产生用于生产杂交谷类植物的谷类植物。
用于雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因的特异性标记可以用于确认重排。
在某些实施方案中，如上文所述，具有重排的异源附加染色体的谷类品系可以与优良的谷类品系回交。在某些实施方案中，方法包括：选择包括重排单体异源附加染色体的至少一个杂交谷类植物，并使其与未经本文所公开的其中一种方法处理的谷类植物杂交，以在后代中减少被引入谷类植物基因组中的任何不需要的染色体重排或突变。
在某些实施方案中，方法包括：检查来自群体的至少一粒选择标记基因表达种子，以确认该种子包括重排单体异源附加染色体，该重排单体异源附加染色体包括位于其着丝粒的同一侧上的显性雄性可育性恢复基因以及该至少一个选择标记基因。在某些实施方案中，检查步骤包括执行细胞学分析或分子分析。在某些实施方案中，检查步骤包括执行FISH(荧光原位杂交)或GISH(基因组原位杂交)显微镜观察以检测易位的位置。
在某些实施方案中，谷类植物(如上文所定义，其至少包括种子、后代或其部分)不包括异源附加染色体的错分裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂，也不包括ii)异源附加染色体的断裂。
部分同源配对方法
在某些实施方案中，根据本发明的各个方面，该方法可包括将诱导部分同源配对的部分同源配对抑制基因突变引入包括二体异源附加染色体的谷类植物品系中，该二体异源附加染色体携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因与至少一个选择标记基因位于异源附加染色体的着丝粒的不同侧上。在某些实施方案中，雄性可育性恢复基因与至少一个选择标记基因位于异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。在某些实施方案中，方法包括：a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系，该谷类植物品系包括至少一条异源附加染色体，该至少一条异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带雄性可育性恢复基因以及选择标记基因；b)诱导至少一条异源附加染色体或异源染色体片段的部分同源重组；以及c)获得包括部分同源异源附加染色体或异源染色体片段的谷类植物。在上文更详细地描述了雄性可育性基因、雄性可育性恢复基因以及选择标记基因。
通过部分同源配对抑制基因(Ph)阻止部分同源配对，即在不同基因组中的或在同一基因组内但在通常不配对的染色体之间的等效染色体的配对。在某些实施方案中，部分同源配对抑制基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。如上文更详细所述，突变的部分同源抑制基因(ph)(例如ph1b或ph2)可以允许存在部分同源配对。在某些实施方案中，部分同源配对抑制基因突变是来自染色体5B或染色体3B的基因缺失。在某些实施方案中，缺失的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。
在某些实施方案中，上文步骤b)的部分同源重组由部分同源配对抑制基因的突变实现。正因如此，异源附加染色体或至少其片段可以成为谷类植物的基因组的一部分。在某些实施方案中，部分同源配对可以通过表达抑制部分同源抑制基因的基因来实现，这些基因诸如但不限于来自拟斯卑尔脱山羊草的那些基因。
部分同源抑制基因突变可以作为二体异源附加染色体引入。在某些实施方案中，部分同源抑制基因突变通过育种从谷类植物品系消除。可以通过本领域中的技术人员通常已知的分子和/或细胞遗传技术来直接检测部分同源抑制基因突变。
作为举例而并非限制，用于生产杂交谷类植物的突变部分同源抑制基因方法可以通过如下的步骤(还参见如实施例3中所概述的；图7)来实现：
步骤a)：使包括二体异源附加染色体的雄性可育性基因突变纯合的第一谷类植物与雄性可育性基因突变以及部分同源配对抑制基因突变纯合的第二谷类植物杂交，该二体异源附加染色体携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。在某些实施方案中，可以使用携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的单体异源附加染色体。
步骤b)：收获、选择并种植雄性可育性基因突变纯合的在步骤a)中所产生的至少一粒种子，该至少一粒种子包括单体异源染色体，其携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因以及单一拷贝的部分同源配对抑制基因突变。
步骤c)：使步骤b)中所产生的谷类植物自花受精。
步骤d)：收获、选择并种植雄性可育性基因突变以及部分同源配对抑制基因突变纯合的在步骤c)中所产生的至少一粒种子，该至少一粒种子包括整倍体数量的染色体以及单体异源附加染色体。
步骤e)：使步骤d)中所产生的谷类植物自花受精。
步骤f)：收获来自步骤e)的至少四粒种子。
步骤g)：计算来自表达该至少一个选择标记的第一组以及不表达该至少一个选择标记的第二组的步骤f)的种子数量，以便确定分离比率。
步骤h)：如果第一组：第二组的种子数量比率趋向于约3:1，则保留步骤f)的种子，并且如果第一组：第二组的种子数量比率不是约3:1，则抛弃步骤f)的种子。例如，如果比率介于约1:1至约1:3之间，则抛弃种子。分离中的变化显示出单体染色体成功易位到基因组中。三粒标记种子与一粒未标记种子的种子设定比率表示部分同源配对，由此异源附加染色体已经与部分同源小麦染色体中的一者重组。在某些实施方案中，染色体4A、4B、4D的长臂或染色体5A的远端区域与染色体4Ag(Ag：高冰草)的长臂部分同源。在某些实施方案中，异源附加染色体与4A、4B或4D染色体之间的染色体配对还可以出现在短臂上。在某些实施方案中，部分同源配对还可以出现在其他染色体之间。
在某些实施方案中，单体异源附加染色体与4A、4B、4D或5A染色体易位。在某些实施方案中，单体异源附加染色体不与4B染色体易位。
在某些实施方案中，选择标记基因给予分级选择表型。例如，当选择标记基因杂合地存在时，表型具有一定量(例如淡蓝色)；并且当选择标记基因纯合地存在时，与杂合地存在时相比，其存在较大的量(例如较深的蓝色)。
在某些实施方案中，谷类植物(如上文所定义，其至少包括种子、后代或其部分)不包括异源附加染色体的错分裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂，也不包括ii)异源附加染色体的断裂。
基因编辑整合方法
在某些实施方案中，根据本发明的各个方面，该方法可包括进行基因编辑以插入雄性可育性恢复基因以及任选至少一个选择标记基因。在某些实施方案中，该方法包括将雄性可育性恢复基因以及任选至少一个选择标记基因整合到小麦基因组中或谷类植物的异源附加染色体中。在某些实施方案中，整合是随机的。在某些实施方案中，整合是靶向性的。
在某些实施方案中，该方法包括：a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系；b)将雄性可育性恢复基因以及任选至少一个选择标记基因整合到谷类植物品系的基因组或异源附加染色体中，其中雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因遗传连锁并紧密靠近；以及c)获得包括遗传连锁的雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的谷类植物。
在某些实施方案中，细胞包括雄性不育基因型。
在某些实施方案中，通过基因表达盒将雄性可育性恢复基因以及该至少一个选择标记基因引入谷类植物品系的细胞中，这些基因表达盒可以位于相同或不同的DNA构建体上。在某些实施方案中，将雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因在基因盒中配置为5’对5’、3’对3’、5’对3’或3’对5’。一旦排列为紧密靠近，便可以将基因盒引入谷类植物中。
在某些实施方案中，引入该至少一个选择标记基因，使得雄性可育表型可以用作经修饰的植物的指示物。在某些实施方案中，引入雄性可育性恢复基因，使得标记的表达可以用于指示经修饰的植物。在整合之后，雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因相关联，并位于单体异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
在某些实施方案中，通过生物学或物理学方式将基因盒引入细胞中，这些方式包括转染、转化(包括通过土壤杆菌属、优选通过根癌土壤杆菌进行转化)、病毒载体、生物轰击(即粒子轰击)、使用化学试剂进行转染(包括聚乙二醇转染)、电穿孔、电细胞融合，或其任何组合。
在某些实施方案中，通过对在二元质粒中的T-DNA边界内包含的雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因进行土壤杆菌介导转化来将基因盒引入细胞中。
在某些实施方案中，通过对呈超螺旋、环状、松弛或线性构型的包括基因盒的质粒进行粒子轰击来将基因盒引入细胞中。在某些实施方案中，粒子轰击包括基因盒的PCR扩增子，由此使得仅仅引入包含本文所公开的单体异源附加染色体的谷类植物中已经存在的DNA。
在某些方面，该方法包括在目的谷类植物基因组中的特异性位置处形成基因组单链或双链断裂(DSB)。然后，可以在双链断裂的位点处插入雄性可育性恢复基因和/或至少一个选择标记基因。在某些实施方案中，如果通过同源重组来整合雄性可育性恢复基因和/或至少一个选择标记基因盒，则适当地设计侧接基因盒的同源臂。例如，基因可以在每一侧上沿长度具有约20至约1000个碱基对，其中与DSB位点的任一侧上的基因组序列具有>90％同源性。
在某些实施方案中，整合步骤b)包括使用位点特异性核酸酶来对连锁的雄性可育性恢复基因与至少一个选择标记基因的整合进行靶向，该位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中的靶位点处作出双链断裂，并且其中在双链断裂的位点处将连锁的雄性可育性恢复基因与该至少一个选择标记基因整合到谷类植物品系基因组中。在某些实施方案中，该位点特异性核酸酶是大范围核酸酶、TALEN、ZFN或CRISPR核酸酶。在某些实施方案中，通过编码/表达用于位点特异性核酸酶活性的所需成分的至少一个DNA盒的转化、通过表达用于位点特异性核酸酶活性的所需成分的RNA分子的转化，或者通过纯化蛋白质或核糖核蛋白质位点特异性核酸酶复合物的转化来将位点特异性核酸酶递送到谷类植物品系细胞中。在下文更详细地论述位点特异性核酸酶以及整合策略。
在某些实施方案中，位点特异性核酸酶诱导的双链断裂是将该至少一个选择标记基因及雄性可育性恢复基因盒整合到谷类植物基因组中的位点。在某些实施方案中，不需要同源臂。在某些实施方案中，转化的线性PCR扩增子仅由盒组成。在某些实施方案中，以如下方式设计质粒：除了诱导基因组双链断裂，核酸酶还会将盒/修复模板从质粒分裂开。
在某些实施方案中，该方法包括使该至少一个选择标记基因及雄性可育性恢复基因盒与上游及下游同源臂侧接，以通过同源重组将盒整合到双链断裂的位点中。这可以被定义为修复模板，其中任一基因或两个基因均包括在同源臂之间。
在某些实施方案中，细胞来自未成熟胚、原生质体或愈伤组织。在某些实施方案中，可以用于该方法的细胞或组织是整个或部分剖开的胚。在某些实施方案中，直接轰击分生组织并使胚发芽以产生植物。在某些实施方案中，转化方法可进一步包括转化基因盒，其提供对除草剂、抗生素或其他细胞毒性化合物的抗性以跟踪转化。
在某些实施方案中，转化的细胞或组织是雄性不育基因型，并且进行再生或发芽而无需选择。雄性可育及选择标记表型或单独的任一表型可以用于识别其中两个基因被整合到它们被正确表达的位置中的植物。
在某些实施方案中，识别“优良事件”，其特征在于，在谷类植物基因组中的优选位置中具有单一拷贝插入，该单一拷贝插入不会破坏天然基因序列。在某些实施方案中，整合的基因盒允许基因的适当表达。在某些实施方案中，整合的基因盒允许雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的稳定表达。
用于雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因的特异性标记可以用于确认重排。在某些实施方案中，方法包括：检查来自群体的至少一粒选择标记基因表达种子，以确认该种子包括重排单体异源附加染色体，该重排单体异源附加染色体包括位于其着丝粒的同一侧上的显性雄性可育性恢复基因以及选择标记基因。在某些实施方案中，检查步骤包括执行细胞学分析或分子分析。在某些实施方案中，检查步骤包括使用所添加基因的引物来进行PCR筛选。在某些实施方案中，检查步骤包括执行FISH(荧光原位杂交)或GISH(基因组原位杂交)显微镜观察以检测易位的位置。
在某些实施方案中，谷类植物(如上文所定义，其至少包括其种子、后代或部分)不包括异源附加染色体的错分裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂，也不包括ii)异源附加染色体的断裂。
异源附加染色体的基因编辑重排方法
在某些实施方案中，根据本发明的各个方面，该方法可包括重排异源附加染色体，该异源附加染色体包括位于着丝粒的不同侧上的雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因二者。在某些实施方案中，使用位点特异性核酸酶来产生重排。
在某些实施方案中，该方法包括：a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系；b)
将雄性可育性恢复基因或至少一个选择标记基因整合到异源附加染色体或谷类植物品系的基因组中；以及c)获得包括遗传连锁的雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的谷类植物，其中遗传连锁的雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因位于异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。该方法可进一步包括破坏位于着丝粒的与遗传连锁的雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因相对的一侧上的雄性可育性恢复基因和/或至少一个选择标记基因。
在某些实施方案中，整合是随机的。在某些实施方案中，整合是靶向性的。
在某些实施方案中，仅将雄性可育性恢复基因或该至少一个选择标记基因引入细胞或组织中。例如，可以将雄性可育性恢复基因整合成与位于单体异源附加染色体上的该至少一个选择标记基因紧密靠近。作为另一实例，可以将该至少一个选择标记基因整合成与位于单体异源附加染色体上的雄性可育性恢复基因紧密靠近。
在某些实施方案中，该方法包括将基因盒引入谷类植物品系的细胞中，该基因盒在异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因相同的侧上携带相同或不同的至少一个选择标记基因以及位点特异性核酸酶，该位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中的靶位点处作出双链断裂，并且其中该相同或不同的至少一个选择标记基因在双链断裂的位点处被整合到谷类植物品系基因组中。
在某些实施方案中，该方法包括将基因盒引入谷类植物品系的细胞中，该基因盒在该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与该至少一个选择标记基因相同的侧上携带相同或不同的雄性可育性恢复基因以及位点特异性核酸酶，该位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中的靶位点处作出双链断裂，并且其中该相同或不同的雄性可育性恢复基因在双链断裂的位点处被整合到谷类植物品系基因组中。
该方法还可以包括使用至少两种位点特异性核酸酶来重排异源附加染色体的着丝粒的相对侧上存在的雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，使得它们存在于异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
在某些实施方案中，该方法包括将至少两种不同的位点特异性核酸酶引入谷类植物品系的细胞中，其中至少一种位点特异性核酸酶在该至少一个选择标记基因附近但在该至少一个选择标记基因与异源附加染色体的染色体末端之间作出第一双链断裂以形成染色体的第一末端，并且至少一种其他位点特异性核酸酶在雄性可育性恢复基因附近但在雄性可育性恢复基因与异源附加染色体的着丝粒之间作出第二双链断裂以形成第二染色体末端，并且其中交换这些染色体末端，使得该至少一个选择标记位于该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因相同的侧上。
在某些实施方案中，该方法包括将至少两种不同的位点特异性核酸酶引入谷类植物品系的细胞中，其中至少一种位点特异性核酸酶在雄性可育性恢复基因附近但在雄性可育性恢复基因与异源附加染色体的染色体末端之间作出第一双链断裂以形成染色体的第一末端，并且至少一种其他位点特异性核酸酶在该至少一个选择标记基因附近但在该至少一个选择标记基因与异源附加染色体的着丝粒之间作出第二双链断裂以形成第二染色体末端，并且其中交换这些染色体末端，使得该至少一个选择标记基因位于该至少一条异源附加染色体的着丝粒的与雄性可育性恢复基因相同的侧上。
在某些实施方案中，第一及第二双链断裂同时发生。在某些实施方案中，第一及第二双链断裂在时间上非常接近地发生。
在某些实施方案中，该位点特异性核酸酶是大范围核酸酶、TALEN、ZFN或CRISPR核酸酶。在某些实施方案中，通过编码用于位点特异性核酸酶活性的所需基因的至少一个DNA盒的转化、RNA分子的转化，或者通过纯化蛋白质或核糖核蛋白质复合物的转化来将位点特异性核酸酶递送到谷类植物品系细胞中。在下文更详细地论述位点特异性核酸酶以及整合策略。
在某些实施方案中，位点特异性核酸酶诱导的双链断裂是将该至少一个选择标记基因及雄性可育性恢复基因盒整合到谷类植物基因组中的位点。在某些实施方案中，不需要同源臂。在某些实施方案中，转化的线性PCR扩增子仅由盒组成。在某些实施方案中，以如下方式设计质粒：除了诱导基因组双链断裂，核酸酶还会将盒/修复模板从质粒分裂开。
在某些实施方案中，该方法包括使该至少一个选择标记基因及雄性可育性恢复基因盒与上游及下游同源臂侧接，以通过同源重组将盒整合到双链断裂的位点中。
在某些实施方案中，细胞来自未成熟胚、成熟胚、发芽胚、原生质体或愈伤组织。在某些实施方案中，可以用于该方法的细胞或组织是整个或部分剖开的胚。在某些实施方案中，直接轰击分生组织并使胚发芽以产生植物。在某些实施方案中，转化方法可进一步包括选择标记基因盒以跟踪转化。
在某些实施方案中，转化的细胞或组织是雄性不育基因型，并且进行再生或发芽而无需选择。雄性可育及选择标记表型可以用于识别其中两个基因被整合到它们被正确表达的位置中的植物。
在某些实施方案中，识别“优良事件”，其特征在于，在谷类植物基因组中的优选位置中具有单一拷贝插入，该单一拷贝插入不会破坏天然基因序列。在某些实施方案中，整合的基因盒允许基因的适当表达。在某些实施方案中，整合的基因盒允许雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的稳定表达。
用于雄性可育性恢复基因和/或该至少一个选择标记基因的特异性标记可以用于确认重排。在某些实施方案中，方法包括：检查来自群体的至少一粒选择标记基因表达种子，以确认该种子包括重排单体异源附加染色体，该重排单体异源附加染色体包括位于其着丝粒的同一侧上的显性雄性可育性恢复基因以及选择标记基因。在某些实施方案中，检查步骤包括执行细胞学分析或分子分析。在某些实施方案中，检查步骤包括使用所添加基因的引物来进行PCR筛选。在某些实施方案中，检查步骤包括执行FISH(荧光原位杂交)或GISH(基因组原位杂交)显微镜观察以检测易位的位置。
在某些实施方案中，谷类植物(如上文所定义，其至少包括其种子、后代或部分)不包括异源附加染色体(即，这两个基因盒)的错分裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括异源附加染色体的断裂。在某些实施方案中，谷类植物不包括i)异源附加染色体的错分裂，也不包括ii)异源附加染色体的断裂。
雄性不育雌性亲本品系的保持
本文还提供了保持用于生产杂交谷类植物的雄性不育亲本谷类植物品系的方法，其包括使雄性不育雌性植物与雄性亲本植物杂交，该雄性亲本植物类似于该雌性植物但具有携带雄性可育性恢复基因以及选择标记基因的染色体，该选择标记基因向后代和/或后代种子赋予表型特征。根据该杂交，后代谷类植物种子群体包括这两种亲本品系的混合物，其可以基于表型特征来进行分离。在某些实施方案中，包括雄性可育性恢复基因的染色体是异源附加染色体。
为了生产携带异源附加染色体、部分同源染色体对和/或整合核酸构建体的杂交谷类种子，可以使杂交谷类植物进行自花受精。可选地，杂交谷类植物可以与类似的谷类植物、或与携带不同于杂交谷类植物的一种或多种核酸的谷类植物或与用于生产杂交谷类种子的已知植物育种方法的非转基因植物杂交。这些谷类种子可以用于提供包括异源附加染色体、部分同源染色体对和/或整合核酸构建体的本发明的后代杂交谷类植物。
作为举例而并非限制，一种保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物的雄性不育雌性亲本品系的方法可以通过以下步骤来实现：
步骤a)：种植包括纯合的雄性可育性基因突变以及单体异源附加染色体的至少一粒种子，该单体异源附加染色体在其着丝粒的同一侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，由此可将具有该单体异源附加染色体的种子与不具有该单体异源附加染色体的种子分开以产生至少一粒后代种子。
步骤b)：使步骤a)中产生的谷类植物自花受精。
步骤c)：选择不包括单体异源附加染色体的至少一粒种子以种植至少一个不育雌性亲本谷类植物，以便与可育雄性谷类植物杂交以用于杂交谷类植物及杂交种子生产。
步骤d)：选择包括单体异源附加染色体的至少一粒种子以便保持该谷类植物。
作为举例而并非限制，一种保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物的雄性不育雌性亲本品系的方法可以通过以下步骤来实现：
步骤a)：种植包括纯合的雄性可育性基因突变以及携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的异源附加染色体的至少一部分的至少一粒种子，该异源附加染色体的该至少一部分易位到部分同源染色体对中的至少一条染色体中。
步骤b)：使步骤a)中产生的谷类植物自花受精。
步骤c)：选择不包括易位到部分同源染色体对中的至少一条染色体中的异源附加染色体的至少一粒种子以种植至少一个不育雌性亲本谷类植物，以便与可育雄性谷类植物杂交以用于杂交谷类植物及杂交种子生产。
步骤d)：选择包括易位到部分同源染色体对中的一条染色体中的异源附加染色体的至少一粒种子以保持该谷类植物，其中如优选地通过该至少一个选择标记基因的表达所指示，该种子是易位杂合的。
步骤e)：抛弃包括易位到部分同源染色体对中的至少两条染色体中的异源附加染色体的任何种子以保持该谷类植物，其中如优选地通过该至少一个选择标记基因的表达所指示，该种子是易位纯合的。
本发明的位点特异性核酸酶
在某些实施方案中，根据本发明的各个方面，该至少一种位点特异性核酸酶可包括锌指核酸酶、类似转录激活因子的效应核酸酶、CRISPR/Cas系统、工程化归巢内切核酸酶、以及大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFn)、类似转录激活因子的效应核酸酶(TALEN)，和/或其任何组合、变体或催化活性片段。
在其自然环境中的CRISPR系统描述了一种分子复合物，其包括可以产生特异性DNA双链断裂的与Cas核酸酶或另一CRISPR核酸酶(如Cpf1核酸酶(Zetsche等人，2015，上文))组合的至少一种小的且单独的非编码RNA。当前，将CRISPR系统归类为2类，其包括五种类型的CRISPR系统，举例来说，II型系统使用Cas9作为效应器并且V型系统使用Cpf1作为效应分子(Makarova等人，Nature Rev.Microbiol.，2015)。在人工CRISPR系统中，合成非编码RNA及CRISPR核酸酶和/或任选经修饰的CRISPR核酸酶(被修饰为用作切口酶或缺乏任何核酸酶功能)可以与至少一种合成或人工指导RNA或gRNA相组合地使用，该至少一种合成或人工指导RNA或gRNA结合了crRNA和/或tracrRNA的功能(Makarova等人，2015，上文)。由自然系统中的CRISPR/Cas介导的免疫应答需要CRISPR-RNA(crRNA)，其中控制CRISPR核酸酶的特异性激活的该指导RNA的成熟在迄今为止所表征的各种CRISPR系统之间差别很大。首先，侵入DNA(也称为间隔)被整合在CRISPR基因座的近端处的两个相邻重复区域之间。举例来说，II型CRISPR系统可以编码Cas9核酸酶作为用于干扰步骤的关键酶，该系统包含crRNA以及反式激活RNA(tracrRNA)作为指导基序。这些进行杂交并形成双链(ds)RNA区域，其通过RNAseIII识别并且可以分裂开以形成成熟的crRNA。这些接着又与Cas分子相关联以将核酸酶特异性地引导至靶核酸区域。重组gRNA分子可包括可变DNA识别区域以及Cas相互作用区域二者，并且因此可以独立于特定靶核酸以及所需Cas核酸酶而特异性地设计。作为另一种安全机制，PAM(原型间隔相邻基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是DNA序列，其直接来自于Cas9/RNA复合物识别的DNA。来自酿脓链球菌的Cas9的PAM序列已经被描述为“NGG”或“NAG”(标准IUPAC核苷酸编码)(Jinek等人，Science 2012，337：816-821)。来自金黄色酿脓葡萄球菌的Cas9的PAM序列是“NNGRRT”或“NNGRR(N)”。已知其他变体CRISPR/Cas9系统。因此，脑膜炎奈瑟氏菌Cas9在PAM序列NNNNGATT处分裂开。嗜热链球菌Cas9在PAM序列NNAGAAW处分裂开。最近，已经描述了用于弯曲菌属的CRISPR系统的另一种PAM基序NNNNRYAC(WO2016/021973A1)。对于Cpf1核酸酶，据描述，相比于通过Cas9系统识别的一般富含G的PAM，不具有tracrRNA的Cpf1-crRNA复合物能高效地识别并分裂开通过短的富含T的PAM实现的靶DNA(Zetsche等人，上文)。此外，通过使用经修饰的CRISPR多肽，可以获得特异性单链断裂。Cas切口酶与各种重组gRNA的组合使用还可以通过双DNA切割来诱导高特异性的DNA双链断裂。此外，通过使用两种gRNA，可以使DNA结合的特异性以及因此DNA分裂最优化。其他CRISPR效应器(诸如最初针对细菌所述的CasX及CasY效应器)同时是可获得的并且代表可以用于基因组工程目的的其他效应器(Burstein等人，Nature，2017，542，237-241)。
当前，例如，依赖于Cas9的II型系统或其变体或任何嵌合形式作为内切核酸酶已经被修饰用于基因组工程。由两种成分(指导RNA(gRNA)(也称为单一指导RNA(sgRNA))以及非特异性CRISPR相关联的内切核酸酶)组成的合成CRISPR系统可以用于通过共同表达对所要定向的基因具有特异性且能够与内切核酸酶Cas9相关联的gRNA来产生敲除细胞或动物。值得注意的是，gRNA是人造分子，其包括与Cas或任何其他CRISPR效应蛋白质或其变体或催化活性片段相互作用的一个结构域以及与目的靶核酸相互作用的另一结构域，并且因此代表crRNA与tracrRNA的合成融合(称为“单一指导RNA”(sgRNA)或简称“gRNA”)。假如基因组靶存在于紧邻PAM序列的上游，则该基因组靶可以是任何～20核苷酸DNA序列。PAM序列对于靶结合具有突出的重要性，并且确切的序列取决于Cas9的种类，例如对于来自酿脓链球菌的Cas9，读取5′NGG 3′或5′NAG 3′(标准IUPAC核苷酸编码)(Jinek等人，Science 2012，上文)。来自金黄色酿脓葡萄球菌的Cas9的PAM序列是NNGRRT或NNGRR(N)。已知许多其他变体CRISPR/Cas9系统，其中包括将PAM序列NNNNGATT分裂开的脑膜炎奈瑟氏菌Cas9。嗜热链球菌Cas9将PAM序列NNAGAAW分裂开。使用经修饰的Cas核酸酶，可以将定向单链断裂引入目的靶序列中。通过此种Cas切口酶与不同重组gRNA的组合使用，可以使用双切割系统来引入高位点特异性的DNA双链断裂。使用一种或多种gRNA可以进一步提高整体特异性并降低脱靶影响。
