TW202306577A

TW202306577A - 表現ｃ－Ｊｕｎ之ＮＲ４Ａ缺陷型細胞及其用途

Info

Publication number: TW202306577A
Application number: TW111120715A
Authority: TW
Inventors: 子敏林; 瑞秋琳恩
Original assignee: 美商萊爾免疫藥物公司
Priority date: 2021-06-02
Filing date: 2022-06-02
Publication date: 2023-02-16
Also published as: CA3177712A1; AU2022286947A1; JP2024520676A; US20230052243A1; EP4347826A1; KR20240027676A; AU2022286947A9; WO2022256437A1

Abstract

本揭示案提供促進免疫細胞之持續效應功能之方法，其包括修飾該等細胞以過表現c-Jun且表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白。亦提供經修飾細胞，例如免疫細胞，其已經修飾以過表現c-Jun且表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白。過表現c-Jun且同時降低 NR4A基因及/或蛋白之表現水準產生耗竭/功能障礙抗性細胞，該等細胞為細胞凋亡抗性以及免疫檢查點抗性的，且亦在腫瘤微環境中維持抗腫瘤功能。

Description

表現ｃ－Ｊｕｎ之ＮＲ４Ａ缺陷型細胞及其用途

本揭示案係關於基於細胞(例如T細胞)之癌症免疫療法，其涉及投與經修飾具有降低的 NR4A基因及/或蛋白表現水準及c-Jun過表現之免疫細胞。

癌症免疫療法依賴於獲得T細胞，其係免疫系統之受感染及患病細胞之主要殺手，攻擊並殺傷腫瘤細胞。然而，免疫療法存在重要的絆腳石：T細胞之殺傷能力可減弱，該現象通常稱為耗竭。免疫檢查點阻斷、嵌合抗原受體(CAR) T細胞療法及T細胞受體改造(TCR)之T細胞療法係利用自患者分離之功能活性T細胞之治療且需要高度功能性T細胞才能有效。該等T細胞經離體改造及擴增以識別靶癌細胞上之特異性抗原。

當免疫系統被迫長時段有活性時，例如在持續病毒感染或癌症進行性發展之情況下，效應T細胞可變得耗竭。T細胞耗竭之一個標誌係免疫檢查點蛋白如PD-1及CTLA-4之表現增加，此可導致彼等T細胞停工(即變成非功能的)。免疫檢查點抑制劑阻斷該等檢查點蛋白，且如此可增加針對腫瘤之免疫反應。一些研究已表明，阻斷耗竭T細胞中檢查點蛋白之活性無法達成該結果。由於所謂的熱腫瘤，即包括高水準免疫細胞且因此應係因應免疫療法之理想候選者之腫瘤，通常具有主要由耗竭T細胞構成之群體，故此係重要的。另外，腫瘤微環境可誘導衰老及耗竭的細胞表型。因此，設計逆轉及/或防止該等耗竭狀態之策略係改良免疫治療效能之關鍵。

在一些態樣中，本揭示案提供細胞組合物，其包含經修飾免疫細胞之群體，該等經修飾免疫細胞表現(i)降低的表現水準之 核受體亞家族 4 組 A基因及/或蛋白，其選自由以下組成之群：NR4A成員1 (NR4A1)基因及/或蛋白、NR4A成員2 (NR4A2)基因及/或蛋白、及NR4A成員3 (NR4A3)基因及/或蛋白，及(ii)增加的表現水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。

在一些態樣中，與參考細胞組合物(例如其中細胞未經修飾以表現較低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白之相應細胞組合物)相比，經修飾免疫細胞之群體中 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。

在一些態樣中，經修飾免疫細胞包含淋巴球、嗜中性球、單核球、巨噬細胞、樹突細胞及其任一組合。在一些態樣中，淋巴球包含T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、淋巴介質活化殺手細胞、自然殺手(NK)細胞及其任一組合。在一些態樣中，淋巴球係T細胞。在一些態樣中，T細胞包含嵌合抗原受體(CAR)及/或T細胞受體(TCR)，例如經改造之TCR。在一些態樣中，經修飾免疫細胞包含特異性結合至腫瘤抗原之CAR及/或TCR。在一些態樣中，CAR及/或TCR特異性結合至CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-1 1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、鄰-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、天冬醯胺內肽酶、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺癌相關蛋白(prostein)、生存素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體(例如包括KRAS、HRAS、NRAS突變體蛋白)、hTERT、肉瘤易位斷裂點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶反轉錄酶、RU1、RU2、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1或其任何組合。

在一些態樣中，CAR及/或TCR特異性結合至ROR1。在一些態樣中，CAR包含衍生自R12、R11、2A2或其任一組合之抗原結合結構域。在一些態樣中，CAR包含含有SEQ ID NO: 17之重鏈可變結構域及含有SEQ ID NO: 21之輕鏈可變結構域。

在一些態樣中，經修飾免疫細胞之群體具有少於約50%、少於約40%、少於約30%、少於約20%、少於約10%或少於約5%之效應T細胞。在一些態樣中，經修飾免疫細胞之群體包含至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%之幼稚T (T _N)細胞、中央記憶T細胞(T _CM細胞)、幹細胞記憶T (T _SCM)細胞或其任一組合。

在一些態樣中，經修飾免疫細胞已用基因編輯工具修飾以減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現。在一些態樣中，基因編輯工具能夠降低以下之水準：(i) NR4A1基因及/或蛋白，(ii) NR4A2基因及/或蛋白，(iii) NR4A3基因及/或蛋白，或(iv)其任一組合。在一些態樣中，基因編輯工具包含shRNA、siRNA、miRNA、反義寡核苷酸、CRISPR、鋅指核酸酶、TALEN、大範圍核酸酶、限制性核酸內切酶或其任一組合。在一些態樣中，基因編輯工具係CRISPR。在一些態樣中，基因編輯工具包含引導RNA，該引導RNA包含以下中之任一者中所述之序列、由其組成或基本上由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。

在一些態樣中，c-Jun蛋白包含與如SEQ ID NO: 6中所述之胺基酸序列具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。在一些態樣中，c-Jun蛋白包含如SEQ ID NO: 6中所述之胺基酸序列。

在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞已用編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列修飾，使得經修飾免疫細胞過表現c-Jun蛋白。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含：(a)與如SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(b)與如SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(c)與如SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(d)與如SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(e)與如SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(f)與如SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(g)與如SEQ ID NO:14中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(h)與如SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；或(i)與如SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 14中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。在一些態樣中，經修飾免疫細胞已用能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑修飾。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，經修飾免疫細胞之群體在個體中展現一或多種增強的性質。在一些態樣中，經修飾免疫細胞之一或多種增強的性質包括(i)增強的增殖，(ii)增強的細胞毒性，(iii)增強的細胞介素表現，(iv)增強的持久性，或(v)其任一組合。

在一些態樣中，其中經修飾免疫細胞展現增強的細胞介素表現。在一些態樣中，細胞介素係介白素-2 (IL-2)、干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)或其任一組合。在一些態樣中，IL-2之表現水準與參考免疫細胞群體中IL-2之表現水準相比增加至少約2倍至至少約10倍。在一些態樣中，IFN-γ之表現水準與參考免疫細胞群體中IFN-γ之表現水準相比增加至少約2倍至至少約10倍。在一些態樣中，TNF-α之表現水準與參考免疫細胞群體中TNF-α之表現水準相比增加至少約2倍至至少約10倍。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，經修飾免疫細胞展現減少的耗竭或功能障礙。在一些態樣中，經修飾免疫細胞展現減少的細胞凋亡或不展現細胞凋亡(細胞凋亡抗性)。在一些態樣中，經修飾免疫細胞表現減少的免疫檢查點標記物(為免疫檢查點抗性)。在一些態樣中，經修飾免疫細胞在腫瘤微環境(TME)中維持抗腫瘤功能。在一些態樣中，經修飾免疫細胞展現(i)低氧環境中增強的活性，(ii)低營養環境(即葡萄糖)中增強的活性，(iii)抑制性代謝物/細胞介素(例如腺苷、TGF-β、ROS等)存在下增強的活性，(iv)在暴露於抑制性細胞(例如MDSC、Treg等)時增強的活性，或(v)其任一組合。

在一些態樣中，本揭示案提供醫藥組合物，其包含本文所述之經修飾免疫細胞之群體及醫藥學上可接受之載劑。

在一些態樣中，本揭示案提供治療有需要之個體之腫瘤的方法，其包括向個體投與本文所述之細胞組合物或醫藥組合物。在一些態樣中，與參考腫瘤體積(例如投與前個體之腫瘤體積及/或未接受投與之個體之腫瘤體積)相比，投與使個體之腫瘤體積減小。在一些態樣中，與參考腫瘤體積(例如投與前個體之腫瘤體積及/或未接受投與之個體之腫瘤體積)相比，腫瘤體積在投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，與參考腫瘤重量(例如投與前個體之腫瘤重量及/或未接受投與之個體之腫瘤重量)相比，投與使個體之腫瘤重量減小。在一些態樣中，與參考腫瘤重量(例如投與前個體之腫瘤重量及/或未接受投與之個體之腫瘤重量)相比，腫瘤重量在投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。

在一些態樣中，投與增強個體中免疫細胞之一或多種性質。在一些態樣中，免疫細胞之增強的性質包括(i)增強的增殖，(ii)增強的細胞毒性，(iii)增強的細胞介素表現，(iv)增強的持久性，或(v)其任一組合。在一些態樣中，投與增強細胞介素表現。在一些態樣中，細胞介素包含IL-2、IFN-γ、TNF-α或其任一組合。在一些態樣中，投與減少或防止免疫細胞之耗竭或功能障礙。在一些態樣中，免疫細胞展現減少的細胞凋亡或不展現細胞凋亡(細胞凋亡抗性)。在一些態樣中，免疫細胞展現減少的免疫檢查點標記物或不展現免疫檢查點標記物(為免疫檢查點抗性)。在一些態樣中，免疫細胞在腫瘤微環境(TME)中維持抗腫瘤功能。在一些態樣中，免疫細胞展現(i)低氧環境中增強的活性，(ii)低營養環境(即葡萄糖)中增強的活性，(iii)抑制性代謝物/細胞介素抗性(腺苷、TGF-β、ROS等)存在下增強的活性，(iv)在暴露於抑制性細胞(MDSC、Treg等)時增強的活性，或其任一組合。

在一些態樣中，腫瘤衍生自癌症，包含乳癌、頭頸癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌(renal cancer)、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌(kidney cancer)、胰臟癌、甲狀腺癌、食道癌、眼癌、胃(stomach/gastric)癌、胃腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其組合。

在一些態樣中，該方法包括向個體投與另一治療劑。在一些態樣中，另一治療劑包括化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任一組合。在一些態樣中，另一治療劑係免疫檢查點抑制劑。在一些態樣中，免疫檢查點抑制劑包括抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗GITR抗體、抗TIM3抗體及其任一組合。

在一些態樣中，另一治療劑及細胞組合物係同時投與。在一些態樣中，其中另一治療劑及細胞組合物係依序投與。在一些態樣中，細胞組合物係以腸胃外、肌內、皮下、眼部、靜脈內、腹膜內、真皮內、眶內、大腦內、顱內、脊椎內、室內、鞘內、腦池內、囊內、腫瘤內或其任一組合投與。

在一些態樣中，本揭示案提供製備本文所述之免疫細胞(或細胞組合物)之方法，其包括用基因編輯工具修飾細胞，其中基因編輯工具減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白中任一者之表現，及修飾免疫細胞以過表現c-Jun。在一些態樣中，修飾免疫細胞以過表現c-Jun包括使免疫細胞與編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列接觸。在一些態樣中，修飾免疫細胞以過表現c-Jun包括使免疫細胞與能夠增加內源c-Jun蛋白之表現之轉錄活化劑接觸。在一些態樣中，轉錄活化劑連接至已經修飾以缺乏核酸內切酶活性之Cas蛋白。

本文亦提供產生過表現c-Jun蛋白且具有降低的 NR4A基因及/或NR4A蛋白水準之細胞之方法，其包括用(i)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列及(ii)基因編輯工具修飾細胞，其中基因編輯工具包含引導RNA (gRNA)且能夠減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現，且其中gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。

在一些態樣中，本揭示案提供減少或抑制表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞之耗竭的方法，其包括修飾細胞以降低 NR4A基因及/或蛋白之表現水準，及修飾細胞以過表現c-Jun蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白之減少的表現會減少或抑制細胞之耗竭。

在一些態樣中，細胞係免疫細胞。在一些態樣中，與參考細胞組合物(例如其中細胞未經修飾以表現較低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白之相應細胞組合物)相比，細胞中 NR4A基因及/或蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。

在一些態樣中，修飾細胞包括使細胞與能夠降低細胞中 NR4A基因及/或蛋白之表現水準之基因編輯工具接觸。在一些態樣中，修飾細胞以過表現c-Jun蛋白包括使免疫細胞與編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列接觸。在一些態樣中，修飾免疫細胞以過表現c-Jun包括使免疫細胞與能夠增加內源c-Jun蛋白之表現之轉錄活化劑接觸。在一些態樣中，轉錄活化劑連接至已經修飾以缺乏核酸內切酶活性之Cas蛋白。

在一些態樣中，本揭示案進一步提供增加表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞因應抗原刺激之細胞介素產生之方法，其包括用以下修飾細胞：(i)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，使得細胞在修飾後過表現c-Jun蛋白，及(ii)基因編輯工具，其中基因編輯工具包含引導RNA (gRNA)且能夠減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現，且其中gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。

在一些態樣中，細胞介素包含IFN-γ、IL-2、TNF-α或其組合。在一些態樣中，在修飾後，與參考細胞(例如未用c-Jun核苷酸序列及/或基因編輯工具修飾之相應細胞)相比，因應抗原刺激之細胞介素產生增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。

本揭示案亦提供增加表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞因應持續抗原刺激之效應功能之方法，其包括用以下修飾細胞：(i)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，使得細胞在修飾後過表現c-Jun蛋白，及(ii)基因編輯工具，其中基因編輯工具包含引導RNA (gRNA)且能夠減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現，且其中gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。

在一些態樣中，在修飾後，與參考細胞(例如未用c-Jun核苷酸序列及/或基因編輯工具修飾之相應細胞)相比，細胞在至少一輪、至少兩輪或至少三輪額外抗原刺激分析中保持效應功能。在一些態樣中，效應功能包括以下能力：(i)殺傷靶細胞(例如腫瘤細胞)，(ii)在進一步抗原刺激時產生細胞介素，或(iii) (i)及(ii)二者。

在一些態樣中，本揭示案提供藉由本文所述之方法製備之細胞組合物。在一些態樣中，本文提供細胞組合物，其包含如下細胞：(a)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(b)具有增加的c-Jun蛋白水準，及(c)表現降低水準之(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，(iii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，或(iv) (i)至(iii)之任一組合，其中細胞已用gRNA修飾，該gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、由其組成或基本上由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。在一些態樣中，細胞組合物係活體內細胞。在一些態樣中，細胞係離體細胞或活體外細胞。在一些態樣中，醫藥組合物包含細胞。

在一些態樣中，本揭示案提供套組，其包含(i)減少 NR4A基因及/或蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之載體，(iii)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，及根據本文所述之方法治療腫瘤之說明書。在一些態樣中，套組包含(i)減少 NR4A基因及/或蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之載體，(iii)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，及根據本文所述之方法製備細胞組合物之說明書。

在一些態樣中，本揭示案提供本文所述之細胞組合物或醫藥組合物之用途，其用於製造治療有需要之個體之腫瘤的藥物，該治療包括投與個體。

在一些態樣中，本揭示案提供用於治療有需要之個體之腫瘤的本文所述之細胞組合物或醫藥組合物，該治療包括投與個體。

相關申請案之交叉引用

本PCT申請案主張於2021年6月2日提出申請之美國臨時申請案第63/195,956號及於2022年5月19日提出申請之美國臨時申請案第63/365,023號的優先權益，該等美國臨時申請案中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。經由EFS-WEB電子提交之序列表之引用

在本申請案中提交之電子提交之序列表(名稱：4385_087PC02_Seqlisting_ST25.txt，大小：97,218個位元組；及創建日期：2022年6月1日)之內容之全文皆以引用方式併入本文中。

本揭示案係關於組合物，其包含經修飾免疫細胞之群體，該等經修飾免疫細胞(i)表現降低水準之核受體亞家族4組A (NR4A)成員1 ( NR4A1)、成員2 ( NR4A2)或成員3 ( NR4A3)基因及/或NR4A1、NR4A2或NR4A3蛋白，及(ii)增加的表現水準之轉錄因子c-Jun。如本文進一步闡述，在一些態樣中，可用於本揭示案之免疫細胞已經修飾以表現降低水準之NR4A家族之單一成員(「 單基因剔除」)。舉例而言，在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有：(i)增加水準之c-Jun及(ii)降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有：(i)增加水準之c-Jun及(ii)降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有：(i)增加水準之c-Jun及(ii)降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，可用於本揭示案之免疫細胞已經修飾以表現降低水準之NR4A家族之兩個成員(「 雙基因剔除」)。舉例而言，在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有：(i)增加水準之c-Jun及(ii)降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有：(i)增加水準之c-Jun及(ii)降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有：(i)增加水準之c-Jun及(ii)降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，可用於本揭示案之免疫細胞已經修飾以表現降低水準之NR4A家族之所有成員(「 三基因剔除」)。因此，在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有：(i)增加水準之c-Jun及(ii)降低水準之以下中之每一者： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。降低 NR4A基因之水準可藉由使用基因編輯技術(例如基因編輯技術，例如CRISPR)來完成。如根據本揭示案所明瞭，除非另有指示，否則術語「 NR4A 基因及 / 或 NR4A 蛋白」包含本文所述之NR4A單基因剔除、雙基因剔除及三基因剔除中之任一者。

降低 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之水準及增加轉錄因子c-Jun之表現水準可產生一或多種持續效應功能，例如在免疫細胞(例如本文所述之彼等免疫細胞)中。持續效應功能之一個態樣係增強的T細胞活化(例如增強的擴增、增強的細胞毒性、增強的細胞介素表現)。降低 NR4A1 、 NR4A2 或 NR4A3基因及/或蛋白(或其組合)之水準並增加轉錄因子c-Jun之表現水準可產生耗竭/功能障礙抗性細胞。另外，降低 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之水準並增加轉錄因子c-Jun之表現水準可在TME環境中維持抗腫瘤功能。

本揭示案亦提供例如治療有需要之個體之腫瘤之方法，其包括向個體投與本文所述之細胞組合物(例如包含免疫細胞之組合物，該免疫細胞已經修飾以具有(i)降低水準之 NR4A家族之一或多個成員及(ii)增加水準之c-Jun蛋白)。

本揭示案亦提供例如生成經修飾免疫細胞之方法，該等經修飾免疫細胞表現(i)降低水準之核受體亞家族4組A成員( NR4A1 、 NR4A2或 NR4A3)基因及/或蛋白中之一者及內源水準之其他兩個NR4A成員(例如 NR4A1及 NR4A2基因及蛋白； NR4A1 及 NR4A3基因及蛋白；或 NR4A2 及 NR4A3基因及蛋白)，及(ii)增加的表現水準之轉錄因子c-Jun；使用經修飾免疫細胞之方法；包含經修飾免疫細胞之醫藥組合物；或包含經修飾免疫細胞之套組。如本文進一步闡述，在一些態樣中，本揭示案亦提供生成經修飾免疫細胞之方法，該等經修飾免疫細胞具有增加水準之c-Jun蛋白及降低水準之NR4A家族之兩個或所有三個成員。

在更詳細闡述本揭示案之前應理解，本揭示案並不限於所述之特定組合物或製程步驟，因此其當然可發生變化。如熟習此項技術者在閱讀本揭示案後應明瞭，本文闡述及說明之每一個別態樣具有離散組分及特徵，其可容易地自其他若干態樣中任一者之特徵分離或與其組合而不背離本揭示案之範圍或精神。可以所列舉事件之順序或以邏輯上可能之任何其他順序來實施任一所列舉方法。

本文所提供之標題並非本揭示案之各個態樣之限制，本揭示案可藉由參考整個說明書來限定。亦應理解，本文所用之術語僅用於闡述特定態樣之目的，而不欲具有限制性，此乃因本揭示案之範圍將僅受所附申請專利範圍的限制。 I. 術語

為可更容易地理解本揭示案，首先定義某些術語。如本申請案中所用，除非本文另外明確提供，否則以下術語中之每一者應具有下文所述之含義。其他定義闡述於本申請案通篇中。

在本揭示案通篇中，術語「一(a)」或「一(an)」實體係指一或多個(種)該實體；例如，「免疫細胞」應理解為代表一或多個(種)免疫細胞。因此，術語「一(a)」(或「一(an)」)、「一或多個(種)」及「至少一個(種)」在本文中可互換使用。

另外，本文所用之「及/或」應視為具或不具另一者之兩個指定特徵或組分中之每一者之特定揭示。因此，如本文片語(例如「A及/或B」)中所用之術語「及/或」意欲包括「A及B」、「A或B」、「A」(單獨)及「B」(單獨)。同樣，如片語(例如「A、B及/或C」)中所用之術語「及/或」意欲涵蓋以下態樣中之每一者：A、B及C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A及C；A及B；B及C；A (單獨)；B (單獨)；及C (單獨)。

應理解，每當在本文中使用語言「包含」闡述態樣時，亦提供根據「由……組成」及/或「基本上由……組成」闡述之其他類似態樣。

除非另有定義，否則本文所用之所有技術及科學術語皆具有與本揭示案相關之領域之普通技術人員通常理解之含義相同之含義。舉例而言，Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show，第2版，2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology，第3版，1999, Academic Press；及Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology，修訂版，2000, Oxford University Press向熟習此項技術者提供本揭示案中所用之許多術語之通用詞典。

單位、前綴及符號以其國際單位製(Système International de Unites，SI)接受之形式表示。數字範圍包括限定範圍之數字。除非另有指示，否則胺基酸序列係以胺基至羧基之取向自左至右書寫。本文所提供之標題並非本揭示案之各個態樣之限制，本揭示案可藉由參考整個說明書來獲得。因此，下文緊接定義之術語藉由參考本說明書之全文經更全面地定義。

本文所用之縮寫定義於本揭示案通篇中。本揭示案之各個態樣進一步詳細闡述於以下子部分中。

術語「約」或「基本上包含」係指值或組成在如由熟習此項技術者所測定之特定值或組成之可接受之誤差範圍內，此將部分取決於量測或測定值或組成之方式，即量測系統之限制。舉例而言，「約」或「基本上包含」可意指根據此項技術中之實踐在1個標準偏差內或大於1個標準偏差內。替代地，「約」或「基本上包含」可意指高達10%之範圍。另外，尤其對於生物系統或過程，該等術語可意指高達一個數量級或高達值之5倍。當申請案及申請專利範圍中提供特定值或組成時，除非另有說明，否則「約」或「基本上包含」之含義應假設在特定值或組成之可接受之誤差範圍內。

如本文所用之術語「大約」在應用於一或多個所關注值時係指與所述參考值相似之值。在一些態樣中，除非另有說明或自上下文明顯看出，否則術語「大約」係指在任一方向上(大於或小於)在所述參考值之10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小內之一系列值(此數值將超過可能值之100%的情況除外)。

如本文所述，除非另有指示，否則任一濃度範圍、百分比範圍、比率範圍或整數範圍應理解為包括所列舉範圍內之任一整數及(適當時)其分數(例如整數之十分之一及百分之一)的值。

如本文所用之「投與」係指使用熟習此項技術者已知之多種方法及遞送系統中之任一者將治療劑或包含治療劑之組合物物理引入個體。本文所述治療劑之不同投與途徑包括靜脈內、腹膜內、肌內、皮下、脊椎或其他腸胃外投與途徑，例如藉由注射或輸注。如本文所用之片語「腸胃外投與」意指除腸及局部投與外之投與模式，通常藉由注射，且包括(但不限於)靜脈內、腹膜內、肌內、動脈內、鞘內、淋巴內、病灶內、囊內、眶內、心內、真皮內、經氣管、氣管內、肺、皮下、表皮下、關節內、囊下、蛛網膜下、室內、玻璃體內、硬膜外及胸骨內注射及輸注以及活體內電穿孔。替代地，本文所述之治療劑可經由非腸胃外途徑，例如局部、表皮或黏膜投與途徑，例如鼻內、經口、經陰道、經直腸、舌下或局部來投與。投與亦可實施例如一次、複數次及/或在一或多個延長時段內實施。

如本文所用之術語「抗原」係指任何天然或合成免疫原性物質，例如蛋白質、肽或半抗原。如本文所用之術語「同源抗原」係指免疫細胞(例如T細胞)識別且藉此誘導免疫細胞活化(例如觸發誘導效應功能、例如細胞介素產生及/或細胞增殖之細胞內信號)的抗原。

核苷酸係由其公認單字母代碼來提及。除非另有指示，否則核酸係以5′至3′之取向自左至右書寫。核苷酸在本文中係由IUPAC-IUB生物化學命名委員會(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推薦之其通常已知之單字母符號來提及。因此，A代表腺嘌呤，C代表胞嘧啶，G代表鳥嘌呤，T代表胸腺嘧啶，U代表尿嘧啶。

應理解，在所揭示序列中，T及U係可互換的，此端視序列係DNA抑或RNA而定。舉例而言，gRNA間隔體序列在本揭示案中呈現為DNA (A/T/C/G)，而gRNA嵌合框呈現為RNA (A/U/C/G)。

胺基酸在本文中係由其通常已知之三字母符號或由IUPAC-IUB生物化學命名委員會推薦之單字母符號來提及。除非另有指示，否則胺基酸序列係以胺基至羧基之取向自左至右書寫。

「多肽」係指包含至少兩個連續連接之胺基酸殘基之鏈，且鏈之長度無上限。蛋白質中之一或多個胺基酸殘基可含有修飾，例如(但不限於)糖基化、磷酸化或二硫鍵形成。「蛋白質」可包含一或多條多肽。除非另有說明，否則術語「蛋白質」及「多肽」可互換使用。

如本文所用之術語「核酸分子」意欲包括DNA分子及RNA分子。核酸分子可為單股或雙股，且可為cDNA。

如本文所用之術語「多核苷酸」係指任一長度之核苷酸之聚合物，包括核糖核苷酸、去氧核糖核苷酸、其類似物或其混合物。此術語係指分子之一級結構。因此，該術語包括三股、雙股及單股去氧核糖核酸(「DNA」)以及三股、雙股及單股核糖核酸(「RNA」)。其亦包括多核苷酸之經修飾(例如藉由烷基化及/或藉由封端)及未經修飾之形式。更具體而言，術語「多核苷酸」包括多去氧核糖核苷酸(含有2-去氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖，包括mRNA及gRNA，無論係剪接抑或非剪接)、為嘌呤或嘧啶鹼基之N-糖苷或C-糖苷之任何其他類型之多核苷酸及含有正核苷酸(normucleotidic)主鏈之其他聚合物(例如聚醯胺(例如肽核酸「PNA」)及聚嗎啉基聚合物)及其他合成序列特異性核酸聚合物，條件係聚合物含有呈允許鹼基配對及鹼基堆積之構形之核鹼基，例如在DNA及RNA中所發現。

如本文所用之術語「載體」欲指能夠運輸與其連接之另一核酸之核酸分子。一種類型之載體係「質體」，其係指其他DNA區段可連結至其中之環狀雙股DNA環。另一類型之載體係病毒載體，其中其他DNA區段可連結至病毒基因體中。某些載體能夠在其所引入之宿主細胞中自主複製(例如具有細菌複製起點之細菌載體及游離型哺乳動物載體)。其他載體(例如非游離型哺乳動物載體)可在引入宿主細胞中後整合至宿主細胞之基因體中，且由此與宿主基因體一起複製。另外，某些載體能夠引導其可操作連接之基因之表現。該等載體在本文中稱為「重組表現載體」(或簡稱為「表現載體」)。一般而言，用於重組DNA技術中之表現載體通常呈質體形式。在本說明書中，「質體」及「載體」可互換使用，此乃因質體係最常用之載體形式。然而，亦包括其他形式之表現載體，例如病毒載體(例如複製缺陷反轉錄病毒、腺病毒及腺相關病毒)，其發揮等效之功能。

「癌症」係指特徵在於異常細胞在體內不受控生長之一大組各種疾病。失調的細胞分裂及生長可形成惡性腫瘤，其侵入鄰近組織且亦可經由淋巴系統或血流轉移至身體之遠端部分。如本文所用之「癌症」係指原發性、轉移性及復發性癌症。

如本文所用之術語「免疫反應」係指脊椎動物內對外源劑之生物反應，該反應保護有機體抵抗該等劑及由其引起之疾病。免疫反應係藉由免疫系統細胞(例如T淋巴球、B淋巴球、自然殺手(NK)細胞、巨噬細胞、嗜酸性球、肥大細胞、樹突細胞或嗜中性球)及由該等細胞中之任一者或肝臟產生之可溶性大分子(包括抗體、細胞介素及補體)的作用來調介，該作用可選擇性靶向、結合、損傷、破壞及/或自脊椎動物之身體消除侵入性病原體、感染病原體之細胞或組織、癌性或其他異常細胞或(在自體免疫或病理性發炎之情形下)正常人類細胞或組織。免疫反應包括例如活化或抑制T細胞，例如效應T細胞或Th細胞，例如CD4 ⁺或CD8 ⁺T細胞，或抑制T _reg細胞。如本文所用之術語「T細胞」及「T淋巴球」係可互換的且係指由胸腺產生或處理之任何淋巴球。在一些態樣中，T細胞係CD4 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞係CD8 ⁺T細胞。在一些態樣中，T細胞係NKT細胞。

如本文所用之術語「抗腫瘤免疫反應」係指針對腫瘤抗原之免疫反應。增加的刺激免疫反應或免疫系統之能力可源自T細胞共刺激受體之增強的促效劑活性及/或抑制性受體之增強的拮抗劑活性。增加的刺激免疫反應或免疫系統之能力可由量測免疫反應之分析(例如量測細胞介素或趨化介素釋放之變化、細胞溶解活性(直接在靶細胞上或間接經由偵測CD107a或顆粒酶測定)及增殖之分析)中之EC ₅₀或最大活性水準之倍數增加來反映。在一些態樣中，刺激免疫反應或免疫系統活性之能力可增強例如至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約100%。在一些態樣中，刺激免疫反應或免疫系統活性之能力可增強例如至少約1.2倍、至少約1.4倍、至少約1.6倍、至少約1.8倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。

「個體」包括任何人類或非人類動物。術語「非人類動物」包括(但不限於)脊椎動物，例如非人類靈長類動物、綿羊、狗及嚙齒類動物，例如小鼠、大鼠及豚鼠。在一些態樣中，個體係人類。術語「個體」及「患者」在本文中可互換使用。

術語「治療有效量」或「治療有效劑量」係指提供期望生物、治療及/或預防結果之劑(例如本文所揭示之經修飾免疫細胞)之量。該結果可為減少、改善、緩和、減弱、延遲及/或減輕疾病之一或多個徵象、症狀或病因或生物系統之任何其他期望變化。關於實體腫瘤，有效量包含足以引起腫瘤皺縮及/或足以減小腫瘤生長速率(例如抑制腫瘤生長)或足以防止或延遲其他不希望細胞增殖之量。在一些態樣中，有效量係足以延遲腫瘤發展之量。在一些態樣中，有效量係足以防止或延遲腫瘤復發之量。有效量可以一或多次投與來投與。有效量之組合物可例如(i)減少癌細胞之數量；(ii)減小腫瘤大小；(iii)抑制、延緩、在一定程度上減緩且可停止癌細胞浸潤至外周器官中；(iv)抑制(即在一定程度上減緩且可停止)腫瘤轉移；(v)抑制腫瘤生長；(vi)防止或延遲腫瘤發生及/或復發；及/或(vii)在一定程度上解除與癌症相關之一或多種症狀。

在一些態樣中，「治療有效量」係在臨床上證實影響癌症之顯著減少或減緩癌症(例如晚期實體腫瘤)之進展(消退)的本文經修飾細胞之量。治療劑促進疾病消退之能力可使用熟習此項技術者已知之多種方法來評估，例如在人類個體中在臨床試驗期間、在預測人類中之功效之動物模型系統中或藉由在活體外分析中分析劑之活性。

如本文所用之術語「標準護理」係指醫學專家接受作為某一類型疾病之適當治療且由健康護理專業人員廣泛使用之治療。該術語可與以下術語中之任一者互換使用：「最佳實踐」、「標準醫學護理」及「標準療法」。

舉例而言，「抗癌劑」促進個體之癌症消退或防止進一步腫瘤生長。在一些態樣中，治療有效量之藥物促進癌症消退至消除癌症之程度。

「促進癌症消退」意指，單獨或與抗瘤劑組合投與有效量之藥物可降低腫瘤生長或大小、使腫瘤壞死、降低至少一種疾病症狀之嚴重程度、增加無疾病症狀時段之頻率及持續時間、或防止因患病所致之受損或失能。

關於治療之術語「有效」及「有效性」包括藥理學有效性及生理學安全性二者。藥理學有效性係指藥物促進患者之癌症消退之能力。生理學安全性係指在細胞、器官及/或有機體層級上源自投與藥物之毒性或其他不良生理學效應(不良效應)之水準。

如本文所用之術語「免疫檢查點抑制劑」係指完全或部分減少、抑制、干擾或調節一或多種檢查點蛋白之分子。檢查點蛋白調控T細胞活化或功能。已知多種檢查點蛋白，例如CTLA-4及其配位體CD80及CD86；以及PD-1與其配位體PD-L1及PD-L2。Pardoll, D.M., Nat Rev Cancer12(4):252-64 (2012)。該等蛋白質負責T細胞反應之共刺激或抑制性相互作用。免疫檢查點蛋白調控且維持自身耐受性以及生理學免疫反應之持續時間及幅度。免疫檢查點抑制劑包括抗體或衍生自抗體。

如本文所用之術語「氧化壓力」係指特徵在於氧化劑過量及/或抗氧化劑水準降低之條件。細胞氧化劑可包括(但不限於)氧自由基(超氧化物陰離子、羥基自由基及/或過氧基自由基)；非自由基活性含氧物，例如過氧化氫及單重氧；碳自由基；氮自由基；硫自由基；及其組合。在一些態樣中，氧化壓力之條件可引起例如細胞損傷、細胞效能受損及/或細胞死亡。

如本文所用之術語「經修飾細胞」係指已經受非天然改造以使得細胞之表型(即 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現水準及c-Jun蛋白之表現水準)不同於未經修飾細胞(即參考細胞)之細胞，例如T細胞。如根據本揭示案應明瞭，與參考細胞(例如未經修飾之相應細胞)相比，本文所揭示之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白。舉例而言，在一些態樣中，本文所述之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及(ii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之(i) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及(ii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，本文所述之經修飾細胞過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，及(iii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。如本文所用之術語「相應細胞」係指與經修飾細胞屬於同一免疫細胞分類之細胞。舉例而言，若經修飾細胞係T細胞，則相應細胞亦將為T細胞。

如本文所用之術語「內源表現」或「內源表現水準」或「內源水準」 (或其語法變化形式)係指天然(例如，基因及/或蛋白質並非藉由非天然改造直接操縱)之基因及/或蛋白質表現(例如量、動力學等)。舉例而言，在一些態樣中，本文所揭示之經修飾細胞(例如具有NR4A3敲低且過表現c-Jun蛋白之CAR或TCR T細胞)並不表現內源水準之 NR4A3基因及/或蛋白，但由於兩種 NR4A1及 NR4A2基因尚未敲低(例如藉由CRISPR，例如非天然改造)，經修飾細胞內源表現 NR4A1及 NR4A2基因及/或NR4A1及NR4A2蛋白。

在一些態樣中，經修飾細胞係藉由將外來或外源核酸引入細胞中來產生。在一些態樣中，外來或外源核酸可編碼本文所揭示之基因編輯工具。核酸可藉由此項技術中已知之方法引入細胞中，該等方法係例如電穿孔(參見例如Heiser W. C. Transcription Factor Protocols: Methods in Molecular Biology™ 2000; 130: 117-134)、化學(例如磷酸鈣或脂質)轉染(參見例如Lewis W. H.等人， Somatic Cell Genet.1980年5月; 6(3): 333-47；Chen C.等人， Mol Cell Biol.1987年8月; 7(8): 2745-2752)、與含有重組質體之細菌性原生質體融合(參見例如Schaffner W. Proc Natl Acad Sci USA.1980年4月; 77(4): 2163-7)或將經純化DNA直接顯微注射至細胞核中(參見例如Capecchi M. R. Cell.1980年11月; 22(2 Pt 2): 479-88)。

應理解，提及「經修飾細胞」或「細胞」之揭示內容同樣適用於彼等細胞之群體，即適用於複數個彼等細胞。

如本文所用之術語「升高的濃度」或「升高的水準」及其語法變化形式係指與適當對照(例如健康組織或細胞)相比，高於正常水準之物質(例如活性含氧物；ROS)。

如本文所用之術語「活性含氧物」及「ROS」係指含有氧之高反應性化學物質，其易於與其他分子反應，產生潛在損傷性修飾。活性含氧物包括例如氧離子、自由基以及無機及有機過氧化物，例如過氧化氫、超氧化物、羥基自由基、脂質氫過氧化物酶及單重氧。其通常係極小分子且因存在未配對價殼電子而具高反應性。幾乎所有的癌症皆與活性含氧物之升高的濃度相關。Liou, G.等人， Free Radic Res44(5): 1-31 (2010)。

如本文所用之術語「嵌合抗原受體」及「CAR」係指具有抗原特異性細胞外結構域之重組融合蛋白，該細胞外結構域偶合至在抗原與細胞外結構域結合時引導細胞執行特殊功能之細胞內結構域。術語「人工T細胞受體」、「嵌合T細胞受體」及「嵌合免疫受體」各自在本文中可與術語「嵌合抗原受體」互換使用。嵌合抗原受體與其他抗原結合劑之區別在於其能夠結合MHC非依賴性抗原並經由其細胞內結構域轉導活化信號。

嵌合抗原受體之抗原特異性細胞外結構域識別且特異性結合抗原，通常為惡性病之表面表現抗原。抗原特異性細胞外結構域特異性結合抗原，例如當其以介於約0.1 pM至約10 µM之間(例如約0.1 pM至約1 µM或約0.1 pM至約100 nM)的親和力常數或相互作用親和力(K _D)結合抗原時。測定相互作用親和力之方法為此項技術中已知。適用於本揭示案CAR中之抗原特異性細胞外結構域可為任何抗原結合多肽，眾多種抗原結合多肽為此項技術中已知。在一些態樣中，抗原結合結構域係單鏈Fv (scFv)。其他基於抗體之識別結構域(cAb VHH (駱駝科抗體可變結構域)及其人類化形式、lgNAR VH (鯊魚抗體可變結構域)及其人類化形式、sdAb VH (單結構域抗體可變結構域)及「駱駝化」抗體可變結構域)係適用的。在一些態樣中，基於T細胞受體(TCR)之識別結構域(例如單鏈TCR (scTv，含有V.α.V.β.之單鏈兩結構域TCR))亦係適用的。

本文所揭示之嵌合抗原受體亦可包括在抗原結合至抗原特異性細胞外結構域時向細胞(表現CAR)提供細胞內信號之細胞內結構域。在一些態樣中，CAR之細胞內信號傳導結構域負責活化其中表現嵌合受體之T細胞之至少一種效應功能。

術語「細胞內結構域」係指在抗原與細胞外結構域結合時轉導效應功能信號且引導T細胞執行特殊功能之CAR部分。適宜細胞內結構域之非限制性實例包括T細胞受體之ζ鏈或其任一同源物(例如η、δ、γ或ε)、MB 1鏈、829、Fc RIII、Fc RI及信號傳導分子之組合，例如CD3.ζ.以及CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40及其組合以及其他相似分子及片段。可使用活化蛋白家族之其他成員之細胞內信號傳導部分，例如FcγRIII及FcεRI。儘管通常將採用整個細胞內結構域，但在許多情形下不必使用整個細胞內多肽。就可使用細胞內信號傳導結構域之截短部分而言，該截短部分可用於替代完整鏈，只要其仍轉導效應功能信號即可。因此，術語細胞內結構域意欲包括細胞內結構域之足以轉導效應功能信號之任何截短部分。通常，抗原特異性細胞外結構域藉由跨膜結構域連接至嵌合抗原受體之細胞內結構域。跨膜結構域橫跨細胞膜，將CAR錨定至T細胞表面，且將細胞外結構域連接至細胞內信號傳導結構域，由此影響CAR在T細胞表面上之表現。嵌合抗原受體亦可進一步包含一或多個共刺激結構域及/或一或多個間隔體。共刺激結構域衍生自共刺激蛋白之細胞內信號傳導結構域，其增強活體內細胞介素產生、增殖、細胞毒性及/或持久性。

「肽鉸鏈」或「間隔體」將抗原特異性細胞外結構域連接至跨膜結構域。跨膜結構域融合至共刺激結構域，視情況地共刺激結構域融合至第二共刺激結構域，且共刺激結構域融合至信號傳導結構域，但不限於CD3ζ。舉例而言，將間隔體結構域納入抗原特異性細胞外結構域與跨膜結構域之間及多個scFv之間(在串聯CAR之情形下)可影響抗原結合結構域之撓性且由此影響CAR功能。適宜跨膜結構域、共刺激結構域及間隔體為此項技術中已知。

如本文所用之術語「ug」及「uM」可分別與「μg」及「μΜ」互換使用。

如本文所用之術語「基因編輯」係指改變存在於細胞基因體中之遺傳資訊之過程。此基因編輯可藉由操縱基因體DNA來實施，從而修飾遺傳資訊。在一些態樣中，該基因編輯可影響已經編輯之DNA之表現。在一些態樣中，該基因編輯不會影響已經編輯之DNA之表現。在一些態樣中，本文所揭示經修飾細胞之基因編輯可使用本文所述之基因編輯工具來進行。基因編輯工具之非限制性實例包括RNA干擾分子(例如shRNA、siRNA、miRNA)、反義寡核苷酸、CRISPR、鋅指核酸酶(ZFN)、轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)、大範圍核酸酶、限制性核酸內切酶或其任一組合。

如本文所用之術語「核酸酶」係指對DNA裂解具有催化活性之酶。可在本文所揭示之方法及組合物中使用將切口或雙股斷裂誘導至期望識別位點中之任一核酸酶劑。可採用天然或原生核酸酶劑，只要核酸酶劑在期望識別位點中誘導切口或雙股斷裂即可。替代地，可採用經修飾或經改造之核酸酶劑。「經改造之核酸酶劑」包含自其原生形式改造(經修飾或衍生)以在期望識別位點中特異性識別且誘導切口或雙股斷裂之核酸酶。因此，經改造之核酸酶劑可衍生自原生、天然核酸酶劑或其可人工產生或合成。核酸酶劑之修飾可少至蛋白質裂解劑中之一個胺基酸或核酸裂解劑中之一個核苷酸。在一些態樣中，經改造之核酸酶在識別位點中誘導切口或雙股斷裂，其中識別位點並非將由原生(未經改造或未經修飾)核酸酶劑識別之序列。在識別位點或其他DNA中產生切口或雙股斷裂在本文中可稱為「切割」或「裂解」識別位點或其他DNA。

