JP2024520676A

JP2024520676A - Ｎｒ４ａ３欠損免疫細胞及びその使用

Info

Publication number: JP2024520676A
Application number: JP2023574474A
Authority: JP
Inventors: ラム，ヴィオラ; クリスティーナリン，レイチェル
Original assignee: Lyell Immunopharma Inc
Current assignee: Lyell Immunopharma Inc
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2022-06-01
Publication date: 2024-05-24
Also published as: CA3177712A1; AU2022286947A1; TW202306577A; US20230052243A1; EP4347826A1; KR20240027676A; AU2022286947A9; WO2022256437A1

Abstract

本開示は、免疫細胞のエフェクター機能の持続を促進する方法を提供し、該方法は、該細胞を、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下するように改変することを含む。同様に提供するのは、改変された細胞、例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変された免疫細胞である。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現させると同時にＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルを低下させることにより、アポトーシス抵抗性であり、かつ免疫チェックポイント抵抗性でもある疲弊／機能不全耐性の細胞がもたらされ、また、腫瘍微小環境での抗腫瘍機能の維持ももたらされる。

Description

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０２１年６月２日に出願された米国仮出願第６３／１９５，９５６号、及び２０２２年５月１９日に出願された米国仮出願第６３／３６５，０２３号の優先権の利益を主張する。当該仮出願の各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

ＥＦＳ－ＷＥＢを介して電子的に提出された配列表の参照
本出願にて提出された、電子的に提出された配列表（名称：４３８５＿０８７ＰＣ０２＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、サイズ：９７，２１８バイト、作成日：２０２２年６月１日）の内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

本開示は、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびにｃ－ＪＵＮが過剰発現するように改変された免疫細胞の投与を含む、細胞ベース（例えば、Ｔ細胞）のがん免疫療法に関する。

がん免疫療法は、感染細胞及び異常細胞の免疫系の主なキラーであるＴ細胞に、腫瘍細胞を攻撃及び殺傷させることに依存している。しかしながら、免疫療法には重要な障害がある。Ｔ細胞の殺傷能力は衰える場合があり、しばしば疲弊と呼ばれる現象が存在する。免疫チェックポイント遮断、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法、及びＴ細胞受容体で操作された（ＴＣＲ）Ｔ細胞療法は、患者から単離した機能的に活性なＴ細胞を使用する、有効であるためには高度に機能的なＴ細胞が必要な治療である。これらのＴ細胞は、標的がん細胞の特定の抗原を認識するように操作され、エキソビボで拡大される。

免疫系が、例えば、持続的なウイルス感染またはがんの漸進的発達により長時間活性を有することを強いられると、エフェクターＴ細胞が疲弊する可能性がある。疲弊したＴ細胞の１つの特徴は、ＰＤ－１及びＣＴＬＡ－４のような免疫チェックポイントタンパク質の発現が増加することであり、これにより、それらＴ細胞の離脱が引き起こされ得る（すなわち、非機能的になる）。免疫チェックポイント阻害剤は、これらのチェックポイントタンパク質を遮断し、その際、腫瘍に対する免疫応答を高めることができる。いくつかの研究により、疲弊したＴ細胞においては、チェックポイントタンパク質の活性を遮断することは、この目的を達成しないことが示唆された。このことは、いわゆる炎症性腫瘍（ｈｏｔｔｕｍｏｒ）、すなわち、高レベルの免疫細胞を含み、ひいては免疫療法に応答するための理想的な候補となるはずである腫瘍が、多くの場合、ほとんどが疲弊したＴ細胞から構成される集団を含むことから重要である。さらに、腫瘍微小環境は、老化及び疲弊した細胞表現型を誘導し得る。したがって、これらの疲弊した状態を逆転及び／または防止する戦略を考案することは、免疫療法の有効性の改善に極めて重要である。

いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａメンバー１（ＮＲ４Ａ１）遺伝子及び／またはタンパク質、ＮＲ４Ａメンバー２（ＮＲ４Ａ２）遺伝子及び／またはタンパク質、ならびにＮＲ４Ａメンバー３（ＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質からなる群から選択される核内受容体サブファミリー４グループＡ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルの低下ならびに（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルの増加を発現する改変された免疫細胞の集団を含む細胞組成物を提供する。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルは、参照細胞組成物（例えば、細胞が、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞組成物）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該リンパ球はＴ細胞である。いくつかの態様では、該Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、操作されたＴＣＲを含む。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、腫瘍抗原に特異的に結合するＣＡＲ及び／またはＴＣＲを含む。いくつかの態様では、該ＣＡＲ及び／または該ＴＣＲは、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＴｎＡｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＡＧＥＡｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ変異体タンパク質）、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する。

いくつかの態様では、該ＣＡＲ及び／または該ＴＣＲは、ＲＯＲ１に特異的に結合する。いくつかの態様では、該ＣＡＲは、Ｒ１２、Ｒ１１、２Ａ２、またはそれらの任意の組み合わせに由来する抗原結合ドメインを含む。いくつかの態様では、該ＣＡＲは、配列番号１７を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号２１を含む軽鎖可変ドメインを含む。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞の集団は、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満のエフェクターＴ細胞を有する。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞の集団は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％のナイーブＴ（Ｔ_Ｎ）細胞、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）、幹メモリーＴ（Ｔ_ＳＣＭ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、遺伝子編集ツールでＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるように改変されている。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールは、（ｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのレベルを低下させることが可能である。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールは、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲである。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む。

いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。

いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、該改変された免疫細胞がｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列で改変されている。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｂ）配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｃ）配列番号１０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｄ）配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｅ）配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｆ）配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｇ）配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｈ）配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、または（ｉ）配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を高めることが可能な転写活性化因子で改変されている。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞の集団は、参照免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、対象において１つ以上の特性の向上を示す。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞の１つ以上の特性の向上は、（ｉ）増殖の向上、（ｉｉ）細胞傷害性の向上、（ｉｉｉ）サイトカイン発現の向上、（ｉｖ）持続性の向上、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、サイトカイン発現の向上を示す。いくつかの態様では、該サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様では、該ＩＬ－２の発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＩＬ－２の発現レベルと比較して、少なくとも約２倍～少なくとも約１０倍に増加する。いくつかの態様では、該ＩＦＮ－γの発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＩＦＮ－γの発現レベルと比較して、少なくとも約２倍～少なくとも約１０倍に増加する。いくつかの態様では、該ＴＮＦ－αの発現レベルは、参照免疫細胞の集団におけるＴＮＦ－αの発現レベルと比較して、少なくとも約２倍～少なくとも約１０倍に増加する。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、参照免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、疲弊または機能不全の減少を示す。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、アポトーシスの減少を示すか、またはアポトーシスを示さない（アポトーシス抵抗性）。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、減少した免疫チェックポイントマーカーを発現する（免疫チェックポイント抵抗性である）。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、（ｉ）低酸素環境での活性の向上、（ｉｉ）低栄養（すなわち、グルコース）環境での活性の向上、（ｉｉｉ）抑制性代謝産物／サイトカイン（例えば、アデノシン、ＴＧＦ－β、ＲＯＳ等）の存在下での活性の向上、（ｉｖ）抑制細胞（例えば、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ等）への曝露時の活性の向上、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを示す。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の改変された免疫細胞の集団及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、腫瘍の治療を必要とする対象におけるその治療方法を提供し、該方法は、該対象に対して、本明細書に記載の細胞組成物または医薬組成物を投与することを含む。いくつかの態様では、該投与により、該対象における腫瘍体積が、参照腫瘍体積（例えば、該投与の前の該対象における腫瘍体積及び／または該投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して減少する。いくつかの態様では、該腫瘍体積は、該投与後に、参照腫瘍体積（例えば、該投与の前の該対象における腫瘍体積及び／または該投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。いくつかの態様では、該投与により、該対象における腫瘍重量が、参照腫瘍重量（例えば、該投与の前の該対象における腫瘍重量及び／または該投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して減少する。いくつかの態様では、該腫瘍重量は、該投与後に、参照腫瘍重量（例えば、該投与の前の該対象における腫瘍重量及び／または該投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。

いくつかの態様では、該投与により、該対象における免疫細胞の１つ以上の特性が向上する。いくつかの態様では、該免疫細胞の特性の向上は、（ｉ）増殖の向上、（ｉｉ）細胞傷害性の向上、（ｉｉｉ）サイトカイン発現の向上、（ｉｖ）持続性の向上、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該投与により、サイトカイン発現が向上する。いくつかの態様では、該サイトカインは、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該投与により、該免疫細胞の疲弊または機能不全が減少するか、または防止される。いくつかの態様では、該免疫細胞は、アポトーシスの減少を示すか、またはアポトーシスを示さない（アポトーシス抵抗性）。いくつかの態様では、該免疫細胞は、免疫チェックポイントマーカーの低下を示すかまたは免疫チェックポイントマーカーを示さない（免疫チェックポイント抵抗性である）。いくつかの態様では、該免疫細胞は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する。いくつかの態様では、該免疫細胞は、（ｉ）低酸素環境での活性の向上、（ｉｉ）低栄養（すなわち、グルコース）環境での活性の向上、（ｉｉｉ）抑制性代謝産物／サイトカイン抵抗性（アデノシン、ＴＧＦ－β、ＲＯＳ等）の存在下での活性の向上、（ｉｖ）抑制細胞（ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ等）への曝露時の活性の向上、またはそれらの任意の組み合わせを示す。

いくつかの態様では、該腫瘍は、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）癌、胃腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する。

いくつかの態様では、該方法は、該対象に対して、さらなる治療薬を投与することを含む。いくつかの態様では、該さらなる治療薬は、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの治療、サイトカイン、外科手術、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該さらなる治療薬は、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの態様では、該免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、及びそれらの任意の組み合わせを含む。

いくつかの態様では、該さらなる治療薬及び該細胞組成物は、同時に投与される。いくつかの態様では、該さらなる治療薬及び該細胞組成物は、連続して投与される。いくつかの態様では、該細胞組成物は、非経口投与、筋肉内投与、皮下投与、点眼、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、眼窩内投与、脳内投与、頭蓋内投与、脊髄内投与、心室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、嚢内投与、腫瘍内投与、またはそれらの任意の組み合わせで投与される。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の免疫細胞（または細胞組成物）の調製方法を提供し、該方法は、該細胞を遺伝子編集ツールで改変することであって、該遺伝子編集ツールが、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のいずれか１つの発現を減少させる、該改変すること、ならびにｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように該免疫細胞を改変することを含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように該免疫細胞を改変することは、該免疫細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列と接触させることを含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように該免疫細胞を改変することは、該免疫細胞を、内因性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を増加させることが可能な転写活性化因子と接触させることを含む。いくつかの態様では、該転写活性化因子は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されたＣａｓタンパク質に結合される。

同様に本明細書に提供するのは、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現する、ならびにＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルが低下した細胞の産生方法であり、該方法は、該細胞を、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び（ｉｉ）遺伝子編集ツールで改変することを含み、該遺伝子編集ツールは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させることが可能であり、該ｇＲＮＡは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

いくつかの態様では、本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞の疲弊を低減または阻害する方法を提供し、該方法は、該細胞を、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変すること、ならびに該細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変することを含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現の低下により、該細胞の疲弊が低減または阻害される。

いくつかの態様では、該細胞は、免疫細胞である。いくつかの態様では、該細胞におけるＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルは、参照細胞組成物（例えば、細胞が、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞組成物）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。

いくつかの態様では、該細胞を改変することは、該細胞を、該細胞における該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルを低下させることが可能な遺伝子編集ツールと接触させることを含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように該細胞を改変することは、該免疫細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列と接触させることを含む。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように該免疫細胞を改変することは、該免疫細胞を、内因性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を増加させることが可能な転写活性化因子と接触させることを含む。いくつかの態様では、該転写活性化因子は、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されたＣａｓタンパク質に結合される。

いくつかの態様では、本開示はさらに、抗原刺激に応答して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞によってサイトカインの産生を増加させる方法を提供し、該方法は、該細胞を、（ｉ）該細胞が改変後にｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列で改変すること、及び（ｉｉ）遺伝子編集ツールで改変することを含み、該遺伝子編集ツールは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させることが可能であり、該ｇＲＮＡは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

いくつかの態様では、該サイトカインは、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、該改変後、該抗原刺激に応答した該サイトカインの産生は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎのヌクレオチド配列及び／または遺伝子編集ツールで改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する。

本開示はまた、持続抗原刺激に応答して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞のエフェクター機能を増加させる方法を提供し、該方法は、該細胞を、（ｉ）該細胞が改変後にｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列で改変すること、及び（ｉｉ）遺伝子編集ツールで改変することを含み、該遺伝子編集ツールは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させることが可能であり、該ｇＲＮＡは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。

いくつかの態様では、該改変後、該細胞は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎのヌクレオチド配列及び／または遺伝子編集ツールで改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回のさらなる抗原刺激アッセイに対してエフェクター機能を保持する。いくつかの態様では、該エフェクター機能は、（ｉ）標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺傷する能力、（ｉｉ）さらなる抗原刺激時にサイトカインを産生する能力、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の方法によって調製される細胞組成物を提供する。いくつかの態様では、本明細書に提供するのは、（ａ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｂ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加し、かつ（ｂ）（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせの発現レベルが低下した細胞を含む細胞組成物であり、該細胞は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるｇＲＮＡで改変されている。いくつかの態様では、該細胞組成物は、インビボ細胞である。いくつかの態様では、該細胞は、エキソビボ細胞またはインビトロ細胞である。いくつかの態様では、医薬組成物は、該細胞を含む。

いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびに本明細書に記載の方法に従って腫瘍を治療するための使用説明書を含むキットを提供する。いくつかの態様では、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびに本明細書に記載の方法に従って細胞組成物を調製するための使用説明書を含むキット。

いくつかの態様では、本開示は、腫瘍の治療を必要とする対象への投与を含む、該対象における腫瘍の治療の薬剤の製造のための本明細書に記載の細胞組成物または医薬組成物の使用を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、腫瘍の治療を必要とする対象への投与を含む、該対象における腫瘍の治療のための本明細書に記載の医薬組成物の細胞組成物を提供する。

独立した４ドナーでの、２時間のＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄ刺激後、ＣＡＲＴ細胞産生の７日目におけるｃ－Ｊｕｎを過剰発現する（「＋ｃ－Ｊｕｎ」）または過剰発現しない（「－ｃ－Ｊｕｎ」）ＮＲ４Ａ３編集（「ＮＲ４Ａ３ＫＯ」）及び対照非編集ＣＤ４^＋（左）及びＣＤ８^＋（右）ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞のＮＲ４Ａ３発現のパーセンテージを示す（刺激、塗りつぶした円）。未刺激細胞（中抜き円、Ｄｙｎａｂｅａｄなし）は、陰性対照として使用した。刺激条件の対応のないｔ検定を統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＣＡＲＴ細胞産生の７日目の４ドナーからの、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ１編集（「ＮＲ４Ａ１ＫＯ」）、ＮＲ４Ａ２編集（「ＮＲ４Ａ２ＫＯ」）、ＮＲ４Ａ３編集（「ＮＲ４Ａ３ＫＯ」）、及び対照非編集ＣＤ４^＋（中抜き円）及びＣＤ８^＋（塗りつぶした円）ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞のＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋ＲＯＲ１ＣＡＲの発現のパーセンテージ（左）及びＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋Ｔ細胞でのＲＯＲ１ＣＡＲの幾何平均蛍光（右）を示す。刺激条件の対応のないｔ検定を統計分析に使用したところ、有意ではなかった。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞による、独立した４ドナーでの連続刺激アッセイにおけるＨ１９７５－ＮＬＲＮＳＣＬＣ細胞の連続的な抗ＲＯＲ１溶解を示す。示される異なる群は、以下を含む：（ａ）ＮＲ４Ａ１ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（三角）、（ｂ）ＮＲ４Ａ２ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（星）、（ｃ）ＮＲ４Ａ３ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（黒円）、（ｄ）対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞でｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（ｘ記号）、（ｅ）ＮＲ４Ａ１ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（ひし形）、（ｆ）ＮＲ４Ａ２ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（アスタリスク）、（ｇ）ＮＲ４Ａ３ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（中抜き円）、（ｈ）対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞でｃ－Ｊｕｎ過剰発現（縦線）、及び（ｉ）非形質導入ｍｏｃｋＴ細胞（四角）。Ｈ１９７５－ＮＬＲ標的細胞の溶解は、全ＮＬＲ強度を測定することによって定量化した。ＮＬＲ強度は、刺激回ごとに再プレーティングした後の開始強度に対して正規化した。ＮＬＲ－ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ．各グラフは、独立した４ドナーからのデータを示す。図３に対応するＨ１９７５連続刺激アッセイ中のｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞から生じた、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）の分泌を示す。示される異なる群は、図３と同じである。各再プレーティングの２４時間後に上清を回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。グラフは、独立した４ドナーからのデータを示す。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。図３に対応するＨ１９７５連続刺激アッセイ中のｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞から生じた、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の分泌を示す。示される異なる群は、図３と同じである。各再プレーティングの２４時間後に上清を回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。グラフは、独立した４ドナーからのデータを示す。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。図３に対応するＨ１９７５連続刺激アッセイ中のｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞から生じた、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）の分泌を示す。示される異なる群は、図３と同じである。各再プレーティングの２４時間後に上清を回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。グラフは、独立した４ドナーからのデータを示す。エラーバーは、三連ウェルの平均＋／－ＳＤを表す。図３に対応するＨ１９７５連続刺激アッセイ中の各再プレーティング後のｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集及び対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞からのＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋ＣＤ４^＋（上）及びＣＤ８^＋（下）Ｔ細胞でのＲＯＲ１ＣＡＲのＲＯＲ１ＣＡＲ発現のパーセンテージを示す。示される異なる群は、以下を含む：（ａ）ＮＲ４Ａ１ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（三角）、（ｂ）ＮＲ４Ａ２ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（星）、（ｃ）ＮＲ４Ａ３ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（黒円）、（ｄ）対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞でｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（ｘ記号）、（ｅ）ＮＲ４Ａ１ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（ひし形）、（ｆ）ＮＲ４Ａ２ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（アスタリスク）、（ｇ）ＮＲ４Ａ３ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（中抜き円）、及び（ｈ）対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞でｃ－Ｊｕｎ過剰発現（縦線）。図３に対応するＨ１９７５連続刺激アッセイ中に、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集及び対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞から予測されるＣＤ３^＋ＲＯＲ１ＣＡＲ^＋Ｔ細胞数における倍率変化を示す。予測される細胞数は、次回の刺激に細胞の２５％の移動が含まれると計算した。倍率変化は、（刺激から予測される細胞数／前回の刺激から予測される細胞数）として計算した。グラフは、独立した４ドナーからのデータを示す。示されている群は、図３と同じである。図３における２回目の刺激に対応するＨ１９７５連続刺激アッセイからのｃ－Ｊｕｎを過剰発現する（「＋ｃＪｕｎ」）または過剰発現しない（「－ｃＪｕｎ」）ＮＲ４Ａ３編集（「ＮＲ４Ａ３ＫＯ」）及び対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞からのＲＯＲ１ＣＡＲ^＋ＣＤ４^＋（上）及びＣＤ８^＋（下）Ｔ細胞での抑制性受容体（ＴＩＭ３、ＣＤ３９、及びＰＤ１）の発現を示す。対応のあるｔ検定を統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。ｎ＝独立した４ドナー。Ａ及びＢは、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３のレベルが低下するように改変された（トリプルＫＯ、ＮＲ４ＡＴＫＯ）抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞による、Ａ５４９－ＮＬＲ及びＨ１９７５－ＮＬＲ細胞の連続的な溶解をそれぞれ示す。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しかつ編集なしの抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞（内因性レベルのＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３を含む「対照ＲＯＲ１ＣＡＲ」）ならびに未処理の標的細胞（「標的単独」）は、対照として示されている。標的細胞の溶解は、全ＮＬＲ強度を測定することによって定量化した。ＮＬＲ強度は、刺激回ごとに再プレーティングした後の開始強度に対して正規化した。ＮＬＲ－ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ．Ａ及びＢは、それぞれ、Ａ５４９及びＨ１９７５標的細胞を使用した、連続刺激アッセイ（図７Ａ及び７Ｂ参照）での、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３のレベルが低下するように改変された（トリプルノックアウト（ＮＲ４ＡＴＫＯ、黒いバー）抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞によって産生されたＩＦＮ－γのレベルを示す。上清を、各再プレーティングの２４時間後（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、刺激４、及び刺激５）に回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しかつ編集なしの抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞（内因性レベルのＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３を含む「対照ＲＯＲ１ＣＡＲ」）は、対照として示されている（グレーのバー）。Ａ及びＢの各々において、独立した３ドナーからの結果が示されている。対応のないｔ検定を統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ａ及びＢは、それぞれ、Ａ５４９及びＨ１９７５標的細胞を使用した、連続刺激アッセイ（例えば、図７Ａ及び７Ｂ参照）での、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３のレベルが低下するように改変された（トリプルノックアウト（ＮＲ４ＡＴＫＯ）、黒いバー）抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞によって産生されたＩＬ－２のレベルを示す。上清を、各再プレーティングの２４時間後（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、刺激４、及び刺激５）に回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しかつ編集なしの抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞（内因性レベルのＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３を含む「対照ＲＯＲ１ＣＡＲ」）は、対照として示されている（グレーのバー）。Ａ及びＢの各々において、独立した３ドナーからの結果が示されている。対応のないｔ検定を統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ａ及びＢは、それぞれ、Ａ５４９及びＨ１９７５標的細胞を使用した、連続刺激アッセイ（例えば、図７Ａ及び７Ｂ参照）での、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３のレベルが低下するように改変された（トリプルノックアウト（ＮＲ４ＡＴＫＯ、黒いバー）抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞によって産生されたＴＮＦ－αのレベルを示す。上清を、各再プレーティングの２４時間後（すなわち、刺激１、刺激２、刺激３、刺激４、及び刺激５）に回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しかつ編集なしの抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞（内因性レベルのＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３を含む「対照ＲＯＲ１ＣＡＲ」）は、対照として示されている（グレーのバー）。Ａ及びＢの各々において、独立した３ドナーからの結果が示されている。対応のないｔ検定を統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｈ１９７５標的細胞を使用した、連続刺激アッセイ（例えば、図７Ａ及び７Ｂ参照）での、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３のレベルが低下するように改変された（トリプルノックアウト（ＮＲ４ＡＴＫＯ）、三角）抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞の持続性を示す。ＮＲ４Ａ編集抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞及び対照群は、図７Ａ及び７Ｂに記載のものと同じである。持続性は、各連続刺激後（すなわち、刺激－１、刺激－２、刺激－３、刺激－４）のｃＰａｒｐ（－）ＣＤ３＋ＥＧＦＲ＋ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞の数をフローサイトメトリーで定量化することによって測定した。独立した３ドナーでの、２時間のＰＭＡ＋イオノマイシン刺激後、ＴＣＲＴ細胞産生の７日目におけるｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたは過剰発現しないＮＲ４Ａ３編集（ＫＯ）及び対照非編集ＣＤ４＋（左のグラフ）及びＣＤ８＋（右のグラフ）ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞のＮＲ４Ａ３発現のパーセンテージを示す（刺激、塗りつぶした円）。未刺激細胞（中抜き円、ＰＭＡ＋イオノマイシン刺激なし）は、陰性対照として使用した。刺激条件の対応のないｔ検定を統計分析に使用した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。ＴＣＲＴ細胞産生の７日目の３ドナーからの、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ１編集、ＮＲ４Ａ２編集、ＮＲ４Ａ３編集（ＫＯ）、及び対照非編集ＣＤ４＋（中抜き円）及びＣＤ８＋（塗りつぶした円）ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞のＴＣＲｖ１３．１＋ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲの発現のパーセンテージ（左のグラフ）及びＴＣＲｖ１３．１＋Ｔ細胞でのＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲの幾何平均蛍光（右のグラフ）を示す。対応のないｔ検定を統計分析に使用した。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。独立した３ドナーからのｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集（ＫＯ）、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞による、連続刺激アッセイにおけるＮＹ－ＥＳＯ－１＋Ａ３７５－ＮＬＲメラノーマ細胞の連続的な溶解を示す。具体的には、示される異なるＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞は、以下を含む：（ａ）ＮＲ４Ａ１ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（三角）、（ｂ）ＮＲ４Ａ２ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（星）、（ｃ）ＮＲ４Ａ３ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（黒円）、（ｄ）対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞でｃ－Ｊｕｎ過剰発現なし（ｘ記号）、（ｅ）ＮＲ４Ａ１ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（ひし形）、（ｆ）ＮＲ４Ａ２ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（アスタリスク）、（ｇ）ＮＲ４Ａ３ノックアウトでｃ－Ｊｕｎ過剰発現（中抜き円）、（ｈ）対照非編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞でｃ－Ｊｕｎ過剰発現（縦線）、及び（ｉ）非形質導入ｍｏｃｋＴ細胞（四角）。Ａ３７５－ＮＬＲ標的細胞の溶解は、全ＮＬＲカウントを測定することによって定量化した。ＮＬＲカウントは、刺激回ごとに再プレーティングした後の開始カウントに対して正規化した。ＮＬＲ－ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ．各グラフは、独立したドナーからのデータを表す。図１４に対応するＡ３７５連続刺激アッセイ中のｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞から生じた、インターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）の分泌を示す。上清を、各再プレーティングの２４時間後に回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。様々な群は、図１４に記載のものと同じである。グラフは、独立した３ドナーからのデータを示す。図１４に対応するＡ３７５連続刺激アッセイ中のｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞から生じた、インターロイキン－２（ＩＬ－２）の分泌を示す。上清を、各再プレーティングの２４時間後に回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。様々な群は、図１４に記載のものと同じである。グラフは、独立した３ドナーからのデータを示す。図１４に対応するＡ３７５連続刺激アッセイ中のｃ－Ｊｕｎを過剰発現するまたはしないＮＲ４Ａ編集、対照非編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞、及びｍｏｃｋ未形質導入Ｔ細胞から生じた、腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）の分泌を示す。上清を、各再プレーティングの２４時間後に回収し、サイトカインをＭＳＤによって定量化した。様々な群は、図１４に記載のものと同じである。グラフは、独立した３ドナーからのデータを示す。

本開示は、（ｉ）核内受容体サブファミリー４グループＡ（ＮＲ４Ａ）のメンバー１（ＮＲ４Ａ１）、メンバー２（ＮＲ４Ａ２）もしくはメンバー３（ＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下し、かつ（ｉｉ）転写因子ｃ－Ｊｕｎの発現レベルが増加した改変された免疫細胞の集団を含む組成物を対象とする。本明細書でさらに記載するように、いくつかの態様では、本開示に有用な免疫細胞は、ＮＲ４Ａファミリーの単一のメンバーの発現レベルが低下するように改変されている（「単一ノックアウト」）。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎのレベルが増加ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎのレベルが増加ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎのレベルが増加ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、本開示に有用な免疫細胞は、ＮＲ４Ａファミリーの２つのメンバーの発現レベルが低下するように改変されている（「ダブルノックアウト」）。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎのレベルが増加ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎのレベルが増加ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎのレベルが増加ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、本開示に有用な免疫細胞は、ＮＲ４Ａファミリーのすべてのメンバーの発現レベルが低下するように改変されている（「トリプルノックアウト」）。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎのレベルが増加ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の各々のレベルが低下している。該ＮＲ４Ａ遺伝子のレベルの低下は、遺伝子編集技術、例えば、ＣＲＩＳＰＲ等の遺伝子編集技術を使用して達成され得る。本開示から明らかなように、特に明記しない限り、「ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質」という用語は、本明細書に記載のＮＲ４Ａ単一ノックアウト、ダブルノックアウト、及びトリプルノックアウトのいずれかを含む。

ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質発現のレベルの低下と、転写因子ｃ－Ｊｕｎの発現レベルの増加の両方により、例えば、本明細書に記載の免疫細胞等の免疫細胞において、１つ以上の持続的なエフェクター機能につながり得る。持続的なエフェクター機能の１つの態様は、Ｔ細胞活性化の向上（例えば、増殖の向上、細胞傷害性の向上、サイトカイン発現の向上）である。ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質（またはそれらの組み合わせ）のレベルの低下、ならびに転写因子ｃ－Ｊｕｎの発現レベルの増加により、疲弊／機能障害抵抗性細胞がもたらされ得る。さらに、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低下させ、転写因子ｃ－Ｊｕｎの発現レベルを増加させることにより、ＴＭＥ環境において抗腫瘍機能の維持がもたらされ得る。

本開示はまた、例えば、腫瘍の治療を必要とする対象におけるその治療方法を提供し、該方法は、該対象に対して、本明細に記載の細胞組成物（例えば、（ｉ）ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルが低下及び（ｉｉ）該ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加するように改変されている免疫細胞を含む組成物）を投与することを含む。

本開示はまた、例えば、（ｉ）核内受容体サブファミリー４グループＡのメンバー（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２もしくはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質のうちの１つの発現レベルならびに他の２つのＮＲ４Ａメンバー（例えば、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及びタンパク質、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３遺伝子及びタンパク質、またはＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３遺伝子及びタンパク質）の内因性の発現レベルが低下し、かつ（ｉｉ）転写因子ｃ－Ｊｕｎの発現レベルが増加した、改変された免疫細胞を生成する方法、該改変された免疫細胞の使用方法、該改変された免疫細胞を含む医薬組成物、または該改変された免疫細胞を含むキットを提供する。本明細書でさらに記載するように、いくつかの態様では、本開示はまた、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加し、該ＮＲ４Ａファミリーの２つまたは３つすべてのメンバーのレベルが低下した、改変された免疫細胞を生成する方法を提供する。

本開示を詳細に記載する前に、本開示が、記載される特定の組成物またはプロセスステップに限定されず、したがって、当然のことながら様々であり得ることを理解されたい。本開示の読後に当業者には明らかになる通り、本明細書に記載及び例示される個々の態様の各々は、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの態様のうちのいずれかの特徴から容易に切り離され得るか、またはそれと組み合わされ得る別々の構成要素及び特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順序で行われる場合もあれば、論理的に可能な任意の他の順序で行われる場合もある。

本明細書に示される見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、本開示の態様は、本明細書の全体を参照することによって定義され得るものである。本明細書で使用される専門用語は、特定の態様を説明するためのものにすぎず、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。

Ｉ．用語
本開示をより容易に理解することができるようにするため、ある特定の用語を最初に定義する。本出願で使用される場合、本明細書に別段明記されない限り、以下の用語の各々は、下記に記載する意味を有するものとする。さらなる定義は、本出願の全体を通じて記載される。

本開示全体を通して、用語「ａ」または「ａｎ」実体は、その実体の１つ以上を指し、例えば、「免疫細胞（ａｎｉｍｍｕｎｅｃｅｌｌ）」は、１つ以上の免疫細胞を表すと理解される。したがって、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義で使用され得る。

さらに、本明細書で使用される、「及び／または」は、２つの指定された特性または成分の各々を、他方を伴う、または他方を伴わない特定の開示として見なされるべきである。したがって、本明細書において、「Ａ及び／またはＢ」等の句で使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」等の句で使用される用語「及び／または」は、以下の態様の各々を包含することを意図する：Ａ、Ｂ、及びＣ、Ａ、Ｂ、またはＣ、ＡまたはＣ、ＡまたはＢ、ＢまたはＣ、Ａ及びＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ（単独）、Ｂ（単独）、ならびに「Ｃ」（単独）。

態様が、文体「含む」とともに本明細書に記載される場合は常に、「からなる」及び／または「から本質的になる」の観点から記載される他の同様の態様もまた提供されることが理解される。

別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本開示が関連する当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、ｔｈｅＣｏｎｃｉｓｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ－Ｓｈｏｗ，２ｎｄｅｄ．，２００２，ＣＲＣＰｒｅｓｓ、ＴｈｅＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＣｅｌｌａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄｅｄ．，１９９９，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、及びｔｈｅＯｘｆｏｒｄＤｉｃｔｉｏｎａｒｙｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，ＯｘｆｏｒｄＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＰｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。

単位、接頭辞、及び記号は、それらのＳｙｓｔｅｍｅＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌｄｅＵｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で認められた形態で示される。数値範囲は、その範囲を画定する数を含む。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右へ記載される。本明細書に示される見出しは、本開示の様々な態様を限定するものではなく、本開示の態様は、本明細書の全体を参照することによって得られるものである。したがって、直下で定義される用語は、本明細書を全体として参照することによってさらに十分に定義される。

本明細書で使用される略語は、本開示全体を通して定義される。本開示の様々な態様については、以下のサブセクションでさらに詳細に説明する。

「約」または「本質的に含む」という用語は、当業者によって決定される特定の値または組成の許容誤差範囲内にある値または組成を指し、これは、部分的には、値または組成がどのように測定または決定されるか、すなわち、測定システムの限界に依存する。例えば、「約」または「本質的に含む」とは、当技術分野における実践ごとに１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」または「本質的に含む」とは、最大１０％の範囲を意味し得る。さらに、特に生物系または生物学的過程に関して、この用語は、最大１桁または最大５倍の値を意味し得る。特定の値または組成が本出願及び特許請求の範囲で提供される場合、特に明記しない限り、「約」または「本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成の許容誤差範囲内にあると想定されるべきである。

本明細書で使用される、１つ以上の目的の値に適用される「およそ」という用語は、記載される参照値と同様の値を指す。いくつかの態様では、「およそ」という用語は、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、記載される参照値のいずれかの方向に（該参照値を超えるまたは下回る）１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれを下回る範囲内の値の範囲を指す（かかる数がとり得る値の１００％を超える場合を除く）。

本明細書に記載の通り、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比率範囲、または整数範囲は、別段の指示がない限り、列挙される範囲内の任意の整数値を含み、適切な場合、その分数（例えば、整数の１０分の１及び１００分の１）を含むと理解されるべきである。

本明細書で使用される、「投与すること」とは、当業者に知られている様々な方法及び送達系のいずれかを用いて、対象に対して治療薬または治療薬を含む組成物を物理的に導入することを指す。本明細書に記載の治療薬に関する様々な投与経路としては、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、脊髄または他の非経口投与経路、例えば、注射または注入によるものが挙げられる。本明細書で使用される、「非経口投与」という句は、経腸及び局所投与以外の、通常は注射による投与方法を意味し、これは、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、経気管、気管内、経肺、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、心室内、硝子体内、硬膜外、及び胸骨内注射及び注入に加えて、インビボエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない。代替的に、本明細書に記載の治療薬は、局所、表皮、または粘膜投与経路等の非経口ではない経路によって、例えば、鼻腔内、経口、膣内、直腸内、舌下または局所的に投与され得る。また、投与は、例えば、１回、複数回、及び／または１つ以上の長期間にわたって行うことができる。

本明細書で使用される、「抗原」という用語は、タンパク質、ペプチド、またはハプテン等の任意の天然または合成の免疫原性物質を指す。本明細書で使用される、「同種抗原」という用語は、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）が認識することによって免疫細胞の活性化を誘導する（例えば、サイトカイン産生等のエフェクター機能を誘導する、及び／または細胞増殖のために細胞内シグナルを誘導する）抗原を指す。

ヌクレオチドは、それらの一般的に認められている１文字のコードによって表される。別段の指示がない限り、核酸は、５’から３’の方向で、左から右へ記載される。本明細書においてヌクレオチドは、ＩＵＰＡＣ－ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される一般に知られるヌクレオチドの１文字記号により表記される。したがって、Ａはアデニンを表し、Ｃはシトシンを表し、Ｇはグアニンを表し、Ｔはチミンを表し、Ｕはウラシルを表す。

開示される配列のＴ及びＵにおいては、該配列がＤＮＡであるかまたはＲＮＡであるかに応じて互換的であることが理解されるべきである。例えば、ｇＲＮＡのスペーサー配列は、本開示ではＤＮＡ（Ａ／Ｔ／Ｃ／Ｇ）として提示されるが、該ｇＲＮＡのキメラフレームは、ＲＮＡ（Ａ／Ｕ／Ｃ／Ｇ）として提示される。

本明細書では、アミノ酸は、それらの一般に知られる３文字記号、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号により表記される。別段の指示がない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で、左から右へ記載される。

「ポリペプチド」は、少なくとも２つの連続的に連結されたアミノ酸残基を含む鎖を指し、鎖の長さに上限はない。タンパク質中の１つ以上のアミノ酸残基は、修飾、例えば、限定されないが、グリコシル化、リン酸化、またはジスルフィド結合の形成を含み得る。「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチドを含み得る。特に指定のない限り、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、同義で使用され得る。

本明細書で使用される、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子を含むことを意図している。核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、ｃＤＮＡであってもよい。