一旦被表达，Cas9蛋白质和gRNA便会通过gRNA“支架”结构域与Cas9上的表面暴露的带正电荷的凹槽之间的相互作用而形成核糖核蛋白质复合物。在gRNA结合之后，Cas9经历构象变化，该gRNA结合将分子从非活性的非DNA结合构象改变为活性DNA结合构象。重要的是，gRNA的“间隔区”序列仍自由地与靶DNA相互作用。Cas9-gRNA复合物将结合任何基因组序列与PAM，但是gRNA间隔区与靶DNA匹配的程度决定了Cas9是否切割。一旦Cas9-gRNA复合物结合了推定的DNA目标，位于gRNA定向序列的3′末端处的“种子”序列便开始退火至靶DNA。如果种子与靶DNA序列匹配，则gRNA将继续沿3′至5′方向(相对于gRNA的极性)退火至靶DNA。
在本发明的组合物及方法中有用的Cas蛋白质的实例包括Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas5e(CasD)、Cas6、Cas6e、Cas6f、Cas7、Cas8a1、Cas8a2、Cas8b、Cas8c、Cas9(Csn1或Csx12)、Cas10、Casl0d、CasF、CasG、CasH、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1(CasA)、Cse2(CasB)、Cse3(CasE)、Cse4(CasC)、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、CasY、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4及Cu1966，及其同源物或修饰形式。
当gRNA被正确设计时，CRISPR/Cas(例如，CRISPR/Cas9)以及同样地，CRISPR/Cpf1或CRISPR/CasX或CRISPR/CasY以及其他CRISPR系统具有高特异性，但特别是对于基于CRISPR技术的临床应用或定向植物GE，尤其特异性仍然是重要的问题。CRISPR系统的特异性在很大程度上决定于相比于基因组的剩余部分，gRNA定向序列对于基因组目标的特异性程度。因此，根据本发明的方法在与至少一种CRISPR核酸酶作为位点特异性核酸酶的使用结合并进一步与适宜CRISPR核酸的使用结合时可以提供明显更加可预见的GE结果。鉴于CRISPR复合物可以在特异性位点处促成细胞或细胞系统的基因组或遗传物质的高精度切割，本文所提出的方法提供了另外的控制机制，其确保可编程且可预见的修复机制。
根据本发明的各个实施方案，关于共价和非共价结合或连结的上述公开内容也适用于CRISPR核酸序列，其可包括一个以上部分，例如crRNA以及tracrRNA部分，如上文所详细说明，这些部分可彼此相关联。在一个实施方案中，根据本发明，本发明的修复模板核酸序列(例如，包括欲被插入的基因)可以放置在目的CRISPR核酸序列内以形成杂交核酸序列，该杂交可以通过共价和非共价关联来形成。
在根据本发明的各个方面的另一实施方案中，在预定位置侧接至少一个目的核酸序列的一个或多个核酸序列可以与邻近该预定位置、在该预定位置上游和/或下游、在相应邻近区域的整个长度上的一个或多个核酸序列具有至少85％-100％的互补性。值得注意的是，可以使用该至少一个侧接区域的较低程度的同源性或互补性，例如与目的遗传物质中的至少一个邻近区域具有至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％或至少84％的同源性/互补性。对于依赖于HDR模板(即修复模板)的高精度基因编辑，大于95％的同源性/互补性有利于实现目的性高的修复事件。如Rubnitz等人，Mol.Cell Biol.，1984，4(11)，2253-2258中所示，非常低的序列同源性也可足以获得同源重组。如技术人员已知的，互补性的程度将取决于欲被修饰的遗传物质、计划编辑的性质、基因组的复杂性及大小、潜在脱靶位点的数量、遗传背景以及欲被修饰的细胞或细胞系统内的环境。
在某些实施方案中，位点特异性核酸酶可以是锌指核酸酶(ZFn)、类似转录激活因子的效应核酸酶(TALEN)、大范围核酸酶和/或限制性内切核酸酶。用于本发明的组合物及方法中的使用这些位点特异性核酸酶的融合RNA及融合蛋白质分子或者其功能性片段或衍生物可以采用与上文针对Cas分子或者其功能性片段或衍生物所公开的相同的方式及结构来制作。
类似转录激活因子的效应核酸酶(TALEN)是可以被设计成切割DNA的靶序列的限制性内切酶。通过将TAL效应器DNA结合结构域融合至DNA分裂结构域(切割DNA链的核酸酶)来制作它们。TAL效应核酸酶是一类序列特异性核酸酶，其可以用于在原核或真核生物体的基因组中的特异性靶序列处作出双链断裂。通过将天然的或工程化的类似转录激活因子(TAL)的效应器或其功能部分融合至内切核酸酶(诸如例如FokI)的催化性结构域来形成TAL效应核酸酶。独特的模块化TAL效应器DNA结合结构域允许具有潜在任何给定DNA识别特异性的蛋白质的设计。因此，TAL效应核酸酶的DNA结合结构域可被设计为识别特异性DNA靶位点，并且因此可用于在所需靶序列处作出双链断裂。参见WO 2010/079430；Morbitzer等人(2010)PNAS 10.1073/pnas.1013133107；Scholze&Boch(2010)Virulence 1：428-432；Christian等人Genetics(2010)186：757-761；Li等人(2010)Nuc.Acids Res.doi：10.1093/nar/gkq704；以及Miller等人(2011)Nature Biotechnology 29：143-148；所有这些文献均以引用的方式全文并入本文中并用于所有目的。
合适的TAL核酸酶的实例以及用于制备合适的TAL核酸酶的方法公开于例如美国专利申请第2011/0239315号、第2011/0269234号、第2011/0145940号、第2003/0232410号、第2005/0208489号、第2005/0026157号、第2005/0064474号、第2006/0188987号以及第2006/0063231号中(每一专利申请均以引用的方式全文并入本文中并用于所有目的)。在各种实施方案中，TAL效应核酸酶被设计为在例如目的基因组基因座中的靶核酸序列中或附近进行切割，其中靶核酸序列位于欲通过定向载体修饰的序列处或附近。适用于本文所提供的各种方法及组合物的TAL核酸酶包括被特异性地设计为在欲通过定向载体修饰的靶核酸序列处或附近结合的那些。
在一个实施方案中，TALEN的每一单体均包括12-25个TAL重复，其中每一TAL重复均结合1bp次位点。在某些实施方案中，位点特异性核酸酶是嵌合蛋白质，其包括可操作地连接至独立核酸酶的基于TAL重复的DNA结合结构域。在某些实施方案中，独立核酸酶是FokI内切核酸酶。在一个实施方案中，位点特异性核酸酶包括第一基于TAL重复的DNA结合结构域以及第二基于TAL重复的DNA结合结构域，其中第一及第二基于TAL重复的DNA结合结构域中的每一者均可操作地连接至FokI核酸酶，其中第一及第二基于TAL重复的DNA结合结构域识别通过约6bp至约40bp分裂位点分离的在靶DNA序列的每一链中的两个邻近靶DNA序列，并且其中FokI核酸酶进行二聚化并在靶序列处作出双链断裂。
在某些实施方案中，位点特异性核酸酶包括第一基于TAL重复的DNA结合结构域以及第二基于TAL重复的DNA结合结构域，其中第一及第二基于TAL重复的DNA结合结构域中的每一者均可操作地连接至FokI核酸酶，其中第一及第二基于TAL重复的DNA结合结构域识别通过5bp或6bp分裂位点分离的在靶DNA序列的每一链中的两个邻近靶DNA序列，并且其中FokI核酸酶进行二聚化并作出双链断裂。
本文所公开的各种方法及组合物中所采用的位点特异性核酸酶可进一步包括锌指核酸酶(ZFN)。锌指核酸酶(ZFN)是一类工程化DNA结合蛋白质，其通过在定向位置处在DNA中形成双链断裂(DSB)来帮助基因组的定向编辑。ZFN包括两个功能性结构域：i)DNA结合结构域，其包括一连串双指模块(每一双指模块均识别DNA的独特六聚物(6bp)序列—双指模块缝合在一起形成锌指蛋白质，每一者具有≥24bp的特异性)；以及ii)DNA分裂结构域，其包括Fok I的核酸酶结构域。当DNA结合及分裂结构域融合在一起时，便形成了高特异性的一对“基因组剪刀”。
在某些实施方案中，ZFN的每一单体均包括3个或更多个基于锌指的DNA结合结构域，其中每一基于锌指的DNA结合结构域均结合到3bp次位点。在其他实施方案中，ZFN是嵌合蛋白质，其包括可操作地连接至独立核酸酶的基于锌指的DNA结合结构域。在某些实施方案中，独立内切核酸酶是FokI内切核酸酶。在某些实施方案中，位点特异性核酸酶包括第一ZFN以及第二ZFN，其中第一ZFN以及第二ZFN中的每一者均可操作地连接至FokI核酸酶，其中第一以及第二ZFN识别通过约6bp至约40bp分裂位点或约5bp至约6bp分裂位点分离的在靶DNA序列的每一链中的两个邻近靶DNA序列，并且其中FokI核酸酶进行二聚化并作出双链断裂。参见例如US20060246567；US20080182332；US20020081614；US20030021776；WO/2002/057308A2；US20130123484；US20100291048；以及WO/2011/017293A2，其中每一者均以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。
在另一实施方案中，位点特异性核酸酶是大范围核酸酶。已经基于保守序列基序将大范围核酸酶分为四个家族，这些家族是LAGLIDADG、GIY-YIG、H-N-H以及His-Cys家族。这些基序参与金属离子的配位以及磷酸二酯键的水解。HEases由于其长的识别位点并且由于能在其DNA衬底中容忍一些序列多态性而值得注意。已知大范围核酸酶结构域、结构及功能，参见例如Guhan以及Muniyappa(2003)Crit Rev Biochem Mol Biol 38：199-248；Lucas等人(2001)Nucleic Acids Res 29：960-9；Jurica以及Stoddard(1999)Cell Mol LifeSci 55：1304-26；Stoddard(2006)Q Rev Biophys 38：49-95；以及Moure等人(2002)NatStruct Biol 9：764。在一些实例中，使用天然发生的变体和/或工程化衍生物大范围核酸酶。已知用于修饰动力学、辅因子相互作用、表达、最佳条件、和/或识别位点特异性以及活性筛选的方法，参见例如Epinat等人(2003)Nucleic Acids Res 31：2952-62；Chevalier等人(2002)Mol Cell 10：895-905；Gimble等人(2003)Mol Biol 334：993-1008；Seligman等人(2002)Nucleic Acids Res 30：3870-9；Sussman等人(2004)J Mol Biol 342：31-41；Rosen等人(2006)Nucleic Acids Res 34：4791-800；Chames等人(2005)Nucleic AcidsRes 33：e178；Smith等人(2006)Nucleic Acids Res 34：e149；Gruen等人(2002)NucleicAcids Res 30：e29；Chen以及Zhao(2005)Nucleic Acids Res 33：e154；WO2005105989；WO2003078619；WO2006097854；WO2006097853；WO2006097784；以及WO2004031346。所有这些文献均以引用的方式全文并入本文中并用于所有目的。
在本文可以使用任何大范围核酸酶，包括但不限于：I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SceVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-Aural、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NcIIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorI、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII，或者其任何活性变体或片段。
在一个实施方案中，大范围核酸酶识别12至40个碱基对的双链DNA序列。在一个实施方案中，大范围核酸酶识别基因组中的一个完全匹配靶序列。在一个实施方案中，大范围核酸酶是归巢核酸酶。在一个实施方案中，归巢核酸酶是LAGLIDADG家族的归巢核酸酶。在一个实施方案中，LAGLIDADG家族的归巢核酸酶选自I-SceI、I-CreI以及I-Dmol。
位点特异性核酸酶可进一步包括限制性内切核酸酶，其包括I型、II型、III型以及IV型内切核酸酶。I型及III型限制性内切核酸酶识别特异性识别位点，但通常在距核酸酶结合位点的可变位置处进行分裂，该位置可以是与分裂位点(识别位点)相距几百个碱基对。在II型系统中，限制性活性不依赖于任何甲基化酶活性，并且分裂通常出现在结合位点内或附近的特异性位点处。大多数II型酶切割回文序列，然而IIa型酶识别非回文识别位点并在识别位点外部进行分裂，IIb型酶切割序列两次且两个位点均在识别位点外部，并且IIs型酶识别非对称识别位点并且在一侧上且在距识别位点约1-20个核苷酸的限定距离处进行分裂。IV型限制性内切酶将甲基化DNA作为目标。限制性内切酶例如在以下文献中被进一步描述及分类：REBASE数据库(网页地址rebase.neb.com；Roberts等人(2003)NucleicAcids Res 31：418-20)，Roberts等人(2003)Nucleic Acids Res 31：1805-12，以及Belfort等人(2002)在Mobile DNA II中第761-783页，编著Craigie等人(华盛顿特区ASM出版社)；所有这些文献均以引用的方式全文并入本文中并用于所有目的。
所有SSN将DSB引入靶基因组序列中并激活非同源末端连接(NHEJ)介导的DNA修复，其会产生包括在目的基因组基因座处的核酸序列的插入或缺失的突变体等位基因并由此导致细胞中的目的基因组基因座的破坏。如果提供修复模板，则DSB还会通过同源重组来刺激同源导向修复(HDR)。HDR可以产生完美修复，其恢复在破坏位点处的原始序列，或者HDR可以用于指导设计修饰，诸如在双链断裂位点处的序列的缺失、插入或替代。
位点特异性核酸酶可以将双链断裂引入靶核酸(例如基因组DNA)中。双链断裂可以刺激细胞的内源DNA修复途径(例如，HR、NHEJ、A-NHEJ或MMEJ)。由于NHEJ和/或HR而对靶核酸的修饰可以导致例如突变、缺失、改变、整合、基因修正、基因替代、基因标签、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏和/或基因突变。将非天然核酸整合到基因组DNA中的过程可被称为基因编辑。在某些实施方案中，在通过位点特异性核酸酶将靶核酸分裂开之后，可破坏分裂位点(例如，该位点可能无法供具有原始核酸-定向核酸及位点特异性核酸酶的另一轮分裂使用)。
同源重组(HR)可以使用同源模板来进行。同源模板可包括与侧接靶核酸分裂位点的序列同源的序列。同源重组包括修复，其中修复模板(其包括与分裂靶基因座序列同源的第二DNA序列)用作用于修复分裂靶基因座序列的模板，使得遗传信息从修复模板转移至靶基因座。结果，新核酸材料(例如，雄性可育性恢复基因和/或至少一个选择标记基因)被插入/拷贝到DNA断裂位点中。这些方法导致例如但不限于：基因修正、基因替代、基因标签、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、基因突变和/或基因敲低。
NHEJ可以修复分裂靶核酸而无需同源模板。这可导致靶核酸(例如，正在试图禁用的基因)的缺失。在NHEJ中，可以通过断裂末端彼此直接连接来修复双链断裂。正因如此，没有新核酸材料被插入靶基因座中，然而一些核酸材料可能会丢失，从而导致缺失。
递送方法
已知各种用于将核苷酸序列及多肽引入细胞中的方法，包括例如转化，以及将多肽、DNA或mRNA引入细胞中。在某些实施方案中，提供位点特异性核酸酶作为蛋白质。在某些实施方案中，提供位点特异性核酸酶作为核酸，诸如例如但不限于mRNA。
本领域的技术人员已知根据本发明方法的各种适合的瞬时且稳定的递送技术，其用于将遗传物质、生物分子(包括任何种类的单链及双链DNA和/或RNA，或氨基酸)、合成或化学物质引入真核细胞、优选植物细胞中，或引入包括目的遗传物质的细胞系统中。用于将多核苷酸和多肽引入植物中的方案可根据作为转化目标的植物或植物细胞的类型(诸如单子叶植物或双子叶植物)而变化。将多核苷酸和多肽引入植物细胞中并随后插入植物基因组中的适当方法包括(除了本文中所列出的那些)：聚乙二醇介导的转化、微粒轰击、通过花粉管介导而引入受精胚/合子中、微注射(Crossway等人，Biotechniques(1986)4：320-34以及美国专利第6,300,543号)、分生组织转化(美国专利第5,736,369号)、电穿孔(Riggs等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：5602-6)、土壤杆菌介导转化(美国专利第5,563,055号以及第5,981,840号)、直接基因转移(Paszkowski等人，EMBO J.(1984)3：2717-22)，以及弹道粒子加速(美国专利第4,945,050号、第5,879,918号、第5,886,244号、第5,932,782号，Tomes等人，(1995)植物细胞、组织和器官培养：基本方法(Plant Cell,Tissue,andOrgan Culture:Fundamental Methods)中“通过微粒轰击直接将DNA转移到完整植物细胞中”，编著Gamborg以及Phillips(柏林施普林格出版社)；McCabe等人，Biotechnology(1988)6：923-6；Weissinger等人，Ann Rev Genet(1988)22：421-77；Sanford等人，Particulate Science and Technology(1987)5：27-37(洋葱)；Christou等人，PlantPhysiol(1988)87：67-74(大豆)；Finer以及McMullen，In Vitro Cell Dev Biol(1991)27P：175-82(大豆)；Singh等人，Theor Appl Genet(1998)96：319-24(大豆)；Datta等人，Biotechnology(1990)8：736-40(水稻)；Klein等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：4305-9(玉米)；Klein等人，Biotechnology(1988)6：559-63(玉米)；美国专利第5,240,855号、第5,322,783号以及第5,324,646号；Klein等人，Plant Physiol(1988)91：440-4(玉米)；Fromm等人，Biotechnology(1990)8：833-9(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人，Nature(1984)311：763-4；美国专利第5,736,369号(谷类)；Bytebier等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1987)84：5345-9(百合科)；De Wet等人，(1985)胚珠组织的实验操作(The Experimental Manipulation of Ovule Tissues)，编著Chapman等人，(纽约Longman)，第197-209页(花粉)；Kaeppler等人，Plant Cell Rep(1990)9：415-8)以及Kaeppler等人，Theor Appl Genet(1992)84：560-6(须介导转化)；D'Halluin等人，PlantCell(1992)4：1495-505(电穿孔)；Li等人，Plant Cell Rep(1993)12：250-5；Christou以及Ford，Annals Botany(1995)75：407-13(水稻)以及Osjoda等人，Nat Biotechnol(1996)14：745-50(通过根癌土壤杆菌获得的玉米)；所有这些文献均以引用的方式全文并入本文中以用于所有目的。
可选地，DNA构建体可以与适合的T-DNA侧接区域结合，并被引入常规的根癌土壤杆菌宿主载体中。在科学文献中详细描述了根癌土壤杆菌介导的转化技术，其包括二元载体的消除以及使用。参见例如Horsch等人(1984)Science 233：496-498，以及Fraley等人(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 80：4803。根癌土壤杆菌宿主的毒力功能将使用二元TDNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12：8711-8721)或共培养方法(Horsch等人(1985)Science 227：1229-1231)来在细胞被细菌感染时指导构建体以及邻近标记插入植物细胞DNA中。土壤杆菌转化系统还可以用于将DNA转化并转移到单子叶植物及植物细胞。参见Hernalsteen等人(1984)EMBO J 3：3039-3041；Hooykass-Van Slogteren等人(1984)Nature 311：763-764；Grimsley等人(1987)Nature 325：1677-179；Boulton等人(1989)Plant Mol.Biol.12：31-40；以及Gould等人(1991)Plant Physiol.95：426-434。
可选地，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触来将多核苷酸引入植物中。通常，此类方法包括将多核苷酸并入病毒DNA或RNA分子内。在某些实施方案中，最初可以将目的多肽合成为病毒多蛋白质的一部分，随后通过体内或体外的蛋白质水解对该病毒多蛋白质进行加工以产生所需的重组蛋白质。已知用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质(包括病毒DNA或RNA分子)的方法，参见例如美国专利第5,889,191号、第5,889,190号、第5,866,785号、第5,589,367号以及第5,316,931号。
在其他实施方案中，将编码位点特异性核酸酶蛋白质的RNA多核苷酸引入植物细胞中，然后通过产生足以修饰细胞(在存在至少一个指导RNA的情况下)的量的蛋白质的宿主细胞来进行翻译并处理，但是在过去预期时间段之后或者在一个或多个细胞分裂之后，该RNA多核苷酸不会继续存在。本领域的技术人员已知用于将mRNA引入植物原生质体以用于瞬时表达的方法(参见例如Gallie，Plant Cell Reports(1993)，13；119-122)。瞬间转化方法包括但不限于：直接将多肽(诸如双链断裂诱导剂)引入生物体中；引入多核苷酸(诸如DNA和/或RNA多核苷酸)；以及将RNA转录物(诸如编码双链断裂诱导剂的mRNA)引入生物体中。此种方法包括例如微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等人，Mol.Gen.Genet.(1986)202：179-85；Nomura等人，Plant Sci.(1986)44：53-8；Hepler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)91：2176-80；以及Hush等人，J.Cell Sci.(1994)107：775-84。
对于粒子轰击或通过原生质体转化，表达系统可包括一个或多个隔离的线性片段或者可以是较大构建体的一部分，该构建体可包含细菌复制元件、细菌可选择标记或其他可检测元件。包括编码指导和/或Cas的多核苷酸的表达盒可以与标记盒(例如，包括转化基因，其提供对除草剂、抗生素或其他细胞毒性化合物的抗性)在物理上相连或者可以与编码标记盒的第二核酸分子混合。标记盒由用于表达可检测或可选择标记的所需元件构成，该标记允许对转化细胞进行有效选择。
上述递送技术，单独地或相组合地，可以用于植物中方法或用于递送至体外细胞中。
为了能够向目的细胞系统提供高活性分子，在某些实施方案中，可能因此优选的是提供预组装功能性分子复合物，其包括至少一个位点特异性核酸酶、任选至少一个gRNA(用于CRISPR核酸酶)，并且进一步提供目的核酸序列，该目的核酸序列优选侧接至少一个呈修复模板形式的同源区域，从而能够向细胞或细胞系统提供功能完备的基因编辑复合物。
在本文所公开的任一种方法中，可以使位点特异性核酸酶最优化以在植物中表达，包括但不限于植物优选型启动子、植物组织特异性启动子和/或植物优选型密码子优化，如本文中更详细所述。
用于本发明的其他方法及组合物见于US2015/0152398、US2016/0145631、WO2016/205749以及WO2016/196655中；所有这些文献均以引用的方式全文并入本文中并用于所有目的。
实施例
还通过以下实施例来描述并说明本发明。然而，在说明书中的任何地方对这些及其他实施例的使用仅仅用于举例说明，而不是限制本发明的或任何例示性术语的范围和含义。同样，本发明也不限于此处描述的任何具体的优选实施方案。实际上，通过阅读本说明书，本发明的许多修饰和变化对本领域的技术人员来说可以是显而易见的，并且这些变化可以在不脱离本发明的精神或范围的条件下作出。因此，本发明仅仅由各项所附权利要求以及这些权利要求的等价方案的完整范围所限制。
实施例1：实现改良BLA系统的杀配子(Gc)基因方法。
已知杀配子(Gc)基因(也被称为杜鹃基因)能导致配子败育以及染色体断裂。Gc因子位于卵穗山羊草的染色体4Mg上，当转移到普通小麦时，其主要在缺乏Gc因子的配子体中导致适中的染色体断裂。结果，可以产生多中心的环形染色体，其发起断裂融合桥循环，这些断裂融合桥循环可以持续存在于所得到的孢子体中。弱杀配子(Gc)基因(与强Gc基因相比，其诱导较少的断裂)可以用于诱导染色体结构变化(Kynast RG、Friebe B、GillBS.2000，Chromosome Res.8：133-139)。结果，不具有Gc基因的配子是功能性的并允许在此类植物的子代中选择染色体畸变。
图5显示了用于实现携带异源附加染色体的小麦品系的优选育种方案，该异源附加染色体具有重排BLA基因座和/或恢复基因座。各个步骤描述如下：
在第一杂交中，已将Gc染色体引入携带异源附加染色体(蓝色/恢复)并纯合地携带‘Probus’缺失的小麦品系中。选择具有如下染色体构成的后代以用于进一步育种，该染色体构成包括二体21条小麦染色体、一条单体异源附加染色体(蓝色/恢复)以及单体杀配子染色体并半合地包括‘Probus’缺失。这些后代的种子是蓝色的并且是可育的(即，21”+B'+2C(Msms))。抛弃所产生的可育白色种子。
在第二杂交中，使第一杂交的所选后代再次与携带异源附加染色体(蓝色/恢复)并纯合地携带‘Probus’缺失的小麦品系杂交。从所产生的后代中，选择携带蓝色基因及Gc基因并纯合地携带‘Probus缺失’但不具有2Cc染色体的那些F1种子。随后使从这些F1种子长成的植物进行自花受精。使用从这些植物收获的蓝色种子(F2)来培育F2植物，再次使F2植物进行自花受精以产生F3种子。
基于种子颜色来分离F3种子。种植所有白色种子(～1-200)作为群体主体并且对可育穗进行表型。未显示出可育穗的任何群体均可具有重排异源附加染色体，并且对对应蓝色种子进行细胞学检查以确认是否已发生该染色体的任何有利的重排。
F3中白色种子的种植以及对完全不育的检查显示，已经发生了重排。另外，期望看到1-2％可育植物，这表明尚未发生重排。
用于可育性及颜色基因的任何特异性标记均可用于确认重排(例如表1)。图14示出了异源附加染色体(A)上的标记的分布以及用于检测恢复基因(Rf)的凝胶色谱。
表1.可用于检测异源附加染色体以及将异源附加染色体或其部分易位到小麦基因组的染色质上的标记列表
Figure BDA0002472817950000641
Figure BDA0002472817950000651
Figure BDA0002472817950000661
具有重排异源附加染色体的品系可以与优良小麦品系回交以消除42条小麦染色体中的任何其他不需要的染色体重排。
实施例2：实现改良BLA系统的辐射方法
图6显示了用于实现携带异源附加染色体的小麦品系的优选育种方案，该异源附加染色体具有重排BLA基因座和/或恢复基因座。各个步骤描述如下：
使用175、200、225及250Gy的γ射线辐射携带异源附加染色体(蓝色/恢复)并纯合地携带‘Probus’缺失(即，21”+B’)的各批次的种子。已知这会产生不同水平的染色体断裂。使很多种子(M0)发芽，其中对于不同的辐射水平预期有不同的植物成活率水平。收获结籽植物。从一个单独的植物收获的所有种子收集在M1群体中，M1群体包括白色及蓝色种子。
