JP6022556B2 - 配列特異的な操作されたリボヌクレアーゼh、および、dna−rnaハイブリッド結合タンパク質の配列優先性を決定する方法 - Google Patents
配列特異的な操作されたリボヌクレアーゼh、および、dna−rnaハイブリッド結合タンパク質の配列優先性を決定する方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6022556B2 JP6022556B2 JP2014514834A JP2014514834A JP6022556B2 JP 6022556 B2 JP6022556 B2 JP 6022556B2 JP 2014514834 A JP2014514834 A JP 2014514834A JP 2014514834 A JP2014514834 A JP 2014514834A JP 6022556 B2 JP6022556 B2 JP 6022556B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- rna
- sequence
- seq
- zfqqr
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 60
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 title description 23
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 title description 20
- 101710203526 Integrase Proteins 0.000 title description 17
- 102000023732 binding proteins Human genes 0.000 title 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 95
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 95
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 92
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 82
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 79
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 69
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 68
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 68
- 108010052833 ribonuclease HI Proteins 0.000 claims description 60
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 33
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 33
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 claims description 32
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 claims description 32
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 claims description 29
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 26
- 241000006382 Bacillus halodurans Species 0.000 claims description 23
- 101150059756 rnhA gene Proteins 0.000 claims description 17
- 102220480585 Serine/threonine-protein kinase RIO2_K123A_mutation Human genes 0.000 claims description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 15
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 15
- 102200036809 rs387907341 Human genes 0.000 claims description 15
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000003751 zinc Chemical class 0.000 claims description 4
- 102220478793 Neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-10_K81A_mutation Human genes 0.000 claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 78
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 75
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 60
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 46
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 43
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 40
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 30
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 21
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 19
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 18
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 15
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 14
- 102220521759 Interferon-inducible double-stranded RNA-dependent protein kinase activator A_K81A_mutation Human genes 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 13
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 13
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 11
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 10
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 10