如本文所用之「編碼序列」或「編碼核酸」意指包含編碼蛋白質(例如Cas9蛋白、CAR或TCR)之核苷酸序列之核酸(RNA或DNA分子)，或多核苷酸(例如gRNA)。編碼序列可進一步包括可操作連接至包括啟動子及多腺苷酸化信號之調控元件的起始及終止信號，其能夠引導投與核酸之個體或哺乳動物之細胞中之表現。編碼序列可經密碼子最佳化。

如本文所用之「補體」或「互補」係指核酸分子之核苷酸或核苷酸類似物之間的沃森-克里克(Watson-Crick)鹼基配對(例如A-T/U及C-G)或Hoogsteen鹼基配對。「互補性」係指兩條核酸序列之間共享之性質，使得當其彼此反向平行比對時，每一位置之核苷酸鹼基將係互補的。

本文所述之各個態樣進一步詳細闡述於以下子部分中。 II. 經修飾免疫細胞

由於腫瘤微環境中腫瘤浸潤淋巴球(TIL)之耗竭，實體腫瘤之細胞免疫療法之成功受到限制。持續暴露於腫瘤抗原導致T細胞耗竭，其特徵在於細胞毒性及細胞介素產生之進行性損失以及增加的抑制性標記物(例如PD-1)表現(Wherry等人， Nat. Rev. Immunol. 15, 486-499 (2015))。另外，耗竭的TIL上調且替代地使用轉錄因子，具體而言NR4A家族(Chen等人， Nature567, 530-534 (2019))。

本揭示案提供經修飾免疫細胞，即藉由例如基因編輯修飾之細胞，其表現降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白，且過表現c-Jun蛋白，且因此展示增強的功能(例如持續效應功能)及/或減少的耗竭(例如過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之NR4A基因及/或蛋白之T細胞，例如過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之NR4A基因及/或蛋白之CAR或TCR T細胞)。

在一些態樣中，本揭示案提供經修飾免疫細胞之群體，該等經修飾免疫細胞表現(i)降低的表現水準之核受體亞家族4組A基因及/或蛋白，其選自由以下組成之群：NR4A成員1 (NR4A1)基因及/或蛋白、NR4A成員2 (NR4A2)基因及/或蛋白、及NR4A成員3 (NR4A3)基因及/或蛋白，及(ii)增加的表現水準之c-Jun蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白、 NR4A2基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白之任何組合。 II.A. NR4A3

核受體亞家族4組A成員3，通常縮寫為「NR4A3」，且亦稱為MINOR、CSMF、NOR1、CHN、促分裂原誘導之核孤兒受體、神經元源性孤兒受體、核激素受體NOR-1、「軟骨肉瘤，骨外黏液樣，融合至EWS」及TEC，其係在人類中由 NR4A3基因編碼之蛋白質。孤兒核受體之NR4A家族包括NR4A1 (Nur77)、NR4A2 (Nurr1)及NR4A3 (Nor-1)。其作為轉錄因子以配位體非依賴性方式起作用。其功能主要藉由多種細胞外信號快速且瞬時誘導其表現來控制，且因此視為立即早期基因。NR4A參與多種細胞功能，包括細胞凋亡、存活、增殖、血管生成、發炎、DNA修復及脂肪酸代謝。

NR4A3基因位於染色體9上(鹼基99,821,885至99,866,893；45,039個鹼基；正股取向；NCBI參考序列：NC_000009.12)。NR4A3係以細胞及反應元件(靶)特異性方式結合至啟動子區域中之調控元件之轉錄活化劑。NR4A3藉由作為單體結合至NR4A1反應元件(NBRE) 5'-AAAAGGTCA-3' (SEQ ID NO: 100)位點及作為同二聚體結合至其經調控靶基因(根據相似性)之啟動子中之Nur反應元件(NurRE)位點來誘導基因表現，且在許多不同細胞類型之增殖、存活及分化之調控方面起作用。

NR4A3蛋白具有藉由選擇式剪接產生之三種同種型。序列顯示於下表1中。

在一些態樣中，可用於本揭示案之細胞組合物包含經修飾免疫細胞之群體，該等經修飾免疫細胞(i)過表現c-Jun，例如重組產生之c-Jun蛋白，(ii)具有降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，及(iii)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，且另外具有 NR4A1及 NR4A2基因以及NR4A1及NR4A2蛋白之內源表現。在一些態樣中，該等經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun及降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白)亦具有降低水準之以下中之一者：(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白；(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白；或(iii) (i)及(ii)二者。因此，除非另有指示，否則具有降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之經修飾免疫細胞可具有NR4A家族之其他成員之內源或減少的表現。如本文所用之術語「 NR4A3基因」係指任何轉錄物、基因體DNA、前mRNA或mRNA。如本文所用之術語「NR4A3蛋白」係指上文所揭示之同種型α、同種型β或同種型3以及其變異體及突變體。如本文所用之術語NR4A3蛋白亦涵蓋具有野生型NR4A3蛋白之至少一種功能之本文所揭示任一同種型之任何片段或變異體。

如本文所用之術語「降低的水準」、「較低水準」、「降低的表現水準」或「較低水準」(或其變化形式)係指物理水準之降低(例如因基因體之編輯所致較少之基因序列，或因蛋白質表現減少所致較少之蛋白質)及功能之降低。舉例而言， NR4A3基因水準之降低可指基因功能之降低，例如由於引入終止密碼子或框移之突變之引入、將改變轉錄之表觀遺傳修飾或啟動子基因或調控NR4A3表現之另一基因上之突變或其他變化。在一些態樣中，與參考細胞相比，經修飾細胞中 NR4A3基因水準之降低係指能夠編碼功能性NR4A3蛋白(例如野生型NR4A3蛋白)之基因體DNA、前mRNA及/或mRNA之量(例如濃度)減小。類似地，NR4A3蛋白之減少可指引起功能性NR4A3蛋白(例如野生型NR4A3蛋白)表現之變化，包括(但不限於)導致功能損失(部分或完全)之變化(例如突變或轉譯後修飾)，或結合至NR4A3之功能位點從而改變例如其與其他細胞信號傳導配偶體之相互作用的分子之活性。

NR4A3基因水準(例如整個基因或其部分之存在/不存在或基因功能)可藉由此項技術中已知之多種方法來量測。NR4A3蛋白水準(例如NR4A3蛋白或其片段之存在/不存在或量化或蛋白質功能)可藉由此項技術中已知之多種方法來量測。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞)之群體中 NR4A3基因之表現水準及/或NR4A3蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。在一些態樣中，免疫細胞之群體(例如T細胞，CAR表現細胞或TCR表現細胞之群體)中 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之表現在修飾後被完全抑制。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A3基因之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中 NR4A3基因之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之NR4A3蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中NR4A3蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A3基因及NR4A3蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中 NR4A3基因及NR4A3蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，本文所揭示之經修飾免疫細胞(即表現降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之細胞)包含淋巴球、嗜中性球、單核球、巨噬細胞、樹突細胞或其組合。在一些態樣中，本文所揭示之經修飾免疫細胞(即表現降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之細胞群體)包含淋巴球。在一些態樣中，淋巴球係T細胞，例如CD8+ T細胞及/或CD4+ T細胞。如本文所用之「經修飾免疫細胞」包括最初經修飾免疫細胞之子代細胞，其中子代細胞亦表現降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。 II.B. NR4A2

核受體亞家族4組A成員2，通常縮寫為NR4A2，亦稱為NOT、RNR1、HZF-3、NURR1、TINUR，其係在人類中由 NR4A2基因編碼之蛋白質。 NR4A2基因位於染色體2上(鹼基156,324,432至156,332,724，NCBI參考序列：NC_000002.12)。

NR4A2蛋白具有藉由選擇式剪接產生之兩種同種型。序列顯示於下表2中。

在一些態樣中，可用於本揭示案之細胞組合物包含經修飾免疫細胞之群體，該等經修飾免疫細胞(i)過表現c-Jun，例如重組產生之c-Jun蛋白，(ii)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，及(iii)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，且另外具有 NR4A1及 NR4A3基因以及NR4A1及NR4A3蛋白之內源表現。在一些態樣中，該等經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun及降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白)亦具有降低水準之以下中之一者：(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白；(ii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白；或(iii) (i)及(ii)二者。因此，除非另有指示，否則具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白之經修飾免疫細胞可具有NR4A家族之其他成員之內源或減少的表現。如本文所用之術語「 NR4A2基因」係指任何轉錄物、基因體DNA、前mRNA或mRNA。如本文所用之術語「NR4A2蛋白」係指上文所揭示之同種型1或2以及其變異體及突變體。如本文所用之術語NR4A2蛋白亦涵蓋具有野生型NR4A2蛋白之至少一種功能之本文所揭示任一同種型之任何片段或變異體。

如本文所用之術語「降低的水準」、「較低水準」、「降低的表現水準」或「較低水準」(或其變化形式)係指物理水準之降低(例如因基因體之編輯所致較少之基因序列，或因蛋白質表現減少所致較少之蛋白質)及功能之降低。舉例而言， NR4A2基因水準之降低可指基因功能之降低，例如由於引入終止密碼子或框移之突變之引入、將改變轉錄之表觀遺傳修飾或啟動子基因或調控NR4A2表現之另一基因上之突變或其他變化。在一些態樣中，與參考細胞相比，經修飾細胞中 NR4A2基因水準之降低係指能夠編碼功能性NR4A2蛋白(例如野生型NR4A2蛋白)之基因體DNA、前mRNA及/或mRNA之量(例如濃度)減小。類似地，NR4A2蛋白之減少可指引起功能性NR4A2蛋白(例如野生型NR4A2蛋白)表現之變化，包括(但不限於)導致功能損失(部分或完全)之變化(例如突變或轉譯後修飾)，或結合至NR4A2之功能位點從而改變例如其與其他細胞信號傳導配偶體之相互作用的分子之活性。

NR4A2基因水準(例如整個基因或其部分之存在/不存在或基因功能)可藉由此項技術中已知之多種方法來量測。NR4A2蛋白水準(例如NR4A2蛋白或其片段之存在/不存在或量化或蛋白質功能)可藉由此項技術中已知之多種方法來量測。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞)之群體中 NR4A2基因之表現水準及/或NR4A2蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。在一些態樣中，免疫細胞之群體(例如CAR表現細胞或TCR表現細胞之群體)中 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白之表現在修飾後被完全抑制。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A2基因之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中 NR4A2基因之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之NR4A2蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中NR4A2蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A2基因及NR4A2蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中 NR4A2基因及NR4A2蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，本文所揭示之經修飾免疫細胞(即表現降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白之細胞)包含淋巴球、嗜中性球、單核球、巨噬細胞、樹突細胞或其組合。在一些態樣中，本文所揭示之經修飾免疫細胞(即表現降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白之細胞群體)包含淋巴球。在一些態樣中，淋巴球係T細胞，例如CD8+ T細胞及/或CD4+ T細胞。如本文所用之「經修飾免疫細胞」包括最初經修飾免疫細胞之子代細胞，其中子代細胞亦表現降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。 II.C. NR4A1

核受體亞家族4組A成員1，通常縮寫為NR4A1，且亦稱為HMR、N10、TR3、NP10、GFRP1、NAK-1、NGFIB及NUR77，其係在人類中由 NR4A1基因編碼之蛋白質。 NR4A1基因位於染色體12上(鹼基52022832至52059507；NCBI參考序列NC_000012.12)。

NR4A1蛋白具有藉由選擇式剪接產生之三種同種型。序列顯示於下表3中。

在一些態樣中，可用於本揭示案之細胞組合物包含經修飾免疫細胞之群體，該等經修飾免疫細胞(i)過表現c-Jun，例如重組產生之c-Jun蛋白，(ii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，及(iii)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，且另外具有 NR4A2及 NR4A3基因以及NR4A2及NR4A3蛋白之內源表現。在一些態樣中，該等經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun及降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白)亦具有降低水準之以下中之一者：(i) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白；(ii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白；或(iii) (i)及(ii)二者。因此，除非另有指示，否則具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白之經修飾免疫細胞可具有NR4A家族之其他成員之內源或減少的表現。如本文所用之術語「 NR4A1基因」係指任何轉錄物、基因體DNA、前mRNA或mRNA。如本文所用之術語「NR4A1蛋白」係指上文所揭示之同種型1、同種型2或同種型3以及其變異體及突變體。如本文所用之術語NR4A1蛋白亦涵蓋具有野生型NR4A1蛋白之至少一種功能之本文所揭示任一同種型之任何片段或變異體。

如本文所用之術語「降低的水準」、「較低水準」、「降低的表現水準」或「較低水準」(或其變化形式)係指物理水準之降低(例如因基因體之編輯所致較少之基因序列，或因蛋白質表現減少所致較少之蛋白質)及功能之降低。舉例而言， NR4A1基因水準之降低可指基因功能之降低，例如由於引入終止密碼子或框移之突變之引入、將改變轉錄之表觀遺傳修飾或啟動子基因或調控NR4A1表現之另一基因上之突變或其他變化。在一些態樣中，與參考細胞相比，經修飾細胞中 NR4A1基因水準之降低係指能夠編碼功能性NR4A1蛋白(例如野生型NR4A1蛋白)之基因體DNA、前mRNA及/或mRNA之量(例如濃度)減小。類似地，NR4A1蛋白之減少可指引起功能性NR4A1蛋白(例如野生型NR4A1蛋白)表現之變化，包括(但不限於)導致功能損失(部分或完全)之變化(例如突變或轉譯後修飾)，或結合至NR4A1之功能位點從而改變例如其與其他細胞信號傳導配偶體之相互作用的分子之活性。

NR4A1基因水準(例如整個基因或其部分之存在/不存在或基因功能)可藉由此項技術中已知之多種方法來量測。NR4A1蛋白水準(例如NR4A1蛋白或其片段之存在/不存在或量化或蛋白質功能)可藉由此項技術中已知之多種方法來量測。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞)之群體中 NR4A1基因之表現水準及/或NR4A1蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。在一些態樣中，免疫細胞之群體(例如CAR表現細胞或TCR表現細胞之群體)中 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白之表現在修飾後被完全抑制。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A1基因之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中 NR4A1基因之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之NR4A1蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中NR4A1蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，與參考免疫細胞群體(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A1基因及NR4A1蛋白之相應細胞)相比，免疫細胞之群體中 NR4A1基因及NR4A1蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

在一些態樣中，本文所揭示之經修飾免疫細胞(即表現降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白之細胞)包含淋巴球、嗜中性球、單核球、巨噬細胞、樹突細胞或其組合。在一些態樣中，本文所揭示之經修飾免疫細胞(即表現降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白之細胞群體)包含淋巴球。在一些態樣中，淋巴球係T細胞，例如CD8+ T細胞及/或CD4+ T細胞。如本文所用之「經修飾免疫細胞」包括最初經修飾免疫細胞之子代細胞，其中子代細胞亦表現降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。 II.D. c-Jun 蛋白

除如上文所述降低水準之 NR4A基因及/或蛋白以外，本揭示案之經修飾免疫細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)亦經修飾以具有增加水準之c-Jun蛋白。如本文所展示，在一些態樣中，免疫細胞經修飾以包含編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列，以與參考免疫細胞(例如未經修飾以包含編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列之相應免疫細胞)相比增加c-Jun蛋白之水準。在一些態樣中，c-Jun蛋白可由多順反子多核苷酸編碼，其中多核苷酸編碼多種蛋白質，包括c-Jun及配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)及(在一些態樣中)一或多種其他蛋白質(例如安全開關蛋白，例如EGFRt)。在一些態樣中，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白之經修飾免疫細胞包含編碼嵌合多肽之多核苷酸，該嵌合多肽包含c-Jun多肽及配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)。在一些態樣中，該嵌合多肽可包括可裂解連接體，使得c-Jun多肽及配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)在轉譯後裂解成單獨功能蛋白。在一些態樣中，本文所提供之經修飾免疫細胞(即具有降低水準之NR4A家族之一或多個成員之基因及/或蛋白)能夠天然表現c-Jun蛋白(例如不用編碼c-Jun蛋白之外源核苷酸序列修飾細胞)。在一些態樣中，該等免疫細胞已用轉錄活化劑(例如基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化劑，例如CRISPRa)修飾，使得內源c-Jun蛋白之表現與參考細胞(例如未用轉錄活化劑修飾之相應細胞)相比有所增加。

如本文所用之術語「轉錄活化劑」係指增加基因或基因組之轉錄(例如，藉由結合至核酸序列之增強子或啟動子近端元件，且由此誘導其轉錄)之蛋白質。可與本揭示案一起使用之該等轉錄活化劑之非限制性實例包括：基於轉錄活化劑樣效應物(TALE)之轉錄活化劑、基於鋅指蛋白(ZFP)之轉錄活化劑、基於成簇規則間隔之短迴文重複(CRISPR)/CRISPR相關蛋白(Cas)系統之轉錄活化劑或其組合。參見例如Kabadi等人， Methods69(2): 188-197 (2014年9月)，其全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，本文所述之細胞已用基於CRISPR/Cas系統之轉錄活化劑(例如CRISPR活化(CRISPRa))修飾。參見例如Nissim等人， Molecular Cell54: 1-13 (2014年5月)，其全文皆以引用方式併入本文中。CRISPRa係一種類型之CRISPR工具，其包含使用缺乏核酸內切酶活性、但保留結合至其引導RNA及靶DNA核酸序列之能力的經修飾Cas蛋白。可與本揭示案一起使用之該等經修飾Cas蛋白之非限制性實例為此項技術中已知。參見例如Pandelakis等人， Cell Systems10(1): 1-14 (2020年1月)，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，經修飾Cas蛋白包含經修飾之Cas9蛋白(在此項技術中亦稱為「dCas9」)。在一些態樣中，經修飾Cas蛋白包含經修飾之Cas12a蛋白。在一些態樣中，可用於本揭示案之經修飾Cas蛋白結合至引導多核苷酸(例如小引導RNA) (「經修飾Cas-引導複合物」)，其中引導多核苷酸包含與編碼所關注蛋白質(例如c-Jun)之核酸序列區域互補之識別序列。在一些態樣中，引導多核苷酸包含與編碼所關注蛋白質之內源核酸序列之啟動子區域互補之識別序列。在一些態樣中，一或多種轉錄活化劑連接至經修飾Cas-引導複合物(例如經修飾Cas蛋白之N末端及/或C末端)，使得當將經修飾Cas-引導複合物引入細胞中時，一或多種轉錄活化劑可結合至核酸序列之調控元件(例如啟動子區域)，且由此誘導及/或增加經編碼蛋白質(例如c-Jun)之表現。在一些態樣中，一或多種轉錄活化劑可結合至內源基因之調控元件(例如啟動子區域)，且由此誘導及/或增加經編碼蛋白質(例如c-Jun)之表現。可使用之常見一般活化劑之非限制性說明性實例包括RNAP之ω次單元、VP16、VP64及p65。參見例如Kabadi及Gersbach, Methods69: 188-197 (2014)，其全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，一或多種轉錄抑制物(例如Kruppel相關盒結構域(KRAB))可連接至經修飾Cas-引導複合物(例如經修飾Cas蛋白之N末端及/或C末端)，使得當引入細胞中時，一或多種轉錄抑制物可抑制或減少基因(例如可干擾c-Jun表現之基因(例如Bach2))之轉錄。參見例如US20200030379A1及Yang等人， J Transl Med19:459 (2021)，其中之每一者之全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，可用於本揭示案之經修飾Cas蛋白可連接至一或多種轉錄活化劑及一或多種轉錄抑制物。

如熟習此項技術者應明瞭，在一些態樣中，本文所述之細胞已使用多種方法之組合進行修飾。例如，在一些態樣中，細胞已經修飾以具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)且包含(i)編碼一或多種蛋白質(例如配位體結合蛋白，例如CAR或TCR)之外源核苷酸序列，及(ii)增加內源蛋白(例如c-Jun)之表現之外源轉錄活化劑(例如CRISPRa)。在一些態樣中，細胞已經修飾以具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)且包含(i)編碼第一種蛋白質(例如配位體結合蛋白)之外源核苷酸序列，及(ii)編碼第二種蛋白質(例如c-Jun蛋白)之外源核苷酸序列。如本文所述，在一些態樣中，編碼第一種及第二種蛋白質之外源核苷酸序列可為單一多順反子載體之一部分。

在一些態樣中，由於上文所述之修飾(例如引入外源引入之c-Jun核苷酸序列及/或轉錄活化劑)，經修飾細胞過表現，即表現高於不具該修飾之相應細胞(「參考細胞」)之水準(例如大至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%或大至少約1.5倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍或至少約10倍)之c-Jun蛋白。術語「表現增加水準[或量]之」、「過表現」或「增加……之表現」(及本文所用片語之類似形式)可互換使用。

c-Jun係屬於活化劑蛋白-1 (AP-1)家族之致癌轉錄因子。其與多種蛋白質(例如c-Fos)相互作用以形成調節多種細胞信號傳導路徑(包括細胞增殖及腫瘤進展)之二聚體複合物。因此，已在某些癌症中觀察到增加的c-Jun表現，且業內對開發c-Jun拮抗劑來治療該癌症很感興趣。參見例如Brennan, A.等人， J Exp Clin Cancer Res39(1): 184 (2020年9月)。

在人類中，c-Jun蛋白係由 JUN基因編碼，該基因位於染色體1上(GenBank登錄號NC_000001.11之核苷酸58,780,791至58,784,047，負股取向)。 JUN基因及其編碼蛋白質之同義詞為業內已知且包括「Jun原致癌基因、AP-1轉錄因子次單元」、「v-Jun禽肉瘤病毒17致癌基因同源物」、「轉錄因子AP-1」、「Jun致癌基因」、「AP-1」、「Jun活化結構域結合蛋白」、「p39」及「增強子結合蛋白AP1」。野生型人類c-Jun蛋白序列之長度為331個胺基酸。野生型人類c-Jun之胺基酸及核酸序列分別提供於表4及表5中。

II.D.1. 密碼子最佳化

如本文所述，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白之經修飾免疫細胞包含含有編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列之多核苷酸，其中核苷酸序列已經密碼子最佳化。因此，在一些態樣中，本文所述之編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列(在本文中亦稱為「c-Jun核苷酸序列」)不同於野生型c-Jun核苷酸序列(例如SEQ ID NO: 6)。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 7至16中所述之任一核酸序列具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7至16中之任一者中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，本文所述之編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列具有至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 9中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列與SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少約80%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 14中所述之核酸序列具有至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 14中所述之核酸序列具有至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 14中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列具有至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列。

在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列具有至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列與SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列一致性。在一些態樣中，核苷酸序列包含SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列。

本文所揭示之c-Jun核苷酸序列可使用此項技術中已知之任何方法進行密碼子最佳化。例如，在一些態樣中，本文所揭示c-Jun核苷酸序列之密碼子已經最佳化以與野生型核苷酸序列(例如SEQ ID NO: 6)相比改變(例如增加或減小)以下參數中之一或多者：(i)密碼子適應指數(即密碼子使用偏好性)；(ii)鳥嘌呤-胞嘧啶(GC)核苷酸含量；(iii) mRNA二級結構及不穩定模體；(iv)重複序列(例如正向重複、反向重複、dyad重複)；(v)限制酶識別位點；或(vi)其組合。

不受限於任一理論，在一些態樣中，該密碼子最佳化可增加由核苷酸序列編碼之蛋白質之表現。因此，在一些態樣中，與用野生型核苷酸序列(例如SEQ ID NO: 6)轉染之細胞中之相應表現相比，本揭示案之經密碼子最佳化之c-Jun核苷酸序列在轉染、轉導或以其他方式引入人類細胞(例如人類T細胞)中時能夠增加經編碼c-Jun轉錄因子之表現。在一些態樣中，與用野生型核苷酸序列(例如SEQ ID NO: 6)轉染、轉導或以其他方式遺傳修飾以進行表現之細胞中之相應表現相比，c-Jun轉錄因子之表現增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)之經修飾免疫細胞中增加的c-Jun轉錄因子表現可改良及/或增強經轉染細胞(例如免疫細胞，例如T細胞，例如CD4 ⁺及/或CD8 ⁺T細胞)之一或多種性質。該等性質之非限制性實例包括：耗竭抗性(例如，如藉由減少的耗竭標記物(例如PD-1、CD39、TIM-3及/或LAG-3)表現；增加的存活；及/或增加的細胞介素產生所指示)、增加的持久性/存活、增加的擴增/增殖、改良之效應功能(例如抗原刺激時之細胞介素產生、表現靶抗原之細胞之溶解或二者)或其組合。

可用於量測耗竭、細胞表型、持久性、細胞毒性及/或殺傷、增殖、細胞介素產生/釋放及基因表現概況之分析為此項技術中已知，且包括例如流式細胞術、細胞內細胞介素染色(ICS)、INCUCYTE ^®免疫細胞殺傷分析、中尺度發現(Meso Scale Discovery，MSD)或類似分析、持續抗原刺激分析、批量及單細胞RNAeq (參見例如Fron Genet. 2020; 11:220；2019 Bioinformatics 35:i436-445；2019 Annual Review of Biomed. Data Sci. 2:139-173)、細胞毒性/殺傷分析、ELISA、西方墨點(western blot)以及其他標準分子及細胞生物學方法，例如本文所述之標準分子及細胞生物學方法或如例如Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 1999-2021)或別處所述之標準分子及細胞生物學方法。

在一些態樣中，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白之經修飾免疫細胞中增加的c-Jun轉錄因子表現會增加細胞對耗竭之抗性。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之以下中之每一者： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，耗竭抗性增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)之經修飾免疫細胞中c-Jun轉錄因子之過表現可減少耗竭細胞之耗竭。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之以下中之每一者： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應耗竭細胞)相比，耗竭在經修飾免疫細胞中減少至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍。

在一些態樣中，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)之經修飾免疫細胞中增加的c-Jun轉錄因子表現可增加細胞之持久性/存活，例如當活體內投與個體時。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之以下中之每一者： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，細胞之持久性/存活增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)之經修飾免疫細胞中增加的c-Jun轉錄因子表現可增加細胞之擴增/增殖，例如在抗原刺激時。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之以下中之每一者： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，細胞之擴增/增殖增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)之經修飾免疫細胞中增加的c-Jun轉錄因子表現可增加細胞之效應功能，例如因應持續抗原刺激之增加的細胞介素產生、顆粒酶釋放及/或細胞毒性。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾免疫細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之以下中之每一者： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，細胞之效應功能(例如因應持續抗原刺激)增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更大。

不受限於任一理論，經修飾以表現降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)之T細胞中c-Jun之過表現藉由例如減輕或防止T細胞功能障礙(例如T細胞耗竭)來幫助維持細胞之活性狀態。本文所提供之c-Jun核苷酸序列(例如本文所述之經密碼子最佳化之c-Jun)可用於改造已經修飾以具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)之免疫細胞，例如T細胞，其隨後展現針對期望靶細胞(例如內源TCR之靶或如本文所述嵌合結合蛋白之靶)之持續強效細胞毒性。與不會過表現c-Jun之T細胞相比，過表現本文所揭示之經密碼子最佳化之c-Jun之經改造T細胞展示極少的T細胞耗竭跡象。在一些態樣中，本文所提供之經修飾T細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白。在一些態樣中，本文所提供之經修飾T細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中，本文所提供之經修飾T細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，經修飾T細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，經修飾T細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾T細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，經修飾T細胞(即過表現c-Jun)具有降低水準之以下中之每一者： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。

如本文所述，在一些態樣中，本揭示案包括經修飾免疫細胞，其過表現c-Jun且表現降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，同時具有內源水準之 NR4A1及 NR4A2基因以及NR4A1及NR4A2蛋白及配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)。在一些態樣中，本揭示案包括經修飾免疫細胞，其過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，同時具有內源水準之 NR4A1及 NR4A3基因以及NR4A1及NR4A3蛋白及配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)。在一些態樣中，本揭示案包括經修飾免疫細胞，其過表現c-Jun且表現降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，同時具有內源水準之 NR4A2及 NR4A3基因以及NR4A2及NR4A3蛋白及配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)。如本文所述，在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有降低水準之NR4A家族之兩個成員。舉例而言，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞已經修飾以(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中，免疫細胞已經修飾以(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中，免疫細胞已經修飾以(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。如本文所述，在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞具有降低水準之NR4A家族之所有成員。因此，在一些態樣中，本文所提供之免疫細胞已經修飾以(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。

替代地，可用於本揭示案之c-Jun蛋白可為突變體人類c-Jun蛋白，只要突變體c-Jun蛋白不會影響突變體拯救功能障礙(耗竭) T細胞之能力即可。在一些態樣中，突變體c-Jun蛋白包含與野生型c-Jun蛋白之C末端胺基酸殘基(例如C末端50個、75個、100個、150個、200個或250個或更多個殘基)、C末端部分(例如四分之一、三分之一或一半)或C末端結構域(例如ε、bZIP及其胺基酸C末端)至少約70% (例如至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%)之序列一致性。在一些態樣中，使野生型c-Jun蛋白之N末端胺基酸殘基(例如N末端50個、75個、100個或150個或更多個)、N末端部分(例如四分之一、三分之一或一半)或N末端結構域(例如δ、反式活化(transactivation)結構域及其胺基酸N末端)缺失、突變或以其他方式失活。

在一些態樣中，c-Jun蛋白在其反式活化結構域及/或其δ結構域中包含失活突變(例如取代、缺失或插入)。在一些態樣中，c-Jun蛋白包含S63A及S73A突變中之一或兩者。在一些態樣中，與野生型人類c-Jun相比，c-Jun蛋白在殘基2與102之間或在殘基30與50之間具有缺失。

在一些態樣中，可用於本發明經修飾免疫細胞之c-Jun多肽包含截短c-Jun多肽，如WO2019/118902中所揭示，該專利之全文皆以引用方式明確併入本文中。

在一些態樣中，當在細胞中過表現時，過表現之c-Jun多肽以及減少的NR4A基因及/或蛋白表現能夠防止及/或減少細胞耗竭(例如具有減少的 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白表現且具有 NR4A1及 NR4A2基因及/或蛋白之內源表現的表現CAR或TCR之免疫細胞(例如抗ROR1 CAR T細胞)、具有減少的 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白表現且具有 NR4A1及 NR4A3基因及/或蛋白之內源表現的表現CAR或TCR之免疫細胞(例如抗ROR1 CAR T細胞)、或具有減少的 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白表現且具有 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白之內源表現的表現CAR或TCR之免疫細胞(例如抗ROR1 CAR T細胞))。不希望受限於任一理論，在一些態樣中，具有減少的 NR4A基因及/或蛋白表現之過表現c-Jun蛋白之細胞具有耗竭抗性，由此解決授受性細胞療法(例如CAR T細胞療法)進展之主要障礙。在一些態樣中，與參考細胞(例如不會過表現c-Jun蛋白且具有 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白之內源表現之相應細胞)相比，耗竭抗性增加至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約200倍、至少約300倍、至少約400倍、至少約500倍、至少約750倍或至少約1,000倍或更大。

在一些態樣中，免疫細胞(例如T細胞)中c-Jun蛋白之過表現以及減少的 NR4A基因(例如 NR4A1、 NR4A2或 NR4A3)及/或蛋白表現藉由例如減輕或防止T細胞功能障礙(例如T細胞耗竭)來幫助維持細胞之活性狀態。本發明經改造之免疫細胞(例如T細胞)展現針對帶有抗原之細胞(例如帶有ROR1之腫瘤細胞)之持續強效細胞毒性。與不會過表現c-Jun蛋白且不具減少的 NR4A(例如 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現之T細胞相比，本發明經改造之T細胞展示極少的T細胞耗竭跡象及增加的效應細胞跡象，該等效應細胞可持續存在且作用時間更長。

在一些態樣中，本文所提供之免疫細胞(例如表現CAR或TCR，例如本文所述之抗ROR1 CAR改造細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有減少的 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白表現)具有減少的一或多種耗竭標記物(包括但不限於TIGIT、PD-1及CD39)表現。耗竭標記物之表現可在批量群體中藉由流式細胞術、使用批量RNASeq轉錄體分析來量測，或在一些態樣中，個別細胞轉錄體分析可使用單細胞RNASeq來實施。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經改造以過表現c-Jun蛋白且表現內源水準之 NR4A1 、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白的相應細胞)相比，本文所述之免疫細胞(例如表現CAR或TCR，例如抗ROR1 CAR改造T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有減少的 NR4A(例如 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現)中一或多種耗竭標記物之表現降低至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍或至少約100倍或更大。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經改造以過表現c-Jun蛋白或具有 NR4A1 、 NR4A2及 NR4A3蛋白之內源表現之相應細胞)相比，本文所述之免疫細胞(例如表現CAR或TCR，例如抗ROR1 CAR改造T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有減少的 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白表現)中TIGIT之表現降低至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍或至少約100倍或更大。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經改造以過表現c-Jun蛋白且具有內源 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白表現之相應細胞)相比，本文所述之免疫細胞(例如表現CAR或TCR，例如抗ROR1 CAR改造T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有減少的 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白表現)中PD-1之表現降低至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍或至少約100倍或更大。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經改造以過表現c-Jun蛋白且具有 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白之內源表現之相應細胞)相比，本文所述之免疫細胞(例如表現CAR或TCR，例如抗ROR1 CAR改造T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有減少的 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白表現)中CD39之表現降低至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3.0倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，在抗原刺激後，與不會過表現c-Jun蛋白且不具降低水準之 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白的相應細胞之對照群體相比，本文所述免疫細胞之群體(例如表現CAR或TCR，例如經改造之抗ROR1 CAR T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有減少的 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白表現)分泌至少約5倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍、至少約50倍、至少約55倍、至少約60倍、至少約65倍、至少約70倍、至少約75倍、至少約80倍、至少約85倍、至少約90倍、至少約95倍、至少約100倍、至少約125倍或至少約150倍之IL-2、IFN-γ及/或TNF-α。在一些態樣中，在持續抗原刺激之第0天及/或第14天在1:1、1:5、1:10及/或1:20 E:T比率下，與不會過表現c-Jun蛋白且不具降低水準之 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白的相應細胞之對照群體相比，本文所述免疫細胞之群體(例如表現CAR或TCR，例如經改造之抗ROR1 CAR T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有降低水準之 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白)表現至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約4.5倍、至少約5倍、至少約5.5倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更多之IL-2、IFN-γ及/或TNF-α。細胞介素分泌可使用此項技術中已知之方法、例如藉由ELISA或MSD分析來量測。

在一些態樣中，與不會過表現c-Jun蛋白且不具降低水準之 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白的相應細胞之對照群體相比，本文所述免疫細胞之群體(例如表現CAR或TCR，例如經改造之抗ROR1 CAR T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有降低水準之 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白)展示至少約2倍、至少約4倍、至少約6倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約150倍、至少約200倍或至少約250倍或更高之增強的殺傷效率，例如如藉由曲線下面積(AUC)所量化。

在一些態樣中，與不會過表現c-Jun蛋白且不具降低水準之 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白的相應細胞之對照群體相比，本文所述免疫細胞之群體(例如表現CAR或TCR，例如經改造之抗ROR1 CAR T細胞，且過表現c-Jun蛋白並具有降低水準之 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白)展示至少相等或至少約1.5倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約75倍、至少約100倍、至少約125倍、至少約150倍、至少約200倍、至少約225倍、至少約250倍、至少約300倍、至少約400倍或至少約500倍或更大之因應抗原之增強的增殖。抗原誘導之增殖可使用此項技術中已知之增殖分析(例如本文所述之增殖分析)來測試。

可用於量測本文所述細胞(例如抗ROR1 CAR T細胞)之一或多種性質(例如耗竭、細胞表型、持久性、細胞毒性及/或殺傷、增殖、細胞介素釋放及基因表現概況)之分析為此項技術中已知，且包括例如流式細胞術、細胞內細胞介素染色(ICS)、IncuCyte免疫細胞殺傷分析、中尺度發現(MSD)或類似分析、持續抗原刺激分析、依序抗原刺激分析(類似於持續抗原刺激分析，但每輪再刺激不會重設E:T細胞比率)、批量及單細胞RNAeq (參見例如Fron Genet. 2020; 11:220；2019 Bioinformatics 35:i436-445；2019 Annual Review of Biomed. Data Sci. 2:139-173)、細胞毒性/殺傷分析、ELISA、西方墨點以及其他標準分子及細胞生物學方法，例如本文所述之標準分子及細胞生物學方法或如例如Current Protocols in Molecular Biology或Current Protocols in Immunology (John Wiley & Sons, Inc., 1999-2021)或別處所述之標準分子及細胞生物學方法。

在一些態樣中，免疫細胞之群體係純群體。在一些態樣中，純群體包含至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少99%之屬於同一免疫細胞類型之細胞(例如，99%之免疫細胞係淋巴球)。在一些態樣中，免疫細胞之群體包含一種、兩種、三種、四種或五種不同之細胞類型，例如，包含兩種細胞類型之免疫細胞之群體可包含淋巴球及樹突細胞。

在一些態樣中，本文所揭示經修飾免疫細胞之群體包含淋巴球、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，本文所揭示經修飾免疫細胞之群體包含淋巴球，其中淋巴球選自由以下組成之群：T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、淋巴介質活化殺手細胞、自然殺手(NK) T細胞及其任一組合。在一些特定態樣中，淋巴球係T細胞。在一些特定態樣中，淋巴球係NK細胞。

在一些態樣中，本文所揭示之經修飾免疫細胞係T細胞。在一些態樣中，T細胞包含CAR。在一些態樣中，可經製備以表現CAR之經修飾T細胞(CAR T細胞)係例如CD8 ⁺T細胞或CD4 ⁺T細胞。在一些態樣中，本文所揭示之CAR表現細胞係CAR T細胞，例如單CAR T細胞、基因體編輯之CAR T細胞、雙CAR T細胞或串聯CAR T細胞。在一些態樣中，本文所揭示之經修飾細胞係NK細胞。在一些態樣中，NK細胞包含CAR。在一些態樣中，CAR NK細胞係單CAR NK細胞、雙CAR NK細胞或串聯CAR NKT細胞。在一些態樣中，本揭示案之經修飾細胞包含T細胞及NK細胞。在一些態樣中，T細胞及NK細胞皆包含CAR。該等CAR T細胞及CAR NK細胞之實例提供於國際申請案第PCT/US2019/044195號中。在一些態樣中，T細胞、NK細胞或二者包含本文所述之其他配位體結合蛋白中之任一者。舉例而言，在一些態樣中，T細胞包含TCR，例如經改造之TCR。在一些態樣中，NK細胞包含TCR，例如經改造之TCR。

在一些態樣中，經修飾免疫細胞可為任一免疫細胞類型。在一些態樣中，細胞係經修飾用於任一授受性細胞轉移(ACT)療法(亦稱為授受性細胞療法)之免疫細胞。ACT療法可為自體療法或同種異體療法。在一些態樣中，ACT療法包括(但不限於) CAR T療法、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)療法、NK細胞療法或其任一組合。

在一些態樣中，經修飾免疫細胞係用於TIL療法之TIL。使用TIL作為授受性細胞轉移療法來治療癌症已研究二十多年，使用TIL授受性細胞療法來治療黑色素瘤。Rosenberg SA 等人(2011年7月)。 Clinical Cancer Research17 (13): 4550-7 (2011年7月)。在授受性T細胞轉移療法中，TIL係自手術切除之已切割成小片段之腫瘤或自腫瘤片段分離之單細胞懸浮液離體擴增。建立多種個別培養物，使其單獨生長且分析其特異性腫瘤識別。在幾周之進程內擴增TIL。然後在「快速擴增方案」(REP)中進一步擴增呈現最佳腫瘤反應性之所選TIL株，該快速擴增方案使用抗CD3活化，通常持續兩週之時段。生長於培養物中之TIL可在離體過程期間之任一時間修飾，以使得 NR4A1 、 NR4A2或 NR4A3基因及/或 NR4A1、 NR4A2或 NR4A3蛋白(包括其組合)之表現減少且c-Jun蛋白之表現增加。將最終REP後TIL輸注回患者中。該過程亦可涉及清除內源淋巴球之初步化學療法方案，以向授受轉移之TIL提供足以包圍腫瘤位點之入口。

如本文所述，本揭示案之免疫細胞(例如過表現c-Jun蛋白並具有降低水準之 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白)可包含配位體結合蛋白(在本文中亦稱為「嵌合結合蛋白」)。可用於本揭示案之配位體結合蛋白(例如嵌合結合蛋白)之非限制性實例包含嵌合抗原受體(CAR)、T細胞受體(TCR) (例如經改造之TCR)、嵌合抗體-T細胞受體(caTCR)、嵌合信號傳導受體(CSR)、T細胞受體模擬物(TCR模擬物)及其組合。

在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如T細胞)可包含特異性結合至抗原(例如腫瘤抗原)之嵌合抗原受體(CAR)。可與本揭示案一起使用之CAR之非限制性實例為此項技術中已知。參見例如US 2020/0172879 A1及US 2019/0183932 A1，其中之每一者之全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如T細胞)包含T細胞受體(TCR)，例如經改造之T細胞受體(亦稱為「基因轉殖TCR」)。T細胞受體係由2條不同之跨膜多肽鏈構成之異二聚體：α鏈及β鏈，其各自係由恆定區及可變區組成，該恆定區將鏈錨定於T細胞表面膜內，該可變區識別並結合至由MHC呈遞之抗原。TCR複合物與6條多肽締合形成2種異二聚體CD3γε及CD3δε及1種同二聚體CD3 ζ，其一起形成CD3複合物。T細胞受體改造之T細胞療法利用保持該等複合物特異性靶向由特定腫瘤細胞表現之抗原之T細胞修飾。如本文所用之術語「經改造之TCR」或「經改造之T細胞受體」係指經改造以期望親和力特異性結合至主要組織相容性複合物(MHC)/肽靶抗原之T細胞受體(TCR)，其經選擇、選殖及/或隨後引入T細胞群體中。

在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如T細胞)包含嵌合抗體-T細胞受體(caTCR)。如本文所用之「 嵌合抗體 -T 細胞受體」或「 caTCR」包含(i)特異性結合至所關注抗原之抗體部分，及(ii)能夠募集至少一種TCR相關之信號傳導分子之T細胞受體模組。在一些態樣中，抗體部分及T細胞受體模組融合在一起。在一些態樣中，嵌合結合蛋白包含嵌合信號傳導受體(CSR)。「 嵌合信號傳導受體」或「 CSR」包含特異性結合至靶配位體之配位體結合結構域及能夠將刺激信號提供至表現CSR之免疫細胞之共刺激信號傳導結構域。caTCR及CSR之非限制性實例進一步闡述於US 10,822,413 B2中，該專利之全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，本文所揭示之免疫細胞(例如T細胞)包含T細胞受體模擬物(TCR模擬物)。如本文所用之術語「 T 細胞受體模擬物」或「 TCR 模擬物」係指已經改造以識別腫瘤抗原之抗體(或其片段)，其中腫瘤抗原在HLA分子之背景下展示。如熟習此項技術者應明瞭，該等抗體可模擬TCR之特異性。TCR模擬物之非限制性實例提供於例如US 2009/0226474 A1及US 2019/0092876 A1中，該等專利中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，可在本文所揭示之經修飾細胞上表現之配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)特異性結合(即靶向)在腫瘤細胞(例如惡性B細胞、惡性T細胞或惡性漿細胞)上表現之一或多種抗原。

