BRPI0307383B1 - método de recombinação genética direcionada em célula de planta hospedeira - Google Patents

Abstract

"mutagênese cromosômica alvo utilizando nucleases de ramificações de zinco". a presente invenção refere-se a um método ou métodos de recombinação genética ou mutagênese em uma célula ou organismo hospedeiro, e às composições úteis para a execução do método. o método alvo da presente invenção explora os mecanismos celulares endógenos para a recombinação homóloga e o reparo de rupturas de filamentos duplos no material genético. a presente invenção apresenta numerosos aperfeiçoamentos em relação aos métodos de mutagênese anteriores, e tais vantagens incluem o fato que o método é geralmente aplicável a uma ampla variedade de organismos, o método é visado de modo que as desvantagens associadas com a inserção aleatória do dna no material genético hospedeiro sejam eliminadas, e determinadas realizações requerem uma manipulação relativamente pequena do material genético hospedeiro para ser bem sucedido. adicionalmente, ela apresenta um método que produz organismos com modificações específicas nos genes em um curto período de tempo.

Description

“MÉTODO DE RECOMBINAÇÃO GENÉTICA DIRECIONADA EM CÉLULA DE PLANTA HOSPEDEIRA” REFERÊNCIA REMISSIVA A PEDIDOS CORRELATOS

[001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido de patente provisório U.S. N O 60/351.035 depositado em 23 de janeiro de 2002, e do Pedido de Patente PCT NO PCT/US03/02012.

RECONHECIMENTO DE SUPORTE DE PESQUISA FEDERAL

[002] O governo dos Estados Unidos tem determinados direitos na invenção com base no suporte parcial pela Concessão ROI GM 58504.

ANTECEDENTES DA INVENCÃO

[003] A escolha dos genes - o processo da substituição ou mutação de gene pela recombinação homóloga ou pela mutação - é uma técnica muito útil, mas tipicamente ineficiente para a introdução de mudanças desejadas no material genético de uma célula hospedeira. Somente quando uma forte seleção para o produto alvo pode ser aplicada é que é possível a recuperação da alteração desejada. Um método geral para melhorar a eficiência da escolha de focalização do gene seria valioso em muitas circunstâncias, bem como a extensão dessa ferramenta para uma faixa mais ampla de organismos.

[004] Foi demonstrado nas experiências modelo que a introdução de uma ruptura de filamento duplo (DSB) no DNA hospedeiro intensifica bastante a frequência de recombinação localizada. Entretanto, esses testes requeriam a inserção de um sítio de reconhecimento para uma endonuclease específica antes que a clivagem pudesse ser induzida. Analogamente, na Drosophila as DSBs produzidas pela excisão de P-elemento são recombinagênicas, mas requerem a existência prévia do P- elemento no sítio alvo.

[005] Embora os métodos previamente demonstrados de transformação genética foram altamente bem sucedidos, a transformação sem recombinação direcionada também foi acompanhada pelos problemas associados com a inserção aleatória do DNA introduzido. A integração aleatória pode conduzir à inativação de genes essenciais, ou à expressão aberrante do gene introduzido. Os problemas adicionais associados com a transformação genética incluem o mosaicismo devido às integrações múltiplas e dificuldades técnicas associadas com a geração de vetores virais recombinantes defeituosos de replicação.

[006] A recombinação ou mutação genética direcionada de uma célula ou de um organismo é agora desejável porque as sequências genômicas completas foram determinadas para um número de organismos, e mais sequências estão sendo obtidas a cada dia. Não somente a capacidade de dirigir uma mutação para um locus genético específico ajudar bastante aqueles que estudam a função de genes particulares, mas a recombinação genética direcionada também deve ter aplicações terapêuticas e agrícolas. São necessários métodos de recombinação genética direcionada que sejam mais gerais, eficientes, e/ou reproduzíveis do que as técnicas atualmente disponíveis.

DESCRICÀO RESUMIDA DA INVENCÀO

[007] A presente invenção apresenta composições e métodos para a execução de recombinação ou mutação genética direcionada. Qualquer segmento do ácido nucléico endógeno em uma célula ou em um organismo pode ser modificado pelo método da invenção contanto que a sequência da região alvo, ou porção da região alvo, seja conhecida, ou se o DNA isolado homólogo à região alvo estiver disponível.

[008] Em determinadas realizações, as composições e os métodos compreendem a transformação de um organismo hospedeiro mediante a introdução de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) quimérica em uma célula ou organismo e que identifica uma célula ou um organismo resultante em que uma sequência de DNA endógeno selecionada é clivada e exibe uma mutação.

[009] Em uma realização preferida, tais métodos compreendem a seleção de um domínio de ligação de DNA de dedo de zinco que pode preferivelmente se ligar a um locus de DNA hospedeiro específico a ser mutado; também a seleção de um domínio de clivagem de DNA não específico com capacidade de clivar DNA de filamento duplo quando ligado operativamente ao dito domínio de ligação e introduzido na célula hospedeira; também a seleção de uma região de promotor com capacidade de induzir a expressão na célula hospedeira; e também a ligação operativa do DNA que codifica o domínio de ligação e o domínio de clivagem e a região do promotor para produzir um construto de DNA. O construto de DNA é introduzido então em uma célula hospedeira alvo e é identificada pelo menos uma célula hospedeira que exibe a recombinação no locus alvo no DNA hospedeiro. Em uma realização particular, o domínio de ligação do DNA compreende os domínios de ligação de três dedos de zinco Cis2-His2. Em uma outra realização, o domínio de clivagem compreende um domínio de clivagem derivado da endonuclease de restrição Fokl do tipo II. Em uma realização, um promotor de choque térmico induzível é ligado operativamente ao DNA que codifica a nuclease de dedo do zinco quimérica.

[0010] As realizações adicionais envolvem métodos para a inserção direcionada pela recombinação homóloga de sequências de DNA selecionadas (DNA doador). O DNA doador pode compreender uma sequência que codifique um produto a ser produzido na célula hospedeira. O dito produto pode ser aquele que é produzido para o benefício da célula ou do organismo hospedeiro (por exemplo, a terapia de genes), ou o produto pode ser aquele que é produzido para ser utilizado fora da célula ou do organismo hospedeiro (por exemplo, o produto pode ser selecionado, mas sem ficar a eles limitado, produtos farmacêuticos, hormônios, produtos de proteína utilizados na fabricação de objetos ou dispositivos úteis, nutracêuticos, produtos utilizados na fabricação ou na síntese química, etc.).

[0011] Em uma determinada realização, a presente invenção é utilizada para romper um gene direcionado em uma célula somática. Tal gene pode ser super-expressado em um ou mais tipos de células, resultando na doença. A ruptura de tal gene só pode ser bem sucedida a uma porcentagem baixa de células somáticas, mas tal ruptura pode contribuir para uma saúde melhor para um individual que sofre da doença devido à super-expressão de tal gene.

[0012] Em uma outra realização, a presente invenção pode ser utilizada para romper um gene alvo em uma célula de germe. As células com tal ruptura no gene alvo podem ser selecionadas a fim de criarem um organismo sem função do gene alvo. Em tal célula a função do gene alvo pode ser completamente eliminada.

[0013] Em uma outra realização, a presente invenção pode ser utilizada para intensificar a expressão de um gene particular mediante a inserção de um elemento de controle em uma célula somática. Tal elemento de controle pode ser selecionado de um grupo que consiste, mas sem ficar a eles limitado, promotores constitutivamente ativos, induzíveis, específicos de tecidos ou específicos de estágios de desenvolvimento. Tal elemento de controle pode ser visado em um locus cromossomal onde efetue a expressão de um gene particular que seja responsável por um produto com um efeito terapêutico em tal célula ou no organismo hospedeiro. A presente invenção também pode apresentar a inserção do DNA doador contendo um gene que codifica um produto que, quando expressado, tenha um efeito terapêutico na célula ou no organismo hospedeiro. Um exemplo de tal método terapêutico consiste em utilizar a recombinação genética direcionada da presente invenção para efetuar a inserção em uma célula pancreática de um promotor ativo ligado operativamente ao DNA doador que contém um gene de insulina. A célula pancreática que contém o DNA doador produziria então a insulina, ajudando desse modo um hospedeiro diabético. Adicionalmente, os construtos de DNA doador poderiam ser inseridos em um genoma de uma plantação a fim de efetuar a produção de um produto de gene farmaceuticamente relevante.

Um gene que codifica um produto de proteína farmaceuticamente útil, tal como a insulina ou a hemoglobina, ligado funcionalmente a um elemento de controle, tal como promotores constitutivamente ativos, induzíveis, específicos de tecidos ou específicos de estágios de desenvolvimento, poderia ser inserido em uma planta hospedeira a fim de produzir uma grande quantidade de produto de proteína farmaceuticamente útil na planta hospedeira. Tais produtos de proteína poderiam então ser isolados da planta. Alternativamente, os métodos acima mencionados podem ser utilizados em uma célula de germe.

[0014] A presente invenção pode ser utilizada em células somáticas e de linhagem germinativa para efetuar a alteração em qualquer locus cromossomal alvo.

[0015] Os métodos da presente invenção são aplicáveis a uma ampla gama de tipos de células e organismos. A presente invenção pode ser aplicada a qualquer uma das seguintes células, embora os métodos da invenção não fiquem limitados às células ou aos organismos aqui relacionados: um organismo unicelular ou multicelular; um oócito; um gameta; uma célula de linhagem germinativa na plantação ou no organismo hospedeiro; uma célula somática na plantação ou no organismo hospedeiro; uma célula de inseto, incluindo um inseto selecionado do grupo que consiste em Coleoptera, Diptera, Hemiptera, Homoptera, Himenoptera, Lepidoptera, ou Orthoptera, incluindo uma mosca de fruta, um mosquito e uma mosca; uma célula de planta, incluindo uma célula de monocotiledônea e uma célula de dicotiledônea; uma célula de mamífero, incluindo, mas sem ficar a elas limitada, uma célula selecionada do grupo que consiste em células de camundongos, ratos, porcos, carneiros, bovinos, cães ou gatos; uma célula de ave, incluindo, mas sem ficar a elas limitada, uma célula selecionada do grupo que consiste em células de galinhas, perus, patos ou gansos; ou uma célula de peixes, incluindo, mas sem ficar a elas limitada, células de peixe zebra, truta ou salmão.

[0016] Há muitas alterações e variações da invenção tal como aqui descrito. A invenção é exemplificada para a recombinação genética direcionada no inseto, Drosophila, e nas plantas, Arabidopsis e tabaco. Na Drosophila e na Arabidopsis, a sequência de nucleotídeo é conhecida para a maior parte do genoma. Os segmentos grandes de sequências genômicas de outros organismos estão se tornando conhecidos em um ritmo rápido. Os elementos necessários para a execução dos métodos da presente invenção tal como aqui indicado podem ser adaptados para a aplicação em qualquer célula ou organismo. A invenção apresenta, portanto, um método geral para a recombinação genética direcionada em qualquer célula ou organismo.