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 8
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 7
- OAICVXFJPJFONN-NJFSPNSNSA-N Phosphorus-33 Chemical compound [33P] OAICVXFJPJFONN-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 6
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 101710137500 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 6
- 108010017070 Zinc Finger Nucleases Proteins 0.000 description 6
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 6
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 6
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 6
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 6
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 6
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 101150079036 rnc gene Proteins 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 4
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 3
- 101100528654 Lactococcus lactis subsp. lactis (strain IL1403) rnhC gene Proteins 0.000 description 3
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 2
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 2
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 101000686777 Escherichia phage T7 T7 RNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 108020004422 Riboswitch Proteins 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical class [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 1-naphthaleneacetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CC=CC2=C1 PRPINYUDVPFIRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 101100376453 Bacillus subtilis (strain 168) yitJ gene Proteins 0.000 description 1
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 description 1
- 108020001019 DNA Primers Proteins 0.000 description 1
- 108091008102 DNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700020911 DNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100030013 Endoribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010093099 Endoribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029100 Hematopoietic prostaglandin D synthase Human genes 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 108091008103 RNA aptamers Proteins 0.000 description 1
- 230000026279 RNA modification Effects 0.000 description 1
- 230000007022 RNA scission Effects 0.000 description 1
- 108700020471 RNA-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000044126 RNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010057163 Ribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 102000003661 Ribonuclease III Human genes 0.000 description 1
- 108010046983 Ribonuclease T1 Proteins 0.000 description 1
- 101710185844 Ribonuclease Y Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 108020001778 catalytic domains Proteins 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000001687 destabilization Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 230000005783 single-strand break Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007671 third-generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004572 zinc-binding Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
- C12Y301/26—Endoribonucleases producing 5'-phosphomonoesters (3.1.26)
- C12Y301/26004—Ribonuclease H (3.1.26.4)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
a)好ましくは結合ドメインの除去によって、および/または、基質の結合に関与するアミノ酸の置換によって、基質と結合しないが触媒活性を保持する、RNase HI触媒ドメインを得る工程、