在一些態樣中，配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)特異性結合至(即靶向)選自由以下組成之群之抗原：CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-1 1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、鄰-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、天冬醯胺內肽酶、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺癌相關蛋白、生存素、端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體(例如包括KRAS、HRAS、NRAS突變體蛋白)、hTERT、肉瘤易位斷裂點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶反轉錄酶、RU1、RU2、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1、CD2、CD3ε、CD4、CD5、CD7、APRIL蛋白之細胞外部分及其任何組合。

在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如經修飾CAR或TCR改造細胞)可靶向主要類型之抗原(例如腫瘤抗原)：共享腫瘤相關抗原(共享TAA)及獨特腫瘤相關抗原(獨特TAA)或腫瘤特異性抗原。前者可包括(但不限於)睪丸癌(CT)抗原、過表現抗原及分化抗原，而後者可包括(但不限於)新抗原及腫瘤病毒抗原。人類乳頭瘤病毒(HPV) E6蛋白及HPV E7蛋白屬於腫瘤病毒抗原之類別。

在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如經修飾CAR或TCR改造細胞)可靶向CT抗原，例如黑色素瘤相關抗原(MAGE)，包括(但不限於) MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A6、MAGE-A8、MAGE-A9.23、MAGE-A10及MAGE-A12。在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如經修飾CAR或TCR改造細胞)可靶向糖蛋白(gp100)、由T細胞識別之黑色素瘤抗原(MART-1)及/或酪胺酸酶，其主要發現於黑色素瘤及正常黑色素細胞中。在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如經修飾CAR或TCR改造細胞)可靶向威爾姆氏腫瘤(Wilms tumor) 1 (WT1)，即在大多數急性骨髓性白血病(AML)、急性淋巴性白血病、幾乎每種類型之實體腫瘤及若干關鍵組織(例如心臟組織)中高表現之一類過表現抗原。在一些態樣中，本文所述之免疫細胞(例如經修飾CAR或TCR改造細胞)可靶向間皮素，其係在間皮瘤中高表現、但亦存在於若干組織(包括氣管)之間皮細胞上之另一類過表現抗原。

在一些態樣中，本揭示案之經修飾免疫細胞(例如CAR T或NK細胞或TCR改造之T細胞)可靶向上文所揭示之腫瘤抗原中之任一者或其組合。如本文所述，在一些態樣中，本文所提供之免疫細胞可特異性靶向ROR1抗原。受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1 (ROR1)在約57%之三重陰性乳癌(TNBC)患者及42%之非小細胞肺癌(NSCLC)腺癌患者中過表現(Balakrishnan 2017)且代表嵌合抗原受體(CAR) T細胞之具高度吸引力之靶。可使用抗ROR1 CAR T細胞安全地靶向受體酪胺酸激酶樣孤兒受體1陽性(ROR1 ⁺)實體腫瘤(Specht 2020)；然而，效能係受限的，此部分歸因於CAR T細胞在實體腫瘤惡性病患者中輸注後展現耗竭或功能障礙。另外，實體腫瘤具有限制免疫療法(例如CAR T細胞)之抗腫瘤活性之免疫抑制障壁(Newick 2016、Srivastava 2018、Martinez 2019)。

不希望受限於任一理論，本文所述之表現抗ROR1嵌合結合蛋白(例如抗ROR1 CAR或抗ROR1 TCR)之細胞已經修飾以過表現c-Jun蛋白且同時表現降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或NR4A1、NR4A2及/或NR4A3蛋白。如本文所述，在一些態樣中，表現抗ROR1嵌合結合蛋白(例如抗ROR1 CAR或抗ROR1 TCR)之細胞已經修飾以過表現c-Jun蛋白且同時具有降低水準之NR4A家族之多個成員。與此項技術中可用之其他抗ROR1細胞(例如，表現配位體結合蛋白，但未經修飾以過表現c-Jun蛋白及/或具有降低水準之NR4A家族之多個成員)相比，該等經修飾細胞對耗竭更具抗性且展現改良之效應功能。

在一些態樣中，本文所述之經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun蛋白並具有降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或NR4A1、NR4A2及/或NR4A3蛋白)包含ROR1結合嵌合抗原受體(「抗ROR1 CAR」)。例示性抗ROR1 CAR闡述於Hudecek等人，Clin. Cancer Res. 19.12(2013): 3153-64中，該文獻之全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，本揭示案之包含抗ROR1 CAR之CAR T細胞係如Hudecek等人中所述生成(例如，如Hudecek等人，第3155頁，第一完整段落中所述，該文獻之全文皆以引用方式併入本文中)。在一些態樣中，本揭示案之抗ROR1 CAR包括包含以下文獻中所述之2A2、R11及R12抗ROR1單株抗體之VH及/或VL序列之抗體或其片段：Hudecek等人，段落橋接頁3154-55；Baskar等人，MAbs 4(2012): 349-61；及Yang等人，PLoS ONE 6(2011):e21018，該等文獻之全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，可用於本揭示案之抗ROR1嵌合結合蛋白(例如抗ROR1 CAR或抗ROR1 TCR)能夠與抗ROR1抗體(例如R12抗體)交叉競爭。R12抗體序列顯示於表7中。在一些態樣中，可用於本揭示案之抗ROR1嵌合結合蛋白(例如抗ROR1 CAR或抗ROR1 TCR)結合至R12抗體之相同抗原決定基。如熟習此項技術者應明瞭，此項技術中已知之任一抗ROR1抗體可與本揭示案一起使用。該等抗體之非限制性實例包括以下文獻中所述之2A2及R11抗體：Hudecek等人，Clin. Cancer Res. 19.12(2013):3153-64；Baskar等人，MAbs 4(2012):349-61；及Yang等人，PLoS ONE 6(2011):e21018；US 9,316,646 B2；及US 9,758,586 B2；該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，可在本文所揭示之經修飾免疫細胞上表現之本文所述抗ROR1嵌合結合蛋白(例如抗ROR1 CAR)之抗原結合結構域包含R12抗體之VH CDR3。在一些態樣中，本揭示案之抗ROR1嵌合結合蛋白(例如抗ROR1 CAR)之抗原結合結構域包含R12抗體之VH CDR1、VH CDR2及VH CDR3。在一些態樣中，本揭示案之抗ROR1嵌合結合蛋白(例如抗ROR1 CAR)之抗原結合結構域包含R12抗體之VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2及VL CDR3。在一些態樣中，本揭示案之抗ROR1嵌合結合蛋白之抗原結合結構域(例如R12 scFv)包含R12抗體之VH及VL。

在一些態樣中，可在本文所揭示之經修飾免疫細胞上表現之嵌合結合蛋白(例如本文所提供CAR或TCR中之任一者，例如抗ROR1 CAR)之細胞內結構域包含信號傳導結構域，例如衍生自CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d之信號傳導結構域。在一些態樣中，嵌合結合蛋白(例如CAR或TCR)進一步包含共刺激結構域，例如衍生自2B4、HVEM、ICOS、LAG3、DAP10、DAP12、CD27、CD28、4-1BB (CD137)、OX40 (CD134)、CD30、CD40、ICOS (CD278)、糖皮質素誘導之腫瘤壞死因子受體(GITR)、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C或B7-H3之共刺激結構域。在一些態樣中，嵌合結合蛋白(例如CAR或TCR)包含4-1BB共刺激結構域。

在一些態樣中，可在本文所揭示之經修飾免疫細胞上表現之嵌合結合蛋白(例如本文所提供之CAR或TCR)之跨膜結構域可包括至少例如KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1 (CD11a、CD18)、ICOS (CD278)、4-1BB (CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM (LIGHTR)、SLAMF7、NKp80 (KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1 (CD226)、SLAMF4 (CD244、2B4)、CD84、CD96 (Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9 (CD229)、CD160 (BY55)、PSGL1、CD100 (SEMA4D)、SLAMF6 (NTB-A、Ly108)、SLAM (SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME (SLAMF8)、SELPLG (CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C或CD19之跨膜區。

在一些態樣中，可在本文所揭示之經修飾免疫細胞上表現之嵌合結合蛋白(例如CAR或TCR)進一步包含編碼共刺激結構域(例如本文所述之共刺激結構域)之序列。在一些態樣中，共刺激結構域包含以下之共刺激結構域：介白素-2受體(IL-2R)、介白素-12受體(IL-12R)、IL-7、IL-21、IL-23、IL-15、CD2、CD3、CD4、CD7、CD8、CD27、CD28、CD30、CD40、4-1BB/CD137、ICOS、淋巴球功能相關抗原-1 (LFA-1)、LIGHT、NKG2C、OX40、DAP10、B7-H3、缺失Lck結合之CD28 (ICA)、BTLA、GITR、HVEM、LFA-1、LIGHT、NKG2C、PD-1、TILR2、TILR4、TILR7、TILR9、Fc受體γ鏈、Fc受體ε鏈、與CD83特異性結合之配位體或其任一組合。

如本文進一步闡述，在一些態樣中，本文所述之免疫細胞係例如藉由基因編輯工具修飾，以減少 NR4A1 、 NR4A2或 NR4A3基因及/或蛋白(包括其組合)之表現。減少的 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因表現可例如藉由編輯整個 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因、藉由編輯 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因之一部分、藉由編輯控制 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因表現之調控區來進行。因此，為減少表現配位體結合蛋白之免疫細胞(例如本文所提供之CAR表現細胞或TCR表現細胞)中 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白(包括其組合)之表現，可使用此項技術中已知用於減少細胞中之基因及/或蛋白表現之任何方法。例如，在一些態樣中，本文所提供之免疫細胞(例如CAR表現細胞或TCR表現細胞)之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或其編碼之蛋白質的表現可藉由使細胞與基因編輯工具接觸來減少，該基因編輯工具能夠降低 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及其編碼之蛋白質的表現水準。基因編輯工具之非限制性實例顯示於下文中。在一些特定態樣中，基因編輯工具包含例如shRNA、siRNA、miRNA、反義寡核苷酸、CRISPR、鋅指核酸酶、TALEN、大範圍核酸酶、限制性核酸內切酶或其任一組合。在一些態樣中，基因編輯工具係CRISPR。在一些態樣中，基因編輯工具包含特異性靶向NR4A家族之成員之引導RNA (gRNA)。該等gRNA之非限制性實例提供於表A、表C及表D中。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以具有降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白且表現c-Jun蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所提供免疫細胞之群體(例如藉由本文所揭示之方法產生之CAR或TCR表現細胞，即表現降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白及增加水準之c-Jun蛋白)展現一或多種增強或改良之性質。在一些態樣中，改良本文所揭示免疫細胞之一或多種性質可幫助治療腫瘤(例如減小腫瘤體積及/或腫瘤重量)。可使用本揭示案改良之一或多種性質包括可用於治療癌症之本文所揭示免疫細胞之任何性質。舉例而言，在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及蛋白且表現c-Jun蛋白之CAR或TCR表現細胞)相比，免疫細胞之群體(例如藉由本文所揭示之方法產生之CAR或TCR表現細胞，即表現降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白及增加水準之c-Jun蛋白)可展現較大之效應活性。

在一些態樣中，相對於參考細胞，經修飾免疫細胞之增強的性質包括 (i) 免疫細胞之增加的擴增及/或增殖， (ii) 免疫細胞之增加的細胞毒性， (iii) 免疫細胞之增加的細胞介素表現，或 (iv) 其任一組合。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以具有減少的 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白表現且過表現c-Jun蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun並具有降低水準之以下中之一或多者之本文所述之CAR或TCR表現細胞： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白)具耗竭抗性及/或功能障礙抗性。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以具有減少的 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白表現且過表現c-Jun蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun並具有降低水準之以下中之一或多者之本文所述之CAR或TCR表現細胞： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白)具細胞凋亡抗性，即其展現減少的細胞凋亡或不展現細胞凋亡。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以具有減少的 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白表現且過表現c-Jun蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun並具有降低水準之以下中之一或多者之本文所述之CAR或TCR表現細胞： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白)具免疫檢查點抗性，即其展現減少的免疫檢查點活性或不展現免疫檢查點活性。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以具有減少的 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白表現且過表現c-Jun蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun並具有降低水準之以下中之一或多者之本文所述之CAR或TCR表現細胞： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白)展現增強的T細胞活化。在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以具有減少的 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白表現且過表現c-Jun蛋白之相應免疫細胞)相比，該增強的T細胞活化可例如藉由經修飾免疫細胞展現增強的擴增、增強的細胞毒性、增強的細胞介素表現或其任一組合來證實。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以具有減少的 NR4A1、 NR4A2及 NR4A3基因及/或蛋白表現且過表現c-Jun蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如過表現c-Jun並具有降低水準之以下中之一或多者之本文所述之CAR或TCR表現細胞： NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白)在腫瘤微環境(TME)中維持抗腫瘤功能。

本揭示案亦提供醫藥組合物，其包含本文所揭示之經修飾免疫細胞群體及醫藥學上可接受之載劑。該等醫藥組合物進一步闡述於本揭示案之別處。 III. 治療方法

本文提供治療有需要之個體之腫瘤(或癌症)之方法，其包括向個體投與本揭示案之細胞組合物，例如過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A(例如 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或其編碼之蛋白質(即NR4A蛋白)的細胞。如本文所用之術語「細胞組合物」係指單獨或與一或多種其他劑(例如賦形劑)組合之免疫細胞。在一些態樣中，細胞包含特異性結合至本文所述之腫瘤抗原之配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)。在一些態樣中，腫瘤抗原包含ROR1。因此，在一些態樣中，本文所提供之治療腫瘤之方法包括向個體投與本文所述之細胞組合物，其中細胞(i)過表現c-Jun蛋白，(ii)具有降低水準之 NR4A基因及/或蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)，及(iii)表現特異性靶向腫瘤抗原之CAR。在一些態樣中，本文所提供之治療腫瘤之方法包括向個體投與本文所述之細胞組合物，其中細胞(i)過表現c-Jun蛋白，(ii)具有降低水準之 NR4A基因及/或蛋白(例如NR4A1、NR4A2、NR4A3或其組合)，及(iii)表現特異性靶向腫瘤抗原之TCR (例如經改造之TCR)。

在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2或 NR4A3)基因之相應細胞)相比， NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之NR4A (NR4A1、NR4A2或NR4A3)蛋白之相應細胞)相比，NR4A (NR4A1、NR4A2及/或NR4A3)蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)相比， NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。降低 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現水準之方法提供於本揭示案之別處。

在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，投與本揭示案之細胞組合物會減小個體之腫瘤體積。在一些態樣中，參考腫瘤體積係投與經修飾細胞前個體之腫瘤體積。在一些態樣中，參考腫瘤體積係未接受投與之相應個體之腫瘤體積。除非另有指示，否則「未接受投與之相應個體」(或其變化形式)包括以下中之任一者：(1)接受表現內源水準之c-Jun及NR4A家族之所有成員之相應細胞的投與之相應個體(例如患有相同腫瘤)；(2)接受過表現c-Jun但具有內源水準之NR4A家族之所有成員之相應細胞的投與之相應個體；(3)接受具有降低水準之NR4A家族之一或多個成員但不過表現c-Jun之相應細胞的投與之相應個體；及(4) (1)至(3)之任一組合。在一些態樣中，與參考腫瘤體積相比，個體之腫瘤體積在投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。

在一些態樣中，治療腫瘤包括減小個體之腫瘤重量。在一些態樣中，本文所揭示之經修飾細胞在投與個體時可減小個體之腫瘤重量。在一些態樣中，與參考腫瘤重量相比，腫瘤重量在投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。在一些態樣中，參考腫瘤重量係投與經修飾細胞前個體之腫瘤重量。在一些態樣中，參考腫瘤重量係未接受投與之相應個體之腫瘤重量。

在一些態樣中，向個體(例如患有腫瘤)投與本揭示案之細胞組合物可增加個體之腫瘤及/或TME中TIL (例如CD4 ⁺或CD8 ⁺)之數量及/或百分比。在一些態樣中，與參考(例如未接受經修飾細胞之個體或投與經修飾細胞前之相同個體之相應值)相比，腫瘤及/或TME中TIL之數量及/或百分比增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更大。在一些態樣中，與參考(例如未接受經修飾細胞之個體或投與經修飾細胞前之相同個體之相應值)相比，向個體(例如患有腫瘤)投與本揭示案之細胞組合物可使個體之腫瘤及/或TME中TIL (例如CD4 ⁺或CD8 ⁺)之數量及/或百分比增加至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約3.5倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約8倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約50倍、至少約75倍或至少約100倍。

在一些態樣中，投與本揭示案之細胞組合物可減少個體之腫瘤及/或TME中調控T細胞之數量及/或百分比。在一些態樣中，與參考(例如未接受經修飾細胞投與之個體之相應數量及/或百分比)相比，腫瘤及/或TME中調控T細胞之數量及/或百分比減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。

在一些態樣中，投與本揭示案之細胞組合物可減少個體之腫瘤及/或TME中骨髓源性抑制細胞(MDSC)之數量及/或百分比。在一些態樣中，MDSC係單核球性MDSC (M-MDSC)。在一些態樣中，MDSC係多形核MDSC (PMN-MDSC)。在一些態樣中，MDSC包含M-MDSC及PMN-MDSC。在一些態樣中，與參考(例如未接受經修飾細胞投與之相應個體之值)相比，腫瘤及/或TME中MDSC之數量及/或百分比減少至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或約100%。

除上述外，投與本揭示案之細胞組合物可具有有助於腫瘤治療之其他效應。該等效應進一步闡述於下文中。

如本文所述，本揭示案之細胞組合物(即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白及特異性結合至腫瘤抗原(例如ROR1)之結合分子)可用於治療多種癌症類型，例如衍生自包括以下之癌症之腫瘤：乳癌、頭頸癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌(renal cancer)、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌(kidney cancer)、胰臟癌、甲狀腺癌、食道癌、眼癌、胃(stomach/gastric)癌、胃腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其組合。癌症適應症之全面及非限制性清單提供於本申請案之適應症部分中。

在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物可與其他治療劑(例如抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在一些態樣中，本文所揭示之治療腫瘤之方法包括投與本揭示案之細胞組合物與一或多種其他治療劑之組合。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物可與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多種元件。在一些態樣中，抗癌劑包括免疫檢查點抑制劑(即阻斷經由特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。可用於本發明方法中之免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括CTLA-4拮抗劑(例如抗CTLA-4抗體)、PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)、TIM-3拮抗劑(例如抗TIM-3抗體)或其組合。組合治療之全面及非限制性清單詳細揭示於本申請案之組合治療部分中。

在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物係在投與另一治療劑之前或之後投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物係與另一治療劑同時投與個體。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物及另一治療劑可作為醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物同時投與。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物及另一治療劑係作為單獨組合物同時投與。

在一些態樣中，可用本揭示案治療之個體係非人類動物，例如大鼠或小鼠。在一些態樣中，可治療之個體係人類。

在一些態樣中，例如在本文所揭示之方法中治療腫瘤包括增強T細胞(例如腫瘤特異性T細胞)之活化。如本文所用之術語「增強T細胞之活化」係指在活化期間改變細胞信號傳導以促進T細胞記憶之保持。

因此，在一些態樣中，本揭示案係關於增強T細胞活化之方法，其係藉由在細胞中過表現c-Jun蛋白並降低 NR4A( NR4A1、 NR4A2或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現水準來實施。細胞之活化狀態可藉由此項技術中已知之任一方法、例如藉由分析細胞之一或多種功能性質(例如增殖、細胞毒性、細胞介素產生)或藉由分析細胞之表型表現來測定。在一些態樣中，增強T細胞(例如腫瘤特異性T細胞)之活化可在細胞中產生以下改良性質中之一或多者：(i)增強的擴增，(ii)增強的細胞毒性，(iii)增強的細胞介素表現，或(iv)其任一組合。

在一些態樣中，增強T細胞(例如腫瘤特異性T細胞)之活化可增強細胞之擴增。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白且過表現c-Jun蛋白之相應細胞)之擴增相比，T細胞之擴增增強(即增加)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更大。在一些態樣中，增強的擴增可增加例如個體中經修飾T細胞(即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白)之數量。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A基因及/或蛋白且過表現c-Jun蛋白之相應細胞)之數量相比，經修飾T細胞之數量增加至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更大。

在一些態樣中，增強T細胞(例如腫瘤特異性T細胞)之活化可增強細胞之細胞毒性。如本文所用之術語「細胞毒性」係指本揭示案之細胞組合物(例如腫瘤特異性T細胞)攻擊並誘導腫瘤細胞損傷之能力。本揭示案之細胞組合物(例如腫瘤特異性T細胞)可藉由此項技術中已知之任一方法、例如經由釋放細胞毒性分子(例如穿孔蛋白、顆粒酶及顆粒溶素)或經由Fas-Fas配位體相互作用誘導腫瘤細胞之細胞凋亡來攻擊並誘導腫瘤細胞之損傷。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及蛋白且過表現c-Jun蛋白之相應細胞)之細胞毒性相比，T細胞之細胞毒性增強(即增加)至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約100%、至少約110%、至少約120%、至少約130%、至少約140%、至少約150%、至少約160%、至少約170%、至少約180%、至少約190%、至少約200%、至少約210%、至少220%、至少約230%、至少約240%、至少約250%、至少約260%、至少約270%、至少約280%、至少約290%或至少約300%或更大。

在一些態樣中，增強T細胞(例如腫瘤特異性T細胞)之活化可增強細胞中之細胞介素表現。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現較低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)之細胞介素表現相比，細胞介素表現增強(即增加)至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。如本文所用之術語「細胞介素」係指可用於治療癌症之任一細胞介素。該等細胞介素之非限制性實例包括IFN-γ、TNF-α、IL-2及其任一組合。

在一些態樣中，免疫細胞之擴增及/或增殖、免疫細胞之細胞毒性或免疫細胞之細胞介素表現增加約2倍至約100倍、至約150倍、至約200倍、至約250倍、至約300倍、至約350倍、至約400倍、至約450倍、至約500倍或更大。在一些態樣中，免疫細胞之擴增及/或增殖、免疫細胞之細胞毒性或免疫細胞之細胞介素表現增加約10倍至約500倍、約20倍至約400倍、約25倍至約250倍、約10倍至約50倍。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現較低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應免疫細胞)之擴增及/或增殖、細胞毒性或細胞介素表現相比，免疫細胞之擴增及/或增殖、免疫細胞之細胞毒性或免疫細胞之細胞介素表現增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。

在一些態樣中，本揭示案之經修飾免疫細胞展現相對於參考細胞增加的細胞介素表現。在一些態樣中，細胞介素係介白素-2 (IL-2)、干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)或其任一組合。

在一些態樣中，與參考免疫細胞中IL-2之表現水準相比，經修飾免疫細胞中IL-2之表現水準增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，與參考免疫細胞中IFN-γ之表現水準相比，經修飾免疫細胞中IFN-γ之表現水準增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，與參考免疫細胞中TNF-α之表現水準相比，經修飾免疫細胞中TNF-α之表現水準增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，本文所揭示之表現配位體結合蛋白之免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞) (即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或NR4A蛋白)在用抗原(例如同源抗原(例如腫瘤抗原))刺激(例如依序刺激及/或慢性刺激)時產生增加量之IL-2。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現較低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)產生之IL-2之量相比，由免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞)產生之IL-2之量增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，本文所揭示之表現配位體結合蛋白之免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞) (即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白)在用抗原(例如同源抗原(例如腫瘤抗原))刺激(例如依序刺激及/或慢性刺激)時產生增加量之IFN-γ。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現較低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)相比，由免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞)產生之IFN-γ之量增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，本文所揭示之表現配位體結合蛋白之免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞) (即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白)在用抗原(例如同源抗原(例如腫瘤抗原))刺激(例如依序刺激及/或慢性刺激)時產生增加量之TNF-α。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現較低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)產生之TNF-α之量相比，由免疫細胞(例如CAR或TCR表現細胞)產生之TNF-α之量增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以過表現c-Jun蛋白且具有降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如本文所述之CAR或TCR表現細胞)展現增加的細胞擴增及/或細胞增殖。在一些態樣中，與參考免疫細胞之細胞擴增及/或細胞增殖相比，經修飾免疫細胞之細胞擴增及/或細胞增殖增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以過表現c-Jun蛋白且具有降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如本文所述之CAR或TCR表現細胞)展現增加的持久性及/或存活。在一些態樣中，與參考免疫細胞之持久性及/或存活相比，經修飾免疫細胞之持久性及/或存活增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以過表現c-Jun蛋白且具有降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如本文所述之CAR或TCR表現細胞)展現增加的抗腫瘤活性。在一些態樣中，與參考免疫細胞之抗腫瘤活性相比，經修飾免疫細胞之抗腫瘤活性增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約15倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約40倍、至少約50倍或至少約100倍或更大。

在一些態樣中，與參考免疫細胞(即未經修飾以過表現c-Jun蛋白且具有降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應免疫細胞)相比，本文所揭示之經修飾免疫細胞(例如本文所述之CAR或TCR表現細胞)展現減少的耗竭或功能障礙。在一些態樣中，與參考免疫細胞相比，經修飾免疫細胞之耗竭或功能障礙減少至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍。

在一些態樣中，本文所揭示之經修飾細胞可與其他治療劑(例如抗癌劑及/或免疫調節劑)組合使用。因此，在一些態樣中，本文所揭示治療腫瘤之方法包括向個體投與本揭示案之經修飾細胞與一或多種其他治療劑之組合。該等劑可包括例如化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任一組合。在一些態樣中，本文所揭示之經修飾細胞(即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白)可與標準護理治療(例如手術、輻射及化學療法)組合使用。本文所述之方法亦可用作維持療法，例如意欲防止腫瘤發生或復發之療法。

在一些態樣中，本揭示案之經修飾細胞可與一或多種抗癌劑組合使用，使得可靶向免疫路徑之多種元件。該等組合之非限制性實例包括：增強腫瘤抗原呈遞之療法(例如樹突細胞疫苗、GM-CSF分泌細胞疫苗、CpG寡核苷酸、咪喹莫特(imiquimod))；例如藉由抑制CTLA-4及/或PD1/PD-L1/PD-L2路徑及/或清除或阻斷T _reg或其他免疫抑制細胞(例如骨髓源性抑制細胞)來抑制負免疫調控之療法；例如使用刺激CD-137、OX-40及/或CD40或GITR路徑及/或刺激T細胞效應功能之促效劑來刺激正免疫調控之療法；增加全身性抗腫瘤T細胞頻率之療法；例如使用CD25拮抗劑(例如達利珠單抗(daclizumab))或藉由離體抗CD25珠粒清除來清除或抑制T _reg(例如腫瘤中之T _reg)之療法；影響腫瘤中之抑制性骨髓細胞功能之療法；增強腫瘤細胞之免疫原性之療法(例如蒽環)；授受性T細胞或NK細胞轉移，包括經遺傳修飾之細胞，例如由嵌合抗原受體修飾之細胞(CAR-T療法)；抑制代謝酶(例如吲哚胺雙加氧酶(IDO)、雙加氧酶、精胺酸酶或一氧化氮合成酶)之療法；逆轉/防止T細胞無反應性或耗竭之療法；觸發腫瘤位點之先天性免疫活化及/或發炎之療法；投與免疫刺激細胞介素；阻斷免疫阻抑性細胞介素；或其任一組合。

在一些態樣中，抗癌劑包括免疫檢查點抑制劑(即阻斷經由特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。可用於本發明方法中之免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括CTLA-4拮抗劑(例如抗CTLA-4抗體)、PD-1拮抗劑(例如抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體)、TIM-3拮抗劑(例如抗TIM-3抗體)或其組合。該等免疫檢查點抑制劑之非限制性實例包括以下：抗PD1抗體(例如尼沃魯單抗(nivolumab，OPDIVO ^®)、派姆單抗(pembrolizumab，KEYTRUDA ^®；MK-3475)、匹利珠單抗(pidilizumab，CT-011)、PDR001、MEDI0680 (AMP-514)、TSR-042、REGN2810、JS001、AMP-224 (GSK-2661380)、PF-06801591、BGB-A317、BI 754091、SHR-1210及其組合)；抗PD-L1抗體(例如阿替珠單抗(atezolizumab，TECENTRIQ ^®；RG7446；MPDL3280A；RO5541267)、德瓦魯單抗(durvalumab，MEDI4736、IMFINZI ^®)、BMS-936559、阿維魯單抗(avelumab，BAVENCIO ^®)、LY3300054、CX-072 (Proclaim-CX-072)、FAZ053、KN035、MDX-1105及其組合)；及抗CTLA-4抗體(例如伊匹單抗(ipilimumab，YERVOY ^®)、曲美木單抗(tremelimumab，替西莫單抗(ticilimumab)；CP-675,206)、AGEN-1884、ATOR-1015及其組合)。

在一些態樣中，抗癌劑包括免疫檢查點活化劑(即促進經由特定免疫檢查點路徑之信號傳導)。在一些態樣中，免疫檢查點活化劑包括OX40促效劑(例如抗OX40抗體)、LAG-3促效劑(例如抗LAG-3抗體)、4-1BB (CD137)促效劑(例如抗CD137抗體)、GITR促效劑(例如抗GITR抗體)、TIM3促效劑(例如抗TIM3抗體)或其組合。

在一些態樣中，本文所揭示之經修飾細胞係在投與另一治療劑之前或之後投與個體。在一些態樣中，經修飾細胞係與另一治療劑同時投與個體。在一些態樣中，經修飾細胞及另一治療劑可作為醫藥學上可接受之載劑中之單一組合物同時投與。在一些態樣中，經修飾細胞及另一治療劑係作為單獨組合物同時投與。在一些態樣中，另一治療劑及經修飾免疫細胞係依序投與。 IV. 製造經修飾免疫細胞之方法

本揭示案提供生成或製備過表現c-Jun蛋白且具有降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之細胞的方法，其包括例如(i)用基因編輯工具修飾細胞，其中基因編輯工具減少 NR4A基因及/或蛋白之表現，及(ii)修飾細胞以過表現c-Jun蛋白。在一些態樣中，細胞可藉由用包含表現c-Jun蛋白之核苷酸序列之多核苷酸轉導細胞來修飾。如本文所述，在一些態樣中，細胞可用能夠增加內源c-Jun蛋白之表現之轉錄活化劑來修飾。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A2及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A3及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白及 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A2基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白、 NR4A2基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，增加的c-Jun蛋白表現與減少的 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現之組合協同減少或抑制細胞之耗竭。

因此，本揭示案亦提供減少或抑制表現配位體結合蛋白(例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR))之細胞之耗竭的方法，其包括修飾細胞以降低 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或NR4A3)基因及/或蛋白之表現水準並過表現c-Jun蛋白。在一些態樣中，細胞係免疫細胞。另外，本揭示案提供促進免疫細胞之持續效應功能之方法，其包括修飾細胞以表現降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白並過表現c-Jun蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A2及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A3及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白及 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A2基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白、 NR4A2基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。

基因編輯(例如鹼基編輯)可使用此項技術中已知之任一編輯工具來實施。舉例而言，在一些態樣中，經修飾細胞(例如免疫細胞)可使用諸如以下之技術來修飾：CRISPR/Cas、TALEN、鋅指核酸酶(ZFN)、大範圍核酸酶、限制性核酸內切酶、干擾RNA (RNAi)或反義寡核苷酸。在一些態樣中， NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或表現亦可使用shRNA、siRNA或miRNA來修飾。所有該等技術更詳細論述於下文中。在一些態樣中，用於減少 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現之方法包括使用一或多種基因編輯工具(例如兩種、三種或更多種工具)。在一些態樣中，用於減少 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現之方法包括作用於NR4A DNA (例如CRISPR)或RNA (例如反義寡核苷酸)之至少一種方法及作用於NR4A蛋白(例如抑制與細胞信號傳導配偶體之結合或轉譯後修飾)之至少一種方法。

在一些態樣中，如本文所揭示、例如藉由使用基因編輯工具修飾以降低或消除 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因水準之細胞(例如免疫細胞)可進一步經修飾以表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)。因此，在一些態樣中，製備本文所述之免疫細胞之方法包括用以下修飾免疫細胞：(i)基因編輯工具(例如能夠特異性靶向NR4A家族之一或多個成員)，(ii)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，及(iii)編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核苷酸序列。在一些態樣中，製備本文所述之免疫細胞之方法包括用以下修飾免疫細胞：(i)基因編輯工具(例如能夠特異性靶向NR4A家族之一或多個成員)，(ii)能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑，及(iii)編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核苷酸序列。如本文所述，在一些態樣中，基因編輯工具包含引導RNA，該引導RNA包含以下中之任一者中所述之序列、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。(參見例如表A、表C及表D)。可使用之其他基因編輯工具之非限制性實例進一步闡述於本揭示案之別處。

在一些態樣中，可與上述方法一起使用之編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含本文所提供之任一c-Jun核苷酸序列。舉例而言，在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列包含：(a)與如SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(b)與如SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(c)與如SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(d)與如SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(e)與如SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(f)與如SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(g)與如SEQ ID NO:14中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；(h)與如SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；或(i)與如SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列。

在一些態樣中，根據本文所揭示之基因編輯方法修飾且表現CAR或TCR之免疫細胞可具有改良之抗癌性質。該等抗癌性質之非限制性實例闡述於本揭示案之別處。

儘管用於減少 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現之方法(例如基因編輯)係在CAR或TCR表現細胞之背景下提供，但熟習此項技術者將意識到，本文所揭示之方法可用於任何細胞，其中減少 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現係合意的。舉例而言，在一些態樣中，本文所揭示之用於減少 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現之方法可應用於免疫細胞。在一些態樣中，免疫細胞包含淋巴球、嗜中性球、單核球、巨噬細胞、樹突細胞或其組合。在一些態樣中，淋巴球包含T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、淋巴介質活化殺手細胞、自然殺手(NK)細胞或其組合。在一些態樣中，淋巴球係T細胞，例如CD4 ⁺T細胞或CD8 ⁺T細胞。在一些態樣中，淋巴球係腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。在一些態樣中，TIL係CD8 ⁺TIL。在一些態樣中，TIL係CD4 ⁺TIL。因此，本揭示案提供細胞組合物，其包含根據本文所揭示之用於減少 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現及達成c-Jun蛋白之過表現的方法製備之經修飾細胞(例如經修飾免疫細胞，其中母體細胞係例如上文所揭示之任何細胞)，其中相對於參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白且過表現c-Jun蛋白之相應細胞)，經修飾細胞展現減少的 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現及增加的c-Jun蛋白表現。在一些態樣中，該等經修飾細胞可用於製備醫藥組合物。

在一些態樣中，修飾本文所述之細胞包括(i)使細胞與能夠降低細胞中 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現水準之基因編輯工具接觸，及(ii)使細胞與包含編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列之多核苷酸接觸。在一些態樣中，修飾本文所述之細胞包括(i)使細胞與能夠降低細胞中 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現水準之基因編輯工具接觸，及(ii)使細胞與能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑接觸。在一些態樣中，使基因編輯工具(或能夠減少 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現之任何其他工具)與欲修飾之細胞接觸可在活體內、活體外、離體或其組合進行。在一些態樣中，接觸係在活體內進行(例如基因療法)。在一些態樣中，接觸係在活體外進行。在一些態樣中，接觸係離體進行。在一些態樣中，細胞係自體細胞。在一些態樣中，細胞係異源細胞。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以表現較低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白之相應細胞)中 NR4A基因及/或蛋白之水準相比，基因編輯工具(或能夠減少 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現之任何其他工具)之接觸使細胞中 NR4A基因及/或蛋白之表現水準降低至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、20倍、30倍、40倍或至少約50倍。

在一些態樣中，使細胞與基因編輯工具接觸包括不同之遞送途徑。通常，對於減少細胞中 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現之本文所揭示之基因編輯工具，基因編輯工具必須能夠進入細胞且結合至所關注基因。在一些態樣中，可使用此項技術中已知用於將所關注分子遞送至細胞之任何遞送媒劑。參見例如美國專利第10,047,355 B2號，其全文皆以引用方式併入本文中。關於可用載體之其他揭示內容提供於本揭示案之別處。

在一些態樣中，基因編輯工具可以消除功能蛋白表現之方式突變編碼NR4A ( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)蛋白之基因。在一些態樣中，基因編輯工具可移除編碼NR4A1、NR4A2及/或NR4A3蛋白之整個基因，由此消除蛋白表現。在一些態樣中，基因編輯工具移除編碼NR4A (NR4A1、NR4A2及/或NR4A3)蛋白之基因之一部分(例如一或多個外顯子)。在一些態樣中，基因編輯工具(例如鹼基編輯器)修飾特定核苷酸鹼基而不生成插入/缺失(indel)。如本文所用之術語「插入/缺失」係指可導致基因編碼區內之框移突變之核酸內核苷酸鹼基之插入或缺失。鹼基編輯器之非限制性實例揭示於美國公開案第2017/0121693號(公開於2017年5月4日)中，該美國公開案之全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，製備本文所述之經修飾免疫細胞之方法進一步包括修飾細胞以表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)。在一些態樣中，細胞進一步經修飾以表現CAR。在一些態樣中，細胞進一步經修飾以表現TCR (例如經改造之TCR)。在一些態樣中，修飾細胞以表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)包括使細胞與編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核酸序列接觸。在一些態樣中，編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核酸序列係自載體(例如表現載體)表現。在一些態樣中，載體可進一步包含編碼另一所關注蛋白質(例如c-Jun蛋白)之核苷酸序列。

在一些態樣中，本文所揭示之基因編輯工具係自包含編碼基因編輯工具之核酸序列之載體表現。在一些態樣中，編碼基因編輯工具之核酸序列、編碼c-Jun蛋白之核酸序列及編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核酸序列處於單獨載體上。在一些態樣中，編碼基因編輯工具之核酸序列及編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核酸序列處於同一載體上。在一些態樣中，編碼基因編輯工具之核酸序列及編碼c-Jun蛋白之核酸序列處於同一載體上。在一些態樣中，編碼c-Jun蛋白之核酸序列及編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核酸序列處於同一載體上。在一些態樣中，編碼基因編輯工具之核酸序列、編碼c-Jun蛋白之核酸序列及編碼配位體結合蛋白之核酸序列皆處於同一載體上。 IV.A. 基因編輯工具

可使用一或多種基因編輯工具來修飾本揭示案之細胞。基因編輯工具之非限制性實例揭示於下文中： IV.A.1. CRISPR/Cas 系統

在一些態樣中，可用於本揭示案中之基因編輯工具包含CRISPR/Cas系統。該等系統可採用例如編碼Cas9核酸酶之核酸分子，其在一些情況下經密碼子最佳化用於欲表現其之期望細胞類型(例如T細胞，例如CAR表現T細胞或經改造之TCR表現T細胞)。如本文進一步闡述，在一些態樣中，該系統可包含Cas9核酸酶蛋白。

CRISPR/Cas系統使用Cas核酸酶，例如Cas9核酸酶，其藉由與引導RNA (例如合成引導RNA) (gRNA)複合靶向基因體位點，該引導RNA與緊接在由Cas核酸酶(例如Cas9)識別之NGG模體之前的靶DNA序列雜交。此導致NGG模體上游之三個核苷酸之雙股斷裂。CRISPR/Cas9系統之獨特能力係藉由共表現單一Cas9蛋白與兩個或更多個gRNA (例如至少一個、兩個、三個、四個、五個、六個、七個、八個、九個或十個gRNA)同時靶向多個不同之基因體基因座。該等系統亦可採用包含兩個單獨分子之引導RNA。在一些態樣中，兩分子gRNA包含crRNA樣(「CRISPR RNA」或「靶-RNA」或「crRNA」或「crRNA重複」)分子及相應tracrRNA樣(「反式作用CRISPR RNA」或「活化劑-RNA」或「tracrRNA」或「支架」)分子。

crRNA包含gRNA之DNA靶向區段(單股)及形成gRNA之蛋白質結合區段之一半雙股RNA (dsRNA)雙鏈體的一段核苷酸。相應tracrRNA (活化劑-RNA)包含形成gRNA之蛋白質結合區段之另一半dsRNA雙鏈體的一段核苷酸。因此，crRNA之一段核苷酸與tracrRNA之一段核苷酸互補且雜交以形成gRNA之蛋白質結合結構域之dsRNA雙鏈體。因此，可稱每一crRNA具有相應tracrRNA。crRNA另外提供單股DNA靶向區段。因此，gRNA包含與靶序列(例如， NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3mRNA)雜交之序列及tracrRNA。因此，crRNA及tracrRNA (作為相應對)雜交形成gRNA。若用於細胞內之修飾，則給定crRNA或tracrRNA分子之精確序列及/或長度可經設計以特異性針對將使用RNA分子之物種(例如人類)。

編碼三種元件(Cas9、tracrRNA及crRNA)之天然基因通常組織在操縱子中。天然CRISPR RNA端視Cas9系統及有機體而不同，但通常含有長度介於21至72個核苷酸之間之靶向區段，側接有長度介於21至46個核苷酸之間之兩個正向重複(DR) (參見例如WO2014/131833)。在釀膿鏈球菌(S. pyogenes)之情形下，DR長36個核苷酸且靶向區段長30個核苷酸。位於3′之DR與相應tracrRNA互補且雜交，該tracrRNA進而結合至Cas9蛋白。

替代地，本文所用之CRISPR系統可進一步採用與密碼子最佳化Cas9一起發揮功能之融合crRNA-tracrRNA構築物(即單一轉錄物)。此單一RNA通常稱為引導RNA或gRNA。在gRNA內，crRNA部分鑑別為給定識別位點之「靶序列」且tracrRNA通常稱為「支架」。簡言之，將含有靶序列之短DNA片段插入引導RNA表現質體中。gRNA表現質體包含靶序列(在一些態樣中為約20個核苷酸)、一種形式之tracrRNA序列(支架)以及在細胞中有活性之適宜啟動子及在真核細胞中正確處理所需之元件。許多系統依賴於定制之互補寡聚物，其退火形成雙股DNA且然後選殖至gRNA表現質體中。

然後將gRNA表現盒及Cas9表現盒引入細胞中。參見例如Mali P等人，(2013) Science2013年2月15日; 339(6121):823-6；Jinek M等人， Science2012年8月17日; 337(6096):816-21；Hwang W Y等人， Nat Biotechnol2013年3月; 31(3):227-9；Jiang W等人， Nat Biotechnol2013年3月; 31(3):233-9；及Cong L等人， Science2013年2月15日; 339(6121):819-23，該等文獻中之每一者之全文皆以引用方式併入本文中。亦參見例如WO/2013/176772 A1、WO/ 2014/065596 A1、WO/2014/089290 A1、WO/2014/093622 A2、WO/2014/099750 A2及WO/2013142578 A1，該等文獻中之每一者之全文皆以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，Cas9核酸酶可以蛋白質形式提供。例如，在一些態樣中，可用於本揭示案之細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)可藉由引入Cas9核酸酶蛋白及包含gRNA之核酸分子來修飾(例如以具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白)。在一些態樣中，Cas9核酸酶蛋白及包含gRNA之核酸分子可依序引入細胞中。在一些態樣中，Cas9核酸酶蛋白及包含gRNA之核酸分子可同時引入細胞中。例如，在一些態樣中，同時投與包括同時但作為單獨組合物引入Cas9核酸酶蛋白及包含gRNA之核酸分子。在一些態樣中，Cas9蛋白可以與包含gRNA之核酸分子之複合物形式(即作為單一組合物)提供。