[0017] Tabela I: Ilustra o número de mutantes da linhagem germinativa recuperados mediante o cruzamento dos machos expostos a um choque térmico com as fêmeas ligadas com X[C(1)DX] e as fêmeas do choque térmico aos machos de FM6 (y) de acordo com uma realização da presente invenção. A porcentagem de todos os progenitores tratados com choque selecionados que formaram pelo menos um mutante de linhagem germinativa é mostrado entre parênteses na coluna # Formando y. O número total de moscas mutantes recuperadas é fornecido na coluna Total y e também é expressado como uma porcentagem de qualquer prole candidata (entre parênteses). O número da prole de mutantes por mosca variou de 1 a 15. Os dados ND são da M. Bibikova et al. (2002) Genetics 161: 1169-1175 que é aqui incorporado por referência.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0018] A presente invenção refere-se a métodos e composições para a execução da recombinação ou mutação genética direcionada. Ao contrário dos métodos previamente conhecidos para a recombinação genética direcionada, a presente invenção é eficiente e barata de executar e é adaptável a qualquer célula ou organismo. Qualquer segmento de ácido nucléico de filamento duplo de uma célula ou organismo pode ser modificado pelo método da presente invenção. O método explora os processos tanto homólogos quanto não homólogos de recombinação que são endógenos em todas as células.

[0019] O método da presente invenção apresenta inserções de DNA alvo e deleções de DNA alvo. O método envolve a transformação de uma célula com um DNA que compreende no mínimo um construto de ácido nucléico que codifica uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) quimérica. Em uma realização particular, o método envolve adicionalmente a transformação de uma célula com um DNA doador que compreende um construto de ácido nucléico. Outros esquemas baseados nesses conceitos gerais estão dentro do âmbito e caráter da invenção, e são imediatamente aparentes aos elementos versados na técnica.

[0020] A presente invenção pode ser utilizada em células somáticas e de germes para conduzir a manipulação genética em um locus genético particular.

[0021] Em uma realização particular, a presente invenção é utilizada para romper um gene em uma célula somática em que esse gene está super-expressando um produto e/ou está expressando um produto que é nocivo à célula ou ao organismo. Tal gene pode ser super-expressado em um ou mais tipos de células, resultando na doença. A ruptura de tal gene pelos métodos da presente invenção pode contribuir para uma saúde melhor para um individual que sofre da doença devido à expressão de tal gene. Em outras palavras, a ruptura dos genes até mesmo em uma porcentagem pequena de células pode funcionar de modo a diminuir os níveis da expressão a fim de produzir um efeito terapêutico.

[0022] Em uma outra realização, a presente invenção pode ser utilizada para romper um gene em uma célula de germe. As células com tal ruptura em um gene particular podem ser selecionadas a fim de criarem um organismo sem função de tal gene. Em tal célula o gene pode ser completamente eliminado. A ausência da função nessa célula particular pode ter um efeito terapêutico.

[0023] Em uma outra realização, a presente invenção pode ser utilizada para intensificar a expressão de um gene particular mediante a inserção de um elemento de controle em uma célula somática. Tal elemento de controle pode ser um promotor constitutivamente ativo, induzível ou específico de estágio de desenvolvimento. Ele também pode ser um promotor específico de tecidos com capacidade de efetuar a expressão somente em tipos de células particulares. Tal elemento de controle pode ser colocado de uma tal maneira para efetuar a expressão de um gene particular que seja responsável por um produto com um efeito terapêutico em tal célula.

[0024] A presente invenção também pode apresentar a inserção do DNA doador que codifica um produto de gene que, quando expressado constitutivamente, tenha um efeito terapêutico. Um exemplo dessa realização seria a inserção de tais construtos de DNA em um individual que sofre de diabetes a fim de efetuar a inserção de um promotor ativo e DNA doador que codifica o gene de insulina em uma população de células pancreáticas. Essa população de células pancreáticas que contêm o DNA exógeno deve então produzir a insulina, ajudando desse modo o paciente diabético. Adicionalmente, tais construtos de DNA poderiam ser inseridos em plantações a fim de efetuarem a produção de produtos de genes farmaceuticamente relevantes. Os genes para produtos de proteína, tais como a insulina, a lípase ou a hemoglobina, poderiam ser inseridos em plantas junto com elementos de controle, tais como promotores constitutivamente ativos ou induzíveis, a fim de produzirem grandes quantidades desses produtos farmacêuticos em uma planta. Tais produtos de proteína poderiam então ser isolados da planta. As plantas ou os animais transgênicos podem ser produzidos por esse método por meio de uma técnica de transferência de núcleo (McCreath, K.J. et al. (2000) Nature 405:1066-1069; Polejaeva, I A et al., (2000) Nature 407: 86-90) . Os vetores específicos do tipo de tecido ou de célula também podem ser empregados para conferir a expressão do gene somente nas células selecionadas.

[0025] Alternativamente, os métodos acima mencionados podem ser utilizados em uma célula de germe a fim de selecionar as células onde a inserção ocorreu na maneira planejada a fim de que todas as divisões de célula subsequentes da célula produzam células com a alteração genética desejada.

[0026] Tal como aqui empregado, as células nas quais ocorre a manipulação genética e um segmento de DNA ou um gene exógeno foi introduzido através da mão do homem são chamadas células recombinantes. Consequentemente, as células recombinantes podem ser distinguidas das células naturais que não contêm um segmento de DNA ou um gene exógeno recombinantemente introduzido. As células recombinantes incluem aquelas que têm um cDNA ou gene genômico introduzido, e também incluem os genes posicionados junto a um promotor heterólogo não naturalmente associado com o gene introduzido particular.

[0027] Para expressar uma proteína ou um peptídeo codificado recombinante, que seja mutante ou do tipo selvagem, de acordo com a presente invenção deve ser preparado um vetor da expressão que compreende ácidos nucléicos isolados sob o controle, ou ligados operativamente a, um ou mais promotores, os quais podem ser induzíveis, constitutivamente ativos ou específicos de tecidos, por exemplo. Para colocar uma sequência de codificação "sob o controle" de um promotor, a extremidade 5' do sítio de iniciação da transcrição da estrutura de leitura transcricional é geralmente colocada entre aproximadamente 1 e aproximadamente 50 nucleotídeos "a jusante" (isto é, 3') do promotor escolhido. O promotor “a montante” estimula a transcrição do DNA e promove a expressão da proteína recombinante codificada. Este é o significado da expressão "recombinante" neste contexto.

[0028] As maneiras de efetuar a expressão da proteína são bem conhecidas no estado da técnica. Um elemento versado na técnica é capaz de expressar uma proteína de sua escolha de acordo com a presente invenção.

[0029] Os métodos da presente invenção podem ser aplicados aos organismos inteiros ou em células ou tecidos ou núcleos cultivados, incluindo aquelas células, tecidos ou núcleos cultivados que podem ser utilizados para regenerar um organismo intato, ou em gametas tais como ovos ou esperma em estágios variados de seu desenvolvimento. Devido ao fato que as DSBs estimulam o reparo mutagênico essencialmente em todas as células ou organismos, a clivagem por ZFNs pode ser utilizada em todas as células ou organismos. Os métodos da presente invenção podem ser aplicados às células derivadas de qualquer organismo, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, insetos, fungos, roedores, bovinos, carneiros, caprinos, galinhas, e outros animais agricolamente importantes, bem como outros mamíferos, incluindo, mas sem ficar a eles limitados, cães, gatos e seres humanos.

[0030] Adicionalmente, as composições e os métodos da presente invenção podem ser utilizados nas plantas. É contemplado que as composições e os métodos podem ser utilizados em qualquer variedade de espécies de plantas, incluindo monocotiledôneas ou dicotiledôneas. Em determinadas realizações, a invenção pode ser utilizada nas plantas tais como gramíneas, legumes, produtos de amido, membros da família Brassica, ervas e temperos, plantações de óleo, plantas ornamentais, madeiras e fibras, frutas, plantas medicinais, plantas venenosas, milho, algodão, feijão de rodízio e qualquer outra espécie de plantação. Em realizações alternativas, a invenção pode ser utilizada nas plantas tais como a cana de açúcar, o trigo, o arroz, o milho, a batata, a beterraba, a mandioca, a cevada, a soja, a batata doce, a fruta da palma de óleo, o tomate, o sorgo, a laranja, a uva, a banana, a maçã, o repolho, a melancia, o coco, a cebola, o caroço de algodão, a semente de colza e o inhame. Em algumas realizações, a invenção pode ser utilizada nos membros das espécies de Solanaceae, tais como o tabaco, o tomate, a batata e a pimenta. Em outras realizações, a invenção pode ser utilizada em plantas ornamentais venenosas, tais como o oleandro, em qualquer espécie de teixo e rododendro. Em uma realização particular, a espécie de Brassica é a Arabidopsis.

[0031] As gramíneas incluem, mas sem ficar a elas limitadas, o trigo, milho, arroz, centeio, triticale, aveia, cevada, sorgo, painço, cana de açúcar, gramíneas de gramado e gramíneas de forragem. As gramíneas de forragem incluem, mas sem ficar a elas limitadas, capim do Kentucky, capim rabo de rato, capim do prado, estema azul gigante, estema azul pequeno e gama azul. Os legumes incluem, mas sem ficar a eles limitados, feijões tais como a soja, fava ou feijão de Windsor, feijão fradinho, feijão lima, feijão pinto, feijão marinho, feijão de cera, feijão verde, feijão manteiga e feijão de mung; ervilhas tais como ervilha verde, ervilha rachada, ervilha de olho preto, grão de bico, lentilhas e a ervilha da neve; amendoim; outros legumes tais como alfarroba, feno grego, kudzu, índigo, alcaçuz, algarobo, copaifera, pau-rosa, vagem, vagem sena, tamarindo, e raiz de tuba; e as plantações de forragem tal como a alfafa. Os produtos de amido incluem, mas sem ficar a eles limitados, batatas de quaisquer espécies incluindo a batata branca, a batata doce, a mandioca, e os inhames. Os Brassica, incluem, mas sem ficar a eles limitados, o repolho, brócoli, couve-flor, couve de Bruxelas, nabos, couve, couve galega e rabanete. As plantações de óleo incluem, mas sem ficar a ela limitadas, a soja, palma, semente de colza, girassol, amendoim, caroço de algodão, coco, semente de oliveira. As madeiras e as fibras incluem, mas sem ficar a eles limitadas, o algodão, linho, e bambu. Outras plantações incluem, mas sem ficar a elas limitadas, quinoa, amaranto, tarwi, tamarillo, oca, café, chá, e cacau.