b)DNA−RNAハイブリッド中の特定の配列に結合する能力を有する結合ドメインを含む、好ましくは、ジンクフィンガーDNA−RNAハイブリッド結合ドメインを含む、工程a)で得られたRNase HI触媒ドメインを含む融合タンパク質を作ることによって操作したRNase HIを得る工程。操作したRNase HIを得る好ましい方法では、ジンクフィンガードメインは、ジンクフィンガーZfQQRの誘導体、好ましくは、SEQ ID No.2で示された配列ZfQQRのヌクレオチド19−303によってコードされたポリペプチドである。そのような方法では、RNase HIの触媒ドメインは好ましくはバチルス・ハロデュランスからであり、好ましくは、SEQ ID:1で示されるrnhA遺伝子のヌクレオチド175−588によってコードされたポリペプチドを含む。RNase HIの触媒ドメインは、好ましくは、少なくともアミノ酸上の置換、欠失、および/または挿入(insretion)から選択される基質結合領域の変化を含む。
a)DNA−RNAハイブリッド基質のライブラリの混合物に、精製したタンパク質またはそのドメインを接触させる工程であって、DNA−RNAハイブリッド基質は、中心部分、好ましくは9または10のヌクレオチド位置に、無作為な配列を含み、フランキング配列は固定され、試験されるタンパク質またはそのドメインが、それに対する親和性を有している配列結合することを可能にする、工程、
b)結合したDNA−RNAハイブリッドを含むタンパク質またはそのドメインの、レジン、好ましくはグルタチオンアガロースへの固定化によって、結合していないDNA−RNAハイブリッドを分離する工程、
c)結合していないハイブリッドを取り除く工程、
d)好ましくはグルタチオンを含有する緩衝液を加えることによって、関連するDNA−RNAハイブリッドと一緒に、組換え型タンパク質を分離する工程、
e)PCR、好ましくはRT−PCRを用いて、分離したハイブリッドを増幅する工程であって、増幅反応において、無作為化領域のフランキング配列上の既知の配列に相補的なプライマーが用いられ、プライマーの1つでのPCR反応中に、RNAポリメラーゼ・プロモーターの配列は、RNAポリメラーゼによるインビトロの転写のための二本鎖DNAを得るために加えられる、工程、
f)DNA−RNAハイブリッドを得るために、RNaseH活性と、RNA鋳型の3’末端に相補的なDNAプライマーとを持っていない逆転写酵素を用いて、逆転写を行う工程を含み、工程a)乃至f)は好ましくは繰り返される。
a)RNARNAポリメラーゼのためのプロモータ配列を含む、不変の配列に隣接する、中央の位置に縮重配列を包含しているDNAオリゴヌクレオチドのライブラリをPCR増幅する工程、
b)鋳型として工程a)で得られた二本鎖DNA上のRNAポリメラーゼを使用してRNA鎖を合成する工程、
c)RNaseH活性を持っていない逆転写酵素を用いて、工程b)で得られたRNAの3’末端にある不変な配列に相補的なプライマーの逆転写を行う工程であって、逆転写の間、RNA鎖は分離されず、完全に相補的なRNA鎖とDNA鎖からなるハイブリッドが得られる、工程。好ましくは、そのような方法では、オリゴヌクレオチドは、無作為の9または10のヌクレオチド位置を含む中央の位置に、縮重配列を含有する。さらにより好ましくは、プロモータ配列は、T7 RNAポリメラーゼのためのプロモータ配列を含み、RNAポリメラーゼはT7 RNAポリメラーゼである。
バチルス・ハロデュランスからのrnhA遺伝子(SEQ ID NO:1)(SEQ ID NO:1は、rnhA RNase HI(遺伝子ID 893801,BH0863)のDNA配列である)を保有するベクターpET15aは私的なソースから得られた。cat(触媒ドメイン)をコードする遺伝子のフラグメントは、鋳型としてrnhA遺伝子を保有するpET15aと、50pmolの各プライマーBhcatr(SEQ ID No:12)およびBhcatf(SEQ ID No:11)(図1参照)、および、175−588のヌクレオチドに対応するrnhA遺伝子フラグメントをコードするDNAを含む1U Phusionポリメラーゼ(New England Biolabs)とで行われる標準的な条件下で、PCR技術を使用することにより増幅され、ベクターDNA pET 30b(Novagen社)は、NdeIおよびKpnI(Fermentas)で消化された。DNAを含有する反応混合物を、TAE緩衝液中の0.7%アガロースゲル上で分離し、予想されるサイズ430bpおよび5313bpに対応するフラグメントをそれぞれ、再単離用のキット(Gel out,A&A Biotechnology)を用いて、ゲルから再単離した。その後、50ngの再単離したrnhA遺伝子フラグメントと25ngの切断したベクターpET 30bを、バクテリオファージT4DNAリガーゼ(Fermentas)で処理し、リガーゼを熱失活させた。その後、ライゲーション反応混合物を細菌細胞の形質転換に使用した。大腸菌の形質転換受容性のある細菌(Top10(Invitrogen))を、ライゲーション反応混合物(50μlの細菌細胞当たり20−200ナノグラム)で形質転換した。30μg/μlmlのカナマイシンを補充したLB−寒天プレート上で形質転換体を選択した。所望の組み換え型を含む形質転換体の選択は制限地図の分析に基づき、その後、サンプルを配列決定してコンストラクトの配列を確認した。
ジンクフィンガーZfQQRをコードする遺伝子の合成は、Shi Y, Berg JM. Specific DNA−RNA hybrid binding proteins. Science. 1995. vol. 268, 282−284の記事からのアミノ酸配列に基づいて、Epoch‘s Life Scienceから注文された(ジンクフィンガーZFQQR遺伝子の合成されたDNAの配列であるSEQ ID No:2を参照)。ZfQQRをコードするDNAと、DNAベクターpET28b(Novagen社)を、制限酵素NcoIおよびXhoIで消化した(酵素はFermentas社からのもので、反応は、メーカーの指示に従って緩衝液2X Yellow中で、37°Cで1時間、1mgのDNA当たり1つの酵素単位で行われた)。反応混合物をTAE緩衝液中の0.7%アガロースゲル上で分離し、実施例1のように処理した。その後、50ナノグラムの再単離したZfQQR遺伝子と25ナノグラムの消化したベクターpET28bを、室温で1時間、T4DNAリガーゼ(Fermentas。メーカーによって供給された緩衝液中で反応を行なった)によってライゲートさせた。リガーゼを75°Cで10分間、インキュベーションによって熱失活させた。その後、実施例1のように細菌細胞に形質転換するためにライゲーション反応混合物を使用した。
ベクターpET28bからのZfQQRをコードする遺伝子のフラグメントを、PCR技術によって増幅した。その反応は、鋳型としてZfQQR遺伝子と、50pmolの各プライマーBhzf(SEQ ID No:13)およびKmf(SEQ ID No:14)(図1参照)を含む1UのPhusionポリメラーゼ(New England Biolabs)を保有するpET28b上で行われた標準的な条件下で実施された。ベクターpET30b中のRNase HIの触媒ドメインをコードする遺伝子のフラグメントを、PCT技術によって増幅した。その反応は、鋳型としてcat遺伝子と、50pmolの各プライマーKmf(SEQ ID No:14)およびBhcatr(SEQ ID No:12(図1参照)を含む1UのPhusionポリメラーゼ(New England Biolabs)を保有するpET30b上で行われた標準的な条件下で実施された。精製されたPCR生成物を、バクテリオファージT4ポリヌクレオチドキナーゼ(Fermentas)でリン酸化した。両方の反応からのDNA(20ナノグラム)を組み合わせ、ライゲートし、ライゲーション反応混合物を、実施例1のように、細菌細胞に形質転換した。