本明細書で使用される、「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、それらのアナログ、またはそれらの混合物を含めた任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指す。この用語は、該分子の一次構造を指す。したがって、該用語は、三本鎖、二本鎖、及び一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）、ならびに三本鎖、二本鎖、及び一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。これは、例えば、アルキル化及び／またはキャッピングにより修飾されたポリヌクレオチドならびに未修飾型のポリヌクレオチドも含む。より具体的には、「ポリヌクレオチド」という用語は、スプライシングされているかスプライシングされていないかにかかわらず、ポリデオキシリボヌクレオチド（２－デオキシ－Ｄ－リボースを含む）、ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含めたポリリボヌクレオチド（Ｄ－リボースを含む）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ－またはＣ－グリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチド、ならびに非ヌクレオチド骨格を含む他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸「ＰＮＡ」）及びポリモルホリノポリマー、ならびにポリマーがＤＮＡ及びＲＮＡに見られるような塩基対合及び塩基積層を可能にする構成の核酸塩基を含む他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。

本明細書で使用される、「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指すことが意図される。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、これは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされ得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプベクターは、ウイルスベクターであり、ここでは、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノムにライゲートされ得る。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることが可能であり、それによって宿主ゲノムとともに複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが作動可能に連結された遺伝子の発現を指示することが可能である。かかるベクターは、本明細書では、「組み換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ばれる。一般に、組み換えＤＮＡ技術において利用される発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。プラスミドは、最も一般的に使用される形態のベクターであるため、本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は同義で使用され得る。しかしながら、同様に含まれるのは、他の形態の発現ベクター、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）であり、これらは、同等の機能を果たす。

「がん」とは、体内の異常細胞の制御されない成長を特徴とする様々な疾患の広範な群を指す。制御されない細胞分裂及び成長により、悪性腫瘍の形成がもたらされ、これが隣接する組織に広がり、また、リンパ系または血流を介して体内の遠隔部位に転移し得る。本明細書で使用される、「がん」は、原発がん、転移がん、及び再発がんを指す。

本明細書で使用される、「免疫応答」という用語は、外来作用物質に対する脊椎動物内の生物学的応答を指し、その応答が、これらの作用物質及びそれらに起因する疾患から生物を保護する。免疫応答は、免疫系の細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、好酸球、肥満細胞、樹状細胞または好中球）ならびにこれらの細胞のいずれかまたは肝臓によって産生される、侵入する病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、がんもしくは他の異常な細胞、または自己免疫もしくは病理学的炎症の場合は正常なヒト細胞もしくは組織に対する選択的標的化、それらとの結合、それらに対する損傷、それらの破壊、及び／または脊椎動物の体内からの排除をもたらす可溶性高分子（抗体、サイトカイン、及び補体を含む）の作用によって媒介される。免疫反応としては、例えば、Ｔ細胞、例えば、エフェクターＴ細胞もしくはＴｈ細胞、例えば、ＣＤ４^＋もしくはＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化もしくは阻害、またはＴ_ｒｅｇ細胞の阻害が挙げられる。本明細書で使用される、「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」という用語は同義であり、胸腺によって産生または処理される任意のリンパ球を指す。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＮＫＴ細胞である。

本明細書で使用される、「抗腫瘍免疫応答」という用語は、腫瘍抗原に対する免疫応答を指す。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、Ｔ細胞共刺激受容体のアゴニスト活性の向上及び／または抑制性受容体のアンタゴニスト活性の向上に起因し得る。免疫応答または免疫系を刺激する能力の増大は、免疫応答を測定するアッセイ、例えば、サイトカインまたはケモカインの放出、細胞溶解活性（標的細胞で直接、またはＣＤ１０７ａもしくはグランザイムを検出することによって間接的に測定される）、及び増殖の変化を測定するアッセイにおける、ＥＣ_５０または最大活性レベルの増加倍率に反映され得る。いくつかの態様では、免疫応答または免疫系の活性を刺激する能力は、例えば、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％向上し得る。いくつかの態様では、免疫応答または免疫系の活性を刺激する能力は、例えば、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、またはそれより多く向上し得る。

「対象」には、あらゆるヒトまたは非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」という用語は、脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ならびにげっ歯類、例えば、マウス、ラット、及びモルモットを含むがこれらに限定されない。いくつかの態様では、該対象はヒトである。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では同義で使用される。

「治療有効量」または「治療有効用量」という用語は、所望の生物学的結果、治療結果、及び／または予防結果をもたらす薬剤（例えば、本明細書に開示する改変された免疫細胞）の量を指す。その結果は、疾患の徴候、症状、もしくは原因のうちの１つ以上の低減、改善、緩和、減少、遅延、及び／または軽減、または生物系の任意の他の所望の変化であり得る。固形腫瘍に関して、有効量は、腫瘍の縮小を引き起こし、及び／または腫瘍の成長速度を低下させる（例えば、腫瘍成長を抑制する）か、または他の望ましくない細胞増殖を阻止もしくは遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの態様では、有効量は、腫瘍の増殖を遅延させるのに十分な量である。いくつかの態様では、有効量は、腫瘍の再発を予防するまたは遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回以上の投与で施され得る。該組成物の有効量は、例えば、（ｉ）がん細胞の数を減少させ、（ｉｉ）腫瘍サイズを縮小し、（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞の浸潤を阻害し、遅らせ、ある程度緩徐化し、停止する場合もあり、（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し（すなわち、ある程度緩徐化し、停止する場合もあり、（ｖ）腫瘍成長を阻害し、（ｖｉ）腫瘍の発生及び／または再発を防止もしくは遅延させ、及び／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状のうちの１つ以上をある程度軽減することができる。

いくつかの態様では、「治療有効量」は、進行性固形腫瘍等のがんの著しい減少またはがんの進行の緩徐化（退行）をもたらすことが臨床的に証明されている、本明細書における改変された細胞の量である。疾患の退行を促進する治療薬の能力は、熟練した医師に知られている種々の方法を使用して、例えば、臨床試験中のヒト対象で、ヒトにおける効力を予測する動物モデル系で、またはインビトロアッセイにて薬剤の活性をアッセイすることで評価され得る。

本明細書で使用される、「標準治療」という用語は、特定のタイプの疾患に対する適切な治療として医療専門家によって受け入れられ、医療従事者によって広く使用されている治療を指す。該用語は、次の用語：「ベストプラクティス」、「標準的医療」、及び「標準的治療」のいずれとも同義で使用され得る。

例として、「抗がん剤」は、対象のがんの退縮を促進するか、またはさらなる腫瘍成長を防止する。いくつかの態様では、該薬物の治療有効量は、がんを排除する点まで該がんの退縮を促進する。

「がんの退縮を促進する」とは、該薬物の有効量を単独で、または抗腫瘍薬と組み合わせて投与することにより、腫瘍の成長もしくはサイズが減少するか、該腫瘍が壊死するか、少なくとも１つの疾患症状の重症度が低下するか、疾患の無症状期間の頻度及び持続期間が延長されるか、または疾患の苦痛に起因する機能障害もしくは身体障害が防止されることを意味する。

治療に関する「有効」及び「有効性」という用語は、薬理学的有効性と生理学的安全性の両方を含む。薬理学的有効性とは、患者のがんの退縮を促進する薬物の能力を指す。生理学的安全性とは、薬物の投与に起因する、細胞、器官、及び／または生物のレベルでの毒性、または他の有害な生理作用（副作用）のレベルを指す。

本明細書で使用される、「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、１つ以上の免疫チェックポイントタンパク質を完全または部分的に減少させる、阻害する、妨げる、または調節する分子を指す。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞の活性化または機能を調節する。ＣＴＬＡ－４ならびにそのリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６、ならびにＰＤ－１とそのリガンドであるＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２等の多数のチェックポイントタンパク質が知られている。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｄ．Ｍ．，ＮａｔＲｅｖＣａｎｃｅｒ１２（４）：２５２－６４（２０１２）。これらのタンパク質は、Ｔ細胞応答の共刺激または抑制性相互作用を担う。免疫チェックポイントタンパク質は、自己寛容、ならびに生理学的免疫応答の期間及び程度を調節して維持する。免疫チェックポイント阻害剤は、抗体を含むか、または抗体に由来する。

本明細書で使用される、「酸化的ストレス」という用語は、過剰の酸化物質及び／または抗酸化物質レベルの減少を特徴とする状態を指す。細胞の酸化物質としては、酸素のラジカル（スーパーオキシドアニオン、ヒドロキシルラジカル、及び／またはペルオキシラジカル）、反応性非ラジカル酸素種、例えば、過酸化水素及び一重項酸素、炭素ラジカル、窒素ラジカル、硫黄ラジカル、ならびにそれらの組み合わせを挙げることができるがこれらに限定されない。いくつかの態様では、酸化的ストレスの状態は、例えば、細胞損傷、細胞の機能不全、及び／または細胞死をもたらし得る。

本明細書で使用される、「改変された細胞」という用語は、細胞の表現型（すなわち、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベル）が、未改変の細胞（すなわち、参照細胞）と異なるように、天然に存在しない操作を受けた該細胞、例えば、Ｔ細胞を指す。本開示から明らかなように、本明細書に開示する改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつ参照細胞（例えば、改変されていない対応する細胞）と比較して、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下している。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびに（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している。本明細書で使用される、「対応する細胞」という用語は、改変された細胞と同じ免疫細胞分類に属する細胞を指す。例えば、該改変された細胞がＴ細胞の場合、対応する細胞もまたＴ細胞である。

本明細書で使用される、「内因性発現」または「内因性発現レベル」または「内因性レベル」という用語（またはその文法的異表記）は、天然に存在する（例えば、遺伝子及び／またはタンパク質が天然に存在しない操作によって直接操作されない）遺伝子及び／またはタンパク質の発現（例えば、量、動態等）を指す。例えば、いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞（例えば、ＮＲ４Ａ３がノックダウンされ、かつｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するＣＡＲまたはＴＣＲＴ細胞）は、内因性レベルのＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を発現しないが、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子の二者はノックダウンされていないため（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、例えば、天然に存在しない操作によって）、該改変された細胞は、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質を内因的に発現する。

いくつかの態様では、改変された細胞は、外来または外因性核酸を細胞に導入することによって産生される。いくつかの態様では、該外来または外因性核酸は、本明細書に開示する遺伝子編集ツールをコードし得る。核酸は、当技術分野で既知の方法、例えば、エレクトロポレーション（例えば、ＨｅｉｓｅｒＷ．Ｃ．ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＦａｃｔｏｒＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（商標）２０００；１３０：１１７－１３４参照）、化学（例えば、リン酸カルシウムまたは脂質）トランスフェクション（例えば、ＬｅｗｉｓＷ．Ｈ．，ｅｔａｌ．，ＳｏｍａｔｉｃＣｅｌｌＧｅｎｅｔ．１９８０Ｍａｙ；６（３）：３３３－４７、ＣｈｅｎＣ．，ｅｔａｌ．，ＭｏｌＣｅｌｌＢｉｏｌ．１９８７Ａｕｇｕｓｔ；７（８）：２７４５－２７５２参照）、組み換えプラスミドを含む細菌プロトプラストとの融合（例えば、ＳｃｈａｆｆｎｅｒＷ．ＰｒｏｃＮａｔｌＡｃａｄＳｃｉＵＳＡ．１９８０Ａｐｒｉｌ；７７（４）：２１６３－７参照）、または精製されたＤＮＡの細胞核への直接的なマイクロインジェクション（例えば、ＣａｐｅｃｃｈｉＭ．Ｒ．Ｃｅｌｌ．１９８０Ｎｏｖｅｍｂｅｒ；２２（２Ｐｔ２）：４７９－８８参照）によって細胞に導入され得る。

「改変された細胞」または「細胞」に関する開示は、これら細胞の集団、すなわち、複数のこれら細胞に等しく適用可能であると理解されたい。

本明細書で使用される、「高濃度」または「高レベル」という用語及びそれらの文法的異表記は、適切な対照（例えば、健康な組織または細胞）と比較した、物質（例えば、反応性酸素種、ＲＯＳ）の通常より高いレベルを指す。

本明細書で使用される、「反応性酸素種」及び「ＲＯＳ」という用語は、他の分子と容易に反応し、損傷を生じる可能性のある改変をもたらす、酸素を含む高反応性化学物質を指す。反応性酸素種としては、例えば、酸素イオン、無機及び有機のフリーラジカル及び過酸化物、例えば過酸化水素、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカル、脂質ヒドロペルオキシダーゼ、及び一重項酸素が挙げられる。これらは通常きわめて小さい分子であり、不対原子価殻電子の存在に起因して高反応性である。ほぼすべてのがんは、高濃度の反応性酸素種と関連している。Ｌｉｏｕ，Ｇ．，ｅｔａｌ．，ＦｒｅｅＲａｄｉｃＲｅｓ４４（５）：１－３１（２０１０）。

本明細書で使用される、「キメラ抗原受容体」及び「ＣＡＲ」という用語は、抗原が細胞外ドメインに結合する際に特殊な機能を果たすことを細胞に指示する、細胞内ドメインに結合した抗原特異的細胞外ドメインを有する組み換え融合タンパク質を指す。「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、及び「キメラ免疫受容体」という用語は各々、本明細書では「キメラ抗原受容体」という用語と同義で使用され得る。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原と結合し、その細胞内ドメインを介して活性化シグナルを伝達するというその両方の能力によって他の抗原結合剤とは区別される。

キメラ抗原受容体の抗原特異的細胞外ドメインは、抗原、通常は悪性腫瘍の表面発現抗原を認識し、それに特異的に結合する。抗原特異的細胞外ドメインは、例えば、それが抗原に、親和性定数または相互作用の親和性（Ｋ_Ｄ）約０．１ｐＭ～約１０μＭ、例えば、約０．１ｐＭ～約１μＭまたは約０．１ｐＭ～約１００ｎＭで結合する場合に、抗原に特異的に結合する。相互作用の親和性を決定する方法は、当技術分野では既知である。本開示のＣＡＲでの使用に適した抗原特異的細胞外ドメインは、任意の抗原結合ポリペプチドであることができ、多種多様なポリペプチドが当技術分野において既知である。いくつかの態様では、該抗原結合ドメインは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。他の抗体ベースの認識ドメイン、（ｃＡｂＶＨＨ（ラクダ科抗体可変ドメイン）及びそのヒト化型、ＩｇＮＡＲＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）及びそのヒト化型、ｓｄＡｂＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）、ならびに「ラクダ化」抗体可変ドメインは、使用に適する。いくつかの態様では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメイン、例えば、一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶアルファＶベータを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）も使用に適する。

本明細書に開示するキメラ抗原受容体は、抗原特異的細胞外ドメインへの抗原結合時に、細胞に細胞内シグナル（ＣＡＲを発現する）を提供する細胞内ドメインも含み得る。いくつかの態様では、該ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、該キメラ受容体が発現するＴ細胞のエフェクター機能の少なくとも１つの活性化を担う。

「細胞内ドメイン」という用語は、抗原が細胞外ドメインに結合した際にエフェクター機能シグナルを伝達し、かつ特殊機能を実行するようにＴ細胞に指示するＣＡＲの部分を指す。適切な細胞内ドメインの非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体のゼータ鎖または任意のその相同体（例えば、イータ、デルタ、ガンマ、またはイプシロン）、ＭＢ１鎖、８２９、ＦｃＲＩＩＩ、ＦｃＲＩ、及びシグナル伝達分子の組み合わせ、例えば、ＣＤ３ゼータ及びＣＤ２８、ＣＤ２７、４－１ＢＢ、ＤＡＰ－１０、ＯＸ４０、及びそれらの組み合わせ、ならびに他の同様の分子及び断片が挙げられる。ＦｃγＲＩＩＩ及びＦｃεＲＩのような、活性化タンパク質ファミリーの他のメンバーの細胞内シグナル伝達部分を使用してもよい。通常は、細胞内ドメイン全体が用いられるが、多くの場合、細胞内ポリペプチド全体を使用する必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインの切断型部分が用いられ得る場合において、かかる切断型部分は、それが依然としてエフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用され得る。したがって、細胞内ドメインという用語は、エフェクター機能シグナルを伝達するのに十分な細胞内ドメインの任意の切断型部分を含むことが意図される。通常、抗原特異的細胞外ドメインは、キメラ抗原受容体の細胞内ドメインに膜貫通ドメインによって連結される。膜貫通ドメインは、細胞膜を横断し、ＣＡＲをＴ細胞表面に固定し、細胞外ドメインを細胞内シグナル伝達ドメインに接続し、ひいてはＴ細胞表面におけるＣＡＲの発現に影響を及ぼす。キメラ抗原受容体はさらに、１つ以上の共刺激ドメイン及び／または１つ以上のスペーサーも含み得る。共刺激ドメインは、サイトカイン産生、増殖、細胞傷害性、及び／または持続性をインビボで向上させる共刺激性タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインに由来する。

「ペプチドヒンジ」または「スペーサー」は、抗原特異的細胞外ドメインを膜貫通ドメインに接続する。該膜貫通ドメインは、該共刺激ドメインに融合され、任意に、共刺激ドメインは、第二の共刺激ドメインに融合され、該共刺激ドメインは、ＣＤ３ζに限定されないシグナル伝達ドメインに融合される。例えば、該抗原特異的細胞外ドメインと該膜貫通ドメイン間、及びタンデムＣＡＲの場合は複数のｓｃＦｖ間にスペーサードメインを含めると、該抗原結合ドメイン（複数可）の柔軟性、ひいてはＣＡＲ機能に影響が及び得る。適切な膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、及びスペーサーは当技術分野では既知である。

本明細書で使用される、「ｕｇ」及び「ｕＭ」という用語は、それぞれ「μｇ」及び「μΜ」と同義で使用される。

本明細書で使用される、「遺伝子編集」という用語は、細胞のゲノムに存在する遺伝情報を変化させるプロセスを指す。この遺伝子編集は、遺伝情報の修正をもたらすゲノムＤＮＡを操作することによって行われ得る。いくつかの態様では、かかる遺伝子編集は、編集されたＤＮＡの発現に影響を及ぼし得る。いくつかの態様では、かかる遺伝子編集は、編集されたＤＮＡの発現に影響を及ぼさない。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞の遺伝子編集は、本明細書に記載の遺伝子編集ツールを使用して行われ得る。遺伝子編集ツールの非限定的な例としては、ＲＮＡ干渉分子（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

本明細書で使用される、「ヌクレアーゼ」という用語は、ＤＮＡ開裂のための触媒活性を有する酵素を指す。所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ剤が、本明細書に開示する方法及び組成物において使用され得る。当該ヌクレアーゼ剤が所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導する限り、天然に存在するまたは天然のヌクレアーゼ剤を使用することができる。別の方法として、改変されたまたは操作されたヌクレアーゼ剤が使用され得る。「操作されたヌクレアーゼ剤」は、その天然の形態から、所望の認識部位にニックまたは二本鎖切断を特異的に認識及び誘導するように操作された（改変または誘導された）ヌクレアーゼを含む。したがって、操作されたヌクレアーゼ剤は、天然の、天然に存在するヌクレアーゼ剤に由来する場合もあれば、人工的に創出または合成される場合もある。ヌクレアーゼ剤の改変は、タンパク質開裂剤中のわずか１個のアミノ酸または核酸開裂剤中の１個のヌクレオチドでよい。いくつかの態様では、該操作されたヌクレアーゼは、認識部位にニックまたは二本鎖切断を誘導し、該認識部位は、天然の（操作されていない、または改変されていない）ヌクレアーゼ剤によって認識されていた配列ではない。認識部位または他のＤＮＡにニックまたは二本鎖切断を生じさせることは、本明細書では、該認識部位または他のＤＮＡを「切断すること」または「開裂すること」と呼ぶことができる。

本明細書で使用される、「コード配列」または「コード核酸」は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）、例えば、Ｃａｓ９タンパク質、ＣＡＲ、もしくはＴＣＲ、またはポリヌクレオチド、例えば、ｇＲＮＡを意味する。該コード配列はさらに、該核酸を投与される個体または哺乳類の細胞中での発現を指示することが可能なプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む調節要素に作動可能に連結された開始及び終結シグナルを含み得る。このコード配列は、コドン最適化され得る。

本明細書で使用される、「相補」または「相補的な」とは、核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログ間の、Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ（例えば、Ａ－Ｔ／Ｕ及びＣ－Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合を意味する。「相補性」とは、２つの核酸配列が互いに逆平行にアラインされた場合、各位置のヌクレオチド塩基が相補的であるような、それらの間で共有される特性を指す。

本明細書に記載の様々な態様は、以下のサブセクションでさらに詳細に説明される。

ＩＩ．改変された免疫細胞
固形腫瘍に対する細胞免疫療法の成功は、腫瘍微小環境での腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の疲弊に起因して制限されている。腫瘍抗原への持続的な曝露により、Ｔ細胞の疲弊がもたらされる。これは、細胞傷害性及びサイトカイン産生の進行性消失、ならびに抑制性マーカー、例えば、ＰＤ－１の発現の増加を特徴とする（Ｗｈｅｒｒｙｅｔａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５，４８６－４９９（２０１５））。さらに、疲弊したＴＩＬは、転写因子、具体的にはＮＲ４Ａファミリーを上方制御し、これを代わりに使用する（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ５６７，５３０－５３４（２０１９））。

本開示は、改変された免疫細胞、すなわち、例えば、遺伝子編集によって改変された、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下し、かつｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、結果として、機能の向上、例えば、エフェクター機能の持続及び／または疲弊の減少を示す細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下しているＴ細胞、例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下しているＣＡＲまたはＴＣＲＴ細胞）を提供する。

いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａメンバー１（ＮＲ４Ａ１）遺伝子及び／またはタンパク質、ＮＲ４Ａメンバー２（ＮＲ４Ａ２）遺伝子及び／またはタンパク質、ならびにＮＲ４Ａメンバー３（ＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質からなる群から選択される核内受容体サブファミリー４グループＡ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルの低下ならびに（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルの増加を発現する改変された免疫細胞の集団を提供する。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の任意の組み合わせを含む。

ＩＩ．Ａ．ＮＲ４Ａ３
一般に「ＮＲ４Ａ３」と略される、核内受容体サブファミリー４グループＡのメンバー３、別名ＭＩＮＯＲ、ＣＳＭＦ、ＮＯＲ１、ＣＨＮ、マイトジェン誘導核内オーファン受容体、ニューロン由来オーファン受容体、核内ホルモン受容体ＮＯＲ－１、「軟骨肉腫、骨外性粘液型、ＥＷＳ融合型」、及びＴＥＣは、ヒトにおいてＮＲ４Ａ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。オーファン核内受容体のＮＲ４Ａファミリーは、ＮＲ４Ａ１（Ｎｕｒ７７）、ＮＲ４Ａ２（Ｎｕｒｒ１）、及びＮＲ４Ａ３（Ｎｏｒ－１）を含む。それらは、転写因子としてリガンド非依存的に作用する。それらの機能は、主に様々な細胞外シグナルによるそれらの発現の迅速かつ一過性の誘導によって制御されるため、前初期遺伝子と見なされる。該ＮＲ４Ａは、アポトーシス、生存、増殖、血管新生、炎症、ＤＮＡ修復、及び脂肪酸代謝を含めた様々な細胞機能に関与する。

該ＮＲ４Ａ３遺伝子は、９番染色体に位置する（塩基９９，８２１，８８５～９９，８６６，８９３、４５，０３９塩基、プラス鎖配向、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００９．１２）。ＮＲ４Ａ３は、細胞特異的及び応答要素（標的）特異的にプロモーター領域の調節要素に結合する転写活性化因子である。ＮＲ４Ａ３は、モノマーとして、ＮＲ４Ａ１応答要素（ＮＢＲＥ）５’－ＡＡＡＡＧＧＴＣＡ－３’（配列番号１００）部位に、及びホモ二量体として、Ｎｕｒ応答要素（ＮｕｒＲＥ）に、それらの調節される標的遺伝子のプロモーター内で結合することによって遺伝子発現を（類似性によって）誘導し、多くの異なる細胞型の増殖、生存、及び分化の調節において役割を果たす。

該ＮＲ４Ａ３タンパク質は、選択的スプライシングによって産生される３つのアイソフォームを有する。それらの配列を以下の表１に示す。

いくつかの態様では、本開示に有用な細胞組成物は、改変された免疫細胞の集団を含み、該細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎ、例えば、組み換え的に産生されたｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが低下し、（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合し）、さらに、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する。いくつかの態様では、かかる改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが低下している）はまた、以下のうちの１つのレベルが低下している：（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方。したがって、特に明記しない限り、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが低下している改変された免疫細胞は、該ＮＲ４Ａファミリーの他のメンバーの内因性発現を有する場合もあればその発現が低下している場合もある。本明細書で使用される、「ＮＲ４Ａ３遺伝子」という用語は、任意の転写産物、ゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡを指す。本明細書で使用される、「ＮＲ４Ａ３タンパク質」という用語は、上記に開示するアイソフォームアルファ、アイソフォームベータ、またはアイソフォーム３、ならびにそれらのバリアント及び変異体を指す。本明細書で使用される、ＮＲ４Ａ３タンパク質という用語はまた、野生型ＮＲ４Ａ３タンパク質の少なくとも１つの機能を有する、本明細書に開示するアイソフォームのいずれかの任意の断片またはバリアントも包含する。

本明細書で使用される、「レベルの低下」、「より低いレベル」、「発現レベルの低下」または「より低いレベル」という用語（またはそれらの異表記）は、物理レベルの低下（例えば、ゲノムからの編集に起因した遺伝子配列の減少、またはタンパク質発現の低下に起因したタンパク質の減少）及び機能の低下の両方を指す。例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルの低下は、例えば、終止コドンまたはフレームシフトを導入する変異の導入に起因した遺伝子機能の減少、転写を変更するエピジェネティックな改変、またはＮＲ４Ａ３の発現を調節するプロモーター遺伝子もしくは別の遺伝子の変異もしくは他の変化を指すことができる。いくつかの態様では、改変された細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子のレベルの低下は、機能的ＮＲ４Ａ３タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ３タンパク質をコードすることが可能なゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡの量（例えば、濃度）の参照細胞と比較した減少を指す。同様に、ＮＲ４Ａ３タンパク質の低下は、機能喪失（部分的または完全）を引き起こす変化（例えば、変異もしくは翻訳後修飾）が挙げられるがこれに限定されない、機能的ＮＲ４Ａ３タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ３タンパク質の発現をもたらす変化、または、例えば、他の細胞シグナル伝達パートナーとの相互作用を変更するＮＲ４Ａ３の機能的部位に結合する分子の活性を指すことができる。

ＮＲ４Ａ３遺伝子のレベル（例えば、遺伝子全体もしくはその一部の存在／不在、または遺伝子機能）は、当技術分野で既知の様々な方法によって測定され得る。ＮＲ４Ａ３タンパク質のレベル（例えば、ＮＲ４Ａ３タンパク質もしくはその断片の存在／不在、または定量化もしくはタンパク質機能）は、当技術分野で既知の様々な方法によって測定され得る。

いくつかの態様では、免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子の発現レベル及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。いくつかの態様では、該免疫細胞の集団（例えば、Ｔ細胞、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の集団）のタンパク質における該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現は、該改変後に完全に抑制される。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及びＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ３遺伝子及びＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している細胞）は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している細胞の集団）は、リンパ球を含む。いくつかの態様では、該リンパ球は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。本明細書で使用される、「改変された免疫細胞」は、最初に改変された免疫細胞の後代細胞を含み、該後代細胞もまた、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している。

ＩＩ．Ｂ．ＮＲ４Ａ２
一般にＮＲ４Ａ２と略される、核内受容体サブファミリー４グループＡのメンバー２、別名ＮＯＴ、ＲＮＲ１、ＨＺＦ－３、ＮＵＲＲ１、ＴＩＮＵＲは、ヒトにおいてＮＲ４Ａ２遺伝子によってコードされるタンパク質である。該ＮＲ４Ａ２遺伝子は、２番染色体に位置する（塩基１５６，３２４，４３２～１５６，３３２，７２４、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＣ＿０００００２．１２）。

該ＮＲ４Ａ２タンパク質は、選択的スプライシングによって産生される２つのアイソフォームを有する。それらの配列を以下の表２に示す。

いくつかの態様では、本開示に有用な細胞組成物は、改変された免疫細胞の集団を含み、該細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎ、例えば、組み換え的に産生されたｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが低下し、（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合し）、さらに、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３タンパク質の内因性発現を有する。いくつかの態様では、かかる改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが低下している）はまた、以下のうちの１つのレベルが低下している：（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方。したがって、特に明記しない限り、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが低下している改変された免疫細胞は、該ＮＲ４Ａファミリーの他のメンバーの内因性発現を有する場合もあればその発現が低下している場合もある。本明細書で使用される、「ＮＲ４Ａ２遺伝子」という用語は、任意の転写産物、ゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡを指す。本明細書で使用される、「ＮＲ４Ａ２タンパク質」という用語は、上記に開示するアイソフォーム１または２、ならびにそれらのバリアント及び変異体を指す。本明細書で使用される、ＮＲ４Ａ２タンパク質という用語はまた、野生型ＮＲ４Ａ２タンパク質の少なくとも１つの機能を有する、本明細書に開示するアイソフォームのいずれかの任意の断片またはバリアントも包含する。

本明細書で使用される、「レベルの低下」、「より低いレベル」、「発現レベルの低下」または「より低いレベル」という用語（またはそれらの異表記）は、物理レベルの低下（例えば、ゲノムからの編集に起因した遺伝子配列の減少、またはタンパク質発現の低下に起因したタンパク質の減少）及び機能の低下の両方を指す。例えば、ＮＲ４Ａ２遺伝子のレベルの低下は、例えば、終止コドンまたはフレームシフトを導入する変異の導入に起因した遺伝子機能の減少、転写を変更するエピジェネティックな改変、またはＮＲ４Ａ２の発現を調節するプロモーター遺伝子もしくは別の遺伝子の変異もしくは他の変化を指すことができる。いくつかの態様では、改変された細胞におけるＮＲ４Ａ２遺伝子のレベルの低下は、機能的ＮＲ４Ａ２タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ２タンパク質をコードすることが可能なゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡの量（例えば、濃度）の参照細胞と比較した減少を指す。同様に、ＮＲ４Ａ２タンパク質の低下は、機能喪失（部分的または完全）を引き起こす変化（例えば、変異もしくは翻訳後修飾）が挙げられるがこれに限定されない、機能的ＮＲ４Ａ２タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ２タンパク質の発現をもたらす変化、または、例えば、他の細胞シグナル伝達パートナーとの相互作用を変更するＮＲ４Ａ２の機能的部位に結合する分子の活性を指すことができる。

ＮＲ４Ａ２遺伝子のレベル（例えば、遺伝子全体もしくはその一部の存在／不在、または遺伝子機能）は、当技術分野で既知の様々な方法によって測定され得る。ＮＲ４Ａ２タンパク質のレベル（例えば、ＮＲ４Ａ２タンパク質もしくはその断片の存在／不在、または定量化もしくはタンパク質機能）は、当技術分野で既知の様々な方法によって測定され得る。

いくつかの態様では、免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）の集団におけるＮＲ４Ａ２遺伝子の発現レベル及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。いくつかの態様では、該免疫細胞の集団（例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の集団）における該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現は、該改変後に完全に抑制される。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ２遺伝子の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ２遺伝子の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ２遺伝子及びＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下している細胞）は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下している細胞の集団）は、リンパ球を含む。いくつかの態様では、該リンパ球は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。本明細書で使用される、「改変された免疫細胞」は、最初に改変された免疫細胞の後代細胞を含み、該後代細胞もまた、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下している。

ＩＩ．Ｃ．ＮＲ４Ａ１
一般にＮＲ４Ａ１と略される、核内受容体サブファミリー４グループＡのメンバー１、別名ＨＭＲ、Ｎ１０、ＴＲ３、ＮＰ１０、ＧＦＲＰ１、ＮＡＫ－１、ＮＧＦＩＢ、及びＮＵＲ７７は、ヒトにおいてＮＲ４Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。該ＮＲ４Ａ１遺伝子は、１２番染色体に位置する（塩基５２０２２８３２～５２０５９５０７、ＮＣＢＩ参照配列ＮＣ＿００００１２．１２）。

該ＮＲ４Ａ１タンパク質は、選択的スプライシングによって産生される３つのアイソフォームを有する。それらの配列を以下の表３に示す。

いくつかの態様では、本開示に有用な細胞組成物は、改変された免疫細胞の集団を含み、該細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎ、例えば、組み換え的に産生されたｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルが低下し、（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合し）、さらに、ＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３遺伝子ならびにＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３タンパク質の内因性発現を有する。いくつかの態様では、かかる改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルが低下している）はまた、以下のうちの１つのレベルが低下している：（ｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質、または（ｉ）と（ｉｉ）の両方。したがって、特に明記しない限り、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルが低下している改変された免疫細胞は、該ＮＲ４Ａファミリーの他のメンバーの内因性発現を有する場合もあればその発現が低下している場合もある。本明細書で使用される、「ＮＲ４Ａ１遺伝子」という用語は、任意の転写産物、ゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡを指す。本明細書で使用される、「ＮＲ４Ａ１タンパク質」という用語は、上記に開示するアイソフォーム１、アイソフォーム２、またはアイソフォーム３、ならびにそれらのバリアント及び変異体を指す。本明細書で使用される、ＮＲ４Ａ１タンパク質という用語はまた、野生型ＮＲ４Ａ１タンパク質の少なくとも１つの機能を有する、本明細書に開示するアイソフォームのいずれかの任意の断片またはバリアントも包含する。

本明細書で使用される、「レベルの低下」、「より低いレベル」、「発現レベルの低下」または「より低いレベル」という用語（またはそれらの異表記）は、物理レベルの低下（例えば、ゲノムからの編集に起因した遺伝子配列の減少、またはタンパク質発現の低下に起因したタンパク質の減少）及び機能の低下の両方を指す。例えば、ＮＲ４Ａ１遺伝子のレベルの低下は、例えば、終止コドンまたはフレームシフトを導入する変異の導入に起因した遺伝子機能の減少、転写を変更するエピジェネティックな改変、またはＮＲ４Ａ１の発現を調節するプロモーター遺伝子もしくは別の遺伝子の変異もしくは他の変化を指すことができる。いくつかの態様では、改変された細胞におけるＮＲ４Ａ１遺伝子のレベルの低下は、機能的ＮＲ４Ａ１タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ１タンパク質をコードすることが可能なゲノムＤＮＡ、ｐｒｅ－ｍＲＮＡ、及び／またはｍＲＮＡの量（例えば、濃度）の参照細胞と比較した減少を指す。同様に、ＮＲ４Ａ１タンパク質の低下は、機能喪失（部分的または完全）を引き起こす変化（例えば、変異もしくは翻訳後修飾）が挙げられるがこれに限定されない、機能的ＮＲ４Ａ１タンパク質、例えば、野生型ＮＲ４Ａ１タンパク質の発現をもたらす変化、または、例えば、他の細胞シグナル伝達パートナーとの相互作用を変更するＮＲ４Ａ１の機能的部位に結合する分子の活性を指すことができる。

ＮＲ４Ａ１遺伝子のレベル（例えば、遺伝子全体もしくはその一部の存在／不在、または遺伝子機能）は、当技術分野で既知の様々な方法によって測定され得る。ＮＲ４Ａ１タンパク質のレベル（例えば、ＮＲ４Ａ１タンパク質もしくはその断片の存在／不在、または定量化もしくはタンパク質機能）は、当技術分野で既知の様々な方法によって測定され得る。

いくつかの態様では、免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）の集団におけるＮＲ４Ａ１遺伝子の発現レベル及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。いくつかの態様では、該免疫細胞の集団（例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞の集団）のタンパク質における該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現は、該改変後に完全に抑制される。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ１遺伝子の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ１遺伝子の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ１遺伝子及びＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルは、参照免疫細胞、例えば、ＮＲ４Ａ１遺伝子及びＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞の集団と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下している細胞）は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下している細胞の集団）は、リンパ球を含む。いくつかの態様では、該リンパ球は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。本明細書で使用される、「改変された免疫細胞」は、最初に改変された免疫細胞の後代細胞を含み、該後代細胞もまた、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下している。

ＩＩ．Ｄ．ｃ－Ｊｕｎタンパク質
上記のＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質のレベルの低下に加えて、本開示の改変された免疫細胞（例えば、免疫細胞を発現するＣＡＲまたはＴＣＲ）はまた、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加するように改変される。本明細書で明らかにされるように、いくつかの態様では、免疫細胞は、参照免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列を含むように改変されなかった対応する免疫細胞）と比較して、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加するように、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列を含むように改変される。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、ポリシストロン性ポリヌクレオチドによってコードされ、該ポリヌクレオチドは、ｃ－Ｊｕｎ及びリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）ならびに、いくつかの態様では、１つ以上のさらなるタンパク質（例えば、ＥＧＦＲｔ等の安全スイッチタンパク質）を含めた複数のタンパク質をコードする。いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルが低下している改変された免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及びリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、かかるキメラポリペプチドは、ｃ－Ｊｕｎポリペプチド及びリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）が翻訳後に別々の機能的タンパク質に開裂するように、開裂可能なリンカーを含み得る。いくつかの態様では、本明細書に提供する改変された免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーの遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している）は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を天然に（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列で該細胞を改変することなく）発現することが可能である。いくつかの態様では、かかる免疫細胞は、転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムベースの転写活性化因子、例えば、ＣＲＩＳＰＲａ）で改変され、その結果、内因性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現が、参照細胞（例えば、該転写活性化因子で改変されていない対応する細胞）と比較して増加する。