Definições: [0032] Para as finalidades da presente invenção, os seguintes termos terão os seguintes significados: [0033] Tal como aqui empregada, a expressão "recombinação genética direcionada" refere-se a um processo no qual a recombinação ocorre dentro de um locus alvo do DNA presente em uma célula hospedeira ou em um organismo hospedeiro. A recombinação pode envolver o DNA tanto homólogo quanto não homólogo. Um exemplo de recombinação genética direcionada homóloga seria a clivagem de um locus selecionado do DNA hospedeiro por uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), seguida pelo recombinação homóloga do DNA clivado com o DNA homólogo da origem tanto exógena quanto endógena. Um exemplo de recombinação genética direcionada não homóloga seria a clivagem de um locus selecionado do DNA hospedeiro por uma ZFN, seguida pela união de extremidade não homóloga (NHEJ) do DNA clivado.

[0034] Tal como aqui empregadas, as expressões "célula hospedeira" ou "organismo hospedeiro" ou simplesmente "de um hospedeiro alvo", referem-se a uma célula ou um organismo que é selecionado para ser transformado geneticamente para conter um ou mais genes para a expressão de uma função utilizada nos métodos da presente invenção. Um hospedeiro também pode ser um organismo ou uma célula que é transformado pelos métodos de recombinação ou mutação genética direcionada da presente invenção.

[0035] A expressão "alvo" ou "locus alvo" ou "região alvo" refere-se neste caso ao gene ou ao segmento de DNA selecionado para a modificação pelo método de recombinação genética direcionada da presente invenção. Normalmente, o alvo é um gene endógeno, segmento de codificação, região de controle, íntron, éxon ou uma parte destes, do organismo hospedeiro. Entretanto, o alvo pode ser qualquer parte ou partes do DNA hospedeiro.

[0036] Para as finalidades da presente invenção, a expressão "nuclease de dedo de zinco" ou "ZFN" referem-se a uma molécula de proteína quimérica que compreende pelo menos um domínio de ligação do DNA de dedo de zinco ligado eficazmente a pelo menos uma nuclease capaz de clivar o DNA. Normalmente, a clivagem por uma ZFN em um locus alvo resulta em uma ruptura de filamento duplo (DSB) nesse locus.

[0037] Para as finalidades da presente invenção, o termo "marcador" refere-se a um gene ou uma sequência cuja presença ou ausência conduz um fenótipo detectável para a célula ou organismo hospedeiro. Vários tipos de marcadores incluem, mas sem ficar a eles limitados, marcadores de seleção, marcadores de crivo e marcadores moleculares. Os marcadores de seleção são geralmente os genes que podem ser expressados para conduzir um fenótipo que torna um organismo resistente ou suscetível a um conjunto específico de condições ambientais. Os marcadores de crivo também podem conduzir um fenótipo que é um traço imediatamente observável e distinguível, tal como a Proteína Fluorescente Verde (GFP), GUS ou beta-galactosidase. Os marcadores moleculares são, por exemplo, as características da sequência que podem ser singularmente identificadas pela sondagem de oligonucteotídeo, por exemplo RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), ou marcadores de SSR (de repetição de sequência simples).

[0038] Tal como aqui empregada, a expressão "doador" ou "construto doador" refere-se ao conjunto inteiro dos segmentos de DNA a serem introduzidos na célula ou organismo hospedeiro como um grupo funcional. A expressão "DNA doador", tal como aqui empregada, refere-se a um segmento do DNA com homologia suficiente para a região do locus alvo para permitir a participação na recombinação homóloga no sítio do DSB alvo.

[0039] Para as finalidades da presente invenção, o termo "gene" refere-se a uma sequência de ácido nucléico que inclui as sequências traduzidas que codificam uma proteína ("éxons"), as sequências de intervenção não traduzidas ("íntrons"), a região não traduzida 5' e 3' e todos os elementos reguladores associados.

[0040] Para as finalidades da presente invenção, o termo "sequência" significa qualquer série de bases de ácido nucléico ou de resíduos de aminoácido, e podem ou não podem se referir a uma sequência que codifique ou denote um gene ou uma proteína. Muitos dos construtos genéticos aqui utilizados são descritos em termos das posições relativas dos vários elementos genéticos entre si. Para as finalidades da presente invenção, o termo "adjacente" é utilizado para indicar dois elementos que ficam um ao lado do outro sem implicar a fusão real dos dois elementos. Adicionalmente, para as finalidades da presente invenção, "de flanco" é utilizado para indicar que sequências iguais, similares ou correlatas existem em um ou outro lado de uma determinada sequência. Os segmentos descritos como "de flanco" não são necessariamente fundidos diretamente ao segmento que eles flanqueiam, uma vez que pode haver um DNA de intervenção não especificado entre uma determinada sequência e as suas sequências de flanco. Esses e outros termos utilizados para descrever a posição relativa são utilizados de acordo com o uso aceito normal no campo da genética.

[0041] Para as finalidades da presente invenção, o termo "recombinação" é utilizado para indicar o processo por meio do qual o material genético em um determinado locus é modificado como uma consequência de uma interação com o outro material genético. Para as finalidades da presente invenção, a expressão "recombinação homóloga" é utilizada para indicar a recombinação que ocorre em consequência da interação entre os segmentos do material genético que são homólogos, ou idênticos. Por outro lado, para as finalidades da presente invenção, a expressão "recombinação não homóloga" é utilizada para indicar uma recombinação que ocorre como uma consequência da interação entre os segmentos do material genético que não são homólogos, ou idênticos. A união de extremidade não homóloga (NHEJ) é um exemplo da recombinação não homóloga.

[0042] Além disso, para as finalidades da presente invenção, o termo "a" ou "uma" entidade refere-se a uma ou mais dessa entidade; por exemplo, "a proteína" ou "uma molécula de ácido nucléico" referem-se a um ou a mais desses compostos, ou a pelo menos um composto. Desse modo, as expressões "a" ou "uma", "uma ou mais" e "pelo menos uma" podem ser aqui utilizadas intercambiavelmente. Também deve ser observado que as expressões "que compreende", "que inclui" e "que tem" podem ser utilizadas intercabiavelmente. Além disso, um composto "selecionado do grupo que consiste em" refere-se a um ou mais dos compostos na lista a seguir, incluindo misturas (isto é, combinações) de dois ou mais dos compostos. De acordo com a presente invenção, um composto isolado ou biologicamente puro é um composto que é removido de seu meio natural. Desse modo, "isolado" e "biologicamente puro" não reflete necessariamente a extensão até a qual o composto foi purificado. Um composto isolado da presente invenção pode ser obtido de sua fonte natural, pode ser produzido ao se utilizar técnicas de biologia molecular, ou pode ser produzido pela síntese química.

Nucleases de Dedo de Zinco [0043] Uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) da presente invenção é uma molécula de proteína quimérica com capacidade de dirigir a recombinação genética direcionada ou a mutação alvo em uma célula hospedeira ao causar uma ruptura de filamento duplo (DSB) no locus alvo. Uma ZFN da presente invenção inclui um domínio de ligação de DNA e um domínio de clivagem de DNA, sendo que o domínio de ligação de DNA inclui pelo menos um dedo de zinco e é ligado operativamente a um domínio de clivagem de DNA. O domínio de ligação de DNA de dedo de zinco fica no terminal N da molécula de proteína quimérica e o domínio de clivagem de DNA fica localizado no terminal C da dita molécula.

[0044] A ZFN tal como aqui descrito deve ter pelo menos um dedo de zinco. Em uma realização preferida, uma ZFN da presente invenção deve ter pelo menos três dedos de zinco a fim de ter uma especificidade suficiente para ser útil para a recombinação genética direcionada em uma célula ou um organismo hospedeiro. Uma ZFN que compreende mais de três dedos de zinco se enquadra dentro do âmbito da invenção. Uma ZFN que tem mais de três dedos de zinco, embora leve mais tempo para ser construída, deve ter uma especificidade progressivamente maior com cada dedo de zinco adicional. Em uma realização particular, o domínio de ligação de DNA compreende três peptídeos de dedo de zinco ligados operativamente a um domínio de clivagem de DNA.

[0045] O domínio de dedo de zinco da presente invenção pode ser derivado de qualquer classe ou tipo de dedo de zinco. Em uma realização particular, o domínio de dedo de zinco compreende o tipo Cys2His2 de dedo de zinco que é representado de maneira muito geral, por exemplo, pelos fatores de transcrição de dedo de zinco TFIIIA ou Sp1. Em uma realização preferida, o domínio de dedo de zinco compreende três dedos de zinco do tipo Cys2His2. O reconhecimento e/ou a especificidade de ligação de DNA de uma ZFN podem ser alterados a fim de realizar a recombinação genética direcionada em qualquer sítio escolhido no DNA celular. Tal modificação pode ser realizada ao se utilizar técnicas de biologia molecular e/ou de síntese química conhecidas (Ver, por exemplo, M. Bibikova et al. (2002) Genetics 161: 1169-1175). As ZFNs que compreendem dedos de zinco que têm uma ampla variedade de especificidades de reconhecimento e/ou ligação de DNA estão dentro do âmbito da presente invenção.

[0046] O domínio de clivagem de DNA de ZFN é derivado de uma classe de domínios de clivagem de DNA não específicos, por exemplo, o domínio de clivagem de DNA de uma enzima de restrição do tipo II. Em uma realização particular, o domínio de clivagem de DNA é derivado da enzima de restrição do tipo II, Fokl.

[0047] Em uma realização particular, uma ZFN compreende três dedos de zinco do tipo Cys2His2, e um domínio de clivagem de DNA derivado da enzima de restrição do Tipo II, Fokl. De acordo com essa realização, cada dedo de zinco entra em contato com três pares base consecutivos de DNA, criando uma sequência de reconhecimento de 9 bp para o domínio de ligação de DNA de ZFN. O domínio de clivagem de DNA da realização requer uma dimerização de dois domínios de clivagem de DNA de ZFN para a clivagem eficaz do DNA de filamento duplo (Ver, por exemplo, J. Smith et al., (2000) Nucleic Acids Res. 28: 3361-3369) . Isto impõe um requisito para dois sítios de reconhecimento invertido (DNA alvo) dentro de bastante proximidade para a recombinação genética direcionada eficaz. Se todas as posições nos sítios alvo forem contatadas especificamente, esses requisitos acarretam o reconhecimento de um total de 18 (dezoito) pares bases de DNA. Pode haver um espaço entre os dois sítios. Em uma realização particular, o espaço entre os sítios de reconhecimento para as ZFNs da presente invenção pode ser equivalente a 6 - 35 bp de DNA. A região do DNA entre os dois sítios de reconhecimento aqui indicada como o "espaçador".