実施例3で生成されたフラグメントのライゲーションは、読み取り枠が当初、catをコードする遺伝子の一部と末端でZfQQRをコードする遺伝子フラグメントとを含んでいたコンストラクトを作成した。得られたDNAコンストラクトは、タンパク質の位置81、89、および123でアミノ酸残基をコードするヌクレオチドにおいてPCR技術を用いて置換を導入するために鋳型として役立った。置換は段階的に導入され、最初は、残基81(リジンからアラニンへの置換)および89(グルタミン酸に対するリジンの置換)をコードする置換ヌクレオチドであり、そのようなコンストラクトを得た後にのみ、位置123(リジンからアラニンへの置換)の残基をコードするヌクレオチドを形質転換するために、PCRを行った。PCR反応は、鋳型としてcat−ZfQQR遺伝子と、50pmolの各プライマーK81Af(SEQ ID No:17)、K81Ar(SEQ ID No:16)、K89Ef(SEQ ID No:19)、K89Er(SEQ ID No:18)、K123Af(SEQ ID No:21)、および、K123Ar(SEQ ID No:20)を含む1UのPhusionポリメラーゼ(New England Biolabs)を保有するpET28b上で行われた標準的な条件下で実施された(図1参照)。
実施例4で生成されたコンストラクトは、末端でcatAEA−ZfQQRをコードする読み取り枠を保有し、SEQ ID No:3の遺伝子中のドメイン間リンカー409−449をコードする領域でPCR技術を用いて領域間リンカーを短くするための鋳型として役立った。PCR反応は、鋳型としてcatAEA−ZfQQR遺伝子と、50pmolの各プライマーdel11f(SEQ ID No:22)およびdel11r(SEQ ID No:23)(これらはGQと呼ばれる変異体を生成するために使用された)、あるいは、プライマーdel5f(SEQ ID No:24)およびdel5r(SEQ ID No:25)(これらはGGKKQと呼ばれる変異体を生成するために使用された)をそれぞれ含む1UのPhusionポリメラーゼ(New England Biolabs)を保有するpET30b上で行われた標準的な条件下で実施された(プライマー配列については図1参照)。
バチルス・ハロデュランスからの完全長のRNase HIをコードする遺伝子を含むプラスミドpET15a、catをコードする遺伝子を含むpET 30b、catAEA−ZfQQRをコードする遺伝子を含むpET 30b、および、変異体GQをコードする遺伝子を含むpET 30b、および、変異体GGKKQをコードする遺伝子を含むpET30をそれぞれ、大腸菌株ER2566(New England Biolabs)に形質転換した。IPTGでタンパク質発現を誘発し、Ni−NTAレジン(Sigma Aldrich)で、標準的な手順に従って、タンパク質を精製した。
バチルス・ハロデュランス、cat、cat−ZfQQR、および、catAEA−ZfQQRからの完全長のRNase HIの酵素活性および特異性に対する、反応におけるマグネシウムイオンと亜鉛イオンの存在の効果を試験した。活性アッセイは、5mM MgCl2および/または20μM ZnSO4の存在を含んでいた。基質DNA−RNAハイブリッド中のRNA鎖の5’末端を、放射性同位元素リン33で標識化した。消化反応は0.05μMの放射性同位元素で標識化した基質と0.5μMの標識化していない基質を含んでいた。
RNA:
AGAACUAGUGGAUCAACCGGGCUGCAGGAAUUCGAUAUCAAGCUUAUCGAUACCGUGGCGGUUCUUCCCCAAGCC(SEQ ID No:9)
DNA:
GCTTGGGGAAGAACCGCCACGGTATCGATAAGCTTGATATCGAATTCCTGCAGCCCGGTTGATCCACTAGTTCT(SEQ ID No:9)
および、25mM トリス(pH8.0)、100mM KCl、5mM MgCl2、および/または、20μM ZnSO4、2mM DTT。反応は以下のものを含んでいた:バチルス・ハロデュランスからの完全長の12.5nMのRNase HI、625nMのcat、5nMのcat−ZfQQR、または、25nMのcatAEA−ZfQQR。消化反応は37°Cで行われ、50%の最終濃度にフォルムアミドを加えることにより、30分後には止まった。消化産物を、6Mの尿素を含有する12%変性ポリアクリルアミドゲル中に分離させた(図3を参照)。ゲルを真空乾燥器で乾燥させ、Storage Phosphor Screens(GE Healthcare)に一晩中晒した。オーディオラジオグラム(audioradiogram)をTyphoon Trio Scanner(GE Healthcare)でスキャンした。
3つの78ヌクレオチドの長い一本鎖DNAを合成して、それぞれ鋳型A(SEQ ID No:26)、鋳型B(SEQ ID No:27)、および、鋳型9N(SEQ ID No:28)と名付けた。PCR技術を用いて、二本鎖DNAを作成するために、これらのオリゴヌクレオチドを鋳型として使用した。その反応は、およそ0.1pmolの鋳型と、10pmolの各プライマー1および2を含む1単位のPhusionポリメラーゼ(New England Biolabs)の標準的な条件下で行われた:
プライマー1:
AATTTAATACGACTCACTATAGGGCTCTAGATCTCACTAAGCATAG(SEQ ID No:33)
プライマー2:
GAGATCTAGACGGAACATG(SEQ ID No:34)
一本鎖RNAを、70°Cで2分間インキュベートし、その後、氷上で2分間インキュベートした。調製した鋳型を逆転写にさらした。その反応は、最終濃度の1mM dNTP混合物、200pmolのプライマーアニーリングした鋳型、42°Cで2時間、逆転写酵素(Fermentas)を含まない40単位のRiboLock(Fermentas)および400単位のRevertAid H で、メーカーによって供給された緩衝液において40μlで行われた。反応混合物からのDNA−RNAハイブリッドを、標準手順でG−25 rasin(Sigma Aldrich)を使用することにより、緩衝液とdNTPsから分離した。
GSTとのジンクフィンガードメインの融合を得るために、ZFQQRをコードする遺伝子をクローン化し、発現ベクターpGEX−4T−1(Amersham)を作った。ジンクフィンガーZfQQRをコードする遺伝子の合成は、Shi Y, Berg JM. Specific DNA−RNA hybrid binding proteins. Science. 1995. vol. 268, 282−284の記事からアミノ酸配列に基づいて、Epoch‘s Life Sciencesから注文された。ZfQQRをコードするDNAをPCR技術を用いて増幅した。プライマーZFfおよびZFrを合成し、GSTドメインとジンクフィンガーZfQQRをコードする遺伝子の融合のDNAコンストラクトの調製に使用した。反応は、標準的な条件と、50pmolの各プライマーZFfおよびZFrを含む1単位のPhusionポリメラーゼ(New England Biolabs)で行われた:
ZFf:
GGTTCTGGTGACCCGGG(SEQ ID No:35)
ZFr:
CGGGAAAACAGCATTCCAGGTATTAG(SEQ ID No:36)