本明細書で使用される、「転写活性化因子」という用語は、遺伝子または遺伝子セットの転写を（例えば、核酸配列のエンハンサーまたはプロモーター近位要素に結合し、それによってその転写を誘導することによって）増加させるタンパク質を指す。本開示で使用され得るかかる転写活性化因子の非限定的な例としては、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ベースの転写活性化因子、ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）ベースの転写活性化因子、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）システムベースの転写活性化因子、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＫａｂａｄｉｅｔａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ６９（２）：１８８－１９７（Ｓｅｐ．２０１４）を参照されたい。

いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムベースの転写活性化因子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ活性化（ＣＲＩＳＰＲａ）で改変されている。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＮｉｓｓｉｍｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｅｌｌ５４：１－１３（Ｍａｙ２０１４）を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲａは、エンドヌクレアーゼ活性を欠くが、そのガイドＲＮＡ及び標的ＤＮＡ核酸配列に結合する能力を保持する修飾されたＣａｓタンパク質の使用を含むＣＲＩＳＰＲツールの一種である。本開示で使用され得るかかる修飾されたＣａｓタンパク質の非限定的な例は、当技術分野で既知である。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＰａｎｄｅｌａｋｉｓｅｔａｌ．，ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ１０（１）：１－１４（Ｊａｎ．２０２０）を参照されたい。いくつかの態様では、該修飾されたＣａｓタンパク質は、修飾されたＣａｓ９タンパク質（当技術分野では「ｄＣａｓ９」とも呼ばれる）を含む。いくつかの態様では、該修飾されたＣａｓタンパク質は、修飾されたＣａｓ１２ａタンパク質を含む。いくつかの態様では、本開示に有用な修飾されたＣａｓタンパク質は、ガイドポリヌクレオチド（例えば、低分子ガイドＲＮＡ）に結合し（「修飾されたＣａｓガイド複合体」）、該ガイドポリヌクレオチドは、目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）をコードする核酸配列の領域に相補的である認識配列を含む。いくつかの態様では、該ガイドポリヌクレオチドは、目的のタンパク質をコードする内因性核酸配列のプロモーター領域に相補的な認識配列を含む。いくつかの態様では、１つ以上の転写活性化因子は、該修飾されたＣａｓガイド複合体（例えば、該修飾されたＣａｓタンパク質のＮ末端及び／またはＣ末端）に結合され、該修飾されたＣａｓガイド複合体が細胞に導入された場合に、１つ以上の転写活性化因子が、核酸配列の調節要素（例えば、プロモーター領域）に結合することができ、それによって、コードされたタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現が誘導され、及び／または増加する。いくつかの態様では、該１つ以上の転写活性化因子は、内因性遺伝子の調節要素（例えば、プロモーター領域）に結合することができ、それによって、コードされたタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現を誘導する及び／または増加させることができる。使用され得る一般的な活性化因子の非限定的な例としては、ＲＮＡＰのオメガサブユニット、ＶＰ１６、ＶＰ６４及びｐ６５が挙げられる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＫａｂａｄｉａｎｄＧｅｒｓｂａｃｈ，Ｍｅｔｈｏｄｓ６９：１８８－１９７（２０１４）を参照されたい。

いくつかの態様では、１つ以上の転写リプレッサー（例えば、Ｋｒｕｐｐｅｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｂｏｘドメイン（ＫＲＡＢ））は、修飾されたＣａｓガイド複合体（例えば、修飾されたＣａｓタンパク質のＮ及び／またはＣ末端）に結合される可能性があり、細胞に導入された場合に、１つ以上の転写リプレッサーが、遺伝子、例えば、ｃ－Ｊｕｎの発現を妨害し得る遺伝子（例えば、Ｂａｃｈ２）の転写を抑制または低減し得る。例えば、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０００３０３７９Ａ１及びＹａｎｇｅｔａｌ．，ＪＴｒａｎｓｌＭｅｄ１９：４５９（２０２１）を参照されたい。いくつかの態様では、本開示に有用な修飾されたＣａｓタンパク質は、１つ以上の転写活性化因子及び１つ以上の転写リプレッサーの両方に結合し得る。

当業者には明らかなように、いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞は、複数のアプローチの組み合わせを使用して改変されている。例えば、いくつかの態様では、細胞は、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下するように、ならびに（ｉ）１つ以上のタンパク質（例えば、リガンド結合タンパク質、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする外因性ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）内因性タンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎ）の発現を増加させる外因性転写活性化因子（例えば、ＣＲＩＳＰＲａ）を含むように改変されている。いくつかの態様では、細胞は、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下するように、ならびに（ｉ）第一のタンパク質（例えば、リガンド結合タンパク質）をコードする外因性ヌクレオチド配列及び（ｉｉ）第二のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質）をコードする外因性ヌクレオチド配列を含むように改変されている。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該第一及び第二のタンパク質をコードする外因性ヌクレオチド配列は、単一のポリシストロン性ベクターの一部であり得る。

いくつかの態様では、上記の改変（例えば、外因的に導入されたｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列及び／または転写活性化因子の導入）に起因して、該改変された細胞は、かかる改変を有しない対応する細胞（「参照細胞」）より、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現する、すなわち、より高いレベル（例えば、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、もしくは少なくとも約１００％多く、または少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、もしくは少なくとも約１０倍）を発現する。「～の発現レベル［もしくは量」が増加する」、「過剰発現する」、または「～の発現が増加する」という表現（及び本明細書で使用される句の同様の形態）は、同義で使用される。

ｃ－Ｊｕｎは、活性化因子タンパク質－１（ＡＰ－１）ファミリーに属する発がん性転写因子である。これは、様々なタンパク質（例えば、ｃ－Ｆｏｓ）と相互作用して、細胞増殖及び腫瘍進行を含めた様々な細胞シグナル伝達経路を調節する二量体複合体を形成する。したがって、ある特定のがんでｃ－Ｊｕｎ発現の増加が観察され、かかるがんを治療するためのｃ－Ｊｕｎアンタゴニストの開発に大きな関心が寄せられてきた。例えば、Ｂｒｅｎｎａｎ，Ａ．，ｅｔａｌ．，ＪＥｘｐＣｌｉｎＣａｎｃｅｒＲｅｓ３９（１）：１８４（Ｓｅｐ．２０２０）を参照されたい。

ヒトでは、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、１番染色体（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿０００００１．１１のヌクレオチド５８，７８０，７９１～５８，７８４，０４７、マイナス鎖方向）に位置するＪＵＮ遺伝子によってコードされる。ＪＵＮ遺伝子、及びそのコードされるタンパク質の同義語が知られており、これらとしては、「Ｊｕｎがん原遺伝子、ＡＰ－１転写因子サブユニット」、「ｖ－Ｊｕｎトリ肉腫ウイルス１７がん遺伝子ホモログ」、「転写因子ＡＰ－１」、「Ｊｕｎがん遺伝子」、「ＡＰ－１」、「Ｊｕｎ活性化ドメイン結合タンパク質」、「ｐ３９」、及び「エンハンサー結合タンパク質ＡＰ１」が挙げられる。野生型ヒトｃ－Ｊｕｎタンパク質配列は、３３１アミノ酸長である。野生型ヒトｃ－Ｊｕｎのアミノ酸配列及び核酸配列を、それぞれ、表４及び５に示す。

ＩＩ．Ｄ．１．コドン最適化
本明細書に記載の通り、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルが低下した改変された免疫細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含み、該ヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列（本明細書では「ｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列」とも呼ばれる）は、野生型ｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列のもの（例えば、配列番号６）とは異なる。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７～１６に記載の核酸配列のいずれか１つと少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７～１６のいずれか１つに記載の核酸配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号７に記載の核酸配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号８に記載の核酸配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に記載の核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、本明細書に記載のｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９に記載の核酸配列に対して、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号９に記載の核酸配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載の核酸配列に対して少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号１０に記載の核酸配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号１１に記載の核酸配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号１２に記載の核酸配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ヌクレオチド配列は、配列番号１３に記載のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号１４に記載のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号１５に記載のヌクレオチド配列を含む。

いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。いくつかの態様では、該ヌクレオチド配列は、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含む。

本明細書に開示するｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列は、当技術分野で既知の任意の方法を使用してコドン最適化され得る。例えば、いくつかの態様では、本明細書に開示するｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列のコドンは、野生型ヌクレオチド配列（例えば、配列番号６）と比較して１つ以上の以下のパラメーターを改変する（例えば、増加もしくは低下させる）ように最適化されている：（ｉ）コドン適応指数（すなわち、コドン使用頻度バイアス）、（ｉｉ）グアニン・シトシン（ＧＣ）ヌクレオチド含量、（ｉｉｉ）ｍＲＮＡ二次構造及び不安定なモチーフ、（ｉｖ）反復配列（例えば、ダイレクトリピート、逆位リピート、ダイアドリピート）、（ｖ）制限酵素認識部位、または（ｖｉ）それらの組み合わせ。

いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、かかるコドン最適化は、該ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現を増加させることができる。したがって、いくつかの態様では、本開示のコドン最適化ｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列は、ヒト細胞、例えば、ヒトＴ細胞にトランスフェクト、形質導入または別の方法で導入された場合、野生型ヌクレオチド配列（例えば、配列番号６）をトランスフェクトした細胞における対応する発現と比較して、コード化ｃ－Ｊｕｎ転写因子の発現を増加させることが可能である。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎ転写因子の発現は、発現するように野生型ヌクレオチド配列（例えば、配列番号６）をトランスフェクト、形質導入、または別の方法で遺伝子改変された細胞における対応する発現と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下した改変された免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎ転写因子の発現の増加は、トランスフェクトされた細胞（例えば、免疫細胞、例えば、ＣＤ４^＋及び／またはＣＤ８^＋Ｔ細胞等のＴ細胞）の１つ以上の特性を改善及び／または向上させ得る。かかる特性の非限定的な例としては、疲弊に対する耐性（例えば、ＰＤ－１、ＣＤ３９、ＴＩＭ－３、及び／またはＬＡＧ－３等の疲弊マーカーの発現の低下、生存の延長、及び／またはサイトカイン産生の増加によって示される）、持続性／生存の延長、拡大／増殖の増加、エフェクター機能の向上（例えば、抗原刺激時のサイトカイン産生、標的抗原を発現する細胞の溶解、もしくは両方）、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

疲弊、細胞表現型、持続性、細胞傷害性及び／または殺傷、増殖、サイトカインの産生／放出、及び遺伝子発現プロファイルを測定するために有用なアッセイは、当技術分野で既知であり、これらとしては、例えば、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＩＮＣＵＣＹＴＥ（登録商標）免疫細胞殺傷分析、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）または同様のアッセイ、持続抗原刺激アッセイ、バルク及びシングルセルＲＮＡｓｅｑ（例えば、ＦｒｏｎＧｅｎｅｔ．２０２０；１１：２２０、２０１９Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３５：ｉ４３６－４４５、２０１９ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｍｅｄ．ＤａｔａＳｃｉ．２：１３９－１７３を参照のこと）、細胞傷害性／殺傷アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の標準的な分子及び細胞生物学方法、例えば、本明細書に記載のものまたは例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙもしくはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９－２０２１）もしくはその他に記載のものが挙げられる。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルが低下した改変された免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎ転写因子の発現の増加は、疲弊に対する細胞の耐性を高める。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の各々のレベルが低下している。いくつかの態様では、該疲弊に対する耐性は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれを超えて高められる。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下した改変された免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎ転写因子の過剰発現は、疲弊した細胞における疲弊を減少させることができる。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の各々のレベルが低下している。いくつかの態様では、疲弊は、改変された免疫細胞において、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する疲弊した細胞）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、もしくは少なくとも約１，０００倍減少する。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下した改変された免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎ転写因子の発現の増加は、該細胞の持続性／生存を、例えば、インビボで対象に投与された場合に延長することができる。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の各々のレベルが低下している。いくつかの態様では、該細胞の持続性／生存は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれを超えて高められる。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下した改変された免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎ転写因子の発現の増加は、該細胞の拡大／増殖を、例えば、抗原刺激時に増加させることができる。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の各々のレベルが低下している。いくつかの態様では、該細胞の拡大／増殖は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれを超えて高められる。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下した改変された免疫細胞におけるｃ－Ｊｕｎ転写因子の発現の増加は、該細胞のエフェクター機能、例えば、持続抗原刺激に応答したサイトカイン産生、グランザイム放出、及び／または細胞傷害性を増加させることができる。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の各々のレベルが低下している。いくつかの態様では、該細胞のエフェクター機能（例えば、持続抗原刺激に応答して）は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれを超えて高められる。

いかなる理論にも拘束されるものではないが、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）の発現レベルが低下するように改変されたＴ細胞におけるｃ－Ｊｕｎの過剰発現は、該細胞の活性状態を、例えば、Ｔ細胞の機能不全（例えば、Ｔ細胞の疲弊）を軽減または防止することによって維持するのに役立つ。本明細書に提供するｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載のコドン最適化ｃ－Ｊｕｎ）は、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下するように改変された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を操作するために使用することができ、これは、その結果、所望の標的細胞（例えば、内因性ＴＣＲの標的または本明細書に記載のキメラ結合タンパク質の標的）に対して持続する強力な細胞傷害性を示す。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しないＴ細胞と比較して、本明細書に開示するコドン最適化ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の疲弊の徴候が少ない。いくつかの態様では、本明細書に提供する改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に提供する改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、本明細書に提供する改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している。いくつかの態様では、該改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下している。いくつかの態様では、該改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する）は、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の各々のレベルが低下している。

本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本開示は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下している一方、内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を有する（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）改変された免疫細胞を含む。いくつかの態様では、本開示は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下している一方、内因性レベルのＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３タンパク質、ならびにリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を有する（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）改変された免疫細胞を含む。いくつかの態様では、本開示は、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下している一方、内因性レベルのＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３タンパク質、ならびにリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を有する（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）改変された免疫細胞を含む。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、該ＮＲ４Ａファミリーの２つのメンバーのレベルが低下している。例えば、いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞は、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現する（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）ように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルが両方低下するように改変されている。いくつかの態様では、免疫細胞は、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現する（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）ように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下するように改変されている。いくつかの態様では、免疫細胞は、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現する（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）ように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが両方低下するように改変されている。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞は、該ＮＲ４Ａファミリーのすべてのメンバーのレベルが低下している。したがって、いくつかの態様では、本明細書に提供する免疫細胞は、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現する（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）ように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質が改変されている。

代替的に、本開示に有用なｃ－Ｊｕｎタンパク質は、変異ｃ－Ｊｕｎタンパク質が機能不全の（疲弊した）Ｔ細胞をレスキューする変異体の能力に影響を与えない限り、変異ヒトｃ－Ｊｕｎタンパク質であり得る。いくつかの態様では、変異ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、野生型ｃ－Ｊｕｎタンパク質のＣ末端のアミノ酸残基（例えば、Ｃ末端の５０、７５、１００、１５０、２００、もしくは２５０個以上の残基）、Ｃ末端部分（例えば、４分の１、３分の１、もしくは半分）またはＣ末端ドメイン（例えば、イプシロン、ｂＺＩＰ、及びそのアミノ酸のＣ末端）と少なくとも約７０％（例えば、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含む。いくつかの態様では、野生型ｃ－Ｊｕｎタンパク質のＮ末端のアミノ酸残基（例えば、Ｎ末端の５０、７５、１００、もしくは１５０個以上）、Ｎ末端部分（例えば、４分の１、３分の１、もしくは半分）、またはＮ末端ドメイン（例えば、デルタ、トランス活性化ドメイン、及びそのアミノ酸のＮ末端）が欠失、突然変異、またはその他の方法で不活性化される。

いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、そのトランス活性化ドメイン及び／またはそのデルタドメインに不活性化変異（例えば、置換、欠失、または挿入）を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、Ｓ６３Ａ及びＳ７３Ａ変異の一方または両方を含む。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質は、野生型ヒトｃ－Ｊｕｎと比較して、残基２と１０２の間、または残基３０と５０の間に欠失を有する。

いくつかの態様では、本改変された免疫細胞に有用なｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、その全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれるＷＯ２０１９／１１８９０２に開示されている切断型ｃ－Ｊｕｎポリペプチドを含む。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現の低下と併せて、過剰発現したｃ－Ｊｕｎポリペプチドは、細胞において過剰発現した場合に、該細胞（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲを発現し、かつＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現が低下し、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質の内因性発現を有する免疫細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞）、ＣＡＲもしくはＴＣＲを発現し、かつＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現が低下し、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の内因性発現を有する免疫細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞）、またはＣＡＲもしくはＴＣＲを発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現が低下し、ＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の内因性発現を有する免疫細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞））の疲弊を防止及び／または低減することが可能である。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下した、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現する細胞は、耐疲弊性であり、それによって養子細胞療法（例えば、ＣＡＲＴ細胞療法）の進歩に対する大きな障壁に対処する。いくつかの態様では、該疲弊に対する耐性は、参照細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現せず、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の内因性発現を有する対応する細胞）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、もしくは少なくとも約１，０００倍またはそれを超えて高められる。

ＮＲ４Ａ遺伝子（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３）及び／またはタンパク質の発現の低下と併せて、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞におけるｃ－Ｊｕｎタンパク質の過剰発現は、いくつかの態様では、該細胞の活性状態を、例えば、Ｔ細胞の機能不全（例えば、Ｔ細胞の疲弊）を軽減または防止することによって維持するのに役立つ。本操作された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、抗原担持細胞（例えば、ＲＯＲ１を担持する腫瘍細胞）に対して持続的で強力な細胞傷害性を示す。ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現せず、ＮＲ４Ａ（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下していないＴ細胞と比較して、本操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の疲弊の兆候が少なく、持続すること及びより長く機能することができるエフェクター細胞の兆候が増加している。

いくつかの態様では、本明細書に提供する免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１ＣＡＲ操作細胞、及びｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下している）は、ＴＩＧＩＴ、ＰＤ－１及びＣＤ３９が挙げられるがこれらに限定されない１つ以上の疲弊マーカーの発現が低下している。疲弊マーカーの発現は、バルク集団において、フローサイトメトリーによって、バルクＲＮＡＳｅｑトランスクリプトーム分析を使用して測定することができるか、またはいくつかの態様では、個別細胞トランスクリプトーム分析が、シングルセルＲＮＡＳｅｑを使用して行われ得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ操作Ｔ細胞、及びｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下している）における１つ以上の疲弊マーカーの発現は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように操作されておらず、かつ内因性レベルのＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を発現する対応する細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ操作Ｔ細胞、及びｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下している）におけるＴＩＧＩＴの発現は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように操作されていないか、またはＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３タンパク質の内因性発現を有する対応する細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ操作Ｔ細胞、及びｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下している）におけるＰＤ－１の発現は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように操作されておらず、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の内因性発現を有する対応する細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、もしくは少なくとも約１００倍を超えて低下する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ操作Ｔ細胞、及びｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下している）におけるＣＤ３９の発現は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように操作されておらず、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の内因性発現を有する対応する細胞）と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて低下する。

いくつかの態様では、抗原刺激後、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、操作された抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下している）の集団は、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現せず、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下していない対応する細胞の対照集団と比較して、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１２５倍、もしくは少なくとも約１５０倍またはそれを超えるＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、及び／またはＴＮＦ－αを分泌する。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、操作された抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している）の集団は、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現せず、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下していない対応する細胞の対照集団と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えるＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、及び／またはＴＮＦ－αを、１：１、１：５、１：１０及び／または１：２０のＥ：Ｔ比での持続抗原刺激の０日目及び／または１４日目に発現する。サイトカイン分泌は、ＥＬＩＳＡまたはＭＳＤ分析等の当技術分野で既知の方法を使用して測定され得る。

いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、操作された抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している）の集団は、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現せず、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下していない対応する細胞の対照集団と比較して、例えば、曲線下面積（ＡＵＣ）によって定量化して、少なくとも約２倍、少なくとも約４倍、少なくとも約６倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、もしくは少なくとも約２５０倍またはそれを超えて向上した殺傷効率を示す。

いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する、例えば、操作された抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞、ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している）の集団は、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現せず、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下していない対応する細胞の対照集団と比較して、少なくとも等しいか、または少なくとも約１．５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１２５倍、少なくとも約１５０倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約２２５倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、もしくは少なくとも約５００倍またはそれを超える増殖を抗原に応答して示す。抗原誘導性の増殖は、本明細書に記載のもの等、当技術分野で既知の増殖アッセイを使用して調べることができる。

本明細書に記載の細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞）の１つ以上の特性、例えば、疲弊、細胞表現型、持続性、細胞傷害性及び／または殺傷、増殖、サイトカイン放出、及び遺伝子発現プロファイルを測定するために有用なアッセイは、当技術分野で知られており、これらとしては、例えば、フローサイトメトリー、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）、ＩｎｃｕＣｙｔｅ免疫細胞殺傷分析、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）または同様のアッセイ、持続抗原刺激アッセイ、連続抗原刺激アッセイ（持続抗原刺激アッセイと同様であるが、各再刺激回でＥ：Ｔ細胞比をリセットしない）、バルク及びシングルセルＲＮＡｓｅｑ（例えば、ＦｒｏｎＧｅｎｅｔ．２０２０；１１：２２０、２０１９Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ３５：ｉ４３６－４４５、２０１９ＡｎｎｕａｌＲｅｖｉｅｗｏｆＢｉｏｍｅｄ．ＤａｔａＳｃｉ．２：１３９－１７３を参照のこと）、細胞傷害性／殺傷アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロットならびに他の標準的な分子及び細胞生物学方法、例えば、本明細書に記載のものまたは例えば、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙもしくはＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９９－２０２１）もしくはその他に記載のものが挙げられる。

いくつかの態様では、該免疫細胞の集団は、純粋な集団である。いくつかの態様では、該純粋な集団は、同じ免疫細胞型に属する細胞を少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも９９％含む（例えば、該免疫細胞の９９％がリンパ球である）。いくつかの態様では、該免疫細胞の集団は、１、２、３、４、または５つの異なる細胞型を含み、例えば、２つの細胞型を含む免疫細胞の集団は、リンパ球及び樹状細胞を含み得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞の集団は、リンパ球を含むか、リンパ球からなるか、またはリンパ球から本質的になる。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞の集団は、リンパ球を含み、該リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞、及びそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの特定の態様では、該リンパ球は、Ｔ細胞である。いくつかの特定の態様では、該リンパ球は、ＮＫ細胞である。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの態様では、該Ｔ細胞は、ＣＡＲを含む。いくつかの態様では、該ＣＡＲを発現するように調製され得る改変されたＴ細胞（ＣＡＲＴ細胞）は、例えば、ＣＤ８^＋Ｔ細胞またはＣＤ４^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示するＣＡＲ発現細胞は、ＣＡＲＴ細胞、例えば、モノＣＡＲＴ細胞、ゲノム編集ＣＡＲＴ細胞、二重ＣＡＲＴ細胞、またはタンデムＣＡＲＴ細胞である。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞は、ＮＫ細胞である。いくつかの態様では、該ＮＫ細胞は、ＣＡＲを含む。いくつかの態様では、該ＣＡＲＮＫ細胞は、モノＣＡＲＮＫ細胞、二重ＣＡＲＮＫ細胞、またはタンデムＣＡＲＮＫＴ細胞である。いくつかの態様では、本開示の改変された細胞は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方を含む。いくつかの態様では、該Ｔ細胞及びＮＫ細胞は、両方がＣＡＲを含む。かかるＣＡＲＴ細胞及びＣＡＲＮＫ細胞の例は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４４１９５号に提供されている。いくつかの態様では、該Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはその両方は、本明細書に記載の他のリガンド結合タンパク質のいずれかを含む。例えば、いくつかの態様では、該Ｔ細胞は、ＴＣＲ、例えば、操作されたＴＣＲを含む。いくつかの態様では、該ＮＫ細胞は、ＴＣＲ、例えば、操作されたＴＣＲを含む。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、任意の免疫細胞型であり得る。いくつかの態様では、該細胞は、任意の養子細胞移入（ＡＣＴ）療法（別名養子細胞療法）用の改変された免疫細胞である。ＡＣＴ療法は、自家療法または同種療法であり得る。いくつかの態様では、該ＡＣＴ療法としては、ＣＡＲＴ療法、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）療法、ＮＫ細胞療法、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられるがこれらに限定されない。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞は、ＴＩＬ療法用のＴＩＬである。がんを治療するための養子細胞移入療法としてのＴＩＬの使用は、メラノーマのＴＩＬ養子細胞療法を使用し、２０年以上にわたって研究されてきた。ＲｏｓｅｎｂｅｒｇＳＡｅｔａｌ．，（Ｊｕｌｙ２０１１）．ＣｌｉｎｉｃａｌＣａｎｃｅｒＲｅｓｅａｒｃｈ１７（１３）：４５５０－７（Ｊｕｌｙ２０１１）。養子Ｔ細胞移入療法では、外科的に切除した腫瘍を小断片に切り分けたもの、または腫瘍断片から単離した単細胞浮遊液から、ＴＩＬをエキソビボで増殖させる。個々の培養物を複数樹立し、別々に成長させ、特異的腫瘍認識についてアッセイする。ＴＩＬを、数週間かけて拡大する。次いで、最も良好な腫瘍反応性を示した特定のＴＩＬ株を、通常２週間にわたって抗ＣＤ３活性化を使用する「急速拡大プロトコル」（ＲＥＰ）でさらに拡大させる。該培養で成長したＴＩＬは、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３タンパク質にそれらの組み合わせを含めた発現が低下し、かつｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現が増加するように、該エキソビボプロセスの任意の時点で改変され得る。ＲＥＰ後の最終的なＴＩＬが、当該患者に注入で戻される。該プロセスは、養子移入されたＴＩＬを、腫瘍部位を包囲するのに十分に接近させるようにするために、内因性リンパ球を枯渇させる予備的な化学療法レジメンを含む場合もある。

本明細書に記載の通り、本開示の免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している）は、リガンド結合タンパク質（本明細書では、「キメラ結合タンパク質」とも呼ばれる）を含み得る。本開示に有用なリガンド結合タンパク質（例えば、キメラ結合タンパク質）の非限定的な例は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、操作されたＴＣＲ）、キメラ抗体－Ｔ細胞受容体（ｃａＴＣＲ）、キメラシグナル伝達受容体（ＣＳＲ）、Ｔ細胞受容体模倣物（ＴＣＲ模倣物）、及びそれらの組み合わせを含む。

いくつかの態様では、本明細書に開示する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、抗原（例えば、腫瘍抗原）に特異的に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含み得る。本開示で使用され得るＣＡＲの非限定的な例は、当技術分野で既知である。例えば、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ２０２０／０１７２８７９Ａ１及びＵＳ２０１９／０１８３９３２Ａ１を参照されたい。

いくつかの態様では、本明細書に開示する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、操作されたＴ細胞受容体（別名「トランスジェニックＴＣＲ」）を含む。Ｔ細胞受容体は、α鎖及びβ鎖という２つの異なる膜貫通ポリペプチド鎖から構成されたヘテロ二量体であり、各鎖は、該鎖をＴ細胞表面膜内に固定する定常領域と、ＭＨＣが提示する抗原を認識しこれに結合する可変領域からなる。該ＴＣＲ複合体は、ＣＤ３γε及びＣＤ３δεの２つのヘテロ二量体、ならびに１つのホモ二量体ＣＤ３ζを形成する６つのポリペプチドに関連しており、これらが一緒になってＣＤ３複合体を形成している。Ｔ細胞受容体で操作されたＴ細胞療法は、これらの複合体を保持するＴ細胞の改変を利用して、特定の腫瘍細胞によって発現される抗原を特異的に標的とする。本明細書で使用される、「操作されたＴＣＲ」または「操作されたＴ細胞受容体」という用語は、選択され、クローニングされ、及び／または後にＴ細胞の集団に導入される主要組織適合抗原（ＭＨＣ）／ペプチド標的抗原に所望の親和性で特異的に結合するように操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を指す。

いくつかの態様では、本明細書に開示する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、キメラ抗体－Ｔ細胞受容体（ｃａＴＣＲ）を含む。本明細書で使用される、「キメラ抗体－Ｔ細胞受容体」または「ｃａＴＣＲ」は、（ｉ）目的の抗原と特異的に結合する抗体部分及び（ｉｉ）少なくとも１つのＴＣＲ関連シグナル伝達分子をリクルートすることが可能なＴ細胞受容体モジュールを含む。いくつかの態様では、該抗体部分と該Ｔ細胞受容体モジュールは一緒に融合される。いくつかの態様では、該キメラ結合タンパク質は、キメラシグナル伝達受容体（ＣＳＲ）を含む。「キメラシグナル伝達受容体」または「ＣＳＲ」は、標的リガンドと特異的に結合するリガンド結合ドメイン及びＣＳＲを発現する免疫細胞に刺激シグナルを提供することが可能な共刺激シグナル伝達ドメインを含む。ｃａＴＣＲ及びＣＳＲの非限定的な例は、参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ１０，８２２，４１３Ｂ２にさらに記載されている。

いくつかの態様では、本明細書に開示する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体模倣物（ＴＣＲ模倣物）を含む。本明細書で使用される、「Ｔ細胞受容体模倣物」または「ＴＣＲ模倣物」という用語は、腫瘍抗原を認識するよう操作された抗体（またはその断片）を指し、該腫瘍抗原は、ＨＬＡ分子と関連して提示される。当業者には明白な通り、これらの抗体は、ＴＣＲの特異性を模倣することができる。ＴＣＲ模倣物の非限定的な例は、例えば、ＵＳ２００９／０２２６４７４Ａ１及びＵＳ２０１９／００９２８７６Ａ１に提供されており、これらの各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞で発現され得るリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）は、腫瘍細胞、例えば、悪性Ｂ細胞、悪性Ｔ細胞、または悪性形質細胞で発現される１つ以上の抗原に特異的に結合する（すなわち、それを標的とする）。

いくつかの態様では、該リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）は、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＴｎＡｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－１１Ｒａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＡＧＥＡ１、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、スルビビン、テロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体（例えば、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ変異タンパク質を含む）、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＣＤ２、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＡＰＲＩＬタンパク質の細胞外部分、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される抗原に特異的に結合する（すなわち、それを標的とする）。

いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、改変されたＣＡＲまたはＴＣＲ操作細胞）は、抗原（例えば、腫瘍抗原）の主なタイプ、すなわち、共通腫瘍関連抗原（共通ＴＡＡ）及び固有の腫瘍関連抗原（固有ＴＡＡ）、または腫瘍特異的抗原を標的とし得る。前者としては、がん－精巣（ＣＴ）抗原、過剰発現抗原、及び分化抗原を挙げることができるがこれらに限定されず、後者は、新抗原及び腫瘍ウイルス抗原を挙げることができるがこれらに限定されない。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ６タンパク質及びＨＰＶＥ７タンパク質は、腫瘍ウイルス抗原のカテゴリーに属する。

いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、改変されたＣＡＲまたはＴＣＲ操作細胞）は、ＣＴ抗原、例えば、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＭＡＧＥ－Ａ２、ＭＡＧＥ－Ａ３、ＭＡＧＥ－Ａ４、ＭＡＧＥ－Ａ６、ＭＡＧＥ－Ａ８、ＭＡＧＥ－Ａ９．２３、ＭＡＧＥ－Ａ１０、及びＭＡＧＥ－Ａ１２を含むがこれらに限定されないメラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）を標的とし得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、改変されたＣＡＲまたはＴＣＲ操作細胞）は、メラノーマ及び正常なメラノサイトに主に見出される糖タンパク質（ｇｐ１００）、Ｔ細胞により認識されるメラノーマ抗原（ＭＡＲＴ－１）、及び／またはチロシナーゼを標的とし得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、改変されたＣＡＲまたはＴＣＲ操作細胞）は、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ１）、すなわち、ほとんどの急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病、ほとんどすべてのタイプの固形腫瘍、及び数種の決定組織、例えば、心臓組織で高発現する過剰発現抗原の一種を標的とし得る。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、改変されたＣＡＲまたはＴＣＲ操作細胞）は、メソテリン、すなわち、中皮腫で高発現するが、気管を含めた数種の組織の中皮細胞にも存在する別の種類の過剰発現抗原を標的とし得る。

いくつかの態様では、本開示の改変された免疫細胞、例えば、ＣＡＲＴ細胞もしくはＮＫ細胞またはＴＣＲ操作Ｔ細胞は、上記に開示する腫瘍抗原またはそれらの組み合わせのいずれか１つを標的とし得る。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本明細書に提供する免疫細胞は、ＲＯＲ１抗原を特異的に標的とし得る。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１（ＲＯＲ１）は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）患者の約５７％及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌患者の４２％で過剰発現されており（Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ２０１７）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞にとって非常に魅力的な標的を意味する。受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体１陽性（ＲＯＲ１^＋）固形腫瘍は、抗ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞で安全に標的化され得る（Ｓｐｅｃｈｔ２０２０）が、固形腫瘍の悪性腫瘍患者では、ＣＡＲＴ細胞が注入後に疲弊または機能不全を示すため、有効性は一部制限されている。さらに、固形腫瘍は、ＣＡＲＴ細胞等の免疫療法の抗腫瘍活性を制限する免疫抑制バリアを有する（Ｎｅｗｉｃｋ２０１６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ２０１８、Ｍａｒｔｉｎｅｚ２０１９）。

いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載の抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質を発現する細胞（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ１ＴＣＲ）は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現すると同時に、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下するように改変されている。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ１ＴＣＲ）を発現する細胞は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現すると同時に、ＮＲ４Ａファミリーの複数のメンバーのレベルが低下するように改変されている。これらの改変された細胞は、当技術分野で利用可能な他の抗ＲＯＲ１細胞（例えば、リガンド結合タンパク質を発現するが、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、及び／または該ＮＲ４Ａファミリーの複数のメンバーのレベルが低下するように改変されていない）と比較して、疲弊に対してより耐性が高く、かつエフェクター機能の改善を示す。

いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが低下している）は、ＲＯＲ１結合キメラ抗原受容体（「抗ＲＯＲ１ＣＡＲ」）を含む。例示的な抗ＲＯＲ１ＣＡＲは、参照により全体として本明細書に組み込まれるＨｕｄｅｃｅｋ，ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９．１２（２０１３）：３１５３－６４に記載されている。いくつかの態様では、抗ＲＯＲ１ＣＡＲを含む本開示のＣＡＲＴ細胞は、Ｈｕｄｅｃｅｋｅｔａｌ．に記載されているように生成される（例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＨｕｄｅｃｅｋｅｔａｌ．３１５５頁、第一段落全体に記載されているように）。いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１ＣＡＲには、参照により全体として本明細書に組み込まれるＨｕｄｅｃｅｋｅｔａｌ．（３１５４－５５頁にわたって記載の段落）、Ｂａｓｋａｒｅｔａｌ．ＭＡｂｓ４（２０１２）：３４９－６１、及びＹａｎｇｅｔａｌ．ＰＬｏＳＯＮＥ６（２０１１）：ｅ２１０１８に記載の２Ａ２、Ｒ１１、及びＲ１２抗ＲＯＲ１モノクローナル抗体のＶＨ及び／またはＶＬ配列を含む抗体またはその断片が含まれる。