[0048] Um ligante, se estiver presente, entre os domínios de clivagem e reconhecimento do ZFN, compreende uma sequência de resíduos de aminoácido selecionados de modo que o ligante resultante seja flexível. Ou, para a especificidade de sítio alvo máxima, são formados construtos sem ligantes. Um construto sem ligante tem uma preferência forte para a ligação e então a clivagem entre os sítios de reconhecimento que ficam distanciados a 6 bp. Entretanto, com comprimentos do ligante entre de 0 e 18 aminoácidos no comprimento, a clivagem mediada por ZFN ocorre entre os sítios de reconhecimento que estão distanciados entre 5 e 35 bp. Para um determinado comprimento de ligante, deve haver um limite para a distância entre os sítios de reconhecimento que é consistente com a ligação e a dimerização (M. Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 289- 287). Em uma realização particular, não há nenhum ligante entre os domínios de clivagem e reconhecimento, e o locus alvo compreende dois sítios de reconhecimento de nove nucleotídeos na orientação invertida um com respeito ao outro, separados por um espaçador de seis nucleotídeos.

[0049] A fim de visar a recombinação ou a mutação genética de acordo com uma realização particular da presente invenção, duas sequências de reconhecimento de DNA de dedo de zinco de 9 bp devem ser identificados no DNA hospedeiro. Esses sítios do reconhecimento estarão em uma orientação invertida um com respeito ao outro e separados por aproximadamente 6 bp de DNA. As ZFNs são então geradas mediante o desenho e a produção das combinações de dedo de zinco que ligam o DNA especificamente no locus alvo, e então a ligação dos dedos de zinco a um domínio de clivagem de uma enzima de restrição do tipo II.

Recombinação ou mutação genética direcionada [0050] O método da presente invenção pode ser utilizado para a recombinação ou a mutação genética direcionada de qualquer célula ou organismo. Os requisitos mínimos incluem um método para introduzir o material genético em uma célula ou um organismo (transformação tanto estável quanto transiente), as informações em sequência a respeito da região alvo endógena, e um construto ou construtos de ZFN que reconhece e cliva o locus alvo. De acordo com algumas realizações da presente invenção, por exemplo, a recombinação homóloga, o DNA doador também pode ser requerido.

[0051] De acordo com uma outra realização da presente invenção, o DNA que codifica um marcador identificável também será incluído com o construto de DNA. Tais marcadores podem incluir um gene ou uma sequência cuja presença ou ausência conduz um fenótipo detectável para célula ou o organismo hospedeiro. Vários tipos de marcadores incluem, mas sem ficar a eles limitados, marcadores de seleção, marcadores de crivo e marcadores moleculares. Os marcadores de seleção são geralmente os genes que podem ser expressados para conduzir um fenótipo que torna um organismo resistente ou suscetível a um conjunto específico de condições ambientais. Os marcadores de crivo também podem conduzir um fenótipo que seja um traço imediatamente observável e distinguível, tal como a Proteína Fluorescente Verde (GFP), beta-glucuronidase (GUS) ou beta-galactosidase. Os marcadores também podem ser marcadores selecionáveis negativos ou positivos. Em uma realização particular, tal marcador selecionável negativo é codA. Os marcadores moleculares são, por exemplo, as características de sequência que podem ser excepcionalmente identificadas pela sondagem de oligonucleotídeo, por exemplo RFLP (polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição), ou marcadores de SSR (repetição de sequência simples).

[0052] A eficiência com a qual a recombinação homóloga endógena ocorre nas células de um determinado hospedeiro varia de uma classe da célula ou do organismo a outra. Entretanto, o uso de um método de seleção eficiente ou de um método de seleção sensível pode compensar uma taxa baixa de recombinação. Consequentemente, as ferramentas básicas para a prática da invenção estão disponíveis aos elementos versados na técnica para uma ampla gama e diversidade de células ou organismos tais que a aplicação bem sucedida de tais ferramentas para qualquer célula ou organismo hospedeiro é imediatamente previsível. As composições e os métodos da presente invenção podem ser projetados para introduzir uma mutação ou recombinação genética direcionada em qualquer célula ou organismo hospedeiro. A flexibilidade da presente invenção permite a manipulação genética a fim de criar modelos genéticos de doença ou investigar a função do gene.

[0053] As composições e os métodos da presente invenção também podem ser utilizados para efetuar a recombinação ou mutação genética direcionada em uma célula de mamífero. Além disso, uma ZFN pode ser projetada para clivar um gene particular ou um locus cromossomal, o qual é injetado então em um embrião isolado antes do reimplante em uma fêmea. A clivagem do DNA mediada por ZFN pode ocorrer tanto na presença quanto na ausência do DNA doador. A prole é selecionada então para a alteração genética desejada.

[0054] As composições e os métodos da presente invenção também podem ser utilizados para executar a terapia de gene de linhagem germinativa em mamíferos. Em uma realização, as ZFNs podem ser projetadas para visar genes particulares de interesse. Os ovos e o esperma podem ser coletados e executada a fertilização in vitro. No estágio do zigoto, o embrião pode ser tratado com uma ZFN projetada para visar uma sequência particular e um segmento de DNA doador contendo uma sequência sem a mutação nociva. O embrião pode então ser retornado a uma fêmea ou a uma alternativa uterina para o restante do período de gestação. Em uma realização particular, por exemplo, o gene nocivo é o alelo delta F508 de fibrosa cística (CF) comum. As ZFNs e o DNA doador são utilizado de acordo com os métodos da presente invenção a fim de aliviar a doença causada por um gene mutante. De acordo com o método, os ovos e o esperma dos progenitores portadores conhecidos são coletados e fertilizados in vitro. Depois da fertilização in vitro, o zigoto pode ser injetado com as ZFNs projetadas para visar o delta alelo F508, e com o DNA doador que contém o alelo do tipo selvagem. O zigoto transformado pode então ser reimplantado na mãe. Com as composições e os métodos da presente invenção, tal substituição do gene deve permitir que a prole e todos os descendentes fiquem livres da mutação de CF.

[0055] Em uma outra realização, a recombinação homóloga pode ser utilizada tal como segue. Primeiramente, um sítio para a integração é selecionado dentro da célula hospedeira. As sequências homólogas àquelas localizadas a montante e a jusante do sítio de integração são incluídas então em um construto genético, flanqueando o gene selecionado a ser integrado no genoma. Flanqueando, neste contexto, significa simplesmente que as sequências homólogas alvo são localizadas tanto a montante (5') quanto a jusante (3') do gene selecionado. O construto é então introduzido na célula, desse modo permitindo a recombinação entre as sequências celulares e o construto.

[0056] Como uma medida prática, o construto genético vai agir normalmente como muito mais do que um veículo para inserir o gene no genoma. Por exemplo, é importante poder selecionar os recombinantes e, consequentemente, é comum incluir dentro do construto um gene de marcador selecionável. O marcador permite a seleção das células que integraram o construto em seu DNA genômico. Além disso, a recombinação homóloga pode ser utilizada para "eliminar" (deletar) ou interromper um gene particular. Desse modo, uma outra abordagem para inibir a expressão do gene envolve o uso de recombinação homóloga, ou "tecnologia de eliminação". Isto é obtido mediante a inclusão de uma forma mutada ou bastante deletada do gene heterólogo entre as regiões de flanqueio dentro do construto. Desse modo, é possível, em um único evento de recombinação, (i) "eliminar" um gene endógeno, (ii) empregar um marcador selecionável para identificar tal evento e (iii) introduzir um transgene para a expressão.

[0057] A frequência da recombinação homóloga em qualquer célula é influenciada por uma série de fatores. As células ou os organismos diferentes variam com respeito à quantidade de recombinação homóloga que ocorre em suas células e a proporção relativa da recombinação homóloga que ocorre também é variável com as espécies. O comprimento da região de homologia entre o doador e o alvo afeta a frequência de eventos de recombinação homóloga, quanto mais longa a região de homologia, maior a frequência. O comprimento da região de homologia necessário para observar a recombinação homóloga também é específico da espécie. Entretanto, as diferenças na frequência de eventos de recombinação homóloga podem ser compensadas pela sensibilidade da seleção para as recombinações que ocorrem de fato. Deve ser apreciado que os limites absolutos para o comprimento da homologia de doador-alvo ou para o grau da homologia de doador-alvo não podem ser fixos mas dependem do número dos eventos potenciais que podem ser marcados e da sensibilidade da seleção para os eventos de recombinação homóloga. Onde é possível selecionar 109 eventos, por exemplo, em células cultivadas, uma seleção que possa identificar uma recombinação em 109 células deverá apresentar resultados úteis. Onde o organismo é maior, ou tem um tempo de geração mais longo, de maneira tal que somente 100 indivíduos podem ser marcados em um único teste, a frequência de recombinação deve ser mais elevada e a sensibilidade da seleção é menos crítica. O método da presente invenção aumenta drasticamente a eficiência da recombinação homóloga na presença do DNA doador extracromossomal (vide os Exemplos). A invenção pode ser executada mais imediatamente no caso das células ou organismos que têm tempos de geração rápidos ou para os quais se dispõe de sistemas de seleção sensíveis, ou para os organismos que são unicelulares ou para os quais existem linhagens de células pluripotentes que podem ser desenvolvidas na plantação e que podem ser regeneradas ou incorporadas em organismos adultos. O tempo de geração rápido é a vantagem demonstrada para a mosca de frutas, Drosophila, na presente invenção. As células de planta, Arabidopsis, são um exemplo de células pluripotentes que podem ser desenvolvidas na plantação e então regeneradas ou incorporadas em um organismo intato, e de tabaco são um outro exemplo. Essas células ou organismos são representantes de suas classes respectivas e a descrição demonstra como a invenção pode ser aplicada por todas essas classes. Deve ficar compreendido pelos elementos versados na técnica que a invenção é operativa independente do método utilizado para transformar o organismo. Adicionalmente, o fato que a invenção é aplicável a tais organismos díspares tais como plantas e insetos demonstra a aplicabilidade ampla da invenção aos organismos vivos de maneira geral.

Distribuição de Ácido Nucléico [0058] A transformação pode ser realizada por uma variedade de técnicas conhecidas que dependem dos requisitos particulares de cada célula ou organismo. Tais técnicas foram elaboradas para um número de organismos e células, e podem ser adaptadas sem experimentação inadequada a todas as outras células. A transformação estável envolve a entrada do DNA nas células e no núcleo da célula. Para os organismos unicelulares e os organismos que podem ser regenerados de células simples (que incluem todas as plantas e alguns mamíferos), a transformação pode ser efetuada na cultura in vitro, seguida pela seleção para transformantes e a regeneração dos transformantes. Os métodos normalmente utilizados para transferir o DNA ou o RNA para as células incluem a formação de complexos de DNA ou de RNA com lipídios catiônicos, lipossomas ou outros materiais carreadores, micro-injeção, bombardeio com pistola de partículas, eletroporação, e a incorporação de DNA ou RNA de transformação em vetores de vírus. Outras técnicas são bem conhecidas no estado da técnica.