ジンクフィンガーZfQQRに対するDNA−RNAハイブリッドの結合反応は、40μlで行われ、200pmolのDNA−RNAハイブリッド、ジンクフィンガーZfQQRを含む1pmolのGST融合、25mM トリス pH8.0、100mM KCl、20μM ZnSO4、2mM DTTを含んでいた。反応は30分間室温で行われた。この後、反応物を7.5μlのグルタチオン・セファロース・レジンに加え、振動させながら(1,400rpm)22°CでThermomixer compact(Eppendorf)で30分間インキュベートした。次の段階では、レジンを100μlの緩衝液P(25mM トリス(pH8.0)、100mM KCl、20μM ZnSO4、2mM DTT)で3回洗浄し、各回、サンプルを室温で2分間、1000gで遠心分離にかけ、上澄みを取り除いた。次の工程は溶出であり、30μlの緩衝液Eと室温で10分間のインキュベーションで2度繰り返した。各インキュベーションの後、サンプルを室温で2分間1000gで遠心分離機にかけ、上澄みをチューブに移した。二本鎖DNAを得るために、DNA−RNAハイブリッドに関連するジンクフィンガーを含むGST融合を含有する5μlの溶出液を、PCRを用いて増幅にさらし、その後、RNAを転写し、DNA−RNAハイブリッドを実施例8のような逆転写によって合成した。得られたDNA−RNAハイブリッドをSELEXの次のラウンドの出発物質であった。
対照のSELEX方法は、ジンクフィンガーZfQQRのための結合部位を含むDNA−RNAハイブリッド(ハイブリッドA。鋳型A SEQ ID:26に形成される)と、そのような結合部位を有しておらず、その代わりにXhoI制限部位を有しているハイブリッド(Bハイブリッド。鋳型B SEQ ID No:27に形成される)の混合物上で行われた。5ラウンドのSELEXを、1:10000の比率のハイブリッドA:Bの混合物からなる対照プール上で行った。2つの配列を区別するために、各ラウンド後の溶出液のPCR増幅に由来する100ナノグラムのDNAを、37°Cで16時間、2つの酵素単位XhoIで消化した。消化産物を、TBE緩衝液中の15%天然ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ゲルを0.5μg/mlの最終濃度の臭化エチジウム溶液中で2分間インキュベートした。バンドは、画像MultiImager Fluoro−S(BioRad)を電子保管するためのCCDカメラを用いて、紫外線下で視覚化された。切断していないDNA(78bp)と、消化産物(55および23の塩基対)に対応するバンドの強度は、Quantity One(BioRad)を用いて測定され、各ラウンドの後にDNA−RNAハイブリッドの鋳型上で得られたDNAの相対的な比率が計算された(図14参照)。GSTとジンクフィンガーZfQQRの融合を含む5ラウンドの選択の後、ZfQQRのための結合部位を保有するDNAとそのような配列のないDNAとの比率は、1:1,7に変化した。このことは、SELEX手順を行うことによって、対照配列のプールが、ZfQQRに特異的に結合された配列によって、8500倍も濃縮されたことを意味している。
SELEXライブラリRNA−DNAハイブリッド
次の段階では、中央のランダムな配列(鋳型9N上で生成される−SEQ ID No:28)を含むDNA−RNAハイブリッドのライブラリは、SELEX手順を行うために、かつ、実施例11のようにジンクフィンガーZfQQRの配列優先性を決定するために使用された。選択されたハイブリッドの配列を決定するために、5ラウンドのSELEX後に溶出液の鋳型上で得られた500ナノグラムのDNA PCR生成物を、メーカーから提供された緩衝液中で5単位のXbaI酵素(Fermentas)で消化した。消化産物を、TBE緩衝液中の15%の天然ポリアクリルアミドゲル上で分離した。43の塩基対のフラグメント長さに対応するバンドを、標準手順に従ってゲルから取り除いて単離した。コンカテマーを得るために、100ナノグラムの消化したDNAフラグメントを、室温で3時間、メーカーから提供された緩衝液中のバクテリオファージT4DNAリガーゼ(Fermentas)でライゲートした。リガーゼを10分間75°Cでインキュベートすることで熱失活させた。200ナノグラムのDNAプラスミドベクターpUC18(Fermentas)を、37°Cで3時間、メーカーから提供された緩衝液中のXbaI酵素で消化させた。反応混合物は、TAE中の0.7%アガロースゲルで分離し、予想されるサイズに対応するフラグメントは、アガロースゲルからの再単離用キット(Gel out,A&A Biotechnology)を用いてゲルから再単離する。そのように調製したベクターおよびコンカテマーをライゲートし、その後、細菌株に形質転換した。所望の組み換え型を含む適切な形質転換体の選択はコロニーの色の分析に基づき、12のクローンを配列決定し、表2に示されるようなSELEX手順によって得られた合計42のフラグメントを含むことが分かった。
5ラウンドのSELEXの後に得られた共通配列がジンクフィンガーによって結合していることを確認するために、ニトロセルロースフィルター結合方法を用いて一定のKDを測定した。アッセイは、文献に記載の放射能で標識化された基質(LDNA、LRNA)と、共通配列(CDNA、CRNA)で行われた(図16参照)。
LDNA:TCACTGGGGAAGAAGAATCCTC(SEQ ID No:29)
LRNA:GAGGAUUCUUCUUCCCCAGUGA(SEQ ID No:30)
CDNA:TCACTGGTCGGTGGGAATCCTC(SEQ ID No:31)
CRNA:GAGGAUUCCCACCGACCAGUGA(SEQ ID No:32)
SEQ ID No:1−バチルス・ハロデュランス(完全長)からの遺伝子rnhAリボヌクレアーゼHI(遺伝子ID 893801 BH0863)のDNA配列;
SEQ ID No:2−ジンクフィンガーZfQQRのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:3−ジンクフィンガーZfQQRとの、置換K81A、K89E、およびK123Aを含む、バチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼHIのフラグメントを含有する酵素融合をコードする遺伝子のヌクレオチド配列(catAEA−ZfQQRと呼ばれる);
SEQ ID No:4−ジンクフィンガーZfQQRとの、置換K81A、K89E、K123Aを含む、バチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼHIのフラグメントを含有する融合のアミノ酸配列(catAEA−ZfQQRと呼ばれる);
SEQ ID No:5−catAEA−ZfQQR(位置138−148のアミノ酸をコードするフラグメントによって短くされたジンクフィンガーZfQQRドメイン間リンカーを含む、位置K81A、K89E、およびK123Aのタンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらす置換を含む、バチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼHIのフラグメントを含有する酵素融合)のGQ変異体をコードする遺伝子のヌクレオチド配列(GQと呼ばれる)
SEQ ID No:6−catAEA−ZfQQRのGQ変異体のアミノ酸配列(酵素融合)(GQと呼ばれる);
SEQ ID No:7−catAEA−ZfQQR(位置138−139および141−146のアミノ酸をコードするフラグメントによってドメイン間リンカーを含む、ジンクフィンガーZfQQRを含む、位置K81A、K89E、およびK123Aでのタンパク質のアミノ酸配列における変化をもたらす置換を含むバチルス・ハロデュランスからのリボヌクレアーゼHIのフラグメントを含有する酵素融合)のGGKKQ変異体のヌクレオチド配列(GGKKQと呼ばれる);
SEQ ID No:8−酵素融合のGGKKQ変異体のアミノ酸配列(GGKKQと呼ばれる);
SEQ ID No:9−ZfQQRのための結合配列を含む基質のRNA鎖;
SEQ ID No:10−ZfQQRのための結合配列を含む基質のDNA鎖;