いくつかの態様では、本開示に有用な抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ１ＴＣＲ）は、抗ＲＯＲ１抗体、例えば、Ｒ１２抗体と交差競合することが可能である。該Ｒ１２抗体配列が表７に示されている。いくつかの態様では、本開示に有用な抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ１ＴＣＲ）は、該Ｒ１２抗体の同じエピトープに結合する。当業者には明らかなように、当技術分野で既知の任意の抗ＲＯＲ１抗体が本開示で使用され得る。かかる抗体の非限定的な例としては、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＨｕｄｅｃｅｋ，ｅｔａｌ．Ｃｌｉｎ．ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．１９．１２（２０１３）：３１５３－６４、Ｂａｓｋａｒｅｔａｌ．ＭＡｂｓ４（２０１２）：３４９－６１、及びＹａｎｇｅｔａｌ．ＰＬｏＳＯＮＥ６（２０１１）：ｅ２１０１８、ＵＳ９，３１６，６４６Ｂ２、及びＵＳ９，７５８，５８６Ｂ２に記載の２Ａ２及びＲ１１抗体が挙げられる。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞で発現され得る本明細書に記載の抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ）の抗原結合ドメインは、該Ｒ１２抗体のＶＨＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ）の抗原結合ドメインは、該Ｒ１２抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、及びＶＨＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ）の抗原結合ドメインは、該Ｒ１２抗体のＶＨＣＤＲ１、ＶＨＣＤＲ２、ＶＨＣＤＲ３、ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含む。いくつかの態様では、本開示の抗ＲＯＲ１キメラ結合タンパク質の抗原結合ドメイン、例えば、Ｒ１２ｓｃＦｖは、該Ｒ１２抗体のＶＨ及びＶＬを含む。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞で発現され得るキメラ結合タンパク質（例えば、本明細書に提供するＣＡＲまたはＴＣＲのいずれか、例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ）の細胞内ドメインは、シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するものを含む。いくつかの態様では、該キメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）はさらに、共刺激ドメイン、例えば、２Ｂ４、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＡＧ３、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＢ７－Ｈ３に由来するものを含む。いくつかの態様では、該キメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）は、４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞で発現され得るキメラ結合タンパク質（例えば、本明細書に提供するＣＡＲまたはＴＣＲ）の膜貫通ドメインは、例えば、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒベータ、ＩＬ２Ｒガンマ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、またはＣＤ１９の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含み得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞で発現され得るキメラ結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）はさらに、共刺激ドメイン、例えば、本明細書に記載の共刺激ドメインをコードする配列を含む。いくつかの態様では、該共刺激ドメインは、インターロイキン－２受容体（ＩＬ－２Ｒ）、インターロイキン－１２受容体（ＩＬ－１２Ｒ）、ＩＬ－７、ＩＬ－２１、ＩＬ－２３、ＩＬ－１５、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－１（ＬＦＡ－１）、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、Ｂ７－Ｈ３、Ｌｃｋ結合欠失ＣＤ２８（ＩＣＡ）、ＢＴＬＡ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＬＦＡ－１、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＰＤ－１、ＴＩＬＲ２、ＴＩＬＲ４、ＴＩＬＲ７、ＴＩＬＲ９、Ｆｃ受容体ガンマ鎖、Ｆｃ受容体ε鎖、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせの共刺激ドメインを含む。

さらに本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞は、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質（それらの組み合わせを含む）の発現が低下するように、例えば、遺伝子編集ツールによって改変される。該ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子の発現の低下は、例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子全体を編集することによって、該ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子の一部を編集することによって、該ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子の発現を制御する調節領域を編集することによってなされ得る。したがって、リガンド結合タンパク質を発現する免疫細胞（例えば、本明細書に提供するＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞）におけるＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質（それらの組み合わせを含む）の発現を低下させるために、細胞における遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための当技術分野で既知の方法が使用され得る。例えば、いくつかの態様では、本明細書に提供する免疫細胞（例えば、ＣＡＲ発現細胞またはＴＣＲ発現細胞）のＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはそのコードされるタンパク質の発現は、該細胞を、該ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及びそのコードされるタンパク質の発現レベルを低下させることが可能な遺伝子編集ツールと接触させることによって低下させることができる。該遺伝子編集ツールの非限定的な例は、以下に示されている。いくつかの特定の態様では、該遺伝子編集ツールは、例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲである。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールは、該ＮＲ４Ａファミリーのメンバーを特異的に標的とするガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。かかるｇＲＮＡの非限定的な例を表Ａ、Ｃ、及びＤに示す。

いくつかの態様では、本明細書に提供する免疫細胞（例えば、本明細書に開示する方法によって産生されたＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞、すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下し、かつｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加している）の集団は、参照免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、１つ以上の特性の向上または改善を示す。いくつかの態様では、本明細書に開示する免疫細胞の１つ以上の特性を改善することは、腫瘍の治療（例えば、腫瘍体積及び／または腫瘍重量の低減）に役立つ可能性がある。本開示によって改善され得る１つ以上の特性としては、がんの治療に有用であり得る本明細書に開示する免疫細胞の任意の特性が挙げられる。例えば、いくつかの態様では、該免疫細胞（例えば、本明細書に開示する方法によって産生されたＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞、すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下し、かつｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加している）の集団は、参照細胞（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及びタンパク質の発現レベルが低下するように、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するように改変されていないＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）と比較して、高いエフェクター活性を示し得る。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞の特性の向上は、参照細胞に対する、
（ｉ）該免疫細胞の拡大及び／または増殖の増加、
（ｉｉ）該免疫細胞の細胞傷害性の増加、
（ｉｉｉ）該免疫細胞のサイトカイン発現の増加、または
（ｉｖ）それらの任意の組み合せを含む。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のうちの１つ以上のレベルが低下している本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、疲弊耐性及び／または機能不全耐性である。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のうちの１つ以上のレベルが低下している本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、アポトーシス抵抗性であり、すなわち、アポトーシスの減少を示すか、アポトーシスを示さない。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のうちの１つ以上のレベルが低下している本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、免疫チェックポイント抵抗性であり、すなわち、免疫チェックポイント活性の低下を示すかまたは免疫チェックポイント活性を示さない。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のうちの１つ以上のレベルが低下している本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、Ｔ細胞活性化の向上を示す。いくつかの態様では、かかるＴ細胞活性化の向上は、例えば、参照免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、増殖の向上、細胞傷害性の向上、サイトカイン発現の向上、またはそれらの任意の組み合わせを示す改変された免疫細胞によって証明され得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のうちの１つ以上のレベルが低下している本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）における抗腫瘍機能を維持する。

本開示はまた、本明細書に開示する改変された免疫細胞の集団及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物も提供する。かかる医薬組成物は、本開示の他の箇所でさらに記載されている。

ＩＩＩ．治療方法
本明細書に提供するのは、腫瘍（またはがん）の治療を必要とする対象におけるその治療方法であり、該方法は、該対象に対して、本開示の細胞組成物、例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはそのコードされるタンパク質、すなわち、ＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下している細胞を投与することを含む。本明細書で使用される、「細胞組成物」という用語は、該免疫細胞単独、または１つ以上のさらなる薬剤（例えば、賦形剤）との組み合わせを指す。いくつかの態様では、該細胞は、本明細書に記載の腫瘍抗原に特異的に結合するリガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を含む。いくつかの態様では、腫瘍抗原は、ＲＯＲ１を含む。したがって、いくつかの態様では、本明細書に提供する腫瘍の治療方法は、該対象に対して、本明細書に記載の細胞組成物を投与することを含み、該細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下し、かつ（ｉｉｉ）腫瘍抗原を特異的に標的とするＣＡＲを発現する。いくつかの態様では、本明細書に提供する腫瘍の治療方法は、該対象に対して、本明細書に記載の細胞組成物を投与することを含み、該細胞は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）のレベルが低下し、かつ（ｉｉｉ）腫瘍抗原を特異的に標的とするＴＣＲ（例えば、操作されたＴＣＲ）を発現する。

いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子の発現レベルは、参照細胞（例えば、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３）遺伝子の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）タンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３）タンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及びタンパク質の両方の発現レベルは、参照細胞（例えば、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する。該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルを低下させる方法は、本開示の他の箇所で提供されている。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物の投与により、該対象における腫瘍体積が参照腫瘍体積と比較して減少する。いくつかの態様では、該参照腫瘍体積は、該改変された細胞の投与の前の対象における腫瘍体積である。いくつかの態様では、該参照腫瘍体積は、投与を受けなかった対応する対象における腫瘍体積である。特に明記しない限り、「投与を受けなかった対応する対象」（またはそのバリアント）は、以下のいずれかを含む：（１）内因性レベルのｃ－Ｊｕｎタンパク質及び該ＮＲ４Ａファミリーの全メンバーを発現する対応する細胞の投与を受けた対応する対象（例えば、同じ腫瘍に罹患している）、（２）ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するが、該ＮＲ４Ａファミリーの全メンバーの内因性レベルを有する対応する細胞の投与を受けた対応する対象、（３）該ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルが低下しているが、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない対応する細胞の投与を受けた対応する対象、及び（４）（１）～（３）の任意の組み合わせ。いくつかの態様では、該対象における腫瘍体積は、投与後に、該参照腫瘍体積と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。

いくつかの態様では、腫瘍の治療は、当該対象の腫瘍重量を減少させることを含む。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞は、対象に投与された場合、該対象の腫瘍重量を減少させることができる。いくつかの態様では、該腫瘍重量は、投与後に、参照腫瘍重量と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。いくつかの態様では、該参照腫瘍重量は、該改変された細胞の投与の前の対象における腫瘍重量である。いくつかの態様では、該参照腫瘍重量は、投与を受けなかった対応する対象の腫瘍重量である。

いくつかの態様では、例えば、腫瘍に罹患した対象に対する本開示の細胞組成物の投与により、該対象の腫瘍及び／またはＴＭＥのＴＩＬ（例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋）の数及び／またはパーセンテージを増加させることができる。いくつかの態様では、腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＴＩＬの数及び／またはパーセンテージは、参照（例えば、該改変された細胞を受けなかった対象または該改変された細胞の投与前の同じ対象の対応する値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、もしくは少なくとも約３００％またはそれを超えて増加する。いくつかの態様では、例えば、腫瘍に罹患した対象に対する本開示の細胞組成物の投与により、該対象の腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＴＩＬ（例えば、ＣＤ４^＋またはＣＤ８^＋）の数及び／またはパーセンテージは、参照（例えば、該改変された細胞を受けなかった対象または該改変された細胞の投与前の同じ対象の対応する値）と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、または少なくとも約１００倍増加し得る。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物の投与により、対象の腫瘍及び／またはＴＭＥにおける制御性Ｔ細胞の数及び／またはパーセンテージが減少し得る。いくつかの態様では、腫瘍及び／またはＴＭＥにおける制御性Ｔ細胞の数及び／またはパーセンテージは、参照（例えば、該改変された細胞の投与を受けなかった対象における対応する数及び／またはパーセンテージ）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％減少する。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物の投与により、対象の腫瘍及び／またはＴＭＥにおける骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数及び／またはパーセンテージが減少し得る。いくつかの態様では、該ＭＤＳＣは、単球性のＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様では、該ＭＤＳＣは、多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様では、該ＭＤＳＣは、Ｍ－ＭＤＳＣとＰＭＮ－ＭＤＳＣの両方を含む。いくつかの態様では、該腫瘍及び／またはＴＭＥにおけるＭＤＳＣの数及び／またはパーセンテージは、参照（例えば、該改変された細胞の投与を受けなかった対応する対象における値）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または約１００％減少する。

上記に加えて、本開示の細胞組成物を投与することにより、腫瘍の治療に貢献する他の効果をもたらすことができる。かかる効果を以下にさらに説明する。

本明細書に記載の通り、本開示の細胞組成物（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下し、腫瘍抗原、例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する結合分子を発現する）は、様々ながん型、例えば、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）癌、胃腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する腫瘍を知慮するために使用され得る。包括的かつ非限定的ながんの適応のリストが、本出願の適応のセクションに提供されている。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、他の治療薬（例えば、抗がん剤及び／または免疫調節剤）と組み合わせて使用され得る。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示する腫瘍を治療する方法は、本開示の細胞組成物を１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせて投与することを含む。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、免疫経路の複数の要素が標的とされ得るように、１つ以上の抗がん剤と組み合わせて使用され得る。いくつかの態様では、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介してシグナル伝達を遮断する）。本方法で使用され得る免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。併用療法の包括的かつ非限定的なリストは、本出願の併用療法のセクションで詳細に開示される。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、該対象に対して、該さらなる治療薬の投与の前または後に投与される。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、該対象に対して、該さらなる治療薬と同時に投与される。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物及び該さらなる治療薬は、医薬的に許容される担体に含まれる単一の組成物として同時に投与され得る。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物及び該さらなる治療薬は、別々の組成物として同時に投与される。

いくつかの態様では、本開示によって治療され得る対象は、非ヒト動物、例えば、ラットまたはマウスである。いくつかの態様では、治療され得る対象は、ヒトである。

いくつかの態様では、腫瘍を、例えば、本明細書に開示する方法で治療することは、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を高めることを含む。本明細書で使用される、「Ｔ細胞の活性化を高めること」という表現は、Ｔ細胞の記憶の保持を促進するように、活性化の過程で該細胞のシグナル伝達を変更することを指す。

したがって、いくつかの態様では、本開示は、Ｔ細胞の活性化を、該細胞においてｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現させること、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルを低下させることによって高める方法に関する。細胞の活性化状態は、当技術分野で既知の任意の方法により、例えば、該細胞の１つ以上の機能特性（例えば、増殖、細胞傷害性、サイトカイン産生）を分析することによって、または該細胞の表現型発現を分析することによって特定され得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を高めることにより、該細胞において以下の特性の改善のうちの１つ以上がもたらされ得る：（ｉ）増殖の向上、（ｉｉ）細胞傷害性の向上、（ｉｉｉ）サイトカイン発現の向上、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせ。

いくつかの態様では、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を高めることにより、該細胞の増殖が向上する。いくつかの態様では、該Ｔ細胞の増殖は、参照細胞（例えば、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する細胞）の増殖と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、もしくは少なくとも約３００％またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。いくつかの態様では、該増殖の向上により、該改変されたＴ細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下している）の数の増加が、例えば、対象においてもたらされ得る。いくつかの態様では、該改変されたＴ細胞の数は、参照細胞（例えば、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する細胞）の数と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、もしくは少なくとも約３００％またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を高めることにより、該細胞の細胞傷害性が向上する。本明細書で使用される、「細胞傷害性」という用語は、本開示の細胞組成物（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）が腫瘍細胞を攻撃し、腫瘍細胞の損傷を誘導する能力を指す。本開示の細胞組成物（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）は、当技術分野で既知の任意の方法により、例えば、腫瘍細胞のアポトーシスを、細胞傷害性分子（例えば、パーフォリン、グランザイム、及びグラニュライシン）の放出を介して、またはＦａｓ－Ｆａｓリガンド相互作用を介して誘導することによって、腫瘍細胞を攻撃し、腫瘍細胞の損傷を誘導することができる。いくつかの態様では、該Ｔ細胞の細胞傷害性は、参照細胞（例えば、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及びタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する細胞）の増殖と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２１０％、少なくとも２２０％、少なくとも約２３０％、少なくとも約２４０％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２６０％、少なくとも約２７０％、少なくとも約２８０％、少なくとも約２９０％、もしくは少なくとも約３００％またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。

いくつかの態様では、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の活性化を高めることにより、該細胞のサイトカイン発現が向上する。いくつかの態様では、該サイトカイン発現は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のサイトカイン発現と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。本明細書で使用される、「サイトカイン」という用語は、がんの治療に有用であり得る任意のサイトカインを指す。かかるサイトカインの非限定的な例としては、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

いくつかの態様では、該免疫細胞の拡大及び／または増殖、該免疫細胞の細胞傷害性、または該免疫細胞のサイトカイン発現は、約２倍～約１００倍、～約１５０倍、～約２００倍、～約２５０倍、～約３００倍、～約３５０倍、～約４００倍、～約４５０倍、～約５００倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様では、該免疫細胞の拡大及び／または増殖、該免疫細胞の細胞傷害性、または該免疫細胞のサイトカイン発現は、約１０倍～約５００倍、約２０倍～約４００倍、約２５倍～約２５０倍、約１０倍～約５０倍増加する。いくつかの態様では、該免疫細胞の拡大及び／または増殖、該免疫細胞の細胞傷害性、または該免疫細胞のサイトカイン発現は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する免疫細胞）のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、本開示に従う改変された免疫細胞は、参照細胞に対してサイトカイン発現の増加を示す。いくつかの態様では、該サイトカインは、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの任意の組み合わせである。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞におけるＩＬ－２の発現レベルは、参照免疫細胞におけるＩＬ－２の発現レベルと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞におけるＩＦＮ－γの発現レベルは、参照免疫細胞におけるＩＦＮ－γの発現レベルと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、該改変された免疫細胞におけるＴＮＦ－αの発現レベルは、参照免疫細胞におけるＴＮＦ－αの発現レベルと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、本明細書に開示するリガンド結合タンパク質を発現する免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下している）は、抗原、例えば、同種抗原（例えば、腫瘍抗原）で、例えば、連続刺激及び／または慢性刺激で刺激された場合に増加した量のＩＬ－２を産生する。いくつかの態様では、該免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）によって産生されるＩＬ－２の量は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、本明細書に開示するリガンド結合タンパク質を発現する免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下している）は、抗原、例えば、同種抗原（例えば、腫瘍抗原）で、例えば、連続刺激及び／または慢性刺激で刺激された場合に増加した量のＩＦＮ－γを産生する。いくつかの態様では、該免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）によって産生されるＩＦＮ－γの量は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、本明細書に開示するリガンド結合タンパク質を発現する免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下している）は、抗原、例えば、同種抗原（例えば、腫瘍抗原）で、例えば、連続刺激及び／または慢性刺激で刺激された場合に増加した量のＴＮＦ－αを産生する。いくつかの態様では、該免疫細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）によって産生されるＴＮＦ－αの量は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、細胞拡大及び／または細胞増殖の増加を示す。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞における細胞拡大及び／または細胞増殖は、該参照免疫細胞のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、持続性及び／または生存の延長を示す。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞における持続性及び／または生存は、該参照免疫細胞のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて延長する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、抗腫瘍活性の増加を示す。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞における抗腫瘍活性は、該参照免疫細胞のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、もしくは少なくとも約１００倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された免疫細胞（例えば、本明細書に記載のＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）は、参照免疫細胞（すなわち、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下するように改変されていない対応する免疫細胞）と比較して、疲弊または機能不全の減少を示す。いくつかの態様では、該改変された免疫細胞における疲弊または機能不全は、該参照免疫細胞と比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍減少する。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞は、他の治療薬（例えば、抗がん剤及び／または免疫調節剤）と組み合わせて使用され得る。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示する腫瘍を治療する方法は、本開示の改変された細胞を１つ以上のさらなる治療薬と組み合わせて対象に投与することを含む。かかる薬剤としては、例えば、化学療法薬、標的抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞傷害剤、免疫ベースの療法、サイトカイン、外科的処置、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合せを挙げることができる。いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下している）は、標準治療（例えば、手術、放射線、及び化学療法）と組み合わせて使用され得る。本明細書に記載の方法は、維持療法、例えば、腫瘍の発生または再発を予防することを目的とした療法として使用することもできる。

いくつかの態様では、本開示の改変された細胞は、免疫経路の複数の要素が標的とされ得るように、１つ以上の抗がん剤と組み合わせて使用され得る。非限定的なかかる組み合わせとしては、腫瘍抗原提示を高める療法（例えば、樹状細胞ワクチン、ＧＭ－ＣＳＦ分泌型細胞ワクチン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、イミキモド）、負の免疫調節を、例えば、ＣＴＬＡ－４及び／またはＰＤ１／ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－Ｌ２経路を阻害すること及び／またはＴ_ｒｅｇもしくは他の免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来サプレッサー細胞）を枯渇もしくは遮断することによって阻害する療法、正の免疫調節を、例えば、ＣＤ－１３７、ＯＸ－４０、及び／またはＣＤ４０またはＧＩＴＲ経路を刺激する及び／またはＴ細胞エフェクター機能を刺激するアゴニストで刺激する療法、抗腫瘍Ｔ細胞の頻度を全身的に増加させる療法、Ｔ_ｒｅｇ、例えば、腫瘍のＴ_ｒｅｇを、例えば、ＣＤ２５のアゴニスト（例えば、ダクリズマブ）を使用して、もしくはエキソビボ抗ＣＤ２５ビーズ枯渇により枯渇もしくは阻害する療法、該腫瘍に含まれるサプレッサー骨髄細胞の機能に影響を及ぼす療法、腫瘍細胞の免疫原性を高める療法（例えば、アントラサイクリン）、遺伝子操作された細胞を含む養子Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞移入、例えば、キメラ抗原受容体によって改変された細胞（ＣＡＲ－Ｔ療法）、代謝酵素、例えば、インドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、ジオキシゲナーゼ、アルギナーゼ、もしくは酸化窒素シンターゼを阻害する療法、Ｔ細胞のアネルギーもしくは疲弊を逆転させる／防止する療法、自然免疫活性化及び／または腫瘍部位の炎症を誘発する療法、免疫刺激サイトカインの投与、免疫抑制サイトカインの遮断、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

いくつかの態様では、抗がん剤は、免疫チェックポイント阻害剤を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介してシグナル伝達を遮断する）。本方法で使用され得る免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例は、ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト（例えば、抗ＣＴＬＡ－４抗体）、ＰＤ－１アンタゴニスト（例えば、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）、ＴＩＭ－３アンタゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ－３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。かかる免疫チェックポイント阻害剤の非限定的な例としては、抗ＰＤ１抗体（例えば、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ＭＫ－３４７５）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＰＤＲ００１、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ－５１４）、ＴＳＲ－０４２、ＲＥＧＮ２８１０、ＪＳ００１、ＡＭＰ－２２４（ＧＳＫ－２６６１３８０）、ＰＦ－０６８０１５９１、ＢＧＢ－Ａ３１７、ＢＩ７５４０９１、ＳＨＲ－１２１０、及びそれらの組み合わせ）、抗ＰＤ－Ｌ１抗体（例えば、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）、ＲＧ７４４６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＯ５５４１２６７）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（登録商標））、ＢＭＳ－９３６５５９、アベルマブ（ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標））、ＬＹ３３０００５４、ＣＸ－０７２（Ｐｒｏｃｌａｉｍ－ＣＸ－０７２）、ＦＡＺ０５３、ＫＮ０３５、ＭＤＸ－１１０５、及びそれらの組み合わせ）、ならびに抗ＣＴＬＡ－４抗体（例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））、トレメリムマブ（チシリムマブ、ＣＰ－６７５，２０６）、ＡＧＥＮ－１８８４、ＡＴＯＲ－１０１５、及びそれらの組み合わせ）が挙げられる。

いくつかの態様では、抗がん剤は、免疫チェックポイント活性化因子を含む（すなわち、特定の免疫チェックポイント経路を介してシグナル伝達を促進する）。いくつかの態様では、免疫チェックポイント活性化因子は、ＯＸ４０アゴニスト（例えば、抗ＯＸ４０抗体）、ＬＡＧ－３アゴニスト（例えば、抗ＬＡＧ－３抗体）、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニスト（例えば、抗ＣＤ１３７抗体）、ＧＩＴＲアゴニスト（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体）、ＴＩＭ３アゴニスト（例えば、抗ＴＩＭ３抗体）、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの態様では、本明細書に開示する改変された細胞は、該対象に対して、該さらなる治療薬の投与の前または後に投与される。いくつかの態様では、該改変された細胞は、該対象に対して、該さらなる治療薬と同時に投与される。いくつかの態様では、該改変された細胞及び該さらなる治療薬は、医薬的に許容される担体に含まれる単一の組成物として同時に投与され得る。いくつかの態様では、該改変された細胞及び該さらなる治療薬は、別々の組成物として同時に投与される。いくつかの態様では、該さらなる治療薬及び該改変された免疫細胞は、連続して投与される。

ＩＶ．改変された免疫細胞の製造方法
本開示は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下している細胞を生成または調製する方法を提供し、該方法は、例えば、（ｉ）該細胞を遺伝子編集ツールで改変すること、ここで、該遺伝子編集ツールは、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるものであること、ならびに（ｉｉ）該細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変することを含む。いくつかの態様では、該細胞は、該細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を発現するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドで形質導入することによって改変され得る。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該細胞は、内因性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を高めることが可能な転写活性化因子で改変され得る。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ１及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ２及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ３及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現の低下と併せたｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現の増加により、該細胞の疲弊が相乗的に低減または阻害される。

したがって、本開示はまた、リガンド結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ））を発現する細胞の疲弊を低減または阻害する方法を提供し、該方法は、該細胞を、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変することを含む。いくつかの態様では、該細胞は、免疫細胞である。また、本開示は、免疫細胞におけるエフェクター機能の持続を促進する方法を提供し、該方法は、該細胞を、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変することを含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ１及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ２及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ３及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を含む。

遺伝子編集、例えば、塩基編集は、当技術分野で既知の任意の編集ツールを使用して行うことができる。例えば、いくつかの態様では、改変された細胞（例えば、免疫細胞）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド等の技術を使用して改変され得る。いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／または発現は、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡを使用しても改変され得る。これらの技術はすべて、以下でより詳細に説明される。いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるために使用される方法は、１つ以上の遺伝子編集ツール（例えば、２つ、３つ、またはそれ以上のツール）を使用することを含む。いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるために使用される方法は、ＮＲ４ＡのＤＮＡに作用する少なくとも１つの方法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ）またはＲＮＡに作用する少なくとも１つの方法（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）及びＮＲ４Ａタンパク質に作用する少なくとも１つの方法（例えば細胞シグナル伝達パートナーに対する結合の阻害または翻訳後修飾）を含む。

いくつかの態様では、本明細書に開示するように、例えば、遺伝子編集ツールを使用してＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子レベルを低下させるようにまたは無効にするように改変された細胞（例えば、免疫細胞）はさらに、リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように改変され得る。したがって、いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞を調製する方法は、免疫細胞を、（ｉ）遺伝子編集ツール（例えば、ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーを特異的に標的化することが可能）、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードするヌクレオチド配列で改変することを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の免疫細胞を調製する方法は、免疫細胞を、（ｉ）遺伝子編集ツール（例えば、ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーを特異的に標的化することが可能）、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を増加させることが可能な転写活性化因子、及び（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードするヌクレオチド配列で改変することを含む。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるガイドＲＮＡを含む（例えば、表Ａ、Ｃ、及びＤ参照）。使用され得る他の遺伝子編集ツールの非限定的な例は、本開示の他の箇所でさらに説明されている。

いくつかの態様では、上記の方法とともに使用され得るｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、本明細書に提供するｃ－Ｊｕｎヌクレオチド配列のいずれかを含む。例えば、いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、（ａ）配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｂ）配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｃ）配列番号１０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｄ）配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｅ）配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｆ）配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｇ）配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、（ｈ）配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、または（ｉ）配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む。

いくつかの態様では、本明細書に開示する遺伝子編集方法に従って改変され、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞は、改善された抗がん特性を有し得る。かかる抗がん特性の非限定的な例は、本開示の他の箇所で説明されている。

ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための方法、例えば、遺伝子編集は、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞との関連で提供されているが、当業者には、本明細書に開示する方法が、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させることが所望される任意の細胞に使用され得ることが認識されよう。例えば、いくつかの態様では、本明細書に開示するＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させる方法は、免疫細胞に適用され得る。いくつかの態様では、該免疫細胞は、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラル（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、リンパ球は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの態様では、ＴＩＬは、ＣＤ８^＋ＴＩＬである。いくつかの態様では、ＴＩＬは、ＣＤ４^＋ＴＩＬである。したがって、本開示は、本明細書に開示するＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるため、ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現させるための方法に従って調製された改変された細胞（例えば、改変された免疫細胞、その親細胞は、例えば、上記に開示する任意の細胞である）を含む細胞組成物を提供し、該改変された細胞は、参照細胞（例えば、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質が過剰発現するように改変されていない対応する細胞）に対して、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現の低下ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質の過剰発現を示す。いくつかの態様では、これらの改変された細胞は、医薬組成物を調製するために使用され得る。

いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞を改変することは、（ｉ）該細胞を、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の該細胞における発現レベルを低下させることが可能な遺伝子編集ツールと接触させること、ならびに（ｉｉ）該細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドと接触させることを含む。いくつかの態様では、本明細書に記載の細胞を改変することは、（ｉ）該細胞を、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の該細胞における発現レベルを低下させることが可能な遺伝子編集ツールと接触させること、ならびに（ｉｉ）該細胞を、ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を増加させることが可能な転写活性化因子と接触させることを含む。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツール（またはＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させることが可能な任意の他のツール）を、改変するべき細胞と接触させることは、インビボ、インビトロ、エキソビボ、またはそれらの組み合わせで行われ得る。いくつかの態様では、該接触させることは、インビボで行われる（例えば、遺伝子治療）。いくつかの態様では、該接触させることは、インビトロで行われる。いくつかの態様では、該接触させることは、エキソビボで行われる。いくつかの態様では、該細胞は、自己細胞である。いくつかの態様では、該細胞は、異種細胞である。いくつかの態様では、該遺伝子ツール（または該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させることが可能な任意の他のツール）を接触させることにより、該細胞における該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルは、参照細胞（例えば、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質のレベルと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、または少なくとも５０倍低下する。

いくつかの態様では、細胞を遺伝子編集ツールと接触させることは、様々な送達経路を含む。一般に、細胞においてＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための本明細書に開示する遺伝子編集ツールの場合、該遺伝子編集ツールは、該細胞に侵入すること及び目的の遺伝子に結合することが可能でなければならない。いくつかの態様では、目的の分子を細胞に送達するための当技術分野で既知の任意の送達媒体が使用され得る。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第１０，０４７，３５５Ｂ２号を参照されたい。使用され得るベクターに関するさらなる開示は、本開示の他の箇所に提供されている。

いくつかの態様では、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）タンパク質をコードする遺伝子を、該機能的タンパク質の発現を破棄するように変異させることができる。いくつかの態様では、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質をコードする全遺伝子を除去することができるため、該タンパク質の発現が破棄される。いくつかの態様では、遺伝子編集ツールは、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）タンパク質をコードする遺伝子の一部（例えば、１つ以上のエクソン）を除去する。いくつかの態様では、遺伝子編集ツール、例えば、塩基編集剤は、インデルを生成することなく特定のヌクレオチド塩基を修飾する。本明細書で使用される、「インデル」という用語は、遺伝子のコード領域内でフレームシフト突然変異をもたらし得る、核酸内のヌクレオチド塩基の挿入または欠失を指す。塩基編集剤の非限定的な例は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１７年５月４日公開の米国公開第２０１７／０１２１６９３号に開示されている。

いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞を調製する方法はさらに、該細胞を、リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように改変することを含む。いくつかの態様では、該細胞はさらに、ＣＡＲを発現するように改変される。いくつかの態様では、該細胞はさらに、ＴＣＲを発現するように改変される（例えば、操作されたＴＣＲ）。いくつかの態様では、リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように細胞を改変することは、該細胞を、該リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする核酸配列と接触させることを含む。いくつかの態様では、該リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする核酸配列は、ベクター（例えば、発現ベクター）から発現される。いくつかの態様では、該ベクターはさらに、さらなる目的のタンパク質（例えば、ｃ－Ｊｕｎタンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示する遺伝子編集ツールは、該遺伝子編集ツールをコードする核酸配列を含むベクターから発現される。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールをコードする核酸配列、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする核酸配列、及び該リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする核酸配列は、別々のベクター上にある。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールをコードする核酸配列及び該リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする核酸配列は、同じベクター上にある。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールをコードする核酸配列及び該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする核酸配列は、同じベクター上にある。いくつかの態様では、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする核酸配列及び該リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする核酸配列は、同じベクター上にある。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールをコードする核酸配列、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする核酸配列、及び該リガンド結合タンパク質をコードする核酸配列は、すべて同じベクター上にある。

ＩＶ．Ａ．遺伝子編集ツール
本開示の細胞を改変するために１つ以上の遺伝子編集ツールが使用され得る。遺伝子編集ツールの非限定的な例を下記に開示する。

ＩＶ．Ａ．１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム
いくつかの態様では、本開示で使用され得る遺伝子編集ツールは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを含む。かかるシステムは、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸分子を使用することができ、これは、場合によっては、それが発現される所望の細胞型（例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＡＲ発現または操作されたＴＣＲ発現Ｔ細胞）向けにコドン最適化される。本明細書でさらに説明されるように、いくつかの態様では、かかるシステムは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質を含み得る。

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼを使用し、これは、該Ｃａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９によって認識されるＮＧＧモチーフの直前の標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡ（例えば、合成ガイドＲＮＡ）（ｇＲＮＡ）と複合体を形成することによってゲノム部位を標的とする。これにより、該ＮＧＧモチーフの上流に二本鎖切断３ヌクレオチドがもたらされる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの独自の能力は、単一のＣａｓ９タンパク質を２つ以上のｇＲＮＡ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のｇＲＮＡ）と共発現させることにより、複数の別個のゲノム遺伝子座を同時に標的とする能力である。かかるシステムは、２つの別々の分子を含むガイドＲＮＡを使用することもできる。いくつかの態様では、２分子ｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ様（「ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ」または「ターゲッターＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡ」または「ｃｒＲＮＡリピート」）分子及び対応するｔｒａｃｒＲＮＡ様（「トランス作用性ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ」または「活性化因子ＲＮＡ」または「ｔｒａｃｒＲＮＡ」または「足場」）分子を含む。

ｃｒＲＮＡは、該ｇＲＮＡのＤＮＡ標的化セグメント（一本鎖）及び該ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）二重鎖の半分を形成する一続きのヌクレオチドの両方を含む。対応するｔｒａｃｒＲＮＡ（活性化因子ＲＮＡ）は、該ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖の残りの半分を形成する一続きのヌクレオチドを含む。したがって、ｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡの一続きのヌクレオチドに相補的であり、これとハイブリダイズして、該ｇＲＮＡのタンパク質結合ドメインのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成する。したがって、各ｃｒＲＮＡは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡを有すると言える。該ｃｒＲＮＡはさらに、一本鎖ＤＮＡ標的化セグメントをもたらす。したがって、ｇＲＮＡは、標的配列（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３ｍＲＮＡ）とハイブリダイズする配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。したがって、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは（対応する対として）ハイブリダイズし、ｇＲＮＡを形成する。細胞内での改変のために使用される場合、所与のｃｒＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子の正確な配列及び／または長さは、ＲＮＡ分子が使用される種（例えば、ヒト）に特異的であるように設計され得る。

３つの要素（Ｃａｓ９、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ）をコードする天然に存在する遺伝子は、通常、オペロン（複数可）に構築される。天然に存在するＣＲＩＳＰＲＲＮＡは、Ｃａｓ９システム及び生物によって異なるが、多くの場合、２１～４６ヌクレオチド長の２つのダイレクトリピート（ＤＲ）が両側に配置された２１～７２ヌクレオチド長の標的化セグメントを含む（例えば、ＷＯ２０１４／１３１８３３参照）。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓの場合、ＤＲは、３６ヌクレオチド長であり、標的化セグメントは、３０ヌクレオチド長である。３’に位置するＤＲは、対応するｔｒａｃｒＲＮＡに相補的であり、これとハイブリダイズし、次いでＣａｓ９タンパク質に結合する。

代替的に、本明細書で使用されるＣＲＩＳＰＲシステムはさらに、コドン最適化Ｃａｓ９とともに機能する融合ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ構築物（すなわち、単一の転写産物）を使用する場合がある。この単一のＲＮＡは、多くの場合、ガイドＲＮＡまたはｇＲＮＡと呼ばれる。ｇＲＮＡ内では、該ｃｒＲＮＡ部分は、所与の認識部位の「標的配列」として識別され、該ｔｒａｃｒＲＮＡは、多くの場合「足場」と呼ばれる。簡潔には、該標的配列を含む短いＤＮＡ断片を、ガイドＲＮＡ発現プラスミドに挿入する。該ｇＲＮＡ発現プラスミドは、該標的配列（いくつかの態様では、約２０ヌクレオチド）、ある形態のｔｒａｃｒＲＮＡ配列（足場）、ならびに当該細胞で活性を有する適切なプロモーター及び真核細胞における適切なプロセシングに必要な要素を含む。該システムの多くは、カスタムの相補的オリゴに依存し、これらをアニールして二本鎖ＤＮＡを形成し、その後該ｇＲＮＡ発現プラスミドにクローニングする。

該ｇＲＮＡ発現カセット及び該Ｃａｓ９発現カセットを次いで該細胞に導入する。例えば、ＭａｌｉＰｅｔａｌ．，（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８２３－６、ＪｉｎｅｋＭｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１２Ａｕｇ．１７；３３７（６０９６）：８１６－２１、ＨｗａｎｇＷＹｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１３Ｍａｒｃｈ；３１（３）：２２７－９、ＪｉａｎｇＷｅｔａｌ．，ＮａｔＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ２０１３Ｍａｒｃｈ、３１（３）：２３３－９、及びＣｏｎｇＬｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３Ｆｅｂ．１５；３３９（６１２１）：８１９－２３を参照されたい。これらの各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。同様に、例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１、ＷＯ／２０１４／０６５５９６Ａ１、ＷＯ／２０１４／０８９２９０Ａ１、ＷＯ／２０１４／０９３６２２Ａ２、ＷＯ／２０１４／０９９７５０Ａ２、及びＷＯ／２０１３１４２５７８Ａ１も参照されたい。これらの各々は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様では、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、タンパク質の形態で提供され得る。例えば、いくつかの態様では、本開示に有用な細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及びｇＲＮＡを含む核酸分子を導入することによって、（例えば、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルが低下するように）改変され得る。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及び該ｇＲＮＡを含む核酸分子は、該細胞に連続して導入され得る。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及び該ｇＲＮＡを含む核酸分子は、該細胞に同時に導入され得る。例えば、いくつかの態様では、該同時投与は、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質及び該ｇＲＮＡを含む核酸分子を、同時に別々の組成物として導入することを含む。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９タンパク質は、該ｇＲＮＡを含む核酸分子との複合体の形態で（すなわち、単一の組成物として）提供され得る。