Exemplos de alguns sistemas de distribuição úteis na prática da presente invenção Formulações lipossomais: [0059] Em determinadas realizações amplas da invenção, os oligo- ou polinucleotídeos e/ou os vetores de expressão que contêm ZFNs e, onde apropriado, o DNA doador, podem ser aprisionados em um lipossoma. Os lipossomas são estruturas vesiculares caracterizadas por uma membrana de duas camadas de fosfolipídio e um meio aquoso interno. Os lipossomas multilamelares têm múltiplas camadas de lipídio separadas pelo meio aquoso. Eles se formam espontaneamente quando os fosfolipídios são suspensos em um excesso da solução aquosa. Os componentes lipídicos passam por um auto-rearranjo antes da formação de estruturas fechadas e aprisionam a água e os solutos dissolvidos entre as camadas duplas de lipídio.

Também são contemplados os complexos de lipídio catiônico e ácido nucléico, tais como os complexos de lipofectamina e ácido nucléico. Os lipídios apropriados para o uso de acordo com a presente invenção podem ser obtidos junto a fontes comerciais. Os lipossomas utilizados de acordo com a presente invenção podem ser produzidos por métodos diferentes, e tais métodos são conhecidos 5 no estado da técnica. O tamanho dos lipossomas varia dependendo do método de síntese.

Microinieção: [0060] A microinjeção direto de DNA em várias células, incluindo as células do ovo ou do embrião, também têm sido empregadas eficazmente para a transformação de muitas espécies. No camundongo, a existência de células tronco embriônicas (ES) pluripotentes que podem ser cultivadas in vitro tem sido explorada para gerar camundongos transformados. As células ES podem ser transformadas em cultura, e a seguir micro-injetadas em blastocistos de camundongo, onde se integram no embrião em desenvolvimento e por fim geram quimeras de linhagem germinativa. Com o interdesenvolvimento de irmãos heterozigóticos, os animais homozigóticos que contêm o gene desejado podem ser obtidos.

Adenovírus: [0061] Os adenovírus humanos são vírus de tumor de DNA de filamento duplo com tamanhos de genoma de aproximadamente 36 Kb. Como um sistema modelo para a expressão de gene eucariótico, os adenovírus foram estudados extensamente e bem caracterizados, o que faz com que eles constituam um sistema atraente para o desenvolvimento de adenovírus como um sistema de transferência de genes. Esse grupo de vírus é fácil de cultivar e manipular, e eles exibem uma ampla gama de hospedeiros in vitro e in vivo. Em células liticamente infectadas, os adenovírus são capazes de encerrar a síntese de proteína do hospedeiro, dirigindo as maquinarias celulares para que sintetizem grandes quantidades de proteínas virais, e para que sejam produzidas quantidades copiosas de vírus.

[0062] As vantagens particulares de um sistema de adenovírus para distribuir o DNA que codifica proteínas estranhas a uma célula incluem (i) a capacidade de substituir partes relativamente grandes de DNA viral por DNA estranho; (ii) a estabilidade estrutural de adenovírus recombinantes; (iii) a segurança da administração adenoviral aos seres humanos; e (iv) a falta de qualquer associação conhecida de infecção adenoviral com o câncer ou malignidades; (v) a capacidade de obter títulos elevados de vírus recombinante; e (v) a infectividade elevada do adenovírus.

[0063] Geralmente, os sistemas de transferência de gene de adenovírus são baseados no adenovírus criado recombinante, o qual que se torna incompetente na replicação pela deleção de uma parte de seu genoma, tal como El, e, no entanto, ainda mantém a sua competência para a infecção. As sequências que codificam proteínas estranhas relativamente grandes podem ser expressadas quando deleções adicionais são feitas no genoma do adenovírus. Por exemplo, os adenovírus suprimidos em ambas as regiões El e E3 podem conter até 10 kB de DNA estranho e podem ser cultivados até títulos elevados em 293 células.

Outros Vetores Virais Como Construtos de Expressão.

[0064] Outros vetores virais podem ser empregados como construtos de expressão na presente invenção. Os vetores derivados de, por exemplo, vírus de vaccinia, vírus adeno-associados (AAV), e os vírus de herpes podem ser empregados. Os vírus defeituosos de hepatite B podem ser utilizados para a transformação de células hospedeiras. Os estudos in vitro mostram que o vírus pode manter a capacidade de envolvimento dependente de auxiliar e a transcrição reversa apesar da deleção de até 80% de seu genoma. Partes potencialmente grandes do genoma viral podem ser substituídas por material genético estranho. O hepatotropismo e a persistência (integração) são propriedades particularmente atraentes para a transferência de gene dirigida para o fígado. O gene de cloranfenicol acetil transferase (CAT) foi introduzido com sucesso no genoma do vírus de hepatite B de pato em lugar das sequências de codificação de polimerase viral, de superfície e de pré-superfície. O vírus defeituoso foi cotransfectado com vírus do tipo selvagem em uma linhagem de células de hepatoma de aves, e o meios de cultura contendo títulos elevados do vírus recombinante foram utilizados para infectar os hepatócitos primários de patinhos. A expressão estável do gene de CAT foi detectada subsequentemente. Métodos Não Virais.

[0065] Diversos métodos não virais são contemplados pela presente invenção para a transferência para uma célula hospedeira de construtos de DNA que codificam ZFNs e, quando apropriado, DNA doador. Estes incluem a precipitação de fosfato de cálcio, complexos de lipofectamina-DNA, e a transfecção mediada por receptor. Algumas destas técnicas podem ser adaptadas com êxito para o uso in vivo ou ex vivo.

[0066] Em uma realização da invenção, o construto de expressão pode simplesmente consistir em DNA recombinante despido. A transferência do construto pode ser efetuada por quaisquer dos métodos de transferência de DNA mencionados acima que permeabilizam física ou quimicamente a membrana da célula. Por exemplo, o DNA de poliomavírus na forma de precipitados de CaP04 foi injetado com sucesso no fígado e no baço de camundongos recém nascidos e adultos, o que demonstrou então a replicação viral ativa e a infecção aguda. Além disso, a injeção intraperitoneal direta de vetores de expressão de plasmídio precipitados por CaP04 resulta na expressão dos genes transfectados.

Transformação de Plantas: [0067] As plantas transformadas são obtidas por um processo de transformação de plantas inteiras, ou mediante a transformação de células simples ou amostras do tecido em plantas inteiras de cultura e regeneração das células transformadas. Quando as células de germe ou as sementes são transformadas não há nenhuma necessidade de regenerar as plantas inteiras, uma vez que as plantas transformadas podem ser desenvolvidas diretamente da semente. Uma planta transgênica pode ser produzida por quaisquer os meios conhecidos no estado da técnica, incluindo, mas sem ficar a elas limitados, a transferência de DNA mediada por Agrobacterium tumefaciens, preferivelmente com um vetor de T-DNA desarmado, a eletroporação, a transferência direta de DNA, e um bombardeio de partículas. As técnicas são bem conhecidas no estado da técnica para a introdução do DNA em monocotoledôneas bem como dicotiledôneas, bem como são as técnicas para a cultura de tais tecidos de plantas e a regeneração desses tecidos. A regeneração de plantas transformadas inteiras das células ou do tecido transformado foi executada na maior parte dos gêneros de plantas, monocotiledôneas e dicotiledôneas, incluindo todas as plantações agronomicamente importantes.

Seleção para Mutações [0068] Os métodos para a seleção genética para detectar com exatidão as mutações em amostras de DNA, cDNA ou RNA genômicos podem ser empregados, dependendo da situação específica. Uma série de métodos diferentes foi utilizada para detectar as mutações de ponto, incluindo a eletroforese com gel de gradiente de desnaturação ("DGGE"), a análise de polimorfismo de enzima de restrição, métodos de clivagem química e enzimática, e outros. Os procedimentos mais comuns atualmente em uso incluem o sequenciamento direto das regiões alvo amplificadas por PCRTM e a análise de polimorfismo de conformação de filamento simples ("SSCP"). O SSCP é baseado nas diferentes mobilidades de moléculas de ácido nucléico de um só filamento de sequência diferente na eletroforese com gel. As técnicas para a análise de SSCP são bem conhecidas no estado da técnica.

[0069] Um outro método de seleção para as mutações de pontos é baseado na clivagem de RNase de incompatibilidade de pares em heteroduplexos de RNA/DNA e de RNA/RNA. Tal como aqui utilizada, o termo "incompatibilidade" é definido como uma região de um ou mais nucleotídeos não emparelhados ou mal emparelhados em uma molécula de RNA/RNA, de RNA/DNA ou de DNA/DNA de filamento duplo. Essa definição inclui desse modo as incompatibilidades devidas às mutações de inserção/deleção, bem como as mutações de pontos de uma só base e de múltiplas bases.

EXEMPLOS

[0070] Os seguintes exemplos são incluídos para demonstrar as realizações preferidas da invenção. Deve ser apreciado pelos elementos versados na técnica que as técnicas apresentadas nos exemplos a seguir representam as técnicas descobertas pelos autores da invenção para funcionar bem na prática da invenção, e desse modo podem ser consideradas como constituindo os modos preferidos para a sua prática. Entretanto, os elementos versados na técnica, à luz da presente descrição, devem apreciar o fato que muitas mudanças podem ser feitas nas realizações específicas que são apresentadas e ainda obter um resultado semelhante ou similar sem que se desvie do caráter e âmbito da invenção.

Exemplo 1 - Indução de Mutações Alvo Desenho da Dedo de Zinco [0071] Um par de ZFNs foi desenhado e construído para um locus cromossoma alvo (y) no gene amarelo de Drosophila. Os dedos de zinco se ligam geralmente de preferência às regiões ricas em G do DNA, e foi realizado um estudo extensivo dos dedos que ligam todos os triplos de 5'-GNN-3 (Segal ef al. (1999) PNAS USA 96:2758-2763). Devido ao fato que os sítios de ligação devem estar em uma orientação invertida uns com respeito aos outros para a clivagem eficaz pelas ZFNs (Bibikova ef al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297), o locus cromossomal alvo da Drosophila (y) foi vasculhado por sequências de reconhecimento invertido da forma (NNC)3...(GNN)3. Tal sítio foi identificado no éxon 2 com uma separação de 6 bp entre os sítios de reconhecimento do 9-mer componente, que é o espaçador ideal para o reconhecimento específico e a clivagem pelas ZFNs que não têm nenhum ligante ou espaçador adicionado entre os domínios de ligação e clivagem (M. Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21 : 289-287). As sequências de reconhecimento específicas das duas ZFNs são descritas em Bibikova et al. 2002, Genetics 161: 1169-1175. Os DNAs que codificam os dedos de zinco que reconhecem a sequência de DNA, 5'-GCGGATGCG-3' (SEQ ID NO:1) e 5'-GCGGTAGCG-3' (SEQ ID No.2), foram obtidos junto aos Drs. David Segal e Carlos Barbas (Scripps Research Institute, La Jolla, CA) (Segal, D. J., et al. (1999) PNAS 96, 2758-2763). Os DNAs que codificam os dedos de zinco foram então modificados ao se utilizar primers de PCR mutagênicos, e dois conjuntos de três dedos de zinco cada um foram produzidos: um, indicado como yA, que reconhece um dos 9-mers componentes do gene y alvo (5'-GTGGATGAG-3' (NO. SEQ do ID:3)) e outro, indicado como yB, que reconhece o outro 9-mer componente do gene y alvo (5'-GCGGTAGGC-3' (NO. SEQ do ID: 4)). Dois dedos foram modificadas em yA mas somente uma em yB. Os DNAs que codificam cada um dos conjuntos de três dedos resultantes dos dedos de zinco foram ambos clonados na estrutura com o domínio de clivagem de DNA Fokl no plasmídio de expressão pET15b, sem nenhum DNA de ligante de intervenção entre os domínios de reconhecimento de DNA e de clivagem. Ambas as proteínas de ZFN quiméricas foram expressadas, purificadas através de cromatografia de afinidade de Ni, e testadas quanto à atividade de clivagem in vitro por métodos descritos previamente em (Smith, J., et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28, 3361-3369; e Bibikova, M., et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21, 289-297), utilizando o plasmídio pS/G (Geyer, P. K. & Corces, V. G. (1987) Genes Dev. I, 996-1004), o qual contém o gene y completo. Juntas, as duas ZFNs formaram uma única ruptura de filamento duplo (DSB) no sítio esperado em um DNA do plasmídio 10,7-kb contendo o gene y.