基于颜色来分离每一群体的种子。在托盘中培育来自每一个所收获的M0植物的所有(～1-200)白色种子(M1)以用于表型分型。抛弃显示出任何可育植物的包含白色种子的任何M1群体；通过使对应蓝色种子(M1)自花受精来增加显示出零可育植物的包含白色种子的任何M1群体。从该杂交中，对～1,000粒白色M2种子进行表型。抛弃显示出任何可育植物的包含白色种子的任何M2群体；对具有零可育植物的包含白色种子的任何M2群体进行细胞学检查，以关于BLA基因座和/或恢复基因座的可能重排来确定异源附加染色体的染色体组成。
而且，可以启动回交过程以消除42条小麦染色体中的所有不需要的突变及重排。
实施例3.1：实现改良BLA系统的ph1b诱导部分同源配对方法
通过部分同源配对(Ph)基因阻止部分同源配对，即在三个不同基因组中的等效染色体的配对。来源于普通小麦中国春的已知突变体ph1b允许出现部分同源配对。在图7中，示出了用于形成代换系的两步法：
首先使携带二体异源附加染色体(蓝色/恢复)的小麦品系与ph1b小麦品系杂交，这会诱导异源附加染色体与其中一个小麦同系物(例如4A、4B、4D或5A(参见图4))之间的部分同源配对。
在初始杂交之后，使携带单体异源附加染色体并杂合地携带突变Ph1(即ph1b突变)的F1植物自花受精以产生具有以下染色体/基因构成的种子：纯合地存在21条二体小麦染色体与单体异源附加染色体以及位于染色体5B的长臂上的ph1b突变。
为了确定单体染色体成功易位到基因组中，使从这些种子长成的植物进行第二次自花受精，并且分离成蓝色及白色种子(F2)并进行分析。分离中的变化显示出单体染色体成功易位到基因组中。通过3:1或明显地偏离1:3的比率的蓝色种子与白色种子的分离并且通过确定42条染色体的存在来证明成功的重排。
在F2植物上与白色相比蓝色更多(例如，三个蓝色与一个白色)的种子设定比率表示部分同源配对，由此异源附加染色体已与部分同源小麦染色体中的一条重组。假定染色体4A、4B、4D的长(L)臂或染色体5A的远端区域与染色体4Ag(Ag：高冰草)的长臂部分同源，并且在这些长臂上不会降低部分同源配对的频率。异源附加染色体与4A、4B或4D染色体之间的染色体配对还可以发生在短(S)臂上。不难想象，配对也可以发生在其他小麦染色体上。
对于表达蓝色糊粉颜色的明显易位品系，长臂上的任何部分同源交换仍然包括蓝色糊粉基因。易位到小麦染色体4(4Ta–普通小麦)所产生的染色体可以被命名为：
4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)-4TaS或4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)-4TaS
上述相互交换中的任一者将与小麦染色体4配对以给出开放的二价关联。4B染色体例如将携带用于雄性不育的基因或者缺乏用于雄性可育性的基因(‘Probus’缺失)。可能的及优选的结果是：
易位到染色体4A上：
染色体1＝4AL·4AS
染色体2＝4AL-4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)、或
4AL-4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)
或
染色体1＝4AL·4AS
染色体2＝4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)-4AS、或
4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)-4AS
易位到染色体4B上：
染色体1＝4BL·4BS(缺失)
染色体2＝4BL-4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)、或
4BL-4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)
易位到染色体4D上：
染色体1＝4DL·4DS
染色体2＝4DL-4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)、或
4DL-4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)
或
染色体1＝4DL·4DS
染色体2＝4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)-4DS、或
4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)-4DS
假定对42条染色体品系进行细胞学测试以识别易位的位置。选择表现出Bla染色体易位到小麦染色体上的品系以用于进一步测试并与具有msms缺失的正常Ph1杂交。
通过使用不同的基因型，第一杂交产生了各种后代群体，对这些后代群体的染色体构成进行了测试(参见表2)。图8示出了通过标记冰草属染色质来照亮易位。产生能存活的植物。
表2示出了存在具有42条染色体及蓝色种子的一些品系，但并非全部针对冰草属易位的存在进行了检查。
基因型 群体 样品 冰草属拷贝 染色体编号 植物状态
Pavon 8 8-4 2 44
92 92-1 1 43
110 110-2 1 43
Angas P4-2 P4-2-1 n.d. 42 非常弱
P4-2-3 n.d. 42 弱
P4-2-4 2 43
P4-8 P4-8-3 n.d. 43
P5-5 P5-5-3 1 42 非常弱
P7-1 P7-1-1 n.d. 42 非常弱
P7-1-2 n.d. 42 健康
P7-1-4 2 42 健康
P7-3 P7-3-1 n.d. 42 健康
P7-3-3 n.d. 42 弱
P7-5 P7-5-1 n.d. 41 健康
P7-5-3 n.d. 42 健康
图9的表格示出了另一组种子群体，对其检查了易位的存在，已经确认了易位并且已经识别出易位发生到哪些小麦染色体上(还参见图10至图13的荧光原位杂交(FISH)彩照)。图9的表格显示了蓝色糊粉(Bla)亲本品系、ph1b突变品系以及来源于Bla品系与ph1b突变品系之间的原始杂交的品系的荧光原位杂交(FISH)染色体扫描的第一结果。
图11至图13的照片证明已经发生了易位。它们确认了例如，易位发生到来自小麦染色体4B短臂的染色质上(图11A及B)并发生到来自小麦染色体4D短臂的染色质上(图12及13)。下一步骤是自交并然后与缺体四体品系(例如N4DT4A)杂交，以促成与正常4D染色体的配对(还参见实施例3.3)。
实施例3.2：通过将冰草属小段易位到小麦上来支持ph1b诱导部分同源配对方法。
可选地或除了实施例3.1之外，未携带用于蓝色种子颜色的基因的一定比例的冰草属染色质可易位到小麦染色体4A、4B、4D或5A上。在这种情况下，小麦-冰草属染色体将与完整的Bla染色体配对(图4；下组)。
冰草属染色质(4AgL–高冰草)易位到小麦染色体4(4Ta–普通小麦)产生的染色体可以被命名为：
4AgL-4TaL·4TaS
该染色体将与完整的Bla染色体配对以给出开放的二价关联。4B染色体例如将携带用于雄性不育的基因或者缺乏用于雄性可育性的基因(‘Probus’缺失)。可能的及优选的结果是：
易位到染色体4A上：
染色体1＝4AgL-4AL·4AS
染色体2＝4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)、或
4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)
易位到染色体4B上(参见图15)：
染色体1＝4AgL-4BL·4BS(缺失)
染色体2＝4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)
4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)
易位到染色体4D上：
染色体1＝4AgL-4DL·4DS
染色体2＝4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)
4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)
假定对42条染色体品系进行细胞学测试以识别易位的位置。选择表现出冰草属染色质小段易位到小麦染色体上的品系以用于进一步测试并与具有msms缺失的正常Ph1杂交。
实施例3.3：通过与缺体四体品系杂交来将新的易位染色体转移到42条染色体背景中。
对42染色体系统进行的任何上述成功易位随后都会需要经历一系列杂交以消除所有不需要的易位及额外染色体，以最终实现42条染色体Bla品系。一个关键步骤是在Ta-4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)或Ta-4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)的情况下促成易位染色体与普通小麦染色体配对，或者在4AgL-TaL·TaS的情况下促成易位染色体与原始Bla染色体配对。此种配对促成可通过与缺体四体品系杂交来实现，该缺体四体品系缺少了其中作出新易位的对应染色体对(图16A-C)。
此种转移过程示例为4AgL(蓝色)-4BoL·4BoS(可育性恢复)-4DS(标记为D*)。然而，也可以应用在4AgL(蓝色)-4BL·4BoS(可育性恢复)-4DS的情况下。在步骤I中，除了一组正常的二价染色体(AA-BB-DD)之外包含单价D*的易位品系与携带两个A基因组以及一个B基因组(AA-AA-BB)但不携带D基因组的缺体四体普通小麦中国春杂交。在步骤II中，选择F1蓝色种子(A-AA-BB-DD*)并与正常小麦(AA-BB-DD)杂交。从这四种类型的配子中，两个组合产生了表现出染色体组成A-AA-BB-DD*以及AA-BB-DD*的蓝色种子，由此通过使用qPCR来消除具有额外A染色体的品系。可选地，此种消除还可以通过流式细胞仪来执行。在步骤III中，从所选蓝色种子(AA-BB-DD*)获得的植物与正常小麦(优良物质)回交以产生BC1F1蓝色种子(BC1：回交1，子代1)。在步骤IV中，从这些蓝色种子获得的这些植物与纯合地携带Probus缺失的ms1缺失品系(AA-BsBs-DD)杂交，并且选择BC2F1蓝色种子。在步骤V中，在自交之后，例如通过使用KASP标记技术来选择从具有(AA-BsBs-DD*)的步骤IV后代的所选蓝色种子产生的植物。最后的自交(步骤VI)产生了三种类型的后代：
-单一蓝色(淡蓝色)可育(AA–BsBs-DD*)
-双蓝色(深蓝色)可育(AA–BsBs-DD*)
-白色不育(AA–BsBs-DD)。
此种系统在工作时分离1:2:1(双蓝色：单一蓝色：白色)。白色种子可以用于杂交测交生产，单一蓝色种子可以用于产生更多白色种子或用于培育池发展，并且双蓝色种子应被抛弃。
实施例4：将蓝色糊粉(bla)以及可育性恢复(Rf)基因盒随机整合到小麦基因组中。
为了生产具有遗传连锁的bla与Rf基因盒的小麦植物，将bla与Rf基因(包括启动子以及终止子(例如，ORF的500bp至2.5kb上游和300bp至1.5kb下游))从合适的基因型进行PCR扩增并使用标准分子生物学技术克隆到单一质粒中。基因盒可以排列成任何构型，包括“头对头”、“尾对尾”、“尾对头”或“头对尾”。由此将基因盒融合到单一分子中，它们之间仅有短的DNA序列。在植物基因组中，此种紧密靠近的排列导致了这两个基因之间的遗传连锁的情形，并且因此，蓝色糊粉与雄性可育表型将典型地共同继承。
一旦在质粒中排列成紧密靠近，连接的基因盒便可以通过多种方式被递送至小麦细胞中，这些方式诸如但不限于：
-对在二元质粒中的T-DNA边界内包含的基因进行土壤杆菌介导转化
-对呈超螺旋、环状、松弛或线性构型的质粒进行粒子轰击
-对连接的盒的PCR扩增子进行粒子轰击，由此使得仅仅引入包含43条染色体的小麦植物中已经存在的DNA(不会引入通过有性杂交产生的植物中尚未存在的DNA)
-在本领域中所使用的其他形式的转化
以此种方式处理的该类型的细胞可以来自适用于所用转化方法的任何基因型。如果方法是体外转化及再生，则所处理的该类型的组织可以是未成熟胚或愈伤组织。或者该类型的组织可以是整个或部分剖开的胚，其中直接轰击分生组织并使胚发芽以产生植物。转化方案可以包括或不包括标记基因盒。
在一种情形中，细胞从雄性不育基因型转化并且进行再生或发芽而无需选择，然后使用雄性可育及蓝色糊粉表型来识别其中两个基因被整合到它们被正确表达的位置中的植物。
之后，识别“优良事件”，其典型特征在于，在基因组的优选位置中具有单一拷贝插入，该单一拷贝插入不会破坏天然基因序列并且允许在各代中稳定的基因的适当表达。qPCR通常用于识别第一代中的单一拷贝事件。
实施例5：将bla以及Rf基因盒靶向整合到小麦基因组中。
为了生产具有遗传连锁的bla与Rf基因盒(其被整合到小麦基因组内的靶向位置中)的小麦植物，使用类似于实施例4中所述的程序，具有以下不同：
选择小麦基因组内的靶位置，其允许良好的转基因表达，不会破坏天然基因，并且对于育种具有良好的特征。将诸如大范围核酸酶、TALEN、ZFN或CRISPR核酸酶之类的位点特异性核酸酶设计成在靶位点处作出双链断裂。可以通过编码所需基因的DNA盒的转化、通过RNA分子的转化，或者通过纯化蛋白质或核糖核蛋白质复合物的转化来递送核酸酶。
由位点特异性核酸酶(SSN)诱导的双链断裂(DSB)是bla及Rf基因盒被整合到小麦基因组中的位点。整合策略可以是通过非同源末端连接(NHEJ)，其中包含bla及Rf基因盒的DNA分子通过细胞机器连接到DSB中。在这种情况下，不需要同源臂。在一个例子中，转化仅由盒组成的线性PCR扩增子。在另一例子中，可以通过如下方式来设置质粒：除了诱导基因组DSB，SSN还会将盒从质粒分裂开。替代整合策略是使bla及Rf基因盒与上游及下游同源臂侧接，以通过同源重组将盒整合到DSB的位点中。
实施例6：将bla基因盒靶向整合到第43条染色体上的Rf基因盒附近。
为了生产具有在Rf基因盒附近的bla基因盒(其位于第43条染色体内的靶向位置中)的小麦植物，使用类似于实施例5中所述的程序，具有以下不同：
代替将这两个基因盒克隆到质粒中，仅仅克隆bla基因盒。将SSN定向到第43条染色体上的Rf基因盒附近的位点。如果通过同源重组来整合bla基因盒，则适当地设计侧接bla盒的同源臂。
可以使用用于修饰及转化程序的任何适当的基因型。例如，可以具有包含缺乏bla基因的第43条染色体的基因型，使得蓝色糊粉表型可以用作经修饰的植物的指示物。
实施例7：将Rf基因靶向整合到第43条染色体上的bla基因盒附近。
为了生产具有在bla基因盒附近的Rf基因盒(其位于第43条染色体内的靶向位置中)的小麦植物，使用类似于实施例5中所述的程序，具有以下不同：
代替将这两个基因盒克隆到质粒中，仅仅克隆Rf基因盒。将SSN定向到第43条染色体上的bla基因盒附近的位点。如果通过同源重组来整合Rf基因盒，则适当地设计侧接Rf盒的同源臂。
可以使用用于修饰及转化程序的任何适当的基因型。例如，可以具有包含缺乏Rf基因的第43条染色体的基因型，使得雄性可育表型可以用作经修饰的植物的指示物。
实施例8：导致bla基因盒与Rf基因盒遗传连锁的第43条染色体的核酸酶诱导重排。
为了生产通过第43条染色体的核酸酶诱导重排而具有遗传连锁的bla与Rf基因的小麦植物，仅仅将SSN递送至包含上面携带有两个基因的第43条染色体的细胞。需要至少两个SSN，但是更多的SSN可以用于进一步分裂第43条染色体。在优选的实施方案中，一个核酸酶简短地定向在其中一个基因的外部(朝向染色体的末端)，并且另一核酸酶仅仅定向在另一基因内部(朝向着丝粒)。通过使染色体的两个末端同时断裂或紧密地依次断裂，所需结果是交换这些染色体末端，使得bla与Rf基因由此在第43条染色体的一个臂上彼此紧密靠近。
由于产生转基因植物的成本，可能期望产生表达活性核酸酶的小麦品系并使该小麦品系与包含第43条染色体的品系杂交，由此通过育种使核酸酶与其靶位点接触。在几千个这种独立植物中，具有潜在重排事件的每一植物均可以产生。
由于重排是非常精确的，因此所需结果是已知的，并且可以设计跨越优选融合的接合处的引物。由此，可以筛选成百上千的原始及后续世代植物以找出具有正确重排的一者。
实施例9：外源基因渐渗工具。
具有ph1b突变体并具有能促进与小麦外源物种杂交的可杂交基因的BLA系统(基于42条或42+1条染色体)可以用于将基因从外源物种转移至小麦中。来自此种杂交的白色种子是不育的双单倍体，并且将与常规小麦杂交。从此种杂交中，可以选择携带新的易位的可育正常Ph1品系。
实施例10：新黑小麦品系。
识别出可与黑麦杂交的白色种子雄性不育BLA品系。如果这些BLA品系中的任一者均可与黑麦杂交，则应该能够使相同的品系(可育蓝色种子品系)与黑麦杂交以获得蓝色种子小麦-黑麦双单倍体。这种技术可产生新的次级蓝色种子黑小麦。还可以在六倍体黑小麦与Bla小麦之间进行直接杂交，随后在自交以及针对系统成分进行筛选之后选择AABBRR后代。
实施例11：轮回选择。
BLA可以用于在轮回选择计划中促进重组。基于现有技术数量性状位点(QTL)/基因组范围关联研究来将一系列雌性转化成BLA。这些雌性携带目的关键区域以用于选择。根据基于表型分析的后代分布的上端中的互补标记来识别雄性。使这些雄性作为花粉主体与若干雌性杂交，并且培育所产生的种子并使其自花受精。同时，使用Kompetitive等位基因特异性PCR(KASP)试验来针对标记对这些植物进行筛选，以识别出用于第二轮重组的那些植物。
***
本发明在范围上不应受限于本文所述的具体实施方案。实际上，除了本文所述的那些，本发明的各种修改形式对于本领域的技术人员在阅读上述说明之后将变得显而易见。此种修改形式旨在落在所附权利要求的范围内。
在本文中所引用的所有专利、申请、出版物、试验方法、文献以及其他材料均以引用的方式全文并入本文中，就像实际上存在于该说明书中一样。
序列表
<110> 科沃施种子欧洲股份两合公司
全球作物创新私人有限公司
悉尼大学
<120> 改良蓝色糊粉及其他分离系统
<130> KWS0275PCT
<150> US 62/551,599
<151> 2017-08-29
<150> US 62/610,727
<151> 2017-12-27
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 3838
<212> DNA
<213> Hordeum vulgare
<400> 1
cgcacatcaa cataaactca tcagatggga ataatcggat ctacgaagga cataaaactc 60
tttaatctca tgacaacgcc agaagagcaa gagtaaatat attctcataa aaaacaatga 120
acactagatg atgacgaaga acataagatt cttcaaggag aaattgcggc agcggagatg 180
gcagccggag gcgagggggc caaaaactct gttgcggcgg cagcggtagc cttggtgaaa 240
cccacacgtt tgcacaccat ataagttgtt tgcaagggtt acatgggcct cgctctcgtg 300
aaaaagaagg tcatacatgg gtcttggtct cgtgcaaaac gaaaggtcag cagtccatgg 360
gccggaggaa aaaccgggca acaacacgcc atgtgtgttt tcgcgggaac ccaattccga 420
aatcactcac cggcacctcg tcccgatgcc ttccagaacg ttctacgtgc ttccacaggg 480
ccagcccagc cgtgggatca gatcaggatc agcacgaaca ttgaagctag cgcggcgata 540
tttttcccag cctccgcctc gctcgacgac tgcatttcat ttcgaaaaca aaaaaaagag 600
ctttctcctt ctcatcccga gcgccagagg agcaccagaa aggccaccca cccaccctca 660
cgtaccgccc tcgcacccgc gcggccacat ctgggccgtc cacttgggca gctggccgtt 720
ccattcccga actgacgggc aggatcgagc gagcggcgcg cccacggctc ctccggctat 780
ataacccgcc acccacacca ctcccctccg gcgttccacc agagccttcc tccctccacc 840
gcaccaccac caccaccgcg ccaaaaaccc tagggagcga gcgagctcac ctcgccccgc 900
ccatggagag atcccgccgc ctgctgctcg tggcggggct cctcgccgcg ctgctcccgg 960
cggcggccgc caccttcggg ctgcagcagg gggcgcagtg cgaccccacg ttcctggcga 1020
cgcaggccgc gctcttctgc gcccccgaca tgcccacggc ccagtgctgc gagcccgtcg 1080
tcgccgcctt cgacctcggg ggcggcgtcc cctgcctctg ccgcgtcgcc gccgagccgc 1140
agctggtcat ggcggggctc aacgccaccc acctcttcgc gctgtacacc tcctgcggcg 1200
gcatccgtcc cggtggcgcc cacctcgccg ccgcctgcca aggtacgttc acgttcaccg 1260
cctccctccc tctccttctc tctttgcacc tgtaccagcc gattcggcgt tcgctttcgc 1320
gtttcccggt agttttgatg gtttctcgag tcgccagtgc tccgatttgg gttcggtttc 1380
cttgcgttgt accggatctg cctgtacggc gcgcggcgtc ggggttctcg ttgtttcccg 1440
tggcgagcat ccccgcgcgc ccacggccta gctagcttac cttcagatac gcggagcgat 1500
ttaggatcag tatgaggagt tcgtcgtaga agaatgcatg cggaacgcgc gattgtttgt 1560
ttcatcgatt ttggatctgt gataggcctg cttgttcccg agtttttgca cgtagaagaa 1620
tcatgtgcag aacccctggt ccattatttg ttatgtatat acacgattac ttgtgcatat 1680
gcagaagtct tagttatctg ctacccttcc agaattattc gtggtgtttt tgttcctcta 1740
gttaaacttc agatgatctt tcgttcgagt ttattttcct gcctgtaact gagatcgata 1800
tacctatcac cgtgactgtg agagagacag agagttgttg ccgtttaact gctatatata 1860
tgtacgtttt ctgctactgt ttaatcgact gctccatccc gttcgcgata ggacttgttt 1920
caaaccgtca cgcagctctg cttcctgcag tgtcttttgt cttcgtttgg tcaaaactga 1980
aaacgcttgc tatcgaggcc agaggcaggg caaaagctcc ccgtactttt cgctttgcag 2040
tggcatctct ttcttttttt ttgccgaaaa ttgtttccac gttcatcccc gggtgtcgta 2100
ctacttaatt atctgcatgc agttttcgtg tccttcctcc gtcgtgaaaa aaaggttggg 2160
tcaaatgaat caaccgtgta tgcagggcag cagcaacaga gatagagtag ctggctgtcg 2220
cagctttaac aaaagcagtc tgtggcctgc cacagttttc ctgatttttg tttaatctgg 2280
cctgggcttc ttttcttgtt gcgcacgtcg tcgcctcctt cttttttccc aattttttga 2340
tttcttttga gataaggaca cgaacggctg gtaactgact tttcttgttg ttttttactg 2400
tgggttttgg acgcaggacc ggctcccccg gccgccgtcg tcagcagccc cccgccacca 2460
tcgccagcac ctcgccgcaa acaggcagcg cgtacgaacc tctcgctctc tctctctccc 2520
tctcgcctgc atctcgctct gtacataacc tattgggttc atatgctgat cagcgttgac 2580
atactaactt gttcatttga ttctcagacg acgcgcctcc accgccgccg tccagcgaga 2640
agccatcccc gccgccccag gagcatgacg gcgccgcaca cgccaagagc gcccccgccc 2700
tcgcggctcc taccccgctc gcgcccgctg ccgctactgc cccgccgccc gaggcgccac 2760
actccgccgc gtcgtcgtcc gattcggcct tcatcttcat cgccgcggcc atgctcgcca 2820
tttacatcgt cctctgaatg gccgaccccc aaggcagcag agtacttgtc atctgattcc 2880
gtttcatgct tgtcgccgtt tgttgaggtt cgtttctgca gtccgaacaa gacggtgggg 2940
ttttgatcgg gtacccagat ttctatgtcg atcgcgcgta ctagtactag tagttgctta 3000
gcagatgaac gaacattggg ttttgggatt cctctagctg atgaaccact gctattttcc 3060
atgtgatcga tggatatgat ctgaatggat ggatgaagtt ttggtttctg atgctgatga 3120
tgtgctgctt cttcatttgc atgctcgatc tattccttca attttgtgga gcaacagttt 3180
gtttagcttc tgttctgcta tgaataatgc cgcttgcatc ttgtcattgc tgataatctg 3240
cttaatgcag acattgcttc cgtcccaaac aatctgttgc ttaccaggta atgcatataa 3300
tctgtacctc accttcgcac aacaacagaa gctaccctgc taaaaaaaca cacacacaca 3360
cacaaaaaaa acagaagctg gtctcacacg gaagccgctt cggggactgt ttgcagcttt 3420
ttattgccat tttgtttttc atgcaggtac aaatcgaggg tgttgcttga tttgatcatg 3480
gatgatcact tagagcaaca tgtgtgtttt gtctgtgttt tattcgttgc tcgtccatcc 3540
aatttaaact tgaaatggat cgtgtgtgga taaaagaaga cgtgcgtcag tttgaatcga 3600
cgcgttgggt tatattttgt gtctgtgacg accgaaacga agacaaaata tatcgtccgg 3660
ttagaattgc tctaatgcta gctttctctc ctaccatcgc attccgtggt aggaaaaagt 3720
actagaacca caggaaactg gaacgcaaga aaagcatatc taccgttggc cgttgatctt 3780
gtttcacatt cggtatggct ccggtcatat tgttggagat tcacattcat gcacgcaa 3838
<210> 2
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HvMs1的cDNA
<400> 2
atggagagat cccgccgcct gctgctcgtg gcggggctcc tcgccgcgct gctcccggcg 60