SEQ ID No:11−Bhcatfプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:12−Bhcatrプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:13−BhZfプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:14−Kmfプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:15−Kmrプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:16−K81Arプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:17−K81Afプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:18−K89Erプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:19−K89Efプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:20−K123Arプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:21−K123Afプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:22−del11fプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:23−del11rプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:24−del5fプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:25−del5rプライマーのヌクレオチド配列;
SEQ ID No:26−ZfQQRのための結合部位を含むSELEX方法の対照に使用された基質のDNA鎖の配列(鋳型A);
SEQ ID No:27−ZfQQRのための結合部位を有しておらず、その代わりにXhoI制限部位を有する、SELEX方法の対照に使用された基質のDNA鎖の配列(鋳型B);
SEQ ID No:28−中央のノナヌクレオチドランダムな配列を含むDNA−RNAハイブリッドのライブラリの構造に使用された基質のDNA鎖の配列(鋳型9N);
SEQ ID No:29−KDを決定するために使用されたZfQQR結合配列を含むDNA−RNAハイブリッドのDNA鎖のヌクレオチド配列;
SEQ ID No:30−KDを決定するために使用されたZfQQR結合配列を含むDNA−RNAハイブリッドのRNA鎖のヌクレオチド配列;
SEQ ID No:31−KDを決定するために使用されたSELEXから推論される共通配列を含むDNA−RNAハイブリッドのDNA鎖のヌクレオチド配列;
SEQ ID No:32−KDを決定するために使用されたSELEXから推論される共通配列を含むDNA−RNAハイブリッドのRNA鎖のヌクレオチド配列;
SEQ ID No:33−プライマー1−PCR反応における鋳型A、B、および9NのDNAの増幅に使用されたプライマー;
SEQ ID No:34−プライマー2−PCR反応における鋳型A、B、および9NのDNAの増幅に使用されたプライマー;
SEQ ID No:35−プライマーZFf−GSTドメインをコードする融合遺伝子と、ジンクフィンガーZf−QQをコードする遺伝子のDNAコンストラクトの調製のためにPCRで使用されたプライマー;
SEQ ID No:36−プライマーZFr−GSTドメインをコードする融合遺伝子と、ジンクフィンガーZf−QQをコードする遺伝子のDNAコンストラクトの調製のためにPCRで使用されたプライマー;
SEQ ID No:37−GSTドメインの融合をコードする遺伝子と、ジンクフィンガーZfQQRをコードする遺伝子のヌクレオチド配列である(融合GST−ZfQQR)。
Claims (11)
- DNA−RNAハイブリッド中のRNA鎖を切断するリボヌクレアーゼであって、
リボヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼ HI(RNase HI)の触媒ドメインの誘導体及びジンクフィンガーDNA−RNAハイブリッド結合ドメインを含む融合タンパク質であり、
RNase HIの触媒ドメインの誘導体は、バチルス・ハロデュランスからのものであり、SEQ ID No:1で示されるrnhA遺伝子の175−588までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを含み、
RNase HIの触媒ドメインの誘導体は、SEQ ID No:1によってコードされたポリペプチドの配列に基づく基質結合ドメインのK81A、K89E、および、K123Aのすべてのアミノ酸残基の置換を含み、
RNase HIの触媒ドメインの誘導体は、RNase HIハイブリッド結合ドメインを含まず、
ジンクフィンガーDNA−RNAハイブリッド結合ドメインは、DNA−RNAハイブリッド中の特異的な配列に結合する能力を有している、ことを特徴とするリボヌクレアーゼ。 - ジンクフィンガードメインが、ジンクフィンガーZfQQRの誘導体であることを特徴とする請求項1に記載のリボヌクレアーゼ。
- ジンクフィンガードメインが、SEQ ID No.2で示される配列ZfQQRの19−303までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドであることを特徴とする請求項2に記載のリボヌクレアーゼ。
- リボヌクレアーゼは、SEQ ID No.4で示されるような融合タンパク質catAEA−ZfQQR、またはSEQ ID No.6で示されるような融合タンパク質GQを含むか、またはSEQ ID No.8で示されるような融合タンパク質GGKKQを含む、ことを特徴とする請求項1乃至3のいずれか一項に記載のリボヌクレアーゼ。
- 請求項1乃至4のいずれか一項のリボヌクレアーゼを含む組成物。
- DNA−RNAハイブリッド中のRNA鎖のインビトロでの切断のための請求項1乃至4のいずれか一項のリボヌクレアーゼ、または、請求項5の組成物の使用。
- DNA−RNAハイブリッド中のRNA鎖の切断は、ジンクフィンガーの結合部位から離れた、2−16のヌクレオチドにあることを特徴とする請求項6に記載の使用。
- DNA−RNAハイブリッド中のRNA鎖の切断が、ジンクフィンガーの結合部位から離れた、5−7のヌクレオチドにあることを特徴とする請求項7に記載の使用。
- DNA−RNAハイブリッド中のRNA鎖を切断する、RNase HIの操作した変異体を得る方法であって、
前記方法は、
a)バチルス・ハロデュランスからのものであり、SEQ ID No:1で示されるrnhA遺伝子の175−588までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを含む、RNase HI触媒ドメインの誘導体を得る工程と、
ここで、RNase HIの触媒ドメインの誘導体は、SEQ ID No:1によってコードされたポリペプチドの配列に基づく基質結合ドメインのK81A、K89E、および、K123Aのすべてのアミノ酸残基の置換を含み、
RNase HIの触媒ドメインの誘導体は、RNase HIハイブリッド結合ドメインを含まず、
b)DNA−RNAハイブリッド中の特異的な配列に結合する能力を有するジンクフィンガー結合ドメインを含む、工程a)で得られたRNase HI触媒ドメインの誘導体を含む融合タンパク質を作ることによって操作したRNase HIを得る工程を含む、