Vetores de elemento P e transformação de larvas de mosca.

[0072] As sequências de codificação de ZFN de yA e yB foram então clonadas separadamente atrás do promotor de choque térmico de Drosophila Hsp70 pela inserção do DNA de ZFN entre os sítios BamHl e Sall de um plasmídio phsp70 modificado (Petersen, R. B. & Lindquist, S. (1989) Cell. Regul. 1, 135-149). Um fragmento contendo o promotor de choque térmico e as sequências de DNA de ZFN foi excisado pela digestão parcial de HindIII e pela digestão completa de Apal e clonado entre esses mesmos sítios de endonuclease no vetor de clonagem comercialmente disponível, pBluescript (Mismer, D. & Rubin, G. M. (1987) Genetics 116, 565-578). Depois da verificação da sequência de inserção, ele foi excisado pela digestão com Notl e foi inserido no vetor pDM30 de elemento ry+ P. Os plasmídios yA e yB resultantes foram injetados separadamente em embriões v ry, junto com o plasmídeo de expressão de P-transposase pn25.lwc, e os adultos da eclosão foram cruzados para selecionar os transformantes da linhagem germinativa ry+. A inserção de ry+ foi mapeada para um cromossoma específico para múltiplos transformantes independentes com cada ZFN. Estoques tanto balanceados quanto homozigóticos foram criado para diversas linhagens contendo yA e yB sem problemas de viabilidade na maioria dos casos. Os genes para as duas ZFNs foram unidos (tal como descrito nos exemplos a seguir) com cruzamentos apropriados de moscas maduras, e a prole foi submetida ao choque térmico quatro dias após a iniciação do cruzamento mediante a imersão dos frascos de vidro contendo as moscas em um banho de água a 35oC por uma hora. À medida que os adultos iram eclodindo, eles foram selecionados quanto à evidência de mutações y somáticas. Os frascos de controle dos cruzamentos envolvendo cada nuclease foram submetidos separadamente ao choque térmico, e as moscas yA + yB que não tinham sido submetidas ao choque térmico também foram selecionadas.

Recuperação de mutantes de linhagem germinativa.

[0073] Todas as moscas emergentes do protocolo de choque térmico e contendo ambas as nucleases yA e yB foram cruzadas para revelar as mutações potenciais de linhagem germinativa. Os machos foram cruzados com duas ou três fêmeas X[C(1)DX], e a prole masculina resultante foi selecionada quanto à coloração amarela do corpo. As fêmeas foram cruzadas com dois ou três machos y (FM6), e a prole resultante de ambos os gêneros foi selecionada. Os mutantes foram identificados e todos eram os machos que tinham sido originados de pais machos. Essa prole macho mutante identificada foi cruzada então com fêmeas C(1)DX para produzir a progênie adicional contendo a mesma mutação.

Análise do DNA.

[0074] A presença ou a ausência do DNA alvo foram identificadas pela análise do DNA. Moscas individuais foram homogeneizadas em 100 μΐ de uma mistura 1:1 de fenol e tampão de trituração (uréia 7 M, 2% de SDS, 10 mM de Tris, pH 8,0, 1 mM de EDTA, NaCl 0,35 M) pré-aquecida até 60oC. Cada amostra foi extraída com 50 μl de clorofórmio, a fase orgânica foi retroextraída com 100 μl de tampão de trituração, e as fases aquosas combinadas foram extraídas novamente com 50 μl de clorofórmio. O DNA foi precipitado com etanol e dissolvido novamente em 20 μl de 10 mM de Tris, pH 8,5. Um fragmento de DNA de 600 bp foi amplificado por PCR com primers flanqueando o sítio de reconhecimento de yA + de yB. Os primers foram denominados YF2(5'ATTCCTTGTGTCCAAAATAATGAC-3' (SEQ ID NO:5)) e YR3 (5'- AAAATAGGCATATGCATCATCGC3' (SEQ ID NO:6)). Para as deleções maiores, YR3 foi utilizado em combinação com uma sequência mais distante, YFI (5'ATTTTGTACATATGTTCTTAAGCAG-3' (SEQ ID NO:7)). Os fragmentos amplificados foram recuperados após a eletroforese gel, e as sequências de DNA foram determinadas na University of Utah DNA Sequencing Core Facility com um sequenciador capilar AB13700 e o primer YR3.

Indução de Mutações y Alvo Resultantes de Rupturas de Filamentos Duplos e União de Extremidade Não Homóloga [0075] Foi verificado que os níveis da expressão de YA induzido a 37oC, em diversos transformantes independentes, são letais quando aplicados em estágios larvais e embriônicos. A moderação do choque térmico a 35oC permitiu a sobrevivência de uma boa proporção das moscas contendo yA. A ZFN de yB não afetou a viabilidade em nenhuma temperatura testada.

[0076] Depois que as moscas individuais contendo as nucleases yA e yB no mesmo cromossoma foram cruzadas e a sua progênie submetida ao choque térmico, uma prole demonstrou o mosaico y, bem como mutações da linhagem germinativa foram observadas na prole masculina. Nos machos (exceto na replicação de DNA seguinte), somente a religação simples ou NHEJ estava disponível para reparar os danos após um DSB. Na Drosophila, bem como em muitos outros eucariotas, a NHEJ produz frequentemente deleções e/ou inserções no sítio de união. Uma vez que o DSB é o alvo para as sequências de codificação de proteína em y+, a maior parte de tais alterações deve levar a trocas de estrutura ou à deleção dos códons essenciais, o que pode conduzir a um fenótipo de remendos do tecido y mutante.

[0077] Os mosaicos amarelos somáticos foram identificados em múltiplos machos yA + yB. A maior parte dos remendos estava na cutícula abdominal distal e nas cerdas, mas alguns exemplos na perna, na asa e em cerdas escutelares também foram observados. Nenhum outro defeito fenotípico foi observado em uma base regular. A frequência de mosaicos somáticos era bastante elevada. Nos dados coletados dos cruzamentos que envolvem um número de linhagens yA e yB independentes, 105 de 228 machos candidatos (46%) apresentaram remendos y óbvios. Para algumas combinações de yA + yB, a frequência foi maior do que 80%. Nenhum mosaico amarelo foi observado nos controles com uma única nuclease ou sem choque térmico. Isto indica que as ZFNs de yA + yB são capazes de induzir mutações somáticas em seu alvo designado.

Caracterização de mutações y de linhagem germinativa.

[0078] Para isolar as mutações y de linhagem germinativa, todos os machos yA + yB de diversas experiências de choque térmico foram cruzados com fêmeas contendo um cromossoma X[C(1)DX/Y], a fim de produzir a prole masculina, sendo que foi verificado que estes recebem somente o cromossoma X de seu pai. No total, 228 pais machos resultaram 5.870 filhos; 26 da prole masculina, de 13 pais diferentes, eram claramente y por todos os seus corpos. Desse modo, 5,7% dos pais machos yA + yB produziram pelo menos um mutante de linhagem germinativa. Dos treze pais, seis tinham sido identificados como tendo remendos y somáticos, enquanto que os outros sete pareciam ser inteiramente y+ em características de diagnósticas. Nenhuma mosca y foi isolada entre 7050 da progênie de 125 fêmeas de yA + yB submetidas ao choque térmico cruzadas com machos y. As ZFNs parecem ser eficazes na indução de mutações através de NHEJ mais eficientemente na linhagem germinativa masculina.

[0079] O DNA foi isolado dos treze pais identificados acima e de cinco machos adicionais a fim de analisar cada um deles quanto à presença do DNA alvo. Um fragmento de 600 bp incluindo o sítio de clivagem esperado foi amplificado através de PCR. Em três das dezoito moscas macho, o sítio de ligação para um dos primers tinha sido deletado, e um primer novo teve que ser gerado a fim de executar a amplificação. Esse primer novo ficou localizado em uma posição mais distante. A análise da sequência de todos os fragmentos revelou alterações singulares precisamente no sítio alvo. Nove dos mutantes arranjados em sequência tiveram deleções simples; cinco tiveram as deleções acompanhadas por inserções; e três eram duplicações curtas simples. Três das deleções se estenderam por centenas de bps para um lado do alvo e essas eram as três amostras que requereram um desenho de um novo primer. Esses são exatamente os tipos de mutações que se esperava resultassem de NHEJ após a clivagem pelas ZFNs de yA + yB, e são muito similares àqueles produzidos após a excisão do elemento P. Algumas das mutações y de mudança da estrutura criaram um códon de bloqueio dentro de uma distância curta da alteração, enquanto que uma inseriu um códon de asparagina na estrutura de leitura normal.

Clivagem e mutagênese direcionada.

[0080] Este exemplo demonstrou que as ZFNs podem ser projetadas para produzir DSBs no locus cromossomal alvo em um genoma exemplificador a fim de produzir uma alteração genética permanente. A frequência de mutação somática observada era bastante elevada, e o número real de mosaicos somáticos pode ser ainda mais elevado, uma vez que as mutações y não têm nenhum efeito em muitas características visíveis. Isto foi corroborado pela recuperação de mutações de linhagem germinativa de pais fenotipicamente y+.

[0081] Neste Exemplo particular, as mutações de linhagem germinativa foram recuperadas somente nos machos e a uma frequência mais baixa do que os mosaicos somáticos.

Exemplo 2: Rupturas de filamentos duplos induzidas por ZFN estimulam a recombinação genética direcionada na presença de DNA doador homólogo Desenho da Dedo de Zinco e do DNA Doador [0082] Um par de ZFNs foi projetado e construído para um locus cromomossomal alvo no gene amarelo (y) de Drosophila tal como descrito no Exemplo 1.