いくつかの態様では、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、該タンパク質をコードする核酸の形態で提供され得る。したがって、いくつかの態様では、本開示に有用な細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をコードする第一の核酸分子及びｇＲＮＡを含む第二の核酸分子を導入することによって、（例えば、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルが低下するように）改変され得る。いくつかの態様では、該第一及び第二の核酸分子は、連続して該細胞に導入され得る。いくつかの態様では、該第一及び第二の核酸分子は、同時に該細胞に導入され得る。例えば、いくつかの態様では、該第一及び第二の核酸分子は、該細胞に同時に、別々の組成物として導入され得る。いくつかの態様では、該第一及び第二の核酸分子は、単一のポリヌクレオチドの一部であることができ、該細胞は、該単一のポリヌクレオチドを含むように改変される。

該Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸は、ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））またはＤＮＡであり得る。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、ＲＮＡの形態で提供され得る。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、該ＲＮＡをコードするＤＮＡの形態で提供され得る。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、別々のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子、またはそれぞれｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをコードする別々のＤＮＡ分子の形態で提供され得る。

いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）及びトランス活性化ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）をコードする第三の核酸配列を含む。いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｉ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質である。いくつかの態様では、該ＩＩ型Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９である。いくつかの態様では、該ＩＩ型Ｃａｓ、例えば、Ｃａｓ９は、ヒトコドン最適化Ｃａｓである。

いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両鎖を切断することなく標的核酸配列内に一本鎖切断（すなわち、「ニック」）を創出することができる「ニッカーゼ」である。Ｃａｓ９は、例えば、２つのヌクレアーゼドメイン、すなわち、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメイン及びＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインを含み、これらは対向するＤＮＡ鎖の切断に関与する。これらのドメインのいずれかの変異がニッカーゼを創出し得る。ニッカーゼを創出する変異の例は、例えば、ＷＯ／２０１３／１７６７７２Ａ１及びＷＯ／２０１３／１４２５７８Ａ１に見出すことができ、これらは各々、参照により本明細書に組み込まれる。

いくつかの態様では、ｄｓＤＮＡの各鎖の標的部位に特異的な２つの別々のＣａｓタンパク質（例えば、ニッカーゼ）は、別の核酸または同じ核酸上の別々の領域上のオーバーハンギング配列に相補的なオーバーハンギング配列を創出することができる。核酸を、ｄｓＤＮＡの両鎖上の標的部位に特異的な２つのニッカーゼと接触させることによって創出されるオーバーハンギング末端は、５’または３’のいずれかのオーバーハンギング末端であり得る。例えば、第一のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第一の鎖に一本鎖切断を創出することができ、第二のニッカーゼは、ｄｓＤＮＡの第二の鎖に一本鎖切断を創出することができ、その結果、オーバーハンギング配列が創出される。一本鎖切断を創出する各ニッカーゼの標的部位は、創出されるオーバーハンギング末端の配列が異なる核酸分子のオーバーハンギング末端の配列と相補的であるように選択され得る。２つの異なる核酸分子の相補的なオーバーハンギング末端は、本明細書に開示する方法によってアニールされ得る。いくつかの態様では、該第一の鎖のニッカーゼの標的部位は、該第二の鎖のニッカーゼの標的部位とは異なる。

いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子、ならびにそのコードされるＮＲ４Ａタンパク質の発現は、該細胞を、例えば、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子に特異的であるＣＲＩＳＰＲ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システム）と接触させることによって低下する。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該ＮＲ４Ａ１遺伝子に特異的である。したがって、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲと接触させた後、該細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、（ｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、（ｉｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質を有し、かつ（ｉｉｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該ＮＲ４Ａ２遺伝子に特異的である。したがって、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲと接触させた後、該細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、（ｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質を有し、（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、かつ（ｉｉｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該ＮＲ４Ａ３遺伝子に特異的である。したがって、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲと接触させた後、該細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、（ｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質を有し、（ｉｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質を有し、かつ（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下する。

本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、複数のＮＲ４Ａ遺伝子を標的とする。例えば、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該ＮＲ４Ａ１遺伝子と該ＮＲ４Ａ２遺伝子の両方を標的とすることが可能である。したがって、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲと接触させた後、該細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、（ｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、かつ（ｉｉｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を有する。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該ＮＲ４Ａ１遺伝子と該ＮＲ４Ａ３遺伝子の両方を標的とすることが可能である。したがって、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲと接触させた後、該細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、（ｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、（ｉｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質を有し、かつ（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下する。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／または該ＮＲ４Ａ３遺伝子の両方を標的とすることが可能である。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲと接触させた後、該細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、（ｉ）内因性レベルの該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質を有し、（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、かつ（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下する。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該ＮＲ４Ａ１遺伝子、該ＮＲ４Ａ２遺伝子、及び該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とすることが可能である。したがって、いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲと接触させた後、該細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現免疫細胞）は、（ｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下し、かつ（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質のレベルが低下する。

いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲを使用した遺伝子編集により、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子のレベルが、参照細胞（例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用した遺伝子編集に供されていない対応する細胞）で観察されるＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子レベルに対して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％低下する。いくつかの態様では、該ＣＲＩＳＰＲは、該免疫細胞におけるＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）の発現を完全に無効にする。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子のレベルは、当技術分野で既知の任意の技術、例えば、デジタルドロップレットＰＣＲを使用して測定され得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示するｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ９をコードする核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡである。いくつかの態様では、本明細書に開示するｇＲＮＡ及び／またはＣａｓ９をコードするＲＮＡまたはＤＮＡは、それぞれ、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡである。いくつかの態様では、該合成ＲＮＡまたはＤＮＡは、少なくとも１つの非天然核酸塩基を含む。いくつかの態様では、ある特定のクラスのすべての核酸塩基が、非天然核酸塩基と置き換えられている（例えば、本明細書に開示するポリヌクレオチドにおけるすべてのウリジンが、非天然核酸塩基、例えば、５－メトキシウリジンまたはプソイドウリジンと置き換えられ得る）。いくつかの態様では、該ポリヌクレオチド（例えば、合成ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ）は、天然の核酸塩基のみ、すなわち、合成ＤＮＡの場合はＡ、Ｃ、Ｔ及びＵ、または合成ＲＮＡもしくは合成ＤＮＡの場合にはＡ、Ｃ、Ｔ及びＵを含む。一般に、本明細書に開示するＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集方法は、細胞、例えば、免疫細胞を、インビボ、インビトロ、またはエキソビボで、（ｉ）Ｃａｓ９または該Ｃａｓ９をコードする核酸、及び（ｉｉ）少なくとも１つのＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３）遺伝子のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）または該ｇＲＮＡをコードする核酸と接触させることを含み、該ｇＲＮＡは、該ＮＲ４Ａ遺伝子に含まれる配列（例えば、イントロン及び／またはエクソン配列）を標的とし、該細胞を、該Ｃａｓ９及び少なくとも１つのｇＲＮＡと接触させることにより、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現が低下する。

いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０、５２～５７、５８、６１、６５、６７、６８、７０、７１、７５、７６、８２、８３、８６、９４、及び９６に記載の配列の任意の１つ以上を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号３０に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５２に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５３に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５４に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５５に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５６に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５６に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５６に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５７に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号５８に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６１に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６５に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６７に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号６８に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７０に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７１に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７５に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号７６に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８２に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８３に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号８６に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９４に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９４に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配
列番号９４に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９４に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ３遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号９６に記載の配列から本質的になる。

本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該遺伝子編集方法はさらに、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方のレベルを低下させることを含み得る。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２５に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ１遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２６に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２７に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２８に記載の配列から本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に記載の配列を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に記載の配列からなる。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ２遺伝子を標的とするために使用され得るｇＲＮＡは、配列番号２９に記載の配列から本質的になる。

本明細書で使用される、「接触させること」という用語（例えば、細胞、例えば、免疫細胞を少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓ９と接触させること）は、少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９をインビトロにて細胞内で一緒にインキュベートすること（例えば、培養中で該ｇＲＮＡ及び／またはＣａｓタンパク質、または該ｇＲＮＡ（複数可）及び／またはＣａｓ９タンパク質（複数可）をコードする核酸（複数可）を細胞に添加すること）、または細胞をインビボもしくはエキソビボで接触させることを含むことを意図している。

本明細書に開示する、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子の標的配列を、少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９（またはそれらをコードする少なくとも１つの核酸配列）と接触させるステップは、任意の適切な方法で行われ得る。例えば、該細胞、例えば、免疫細胞は、細胞培養条件で処理され得る。本明細書に開示する、少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（またはそれらをコードする少なくとも１つの核酸配列）と接触させた細胞は、別の薬剤、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲをコードする少なくとも１つの核酸配列を含むベクターと同時にまたは連続して接触させることもできる。いくつかの態様では、該細胞をインビトロまたはエキソビボで接触させた後、該方法はさらに、該細胞を当該対象に導入し、それによって疾患または状態、例えば、がんの症状を治療または改善することを含む。

エキソビボ法の場合、細胞は、自己細胞、すなわち、免疫細胞（複数可）に含まれる標的ポリヌクレオチド配列（例えば、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子）を変更する必要がある対象から採取した該免疫細胞（複数可）を含み得る（すなわち、ドナー及びレシピエントが同じ個体である）。自己細胞は、該細胞の任意の免疫学的に基づいた拒絶を回避するという利点を有する。代替的に、該細胞は、例えば、ドナーから採取される異種であり得る。通常、該細胞がドナーに由来する場合、それらは、レシピエントと免疫学的に十分に適合するドナーに由来し、すなわち、移植片拒絶反応の対象とならず、免疫抑制の必要性が低減または除去される。いくつかの態様では、該細胞は、異種起源、すなわち、レシピエント、またはレシピエントの種と免疫学的に十分に適合するように遺伝子操作された非ヒト哺乳類から採取される。免疫学的適合性を特定するための方法は、当技術分野で既知であり、ＨＬＡ及びＡＢＯ決定基に関するドナーとレシピエントの適合性を評価するための組織適合検査を含む。例えば、ＴｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ＢａｃｈａｎｄＡｕｃｈｉｎｃｌｏｓｓ，Ｅｄｓ．（Ｗｉｌｅｙ，Ｊｏｈｎ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ１９９４）を参照されたい。

いくつかの態様では、本開示は、改変された免疫細胞を生成する方法を提供し、該方法は、細胞、例えば、免疫細胞（Ｔ細胞等）に含まれるＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子配列を、エキソビボで、該細胞に含まれるＮＲ４Ａ遺伝子配列を、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子に含まれるモチーフを標的とするＣａｓ９タンパク質（またはかかるＣａｓ９タンパク質をコードする核酸）及び１つのｇＲＮＡ（例えば、ＮＲ４Ａ３のエクソン３及び４に位置するモチーフ）と接触させることによって変更することを含み、該ｇＲＮＡは、該Ｃａｓ９タンパク質を該標的遺伝子に向かわせ、該標的モチーフにハイブリダイズさせ、該ＮＲ４Ａ遺伝子は、一部または全体的に開裂し、該開裂の効率は、約１０％～約１００％である。かかるｇＲＮＡの非限定的な例を本明細書に示す（例えば、表Ａ、Ｃ、及びＤ参照）。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本明細書に記載の改変された免疫細胞を生成する方法は、該ＮＲ４Ａ遺伝子配列を、該細胞を、該Ｃａｓ９タンパク質をコードする第一の核酸分子及び該ＮＲ４Ａ遺伝子ファミリーの１つ以上のメンバーを標的とするｇＲＮＡを含む第二の核酸分子と接触させることによって変更することを含む。いくつかの態様では、該第一の及び核酸分子を、連続して該細胞と接触させる。いくつかの態様では、該第一の及び核酸分子を、同時に該細胞と接触させる。例えば、いくつかの態様では、該細胞を、該Ｃａｓ９タンパク質をコードする第一の核酸分子及び該ｇＲＮＡを含む第二の核酸分子を含む単一のポリヌクレオチドと接触させる。

いくつかの態様では、該細胞は、上記の変更ステップの前に、後に、またはそれと同時に、リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードする核酸（例えば、ベクター）で改変（例えば、トランスフェクト）されている。さらに、本開示の他の箇所でさらに記載されるように、いくつかの態様では、該細胞は、上記の変更ステップの前、後、またはそれと同時に、ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加するように改変されている。

いくつかの態様では、該開裂の効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％である。

本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、使用されるＣａｓ、例えば、Ｃａｓ９に応じて様々な長さのｇＲＮＡスペーサー配列を使用することができる。異なる種に由来するＣａｓ９は、機能的リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成するためにそれらの対応するｇＲＮＡと対合する必要があり、換言すれば、異なる細菌種から操作されたキメラｇＲＮＡフレームは、スペーサー配列及びキメラフレーム配列の差に起因して、異なる長さを有し得る。

いくつかの態様では、該ｇＲＮＡスペーサー配列は、少なくとも約１８ヌクレオチド（例えば、約１８、約１９、約２０、約２１、または約２２ヌクレオチド）長であり得る。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９に結合するｇＲＮＡに含まれるＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのｇＲＮＡスペーサー配列の長さは、２０ヌクレオチドであるが、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＣａｓ９に結合するｇＲＮＡに含まれるＳ．ａｕｒｅｕｓのｇＲＮＡスペーサー配列の長さは、２１ヌクレオチドである。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡスペーサー配列は、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５ヌクレオチドを含み得る。

該ｇＲＮＡスペーサー配列と、それが該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子上で結合するＤＮＡ鎖との完全な一致が好ましいが、ｇＲＮＡのスペーサー配列とＮＲ４Ａの標的配列間のミスマッチもまた、それがＮＲ４Ａ遺伝子レベルの低下またはＮＲ４Ａ遺伝子機能の減少をもたらす限り、許容される。該標的ＮＲ４Ａ配列と完全に相補的なｇＲＮＡ上の約８～約１２個の連続したヌクレオチド間の「シード」配列は、該ＮＲ４Ａ遺伝子の標的配列の適切な認識に好ましい。該ｇＲＮＡのスペーサー配列の残りの部分は、１つ以上のミスマッチを含むことができる。

一般に、ｇＲＮＡ活性は、ミスマッチの数と逆相関している。好ましくは、本開示のｇＲＮＡのスペーサー配列は、約７個未満のミスマッチを含む。いくつかの態様では、ｇＲＮＡのスペーサー配列は、対応するＮＲ４Ａ遺伝子の標的配列と、７個のミスマッチ、６個のミスマッチ、５個のミスマッチ、４個のミスマッチ、３個のミスマッチ、より好ましくは、２個またはそれより少ないミスマッチを含み、さらにより好ましくは、ミスマッチを含まない。該ｇＲＮＡ中のヌクレオチド数が少ないほど、許容されるミスマッチの数は少なくなる。結合親和性は、一致するｇＲＮＡ－ＤＮＡの組み合わせの合計に依存すると考えられる。

本開示のｇＲＮＡのスペーサー配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ編集システムのオフターゲット効果を最小限に抑えるように選択され得る。したがって、いくつかの態様では、該ｇＲＮＡのスペーサー配列は、当該細胞に含まれるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも２つのミスマッチを含むように選択される。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡのスペーサー配列は、当該細胞に含まれるすべての他のゲノムヌクレオチド配列と比較した場合に、少なくとも１つのミスマッチを含むように選択される。当業者には、オフターゲット効果を最小限に抑えるために適切なｇＲＮＡのスペーサー配列を選択するため、様々な技術（例えば、バイオインフォマティクス分析）が使用され得ることが理解されよう。

いくつかの態様では、該ｇＲＮＡのスペーサー配列は、配列番号３１～４２のスペーサー配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

いくつかの態様では、該ｇＲＮＡのスペーサー配列は、配列番号３１～４２のいずれか１つのＤＮＡ配列と比較して、少なくとも１、２、３、４または５個のヌクレオチドのミスマッチを含むスペーサー配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。

いくつかの態様では、編集の効果は、複数の位置を標的とすることによって増加し得る。

いくつかの態様では、２つのｇＲＮＡが、該ＮＲ４Ａ遺伝子の同じ鎖の配列に相補的である、及び／またはハイブリダイズする。いくつかの態様では、２つのｇＲＮＡが、該ＮＲ４Ａ遺伝子の向かい合う鎖の配列に相補的である、及び／またはハイブリダイズする。いくつかの態様では、該２つのｇＲＮＡは、該ＮＲ４Ａ遺伝子の向かい合う鎖の配列に相補的ではなく、及び／またはハイブリダイズしない。いくつかの態様では、２つのｇＲＮＡが、該ＮＲ４Ａ遺伝子の重複する標的モチーフに相補的である、及び／またはハイブリダイズする。いくつかの態様では、２つのｇＲＮＡが、該ＮＲ４Ａ遺伝子のオフセット標的モチーフに相補的である、及び／またはハイブリダイズする。

一般に、本開示のｇＲＮＡは、その配列の任意のバリアントまたは化学修飾を、それが対応するＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質の標的配列への結合、及びその後の該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子の除去（全または一部）を可能にする限り、含むことができる。

本明細書に開示する方法で使用されるＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、核酸を開裂するエンドヌクレアーゼであり、多くの細菌のゲノムのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座によってコードされ、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに関与している。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ等を含めた多くの種の細菌によって産生される。したがって、本開示に有用なＣａｓ９タンパク質は、当技術分野で既知の任意の適切な細菌に由来し得る。かかる細菌の非限定的な例としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕｔａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｎｅｕｍｏｎｉａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒｊｅｊｕｎｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｉｎｎｏｃｕａ、及びＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａｎｏｖｉｃｉｄａが挙げられる。本明細書に開示する方法は、当技術分野で既知の任意のＣａｓ９によって実施され得る。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９は、野生型Ｃａｓ９である。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９は、酵素活性が向上した変異Ｃａｓ９であるか、Ｃａｓ９部分を含む融合タンパク質である。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９タンパク質である。

Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は通常、細菌で発現されるため、それらの核酸配列を、Ｃａｓ９組み換えタンパク質を設計及び調製する際に、真核細胞（例えば、哺乳類細胞）での最適な発現用に修飾することが有利であり得る。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示する方法で使用されるＣａｓ９をコードする核酸は、真核細胞での発現用に、例えば、それを必要とするヒト対象の細胞での発現用にコドン最適化されている。

いくつかの態様では、本明細書に開示する方法で使用されるＣａｓ９タンパク質は、１つ以上のアミノ酸置換または修飾を含む。いくつかの態様では、該１つ以上のアミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換を含む。場合によっては、置換及び／または修飾によって、タンパク質分解を防止もしくは低減すること、及び／または細胞での該ポリペプチドの半減期を延長することができる。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９タンパク質は、ペプチド結合置換（例えば、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素等）を含み得る。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９タンパク質は、天然に存在するアミノ酸を含み得る。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９タンパク質は、代替アミノ酸（例えば、Ｄ－アミノ酸、ベータ－アミノ酸、ホモシステイン、ホスホセリン等）を含み得る。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９タンパク質は、異種部分を含むための修飾（例えば、ペグ化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、エンドキャッピング等）を含み得る。

本明細書に開示する方法は、概してＣａｓ９タンパク質を使用して実施されるが、いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓｌ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、またはＣａｓ８であり得ることが想定される。いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質は、任意の細菌種に由来するＣａｓ９タンパク質またはその機能的部分である。いくつかの特定の態様では、本明細書に開示する方法で使用されるＣａｓ９タンパク質は、ＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓｐｙｏｇｅｎｅｓもしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓのＣａｓ９タンパク質もしくはその機能的部分であるか、またはかかるＣａｓ９もしくはその機能的部分をコードする核酸である。使用され得る他のＣａｓヌクレアーゼの非限定的な例は、当技術分野で既知であり、例えば、その各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＵＳ９，９７０，００１Ｂ２、ＵＳ１０，２２１，３９８Ｂ２、及びＵＳ２０２０／０１９０４８７Ａ１に記載されている。いくつかの態様では、本開示に有用なＣａｓヌクレアーゼは、Ｉ型Ｃａｓタンパク質を含む。Ｉ型Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ３、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、及びそれらのバリアントが挙げられる。いくつかの態様では、本開示に有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む。ＩＩ型Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ９、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、及びそれらのバリアントが挙げられる。いくつかの態様では、本開示に有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＩＩＩ型Ｃａｓタンパク質を含む。非限定的な例としては、Ｃａｓ１０、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１１、及びそれらのバリアントが挙げられる。いくつかの態様では、本開示に有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＩＶ型Ｃａｓタンパク質を含む。かかるＣａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃｓｆ１が挙げられる。いくつかの態様では、本開示に有用なＣａｓヌクレアーゼは、Ｖ型Ｃａｓタンパク質を含む。非限定的な例としては、Ｃａｓ１２、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）、Ｃａｓ１２ｆ（Ｃａｓ１４、Ｃ２ｃ１０）、Ｃａｓ１２ｇ、Ｃａｓ１２ｈ、Ｃａｓ１２ｉ、Ｃａｓ１２ｋ（Ｃ２ｃ５）、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ９、及びそれらのバリアントが挙げられる。いくつかの態様では、本開示に有用なＣａｓヌクレアーゼは、ＶＩ型Ｃａｓタンパク質を含む。ＶＩ型Ｃａｓタンパク質の非限定的な例としては、Ｃａｓ１３、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２）、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、及びそれらのバリアントが挙げられる。

場合によっては、本開示に有用なＣａｓタンパク質は、上記のＣａｓタンパク質のオルソログまたはホモログを含む。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とも呼ばれる）及び「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ）」（本明細書では「ホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とも呼ばれる）という用語は、当技術分野では周知である。さらなる指針によれば、本明細書で使用される、タンパク質の「ホモログ」とは、そのホモログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を果たす同じ種のタンパク質である。ホモログのタンパク質は、構造的に関連している場合もあるが、構造的に関連している必要はなく、または、部分的にのみ構造的に関連する。本明細書で使用される、タンパク質の「オルソログ」とは、そのオルソログであるタンパク質と同じまたは同様の機能を果たす異なる種のタンパク質である。オルソログのタンパク質は、構造的に関連している場合もあるが、構造的に関連している必要はなく、または、部分的にのみ構造的に関連する。

本明細書で使用される、「機能的部分」とは、少なくとも１つのｇＲＮＡと複合体を形成し、標的配列を開裂し、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現の低下をもたらす能力を保持するペプチド、例えば、Ｃａｓ９の部分を指す。いくつかの態様では、該機能的部分は、ＤＮＡ結合ドメイン、少なくとも１つのＲＮＡ結合ドメイン、ヘリカーゼドメイン、及びエンドヌクレアーゼドメインからなる群から選択される、作動可能に連結されたＣａｓ９タンパク質の機能的ドメインの組み合わせを含む。いくつかの態様では、該機能的ドメインは、非共有結合複合体を形成する。いくつかの態様では、該機能的ドメインは、融合複合体（例えば、融合タンパク質）を形成する。いくつかの態様では、該機能的ドメインは、化学的に結合している（例えば、１つ以上のスペーサーまたはリンカーを介して）。いくつかの態様では、該機能的ドメインは、コンジュゲートされる。

本開示は、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子を少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９と接触させる様々な方法を企図することを理解されたい。いくつかの態様では、外因性Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、ポリペプチドの形態で細胞に導入され得る。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、細胞透過性ポリペプチドまたは細胞透過性ペプチドにコンジュゲートまたは融合され得る。本明細書で使用される、「細胞透過性ポリペプチド」及び「細胞透過性ペプチド」とは、細胞への分子の取り込みを容易にするポリペプチドまたはペプチドをそれぞれ指す。該細胞透過性ポリペプチドは、検出可能な標識を含み得る。

いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、荷電タンパク質、例えば、正、負または全体的に中性の電荷を担持するタンパク質にコンジュゲートまたは融合され得る。かかる結合は、共有結合であり得る。いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９を、過度に正電荷を有するペプチドに融合させ、該Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９が細胞に浸透する能力を著しく高めることができる。Ｃｒｏｎｉｃａｎｅｔａｌ．ＡＣＳＣｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．５（８）：７４７－５２（２０１０）を参照されたい。いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、細胞へのその侵入を容易にするため、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）に融合され得る。例示的なＰＴＤとしては、Ｔａｔ、オリゴアルギニン、及びペネトラチンが挙げられるがこれらに限定されない。したがって、いくつかの特定の態様では、本明細書に開示する方法は、細胞透過性ペプチドに融合されたＣａｓタンパク質、ＰＴＤに融合されたＣａｓタンパク質、ｔａｔドメインに融合されたＣａｓタンパク質、オリゴアルギニンドメインに融合されたＣａｓタンパク質、ペネトラチンドメインに融合されたＣａｓタンパク質、またはそれらの組み合わせを含むＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質を使用して実施され得る。

いくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９は、細胞、例えば、免疫細胞、例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現し、かつｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加しており、標的ポリヌクレオチド配列、例えば、該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子を含む免疫細胞に、該Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸の形態で導入され得る。該核酸を細胞に導入するプロセスは、任意の適切な技術によって達成され得る。適切な技術としては、リン酸カルシウムまたは脂質によるトランスフェクション、エレクトロポレーション、及びウイルスベクターを使用した形質導入または感染が挙げられる。いくつかの態様では、該核酸は、ＤＮＡを含む。いくつかの態様では、該核酸は、本明細書に記載の修飾ＤＮＡを含む。いくつかの態様では、該核酸は、ｍＲＮＡを含む。いくつかの態様では、該核酸は、本明細書に記載の修飾ｍＲＮＡ（例えば、合成修飾ｍＲＮＡ）を含む。

本明細書に開示する方法で使用されるｇＲＮＡ配列及び／またはＣａｓ９をコードする核酸配列は、例えば、それらの安定性を高めるように（例えば、それらを必要とする対象への投与後のそれらの血漿内半減期を延長するように）化学的に修飾され得る。本明細書に開示するｇＲＮＡ及び／または例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸配列に対する可能な化学修飾については、本明細書で以下に詳細に論じる。

いくつかの態様では、ｇＲＮＡ全体が化学的に修飾される。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡのスペーサーのみが化学的に修飾される。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡのスペーサー及びｇＲＮＡのフレーム配列が化学的に修飾される。特定の化学修飾の非限定的な例を以下に詳細に開示する。

したがって、本明細書に開示する方法のいくつかの態様では、該Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）及び１つ以上のｇＲＮＡは、それらをコードする１つ以上の送達ベクターからの発現を介して標的細胞に提供される。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡ（複数可）及びＣａｓ９を標的細胞に導入するための上記のベクター（複数可）は、ウイルスベクターである。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡ（複数可）及びＣａｓ９を標的細胞に導入するための上記のベクター（複数可）は、非ウイルスベクターである。いくつかの態様では、該ウイルスベクターは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター（ＬＶ）、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはそれらの組み合わせである。該ＡＡＶベクター（複数可）は、ＡＡＶＩ、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含めたいくつかのカプシド型のうちの１つ以上に基づき得る。いくつかの態様では、該ＡＡＶベクターは、ＡＡＶＤＪ－８、ＡＡＶ２ＤＪ９、またはそれらの組み合わせである。

上記で開示した方法に加えて、本開示はさらに、本開示の方法を実施するための組成物を提供する。したがって、本開示は、少なくとも１つの上記のｇＲＮＡをコードする核酸を提供する。

同様に提供するのは、組成物及び／または少なくとも１つのＣａｓ９である。いくつかの態様では、該Ｃａｓ９をコードする核酸は、（ｉ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９、（ｉｉ）Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９、（ｉｉｉ）Ｓ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９またはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９に由来する、Ｃａｓ９活性を保持している変異Ｃａｓ９、（ｉｖ）Ｃａｓ９部分を含む融合タンパク質、または（ｖ）それらの組み合わせをコードする。

いくつかの態様では、１つ以上の遺伝子編集ツール（例えば、本明細書に開示するもの）は、本開示の細胞を改変するために使用され得る。

ＩＶ．Ａ．２．ＴＡＬＥＮ
いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を編集（例えば、低減もしくは阻害）するために使用され得る遺伝子編集ツールは、ヌクレアーゼ剤、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、原核生物または真核生物のゲノムの特定の標的配列において二本鎖切断を行うために使用され得る配列特異的ヌクレアーゼのクラスである。ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、天然または操作された転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクター、またはその機能的部分を、エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ等の触媒ドメインに融合することによって創出される。

特有のモジュール型ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインにより、潜在的に任意の所与のＤＮＡ認識特異性を有するタンパク質の設計が可能になる。したがって、該ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインを、特定のＤＮＡ標的部位を認識するように操作し、ひいては所望の標的配列において二本鎖切断を行うために使用することができる。ＷＯ２０１０／０７９４３０、Ｍｏｒｂｉｔｚｅｒｅｔａｌ．，（２０１０）ＰＮＡＳ１０．１０７３／ｐｎａｓ．１０１３１３３１０７、Ｓｃｈｏｌｚｅ＆Ｂｏｃｈ（２０１０）Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ１：４２８－４３２、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（２０１０）１８６：７５７－７６１、Ｌｉｅｔａｌ．，（２０１０）Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．（２０１０）ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｑ７０４、及びＭｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（２０１１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２９：１４３－１４８を参照されたい。これらはすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

適切なＴＡＬヌクレアーゼの非限定的な例、及び適切なＴＡＬヌクレアーゼを調製するための方法は、例えば、米国特許出願第２０１１／０２３９３１５Ａ１号、第２０１１／０２６９２３４Ａ１号、第２０１１／０１４５９４０Ａ１号、第２００３／０２３２４１０Ａ１号、第２００５／０２０８４８９Ａ１号、第２００５／００２６１５７Ａ１号、第２００５／００６４４７４Ａ１号、第２００６／０１８８９８７Ａ１号、及び第２００６／００６３２３１Ａ１号（各々が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

様々な態様では、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼは、例えば、目的のゲノム遺伝子座における標的核酸配列またはその近傍を切断するように操作され、該標的核酸配列は、標的ベクターによって修飾される配列またはその近傍にある。本明細書に提供する様々な方法及び組成物での使用に適したＴＡＬヌクレアーゼは、本明細書に記載の標的ベクターによって修飾される標的核酸配列またはその近傍に結合するように特異的に設計されるものを含む。

いくつかの態様では、該ＴＡＬＥＮの各モノマーは、約１２～約２５個のＴＡＬリピートを含み、各ＴＡＬリピートは、１ｂｐのサブ部位に結合する。いくつかの態様では、該ヌクレアーゼ剤は、独立したヌクレアーゼに作動可能に連結したＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含むキメラタンパク質である。いくつかの態様では、該独立したヌクレアーゼは、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼである。いくつかの態様では、該ヌクレアーゼ剤は、第一のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第二のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、該第一及び第二のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、該第一及び第二のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、約６ｂｐ～約４０ｂｐの開裂部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、該ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、標的配列において二本鎖切断を行う。

いくつかの態様では、該ヌクレアーゼ剤は、第一のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメイン及び第二のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインを含み、該第一及び第二のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインの各々は、ＦｏｋＩヌクレアーゼに作動可能に連結しており、該第一及び第二のＴＡＬリピートベースのＤＮＡ結合ドメインは、５ｂｐまたは６ｂｐの開裂部位によって分離された標的ＤＮＡ配列の各鎖の２つの隣接する標的ＤＮＡ配列を認識し、ＦｏｋＩヌクレアーゼは二量体化し、二本鎖切断を行う。

ＩＶ．Ａ．３．ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）
いくつかの態様では、本開示に有用な遺伝子編集ツールは、ヌクレアーゼ剤、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）システムを含む。ジンクフィンガーベースのシステムは、２つのタンパク質ドメイン、すなわち、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」、または「ＺＦＰ」は、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１つ以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質またはより大きなタンパク質内のドメインである。該ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３）に結合することにより、酵素ドメインの活性を配列の近傍に向かわせ、ひいては該標的配列の傍の内因性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいかなるの所望の配列にも結合するように操作され得る。本明細書に開示するように、いくつかの態様では、該ジンクフィンガードメインは、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）タンパク質をコードするＤＮＡ配列に結合する。したがって、開裂または組み換えが所望される標的ＤＮＡ配列を含む標的遺伝子座を同定した後、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインが、該標的遺伝子座内の１つ以上の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作され得る。細胞におけるジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質の発現により、該標的遺伝子座に改変がもたらされる。

いくつかの態様では、ジンクフィンガー結合ドメインは、１つ以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒｅｔａｌ．，（１９８５）ＥＭＢＯＪ．４：１６０９－１６１４、Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３）ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡｍｅｒｉｃａｎＦｅｂｒｕａｒｙ：５６－６５、米国特許第６，４５３，２４２号。通常、単一のジンクフィンガードメインは、約３０アミノ酸長である。個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（すなわち、トリプレット）配列（または隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１ヌクレオチドが重複し得る４ヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインが配列に結合するように操作される当該配列（例えば、標的配列）の長さが、操作されるジンクフィンガー結合ドメインのジンクフィンガーの数を決定する。例えば、フィンガーモチーフが、重複するサブ部位には結合しないＺＦＰの場合には、６ヌクレオチドの標的配列には、２つのフィンガー結合ドメインが結合し、９ヌクレオチドの標的配列には、３つのフィンガー結合ドメインが結合する等である。標的部位における、個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわち、サブ部位）は、マルチフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間のリンカー）の長さ及び性質に応じて、連続している必要はなく、１つまたは数個のヌクレオチドによって隔てられてもよい。いくつかの態様では、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、３～６個の個々のジンクフィンガリピートを含み、各々約９～約１８塩基対を認識することができる。

ジンクフィンガー結合ドメインは、最適な配列に結合するように操作され得る。例えば、Ｂｅｅｒｌｉｅｔａｌ．，（２００２）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１、Ｐａｂｏｅｔａｌ．，（２００１）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０、Ｉｓａｌａｎｅｔａｌ．，（２００１）ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０、Ｓｅｇａｌｅｔａｌ．，（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７、Ｃｈｏｏｅｔａｌ．，（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照されたい。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して新規な結合特異性を有し得る。操作方法としては、合理的設計及び様々なタイプの選択が挙げられるがこれらに限定されない。

ジンクフィンガードメインによる結合のための標的ＤＮＡ配列の選択は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って達成され得る。当業者には、ヌクレオチド配列の単純な目視検査もまた、標的ＤＮＡ配列の選択に使用され得ることが明らかであろう。したがって、標的ＤＮＡ配列選択のための任意の手段を、本明細書に記載の方法に使用することができる。標的部位は、一般に、少なくとも約９ヌクレオチド長を有し、したがって、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインと結合する。しかしながら、例えば、４フィンガーの結合ドメインと１２ヌクレオチドの標的部位との結合、５フィンガーの結合ドメインと１５ヌクレオチドの標的部位との結合、または６フィンガーの結合ドメインと１８ヌクレオチドの標的部位との結合も可能である。明らかなように、より長い標的部位に対するより大きな結合ドメイン（例えば、７、８、９フィンガー及びそれより大きい）の結合も可能である。

該ジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、任意のエンドまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。酵素ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとしては、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。例えば、２００２－２００３Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．及びＢｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．（１９９７）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照されたい。ＤＮＡを開裂するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ、膵臓ＤＮａｓｅＩ、ミクロコッカスヌクレアーゼ、酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ、Ｌｉｎｎｅｔａｌ．（ｅｄｓ．）Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうちの１つ以上を開裂ドメインの起源として使用することができる。

本明細書に記載のＺＦＰの酵素ドメインとしての使用に適した制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）の例は、多くの種に存在し、ＤＮＡに対して配列特異的に結合すること（認識部位において）、及び該結合部位またはその近傍でＤＮＡを開裂することが可能である。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除かれた部位においてＤＮＡを切断し、分離可能な結合及び開裂ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上の認識部位から９個目のヌクレオチドにおいて及び他方の鎖上の認識部位から１３個目のヌクレオチドにおいてＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、第５，４３６，１５０号及び第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉｅｔａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：４２７５－４２７９、Ｌｉｅｔａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：２７６４－２７６８、Ｋｉｍｅｔａｌ．（１９９４ａ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：８８３－８８７、Ｋｉｍｅｔａｌ．（１９９４ｂ）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照されたい。したがって、いくつかの態様では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの酵素ドメイン及び１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。

当該結合ドメインから開裂ドメインが分離可能な例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性である。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅｅｔａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９５：１０，５７０－１０，５７５。したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合を使用した標的化二本鎖ＤＮＡ開裂の場合、各々がＦｏｋＩ酵素ドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性のある開裂ドメインを再構成することができる。代替的に、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含む単一のポリペプチド分子も使用され得る。ＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは、米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。