ことを特徴とする方法。 - ジンクフィンガードメインが、ジンクフィンガーZfQQRの誘導体であることを特徴とする請求項9に記載の方法。
- ジンクフィンガードメインが、SEQ ID No.2で示される配列ZfQQRの19−303までのヌクレオチドによってコードされたポリペプチドであることを特徴とする請求項10に記載の方法。
Applications Claiming Priority (9)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201161494481P | 2011-06-08 | 2011-06-08 | |
US201161494494P | 2011-06-08 | 2011-06-08 | |
PL395180A PL222513B1 (pl) | 2011-06-08 | 2011-06-08 | Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA |
PL395179A PL222512B1 (pl) | 2011-06-08 | 2011-06-08 | Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA |
US61/494,494 | 2011-06-08 | ||
US61/494,481 | 2011-06-08 | ||
PLP.395180 | 2011-06-08 | ||
PLP.395179 | 2011-06-08 | ||
PCT/PL2012/050019 WO2012169916A2 (en) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | Sequence-specific engineered ribonuclease h and the method for determining the sequence preference of dna-rna hybrid binding proteins |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2014516569A JP2014516569A (ja) | 2014-07-17 |
JP2014516569A5 JP2014516569A5 (ja) | 2014-10-16 |
JP6022556B2 true JP6022556B2 (ja) | 2016-11-09 |
Family
ID=47296662
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2014514834A Expired - Fee Related JP6022556B2 (ja) | 2011-06-08 | 2012-06-07 | 配列特異的な操作されたリボヌクレアーゼh、および、dna−rnaハイブリッド結合タンパク質の配列優先性を決定する方法 |
Country Status (10)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9353358B2 (ja) |
EP (2) | EP2718430B1 (ja) |
JP (1) | JP6022556B2 (ja) |
KR (1) | KR20140066977A (ja) |
CN (1) | CN103764820A (ja) |
AU (1) | AU2012267270B2 (ja) |
CA (1) | CA2837503C (ja) |
DK (1) | DK2718430T3 (ja) |
ES (1) | ES2557633T3 (ja) |
WO (1) | WO2012169916A2 (ja) |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108024947A (zh) | 2015-07-27 | 2018-05-11 | 玫琳凯有限公司 | 局部皮肤用制剂 |
CN108314736B (zh) * | 2017-01-18 | 2021-08-31 | 李燕强 | 一种促进rna降解的方法 |
CN110846724B (zh) * | 2019-12-03 | 2023-04-28 | 江西海普洛斯医学检验实验室有限公司 | 构建mRNA链特异文库的方法及试剂盒 |
US20230295707A1 (en) * | 2022-03-21 | 2023-09-21 | Abclonal Science, Inc. | T4 DNA Ligase Variants with Increased Ligation Efficiency |
Family Cites Families (11)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS5459392A (en) | 1977-10-14 | 1979-05-12 | Rikagaku Kenkyusho | Novel nuclease and its preparation |
US5270163A (en) * | 1990-06-11 | 1993-12-14 | University Research Corporation | Methods for identifying nucleic acid ligands |
US6855530B2 (en) * | 2000-11-15 | 2005-02-15 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Human RNase H1 mutants |
JP4968498B2 (ja) | 2002-01-23 | 2012-07-04 | ユニバーシティ オブ ユタ リサーチ ファウンデーション | ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発 |
US20060057590A1 (en) | 2004-09-14 | 2006-03-16 | Azeddine Si-Ammour | RNA probes |
US7804803B2 (en) | 2005-07-25 | 2010-09-28 | Honeywell International Inc. | Neighbor based TDMA slot assignment |
US20100055793A1 (en) | 2005-07-25 | 2010-03-04 | Johns Hopkins University | Site-specific modification of the human genome using custom-designed zinc finger nucleases |
WO2009126632A1 (en) * | 2008-04-08 | 2009-10-15 | Archemix Corp. | Compositions and methods for the use of mutant t3 rna polymerases in the synthesis of modified nucleic acid transcripts |
WO2009146179A1 (en) | 2008-04-15 | 2009-12-03 | University Of Iowa Research Foundation | Zinc finger nuclease for the cftr gene and methods of use thereof |
KR20100080068A (ko) | 2008-12-31 | 2010-07-08 | 주식회사 툴젠 | 신규한 징크 핑거 뉴클레아제 및 이의 용도 |