[0083] A fim de produzir um DNA doador identificável para o gene de Drosophila, y, os sítios de reconhecimento yA e yB para as ramificações de zinco foram substituídos por dois códons de bloqueio na estrutura e um sítio Xhol. Essas mudanças foram introduzidas pela amplificação com primers PCR contendo a sequência desejada. Com relação ao tipo selvagem y, 21 bp foram suprimidos restando somente 3 bp do sítio de reconhecimento yA, e uma substituição de 9 bp inseriu os dois códons de bloqueio na estrutura e inseriu o sítio Xhol. Esse mutante (yM) contém um total de 8 kb de homologia para o locus de y. Ele foi inserido em um vetor de elemento P e introduzido no genoma da mosca. A sequência de yM é flanqueada por sítios de reconhecimento para a recombinase de FLP (FRT) e a meganuclease 1-Scel para permitir a excisão e a linearização do doador. Foi verificado que a geração de um DNA doador extracromossomal linear in situ por este meio aumenta a sua eficácia na recombinação (Y.S. Rong and K.G. Golic, Science 288, 2013-2018 (2000)).

Desenho Experimental [0084] O desenho da experiência de recombinação genética direcionada é tal como segue: O alvo y+ encontra-se no cromossoma X. Os transgenes para as ZFNs de yA e yB encontram-se em um cromossoma 2, enquanto que aqueles para FLP e/ou I-Scel (quando presente) encontram-se no outro cromossoma 2. O DNA doador (yM) fica localizado no cromossoma 3 em um vetor do elemento p que também contém o gene branco (W+). Cada um desses genes inseridos está sob o controle de um promotor de Drosophila HSP70. Com a indução de choque térmico, as ZFNs cortam o seu alvo em y. Esse cromossoma rompido pode ser restaurado ao tipo selvagem, ou pode adquirir uma mutação y por NHEJ ou então pela recombinação homóloga. Quando nem FLP nem I-Scel está presente, o doador permanece integrado. Quando FLP é expressado, o doador é excisado como um círculo extracromossomal. Quando I-Scel também é expressado, ele converte o doador em uma molécula linear fora das extremidades que pode recombinar com o locus clivado alvo. As experiências também foram realizadas com o doador linear somente na ausência de YA e yB (e portanto sem a clivagem do alvo).

[0085] As larvas que contêm cópias simples desses componentes de DNA introduzidos foram submetidas ao choque térmico a 35oC, por uma hora, em 0-4 dias após terem postos os ovos. A experiência continha cinco grupos tal como exemplificado abaixo: ND, nenhum doador: YA + yB apenas; ID, doador integrado: yA + yB + doador, nenhum FLP ou I- Scel; CD, doador extracromossomal circular: yA + yB + FLP + doador; LD, doador extracromossomal linear: yA + yB + FLP + I-Scel + doador; DO, doador linear apenas: FLP + I-Scel + doador, mas nenhum ZFN.

[0086] Os adultos que emergem do protocolo de choque térmico foram cruzados para revelar mutações y de linhagem germinativa. As frequências das mutações y de linhagem germinativa que resultam do tratamento de choque térmico são mostradas na Tabela 1 na coluna 3. As frequências de mutação se elevaram em machos e em fêmeas na presença do doador, e a frequência aumentou ainda mais com DNA extracromossomal e linear. Com DNA extracromossomal linear, quase 20% dos machos e 14% das fêmeas 20 resultaram em pelo menos uma prole mutante.

[0087] As mutações y foram propagadas em outros cruzamentos, e o DNA cromossomal foi recuperado. A frequência de mutantes y de linhagem germinativa e a proporção devida a NHEJ ou à recombinação homóloga com o DNA doador foi determinada por uma amplificação PCR de 600 bp de DNA incluindo a região alvo do gene y seguida pela digestão de Xhol do produto amplificado. Os produtos da recombinação homóloga entre o doador e o alvo foram reconhecidos pela digestão de Xhol do fragmento de PCR; alguns destes e muitos dos produtos resistentes a Xhol foram arranjados em sequência. Estes últimos exibiram deleções e/ou inserções pequenas e ocasionalmente deleções maiores, toadas as quais são características de NHEJ.

[0088] A quarta coluna da Tabela 1 relata a recuperação de mutantes de linhagem germinativa como uma porcentagem de qualquer prole. As frações dessas mutações resultantes de NHEJ ou da recombinação homóloga com o doador surgiram quando o DNA doador ficou mais eficaz na participação na recombinação homóloga: o DNA doador linear é mais eficaz do que o DNA doador circular, que foi mais eficaz do que o DNA doador integrado. O doador integrado, localizado no cromossoma 3, não foi muito eficaz no papel de um molde para o reparo da ruptura em y e a maior parte das mutações recuperados era devida a NHEJ. O doador circular foi muito mais eficaz e foi determinado que aproximadamente 1/3 de todas as mutações era devido às substituições de genes. Com o doador linear, mais de 2% de todos os filhos dos machos eram mutantes, e 63% destes eram produtos da recombinação homóloga. Na linhagem germinativa fêmea 73% das mutações y eram substituições homólogas. A clivagem alvo por ZFNs quiméricas estimula a recombinação genética direcionada de maneira substancial, e a maneira mais eficaz para integrar o DNA doador no genoma de um organismo hospedeiro é com o DNA doador linear.

[0089] Os resultados da recombinação genética direcionada induzida por ZFN diferem daqueles obtidos sem a clivagem alvo em diversos respeitos. Primeiramente, as mutações induzidas foram encontradas nas linhagens de germes masculinos e femininos, enquanto que somente as fêmeas tinham resultado em frequências boas em experimentações precedentes por outros pesquisadores. Aparentemente, a presença de um DSB no alvo ativa processos de recombinação nos machos que não são eficientes em cromossomas intatos. As frequências de escolha de alvos mais baixas observadas nas fêmeas podem refletir a possibilidade de reparar a ruptura pela recombinação com um cromossoma X homólogo não cortado. Em segundo lugar, a frequência total de mutações induzidas foi aproximadamente 10 (dez) vezes maior nos machos nas experiências com DNA linear e DNA circular do que foi observado anteriormente nas fêmeas y com um doador nas extremidades: aproximadamente 1/50 gametas, comparados com 1/500 gametas. Até mesmo na linhagem germinativa fêmea, a frequência de mutações induzidas por ZFN era de 1/200 gametas, e 3/4 destes eram substituições de genes. Desse modo, a presença de um doador homólogo não impossibilita a interação com o doador extracromossomal. Em terceiro lugar, as deleções e as inserções devidas a NHEJ também foram observadas, além dos recombinantes homólogos alvos. Tais produtos não eram esperados nem não foram observados na ausência da clivagem alvo.

Exemplo 3: Expressão de ZFNs quiméricas em Arabidopsis a fim de estimular a indução de mutações alvo.

Desenho Experimental: [0090] O método da presente invenção será utilizado para visar e eliminar o gene TRANSPARENT TESTA GLABRA1 de Arabidopsis (TTG1, gene número AT5G24520 (número AJ133743 do GenBank). Um EST para esse gene foi arranjado em sequência (números F20055, F20056 do GenBank). O gene codifica uma proteína que contém repetições de WD40 (Walker et al. (1999) Plant Cell 11, 1337-1349).

[0091] Dois construtos de DNA quiméricos serão gerados, os quais consistem na (1) sequência de ácido nucléico que codifica a região do promotor do gene HSP18.2 de Arabidopsis e (2) a sequência de ácido nucléico que codifica as proteínas de dedo de zinco específicas para o gene TTG1 ligado operativamente a uma sequência de ácido nucléico que codifica uma endonuclease não específica. O promotor HSP18.2 vai conferir expressão em Arabidopsis e a expressão do gene será controlada mediante a sujeição de choque térmico às plantas resultantes. Os genes quiméricos serão referidos como HS::ZmTTG1A e HS::ZnTTG1B. Estes dois genes podem ser incorporados no mesmo vetor Agrobacterium.

[0092] Todas as nossas experiências serão realizadas usando o modelo de organismo genético Arabidopsis thaliana, porque um número de características desejáveis deste sistema incluindo tamanho reduzido, genoma pequeno, e crescimento rápido. A mutante ttg1 tem um fenótipo distintivo, o que o torna um excelente modelo exemplar. Por exemplo, mutantes ttg1 são glabros e as plantas mutantes carecem tricomas em folhas e caules. Tricomas são apêndices externos tipo cabelos da epiderme.

[0093] Adicionalmente, os mutantes ttg1 são defeituosos na produção de flavonoides. Flavonoides são uma classe complexa de compostos incluindo pigmentos roxos de antocianina e taninos. Proteína TTG1 positivamente regula a síntese da enzima dihidroflavonol redutase, que é requerida para a produção de ambos antocianina quanto taninos (Shirley et al. (1995) Plant Journal 8: 659-671, Pelletier e Shirley (1996) Plant Physiology 111: 339-345).

[0094] Estes mutantes ttg1 também possuem uma testa transparente ou revestimento de semente. Na do tipo selvagem, o revestimento de semente (camada interna do tegumento interior) possui tanino marrom denso, e mutantes ttg1 carecem deste pigmento. Como consequência, o revestimento de semente da semente coletada de mutantes ttg1 são transparentes, e a semente coletada de mutantes ttg1 são amarelas, pois os embriões amarelos mostram através do revestimento de semente transparente.

[0095] Estes mutantes ttg1 também carecem de antocianinas. Na do tipo selvagem, mudas, caules, e folhas produzem pigmentos de antocianinas avermelhados/roxos, particularmente sob estresse. Estes pigmentos estão ausentes em mutantes ttg1.

[0096] Adicionalmente, os mutantes ttg1 produzem cabelos extras na raiz. No tipo selvagem, os cabelos da raiz são produzidos somente a partir das células de tricoblasto. Nos mutantes ttg1, por outro lado, os cabelos da raiz são produzidos por células de tricoblasto e por células de atricoblasto. O resultado é uma raiz que parece mais cabeluda (Galway et al. (1994) Developmental Biology 166, 740-754).

[0097] Os mutantes ttgl também não produzem mucilagem na camada externa do revestimento da semente. A mucilagem é um hidrato de carbono complexo, chamado às vezes de mixomiceto, que cobre o revestimento de semente. Finalmente, os mutantes ttgl alteraram a latência e as sementes ttgl não requerem a secagem ou tratamentos frios para germinarem.

[0098] A presença de todas as sete características torna a seleção visual para esse genótipo de mutante uma tarefa fácil.

Desenho de Dedos de Zinco [0099] O gene TTGI foi escaneado quanto às sequências da forma: NNY NNY NNY NNNNNN RNN RNN RNN, onde Y é T ou C, R é A ou G, e N é qualquer base. Essas sequências identificadas que compreendem triplos que são iniciados por um A ou um G na orientação oposta, isto é, em filamentos opostos, e separados por exatamente 6 bp. Foi mostrado que esta é uma estrutura preferida para o reconhecimento e clivagem da nuclease de dedo de zinco (M. Bibikova ef al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21: 289-287).