在一些態樣中，Cas9核酸酶可以編碼蛋白質之核酸形式提供。因此，在一些態樣中，可用於本揭示案之細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)可藉由引入編碼Cas9核酸酶蛋白之第一核酸分子及包含gRNA之第二核酸分子來修飾(例如以具有降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白)。在一些態樣中，第一及第二核酸分子可依序引入細胞中。在一些態樣中，第一及第二核酸分子可同時引入細胞中。例如，在一些態樣中，第一及第二核酸分子可同時但作為單獨組合物引入細胞中。在一些態樣中，第一及第二核酸分子可為單一多核苷酸之一部分，且細胞經修飾以包含單一多核苷酸。

編碼Cas9核酸酶之核酸可為RNA (例如信使RNA (mRNA))或DNA。在一些態樣中，gRNA可以RNA形式提供。在一些態樣中，gRNA可以編碼RNA之DNA形式提供。在一些態樣中，gRNA可以單獨crRNA及tracrRNA分子、或分別編碼crRNA及tracrRNA之單獨DNA分子形式提供。

在一些態樣中，gRNA包含編碼成簇規則間隔之短迴文重複(CRISPR) RNA (crRNA)及反式活化CRISPR RNA (tracrRNA)之第三核酸序列。在一些態樣中，Cas蛋白係I型Cas蛋白。在一些態樣中，Cas蛋白係II型Cas蛋白。在一些態樣中，II型Cas蛋白係Cas9。在一些態樣中，II型Cas (例如Cas9)係人類密碼子最佳化Cas。

在一些態樣中，Cas蛋白係可在靶核酸序列內產生單股斷裂(即「切口」)而不切割雙股DNA (dsDNA)之兩條股之「切口酶」。例如，Cas9包含兩個核酸酶結構域，即RuvC樣核酸酶結構域及HNH樣核酸酶結構域，其負責相對DNA股之裂解。該等結構域中任一者之突變可產生切口酶。產生切口酶之突變之實例可參見例如WO/2013/ 176772 A1及WO/2013/142578 A1，其中之每一者以引用方式併入本文中。

在一些態樣中，特異性針對dsDNA每股上之靶位點之兩種單獨Cas蛋白(例如切口酶)可產生與另一核酸上之懸突序列互補之懸突序列或相同核酸上之單獨區域。藉由使核酸與特異性針對dsDNA雙股上之靶位點之兩種切口酶接觸產生之懸突末端可為5′或3′懸突末端。舉例而言，第一種切口酶可在dsDNA之第一股上產生單股斷裂，而第二種切口酶可在dsDNA之第二股上產生單股斷裂，使得產生懸突序列。可選擇產生單股斷裂之每一切口酶之靶位點，使得所產生之懸突末端序列與不同核酸分子上之懸突末端序列互補。可藉由本文所揭示之方法使兩個不同核酸分子之互補懸突末端退火。在一些態樣中，第一股上之切口酶之靶位點不同於第二股上之切口酶之靶位點。

在一些態樣中， NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及其編碼之NR4A蛋白的表現係藉由使細胞與CRISPR (例如CRISPR-Cas9系統)接觸來降低，該CRISPR例如特異性針對 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因。在一些態樣中，CRISPR特異性針對 NR4A1基因。因此，在一些態樣中，在與CRISPR接觸後，細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)具有：(i)降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)內源水準之 NR4A2基因及/或蛋白，及(iii)內源水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，CRISPR特異性針對 NR4A2基因。因此，在一些態樣中，在與CRISPR接觸後，細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)具有：(i)內源水準之 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白，及(iii)內源水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，CRISPR特異性針對 NR4A3基因。因此，在一些態樣中，在與CRISPR接觸後，細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)具有：(i)內源水準之 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)內源水準之 NR4A2基因及/或蛋白，及(iii)降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。

如本文所述，在一些態樣中，CRISPR靶向多種 NR4A基因。例如，在一些態樣中，CRISPR能夠靶向 NR4A1基因及 NR4A2基因。因此，在一些態樣中，在與CRISPR接觸後，細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)具有：(i)降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白，及(iii)內源水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，CRISPR能夠靶向 NR4A1基因及 NR4A3基因。因此，在一些態樣中，在與CRISPR接觸後，細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)具有：(i)降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)內源水準之 NR4A2基因及/或蛋白，及(iii)降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，CRISPR能夠靶向 NR4A2基因及/或 NR4A3基因。在一些態樣中，在與CRISPR接觸後，細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)具有：(i)內源水準之 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白，及(iii)降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中，CRISPR能夠靶向 NR4A1基因、 NR4A2基因及 NR4A3基因。因此，在一些態樣中，在與CRISPR接觸後，細胞(例如CAR或TCR表現免疫細胞)具有：(i)降低水準之 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)降低水準之 NR4A2基因及/或蛋白，及(iii)降低水準之 NR4A3基因及/或蛋白。

在一些態樣中，相對於在參考細胞(例如未使用CRISPR進行基因編輯之相應細胞)中觀察到之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因水準，使用CRISPR之基因編輯使 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因水準降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。在一些態樣中，CRISPR完全消除免疫細胞中 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)之表現。在一些態樣中， NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因水準可使用此項技術中已知之任一技術、例如藉由數位液滴PCR來量測。

在一些態樣中，本文所揭示之編碼gRNA及/或Cas9之核酸係RNA或DNA。在一些態樣中，本文所揭示之編碼gRNA及/或Cas9之RNA或DNA分別係合成RNA或合成DNA。在一些態樣中，合成RNA或DNA包含至少一個非天然核鹼基。在一些態樣中，某一類之所有核鹼基已經非天然核鹼基替代(例如，本文所揭示多核苷酸中之所有尿苷可經非天然核鹼基替代，例如5-甲氧基尿苷或假尿苷)。在一些態樣中，多核苷酸(例如合成RNA或合成DNA)僅包含天然核鹼基，即A、C、T及U (在合成DNA之情形下)或A、C、T及U (在合成RNA或合成DNA之情形下)。

一般而言，本文所揭示之CRISPR基因編輯方法包括使活體內、活體外或離體細胞(例如免疫細胞)與以下接觸：(i) Cas9或編碼Cas9之核酸；及(ii)至少一種 NR4A( NR4A1、 NR4A2或 NR4A3)基因引導RNA (gRNA)或編碼gRNA之核酸，其中gRNA靶向 NR4A基因中之序列(例如內含子及/或外顯子序列)，其中使細胞與Cas9及至少一種gRNA接觸可減少 NR4A( NR4A1、 NR4A2或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現。

在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含以下中所述序列中之任一者或多者、由其組成或基本上由其組成：SEQ ID NO: 30、52-57、58、61、65、67、68、70、71、75、76、82、83、86、94及96。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 30中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 30中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 30中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 30中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 52中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 52中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 52中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 52中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 53中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 53中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 53中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 53中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 54中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 54中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 54中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 54中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 55中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 55中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 55中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 55中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 56中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 56中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 56中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 56中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 57中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 57中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 57中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 57中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 58中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 58中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 58中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 58中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 61中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 61中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 61中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 61中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 65中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 65中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 65中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 65中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 67中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 67中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 67中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 67中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 68中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 68中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 68中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 68中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 70中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 70中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 70中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 70中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 71中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 71中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 71中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 71中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 75中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 75中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 75中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 75中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 76中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 76中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 76中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 76中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 82中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 82中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 82中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 82中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 83中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 83中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 83中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 83中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 86中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 86中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 86中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 86中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 94中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 94中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 94中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 94中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 96中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA包含SEQ ID NO: 96中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係由SEQ ID NO: 96中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A3基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 96中所述之序列組成。

如本文所述，在一些態樣中，基因編輯方法可進一步包括降低以下之水準：(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，或(iii) (i)及(ii)二者。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA包含SEQ ID NO: 25中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA包含SEQ ID NO: 25中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA係由SEQ ID NO: 25中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 25中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA包含SEQ ID NO: 26中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA包含SEQ ID NO: 26中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA係由SEQ ID NO: 26中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A1基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 26中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA包含SEQ ID NO: 27中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA包含SEQ ID NO: 27中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA係由SEQ ID NO: 27中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 27中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA包含SEQ ID NO: 28中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA包含SEQ ID NO: 28中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA係由SEQ ID NO: 28中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 28中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA包含SEQ ID NO: 29中所述之序列、由其組成或基本上由其組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA包含SEQ ID NO: 29中所述之序列。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA係由SEQ ID NO: 29中所述之序列組成。在一些態樣中，可用於靶向 NR4A2基因之gRNA係基本上由SEQ ID NO: 29中所述之序列組成。

如本文所用之術語「接觸」(例如使細胞(例如免疫細胞)與至少一種gRNA及至少一種Cas9接觸)意欲包括將至少一種gRNA及至少一種Cas蛋白(例如Cas9)在活體外細胞中一起培育(例如將gRNA及/或Cas蛋白或編碼gRNA及/或Cas9蛋白之核酸添加至培養中之細胞中)或活體內或離體接觸細胞。

使 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因靶序列與如本文所揭示之至少一種gRNA及至少一種Cas蛋白(例如Cas9) (或編碼其之至少一種核酸)接觸之步驟可以任何適宜方式實施。舉例而言，可在細胞培養條件下處理細胞，例如免疫細胞。應理解，與本文所揭示之至少一種gRNA及至少一種Cas蛋白(例如Cas9蛋白) (或編碼其之至少一種核酸)接觸之細胞亦可同時或隨後與另一劑(例如包含編碼CAR或TCR之至少一條核酸序列之載體)接觸。在一些態樣中，在活體外或離體接觸細胞後，該方法進一步包括將細胞引入個體中，由此治療或改善疾病或疾患(例如癌症)之症狀。

對於離體方法，細胞可包括自體細胞，即取自需要改變一或多個細胞中之靶多核苷酸序列(例如， NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因)之個體之一或多個免疫細胞(即供體與接受者係同一個體)。自體細胞具有避免任何基於免疫之細胞排斥之優點。替代地，細胞可為異源的，例如取自供體。通常，當細胞來自供體時，其將來自與接受者足夠免疫相容之供體，即不經歷移植排斥，以減少或去除對免疫抑制之需求。在一些態樣中，細胞取自異種來源，即已經遺傳改造以與接受者或接受者之物種足夠免疫相容之非人類哺乳動物。用於測定免疫相容性之方法為此項技術中已知，且包括組織分型以針對HLA及ABO決定簇評價供體-接受者相容性。參見例如Transplantation Immunology, Bach及Auchincloss編輯(Wiley, John & Sons公司, 1994年)。

在一些態樣中，本揭示案提供生成經修飾免疫細胞之方法，其包括藉由使細胞中之 NR4A基因序列與Cas9蛋白(或編碼該Cas9蛋白之核酸)及靶向 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因中之模體(例如位於 NR4A3之外顯子3及4中之模體)之一種gRNA接觸來改變離體細胞(例如免疫細胞，例如T細胞)中之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因序列，其中gRNA將Cas9蛋白引導至靶基因且與靶模體雜交，其中 NR4A基因部分或完全裂解，且其中裂解效率係約10%至約100%。該等gRNA之非限制性實例提供於本文中(參見例如表A、表C及表D)。如本文所述，在一些態樣中，本文所述之生成經修飾免疫細胞之方法包括藉由使細胞與編碼Cas9蛋白之第一核酸分子及包含靶向 NR4A基因家族之一或多個成員之gRNA之第二核酸分子接觸來改變 NR4A基因序列。在一些態樣中，第一及第二核酸分子係依序與細胞接觸。在一些態樣中，第一及第二核酸分子係同時與細胞接觸。例如，在一些態樣中，使細胞與單一多核苷酸接觸，該多核苷酸包含編碼Cas9蛋白之第一核酸分子及包含gRNA之第二核酸分子。

在一些態樣中，細胞在上文所述之改變步驟之前、之後或同時用編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之核酸(例如載體)修飾(例如轉染)。另外，如本揭示案之別處進一步闡述，在一些態樣中，細胞在上文所述之改變步驟之前、之後或同時經修飾以具有增加水準之c-Jun蛋白。

在一些態樣中，裂解效率係至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或約100%。

本揭示案之CRISPR/Cas系統可使用不同長度之gRNA間隔體序列，此端視所用Cas (例如Cas9)而定。來自不同物種之Cas9必須與其相應gRNA配對以形成功能性核糖核蛋白(RNP)複合物，換言之，自不同細菌物種改造之嵌合gRNA框因間隔體序列及嵌合框序列之差別而可具有不同長度。

在一些態樣中，gRNA間隔體序列可長至少約18個核苷酸(例如約18個、約19個、約20個、約21個或約22個核苷酸)。舉例而言，gRNA中結合至釀膿鏈球菌Cas9之釀膿鏈球菌gRNA間隔體序列之長度為20個核苷酸，而gRNA中結合至金黃色葡萄球菌Cas9之金黃色葡萄球菌( S. aureus) gRNA間隔體序列之長度為21個核苷酸。在一些態樣中，gRNA間隔體序列可包含10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、26個、27個、28個、29個、30個、31個、32個、33個、34個或35個核苷酸。

儘管gRNA間隔體序列與其在 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因上結合之DNA股之間的完全匹配係較佳的，但亦允許gRNA間隔體序列與 NR4A靶序列之間存在錯配，只要其仍可降低 NR4A基因水準或降低 NR4A基因功能即可。gRNA上與靶 NR4A序列完全互補之介於約8至約12個連續核苷酸之間的「種子」序列較佳用於正確識別 NR4A基因上之靶序列。gRNA間隔體序列之其餘部分可包含一或多個錯配。

一般而言，gRNA活性與錯配數呈負相關。較佳地，本揭示案之gRNA間隔體序列包含少於約7個錯配。在一些態樣中，gRNA間隔體序列與相應 NR4A基因靶序列包含7個錯配、6個錯配、5個錯配、4個錯配、3個錯配，更佳地2個錯配或更少，且甚至更佳地無錯配。gRNA中核苷酸之數量越少，容許之錯配數越少。認為結合親和力取決於匹配gRNA-DNA組合之和。

本揭示案之gRNA間隔體序列可經選擇以最小化CRISPR/Cas編輯系統之脫靶效應。因此，在一些態樣中，選擇gRNA間隔體序列，使得其與細胞中之所有其他基因體核苷酸序列相比含有至少兩個錯配。在一些態樣中，選擇gRNA間隔體序列，使得其與細胞中之所有其他基因體核苷酸序列相比含有至少一個錯配。熟習此項技術者應瞭解，可使用多種技術來選擇適宜gRNA間隔體序列以最小化脫靶效應(例如生物資訊學分析)。

在一些態樣中，gRNA間隔體序列包含SEQ ID NO: 31-42之間隔體序列、由其組成或基本上由其組成。

在一些態樣中，gRNA間隔體序列包含與SEQ ID NO: 31-42中任一者之DNA序列相比包含至少一個、兩個、三個、四個或五個核苷酸錯配之間隔體序列、由其組成或基本上由其組成。

在一些態樣中，可藉由靶向多個位置來增加編輯效能。

在一些態樣中，兩個gRNA與 NR4A基因之同一股上之序列互補及/或雜交。在一些態樣中，兩個gRNA與 NR4A基因之相對股上之序列互補及/或雜交。在一些態樣中，兩個gRNA不與 NR4A基因之相對股上之序列互補及/或雜交。在一些態樣中，兩個gRNA與 NR4A基因之重疊靶模體互補及/或雜交。在一些態樣中，兩個gRNA與 NR4A基因之偏移靶模體互補及/或雜交。

一般而言，本揭示案之gRNA可包含其序列或化學修飾之任一變異體，條件係其允許相應Cas蛋白(例如Cas9蛋白)結合至靶序列，且隨後切除(全部或一部分) NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因。

本文所揭示方法中所用之Cas蛋白(例如Cas9)係裂解核酸之核酸內切酶，由多種細菌基因體之CRISPR基因座編碼並參與II型CRISPR系統。Cas9蛋白係由多個細菌物種產生，包括釀膿鏈球菌( Streptococcus pyogenes)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、嗜熱鏈球菌( Streptococcus thermophilus)、腦膜炎雙球菌( Neisseria meningitidis)等。因此，可用於本揭示案之Cas9蛋白可衍生自此項技術中已知之任何適宜細菌。該等細菌之非限制性實例包括釀膿鏈球菌、變種鏈球菌( Streptococcus mutans)、肺炎鏈球菌( Streptococcus pneumonia)、金黃色鏈球菌( Streptococcus aureus)、嗜熱鏈球菌、空腸彎曲桿菌( Campylobacter jejuni)、腦膜炎雙球菌、敗血性巴氏桿菌( Pasteurella multocida)、無害李斯特氏菌( Listeria innocua)及新兇手弗朗西斯菌( Francisella novicida)。本文所揭示之方法可使用此項技術中已知之任一Cas9來實踐。在一些態樣中，Cas9係野生型Cas9。在一些態樣中，Cas9係具有增強的酶活性之突變Cas9或包含Cas9部分之融合蛋白。在一些態樣中，Cas9核酸酶蛋白係釀膿鏈球菌Cas9蛋白。

由於Cas9核酸酶蛋白通常在細菌中表現，故在設計及製備Cas9重組蛋白時，修飾其核酸序列用於真核細胞(例如哺乳動物細胞)中之最佳表現可能係有利的。因此，在一些態樣中，編碼本文所揭示方法中所用之Cas9之核酸已經密碼子最佳化用於在真核細胞中表現，例如用於在有需要之人類個體之細胞中表現。

在一些態樣中，本文所揭示方法中所用之Cas9蛋白包含一或多個胺基酸取代或修飾。在一些態樣中，一或多個胺基酸取代包含保守胺基酸取代。在一些情況下，取代及/或修飾可防止或減少蛋白水解性降解及/或延長細胞中多肽之半衰期。在一些態樣中，Cas9蛋白可包含肽鍵替代(例如脲、硫脲、胺基甲酸酯、磺醯脲等)。在一些態樣中，Cas9蛋白可包含天然胺基酸。在一些態樣中，Cas9蛋白可包含替代性胺基酸(例如D-胺基酸、β-胺基酸、高半胱胺酸、磷酸絲胺酸等)。在一些態樣中，Cas9蛋白可包含修飾以包括異源部分(例如聚乙二醇化、糖基化、脂化、乙醯化、封端等)。

儘管本文所揭示之方法通常係使用Cas9蛋白來實踐，但設想在一些態樣中，Cas蛋白可為Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7或Cas8。在一些態樣中，Cas蛋白係來自任何細菌物種之Cas9蛋白或其功能部分。在一些特定態樣中，本文所揭示方法中所用之Cas9蛋白係釀膿鏈球菌或金黃色葡萄球菌Cas9蛋白或其功能部分，或編碼該Cas9或其功能部分之核酸。其他可用Cas核酸酶之非限制性實例為此項技術中已知且闡述於例如US 9,970,001 B2；US 10,221,398 B2；及US 2020/0190487 A1中，該等專利中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，可用於本揭示案之Cas核酸酶包含I型Cas蛋白。I型Cas蛋白之非限制性實例包括Cas3、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8a、Cas8b、Cas8c、Cas10d、Cse1、Cse2、Csy1、Csy2、Csy3及其變異體。在一些態樣中，可用於本揭示案之Cas核酸酶包含II型Cas蛋白。II型Cas蛋白之非限制性實例包括Cas9、Csn2、Cas4及其變異體。在一些態樣中，可用於本揭示案之Cas核酸酶包含III型Cas蛋白。非限制性實例包括Cas10、Csm2、Cmr5、Csx10、Csx11及其變異體。在一些態樣中，可用於本揭示案之Cas核酸酶包含IV型Cas蛋白。該Cas蛋白之非限制性實例包括Csf1。在一些態樣中，可用於本揭示案之Cas核酸酶包含V型Cas蛋白。非限制性實例包括Cas12、Cas12a (Cpf1)、Cas12b (C2c1)、Cas12c (C2c3)、Cas12d (CasY)、Cas12e (CasX)、Cas12f (Cas14、C2c10)、Cas12g、Cas12h、Cas12i、Cas12k (C2c5)、C2c4、C2c8、C2c9及其變異體。在一些態樣中，可用於本揭示案之Cas核酸酶包含VI型Cas蛋白。VI型Cas蛋白之非限制性實例包括Cas13、Cas13a (C2c2)、Cas13b、Cas13c、Cas13d及其變異體。

在一些情形下，可用於本揭示案之Cas蛋白包含上文所提及Cas蛋白之異種同源物或同源物。術語「異種同源物(orthologue)」 (在本文中亦稱為「異種同源物(ortholog)」)及「同源物(homologue)」 (在本文中亦稱為「同源物(homolog)」)為此項技術中所熟知。藉助進一步引導，如本文所用之蛋白質之「同源物」係與其同源蛋白質發揮相同或相似功能之同一種類之蛋白質。同源蛋白質可能但無需係結構相關的，或僅係部分結構相關的。如本文所用之蛋白質之「異種同源物」係與其異種同源蛋白質發揮相同或相似功能之不同種類之蛋白質。異種同源蛋白質可能但無需係結構相關的，或僅係部分結構相關的。

如本文所用之「功能部分」係指肽(例如Cas9)之一部分，其保留與至少一種gRNA複合且裂解靶序列，從而減少 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現的能力。在一些態樣中，功能部分包含選自由以下組成之群之可操作連接之Cas9蛋白功能結構域之組合：DNA結合結構域、至少一個RNA結合結構域、解旋酶結構域及核酸內切酶結構域。在一些態樣中，功能結構域形成非共價複合物。在一些態樣中，功能結構域形成融合複合物(例如融合蛋白)。在一些態樣中，功能結構域係化學連接的(例如經由一或多個間隔體或連接體)。在一些態樣中，功能結構域係結合的。

應瞭解，本揭示案涵蓋使 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因與至少一種gRNA及至少一種Cas蛋白(例如Cas9)接觸之多種方式。在一些態樣中，外源Cas蛋白(例如Cas9)可以多肽形式引入細胞中。在一些態樣中，Cas蛋白(例如Cas9)可結合至或融合至細胞穿透多肽或細胞穿透肽。如本文所用之「細胞穿透多肽」及「細胞穿透肽」分別指促進分子攝取至細胞中之多肽或肽。細胞穿透多肽可含有可偵測標記。

在一些態樣中，Cas蛋白(例如Cas9)可結合至或融合至帶電蛋白質，例如攜帶正電荷、負電荷或總體中性電荷之蛋白質。該鍵聯可為共價的。在一些態樣中，Cas蛋白(例如Cas9)可融合至超帶正電之肽以顯著增加Cas蛋白(例如Cas9)穿透細胞之能力。參見Cronican等人，ACS Chem. Biol. 5(8):747-52 (2010)。在一些態樣中，Cas蛋白(例如Cas9)可融合至蛋白質轉導結構域(PTD)以促進其進入細胞中。例示性PTD包括(但不限於) Tat、寡精胺酸及穿透素。因此，在一些特定態樣中，本文所揭示之方法可使用Cas蛋白(例如Cas9蛋白)來實踐，該Cas蛋白包含融合至細胞穿透肽之Cas蛋白、融合至PTD之Cas蛋白、融合至tat結構域之Cas蛋白、融合至寡精胺酸結構域之Cas蛋白、融合至穿透素結構域之Cas蛋白或其組合。

在一些態樣中，Cas蛋白(例如Cas9)可引入細胞(例如免疫細胞，例如表現CAR或TCR且具有增加水準之c-Jun蛋白之免疫細胞)中，該細胞含有呈編碼Cas蛋白(例如Cas9)之核酸形式之靶多核苷酸序列，例如， NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因。將核酸引入細胞中之過程可藉由任一適宜技術來達成。適宜技術包括磷酸鈣或脂質介導之轉染、電穿孔及使用病毒載體轉導或感染。在一些態樣中，核酸包含DNA。在一些態樣中，核酸包含如本文所述之經修飾DNA。在一些態樣中，核酸包含mRNA。在一些態樣中，核酸包含如本文所述之經修飾mRNA (例如合成經修飾mRNA)。

本文所揭示方法中所用之gRNA序列及/或編碼Cas9之核酸序列可經化學修飾以增強例如其穩定性(例如以增加其在投與有需要之個體後之血漿半衰期)。對本文所揭示之gRNA及/或編碼例如Cas9之核酸序列之可能化學修飾詳細論述於本說明書之下文中。

在一些態樣中，整個gRNA經化學修飾。在一些態樣中，僅gRNA間隔體經化學修飾。在一些態樣中，gRNA間隔體及gRNA框序列經化學修飾。特定化學修飾之非限制性實例詳細揭示於下文中。

因此，在本文所揭示方法之一些態樣中，Cas蛋白(例如Cas9)及一或多種gRNA經由自編碼其之一或多種遞送載體表現提供至靶細胞。在一些態樣中，上文所提及用於在靶細胞中引入一或多種gRNA及Cas9之一或多種載體係病毒載體。在一些態樣中，上文所提及用於在靶細胞中引入一或多種gRNA及Cas9之一或多種載體係非病毒載體。在一些態樣中，病毒載體係腺相關載體(AAV)、慢病毒載體(LV)、反轉錄病毒載體、腺病毒載體、疱疹病毒載體或其組合。一或多種AAV載體可基於若干衣殼類型中之一或多者，包括AAVI、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8及AAV9。在一些態樣中，AAV載體係AAVDJ-8、AAV2DJ9或其組合。

除上文所揭示之方法外，本揭示案進一步提供組合物以實踐所揭示之方法。因此，本揭示案提供編碼至少一種上文所提及gRNA之核酸。

亦提供組合物及/或至少一種Cas9。在一些態樣中，編碼Cas9之核酸編碼(i)金黃色葡萄球菌之Cas9，(ii)釀膿鏈球菌之Cas9，(iii)衍生自金黃色葡萄球菌之Cas9或釀膿鏈球菌之Cas9的突變體Cas9，其中突變體蛋白保留Cas9活性，(iv)包含Cas9部分之融合蛋白，或(v)其組合。

在一些態樣中，可使用一或多種基因編輯工具(例如本文所揭示之基因編輯工具)來修飾本揭示案之細胞。 IV.A.2. TALEN

在一些態樣中，可用於編輯(例如減少或抑制) NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現之基因編輯工具係核酸酶劑，例如轉錄活化劑樣效應核酸酶(TALEN)。TAL效應核酸酶係一類序列特異性核酸酶，其可用於在原核或真核有機體之基因體中之特定靶序列處製造雙股斷裂。TAL效應核酸酶係藉由將原生或經改造之轉錄活化劑樣(TAL)效應物或其功能部分融合至核酸內切酶(例如FokI)之催化結構域而產生。

獨特的模組TAL效應DNA結合結構域允許設計具有潛在任何給定DNA識別特異性之蛋白質。因此，TAL效應核酸酶之DNA結合結構域可經改造以識別特定DNA靶位點且因此用於在期望靶序列處製造雙股斷裂。參見WO 2010/079430；Morbitzer等人，(2010) PNAS10.1073/pnas.1013133107；Scholze及Boch (2010) Virulence1:428-432；Christian等人， Genetics(2010) 186:757-761；Li等人，(2010) Nuc. Acids Res. (2010) doi:10.1093/nar/gkq704；及Miller等人，(2011) Nature Biotechnology29:143-148；該等所有參考文獻之全文皆以引用方式併入本文中。

適宜TAL核酸酶及製備適宜TAL核酸酶之方法的非限制性實例揭示於例如美國專利申請案第2011/ 0239315 A1號、美國專利申請案第2011/0269234 A1號、美國專利申請案第2011/0145940 A1號、美國專利申請案第2003/0232410 A1號、美國專利申請案第2005/0208489 A1號、美國專利申請案第2005/0026157 A1號、美國專利申請案第2005/0064474 A1號、美國專利申請案第2006/ 0188987 A1號及美國專利申請案第2006/0063231 A1號(各自以引用方式併入本文中)中。

在多個態樣中，TAL效應核酸酶經改造，其在例如所關注基因體基因座中之靶核酸序列中或附近切割，其中靶核酸序列處於欲由靶向載體修飾之序列處或附近。適於與本文所提供之各種方法及組合物一起使用之TAL核酸酶包括經特異性設計以在欲由如本文所述之靶向載體修飾之靶核酸序列處或附近結合的TAL核酸酶。

在一些態樣中，TALEN之每一單體包含約12至約25個TAL重複，其中每一TAL重複結合1 bp亞位點。在一些態樣中，核酸酶劑係包含可操作連接至獨立核酸酶之基於TAL重複之DNA結合結構域之嵌合蛋白。在一些態樣中，獨立核酸酶係FokI核酸內切酶。在一些態樣中，核酸酶劑包含基於TAL重複之第一DNA結合結構域及基於TAL重複之第二DNA結合結構域，其中基於TAL重複之第一及第二DNA結合結構域中之每一者可操作連接至FokI核酸酶，其中基於TAL重複之第一及第二DNA結合結構域識別每股靶DNA序列中由約6 bp至約40 bp裂解位點分開之兩條鄰接靶DNA序列，且其中FokI核酸酶二聚化且在靶序列處製造雙股斷裂。

在一些態樣中，核酸酶劑包含基於TAL重複之第一DNA結合結構域及基於TAL重複之第二DNA結合結構域，其中基於TAL重複之第一及第二DNA結合結構域中之每一者可操作連接至FokI核酸酶，其中基於TAL重複之第一及第二DNA結合結構域識別每股靶DNA序列中由5 bp或6 bp裂解位點分開之兩條鄰接靶DNA序列，且其中FokI核酸酶二聚化且製造雙股斷裂。 IV.A.3. 鋅指核酸酶 (ZFN)

在一些態樣中，可用於本揭示案之基因編輯工具包括核酸酶劑，例如鋅指核酸酶(ZFN)系統。基於鋅指之系統包含融合蛋白，其包含兩個蛋白質結構域：鋅指DNA結合結構域及酶結構域。「鋅指DNA結合結構域」、「鋅指蛋白」或「ZFP」係經由一或多個鋅指以序列特異性方式結合DNA之蛋白質或較大蛋白質內之結構域，該一或多個鋅指係結合結構域內之胺基酸序列之區域，其結構經由鋅離子之配位而穩定。鋅指結構域藉由結合至靶DNA序列(例如， NR4A1 、 NR4A2或 NR4A3)將酶結構域之活性引導至序列附近，且因此誘導靶序列附近內源靶基因之修飾。鋅指結構域可經改造以結合至幾乎任何期望序列。如本文所揭示，在一些態樣中，鋅指結構域結合編碼NR4A (NR4A1、NR4A2及/或NR4A3)蛋白之DNA序列。因此，在鑑別含有期望裂解或重組之靶DNA序列之靶遺傳基因座後，一或多個鋅指結合結構域可經改造以結合至靶遺傳基因座中之一或多條靶DNA序列。在細胞中表現包含鋅指結合結構域及酶結構域之融合蛋白實現靶遺傳基因座之修飾。

在一些態樣中，鋅指結合結構域包含一或多個鋅指。Miller等人，(1985) EMBO J. 4:1609-1614；Rhodes (1993) Scientific American February:56-65；美國專利第6,453,242號。通常，單一鋅指結構域之長度為約30個胺基酸。個別鋅指結合至三核苷酸(即三聯體)序列(或可與相鄰鋅指之四核苷酸結合位點重疊一個核苷酸之四核苷酸序列)。因此，鋅指結合結構域經改造以結合之序列(例如靶序列)之長度將決定經改造之鋅指結合結構域中鋅指之數量。舉例而言，對於指模體不與重疊亞位點結合之ZFP，六核苷酸靶序列係由兩指結合結構域結合；九核苷酸靶序列係由三指結合結構域結合等。靶位點中個別鋅指之結合位點(即亞位點)無需鄰接，但可由一或若干個核苷酸分開，此端視多指結合結構域中鋅指之間的胺基酸序列(即指間連接體)之長度及性質而定。在一些態樣中，個別ZFN之DNA結合結構域包含介於三個與六個之間的個別鋅指重複且可各自識別介於約9個與約18個之間的鹼基對。

鋅指結合結構域可經改造以結合至所選序列。參見例如Beerli等人，(2002) Nature Biotechnol.20:135-141；Pabo等人，(2001) Ann. Rev. Biochem.70:313-340；Isalan等人，(2001) Nature Biotechnol. 19:656-660；Segal等人，(2001) Curr. Opin. Biotechnol.12:632-637；Choo等人，(2000) Curr. Opin. Struct. Biol.10:411-416。與天然鋅指蛋白相比，經改造之鋅指結合結構域可具有新穎結合特異性。改造方法包括(但不限於)合理設計及各種類型之選擇。

用於鋅指結構域結合之靶DNA序列之選擇可例如根據美國專利第6,453,242號中所揭示之方法來實現。熟習此項技術者應明瞭，核苷酸序列之簡單目視檢查亦可用於選擇靶DNA序列。因此，在本文所述之方法中可使用任何靶DNA序列選擇方法。靶位點之長度通常為至少約9個核苷酸，且因此由包含至少三個鋅指之鋅指結合結構域結合。然而，例如4指結合結構域與12核苷酸靶位點結合、5指結合結構域與15核苷酸靶位點結合或6指結合結構域與18核苷酸靶位點結合亦係可能的。如應明瞭，更大結合結構域(例如7指、8指、9指及更多指)與更長靶位點之結合亦係可能的。

鋅指融合蛋白之酶結構域部分可自任何核酸內切酶或核酸外切酶獲得。可衍生出酶結構域之例示性核酸內切酶包括(但不限於)限制性核酸內切酶及歸巢核酸內切酶。參見例如2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.；及Belfort等人，(1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388。已知裂解DNA之其他酶(例如51核酸酶；綠豆核酸酶；胰臟DNaseI；微球菌核酸酶；酵母菌HO核酸內切酶；亦參見Linn等人(編輯) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993)。該等酶中之一或多者(或其功能片段)可用作裂解結構域之來源。

適於用作本文所述ZFP之酶結構域之例示性限制性核酸內切酶(限制酶)存在於許多物種中且能夠序列特異性結合至DNA (在識別位點處)，並在結合位點處或附近裂解DNA。某些限制酶(例如IIS型)在自識別位點移除之位點裂解DNA且具有可分開之結合及裂解結構域。舉例而言，IIS型酶FokI在一股上距其識別位點9個核苷酸及另一股上距其識別位點13個核苷酸處催化DNA之雙股裂解。參見例如美國專利第5,356,802號；美國專利第5,436,150號及美國專利第5,487,994號；以及Li等人，(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA89:4275-4279；Li等人，(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90:2764-2768；Kim等人，(1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA91:883-887；Kim等人，(1994b) J. Biol. Chem.269: 31,978-31,982。因此，在一些態樣中，融合蛋白包含來自至少一種IIS型限制酶之酶結構域及一或多個鋅指結合結構域。

裂解結構域可與結合結構域分開之例示性IIS型限制酶係FokI。此特定酶作為二聚體有活性。Bitinaite等人，(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA95: 10,570-10,575。因此，對於使用鋅指-FokI融合物之靶向雙股DNA裂解，可使用各自包含FokI酶結構域之兩個融合蛋白來重構催化活性裂解結構域。替代地，亦可使用含有鋅指結合結構域及兩個FokI酶結構域之單一多肽分子。包含FokI酶結構域之例示性ZFP闡述於美國專利第9,782,437號中。 IV.A.3. 大範圍核酸酶

在一些態樣中，用於調控細胞中之NR4A (NR4A1、NR4A2及/或NR4A3)表現之基因編輯工具包括核酸酶劑，例如大範圍核酸酶系統。大範圍核酸酶已基於保守序列模體分類成四個家族，該等家族係「LAGLIDADG」、「GIY-YIG」、「H-N-H」及「His-Cys盒」家族。該等模體參與金屬離子之配位及磷酸二酯鍵之水解。

HEase之顯著之處在於其長識別位點及耐受其DNA受質中之一些序列多態性。已知大範圍核酸酶結構域、結構及功能，參見例如Guhan及Muniyappa (2003) Crit Rev Biochem Mol Biol 38:199-248；Lucas等人，(2001) Nucleic Acids Res29:960-9；Jurica及Stoddard, (1999) Cell Mol Life Sci55:1304-26；Stoddard, (2006) Q Rev Biophys38:49-95；及Moure等人，(2002) Nat Struct Biol9:764。

在一些實例中，使用天然變異體及/或經改造之衍生性大範圍核酸酶。已知用於改質動力學、輔因子相互作用、表現、最佳條件及/或識別位點特異性以及篩選活性之方法，參見例如Epinat等人，(2003) Nucleic Acids Res31:2952-62；Chevalier等人，(2002) Mol Cell10:895-905；Gimble等人，(2003) Mol Biol334:993-1008；Seligman等人，(2002) Nucleic Acids Res30:3870-9；Sussman等人，(2004) J Mol Biol342:31-41；Rosen等人，(2006) Nucleic Acids Res34:4791-800；Chames等人，(2005) Nucleic Acids Res33:e178；Smith等人，(2006) Nucleic Acids Res34:e149；Gruen等人，(2002) Nucleic Acids Res30:e29；Chen及Zhao, (2005) Nucleic Acids Res33:e154；WO2005105989；WO2003078619；WO2006097854；WO2006097853；WO2006097784；及WO2004031346；該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。

可在本文中使用任一大範圍核酸酶，包括(但不限於) I-SceI、I-SceII、I-SceIII、I-SceIV、I-SceV、I-SecVI、I-SceVII、I-CeuI、I-CeuAIIP、I-CreI、I-CrepsbIP、I-CrepsbIIP、I-CrepsbIIIP、I-CrepsbIVP、I-TliI、I-PpoI、PI-PspI、F-SceI、F-SceII、F-SuvI、F-TevI、F-TevII、I-AmaI、I-AniI、I-ChuI、I-CmoeI、I-CpaI、I-CpaII、I-CsmI、I-CvuI、I-CvuAIP、I-DdiI、I-DdiII、I-DirI、I-DmoI、I-HmuI、I-HmuII、I-HsNIP、I-LlaI、I-MsoI、I-NaaI、I-NanI、I-NcIIP、I-NgrIP、I-NitI、I-NjaI、I-Nsp236IP、I-PakI、I-PboIP、I-PcuIP、I-PcuAI、I-PcuVI、I-PgrIP、I-PobIP、I-PorIIP、I-PbpIP、I-SpBetaIP、I-ScaI、I-SexIP、I-SneIP、I-SpomI、I-SpomCP、I-SpomIP、I-SpomIIP、I-SquIP、I-Ssp6803I、I-SthPhiJP、I-SthPhiST3P、I-SthPhiSTe3bP、I-TdeIP、I-TevI、I-TevII、I-TevIII、I-UarAP、I-UarHGPAIP、I-UarHGPA13P、I-VinIP、I-ZbiIP、PI-MtuI、PI-MtuHIP、PI-MtuHIIP、PI-PfuI、PI-PfuII、PI-PkoI、PI-PkoII、PI-Rma43812IP、PI-SpBetaIP、PI-SceI、PI-TfuI、PI-TfuII、PI-ThyI、PI-TliI、PI-TliII或其任何活性變異體或片段。

在一些態樣中，大範圍核酸酶識別12至40個鹼基對之雙股DNA序列。在一些態樣中，大範圍核酸酶識別基因體中之一條完全匹配之靶序列。在一些態樣中，大範圍核酸酶係歸巢核酸酶。在一些態樣中，歸巢核酸酶係歸巢核酸酶之「LAGLIDADG」家族。在一些態樣中，歸巢核酸酶之「LAGLIDADG」家族選自I-SceI、I-CreI、I-Dmol或其組合。 IV.A.4. 限制性核酸內切酶

在一些態樣中，可用於本揭示案之基因編輯工具包括核酸酶劑，例如限制性核酸內切酶，其包括I型、II型、III型及IV型核酸內切酶。I型及III型限制性核酸內切酶識別特定識別位點，但通常在距核酸酶結合位點之可變位置進行裂解，該可變位置可遠離裂解位點(識別位點)數百個鹼基對。在II型系統中，限制活性獨立於任何甲基酶活性，且裂解通常係在結合位點內或附近之特定位點進行。大多數II型酶切割迴文序列，然而IIa型酶識別非迴文識別位點且在識別位點外部裂解，IIb型酶切割序列兩次且兩個位點皆在識別位點外部，並且IIs型酶識別不對稱識別位點且在一側在距識別位點約1-20個核苷酸之限定距離裂解。IV型限制酶靶向甲基化DNA。限制酶在以下中進一步闡述及分類：例如REBASE資料庫(rebase.neb.com之網頁；Roberts等人，(2003) Nucleic Acids Res31:418-20)；Roberts等人，(2003) Nucleic Acids Res31:1805-12；及Belfort等人，(2002)，Mobile DNA II，第761-783頁，Craigie等人編輯(ASM Press, Washington, D.C.)。

如本文所述，在一些態樣中，基因編輯工具(例如CRISPR、TALEN、大範圍核酸酶、限制性核酸內切酶、RNAi、反義寡核苷酸)可藉由此項技術中已知之任何方法引入細胞中。在一些態樣中，可將編碼特定基因編輯工具之多肽直接引入細胞中。替代地，可將編碼基因編輯工具之多核苷酸引入細胞中。在一些態樣中，當將編碼基因編輯工具之多核苷酸引入細胞中時，基因編輯工具可在細胞內瞬時、條件化或組成性表現。因此，編碼基因編輯工具之多核苷酸可含於表現盒中且可操作連接至條件啟動子、誘導型啟動子、組成型啟動子或組織特異性啟動子。替代地，基因編輯工具係作為編碼或包含基因編輯工具之mRNA引入細胞中。

亦提供核酸酶劑之活性變異體及片段(即經改造之核酸酶劑)。該等活性變異體可包含與原生核酸酶劑至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更大之序列一致性，其中活性變異體保留在期望識別位點處切割之能力且因此保留切口或雙股斷裂誘導活性。舉例而言，本文所述之任一核酸酶劑可自原生核酸內切酶序列修飾且經設計以識別並誘導不會由原生核酸酶劑識別之識別位點處之切口或雙股斷裂。因此，在一些態樣中，經改造之核酸酶對誘導不同於相應原生核酸酶劑識別位點之識別位點處之切口或雙股斷裂具有特異性。用於切口或雙股斷裂誘導活性之分析已知且通常量測核酸內切酶對含有識別位點之DNA受質之總體活性及特異性。

當經由引入編碼核酸酶劑之多核苷酸將核酸酶劑提供至細胞時，與編碼核酸酶劑之天然多核苷酸序列相比，該編碼核酸酶劑之多核苷酸可經修飾以取代在所關注細胞中具有較高使用頻率之密碼子。舉例而言，編碼核酸酶劑之多核苷酸可經修飾以取代在所關注給定細胞中具有較高使用頻率之密碼子。 IV.A.5. 干擾 RNA (RNAi)