gcggccgcca ccttcgggct gcagcagggg gcgcagtgcg accccacgtt cctggcgacg 120
caggccgcgc tcttctgcgc ccccgacatg cccacggccc agtgctgcga gcccgtcgtc 180
gccgccttcg acctcggggg cggcgtcccc tgcctctgcc gcgtcgccgc cgagccgcag 240
ctggtcatgg cggggctcaa cgccacccac ctcttcgcgc tgtacacctc ctgcggcggc 300
atccgtcccg gtggcgccca cctcgccgcc gcctgccaag gaccggctcc cccggccgcc 360
gtcgtcagca gccccccgcc accatcgcca gcacctcgcc gcaaacaggc agcgcacgac 420
gcgcctccac cgccgccgtc cagcgagaag ccatccccgc cgccccagga gcatgacggc 480
gccgcacacg ccaagagcgc ccccgccctc gcggctccta ccccgctcgc gcccgctgcc 540
gctactgccc cgccgcccga ggcgccacac tccgccgcgt cgtcgtccga ttcggccttc 600
atcttcatcg ccgcggccat gctcgccatt tacatcgtcc tctga 645
<210> 3
<211> 214
<212> PRT
<213> Hordeum vulgare
<400> 3
Met Glu Arg Ser Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu Pro Ala Ala Ala Ala Thr Phe Gly Leu Gln Gln Gly Ala Gln
20 25 30
Cys Asp Pro Thr Phe Leu Ala Thr Gln Ala Ala Leu Phe Cys Ala Pro
35 40 45
Asp Met Pro Thr Ala Gln Cys Cys Glu Pro Val Val Ala Ala Phe Asp
50 55 60
Leu Gly Gly Gly Val Pro Cys Leu Cys Arg Val Ala Ala Glu Pro Gln
65 70 75 80
Leu Val Met Ala Gly Leu Asn Ala Thr His Leu Phe Ala Leu Tyr Thr
85 90 95
Ser Cys Gly Gly Ile Arg Pro Gly Gly Ala His Leu Ala Ala Ala Cys
100 105 110
Gln Gly Pro Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Ser Ser Pro Pro Pro Pro
115 120 125
Ser Pro Ala Pro Arg Arg Lys Gln Ala Ala His Asp Ala Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Lys Pro Ser Pro Pro Pro Gln Glu His Asp Gly
145 150 155 160
Ala Ala His Ala Lys Ser Ala Pro Ala Leu Ala Ala Pro Thr Pro Leu
165 170 175
Ala Pro Ala Ala Ala Thr Ala Pro Pro Pro Glu Ala Pro His Ser Ala
180 185 190
Ala Ser Ser Ser Asp Ser Ala Phe Ile Phe Ile Ala Ala Ala Met Leu
195 200 205
Ala Ile Tyr Ile Val Leu
210
<210> 4
<211> 663
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TaMs1的cDNA
<400> 4
atggagagat cccgcgggct gctgctggtg gcggggctgc tggcggcgct gctgccggcg 60
gcggcggcgc agccgggggc gccgtgcgag cccgcgctgc tggcgacgca ggtggcgctc 120
ttctgcgcgc ccgacatgcc gacggcccag tgctgcgagc ccgtcgtcgc cgccgtcgac 180
ctcggcggcg gggtgccctg cctctgccgc gtcgccgccg agccgcagct cgtcatggcg 240
ggcctcaacg ccacccacct cctcacgctc tacagctcct gcggcggcct ccgccccggc 300
ggcgcccacc tcgccgccgc ctgcgaagga cccgctcccc cggccgccgt cgtcagcagc 360
cccccgcccc cgcctccacc gtccgccgca cctcgccgca agcagccagc gcacgacgca 420
ccaccgccgc caccgccgtc gagcgagaag ccgtcgtccc cgccgccgtc ccaggaccac 480
gacggcgccg ccccccgcgc caaggccgcg cccgcccagg cggccacctc cacgctcgcg 540
cccgccgccg ccgccaccgc cccgccgccc caggcgccgc actccgccgc gcccacggcg 600
ccgtccaagg cggccttctt cttcgtcgcc acggccatgc tcggcctcta catcatcctc 660
tga 663
<210> 5
<211> 220
<212> PRT
<213> Triticum aestivum
<400> 5
Met Glu Arg Ser Arg Gly Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu Pro Ala Ala Ala Ala Gln Pro Gly Ala Pro Cys Glu Pro Ala
20 25 30
Leu Leu Ala Thr Gln Val Ala Leu Phe Cys Ala Pro Asp Met Pro Thr
35 40 45
Ala Gln Cys Cys Glu Pro Val Val Ala Ala Val Asp Leu Gly Gly Gly
50 55 60
Val Pro Cys Leu Cys Arg Val Ala Ala Glu Pro Gln Leu Val Met Ala
65 70 75 80
Gly Leu Asn Ala Thr His Leu Leu Thr Leu Tyr Ser Ser Cys Gly Gly
85 90 95
Leu Arg Pro Gly Gly Ala His Leu Ala Ala Ala Cys Glu Gly Pro Ala
100 105 110
Pro Pro Ala Ala Val Val Ser Ser Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ser
115 120 125
Ala Ala Pro Arg Arg Lys Gln Pro Ala His Asp Ala Pro Pro Pro Pro
130 135 140
Pro Pro Ser Ser Glu Lys Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser Gln Asp His
145 150 155 160
Asp Gly Ala Ala Pro Arg Ala Lys Ala Ala Pro Ala Gln Ala Ala Thr
165 170 175
Ser Thr Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Thr Ala Pro Pro Pro Gln Ala
180 185 190
Pro His Ser Ala Ala Pro Thr Ala Pro Ser Lys Ala Ala Phe Phe Phe
195 200 205
Val Ala Thr Ala Met Leu Gly Leu Tyr Ile Ile Leu
210 215 220
<210> 6
<211> 4335
<212> DNA
<213> Triticum aestivum
<400> 6
agacttaaac catttagtta caaatatcga tgcacacctt cggtggggcg ttgtgaaaaa 60
gcatgttttt tgggtcgaca agcccctttt gcaacgtatc ctcttctaat cctattcaga 120
tcattaacat cataagctgc aattgacatg ctcttctgag gatcaggttc atgcaattaa 180
acatcataaa ctgcatcttt gatgtcatcc ttttcctata ttttttccag attattggct 240
tgcttcgttt tcaatatcag gttctatgat tcgacttctg ttgttgccag taataatttg 300
tagttgctgc ggaatatgaa ctcaaggaga gctgatggtg ctatgaagtt gatttgatgg 360
gaggttgttc tacacctgca cttgctgctc gacttaaata catgccttgg atttcttccc 420
agctctagta cataatattt ttcaaattaa tgttccacga cataaaattt aaatccacaa 480
acatattttt agtacatgaa caattttcta atatagggca aacatttttc atatacaaac 540
cgatcatttt aatatatggt gaaaatcagt gtaatatatg ctgaaatgtt ttcaaataca 600
tattgaacat atttataata aatggtgaac atttttttta ataattgatg accattttta 660
aaatgcatat tgaacatttt ataatataca ctgtacagtt ttataataat cgacgaacat 720
cttttggagt tctgaacatt tttttcaaaa acacaagcca ttttccagga agaatacaaa 780
tgcaaaagaa atgagatatc caaaaagcaa aaaagaaaaa caaaacaaaa cagagaaacc 840
tacaggaaaa tccaaacaga aaaggcaaag aaagaacccg aactgggcca ggcaatgttt 900
ccaacggcct cgctcttcct gaacaagaag gccagtcagc ccatgggctg ctcccagtac 960
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cgcccgcagc gggaacccga cgtcggtctg gtgcgttctg gcgccttcca gaactctcca 1080
caggctcccg cagccgtccg atcagatcag cacgaagcac gaacattggc gcgcggcgat 1140
attttctttc ctcgcccgac gacggccgca ctgcatttca ttttgaattt caaaattcgg 1200
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ccacccaccc acccccgccc tcacgtgccc cgcgcggccg catccgggcc gtccgcgcgg 1320
acagctggcc gcgcccagcc cgaaccgacg cccaggatcg agcgagggcg gcgcgcccgg 1380
ggcttggctt agcgtccacg ccacctccgg ctatataagc cgccccacac ccgctccccc 1440
tccggcattc cattccgcca ccgcaccacc accaccacca aaccctagcg agcgagcgag 1500
ggagagagag accgccccgc cgcgacgatg gagagatccc gcgggctgct gctggtggcg 1560
gggctgctgg cggcgctgct gccggcggcg gcggcgcagc cgggggcgcc gtgcgagccc 1620
gcgctgctgg cgacgcaggt ggcgctcttc tgcgcgcccg acatgccgac ggcccagtgc 1680
tgcgagcccg tcgtcgccgc cgtcgacctc ggcggcgggg tgccctgcct ctgccgcgtc 1740
gccgccgagc cgcagctcgt catggcgggc ctcaacgcca cccacctcct cacgctctac 1800
agctcctgcg gcggcctccg ccccggcggc gcccacctcg ccgccgcctg cgaaggtacg 1860
ttgtccgcct cctcccctcc ctccctccct ccctctctct ctacgtgctc gctttcctgc 1920
ttacctagta gtacgtagtt tcccatgcct tcttgactcg ctagaagtgc tccggtttgg 1980
gtctgttaat ttcctcgctg tactaccgga tctgtcgtcg gcacggcgcg cggcgtcggg 2040
tcctcgcctt ctcccgtggc gaccgacctg cgcagcgcgc gcgcggccta gctagcttca 2100
taccgctgta cctcgacata cacggagcga tctatggtct actctgagta tttcctcatc 2160
gtagaacgca tgcgccgctc gcgattgttt cgtcgattct agatccgtgc ttgttcccgc 2220
gagttagtat gcatctgcgt gcatatgccg tacgcacgca gatgcagagt ctgttgctcg 2280
agttatctac tgtcgttcgc tcgaccatat ttgcctgtta atttcctgtt catcgtgcat 2340
gcagtagtag tagccatgtc cacgccttct tgttttgagg cgatcatcgt cgagatccat 2400
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tggcaccgca gtgcgtcgcc tctgccgctt ttgcgaaaca tttccatgtt gatcctctgg 2580
cggaactact ttttcgcgtg cggtttgcgt ggccttcctc tctcgtgaaa agaggtcggg 2640
tcaaaccaaa tggatcgcct cttggcagag cagcggcagc agatagctgg ccgtctcgca 2700
gctttggcag aaccggtctg tggccatctg tcgccgcctg ccaccgtttc cctgatgttt 2760
gtttctctct cgcctgccac tgtttctttt cttgttgcgc acgtacgtcg tcacctcctc 2820
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taactttggc tgctgctgtt aattactgtg gattttggat gcaggacccg ctcccccggc 2940
cgccgtcgtc agcagccccc cgcccccgcc tccaccgtcc gccgcacctc gccgcaagca 3000
gccagcgcgt aagaacctct ccctctccct ctctctctcc ctctcgcctg catctcgcta 3060
tgtttatcca tgtccatatg ttgatcagcc ttgtttagtt actaacatgt gcaccggatc 3120
gggttctcgc agacgacgca ccaccgccgc caccgccgtc gagcgagaag ccgtcgtccc 3180
cgccgccgtc ccaggaccac gacggcgccg ccccccgcgc caaggccgcg cccgcccagg 3240
cggccacctc cacgctcgcg cccgccgccg ccgccaccgc cccgccgccc caggcgccgc 3300
actccgccgc gcccacggcg ccgtccaagg cggccttctt cttcgtcgcc acggccatgc 3360
tcggcctcta catcatcctc tgagtcgcgc gccgaccccg cgagagaccg tggtccgtcc 3420
agtcgcagta gagtagagcg ctcgtcgtct cgttccgttt cgtgcctgtc gccgttcgag 3480
gttcgtttct gcgtgcagtc cggtcgaaga agccggtggg ttttgagtac tagtggtagt 3540
agtagcagca gctatcgttt ctgtccgctc gtacgtgttt gcgtggtcgc ggagaacaat 3600
taattgggtg tttgcgagtc ctctggttaa gatgaaccac tgatgctatg tgatcgatcg 3660
atcggtatga tctgaatgga aatggatcaa gttttgcgtt ctgctgatga tgtgatccat 3720
ttggatctgt gtggggcaac agtttcgctt gcttttgctc tgcgatgaac gaatgcttct 3780
tgcatgcatc ttgtctttgc ttaatttgaa ctgtagaacg gatgcagtac tgatttctgc 3840
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ttgaaatccg aattc 4335
<210> 7
<211> 4335
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Ms1的合成DNA
<400> 7
aagcttaaac catttagtta caaatatcga tgcacacctt cggtggggcg ttgtgaaaaa 60
gcatgttttt tgggtcgaca agcccctttt gcaacgtatc ctcttctaat cctattcaga 120
tcattaacat cataagctgc aattgacatg ctcttctgag gatcaggttc atgcaattaa 180
acatcataaa ctgcatcttt gatgtcatcc ttttcctata ttttttccag attattggct 240
tgcttcgttt tcaatatcag gttctatgat tcgacttctg ttgttgccag taataatttg 300
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gaggttgttc tacacctgca cttgctgctc gacttaaata catgccttgg atttcttccc 420
agctctagta cataatattt ttcaaattaa tgttccacga cataaaattt aaatccacaa 480
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cgatcatttt aatatatggt gaaaatcagt gtaatatatg ctgaaatgtt ttcaaataca 600
tattgaacat atttataata aatggtgaac atttttttta ataattgatg accattttta 660
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cttttggagt tctgaacatt tttttcaaaa acacaagcca ttttccagga agaatacaaa 780
tgcaaaagaa atgagatatc caaaaagcaa aaaagaaaaa caaaacaaaa cagagaaacc 840
tacaggaaaa tccaaacaga aaaggcaaag aaagaacccg aactgggcca ggcaatgttt 900
ccaacggcct cgctcttcct gaacaagaag gccagtcagc ccatgggctg ctcccagtac 960
tcgggccccg ctgtggcagc acgccatgta atagttttcg cgggaatcca acgccgaaat 1020
cgcccgcagc gggaacccga cgtcggtctg gtgcgttctg gcgccttcca gaactctcca 1080
caggctcccg cagccgtccg atcagatcag cacgaagcac gaacattggc gcgcggcgat 1140
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aaacggaata gctttctcgc atcccgaggc gaggcggtta cgggcgccag aggggccacc 1260
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ggcttggctt agcgtccacg ccacctccgg ctatataagc cgccccacac ccgctccccc 1440
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ttacctagta gtacgtagtt tcccatgcct tcttgactcg ctagaagtgc tccggtttgg 1980
gtctgttaat ttcctcgctg tactaccgga tctgtcgtcg gcacggcgcg cggcgtcggg 2040
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taccgctgta cctcgacata cacggagcga tctatggtct actctgagta tttcctcatc 2160
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gagttagtat gcatctgcgt gcatatgccg tacgcacgca gatgcagagt ctgttgctcg 2280
agttatctac tgtcgttcgc tcgaccatat ttgcctgtta atttcctgtt catcgtgcat 2340
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ctactttttt gccagttttg tttacttttg atgaaatata cggatgaatc ggctggtgat 2880
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atcggtatga tctgaatgga aatggatcaa gttttgcgtt ctgctgatga tgtgatccat 3720
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ttgatcccca atcccaccat caccatgttc cggagagcca catggaactc acgtcaagcg 4080
gtcacttttt gcagaatcac tcttaccatt ttaccctttt gttgaaacct ctctcctcat 4140
ccccaaaagt tgatgcaaca gtgctatgcg cgcccaccca tgctttttca tatgattgta 4200
aaatttggat cgattttatc ttttgaaccc taagtccggt ttacaatctg tttgcatgtt 4260
tatgttcctt gcggcgagga ccattaaaca agactactat tggatatatt tcgacaggct 4320
ttgaaatccg aattc 4335
<210> 8
<211> 4504
<212> DNA
<213> Oryza sativa
<400> 8
gaacagtgca ctggttggga taacaagaag ttagaaattg ggcatatata tagaagggta 60
agacacctct aatggatagg gtggacaatc catcaaagat gactattttg gcacctctga 120
ggccgtgaca agttgcctat cttcgcaccc ttcacaagtg actccctact tgtgatgggt 180
cgtgagatgt gagccggtga tctttctcag atgtaaattt cggcctctca caagtgactc 240
cttatctgtg ataggtcttg ccctcacagc ctcatctgta acggcctcta attcaatccg 300
ttacagatta aatcattcat gacaagacac tttgacccat cataggtggg ttgttaatgt 360
tgaaccgagg tagcgtggtg gtggcttctt tgattgttga gcgggttgtg ttcttcatca 420
cttggtagga agtaggaacc caagaaggtt agaagcccac aactattata tcgtcggcct 480
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gatgggccag agacgttgcg tcgtcttcga ctcttcgagt gcctggccta cggatctgca 600
cgaatcttag agcaagtaga aaatcgcata tcgtcgtgta gagcgcagca caaattcgag 660
ttgcttttcc ctttttcgca gccaaatctt acctgctcac gtgccgtgct gcccggtgtg 720
cagagcccac gcgccacggc gccagtgtac tacaccgaat cggcaccatc catcgccaca 780
gctggccggt cccccctaag acggacgctc cggatcaatc cacgttggca tggcttcccc 840
gcatcgcctt ctccgcgccc ccgcctatat aatggcgctc tcgcttctct tccccatttc 900
gtcttcccct tctctagagc cttcctctca cagagcacac acaaaaccct agagtaggaa 960
gcgagcgaga gagagagaga gagagagaga gaccacaccc atggagcgct cccacctcgc 1020
cgtcctgctc ggcctcctcg ccttcgccgc cggggtcccg gccgcagcgg cggccaccgc 1080
cgtggaggga gcgcaggcgg ccacggcgga ggcgtcgtgc gagccctcca tcctcgccac 1140
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gctcatcatc tccggcctca acgccaccca cctcctcacg ctgtacgccg cctgcggagg 1320
cctccgccct ggaggcgctc gcctcgccgc cgcctgtgaa ggtacgtaca tgcataacct 1380