ＩＶ．Ａ．３．メガヌクレアーゼ
いくつかの態様では、細胞におけるＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）発現を調節するために使用される遺伝子編集ツールは、メガヌクレアーゼシステム等のヌクレアーゼ剤を含む。メガヌクレアーゼは、保存配列モチーフに基づいて４つのファミリーに分類されており、これらのファミリーは、「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」、「ＧＩＹ－ＹＩＧ」、「Ｈ－Ｎ－Ｈ」、及び「Ｈｉｓ－Ｃｙｓボックス」ファミリーである。これらのモチーフは、金属イオンの配位及びホスホジエステル結合の加水分解に関与する。

ＨＥアーゼは、その長い認識部位、及びそのＤＮＡ基質におけるいくつかの配列多型に対する耐性で知られている。メガヌクレアーゼのドメイン、構造及び機能は既知であり、例えば、ＧｕｈａｎａｎｄＭｕｎｉｙａｐｐａ（２００３）ＣｒｉｔＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍＭｏｌＢｉｏｌ３８：１９９－２４８、Ｌｕｃａｓｅｔａｌ．，（２００１）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ２９：９６０－９、ＪｕｒｉｃａａｎｄＳｔｏｄｄａｒｄ，（１９９９）ＣｅｌｌＭｏｌＬｉｆｅＳｃｉ５５：１３０４－２６、Ｓｔｏｄｄａｒｄ，（２００６）ＱＲｅｖＢｉｏｐｈｙｓ３８：４９－９５、及びＭｏｕｒｅｅｔａｌ．，（２００２）ＮａｔＳｔｒｕｃｔＢｉｏｌ９：７６４を参照されたい。

いくつかの例では、天然に存在するバリアント、及び／または操作された誘導体のメガヌクレアーゼが使用される。動態、補因子相互作用、発現、最適条件、及び／または認識部位特異性の修飾方法、ならびに活性のスクリーニングについては既知であり、例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＥｐｉｎａｔｅｔａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３１：２９５２－６２、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒｅｔａｌ．，（２００２）ＭｏｌＣｅｌｌ１０：８９５－９０５、Ｇｉｍｂｌｅｅｔａｌ．，（２００３）ＭｏｌＢｉｏｌ３３４：９９３－１００８、Ｓｅｌｉｇｍａｎｅｔａｌ．，（２００２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３０：３８７０－９、Ｓｕｓｓｍａｎｅｔａｌ．，（２００４）ＪＭｏｌＢｉｏｌ３４２：３１－４１、Ｒｏｓｅｎｅｔａｌ．，（２００６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３４：４７９１－８００、Ｃｈａｍｅｓｅｔａｌ．，（２００５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３３：ｅ１７８、Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，（２００６）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３４：ｅ１４９、Ｇｒｕｅｎｅｔａｌ．，（２００２）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３０：ｅ２９、ＣｈｅｎａｎｄＺｈａｏ，（２００５）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３３：ｅ１５４、ＷＯ２００５１０５９８９、ＷＯ２００３０７８６１９、ＷＯ２００６０９７８５４、ＷＯ２００６０９７８５３、ＷＯ２００６０９７７８４、及びＷＯ２００４０３１３４６を参照されたい。

Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ－ＳｃｅＩＶ、Ｉ－ＳｃｅＶ、Ｉ－ＳｅｃＶＩ、Ｉ－ＳｃｅＶＩＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、Ｉ－ＣｅｕＡＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＩＩＰ、Ｉ－ＣｒｅｐｓｂＩＶＰ、Ｉ－ＴｌｉＩ、Ｉ－ＰｐｏＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、Ｆ－ＳｃｅＩ、Ｆ－ＳｃｅＩＩ、Ｆ－ＳｕｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩ、Ｆ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＡｍａＩ、Ｉ－ＡｎｉＩ、Ｉ－ＣｈｕＩ、Ｉ－ＣｍｏｅＩ、Ｉ－ＣｐａＩ、Ｉ－ＣｐａＩＩ、Ｉ－ＣｓｍＩ、Ｉ－ＣｖｕＩ、Ｉ－ＣｖｕＡＩＰ、Ｉ－ＤｄｉＩ、Ｉ－ＤｄｉＩＩ、Ｉ－ＤｉｒＩ、Ｉ－ＤｍｏＩ、Ｉ－ＨｍｕＩ、Ｉ－ＨｍｕＩＩ、Ｉ－ＨｓＮＩＰ、Ｉ－ＬｌａＩ、Ｉ－ＭｓｏＩ、Ｉ－ＮａａＩ、Ｉ－ＮａｎＩ、Ｉ－ＮｃＩＩＰ、Ｉ－ＮｇｒＩＰ、Ｉ－ＮｉｔＩ、Ｉ－ＮｊａＩ、Ｉ－Ｎｓｐ２３６ＩＰ、Ｉ－ＰａｋＩ、Ｉ－ＰｂｏＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＩＰ、Ｉ－ＰｃｕＡＩ、Ｉ－ＰｃｕＶＩ、Ｉ－ＰｇｒＩＰ、Ｉ－ＰｏｂＩＰ、Ｉ－ＰｏｒＩＩＰ、Ｉ－ＰｂｐＩＰ、Ｉ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、Ｉ－ＳｃａＩ、Ｉ－ＳｅｘＩＰ、Ｉ－ＳｎｅＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩ、Ｉ－ＳｐｏｍＣＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＰ、Ｉ－ＳｐｏｍＩＩＰ、Ｉ－ＳｑｕＩＰ、Ｉ－Ｓｓｐ６８０３Ｉ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＪＰ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴ３Ｐ、Ｉ－ＳｔｈＰｈｉＳＴｅ３ｂＰ、Ｉ－ＴｄｅＩＰ、Ｉ－ＴｅｖＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩ、Ｉ－ＴｅｖＩＩＩ、Ｉ－ＵａｒＡＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡＩＰ、Ｉ－ＵａｒＨＧＰＡ１３Ｐ、Ｉ－ＶｉｎＩＰ、Ｉ－ＺｂｉＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＩ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＰ、ＰＩ－ＭｔｕＨＩＩＰ、ＰＩ－ＰｆｕＩ、ＰＩ－ＰｆｕＩＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩ、ＰＩ－ＰｋｏＩＩ、ＰＩ－Ｒｍａ４３８１２ＩＰ、ＰＩ－ＳｐＢｅｔａＩＰ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩ、ＰＩ－ＴｆｕＩＩ、ＰＩ－ＴｈｙＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩ、ＰＩ－ＴｌｉＩＩ、またはそれらの任意の活性バリアントもしくは断片が挙げられるがこれらに限定されない任意のメガヌクレアーゼが本明細書で使用され得る。

いくつかの態様では、該メガヌクレアーゼは、１２～４０塩基対の二本鎖ＤＮＡ配列を認識する。いくつかの態様では、該メガヌクレアーゼは、当該ゲノムに含まれる１つの完全に一致した標的配列を認識する。いくつかの態様では、該メガヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼである。いくつかの態様では、該ホーミングヌクレアーゼは、ホーミングヌクレアーゼの「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーである。いくつかの態様では、該ホーミングヌクレアーゼの「ＬＡＧＬＩＤＡＤＧ」ファミリーは、Ｉ－ＳｃｅＩ、Ｉ－ＣｒｅＩ、Ｉ－Ｄｍｏｌ、またはそれらの組み合わせから選択される。

ＩＶ．Ａ．４．制限エンドヌクレアーゼ
いくつかの態様では、本開示で有用な遺伝子編集ツールには、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、及びＩＶ型のエンドヌクレアーゼを含む、制限エンドヌクレアーゼ等のヌクレアーゼ剤が含まれる。Ｉ型及びＩＩＩ型の制限エンドヌクレアーゼは、特定の認識部位を認識するが、通常、ヌクレアーゼ結合部位からの様々な位置で開裂し、これは、開裂部位（認識部位）から数百塩基対離れている場合がある。ＩＩ型システムでは、該制限酵素活性は、メチラーゼ活性とは無関係であり、通常、開裂は、結合部位内またはその近傍の特定の部位で生じる。ほとんどのＩＩ型酵素は回文配列を切断するが、ＩＩａ型酵素は、非回文認識部位を認識し、該認識部位の外側を開裂し、ＩＩｂ型酵素は、該認識部位の外側の両方の部位で二回配列を切断し、ＩＩｓ型酵素は、非対称の認識部位を認識し、一方の側で該認識部位から約１～２０ヌクレオチドの規定の距離で開裂する。ＩＶ型制限酵素は、メチル化ＤＮＡを標的とする。制限酵素は、例えば、ＲＥＢＡＳＥデータベース（ウェブページは、ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ、Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３１：４１８－２０）、Ｒｏｂｅｒｔｓｅｔａｌ．，（２００３）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ３１：１８０５－１２、及びＢｅｌｆｏｒｔｅｔａｌ．，（２００２）ｉｎＭｏｂｉｌｅＤＮＡＩＩ，ｐｐ．７６１－７８３，Ｅｄｓ．Ｃｒａｉｇｉｅｅｔａｌ．，（ＡＳＭＰｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）において、さらに記載及び分類されている。

本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、遺伝子編集ツール（例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡｉ、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、当技術分野で既知の任意の手段によって細胞に導入され得る。いくつかの態様では、特定の遺伝子編集ツールをコードするポリペプチドが、該細胞に直接導入され得る。代替的に、該遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドが、該細胞に導入され得る。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドが該細胞に導入される場合、該遺伝子編集ツールは、該細胞内で一過性に、条件付きで、または構成的に発現され得る。したがって、該遺伝子編集ツールをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれる場合があり、条件的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または組織特異的プロモーターに作動可能に連結され得る。代替的に、該遺伝子編集ツールは、該遺伝子編集ツールをコードする、またはこれを含むｍＲＮＡとして該細胞に導入される。

ヌクレアーゼ剤の活性バリアント及び断片（すなわち、操作されたヌクレアーゼ剤）もまた提供する。かかる活性バリアントは、天然のヌクレアーゼ剤に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を含むことができ、該活性バリアントは、所望の認識部位で切断する能力を保持し、ひいてはニックまたは二本鎖切断誘導活性を保持している。例えば、本明細書に記載のヌクレアーゼ剤のいずれかは、天然のエンドヌクレアーゼ配列から修飾され、天然のヌクレアーゼ剤によって認識されない認識部位にて、ニックまたは二本鎖切断を認識及び誘導するように設計され得る。したがって、いくつかの態様では、該操作されたヌクレアーゼは、対応する天然のヌクレアーゼ剤の認識部位とは異なる認識部位で、ニックまたは二本鎖切断を誘導する特異性を有する。ニックまたは二本鎖切断誘導活性のアッセイは既知であり、一般に、該認識部位を含むＤＮＡ基質に対する該エンドヌクレアーゼの全活性及び特異性を測定する。

該ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドの導入を介して該細胞に該ヌクレアーゼ剤が提供される場合、かかるヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、目的の細胞における使用頻度が、該ヌクレアーゼ剤をコードする天然に存在するポリヌクレオチドと比較して高いコドンを置換するように修飾され得る。例えば、該ヌクレアーゼ剤をコードするポリヌクレオチドは、所与の目的の細胞における使用頻度がより高いコドンを置換するように修飾され得る。

ＩＶ．Ａ．５．干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）
いくつかの態様では、細胞におけるＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）の発現を低下させるために使用され得る遺伝子編集ツールは、ＲＮＡ干渉分子（「ＲＮＡｉ」）を含む。本明細書で使用される、ＲＮＡｉは、内因性遺伝子サイレンシング経路による標的ｍＲＮＡの分解によって内因性標的遺伝子産物の発現の減少を媒介するＲＮＡポリヌクレオチド（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））である。ＲＮＡｉ剤の非限定的な例としては、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、またはそれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの態様では、本開示に有用な遺伝子編集ツールは、１つ以上のｍｉＲＮＡを含む。「ｍｉＲＮＡ」とは、約２１～２５ヌクレオチド長の天然に存在する小さな非コードＲＮＡ分子を指す。いくつかの態様では、本開示に有用なｍｉＲＮＡは、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）のｍＲＮＡ分子に少なくとも部分的に相補的である。ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制、ｍＲＮＡの開裂、及び／または脱アデニル化によって、内因性標的遺伝子産物（すなわち、ＮＲ４Ａタンパク質）の発現を下方制御する（例えば、減少させる）ことができる。

いくつかの態様では、本開示で使用され得る遺伝子編集ツールは、１つ以上のｓｈＲＮＡを含む。「ｓｈＲＮＡ」（または「低分子ヘアピンＲＮＡ」分子）とは、二本鎖領域及び一端にループ領域を含んでヘアピンループを形成するＲＮＡ配列を指し、これを使用して、遺伝子発現を低減及び／またはサイレンシングすることができる。該二本鎖領域は通常、ステムの各側で約１９ヌクレオチド～約２９ヌクレオチド長であり、該ループ領域は通常、約３～約１０ヌクレオチド長である（３’末端または５’末端の一本鎖オーバーハンギングヌクレオチドを任意に含む）。ｓｈＲＮＡは、プラスミドまたは複製しない組み換えウイルスベクターにクローニングされて細胞内に導入されることにより、該ｓｈＲＮＡをコードする配列をゲノムに組み込むことができる。したがって、ｓｈＲＮＡは、内因性標的遺伝子（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）の翻訳及び発現の安定かつ一貫した抑制をもたらし得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示する遺伝子編集ツールは、１つ以上のｓｉＲＮＡを含む。「ｓｉＲＮＡ」とは、通常約２１～２３ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を指す。該ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる多タンパク質複合体と会合し、その間に「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に開裂される。次いで、活性化されたＲＩＳＣに含まれるアンチセンス「ガイド」鎖が、配列相同性のために該ＲＩＳＣを対応するｍＲＮＡに誘導し、同じヌクレアーゼが、該標的ｍＲＮＡ（例えば、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）のｍＲＮＡ）を切断して、特異的な遺伝子サイレンシングがもたらされる。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡは、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４ヌクレオチド長であり、２塩基のオーバーハングをその３’末端に有する。ｓｉＲＮＡは、個々の細胞及び／または培養系に導入され、標的ｍＲＮＡ配列（すなわち、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）のｍＲＮＡ）の分解をもたらすことができる。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれるＦｉｒｅｅｔａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３９１：１９，１９９８ならびに米国特許第７，７３２，４１７号、第８，２０２，８４６号、及び第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。

ＩＶ．Ａ．６．アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）
いくつかの態様では、細胞におけるＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低減するために使用され得る遺伝子編集ツールは、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。本明細書で使用される、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「ＡＳＯ」とは、標的核酸と、特に標的核酸上の連続配列とハイブリダイズすることにより、標的遺伝子（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）の発現を調節することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがって、ｓｉＲＮＡでもｓｈＲＮＡでもない。

いくつかの態様では、本開示で有用なＡＳＯは、一本鎖である。本開示の一本鎖オリゴヌクレオチドは、自己内または自己間の相補性の度合いがオリゴヌクレオチドの全長にわたっておよそ５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２つの分子間の二重鎖）を形成することができると理解される。いくつかの態様では、本開示で有用なＡＳＯは、２’糖修飾ヌクレオシド等の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを１つ以上含み得る。ＡＳＯに行うことのできるさらなる修飾（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子発現を阻害または低減するために使用され得るもの等）は、例えば、米国公開第２０１９／０２７５１４８Ａ１号に提示されている。

いくつかの態様では、ＡＳＯがヌクレアーゼ、例えば、ＲＮアーゼＨ１等のＲＮアーゼＨを動員することが可能な場合、該ＡＳＯは、ＮＲ４Ａ転写産物（例えば、ｍＲＮＡ）のヌクレアーゼによる分解を介して、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３）タンパク質の発現を低下させることができる。ＲＮアーゼＨは、ＲＮＡ／ＤＮＡ二重鎖のＲＮＡ鎖を加水分解する遍在性酵素である。したがって、いくつかの態様では、該標的配列（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３のｍＲＮＡ）に結合すると、ＡＳＯは、該ＮＲ４Ａ３のｍＲＮＡの分解を誘導することができ、それにより、ＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させる。

本明細書に開示するように、遺伝子編集ツールの上記の例は限定を意図するものではなく、当技術分野で利用可能な任意の遺伝子編集ツールを使用して、ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低減もしくは阻害することができる。

ＩＶ．Ａ．７．リプレッサー
いくつかの態様では、本開示で使用され得る（例えば、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるために）遺伝子編集ツールは、リプレッサーを含む。本明細書で使用される、「リプレッサー」という用語は、転写を活性化することなく以下のＮＲ４Ａ応答要素：（ｉ）ＮＧＦＩ－Ｂ応答要素（ＮＢＲＥ）、（ｉｉ）Ｎｕｒ－応答要素（ＮｕｒＲＥ）、または（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の両方に結合することが可能な任意の薬剤を指す。したがって、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥに結合することによって、本明細書に記載のリプレッサーは、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲを発現する免疫細胞）における１つ以上のＮＲ４Ａファミリーメンバーのレベルを抑制する（または低減もしくは阻害する）ことが可能である。いくつかの態様では、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへの該リプレッサーの結合は、細胞が該リプレッサーと接触した場合、該細胞におけるＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質のレベルを低下させる。いくつかの態様では、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへの該リプレッサーの結合は、細胞が該リプレッサーと接触した場合、該細胞におけるＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質のレベルを低下させる。いくつかの態様では、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへの該リプレッサーの結合は、細胞が該リプレッサーと接触した場合、該細胞におけるＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルを低下させる。いくつかの態様では、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへの該リプレッサーの結合は、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方のレベルを低下させる。いくつかの態様では、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへの該リプレッサーの結合は、（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルを低下させる。いくつかの態様では、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへの該リプレッサーの結合は、（ｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルを低下させる。いくつかの態様では、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥへの該リプレッサーの結合は、以下の各々のレベルを低下させる：（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびに（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質。ＮＲ４Ａファミリーのすべてのメンバー（すなわち、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３）のレベルを低下させることが可能なリプレッサーは、「ＮＲ４Ａスーパーリプレッサー」としても知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０２３７０４０Ａ１を参照されたい。

少なくとも上の開示から明らかなように、本開示に有用であるリプレッサーは、ＮＢＲＥ及び／またはＮｕｒＲＥ応答要素に結合することが可能なＤＮＡ結合ドメインを含む。いくつかの態様では、かかるリプレッサーは、さらなるドメインを含む。かかるさらなるドメインの非限定的な例としては、ＮＲ４Ａリガンド結合ドメイン、ＦＬＡＧドメイン、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢ）ドメイン、ＮＣＯＲドメイン、Ｔ２Ａドメイン、自己切断ドメイン、核局在化シグナル、二量体化ドメイン（例えば、ｄｉＺＩＰ二量体化ドメイン）、転写リプレッサードメイン、クロマチン圧縮ドメイン、エピトープタグ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。かかるさらなるドメインに関する追加の開示は、例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０２３７０４０Ａ１に見出すことができる。いくつかの態様では、該さらなるドメインは、転写活性化ドメインを含まない。

本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルを低下させる際に、細胞は、本明細書に記載のＮＲ４Ａリプレッサータンパク質との接触を受ける場合がある。いくつかの態様では、細胞は、ＮＲ４Ａリプレッサーをコードする核酸配列との接触を受ける。

ＩＶ．Ｂ．疲弊／機能不全を低減する方法
本開示は、細胞の疲弊または機能不全を低減、改善、または阻害する方法を提供し、該方法は、該細胞を、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変することを含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ１及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ２及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、ＮＲ４Ａ３及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質の両方を含む。いくつかの態様では、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質は、該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質を含む。

腫瘍細胞が宿主免疫応答を回避し得る様々な様式のうちの１つは、腫瘍特異的免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を引き起こすことによる。本明細書で使用される、「疲弊」、またはより具体的には、「Ｔ細胞の疲弊」という用語は、Ｔ細胞機能の喪失を指し、これは、感染症または疾患（例えば、がん）の結果として生じ得る。Ｔ細胞の疲弊は、本開示では「Ｔ細胞の機能不全」または「Ｔ細胞アネルギー」と同義で使用され得る。いくつかの態様では、Ｔ細胞の疲弊は、様々な免疫チェックポイント阻害性分子（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３）の発現の増加、アポトーシス、及びエフェクター機能（例えば、サイトカイン産生及び細胞傷害性分子、例えば、パーフォリン及びグランザイムの発現）の低下に関連する。したがって、「Ｔ細胞の疲弊を低減する」、「Ｔ細胞の疲弊を改善する」、「Ｔ細胞の疲弊を阻害する」等の表現は、以下のうちの１つ以上を特徴とするＴ細胞の機能の回復した状態を指す：（ｉ）１つ以上の免疫チェックポイント阻害性分子（例えば、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、及びＬＡＧ－３）の発現の低下、（ｉｉ）記憶形成の増加及び／または記憶マーカー（例えば、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、及び／またはＣＣＲ７）の維持、（ｉｉｉ）アポトーシスの防止、（ｉｖ）サイトカイン産生の増加（例えば、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、及び／またはＴＮＦ－α）、（ｖ）殺傷能力の向上、（ｖｉ）表面抗原が少ない腫瘍標的の認識の増加、（ｖｉｉ）抗原に応答した増殖の向上、ならびに（ｖｉｉｉ）それらの任意の組み合わせ。

いくつかの態様では、例えば、本明細書に開示する方法において、細胞を改変することは、疲弊に対する抵抗性または耐性を有するように免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を改変することを含む。したがって、いくつかの態様では、本開示は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の疲弊を、該細胞においてＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、もしくはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルを低下させることによって低減する方法に関する。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を低減することは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞においてすでに生じた機能不全を逆転すること（すなわち、疲弊したＴ細胞の疲弊を低下させること）を含む。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を低減することは、新たに活性化した免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が疲弊することを防止することを含む。本開示から明らかなように、いくつかの態様では、該免疫細胞は、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加するように、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方のために、前もって、同時に、または後に修飾される。

いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を低減することは、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊を逆転及び防止することの両方を含む。

免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、当技術分野で既知の様々な方法によって特定され得る。いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、アポトーシスに対する免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の耐性を評価することによって測定され得る。したがって、いくつかの態様では、本開示の細胞組成物（すなわち、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下している）は、アポトーシスに対して耐性の増加を示す。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物におけるアポトーシスに対する耐性は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。いくつかの態様では、アポトーシスに対する耐性の増加は、本明細書に記載の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の長期持続性または生存を促進し得る。したがって、いくつかの態様では、本開示の細胞組成物（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下している）は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）と比較して、持続性または生存の延長を示す。

いくつかの態様では、本明細書に提供する細胞組成物の持続性または生存は、該参照免疫細胞のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、免疫チェックポイント分子に対する該免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の耐性を評価することによって測定され得る。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物における免疫チェックポイント分子に対する耐性は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のものと比較して、少なくとも１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、免疫チェックポイント分子に対する耐性の増加は、該免疫細胞、例えば、Ｔ細胞における１つ以上の免疫チェックポイント分子の発現の減少に起因する。したがって、いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞）と比較して、１つ以上の免疫チェックポイント分子の発現レベルが低下している。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物における免疫チェックポイント分子の発現レベルは、該参照細胞と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する。免疫チェックポイント分子の例は、当技術分野で既知であり、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＢＴＬＡ、ＳＩＧＬＥＣ７、ＣＤ２００Ｒ、ＴＩＧＩＴ、ＶＩＳＴＡ、及びそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない。

いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が、刺激、例えば、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）刺激後にサイトカインを産生する能力を評価することによって測定され得る。したがって、いくつかの態様では、本開示の細胞組成物（すなわち、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現し、かつＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下している）は、参照細胞のもの（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞におけるサイトカイン産生）と比較して、サイトカイン産生の増加を示す。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物におけるサイトカイン産生は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。サイトカインの非限定的な例としては、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７、ＩＬ－２２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

いくつかの態様では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の疲弊状態は、該免疫細胞、例えば、Ｔ細胞が繰り返しの腫瘍負荷後に腫瘍細胞を殺傷する能力を評価することによって測定され得る。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、２回の腫瘍負荷後に、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞）と比較して、腫瘍細胞の殺傷の増加を示す。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、３回の腫瘍負荷後に、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞）と比較して、腫瘍細胞の殺傷の増加を示す。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、４回の腫瘍負荷後に、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞）と比較して、腫瘍細胞の殺傷の増加を示す。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物は、５回の腫瘍負荷後に、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞）と比較して、腫瘍細胞の殺傷の増加を示す。いくつかの態様では、腫瘍細胞を殺傷することは、腫瘍細胞の派生を防止することを含む。

いくつかの態様では、各腫瘍負荷の後、本開示の細胞組成物の腫瘍細胞殺傷能力は、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて増加する。

ＩＶ．Ｃ．腫瘍微小環境において抗腫瘍機能を維持する方法
腫瘍形成（すなわち、腫瘍の産生または形成）は、３つの段階、すなわち、開始、進行、及び転移からなる複雑で動的なプロセスである。これらの段階の各々は、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）によって緊密に調節される。Ｗａｎｇ，Ｍ．，ｅｔａｌ．，ＪＣａｎｃｅｒ８（５）：７６１－７７３（２０１７）を参照されたい。本明細書で使用される、「腫瘍微小環境」または「ＴＭＥ」という用語は、周囲の血管、免疫細胞、線維芽細胞、シグナル伝達分子、及び細胞外マトリックスを含めた、腫瘍の周りの環境を指す。以下にさらに記載されるように、腫瘍は、細胞外シグナルを放出すること、腫瘍血管新生を促進すること、及び末梢免疫寛容を誘導することによって微小環境に影響を及ぼし得るのに対し、微小環境における免疫細胞は、腫瘍細胞の成長及び進化に影響を及ぼし得る。

腫瘍細胞は通常、極めて速いスピードで成長するため、腫瘍微小環境への血液供給が不十分になる。Ｇｏｕｉｒａｎｄ，Ｖ．，ｅｔａｌ．，ＦｒｏｎｔＯｎｃｏｌ８：１１７（２０１８）を参照されたい。これにより、腫瘍微小環境は低酸素状態になり、反応性酸素種（ＲＯＳ）の生成が増加する。低酸素及びＲＯＳは、免疫細胞機能に悪影響を及ぼす可能性があり、それにより、対象における抗腫瘍免疫応答が阻害される。

いくつかの態様では、例えば、本明細書に開示する方法にて細胞を改変することにより、低酸素環境、例えば、腫瘍微小環境に見られる環境において、免疫細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）の抗腫瘍機能が向上する。本明細書で使用される、「抗腫瘍機能」という用語は、免疫細胞（例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞）が、腫瘍細胞の根絶及び／または制御をもたらす免疫応答を組み込む能力を指す。抗腫瘍機能の非限定的な例は、サイトカイン産生、増殖、疲弊の減少、長期生存、細胞傷害性（例えば、腫瘍細胞殺傷能力）、またはそれらの組み合わせを含む。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物（例えば、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）（例えば、抗ＲＯＲ１結合タンパク質）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、及び（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルが低下するように改変された免疫細胞を含む）の抗腫瘍機能は、低酸素環境において、参照細胞（例えば、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する細胞）と比較して向上する（すなわち、増加する）。

腫瘍細胞の急速な増殖はまた、腫瘍微小環境内の様々な栄養素（例えば、グルコース）の枯渇をもたらし得る。Ｇｏｕｉｒａｎｄ（上掲）を参照されたい。本明細書で論述されるように、栄養素、例えば、グルコースは、正常な免疫細胞機能及び発達のために必須である。いくつかの態様では、本開示の細胞組成物（例えば、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、及び（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルが低下するように改変された免疫細胞を含む）の抗腫瘍機能は、低栄養素環境において、参照細胞（例えば、該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変されていない対応する細胞、例えば、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞）と比較して向上する（すなわち、増加する）。

本明細書に記載の通り、腫瘍細胞が宿主免疫応答を抑制するメカニズムの１つは、腫瘍微小環境に様々な免疫抑制性代謝産物及び／またはサイトカインを放出することによる。腫瘍微小環境内のかかる代謝産物及び／またはサイトカインの蓄積は、免疫細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の正常な機能を阻害し得る。かかる免疫抑制性代謝産物及び／またはサイトカインの非限定的な例としては、インドールアミン－２－３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、アルギナーゼ、誘導性酸化窒素シンテターゼ（ｉＮＯＳ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）－Ａ、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、ＶＥＧＦ、反応性酸素種（ＲＯＳ）、アデノシン、アルギナーゼ、プロスタグランジンＥ２、及びそれらの組み合わせが挙げられる。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物（例えば、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、及び（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルが低下するように改変された免疫細胞を含む）の抗腫瘍機能は、免疫抑制性代謝産物及び／またはサイトカインの存在下で、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）のものと比較して、少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．６倍、少なくとも約１．７倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約１．９倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍またはそれを超えて向上する（すなわち、増加する）。

腫瘍微小環境が抗腫瘍免疫応答を阻害し得る別のメカニズムは、免疫抑制性細胞、例えば、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）及び制御性Ｔ（Ｔ_ｒｅｇ）細胞を介する。

本明細書で使用される、「骨髄由来サプレッサー細胞」または「ＭＤＳＣ」という用語は、骨髄起源、未成熟状態、及びＴ細胞応答を強力に抑制する能力によって定義される、不均一な免疫細胞集団を指す。ＭＤＳＣは、骨髄において生成され、腫瘍を担持する宿主において、末梢リンパ器官及び腫瘍に移行して腫瘍微小環境の形成に寄与する。いくつかの態様では、該ＭＤＳＣは、単球と形態学的及び表現型的に同様である単球性のＭＤＳＣ（Ｍ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様では、該ＭＤＳＣは、好中球と形態学的及び表現型的に同様である多形核ＭＤＳＣ（ＰＭＮ－ＭＤＳＣ）である。いくつかの態様では、ＭＤＳＣは、Ｍ－ＭＤＳＣとＰＭＮ－ＭＤＳＣの両方を含む。腫瘍微小環境内に存在するＭＤＳＣは通常、不十分な食作用活性、継続的な反応性酸素種（ＲＯＳ）、酸化窒素（ＮＯ）、及び大抵は抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ－１０及びＴＧＦ－β）の産生を示す。

本明細書で使用される、「制御性Ｔ細胞」または「Ｔ_ｒｅｇ細胞」という用語は、他のＴ細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）の増殖及び／または機能を抑制する能力を有するＴ細胞の特定の集団を指す。いくつかの態様では、該制御性Ｔ細胞は、ＣＤ４^＋制御性Ｔ細胞である。いくつかの態様では、該制御性Ｔ細胞は、Ｆｏｘｐ３^＋である。制御性Ｔ細胞は、様々な接触依存性及び非依存性メカニズムを介してそれらの免疫抑制活性を発揮し得る。かかるメカニズムの非限定的な例としては、（ｉ）抑制性サイトカイン（例えば、ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、及びＩＬ－３５）の産生、（ｉｉ）免疫チェックポイント及び抑制性受容体（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－Ｌ１、アルギナーゼ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＩＣＯＳ、ＴＩＧＩＴ、ＩＤＯ）の発現、（ｉｉｉ）直接的細胞傷害性（パーフォリン／グランザイム媒介またはＦａｓＬ媒介）、（ｉｖ）エフェクターＴ細胞活性の代謝破壊（例えば、ＩＬ－２消費）、（ｖ）Ｔ細胞の疲弊を促進し得る寛容原性樹状細胞の誘導、（ｖｉ）アデノシン産生、ならびに（ｖｉｉ）それらの任意の組み合わせが挙げられる。

いくつかの態様では、本開示の細胞組成物（例えば、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、及び（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバーのレベルが低下するように改変された免疫細胞を含む）の抗腫瘍機能は、抑制性細胞の存在下、参照細胞（例えば、該ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに該ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞）と比較して向上する（すなわち、増加する）。いくつかの態様では、該抑制性細胞は、ＭＤＳＣである。いくつかの態様では、該抑制性細胞は、Ｔ_ｒｅｇ細胞である。いくつかの態様では、該抑制性細胞は、ＭＤＳＣ及びＴ_ｒｅｇ細胞の両方を含む。

上記開示は、Ｔ細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球）との関連で概ね提供されているが、当業者には、上記開示がまた、他のタイプの免疫細胞にも適用され得ることが認識されよう。したがって、いくつかの態様では、本明細書に開示する方法は、該活性化を向上させ、該疲弊／機能不全を低減し、または腫瘍の治療に有用な任意の免疫細胞の抗腫瘍機能を維持するために使用され得る。かかる免疫細胞の非限定的な例としては、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、またはそれらの組み合わせが挙げられる。いくつかの態様では、リンパ球は、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラル（ＮＫ）細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、リンパ球は、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ４^＋Ｔ細胞またはＣＤ８^＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、リンパ球は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。いくつかの態様では、ＴＩＬは、ＣＤ８^＋ＴＩＬである。いくつかの態様では、ＴＩＬは、ＣＤ４^＋ＴＩＬである。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本開示の免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、例えば、ＣＡＲＴ細胞またはＣＡＲＮＫ細胞を含む。

Ｖ．核酸及びベクター
本開示はまた、細胞内でのＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツールを含む１つ以上の核酸分子を提供する。同様に本明細書に提供するのは、ガイドＲＮＡ（例えば、合成ガイドＲＮＡ）を含む核酸分子である。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールを含む核酸分子及び該ガイドＲＮＡを含む核酸分子は、別々の核酸分子として（同時にまたは連続して）細胞に導入され得る。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツール及び該ガイドＲＮＡは、単一の核酸分子の一部であり得る。例えば、いくつかの態様では、遺伝子編集ツールを含む核酸分子はさらに、ガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に開示する合成ガイドＲＮＡ）を含む。

いくつかの態様では、遺伝子編集ツールを含む核酸分子はさらに、ガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に開示する合成ガイドＲＮＡ）及びＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸を含む。

本明細書に記載の通り、本開示のいくつかの態様は、ＮＲ４Ａ遺伝子（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、ＮＲ４Ａ３、またはそれらの組み合わせ）内の標的配列に特異的に結合することが可能なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（例えば、単離されたポリヌクレオチド）を対象とする。いかなる理論にも拘束されるものではないが、いくつかの態様では、ＮＲ４Ａ遺伝子内の標的配列に結合することによって、本開示のポリヌクレオチドは、細胞（例えば、免疫細胞）におけるＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはコードされるタンパク質のレベルを低下させることが可能である。

本明細書に記載の通り、本明細書に記載のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ遺伝子内の核酸配列に特異的に結合し得るヌクレオチド配列を含む。例えば、いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ１遺伝子内の核酸配列に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ２遺伝子内の核酸配列に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。本開示のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ３遺伝子内の核酸配列に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ１遺伝子内の核酸配列及びＮＲ４Ａ２遺伝子内の核酸配列に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ１遺伝子内の核酸配列及びＮＲ４Ａ３遺伝子内の核酸配列に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ２遺伝子内の核酸配列及びＮＲ４Ａ３遺伝子内の核酸配列に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、本開示のポリヌクレオチドは、ＮＲ４Ａ１遺伝子内の核酸配列、ＮＲ４Ａ２遺伝子内の核酸配列、及びＮＲ４Ａ３遺伝子内の核酸配列に特異的に結合するヌクレオチド配列を含む。かかるヌクレオチド配列は、本明細書では、「結合配列」または「ガイド配列」または「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）とも呼ばれる。したがって、本明細書で使用される、「ガイドＲＮＡ」（ｇＲＮＡ）という用語は、ＮＲ４Ａファミリーの１つ以上のメンバー内の核酸配列に特異的に結合することができ、それにより、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルを低下させる限り、特に限定されない。

いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、約５～約１００ヌクレオチド長であり得る。いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのｇＲＮＡは、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、または約１００ヌクレオチド長である。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、約１０～約３０ヌクレオチド長（例えば、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、または約３０ヌクレオチド）である。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、約２０ヌクレオチド長である。本開示に有用であるｇＲＮＡに関するさらなる開示は、本出願において他の箇所で提供されている（例えば、セクションＩＶ．Ａ．１．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム参照）。