在一些態樣中，可用於減少細胞中之NR4A (NR4A1、NR4A2及/或NR4A3)表現之基因編輯工具包括RNA干擾分子(「RNAi」)。如本文所用，RNAi係RNA多核苷酸，其經由內源基因沈默路徑(例如切丁酶及RNA誘導之沈默複合物(RISC))降解靶mRNA來調介減少的內源靶基因產物表現。RNAi劑之非限制性實例包括微小RNA (在本文中亦稱為「miRNA」)、短髮夾RNA (shRNA)、小干擾RNA (siRNA)、RNA適配體或其組合。

在一些態樣中，可用於本揭示案之基因編輯工具包含一或多個miRNA。「miRNA」係指長度為約21-25個核苷酸之天然的小的非編碼RNA分子。在一些態樣中，可用於本揭示案之miRNA至少部分地與 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3) mRNA分子互補。miRNA可經由轉譯抑制、裂解mRNA及/或去腺苷酸化下調(例如減少)內源靶基因產物(即NR4A蛋白)之表現。

在一些態樣中，可與本揭示案一起使用之基因編輯工具包含一或多個shRNA。「shRNA」(或「短髮夾RNA」分子)係指包含雙股區及在一端形成髮夾環之環區之RNA序列，其可用於減少及/或沈默基因表現。在莖之每一側，雙股區之長度通常為約19個核苷酸至約29個核苷酸，且環區之長度通常為約3至約10個核苷酸(且3′或5′末端單股懸突核苷酸係視情況存在的)。可將shRNA選殖至質體或非複製重組病毒載體中以引入細胞內並將shRNA編碼序列整合至基因體中。因此，shRNA可提供內源靶基因(即， NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)轉譯及表現之穩定且恆定之抑制。

在一些態樣中，本文所揭示之基因編輯工具包含一或多個siRNA。「siRNA」係指長度通常為約21-23個核苷酸之雙股RNA分子。siRNA與多蛋白複合物(稱為RNA誘導之沈默複合物(RISC))締合，在此期間「過客(passenger)」有義股經酶裂解。含於活化RISC中之反義「引導」股隨後因序列同源性將RISC引導至相應mRNA，且相同核酸酶切割靶mRNA (例如 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)mRNA)，從而引起特異性基因沈默。在一些態樣中，siRNA之長度為18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個核苷酸且在其3’末端具有2鹼基懸突。siRNA可引入個別細胞及/或培養系統且引起靶mRNA序列(即， NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)mRNA)降解。siRNA及shRNA進一步闡述於Fire等人， Nature391:19, 1998及美國專利第7,732,417號；美國專利第8,202,846號；及美國專利第8,383,599號中；該等文獻中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。 IV.A.6. 反義寡核苷酸 (ASO)

在一些態樣中，可用於減少細胞中之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白表現之基因編輯工具包括反義寡核苷酸。如本文所用之「反義寡核苷酸」或「ASO」係指能夠藉由與靶核酸、具體而言與靶核酸上之鄰接序列雜交來調節靶基因(例如 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)之表現的寡核苷酸。反義寡核苷酸基本上不為雙股且因此不為siRNA或shRNA。

在一些態樣中，可用於本揭示案之ASO係單股。應理解，本揭示案之單股寡核苷酸可形成髮夾或分子間雙鏈體結構(兩個相同寡核苷酸分子之間的雙鏈體)，只要在寡核苷酸之全長內，內或間自身互補性之程度小於約50%即可。在一些態樣中，可用於本揭示案之ASO可包含一或多個經修飾核苷或核苷酸，例如2’糖修飾之核苷。可對ASO進行之其他修飾(例如可用於抑制或減少 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3基因表現之修飾)提供於例如美國公開案第2019/0275148 A1號中。

在一些態樣中，ASO可經由核酸酶介導之 NR4A轉錄物(例如mRNA)降解來減少NR4A (NR4A1、NR4A2或NR4A3)蛋白之表現，其中ASO能夠募集核酸酶，例如RNase H，例如RNaseH1。RNase H係水解RNA/ DNA雙鏈體之RNA股之遍在酶。因此，在一些態樣中，一旦結合至靶序列(例如 NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3mRNA)，ASO便可立即誘導 NR4A3mRNA之降解，且由此減少NR4A蛋白之表現。

如本文所揭示，基因編輯工具之上述實例不欲具有限制性且可使用此項技術中可獲得之任何基因編輯工具來減少或抑制 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現。 IV.A.7. 抑制物

在一些態樣中，可與本揭示案一起使用(例如以減少 NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3基因及/或蛋白之表現)之基因編輯工具包含抑制物。如本文所用之術語「抑制物」係指能夠結合至以下NR4A反應元件而不活化轉錄之任一劑：(i) NGFI-B反應元件(NBRE)，(ii) Nur反應元件(NurRE)，或(iii) (i)及(ii)二者。因此，藉由結合至NBRE及/或NurRE，本文所述之抑制物能夠抑制(repressing) (或降低或抑制(inhibiting))細胞(例如表現CAR或TCR之免疫細胞)中一或多個 NR4A家族成員之水準。在一些態樣中，當使細胞與抑制物接觸時，抑制物與NBRE及/或NurRE結合會降低細胞中 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白之水準。在一些態樣中，當使細胞與抑制物接觸時，抑制物與NBRE及/或NurRE結合會降低細胞中 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白之水準。在一些態樣中，當使細胞與抑制物接觸時，抑制物與NBRE及/或NurRE結合會降低細胞中 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之水準。在一些態樣中，抑制物與NBRE及/或NurRE結合會降低(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白之水準。在一些態樣中，抑制物與NBRE及/或NurRE結合會降低(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及(ii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之水準。在一些態樣中，抑制物與NBRE及/或NurRE結合會降低(i) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及(ii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白之水準。在一些態樣中，抑制物與NBRE及/或NurRE結合會降低以下中之每一者之水準：(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，及(iii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。能夠降低NR4A家族之所有成員(即NR4A1、NR4A2及NR4A3)之水準的抑制物亦稱為「NR4A超級抑制物」。參見例如WO2020237040A1，其全文皆以引用方式併入本文中。

如根據至少上述揭示內容應明瞭，可用於本揭示案之抑制物包含能夠結合至NBRE及/或NurRE反應元件之DNA結合結構域。在一些態樣中，該等抑制物包含其他結構域。該等其他結構域之非限制性實例包括：NR4A配位體結合結構域、FLAG結構域、Kruppel相關盒(KRAB)結構域、NCOR結構域、T2A結構域、自裂解結構域、核定位信號、二聚化結構域(例如diZIP二聚化結構域)、轉錄抑制物結構域、染色質壓縮結構域、抗原決定基標籤或其任一組合。關於該等其他結構域之其他揭示內容可參見例如WO2020237040A1，其全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，其他結構域不包含轉錄活化結構域。

如本文所述，在一些態樣中，在降低NR4A家族之一或多個成員之水準中，可使細胞與本文所述之NR4A抑制蛋白接觸。在一些態樣中，使細胞與編碼NR4A抑制物之核酸序列接觸。 IV.B. 減少耗竭 / 功能障礙之方法

本揭示案提供減少、改善或抑制細胞之耗竭或功能障礙之方法，其包括修飾細胞以：(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)表現降低水準之 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1及/或NR4A1蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A2及/或NR4A2蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A3及/或NR4A3蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白及 NR4A2基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A2基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。在一些態樣中， NR4A基因及/或蛋白包含 NR4A1基因及/或蛋白、 NR4A2基因及/或蛋白及 NR4A3基因及/或蛋白。

腫瘤細胞可逃避宿主免疫反應之各種方式中之一者係藉由使腫瘤特異性免疫細胞(例如T細胞)變得耗竭。如本文所用之術語「耗竭」或更特定而言「T細胞耗竭」係指喪失T細胞功能，其可因感染或疾病(例如癌症)發生。T細胞耗竭在本揭示案中可與「T細胞功能障礙」或「T細胞無反應性」互換使用。在一些態樣中，T細胞耗竭與各種免疫檢查點抑制分子(例如PD-1、TIM-3及LAG-3)之增加的表現、細胞凋亡及降低的效應功能(例如細胞介素產生及細胞毒性分子、例如穿孔蛋白及顆粒酶之表現)相關。因此，術語「減少T細胞耗竭」、「改善T細胞耗竭」、「抑制T細胞耗竭」及諸如此類係指T細胞功能恢復之狀況，其特徵在於以下中之一或多者：(i)一或多種免疫檢查點抑制分子(例如PD-1、TIM-3及LAG-3)之減少的表現，(ii)增加的記憶形成及/或記憶標記物(例如CD45RO、CD62L及/或CCR7)維持，(iii)防止細胞凋亡，(iv)增加的細胞介素產生(例如IL-2、IFN-γ及/或TNF-α)，(v)增強的殺傷能力，(vi)增加的具有低表面抗原之腫瘤靶識別，(vii)因應抗原增強的增殖，及(viii)其任一組合。

在一些態樣中，例如在本文所揭示之方法中修飾細胞包括修飾免疫細胞(例如T細胞)，以對耗竭具有抗性或耐受性。因此，在一些態樣中，本揭示案係關於減少免疫細胞(例如T細胞，例如腫瘤特異性T細胞)之耗竭之方法，其係藉由降低細胞中 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現水準來實施。在一些態樣中，減少免疫細胞(例如T細胞)之耗竭包括逆轉已在免疫細胞(例如T細胞)中發生之功能障礙(即，使耗竭的T細胞變得不太耗竭)。在一些態樣中，減少免疫細胞(例如T細胞)之耗竭包括防止新活化之免疫細胞(例如T細胞)變得耗竭。如根據本揭示案所明瞭，在一些態樣中，免疫細胞先前、同時或隨後經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)；(ii)具有增加水準之c-Jun蛋白；或(iii) (i)及(ii)二者。

在一些態樣中，減少免疫細胞(例如T細胞)之耗竭包括逆轉及防止免疫細胞(例如T細胞)之耗竭。

免疫細胞(例如T細胞)之耗竭狀態可藉由此項技術中已知之多種方法來確定。在一些態樣中，免疫細胞(例如T細胞)之耗竭狀態可藉由評估免疫細胞(例如T細胞)對細胞凋亡之抗性來量測。因此，在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物(即過表現c-Jun且表現降低水準之 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白)展現增加的細胞凋亡抗性。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現較低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白之相應細胞)之細胞凋亡抗性相比，本揭示案之細胞組合物之細胞凋亡抗性增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。在一些態樣中，增加的細胞凋亡抗性可促進本文所述之免疫細胞(例如T細胞)之長期持久性或存活。因此，在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)相比，本揭示案之細胞組合物(即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白)展現增強的持久性或存活。

在一些態樣中，與參考細胞之持久性或存活相比，本文所提供細胞組合物之持久性或存活增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。

在一些態樣中，免疫細胞(例如T細胞)之耗竭狀態可藉由評估免疫細胞(例如T細胞)對免疫檢查點分子之抗性來量測。在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)之免疫檢查點分子抗性相比，本揭示案之細胞組合物之免疫檢查點分子抗性增加至少1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。

不受限於任一理論，在一些態樣中，增加的免疫檢查點分子抗性歸因於免疫細胞(例如T細胞)上一或多種免疫檢查點分子之減少的表現。因此，在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞，例如免疫細胞，例如T細胞)相比，本揭示案之細胞組合物表現降低水準之一或多種免疫檢查點分子。在一些態樣中，與參考細胞相比，免疫檢查點分子之表現水準在本揭示案之細胞組合物中降低至少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。免疫檢查點分子之實例為此項技術中已知且包括(但不限於) PD-1、TIM-3、LAG-3、BTLA、SIGLEC7、CD200R、TIGIT、VISTA及其任一組合。

在一些態樣中，免疫細胞(例如T細胞)之耗竭狀態可藉由評估免疫細胞(例如T細胞)在刺激(例如T細胞受體(TCR)刺激)時產生細胞介素之能力來量測。因此，在一些態樣中，與參考之細胞介素產生(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞(例如免疫細胞，例如T細胞)之細胞介素產生)相比，本揭示案之細胞組合物(即過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白)展現增加的細胞介素產生。

在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A (NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞)之細胞介素產生相比，本揭示案之細胞組合物之細胞介素產生增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。細胞介素之非限制性實例包括IFN-γ、IL-2、TNF-α、GM-CSF、IL-6、IL-10、IL-4、IL-5、IL-8、IL-9、IL-13、IL-17、IL-22、CCL2、CCL3及其任一組合。

在一些態樣中，免疫細胞(例如T細胞)之耗竭狀態可藉由評估免疫細胞(例如T細胞)在重複腫瘤激發後殺傷腫瘤細胞之能力來量測。在一些態樣中，在兩次腫瘤激發後，與參考細胞(例如，未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞，例如免疫細胞，例如T細胞)相比，本揭示案之細胞組合物展現增加的腫瘤細胞殺傷。在一些態樣中，在三次腫瘤激發後，與參考細胞(例如，未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1 、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之相應細胞，例如免疫細胞，例如T細胞)相比，本揭示案之細胞組合物展現增加的腫瘤細胞殺傷。在一些態樣中，在四次腫瘤激發後，與參考細胞(例如，未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白之相應細胞，例如免疫細胞，例如T細胞)相比，本揭示案之細胞組合物展現增加的腫瘤細胞殺傷。在一些態樣中，在五次腫瘤激發後，與參考細胞(例如，未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白之相應細胞，例如免疫細胞，例如T細胞)相比，本揭示案之細胞組合物展現增加的腫瘤細胞殺傷。在一些態樣中，殺傷腫瘤細胞包括防止腫瘤細胞過度生長。

在一些態樣中，在每一腫瘤激發後，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白之相應細胞)殺傷腫瘤細胞之能力相比，本揭示案之細胞組合物殺傷腫瘤細胞之能力增加至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。 IV.C. 在腫瘤微環境中維持抗腫瘤功能之方法

腫瘤生成(即產生或形成腫瘤)係由三個階段組成之複雜且動態之過程：起始、進展及轉移。該等階段中之每一者由腫瘤微環境(TME)緊密調控。參見Wang, M.等人， J Cancer8(5):761-773 (2017)。如本文所用之術語「腫瘤微環境」或「TME」係指腫瘤周圍之環境，包括周圍血管、免疫細胞、纖維母細胞、信號傳導分子及細胞外基質。如下文進一步闡述，腫瘤可藉由釋放細胞外信號、促進腫瘤血管生成及誘導外周免疫耐受性來影響微環境，而微環境中之免疫細胞可影響腫瘤細胞之生長及進化。

腫瘤細胞通常以極高之速度生長，導致腫瘤微環境之血液供應不充分。參見Gouirand, V.等人， Front Oncol8:117 (2018)。此導致腫瘤微環境變得低氧且增加活性含氧物(ROS)之生成。低氧及ROS可對免疫細胞功能造成負面影響，且由此抑制個體中之抗腫瘤免疫反應。

在一些態樣中，例如在本文所揭示之方法中修飾細胞可增強免疫細胞(例如腫瘤特異性T細胞)在低氧環境中、例如在腫瘤微環境中發現之低氧環境中之抗腫瘤功能。如本文所用之術語「抗腫瘤功能」係指免疫細胞(例如腫瘤特異性T細胞)引起可根除及/或控制腫瘤細胞之免疫反應之能力。抗腫瘤功能之非限制性實例包括細胞介素產生、增殖、減少的耗竭、長期存活、細胞毒性(例如殺傷腫瘤細胞之能力)或其組合。

在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物(例如包含免疫細胞，其經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如抗ROR1結合蛋白)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之NR4A家族之一或多個成員)之抗腫瘤功能在低氧環境中與參考細胞(例如未經修飾以表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白且過表現c-Jun蛋白之相應細胞)相比有所增強(即增加)。

腫瘤細胞之快速增殖亦可清除腫瘤微環境內之各種營養素(例如葡萄糖)。參見Gouirand，見上文。如本文所論述，營養素(例如葡萄糖)係正常免疫細胞功能及發育所必需的。在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物(例如包含免疫細胞，其經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之NR4A家族之一或多個成員)之抗腫瘤功能在低營養素環境中與參考細胞(例如未經修飾以表現降低水準之 NR4A基因及/或NR4A蛋白且過表現c-Jun蛋白之相應細胞，例如免疫細胞，例如T細胞)相比有所增強(即增加)。

如本文所述，腫瘤細胞抑制宿主免疫反應之一種機制係藉由將多種免疫抑制性代謝物及/或細胞介素釋放至腫瘤微環境中。該等代謝物及/或細胞介素在腫瘤微環境內累積可抑制免疫細胞(例如腫瘤浸潤淋巴球)之正常功能。該等免疫抑制性代謝物及/或細胞介素之非限制性實例包括吲哚胺-2-3-雙加氧酶(IDO)、精胺酸酶、誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、乳酸去氫酶(LDH)-A、TGF-β、IL-10、VEGF、活性含氧物(ROS)、腺苷、精胺酸酶、前列腺素E2及其組合。

在一些態樣中，與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白之相應細胞)之抗腫瘤功能相比，本揭示案之細胞組合物(例如包含免疫細胞，其經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之NR4A家族之一或多個成員)之抗腫瘤功能在免疫抑制性代謝物及/或細胞介素存在下增強(即增加)至少約1.1倍、至少約1.2倍、至少約1.3倍、至少約1.4倍、至少約1.5倍、至少約1.6倍、至少約1.7倍、至少約1.8倍、至少約1.9倍、至少約2倍、至少約2.5倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍或更大。

腫瘤微環境可抑制抗腫瘤免疫反應之另一機制係經由免疫抑制性細胞，例如骨髓源性抑制細胞(MDSC)及調控T (T _reg)細胞。

如本文所用之術語「骨髓源性抑制細胞」或「MDSC」係指藉由其骨髓起源、不成熟狀態及強效抑制T細胞反應之能力定義之異質免疫細胞之群體。MDSC係在骨髓中生成，且在帶有腫瘤之宿主中遷移至外周淋巴器官及腫瘤以有助於形成腫瘤微環境。在一些態樣中，MDSC係單核球性MDSC (M-MDSC)，其形態及表型類似於單核球。在一些態樣中，MDSC係多形核MDSC (PMN-MDSC)，其形態及表型類似於嗜中性球。在一些態樣中，MDSC包含M-MDSC及PMN-MDSC。存在於腫瘤微環境內之MDSC通常展現較差的吞噬活性、連續產生活性含氧物(ROS)、一氧化氮(NO)及大多數抗發炎細胞介素(例如IL-10及TGF-β)。

如本文所用之術語「調控T細胞」或「T _reg細胞」係指能夠抑制其他T細胞(例如腫瘤浸潤淋巴球)之增殖及/或功能之特定T細胞群體。在一些態樣中，調控T細胞係CD4 ⁺調控T細胞。在一些態樣中，調控T細胞係Foxp3 ⁺。調控T細胞可經由不同之接觸依賴性及非依賴性機制發揮其免疫抑制活性。該等機制之非限制性實例包括：(i)產生抑制性細胞介素(例如TGF-β、IL-10及IL-35)；(ii)表現免疫檢查點及抑制性受體(例如CTLA-4、PD-L1、精胺酸酶、LAG-3、TIM-3、ICOS、TIGIT、IDO)；(iii)引導細胞毒性(穿孔蛋白/顆粒酶介導或FasL介導)；(iv)效應T細胞活性之代謝破壞(例如IL-2消耗)；(v)誘導耐受原性樹突細胞，其可促進T細胞耗竭；(vi)腺苷產生，及(vii)其任一組合。

在一些態樣中，本揭示案之細胞組合物(例如包含免疫細胞，其經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之NR4A家族之一或多個成員)之抗腫瘤功能在抑制性細胞存在下與參考細胞(例如未經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A基因及/或蛋白之相應細胞)相比有所增強(即增加)。在一些態樣中，抑制性細胞係MDSC。在一些態樣中，抑制性細胞係T _reg細胞。在一些態樣中，抑制性細胞包含MDSC及T _reg細胞。

儘管上述揭示內容主要係在T細胞(例如腫瘤浸潤淋巴球)背景下提供，但熟習此項技術者應意識到，上述揭示內容亦可適用於其他類型之免疫細胞。因此，在一些態樣中，本文所揭示之方法可用於增強可用於治療腫瘤之任何免疫細胞之活化、減少其耗竭/功能障礙或維持其抗腫瘤功能。該等免疫細胞之非限制性實例包括淋巴球、嗜中性球、單核球、巨噬細胞、樹突細胞或其組合。在一些態樣中，淋巴球包含T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、淋巴介質活化殺手細胞、自然殺手(NK)細胞或其組合。在一些態樣中，淋巴球係T細胞，例如CD4 ⁺T細胞或CD8 ⁺T細胞。在一些態樣中，淋巴球係腫瘤浸潤淋巴球(TIL)。在一些態樣中，TIL係CD8 ⁺TIL。在一些態樣中，TIL係CD4 ⁺TIL。如本文所述，在一些態樣中，本揭示案之免疫細胞包含嵌合抗原受體(CAR)，例如CAR T細胞或CAR NK細胞。 V. 核酸及載體

本揭示案亦提供一或多種核酸分子，其包含用於減少細胞中 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現之基因編輯工具。本文亦提供包含引導RNA (例如合成引導RNA)之核酸分子。如本文所述，在一些態樣中，包含基因編輯工具之核酸分子及包含引導RNA之核酸分子可作為單獨核酸分子(同時或依序)引入細胞中。在一些態樣中，基因編輯工具及引導RNA可為單一核酸分子之一部分。例如，在一些態樣中，包含基因編輯工具之核酸分子進一步包含引導RNA (例如本文所揭示之合成引導RNA)。

在一些態樣中，包含基因編輯工具之核酸分子進一步包含引導RNA (例如本文所揭示之合成引導RNA)及編碼Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)之核酸。

如本文所述，本揭示案之一些態樣係關於多核苷酸(例如經分離多核苷酸)，其包含能夠特異性結合至 NR4A基因( NR4A1 、 NR4A2 、 NR4A3或其組合)內之靶序列之核苷酸序列。不受限於任一理論，在一些態樣中，藉由與 NR4A基因內之靶序列結合，本揭示案之多核苷酸能夠降低細胞(例如免疫細胞)中 NR4A基因及/或編碼蛋白質之水準。

如本文所述，本文所述之多核苷酸包含可特異性結合至 NR4A基因內之核酸序列之核苷酸序列。例如，在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸包含特異性結合至 NR4A1基因內之核酸序列之核苷酸序列。在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸包含特異性結合至 NR4A2基因內之核酸序列之核苷酸序列。本揭示案之多核苷酸包含特異性結合至 NR4A3基因內之核酸序列之核苷酸序列。在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸包含特異性結合至 NR4A1基因內之核酸序列及 NR4A2基因內之核酸序列的核苷酸序列。在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸包含特異性結合至 NR4A1基因內之核酸序列及 NR4A3基因內之核酸序列的核苷酸序列。在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸包含特異性結合至 NR4A2基因內之核酸序列及 NR4A3基因內之核酸序列的核苷酸序列。在一些態樣中，本揭示案之多核苷酸包含特異性結合至 NR4A1基因內之核酸序列、 NR4A2基因內之核酸序列及 NR4A3基因內之核酸序列的核苷酸序列。該等核苷酸序列在本文中亦稱為 「結合序列」或「引導序列」或「引導 RNA 」 (gRNA)。因此，如本文所用之術語「引導RNA」(gRNA)不受特定限制，只要其可特異性結合至 NR4A家族之一或多個成員內之核酸序列且由此降低 NR4A基因及/或NR4A蛋白之水準即可。

在一些態樣中，gRNA之長度可介於約5個與約100個核苷酸之間。在一些態樣中，本文所述多核苷酸之gRNA之長度為約5個、約6個、約7個、約8個、約9個、約10個、約15個、約20個、約25個、約30個、約35個、約40個、約45個、約50個、約60個、約70個、約80個、約90個或約100個核苷酸。在一些態樣中，gRNA之長度介於約10個與約30個核苷酸之間(例如約10個、約11個、約12個、約13個、約14個、約15個、約16個、約17個、約18個、約19個、約20個、約21個、約22個、約23個、約24個、約25個、約26個、約27個、約28個、約29個或約30個核苷酸)。在一些態樣中，gRNA之長度為約20個核苷酸。關於可用於本揭示案之gRNA之其他揭示內容提供於本申請案之別處(參見例如部分IV.A.1. CRISPR/Cas系統)。

在一些態樣中，本文所述多核苷酸之gRNA經設計以與 NR4A基因內之核酸序列(在本文中亦稱為「 靶序列」)互補或實質上互補。在一些態樣中，gRNA可納入擺動或簡併鹼基以結合多條序列(例如， NR4A基因內之多條靶序列；或 NR4A基因內之靶序列及NR4A家族之其他成員內之靶序列)。在一些情形下，可改變gRNA以增加穩定性。舉例而言，可納入非天然核苷酸以增加RNA對降解之抗性。在一些態樣中，gRNA可經改變或設計以避免或減少gRNA中之二級結構形成。在一些態樣中，gRNA可經設計以最佳化G-C含量。在一些態樣中，G-C含量介於約40%與約60%之間(例如約40%、約45%、約50%、約55%、約60%)。在一些態樣中，gRNA可含有經修飾核苷酸，例如(但不限於)甲基化或磷酸化核苷酸。修飾本文所述之多核苷酸且由此改良其一或多種性質之其他方法為此項技術中已知。可添加至本文所述多核苷酸中之該等修飾之非限制性實例包括：5'帽、3'聚腺苷酸化尾、核糖開關序列、穩定性控制序列、髮夾、亞細胞定位序列、偵測或標記序列、一或多種蛋白質之結合位點、非天然核苷酸或其組合。參見例如美國公開案第20210123046A1號，其全文皆以引用方式併入本文中。關於該等修飾之其他揭示內容提供於本揭示案之別處。

如本文所述，在一些態樣中，包含基因編輯工具之核酸分子及包含引導RNA之核酸分子可作為單獨核酸分子(同時或依序)引入細胞中。在一些態樣中，基因編輯工具及引導RNA可為單一核酸分子之一部分。例如，在一些態樣中，包含基因編輯工具之核酸分子進一步包含引導RNA (例如本文所揭示之合成引導RNA)。在一些態樣中，包含基因編輯工具之核酸分子進一步包含引導RNA (例如本文所揭示之合成引導RNA)及編碼Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)之核酸。

本揭示案亦提供編碼配位體結合蛋白(例如嵌合抗原受體或T細胞受體)之一或多種核酸。本揭示案亦提供編碼c-Jun蛋白之一或多種核酸，其可用於在本揭示案之經修飾細胞中過表現c-Jun。如本文所述，在一些態樣中，一或多種核酸可為單一載體之一部分。在一些態樣中，每一核酸處於單獨載體上。核酸可存在於完整細胞中、細胞溶解物中或以經部分純化或實質上純之形式存在。

當藉由標準技術自其他細胞組分或其他污染物(例如其他細胞核酸(例如其他染色體DNA，例如在自然界中連接至經分離DNA之染色體DNA)或蛋白質)純化時，核酸係「經分離」或「實質上純的」，該等標準技術包括鹼/SDS處理、CsCl分帶、管柱層析、限制酶、瓊脂糖凝膠電泳及此項技術中所熟知之其他技術。參見F. Ausubel 等人編輯(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York。本文所述之核酸可為例如DNA或RNA且可含或可不含內含子序列。在一些態樣中，核酸係cDNA分子。本文所述之核酸可使用此項技術中已知之標準分子生物學技術來獲得。

在一些態樣中，本揭示案提供載體，其包含以下中之一或多者：(i)經分離核酸分子，其包含用於減少細胞中 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)編碼配位體結合蛋白(例如嵌合抗原受體或T細胞受體)之經分離核酸分子，(iii)編碼c-Jun蛋白之經分離核酸分子，或(iv)其任一組合，且其中每一核酸皆可在本揭示案之經修飾細胞中表現。

如本文所述，該等載體可用於修飾細胞(例如CAR或TCR表現細胞)以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之 NR4A( NR4A1、 NR4A2及/或 NR4A3)基因及/或蛋白，其中該等經修飾細胞可用於治療疾病或病症，例如癌症。在一些態樣中，載體包含編碼以下之多核苷酸：(i)配位體結合蛋白(例如CAR或TCR，例如抗ROR1 CAR或抗ROR1 TCR)，及(ii) c-Jun蛋白，該多核苷酸可操作連接至調控元件。在一些態樣中，載體包含編碼以下之多核苷酸：(i)配位體結合蛋白(例如CAR或TCR，例如抗ROR1 CAR或抗ROR1 TCR)，(ii) c-Jun蛋白，及(iii)截短EGFR，該多核苷酸可操作連接至調控元件。

適於本揭示案之載體包括表現載體、病毒載體及質體載體。在一些態樣中，載體係病毒載體。

如本文所用之術語「載體」及「表現載體」係指任一核酸構築物，其含有插入編碼序列之轉錄及轉譯必需之元件，或在RNA病毒載體之情形下，當引入適當宿主細胞中時含有複製及轉譯必需之元件。表現載體可包括質體、噬菌粒、病毒及其衍生物。

如本文所用之病毒載體包括(但不限於)來自以下病毒之核酸序列：反轉錄病毒，例如莫洛尼鼠類白血病病毒(Moloney murine leukemia virus)、哈維鼠類肉瘤病毒(Harvey murine sarcoma virus)、鼠類乳房腫瘤病毒及勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)；慢病毒；腺病毒；腺相關病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；艾司坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)；乳頭瘤病毒；疱疹病毒；痘瘡病毒；小兒麻痺病毒；及RNA病毒，例如反轉錄病毒。吾人可容易地採用此項技術中所熟知之其他載體。某些病毒載體係基於非細胞病變真核病毒，其中非必需基因已用所關注基因替代。非細胞病變病毒包括反轉錄病毒，其生命週期涉及基因體病毒RNA反轉錄成DNA且隨後原病毒整合至宿主細胞DNA中。

在一些態樣中，載體衍生自腺相關病毒。在一些態樣中，載體衍生自慢病毒。慢病毒載體之實例揭示於WO9931251、W09712622、W09817815、W09817816及WO9818934中，該等專利中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。

其他載體包括質體載體。質體載體已廣泛闡述於此項技術中且為熟習此項技術者所熟知。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989。在過去幾年中，已發現質體載體尤其有利於將基因活體內遞送至細胞，此乃因其無法在宿主基因體內複製及整合至宿主基因體中。然而，具有與宿主細胞相容之啟動子之該等質體可自在質體內可操作編碼之基因表現肽。可自商業供應商獲得之一些常用質體包括pBR322、pUC18、pUC19、各種pcDNA質體、pRC/CMV、各種pCMV質體、pSV40及pBlueScript。特定質體之其他實例包括pcDNA3.1，目錄號V79020；pcDNA3.1/hygro，目錄號V87020；pcDNA4/ myc-His，目錄號V86320；及pBudCE4.1，目錄號V53220，其皆來自Invitrogen (Carlsbad, CA.)。其他質體為熟習此項技術者所熟知。另外，質體可使用標準分子生物學技術進行定制設計以移除及/或添加特定DNA片段。

本揭示案涵蓋使用熟習此項技術者可獲得之任何核酸修飾來修飾本文所揭示之核酸，例如gRNA及編碼gRNA之核酸、編碼Cas9之核酸、包含編碼至少一種gRNA或至少一種gRNA及Cas9之核酸之載體、編碼CAR或TCR之核酸、編碼本文所揭示之任何基因體編輯工具之核酸、編碼RNAi之核酸或反義寡核苷酸。

如本文所用之「未經修飾」或「天然」核苷或核鹼基包括嘌呤鹼基腺嘌呤(A)及鳥嘌呤(G)，以及嘧啶鹼基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。在一些態樣中，合成經修飾gRNA包含至少一個核苷(「鹼基」)修飾或取代。

本申請案中所揭示之核酸(例如gRNA及編碼該等gRNA之核酸以及編碼Cas9之核酸)可包含一或多個修飾。在一些態樣中，本文所揭示之核苷酸序列包含至少一種核苷酸類似物。在一些態樣中，藉由使用活體外轉譯(IVT)或化學合成引入之至少一種核苷酸類似物選自由以下組成之群：2'-O-甲氧基乙基-RNA (2'-MOE-RNA)單體、2'-氟-DNA單體、2'-O-烷基-RNA單體、2'-胺基-DNA單體、鎖定核酸(LNA)單體、cEt單體、cMOE單體、5'-Me-LNA單體、2'-(3-羥基)丙基-RNA單體、阿糖基核酸(ANA)單體、2'-氟-ANA單體、無水己糖醇核酸(HNA)單體、嵌入核酸(INA)單體及該等核苷酸類似物中之兩者或更多者之組合。在一些態樣中，最佳化核酸分子(例如gRNA)包含至少一種主鏈修飾，例如硫代磷酸酯核苷酸間鍵聯。

在一些態樣中，本申請案中所揭示之核酸(例如gRNA及編碼該等gRNA之核酸以及編碼Cas9之核酸)可在末端位置經化學修飾，例如藉由在相對於5’及/或3’末端之位置1、2、3引入M (2′-O-甲基)、MS (2′-O-甲基3′硫代磷酸酯)或MSP (2′-O-甲基3’硫代PACE，膦醯基乙酸酯)修飾或其組合。舉例而言，在一個態樣中，本揭示案之gRNA可包含三個5’核苷酸處之三個M修飾及三個3’核苷酸處之三個M修飾。在一些態樣中，本揭示案之gRNA可包含三個5’核苷酸處之三個MS修飾及三個3’核苷酸處之三個MS修飾。在一些態樣中，本揭示案之gRNA可包含三個5’核苷酸處之三個MSP修飾及三個3’核苷酸處之三個MSP修飾。

在一些態樣中，本文所揭示之核苷酸序列(例如gRNA)中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%或100%之尿苷、腺苷、鳥苷、胞苷核苷已經核苷替代。

在一些態樣中，本申請案中所揭示之核酸(例如gRNA)包含藉由IVT或化學合成產生之核苷酸序列，其中 (i) 野生型核苷酸序列中之至少一個尿苷已經替代；及/或 (ii) 野生型核苷酸序列中之至少一個腺苷已經替代；及/或 (iii) 野生型核苷酸序列中之至少一個鳥苷已經替代；及/或 (iv) 野生型核苷酸序列中之至少一個胞苷已經替代。

本揭示案之經修飾核酸(例如gRNA)無需沿分子之整個長度經均勻修飾。不同核苷酸修飾及/或主鏈結構可存在於核酸中之不同位置。熟習此項技術者應瞭解，核苷酸類似物或其他修飾可位於核酸之任何位置，使得核酸之功能實質上並不降低。修飾亦可為5'或3'末端修飾。核酸可含有最少1%及最大100%之經修飾核苷酸或任一中間百分比，例如至少約20%、至少約25%、至少約30%、至少約35%、至少約40%、至少約45%、至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%或至少約99%之經修飾核苷酸。

在一些態樣中，本文所提供之核酸係編碼RNA (例如gRNA)及/或多肽(例如Cas9)之合成經修飾DNA分子，其中合成經修飾DNA分子包含一或多個修飾。

本文所述之合成經修飾核酸(例如gRNA)包括防止由核酸內切酶及核酸外切酶快速降解之修飾。修飾包括(但不限於)例如(a)末端修飾，例如5'末端修飾(磷酸化、去磷酸化、結合、反向鍵聯等)、3'末端修飾(結合、DNA核苷酸、反向鍵聯等)，(b)鹼基修飾，例如用經修飾鹼基、穩定鹼基、去穩定鹼基或與擴展的配偶體譜系鹼基配對之鹼基或結合鹼基替代，(c)糖修飾(例如在2'位或4'位)或糖替代，以及(d)核苷間鍵聯修飾，包括磷酸二酯鍵聯之修飾或替代。

可與本文所述之方法一起使用之合成經修飾核酸(例如gRNA)組合物之具體實例包括(但不限於)含有經修飾或非天然核苷間鍵聯之經修飾核酸(例如gRNA)。具有經修飾核苷間鍵聯之合成經修飾核酸(例如gRNA)尤其包括在核苷間鍵聯中不具磷原子之核酸。在一些態樣中，合成經修飾核酸(例如gRNA)在其核苷間鍵聯中具有磷原子。

經修飾核苷間鍵聯之非限制性實例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、胺基烷基磷酸三酯、膦酸甲酯及其他膦酸烷基酯(包括膦酸3'-伸烷基酯及手性膦酸酯)、次膦酸酯、胺基磷酸酯(包括3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯)、硫羰基胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及具有正常3'-5'鍵聯之硼基磷酸酯、該等硼基磷酸酯之T-5'連接類似物及具有相反極性之磷酸酯，其中相鄰成對之核苷單元係3'-5'至5'-3'連接或T-5'至5'-T連接。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。

其中不包括磷原子之經修飾核苷間鍵聯具有由短鏈烷基或環烷基核苷間鍵聯、混合雜原子及烷基或環烷基核苷間鍵聯、或一或多個短鏈雜原子或雜環核苷間鍵聯形成之核苷間鍵聯。該等核苷間鍵聯包括具有嗎啉基鍵聯(部分地自核苷之糖部分形成)之核苷間鍵聯；矽氧烷主鏈；硫化物、亞碸及碸主鏈；甲醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈；亞甲基甲醯乙醯基及硫代甲醯乙醯基主鏈；含烯烴之主鏈；胺基磺酸酯主鏈；亞甲基亞胺基及亞甲基肼基主鏈；磺酸酯及磺醯胺主鏈；醯胺主鏈；及具有混合N、O、S及CH2組成部分之其他核苷間鍵聯。

本文所述合成經修飾核酸(例如gRNA)之一些態樣包括具有硫代磷酸酯核苷間鍵聯之核酸及具有雜原子核苷間鍵聯之寡核苷，且具體而言美國專利第5,489,677號之-CH ₂-NH-CH ₂-、-CH ₂-N(CH ₃)-O-CH ₂-[稱為亞甲基(甲基亞胺基)或MMI]、-CH ₂-O-N(CH ₃)-CH ₂-、-CH ₂-N(CH ₃)-N(CH ₃)-CH ₂-及-N(CH ₃)-CH ₂-CH ₂-[其中原生磷酸二酯核苷間鍵聯表示為-O-P-O-CH ₂-]，以及美國專利第5,602,240號之醯胺主鏈，該等美國專利之全文皆以引用方式併入本文中。在一些態樣中，本文之特徵性核酸序列具有美國專利第5,034,506號之嗎啉基主鏈結構，該美國專利之全文皆以引用方式併入本文中。

本文所述之合成經修飾核酸(例如gRNA)亦可含有一或多個經取代糖部分。本文之特徵性核酸可在2'位包括以下中之一者：H (去氧核糖)；OH (核糖)；F；O-烷基、S-烷基或N-烷基；O-烯基、S-烯基或N-烯基；O-炔基、S-炔基或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基及炔基可為經取代或未經取代之C ₁至C ₁₀烷基或C ₂至C ₁₀烯基及炔基。例示性修飾包括O[(CH ₂)nO]mCH ₃、O(CH ₂)nOCH ₃、O(CH ₂)nNH ₂、O(CH ₂)nCH ₃、O(CH ₂)nONH ₂及O(CH ₂)nON[(CH ₂)nCH ₃)] ₂，其中n及m係1至約10。在一些態樣中，合成經修飾RNA在2'位包括以下中之一者：C ₁至C ₁₀低碳烷基、經取代之低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH ₃、OCN、Cl、Br、CN、CF ₃、OCF ₃、SOCH ₃、SO ₂CH ₃、ONO ₂、NO ₂、N ₃、NH ₂、雜環烷基、雜環烷芳基、胺基烷基胺基、聚烷基胺基、經取代矽基、信息基團、嵌入劑、用於改良某一核酸(例如gRNA)之藥物動力學性質之基團或用於改良合成經修飾核酸(例如gRNA)之藥效學性質之基團以及具有相似性質之其他取代基。在一些態樣中，修飾包括2'甲氧基乙氧基(2'-O-CH ₂CH ₂OCH ₃，亦稱為2'-O-(2-甲氧基乙基)或-MOE) (Martin等人，Helv. Chim. Acta, 1995, 78:486-504)，即烷氧基-烷氧基。另一例示性修飾係2'-二甲基胺基氧基乙氧基，即O(CH ₂) ₂ON(CH ₃) ₂基團，亦稱為2'-DMAOE，及2'-二甲基胺基乙氧基乙氧基(在此項技術中亦稱為2'-O-二甲基胺基乙氧基乙基或2'-DMAEOE)，即2'-O-CH ₂-O-CH ₂-N(CH ₂) ₂。

其他修飾包括2'-甲氧基(2'-OCH ₃)、2'-胺基丙氧基(2'-OCH ₂CH ₂CH ₂NH ₂)及2'-氟(2'-F)。亦可在核酸序列上之其他位置、具體而言在3'末端核苷酸上或2'-5'連接核苷酸中糖之3'位及5'末端核苷酸之5'位進行相似修飾。合成經修飾gRNA亦可具有糖模擬物，例如環丁基部分替代戊呋喃糖基糖。

作為非限制性實例，本文所述之合成經修飾gRNA可包括至少一種經修飾核苷，包括2'-O-甲基修飾之核苷、包含5'硫代磷酸酯基團之核苷、2'-胺基修飾之核苷、2'-烷基修飾之核苷、嗎啉基核苷、包含胺基磷酸酯或非天然鹼基之核苷或其任一組合。

在一些態樣中，至少一種經修飾核苷選自由以下組成之群：5-甲基胞苷(5mC)、N6-甲基腺苷(m6A)、3,2'-O-二甲基尿苷(m4U)、2-硫尿苷(s2U)、2'氟尿苷、假尿苷、2'-O-甲基尿苷(Um)、2'去氧尿苷(2' dU)、4-硫尿苷(s4U)、5-甲基尿苷(m5U)、2'-O-甲基腺苷(m6A)、N6,2'-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6,N6,2'-O-三甲基腺苷(m62Am)、2'-O-甲基胞苷(Cm)、7-甲基鳥苷(m7G)、2'-O-甲基鳥苷(Gm)、N2,7-二甲基鳥苷(m2,7G)、N2,N2,7-三甲基鳥苷(m2,2,7G)及肌苷(I)。

替代地，合成經修飾gRNA可包含至少兩個經修飾核苷、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個或更多個，直至核苷酸之整個長度。包含至少一種經修飾核苷之合成經修飾gRNA分子最少包含具有如本文所述修飾之單個核苷。給定合成經修飾gRNA之所有位置不必經均勻修飾，且事實上一種以上之上文所提及修飾可納入單一合成經修飾gRNA中或甚至納入合成經修飾gRNA內之單一核苷處。然而，較佳但非絕對必需的是，分子中之給定核苷在每次出現時經修飾(例如，每一胞嘧啶係經修飾之胞嘧啶，例如5mC)。然而，亦預期，在給定合成經修飾gRNA分子中，相同核苷在不同出現時可以不同方式來修飾(例如，一些胞嘧啶修飾為5mC，其他胞嘧啶修飾為2'-0-甲基胞苷或其他胞嘧啶類似物)。合成經修飾gRNA中複數個經修飾核苷中每一者之修飾無需相同。另外，在本文所述態樣之一些態樣中，合成經修飾gRNA包含至少兩種不同之經修飾核苷。在本文所述之一些態樣中，至少兩種不同之經修飾核苷係5-甲基胞苷及假尿苷。合成經修飾gRNA亦可含有經修飾及未經修飾核苷之混合物。