[00100] Os triplos componentes das sequências identificadas em 1 foram classificados então com o fato se eram dedos de zinco que eram conhecidas para os ligarem especificamente. Dois sítios em TTGI foram identificados como sítios de ligação e clivagem de ZFN potenciais: 5'-TCC GGT CAC AGA ATC GCC GTC GGA-3' (SEQ ID NO:8), e 5'-ACT TCC TTC GAT TGG AAC GAT GTA3' (SEQ ID No.9) (no nucleotídeo 406 na sequência de TTG1).

[00101] As nucleases de dedo de zinco que compreendem um domínio de ligação projetado para ligar o primeiro desses sítios serão construídas tanto pela síntese e extensão de oligonucleotídeo (Segal, D.J. (2002) Methods 26:76-83.), quanto por PCR com primers mutagênicos (M. Bibikova ef al. (2002) Genetics 161:1169-1175). As sequências de codificação resultantes serão inseridas em vetores de plasmídeos na estrutura com o domínio de nuclease Fokl para criar duas sequências de codificação de ZFN, ZnTTGlA e ZnTTGIB. As proteínas codificadas serão expressadas em E. coli e purificadas parcialmente (M. Bibikova ef al. (2002) Genetics 161 :1169-1175). As ZFNs recuperadas serão testadas in vitro quanto à capacidade de clivar o DNA de plasmídio que codifica o gene TTG1. O sucesso neste ensaio não será evidenciado por nenhum clivagem por qualquer ZFN sozinha, mas pela clivagem no sítio esperado por uma mistura das duas ZFNs.

Transformação: [00102] Os genes de HS::ZnTTG1A e HS::ZnTTG18 serão introduzidos no genoma de Arabidopsis ao se utilizar a transformação mediada por Agrobacterium. Para fazer isto, os genes de HS::ZnTTGIA e B serão inseridos em um vetor de transformação de T-DNA de Agrobacterium (pCAMBIA1380) que prende um marcador resistente à higromicina selecionável. Um clone de pCAMBIA HS::ZnTTG1 será introduzido então em células de Agrobacterium ao se utilizar procedimentos padrão de transformação de Agrobacterium, e os genes de HS::ZnTTG1A e HS::ZnTTG18 serão introduzidos então em plantas de Arabidopsis ao se utilizar o método de imersão floral padrão (Veja, Clough, S. and Bent, A (1999) Plant Journal 16:735743) .

Indução da Expressão de ZFNs em uma Célula Hospedeira [00103] As sementes da geração T1 serão coletadas das plantas imersas. A fim de selecionar os brotos transformados, as sementes de T1 serão germinadas em placas de ágar contendo o antibiótico higromicina. Aproximadamente quatro dias após a germinação, as placas contendo os brotos germinados serão envolvidas em um envoltório plástico e imersas em água a 40oC por duas horas para induzir a expressão dos genes de ZFN. Em aproximadamente duas semanas depois da germinação, os brotos transformados resistentes à higromicina serão transferidos para a terra.

Seleção para o Evento Visando o Gene: [00104] Método de Seleção 1 - Os genes HS::ZnTTG1 serão introduzidos em plantas de Arabidopsis do tipo selvagem e as plantas T1 serão aquecidas tal como descrito acima. Nas semanas 1-2 depois do tratamento de calor, uma amostra do tecido será colhida das plantas tratadas a quente e o DNA é extraído desse tecido. A amplificação de PCR ao se utilizar primers de 20 bp flanqueando o sítio alvo de dedo de zinco (25 bp em cada lado do sítio alvo) será utilizada para determinar se o gene HS::ZnTTG1 está presente. A faixa de PCR das plantas de controle que não foram tratadas a quente deve ter uma dimensão de aproximadamente 90 bp. As faixas de PCR das plantas tratadas a quente devem incluir produtos menores do que 90 bp que resultam da existência das deleções que circundam o sítio alvo de dedo de zinco. Para verificar a existência de pequenas deleções, será clonada e determinada a sequência do DNA dos produtos de PCR menores.

[00105] Método de Seleção 2 - Os genes de HS::ZnTTG1A e de HS::ZnTTG1B serão introduzidos em plantas de Arabidopsis do tipo selvagem e as plantas T1 serão tratadas a quente tal como descrito acima. As plantas T1 serão desenvolvidas até a maturidade, poderão se auto-polinizar, e as sementes de T2 serão coletadas. As sementes de T2 serão cultivadas em placas de ágar e serão classificadas para os fenótipos dos brotos incluindo folhas sem pelos (fenótipo pelado), folhas mais brilhantes (antrocianina menos o fenótipo), e raízes cabeludas, tal como descrito acima. As plantas mutantes serão transferidas para a terra e cultivadas ainda mais. O tecido das plantas mutantes será colhido e o DNA será extraído na preparação para a seleção de PCR tal como descrito acima. Resumidamente, o PCR será executado com os primers flanqueando os sítios alvo de dedo de zinco e as amostras que exibem aproximadamente produtos de 90 bp não foram transformadas, enquanto que aquelas que exibem produtos com menos de 90 foram transformadas. Isto é devido à existência das deleções que circundam o sítio alvo de dedo de zinco. Adicionalmente, inserções pequenas ou deleções muito maiores também podem estar presentes em torno do sítio alvo de dedo de zinco. Para verificar a existência dessas ocorrências, é clonada e determinada a sequência de DNA dos produtos de PCR menores.

[00106] Método de Seleção 3 - os genes de HS::ZnTTG1A e de HS::ZnTTG1B serão introduzidos nos mutantes ttg1 heterozigóticos (isto é, o genótipo ttg1/TTG1). As plantas machos estéreis 1 (ms1) serão introduzidas na solução de Agrobacterium (nota: os loci ms1 e ttg1 são ligados distanciados a 6 cM no cromossoma 5). As plantas imersas são então polinizadas com pólen das plantas ttg1-1 homozigóticas. As plantas cruzadas poderão amadurecer, as sementes T1/F1 resultantes serão coletadas, e as sementes T1/F1 poderão germinar na presença de higromicina. Os brotos T1/F1 sobreviventes irão conterão o transgene HS::ZnTTG1 e serão heterozigóticos no locus ttg1 (isto é, o genótipo MS1- -ttg1-1/ms1-TTG1). As plantas T1/F1 serão submetidas ao choque térmico tal como descrito acima. Em um subconjunto de células, o alelo do tipo selvagem será eliminado, resultando em um setor de células ttg1 homozigóticas (isto é, o genótipo ttg1-1/ttg1-ko). Esses setores mutantes serão detectáveis (e, desse modo, um evento de recombinação genética direcionada) com a visualização de diversos fenótipos, tais como folhas sem pelos (fenótipo pelado), folhas mais brilhantes (anticianina menos o fenótipo), e sementes amarelas (fenótipo de testa transparente). O tecido será coletado dos setores mutantes e o alvo será verificado ao se utilizar a estratégia de PCR-clonagem-sequenciamento discutida acima. Dos setores mutantes, as sementes do T2 serão coletadas e cultivadas em plantas de T2. Na geração de T2, o fenótipo será verificado: plantas homozigóticas para o alelo eliminado (isto é, ttg1-ko) também serão homozigóticas para a mutação ms1 e, desse modo, serão machos estéreis (isto é, o genótipo ms1—ttg1-ko/ms1—ttg1-ko). O tecido dos mutantes duplos (fenotipicamente ttg1 e ms1) será colhido e verificado quanto ao alvo ao se utilizar a estratégia de PCR-clonagem-sequenciamento discutida acima.

[00107] Todas as COMPOSIÇÕES, MÉTODOS e APARELHOS aqui descritos e reivindicados podem ser produzidos e executados sem experimentação indevida à luz da presente descrição. Embora as composições e os métodos da presente invenção tenham sido descritos em termos de realizações preferidas, será aparente aos elementos versados na técnica que variações podem ser aplicadas às COMPOSIÇÕES, aos MÉTODOS e aos APARELHOS e nas etapas ou na sequência de etapas dos métodos aqui descritos sem que se desvie do conceito, do caráter e do âmbito da invenção. Mais especificamente, será aparente que determinados agentes que estão química e fisiologicamente relacionados podem substituídos em lugar dos agentes aqui descritos enquanto que resultados idênticos ou similares devem ser obtidos. Todos tais substitutos e modificações similares aparentes aos elementos versados na técnica são considerados como dentro do caráter, do âmbito e do conceito da invenção tal como definido pelas reivindicações anexas.

Tabela 1. Recuperação de mutações y de linhagem germinativa REIVINDICAÇÕES

Claims (12)

1. Método de recombinação genética direcionada em célula de planta hospedeira, caracterizado pelo fato de compreender: a introdução, na célula de planta hospedeira, de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) direcionada para um locus cromossomal alvo de um hospedeiro endógeno escolhido; a indução da expressão da ZFN dentro da célula de planta hospedeira; e a identificação de uma célula hospedeira recombinante em que o locus cromossomal alvo de um hospedeiro endógeno selecionado exibe uma mutação, em que a célula hospedeira recombinante não é uma célula de planta macho estéril.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a mutação é selecionada do grupo que consiste em uma deleção de material genético, uma inserção de material genético, e uma deleção e uma inserção de material genético.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender adicionalmente a introdução do DNA doador na célula de planta hospedeira.

4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o DNA doador fornece uma sequência de gene que codifica um produto a ser produzido na célula de planta hospedeira.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o DNA doador fornece uma sequência de gene que codifica um produto selecionado do grupo que consiste em produtos farmacêuticos, hormônios, proteínas, nutricêuticos ou produtos químicos.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo que consiste em uma monocotiledônea e uma dicotiledônea.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a planta é selecionada do grupo que consiste em milho, arroz, trigo, batata, soja, tomate, membros da família Brassica, e Arabidopsis.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a planta é uma árvore.

9. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que locus cromossomal alvo de um hospedeiro endógeno escolhido exibe uma mutação de inativação de gene.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a mutação é selecionada a partir de um grupo consistindo em uma deleção de material genético, uma inserção de material genético e uma deleção e uma inserção de material genético.

11. Método de recombinação genética direcionada em célula de planta hospedeira, caracterizado pelo fato de compreender: a introdução, na célula de planta hospedeira, de uma molécula de ácido nucléico que codifica uma nuclease de dedo de zinco (ZFN) direcionada para um locus cromossomal alvo de um hospedeiro endógeno escolhido; a indução da expressão da ZFN dentro da célula de planta hospedeira; e a identificação de uma célula hospedeira recombinante em que o locus cromossomal alvo de um hospedeiro endógeno selecionado exibe uma mutação de inativação de gene, em que a célula hospedeira recombinante não é uma célula de planta macho estéril.

12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que a mutação é selecionada a partir de um grupo consistindo em uma deleção de material genético, uma inserção de material genético e uma deleção e uma inserção de material genético.