cctcctcctc ctcctcctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 1440
ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct ctctctctct 1500
ctctctcggt tggggttgct gccttgcgtt tttggttggt ttttcgtggg ttgggcgaga 1560
tccttcgagt tgcttgtgtt ttgtggtatg ctaggcttcg aacgagttgc cggcgttgct 1620
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cggttgttgt atgctacttc tgagatttga gttcatccac tgctaaactg acatcataga 1740
tgaagaatag cagcggcgtt tggtcgattt tgattccttt ctctggatgt tcgagctgat 1800
cttgtggtta ttgctcgaag cctcgaaacg cttgcgcaca tgcaagatcc agcaacgtat 1860
agatctatag tggtgttgtg cttttattcg gatttgtggt tcagtgttta cgtgcgaagt 1920
cacgcgttcg atgtttccgc ttgagctcca tatctatagc acaaatcaat catgtgcgtt 1980
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ggtcgtgatt ctcccttgaa ctccgaatat accgagttta ttatcttttg agcggatttg 2100
gtgttgaact ggcaggactc aaaacccacc cgtgggacga tcgttttctt ttcctttcgc 2160
tttgtgttct ctgtctcctt tccgtgaaat ctctgcgttt cccttctggt gcttgttata 2220
gatgattctg gatcgagccg tgtatgctcg tgcagtggta cgacttggcg atgaacgtgc 2280
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atttggagcc gattcgaacc gggcagcaca gtgctttttt tctgtttcgt tttggaggtt 2460
tccactttcg tgaaaaggaa agggtcaaat cgaatcgccc cctgaaccat cctttgcaga 2520
gcttttttgg acgtttccgc ctttcgtcag agaccatctg cactgcgcgt ttctccccaa 2580
ctcgatcgat tttgcagctt ttaatcactt tttagaaaaa gtttttaatc actcgtcatc 2640
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ttttgtctgt tcaattagcc aagaaacgag tcagtatacc ttcaagatgc atgcagattt 2760
aaaatcggca ctgctcttta tcttgttctt gtttttgcaa gttttggttg gttcaaaact 2820
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ttttgcctgc tgtgtgtaac gttttctttc cgtacgttgc gttccgtttc acgtcgctta 2940
cctctgtttc ttggggcgca agttatggca gtacagccgt tgtttccacg ttggaaggac 3000
ggttttgccc cttcgcttcc agaagcttcc agagattttt cgagtttttc taatgtgttt 3060
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ccttcatcca ctgattgtta atgcgcgtgt aatctttgtg attactaact tgctgctgga 3240
tgctttgcag gcgaggcacc tcccccaccg ccggcggccg agaagctctc cccgccgcct 3300
cagcagcacg acgactccga ccacaacaag cgcgtcggcc cactcccgag aggctctcct 3360
cccccgtatg cccagtccgt cccggtcggc cccgccgccg ctcccccgcc accacgctcc 3420
ggcgcctcct cgtcgctcca ggcgcccctc gccgccacca ccaccatcgt tgccatcacc 3480
ctcatcgccg ccgcccagta ctgaggacac gccgccgccg gcgcccgctc cccagagcca 3540
tgattcgttc gcagtatttt tcatcctgtt cttttgcttc tctctctggc tacccatgta 3600
tatgagtttg gaagacgatg atttgatcta gtagcgcgtt accaagtttg cctagattcg 3660
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cgtttttgat cgatcactag catggccgat gtgagtccag catgaaaagt ggtcgaggag 3780
aacattgttg ctaagttttt tttttgcttt ctatctccag tagctgaaca agtatgtcaa 3840
ctgaatgctg caatgaagtg aatggatgca gtcttaaatt tagcctttct gttgccaact 3900
tcttcctctg ttctgtacgg ttcagatgct gcttgttctg tttatgcgat ggtgttgcat 3960
tgttgtgatg tgtgaagtgc gcccaattct gggtgaactc tgcagtattg gcaagctctg 4020
atcgatacat aaagaactga aatgtgccgg cttctccgcc tcccgttgca tgctcttgtg 4080
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cagcttgctc gatgaaatga ctggttcatg tcaaaaggta aaaactgaca ttctcacgcg 4320
gtaaattccc ctaagcttca tagaccaccg cactgtcatc cactcgacct gccacgacac 4380
ccgccaccgc agaacgcgac accctgtgcc cacggccacc taccctggca cgcaccgagc 4440
cgaagccgga taagcacccg agttgatccc catgagacgt ggcgactcgg ctgccctctg 4500
ccac 4504
<210> 9
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> OsMs1的cDNA
<400> 9
atggagcgct cccacctcgc cgtcctgctc ggcctcctcg ccttcgccgc cggggtcccg 60
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tccggcgcct cctcgtcgct ccaggcgccc ctcgccgcca ccaccaccat cgttgccatc 660
accctcatcg ccgccgccca gtactga 687
<210> 10
<211> 5291
<212> DNA
<213> Brachypodium distachyon
<400> 10
cccttaaaag ggggtaatga tggctcatat tgaggaattg acatgcaccc cttaaaggag 60
gtaatgatgg ctcatattga tttgaggaaa ctccttccat aaggacatct ccaacaagac 120
acagtcagcg gtactataaa gcacggcacc tggatcagtt ctcgtcgagg gtgcagacga 180
cgattgcagt gaatatgatg actatcgcgg cgacgaggag ggggggcagt ggggacggct 240
gaggtgcatc ctctgccaaa ttaaagcacg cgcgcgtgcc acgcgagtca gatcaaggac 300
acgcaaaaca gataacatat taacaggaag caacgcatag atttttagaa tcgagtaaaa 360
gaatagcagc agcatttttt ttagcgaaat agtagcagca attagatcaa gcgaaatgta 420
aaggttgttc acataccaac aagggcggcg gtgtggggcg ggacattgac ctccggggcc 480
tcctccaggg cctgcggcgc ctgctgggcc tcgacaaatg cagtcaggct gcaagatatg 540
agggtaaaaa aacagatgta cagtccggtc aagaaaaaca acaaacatgc agactactta 600
gatctgccaa gactaaatta cctaacgatt ccaagtccag tgatggttgc atcgcgatga 660
atttcagcca tgctgcgtgc ccgcctggtt accggacgcg cgggaagggg agcaagccca 720
atcagagcgg gtgcagccgg gcggcgtgtg ttattgcgat aatactcgac ggtatgcttc 780
caccgcaggt acagtctcag gaaggcatcc gattgaccca ccagatcatc tatcaccaag 840
gtagccattc tgccacccat ctaaacacaa actgagagta agaaagcagt ttgaccgcga 900
ttgtttatca caaaaggcaa cacaaaaaaa ctgctagctt cgtgtcagaa aatcaacatg 960
catggtgcgc gacagtacaa cagaaacatg gggagacata gcagaaacgt ccaaaccaaa 1020
aatccaaaaa aagaaggaga tgcactgcgt aagaaaacag cacgggaagc gctcttcacc 1080
gtgtgagact gcacaagtcc aagagacgac aatagcagaa aagaactgca gaaaggagag 1140
ctgctttcgg gggtcaaagt actagcacgg cttcgatcaa tcggtcgatt aaatccctcg 1200
tgccaccgag atcctcacag tgctcgaggg gacactctaa gtcggctttg tcacatccaa 1260
cccaaacaac acgctcttgt ctaaggtgct caacaaaggt gatgtgttcg cacgcaggca 1320
cagtggaaca acaaactagc gtcgatcgac cacgtccctc ccccagaaaa gtgctcccaa 1380
catgatcgca tcgaagtaat cgtagagata gatcttacag aataaaaaat aaacccaaac 1440
caaaggagga gttctgcact actagatccg aaccaaagcc aggaaatagc aaactaaaca 1500
caaaagatat cgatgaaatc atacatcgtc caaacgtttc ggattacacc ttctggtcgc 1560
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gagcgagcac tccaggaaac ggcggtctcg agcgagcagt ctaggaaatg gcggtcgcga 1680
tggaaaagcc ttcaagagat atcgggtgat gccccctatt tctagagctc tggcctttac 1740
agttcaccac ttcaccctgc gccatcccga ttcccagtac ctatgacgag cgacgaccct 1800
cacgtgcctg gccagcatca cgggagagaa tcttgctcag catctcaacc gcccaaacag 1860
acagctgtcc ggtcccaccc aaatggacgc acaggatcga tcgggccgcc ggtggcctgt 1920
ccttggctaa cccttcacgc ctcttcgtcc cctccgccta tataatccca ccccgctccg 1980
cttcttcccc caccgcgctc tcttcctctg gactcacacc aactcgccta gccctagcgg 2040
taggaagcga aagcgagaga tcccacccat ggagagatcc caccacctcc tcctcgtgct 2100
cggcctcctc gccgcgctgc tcccggcggc cgcggctacc ttcgggacga cgcagccgga 2160
gcctggggcc ccatgcgagc ccaccctcct cgccacccag gtctcgctct tctgcgcgcc 2220
ggacatgccg accgcgcagt gctgcgagcc tgtggtggcc tccgtcgacc tcgggggtgg 2280
cgtcccctgc ctctgccgtg tcgccgccga gccgcagctc gtcatggccg gcctcaacgc 2340
cacccacctc ctcacgctct acacctcctg cggtggactc cgccccggag gcgcccacct 2400
cgccgccgcc tgtgaaggta cgcgacgcct gcgtctctct ctctctctgc gtctctctct 2460
gcgtctctcc catgacgagc aactcgcgat acgccttact gccttatttt ttttgaagat 2520
atgtgtctgc ttggtccact gtatttgggt tcttctttcg agaagttcat ccgtaggcat 2580
ctataatccg acgagttcgg atgagatcaa acagtgacac gcgcgacacc aacgttttca 2640
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ttgtatggct ttcgctccaa tctcgtgcag aaccatattt catcttgggt ttatgctgtt 2760
ctgtaagatc tagcgccatg cagaggtcat ttctgctgtt ccagaccccc tacgtgacat 2820
ttgctgtttt tcctctttgt tgccatggcc acgggttggt ttttacgaaa gatactttga 2880
tatgtcaaga tctgcgagca ctttgaaacc ccaacgcatt ttctatgtgt tttgtgctgt 2940
ttgatcgacc gattgatcga ggccgtgcta gtactttgac acccgaaagc atctctcctt 3000
tctgcagtat cttttctgtt cttgtcgtct cttgggcttg tgcagtttac catggtgaag 3060
agcgcttcat acacgatctg ccgcgaggcc agagcaaaag cttcccgtgc tttttcttgc 3120
acagtgcatc tccttctttt ttgccttttt cgtttggacg tttctgcttc gtctccccat 3180
gtttctgttg tactgtcgcg caccatgcat gttgattttc tgatacgaag ctagtactgc 3240
tctgcagttt ttgtgtagcc ttcctctttc gtgataaaga acgtggtcaa actgctctct 3300
gactctgttc gtctaaatct ttttctcgca ggaaaatttt cgttgcagat ctcctttacc 3360
ctcgtcctcc gcatctgttt gctttacctg ctgtagttgc gttcttcgtt tgaatcaaat 3420
tcttgtttcc ttcttttatc ccatcgctcg tttagttacc ttttcttttt attgaacttt 3480
agttcattgg tgtagtaggc agtagtatgc tttgcgttgt ttgcggagta gcaattgaat 3540
tgctctccgg tctctgcaga gcggcccgct gaacagatag ctggctgcag cagctttacc 3600
agaatcggtc ggttacgaac ttacgattat acccttcgtc ttgctttcat ttactggtag 3660
cctgctagtc ttttcttgtt gcgcacgtaa tcgtacccag tactgtacgc ttagataaaa 3720
tagacgggtc tggccttaaa ttatttcgtt gcgttttcga attttgaatt ccggaagtta 3780
actttatttt gtgctctgtt tggacgcatg tgcaggtcca gctcctcccg ccgccgtcgt 3840
cagtgcccct cccccctccg ccgcacctcg ccgcaagcag ccagcacgta cgaacaacct 3900
tttacacttc gcttgatcta attgctgctg ctatactctc ttactcgatt ctaaatctat 3960
gttttgctca ttattaatat gttgatctga ctcgtgtggc acgcgcgcgt gctttgattt 4020
cgcagacgag gcacctccgc ctccgccgtc gactgagaag ccgtccccgc cgcctcagca 4080
ggacaacgtc accgcccacg gcaaggcaat ccccacccat gcggccacat ccccgctcgc 4140
gccggctgct tccatgatcc acatgtcccc accgcccgca tgcaatccat gctccggctc 4200
cgccgcttcc tcagccgagg ggcccctcct catcgccgcg ctcctcctcg tcatcaccgc 4260
catcatcgtc ggcaccctcg acgataagtg atccaggagc cgtccgcccc ctccgactca 4320
ccaacgtccg actatgatcc agttgcagta gtggtcttgt tctgtttcat gtttctcgcc 4380
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tagaggtcga tgattaatta tattccggtt gtttgctgct ggcttcccag ttccctccag 4980
gtaggaagga accgtatccg ggtagtagcc agtagtagcc aggaagctac tagcagaaca 5040
gtcttctggt gctctttttt tggagtaacg tcttctcgcg atctttttcg agtaattcaa 5100
atccgggtat accgagcctt gtatcagtga gagccgatag tcttaattat ctccagcaca 5160
ggcacaggaa caaccacgtt tgtttttcag aatgcacagc aacatttttt ttaagagcat 5220
ggcacagcta cttttttttt ttttaaggaa acatggcaca gctacatttt tttttagagg 5280
aacatggcac a 5291
<210> 11
<211> 687
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> BdMs1的cDNA
<400> 11
atggagagat cccaccacct cctcctcgtg ctcggcctcc tcgccgcgct gctcccggcg 60
gccgcggcta ccttcgggac gacgcagccg gagcctgggg ccccatgcga gcccaccctc 120
ctcgccaccc aggtctcgct cttctgcgcg ccggacatgc cgaccgcgca gtgctgcgag 180
cctgtggtgg cctccgtcga cctcgggggt ggcgtcccct gcctctgccg tgtcgccgcc 240
gagccgcagc tcgtcatggc cggcctcaac gccacccacc tcctcacgct ctacacctcc 300
tgcggtggac tccgccccgg aggcgcccac ctcgccgccg cctgtgaagg tccagctcct 360
cccgccgccg tcgtcagtgc ccctcccccc tccgccgcac ctcgccgcaa gcagccagca 420
cacgaggcac ctccgcctcc gccgtcgact gagaagccgt ccccgccgcc tcagcaggac 480
aacgtcaccg cccacggcaa ggcaatcccc acccatgcgg ccacatcccc gctcgcgccg 540
gctgcttcca tgatccacat gtccccaccg cccgcatgca atccatgctc cggctccgcc 600
gcttcctcag ccgaggggcc cctcctcatc gccgcgctcc tcctcgtcat caccgccatc 660
atcgtcggca ccctcgacga taagtga 687
<210> 12
<211> 1707
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TpMYC4E的cDNA
<400> 12
atgcgggaaa tagctactca gcggtgtggt aatcgatcaa tggcgctatc agctcctccc 60
agtcaggaac agccgtcggg gaagcaattc ggctaccagc tcgctgctgc tgtgaggagc 120
atcaactgga cttatggcat attttggtcc atttccgcca gcccgcgccc aggccactcc 180
tcagttctgg cgtggaagga tgggttctac aacggcgaga taaagactag aaagattacc 240
ggctcgacca ctacggagct tacagcggac gagcgcgtca tgcacagaag caagcaactg 300
agggagctct acgaatcgct cttgcccggc aactccaaca accgggcaag gcgaccaacc 360
gcctcactgt caccggagga tctcggggac ggcgagtggt attacaccat aagcatgact 420
tacaccttcc accctaatca agggttgcca ggcaaaagct ttgcgagcaa tcaacatgtt 480
tggctgtaca acgctcaata cgcaaacacc agagttttcc cccgcgcgct cttagcaaag 540
acaatcgttt gcattccctt catgggcggt gtgcttgagc tcggaacgtc ggatcaggtg 600
ttggaggacc cgagcatggt gaagcggatc agcacgtctt tctgggagct gcacttgccg 660
tcatccttgg agtcgaagga tccgagctcc agcacatcag caaacgatac cagggaggcc 720
accgacatca tcttgttcga ggatttcgac cacaacgaca cagttgaggg ggtgatctct 780
gagcaaaggg aggtccagtg cccgtccaac gtcaatctgg agcgcctcac aaagcagatg 840
gacgagttcc acagccttct cggtggactg gacgtgcatc ctctcgaaga cagatggatc 900
atggacgagc cctttgagtt tacgttttcc ccagaagtgg cgccggctat ggatatgccg 960
agcaccgacg atgtcatcgt cactttaagt aggtccgaag gctctcgtcc atcctgcttc 1020
acagcgtgga agggatcatc cgagtcgaaa tacgtggctg gccaggtcgt tggggagtca 1080
cagaagttgc tgaataaagt tgtggctggt ggtgcatggg cgagcaatta tggcggtcgc 1140
accatggtga gagctcaggg aattaacagc aacacccatg tcatgacaga gagaagacgc 1200
cgggagaaac tcaacgagat gttcctggtt ctcaagtcac tggtcccgtc cattcacaag 1260
gtagacaaag catccatcct cacagaaacg ataggttatc ttagagaact gaagcaaagg 1320
gtagatcagc tagaatccag ccggtcaccg tctcacccaa aagaaacaac aggaccgagc 1380
agaagccatg tcgtcggcgc taggaagaag atagtctcgg ccggatccaa gaggaaggcg 1440
ccagggctgg agagcccgag caatgtcgtg aacgtgacga tgctggacaa ggtggtgctg 1500
ttggaggtgc agtgcccgtg gaaggagctg ctgatgacac aagtgtttga cgccatcaag 1560
agcctctgtc tggacgttgt ctccgtgcag gcatccacat caggtggccg tcttgacctc 1620
aagatacgag ctaatcagca gcttgcggtc ggttctgcta tggtggcacc tggggcaatc 1680
accgaaacac ttcagaaagc tatatag 1707
<210> 13
<211> 568
<212> PRT
<213> Thinopyrum ponticum
<400> 13
Met Arg Glu Ile Ala Thr Gln Arg Cys Gly Asn Arg Ser Met Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ala Pro Pro Ser Gln Glu Gln Pro Ser Gly Lys Gln Phe Gly Tyr
20 25 30
Gln Leu Ala Ala Ala Val Arg Ser Ile Asn Trp Thr Tyr Gly Ile Phe
35 40 45
Trp Ser Ile Ser Ala Ser Pro Arg Pro Gly His Ser Ser Val Leu Ala
50 55 60