本文所揭示之gRNA及其他核酸(例如用於CRISPR基因編輯之核酸，或編碼CAR或TCR之多核苷酸或多核苷酸組)可使用化學合成使用寡核苷酸合成儀、宿主細胞表現、活體外轉譯(IVT)或此項技術中已知之任何其他方法來產生。天然核苷、非天然核苷或其組合完全或部分替代天然核苷。多核苷酸或核酸合成反應可藉由酶方法利用聚合酶來實施。聚合酶催化多核苷酸或核酸鏈中之核苷酸之間的磷酸二酯鍵產生。

各種遺傳改造工具係基於用作模板之靶核酸之酶擴增。為研究所關注之個別基因或特定區域之序列及其他研究需求，需要自多核苷酸或核酸之小樣品生成靶核酸之多個拷貝。該等方法可應用於製造本文所揭示之gRNA及其他核酸(例如RNAi、ASO、編碼Cas之多核苷酸、或編碼CAR或TCR之多核苷酸或多核苷酸組)。

聚合酶鏈反應(PCR)廣泛應用於靶基因之快速擴增以及基因體映射及測序。用於合成DNA之關鍵組分包含作為模板之靶DNA分子、與靶DNA股末端互補之引子、作為構建塊之三磷酸去氧核苷(dNTP)及DNA聚合酶。隨著PCR進行變性、退火及延伸步驟，新產生之DNA分子可用作下一複製週期之模板，從而達成靶DNA之指數擴增。PCR需要加熱及冷卻週期進行變性及退火。基本PCR之變化形式包括不對稱PCR (Innis等人，PNAS 85, 9436-9440 (1988))、反向PCR (Ochman等人，Genetics 120(3), 621-623, (1988))及反轉錄PCR (RT-PCR) (Freeman等人，BioTechniques 26(1), 112-22, 124-5 (1999))，該等文獻之內容之全文皆以引用方式併入本文中。在RT-PCR中，單股RNA係期望靶且首先藉由反轉錄酶轉化成雙股DNA。可使用任一前述方法來製造本揭示案多核苷酸(例如gRNA、編碼Cas之多核苷酸、或編碼CAR或TCR之多核苷酸或多核苷酸組)之一或多個區域。

亦廣泛使用藉由連結酶組裝多核苷酸或核酸。DNA或RNA連結酶經由形成磷酸二酯鍵促進多核苷酸鏈之5´及3´末端之分子間連結。因此，RNA連結酶可用於例如藉由gRNA間隔體序列及gRNA框序列之3’至5’分子間連結生成gRNA。

可將標準方法應用於合成編碼經分離之所關注多肽之經分離多核苷酸序列。舉例而言，可合成含有編碼特定經分離多肽之密碼子最佳化核苷酸序列之單一DNA或RNA寡聚物。在一些態樣中，可合成編碼期望多肽之一部分之若干小寡核苷酸且然後連結。在一些態樣中，個別寡核苷酸通常含有5'或3'懸突用於互補組裝。

本文所揭示之多核苷酸(例如gRNA、編碼Cas之多核苷酸、或編碼CAR或TCR之多核苷酸或多核苷酸組)可使用此項技術中已知之化學合成方法及潛在核鹼基取代來化學合成。參見例如國際公開案第WO2014093924號、國際公開案第WO2013052523號；國際公開案第WO2013039857號、國際公開案第WO2012135805號、國際公開案第WO2013151671號；美國公開案第US20130115272號；或美國專利第US8999380號、美國專利第US8710200號，該等專利之全文皆以引用方式併入本文中。 VI. 醫藥組合物

本揭示案提供醫藥組合物，其包含已如本文所述經修飾以過表現c-Jun蛋白且表現降低水準之NR4A基因及/或NR4A蛋白之細胞及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。本揭示案提供醫藥組合物，其包含細胞，該細胞已經修飾以(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)表現降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，且進一步具有 NR4A1及 NR4A2基因以及NR4A1及NR4A2蛋白之內源表現(例如本文所述之彼等細胞)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本揭示案提供醫藥組合物，其包含細胞，該細胞已經修飾以(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)表現降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，且進一步具有 NR4A1及 NR4A3基因以及NR4A1及NR4A3蛋白之內源表現(例如本文所述之彼等細胞)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本揭示案提供醫藥組合物，其包含細胞，該細胞已經修飾以(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)表現降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，且進一步具有 NR4A2及 NR4A3基因以及NR4A2及NR4A3蛋白之內源表現(例如本文所述之彼等細胞)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，但具有內源水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，但具有內源水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，但具有內源水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)過表現c-Jun蛋白，及(ii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。

本揭示案提供醫藥組合物，其包含細胞，該細胞已經修飾以(i)過表現c-Jun蛋白，(ii)表現降低水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，及(iii)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，且進一步具有 NR4A1及 NR4A2基因以及NR4A1及NR4A2蛋白之內源表現(例如本文所述之彼等細胞)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本揭示案提供醫藥組合物，其包含細胞，該細胞已經修飾以(i)過表現c-Jun蛋白，(ii)表現降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，及(iii)配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，且進一步具有 NR4A1及 NR4A3基因以及NR4A1及NR4A3蛋白之內源表現(例如本文所述之彼等細胞)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本揭示案提供醫藥組合物，其包含細胞，該細胞已經修飾以(i)過表現c-Jun蛋白，(ii)表現降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，及(iii)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR) (例如特異性結合至ROR1)，且進一步具有 NR4A2及 NR4A3基因以及NR4A2及NR4A3蛋白之內源表現(例如本文所述之彼等細胞)，及醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，但具有內源水準之 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，但具有內源水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，但具有內源水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。在一些態樣中，本文所提供之醫藥組合物包含：(1)細胞，其已經修飾以：(i)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(ii)過表現c-Jun蛋白，及(iii)具有降低水準之 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白；及(2)醫藥學上可接受之載劑、賦形劑或穩定劑。

如本文所述，該等醫藥組合物可用於預防及/或治療癌症。如本文所述，在一些態樣中，存在於本文所揭示醫藥組合物中之經修飾細胞係免疫細胞，例如T細胞(例如CAR或TCR表現T細胞)或NK細胞(例如CAR或TCR表現NK細胞)。

可接受之載劑、賦形劑或穩定劑在所用劑量及濃度下對接受者無毒，且包括緩衝劑，例如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化六甲雙銨；苯紮氯銨(benzalkonium chloride)、苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，例如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間-甲酚)；低分子量(小於約10個殘基)多肽；蛋白質，例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物，例如聚乙烯基吡咯啶酮；胺基酸，例如甘胺酸、麩胺醯胺、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單糖、二糖及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成鹽抗衡離子，例如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型表面活性劑，例如TWEEN ^®、PLURONICS ^®或聚乙二醇(PEG)。

醫藥組合物可經調配用於以任一途徑投與個體。投與途徑之具體實例包括肌內、皮下、眼部、靜脈內、腹膜內、真皮內、眶內、大腦內、顱內、脊椎內、室內、鞘內、腦池內、囊內或腫瘤內。本文亦涵蓋腸胃外投與，其特徵在於皮下、肌內或靜脈內注射。可注射物可以習用形式、即以液體溶液或懸浮液、適於在注射之前溶解或懸浮於液體中之固體形式、或以乳液製備。可注射物、溶液及乳液亦含有一或多種賦形劑。適宜賦形劑係例如水、鹽水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，若需要，欲投與之醫藥組合物亦可含有少量無毒輔助物質，例如潤濕或乳化劑、pH緩衝劑、穩定劑、增溶劑及其他該等劑，例如乙酸鈉、去水山梨醇單月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯及環糊精。

用於腸胃外製劑中之醫藥學上可接受之載劑包括水性媒劑、非水性媒劑、抗微生物劑、等滲劑、緩衝劑、抗氧化劑、局部麻醉劑、懸浮及分散劑、乳化劑、鉗合或螯合劑及其他醫藥學上可接受之物質。水性媒劑之實例包括氯化鈉注射液、林格氏注射液(Ringers Injection)、等滲右旋糖注射液、無菌水注射液、右旋糖及乳酸化林格氏注射液。非水性腸胃外媒劑包括植物來源之不揮發性油、棉籽油、玉米油、芝麻油及花生油。抑菌性或抑真菌性濃縮物中之抗微生物劑可添加至封裝在多劑量容器中之腸胃外製劑中，包括苯酚或甲酚、汞劑、苯甲醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯及對羥基苯甲酸丙酯、硫柳汞、苯紮氯銨及苄索氯銨。等滲劑包括氯化鈉及右旋糖。緩衝劑包括磷酸鹽及檸檬酸鹽。抗氧化劑包括硫酸氫鈉。局部麻醉劑包括鹽酸普魯卡因(procaine hydrochloride)。懸浮及分散劑包括羧甲基纖維素鈉、羥丙基甲基纖維素及聚乙烯基吡咯啶酮。乳化劑包括聚山梨醇酯80 (TWEEN ^®80)。金屬離子之鉗合或螯合劑包括EDTA。醫藥載劑亦包括用於水可混溶媒劑之乙醇、聚乙二醇及丙二醇；及用於調整pH之氫氧化鈉、鹽酸、檸檬酸或乳酸。

用於腸胃外投與之製劑包括準備用於注射之無菌溶液、準備在即將使用前與溶劑合併之無菌乾燥可溶性產品(例如凍乾粉末，包括皮下注射錠劑)、準備用於注射之無菌懸浮液、準備在即將使用前與媒劑合併之無菌乾燥不溶性產品及無菌乳液。溶液可為水性或非水性。

若靜脈內投與，則適宜載劑包括生理鹽水或磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)以及含有增稠及增溶劑(例如葡萄糖、聚乙二醇及聚丙二醇及其混合物)之溶液。

本文所提供之醫藥組合物亦可經調配以靶向欲治療個體之身體之特定組織、受體或其他區域。許多該等靶向方法為熟習此項技術者所熟知。所有該等靶向方法在本文中預期用於本發明組合物。關於靶向方法之非限制性實例，參見例如美國專利第6,316,652號、美國專利第6,274,552號、美國專利第6,271,359號、美國專利第6,253,872號、美國專利第6,139,865號、美國專利第6,131,570號、美國專利第6,120,751號、美國專利第6,071,495號、美國專利第6,060,082號、美國專利第6,048,736號、美國專利第6,039,975號、美國專利第6,004,534號、美國專利第5,985,307號、美國專利第5,972,366號、美國專利第5,900,252號、美國專利第5,840,674號、美國專利第5,759,542及美國專利第5,709,874號，該等美國專利中每一者之全文皆以引用方式併入本文中。

欲用於活體內投與之組合物可為無菌的。此係容易地經由例如無菌過濾膜過濾來實現。

本揭示案亦提供細胞組合物，其包含用於本文所述之一或多種方法(例如促進免疫細胞之群體之持續記憶及/或效應功能)之手段。在一些態樣中，本揭示案提供細胞組合物，其包含用於減少、改善或抑制免疫細胞之群體之耗竭及/或功能障礙之手段。在一些態樣中，手段包括改質免疫細胞之群體中 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現及c-Jun蛋白之表現。在一些態樣中，手段包括改質免疫細胞之群體中 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現及c-Jun蛋白之表現。 VII. 套組

本揭示案亦提供用於實踐本揭示案之任一方法之套組。在一些態樣中，本揭示案提供套組，其包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，及(ii)編碼c-Jun轉錄因子之核苷酸序列，或(iii)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之任一方法治療腫瘤之說明書。在一些態樣中，套組包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑，或(iii)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之任一方法治療腫瘤之說明書。亦提供套組，其包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)編碼c-Jun轉錄因子之核苷酸序列，或(iii)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之方法製備細胞組合物之說明書。在一些態樣中，套組包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑，或(iii)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之方法製備細胞組合物之說明書。

本揭示案亦提供用於實踐本揭示案之任一方法之套組。在一些態樣中，本揭示案提供套組，其包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含配位體結合蛋白(例如嵌合抗原受體(CAR) (例如抗ROR1 CAR)或T細胞受體(TCR) (例如抗ROR1 TCR))之載體，(iii)編碼c-Jun轉錄因子之核苷酸序列，或(iv)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之任一方法治療腫瘤之說明書。在一些態樣中，套組包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之載體，(iii)能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑，或(iv)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之任一方法治療腫瘤之說明書。亦提供套組，其包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含配位體結合蛋白(例如嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR))之載體，(iii)編碼c-Jun轉錄因子之核苷酸序列，或(iv)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之方法製備細胞組合物之說明書。在一些態樣中，套組包含(i)減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之載體，(iii)能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑，或(iv)其組合，及視情況選用之根據本文所揭示之方法製備細胞組合物之說明書。

在一些態樣中，本揭示案提供套組，其包含本文所揭示之組合物，例如(i)展現減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之細胞，例如免疫細胞，(ii)靶向 NR4A基因之至少一種gRNA，(iii)編碼至少一種gRNA之核酸(例如載體)，(iv)至少一種gRNA及Cas蛋白(例如Cas9)，(v)編碼gRNA (例如載體)及Cas蛋白(例如Cas9)之至少一種核酸，(vi)編碼gRNA之至少一種核酸(例如第一載體)及編碼Cas蛋白(例如Cas9)之核酸(例如第二載體)，(vii)包含編碼至少一種gRNA及至少一種Cas蛋白(例如Cas9)之核酸之單一載體，(vii)編碼配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)之載體或載體組。在一些態樣中，套組包含靶向NR4A3之Cas9 RNP (例如包括sgRNA GCUCGAGUAGCCCUCCACGA (SEQ ID NO: 30)之Cas9 RNP)。在一些態樣中，sgRNA包含表A、表C及表D中所揭示之sgRNA。在一些態樣中，套組進一步包含其使用說明書。

本揭示案提供用於治療癌症之套組，其包含本文所揭示之經修飾細胞(例如免疫細胞)，其中細胞展現減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現。本揭示案提供用於治療癌症之套組，其包含本文所揭示之經修飾細胞(例如免疫細胞)，其中細胞展現減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現，且其中細胞表現配位體結合蛋白(例如CAR及/或TCR)。

在一些態樣中，套組包含至少一種本文所揭示gRNA、編碼本文所揭示gRNA之至少一種經分離多核苷酸、編碼本文所揭示gRNA之至少一種載體、包含編碼本文所揭示gRNA之至少一種載體之細胞或其組合。在一些態樣中，套組進一步包含Cas9蛋白、編碼Cas9蛋白之經分離多核苷酸或包含編碼Cas9蛋白之多核苷酸之載體。

本揭示案進一步提供套組或包裝，其包含至少一個容器構件，該至少一個容器構件中佈置有至少一種上文所提及gRNA、Cas9；載體、細胞或其組合，以及減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現之說明書。

在一些態樣中，套組包含至少一種上游gRNA及下游gRNA。因此，在一些態樣中，套組包含(i)至少一種gRNA，其包含SEQ ID NO: 34-41中任一者之間隔體序列，及(ii)至少一種gRNA，其包含SEQ ID NO: 31-33中任一者之間隔體序列。

在特定態樣中，套組包含gRNA，其包含可操作連接至金黃色葡萄球菌嵌合框(例如SEQ ID NO: 42之序列)之SEQ ID NO: 34-41之釀膿鏈球菌間隔體序列。

在一些態樣中，包含針對特定細菌物種Cas9 (例如釀膿鏈球菌Cas9)之gRNA之每一套組進一步包含該Cas9。

在一些態樣中，套組包含一或多種表現靶向癌症抗原之CAR及/或TCR之細胞、培養物或細胞群體。實例實例 1 - 引導 RNA 篩選及經修飾 T 細胞之生成

為評價減少的NR4A家族基因及/或NR4A家族蛋白表現及c-Jun過表現在其對減少耗竭及功能障礙之效應中係冗餘抑或加和，使用ROR1-R12嵌合抗原受體(CAR) T細胞及NY-ESO-1 T細胞受體(TCR) T細胞模型。鑑別出在用ROR1 CAR或NY-ESO-1 TCR轉導之過表現c-Jun蛋白之人類T細胞中，CRISPR-Cas9引導RNA (gRNA)特異性減少每一NR4A家族成員之蛋白質表現。

用於NR4A1及NR4A2之CRISPR-Cas9引導RNA顯示於表A中。在實例2-5中所述之實驗中，NR4A1 sgRNA 5及6係組合使用且NR4A2 sgRNA 1、2及3係組合使用。

在三個獨立實驗(v0、v1及v2)中設計並篩選特異性針對NR4A3之單一gRNA以鑑別具有最大編輯效率及最大蛋白質減少之gRNA。對於所有gRNA篩選，經分離之供體CD4+ T細胞及CD8+ T細胞係購自AllCells。將CD4+ T細胞及CD8+ T細胞解凍且以1:1比率混合以用1% (v/v) TransAct (Miltenyi)活化24小時。24小時後，活化的T細胞用編碼抗ROR1 CAR之雙順反子(v0)或三順反子慢病毒載體(v2)轉導或不進行轉導(v1)。然後用靶向人類NR4A3之Cas9 RNP利用經修飾之引導RNA (Synthego；v0 -表B、v1 -表C及v2 -表D)及Lonza 4D Nucleofector單元對T細胞進行電穿孔。將經電穿孔的T細胞轉移至G-Rex培養板中用於擴增，然後在第7天低溫保藏於CryoStor培養基中。在實驗v0及v1中使用一個供體，而在實驗v2中使用兩個獨立供體。為在第7天藉由流式細胞術評估蛋白質減少之效率，用CD3/CD28 Dynabeads (在v0及v1中)或PMA+離子黴素(在v2中)將3×105個NR4A3編輯之T細胞或對照T細胞(未經RNP電穿孔)在37℃下在96孔圓底板(Corning)中在200 µL RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素(penicillin)/鏈黴素(streptomycin)中刺激兩小時，以誘導最大NR4A3表現。刺激後，如上文所述用表面標記物對細胞染色。然後遵循製造商之說明書用FoxP3轉錄因子染色緩衝液套組(eBiosciences)固定且透化細胞，並使用定制螢光染料結合之NR4A3抗體(R&D Systems)實施細胞內染色。

在v0中，與對照未經編輯之細胞相比，gRNA皆未減少NR4A3蛋白表現(表B)。未藉由NGS實施確認性基因體編輯效率。在v1中，與未經編輯之對照相比，所有7種gRNA皆減少NR4A3蛋白表現，且實施NGS編輯效率。兩種引導物(g4及g8)具有最高的基因體編輯(如藉由總T細胞變異%所量測)。儘管編輯效率較高，但基因體變異體之插入/缺失表徵揭露，g8產生高頻率之不期望框內缺失(表C)。在v2中，前14種gRNA係基於KO條件來選擇，其中對於兩個供體，NR4A3蛋白表現與未經編輯之對照相比減少及/或類似於/優於基準g4 (表D)。進一步評估所選條件以藉由NGS分析確認基因體編輯效率。

如下文實例中更詳細闡述，過表現c-Jun之NR4A3編輯之ROR1 CAR T細胞展示最大的功能益處，此展示在連續ROR1抗原暴露後與對照ROR1 CAR T細胞(例如不會過表現c-Jun)相比顯著延長之細胞毒性、細胞介素產生、T細胞持久性及改良之表型。過表現c-Jun之NR4A3編輯之NY-ESO-1 TCR T細胞亦展示最大功能益處，此展示在連續NY-ESO-1抗原暴露後與對照NY-ESO-1 TCR T細胞(例如不會過表現c-Jun)相比延長之細胞毒性及細胞介素產生。實例 2 - 減少的 NR4A3 表現

在具及不具c-Jun過表現之NR4A編輯之ROR1 CAR T細胞及NY-ESO-1 TCR T細胞中藉由流式細胞術驗證使用NR4A3 sgRNA g4 (SEQ ID NO: 30)之NR4A3蛋白之減少。使用CD3/CD28 Dynabeads或PMA+離子黴素進行刺激以誘導最大NR4A表現。對於流式細胞術分析，用活/死染料將具及不具c-Jun過表現之NR4A3編輯之ROR1 CAR T細胞及NY-ESO-1 TCR T細胞在室溫(RT)下染色10分鐘，用TruStain FcX (Biolegend)在RT下封閉5分鐘，用CCR7在37℃下染色15分鐘，且然後用表面標記物抗體在RT下染色10分鐘。所有染色皆係在Biolegend細胞染色緩衝液中實施。然後用FoxP3轉錄因子染色緩衝液套組(eBiosciences)遵循製造商之說明書固定且透化細胞。用10%正常小鼠及兔血清將細胞在室溫下封閉10分鐘，且然後用cParp (僅用於依序刺激之第0天)及c-Jun染色。

用CD3/CD28 Dynabeads (Thermo Fisher)以3:1珠粒對細胞比率或PMA+離子黴素(BioLegend)將3×10 ⁵個NR4A編輯之或對照ROR1 CAR T細胞及NY-ESO-1 TCR T細胞在37℃下在96孔圓底板(Corning)中在200 µL RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素/鏈黴素中刺激兩小時，以誘導最大NR4A表現。刺激後，移除Dynabeads，且如上文所述用表面標記物對細胞染色。然後用FoxP3轉錄因子染色緩衝液套組(eBiosciences)遵循製造商之說明書固定且透化細胞。使用定制螢光染料結合之NR4A抗體(R&D Systems)進行染色。

與未經編輯之對照相比，NR4A3蛋白表現在NR4A3編輯之ROR1 CD4 ⁺及CD8 ⁺CAR T細胞以及NY-ESO-1 CD4 ⁺及CD8 ⁺TCR T細胞中顯著減少，而與c-Jun表現無關( 圖 1 及圖 12)。類似地，使用特異性針對NR4A1及NR4A2基因之CRISPR-Cas9 gRNA達成高效率NR4A1及NR4A2蛋白減少(數據未顯示)。儘管ROR1 CAR T細胞之轉導效率(鑑別為EGFR ⁺R12 ⁺%)在對照中低於過表現c-Jun之CAR T細胞，但ROR1-R12 CAR之平均幾何螢光(gMFI)在兩種ROR1 CAR構築物中並無顯著不同。ROR1 CAR百分比及gMFI在四個所測試供體中係相似的且不受NR4A編輯之影響 ( 圖 2)。

儘管NY-ESO-1 TCR T細胞之轉導效率(鑑別為TCRvβ13.1+%及gMFI)在對照中顯著高於過表現c-Jun之TCR T細胞，但NY-ESO-1 TCR百分比及gMFI在三個所測試供體中係相似的且不受NR4A編輯之影響( 圖 13)。實例 3 - 依序刺激中之持續細胞毒性及細胞介素產生

在使CAR T細胞依序暴露於抗原之活體外耗竭分析中評估具及不具c-Jun過表現之單一NR4A編輯之ROR1 CAR T細胞(其中CAR T細胞在NR4A1、NR4A2或NR4A3處經編輯)之功能。在設置分析之前，將H1975-NucLight Red (NLR)腫瘤細胞株在RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素/鏈黴素中培養2-3代。用TrypLE Express酶(Gibco)將細胞胰蛋白酶化。

在依序刺激分析中，用H1975 NSCLC ROR1表現腫瘤細胞株對具及不具c-Jun過表現之NR4A編輯之ROR1 CAR T細胞進行五次連續刺激。具體而言，將低溫保藏之ROR1 CAR T細胞解凍且立即以1:1 E:T比率之cParp ^-CD3 ⁺EGFR ⁺R12 ⁺CAR T細胞與H1975-NLR腫瘤細胞一式三份培養於平面24孔分析板(Eppendorf)中之RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素/鏈黴素中。共培養3天後，將各孔重懸浮，且將25%培養物轉移至新板上，每孔具有相同起始數量之新鮮腫瘤細胞。將此重複總共5次刺激。在分析期間在Incucyte中連續量測細胞毒性且在設置每一新刺激後24小時收集上清液以量測細胞介素水準。合併一式三份共培養孔之剩餘細胞用於如上文所述之表型流動分析。c-Jun CAR T細胞優於非c-Jun對照CAR T細胞。意外的是，NR4A3 KO c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞對H1975腫瘤細胞仍具最大細胞毒性，此展示與4個不同供體中之所有其他條件相比，在五輪刺激後持續溶解靶細胞之能力( 圖 3)。

除持續細胞毒性外，當用H1975 NSCLC ROR1表現腫瘤細胞刺激時，與NR4A1編輯、NR4A2編輯或未經編輯之對照及c-Jun ROR1 CAR T細胞相比，NR4A3 KO c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞亦產生最高水準之IFN-γ、IL-2及TNF-α ( 圖 4 及表 9-11)。細胞介素水準係使用中尺度發現V-Plex促發炎面板1人類套組或定制人類IFN-γ、IL-2及TNF-α細胞介素套組遵循製造商之說明書來量測。

細胞介素產生之差異在後幾輪刺激後最明顯，此表明在延長抗原刺激後，NR4A3基因剔除及c-Jun過表現有助於維持功能活性及/或改良CAR T細胞存活。事實上，在NR4A編輯之c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞中觀察到ROR1 CAR頻率之較高維持 ( 圖 5A)。因此，此與在第2-3輪刺激時總NR4A3 KO c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞數之增加的持久性相關聯 ( 圖 5B)。NR4A3 KO c-Jun ROR1 CAR T細胞在第二輪刺激後展示改變的細胞表面表型，此與減少的耗竭一致 ( 圖 6)。與未經編輯之c-Jun ROR1 CAR T細胞相比，NR4A3 KO在所有4個供體中產生顯著較低之TIM3及TIGIT表現，且在4個供體中之3者中產生較低之PD-1。有趣的是，在第二輪刺激後，CD127表現在NR4A3 KO c-Jun ROR1 CAR T細胞上顯著高於未經編輯之c-Jun ROR1 CAR T細胞，即使CD127表現在基線處係相似的(第0天，數據未顯示)。已顯示，CD127在多種病毒感染中係抗原特異性記憶CD8 ⁺T細胞之標記物(Huster等人， PNAS, 101, 5610-5615 (2004)；Boettler等人， J. Virol. 80, 3532-3540 (2006)；Xu等人， Lab. Med. 48, 57-64 (2017))，此表明與單獨c-Jun或KO相比，在NR4A3不存在下c-Jun過表現可協同維持更像記憶之T細胞狀態。

T細胞耗竭之活體外依序刺激模型揭露，在四個獨立供體中，NR4A3編輯之c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞展現針對ROR1表現H1975腫瘤細胞之最大增強以及持續的細胞毒性及細胞介素產生。後幾輪刺激時增加的功能活性可能至少部分歸因於NR4A3編輯之c-Jun ROR1 CAR T細胞在整個分析中增加的持久性。因此，在ROR1-R12 CAR T細胞之背景下編輯NR4A3與c-Jun過表現之組合可改良針對ROR1表現實體腫瘤之細胞免疫療法。

使用GraphPad Prism未配對t-測試實施統計學分析且使用配對t-測試進行統計學分析。ns -不顯著，* p＜ 0.05，** p＜ 0.005，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。實例 4 - 在依序刺激時 NR4A 三重 KO (TKO) c-Jun CAR T 細胞之持續的細胞毒性及細胞介素產生

在使CAR T細胞依序暴露於抗原之活體外耗竭分析中評估具有c-Jun過表現之c-Jun + NR4A三重KO (TKO) ROR1 CAR T細胞(其中CAR T細胞在NR4A1、NR4A2及NR4A3處經編輯)之功能。在設置分析之前，將H1975-NucLight Red (NLR)及A549-NLR腫瘤細胞株在RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素/鏈黴素中培養2-3代。用TrypLE Express酶(Gibco)將細胞胰蛋白酶化。

在依序刺激分析中，用H1975或A549 NSCLC ROR1表現腫瘤細胞株對NR4A TKO或對照(未經編輯) c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞進行五次連續刺激。具體而言，將低溫保藏之ROR1 CAR T細胞解凍且立即以1:1 E:T比率之cParp ^-CD3 ⁺EGFR ⁺R12 ⁺CAR T細胞與H1975-NLR或A549-NLR腫瘤細胞一式三份培養於平面24孔分析板(Eppendorf)中之RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素/鏈黴素中。共培養3天後，將各孔重懸浮，且將25%培養物轉移至新板上，每孔具有相同起始數量之新鮮腫瘤細胞。將此重複總共5次刺激。在分析期間在Incucyte中連續量測細胞毒性且在設置每一新刺激後24小時收集上清液以量測細胞介素水準。合併一式三份共培養孔之剩餘細胞用於如上文所述之表型流動分析。與對照c-Jun ROR1 CAR T細胞相比，NR4A TKO c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞對H1975及/或A549腫瘤細胞仍更具細胞毒性，此展示在3個不同供體中在五輪刺激後持續溶解靶細胞之能力( 圖 7)。除持續細胞毒性外，在用H1975及/或A549多次刺激後，與對照(未經編輯) c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞相比，NR4A TKO c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞亦產生更高水準之IFN-γ、IL-2及TNF-α ( 圖 8-10)。細胞介素水準係使用中尺度發現V-Plex促發炎面板1人類套組或定制人類IFN-γ、IL-2及TNF-α細胞介素套組遵循製造商之說明書來量測。在所有3個供體中在用H1975後續刺激時，與對照c-Jun過表現ROR1 CAR T細胞相比，增加的細胞毒性及細胞介素分泌與NR4A TKO增強的持久性相關聯 ( 圖 11)。實例 5 - 依序刺激中經改造之 TCR T 細胞之持續細胞毒性及細胞介素產生

在使TCR T細胞依序暴露於抗原之活體外耗竭分析中評估具及不具c-Jun過表現之單一NR4A編輯之NY-ESO-1 TCR T細胞(其中TCR T細胞在NR4A1、NR4A2或NR4A3處經編輯)之功能。在設置分析之前，將A375-NucLight Red (NLR)腫瘤細胞株在RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素/鏈黴素中培養2-3代。用Accutase酶(StemCell Technologies)將細胞胰蛋白酶化。

在依序刺激分析中，用A375黑色素瘤NY-ESO-1/LAGE-1a表現腫瘤細胞株對NR4A編輯之對照及c-Jun過表現NY-ESO-1 TCR T細胞進行四次連續刺激。具體而言，將低溫保藏之NY-ESO-1 TCR T細胞解凍且立即以1:1 E:T比率之cParp ^-CD3 ⁺TCRvβ13.1 ⁺TCR T細胞與A375-NLR腫瘤細胞一式三份培養於平面96孔分析板(Eppendorf)中之RPMI-1640 (Gibco) + 10%胎牛血清(Gibco) + 1%青黴素/鏈黴素中。共培養3或4天後，將各孔重懸浮，且將25%培養物轉移至新板上，每孔具有相同起始數量之新鮮腫瘤細胞。將此重複總共4次刺激。在分析期間在Incucyte中連續量測細胞毒性且在設置每一新刺激後24小時收集上清液以量測細胞介素水準。c-Jun過表現TCR T細胞優於非c-Jun對照TCR T細胞。意外的是，NR4A3 KO c-Jun過表現NY-ESO-1 TCR T細胞對A375腫瘤細胞仍具最大細胞毒性，此展示與3個不同供體中之所有其他條件相比，在四輪刺激後持續溶解靶細胞之能力( 圖 14)。

除持續細胞毒性外，當用A375黑色素瘤NY-ESO-1/LAGE-1a表現腫瘤細胞刺激時，與NR4A1編輯、NR4A2編輯或未經編輯之對照及c-Jun NY-ESO-1 TCR T細胞相比，NR4A3 KO c-Jun過表現NY-ESO-1 TCR T細胞亦產生最高水準之IFN-γ、IL-2及TNF-α ( 圖 15 及表 12-14)。當使用第二NY-ESO-1/LAGE-1a表現腫瘤細胞株H1703連續刺激T細胞時觀察到相似之結果(數據未顯示)。細胞介素水準係使用中尺度發現V-Plex促發炎面板1人類套組或定制人類IFN-γ、IL-2及TNF-α細胞介素套組遵循製造商之說明書來量測。細胞介素產生之差異在後幾輪刺激後最明顯。

應瞭解，意欲使用[實施方式]部分而非[發明內容]及[摘要]部分來解釋申請專利範圍。[發明內容]及[摘要]部分可闡述如本發明者所預期之本揭示案之一或多個但非所有例示性態樣，且因此不欲以任何方式限制本揭示案及所附申請專利範圍。

上文已藉助說明實施所指定功能及其關係之功能構建塊來闡述本揭示案。為便於描述，本文已任意限定該等功能構建塊之邊界。可限定替代邊界，只要所指定功能及其關係適當實施即可。

特定態樣之前述描述將如此充分地揭露本揭示案之一般性質，以致於在不背離本揭示案之一般概念之情況下，他人藉由應用此項技術中所熟知之知識、無需過多實驗即可容易地修改及/或改編該等特定態樣之各種應用。因此，基於本文所呈現之教示及指導，該等改編及修改意欲在所揭示態樣之等效物之含義及範圍內。應理解，本文之片語或術語係出於描述而非限制之目的，使得本說明書之術語或片語將由熟習此項技術者根據教示及指導來解釋。

本揭示案之廣度及範圍不應由任一上述例示性態樣限制，而應僅根據所附申請專利範圍及其等效內容來限定。

本申請案通篇中所引用之所有引用參考文獻(包括文獻參考文獻、美國或外國專利或專利申請案及網站)之內容皆以引用方式明確併入，如同其全文係出於任一目的而寫入本文一樣，其中引用之參考文獻亦如此。當出現任何不一致時，以本文字面揭示之材料為準。

[ 圖 1]顯示在四個獨立供體中在2小時CD3/CD28 Dynabead刺激後(Stim，實心圓)在CAR T細胞產生之第7天，具(「+ c-Jun」)或不具c-Jun (「- c-Jun」)過表現之NR4A3編輯(「NR4A3 KO」)及對照未經編輯之CD4 ⁺(左圖)及CD8 ⁺(右圖) ROR1 CAR T細胞中NR4A3表現之百分比。使用Unstim細胞(空心圓，無Dynabeads)作為陰性對照。使用刺激條件之未配對t-測試進行統計學分析。* p＜ 0.05，** p＜ 0.005，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。 [ 圖 2]顯示在CAR T細胞產生之第7天在來自四個供體之具或不具c-Jun過表現之NR4A1編輯(「NR4A1 KO」)、NR4A2編輯(「NR4A2 KO」)、NR4A3編輯(「NR4A3 KO」)及對照未經編輯之CD4 ⁺(空心圓)及CD8 ⁺(實心圓) ROR1 CAR T細胞中，EGFR ⁺R12 ⁺ROR1 CAR表現之百分比(左圖)及EGFR ⁺R12 ⁺T細胞上ROR1 CAR之幾何平均螢光(右圖)。使用刺激條件之未配對t-測試進行統計學分析且並不顯著。 [ 圖 3]顯示在依序刺激分析中在四個獨立供體中，具或不具c-Jun過表現之NR4A編輯之ROR1 CAR T細胞、對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞及模擬未經轉導之T細胞對H1975-NLR NSCLC細胞的連續抗ROR1溶解。所顯示之不同組包括：(a)不具c-Jun過表現之NR4A1基因剔除(三角形)，(b)不具c-Jun過表現之NR4A2基因剔除(星形)，(c)不具c-Jun過表現之NR4A3基因剔除(黑色圓形)，(d)不具c-Jun過表現之對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞(x符號)，(e)具有c-Jun過表現之NR4A1基因剔除(菱形)，(f)具有c-Jun過表現之NR4A2基因剔除(星號)，(g)具有c-Jun過表現之NR4A3基因剔除(空心圓)，(h)具有c-Jun過表現之對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞(垂直線)，及(i)未經轉導之模擬T細胞(正方形)。藉由量測總NLR強度來量化H1975-NLR靶細胞之溶解。將NLR強度相對於針對每輪刺激再平鋪後之起始強度正規化。NLR - NucLight Red。每圖顯示四個獨立供體之資料。 [ 圖 4A-4C]顯示在對應於圖3之H1975依序刺激分析期間，自具或不具c-Jun過表現之NR4A編輯之ROR1 CAR T細胞、對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞及模擬未經轉導之T細胞產生的分泌性干擾素-γ (IFN-γ) ( 圖 4A)、介白素-2 (IL-2) ( 圖 4B)及腫瘤壞死因子-α (TNF-α) ( 圖 4C)。所顯示之不同組與圖3中相同。在每次再平鋪後24小時收集上清液且藉由MSD量化細胞介素。各圖顯示4個獨立供體之資料。誤差槓代表一式三份孔之平均值+/- SD。 [ 圖 5A]顯示在對應於圖3之H1975依序刺激分析期間在每次再平鋪後，來自具或不具c-Jun過表現之NR4A編輯之ROR1 CAR T細胞及對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞的EGFR ⁺R12 ⁺CD4 ⁺(上圖)及CD8 ⁺(下圖) T細胞上ROR1 CAR之ROR1 CAR表現之百分比。所顯示之不同組包括：(a)不具c-Jun過表現之NR4A1基因剔除(三角形)，(b)不具c-Jun過表現之NR4A2基因剔除(星形)，(c)不具c-Jun過表現之NR4A3基因剔除(黑色圓形)，(d)不具c-Jun過表現之對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞(x符號)，(e)具有c-Jun過表現之NR4A1基因剔除(菱形)，(f)具有c-Jun過表現之NR4A2基因剔除(星號)，(g)具有c-Jun過表現之NR4A3基因剔除(空心圓)，及(h)具有c-Jun過表現之對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞(垂直線)。 [ 圖 5B]顯示在對應於圖3之H1975依序刺激分析期間，來自具或不具c-Jun過表現之NR4A編輯之ROR1 CAR T細胞及對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞的經投射CD3 ⁺ROR1 CAR ⁺T細胞數之倍數變化。計算經投射細胞數以將25%之細胞轉移納入下一刺激。倍數變化計算為(自刺激投射之細胞數/自先前刺激投射之細胞數)。各圖顯示四個獨立供體之資料。所顯示之組與圖3中相同。 [ 圖 6]顯示來自對應於圖3中之第二刺激之H1975依序刺激分析之具(「+ cJun」)或不具(「- cJun」) c-Jun過表現之NR4A3編輯之ROR1 CAR T細胞(「NR4A3 KO」)及對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞的ROR1 CAR ⁺CD4 ⁺(上圖)及CD8 ⁺(下圖) T細胞上抑制性受體(TIM3、CD39及PD1)之表現。使用配對t-測試進行統計學分析。* p＜ 0.05，** p＜ 0.005。n= 4個獨立供體。 [ 圖 7A]及[ 圖 7B]分別顯示過表現c-Jun且經修飾以具有降低水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3 (三重KO，即NR4A TKO)的抗ROR1 CAR T細胞對A549-NLR及H1975-NLR細胞之連續溶解。不具編輯之過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(「對照ROR1 CAR」，含有內源水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3)及未經處理之靶細胞(「單獨靶」)顯示為對照。藉由量測總NLR強度來量化靶細胞之溶解。將NLR強度相對於針對每輪刺激再平鋪後之起始強度正規化。NLR - NucLight Red。 [ 圖 8A]及[ 圖 8B]顯示在分別使用A549及H1975靶細胞之依序刺激分析(參見圖7A及圖7B)期間，由過表現c-Jun且經修飾具有降低水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3之抗ROR1 CAR T細胞(三基因剔除(NR4A TKO；黑色槓))產生的IFN-γ水準。在每次再平鋪(即stim 1、stim 2、stim 3、stim 4及stim 5)後24小時收集上清液且藉由MSD量化細胞介素。不具編輯之過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(「對照ROR1 CAR」，含有內源水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3)顯示為對照(灰色槓)。在圖8A及圖8B中之每一者中，提供三個單獨供體之結果。使用未配對t-測試進行統計學分析。* p＜ 0.05，** p＜ 0.005，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。 [ 圖 9A]及[ 圖 9B]顯示在分別使用A549及H1975靶細胞之依序刺激分析(參見例如，圖7A及圖7B)期間，由過表現c-Jun且經修飾具有降低水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3之抗ROR1 CAR T細胞(三基因剔除(NR4A TKO)；黑色槓)產生的IL-2水準。在每次再平鋪(即stim 1、stim 2、stim 3、stim 4及stim 5)後24小時收集上清液且藉由MSD量化細胞介素。不具編輯之過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(「對照ROR1 CAR」，含有內源水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3)顯示為對照(灰色槓)。在圖9A及圖9B中之每一者中，提供三個單獨供體之結果。使用未配對t-測試進行統計學分析。* p＜ 0.05，** p＜ 0.005，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。 [ 圖 10A]及[ 圖 10B]顯示在分別使用A549及H1975靶細胞之依序刺激分析(參見，例如，圖7A及圖7B)期間，由過表現c-Jun且經修飾具有降低水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3之抗ROR1 CAR T細胞(三基因剔除(NR4A TKO；黑色槓))產生的TNF-α水準。在每次再平鋪(即stim 1、stim 2、stim 3、stim 4及stim 5)後24小時收集上清液且藉由MSD量化細胞介素。不具編輯之過表現c-Jun之抗ROR1 CAR T細胞(「對照ROR1 CAR」，含有內源水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3)顯示為對照(灰色槓)。在圖10A及圖10B中之每一者中，提供三個單獨供體之結果。使用未配對t-測試進行統計學分析。* p＜ 0.05，** p＜ 0.005，*** p＜ 0.001，**** p＜ 0.0001。 [ 圖 11]顯示在使用H1975靶細胞之依序刺激分析(參見例如圖7A及圖7B)期間，過表現c-Jun且經修飾具有降低水準之NR4A1、NR4A2及NR4A3之抗ROR1 CAR T細胞(三基因剔除(NR4A TKO)；三角形)的持久性。NR4A編輯之抗ROR1 CAR T細胞及對照組與圖7A及圖7B中所述相同。藉由在每一依序刺激(即stim-1、stim-2、stim-3、stim-4)後藉由流式細胞術量化cParp(-)CD3+EGFR+ ROR1 CAR T細胞數來量測持久性。 [ 圖 12]顯示在三個獨立供體中在2小時PMA+離子黴素刺激後(Stim，實心圓)在TCR T細胞產生之第7天，具或不具c-Jun過表現之NR4A3編輯(KO)及對照未經編輯之CD4+ (左圖)及CD8+ (右圖) NY-ESO-1 TCR T細胞中NR4A3表現之百分比。使用Unstim細胞(空心圓，無PMA+離子黴素刺激)作為陰性對照。使用刺激條件之未配對t-測試進行統計學分析。*p ＜ 0.05，** p ＜ 0.005，*** p ＜ 0.001，**** p ＜ 0.0001。 [ 圖 13]顯示在TCR T細胞產生之第7天在來自三個供體之具或不具c-Jun過表現之NR4A1編輯、NR4A2編輯、NR4A3編輯(KO)及對照未經編輯之CD4+ (空心圓)及CD8+ (實心圓) NY-ESO-1 TCR T細胞中，TCRv 13.1+ NY-ESO-1 TCR表現之百分比(左圖)及TCRv 13.1+ T細胞上NY-ESO-1 TCR之幾何平均螢光(右圖)。使用未配對t-測試進行統計學分析。**** p ＜ 0.0001。 [ 圖 14]顯示在依序刺激分析中來自三個獨立供體之具或不具c-Jun過表現之NR4A編輯之NY-ESO-1 TCR T細胞(KO)、對照未經編輯之NY-ESO-1 TCR T細胞及模擬未經轉導之T細胞對NY-ESO-1+ A375-NLR黑色素瘤細胞的連續溶解。特定而言，所顯示之不同NY-ESO-1 TCR T細胞包括：(a)不具c-Jun過表現之NR4A1基因剔除(三角形)，(b)不具c-Jun過表現之NR4A2基因剔除(星形)，(c)不具c-Jun過表現之NR4A3基因剔除(黑色圓形)，(d)不具c-Jun過表現之對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞(x符號)，(e)具有c-Jun過表現之NR4A1基因剔除(菱形)，(f)具有c-Jun過表現之NR4A2基因剔除(星號)，(g)具有c-Jun過表現之NR4A3基因剔除(空心圓)，(h)具有c-Jun過表現之對照未經編輯之ROR1 CAR T細胞(垂直線)，及(i)未經轉導之模擬T細胞(正方形)。藉由量測總NLR計數來量化A375-NLR靶細胞之溶解。將NLR計數相對於針對每輪刺激再平鋪後之起始計數正規化。NLR - NucLight Red。每圖代表獨立供體之資料。 [ 圖 15A-15C]顯示在對應於圖14之A375依序刺激分析期間，自具或不具c-Jun過表現之NR4A編輯之NY-ESO-1 TCR T細胞、對照未經編輯之NY-ESO-1 TCR T細胞及模擬未經轉導之T細胞產生的分泌性干擾素-γ (IFN-γ) ( 圖 15A)、介白素-2 (IL-2) ( 圖 15B)及腫瘤壞死因子-α (TNF-α) ( 圖 15C)。在每次再平鋪後24小時收集上清液且藉由MSD量化細胞介素。不同組與圖14中所述相同。各圖顯示3個獨立供體之資料。


          <![CDATA[<110>  美商萊爾免疫藥物公司 (LYELL IMMUNOPHARMA, INC.)]]>
          <![CDATA[<120>  表現c-Jun之NR4A缺陷型細胞及其用途]]>
          <![CDATA[<140>  TW 111120715]]>
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          <![CDATA[<170>  PatentIn 3.5版]]>
          <![CDATA[<210>  1]]>
          <![CDATA[<211>  626]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3同種型α]]>
          <![CDATA[<400>  1]]>
          Met Pro Cys Val Gln Ala Gln Tyr Ser Pro Ser Pro Pro Gly Ser Ser 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Ala Ala Gln Thr Tyr Ser Ser Glu Tyr Thr Thr Glu Ile Met Asn 
                      20                  25                  30          
          Pro Asp Tyr Thr Lys Leu Thr Met Asp Leu Gly Ser Thr Glu Ile Thr 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ala Thr Thr Ser Leu Pro Ser Ile Ser Thr Phe Val Glu Gly 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ser Ser Asn Tyr Glu Leu Lys Pro Ser Cys Val Tyr Gln Met Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Leu Ile Lys Val Glu Glu Gly Arg Ala Pro Ser Tyr His His 
                          85                  90                  95      
          His His His His His His His His His His His His Gln Gln Gln His 
                      100                 105                 110         
          Gln Gln Pro Ser Ile Pro Pro Ala Ser Ser Pro Glu Asp Glu Val Leu 
                  115                 120                 125             
          Pro Ser Thr Ser Met Tyr Phe Lys Gln Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          Thr Pro Ala Phe Pro Pro Gln Ala Gly Ala Leu Trp Asp Glu Ala Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Ala Pro Gly Cys Ile Ala Pro Gly Pro Leu Leu Asp Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Met Lys Ala Val Pro Thr Val Ala Gly Ala Arg Phe Pro Leu Phe His 
                      180                 185                 190         
          Phe Lys Pro Ser Pro Pro His Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ser Leu Pro 
              210                 215                 220                 
          Leu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ala Leu Glu Ser 
          225                 230                 235                 240 
          His Pro Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Lys Arg Ala Ala Pro Leu Ala Phe 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Leu Gly Leu Thr Pro Ser Pro Thr Ala Ser Ser Leu Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Glu Ser Pro Ser Leu Pro Ser Pro Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly 
                  275                 280                 285             
          Glu Gly Thr Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His Tyr 
              290                 295                 300                 
          Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro Val 
                          325                 330                 335     
          Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys Cys 
                      340                 345                 350         
          Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys 
                  355                 360                 365             
          Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro Leu Gln Gln 
              370                 375                 380                 
          Glu Pro Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ile Cys Met Met Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Leu Val Arg Ala Leu Thr Asp Ser Thr Pro Arg Asp Leu Asp Tyr 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Tyr Cys Pro Thr Asp Gln Ala Ala Ala Gly Thr Asp Ala Glu 
                      420                 425                 430         
          His Val Gln Gln Phe Tyr Asn Leu Leu Thr Ala Ser Ile Asp Val Ser 
                  435                 440                 445             
          Arg Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Thr Asp Leu Pro Lys Glu 
              450                 455                 460                 
          Asp Gln Thr Leu Leu Ile Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Val Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Arg Leu Ser Ile Arg Ser Asn Thr Ala Glu Asp Lys Phe Val Phe Cys 
                          485                 490                 495     
          Asn Gly Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Leu Arg Gly Phe Gly Glu 
                      500                 505                 510         
          Trp Leu Asp Ser Ile Lys Asp Phe Ser Leu Asn Leu Gln Ser Leu Asn 
                  515                 520                 525             
          Leu Asp Ile Gln Ala Leu Ala Cys Leu Ser Ala Leu Ser Met Ile Thr 
              530                 535                 540                 
          Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu Glu Leu Cys Asn 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Ile Thr Ser Ser Leu Lys Asp His Gln Ser Lys Gly Gln Ala Leu 
                          565                 570                 575     
          Glu Pro Thr Glu Ser Lys Val Leu Gly Ala Leu Val Glu Leu Arg Lys 
                      580                 585                 590         
          Ile Cys Thr Leu Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu Lys Leu Glu Asp 
                  595                 600                 605             
          Leu Val Ser Pro Pro Ser Ile Ile Asp Lys Leu Phe Leu Asp Thr Leu 
              610                 615                 620                 
          Pro Phe 
          625     
          <![CDATA[<210>  2]]>
          <![CDATA[<211>  443]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3同種型β]]>
          <![CDATA[<400>  2]]>
          Met Pro Cys Val Gln Ala Gln Tyr Ser Pro Ser Pro Pro Gly Ser Ser 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Ala Ala Gln Thr Tyr Ser Ser Glu Tyr Thr Thr Glu Ile Met Asn 
                      20                  25                  30          
          Pro Asp Tyr Thr Lys Leu Thr Met Asp Leu Gly Ser Thr Glu Ile Thr 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ala Thr Thr Ser Leu Pro Ser Ile Ser Thr Phe Val Glu Gly 
              50                  55                  60                  
          Tyr Ser Ser Asn Tyr Glu Leu Lys Pro Ser Cys Val Tyr Gln Met Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Arg Pro Leu Ile Lys Val Glu Glu Gly Arg Ala Pro Ser Tyr His His 
                          85                  90                  95      
          His His His His His His His His His His His His Gln Gln Gln His 
                      100                 105                 110         
          Gln Gln Pro Ser Ile Pro Pro Ala Ser Ser Pro Glu Asp Glu Val Leu 
                  115                 120                 125             
          Pro Ser Thr Ser Met Tyr Phe Lys Gln Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr 
              130                 135                 140                 
          Thr Pro Ala Phe Pro Pro Gln Ala Gly Ala Leu Trp Asp Glu Ala Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Ser Ala Pro Gly Cys Ile Ala Pro Gly Pro Leu Leu Asp Pro Pro 
                          165                 170                 175     
          Met Lys Ala Val Pro Thr Val Ala Gly Ala Arg Phe Pro Leu Phe His 
                      180                 185                 190         
          Phe Lys Pro Ser Pro Pro His Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Gly Gly 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Gly Tyr Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ser Leu Pro 
              210                 215                 220                 
          Leu Gly Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ala Leu Glu Ser 
          225                 230                 235                 240 
          His Pro Tyr Gly Leu Pro Leu Ala Lys Arg Ala Ala Pro Leu Ala Phe 
                          245                 250                 255     
          Pro Pro Leu Gly Leu Thr Pro Ser Pro Thr Ala Ser Ser Leu Leu Gly 
                      260                 265                 270         
          Glu Ser Pro Ser Leu Pro Ser Pro Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly 
                  275                 280                 285             
          Glu Gly Thr Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His Tyr 
              290                 295                 300                 
          Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro Val 
                          325                 330                 335     
          Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys Cys 
                      340                 345                 350         
          Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys 
                  355                 360                 365             
          Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro Leu Gln Gln 
              370                 375                 380                 
          Glu Pro Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ile Cys Met Met Asn 
          385                 390                 395                 400 
          Ala Leu Val Arg Ala Leu Thr Asp Ser Thr Pro Arg Asp Leu Asp Tyr 
                          405                 410                 415     
          Ser Arg Val Ser Phe Met Ile Ser Cys Phe Gln Met Asn Asp Gln Gly 
                      420                 425                 430         
          Leu Tyr Leu Trp Leu Leu Val Ile Arg Val Asp 
                  435                 440             
          <![CDATA[<210>  3]]>
          <![CDATA[<211>  637]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3同種型3]]>
          <![CDATA[<400>  3]]>
          Met His Asp Ser Ile Arg Phe Gly Asn Val Asp Met Pro Cys Val Gln 
          1               5                   10                  15      
          Ala Gln Tyr Ser Pro Ser Pro Pro Gly Ser Ser Tyr Ala Ala Gln Thr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Ser Ser Glu Tyr Thr Thr Glu Ile Met Asn Pro Asp Tyr Thr Lys 
                  35                  40                  45              
          Leu Thr Met Asp Leu Gly Ser Thr Glu Ile Thr Ala Thr Ala Thr Thr 
              50                  55                  60                  
          Ser Leu Pro Ser Ile Ser Thr Phe Val Glu Gly Tyr Ser Ser Asn Tyr 
          65                  70                  75                  80  
          Glu Leu Lys Pro Ser Cys Val Tyr Gln Met Gln Arg Pro Leu Ile Lys 
                          85                  90                  95      
          Val Glu Glu Gly Arg Ala Pro Ser Tyr His His His His His His His 
                      100                 105                 110         
          His His His His His His His Gln Gln Gln His Gln Gln Pro Ser Ile 
                  115                 120                 125             
          Pro Pro Ala Ser Ser Pro Glu Asp Glu Val Leu Pro Ser Thr Ser Met 
              130                 135                 140                 
          Tyr Phe Lys Gln Ser Pro Pro Ser Thr Pro Thr Thr Pro Ala Phe Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Gln Ala Gly Ala Leu Trp Asp Glu Ala Leu Pro Ser Ala Pro Gly 
                          165                 170                 175     
          Cys Ile Ala Pro Gly Pro Leu Leu Asp Pro Pro Met Lys Ala Val Pro 
                      180                 185                 190         
          Thr Val Ala Gly Ala Arg Phe Pro Leu Phe His Phe Lys Pro Ser Pro 
                  195                 200                 205             
          Pro His Pro Pro Ala Pro Ser Pro Ala Gly Gly His His Leu Gly Tyr 
              210                 215                 220                 
          Asp Pro Thr Ala Ala Ala Ala Leu Ser Leu Pro Leu Gly Ala Ala Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Ala Ala Gly Ser Gln Ala Ala Ala Leu Glu Ser His Pro Tyr Gly Leu 
                          245                 250                 255     
          Pro Leu Ala Lys Arg Ala Ala Pro Leu Ala Phe Pro Pro Leu Gly Leu 
                      260                 265                 270         
          Thr Pro Ser Pro Thr Ala Ser Ser Leu Leu Gly Glu Ser Pro Ser Leu 
                  275                 280                 285             
          Pro Ser Pro Pro Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Glu Gly Thr Cys Ala 
              290                 295                 300                 
          Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys 
                          325                 330                 335     
          Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg 
                      340                 345                 350         
          Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ser Val Gly Met 
                  355                 360                 365             
          Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg 
              370                 375                 380                 
          Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro Leu Gln Gln Glu Pro Ser Gln Pro 
          385                 390                 395                 400 
          Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ile Cys Met Met Asn Ala Leu Val Arg Ala 
                          405                 410                 415     
          Leu Thr Asp Ser Thr Pro Arg Asp Leu Asp Tyr Ser Arg Tyr Cys Pro 
                      420                 425                 430         
          Thr Asp Gln Ala Ala Ala Gly Thr Asp Ala Glu His Val Gln Gln Phe 
                  435                 440                 445             
          Tyr Asn Leu Leu Thr Ala Ser Ile Asp Val Ser Arg Ser Trp Ala Glu 
              450                 455                 460                 
          Lys Ile Pro Gly Phe Thr Asp Leu Pro Lys Glu Asp Gln Thr Leu Leu 
          465                 470                 475                 480 
          Ile Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Val Leu Arg Leu Ser Ile Arg 
                          485                 490                 495     
          Ser Asn Thr Ala Glu Asp Lys Phe Val Phe Cys Asn Gly Leu Val Leu 
                      500                 505                 510         
          His Arg Leu Gln Cys Leu Arg Gly Phe Gly Glu Trp Leu Asp Ser Ile 
                  515                 520                 525             
          Lys Asp Phe Ser Leu Asn Leu Gln Ser Leu Asn Leu Asp Ile Gln Ala 
              530                 535                 540                 
          Leu Ala Cys Leu Ser Ala Leu Ser Met Ile Thr Glu Arg His Gly Leu 
          545                 550                 555                 560 
          Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu Glu Leu Cys Asn Lys Ile Thr Ser Ser 
                          565                 570                 575     
          Leu Lys Asp His Gln Ser Lys Gly Gln Ala Leu Glu Pro Thr Glu Ser 
                      580                 585                 590         
          Lys Val Leu Gly Ala Leu Val Glu Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu Gly 
                  595                 600                 605             
          Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu Lys Leu Glu Asp Leu Val Ser Pro Pro 
              610                 615                 620                 
          Ser Ile Ile Asp Lys Leu Phe Leu Asp Thr Leu Pro Phe 
          625                 630                 635         
          <![CDATA[<210>  4]]>
          <![CDATA[<211> ]]> 331
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  野生型人類c-Jun]]>
          <![CDATA[<400>  4]]>
          Met Thr Ala Lys Met Glu Thr Thr Phe Tyr Asp Asp Ala Leu Asn Ala 
          1               5                   10                  15      
          Ser Phe Leu Pro Ser Glu Ser Gly Pro Tyr Gly Tyr Ser Asn Pro Lys 
                      20                  25                  30          
          Ile Leu Lys Gln Ser Met Thr Leu Asn Leu Ala Asp Pro Val Gly Ser 
                  35                  40                  45              
          Leu Lys Pro His Leu Arg Ala Lys Asn Ser Asp Leu Leu Thr Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Asp Val Gly Leu Leu Lys Leu Ala Ser Pro Glu Leu Glu Arg Leu Ile 
          65                  70                  75                  80  
          Ile Gln Ser Ser Asn Gly His Ile Thr Thr Thr Pro Thr Pro Thr Gln 
                          85                  90                  95      
          Phe Leu Cys Pro Lys Asn Val Thr Asp Glu Gln Glu Gly Phe Ala Glu 
                      100                 105                 110         
          Gly Phe Val Arg Ala Leu Ala Glu Leu His Ser Gln Asn Thr Leu Pro 
                  115                 120                 125             
          Ser Val Thr Ser Ala Ala Gln Pro Val Asn Gly Ala Gly Met Val Ala 
              130                 135                 140                 
          Pro Ala Val Ala Ser Val Ala Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Phe Ser 
          145                 150                 155                 160 
          Ala Ser Leu His Ser Glu Pro Pro Val Tyr Ala Asn Leu Ser Asn Phe 
                          165                 170                 175     
          Asn Pro Gly Ala Leu Ser Ser Gly Gly Gly Ala Pro Ser Tyr Gly Ala 
                      180                 185                 190         
          Ala Gly Leu Ala Phe Pro Ala Gln Pro Gln Gln Gln Gln Gln Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          His His Leu Pro Gln Gln Met Pro Val Gln His Pro Arg Leu Gln Ala 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Glu Glu Pro Gln Thr Val Pro Glu Met Pro Gly Glu Thr Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Pro Leu Ser Pro Ile Asp Met Glu Ser Gln Glu Arg Ile Lys Ala Glu 
                          245                 250                 255     
          Arg Lys Arg Met Arg Asn Arg Ile Ala Ala Ser Lys Cys Arg Lys Arg 
                      260                 265                 270         
          Lys Leu Glu Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys 
                  275                 280                 285             
          Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln 
              290                 295                 300                 
          Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn His Val Asn Ser Gly Cys 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Leu Met Leu Thr Gln Gln Leu Gln Thr Phe 
                          325                 330     
          <![CDATA[<210>  5]]>
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          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
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          <![CDATA[<223>  野生型人類c-Jun]]>
          <![CDATA[<400>  5]]>
          gctcagagtt gcactgagtg tggctgaagc agcgaggcgg gagtggaggt gcgcggagtc       60
          aggcagacag acagacacag ccagccagcc aggtcggcag tatagtccga actgcaaatc      120
          ttattttctt ttcaccttct ctctaactgc ccagagctag cgcctgtggc tcccgggctg      180
          gtgtttcggg agtgtccaga gagcctggtc tccagccgcc cccgggagga gagccctgct      240
          gcccaggcgc tgttgacagc ggcggaaagc agcggtaccc acgcgcccgc cgggggaagt      300
          cggcgagcgg ctgcagcagc aaagaacttt cccggctggg aggaccggag acaagtggca      360
          gagtcccgga gccaactttt gcaagccttt cctgcgtctt aggcttctcc acggcggtaa      420
          agaccagaag gcggcggaga gccacgcaag agaagaagga cgtgcgctca gcttcgctcg      480
          caccggttgt tgaacttggg cgagcgcgag ccgcggctgc cgggcgcccc ctccccctag      540
          cagcggagga ggggacaagt cgtcggagtc cgggcggcca agacccgccg ccggccggcc      600
          actgcagggt ccgcactgat ccgctccgcg gggagagccg ctgctctggg aagtgagttc      660
          gcctgcggac tccgaggaac cgctgcgcac gaagagcgct cagtgagtga ccgcgacttt      720
          tcaaagccgg gtagcgcgcg cgagtcgaca agtaagagtg cgggaggcat cttaattaac      780
          cctgcgctcc ctggagcgag ctggtgagga gggcgcagcg gggacgacag ccagcgggtg      840
          cgtgcgctct tagagaaact ttccctgtca aaggctccgg ggggcgcggg tgtcccccgc      900
          ttgccacagc cctgttgcgg ccccgaaact tgtgcgcgca gcccaaacta acctcacgtg      960
          aagtgacgga ctgttctatg actgcaaaga tggaaacgac cttctatgac gatgccctca     1020
          acgcctcgtt cctcccgtcc gagagcggac cttatggcta cagtaacccc aagatcctga     1080
          aacagagcat gaccctgaac ctggccgacc cagtggggag cctgaagccg cacctccgcg     1140
          ccaagaactc ggacctcctc acctcgcccg acgtggggct gctcaagctg gcgtcgcccg     1200
          agctggagcg cctgataatc cagtccagca acgggcacat caccaccacg ccgaccccca     1260
          cccagttcct gtgccccaag aacgtgacag atgagcagga gggcttcgcc gagggcttcg     1320
          tgcgcgccct ggccgaactg cacagccaga acacgctgcc cagcgtcacg tcggcggcgc     1380
          agccggtcaa cggggcaggc atggtggctc ccgcggtagc ctcggtggca gggggcagcg     1440
          gcagcggcgg cttcagcgcc agcctgcaca gcgagccgcc ggtctacgca aacctcagca     1500
          acttcaaccc aggcgcgctg agcagcggcg gcggggcgcc ctcctacggc gcggccggcc     1560
          tggcctttcc cgcgcaaccc cagcagcagc agcagccgcc gcaccacctg ccccagcaga     1620
          tgcccgtgca gcacccgcgg ctgcaggccc tgaaggagga gcctcagaca gtgcccgaga     1680
          tgcccggcga gacaccgccc ctgtccccca tcgacatgga gtcccaggag cggatcaagg     1740
          cggagaggaa gcgcatgagg aaccgcatcg ctgcctccaa gtgccgaaaa aggaagctgg     1800
          agagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg     1860
          cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaacc     1920
          acgttaacag tgggtgccaa ctcatgctaa cgcagcagtt gcaaacattt tgaagagaga     1980
          ccgtcggggg ctgaggggca acgaagaaaa aaaataacac agagagacag acttgagaac     2040
          ttgacaagtt gcgacggaga gaaaaaagaa gtgtccgaga actaaagcca agggtatcca     2100
          agttggactg ggttgcgtcc tgacggcgcc cccagtgtgc acgagtggga aggacttggc     2160
          gcgccctccc ttggcgtgga gccagggagc ggccgcctgc gggctgcccc gctttgcgga     2220
          cgggctgtcc ccgcgcgaac ggaacgttgg acttttcgtt aacattgacc aagaactgca     2280
          tggacctaac attcgatctc attcagtatt aaagggggga gggggagggg gttacaaact     2340
          gcaatagaga ctgtagattg cttctgtagt actccttaag aacacaaagc ggggggaggg     2400
          ttggggaggg gcggcaggag ggaggtttgt gagagcgagg ctgagcctac agatgaactc     2460
          tttctggcct gccttcgtta actgtgtatg tacatatata tattttttaa tttgatgaaa     2520
          gctgattact gtcaataaac agcttcatgc ctttgtaagt tatttcttgt ttgtttgttt     2580
          gggtatcctg cccagtgttg tttgtaaata agagatttgg agcactctga gtttaccatt     2640
          tgtaataaag tatataattt ttttatgttt tgtttctgaa aattccagaa aggatattta     2700
          agaaaataca ataaactatt ggaaagtact cccctaacct cttttctgca tcatctgtag     2760
          atactagcta tctaggtgga gttgaaagag ttaagaatgt cgattaaaat cactctcagt     2820
          gcttcttact attaagcagt aaaaactgtt ctctattaga ctttagaaat aaatgtacct     2880
          gatgtacctg atgctatggt caggttatac tcctcctccc ccagctatct atatggaatt     2940
          gcttaccaaa ggatagtgcg atgtttcagg aggctggagg aaggggggtt gcagtggaga     3000
          gggacagccc actgagaagt caaacatttc aaagtttgga ttgtatcaag tggcatgtgc     3060
          tgtgaccatt tataatgtta gtagaaattt tacaataggt gcttattctc aaagcaggaa     3120
          ttggtggcag attttacaaa agatgtatcc ttccaatttg gaatcttctc tttgacaatt     3180
          cctagataaa aagatggcct ttgcttatga atatttataa cagcattctt gtcacaataa     3240
          atgtattcaa ataccaa                                                    3257
          <![CDATA[<210>  6]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  野生型人類c-Jun (編碼區)]]>
          <![CDATA[<400>  6]]>
          atgactgcaa agatggaaac gaccttctat gacgatgccc tcaacgcctc gttcctcccg       60
          tccgagagcg gaccttatgg ctacagtaac cccaagatcc tgaaacagag catgaccctg      120
          aacctggccg acccagtggg gagcctgaag ccgcacctcc gcgccaagaa ctcggacctc      180
          ctcacctcgc ccgacgtggg gctgctcaag ctggcgtcgc ccgagctgga gcgcctgata      240
          atccagtcca gcaacgggca catcaccacc acgccgaccc ccacccagtt cctgtgcccc      300
          aagaacgtga cagatgagca ggagggcttc gccgagggct tcgtgcgcgc cctggccgaa      360
          ctgcacagcc agaacacgct gcccagcgtc acgtcggcgg cgcagccggt caacggggca      420
          ggcatggtgg ctcccgcggt agcctcggtg gcagggggca gcggcagcgg cggcttcagc      480
          gccagcctgc acagcgagcc gccggtctac gcaaacctca gcaacttcaa cccaggcgcg      540
          ctgagcagcg gcggcggggc gccctcctac ggcgcggccg gcctggcctt tcccgcgcaa      600
          ccccagcagc agcagcagcc gccgcaccac ctgccccagc agatgcccgt gcagcacccg      660
          cggctgcagg ccctgaagga ggagcctcag acagtgcccg agatgcccgg cgagacaccg      720
          cccctgtccc ccatcgacat ggagtcccag gagcggatca aggcggagag gaagcgcatg      780
          aggaaccgca tcgctgcctc caagtgccga aaaaggaagc tggagagaat cgcccggctg      840
          gaggaaaaag tgaaaacctt gaaagctcag aactcggagc tggcgtccac ggccaacatg      900
          ctcagggaac aggtggcaca gcttaaacag aaagtcatga accacgttaa cagtgggtgc      960
          caactcatgc taacgcagca gttgcaaaca ttt                                   993
          <![CDATA[<210>  7]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence]]>)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #1]]>
          <![CDATA[<400> ]]> 7
          atgacagcca agatggaaac cacattctac gacgacgccc tgaacgcctc attcctgcct       60
          tctgagagcg gaccttacgg ctacagcaat cctaagatcc tgaaacagag catgaccctt      120
          aacctggctg atcctgttgg aagcctgaaa cctcacctga gagccaaaaa cagcgacctg      180
          ctcaccagcc ctgatgtggg cctgctgaag ctggcctctc cagagctgga acggctgatc      240
          atccagagca gcaacggcca catcacaacc acccctaccc ctacacaatt cctgtgccct      300
          aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgaaggct ttgtgcgggc cctggcagaa      360
          ctgcactctc agaacaccct gcctagcgtg acctccgccg cccagcctgt caacggcgcc      420
          ggaatggtgg cccctgccgt ggcttctgtg gccggcggca gcggcagcgg cggattcagc      480
          gcctctctgc actctgagcc tcctgtctac gccaatctgt ctaatttcaa ccccggagcc      540
          ctgtccagcg gcggcggagc tcctagctac ggcgctgctg gactggcctt ccccgcccag      600
          ccccagcaac agcagcagcc tccacaccac ctgccccagc agatgcccgt gcagcaccct      660
          agactgcagg ccctgaagga agaaccccaa acagtgcctg agatgcctgg cgagacacct      720
          ccactgagcc ccatcgacat ggaaagccag gagcggatca aggccgagag aaagagaatg      780
          cggaacagaa tcgccgctag caagtgcaga aagcggaagc tggaaagaat cgccagactg      840
          gaagagaagg tgaagaccct gaaagcccaa aatagcgagc tggccagcac cgccaacatg      900
          ctgcgggaac aggtggccca gctgaagcag aaggtgatga accacgtgaa ctctggttgt      960
          cagctgatgc tgacccagca gctccagacc ttc                                   993
          <![CDATA[<210>  8]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #2]]>
          <![CDATA[<400>  8]]>
          atgacagcca agatggaaac caccttctac gacgacgccc tcaacgcctc cttcctgcct       60
          tctgagagcg gtccttacgg ctacagcaac cccaagatcc tgaagcaaag catgaccctg      120
          aacctggccg accccgttgg ctccctgaaa cctcacctga gagccaaaaa cagcgacctg      180
          ctgaccagcc ctgatgtggg cctgctgaag ctggcctctc cagagctgga aagactgatt      240
          atccagagca gcaacggcca catcaccaca acacctaccc ctacacagtt cctgtgccct      300
          aagaacgtga ctgatgagca ggagggcttt gccgagggct tcgtgagagc cctggctgag      360
          ctgcattctc agaacaccct gcctagcgtg acctctgccg cccagcctgt taatggcgcc      420
          ggcatggtgg cccctgccgt ggcctctgtg gccggaggca gcggcagcgg cggattcagc      480
          gcctctctgc acagcgagcc ccccgtctac gccaacctga gcaatttcaa ccctggcgcc      540
          ctgtccagcg gcggcggcgc cccttcatat ggcgctgccg gcctggcctt ccccgctcag      600
          ccccagcagc agcaacagcc tccacaccac ctgccccagc agatgcccgt gcagcacccc      660
          agactgcagg ccctgaagga agaacctcag accgtgcccg agatgcctgg cgagacccct      720
          cctctgagcc ctatcgacat ggaaagccag gagagaatca aggccgagag gaagcggatg      780
          cggaacagaa tcgccgccag caagtgcaga aaaagaaagc tggaacggat cgccagactg      840
          gaggagaagg tgaagacact gaaagcccaa aattctgaac tggcctctac cgccaatatg      900
          ctgcgcgagc aggtggctca actgaagcag aaggtgatga accacgtgaa cagcggatgt      960
          cagctgatgc tgacacagca gctgcagact ttt                                   993
          <![CDATA[<210>  9]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #3]]>
          <![CDATA[<400>  9]]>
          atgaccgcca agatggaaac caccttctac gacgacgccc tgaacgccag ctttctgcct       60
          tctgagtctg gcccctacgg ctacagcaac cccaagatcc tgaagcagag catgaccctg      120
          aacctggccg atcctgtggg cagcctgaaa cctcacctga gagccaagaa cagcgacctg      180
          ctgacaagcc ctgatgtggg cctgctgaaa ctggcctctc ctgagctgga acggctgatc      240
          atccagagca gcaacggcca catcaccacc acacctacac caacacagtt tctgtgcccc      300
          aagaacgtga ccgacgagca agagggattc gccgagggct ttgttagagc cctggccgaa      360
          ctgcacagcc agaataccct gcctagcgtg acatctgccg ctcagcctgt taatggcgcc      420
          ggaatggttg ctcctgccgt ggcttctgtt gctggcggat ctggatctgg cggctttagc      480
          gcctctctgc actctgagcc tccagtgtac gccaacctga gcaacttcaa ccctggcgct      540
          cttagctctg gtggcggagc accttcttat ggcgctgccg gattggcctt tcctgctcag      600
          cctcagcagc agcaacagcc tcctcatcat ctgccccagc agatgcctgt gcagcaccct      660
          agactgcagg ccctgaaaga ggaaccccag acagtccctg agatgcccgg cgaaacacct      720
          cctctgagcc ccatcgacat ggaaagccaa gagcggatca aggccgagcg gaagcggatg      780
          agaaatagaa tcgccgcctc caagtgccgg aagaggaagc tggaaagaat cgcccggctg      840
          gaagagaaag tgaaaaccct gaaggcccag aactccgagc tggcctctac cgccaacatg      900
          ctgagagaac aggtggccca gctgaaacag aaagtcatga accacgtgaa cagcggctgc      960
          cagctgatgc tgacacagca gctgcagacc ttc                                   993
          <![CDATA[<210>  10]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #4]]>
          <![CDATA[<400>  10]]>
          atgactgcca aaatggagac tacattctat gacgacgccc tcaatgccag ttttttgccg       60
          agtgaatccg gcccctacgg ctattcaaac cctaagatcc tcaagcaatc aatgaccctc      120
          aatcttgctg acccagttgg ctccctgaaa ccccatctca gagctaaaaa tagtgacctc      180
          cttacttccc ctgatgttgg actcctcaaa cttgcttctc ccgaactcga acgcttgatc      240
          attcaatctt ccaacggcca catcacaaca acacccacac ccacccagtt tctttgccca      300
          aaaaatgtca ccgatgaaca ggaaggtttc gcggaaggat tcgtccgcgc gctggccgaa      360
          ctgcactccc agaatacact tccttcagtt acgtcagccg cccagccagt gaatggtgcg      420
          ggaatggttg ctcctgcggt cgcttctgtc gcagggggct ccggttctgg cggatttagc      480
          gcctctctgc attccgagcc acctgtatat gctaatcttt ctaattttaa ccccggagcc      540
          ttgtctagcg gcggtggtgc ccccagctac ggtgctgcag gactcgcctt cccagctcaa      600
          cctcagcagc agcaacaacc cccccatcac cttccccaac agatgccagt acaacatcca      660
          aggctccagg ccctcaaaga ggaaccacag acggtgcccg aaatgcctgg cgaaactcca      720
          ccactttccc ctattgatat ggaatcccaa gagcgcatca aggccgaaag aaagcgaatg      780
          cggaatagaa tagcagcttc aaaatgtaga aaacggaaat tggaacgaat cgcacggttg      840
          gaagaaaagg tgaagacctt gaaagcccag aacagtgagc tcgcctctac cgctaacatg      900
          ctgcgcgagc aagtcgcaca acttaagcag aaggtgatga accatgtgaa tagcggatgt      960
          caacttatgc tgactcaaca gttgcaaacc ttt                                   993
          <![CDATA[<210>  11]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #5]]>
          <![CDATA[<400>  11]]>
          atgaccgcga aaatggagac aacattttac gatgatgcac tgaacgcctc ttttctgcca       60
          agtgaatccg gcccctacgg atactcaaac cctaagattc tgaaacagtc tatgactctc      120
          aacctggccg acccagttgg cagtctgaag cctcatttgc gagccaagaa tagtgatctg      180
          ctgacctccc cagacgtggg actgctgaaa ctcgcctcac ctgaacttga gcgcttgatt      240
          atacagtcat ccaatgggca catcacaaca acacctactc ctacccagtt tctgtgcccc      300
          aaaaacgtca ccgatgagca ggagggattc gcggaaggct ttgtgcgcgc cctggctgaa      360
          ttgcatagtc agaacactct tcccagcgta accagcgccg cccaaccagt gaatggagcc      420
          ggtatggtgg ctcccgcggt ggctagtgtt gcgggggggt caggctctgg tgggttcagt      480
          gcttctcttc actctgaacc ccctgtgtat gccaatctgt ctaactttaa ccctggggcc      540
          ctctcctctg gtgggggtgc ccccagctac ggagcggccg gcctggcctt tcctgcccag      600
          cctcagcagc agcagcaacc ccctcatcat cttccgcagc agatgccagt acagcatcca      660
          cgcctgcagg ctcttaagga ggagccccag acggtgcccg aaatgcccgg ggaaactcca      720
          cccttgtccc ccattgacat ggagtcccag gagcggatca aggctgaaag aaagaggatg      780
          cggaatcgca tcgcagcctc taaatgccgc aagcggaaac ttgagaggat cgcgcggttg      840
          gaggaaaaag taaaaacctt gaaggcacag aactctgagc tggcgagtac tgccaacatg      900
          ctcagagaac aagtcgcaca gctgaagcag aaagtgatga accatgtgaa cagcggttgt      960
          cagctgatgc tgactcagca gctgcagacc ttc                                   993
          <![CDATA[<210>  12]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #6]]>
          <![CDATA[<400>  12]]>
          atgaccgcca agatggagac cacattctac gatgacgctc tgaacgcttc ctttctgcct       60
          tccgagtccg gcccctacgg ctactccaat cccaagattc tgaagcagag catgacactg      120
          aatctggctg atcccgtggg atctctgaag cctcatctga gagccaagaa ttccgatctg      180
          ctgacaagcc ccgacgtggg actgctcaaa ctggccagcc ccgaactgga gaggctcatt      240
          atccagagct ccaacggcca catcaccaca acacctaccc ctacccagtt tctctgtccc      300
          aagaacgtga cagacgagca agagggattt gccgaaggct tcgtgagagc cctcgccgaa      360
          ctgcatagcc agaacacact gccttccgtg accagcgctg ctcaacccgt gaacggcgct      420
          ggcatggtcg ctcccgccgt cgccagcgtg gctggaggaa gcggatccgg aggcttcagc      480
          gcttccctcc acagcgaacc tcccgtgtac gctaatctga gcaacttcaa ccccggcgct      540
          ctgagcagcg gaggaggagc tcctagctat ggagctgccg gactggcttt tcccgcccag      600
          ccccagcagc agcagcagcc cccccatcat ctgcctcagc agatgcccgt gcagcatccc      660
          agactccaag ctctgaagga ggagcctcag accgtccccg agatgcccgg cgaaaccccc      720
          cctctgtccc ccatcgacat ggaaagccaa gagaggatca aggccgagag gaagaggatg      780
          aggaatagaa tcgccgccag caagtgtaga aagaggaagc tggagaggat cgccagactg      840
          gaggagaagg tgaagaccct caaggctcag aattccgagc tggccagcac agccaacatg      900
          ctgagagagc aagtggccca gctcaagcag aaggtgatga accacgtcaa cagcggatgc      960
          cagctgatgc tcacccagca gctgcagacc ttc                                   993
          <![CDATA[<210>  13]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #7]]>
          <![CDATA[<400>  13]]>
          atgaccgcta aaatggaaac cactttctat gacgatgccc tgaacgcctc cttccttccg       60
          tccgagtccg gaccctacgg atactcaaat cctaagatcc tcaaacagtc gatgaccctc      120
          aacctggccg accccgtggg atccctgaag ccgcacttgc gcgccaagaa ctccgacctc      180
          ctgacgagcc cagacgtggg cctgctgaag ctcgcatcac ccgaacttga gcggttgatc      240
          attcagtcct ccaacggaca tatcaccacc actcccaccc caactcagtt tctgtgtccg      300
          aagaacgtga ccgatgagca agagggattc gccgagggat tcgtgcgggc cctggccgag      360
          ctgcatagcc agaacaccct tccatccgtg acctcggcgg ctcagcctgt gaacggcgcg      420
          ggaatggtcg cgcccgccgt ggcctcggtg gccgggggca gcggcagcgg gggattttcc      480
          gcgtcgctgc actccgagcc gccggtgtac gccaacctgt caaacttcaa ccctggggcc      540
          ctgagctccg gcggtggagc accttcgtac ggcgccgctg gcctggcgtt ccccgcgcaa      600
          ccacagcagc aacagcagcc ccctcaccac ctcccccaac aaatgcctgt gcagcacccg      660
          aggctgcagg ccctcaagga agaaccccag actgtgccgg aaatgccggg ggagactccg      720
          ccgctgtccc ctatcgacat ggaatcacag gaacgcatta aggcagagcg gaagcgcatg      780
          cggaaccgga ttgccgcctc caagtgccgc aagagaaagc tcgaaagaat cgccagattg      840
          gaagaaaagg tcaagactct gaaggcccag aactctgagc tggcatccac cgctaatatg      900
          ctgagggaac aagtggccca gctgaaacag aaggtcatga accacgtcaa cagcggttgc      960
          cagctgatgc tgacccagca actccagaca ttc                                   993
          <![CDATA[<210>  14]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #8]]>
          <![CDATA[<400>  14]]>
          atgaccgcca agatggagac caccttctac gacgacgccc tgaacgccag cttcctgccc       60
          agcgagagcg gaccctacgg ctactctaac cccaagatcc tgaaacagag catgacactg      120
          aatctggccg accccgtggg cagcctgaag cctcacctta gagccaagaa cagcgacctg      180
          ctgaccagcc ccgacgtggg cctgctgaag ctcgcctctc cagagttaga gagactgatc      240
          atccagtcca gcaacggcca catcacaacc accccaaccc ctacccagtt cctgtgcccc      300
          aagaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gccgagggct ttgtgagagc cctggccgag      360
          ttgcactctc agaacaccct gccctccgtg accagcgccg ctcaacctgt gaacggcgca      420
          ggaatggttg ctcctgccgt ggccagcgtt gcaggcggat ctggaagtgg aggcttctcc      480
          gcctcccttc acagcgagcc tcccgtgtac gccaacctga gcaacttcaa ccccggcgcc      540
          ctgagcagtg gaggaggcgc tcccagctat ggagcagctg gattagcctt ccccgcccag      600
          ccacagcagc agcaacagcc tccccaccac ctgcctcagc aaatgcctgt gcagcaccct      660
          cggctgcagg cccttaagga ggagccccag accgttcctg agatgcctgg cgagacccct      720
          cccctgagcc ctatcgacat ggagtcccag gagcggatca aggccgagcg gaagcggatg      780
          cggaaccgga tcgctgcttc caagtgccgg aagagaaagc tggagagaat cgcccggctg      840
          gaggagaagg tgaagaccct gaaggcccag aactccgagc tggcctccac cgccaacatg      900
          ctgcgggagc aggttgcaca gctgaagcag aaggtcatga accacgtgaa cagcggctgc      960
          cagctgatgc tgacccagca gctgcagacc ttc                                   993
          <![CDATA[<210>  15]]>
          <![CDATA[<211>  1059]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #9]]>
          <![CDATA[<400>  15]]>
          atgacagcga agatggagac aaccttctat gacgatgctc ttaacgcctc cttcctgcct       60
          tccgaaagcg ggccctacgg gtactctaat cctaagatac ttaagcaatc gatgactctc      120
          aacctcgctg acccggttgg ctcactgaaa ccacacctga gagctaagaa tagtgacctg      180
          ctcactagtc ccgatgtcgg gcttctgaag ctggcctctc ccgagctgga gaggcttatc      240
          atccaatcat caaatggcca catcaccact accccaacac caactcaatt cctttgccct      300
          aaaaacgtga ccgacgaaca ggaaggcttc gccgagggtt ttgtccgggc cttggccgag      360
          ctgcattctc aaaatacact gccaagcgtc acttctgcgg cgcagccggt taacggagca      420
          gggatggtgg ctcccgccgt tgctagcgtg gccggcggtt ccggctccgg cggtttctct      480
          gcctccttgc attctgagcc accagtctac gcgaacctgt ccaactttaa tccgggggcg      540
          ctgagtagcg gaggcggcgc ccctagctat ggggcagctg gactggcctt cccggcacaa      600
          ccccaacaac aacagcaacc gccacaccat cttcctcaac aaatgccagt gcaacatcca      660
          cgcttacaag ccctcaagga ggaaccccag accgtgcctg agatgcccgg cgaaaccccg      720
          ccattgagcc ctattgacat ggaaagtcaa gagagaatta aggcagagcg caagagaatg      780
          aggaaccgga tcgcagcatc taagtgccgc aaacggaaat tggagcggat cgctcgcttg      840
          gaggagaagg tcaagactct caaggcccag aactccgagc ttgcgagcac agctaatatg      900
          ctgcgcgagc aggtggccca gttaaaacaa aaggtcatga accatgtgaa cagcggctgt      960
          cagctgatgc ttacgcaaca gctgcaaacc tttggctccg gtgcaacgaa cttcagcctg     1020
          ctgaagcagg ccggagatgt tgaggaaaat ccaggtccc                            1059
          <![CDATA[<210>  16]]>
          <![CDATA[<211>  993]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  密碼子最佳化之c-Jun #10]]>
          <![CDATA[<400>  16]]>
          atgacggcca aaatggagac tacgttctac gatgacgcac tcaacgcgtc cttcctgccc       60
          tctgagagtg gaccctatgg ctactccaat ccaaagatcc tgaagcagtc tatgaccctc      120
          aacctggcgg acccggtggg ctcccttaag ccgcacttgc gcgccaagaa ctccgacctg      180
          ctgacctccc ctgatgtggg cctcctcaag ctcgctagcc ctgaattgga gaggctgatc      240
          atccagagct caaatggcca catcaccacc acacctaccc caacccagtt cctgtgccca      300
          aaaaacgtga ccgacgagca ggagggcttc gcggagggct tcgtcagagc tctggccgag      360
          ctgcactcac agaacacgct cccttccgtg acctccgctg cccagccggt caatggcgct      420
          ggaatggtgg ctccggctgt ggcctctgtt gccggcggct ccggctccgg aggcttttca      480
          gcttctctgc attctgagcc cccagtgtac gctaacctga gcaacttcaa ccccggggcg      540
          ctcagctccg gtggcggtgc cccgagctac ggcgcggctg ggctggcgtt ccccgctcag      600
          cctcagcagc aacagcaacc tccccaccac ctgccacagc agatgcctgt gcagcaccca      660
          cgcctgcagg ccttgaagga ggaacctcag actgtgccag agatgcccgg cgagacccca      720
          cccctgtccc cgattgacat ggagagccag gagcgcatca aggcagagcg caagcgtatg      780
          cgcaaccgca tcgcggcctc caagtgccga aagcgcaagc tggagcggat tgctcgcctg      840
          gaggagaagg tgaagaccct gaaggcccag aattccgagc tggcctcgac cgccaacatg      900
          ctacgagaac aggtcgcgca gctgaaacag aaggtcatga accatgtcaa cagcgggtgc      960
          cagctgatgt tgacccagca gcttcagacc ttc                                   993
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          <![CDATA[<211>  121]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<223>  R12 VH]]>
          <![CDATA[<400>  17]]>
          Gln Glu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Ser Leu Thr Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asp Phe Ser Ala Tyr 
                      20                  25                  30          
          Tyr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 
                  35                  40                  45              
          Ala Thr Ile Tyr Pro Ser Ser Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Thr Trp Val 
              50                  55                  60                  
          Asn Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ser Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Gln Met Asn Ser Leu Thr Ala Ala Asp Arg Ala Thr Tyr Phe Cys 
                          85                  90                  95      
          Ala Arg Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile Trp Gly 
                      100                 105                 110         
          Pro Gly Thr Leu Val Thr Ile Ser Ser 
                  115                 120     
          <![CDATA[<210>  18]]>
          <![CDATA[<211>  5]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VH CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  18]]>
          Ala Tyr Tyr Met Ser 
          1               5   
          <![CDATA[<210>  19]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223]]>>  R12 VH CDR2]]&gt;
          <br/>
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          <br/>
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          1               5                   10                  15      
          Gly 
          <![CDATA[<210>  20]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artif]]>icial Sequence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VH CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  20]]>
          Asp Ser Tyr Ala Asp Asp Gly Ala Leu Phe Asn Ile 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  21]]>
          <![CDATA[<211>  112]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VL]]>
          <![CDATA[<400>  21]]>
          Glu Leu Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Val Ser Ala Ala Leu Gly Ser 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Lys Ile Thr Cys Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr 
                      20                  25                  30          
          Ile Asp Trp Tyr Gln Gln Leu Gln Gly Glu Ala Pro Arg Tyr Leu Met 
                  35                  40                  45              
          Gln Val Gln Ser Asp Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro Gly Val Pro Asp 
              50                  55                  60                  
          Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Ile Ile Pro 
          65                  70                  75                  80  
          Ser Val Gln Ala Asp Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Ala Asp Tyr 
                          85                  90                  95      
          Ile Gly Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Thr Gly 
                      100                 105                 110         
          <![CDATA[<210>  22]]>
          <![CDATA[<211>  12]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VL CDR1]]>
          <![CDATA[<400>  22]]>
          Thr Leu Ser Ser Ala His Lys Thr Asp Thr Ile Asp 
          1               5                   10          
          <![CDATA[<210>  23]]>
          <![CDATA[<211>  7]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  R12 VL CDR2]]>
          <![CDATA[<400>  23]]>
          Gly Ser Tyr Thr Lys Arg Pro 
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          <![CDATA[<210>  24]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
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          <![CDATA[<223>  R12 VL CDR3]]>
          <![CDATA[<400>  24]]>
          Gly Ala Asp Tyr Ile Gly Gly Tyr Val 
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  25]]>
          gaaguccucg aacuugaagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  26]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<400>  26]]>
          accuucaugg acggcuacac                                                   20
          <![CDATA[<210>  27]]>
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<400>  27]]>
          uugggauggu caaagaaggu                                                   20
          <![CDATA[<210>  28]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  28]]>
          cagccaggca cuucugaaau                                                   20
          <![CDATA[<210>  29]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A2 sgRNA 3]]>
          <![CDATA[<400>  29]]>
          uccggcgacg cuuguccacu                                                   20
          <![CDATA[<210>  30]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 4]]>
          <![CDATA[<400>  30]]>
          gcucgaguag cccuccacga                                                   20
          <![CDATA[<210>  31]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 4]]>
          <![CDATA[<400>  31]]>
          ggggtcccgt cggccgggtt                                                   20
          <![CDATA[<210>  32]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 5]]>
          <![CDATA[<400>  32]]>
          cccgtcggcc gggttcggcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  33]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 6]]>
          <![CDATA[<400>  33]]>
          ctttaggggt cccgtcggcc                                                   20
          <![CDATA[<210>  34]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<223>  gRNA 7]]>
          <![CDATA[<400>  34]]>
          cagaacttta ggggtcccgt                                                   20
          <![CDATA[<210>  35]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 8]]>
          <![CDATA[<400>  35]]>
          actttagggg tcccgtcggc                                                   20
          <![CDATA[<210>  36]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 9]]>
          <![CDATA[<400>  36]]>
          agcgagcggg gggctgcccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  37]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 10]]>
          <![CDATA[<400>  37]]>
          cgcctccgcc gccggagccc                                                   20
          <![CDATA[<210>  38]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 11]]>
          <![CDATA[<400>  38]]>
          cccgtcggcc gggttcggcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  39]]>
          <![CDATA[<211>  17]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequ]]>ence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  金黃色葡萄球菌(S. aureus)嵌合框架]]>
          <![CDATA[<400>  39]]>
          taatacgact cactata                                                      17
          <![CDATA[<210>  40]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 1]]>
          <![CDATA[<400>  40]]>
          gtcaataccg ccagaatcca                                                   20
          <![CDATA[<210>  41]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 2]]>
          <![CDATA[<400>  41]]>
          caataccgcc agaatccatg                                                   20
          <![CDATA[<210>  42]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  gRNA 3]]>
          <![CDATA[<400>  42]]>
          tcaataccgc cagaatccat                                                   20
          <![CDATA[<210>  43]]>
          <![CDATA[<211>  598]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A2同種型1]]>
          <![CDATA[<400>  43]]>
          Met Pro Cys Val Gln Ala Gln Tyr Gly Ser Ser Pro Gln Gly Ala Ser 
          1               5                   10                  15      
          Pro Ala Ser Gln Ser Tyr Ser Tyr His Ser Ser Gly Glu Tyr Ser Ser 
                      20                  25                  30          
          Asp Phe Leu Thr Pro Glu Phe Val Lys Phe Ser Met Asp Leu Thr Asn 
                  35                  40                  45              
          Thr Glu Ile Thr Ala Thr Thr Ser Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Met 
              50                  55                  60                  
          Asp Asn Tyr Ser Thr Gly Tyr Asp Val Lys Pro Pro Cys Leu Tyr Gln 
          65                  70                  75                  80  
          Met Pro Leu Ser Gly Gln Gln Ser Ser Ile Lys Val Glu Asp Ile Gln 
                          85                  90                  95      
          Met His Asn Tyr Gln Gln His Ser His Leu Pro Pro Gln Ser Glu Glu 
                      100                 105                 110         