いくつかの態様では、本明細書に記載のポリヌクレオチドのｇＲＮＡは、ＮＲ４Ａ遺伝子内の核酸配列（本明細書では「標的配列」とも呼ばれる）と相補的または実質的に相補的となるように設計される。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、複数の配列（例えば、ＮＲ４Ａ遺伝子内の複数の標的配列、またはＮＲ４Ａ遺伝子内の標的配列及びＮＲ４Ａファミリーの他のメンバー内の標的配列）に結合するために揺らぎ塩基または縮重塩基を組み込み得る。場合によっては、該ｇＲＮＡは、安定性を増加させるために変更され得る。例えば、非天然ヌクレオチドが、分解に対するＲＮＡ耐性を増加させるために組み込まれ得る。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、該ｇＲＮＡにおける二次構造形成を回避または低減するように変更または設計され得る。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、Ｇ－Ｃ含量を最適化するように設計され得る。いくつかの態様では、Ｇ－Ｃ含量は、約４０％～約６０％（例えば、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％）である。いくつかの態様では、該ｇＲＮＡは、修飾ヌクレオチド、例えば、限定されないが、メチル化またはリン酸化されたヌクレオチドを含み得る。本明細書に記載のポリヌクレオチドの１つ以上の特性を修飾し、それによりそれを改善するさらなる方法は、当技術分野で既知である。本明細書に記載のポリヌクレオチドに付加され得るかかる修飾の非限定的な例としては、５’キャップ、３’ポリアデニル化テール、リボスイッチ配列、安定性制御配列、ヘアピン、細胞内局在化配列、検出もしくは標識配列、１つ以上のタンパク質のための結合部位、非天然ヌクレオチド、またはそれらの組み合わせが挙げられる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国公開第２０２１０１２３０４６Ａ１号を参照されたい。かかる修飾に関するさらなる開示は、本開示の他の箇所で提供される。

本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールを含む核酸分子及び該ガイドＲＮＡを含む核酸分子は、別々の核酸分子として（同時にまたは連続して）細胞に導入され得る。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツール及び該ガイドＲＮＡは、単一の核酸分子の一部であり得る。例えば、いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールを含む核酸分子はさらに、ガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に開示する合成ガイドＲＮＡ）を含む。いくつかの態様では、該遺伝子編集ツールを含む核酸分子はさらに、ガイドＲＮＡ（例えば、本明細書に開示する合成ガイドＲＮＡ）及びＣａｓヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする核酸を含む。

本開示はまた、リガンド結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体またはＴ細胞受容体）をコードする１つ以上の核酸を提供する。本開示はまた、本開示の改変された細胞内でｃ－Ｊｕｎを過剰発現させるために使用され得る、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする１つ以上の核酸を提供する。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、１つ以上の該核酸は、単一のベクターの一部であり得る。いくつかの態様では、該核酸の各々は、別々のベクターにある。該核酸は、全細胞に、細胞溶解物に、または部分的に精製された形態もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。

核酸は、他の細胞成分または他の夾雑物、例えば、他の細胞核酸（例えば、他の染色体ＤＮＡ、例えば、天然に単離されたＤＮＡに連結されている染色体ＤＮＡ）またはタンパク質から、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌバンディング、カラムクロマトグラフィー、制限酵素、アガロースゲル電気泳動、及び当技術分野で周知の他のものを含む標準的な技術によって精製された場合、「単離されている」または「実質的に純粋とされている」。Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔａｌ．，ｅｄ．（１９８７）ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇａｎｄＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮｅｗＹｏｒｋを参照されたい。本明細書に記載の核酸は、例えば、ＤＮＡでもＲＮＡでもよく、イントロン配列を含む場合も含まない場合もある。いくつかの態様では、該核酸は、ｃＤＮＡ分子である。本明細書に記載の核酸は、当技術分野で既知の標準的な分子生物学技術を使用して得ることができる。

いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）細胞におけるＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツールを含む単離された核酸分子、（ｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体もしくはＴ細胞受容体）をコードする単離された核酸分子、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードする単離された核酸分子、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのうちの１つ以上を含むベクターを提供し、該核酸の各々は、本開示の改変された細胞で発現され得る。

本明細書に記載の通り、かかるベクターは、細胞（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ発現細胞）を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ（ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及び／またはＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変するために使用することができ、かかる改変された細胞は、疾患または障害、例えば、がんを治療するために使用され得る。いくつかの態様では、該ベクターは、調節要素に作動可能に連結された、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ１ＴＣＲ）及び（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、該ベクターは、調節要素に作動可能に連結された、（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ、例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲまたは抗ＲＯＲ１ＴＣＲ）、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質、及び（ｉｉｉ）切断型ＥＧＦＲをコードするポリヌクレオチドを含む。

本開示に適したベクターとしては、発現ベクター、ウイルスベクター、及びプラスミドベクターが挙げられる。いくつかの態様では、該ベクターは、ウイルスベクターである。

本明細書で使用される、「ベクター」及び「発現ベクター」という用語は、適切な宿主細胞に導入された際に、挿入されるコード配列の転写及び翻訳のために必要な要素、またはＲＮＡウイルスベクターの場合には、複製及び翻訳に必要な要素を含む、任意の核酸構築物をさす。発現ベクターには、プラスミド、ファージミド、ウイルス、及びそれらの派生物が含まれ得る。

本明細書で使用される、ウイルスベクターとしては、レトロウイルス、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＳＶ４０型ウイルス、ポリオーマウイルス、エプスタイン・バーウイルス、パピローマウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、ならびにＲＮＡウイルス、例えば、レトロウイルスに由来する核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。当技術分野で周知の他のベクターが容易に使用され得る。ある特定のウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子で置き換えられた非細胞変性真核ウイルスに基づく。非細胞変性ウイルスにはレトロウイルスが含まれ、そのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写を含み、その後、宿主細胞のＤＮＡにプロウイルスが組み込まれる。

いくつかの態様では、ベクターはアデノ随伴ウイルスに由来する。いくつかの態様では、ベクターは、レンチウイルスに由来する。レンチウイルスベクターの例は、ＷＯ９９３１２５１、ＷＯ９７１２６２２、ＷＯ９８１７８１５、ＷＯ９８１７８１６、及びＷＯ９８１８９３４に開示されており、これらは各々、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

他のベクターとしては、プラスミドベクターが挙げられる。プラスミドベクターは、当技術分野で広く記載されており、当業者には周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，１９８９を参照されたい。過去数年間において、プラスミドベクターは、宿主ゲノム内で複製して宿主ゲノム内に組み込まれることがないため、インビボで遺伝子を細胞に送達するのに特に有利であることが分かっている。しかしながら、宿主細胞に適合するプロモーターを有するこれらのプラスミドは、該プラスミド内で作動可能にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。商業的供給者から入手可能ないくつかの一般的に使用されているプラスミドとしては、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、様々なｐｃＤＮＡプラスミド、ｐＲＣ／ＣＭＶ、様々なｐＣＭＶプラスミド、ｐＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔが挙げられる。特定のプラスミドのさらなる例としては、ｐｃＤＮＡ３．１、カタログ番号Ｖ７９０２０、ｐｃＤＮＡ３．１／ｈｙｇｒｏ、カタログ番号Ｖ８７０２０、ｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ－Ｈｉｓ、カタログ番号Ｖ８６３２０、及びｐＢｕｄＣＥ４．１、カタログ番号Ｖ５３２２０（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ．）製）が挙げられる。他のプラスミドも当業者には周知である。さらに、プラスミドは、特定のＤＮＡ断片を除去及び／または付加するように、標準的な分子生物学技術を使用してカスタム設計することができる。

本開示は、本明細書に開示する核酸を修飾するために当業者に利用可能な任意の核酸修飾、例えば、ｇＲＮＡ及びｇＲＮＡをコードする核酸、Ｃａｓ９をコードする核酸、少なくとも１つのｇＲＮＡもしくは少なくとも１つのｇＲＮＡ及びＣａｓ９をコードする核酸を含むベクター、ＣＡＲもしくはＴＣＲをコードする核酸、本明細書に開示する任意のゲノム編集ツールをコードする核酸、ＲＮＡｉをコードする核酸、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を企図する。

本明細書で使用される、「非修飾」または「天然」ヌクレオシドまたは核酸塩基としては、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。いくつかの態様では、合成の修飾されたｇＲＮＡは、少なくとも１つのヌクレオシド（「塩基」）修飾または置換を含む。

本出願に開示する核酸（例えば、ｇＲＮＡ及びかかるｇＲＮＡをコードする核酸、ならびにＣａｓ９をコードする核酸）は、１つ以上の修飾を含み得る。いくつかの態様では、本明細書に開示するヌクレオチド配列は、少なくとも１つのヌクレオチドアナログを含む。いくつかの態様では、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）または化学合成を使用することによって導入される少なくとも１つのヌクレオチドアナログは、２’－Ｏ－メトキシエチル－ＲＮＡ（２’－ＭＯＥ－ＲＮＡ）モノマー、２’－フルオロ－ＤＮＡモノマー、２’－Ｏ－アルキル－ＲＮＡモノマー、２’－アミノ－ＤＮＡモノマー、ロック核酸（ＬＮＡ）モノマー、ｃＥｔモノマー、ｃＭＯＥモノマー、５’－Ｍｅ－ＬＮＡモノマー、２’－（３－ヒドロキシ）プロピル－ＲＮＡモノマー、アラビノ核酸（ＡＮＡ）モノマー、２’－フルオロ－ＡＮＡモノマー、アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）モノマー、インターカレート核酸（ＩＮＡ）モノマー、及び当該ヌクレオチドアナログの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。いくつかの態様では、最適化された核酸分子、例えば、ｇＲＮＡは、少なくとも１つの骨格修飾、例えば、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。

いくつかの態様では、本出願に開示する核酸（例えば、ｇＲＮＡ及びかかるｇＲＮＡをコードする核酸、ならびにＣａｓ９をコードする核酸）は、末端位置で、例えば、５’及び／または３’末端に対して位置１、２、３でＭ（２’－Ｏ－メチル）、ＭＳ（２’－Ｏ－メチル３’ホスホロチオエート）、またはＭＳＰ（２’－Ｏ－メチ３’チオＰＡＣＥ、ホスホノアセテート）修飾、またはそれらの組み合わせを導入することによって化学的に修飾され得る。例えば、１つの態様では、本開示のｇＲＮＡは、３つの５’ヌクレオチドで３つのＭ修飾及び３つの３’ヌクレオチドで３つのＭ修飾を含み得る。いくつかの態様では、本開示のｇＲＮＡは、３つの５’ヌクレオチドで３つのＭＳ修飾及び３つの３’ヌクレオチドで３つのＭＳ修飾を含み得る。いくつかの態様では、本開示のｇＲＮＡは、３つの５’ヌクレオチドで３つのＭＳＰ修飾及び３つの３’ヌクレオチドで３つのＭＳＰ修飾を含み得る。

いくつかの態様では、本明細書に開示するヌクレオチド配列、例えば、ｇＲＮＡにおけるウリジン、アデノシン、グアノシン、シチジンヌクレオシドの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％、または１００％は、ヌクレオシドで置き換えられている。

いくつかの態様では、本出願に開示する核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、ＩＶＴまたは化学合成によって産生されるヌクレオチド配列を含み、
（ｉ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのウリジンは、置き換えられており、及び／または、
（ｉｉ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのアデノシンは、置き換えられており、及び／または、
（ｉｉｉ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのグアノシンは、置き換えられており、及び／または、
（ｉｖ）野生型ヌクレオチド配列における少なくとも１つのシチジンは、置き換えられている。

本開示の修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、分子の長さ全体に沿って均一に修飾されている必要はない。異なるヌクレオチド修飾及び／または骨格構造が、核酸における様々な位置で存在し得る。当業者には、該ヌクレオチドアナログまたは他の修飾（複数可）が、核酸の機能が実質的に低下しないように、該核酸の任意の位置（複数可）に位置し得ることが理解されよう。修飾はまた、５’または３’末端修飾であり得る。該核酸は、最小で１％及び最大で１００％修飾されたヌクレオチド、または間の任意のパーセンテージ、例えば、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％修飾されたヌクレオチドを含み得る。

いくつかの態様では、本明細書に提供する核酸は、ＲＮＡ（例えば、ｇＲＮＡ）及び／またはポリペプチド（例えば、Ｃａｓ９）をコードする合成修飾ＤＮＡ分子であり、該合成修飾ＤＮＡ分子は、１つ以上の修飾を含む。

本明細書に記載の合成修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）には、エンド及びエキソヌクレアーゼによる急速な分解を防止するための修飾が含まれる。修飾としては、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、脱リン酸化、コンジュゲーション、反転結合等）、３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合等）、（ｂ）塩基修飾、例えば、修飾塩基、安定化塩基、不安定化塩基、または広範なパートナーのレパートリーと塩基対合する塩基、またはコンジュゲーション塩基での置き換え、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位または４’位におけるもの）または糖の置き換え、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置き換えを含む、ヌクレオシド間結合修飾が挙げられるがこれらに限定されない。

本明細書に記載の方法で有用な合成修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）組成物の具体例としては、修飾または非天然ヌクレオシド間結合を含む修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）が挙げられるがこれらに限定されない。修飾されたヌクレオシド間結合を有する合成修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）には、とりわけ、ヌクレオシド間結合においてリン原子を有しないものが含まれる。いくつかの態様では、該合成修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）は、そのヌクレオシド間結合（複数可）においてリン原子を有する。

修飾ヌクレオシド間結合の非限定的な例としては、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミデート（３’－アミノホスホルアミデート及びアミノアルキルホスホルアミデート、チオノホスホルアミデートを含む）、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらのＴ－５’結合アナログ、ならびに逆転した極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対が、３’－５’から５’－３’またはＴ－５’から５’－Ｔに連結されている）が挙げられる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。

リン原子を含まない修飾ヌクレオシド間結合は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式ヌクレオシド間結合によって形成されるヌクレオシド間結合を有する。これらとしては、モルホリノ結合（ヌクレオシドの糖部分から部分的に形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合されたＮ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが挙げられる。

本明細書に記載の合成修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）のいくつかの態様には、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を有する核酸及びヘテロ原子ヌクレオシド間結合を有するオリゴヌクレオシド、ならびに特に米国特許第５，４８９，６７７号の－ＣＨ_２－ＮＨ－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｏ－ＣＨ_２－［メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩとして知られている］、－ＣＨ_２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_３）－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－及び－Ｎ（ＣＨ_３）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－［天然ホスホジエステルヌクレオシド間結合は、－Ｏ－Ｐ－Ｏ－ＣＨ_２－として表される］、及び米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格（これらの両方は、参照により全体として本明細書に組み込まれる）が含まれる。いくつかの態様では、本明細書で取り上げられる核酸配列は、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。

本明細書に記載の合成修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）はまた、１つ以上の置換された糖部分を含み得る。本明細書で取り上げられる核酸は、２’位に、Ｈ（デオキシリボース）、ＯＨ（リボース）、Ｆ、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－、もしくはＮ－アルケニル、Ｏ－、Ｓ－もしくはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルのうちの１つを含むことができ、該アルキル、アルケニル及びアルキニルは、置換または非置換Ｃ_１～Ｃ_１０アルキルまたはＣ_２～Ｃ_１０アルケニル及びアルキニルであり得る。例示的な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ_２）ｎＯ］ｍＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＮＨ_２、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３、Ｏ（ＣＨ_２）ｎＯＮＨ_２、及びＯ（ＣＨ_２）ｎＯＮ［（ＣＨ_２）ｎＣＨ_３）］_２が挙げられ、式中、ｎ及びｍは、１～約１０である。いくつかの態様では、合成修飾ＲＮＡは、２’位に、Ｃ_１～Ｃ_１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリール、アラルキル、Ｏ－アルカリールもしくはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ_３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ_３、ＯＣＦ_３、ＳＯＣＨ_３、ＳＯ_２ＣＨ_３、ＯＮＯ_２、ＮＯ_２、Ｎ_３、ＮＨ_２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリール、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、レポーター基、インターカレーター、ある特定の核酸（例えば、ｇＲＮＡ）の薬物動態特性を改善するための基、または合成修飾核酸（例えば、ｇＲＮＡ）の薬力学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。いくつかの態様では、該修飾としては、２’メトキシエトキシ（２’－Ｏ－ＣＨ_２ＣＨ_２ＯＣＨ_３、別名２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または－ＭＯＥ）（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基が挙げられる。別の例示的な修飾は、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、Ｏ（ＣＨ_２）_２ＯＮ（ＣＨ_３）_２基、別名２’－ＤＭＡＯＥ、及び２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野では２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち、２’－Ｏ－ＣＨ_２－Ｏ－ＣＨ_２－Ｎ（ＣＨ_２）_２である。

他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ_３）、２’－アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＮＨ_２）及び２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、該核酸配列の他の位置、特に３’末端ヌクレオチドまたは２’－５’結合オリゴヌクレオチド中の糖の３’位、及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行われ得る。合成修飾ｇＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部位等の糖模倣体を有し得る。

非限定的な例として、本明細書に記載の合成修飾ｇＲＮＡは、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、２’－アミノ－修飾ヌクレオシド、２’－アルキル－修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ホスホルアミデートまたは非天然塩基を含むヌクレオシド、またはそれらの任意の組み合わせを含めた少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含み得る。

いくつかの態様では、該少なくとも１つの修飾ヌクレオシドは、５－メチルシチジン（５ｍＣ）、Ｎ６－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、３，２’－Ｏ－ジメチルウリジン（ｍ４Ｕ）、２－チオウリジン（ｓ２Ｕ）、２’フルオロウリジン、プソイドウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン（Ｕｍ）、２’デオキシウリジン（２’ｄＵ）、４－チオウリジン（ｓ４Ｕ）、５－メチルウリジン（ｍ５Ｕ）、２’－Ｏ－メチルアデノシン（ｍ６Ａ）、Ｎ６，２’－Ｏ－ジメチルアデノシン（ｍ６Ａｍ）、Ｎ６，Ｎ６，２’－Ｏ－トリメチルアデノシン（ｍ６２Ａｍ）、２’－Ｏ－メチルシチジン（Ｃｍ）、７－メチルグアノシン（ｍ７Ｇ）、２’－Ｏ－メチルグアノシン（Ｇｍ）、Ｎ２，７－ジメチルグアノシン（ｍ２，７Ｇ）、Ｎ２，Ｎ２，７－トリメチルグアノシン（ｍ２，２，７Ｇ）、及びイノシン（Ｉ）からなる群から選択される。

代替的に、合成修飾ｇＲＮＡは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０個またはそれを超え、最大で全ヌクレオチド長の修飾ヌクレオシドを含み得る。最小で、少なくとも１つの修飾ヌクレオシドを含む合成修飾ｇＲＮＡ分子は、本明細書に記載の修飾を有する単一のヌクレオシドを含む。所与の合成修飾ｇＲＮＡにおけるすべての位置が、均一に修飾されている必要はなく、実際、複数の前述した修飾が、単一の合成修飾ｇＲＮＡに組み込まれる場合もあれば、合成修飾ｇＲＮＡ内の単一のヌクレオシドで組み込まれる場合もある。しかしながら、不可欠ではないが、分子に含まれる所与のヌクレオシドの存在ごとに修飾される（例えば、各シトシンは、修飾シトシン、例えば、５ｍＣである）ことが好ましい。しかしながら、同じヌクレオシドの異なる存在は、所与の合成修飾ｇＲＮＡ分子において異なる様式で修飾され得ることも企図される（例えば、一部のシトシンは５ｍＣとして修飾されており、他のものは２’－Ｏ－メチルシチジンまたは他のシトシンアナログとして修飾される）。該修飾は、合成修飾ｇＲＮＡに含まれる複数の修飾ヌクレオシドごとに同じである必要はない。さらに、本明細書に記載の態様のうちのいくつかの態様では、合成修飾ｇＲＮＡは、少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオシドを含む。本明細書に記載のいくつかの態様では、該少なくとも２つの異なる修飾ヌクレオシドは、５－メチルシチジン及びプソイドウリジンである。合成修飾ｇＲＮＡはまた、修飾ヌクレオシド及び未修飾ヌクレオシドの両方の混合物も含み得る。

本明細書に開示するｇＲＮＡ及び他の核酸、例えば、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集のために使用される核酸、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセットは、オリゴヌクレオチド合成装置、宿主細胞発現、インビトロ翻訳（ＩＶＴ）、または当技術分野で既知の任意の他の方法を使用して化学合成を使用して産生され得る。全体的または部分的に天然に存在するヌクレオシドを置き換える天然に存在するヌクレオシド、天然に存在しないヌクレオシド、またはそれらの組み合わせ。ポリヌクレオチドまたは核酸合成反応は、ポリメラーゼを利用する酵素法によって行われ得る。ポリメラーゼは、ポリヌクレオチドまたは核酸鎖におけるヌクレオチド間のホスホジエステル結合の創出を触媒する。

遺伝子操作における様々なツールは、鋳型として作用する標的核酸の酵素的増幅に基づく。目的の個々の遺伝子または特定の領域の配列の研究及び他の研究ニーズのため、ポリヌクレオチドまたは核酸の小さなサンプルから標的核酸の複数のコピーを生成することが必要とされる。かかる方法は、本明細書に開示するｇＲＮＡ及び他の核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ＡＳＯ、Ｃａｓをコードするポリヌクレオチド、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット）の製造において適用され得る。

ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、標的遺伝子の急速増幅、ならびにゲノムマッピング及びシーケンシングにおいて広い用途を有する。ＤＮＡを合成するための重要な成分は、鋳型としての標的ＤＮＡ分子、標的ＤＮＡ鎖の末端に相補的なプライマー、構成要素としてのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、及びＤＮＡポリメラーゼを含む。ＰＣＲは、変性、アニーリング及び伸長ステップを介して進行するため、新たに産生されるＤＮＡ分子は、複製の次のサークルのための鋳型として作用することができ、標的ＤＮＡの指数関数的増幅が達成される。ＰＣＲは、変性及びアニーリングのための加熱及び冷却のサイクルを必要とする。基礎的ＰＣＲのバリエーションとしては、非対称ＰＣＲ（Ｉｎｎｉｓｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ８５，９４３６－９４４０（１９８８））、逆ＰＣＲ（Ｏｃｈｍａｎｅｔａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１２０（３），６２１－６２３，（１９８８））、及び逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）（Ｆｒｅｅｍａｎｅｔａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２６（１），１１２－２２，１２４－５（１９９９））が挙げられる。これらの内容は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。ＲＴ－ＰＣＲでは、一本鎖ＲＮＡが所望の標的であり、最初に逆転写酵素によって二本鎖ＤＮＡに変換される。前述の方法のいずれも、本開示のポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓをコードするポリヌクレオチド、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット）の１つ以上の領域の製造において利用され得る。

リガーゼによってポリヌクレオチドまたは核酸を構築することも広く使用されている。ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を介してポリヌクレオチド鎖の５’末端及び３’末端の分子間ライゲーションを促進する。したがって、ＲＮＡリガーゼは、例えば、ｇＲＮＡのスペーサー配列及びｇＲＮＡのフレーム配列の３’から５’への分子間ライゲーションによってｇＲＮＡを生成するために使用され得る。

目的の単離されたポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド配列を合成するために標準的な方法が適用され得る。例えば、特定の単離されたポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を含む単一のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴマーが合成され得る。いくつかの態様では、所望のポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドが合成され、次いでライゲーションされ得る。いくつかの態様では、個々のオリゴヌクレオチドは、通常、相補的アセンブリのための５’または３’オーバーハングを含む。

本明細書に開示するポリヌクレオチド（例えば、ｇＲＮＡ、Ｃａｓをコードするポリヌクレオチド、またはＣＡＲもしくはＴＣＲをコードするポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドのセット）は、当技術分野で既知の化学合成法及び可能性のある核酸塩基置換を使用して化学的に合成され得る。例えば、国際公開第ＷＯ２０１４０９３９２４号、第ＷＯ２０１３０５２５２３号、第ＷＯ２０１３０３９８５７号、第ＷＯ２０１２１３５８０５号、第ＷＯ２０１３１５１６７１号、米国公開第ＵＳ２０１３０１１５２７２号、または米国特許第ＵＳ８９９９３８０号、第ＵＳ８７１０２００号を参照されたい。これらはすべて、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

ＶＩ．医薬組成物
本開示は、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびにＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように、本明細書に記載の通りに改変された細胞、ならびに医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。本開示は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下するように改変され、さらにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する細胞（例えば、本明細書に記載の細胞等）、ならびに医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下するように改変され、さらにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３タンパク質の内因性発現を有する細胞（例えば、本明細書に記載の細胞等）、ならびに医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下するように改変され、さらにＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３遺伝子ならびにＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３タンパク質の内因性発現を有する細胞（例えば、本明細書に記載の細胞等）、ならびに医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方のレベルが低下するが、内因性レベルの該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルが低下するが、内因性レベルの該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルが低下するが、内因性レベルの該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが低下するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。

本開示は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）を発現するように改変され、さらにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の内因性発現を有する細胞（例えば、本明細書に記載の細胞等）、ならびに医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）を発現するように改変され、さらにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３遺伝子ならびにＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ３タンパク質の内因性発現を有する細胞（例えば、本明細書に記載の細胞等）、ならびに医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質の発現レベルが低下するように、ならびに（ｉｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）（例えば、ＲＯＲ１に特異的に結合する）を発現するように改変され、さらにＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３遺伝子ならびにＮＲ４Ａ２及びＮＲ４Ａ３タンパク質の内因性発現を有する細胞（例えば、本明細書に記載の細胞等）、ならびに医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方のレベルが低下するが、内因性レベルの該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を有するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルが低下するが、内因性レベルの該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を有するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方のレベルが低下するが、内因性レベルの該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を有するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。いくつかの態様では、本明細書に提供する医薬組成物は、（１）（ｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現するように、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、ならびに（ｉｉｉ）該ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、該ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、ならびに該ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質のレベルが低下するように改変された細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を含む。

本明細書に記載の通り、かかる医薬組成物は、がんを予防及び／または治療するために使用され得る。本明細書に記載の通り、いくつかの態様では、本明細書に開示する医薬組成物に存在する改変された細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ発現Ｔ細胞）またはＮＫ細胞（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ発現ＮＫ細胞）である。

許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝剤、例えば、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸、アスコルビン酸及びメチオニンを含めた酸化防止剤、防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド、ヘキサメトニウムクロリド、ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド、フェノール、ブチルアルコールもしくはベンジルアルコール、アルキルパラベン、例えば、メチルパラベンもしくはプロピルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール、及びｍ－クレゾール）、低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド、タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン、親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン、アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン、グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、及び他の炭水化物、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトール、塩形成性対イオン、例えば、ナトリウム、金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）、及び／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。

医薬組成物は、対象に対するあらゆる投与経路用に製剤化され得る。投与経路の具体例としては、筋肉内、皮下、眼内、静脈内、腹腔内、皮内、眼窩内、脳内、頭蓋内、脊髄内、心室内、髄腔内、大槽内、嚢内、または腫瘍内が挙げられる。皮下、筋肉内、または静脈内のいずれかの注射を特徴とする非経口投与もまた、本明細書で企図される。注射剤は、液体の溶液もしくは懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固体形態、またはエマルジョンのいずれかとして、従来の形態で調製され得る。該注射剤、溶液及びエマルジョンはまた、１つ以上の賦形剤を含む。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。さらに、所望により、投与される医薬組成物はまた、微量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定剤、溶解度向上剤、及び他のかかる薬剤、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、及びシクロデキストリン等を含み得る。

非経口調製物で使用される医薬的に許容される担体としては、水性媒体、非水性媒体、抗菌剤、等張剤、緩衝剤、酸化防止剤、局所麻酔剤、懸濁剤及び分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の医薬的に許容される物質が挙げられる。水性媒体の例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロース、及び乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。非水性非経口媒体としては、植物由来の不揮発性油、綿実油、コーン油、ゴマ油及び落花生油が挙げられる。フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチル及びプロピルｐ－ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、ベンザルコニウムクロリド、及びベンゼトニウムクロリドを含む複数用量容器に包装される非経口調製物に、静菌または静真菌濃度の抗菌剤を加えることができる。等張剤としては、塩化ナトリウム及びデキストロースが挙げられる。緩衝剤は、リン酸及びクエン酸を含む。酸化防止剤としては、重硫酸ナトリウムが挙げられる。局所麻酔剤としては、塩酸プロカインが挙げられる。懸濁剤及び分散剤としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びポリビニルピロリドンが挙げられる。乳化剤としては、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が挙げられる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤としては、ＥＤＴＡが挙げられる。医薬担体としてはまた、水混和性媒体用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、及びプロピレングリコール、ならびにｐＨ調整用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸も挙げられる。

非経口投与用の調製物としては、そのまま注射できる無菌溶液、使用直前に溶媒と組み合わされる無菌の乾燥した可溶性製品、例えば、凍結乾燥粉末が挙げられ、皮下錠剤、そのまま注射できる無菌懸濁液、使用直前に媒体と組み合わされる無菌の乾燥した不溶性製品、及び無菌エマルジョンを含む。該溶液は、水性でも非水性でもよい。

静脈内投与される場合、適切な担体としては、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、ならびに増粘剤及び可溶化剤、例えば、グルコース、ポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコール、ならびにこれらの混合物を含む溶液が挙げられる。

本明細書に提供する医薬組成物は、特定の組織、受容体、または治療される対象の身体の他の領域を標的とするようにも配合され得る。かかる標的化方法の多くが当業者に周知である。本明細書では、かかる標的化方法のすべてが本発明の組成物の使用のために企図される。標的化方法の非限定的な例については、例えば、各々が参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第６，３１６，６５２号、第６，２７４，５５２号、第６，２７１，３５９号、第６，２５３，８７２号、第６，１３９，８６５号、第６，１３１，５７０号、第６，１２０，７５１号、第６，０７１，４９５号、第６，０６０，０８２号、第６，０４８，７３６号、第６，０３９，９７５号、第６，００４，５３４号、第５，９８５，３０７号、第５，９７２，３６６号、第５，９００，２５２号、第５，８４０，６７４号、第５，７５９，５４２号、及び第５，７０９，８７４号を参照されたい。

インビボ投与に使用される組成物は、滅菌され得る。これは、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成され得る。

本開示はまた、例えば、免疫細胞の集団における持続的記憶及び／またはエフェクター機能を促進する、本明細書に記載の１つ以上の方法のための手段を含む細胞組成物を提供する。いくつかの態様では、本開示は、免疫細胞の集団における疲弊及び／または機能不全を低減、改善、または阻害するための手段を含む細胞組成物を提供する。いくつかの態様では、該手段は、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を改変することを含む。いくつかの態様では、該手段は、免疫細胞の集団におけるＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現ならびにｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を改変することを含む。

ＶＩＩ．キット
本開示はまた、本開示の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、ならびに（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎ転写因子をコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法のいずれかに従って腫瘍を治療するための使用説明書を含むキットを提供する。いくつかの態様では、該キットは、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を増加させることが可能な転写活性化因子、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法のいずれかに従って腫瘍を治療するための使用説明書を含む。同様に提供するのは、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎ転写因子をコードするヌクレオチド配列、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法に従って細胞組成物を調製するための使用説明書を含むキットである。いくつかの態様では、該キットは、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を増加させることが可能な転写活性化因子、または（ｉｉｉ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法に従って細胞組成物を調製するための使用説明書を含む。

本開示はまた、本開示の方法のいずれかを実施するためのキットを提供する。いくつかの態様では、本開示は、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（例えば、抗ＲＯＲ１ＣＡＲ）もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、抗ＲＯＲ１ＴＣＲ）を含むベクター、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎ転写因子をコードするヌクレオチド配列、または（ｉｖ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法のいずれかに従って腫瘍を治療するための使用説明書を含むキットを提供する。いくつかの態様では、該キットは、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ）を含むベクター、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を増加させることが可能な転写活性化因子、または（ｉｖ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法のいずれかに従って腫瘍を治療するための使用説明書を含む。同様に提供するのは、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎ転写因子をコードするヌクレオチド配列、または（ｉｖ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法に従って細胞組成物を調製するための使用説明書を含むキットである。いくつかの態様では、該キットは、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、（ｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲもしくはＴＣＲ）を含むベクター、（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を増加させることが可能な転写活性化因子、または（ｉｖ）それらの組み合わせ、ならびに任意に本明細書に開示する方法に従って細胞組成物を調製するための使用説明書を含む。

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に開示する組成物、例えば、（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現の低下を示す細胞、例えば、免疫細胞、（ｉｉ）該ＮＲ４Ａ遺伝子を標的とする少なくとも１つのｇＲＮＡ、（ｉｉｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡをコードする核酸（例えば、ベクター）、（ｉｖ）少なくとも１つのｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）、（ｖ）ｇＲＮＡ及びＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）をコードする少なくとも１つの核酸（例えば、ベクター）、（ｖｉ）ｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸（例えば、第一のベクター）及びＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸（例えば、第二のベクター）、（ｖｉｉ）少なくとも１つのｇＲＮＡ及び少なくとも１つのＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９をコードする核酸を含む単一のベクター、（ｖｉｉ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）をコードするベクターまたはベクターのセットを含むキットを提供する。いくつかの態様では、該キットは、ＮＲ４Ａ３を標的とするＣａｓ９ＲＮＰ（例えば、ｓｇＲＮＡＧＣＵＣＧＡＧＵＡＧＣＣＣＵＣＣＡＣＧＡ（配列番号３０）を含むＣａｓ９ＲＮＰ）を含む。いくつかの態様では、該ｓｇＲＮＡは、表Ａ、Ｃ、及びＤに開示するものを含む。いくつかの態様では、該キットはさらに、それらの使用に関する使用説明書を含む。

本開示は、本明細書に開示する改変された細胞（例えば、免疫細胞）を含むがんの治療のためのキットを提供し、該細胞は、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現の低下を示す。本開示は、本明細書に開示する改変された細胞（例えば、免疫細胞）を含むがんの治療のためのキットを提供し、該細胞は、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現の低下を示し。該細胞は、リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲ及び／またはＴＣＲ）を発現する。

いくつかの態様では、該キットは、本明細書に開示する少なくとも１つのｇＲＮＡ、本明細書に開示するｇＲＮＡをコードする少なくとも１つの単離されたポリヌクレオチド、本明細書に開示するｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのベクター、本明細書に開示するｇＲＮＡをコードする少なくとも１つのベクターを含む細胞、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、該キットはさらに、Ｃａｓ９タンパク質、Ｃａｓ９タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、またはＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。

本開示はさらに、少なくとも１つの容器手段を含むキットまたはパッケージを提供し、その中に上記のｇＲＮＡ、Ｃａｓ９、ベクター、細胞、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つが、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるための使用説明書とともに配置されている。

いくつかの態様では、該キットは、少なくとも１つの上流ｇＲＮＡ及び下流ｇＲＮＡを含む。したがって、一部において、該キットは、（ｉ）配列番号３４～４１のいずれか１つのスペーサー配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡ、及び（ｉｉ）配列番号３１～３３のいずれか１つのスペーサー配列を含む少なくとも１つのｇＲＮＡを含む。

特定の態様では、該キットは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓのキメラフレーム、例えば、配列番号４２の配列に作動可能に連結された配列番号３４～４１のＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのスペーサー配列を含むｇＲＮＡを含む。

いくつかの態様では、特定の細菌種のＣａｓ９（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９）のためのｇＲＮＡを含む各キットはさらに、かかるＣａｓ９を含む。

いくつかの態様では、該キットは、がん抗原を標的とするＣＡＲ及び／またはＴＣＲを発現する１つ以上の細胞、培養物、または細胞の集団を含む。

実施例１－ガイドＲＮＡのスクリーニング及び改変されたＴ細胞の生成
ＮＲ４Ａファミリーの遺伝子及び／またはＮＲ４Ａファミリーのタンパク質の発現の低下ならびにｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、疲弊及び機能不全を低下させることに対するそれらの効果に不必要であるか、または相加的であるかどうかを評価するため、ＲＯＲ１－Ｒ１２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞及びＮＹ－ＥＳＯ－１Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）Ｔ細胞モデルを使用した。ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するＲＯＲ１ＣＡＲまたはＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲで形質導入されたヒトＴ細胞における各ＮＲ４Ａファミリーメンバーのタンパク質発現を特異的に低下させたＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を同定した。

ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２のためのＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ガイドＲＮＡが表Ａに示されている。実施例２～５に記載の実験において、ＮＲ４Ａ１ｓｇＲＮＡ５及び６を組み合わせて使用し、ＮＲ４Ａ２ｓｇＲＮＡ１、２、及び３を組み合わせて使用した。