EP2467167B1 (en) * | 2009-08-18 | 2017-08-16 | Baxalta GmbH | Aptamers to tissue factor pathway inhibitor and their use as bleeding disorder therapeutics |
-
2012
- 2012-06-07 AU AU2012267270A patent/AU2012267270B2/en not_active Ceased
- 2012-06-07 EP EP12735348.0A patent/EP2718430B1/en not_active Not-in-force
- 2012-06-07 DK DK12735348.0T patent/DK2718430T3/en active
- 2012-06-07 CA CA2837503A patent/CA2837503C/en not_active Expired - Fee Related
- 2012-06-07 WO PCT/PL2012/050019 patent/WO2012169916A2/en active Application Filing
- 2012-06-07 EP EP20140180902 patent/EP2857506A3/en not_active Withdrawn
- 2012-06-07 JP JP2014514834A patent/JP6022556B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-06-07 KR KR1020137032517A patent/KR20140066977A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-06-07 CN CN201280027647.2A patent/CN103764820A/zh active Pending
- 2012-06-07 ES ES12735348.0T patent/ES2557633T3/es active Active
-
2013
- 2013-12-03 US US14/095,351 patent/US9353358B2/en active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2557633T3 (es) | 2016-01-27 |
CA2837503A1 (en) | 2012-12-13 |
WO2012169916A3 (en) | 2013-03-07 |
CN103764820A (zh) | 2014-04-30 |
EP2857506A2 (en) | 2015-04-08 |
EP2718430B1 (en) | 2015-12-09 |
KR20140066977A (ko) | 2014-06-03 |
US20140094385A1 (en) | 2014-04-03 |
JP2014516569A (ja) | 2014-07-17 |
EP2718430A2 (en) | 2014-04-16 |
AU2012267270B2 (en) | 2015-06-11 |
AU2012267270A1 (en) | 2013-12-12 |
CA2837503C (en) | 2018-01-02 |
EP2857506A3 (en) | 2015-04-29 |
US9353358B2 (en) | 2016-05-31 |
WO2012169916A2 (en) | 2012-12-13 |
DK2718430T3 (en) | 2016-02-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN102796728B (zh) | 用于通过转座酶的dna片段化和标记的方法和组合物 | |
US20230407341A1 (en) | Using Truncated Guide RNAs (tru-gRNAs) to Increase Specificity for RNA-Guided Genome Editing | |
EP2712931B1 (en) | Immobilized transposase complexes for DNA fragmentation and tagging | |
JP2022106883A (ja) | Cas9ターゲッティングをガイドする配列に関する方法および組成物 | |
JP6075892B2 (ja) | 二本鎖rnaエンドリボヌクレアーゼ | |
ES2705756T3 (es) | Secuencias de reconocimiento para meganucleasas derivadas de I-Crel y sus usos | |
JP2017500035A (ja) | 遺伝子編集用のcas多様体 | |
JP2015503535A (ja) | 改変されたcascadeリボ核タンパク質およびそれらの用途 | |
Yao et al. | Heterologous expression and purification of Arabidopsis thaliana VIM1 protein: in vitro evidence for its inability to recognize hydroxymethylcytosine, a rare base in Arabidopsis DNA | |
JP6022556B2 (ja) | 配列特異的な操作されたリボヌクレアーゼh、および、dna−rnaハイブリッド結合タンパク質の配列優先性を決定する方法 | |
Nguyen et al. | Activity, stability, and structure of metagenome‐derived LC11‐RNase H1, a homolog of Sulfolobus tokodaii RNase H1 | |
PL222512B1 (pl) | Endorybonukleaza przecinająca nić RNA w hybrydach DNA-RNA | |
PL222513B1 (pl) | Sposób określania sekwencji preferowanych przez białko lub jego domeny wiążące specyficznie sekwencje w hybrydzie DNA-RNA |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140205 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20140829 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20141113 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20151118 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160218 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20160601 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20160823 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20160914 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20161005 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6022556 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |