JP4968498B2 - ジンクフィンガーヌクレアーゼを用いる、標的化された染色体変異誘発 - Google Patents

Description

（関連出願の引用）
本願は、米国仮特許出願第６０／３５１，０３５号（２００２年１月２３日出願）およびＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０３／０２０１２（２００３年１月２２日出願）による優先権を主張する。

（連邦政府の研究支援の承認）
米国政府は、援助ＲＯ１ ＧＭ ５８５０４による部分的支援に基づいて、本発明において、一定の権利を有する。

（発明の背景）
遺伝子標的化（相同組換えによる遺伝子置換または遺伝子変異のプロセス）は、非常に有用であるが、代表的には、宿主細胞の遺伝物質に所望の変化を導入するためには非効率的な技術である。標的化された産物についての強力な選択が適用され得る場合にのみ、所望の変化の回収が可能である。遺伝子標的化の効率を改善するための一般的方法は、より広範囲の生物へのこのツールの拡大と同様、多くの場合において有益である。

モデル実験において、宿主ＤＮＡにおける２本鎖切断（ＤＳＢ）の導入が、局在化された組換えの頻度を大いに高めることが実証されている。しかし、これらの試験は、切断が誘導され得る前に、特定のエンドヌクレアーゼに関する認識部位の挿入を必要とした。同様に、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａでは、Ｐ因子切り出しによって生成されるＤＳＢは組換えを生じるが、Ｐ因子が標的部位に予め存在することを必要とする。

以前に実証された遺伝的形質転換方法は非常に好首尾であるが、標的化された組換えを伴わない形質転換は、導入されたＤＮＡのランダム挿入に関連した問題を伴い得る。ランダム組換えは、必須遺伝子の不活化または導入された遺伝子の異常発現をもたらし得る。遺伝的形質転換に関連したさらなる問題としては、複数の組込みに起因したモザイク性が挙げられる。

細胞または生物の、標的化された遺伝子組換えまたは変異は、いまや可能である。なぜなら、完全なゲノム配列が、多数の生物について決定されており、より多くの配列が日々入手されているからである。特定の遺伝子座に変異を導く能力が、特定の遺伝子の機能を研究することを大いに補助するだけでなく、標的化された遺伝子組換えもまた、治療適用および農業的適用を有する。現在利用可能な技術よりも一般的で、効率的で、そして／または再現可能である、標的化された遺伝子組換えの方法が必要とされる。

（発明の要旨）
本発明は、標的化された遺伝子組換えまたは変異を実施するための組成物および方法を提供する。細胞または生物における内因性核酸の任意のセグメントは、標的領域もしくはその標的領域の一部分の配列が公知である限り、またはこの標的領域に相同な単離されたＤＮＡが利用可能である限り、本発明の方法によって改変され得る。

特定の実施形態では、この組成物および方法は、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸分子を細胞または生物に導入し、そして選択された内因性ＤＮＡ配列が切断されており、かつ変異を示す、得られる細胞または生物を同定することによる、宿主生物の形質転換を含む。

好ましい実施形態では、このような方法は、以下の工程を包含する：変異される特定の宿主ＤＮＡ遺伝子座へと優先的に結合し得るジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを選択する工程；非特異的ＤＮＡ切断ドメインに作動可能に連結されて宿主細胞中に導入された場合に２本鎖ＤＮＡを切断し得る非特異的ＤＮＡ切断ドメインをさらに選択する工程；宿主細胞中での発現を誘導し得るプロモーター領域をさらに選択する工程；ならびに結合ドメインおよび切断ドメインをコードするＤＮＡと、プロモーター領域とをさらに作動可能に連結して、ＤＮＡ構築物を生成する工程。次いで、このＤＮＡ構築物は、標識宿主細胞中に導入され、そして宿主ＤＮＡ中の標的遺伝子座での組換えを示す、少なくとも１つの宿主細胞が同定される。特定の実施形態では、このＤＮＡ結合ドメインは、３つのＣｉｓ_２Ｈｉｓ_２ジンクフィンガーの結合ドメインを含む。別の実施形態では、この切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼＦｏｋＩ由来の切断ドメインを含む。１つの実施形態では、誘導性熱ショックプロモーターは、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするＤＮＡに作動可能に連結される。

さらなる実施形態は、選択されたＤＮＡ配列（ドナーＤＮＡ）の相同組換えによる、標的化された挿入のための方法を含む。ドナーＤＮＡは、宿主細胞中で産生されるべき産物をコードする配列を含み得る。この産物は、宿主細胞または生物の利益のために生成された産物であり得るか（例えば、遺伝子治療）、あるいはこの産物は、宿主細胞または生物の外側での使用のために生成されたものであり得る（例えば、この産物は、医薬品（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ホルモン、有用な対象物またはデバイスの製造において使用されるタンパク質産物、栄養補助食品（ｎｕｔｒｉｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、化学的製造または合成において使用される産物などから選択され得るが、これらに限定されない）。

特定の実施形態において、本発明は、体細胞において標的化した遺伝子を破壊するために利用される。このような遺伝子は、疾患を生じる１つ以上の細胞型において、過剰発現され得る。このような遺伝子の破壊は、低い百分率の体細胞においてのみ成功し得るが、このような破壊は、このような遺伝子の過剰発現に起因する疾患に罹患している個体のためのよりよい健康に寄与し得る。

別の実施形態において、本発明は、生殖細胞において標的化した遺伝子を破壊するために利用され得る。標的化された遺伝子においてこのような破壊を有する細胞は、標的化された遺伝子の機能を有さない生物を作製するために、選択され得る。このような細胞におおいて、標的化された遺伝子の機能は、完全にノックアウトされ得る。

別の実施形態において、本発明は、体細胞への制御エレメントの挿入によって、特定の遺伝子の発現を増強するために利用され得る。このような制御エレメントは、以下からなる群より選択され得るが、これらに限定されない：構成的に活性なプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生段階特異的プロモーター。このような制御エレメントは、染色体遺伝子座に標的化され得、この遺伝子座において、この制御エレメントは、このような細胞または宿主生物における治療効果を有する産物の原因である、特定の遺伝子の発現をもたらす。本発明は、産物をコードする遺伝子を含むドナーＤＮＡの挿入をさらに提供し得、この産物は、発現される場合、宿主細胞または生物に対して治療効果を有する。このような治療方法の例は、本発明の標的化された遺伝子組換えを使用して、インスリン遺伝子を含むドナーＤＮＡに作動可能に連結された活性プロモーターの、膵臓細胞への挿入をもたらすことである。次いで、ドナーＤＮＡを含む膵臓細胞は、インスリンを産生し、それによって、糖尿病宿主を補助する。さらに、ドナーＤＮＡ構築物は、薬学的に適切な遺伝子産物の産生をもたらすために、作物ゲノムへと挿入され得る。制御エレメント（例えば、構成的に活性なプロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーターまたは発生段階特異的プロモーター）に機能的に連結された、薬学的に有用なタンパク質産物（例えば、インスリンまたはヘモグロビン）をコードする遺伝子は、宿主植物において大量の薬学的に有用なタンパク質産物を産生するために、宿主植物に挿入され得る。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離され得る。あるいは、上記の方法は、生殖細胞において利用され得る。

本発明は、任意の染色体標的遺伝子座における変更をもたらすために、体細胞および生殖系列細胞の両方において利用され得る。

本発明の方法は、広範な細胞型および生物に適用可能である。本発明は、以下の細胞のいずれかに適用し得るが、本発明の方法は、本明細書中に列挙される細胞または生物に限定されない：単細胞生物または多細胞生物；卵母細胞；配偶子；培養物中または宿主生物中の生殖系列細胞；培養物中または宿主生物中の体細胞；昆虫細胞（Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、Ｈｏｍｏｐｔｅｒａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、ＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａまたはＯｒｔｈｏｐｔｅｒａ（ショウジョウバエ、蚊および地中海ミバエ（ｍｅｄｆｌｙ）を含む）からなる群より選択される昆虫を含む）；植物細胞（単子葉植物細胞および双子葉植物細胞を含む）；哺乳動物細胞（マウス、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、イヌまたはネコの細胞からなる群より選択される細胞が挙げられるが、これらに限定されない）；鳥類細胞（ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはガチョウの細胞からなる群より選択される細胞が挙げられるが、これらに限定されない）；あるいは魚類細胞（ゼブラフィッシュ、マスまたはサケの細胞が挙げられるが、これらに限定されない）。

本発明の多くの変更およびバリエーションが、本明細書中に記載されるように存在する。本発明は、昆虫（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）および植物（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓおよびタバコ）における標的化された遺伝子組み換えを例示する。ＤｒｏｓｏｐｈｉｌａおよびＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて、ヌクレオチド配列は、ゲノムのほとんどについて既知である。他の生物由来のゲノム配列の大きいセグメントは、速いペースで既知になっている。本明細書中に開示されるような本発明の方法を実施するために必要なエレメントは、任意の細胞または生物における適用のために適合され得る。従って、本発明は、任意の細胞または生物における標的化された遺伝子組み換えのための一般的方法を提供する。

表１：本発明の実施形態に従って、熱ショックに曝した雄性を、ａｔｔａｃｈｅｄ−Ｘ［Ｃ（１）ＤＸ］雌性と交配し、そして熱ショックに曝した雌性をＦＭ６（ｙ）雄性と交配することによって回復された、生殖系列変異体の数を示す。少なくとも１つの生殖系列変異体を生じた、スクリーニングした全ての熱ショックに曝した親の％を、所定のｙの数の列に括弧内に示す。回復された変異体ハエの総数を、総ｙの列に与え、そして全ての候補子孫の％として示す（括弧内）。ハエ１匹当たりの変異体子孫の数は、１〜１５まで変動した。ＮＤデータは、Ｍ．Ｂｉｂｉｋｏｖａら（２００２）Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１：１１６９−１１７５（これは、本明細書中で参考として援用される）に由来する。

（発明の詳細な説明）
本発明は、標的化された遺伝子組換えまたは標的化された変異を実行するための方法および組成物に関連する。以前に知られている標的化された遺伝子組換えの方法と対照的に、本発明は、実行が、効率的かつ安価であり、そして任意の細胞または生物に適応可能である。細胞または生物の二本鎖核酸の任意のセグメントは、本発明の方法により改変され得る。この方法は、全ての細胞に内在性である相同組換えプロセスおよび非相同組換えプロセスの両方を利用する。

本発明の方法は、標的化されたＤＮＡ挿入および標的化されたＤＮＡ欠失の両方を提供する。この方法は、キメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードするＤＮＡを最小限に含む核酸構築物を用いた細胞の形質転換法を包含する。特定の実施形態において、この方法は、ドナーＤＮＡを含む核酸構築物を用いて、細胞を形質転換する工程をさらに包含する。これらの一般的な概念に基づいた他のスキームは、本発明の範囲および精神内であり、そして当業者に容易に理解される。

本発明は、体細胞および生殖細胞の両方で利用され、特定の遺伝子座で遺伝子操作を行い得る。

特定の実施形態において、本発明は、体細胞において遺伝子を壊すために使用される。ここで、遺伝子は、細胞または生物に対して有害な産物を過剰発現し、および／または細胞または生物に対して有害な産物を発現する。このような遺伝子は、疾患において生じる１つ以上の細胞型において過剰発現され得る。本発明の方法による、このような遺伝子の破壊は、このような遺伝子に起因する疾患を被る個体に、より良い健康をもたらし得る。すなわち、細胞のほんの小さな割合の遺伝子の破壊が働き、発現レベルを減少し、治療効果を生じ得る。

別の実施形態において、本発明は、生殖細胞において遺伝子を壊すために使用され得る。特定の遺伝子におけるこのような破壊を有する細胞は、このような遺伝子の機能を有さない生物を作製するために選択され得る。このような細胞において、遺伝子は完全にノックアウトされ得る。この特定の細胞における機能の欠損は、治療効果を有し得る。

別の実施形態において、本発明は、体細胞に制御エレメントを挿入することにより、特定の遺伝子の発現を高めるために使用され得る。このような制御エレメントは、構成的活性プロモーター、誘導性プロモーター、または発生段階特異的プロモーターであり得る。それはまた、特定の細胞型のみで効率的な発現を可能にする組織特異的プロモーターであり得る。このような制御エレメントは、このような細胞において、治療効果を有する産物を担う特定の遺伝子の発現を引き起こすような様式で配置される。

本発明は、遺伝子産物をコードするドナーＤＮＡの挿入をさらに提供し得る。この遺伝子産物は、構成的に発現された場合、治療効果を有する。この実施形態の例は、膵細胞の個体群において、活性プロモーターおよびインシュリン遺伝子をコードするドナーＤＮＡの挿入を引き起こすために、このようなＤＮＡ構築物を糖尿病を被る個体に挿入することである。次いで、外因性ＤＮＡを含む膵細胞のこの個体群は、インシュリンを生成し、それによって糖尿病患者を助ける。さらに、このようなＤＮＡ構築物は作物に挿入され、薬剤的関連遺伝子産物の生成を引き起こし得る。タンパク質産物の遺伝子（例えば、インシュリン、リパーゼまたはヘモグロビン）は、制御エレメント（構成的活性プロモーター、または誘導性プロモーター）と一緒に植物に挿入され、植物中で大量の医薬品を生成し得る。次いで、このようなタンパク質産物は、植物から単離され得る。トランスジェニック植物またはトランスジェニック動物は、これらの遺伝的変更を用いて作製され得る。組織型特異的ベクターまたは細胞型特異的ベクターはまた、選択した細胞内でのみ遺伝子発現を提供するために利用され得る。

あるいは、上記の方法は、生殖細胞内で利用され、計画された様式で挿入が生じ、後の全ての細胞分裂が、設計された遺伝的変更を有する細胞を生成する細胞を選択し得る。

本明細書で使用される場合、遺伝子操作が生じ、かつ外因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子が人間の手で誘導される細胞は、組換え細胞と呼ばれる。従って、組換え細胞は、組換え誘導外因性ＤＮＡセグメントまたは遺伝子を含まない自然に存在する細胞と区別可能である。組換え細胞は、誘導ｃＤＮＡまたは誘導ゲノム遺伝子を有する細胞を含み、そしてまた、特定の誘導遺伝子と天然では関連しない異種プロモーターに隣接して配置される遺伝子を含む。

組換えコードタンパク質またはペプチドを発現させるために、変異体であろうと野生型であろうと、本発明に従って、発現ベクターが調製される。この発現ベクターは、１つ以上のプロモーターの調節下であるか、または１つ以上のプロモーターと作動可能に連結されている、単離された核酸を含み、ここで、これらのプロモーターは、例えば、誘導性、構成的に活性、または組織特異的であり得る。プロモーター「調節下」のコード配列をもたらすため、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端は、一般的に、選択されたプロモーターの約１と約５０ヌクレオチド「下流」（すなわち３’）の間に位置する。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、そしてコード組換えタンパク質の発現を促進する。これは、この文脈では「組換え発現」の意味である。

効果的なタンパク質発現の方法が、当該分野で周知である。当業者は、本発明に従って彼または彼女が選択したタンパク質を発現させることが可能である。

本発明の方法は、すべての生物に対してか、または培養細胞、培養組織または培養核（インタクトな生物を再生するために使用され得る細胞、組織または核を含む）においてか、または配偶子（例えば、それらの発達の様々な段階の卵または精子）適用され得る。ＤＳＢは、本質的に全ての細胞または生物において変異原性修復を刺激するので、ＺＦＮによる切断は、任意の細胞または生物において使用され得る。本発明の方法は、任意の生物（昆虫、真菌、げっ歯類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、および他の農業上重要な動物、ならびに他の哺乳動物（イヌ、ネコおよびヒトが挙げられるが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない）に由来する細胞に適用され得る。

さらに、本発明の組成物および方法は、植物において使用され得る。組成物および方法が、任意の様々な植物種（例えば、単子葉植物または双子葉植物）において使用され得る。特定の実施形態において、本発明は、植物（例えば、イネ科植物、マメ科植物、デンプン原料、アブラナ科メンバー、ハーブおよびスパイス、油料作物、観葉植物、木材および繊維、果実、薬用植物、有毒植物、トウモロコシ、ワタ、トウゴマおよび任意の他の作物種）において使用され得る。代替の実施形態において、本発明は、植物（例えば、サトウキビ、コムギ、イネ、トウモロコシ、ジャガイモ、テンサイ、キャッサバ、オオムギ、ダイズ、サツマイモ、アブラヤシの実、トマト、ソルガム、オレンジ、ブドウ、バナナ、リンゴ、キャベツ、スイカ、ココナッツ、タマネギ、綿実、アブラナおよびヤムにおいて使用され得る。いくつかの実施形態において、本発明は、ナス科（例えば、タバコ、トマト、ジャガイモおよびコショウ）のメンバーにおいて使用され得る。他の実施形態において、本発明は、有害な観葉植物（例えば、セイヨウキョウチクトウ、任意のイチイ種およびシャクナゲ）において使用され得る。特定の実施形態において、アブラナ科はシロイヌナズナである。別の実施形態において、この植物種は、タバコである。

イネ科植物としては、コムギ、トウモロコシ、イネ、ライムギ、ライコムギ、ムギ、オオムギ、ソルガム、キビ、サトウキビ、ローングラス（ｌａｗｎ ｇｒａｓｓ）およびフォーレージグラス（ｆｏｒａｇｅ ｇｒａｓｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。フォーレージグラスとしては、ケンタッキーブルーグラス、チモシーグラス、ウシノケグサ、大ウシクサ、小ウシクサおよびブルーガンマが挙げられるが、これらに限定されない。豆科植物としては、ダイズ、ソラマメ（ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ）またはソラマメ（Ｗｉｎｄｓｏｒ ｂｅａｎ）、インゲンマメ（ｋｉｄｎｅｙ ｂｅａｎ）、ライマメ、インゲンマメ（ｐｉｎｔｏ ｂｅａｎ）、白インゲンマメ、インゲンマメ（ｗａｘ ｂｅａｎ）、ミドリマメ、アオイマメ（ｂｕｔｔｅｒ ｂｅａｎ）およびリョクトウのようなマメ；グリーンピース、スプリットピー、ササゲ、ヒヨコマメ、レンズマメおよびスノーピー（ｓｎｏｗ ｐｅａ）のようなエンドウマメ；ピーナッツ；イナゴマメ、フェヌグリーク（ｆｅｎｕｇｒｅｅｋ）、クズ、アイ、カンゾウ、メスキート、コパイフェラ（ｃｏｐａｉｆｅｒａ）、ローズウッド、ロウザリーピー（ｒｏｓａｒｙ ｐｅａ）、センナポッド（ｓｅｎｎａ ｐｏｄ）、タマリンドおよびチューバルートのような他のマメ科植物；およびアルファルファのような飼料作物が挙げられるが、これらに限定されない。デンプン原料としては、ジャガイモ、サツマイモ、キャッサバ、およびヤムを含む任意の種のジャガイモが挙げられるが、これらに限定されない。アブラナ属としては、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、ブリュッセルキャベツ（ｂｒｕｓｓｅｌ ｓｐｒｏｕｔ）、カブ、コラード、ケールおよびダイコンが挙げられるが、これらに限定されない。油料作物としては、ダイズ、パーム、アブラナ、ヒマワリ、ピーナッツ、綿実、ココナッツ、オリーブ、パーム、カーネルが挙げられるが、これらに限定されない。木材および繊維としては、ワタ、アマ、およびタケが挙げられるが、これらに限定されない。他の作物としては、キノア、アマランス、ターウィ（ｔａｒｗｉ）、タマリロ（ｔａｍａｒｉｌｌｏ）、アンデスカタバミ、コーヒー、茶、およびカカオが挙げられるが、これらに限定されない。

（定義：）
本発明の目的のために、以下の用語は、以下の意味を有する：
本明細書中で使用される場合、用語「標的化された遺伝子組換え」とは、宿主細胞または宿主生物に存在するＤＮＡ標的遺伝子座内で組換えが生じるプロセスを言う。組換えは、相同ＤＮＡまたは非相同ＤＮＡのいずれかを含み得る。相同標的遺伝子組換えの１つの例は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）による宿主ＤＮＡの選択遺伝子座の切断後に続く、外因性起源であるか、または内因性起源のいずれかの相同ＤＮＡを用いた、切断ＤＮＡの相同組換えである。非相同標的遺伝子組換えの１つの例は、ＺＦＮによる宿主ＤＮＡの選択遺伝子座の切断後に続く、切断ＤＮＡの非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。

本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」または「宿主生物」または、単に「標的宿主」とは、選択されて、遺伝的に形質転換され、本発明の方法において使用される機能の発現のための１つ以上の遺伝子を保有する細胞または生物を言う。宿主はさらに、本発明の標的化された遺伝子組換えまたは変異方法により、形質転換された生物または細胞であり得る。

用語「標的」または「標的遺伝子座」あるいは「標的領域」とは、本明細書中で、本発明の標的化された遺伝子組換え法による改変のために選択された遺伝子またはＤＮＡセグメントを言う。通常、標的は、宿主生物の内在性遺伝子、コードセグメント、制御領域、イントロン、エキソンまたはそれらの一部である。しかし、標的は、宿主ＤＮＡの任意の一部であり得る。

本発明の目的のために、用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」は、ＤＮＡを切断し得る少なくとも１つのヌクレアーゼと効率的に結合された、少なくとも１つのジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質分子をいう。通常、ＺＦＮによる標的遺伝子座での切断は、この遺伝子座での二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じる。

本発明の目的のために、用語「マーカー」は、その存在または非存在が、宿主細胞または宿主生物に検出可能な表現型を運搬する遺伝子または配列をいう。種々の型のマーカーとしては、選択マーカー、スクリーニングマーカーおよび分子マーカーが挙げられるがこれらに限定されない。選択マーカーは、通常、発現して、生物を、特性のセットの環境条件に耐性または感受性にする表現型を運搬し得る遺伝子である。スクリーニングマーカーはまた、容易に検出可能かつ区別可能な性質である表現型を運搬し得、例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＵＳまたはβ−ガラクトシダーゼである。分子マーカーは、例えば、オリゴヌクレオチドプロービングによって唯一同定され得る配列特性（例えば、ＲＦＬＰ（制限フラグメント長多型）またはＳＳＲマーカー（単一反復配列））である。

本明細書中で使用される場合、用語「ドナー」または「ドナー構築物」は、官能基として宿主細胞または宿主生物に導入されるＤＮＡセグメントの全セットをいう。本明細書中で使用される場合、用語「ドナーＤＮＡ」は、標的遺伝子座の領域と十分な相同性を有し、標的化されたＤＳＢの部位で、相同性組換えへの関与を可能にするＤＮＡセグメントをいう。

本発明の目的のために、用語「遺伝子」は、タンパク質（「エキソン」）、非翻訳介在性配列（「イントロン」）、５’および３’側の非翻訳領域ならびに任意の関連する調節エレメントをコードする翻訳配列を含む核酸配列をいう。

本発明の目的のために、用語「配列」は、任意の一連の核酸塩基またはアミノ酸残基を意味し、そして遺伝子またはタンパク質をコードするかまたは示す配列をいってもいわなくてもよい。本明細書中で使用される遺伝的構築物の多くは、種々の遺伝的エレメントの互いに対する相対的位置によって記載される。本発明の目的のために、用語「近位」は、２つのエレメントの実際の融合を意味せずに、互いに対して次である２つのエレメントを示すために使用される。さらに、本発明の目的のために、「隣接する」は、同じ配列、類似する配列または関連する配列が、所定の配列のいずれかの側に存在することを示すために使用される。「隣接する」として記載されるセグメントは、それらが隣接するセグメントに直接融合される必要はない。なぜなら、所定の配列とその隣接配列との間に、介在性非特異的ＤＮＡが存在し得るからである。相対的位置を記載するために使用されるこれらの用語および他の用語は、遺伝学の分野における一般的に認められた語法に従って使用される。

本発明の目的のために、用語「組換え」は、所定の位置の遺伝物質が、他の遺伝物質との相互作用の結果として改変されるプロセスを示すために使用される。本発明の目的のために、用語「相同性組換え」は、相同または同一である遺伝物質のセグメントの間の相互作用の結果として生じる組換えを示すために使用される。対照的に、本発明の目的のために、用語「非相同的組換え」は、相同でも同一でもない遺伝物質のセグメントの間の相互作用の結果として生じる組換えを示すために使用される。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）は、非相同性組換えの１つの例である。

さらに、本発明の目的のために、用語「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」の実体は、その実体のうちの１つ以上の実体をいい；例えば、「１つのタンパク質（ａ ｐｏｔｅｉｎ）」または「１つの核酸分子（ａｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、１つ以上のこれらの化合物または少なくとも１つの化合物をいう。このように、用語「１つ（ａ）」または「１つ（ａｎ）」、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書中で交換可能に使用され得る。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」は、交換可能に使用され得ることにも留意のこと。さらに、「〜からなる群から選択される」化合物は、以下の一覧表における１つ以上の化合物をいい、これらとしては、２つ以上の化合物の混合物（すなわち、組み合わせ）が挙げられる。本発明に従って、単離された化合物または生物学的に純粋な化合物は、その天然の環境から取り出された化合物である。このように、「単離された」および「生物学的に純粋」は、化合物が精製された程度を、必ずしも反映する必要はない。本発明の単離された化合物は、その天然の供給源から得られ得るか、分子生物学的技術を使用して産生され得るか、または化学合成によって生成され得る。

（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）
本発明のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）は、標的遺伝子座で二本鎖切断（ＤＳＢ）を引き起こすことによって、宿主細胞において標的化された遺伝子組み換えまたは標的化された変異を指向し得る、キメラタンパク質分子である。本発明のＺＦＮは、ＤＮＡ結合ドメインおよびＤＮＡ切断ドメインを含み、ここで、ＤＮＡ結合ドメインは、少なくとも１つのジンクフィンガーを含み、ＤＮＡ切断ドメインに作動可能に連結される。ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインは、キメラタンパク質分子のＮ末端にあり、ＤＮＡ切断ドメインは、この分子のＣ末端に位置される。

本明細書中に記載されるようにＺＦＮは、少なくとも１つのジンクフィンガーを有さなければならない。好ましい実施形態において、本発明のＺＦＮは、宿主細胞または宿主生物において、標的化された遺伝子組換えに有用であるのに十分な特異性を有するために、少なくとも３つのジンクフィンガーを有する。３つを超えるジンクフィンガーを含むＺＦＮは、本発明の範囲内にある。３つを超えるジンクフィンガーは、構築するのにより時間がかかるが、各さらなるジンクフィンガーと進行的により大きな特異性を有する。特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＤＮＡ切断ドメインと作動可能に連結された３つのジンクフィンガーペプチドから構成される。

本発明のジンクフィンガードメインは、任意のクラスまたは型のジンクフィンガーに由来し得る。特定の実施形態において、ジンクフィンガードメインは、例えば、ジンクフィンガー転写因子ＴＦＩＩＩＡまたはＳｐ１によって、一般的に代表される、Ｃｙｓ _２ Ｈｉｓ _２ 型のジンクフィンガーを含む。好ましい実施形態において、ジンクフィンガードメインは、３つのＣｙｓ _２ Ｈｉｓ _２ 型ジンクフィンガーを含む。
ＺＦＮのＤＮＡ認識特異性および／または結合特異性は、細胞性ＤＮＡの任意の選択された部位で標的化された遺伝子組換えを達成するように変更され得る。このような改変は、公知の分子生物学的合成技術および／または化学的合成技術を使用して達成され得る。広範な種々のＤＮＡ認識特異性および／または結合特異性を有するジンクフィンガーを含むＺＦＮは、本発明の範囲内である。

ＺＦＮ ＤＮＡ切断ドメインは、１つのクラスの非特異的ＤＮＡ切断ドメイン（例えば、ＩＩ型制限酵素のＤＮＡ切断ドメイン）に由来する。特定の実施形態において、ＤＮＡ切断ドメインは、ＩＩ型制限酵素（ＦｏｋＩ）に由来する。

特定の実施形態において、ＺＦＮは、３つのＣｙｓ _２ Ｈｉｓ _２ 型ジンクフィンガーを含み、ＤＮＡ切断ドメインは、ＩＩ型制限酵素（ＦｏｋＩ）に由来する。この実施形態に従って、各ジンクフィンガーは、ＺＦＮ ＤＮＡ結合ドメインに対する９ｂｐの認識配列を作製するＤＮＡの３連続塩基対と接触する。実施形態のＤＮＡ切断ドメインは、二本鎖ＤＮＡの効果的な切断のための２つのＺＦＮ ＤＮＡ切断ドメインの二量体化を必要とする。このことは、有効に標的化された遺伝子組換えのために、非常に近位にある２つの逆転された認識（標的ＤＮＡ）部位に対して必要条件を課す。標的部位内の全ての位置が、特異的に接触される場合、これらの必要条件は、ＤＮＡの１８塩基対全ての認識を増強する。２つの部位の間には、空間が存在しても良い。特定の実施形態において、本発明のＺＦＮの認識部位の間の空間は、６〜３５ｂｐのＤＮＡに等価であり得る。２つの認識部位の間のＤＮＡの領域は、本明細書中で「スペーサー」と称される。

ＺＦＮの切断ドメインと認識ドメインとの間のリンカーは、存在する場合、選択されたアミノ酸残基の配列を含み、その結果、得られたリンカーは、可撓性である。または、最大の標的部位特異性について、リンカーのない構築物が、作製される。リンカーのない構築物は、認識部位に結合し、次いで、６ｂｐ離れた認識部位の間で切断するための強い優先性を有する。しかし、０と１８との間のアミノ酸長のリンカー長を有する場合、ＺＦＮ媒介性切断は、５〜３５ｂｐ離れた認識部位の間に存在する。所定のリンカー長について、結合および二量体化の両方に一致する認識部位の間の距離に対する制限が存在する。特定の実施形態において、切断ドメインと認識ドメインとの間にリンカーは存在せず、標的位置は、互いに関して逆転された方向で、６ヌクレオチドのスペーサーによって分離された２つの９ヌクレオチド認識部位を含む。

本発明の特定の実施形態に従って、遺伝子組換えまたは変異を標的化するために、２つの９ｂｐジンクフィンガーＤＮＡ認識配列が、宿主ＤＮＡ中に同定されなければならない。これらの認識部位は、互いに関して逆転された方向にあり、約６ｂｐのＤＮＡによって分離される。次いで、ＺＦＮは、標的位置でＤＮＡを特異的に結合するジンクフィンガーの組み合わせを設計および生成し、次いで、ＩＩ型制限酵素の切断ドメインにジンクフィンガーを連結することによって生成される。

（標的化された遺伝子組換えまたは変異）
本発明の方法は、任意の細胞または生物の標的化された遺伝子組換えまたは変異のために使用され得る。最低限の必要条件は、遺伝物質を細胞または生物に導入するための方法（安定な形質転換または一過性形質転換のいずれか）、内因性標的領域に関する配列情報、ならびに標的遺伝子座を認識および切断するＺＦＮ構築物を含む。本発明のいくつかの実施形態に従って、例えば、相同組換え、ドナーＤＮＡもまた必要とされる。

本発明の別の実施形態に従って、同定可能なマーカーをコードするＤＮＡもまた、ＤＮＡ構築物と共に含まれる。このようなマーカーは、その存在または非存在が、宿主細胞または宿主生物に検出可能な表現型を運搬する遺伝子または配列を含み得る。種々の型のマーカーとしては、選択マーカー、スクリーニングマーカーおよび分子マーカーが挙げられるがこれらに限定されない。選択マーカーは、通常、発現して、生物を、特性のセットの環境条件に耐性または感受性にする表現型を運搬し得る遺伝子である。スクリーニングマーカーはまた、容易に検出可能かつ識別可能な性質である表現型を運搬し得、例えば、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）またはβ−ガラクトシダーゼである。マーカーは、陰性選択マーカーでも、陽性選択マーカーでもあり得る。特定の実施形態において、このような陰性選択マーカーは、ｃｏｄＡである。分子マーカーは、例えば、オリゴヌクレオチドプロービングによって唯一同定され得る配列特性（例えば、ＲＦＬＰ（制限フラグメント長多型）またはＳＳＲマーカー（単一反復配列））である。

内因性相同組換えが、所定の宿主の細胞において起こる効率は、あるクラスの細胞または生物から別のクラスの細胞または生物を変動する。しかし、効率的な選択方法または感受性のスクリーニング方法の使用は、低い割合の組換えを補償し得る。従って、本発明を実施するための基本的な道具は、任意の所定の宿主細胞または生物に対するこのような道具の首尾よい適用が容易に予測されるように、広範な様々な細胞または生物について、当業者に利用可能である。本発明の組成物および方法は、標的化された変異または遺伝子組換えを、任意の宿主細胞または生物に導入するように、設計され得る。本発明の融通性は、疾患の遺伝モデルを作製するため、または遺伝子機能を調査するための、遺伝子操作を可能にする。

本発明の組成物および方法はまた、哺乳動物細胞において、標的化された遺伝子組換えまたは変異を生じるために使用され得る。さらに、ＺＦＮは、特定の遺伝子または染色体遺伝子座を切断し、これが次いで、単離された胚に注射され、その後、雌性に再移植されるように設計され得る。ＺＦＮ改変されたＤＮＡ切断は、ドナーＤＮＡの存在下または非存在下のいずれかで起こり得る。次いで、子が、所望の遺伝子変化についてスクリーニングされ得る。

本発明の組成物および方法はまた、哺乳動物において、生殖細胞系の遺伝子療法を達成するために使用され得る。１つの実施形態において、ＺＦＮは、目的の特定の遺伝子を標的化するように設計され得る。卵および精子が収集され得、そしてインビトロ授精が実施され得る。接合体段階において、胚は、特定の配列を標的化するよう設計されたＺＦＮと、欠失変異を有さない配列を保有するドナーＤＮＡセグメントを標的化するよう設計されたＺＦＮとの両方を用いて、処理され得る。次いで、この胚は、雌性に戻され得るか、または妊娠期間の休止の代替として、子宮に戻され得る。特定の実施形態において、例えば、欠失遺伝子は、通常の嚢胞性線維症（ＣＦ）対立遺伝子デルタＦ５０８である。ＺＦＮおよびドナーＤＮＡは、変異体遺伝子によって引き起こされる疾患を軽減するために、本発明の方法に従って、使用される。この方法に従って、既知のキャリア親由来の卵および精子が収集され、そしてインビトロ授精される。インビトロ授精後、この接合体は、デルタＦ５０８対立遺伝子を標的化するように設計されたＺＦＮとともに、そして野生型対立遺伝子を保有するドナーＤＮＡとともに、注射され得る。次いで、形質転換された接合体は、母に再移植される。本発明の組成物および方法を用いて、このような遺伝子置換は、子および全ての子孫が、ＣＦ変異を含まないことを可能にする。

別の実施形態において、相同組換えは、以下のように使用され得る。最初に、組み込みの部位が、宿主細胞において選択される。次いで、組み込み部位から下流および上流に配置された配列に相同な配列が、ゲノムに組み込まれるべき選択された遺伝子に隣接して、遺伝子構築物に含まれる。隣接とは、この文脈において、単に、標的の相同配列が、選択された遺伝子の上流（５’）と下流（３’）との両方に位置することを意味する。次いで、この構築物が細胞に導入され、従って、細胞の配列と構築物との間の組換えを可能にする。

実際的な問題として、遺伝子構築物は、通常、ゲノムに遺伝子を挿入するためにビヒクルよりはるかに良好に作用する。例えば、組換え体を選択し得ることが重要であり、従って、構築物に、選択マーカー遺伝子を含めることは、通常のことである。このマーカーは、そのゲノムＤＮＡに構築物を組み込まれた細胞の選択を可能にする。さらに、相同組換えは、特定の遺伝子を「ノックアウト」（欠失）または妨害するために使用され得る。従って、遺伝子発現を阻害するための別のアプローチは、相同組換え、すなわち「ノックアウト技術」の使用を包含する。これは、相同遺伝子の変異されたかまたは大きく欠失された形態を、構築物における隣接する領域の間に含めることによって、達成される。従って、単一の組換え事象において、（ｉ）内因性遺伝子を「ノックアウト」すること、（ｉｉ）このような事象を同定するための選択マーカーを提供すること、および（ｉｉｉ）発現のための導入遺伝子を導入することが可能である。

任意の所定の細胞における相同組換え頻度は、多数の要因によって影響を受ける。異なる細胞または生物は、これらの細胞において起こる相同組換えの量に関して変動し、および起こる相同組換えの相対割合もまた、種によって変動性である。ドナーと標的との間の相同な領域の長さは、相同組換え事象の頻度に影響を与え、相同領域がより長いほど、この頻度はより大きい。相同組換えを観察するために必要とされる、相同領域の長さもまた、種に特異的である。しかし、相同組換え事象の頻度の差異は、起こる組換えの選択の感度によってずらされ得る。ドナー−標的相同性の長さまたはドナー−標的相同性の程度についての絶対的な制限は、固定され得ないが、評定され得る潜在的な事象の数、および相同組換え事象についての選択の感度に依存することが、理解される。例えば、培養された細胞において、１０^９の事象をスクリーニングすることが可能である場合、１０^９個の細胞における１つの組換えを同定し得る選択が、有用な結果を得る。生物がより大きい場合、またはより長い世代時間を有し、その結果、１００の個体のみが単一の試験において評定され得る場合、組換え頻度がより高くなくてはならず、かつ選択感度がさほど重要であってはならない。本発明の方法は、染色体外ドナーＤＮＡの存在下で、相同組換えの効率を劇的に増加させる（実施例を参照のこと）。本発明は、迅速な世代時間を有するか、または感受性の選択系が利用可能である、細胞または生物の場合、あるいは単細胞であるかまたは培養中で増殖し得、そして成体生物に再生または組み込みされ得る多能性細胞株が存在する生物について、最も容易に実施され得る。迅速な世代時間とは、本発明において、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）に付いて実証された平均である。植物細胞（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）は、培養において増殖し得、次いでインタクトな生物に再生または組み込みされ得る、多能性細胞の１つの例である。これらの細胞または生物は、それらのそれぞれのクラスの代表であり、そして本発明がこれらのクラスにわたってどのように適用され得るかを実証する。本発明は、生物の形質転換のために使用される方法とは無関係に作動可能であることが、当業者によって理解される。さらに、本発明が、植物および昆虫のような異種の生物に対して適用可能であるという事実は、本発明の、生存生物に対する一般的な広範な適用可能性を実証する。

（核酸送達）
形質転換体は、各細胞または生物の特定の要件に依存する、種々の公知の技術によって実施され得る。このような技術は、多数の生物および細胞に対して研究されており、そして全ての他の細胞に対して、過度な実験なしで適合され得る。適切な形質転換は、細胞および細胞核へのＤＮＡの進入を包含する。単細胞生物および単一細胞から再生され得る生物（全ての植物およびいくらかの哺乳動物を含む）については、形質転換が、インビトロ培養で実施され得、次いで、形質転換体の選択および形質転換体の再生が行われる。ＤＮＡまたはＲＮＡを細胞に移入するためにしばしば使用される方法は、カチオン性の脂質、リポソーム、または他の材料と、ＤＮＡまたはＲＮＡの複合体を形成し、微小注射、粒子銃ボンバードメント、エレクトロポレーション、およびＤＮＡまたはＲＮＡをウイルスベクターに形質転換するように組み込むことを包含する。他の技術は、当該分野において周知である。

（本発明の実施において有用ないくつかの送達系の例）
（リポソーム処方物：）
本発明の特定の広範な実施形態において、オリゴヌクレオチドまたは／ポリヌクレオチドならびに／あるいはＺＦＮおよび適切な場合にはドナーＤＮＡを含む、発現ベクターが、リポソーム内にトラップされ得る。リポソームとは、リン脂質二重膜および内側の水性媒体によって特徴付けられる、小胞構造体である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された、多脂質層を有する。これらの層は、リン脂質が過剰の水溶液中に懸濁されると自発的に形成される。この脂質成分は、自己再配置を起こし、その後、閉じた構造を形成し、そして水をトラップし、そして脂質二重層の間に、溶解した溶質をトラップする。カチオン性脂質−核酸複合体（例えば、リポフェクタミン−核酸複合体）もまた企図される。本発明による使用のために適切な脂質は、市販供給源により得られ得る。本発明によって使用されるリポソームは、異なる方法によって作製され得、そしてこのような方法は、当該分野において公知である。リポソームのサイズは、合成方法に依存して変動する。

（マイクロインジェクション：）ＤＮＡの種々の細胞（卵または胚細胞を含む）への直接のマイクロインジェクションはまた、多くの種を形質転換するために効果的に使用されている。マウスにおいて、インビトロで培養可能な多能性胚幹（ＥＳ）細胞の存在は、形質転換マウスを作製するために利用されている。ＥＳ細胞は、培養中で形質転換され得、次いで、マウス胚盤胞にマイクロインジェクションされ、ここで、これらの細胞は、発達中の胚に取り込まれ、そして最終的に、生殖細胞系のキメラを作製する。ヘテロ接合型の同胞を異種交配させることによって、所望の遺伝子を有するホモ接合型の動物が得られ得る。

（アデノウイルス：）ヒトアデノウイルスは、約３６Ｋｂのゲノムサイズを有する二本鎖ＤＮＡ腫瘍ウイルスである。真核生物遺伝子発現のためのモデル系として、アデノウイルスは、広範に研究され、そして十分に特徴付けられており、このことは、これらのモデル系を、遺伝子移入系としてアデノウイルスを開発するための魅力的な系にしている。この群のウイルスは、増殖および操作が容易であり、そしてこれらのウイルスは、インビトロおよびインビボで、広範な宿主範囲に存在する。溶解性に感染した細胞において、アデノウイルスは、宿主のタンパク質合成を遮断し得、細胞機構を、多量のウイルスタンパク質の合成に指向し得、そして豊富な量のウイルスを産生し得る。

外来タンパク質をコードするＤＮＡを細胞に送達するためのアデノウイルス系の特定の利点としては、以下が挙げられる：（ｉ）比較的大きな断片のウイルスＤＮＡを外来ＤＮＡと置換する能力；（ｉｉ）組換えアデノウイルスの構造的安定性；（ｉｉｉ）ヒトへのアデノウイルス投与の安全性および（ｉｖ）癌または悪性腫瘍でのアデノウイルス感染のいずれの公知の関連も欠くこと；（ｖ）高い力価の組換えウイルスを得る能力；および（ｖｉ）アデノウイルスの高い感染性。

一般に、アデノウイルス遺伝子移入系は、組換えられた、操作されたアデノウイルスに基づき、これは、そのゲノムの一部（例えば、Ｅ１）の欠失によって複製不完全にされ、そして依然として、その感染のための能力を維持する。比較的大きい外来タンパク質をコードする配列は、さらなる欠失がアデノウイルスゲノムにおいてなされる場合に、発現され得る。例えば、Ｅ１領域とＥ３領域との両方を欠失したアデノウイルスは、１０ｋＢの外来ＤＮＡを保有し得、そして２９３細胞中で高力価で増殖され得る。

（発現構築物としての他のウイルスベクター）他のウイルスベクターは、本発明における発現構築物として使用され得る。例えば、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、およびヘルペスウイルス由来のベクターが、使用され得る。欠損型Ｂ型肝炎ウイルスは、宿主細胞の形質転換のために使用され得る。インビトロ研究は、これらのウイルスが、ヘルパー依存パッケージングの能力を維持し得、そしてそのゲノムの８０％までの欠失にもかかわらず、逆転写し得ることを示す。潜在的に大きい部分のウイルスゲノムは、外来遺伝物質で置き換えられ得る。向肝性および永続性（取り込み）は、肝臓に指向された遺伝子移入のために特に魅力的な特性である。クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子は、ウイルスポリメラーゼ、表面コード配列、および前表面コード配列の代わりに、アヒルのＢ型肝炎ウイルスに首尾よく導入されている。欠損型ウイルスは、野生型ウイルスとともに、トリ肝癌細胞株に共トランスフェクトされ、そして高力価の組換えウイルスを含む培養培地を使用して、子アヒルの初代肝細胞を感染した。安定なＣＡＴ遺伝子発現が、引き続いて検出された。

（非ウイルス方法）
ＺＦＮをコードし、そして適切な場合は、ドナーＤＮＡをコードするＤＮＡ構築物の宿主細胞への移入のためのいくつかの非ウイルス方法が、本発明によって企図される。この方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、およびレセプター媒介性トランスフェクションが挙げられる。これらの技術のいくつかは、インビボ使用またはエキソビボ使用のために首尾良く適合され得る。

本発明の一実施形態において、この発現構築物は、単に、裸の組換えＤＮＡから構成され得る。細胞膜を物理的または化学的に透過可能な構築物の移入は、上記のＤＮＡ移入方法のいずれかによって実施され得る。例えば、ＣａＰＯ_４沈殿物の形態のポリオーマウイルスＤＮＡを、成体および新生仔のマウスの肝臓および脾臓に首尾良く注入し、これは次いで、活性なウイルス複製および急性感染を実証した。さらに、ＣａＰＯ_４沈殿プラスミド発現ベクターの直接腹腔内注射は、トランスフェクトされた遺伝子の発現を生じる。

（植物の形質転換）
形質転換された植物を、全植物を形質転換するプロセスによって、または培養物中の単細胞もしくは組織サンプルを形質転換して、この形質転換された細胞から全植物を再生するプロセスによって得る。胚細胞または種子が、形質転換される場合、全植物を再生する必要はない。なぜなら、形質転換された植物は、種子から直接成長し得るからである。トランスジェニック植物を、当該分野で公知の任意の手段（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性ＤＮＡ移入（好ましくは、ディスアーム型（ｄｉｓａｒｍｅｄ）Ｔ−ＤＮＡベクターを用いる）、エレクトロポレーション、直接ＤＮＡ移入、および粒子ボンバードメントが挙げられるが、これに限定されない）によって生成し得るからである。ＤＮＡを単子葉植物および双子葉植物に導入するための技術は、このような植物の組織を培養するための技術およびこれらの組織を再生するための技術と同様に、当該分野で公知である。形質転換された細胞または組織からの全形質転換植物の再生は、全ての農学的に重要な作物を含むほとんどの植物属（単子葉植物と双子葉植物の両方）において達成されている。

（変異のスクリーニング）
ゲノムＤＮＡサンプル、ｃＤＮＡサンプルまたはＲＮＡサンプルにおける変異を正確に検出するための遺伝子スクリーニング方法が、特定の状況に基づいて用いられ得る。多数の異なる方法が、点変異を検出するために用いられ、この方法としては、変性勾配ゲル電気泳動（「ＤＧＧＥ」）、制限酵素多型分析、化学的切断方法および酵素的切断方法などが挙げられる。現在使用されているより一般的な手順としては、ＰＣＲ^ＴＭにより増幅された標的領域の直接スクリーニング、および一本鎖コンフォメーション多型分析（「ＳＳＣＰ」）が挙げられる。ＳＳＣＰは、ゲル電気泳動における異なる配列の一本鎖核酸分子の異なる移動度に依存する。ＳＳＣＰ分析のための技術は、当該分野で周知である。

点変異の別のスクリーニング方法は、ＲＮＡ／ＤＮＡおよびＲＮＡ／ＲＮＡのヘテロ二重鎖における塩基対ミスマッチのＲＮａｓｅ切断に基づく。本明細書中で使用される場合、用語「ミスマッチ」とは、二本鎖のＲＮＡ／ＲＮＡ分子、ＲＮＡ／ＤＮＡ分子またはＤＮＡ／ＤＮＡ分子における１つ以上の対形成していないかまたは誤って対形成したヌクレオチドの領域として定義される。従って、この定義は、挿入／欠失変異、ならびに１つおよび複数の塩基点変異に起因するミスマッチを含む。

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を例示するために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者らによって発見された技術を表し、従って、その実施のための好ましい様式を構築すると考えられ得ることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示を考慮して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多くの変更が、開示される特定の実施形態において行われ得ることを理解し、そしてなお、同じまたは類似の結果を得るはずである。

（実施例１：標的化された変異の導入）
（ジンクフィンガー設計）
一対のＺＦＮを、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのｙｅｌｌｏｗ（ｙ）遺伝子における染色体標的遺伝子座について設計しそして構築した。ジンクフィンガーは、一般的に、ＤＮＡのＧリッチ領域に優先的に結合し、そして全ての５’−ＧＮＮ−３’トリプレットに結合するフィンガーの大規模な研究が、行われている。結合部位は、ＺＦＮによる有効な切断のために、互いに対して逆方向でなければならないため、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ（ｙ）の染色体標的遺伝子座を、（ＮＮＣ）_３．．．（ＧＮＮ）_３の形態の逆方向認識配列について検索した。このような部位は、成分９マー認識部位の間で６ｂｐの間隔のエキソン２において同定され、これは、付加されたリンカーもスペーサーも結合ドメインと切断ドメインとの間に有さないＺＦＮによる特異的認識および切断のために最適なスペーサーである。２つのＺＦＮの特異的認識配列は、Ｂｉｂｉｋｏｖａら、２００２、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １６１：１１６９−１１７５に記載される。ＤＮＡ配列である、５’−ＧＣＧＧＡＴＧＣＧ−３’（配列番号１）および５’−ＧＣＧＧＴＡＧＣＧ−３’（配列番号２）を認識するジンクフィンガーをコードするＤＮＡを、Ｄｒｓ．Ｄａｖｉｄ ＳｅｇａｌとＣａｒｌｏｓ Ｂａｒｂａｓ（Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から得た。次いで、このジンクフィンガーをコードするＤＮＡを、変異誘発性ＰＣＲプライマーを使用して改変し、そして３つのジンクフィンガーの２セット（一方を、ｙＡ（ｙ遺伝子標的の成分９マーの１つ（５’−ＧＴＧＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号３））を認識する）と呼び、そして他方を、ｙＢ（ｙ遺伝子標的の他の成分９マー（５’−ＧＣＧＧＴＡＧＧＣ−３’（配列番号４））を認識する）と呼ぶ）の各々を作成した。２つのフィンガーが、ｙＡにおいて改変されたが、ｙＢにおいては１つのフィンガーしか改変されなかった。ジンクフィンガーの得られた両方の３フィンガーセットの各々をコードするＤＮＡを、ＤＮＡ認識ドメインと切断ドメインとの間に介在リンカーＤＮＡを有さない、ｐＥＴ１５ｂ発現プラスミド中のＦｏｋＩ ＤＮＡ切断ドメインとインフレームにクローニングした。両方のキメラＺＦＮタンパク質を発現させ、Ｎｉアフィニティクロマトグラフィーで精製し、そして完全ｙ遺伝子を保有するｐＳ／Ｇプラスミドを使用して、インビトロで切断活性について試験した。２つのＺＦＮは共に、二本鎖切断（ＤＳＢ）を、ｙ遺伝子を保有する１０．７ｋｂのプラスミドＤＮＡ中の推定部位で構成した。

（Ｐエレメントベクターおよびハエ幼虫の形質転換）
次いで、ｙＡ ＺＦＮコード配列およびｙＢ ＺＦＮコード配列の両方を、改変ｐｈｓｐ７０プラスミドのＢａｍＨＩ部位とＳａｌＩ部位との間にＺＦＮ ＤＮＡを挿入することによって、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ｈｓｐ７０熱ショックプロモーターの後ろに別々にクローニングした。熱ショックプロモーターおよびＺＦＮ ＤＮＡ配列を保有するフラグメントを、部分ＨｉｎｄＩＩＩ消化および完全ＡｐａＩ消化によって切除し、そして市販のクローニングベクターであるｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ中のこれらの同じエンドヌクレアーゼ部位の間にクローニングした。挿入物の配列の確認の後、これを、ＮｏｔＩで消化することにより切り出し、そしてｒｙ＋ＰエレメントベクターｐＤＭ３０に挿入した。得られたｙＡプラスミドおよびｙＢプラスミドを、Ｐ−トランスポサーゼ発現プラスミドのｐπ２５．ｌｗｃと共に、ｖ ｒｙ胚中に別々に注入し、そして孵化した成体を、交配させて、ｒｙ＋生殖細胞系列形質転換体についてスクリーニングした。ｒｙ＋挿入を、各ＺＦＮを有する複数の独立した形質転換体に特異的な染色体に対してマッピングした。両方の平衡化したホモ接合性のストックを、ほとんどの場合に生存率の問題を有さず、ｙＡおよびｙＢを保有するいくつかの株について作製した。２つのＺＦＮの遺伝子を、（以下の実施例に記載されるようにして）成熟ハエの適切な交雑種と合わせ、そしてその子孫に、これらのハエが入ったガラス容器を３５℃の水浴に１時間漬けることによって、交配の開始後４日で熱ショックを与えた。成体が孵化すると、これらを、体細胞ｙ変異の証拠についてスクリーニングした。各ヌクレアーゼを含む交雑種由来のコントロール容器を、別々に熱ショックに供し、そしてｙＡ＋ｙＢハエ（これは熱ショックを受けていない）もまたスクリーニングした。

（生殖細胞系列変異体の回収）
熱ショックプロトコルから現れ、かつｙＡヌクレアーゼおよびｙＢヌクレアーゼの両方を保有する全てのハエを、交配して、潜在的生殖細胞系列変異を評価した。雄を、２または３匹の固定したＸ［Ｃ（１）ＤＸ］雌と交配し、そして得られた雄性子孫を、黄色の体色についてスクリーニングした。雌を、２または３匹のｙ（ＦＭ６）雄と交配し、そして両方の性の得られた子孫をスクリーニングした。変異種を同定し、そしてこれら全ては、雄性親に由来する雄であった。これらの同定された変異種の雄性子孫を、次いで、Ｃ（１）ＤＸ雌と交配して、同じ変異を保有するさらなる子孫を生成した。

（ＤＮＡ分析）
標的ＤＮＡの存在または非存在を、ＤＮＡ分析によって同定した。個々のハエを、フェノールとグリンド（ｇｒｉｎｄ）緩衝液（７Ｍの尿素、２％のＳＤＳ、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．３５ＭのＮａＣｌ）の予め６０℃に加熱した１：１混合物（１００μｌ）中でホモジナイズした。各サンプルを、５０μｌのクロロホルムで抽出し、有機相を、１００μｌのグリンド緩衝液で逆抽出し、そして合わせた水相を、５０μｌのクロロホルムで再抽出した。ＤＮＡを、エタノールで沈殿させ、そして２０μｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に再溶解した。６００ｂｐのＤＮＡフラグメントを、ｙＡ＋ｙＢ認識部位に隣接するプライマーを用いるＰＣＲによって増幅させた。これらのプライマーを、ＹＦ２（５’ＡＴＴＣＣＴＴＧＴＧＴＣＣＡＡＡＡＴＡＡＴＧＡＣ−３’（配列番号５））およびＹＲ３（５’−ＡＡＡＡＴＡＧＧＣＡＴＡＴＧＣＡＴＣＡＴＣＧＣ３’（配列番号６））と呼んだ。より大きな欠失について、ＹＲ３を、より遠い配列であるＹＦ１（５’ＡＴＴＴＴＧＴＡＣＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＡＡＧＣＡＧ−３’（配列番号７））と共に使用した。増幅されたフラグメントを、ゲル電気泳動の後に回収し、そしてＤＮＡ配列を、ＡＢＩ３７００キャピラリーシーケンサーおよびＹＲ３プライマーを用いて、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｕｔａｈ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで決定した。

（二本鎖切断および非相同性末端連結から生じる標的化されたｙ変異の誘導）
３７℃で誘導されたｙＡの発現のレベルは、いくつかの独立した形質転換体において、幼虫期および胚期に適用された場合に致死性であることが見出された。熱ショックを３５℃に調整することにより、かなりのｙＡ保有ハエが生存できた。ｙＢ ＺＦＮは、試験したいかなる温度でも生存度に影響しなかった。

同じ染色体上にｙＡヌクレアーゼおよびｙＢヌクレアーゼを保有する個々のハエを交雑し、それらの子孫を熱ショックに供した後、雄性子孫において、ｙモザイクを示す子孫ならびに生殖系列変異が観察された。雄（後のＤＮＡ複製を除く）においては、単に簡単な再連結またはＮＨＥＪが、ＤＳＢ後の損傷を修復するために利用可能である。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａでは、多くの他の真核生物におけるように、ＮＨＥＪは、連結部位において欠失および／または挿入を頻繁に生じる。ＤＳＢがｙ^＋におけるタンパク質コード配列に標的化されるので、このような変化のほとんどが、フレームシフト、または必須コドンの欠失に至り、これは、ｙ変異体組織の斑の表現型に至り得る。

黄色（ｙｅｌｌｏｗ）身体モザイクが、多数のｙＡ＋ｙＢ雄において確認された。斑のほとんどは、遠位の腹部表皮および毛に存在したが、脚、羽、および鱗毛におけるいくつかの例もまた観察された。いかなる他の表現型欠陥も、通常には見られなかった。身体モザイクの頻度は、非常に高かった。多数の独立したｙＡ系統およびｙＢ系統を包含する交雑からのプールされたデータでは、２２８の候補の雄のうち１０５（４６％）が、明らかなｙ斑を示した。いくつかのｙＡ＋ｙＢ組み合わせでは、頻度は、８０％より高かった。単一のヌクレアーゼを有するコントロールまたは熱ショックを行わないコントロールにおいては、黄色モザイクは見られなかった。このことは、ｙＡ＋ｙＢ ＺＦＮが、それらの指定した標的で身体変異を誘導し得ることを示す。

（生殖系列ｙ変異の特徴づけ）
生殖系列ｙ変異を単離するために、いくつかの熱ショック実験からの全てのｙＡ＋ｙＢ雄を、固定したＸ染色体を保有する雌に交雑し［Ｃ（１）ＤＸ／Ｙ］、父親のＸ染色体のみを受け取ることが知られる雄性子孫を生成させた。全体において、２２８の雄性父親が５，８７０の息子を生じ；１３の異なる父親からの雄性子孫のうち２６が、明らかに、全身を通してｙであった。従って、ｙＡ＋ｙＢ雄の父親の５．７％が、少なくとも１つの生殖系列変異体を生じた。１３の父親のうち６が、ｙ体斑を有するとして同定されたが、他の７は、診断的特徴において全体的にｙ^＋であるようであった。ｙ雄に交雑した１２５の熱ショックｙＡ＋ｙＢ雌の７０５０の子孫間では、ｙハエは単離されなかった。ＺＦＮは、雄性生殖系列において最も効率的にＮＨＥＪを介して変異を誘導する際に有効であるようである。

標的ＤＮＡの存在についてそれらの各々を分析するために、上記で同定した１３の父親および５つのさらなる雄からＤＮＡを単離した。推定上の切断部位を含む６００ｂｐのフラグメントをＰＣＲによって増幅した。１８の雄ハエのうち３において、プライマーの１つについての結合部位が欠失されていたので、増幅を達成するために新規なプライマーを作製した。この新規なプライマーを、より遠い位置に配置した。全てのフラグメントの配列分析により、ちょうど標的部位において独特の変化が明らかになった。配列決定された変異体のうち、９が、単純な欠失を有し；５が、挿入を伴う欠失を有し；そして３が、単純な短い重複であった。欠失のうち３つが、標的の一方の側に数百ｂｐにわたって伸長しており、これらは、新規なプライマー設計を必要とする３つのサンプルであった。これらは、正確には、ｙＡ＋ｙＢ ＺＦＮによる切断後のＮＨＥＪから生じることが予測された変異のタイプであり、そしてそれらは、Ｐエレメント切り出し後に生成されたものに非常に類似している。フレームシフトｙ変異のいくつかは、変化の短い距離内に停止コドンを生じたが、あるものは、正常なリーディングフレームにアスパラギンコドンを挿入した。

（標的化切断および変異誘発）
本実施例は、永久的な遺伝子変化を生じるために、例示のゲノム中の標的染色体遺伝子座においてＤＳＢを生じるＺＦＮが、設計され得ることを実証した。観察された身体変異の頻度は非常に高かったので、身体モザイクの実数はずっと高いものであり得る。なぜなら、ｙ変異は、多くの可視的な特徴に対して影響を有しないからである。このことは、表現系的にｙ^＋の親からの生殖系列変異の回収によって確証され得る。

この特定の実施例において、生殖系列変異は、雄においてのみ、そして身体モザイクよりも低い濃度で回収された。

（実施例２：ＺＦＮ誘導二本鎖切断が、相同性ドナーＤＮＡの存在下で標的化された遺伝子組換えを刺激する）
（ジンクフィンガーおよびドナーＤＮＡ設計）
実施例１に記載のようにＤｒｏｓｏｐｈｉｌａの黄色（ｙｅｌｌｏｗ）（ｙ）遺伝子における染色体標的遺伝子座のために、一対のＺＦＮを設計し、そして構築した。

Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ遺伝子ｙについて同定可能なドナーＤＮＡを作製するために、ジンクフィンガーについてのｙＡ認識部位およびｙＢ認識部位を、２つのインフレーム停止コドンおよび１つのＸｈｏＩ部位で置換した。これらの変更を、所望の配列を有するＰＣＲプライマーを用いる増幅によって導入した。野生型ｙに対して、２１ｂｐを欠失させ、ｙＡ認識部位の３ｂｐのみを残し、そして９ｂｐ置換は、この２つのインフレーム停止コドンを挿入し、そしてＸｈｏＩ部位を挿入した。この変異体（ｙＭ）は、ｙ遺伝子座に対して全体で８ｋｂの相同性を有する。これをＰエレメントベクターに挿入し、そしてハエゲノムに導入した。ｙＭ配列は、ＦＬＰリコンビナーゼ（ＦＲＴ）およびメガヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの認識部位に隣接し、ドナーの切り出しおよび線状化を可能にする。この手段によるインサイチュでの線状染色体外ドナーＤＮＡの生成は、組換えにおいてその有効性を増強することが示されている。

（実験設計）
標的化された遺伝子組み換え実験の設計は、以下の通りである：ｙ^＋標的は、Ｘ染色体上にある。ｙＡ ＺＦＮおよびｙＢ ＺＦＮのための導入遺伝子は、一方の第２染色体上にあり、ＦＬＰおよび／またはＩ−ＳｃｅＩ（存在する場合）の導入遺伝子は、他方の第２染色体上にある。ドナーＤＮＡ（ｙＭ）は、白色（ｗｈｉｔｅ）遺伝子（Ｗ^＋）もまた有するＰエレメントベクター中の第３染色体上に位置する。これらの挿入された遺伝子の各々は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ＨＳＰ７０プロモーターの制御下にある。熱ショック誘導の際に、ＺＦＮは、ｙでそれらの標的を切断する。この破壊された染色体が野生型に回復され得るか、またはそれが、ＮＨＥＪによるか、または相同組換えによるかのいずれかでｙ変異を獲得し得る。ＦＬＰもＩ−ＳｃｅＩも存在しない場合、ドナーは、組み込まれたままである。ＦＬＰが発現される場合、ドナーは、染色体外環として切り出される。Ｉ−ＳｃｅＩがまた発現される場合、それは、ドナーを末端のない線状分子（ｅｎｄｓ−ｏｕｔ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に変換し、これは、切断された標的遺伝子座と組み換え得る。ｙＡおよびｙＢの存在しない場合にのみ（従って、標的を切断することなく）線状ドナーを用いた実験もまた行った。

これらの導入されたＤＮＡ成分の１コピーを有する幼虫を、産卵０〜４日後、１時間の間３５℃で熱ショックに供した。この実験は、以下に例証するような５つの群を含んだ：
ＮＤ、ドナーなし：ｙＡ＋ｙＢのみ；
ＩＤ、組み込まれたドナー：ｙＡ＋ｙＢ＋ドナー、ＦＬＰもＩ−ＳｃｅＩもなし；
ＣＤ、環状染色体外ドナー：ｙＡ＋ｙＢ＋ＦＬＰ＋ドナー；
ＬＤ、線状染色体外ドナー：ｙＡ＋ｙＢ＋ＦＬＰ＋Ｉ−ＳｃｅＩ＋ドナー；
ＤＯ、線状ドナーのみ：ＦＬＰ＋Ｉ−ＳｃｅＩ＋ドナー、但しＺＦＮなし。

熱ショックプロトコルから出現する成虫を交雑し、生殖系列ｙ変異を明らかにした。熱ショック処理から生じる生殖系列ｙ変異の頻度を表１の第３欄に示す。この変異頻度は、ドナーの存在する雄および雌の両方で上昇し、そしてその頻度は、染色体外の線状ＤＮＡと共にさらに増大した。線状染色体外ＤＮＡがある場合、ほぼ２０％の雄および１４％の雌が、少なくとも１つの変異体子孫を生じた。

さらなる交雑において、ｙ変異を繁殖させ、染色体ＤＮＡを回収した。生殖系列ｙ変異体の頻度、およびＮＨＥＪまたはドナーＤＮＡとの相同組換えのいずれかに起因する割合を、ｙ遺伝子の標的領域を含む６００ｂｐのＤＮＡのＰＣＲ増幅、続いてこの増幅産物のＸｈｏＩ消化によって決定した。ドナーと標的との間の相同組換え産物は、ＰＣＲフラグメントのＸｈｏＩ消化によって認識された；これらのいくつかおよびＸｈｏｌ耐性産物の多くを配列決定した。後者は、小さな欠失および／または挿入、および時折、より大きな欠失を示し、これらは全て、ＮＨＥＪに特徴的である。

表１の第４欄は、全子孫の割合として生殖系列変異体の回収率を記録する。ＮＨＥＪまたはドナーとの相同組換えのいずれかから生じるこれらの変異の割合は、ドナーＤＮＡが相同組換えに関与するのに有効になるにつれて、上昇した：線状ドナーＤＮＡは環状ドナーＤＮＡより有効であり、組み込まれたドナーＤＮＡよりも有効であった。第３染色体上に位置する組み込まれたドナーは、ｙでブレークを修復するための鋳型として供するのにあまり有効ではなく、回収された変異の大部分は、ＮＨＥＪに起因した。環状ドナーは、よりずっと有効であり、そして全ての変異のおよそ１／３が、遺伝子置換に起因することが決定された。線状ドナーがある場合、雄の全息子の２％より多くが変異体であり、そしてこれらの６３％が相同組換えの産物であった。雌性生殖系列においては、ｙ変異の７３％が、相同置換体であった。キメラＺＦＮによる標的切断は、標的化遺伝子組換えを実質的に刺激し、そしてドナーＤＮＡを宿主生物ゲノムに組み込む最も有効な方法は、線状ドナーＤＮＡを用いることである。

ＺＦＮ誘導標的化遺伝子組換えの結果は、いくつかの局面において、標的化切断を行うことなく得られた結果とは異なる。第一に、雄性生殖系列および雌性生殖系列の両方において誘導変異が見い出されたが、他の研究者らによる以前の試行では、雌のみが良好な頻度を有していた。明らかに、標的におけるＤＳＢの存在は、インタクトな染色体に対して効率的ではない雄における組換えプロセスを活性化する。雌においてより低い標的化頻度が観察されることは、切断されていない相同Ｘ染色体との組換えによりブレークを修復する可能性を反映し得る。第二に、誘導変異の全体頻度は、末端ありドナー（ｅｎｄｓ−ｉｎ ｄｏｎｏｒ）を有する雌においてｙで早期に見られたよりも、線状ＤＮＡ実験および環状ＤＮＡ実験における雄で約１０倍高かった：１／５００生殖体に対して約１／５０生殖体。雌性生殖系列においてさえ、ＺＦＮ誘導変異の頻度は、１／２００生殖体であり、そしてこれらの３／４は、遺伝子置換体であった。従って、相同ドナー（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ ｄｏｎｏｒ）の存在は、染色体外ドナーとの相互作用を除外しない。第三には、標的化された相同組換え体に加えて、ＮＨＥＪに起因する欠失および挿入もまた観察された。このような産物は、標的切断がない場合には、予期も観察もされなかった。

（実施例３：）
（標的化された変異の導入を刺激するためのＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおけるキメラＺＦＮの発現）
実験設計：本発明の方法は、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＴＲＡＮＳＰＡＲＥＮＴ ＴＥＳＴＡ ＧＬＡＢＲＡ１遺伝子（ＴＴＧ１、遺伝子番号ＡＴ５Ｇ２４５２０（ＧｅｎＢａｎｋ番号ＡＪ１３３７４３）を標的化し、そしてノックアウトするのに用いられる。この遺伝子のＥＳＴは配列決定されている（ＧｅｎＢａｎｋ番号Ｆ２００５５，Ｆ２００５６）。この遺伝子は、ＷＤ４０反復を含むタンパク質をコードする。

（１）Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＨＳＰ１８．２遺伝子由来のプロモーター領域をコードする核酸配列および（２）非特異的エンドヌクレアーゼをコードする核酸配列に作動可能に連結されたＴＴＧ１遺伝子に特異的なジンクフィンガータンパク質をコードする核酸配列からなる、２つのキメラＤＮＡ構築物が生成される。ＨＳＰ１８．２プロモーターは、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓにおいて発現を付与し、そして遺伝子発現は、得られた植物を熱ショックに供することにより制御される。このキメラ遺伝子は、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１ ＡおよびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂとも呼ばれる。これらの２つの遺伝子は、同じＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベクター中に組み込まれ得る。

全ての本発明者らの実験を、モデル遺伝的生物であるＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａを使用して行う。これは、この系の多くの所望の特性（小さなサイズ、小さなゲノムおよび速い増殖が挙げられる）のためである。ｔｔｇ１変異体は、特有の表現型を有し、これは、この変異体を優れた例示モデルにする。例えば、ｔｔｇ１変異体は、無毛であり、変異体植物は、葉および茎の毛状突起を欠く。毛状突起は、表皮からの毛様生成物（ｈａｉｒ−ｌｉｋｅ ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）である。

さらに、ｔｔｇ１変異体は、フラボノイド生成を欠損している。フラボノイドは複雑なクラスの化合物であり、紫色アントシアニン色素およびタンニンを含む。ＴＴＧ１タンパク質は、酵素ジヒドロフラボノールレダクターゼの合成を正に調節し、この酵素は、アントシアニンおよびタンニンの両方の生成に必要とされる。

これらのｔｔｇ１変異体はまた、透明な殻または種皮を有する。野生型では、この種皮（内部外皮の内部層）は高密度な褐色のタンニンを有し、そして、ｔｔｇ１変異体は、この色素を欠失している。結果として、ｔｔｇ１変異体から回収した種子の種皮は、透明であり、黄色胚が透明な種皮から見えるので、ｔｔｇ１変異体から回収した種は黄色である。

これらのｔｔｇ１変異体はまた、アントシアニンを欠失している。野生型では、実生、茎および葉が、特にストレス下で赤色／紫色アントシアニン色素を産生する。これらの色素は、ｔｔｇ１変異体に存在しない。

さらに、ｔｔｇ１変異体は、外根毛を生じる。野生型では、根毛は、発毛芽細胞のみから生じる。対照的に、ｔｔｇ１変異体では、根毛は発毛芽細胞および無毛芽細胞の両方により生じる。結果として、根がより毛様に見える。

ｔｔｇ１変異体はまた、種皮の外部層に粘液（ｍｕｃｉｌａｇｅ）を産生しない。粘液は、複雑な炭水化物であり、時々、種皮を覆う粘液（ｓｌｉｍｅ）と呼ばれる。最後に、ｔｔｇ１変異体は、変更された休眠状態を有し、ｔｔｇ１の種子は、出芽するために乾燥または冷却処理を必要としない。

７つ全ての特性の存在は、この変異体の遺伝型の視覚的なスクリーニングを容易な作業にする。

（ジンクフィンガーの設計）
ＴＴＧ１遺伝子を、以下の形状の配列について走査した：
ＮＮＹ ＮＮＹ ＮＮＹ ＮＮＮＮＮＮ ＲＮＮ ＲＮＮ ＲＮＮ
ここで、ＹはＴまたはＣのいずれかであり、ＲはＡまたはＧであり、そして、Ｎは任意の塩基である。この同定された配列は、ＡまたはＧから対向する方向（すなわち対向する鎖に）で開始され、正確に６ｂｐ離れるトリプレットからなった。このことは、ジンクフィンガーヌクレアーゼの認識および切断のための好ましい構造であることが示されている。

次いで、１において同定された配列のトリプレット成分を、それに特異的に結合することが知られるジンクフィンガーが存在するかどうかに従って分類した。ＴＴＧ１における２つの部位を、潜在的なＺＦＮ結合部位およびＺＦＮ切断部位として同定した：
５’−ＴＣＣ ＧＧＴ ＣＡＣ ＡＧＡ ＡＴＣ ＧＣＣ ＧＴＣ ＧＧＡ−３’（配列番号８）および５’−ＡＣＴ ＴＣＣ ＴＴＣ ＧＡＴ ＴＧＧ ＡＡＣ ＧＡＴ ＧＴＡ３’（配列番号９）（ＴＴＧ１配列のヌクレオチド４０６）。

第１のこれらの部位に結合するように設計された結合ドメインを含むジンクフィンガーヌクレアーゼを、オリゴヌクレオチド合成および伸長、または変異促進性プライマーを用いるＰＣＲのいずれかにより構築する。得られたコード配列を、プラスミドベクターにインフレームで挿入し、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインが２つのＺＦＮコード配列（ＺｎＴＴＧ１ＡおよびＺｎＴＴＧ１Ｂ）を生じる。コードタンパク質を、Ｅ．Ｃｏｌｉ中に発現させ、部分的に精製する。回収したＺＦＮを、ＴＴＧ１遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡを切断する能力について、インビトロで試験する。このアッセイにおける成功は、いずれかのＺＦＮ単独によっては切断されないが、２つのＺＦＮの混合物によって予測される部位で切断されることにより証明される。

（形質転換：）
ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ａ遺伝子およびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂ遺伝子を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介性形質転換を使用してＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのゲノムに導入する。こうするために、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１ＡおよびＢ遺伝子を、ハイグロマイシン耐性選択マーカーを有するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ Ｔ−ＤＮＡ形質転換ベクター（ｐＣＡＭＢＩＡ１３８０）に挿入する。次いで、ｐＣＡＭＢＩＡ ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１クローンを、標準のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ形質転換手順を用いてＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞に導入し、次いで、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１ＡおよびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂ遺伝子を、標準の花浸漬方法を用いてＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に導入する。

（宿主細胞におけるＺＦＮ発現の誘導）
Ｔ１世代からの種子を浸漬した植物から回収する。形質転換された実生を選択するために、Ｔ１種子を抗生物質（ハイグロマイシン）を含む寒天プレートに発芽させる。発芽の約４日後、発芽した実生を含むプレートをプラスチック製のラップで覆い、４０℃の水に２時間浸し、ＺＦＮ遺伝子の発現を誘導する。発芽の約２週間後、ハイグロマイシン耐性の形質転換実生を土に移す。

（遺伝子ターゲティング事象のスクリーニング：）
（スクリーニング方法１：）
ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１遺伝子を、野生型のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に導入し、Ｔ１植物を上記のように加熱する。熱処理の１〜２週間後、組織サンプルを熱処理植物から回収し、この組織からＤＮＡを抽出する。ジンクフィンガー標的部位に隣接する２０ｂｐのプライマー（標的部位の両側の２５ｂｐ）を用いるＰＣＲ増幅を使用し、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１遺伝子が存在するかどうかを決定する。熱処理をしないコントロール植物からのＰＣＲのバンドは、約９０ｂｐの大きさであるべきである。熱処理した植物からのＰＣＲのバンドは、ジンクフィンガー標的部位の周囲の欠失の存在による９０ｂｐよりも小さい産物を含むべきである。小さい欠失の存在を検証するために、本発明者らは、より小さいＰＣＲ産物をクローニングし、そのＤＮＡ配列を決定する。

（スクリーニング方法２：）
ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ａ遺伝子およびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂ遺伝を、野生型のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ植物に導入し、Ｔ１植物を上記のように熱処理する。Ｔ１植物を成熟まで成長させ、自家受粉を可能にし、Ｔ２種子を回収する。Ｔ２種子を寒天プレートで成長させ、これらを、以下に挙げる実生表現型についてスコア化する：無毛葉（無毛表現型）、より明るい葉（アントシアニンマイナス表現型）および上記のような根毛。変異体植物を、土に移してさらに成長させる。変異植物から組織を回収し、上記のようにＰＣＲスクリーニングのための調製物にＤＮＡを抽出する。簡単には、ジンクフィンガー標的部位に隣接するプライマーを用いてＰＣＲを行う。約９０ｂｐの産物を示すサンプルは形質転換されていないが、９０ｂｐ未満の産物を示すサンプルは形質転換されている。このことは、ジンクフィンガー標的部位の周囲の欠失の存在に起因する。さらに。小さな挿入またはより大きな欠失がまた、ジンクフィンガー標的部位の周囲に存在し得る。これらの発生の存在を検証するために、本発明者らは、より小さなＰＣＲ産物をクローニングし、そのＤＮＡ配列を決定する。

（スクリーニング方法３：）
ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ａ遺伝子およびＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１Ｂ遺伝子を、ヘテロ接合性のｔｔｇ１変異体（すなわち、遺伝型ｔｔｇ１／ＴＴＧ１）に導入する。雄性不妊１（ｍｓ１）植物を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ溶液に導入する（注釈：ｍｓ１座とｔｔｇ１座は連結しており、第５染色体上で６ｃＭ離れている）。次いで、浸漬した植物を、ホモ接合性のｔｔｇ１−１植物由来の花粉で受粉させる。交雑した植物を成熟させ、得られたＴ１／Ｆ１種子を回収し、そして、Ｔ１／Ｆ１種子をハイグロマイシンの存在下で発芽させる。生き残ったＴ１／Ｆ１実生は、ＨＳ：：ＺｎＴＴＧ１トランスジーンを有し、ｔｔｇ１座でヘテロ接合性（すなわち、遺伝型ＭＳ１−−ｔｔｇ１−１／ｍｓ１−−ＴＴＧ１）である。Ｔ１／Ｆ１植物は、上記のように熱処理される。細胞のサブセットにおいて、野生型の対立遺伝子がノックアウトされ、ホモ接合性のｔｔｇ１（すなわち、遺伝型ｔｔｇ１−１／ｔｔｇ１−ｋｏ）細胞のセクターが生じる。これらの変異体セクターは、いくつかの表現型（例えば、無毛の葉（無毛表現型）、明るい葉（アントシアニンマイナス表現型）および黄色種子（透明殻表現型））を可視化することにより検出可能（従って、標的化遺伝組換え事象）である。変異体セクターから組織を回収し、上で議論したＰＣＲ−クローニング−配列決定ストラテジーを使用して標的化を検証する。変異体セクターから、Ｔ２種子を回収し、Ｔ２植物に成長させる。Ｔ２世代において、表現型を検証する：ノックアウト対立遺伝子（すなわちｔｔｇ１−ｋｏ）についてホモ接合性の植物はまた、ｍｓ１変異体についてもホモ接合性であり、従って、雄性不妊（すなわち、遺伝型ｍｓ１−−ｔｔｇ１−ｋｏ／ｍｓ１−−ｔｔｇ１−ｋｏ）である。二重変異体（表現型的にｔｔｇ１およびｍｓ１）由来の組織を回収し、上で議論したＰＣＲ−クローニング−配列決定ストラテジーを使用して標的化について検証する。

本明細書中に開示および特許請求される全ての組成物、方法および装置は、本開示を考慮して過度の実験なしでなされ得、実行され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して記載されているが、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、改変が、組成物、方法および装置、ならびに本明細書中に記載される方法の工程においてまたは工程の順序において適用され得ることは当業者に明らかである。より詳細には、化学的および物理的に関連する特定の因子が本明細書中に記載される因子を代用し得るが、同様または類似の結果が達成されることが明らかである。当業者に明らかな全てのこのような類似の置換および改変は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内であるとみなされる。

配列表

Claims (21)

1. 宿主の植物細胞または昆虫細胞における標的化された遺伝子組換え方法であって、該方法は、以下：
   該宿主の植物細胞または昆虫細胞に、選択された宿主内因性標的遺伝子座に結合するように設計されたジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）をコードする核酸分子を導入する工程；
   該宿主細胞内での該ＺＦＮの発現を誘導する工程；および、
   該選択された宿主内因性標的遺伝子座にて変異を示す、宿主細胞を同定する工程、
   を包含する、方法。
2. 前記変異は、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、ならびに遺伝物質の欠失および挿入からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. ドナーＤＮＡが標的化された遺伝子組換えにより前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれるように該宿主細胞に該ドナーＤＮＡを挿入する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
4. 前記ドナーＤＮＡは、前記宿主細胞中で産生される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項３に記載の方法。
5. 前記ドナーＤＮＡは、タンパク質産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項４に記載の方法。
6. 前記宿主細胞は、昆虫細胞である、請求項１に記載の方法。
7. 前記宿主細胞は、植物細胞である、請求項１に記載の方法。
8. 宿主の植物細胞または昆虫細胞における標的化された遺伝子組換え方法であって、該方法は、以下：
   変異されるべき特定の宿主標的遺伝子座に優先的に結合し得るジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを選択する工程；
   該結合ドメインに作動可能に連結されて該宿主の植物細胞または昆虫細胞に導入された場合、二本鎖ＤＮＡを切断し得る、非特異的なＤＮＡ切断ドメインを選択する工程；
   該宿主細胞における発現を誘導し得る誘導性制御エレメントを選択する工程；
   該結合ドメインおよび該切断ドメインをコードするＤＮＡと、該誘導性制御エレメントとを作動可能に連結して、ＤＮＡ構築物を作製する工程；
   該ＤＮＡ構築物を標的宿主細胞に導入する工程；ならびに、
   該宿主ＤＮＡ中の該標的遺伝子座において組換えを示す少なくとも１つの宿主細胞を同定する工程、
   を包含する、方法。
9. ドナーＤＮＡが標的化された遺伝子組換えにより前記宿主細胞のゲノム中に組み込まれるように該ドナーＤＮＡを該宿主細胞に導入する工程をさらに包含する、請求項８に記載の方法。
10. 前記ドナーＤＮＡは、前記宿主細胞中で産生される産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項９に記載の方法。
11. 前記ドナーＤＮＡは、タンパク質産物をコードする遺伝子配列を提供する、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ＤＮＡ結合ドメインは、３つのジンクフィンガーから構成される、請求項８に記載の方法。
13. 前記ジンクフィンガーは、Ｃｙｓ_２Ｈｉｓ_２ジンクフィンガーからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
14. 前記切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
15. 前記ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである、請求項８に記載の方法。
16. 前記制御エレメントは、熱ショック誘導性制御エレメントからなる群より選択される、請求項８に記載の方法。
17. 前記宿主細胞は、昆虫細胞である、請求項９に記載の方法。
18. 前記宿主細胞は、植物細胞である、請求項９に記載の方法。
19. 前記ＤＮＡ結合ドメインは、３つのジンクフィンガーから構成される、請求項９に記載の方法。
20. 前記切断ドメインは、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。
21. 前記制御エレメントは、熱ショック誘導性制御エレメントからなる群より選択される、請求項９に記載の方法。