Trp Lys Asp Gly Phe Tyr Asn Gly Glu Ile Lys Thr Arg Lys Ile Thr
65 70 75 80
Gly Ser Thr Thr Thr Glu Leu Thr Ala Asp Glu Arg Val Met His Arg
85 90 95
Ser Lys Gln Leu Arg Glu Leu Tyr Glu Ser Leu Leu Pro Gly Asn Ser
100 105 110
Asn Asn Arg Ala Arg Arg Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Glu Asp Leu
115 120 125
Gly Asp Gly Glu Trp Tyr Tyr Thr Ile Ser Met Thr Tyr Thr Phe His
130 135 140
Pro Asn Gln Gly Leu Pro Gly Lys Ser Phe Ala Ser Asn Gln His Val
145 150 155 160
Trp Leu Tyr Asn Ala Gln Tyr Ala Asn Thr Arg Val Phe Pro Arg Ala
165 170 175
Leu Leu Ala Lys Thr Ile Val Cys Ile Pro Phe Met Gly Gly Val Leu
180 185 190
Glu Leu Gly Thr Ser Asp Gln Val Leu Glu Asp Pro Ser Met Val Lys
195 200 205
Arg Ile Ser Thr Ser Phe Trp Glu Leu His Leu Pro Ser Ser Leu Glu
210 215 220
Ser Lys Asp Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ala Asn Asp Thr Arg Glu Ala
225 230 235 240
Thr Asp Ile Ile Leu Phe Glu Asp Phe Asp His Asn Asp Thr Val Glu
245 250 255
Gly Val Ile Ser Glu Gln Arg Glu Val Gln Cys Pro Ser Asn Val Asn
260 265 270
Leu Glu Arg Leu Thr Lys Gln Met Asp Glu Phe His Ser Leu Leu Gly
275 280 285
Gly Leu Asp Val His Pro Leu Glu Asp Arg Trp Ile Met Asp Glu Pro
290 295 300
Phe Glu Phe Thr Phe Ser Pro Glu Val Ala Pro Ala Met Asp Met Pro
305 310 315 320
Ser Thr Asp Asp Val Ile Val Thr Leu Ser Arg Ser Glu Gly Ser Arg
325 330 335
Pro Ser Cys Phe Thr Ala Trp Lys Gly Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Val
340 345 350
Ala Gly Gln Val Val Gly Glu Ser Gln Lys Leu Leu Asn Lys Val Val
355 360 365
Ala Gly Gly Ala Trp Ala Ser Asn Tyr Gly Gly Arg Thr Met Val Arg
370 375 380
Ala Gln Gly Ile Asn Ser Asn Thr His Val Met Thr Glu Arg Arg Arg
385 390 395 400
Arg Glu Lys Leu Asn Glu Met Phe Leu Val Leu Lys Ser Leu Val Pro
405 410 415
Ser Ile His Lys Val Asp Lys Ala Ser Ile Leu Thr Glu Thr Ile Gly
420 425 430
Tyr Leu Arg Glu Leu Lys Gln Arg Val Asp Gln Leu Glu Ser Ser Arg
435 440 445
Ser Pro Ser His Pro Lys Glu Thr Thr Gly Pro Ser Arg Ser His Val
450 455 460
Val Gly Ala Arg Lys Lys Ile Val Ser Ala Gly Ser Lys Arg Lys Ala
465 470 475 480
Pro Gly Leu Glu Ser Pro Ser Asn Val Val Asn Val Thr Met Leu Asp
485 490 495
Lys Val Val Leu Leu Glu Val Gln Cys Pro Trp Lys Glu Leu Leu Met
500 505 510
Thr Gln Val Phe Asp Ala Ile Lys Ser Leu Cys Leu Asp Val Val Ser
515 520 525
Val Gln Ala Ser Thr Ser Gly Gly Arg Leu Asp Leu Lys Ile Arg Ala
530 535 540
Asn Gln Gln Leu Ala Val Gly Ser Ala Met Val Ala Pro Gly Ala Ile
545 550 555 560
Thr Glu Thr Leu Gln Lys Ala Ile
565
<210> 14
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 衍生自野生一粒小麦的Ms1的cDNA
<400> 14
atggagagat cccgccgcct gctgctggtg gcgggcctgc tcgccgcgct gctcccggcg 60
gcggcggccg ccttcgggcc gcagccgggg gcgccgtgcg agcccacgct gctggcgacg 120
caggtggcgc tcttctgcgc gcccgacatg cccaccgcgc agtgctgcga gcccgtcgtc 180
gccgccgtcg acctcggcgg cggggtcccc tgcctctgcc gcgtcgccgc ggagccgcag 240
ctcgtcatgg cgggcctcaa cgccacccac ctcctcacgc tctacagctc ctgcggcggc 300
ctccgtcccg gcggcgccca cctcgccgcc gcctgcgaag gacccgctcc cccggccgcc 360
gtcgtcagca gccccccgcc cccgccaccg tcgaccgcac ctcgccgcaa gcagccagcg 420
cacgacgcac caccgccgcc gccgccgtcc agcgacaagc cgtcgtcccc gccgccgtcc 480
caggagcacg acggcgccgc cccccacgcc aaggccgccc ccgcccaggc ggctacctcc 540
ccgctcgcgc ccgctgctgc catcgccccg ccgccccagg cgccacactc cgccgcggcg 600
acctcgtcgt ccaaggcggc cttcttcttc gtcgccacgg ccatgatcgg cctctacctc 660
atcctctga 669
<210> 15
<211> 222
<212> PRT
<213> Triticum boeoticum
<400> 15
Met Glu Arg Ser Arg Arg Leu Leu Leu Val Ala Gly Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu Pro Ala Ala Ala Ala Ala Phe Gly Pro Gln Pro Gly Ala Pro
20 25 30
Cys Glu Pro Thr Leu Leu Ala Thr Gln Val Ala Leu Phe Cys Ala Pro
35 40 45
Asp Met Pro Thr Ala Gln Cys Cys Glu Pro Val Val Ala Ala Val Asp
50 55 60
Leu Gly Gly Gly Val Pro Cys Leu Cys Arg Val Ala Ala Glu Pro Gln
65 70 75 80
Leu Val Met Ala Gly Leu Asn Ala Thr His Leu Leu Thr Leu Tyr Ser
85 90 95
Ser Cys Gly Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ala His Leu Ala Ala Ala Cys
100 105 110
Glu Gly Pro Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Ser Ser Pro Pro Pro Pro
115 120 125
Pro Pro Ser Thr Ala Pro Arg Arg Lys Gln Pro Ala His Asp Ala Pro
130 135 140
Pro Pro Pro Pro Pro Ser Ser Asp Lys Pro Ser Ser Pro Pro Pro Ser
145 150 155 160
Gln Glu His Asp Gly Ala Ala Pro His Ala Lys Ala Ala Pro Ala Gln
165 170 175
Ala Ala Thr Ser Pro Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ile Ala Pro Pro Pro
180 185 190
Gln Ala Pro His Ser Ala Ala Ala Thr Ser Ser Ser Lys Ala Ala Phe
195 200 205
Phe Phe Val Ala Thr Ala Met Ile Gly Leu Tyr Leu Ile Leu
210 215 220
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5565329F
<400> 16
tgcagtgatc ccgatgccg 19
<210> 17
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5565329R
<400> 17
ctcggtgcga tgtgtgg 17
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5570804F
<400> 18
tgcaggattt tccactgatt aac 23
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5570804R
<400> 19
cggaggtggt acgcggtg 18
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5564956F
<400> 20
tgcagaacta ccagaatctt tatcgg 26
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物5564956R
<400> 21
ctgtgaaacc aagcacccat aatc 24
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5008421F
<400> 22
tgcagagcaa gagcaacatt caa 23
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5008421R
<400> 23
cggtcaatgt ataaaccacg tgc 23
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 3573220F
<400> 24
tgcagtcagt caacgatgg 19
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 3573220R
<400> 25
gtctcacgtg cagcgca 17
<210> 26
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5565375F
<400> 26
tgcagtttct atcatgtcca cg 22
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5565375R
<400> 27
atctcgggtt tatcttcagg g 21
<210> 28
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 1861695F
<400> 28
tgcaggtgtg ctacttaggg c 21
<210> 29
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 1861695R
<400> 29
cggaccttgc cctgaggag 19
<210> 30
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5571044F
<400> 30
tgcagtggaa agtgcggc 18
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5571044R
<400> 31
cggtagatag aagatgagac tttacc 26
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5565269F
<400> 32
tgcaggtgga cctcatggac tac 23
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5565269R
<400> 33
ctcaggcaca ccgcgcagtc 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5570850F
<400> 34
tgcaggcggt cctggacagg 20
<210> 35
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5570850R
<400> 35
cggccgccct caccacac 18
<210> 36
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5565089F
<400> 36
tgcagcattg gcaaataaca c 21
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 5565089R
<400> 37
ggttgcattc tctgtgtatc ac 22
<210> 38
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 RfF1
<400> 38
gccgccgcct gcgaagg 17
<210> 39
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 RfR1
<400> 39
gggggagcgg gtcctgc 17
<210> 40
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 ThMYC4ESpF
<400> 40
ctcccagtca ggaacagc 18
<210> 41
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 TaMYC4SpR
<400> 41
ggtgacagtg aggcggtt 18
<210> 42
<211> 228
<212> PRT
<213> Oryza sativa
<400> 42
Met Glu Arg Ser His Leu Ala Val Leu Leu Gly Leu Leu Ala Phe Ala
1 5 10 15
Ala Gly Val Pro Ala Ala Ala Ala Ala Thr Ala Val Glu Gly Ala Gln
20 25 30
Ala Ala Thr Ala Glu Ala Ser Cys Glu Pro Ser Ile Leu Ala Thr Gln
35 40 45
Val Ser Leu Phe Cys Ala Pro Asp Met Pro Thr Ala Gln Cys Cys Glu
50 55 60
Pro Val Val Ala Ser Val Asp Leu Gly Gly Gly Val Pro Cys Leu Cys
65 70 75 80
Arg Val Ala Ala Glu Pro Gln Leu Ile Ile Ser Gly Leu Asn Ala Thr
85 90 95
His Leu Leu Thr Leu Tyr Ala Ala Cys Gly Gly Leu Arg Pro Gly Gly
100 105 110
Ala Arg Leu Ala Ala Ala Cys Glu Gly Pro Ala Pro Pro Ala Ser Ile
115 120 125
Val Thr Ala Pro Pro Pro Pro Val Ala Phe Arg Arg Lys Pro Pro Ala
130 135 140
Arg Glu Ala Pro Pro Pro Pro Pro Ala Ala Glu Lys Leu Ser Pro Pro
145 150 155 160
Pro Gln Gln His Asp Asp Ser Asp His Asn Lys Arg Val Gly Pro Leu
165 170 175
Pro Arg Gly Ser Pro Pro Pro Tyr Ala Gln Ser Val Pro Val Gly Pro
180 185 190
Ala Ala Ala Pro Pro Pro Pro Arg Ser Gly Ala Ser Ser Ser Leu Gln
195 200 205
Ala Pro Leu Ala Ala Thr Thr Thr Ile Val Ala Ile Thr Leu Ile Ala
210 215 220
Ala Ala Gln Tyr
225
<210> 43
<211> 228
<212> PRT
<213> Brachypodium distachyon
<400> 43
Met Glu Arg Ser His His Leu Leu Leu Val Leu Gly Leu Leu Ala Ala
1 5 10 15
Leu Leu Pro Ala Ala Ala Ala Thr Phe Gly Thr Thr Gln Pro Glu Pro
20 25 30
Gly Ala Pro Cys Glu Pro Thr Leu Leu Ala Thr Gln Val Ser Leu Phe
35 40 45
Cys Ala Pro Asp Met Pro Thr Ala Gln Cys Cys Glu Pro Val Val Ala
50 55 60
Ser Val Asp Leu Gly Gly Gly Val Pro Cys Leu Cys Arg Val Ala Ala
65 70 75 80
Glu Pro Gln Leu Val Met Ala Gly Leu Asn Ala Thr His Leu Leu Thr
85 90 95
Leu Tyr Thr Ser Cys Gly Gly Leu Arg Pro Gly Gly Ala His Leu Ala
100 105 110
Ala Ala Cys Glu Gly Pro Ala Pro Pro Ala Ala Val Val Ser Ala Pro
115 120 125
Pro Pro Ser Ala Ala Pro Arg Arg Lys Gln Pro Ala His Glu Ala Pro
130 135 140
Pro Pro Pro Pro Ser Thr Glu Lys Pro Ser Pro Pro Pro Gln Gln Asp
145 150 155 160
Asn Val Thr Ala His Gly Lys Ala Ile Pro Thr His Ala Ala Thr Ser
165 170 175
Pro Leu Ala Pro Ala Ala Ser Met Ile His Met Ser Pro Pro Pro Ala
180 185 190
Cys Asn Pro Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ser Ser Ala Glu Gly Pro Leu
195 200 205
Leu Ile Ala Ala Leu Leu Leu Val Ile Thr Ala Ile Ile Val Gly Thr
210 215 220
Leu Asp Asp Lys
225
<210> 44
<211> 1722
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cDNA
<400> 44
atgcgggaaa tagctactca gcggtgtggt aatcgatcaa tggcgctatc agctcctccc 60
agtcaggaac agccgtcggg gaagcaattc ggctaccagc tcgctgctgc tgtgaggagc 120
atcaactgga cttatggcat attttggtcc atttccgcca gcccgcgccc aggccactcc 180
tcagttctgg cgtggaagga tgggttctac aacggcgaga taaagactag aaagattacc 240
ggctcgacca ctacggagct tacagcggac gagcgcgtca tgcacagaag caagcaactg 300
agggagctct acgaatcgct cttgcccggc aactccaaca accgggcaag gcgaccaacc 360
gcctcactgt caccggagga tctcggggac ggcgagtggt attacaccat aagcatgact 420
tacaccttcc accctaatca agggttgcca ggcaaaagct ttgcgagcaa tcaacatgtt 480
tggctgtaca acgctcaata cgcaaacacc agagttttcc cccgcgcgct cttagcaaag 540
actgcttcta ttcagacaat cgtttgcatt cccttcatgg gcggtgtgct tgagctcgga 600
acgtcggatc aggtgttgga ggacccgagc atggtgaagc ggatcaacac gtctttctgg 660
gagctgcact tgccgtcatc cttggagtcg aaggatccga gctccagcac atcagcaaac 720
gataccaggg aggccaccga catcatcttg ttcgaggatt tcgaccacaa cgacacagtt 780
gagggggtga tctctgagca aagggaggtc cagtgcacgt ccaacgtcaa tctggagcgc 840
ctcacaaagc agatggacga gttccacagc cttctcggtg gactggacgt gcatcctctc 900
aaagacagat ggatcatgga cgagcccttt gagtttacgt tttccccaga agtggcgccg 960
gctatggata tgccgagcac cgacgatgtc atcgtcactt taagtaggtc cgaaggctct 1020
cgtccatcct gcttcacagc gtggaaggga tcatccgagt cgaaatacgt ggctggccag 1080
gtcgttgggg agtcacagaa gttgctgaat aaagttgtgg ctggtggtgc atgggcgagc 1140
aattatggcg gtcgcaccat ggtgagagct cagggaatta acagcaacac ccatgtcatg 1200
acagagagaa gacgccggga gaaactcaac gagatgttcc tggttctcaa gtcactggtc 1260
ccgtccattc acaaggtaga caaagcatcc atcctcacag aaacgatagg ttatcttaga 1320
gaactgaagc aaagggtaga tcagctagaa tccagccggt caccgtctca cccaaaagaa 1380
acaacaggac cgagcagaag ccatgtcgtc ggcgctagga agaagatagt ctcggccgga 1440
tccaagagga aggcgccagg gctggagagc ccgagcaatg tcgtgaacgt gacgatgctg 1500
gacaaggtgg tgctgttgga ggtgcagtgc ccgtggaagg agctgctgat gacacaagtg 1560
tttgacgcca tcaagagcct ctgtctggac gttgtctccg tgcaggcatc cacatcaggt 1620
ggccgtcttg acctcaagat acgagctaat cagcagcttg cggtcggttc tgctatggtg 1680
gcacctgggg caatcaccga aacacttcag aaagctatat ag 1722
<210> 45
<211> 573
<212> PRT
<213> Thinopyrum ponticum
<400> 45
Met Arg Glu Ile Ala Thr Gln Arg Cys Gly Asn Arg Ser Met Ala Leu
1 5 10 15
Ser Ala Pro Pro Ser Gln Glu Gln Pro Ser Gly Lys Gln Phe Gly Tyr
20 25 30
Gln Leu Ala Ala Ala Val Arg Ser Ile Asn Trp Thr Tyr Gly Ile Phe
35 40 45
Trp Ser Ile Ser Ala Ser Pro Arg Pro Gly His Ser Ser Val Leu Ala
50 55 60
Trp Lys Asp Gly Phe Tyr Asn Gly Glu Ile Lys Thr Arg Lys Ile Thr
65 70 75 80
Gly Ser Thr Thr Thr Glu Leu Thr Ala Asp Glu Arg Val Met His Arg
85 90 95
Ser Lys Gln Leu Arg Glu Leu Tyr Glu Ser Leu Leu Pro Gly Asn Ser
100 105 110
Asn Asn Arg Ala Arg Arg Pro Thr Ala Ser Leu Ser Pro Glu Asp Leu
115 120 125
Gly Asp Gly Glu Trp Tyr Tyr Thr Ile Ser Met Thr Tyr Thr Phe His
130 135 140
Pro Asn Gln Gly Leu Pro Gly Lys Ser Phe Ala Ser Asn Gln His Val
145 150 155 160
Trp Leu Tyr Asn Ala Gln Tyr Ala Asn Thr Arg Val Phe Pro Arg Ala
165 170 175
Leu Leu Ala Lys Thr Ala Ser Ile Gln Thr Ile Val Cys Ile Pro Phe
180 185 190
Met Gly Gly Val Leu Glu Leu Gly Thr Ser Asp Gln Val Leu Glu Asp
195 200 205
Pro Ser Met Val Lys Arg Ile Asn Thr Ser Phe Trp Glu Leu His Leu