ＮＲ４Ａ３に特異的なシングルｇＲＮＡを設計し、スクリーニングして、３つの独立した実験（ｖ０、ｖ１、及びｖ２）における最大編集効率及び最大タンパク質低減を有するｇＲＮＡを同定した。すべてのｇＲＮＡスクリーニングのため、単離されたドナーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓから購入した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を解凍し、活性化のために１％（ｖ／ｖ）ＴｒａｎｓＡｃｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）と１：１の比で２４時間混合した。活性化したＴ細胞を抗ＲＯＲ１ＣＡＲをコードするバイシストロン性（ｖ０）またはトリシストロン性レンチウイルスベクター（ｖ２）で２４時間後に形質導入し、または形質導入しないままとした（ｖ１）。次いでＴ細胞を、修飾ガイドＲＮＡ（Ｓｙｎｔｈｅｇｏ、ｖ０－表Ｂ、ｖ１－表Ｃ及びｖ２－表Ｄ）ならびにＬｏｎｚａ４ＤＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ装置を利用してヒトＮＲ４Ａ３を標的とするＣａｓ９ＲＮＰでエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされたＴ細胞を拡大のためにＧ－Ｒｅｘ培養プレートに移した後、７日目にＣｒｙｏＳｔｏｒ培地中で凍結保存した。１ドナーを実験ｖ０及びｖ１において使用した一方で、独立した２ドナーを実験ｖ２において使用した。７日目にフローサイトメトリーによってタンパク質低減の効率を評価するために、３×１０５ＮＲ４Ａ３編集または対照（ＲＮＰなしでエレクトロポレーションした）Ｔ細胞を、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて２００μＬのＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中でＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ｖ０及びｖ１）またはＰＭＡ＋イオノマイシン（ｖ２）で３７Ｃにて２時間刺激し、最大ＮＲ４Ａ３発現を誘導した。刺激後、細胞を上記の表面マーカーで染色した。次いで細胞を固定し、ＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により、製造業者の使用説明書に従って透過処理し、細胞内染色を、カスタム蛍光色素コンジュゲートＮＲ４Ａ３抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して実施した。

ｖ０におけるｇＲＮＡのいずれも、対照の非編集細胞と比較してＮＲ４Ａ３タンパク質発現を低減しなかった（表Ｂ）。ＮＧＳによる確認的ゲノム編集効率は実施しなかった。ｖ１において、７つすべてのｇＲＮＡが非編集対照と比較してＮＲ４Ａ３タンパク質発現を低減し、ＮＧＳ編集効率を実施した。２つのガイド（ｇ４及びｇ８）は、最も高いゲノム編集を有していた（総Ｔ細胞分散パーセントによって測定）。高い編集効率にもかかわらず、ゲノムバリアントのインデル解析により、ｇ８が高い頻度の望ましくないインフレーム欠失をもたらしたことが明らかになった（表Ｃ）。ｖ２において、上位１４個のｇＲＮＡを、ＮＲ４Ａ３タンパク質発現が非編集対照と比較して低下し、及び／または両方のドナーについて基準のｇ４と同様／より良好であったＫＯ条件に基づいて選択した（表Ｄ）。選択された条件を、ゲノム編集効率を確認するため、ＮＧＳ分析によってさらに評価した。

以下の実施例においてより詳細に記載されているように、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞は、最も高い機能的利益を示し、対照ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）と比較して、連続的ＲＯＲ１抗原曝露後に有意に長期の細胞傷害性、サイトカイン産生、Ｔ細胞持続性、及び表現型の改善が実証された。ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するＮＲ４Ａ３編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞もまた、最も高い機能的利益を示し、対照ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現しない）と比較して連続的ＮＹ－ＥＳＯ－１抗原曝露後に長期の細胞傷害性及びサイトカイン産生が実証された。

実施例２－ＮＲ４Ａ３発現の低下
ＮＲ４Ａ３ｓｇＲＮＡｇ４（配列番号３０）を使用したＮＲ４Ａ３タンパク質の低下を、フローサイトメトリーによって、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する及びしないＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞及びＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞において検証した。ＣＤ３／ＣＤ２８ＤｙｎａｂｅａｄｓまたはＰＭＡ＋イオノマイシンでの刺激を使用して、最大ＮＲ４Ａ発現を誘導した。フローサイトメトリー分析のため、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する及びしないＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞及びＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞を、ｌｉｖｅｄｅａｄｄｙｅで１０分間室温（ＲＴ）にて染色し、ＴｒｕＳｔａｉｎＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で５分間ＲＴにてブロックし、ＣＣＲ７で３７Ｃにて１５分間染色し、次いで表面マーカー抗体で１０分間ＲＴにて染色した。すべての染色は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ細胞染色緩衝液中で実施した。次いで細胞を固定し、製造業者の使用説明書に従ってＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理した。これらの細胞を、室温にて１０％正常マウス及びウサギ血清で１０分間ブロックした後、ｃＰａｒｐ（連続刺激の０日目のみ）及びｃ－Ｊｕｎで染色した。

３×１０^５個のＮＲ４Ａ編集または対照ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞及びＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞を、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において２００μＬのＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中でＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で３：１のビーズ対細胞比、またはＰＭＡ＋イオノマイシン（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で３７Ｃにて２時間刺激し、最大ＮＲ４Ａ発現を誘導した。刺激後、Ｄｙｎａｂｅａｄｓを除去し、細胞を上記の表面マーカーで染色した。次いで細胞を固定し、製造業者の使用説明書に従ってＦｏｘＰ３転写因子染色緩衝液キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で透過処理した。カスタム蛍光色素コンジュゲートＮＲ４Ａ抗体（Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓ）を染色のために使用した。

ＮＲ４Ａ３タンパク質発現は、非編集対照と比較してＮＲ４Ａ３編集ＲＯＲ１ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ＣＡＲＴ細胞ならびにＮＹ－ＥＳＯ－１ＣＤ４^＋及びＣＤ８^＋ＴＣＲＴ細胞において、ｃ－Ｊｕｎ発現とは無関係に有意に低下した（図１及び図１２）。同様に、ＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２遺伝子に特異的なＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ｇＲＮＡを使用して高効率のＮＲ４Ａ１及びＮＲ４Ａ２タンパク質の低下が達成された（データは示さず）。ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞の形質導入効率（％ＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋として同定される）は、対照では、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するＣＡＲＴ細胞よりも低かったが、ＲＯＲ１－Ｒ１２ＣＡＲの平均幾何学的蛍光（ｇＭＦＩ）は、これら２つのＲＯＲ１ＣＡＲ構築物間で有意差はなかった。ＲＯＲ１ＣＡＲのパーセンテージ及びｇＭＦＩは、調べた４ドナー間で同様であり、ＮＲ４Ａ編集によって影響を受けなかった（図２）。

ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞の形質導入効率（％ＴＣＲｖβ１３．１＋及びｇＭＦＩとして同定される）は、対照において、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するＴＣＲＴ細胞より有意に高く、ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲのパーセンテージ及びｇＭＦＩは、調べた３ドナー間で同様であり、ＮＲ４Ａ編集によって影響を受けなかった（図１３）。

実施例３－連続刺激における細胞傷害性の持続及びサイトカイン産生
ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する及びしない単一ＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞（ＣＡＲＴ細胞がＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３のいずれかで編集されたもの）の機能を、ＣＡＲＴ細胞が連続的に抗原に曝露されるインビトロ疲弊アッセイにて評価した。アッセイを設定する前に、Ｈ１９７５－ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ（ＮＬＲ）腫瘍細胞株を、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で２～３回継代培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ酵素（Ｇｉｂｃｏ）でトリプシン処理した。

この連続刺激アッセイでは、ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する及びしないＮＲ４Ａ編集ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞をＨ１９７５ＮＳＣＬＣＲＯＲ１発現腫瘍細胞株を用いて５回の連続刺激に供した。特に、凍結保存されたＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞を解凍し、フラット２４ウェルアッセイプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にて三連でＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、１：１Ｅ：Ｔ比のｃＰａｒｐ^－ＣＤ３^＋ＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋ＣＡＲＴ細胞とＨ１９７５－ＮＬＲ腫瘍細胞を直ちに培養した。３日間の共培養後に、ウェルを再懸濁し、培養物の２５％をウェル当たり同じ初期数の新たな腫瘍細胞とともに新たなプレートに移した。これを合計で５回の刺激について繰り返した。細胞傷害性をＩｎｃｕｃｙｔｅにおいてアッセイの過程で連続的に測定し、各々の新たな刺激を設定してから２４時間後に上清を回収してサイトカインレベルを測定した。三連の共培養ウェルからの残りの細胞を、上記の表現型フロー分析のために合わせた。ｃ－ＪｕｎＣＡＲＴ細胞は、非ｃ－Ｊｕｎ対照ＣＡＲ－Ｔ細胞をしのいだ。予想外にも、ＮＲ４Ａ３ＫＯｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞は、Ｈ１９７５腫瘍細胞に対して依然として最も細胞傷害性が高く、異なる４ドナーにおいてすべての他の条件と比較して、５回の刺激後に標的細胞を溶解する能力を維持することが実証された（図３）。

持続した細胞傷害性に加えて、ＮＲ４Ａ３ＫＯｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞は、Ｈ１９７５ＮＳＣＬＣＲＯＲ１発現腫瘍細胞で刺激した場合、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または非編集対照及びｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞と比較して、より高いレベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αも産生した（図４及び表９～１１）。サイトカインレベルを、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＶ－Ｐｌｅｘ炎症誘発パネル１ヒトキットまたはカスタムヒトＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αサイトカインキットを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。

サイトカイン産生の差は、より後の刺激回後に最も顕著であり、ＮＲ４Ａ３ノックアウト及びｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、長期抗原刺激後に機能的活性の持続及び／またはＣＡＲＴ細胞生存の改善に寄与することを示唆している。実際、ＮＲ４Ａ編集ｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞において、ＲＯＲ１ＣＡＲの頻度の維持の向上が観察された（図５Ａ）。結果的に、これは、２～３回の刺激で総ＮＲ４Ａ３ＫＯｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞数の持続性の増加と相関した（図５Ｂ）。ＮＲ４Ａ３ＫＯｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞は、２回目の刺激後の疲弊の減少と一致する細胞表面の表現型の変化を示した（図６）。ＮＲ４Ａ３ＫＯにより、非編集ｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞と比較して、全４ドナーにおいてＴＩＭ３及びＴＩＧＩＴの発現が有意に低下し、４ドナーのうちの３ドナーにおいてＰＤ－１が低下した。興味深いことに、ＣＤ１２７の発現は、ベースラインで同様であった（０日目、データは示さず）にもかかわらず、２回目の刺激後、ＣＤ１２７の発現は、非編集ｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞と比較して、ＮＲ４Ａ３ＫＯｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞で有意に高かった。ＣＤ１２７は、様々なウイルス感染症における抗原特異的メモリーＣＤ８^＋Ｔ細胞のマーカーであることが分かっており（Ｈｕｓｔｅｒｅｔａｌ．，ＰＮＡＳ，１０１，５６１０－５６１５（２００４）、Ｂｏｅｔｔｌｅｒｅｔａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０，３５３２－３５４０（２００６）、Ｘｕｅｔａｌ．，Ｌａｂ．Ｍｅｄ．４８，５７－６４（２０１７））、ＮＲ４Ａ３の非存在下でのｃ－Ｊｕｎの過剰発現が、ｃ－ＪｕｎまたはＫＯ単独と比較して、相乗的により多くのメモリー様Ｔ細胞状態を維持し得ることが示唆される。

Ｔ細胞疲弊のインビトロ連続刺激モデルは、ＮＲ４Ａ３編集ｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞が、独立した４ドナーにおいてＲＯＲ１発現Ｈ１９７５腫瘍細胞に対して、最大に向上し、持続した細胞傷害性及びサイトカイン産生を示すことを明らかにした。より後の刺激回での機能的活性の増加は、少なくとも部分的に、アッセイ全体を通してＮＲ４Ａ３編集ｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞の持続性の増加によるものである可能性が高い。そのため、ＲＯＲ１－Ｒ１２ＣＡＲＴ細胞との関連で、ｃ－Ｊｕｎの過剰発現と併せてＮＲ４Ａ３を編集することは、ＲＯＲ１発現固形腫瘍に対する細胞免疫療法を改善し得る。

統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍを使用して行った。対応のないｔ検定及び対応のあるｔ検定を統計分析のために使用した。ｎｓ－有意でない、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

実施例４－連続刺激時のＮＲ４ＡトリプルＫＯ（ＴＫＯ）ｃ－ＪｕｎＣＡＲＴ細胞の細胞傷害性の持続及びサイトカイン産生
ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するｃ－Ｊｕｎ＋ＮＲ４ＡトリプルＫＯ（ＴＫＯ）ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞（ＣＡＲＴ細胞がＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、及びＮＲ４Ａ３で編集されたもの）の機能を、ＣＡＲＴ細胞が連続的に抗原に曝露されるインビトロ疲弊アッセイにて評価した。アッセイを設定する前に、Ｈ１９７５－ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ（ＮＬＲ）及びＡ５４９－ＮＬＲ腫瘍細胞株を、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で２～３回継代培養した。細胞をＴｒｙｐＬＥＥｘｐｒｅｓｓ酵素（Ｇｉｂｃｏ）でトリプシン処理した。

この連続刺激アッセイでは、ＮＲ４ＡＴＫＯまたは対照（非編集）ｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞をＨ１９７５またはＡ５４９ＮＳＣＬＣＲＯＲ１発現腫瘍細胞株を用いて５回の連続刺激に供した。特に、凍結保存されたＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞を解凍し、フラット２４ウェルアッセイプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にて三連でＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、１：１Ｅ：Ｔ比のｃＰａｒｐ^－ＣＤ３^＋ＥＧＦＲ^＋Ｒ１２^＋ＣＡＲＴ細胞とＨ１９７５－ＮＬＲまたはＡ５４９－ＮＬＲ腫瘍細胞を直ちに培養した。３日間の共培養後に、ウェルを再懸濁し、培養物の２５％をウェル当たり同じ初期数の新たな腫瘍細胞とともに新たなプレートに移した。これを合計で５回の刺激について繰り返した。細胞傷害性をＩｎｃｕｃｙｔｅにおいてアッセイの過程で連続的に測定し、各々の新たな刺激を設定してから２４時間後に上清を回収してサイトカインレベルを測定した。三連の共培養ウェルからの残りの細胞を、上述したように表現型フロー分析用に合わせた。ＮＲ４ＡＴＫＯｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞は、対照ｃ－ＪｕｎＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞と比較して、Ｈ１９７５及び／またはＡ５４９腫瘍細胞に対して依然として細胞傷害性が高く、異なる３ドナーにおいて５回の刺激後に標的細胞を溶解する能力を維持することが実証された（図７）。持続した細胞傷害性に加えて、ＮＲ４ＡＴＫＯｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞はまた、Ｈ１９７５及び／またはＡ５４９で複数回刺激した後、対照（非編集）ｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞と比較して、より高いレベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αも産生した（図８～１０）。サイトカインレベルを、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＶ－Ｐｌｅｘ炎症誘発パネル１ヒトキットまたはカスタムヒトＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αサイトカインキットを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。この細胞傷害性及びサイトカイン分泌の増加は、全３ドナーにおいて、より後のＨ１９７５刺激での対照ｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＲＯＲ１ＣＡＲＴ細胞と比較したＮＲ４ＡＴＫＯの持続性の向上と相関した（図１１）。

実施例５－操作されたＴＣＲＴ細胞の連続刺激における細胞傷害性の持続及びサイトカイン産生
ｃ－Ｊｕｎを過剰発現する及びしない単一ＮＲ４Ａ編集ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞（ＴＣＲＴ細胞がＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、またはＮＲ４Ａ３のいずれかで編集されたもの）の機能を、ＴＣＲＴ細胞が連続的に抗原に曝露されるインビトロ疲弊アッセイにて評価した。アッセイを設定する前に、Ａ３７５－ＮｕｃＬｉｇｈｔＲｅｄ（ＮＬＲ）腫瘍細胞株を、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で２～３回継代培養した。細胞をアキュターゼ酵素（ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でトリプシン処理した。

この連続刺激アッセイでは、ＮＲ４Ａ編集対照及びｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞をＡ３７５メラノーマＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１ａ発現腫瘍細胞株を用いて４回の連続刺激に供した。特に、凍結保存されたＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞を解凍し、フラット９６ウェルアッセイプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）にて三連でＲＰＭＩ－１６４０（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ）＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン中で、１：１Ｅ：Ｔ比のｃＰａｒｐ^－ＣＤ３^＋ＴＣＲｖβ１３．１^＋ＴＣＲＴ細胞とＡ３７５－ＮＬＲ腫瘍細胞を直ちに培養した。３日または４日間の共培養後に、ウェルを再懸濁し、培養物の２５％をウェル当たり同じ初期数の新たな腫瘍細胞を有する新たなプレートに移した。これを合計で４回の刺激について繰り返した。細胞傷害性をＩｎｃｕｃｙｔｅにおいてアッセイの過程で連続的に測定し、各々の新たな刺激を設定してから２４時間後に上清を回収してサイトカインレベルを測定した。ｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＴＣＲＴ細胞は、非ｃ－Ｊｕｎ対照ＴＣＲＴ細胞をしのいだ。予想外にも、ＮＲ４Ａ３ＫＯｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞は、Ａ３７５腫瘍細胞に対して依然として最も細胞傷害性が高く、異なる３ドナーにおいてすべての他の条件と比較して、４回の刺激後に標的細胞を溶解する能力を維持することが実証された（図１４）。

持続した細胞傷害性に加えて、ＮＲ４Ａ３ＫＯｃ－Ｊｕｎ過剰発現ＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞は、Ａ３７５メラノーマＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１ａ発現腫瘍細胞で刺激した場合、ＮＲ４Ａ１、ＮＲ４Ａ２、または非編集対照及びｃ－ＪｕｎＮＹ－ＥＳＯ－１ＴＣＲＴ細胞と比較して、より高いレベルのＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αも産生した（図１５及び表１２～１４）。Ｔ細胞を第二のＮＹ－ＥＳＯ－１／ＬＡＧＥ－１ａ発現腫瘍細胞株Ｈ１７０３を使用して連続的に刺激した場合、同様の結果が観察された（データは示さず）。サイトカインレベルを、ＭｅｓｏＳｃａｌｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＶ－Ｐｌｅｘ炎症誘発パネル１ヒトキットまたはカスタムヒトＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αサイトカインキットを使用して製造業者の使用説明書に従って測定した。サイトカイン産生における差は、より後の刺激回後に最も顕著であった。

発明の概要及び要約のセクションではなく、発明を実施するための形態のセクションが、特許請求の範囲を解釈するために使用されることが意図されていることを理解されたい。発明の概要及び要約のセクションは、本発明者（複数可）が企図する本開示の例示的な態様のすべてではなく１つ以上を記載し得るものであり、したがって、本開示及び添付の特許請求の範囲を決して限定するものではない。

本開示を、特定の機能及びそれらの関係の実施を示す機能的な構成要素を用いて上記で説明してきた。これらの機能的な構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書で任意に定義した。該特定の機能及びそれらの関係が適切に行われる限り、別の境界が定義される場合もある。

該特定の態様の前述の説明は、本開示の一般的な性質を完全に明らかにすることから、当業者の知識を適用することにより、必要以上の実験をすることなく、本開示の一般概念から逸脱することなく、かかる特定の態様を容易に修正すること、及び／または様々な用途に適合させることができる。したがって、かかる適合及び修正は、本明細書に含まれる教示及び手引きに基づいて、本開示の態様の意義及び均等物の範囲内であることが意図される。本明細書における表現または専門用語は、本明細書の専門用語または表現が、該教示及び手引きに照らして当業者に解釈されるように、限定ではなく説明を目的とするものであることを理解されたい。

本開示の広がり及び範囲は、上記の例示的な態様のいずれによっても限定されるべきでなく、以下の特許請求の範囲及びそれらの均等物によってのみ定義されるべきである。

本出願全体を通して引用されるすべての引用参考文献（参考文献、米国または外国特許または特許出願、及びウェブサイトを含む）の内容は、任意の目的のためにそれらの全体が本明細書に記載されているものとして、そこで引用される参考文献も同様に、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。何らかの矛盾が生じた場合、本明細書に文章で開示される内容が優先する。

Claims

（ｉ）ＮＲ４Ａメンバー１（ＮＲ４Ａ１）遺伝子及び／またはタンパク質、ＮＲ４Ａメンバー２（ＮＲ４Ａ２）遺伝子及び／またはタンパク質、ならびにＮＲ４Ａメンバー３（ＮＲ４Ａ３）遺伝子及び／またはタンパク質からなる群から選択される核内受容体サブファミリー４グループＡ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルの低下ならびに（ｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現レベルの増加を発現する、改変された免疫細胞の集団を含む細胞組成物。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む、請求項１に記載の細胞組成物。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む、請求項１に記載の細胞組成物。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む、請求項１に記載の細胞組成物。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質の両方を含む、請求項１に記載の細胞組成物。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方を含む、請求項１に記載の細胞組成物。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質の両方を含む、請求項１に記載の細胞組成物。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質ならびにＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む、請求項１に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞の集団における前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが、参照細胞組成物（例えば、細胞が、前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞組成物）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、リンパ球、好中球、単球、マクロファージ、樹状細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記リンパ球が、Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１０に記載の細胞組成物。
前記リンパ球が、Ｔ細胞である、請求項１１に記載の細胞組成物。
前記Ｔ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）及び／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、操作されたＴＣＲを含む、請求項１２に記載の細胞組成物。
前記ＣＡＲ及び／または前記ＴＣＲが、腫瘍抗原に特異的に結合する、請求項１３に記載の細胞組成物。
前記ＣＡＲ及び／または前記ＴＣＲが、ＣＤ１９、ＴＲＡＣ、ＴＣＲβ、ＢＣＭＡ、ＣＬＬ－１、ＣＳ１、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＴＳＨＲ、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＣＤ１７１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＴｎＡｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＧＰＣ１、ＧＰＣ２、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－ベータ、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、葉酸受容体アルファ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、プロスターゼ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、エフリンＢ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、フコシルＧＭ１、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、葉酸受容体ベータ、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴｌ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａｌ、レグマイン、ＨＰＶＥ６、Ｅ７、ＭＡＧＥＡｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、プロステイン、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－１／ガレクチン８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、サイクリンＢｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ１、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ１、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、またはそれらの任意の組み合わせに特異的に結合する、請求項１３または１４に記載の細胞組成物。
前記ＣＡＲ及び／または前記ＴＣＲが、ＲＯＲ１に特異的に結合する、請求項１５に記載の細胞組成物。
前記ＣＡＲが、Ｒ１２、Ｒ１１、２Ａ２、またはそれらの任意の組み合わせに由来する抗原結合ドメインを含む、請求項１６に記載の細胞組成物。
前記ＣＡＲが、配列番号１７を含む重鎖可変ドメイン及び配列番号２１を含む軽鎖可変ドメインを含む、請求項１６または１７に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞の集団が、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、または約５％未満のエフェクターＴ細胞を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞の集団が、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％のナイーブＴ（Ｔ_Ｎ）細胞、セントラルメモリーＴ細胞（Ｔ_ＣＭ細胞）、幹メモリーＴ（Ｔ_ＳＣＭ）細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、遺伝子編集ツールでＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させるように改変されている、請求項１～２０のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記遺伝子編集ツールが、（ｉ）前記ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉ）前記ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはタンパク質、（ｉｉｉ）前記ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはタンパク質、または（ｉｖ）それらの任意の組み合わせのレベルを低下させることが可能である、請求項２１に記載の細胞組成物。
前記遺伝子編集ツールが、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＣＲＩＳＰＲ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２１または２２に記載の細胞組成物。
前記遺伝子編集ツールが、ＣＲＩＳＰＲである、請求項２３に記載の細胞組成物。
前記遺伝子編集ツールが、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるガイドＲＮＡを含む、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質が、配列番号６に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質が、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、前記改変された免疫細胞が前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列で改変されている、請求項１～２７のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｂ）配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｃ）配列番号１０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｄ）配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｅ）配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｆ）配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｇ）配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｈ）配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、または
（ｉ）配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項２９に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、ｃ－Ｊｕｎの内因性発現を高めることが可能な転写活性化因子で改変されている、請求項１～３８のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞の集団が、参照免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、対象において１つ以上の特性の向上を示す、請求項１～３９のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞の１つ以上の特性の向上が、（ｉ）増殖の向上、（ｉｉ）細胞傷害性の向上、（ｉｉｉ）サイトカイン発現の向上、（ｉｖ）持続性の向上、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む、請求項４０に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、サイトカイン発現の向上を示す、請求項４１に記載の細胞組成物。
前記サイトカインが、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項４２に記載の細胞組成物。
前記ＩＬ－２の発現レベルが、参照免疫細胞の集団におけるＩＬ－２の発現レベルと比較して、少なくとも約２倍～少なくとも約１０倍に増加する、請求項４３に記載の細胞組成物。
前記ＩＦＮ－γの発現レベルが、参照免疫細胞の集団におけるＩＦＮ－γの発現レベルと比較して、少なくとも約２倍～少なくとも約１０倍に増加する、請求項４３または４４に記載の細胞組成物。
前記ＴＮＦ－αの発現レベルが、参照免疫細胞の集団におけるＴＮＦ－αの発現レベルと比較して、少なくとも約２倍～少なくとも約１０倍に増加する、請求項４３～４５のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、参照免疫細胞（例えば、ｃ－Ｊｕｎ発現を高めるように、及び／またはＮＲ４Ａ遺伝子（複数可）及び／またはＮＲ４Ａタンパク質（複数可）の発現が低下するように改変されなかった対応する細胞）と比較して、疲弊または機能不全の減少を示す、請求項１～４６のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、アポトーシスの減少を示すか、またはアポトーシスを示さない（アポトーシス抵抗性）、請求項４７に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、減少した免疫チェックポイントマーカーを発現する（免疫チェックポイント抵抗性である）、請求項４７または４８に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する、請求項１～４９のいずれか１項に記載の細胞組成物。
前記改変された免疫細胞が、（ｉ）低酸素環境での活性の向上、（ｉｉ）低栄養（すなわち、グルコース）環境での活性の向上、（ｉｉｉ）抑制性代謝産物／サイトカイン（例えば、アデノシン、ＴＧＦ－β、ＲＯＳ等）の存在下での活性の向上、（ｉｖ）抑制細胞（例えば、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ等）への曝露時の活性の向上、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを示す、請求項５０に記載の細胞組成物。
請求項１～５１のいずれか１項に記載の細胞組成物及び医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
腫瘍の治療を必要とする対象におけるその治療方法であって、前記対象に対して、請求項１～５１のいずれか１項に記載の細胞組成物または請求項５２に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
前記投与により、前記対象における腫瘍体積が、参照腫瘍体積（例えば、前記投与の前の前記対象における腫瘍体積及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して減少する、請求項５３に記載の方法。
前記腫瘍体積が、前記投与後に、前記参照腫瘍体積（例えば、前記投与の前の前記対象における腫瘍体積及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍体積）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する、請求項５４に記載の方法。
前記投与により、前記対象における腫瘍重量が、参照腫瘍重量（例えば、前記投与の前の前記対象における腫瘍重量及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して減少する、請求項５３～５５のいずれか１項に記載の方法。
前記腫瘍重量が、前記投与後に、前記参照腫瘍重量（例えば、前記投与の前の前記対象における腫瘍重量及び／または前記投与を受けなかった対象における腫瘍重量）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％減少する、請求項５６に記載の方法。
前記投与により、前記対象における前記免疫細胞の１つ以上の特性が向上する、請求項５３～５７のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫細胞の特性の向上が、（ｉ）増殖の向上、（ｉｉ）細胞傷害性の向上、（ｉｉｉ）サイトカイン発現の向上、（ｉｖ）持続性の向上、または（ｖ）それらの任意の組み合わせを含む、請求項５８に記載の方法。
前記投与により、サイトカイン発現が向上する、請求項５９に記載の方法。
前記サイトカインが、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６０に記載の方法。
前記投与により、前記免疫細胞の疲弊または機能不全が減少するか、または防止される、請求項５３～６１のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫細胞が、アポトーシスの減少を示すか、またはアポトーシスを示さない（アポトーシス抵抗性）、請求項６２に記載の方法。
前記免疫細胞が、免疫チェックポイントマーカーの低下を示すかまたは免疫チェックポイントマーカーを示さない（免疫チェックポイント抵抗性である）、請求項６２または６３に記載の方法。
前記免疫細胞が、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）において抗腫瘍機能を維持する、請求項５３～６４のいずれか１項に記載の方法。
前記免疫細胞が、（ｉ）低酸素環境での活性の向上、（ｉｉ）低栄養（すなわち、グルコース）環境での活性の向上、（ｉｉｉ）抑制性代謝産物／サイトカイン抵抗性（アデノシン、ＴＧＦ－β、ＲＯＳ等）の存在下での活性の向上、（ｉｖ）抑制細胞（例えば、ＭＤＳＣ、Ｔｒｅｇ等）への曝露時の活性の向上、またはそれらの任意の組み合わせを示す、請求項６５に記載の方法。
前記腫瘍が、乳癌、頭頸部癌、子宮癌、脳癌、皮膚癌、腎癌、肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、食道癌、眼癌、胃（ｓｔｏｍａｃｈ、ｇａｓｔｒｉｃ）癌、胃腸癌、卵巣癌、子宮頸癌、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、またはそれらの組み合わせを含むがんに由来する、請求項５３～６６のいずれか１項に記載の方法。
前記対象に対して、さらなる治療薬を投与することを含む、請求項５３～６７のいずれか１項に記載の方法。
前記さらなる治療薬が、化学療法薬、標的化抗がん療法、腫瘍溶解薬、細胞毒性薬、免疫ベースの治療、サイトカイン、外科手術、放射線治療、共刺激分子の活性化因子、免疫チェックポイント阻害剤、ワクチン、細胞免疫療法、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６８に記載の方法。
前記さらなる治療薬が、免疫チェックポイント阻害剤である、請求項６９に記載の方法。
前記免疫チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＬＡＧ－３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、及びそれらの任意の組み合わせを含む、請求項６９または７０に記載の方法。
前記さらなる治療薬及び前記細胞組成物が、同時に投与される、請求項６８～７１のいずれか１項に記載の方法。
前記さらなる治療薬及び前記細胞組成物が、連続して投与される、請求項６８～７１のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞組成物が、非経口投与、筋肉内投与、皮下投与、点眼、静脈内投与、腹腔内投与、皮内投与、眼窩内投与、脳内投与、頭蓋内投与、脊髄内投与、心室内投与、髄腔内投与、大槽内投与、嚢内投与、腫瘍内投与、またはそれらの任意の組み合わせで投与される、請求項５３～７３のいずれか１項に記載の方法。
請求項１～５１のいずれか１項に記載の細胞組成物の調製方法であって、免疫細胞を遺伝子編集ツールで改変することであって、前記遺伝子編集ツールが、前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のいずれか１つの発現を減少させる、前記改変すること、ならびにｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように前記免疫細胞を改変することを含む、前記方法。
ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように前記免疫細胞を改変することが、前記免疫細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列と接触させることを含む、請求項７５に記載の方法。
ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように前記免疫細胞を改変することが、前記免疫細胞を、前記内因性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を増加させることが可能な転写活性化因子と接触させることを含む、請求項７５または７６に記載の方法。
前記転写活性化因子が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されたＣａｓタンパク質に結合される、請求項７７に記載の方法。
ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現する、ならびにＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質のレベルが低下した細胞の産生方法であって、前記細胞を、（ｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列及び（ｉｉ）遺伝子編集ツールで改変することを含み、前記遺伝子編集ツールは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、前記方法。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞の疲弊を低減または阻害する方法であって、前記細胞を、ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが低下するように改変すること、ならびに前記細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように改変することを含む、前記方法。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質を含む、請求項８０に記載の方法。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質を含む、請求項８０または８１に記載の方法。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質が、ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質を含む、請求項８０～８２のいずれか１項に記載の方法。
前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現の低下により、前記細胞の疲弊が低減または阻害される、請求項８０～８３のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞が免疫細胞である、請求項７９～８４のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞におけるＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルが、参照細胞組成物（例えば、細胞が、前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現レベルが低下するように改変されていない対応する細胞組成物）と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約１００％低下する、請求項７９～８５のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞を改変することが、前記細胞を、前記細胞における前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現レベルを低下させることが可能な遺伝子編集ツールと接触させることを含む、請求項７９～８６のいずれか１項に記載の方法。
ｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように前記細胞を改変することが、前記免疫細胞を、ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列と接触させることを含む、請求項８０～８７のいずれか１項に記載の方法。
ｃ－Ｊｕｎを過剰発現するように前記免疫細胞を改変することが、前記免疫細胞を、前記内因性ｃ－Ｊｕｎタンパク質の発現を増加させることが可能な転写活性化因子と接触させることを含む、請求項８０～８８のいずれか１項に記載の方法。
前記転写活性化因子が、エンドヌクレアーゼ活性を欠くように改変されたＣａｓタンパク質に結合される、請求項８９に記載の方法。
抗原刺激に応答して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞によってサイトカインの産生を増加させる方法であって、前記細胞を、（ｉ）前記細胞が改変後にｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列で改変すること、及び（ｉｉ）遺伝子編集ツールで改変することを含み、前記遺伝子編集ツールは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、前記方法。
前記サイトカインが、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、ＴＮＦ－α、またはそれらの組み合わせを含む、請求項９１に記載の方法。
前記改変後、前記抗原刺激に応答した前記サイトカインの産生は、参照細胞（例えば、前記ｃ－Ｊｕｎのヌクレオチド配列及び／または遺伝子編集ツールで改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約１６倍、少なくとも約１７倍、少なくとも約１８倍、少なくとも約１９倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、または少なくとも約５０倍増加する、請求項９１または９２に記載の方法。
持続抗原刺激に応答して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する細胞のエフェクター機能を増加させる方法であって、前記細胞を、（ｉ）前記細胞が改変後にｃ－Ｊｕｎタンパク質を過剰発現するように、前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列で改変すること、及び（ｉｉ）遺伝子編集ツールで改変することを含み、前記遺伝子編集ツールは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含み、前記ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはＮＲ４Ａタンパク質の発現を低下させることが可能であり、前記ｇＲＮＡは、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる、前記方法。
前記改変後、前記細胞が、参照細胞（例えば、前記ｃ－Ｊｕｎのヌクレオチド配列及び／または遺伝子編集ツールで改変されなかった対応する細胞）と比較して、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回のさらなる抗原刺激アッセイに対してエフェクター機能を保持する、請求項９４に記載の方法。
前記エフェクター機能が、（ｉ）標的細胞（例えば、腫瘍細胞）を殺傷する能力、（ｉｉ）さらなる抗原刺激時にサイトカインを産生する能力、または（ｉｉｉ）（ｉ）と（ｉｉ）の両方を含む、請求項９４または９５に記載の方法。
前記ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号７に記載の核酸配列に対して、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｂ）配列番号８に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｃ）配列番号１０に記載の核酸配列に対して、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｄ）配列番号１１に記載の核酸配列に対して、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｅ）配列番号１２に記載の核酸配列に対して、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｆ）配列番号１３に記載の核酸配列に対して、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｇ）配列番号１４に記載の核酸配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、
（ｈ）配列番号１５に記載の核酸配列に対して、少なくとも５５％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列、または
（ｉ）配列番号１６に記載の核酸配列に対して、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、もしくは約１００％の配列同一性を有する核酸配列を含む、請求項７６～９６のいずれか１項に記載の方法。
請求項７５～７８のいずれか１項に記載の方法によって調製される細胞組成物。
（ａ）リガンド結合タンパク質（例えば、ＣＡＲまたはＴＣＲ）を発現し、（ｂ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質のレベルが増加し、かつ（ｂ）（ｉ）ＮＲ４Ａ１遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ１タンパク質、（ｉｉ）ＮＲ４Ａ２遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ２タンパク質、（ｉｉｉ）ＮＲ４Ａ３遺伝子及び／またはＮＲ４Ａ３タンパク質、または（ｉｖ）（ｉ）～（ｉｉｉ）の任意の組み合わせの発現レベルが低下した細胞を含む細胞組成物であって、前記細胞は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８、配列番号６１、配列番号６５、配列番号６７、配列番号６８、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７５、配列番号７６、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８６、配列番号９４、及び配列番号９６のいずれか１つに記載の配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるｇＲＮＡで改変されている、前記細胞組成物。
前記細胞が、インビボ細胞を含む、請求項９９に記載の細胞組成物。
前記細胞が、エキソビボ細胞またはインビトロ細胞を含む、請求項９９に記載の細胞組成物。
請求項９８～１０１のいずれか１項に記載の細胞組成物を含む医薬組成物。
（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、
（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、
（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびに
請求項５３～７４のいずれか１項に記載の方法に従って腫瘍を治療するための使用説明書を含むキット。
（ｉ）ＮＲ４Ａ遺伝子及び／またはタンパク質の発現を低下させるための遺伝子編集ツール、
（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むベクター、
（ｉｉｉ）ｃ－Ｊｕｎタンパク質をコードするヌクレオチド配列、ならびに
請求項７５～７８のいずれか１項に記載の方法に従って細胞組成物を調製するための使用説明書を含むキット。
腫瘍の治療を必要とする対象への投与を含む、前記対象における腫瘍の治療の薬剤の製造のための請求項１～５１及び９８～１０１のいずれか１項に記載の細胞組成物または請求項５２もしくは１０２に記載の医薬組成物の使用。
腫瘍の治療を必要とする対象への投与を含む、前記対象における腫瘍の治療のための請求項１～５１及び９８～１０１のいずれか１項に記載の細胞組成物または請求項５２もしくは１０２に記載の医薬組成物。