210 215 220
Pro Ser Ser Leu Glu Ser Lys Asp Pro Ser Ser Ser Thr Ser Ala Asn
225 230 235 240
Asp Thr Arg Glu Ala Thr Asp Ile Ile Leu Phe Glu Asp Phe Asp His
245 250 255
Asn Asp Thr Val Glu Gly Val Ile Ser Glu Gln Arg Glu Val Gln Cys
260 265 270
Thr Ser Asn Val Asn Leu Glu Arg Leu Thr Lys Gln Met Asp Glu Phe
275 280 285
His Ser Leu Leu Gly Gly Leu Asp Val His Pro Leu Lys Asp Arg Trp
290 295 300
Ile Met Asp Glu Pro Phe Glu Phe Thr Phe Ser Pro Glu Val Ala Pro
305 310 315 320
Ala Met Asp Met Pro Ser Thr Asp Asp Val Ile Val Thr Leu Ser Arg
325 330 335
Ser Glu Gly Ser Arg Pro Ser Cys Phe Thr Ala Trp Lys Gly Ser Ser
340 345 350
Glu Ser Lys Tyr Val Ala Gly Gln Val Val Gly Glu Ser Gln Lys Leu
355 360 365
Leu Asn Lys Val Val Ala Gly Gly Ala Trp Ala Ser Asn Tyr Gly Gly
370 375 380
Arg Thr Met Val Arg Ala Gln Gly Ile Asn Ser Asn Thr His Val Met
385 390 395 400
Thr Glu Arg Arg Arg Arg Glu Lys Leu Asn Glu Met Phe Leu Val Leu
405 410 415
Lys Ser Leu Val Pro Ser Ile His Lys Val Asp Lys Ala Ser Ile Leu
420 425 430
Thr Glu Thr Ile Gly Tyr Leu Arg Glu Leu Lys Gln Arg Val Asp Gln
435 440 445
Leu Glu Ser Ser Arg Ser Pro Ser His Pro Lys Glu Thr Thr Gly Pro
450 455 460
Ser Arg Ser His Val Val Gly Ala Arg Lys Lys Ile Val Ser Ala Gly
465 470 475 480
Ser Lys Arg Lys Ala Pro Gly Leu Glu Ser Pro Ser Asn Val Val Asn
485 490 495
Val Thr Met Leu Asp Lys Val Val Leu Leu Glu Val Gln Cys Pro Trp
500 505 510
Lys Glu Leu Leu Met Thr Gln Val Phe Asp Ala Ile Lys Ser Leu Cys
515 520 525
Leu Asp Val Val Ser Val Gln Ala Ser Thr Ser Gly Gly Arg Leu Asp
530 535 540
Leu Lys Ile Arg Ala Asn Gln Gln Leu Ala Val Gly Ser Ala Met Val
545 550 555 560
Ala Pro Gly Ala Ile Thr Glu Thr Leu Gln Lys Ala Ile
565 570

Claims (231)

1.一种用于生产杂交谷类植物的谷类植物，其中所述谷类植物包括携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的单体异源附加染色体，其中所述雄性可育性恢复基因与所述至少一个选择标记基因位于所述单体异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
2.根据权利要求1所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因是显性基因。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的谷类植物，其中所述谷类植物是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
4.根据权利要求3所述的谷类植物，其中所述谷类植物是黑小麦。
5.根据权利要求3所述的谷类植物，其中所述谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
6.根据权利要求5所述的谷类植物，其中所述谷类植物是硬粒小麦(Triticum durum)或普通小麦(Triticum aestivum)。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦(Triticum boeoticum)或一粒小麦(Triticum monococcum)。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的谷类植物，其中所述选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
10.根据权利要求9所述的谷类植物，其中所述颜色标记基因能够赋予包括所述颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
11.根据权利要求9或权利要求10所述的谷类植物，其中所述颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
12.根据权利要求11所述的谷类植物，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草(Agropyronelongatum)、绒毛冰草(Agropyron trichophorum)或一粒小麦。
13.根据权利要求12所述的谷类植物，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的谷类植物，其中所述谷类植物纯合地包括雄性可育性基因突变。
15.根据权利要求14所述的谷类植物，其中所述雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性基因是Ms1或其包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的谷类植物，其中除了其整倍体数量的染色体之外，所述谷类植物还包括一条附加染色体，其中所述显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因位于所述附加染色体上。
18.根据权利要求17所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因位于所述异源附加染色体上的类似于所述谷类植物的所述突变雄性可育性基因的位置。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的谷类植物的种子或后代或其部分。
20.根据权利要求19所述的种子或后代或其部分，其中所述种子、后代或其部分至少包括位于所述单体异源附加染色体的着丝粒的同一侧上的所述雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。
21.根据权利要求19所述的种子、后代或其部分，其中除了其整倍体数量之外，所述种子、后代或其部分还包括至少一条附加染色体，并且其中所述雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因位于所述附加染色体上。
22.根据权利要求19所述的种子或后代或其部分，其中所述种子、后代或其部分纯合地包括所述雄性可育性基因突变，其中优选地，所述雄性可育性基因突变是ms1基因缺失、ms1基因敲低或ms1基因敲除。
23.一种用于生产杂交谷类植物的谷类植物，其中所述谷类植物包括至少一个部分同源染色体对，其中所述对由第一及第二染色体组成，所述第一染色体是所述谷类植物天然存在的，并且所述第二染色体包括异源染色体片段，所述异源染色体片段包括显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，其中所述谷类植物包括引起雄性不育的雄性可育性基因突变。
24.根据权利要求23所述的谷类植物，其中所述第一染色体包括高冰草的一段染色质，所述一段染色质优选地易位到所述第一染色体的长臂的末端上，由此所述一段染色质与所述异源染色体片段或其部分配对。
25.根据权利要求23或权利要求24所述的谷类植物，其中所述第二染色体进一步包括天然存在的DNA。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的谷类植物，其中所述谷类植物由整倍体数量的染色体组成。
27.根据权利要求23-26中任一项所述的谷类植物，其中所述谷类植物是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
28.根据权利要求27所述的谷类植物，其中所述谷类植物是黑小麦。
29.根据权利要求27所述的谷类植物，其中所述谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
30.根据权利要求29所述的谷类植物，其中所述谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的谷类植物，其中所述谷类植物包括突变的部分同源配对抑制基因。
32.根据权利要求31所述的谷类植物，其中所述部分同源配对抑制基因被缺失。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的谷类植物，其中所述部分同源配对抑制基因通过育种从所述谷类植物消除。
34.根据权利要求23-30中任一项所述的谷类植物，其中所述谷类植物不包括突变的部分同源配对抑制基因。
35.根据权利要求31-33中任一项所述的谷类植物，其中所述突变的部分同源配对抑制基因纯合地存在于染色体5B或染色体3D上。
36.根据权利要求31-33或35中任一项所述的谷类植物，其中所述突变的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。
37.根据权利要求36所述的谷类植物，其中所述突变的部分同源配对抑制基因是ph1b。
38.根据权利要求23-37中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
39.根据权利要求23-37中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
40.根据权利要求23-39中任一项所述的谷类植物，其中所述选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
41.根据权利要求40所述的谷类植物，其中所述颜色标记基因能够赋予包括所述颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
42.根据权利要求40或权利要求41所述的谷类植物，其中所述颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
43.根据权利要求42所述的谷类植物，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
44.根据权利要求43所述的谷类植物，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
45.根据权利要求23-44中任一项所述的谷类植物，其中所述谷类植物纯合地包括雄性可育性基因突变。
46.根据权利要求45所述的谷类植物，其中所述雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
47.根据权利要求23-46中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
48.根据权利要求23-47中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于着丝粒的相对侧上。
49.根据权利要求23-47中任一项所述的谷类植物，其中所述雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于着丝粒的同一侧上。
50.根据权利要求23-49中任一项所述的谷类植物，其中所述第一染色体是4A、4B、4D或5A。
51.根据权利要求23-50中任一项所述的谷类植物，其中所述第一染色体不是4B。
52.根据权利要求23-51中任一项所述的谷类植物的种子、后代或其部分。
53.一种产生用于对谷类植物进行基因组选择的蓝色糊粉(BLA)雄性不育系统的方法，包括：
a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系，所述谷类植物品系包括至少一条异源附加染色体，所述至少一条异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因；
b)重排至少一条异源附加染色体和/或诱导至少一条异源附加染色体的部分同源重组；以及
c)获得包括重排和/或部分同源的异源附加染色体的谷类植物。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因是显性基因。
55.根据权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述雄性可育性基因突变是缺失、敲低或敲除。
56.根据权利要求53-55中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
57.根据权利要求53-56中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性突变是ms1基因缺失、ms1基因敲低或ms1基因敲除。
58.根据权利要求53-57中任一项所述的方法，其中所述异源附加染色体是单体的。
59.根据权利要求53-57中任一项所述的方法，其中所述异源附加染色体是二体的。
60.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述重排步骤b)包括向步骤a)的所述谷类植物品系提供杀配子基因。
61.根据权利要求60所述的方法，其中所述杀配子基因作为单体附加染色体引入。
62.根据权利要求60或权利要求61所述的方法，其中所述杀配子基因诱导至少一条异源附加染色体的断裂及重排。
63.根据权利要求60-62中任一项所述的方法，其中所述杀配子基因是位于卵穗山羊草(Aegilops geniculate)的染色体4Mg或柱穗山羊草(Aegilops cylindrica)的染色体2Cc上的杀配子因子。
64.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述重排步骤b)包括辐射步骤a)的所述谷类植物品系的种子。
65.根据权利要求64所述的方法，其中辐射种子诱导至少一条异源附加染色体的染色体重排。
66.根据权利要求64或权利要求65所述的方法，其中使用175、200、225或250Gy的γ射线来辐射所述种子。
67.根据权利要求64-66中任一项所述的方法，其中辐射所述种子约40分钟至约50分钟。
68.根据权利要求53-59中任一项所述的方法，其中所述重排步骤b)包括对步骤a)的所述谷类植物品系进行基因编辑。
69.根据权利要求68所述的方法，其中基因编辑包括在所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述雄性可育性恢复基因相同的侧上插入相同或不同的蓝色糊粉基因。
70.根据权利要求69所述的方法，其中插入包括将基因盒引入步骤a)的所述谷类植物品系的细胞中，所述基因盒携带相同或不同的蓝色糊粉基因以及位点特异性核酸酶，所述位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中在所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述雄性可育性恢复基因相同的侧上的靶位点处产生链断裂，并且其中所述相同或不同的蓝色糊粉基因在所述双链断裂的位点处被整合到所述谷类植物品系基因组中。
71.根据权利要求68-70中任一项所述的方法，其中位于所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述雄性可育性恢复基因不同的侧上的所述蓝色糊粉基因被破坏。
72.根据权利要求68所述的方法，其中基因编辑包括在所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述蓝色糊粉基因相同的侧上插入相同或不同的雄性可育性恢复基因。
73.根据权利要求72所述的方法，其中插入包括将基因盒引入步骤a)的所述谷类植物品系的细胞中，所述基因盒携带相同或不同的雄性可育性恢复基因以及位点特异性核酸酶，所述位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中在所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述蓝色糊粉基因相同的侧上的靶位点处产生双链断裂，并且其中所述相同或不同的雄性可育性恢复基因在所述双链断裂的位点处被整合到所述谷类植物品系基因组中。
74.根据权利要求68或72-74中任一项所述的方法，其中位于所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述蓝色糊粉基因不同的侧上的所述雄性可育性恢复基因被破坏。
75.根据权利要求68所述的方法，其中基因编辑包括将至少两种不同的位点特异性核酸酶引入步骤a)的所述谷类植物品系的细胞中，其中至少一种位点特异性核酸酶在所述蓝色糊粉基因附近但在所述蓝色糊粉基因与所述异源附加染色体的染色体末端之间产生第一双链断裂以形成所述染色体的第一末端，并且至少一种其他位点特异性核酸酶在所述雄性可育性恢复基因附近但在所述雄性可育性恢复基因与所述异源附加染色体的着丝粒之间产生第二双链断裂以形成第二染色体末端，并且其中所述染色体末端被交换使得所述蓝色糊粉基因位于所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述雄性可育性恢复基因相同的侧上。
76.根据权利要求68所述的方法，其中基因编辑包括将至少两种不同的位点特异性核酸酶引入步骤a)的所述谷类植物品系的细胞中，其中至少一种位点特异性核酸酶在所述雄性可育性恢复基因附近但在所述雄性可育性恢复基因与所述异源附加染色体的染色体末端之间产生第一双链断裂以形成所述染色体的第一末端，并且至少一种其他位点特异性核酸酶在所述蓝色糊粉基因附近但在所述蓝色糊粉基因与所述异源附加染色体的着丝粒之间产生第二双链断裂以形成第二染色体末端，并且其中所述染色体末端被交换使得所述蓝色糊粉基因位于所述至少一条异源附加染色体的着丝粒的与所述雄性可育性恢复基因相同的侧上。
77.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中所述第一及第二双链断裂同时地或在时间上紧密接近地发生。
78.根据权利要求70、71或73-77中任一项所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶、TALEN、ZFN或CRISPR核酸酶。
79.根据权利要求78所述的方法，其中通过编码用于位点特异性核酸酶活性的所需基因的至少一个DNA盒的转化、RNA分子的转化，或者通过纯化的蛋白质或核糖核蛋白质复合物的转化来将所述位点特异性核酸酶递送到所述谷类植物品系细胞中。
80.根据权利要求70、71、73-80中任一项所述的方法，其中所述细胞包括雄性不育基因型。
81.根据权利要求70、71、73-80中任一项所述的方法，其中所述细胞来自未成熟胚或愈伤组织。
82.根据权利要求53所述的方法，其中所述诱导部分同源重组步骤b)包括提供突变的部分同源配对抑制基因或引入抑制所述部分同源配对抑制基因的基因，其中所述部分同源配对抑制基因诱导包括所述显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记的所述异源附加染色体与至少一条部分同源染色体的部分同源重组。
83.根据权利要求82所述的方法，其中所述至少一条部分同源染色体是4A、4B、4D或5A。
84.根据权利要求82所述的方法，其中所述至少一条部分同源染色体不是4B。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的方法，其中所述突变的部分同源配对抑制基因纯合地存在于染色体5B或染色体3D上。
86.根据权利要求82-85中任一项所述的方法，其中所述突变的部分同源配对抑制基因被缺失。
87.根据权利要求82-86中任一项所述的方法，其中所述突变的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。
88.根据权利要求53-87中任一项所述的方法，其中所述谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
89.根据权利要求88所述的方法，其中所述谷类植物是黑小麦。
90.根据权利要求88所述的方法，其中所述谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
91.根据权利要求90所述的方法，其中所述谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
92.根据权利要求53-91中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
93.根据权利要求53-91中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
94.根据权利要求93所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
96.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是从根据权利要求53-95中任一项所述的步骤c)获得，并且其中所述谷类植物不包括所述异源附加染色体的错分裂。
97.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是从根据权利要求53-95中任一项所述的步骤c)获得，并且其中所述谷类植物不包括所述异源附加染色体的断裂。
98.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是从根据权利要求53-95中任一项所述的步骤c)获得，并且其中所述谷类植物不包括i)所述异源附加染色体的错分裂以及ii)所述异源附加染色体的断裂。
99.一种种子或后代或其部分，其得自从根据权利要求53-95中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括所述异源附加染色体的错分裂。
100.一种种子或后代或其部分，其得自从根据权利要求53-95中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括所述异源附加染色体的断裂。
101.一种种子或后代或其部分，其得自从根据权利要求53-95中任一项所述的步骤c)获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括i)所述异源附加染色体的错分裂以及ii)所述异源附加染色体的断裂。
102.一种产生用于对谷类植物进行基因组选择的蓝色糊粉(BLA)雄性不育系统的方法，包括：
a)选择雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系；
b)将雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因整合到所述谷类植物品系的基因组中，其中所述雄性可育性恢复基因与所述蓝色糊粉基因遗传连锁并紧密靠近；以及
c)获得包括所述遗传连锁的雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因的谷类植物。
103.根据权利要求102所述的方法，其中通过基因盒将所述雄性可育性恢复基因以及所述蓝色糊粉基因引入所述谷类植物品系的细胞中。
104.根据权利要求103所述的方法，其中将所述雄性可育性恢复基因与所述蓝色糊粉基因在所述基因盒中配置为5’对5’、3’对3’、5’对3’或3’对5’。
105.根据权利要求102-104中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因与所述蓝色糊粉基因通过接头连接。
106.根据权利要求103-105中任一项所述的方法，其中所述细胞包括雄性不育基因型。
107.根据权利要求103-106中任一项所述的方法，其中所述细胞来自未成熟胚或愈伤组织。
108.根据权利要求102-107中任一项所述的方法，其中所述整合步骤b)包括随机地整合所述连接的雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因。
109.根据权利要求108所述的方法，其中通过对在二元质粒中的T-DNA边界内包含的所述雄性可育性恢复基因以及蓝色糊粉基因进行土壤杆菌介导的转化来将所述基因盒引入所述细胞中。
110.根据权利要求108所述的方法，其中通过对呈超螺旋、环状、松弛或线性构型的包括所述基因盒的质粒进行粒子轰击来将所述基因盒引入所述细胞中。
111.根据权利要求102-107中任一项所述的方法，其中所述整合步骤b)包括使用位点特异性核酸酶来对所述连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因的整合进行靶向，所述位点特异性核酸酶被设计成在谷类植物品系基因组中的靶位点处产生双链断裂，并且其中在所述双链断裂的所述位点处将所述连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因整合到所述谷类植物品系基因组中。
112.根据权利要求111所述的方法，其中所述位点特异性核酸酶是大范围核酸酶、TALEN、ZFN或CRISPR核酸酶。
113.根据权利要求112所述的方法，其中通过编码用于位点特异性核酸酶活性的所需基因的至少一个DNA盒的转化、RNA分子的转化，或者通过纯化的蛋白质或核糖核蛋白质复合物的转化来将所述位点特异性核酸酶递送到所述谷类植物品系细胞中。
114.根据权利要求102-113中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因是显性基因。
115.根据权利要求102-114中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因突变是缺失、敲低或敲除。
116.根据权利要求102-115中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
117.根据权利要求102-114中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性突变是ms1基因缺失、ms1基因敲低或ms1基因敲除。
118.根据权利要求102-117中任一项所述的方法，其中将所述连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因整合到染色体4A、4B、4D或5A中。
119.根据权利要求102-117中任一项所述的方法，其中所述连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因不整合到染色体4B中。
120.根据权利要求102-119中任一项所述的方法，其中所述谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述谷类植物是黑小麦。
122.根据权利要求120所述的方法，其中所述谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
123.根据权利要求122所述的方法，其中所述谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
124.根据权利要求102-123中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
125.根据权利要求102-124中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
126.根据权利要求102-125所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
127.根据权利要求126所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
128.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是从根据权利要求102-127中任一项所述的步骤c)获得，并且其中所述谷类植物包括所述连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因的单一拷贝插入。
129.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是从根据权利要求102-127中任一项所述的步骤c)获得，并且其中所述谷类植物的天然基因序列未被破坏。
130.一种种子或后代或其部分，其得自从根据权利要求102-127中任一项所述的步骤c)获得的所述谷类植物，并且其中所述谷类植物包括所述连接的雄性可育性恢复基因与蓝色糊粉基因的单一拷贝插入。
131.一种种子或后代或其部分，其得自从根据权利要求102-127中任一项所述的步骤c)获得的所述谷类植物，并且其中所述谷类植物的天然基因序列未被破坏。
132.一种制造用于生产杂交谷类植物的谷类植物、其种子或部分的方法，包括：
a)使包括单体异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变的第一谷类植物与包括二体杀配子附加染色体的第二谷类植物杂交，所述单体异源附加染色体在其着丝粒的不同侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，所述二体杀配子附加染色体携带杀配子基因；
b)收获、选择并种植表达所述选择标记基因的通过步骤a)产生的至少一个种子，其中所述种子包括所述单体异源附加染色体以及单体杀配子附加染色体以产生第三谷类植物，其中所述第三谷类植物包括杂合雄性可育性基因突变；
c)使步骤b)中所产生的所述第三谷类植物与步骤a)的所述第一谷类植物杂交；
d)收获、选择并种植表达所述选择标记基因的在步骤c)中所产生的至少一个种子，其中所述种子包括所述单体异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变以产生包括纯合的雄性可育性基因突变的第一子代的后代谷类植物；
e)使步骤d)中所产生的所述第一子代的后代谷类植物自花受精；
f)收获、选择并种植表达所述选择标记基因的在步骤e)中产生的至少一个种子，其中所述种子包括所述单体异源附加染色体以及纯合的雄性可育性基因突变以产生第二子代的后代谷类植物；
g)使步骤f)中所产生的所述第二子代的后代谷类植物自花受精；
h)任选地重复步骤f)及g)至少另外的一代；
i)收获步骤g)中所产生的第三子代的种子，或如果执行步骤h)，则收获步骤h)中所产生的第三子代的种子；
j)选择并种植不表达所述选择标记基因的所述第三子代的至少一个种子以产生第四子代的后代谷类植物；
k)对步骤j)中所产生的所述第四子代的所述谷类植物的穗进行表型分型；以及
l)选择在步骤k)中显示完全不育的所述第四子代的谷类植物的群体以产生用于生产杂交谷类植物的谷类植物。
133.根据权利要求132所述的方法，其中步骤j)包括选择并种植至少25个种子或至少100个种子。
134.一种制造用于生产杂交谷类植物的谷类植物、其种子或部分的方法，包括：
a)辐射包括单体异源附加染色体的至少一个种子，所述单体异源附加染色体在着丝粒的不同侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因；
b)种植在步骤a)中被辐射的所述至少一个种子以产生至少一个第一谷类植物；
c)收获来自步骤b)中所产生的所述至少一个第一谷类植物的基本上所有的种子以形成至少一个种子群体，其中每一种子群体均来自一个单独的植物，并且其中每一种子群体均包括表达所述至少一个选择标记基因的种子以及不表达所述至少一个选择标记基因的种子；
d)种植来自步骤c)的所述群体的不表达所述选择标记基因的至少一个种子；
e)抛弃在步骤d)中产生可育植物的种子群体；
f)使步骤e)中未被抛弃的表达所述选择标记基因的种子自花受精以形成下一个种子群体，其中每一种子群体均来自一个单独的植物，其中每一种子群体均包括表达所述至少一个选择标记基因的种子以及不表达所述至少一个选择标记基因的种子；
g)任选地重复步骤d)及e)至少一次；
h)种植不表达所述至少一个选择标记的至少一个种子；以及
i)从显示完全不育的谷类植物群体选择种子群体以产生用于生产杂交谷类植物的谷类植物。
135.根据权利要求134所述的方法，其中步骤a)包括辐射至少1000个种子或至少8000个种子。
136.根据权利要求134或135所述的方法，其中步骤d)包括种植多达200个种子。
137.根据权利要求134-136中任一项所述的方法，其中步骤g)重复包括种植至少300个种子的步骤d)。
138.根据权利要求132-137中任一项所述的方法，进一步包括：检查来自根据权利要求132所述的步骤l)或根据权利要求134所述的步骤i)的所述群体的至少一个表达选择标记基因的种子，以确认所述种子包括重排的单体异源附加染色体，所述重排的单体异源附加染色体包括位于其着丝粒的同一侧上的所述显性雄性可育性恢复基因以及所述选择标记基因。
139.根据权利要求138所述的方法，其中所述检查步骤包括执行细胞学分析或分子分析。
140.根据权利要求139所述的方法，其中所述检查步骤包括执行FISH(荧光原位杂交)或GISH(基因组原位杂交)显微镜观察以检测易位的位置。
141.根据权利要求132-140中任一项所述的方法，进一步包括：选择包括所述重排的单体异源附加染色体的来自根据权利要求132所述的步骤l)或根据权利要求134所述的步骤i)的所述群体的至少一个杂交谷类植物，并使其与未经根据权利要求132或134所述的其中一种方法处理的谷类植物杂交，以在后代中减少由于根据权利要求132或134所述的方法而被引入所述谷类基因组中的任何不需要的染色体重排或突变。
142.根据权利要求132-141中任一项所述的方法，其中所述谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
143.根据权利要求142所述的方法，其中所述谷类植物是黑小麦。
144.根据权利要求142所述的方法，其中所述谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
145.根据权利要求144所述的方法，其中所述谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
146.根据权利要求132-145中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
147.根据权利要求132-145中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
148.根据权利要求132-147中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述颜色标记基因能够赋予包括所述颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
150.根据权利要求148或权利要求149所述的方法，其中所述颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
151.根据权利要求150所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
152.根据权利要求151所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
153.根据权利要求132-152中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
154.根据权利要求132-153中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
155.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是根据权利要求132-154中任一项获得，并且其中所述谷类植物不包括所述异源附加染色体的错分裂。
156.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是根据权利要求132-154中任一项获得，并且其中所述谷类植物不包括所述异源附加染色体的断裂。
157.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是根据权利要求132-154中任一项获得，并且其中所述谷类植物不包括i)所述异源附加染色体的错分裂以及ii)所述异源附加染色体的断裂。
158.一种种子或后代或其部分，其得自根据权利要求132-154中任一项获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括所述异源附加染色体的错分裂。
159.一种种子或后代或其部分，其得自根据权利要求132-154中任一项获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括所述异源附加染色体的断裂。
160.一种种子或后代或其部分，其得自根据权利要求132-154中任一项获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括i)所述异源附加染色体的错分裂以及ii)所述异源附加染色体的断裂。
161.一种制造用于生产杂交谷类植物品系的谷类植物品系、其种子或部分的方法，包括：
a)使包括二体异源附加染色体的雄性可育性基因突变纯合的第一谷类植物与雄性可育性基因突变以及部分同源配对抑制基因突变纯合的第二谷类植物杂交，所述二体异源附加染色体携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因；
b)收获、选择并种植雄性可育性基因突变纯合的在步骤a)中所产生的至少一个种子，所述至少一个种子包括单体异源染色体，其携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因以及单一拷贝的所述部分同源配对抑制基因突变；
c)使步骤b)中所产生的谷类植物自花受精；
d)收获、选择并种植雄性可育性基因突变以及所述部分同源配对抑制基因突变纯合的在步骤c)中所产生的至少一个种子，所述至少一个种子包括整倍体数量的染色体以及所述单体异源附加染色体；
e)使步骤d)中所产生的谷类植物自花受精；
f)收获来自步骤e)的至少四个种子；
g)计算来自表达所述至少一个选择标记的第一组以及不表达所述至少一个选择标记的第二组的步骤f)的种子数量，以便确定分离比率；
h)如果第一组:第二组的种子数量比率趋向于约3:1，则保留步骤f)的种子，并且如果第一组:第二组的种子数量比率趋向于约1:3，则抛弃步骤f)的种子。
162.根据权利要求161所述的方法，其中所述显性雄性可育性恢复基因与所述至少一个选择标记基因位于所述异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
163.根据权利要求161所述的方法，其中所述显性雄性可育性恢复基因与所述至少一个选择标记基因位于所述异源附加染色体的着丝粒的不同侧上。
164.根据权利要求161-163中任一项所述的方法，其中所述谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
165.根据权利要求164所述的方法，其中所述谷类植物是黑小麦。
166.根据权利要求164所述的方法，其中所述谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
167.根据权利要求166所述的方法，其中所述谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
168.根据权利要求161-167中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
169.根据权利要求161-167中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
170.根据权利要求161-169中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
171.根据权利要求170所述的方法，其中所述颜色标记基因能够赋予包括所述颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
172.根据权利要求170或权利要求171所述的方法，其中所述颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
173.根据权利要求172所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
174.根据权利要求174所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
175.根据权利要求161-174中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
176.根据权利要求161-175中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
177.根据权利要求161-176中任一项所述的方法，其中所述部分同源配对抑制基因突变是来自染色体5B或染色体3B的基因缺失。
178.根据权利要求177所述的方法，其中所述缺失的部分同源配对抑制基因是ph1b或ph2。
179.根据权利要求161-178中任一项所述的方法，其中所述单体异源附加染色体与4A、4B、4D或5A染色体易位。
180.根据权利要求161-178中任一项所述的方法，其中所述单体异源附加染色体不与4B染色体易位。
181.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是根据权利要求161-180中任一项获得，并且其中所述谷类植物不包括所述异源附加染色体的错分裂。
182.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是根据权利要求161-180中任一项获得，并且其中所述谷类植物不包括所述异源附加染色体的断裂。
183.一种谷类植物或其部分，其中所述谷类植物是根据权利要求161-180中任一项获得，并且其中所述谷类植物不包括i)所述异源附加染色体的错分裂以及ii)所述异源附加染色体的断裂。
184.一种种子或后代或其部分，其得自根据权利要求161-180中任一项获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括所述异源附加染色体的错分裂。
185.一种种子或后代或其部分，其得自根据权利要求161-180中任一项获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括所述异源附加染色体的断裂。
186.一种种子或后代或其部分，其得自根据权利要求161-180中任一项获得的谷类植物，并且其中所述种子或后代或其部分不包括i)所述异源附加染色体的错分裂以及ii)所述异源附加染色体的断裂。
187.一种保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物的雄性不育雌性亲本品系的方法，所述方法包括：
a.种植包括纯合的雄性可育性基因突变以及单体异源附加染色体的至少一个种子，所述单体异源附加染色体在其着丝粒的同一侧上携带显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因，由此可将具有所述单体异源附加染色体的种子与不具有所述单体异源附加染色体的种子分开以产生至少一个后代种子；
b.使步骤a)中所产生的谷类植物自花受精；
c.选择不包括所述单体异源附加染色体的至少一个种子以生长至少一个不育雌性亲本谷类植物，以便与可育雄性谷类植物杂交以用于杂交谷类植物及杂交种子生产；以及
d.选择包括所述单体异源附加染色体的至少一个种子以便保持所述谷类植物。
188.一种保持用于生产杂交谷类植物的谷类植物的雄性不育雌性亲本品系的方法，所述方法包括：
a.种植包括纯合的雄性可育性基因突变以及携带显性雄性可育性恢复基因和至少一个选择标记基因的异源附加染色体的至少一部分的至少一个种子，所述异源附加染色体的至少一部分易位到部分同源染色体对中的至少一条染色体中；
b.使步骤a)中所产生的谷类植物自花受精；
c.选择不包括易位到部分同源染色体对中的至少一条染色体中的所述异源附加染色体的至少一个种子以生长至少一个不育雌性亲本谷类植物，以便与可育雄性谷类植物杂交以用于杂交谷类植物及杂交种子生产；
d.选择包括易位到部分同源染色体对中的一条染色体中的所述异源附加染色体的至少一个种子以保持所述谷类植物，其中所述种子对所述易位是杂合的，优选地通过所述至少一个选择标记基因的表达所指示；以及
e.抛弃包括易位到部分同源染色体对中的至少两条染色体中的所述异源附加染色体的任何种子以保持所述谷类植物，其中所述种子对所述易位是纯合的，优选地通过所述至少一个选择标记基因的表达所指示。
189.根据权利要求187或权利要求188所述的方法，其中所述谷类植物或其后代是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
190.根据权利要求189所述的方法，其中所述谷类植物是黑小麦。
191.根据权利要求189所述的方法，其中所述谷类植物是四倍体小麦或六倍体小麦。
192.根据权利要求191所述的方法，其中所述谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
193.根据权利要求187-192中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
194.根据权利要求187-193中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
195.根据权利要求187-194中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
196.根据权利要求195所述的方法，其中所述颜色标记基因能够赋予包括所述颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
197.根据权利要求195或权利要求196所述的方法，其中所述颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
198.根据权利要求197所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
199.根据权利要求198所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
200.根据权利要求196-199中任一项所述的方法，其中淡蓝色种子指示所述种子对所述易位是杂合的。
201.根据权利要求196-199中任一项所述的方法，其中深蓝色种子指示所述种子对所述易位是纯合的。
202.根据权利要求187-201中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
203.根据权利要求187-202中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性基因是Ms1或包括选自由以下组成的组的核酸序列的核酸：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
204.一种通过根据权利要求187-203中任一项所述的方法产生的谷类植物或其部分。
205.一种通过根据权利要求187-203中任一项所述的方法产生的种子。
206.一种制造包括至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体的雄性可育性基因突变纯合的谷类植物品系的方法，所述方法包括：
a)使包括至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体的谷类植物与对所述重排的和/或部分同源的染色体在遗传学上相关的基因组缺体的谷类植物杂交，；
b)收获并选择包括所述异源染色体的种子并从所述种子产生植物；
c)使b)的所述植物与谷类植物杂交；
d)收获并选择包括所述异源染色体且不包括任何单体染色体的种子，优选通过使用qPCR和/或流式细胞术，并从所述种子产生植物；
e)任选地，使d)的所述植物与谷类植物回交，并且从所述杂交收获并选择包括所述异源染色体的种子；
f)使d)或e)的所述植物与雄性可育性基因突变纯合的谷类植物杂交；
g)收获并选择包括所述异源染色体的种子并从所述种子产生植物；
h)使g)的所述植物自交，收获并选择包括所述异源染色体的种子；
i)从h)的所述种子产生植物并选择包括所述至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体的雄性可育性基因突变纯合的谷类植物。
207.根据权利要求206所述的方法，其中所述方法进一步包括
j)使步骤i)中所选择的所述植物自交以获得：
I)雄性可育性基因突变纯合的谷类植物，其杂合地包括所述至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体；
II)雄性可育性基因突变纯合的谷类植物，其纯合地包括所述至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体；
III)雄性可育性基因突变纯合的谷类植物，其不包括所述至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体。
208.根据权利要求206所述的方法，其中所述至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体包括或者是携带雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因的单体异源附加染色体，其中所述雄性可育性恢复基因与所述至少一个选择标记基因位于所述单体异源附加染色体的着丝粒的同一侧上。
209.根据权利要求206所述的方法，其中所述至少一条重排的和/或部分同源的异源附加染色体易位到至少一个部分同源染色体对，其中所述对由第一及第二染色体组成，所述第一染色体是所述谷类植物天然存在的，并且所述第二染色体包括所述异源染色体或其片段，所述异源染色体或其片段包括显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因。
210.根据权利要求208或209所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因是显性基因。
211.根据权利要求206-210中任一项所述的方法，其中所述谷类植物是四倍体小麦、六倍体小麦、黑小麦、玉米、水稻、大麦或燕麦。
212.根据权利要求206-211中任一项所述的方法，其中所述谷类植物是硬粒小麦或普通小麦。
213.根据权利要求206-212中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因来自野生一粒小麦或一粒小麦。
214.根据权利要求206-213中任一项所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
215.根据权利要求206-214中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因选自由颜色标记基因、植物高度基因或质地基因组成的组。
216.根据权利要求215所述的方法，其中所述颜色标记基因能够赋予包括所述颜色标记基因的后代种子特征性颜色。
217.根据权利要求216所述的方法，其中所述颜色标记基因是蓝色糊粉基因。
218.根据权利要求217所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因来自高冰草、绒毛冰草或一粒小麦。
219.根据权利要求217或218所述的方法，其中所述蓝色糊粉基因包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)具有SEQ ID NO：44或12的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)具有相对于SEQ ID NO：44或12所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)编码SEQ ID NO：45或13的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)编码相对于SEQ ID NO：45或13所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
220.根据权利要求206或207所述的方法，其中所述雄性可育性基因突变是基因缺失、基因敲低或基因敲除。
221.根据权利要求206、207或220所述的方法，其中所述雄性可育性基因是Ms1或核酸，其包括选自由以下组成的组的核酸序列：
(i)如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(ii)相对于如SEQ ID NO：1、6、7、8或10所述的核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(iii)具有如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(iv)具有相对于如SEQ ID NO：2、4、9、11或14所述核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的编码序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段；
(v)编码如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述的氨基酸序列的核酸序列，或其产生功能性氨基酸序列的片段或变体；
(vi)编码相对于如SEQ ID NO：3、5、15、42或43所述氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列一致性的氨基酸序列的核酸序列，或其片段。
222.根据权利要求206所述的方法，其中除了其整倍体数量的染色体之外，步骤a)的所述谷类植物还包括一条附加染色体，其中所述显性雄性可育性恢复基因以及至少一个选择标记基因位于所述附加染色体上。
223.根据权利要求208或209所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因位于所述异源附加染色体上的类似于所述谷类植物的所述突变雄性可育性基因的位置。
224.根据权利要求209所述的方法，其中所述第一染色体包括一段高冰草的染色质，所述一段染色质优选地易位到所述第一染色体的长臂的末端上，由此所述一段染色质与异源染色体片段或其部分配对。
225.根据权利要求209或224所述的方法，其中所述第二染色体进一步包括天然存在的DNA。
226.根据权利要求209所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于所述着丝粒的相对侧上。
227.根据权利要求209所述的方法，其中所述雄性可育性恢复基因与选择标记基因位于所述着丝粒的同一侧上。
228.根据权利要求209所述的方法，其中所述第一染色体是4A、4B、4D或5A。
229.根据权利要求209所述的方法，其中所述第一染色体不是4B。
230.一种通过根据权利要求206-229中任一项所述的方法产生的谷类植物或其部分。
231.一种通过根据权利要求206-229中任一项所述的方法产生的种子。
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