          Met Met Pro His Ser Gly Ser Val Tyr Tyr Lys Pro Ser Ser Pro Pro 
                  115                 120                 125             
          Thr Pro Thr Thr Pro Gly Phe Gln Val Gln His Ser Pro Met Trp Asp 
              130                 135                 140                 
          Asp Pro Gly Ser Leu His Asn Phe His Gln Asn Tyr Val Ala Thr Thr 
          145                 150                 155                 160 
          His Met Ile Glu Gln Arg Lys Thr Pro Val Ser Arg Leu Ser Leu Phe 
                          165                 170                 175     
          Ser Phe Lys Gln Ser Pro Pro Gly Thr Pro Val Ser Ser Cys Gln Met 
                      180                 185                 190         
          Arg Phe Asp Gly Pro Leu His Val Pro Met Asn Pro Glu Pro Ala Gly 
                  195                 200                 205             
          Ser His His Val Val Asp Gly Gln Thr Phe Ala Val Pro Asn Pro Ile 
              210                 215                 220                 
          Arg Lys Pro Ala Ser Met Gly Phe Pro Gly Leu Gln Ile Gly His Ala 
          225                 230                 235                 240 
          Ser Gln Leu Leu Asp Thr Gln Val Pro Ser Pro Pro Ser Arg Gly Ser 
                          245                 250                 255     
          Pro Ser Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys 
                      260                 265                 270         
          Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys 
                  275                 280                 285             
          Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn 
              290                 295                 300                 
          Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe 
          305                 310                 315                 320 
          Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp 
                          325                 330                 335     
          Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser Pro 
                      340                 345                 350         
          Gln Glu Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Val Ser Leu Ile Ser Ala Leu 
                  355                 360                 365             
          Val Arg Ala His Val Asp Ser Asn Pro Ala Met Thr Ser Leu Asp Tyr 
              370                 375                 380                 
          Ser Arg Phe Gln Ala Asn Pro Asp Tyr Gln Met Ser Gly Asp Asp Thr 
          385                 390                 395                 400 
          Gln His Ile Gln Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Ser Met Glu Ile 
                          405                 410                 415     
          Ile Arg Gly Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Asp Leu Pro Lys 
                      420                 425                 430         
          Ala Asp Gln Asp Leu Leu Phe Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Val 
                  435                 440                 445             
          Leu Arg Leu Ala Tyr Arg Ser Asn Pro Val Glu Gly Lys Leu Ile Phe 
              450                 455                 460                 
          Cys Asn Gly Val Val Leu His Arg Leu Gln Cys Val Arg Gly Phe Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Glu Trp Ile Asp Ser Ile Val Glu Phe Ser Ser Asn Leu Gln Asn Met 
                          485                 490                 495     
          Asn Ile Asp Ile Ser Ala Phe Ser Cys Ile Ala Ala Leu Ala Met Val 
                      500                 505                 510         
          Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu Glu Leu Gln 
                  515                 520                 525             
          Asn Lys Ile Val Asn Cys Leu Lys Asp His Val Thr Phe Asn Asn Gly 
              530                 535                 540                 
          Gly Leu Asn Arg Pro Asn Tyr Leu Ser Lys Leu Leu Gly Lys Leu Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Leu Arg Thr Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu 
                          565                 570                 575     
          Lys Leu Glu Asp Leu Val Pro Pro Pro Ala Ile Ile Asp Lys Leu Phe 
                      580                 585                 590         
          Leu Asp Thr Leu Pro Phe 
                  595             
          <![CDATA[<210>  44]]>
          <![CDATA[<211>  535]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
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          <![CDATA[<223>  NR4A2同種型2]]>
          <![CDATA[<400>  44]]>
          Met Asp Asn Tyr Ser Thr Gly Tyr Asp Val Lys Pro Pro Cys Leu Tyr 
          1               5                   10                  15      
          Gln Met Pro Leu Ser Gly Gln Gln Ser Ser Ile Lys Val Glu Asp Ile 
                      20                  25                  30          
          Gln Met His Asn Tyr Gln Gln His Ser His Leu Pro Pro Gln Ser Glu 
                  35                  40                  45              
          Glu Met Met Pro His Ser Gly Ser Val Tyr Tyr Lys Pro Ser Ser Pro 
              50                  55                  60                  
          Pro Thr Pro Thr Thr Pro Gly Phe Gln Val Gln His Ser Pro Met Trp 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Asp Pro Gly Ser Leu His Asn Phe His Gln Asn Tyr Val Ala Thr 
                          85                  90                  95      
          Thr His Met Ile Glu Gln Arg Lys Thr Pro Val Ser Arg Leu Ser Leu 
                      100                 105                 110         
          Phe Ser Phe Lys Gln Ser Pro Pro Gly Thr Pro Val Ser Ser Cys Gln 
                  115                 120                 125             
          Met Arg Phe Asp Gly Pro Leu His Val Pro Met Asn Pro Glu Pro Ala 
              130                 135                 140                 
          Gly Ser His His Val Val Asp Gly Gln Thr Phe Ala Val Pro Asn Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Ile Arg Lys Pro Ala Ser Met Gly Phe Pro Gly Leu Gln Ile Gly His 
                          165                 170                 175     
          Ala Ser Gln Leu Leu Asp Thr Gln Val Pro Ser Pro Pro Ser Arg Gly 
                      180                 185                 190         
          Ser Pro Ser Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala 
                  195                 200                 205             
          Cys Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe 
              210                 215                 220                 
          Lys Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys 
          225                 230                 235                 240 
          Asn Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg 
                          245                 250                 255     
          Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr 
                      260                 265                 270         
          Asp Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser 
                  275                 280                 285             
          Pro Gln Glu Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Val Ser Leu Ile Ser Ala 
              290                 295                 300                 
          Leu Val Arg Ala His Val Asp Ser Asn Pro Ala Met Thr Ser Leu Asp 
          305                 310                 315                 320 
          Tyr Ser Arg Phe Gln Ala Asn Pro Asp Tyr Gln Met Ser Gly Asp Asp 
                          325                 330                 335     
          Thr Gln His Ile Gln Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Thr Gly Ser Met Glu 
                      340                 345                 350         
          Ile Ile Arg Gly Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Asp Leu Pro 
                  355                 360                 365             
          Lys Ala Asp Gln Asp Leu Leu Phe Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe 
              370                 375                 380                 
          Val Leu Arg Leu Ala Tyr Arg Ser Asn Pro Val Glu Gly Lys Leu Ile 
          385                 390                 395                 400 
          Phe Cys Asn Gly Val Val Leu His Arg Leu Gln Cys Val Arg Gly Phe 
                          405                 410                 415     
          Gly Glu Trp Ile Asp Ser Ile Val Glu Phe Ser Ser Asn Leu Gln Asn 
                      420                 425                 430         
          Met Asn Ile Asp Ile Ser Ala Phe Ser Cys Ile Ala Ala Leu Ala Met 
                  435                 440                 445             
          Val Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu Glu Leu 
              450                 455                 460                 
          Gln Asn Lys Ile Val Asn Cys Leu Lys Asp His Val Thr Phe Asn Asn 
          465                 470                 475                 480 
          Gly Gly Leu Asn Arg Pro Asn Tyr Leu Ser Lys Leu Leu Gly Lys Leu 
                          485                 490                 495     
          Pro Glu Leu Arg Thr Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr 
                      500                 505                 510         
          Leu Lys Leu Glu Asp Leu Val Pro Pro Pro Ala Ile Ile Asp Lys Leu 
                  515                 520                 525             
          Phe Leu Asp Thr Leu Pro Phe 
              530                 535 
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          Met Pro Cys Ile Gln Ala Gln Tyr Gly Thr Pro Ala Pro Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Pro Arg Asp His Leu Ala Ser Asp Pro Leu Thr Pro Glu Phe Ile Lys 
                      20                  25                  30          
          Pro Thr Met Asp Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr 
                  35                  40                  45              
          Ala Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Met Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Phe 
              50                  55                  60                  
          Asp Thr Phe Leu Tyr Gln Leu Pro Gly Thr Val Gln Pro Cys Ser Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ala Ser Phe Lys Phe Glu Asp Phe Gln Val Tyr Gly Cys Tyr 
                      100                 105                 110         
          Pro Gly Pro Leu Ser Gly Pro Val Asp Glu Ala Leu Ser Ser Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Asp Tyr Tyr Gly Ser Pro Cys Ser Ala Pro Ser Pro Ser Thr Pro 
              130                 135                 140                 
          Ser Phe Gln Pro Pro Gln Leu Ser Pro Trp Asp Gly Ser Phe Gly His 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Ser Pro Ser Gln Thr Tyr Glu Gly Leu Arg Ala Trp Thr Glu Gln 
                          165                 170                 175     
          Leu Pro Lys Ala Ser Gly Pro Pro Gln Pro Pro Ala Phe Phe Ser Phe 
                      180                 185                 190         
          Ser Pro Pro Thr Gly Pro Ser Pro Ser Leu Ala Gln Ser Pro Leu Lys 
                  195                 200                 205             
          Leu Phe Pro Ser Gln Ala Thr His Gln Leu Gly Glu Gly Glu Ser Tyr 
              210                 215                 220                 
          Ser Met Pro Thr Ala Phe Pro Gly Leu Ala Pro Thr Ser Pro His Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Gly Ser Gly Ile Leu Asp Thr Pro Val Thr Ser Thr Lys Ala Arg 
                          245                 250                 255     
          Ser Gly Ala Pro Gly Gly Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp 
                      260                 265                 270         
          Asn Ala Ser Cys Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys 
                  275                 280                 285             
          Gly Phe Phe Lys Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu 
              290                 295                 300                 
          Ala Asn Lys Asp Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln 
          305                 310                 315                 320 
          Phe Cys Arg Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val 
                          325                 330                 335     
          Val Arg Thr Asp Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys 
                      340                 345                 350         
          Pro Lys Gln Pro Pro Asp Ala Ser Pro Ala Asn Leu Leu Thr Ser Leu 
                  355                 360                 365             
          Val Arg Ala His Leu Asp Ser Gly Pro Ser Thr Ala Lys Leu Asp Tyr 
              370                 375                 380                 
          Ser Lys Phe Gln Glu Leu Val Leu Pro His Phe Gly Lys Glu Asp Ala 
          385                 390                 395                 400 
          Gly Asp Val Gln Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Ser Gly Ser Leu Glu Val 
                          405                 410                 415     
          Ile Arg Lys Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Glu Leu Ser Pro 
                      420                 425                 430         
          Ala Asp Gln Asp Leu Leu Leu Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Ile 
                  435                 440                 445             
          Leu Arg Leu Ala Tyr Arg Ser Lys Pro Gly Glu Gly Lys Leu Ile Phe 
              450                 455                 460                 
          Cys Ser Gly Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Ala Arg Gly Phe Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Asp Trp Ile Asp Ser Ile Leu Ala Phe Ser Arg Ser Leu His Ser Leu 
                          485                 490                 495     
          Leu Val Asp Val Pro Ala Phe Ala Cys Leu Ser Ala Leu Val Leu Ile 
                      500                 505                 510         
          Thr Asp Arg His Gly Leu Gln Glu Pro Arg Arg Val Glu Glu Leu Gln 
                  515                 520                 525             
          Asn Arg Ile Ala Ser Cys Leu Lys Glu His Val Ala Ala Val Ala Gly 
              530                 535                 540                 
          Glu Pro Gln Pro Ala Ser Cys Leu Ser Arg Leu Leu Gly Lys Leu Pro 
          545                 550                 555                 560 
          Glu Leu Arg Thr Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu 
                          565                 570                 575     
          Lys Leu Glu Asp Leu Val Pro Pro Pro Pro Ile Ile Asp Lys Ile Phe 
                      580                 585                 590         
          Met Asp Thr Leu Pro Phe 
                  595             
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          <![CDATA[<400>  46]]>
          Met Trp Leu Ala Lys Ala Cys Trp Ser Ile Gln Ser Glu Met Pro Cys 
          1               5                   10                  15      
          Ile Gln Ala Gln Tyr Gly Thr Pro Ala Pro Ser Pro Gly Pro Arg Asp 
                      20                  25                  30          
          His Leu Ala Ser Asp Pro Leu Thr Pro Glu Phe Ile Lys Pro Thr Met 
                  35                  40                  45              
          Asp Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr Ala Leu Pro 
              50                  55                  60                  
          Ser Phe Ser Thr Phe Met Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Phe Asp Thr Phe 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Tyr Gln Leu Pro Gly Thr Val Gln Pro Cys Ser Ser Ala Ser Ser 
                          85                  90                  95      
          Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Pro Ala Ser Ala 
                      100                 105                 110         
          Ser Phe Lys Phe Glu Asp Phe Gln Val Tyr Gly Cys Tyr Pro Gly Pro 
                  115                 120                 125             
          Leu Ser Gly Pro Val Asp Glu Ala Leu Ser Ser Ser Gly Ser Asp Tyr 
              130                 135                 140                 
          Tyr Gly Ser Pro Cys Ser Ala Pro Ser Pro Ser Thr Pro Ser Phe Gln 
          145                 150                 155                 160 
          Pro Pro Gln Leu Ser Pro Trp Asp Gly Ser Phe Gly His Phe Ser Pro 
                          165                 170                 175     
          Ser Gln Thr Tyr Glu Gly Leu Arg Ala Trp Thr Glu Gln Leu Pro Lys 
                      180                 185                 190         
          Ala Ser Gly Pro Pro Gln Pro Pro Ala Phe Phe Ser Phe Ser Pro Pro 
                  195                 200                 205             
          Thr Gly Pro Ser Pro Ser Leu Ala Gln Ser Pro Leu Lys Leu Phe Pro 
              210                 215                 220                 
          Ser Gln Ala Thr His Gln Leu Gly Glu Gly Glu Ser Tyr Ser Met Pro 
          225                 230                 235                 240 
          Thr Ala Phe Pro Gly Leu Ala Pro Thr Ser Pro His Leu Glu Gly Ser 
                          245                 250                 255     
          Gly Ile Leu Asp Thr Pro Val Thr Ser Thr Lys Ala Arg Ser Gly Ala 
                      260                 265                 270         
          Pro Gly Gly Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ser 
                  275                 280                 285             
          Cys Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe 
              290                 295                 300                 
          Lys Arg Thr Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu Ala Asn Lys 
          305                 310                 315                 320 
          Asp Cys Pro Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg 
                          325                 330                 335     
          Phe Gln Lys Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr 
                      340                 345                 350         
          Asp Ser Leu Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Gln 
                  355                 360                 365             
          Pro Pro Asp Ala Ser Pro Ala Asn Leu Leu Thr Ser Leu Val Arg Ala 
              370                 375                 380                 
          His Leu Asp Ser Gly Pro Ser Thr Ala Lys Leu Asp Tyr Ser Lys Phe 
          385                 390                 395                 400 
          Gln Glu Leu Val Leu Pro His Phe Gly Lys Glu Asp Ala Gly Asp Val 
                          405                 410                 415     
          Gln Gln Phe Tyr Asp Leu Leu Ser Gly Ser Leu Glu Val Ile Arg Lys 
                      420                 425                 430         
          Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Ala Glu Leu Ser Pro Ala Asp Gln 
                  435                 440                 445             
          Asp Leu Leu Leu Glu Ser Ala Phe Leu Glu Leu Phe Ile Leu Arg Leu 
              450                 455                 460                 
          Ala Tyr Arg Ser Lys Pro Gly Glu Gly Lys Leu Ile Phe Cys Ser Gly 
          465                 470                 475                 480 
          Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Ala Arg Gly Phe Gly Asp Trp Ile 
                          485                 490                 495     
          Asp Ser Ile Leu Ala Phe Ser Arg Ser Leu His Ser Leu Leu Val Asp 
                      500                 505                 510         
          Val Pro Ala Phe Ala Cys Leu Ser Ala Leu Val Leu Ile Thr Asp Arg 
                  515                 520                 525             
          His Gly Leu Gln Glu Pro Arg Arg Val Glu Glu Leu Gln Asn Arg Ile 
              530                 535                 540                 
          Ala Ser Cys Leu Lys Glu His Val Ala Ala Val Ala Gly Glu Pro Gln 
          545                 550                 555                 560 
          Pro Ala Ser Cys Leu Ser Arg Leu Leu Gly Lys Leu Pro Glu Leu Arg 
                          565                 570                 575     
          Thr Leu Cys Thr Gln Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu Lys Leu Glu 
                      580                 585                 590         
          Asp Leu Val Pro Pro Pro Pro Ile Ile Asp Lys Ile Phe Met Asp Thr 
                  595                 600                 605             
          Leu Pro Phe 
              610     
          <![CDATA[<210>  47]]>
          <![CDATA[<211>  325]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A1同種型3]]>
          <![CDATA[<400>  47]]>
          Met Pro Cys Ile Gln Ala Gln Tyr Gly Thr Pro Ala Pro Ser Pro Gly 
          1               5                   10                  15      
          Pro Arg Asp His Leu Ala Ser Asp Pro Leu Thr Pro Glu Phe Ile Lys 
                      20                  25                  30          
          Pro Thr Met Asp Leu Ala Ser Pro Glu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Thr 
                  35                  40                  45              
          Ala Leu Pro Ser Phe Ser Thr Phe Met Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Phe 
              50                  55                  60                  
          Asp Thr Phe Leu Tyr Gln Leu Pro Gly Thr Val Gln Pro Cys Ser Ser 
          65                  70                  75                  80  
          Ala Ser Ser Ser Ala Ser Ser Thr Ser Ser Ser Ser Ala Thr Ser Pro 
                          85                  90                  95      
          Ala Ser Ala Ser Phe Lys Phe Glu Asp Phe Gln Val Tyr Gly Cys Tyr 
                      100                 105                 110         
          Pro Gly Pro Leu Ser Gly Pro Val Asp Glu Ala Leu Ser Ser Ser Gly 
                  115                 120                 125             
          Ser Asp Tyr Tyr Gly Ser Pro Cys Ser Ala Pro Ser Pro Ser Thr Pro 
              130                 135                 140                 
          Ser Phe Gln Pro Pro Gln Leu Ser Pro Trp Asp Gly Ser Phe Gly His 
          145                 150                 155                 160 
          Phe Ser Pro Ser Gln Thr Tyr Glu Gly Leu Arg Ala Trp Thr Glu Gln 
                          165                 170                 175     
          Leu Pro Lys Ala Ser Gly Pro Pro Gln Pro Pro Ala Phe Phe Ser Phe 
                      180                 185                 190         
          Ser Pro Pro Thr Gly Pro Ser Pro Ser Leu Ala Gln Ser Pro Leu Lys 
                  195                 200                 205             
          Leu Phe Pro Ser Gln Ala Thr His Gln Leu Gly Glu Gly Glu Ser Tyr 
              210                 215                 220                 
          Ser Met Pro Thr Ala Phe Pro Gly Leu Ala Pro Thr Ser Pro His Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Glu Gly Ser Gly Ile Leu Asp Thr Pro Val Thr Ser Thr Lys Ala Arg 
                          245                 250                 255     
          Ser Gly Ala Pro Gly Gly Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp 
                      260                 265                 270         
          Asn Ala Ser Cys Gln His Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys 
                  275                 280                 285             
          Gly Phe Phe Lys Val Pro Arg Ser Pro Arg Trp Gly Leu Leu Leu Glu 
              290                 295                 300                 
          Met Glu Arg Gly Trp Pro His Pro Ile Gly Thr Cys Gly Leu Pro Leu 
          305                 310                 315                 320 
          Gly Ser Pro Pro Ser 
                          325 
          <![CDATA[<210>  48]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 1]]>
          <![CDATA[<400>  48]]>
          caauauagcc cuuccccucc                                                   20
          <![CDATA[<210>  49]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 2]]>
          <![CDATA[<400>  49]]>
          aacuggaacc uggaggggaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  50]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 3]]>
          <![CDATA[<400>  50]]>
          uaacuggaac cuggagggga                                                   20
          <![CDATA[<210>  51]]>
          <![CDATA[<400>  51]]>
          000
          <![CDATA[<210>  52]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 5]]>
          <![CDATA[<400>  52]]>
          ccgcugcauu ugguacacgc                                                   20
          <![CDATA[<210>  53]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 6]]>
          <![CDATA[<400>  53]]>
          ugcggcgcag acauacagcu                                                   20
          <![CDATA[<210>  54]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 7]]>
          <![CDATA[<400>  54]]>
          gcagcggccc uugaucaaag                                                   20
          <![CDATA[<210>  55]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 8]]>
          <![CDATA[<400>  55]]>
          auacagcucg gaauacacca                                                   20
          <![CDATA[<210>  56]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 9]]>
          <![CDATA[<400>  56]]>
          ccugcgugua ccaaaugcag                                                   20
          <![CDATA[<210>  57]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 10]]>
          <![CDATA[<400>  57]]>
          gcggcccuug aucaaagugg                                                   20
          <![CDATA[<210>  58]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 11]]>
          <![CDATA[<400>  58]]>
          ggacugcuug aaguacaugg                                                   20
          <![CDATA[<210>  59]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Seq]]>uence)
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 12]]>
          <![CDATA[<400>  59]]>
          cggguggcuc ucaagcgcgg                                                   20
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          gacgacgagc uccugcuggg                                                   20
          <![CDATA[<210>  61]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  61]]>
          gucgggguuc augaucuccg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          gagggcuuga aguggaagag                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  63]]>
          gaugaaggcg guccccacgg                                                   20
          <![CDATA[<210>  64]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  64]]>
          gaagguacug augcugggca                                                   20
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          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  65]]>
          uccuccagcc uccagcccgg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  66]]>
          agcaucagua ccuucgugga                                                   20
          <![CDATA[<210>  67]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  67]]>
          cgacuacacc aagcugacca                                                   20
          <![CDATA[<210>  68]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  68]]>
          uggucagcuu gguguagucg                                                   20
          <![CDATA[<210>  69]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 22]]>
          <![CDATA[<400>  69]]>
          gcuggacccg ccgaugaagg                                                   20
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          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  70]]>
          uugaaguaca uggaggugcu                                                   20
          <![CDATA[<210>  71]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 24]]>
          <![CDATA[<400>  71]]>
          guacgggugg cucucaagcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  72]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  72]]>
          ccgcauaacu ggaaccugga                                                   20
          <![CDATA[<210>  73]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 26]]>
          <![CDATA[<400>  73]]>
          gggcacgugu gccgugugcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  74]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  74]]>
          uacggcgugc gaaccugcga                                                   20
          <![CDATA[<210>  75]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  75]]>
          uggggacugc uugaaguaca                                                   20
          <![CDATA[<210>  76]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 29]]>
          <![CDATA[<400>  76]]>
          ccuuggcagc acugagauca                                                   20
          <![CDATA[<210>  77]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 30]]>
          <![CDATA[<400>  77]]>
          ccuugaucaa aguggaggag                                                   20
          <![CDATA[<210>  78]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  78]]>
          ugcauuuggu acacgcagga                                                   20
          <![CDATA[<210>  79]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  79]]>
          ugaucaaagu ggaggagggg                                                   20
          <![CDATA[<210>  80]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
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          <![CDATA[<400>  80]]>
          guggggaccg ccuucaucgg                                                   20
          <![CDATA[<210>  81]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  81]]>
          aggagcucgu cgucuggcga                                                   20
          <![CDATA[<210>  82]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 35]]>
          <![CDATA[<400>  82]]>
          ccaccucggc uacgacccga                                                   20
          <![CDATA[<210>  83]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  83]]>
          gcggcggcga gggcuugaag                                                   20
          <![CDATA[<210>  84]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  84]]>
          cagcaucagu accuucgugg                                                   20
          <![CDATA[<210>  85]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 38]]>
          <![CDATA[<400>  85]]>
          gccgaugaag gcggucccca                                                   20
          <![CDATA[<210>  86]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 39]]>
          <![CDATA[<400>  86]]>
          ccgucggguc guagccgagg                                                   20
          <![CDATA[<210>  87]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 40]]>
          <![CDATA[<400>  87]]>
          cuacggcgug cgaaccugcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  88]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 41]]>
          <![CDATA[<400>  88]]>
          ccauaacgcc cccgccugcg                                                   20
          <![CDATA[<210>  89]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 42]]>
          <![CDATA[<400>  89]]>
          auaacgcccc cgccugcggg                                                   20
          <![CDATA[<210>  90]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  90]]>
          gccgcauaac uggaaccugg                                                   20
          <![CDATA[<210>  91]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 44]]>
          <![CDATA[<400>  91]]>
          gaaaucgaca guacugacau                                                   20
          <![CDATA[<210>  92]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 45]]>
          <![CDATA[<400>  92]]>
          uuucagaagu gucucagugu                                                   20
          <![CDATA[<210>  93]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 46]]>
          <![CDATA[<400>  93]]>
          gaagugucuc aguguuggaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  94]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  94]]>
          aguguuggaa ugguaaaaga                                                   20
          <![CDATA[<210>  95]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 48]]>
          <![CDATA[<400>  95]]>
          guacagauag ucugaaaggg                                                   20
          <![CDATA[<210>  96]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 49]]>
          <![CDATA[<400>  96]]>
          guguugaguc uguuaaagcu                                                   20
          <![CDATA[<210>  97]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
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          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  97]]>
          gauagucuga aagggaggag                                                   20
          <![CDATA[<210>  98]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 sgRNA 51]]>
          <![CDATA[<400>  98]]>
          agucuguuaa agcucggaca                                                   20
          <![CDATA[<210>  99]]>
          <![CDATA[<211>  20]]>
          <![CDATA[<212>  RNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
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          <![CDATA[<400>  99]]>
          guccguacag auagucugaa                                                   20
          <![CDATA[<210>  100]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
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          <![CDATA[<223>  NBRE]]>
          <![CDATA[<400>  100]]>
          aaaaggtca                                                                9
          <![CDATA[<210>  101]]>
          <![CDATA[<400>  101]]>
          000
          <![CDATA[<210>  102]]>
          <![CDATA[<400>  102]]>
          000
          <![CDATA[<210>  103]]>
          <![CDATA[<400>  103]]>
          000
          <![CDATA[<210>  104]]>
          <![CDATA[<400>  104]]>
          000
          <![CDATA[<210>  105]]>
          <![CDATA[<400>  105]]>
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          <![CDATA[<210>  106]]>
          <![CDATA[<211>  92]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A1 DBD #1]]>
          <![CDATA[<400>  106]]>
          Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ser Cys Gln His 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu Ala Asn Lys Asp Cys Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg Phe Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys 
                          85                  90          
          <![CDATA[<210>  107]]>
          <![CDATA[<211>  93]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A1 DBD #2]]>
          <![CDATA[<400>  107]]>
          Ser Glu Gly Arg Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ser Cys Gln His 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Ile Cys Leu Ala Asn Lys Asp Cys Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Phe Cys Arg Phe Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Gln 
                          85                  90              
          <![CDATA[<210>  108]]>
          <![CDATA[<211>  92]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A2 DBD #1]]>
          <![CDATA[<400>  108]]>
          Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys 
                          85                  90          
          <![CDATA[<210>  109]]>
          <![CDATA[<211>  93]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A2 DBD #2]]>
          <![CDATA[<400>  109]]>
          Asn Glu Gly Leu Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Cys Leu Ala Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser 
                          85                  90              
          <![CDATA[<210>  110]]>
          <![CDATA[<211>  92]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 DBD #1]]>
          <![CDATA[<400>  110]]>
          Gly Glu Gly Thr Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Cys Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys 
                          85                  90          
          <![CDATA[<210>  111]]>
          <![CDATA[<211>  93]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A3 DBD #2]]>
          <![CDATA[<400>  111]]>
          Gly Glu Gly Thr Cys Ala Val Cys Gly Asp Asn Ala Ala Cys Gln His 
          1               5                   10                  15      
          Tyr Gly Val Arg Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Lys Arg Thr 
                      20                  25                  30          
          Val Gln Lys Asn Ala Lys Tyr Val Cys Leu Ala Asn Lys Asn Cys Pro 
                  35                  40                  45              
          Val Asp Lys Arg Arg Arg Asn Arg Cys Gln Tyr Cys Arg Phe Gln Lys 
              50                  55                  60                  
          Cys Leu Ser Val Gly Met Val Lys Glu Val Val Arg Thr Asp Ser Leu 
          65                  70                  75                  80  
          Lys Gly Arg Arg Gly Arg Leu Pro Ser Lys Pro Lys Ser 
                          85                  90              
          <![CDATA[<210>  112]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  具有NBRE結合TAL之DBD]]>
          <![CDATA[<400>  112]]>
          Met Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn His Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala 
                      20                  25                  30          
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln 
              50                  55                  60                  
          Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys 
                          85                  90                  95      
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 
                      100                 105                 110         
          Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 
                          165                 170                 175     
          Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
                      180                 185                 190         
          Pro Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile 
                  195                 200                 205             
          Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Pro Val Cys Gln Ala His Gly 
          225                 230         
          <![CDATA[<210>  113]]>
          <![CDATA[<211>  232]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  具有NurRE結合TAL之DBD #1]]>
          <![CDATA[<400>  113]]>
          Met Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn His Gly Gly 
          1               5                   10                  15      
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala 
                      20                  25                  30          
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly 
                  35                  40                  45              
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln 
              50                  55                  60                  
          Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys 
                          85                  90                  95      
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 
                      100                 105                 110         
          Ile Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
                  115                 120                 125             
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
              130                 135                 140                 
          Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
          145                 150                 155                 160 
          Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 
                          165                 170                 175     
          Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
                      180                 185                 190         
          Pro Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile 
                  195                 200                 205             
          Ala Ser Asn Gly Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu 
              210                 215                 220                 
          Leu Pro Val Cys Gln Ala His Gly 
          225                 230         
          <![CDATA[<210>  114]]>
          <![CDATA[<211>  231]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  具有NurRE結合TA]]>L之DBD #2
          <![CDATA[<400>  114]]>
          Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly Lys 
          1               5                   10                  15      
          Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala His 
                      20                  25                  30          
          Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly Gly 
                  35                  40                  45              
          Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln Ala 
              50                  55                  60                  
          His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Ile Gly 
          65                  70                  75                  80  
          Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys Gln 
                          85                  90                  95      
          Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn Gly 
                      100                 105                 110         
          Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val Cys 
                  115                 120                 125             
          Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser Asn 
              130                 135                 140                 
          His Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro Val 
          145                 150                 155                 160 
          Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala Ser 
                          165                 170                 175     
          His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu Pro 
                      180                 185                 190         
          Val Cys Gln Ala His Gly Leu Thr Pro Glu Gln Val Val Ala Ile Ala 
                  195                 200                 205             
          Ser His Asp Gly Gly Lys Gln Ala Leu Glu Thr Val Gln Arg Leu Leu 
              210                 215                 220                 
          Pro Val Cys Gln Ala His Gly 
          225                 230     
          <![CDATA[<210>  115]]>
          <![CDATA[<211>  9]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ZFP結合序列#1]]>
          <![CDATA[<400>  115]]>
          aaaggtcaa                                                                9
          <![CDATA[<210>  116]]>
          <![CDATA[<400>  116]]>
          000
          <![CDATA[<210>  117]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223]]>>  ZFP結合序列#3]]&gt;
          <br/>
          <br/>&lt;![CDATA[&lt;400&gt;  117]]&gt;
          <br/><![CDATA[gatatt                                                                   6
          <![CDATA[<210>  118]]>
          <![CDATA[<211>  6]]>
          <![CDATA[<212>  DNA]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  ZFP結合序列#4]]>
          <![CDATA[<400>  118]]>
          gccaat                                                                   6
          <![CDATA[<210>  119]]>
          <![CDATA[<211>  92]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  具有ZFP之DBD #1]]>
          <![CDATA[<400>  119]]>
          Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          Phe Ser Gln Ser Gly Asn Leu Thr Glu His Gln Arg Thr His Thr Gly 
                      20                  25                  30          
          Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly His Leu Val Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly Glu Lys Pro Tyr 
              50                  55                  60                  
          Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Gln Arg Ala Asn Leu Arg 
          65                  70                  75                  80  
          Ala His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser 
                          85                  90          
          <![CDATA[<210>  120]]>
          <![CDATA[<211>  64]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  具有ZFP之DBD #2]]>
          <![CDATA[<400>  120]]>
          Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          Phe Ser His Lys Asn Ala Leu Gln Asn His Gln Arg Thr His Thr Gly 
                      20                  25                  30          
          Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Ser 
                  35                  40                  45              
          Gly Asn Leu Val Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser 
              50                  55                  60                  
          <![CDATA[<210>  121]]>
          <![CDATA[<211>  64]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  具有ZFP之DBD #3]]>
          <![CDATA[<400>  121]]>
          Leu Glu Pro Gly Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser 
          1               5                   10                  15      
          Phe Ser Asp Cys Arg Asp Leu Ala Arg His Gln Arg Thr His Thr Gly 
                      20                  25                  30          
          Glu Lys Pro Tyr Lys Cys Pro Glu Cys Gly Lys Ser Phe Ser Thr Thr 
                  35                  40                  45              
          Gly Asn Leu Thr Val His Gln Arg Thr His Thr Gly Lys Lys Thr Ser 
              50                  55                  60                  
          <![CDATA[<210>  122]]>
          <![CDATA[<211>  246]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A LBD #1]]>
          <![CDATA[<400>  122]]>
          Pro Leu Gln Gln Glu Pro Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ile 
          1               5                   10                  15      
          Cys Met Met Asn Ala Leu Val Arg Ala Leu Thr Asp Ser Thr Pro Arg 
                      20                  25                  30          
          Asp Leu Asp Tyr Ser Arg Tyr Cys Pro Thr Asp Gln Ala Ala Ala Gly 
                  35                  40                  45              
          Thr Asp Ala Glu His Val Gln Gln Phe Tyr Asn Leu Leu Thr Ala Ser 
              50                  55                  60                  
          Ile Asp Val Ser Arg Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Thr Asp 
          65                  70                  75                  80  
          Leu Pro Lys Glu Asp Gln Thr Leu Leu Ile Glu Ser Ala Phe Leu Glu 
                          85                  90                  95      
          Leu Phe Val Leu Arg Leu Ser Ile Arg Ser Asn Thr Ala Glu Asp Lys 
                      100                 105                 110         
          Phe Val Phe Cys Asn Gly Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Leu Arg 
                  115                 120                 125             
          Gly Phe Gly Glu Trp Leu Asp Ser Ile Lys Asp Phe Ser Leu Asn Leu 
              130                 135                 140                 
          Gln Ser Leu Asn Leu Asp Ile Gln Ala Leu Ala Cys Leu Ser Ala Leu 
          145                 150                 155                 160 
          Ser Met Ile Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val Glu 
                          165                 170                 175     
          Glu Leu Cys Asn Lys Ile Thr Ser Ser Leu Lys Asp His Gln Ser Lys 
                      180                 185                 190         
          Gly Gln Ala Leu Glu Pro Thr Glu Ser Lys Val Leu Gly Ala Leu Val 
                  195                 200                 205             
          Glu Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr Leu 
              210                 215                 220                 
          Lys Leu Glu Asp Leu Val Ser Pro Pro Ser Ile Ile Asp Lys Leu Phe 
          225                 230                 235                 240 
          Leu Asp Thr Leu Pro Phe 
                          245     
          <![CDATA[<210>  123]]>
          <![CDATA[<211>  247]]>
          <![CDATA[<212>  PRT]]>
          <![CDATA[<213>  人工序列(Artificial Sequence)]]>
          <![CDATA[<220>]]>
          <![CDATA[<223>  NR4A LBD #2]]>
          <![CDATA[<400>  123]]>
          Ser Pro Leu Gln Gln Glu Pro Ser Gln Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro 
          1               5                   10                  15      
          Ile Cys Met Met Asn Ala Leu Val Arg Ala Leu Thr Asp Ser Thr Pro 
                      20                  25                  30          
          Arg Asp Leu Asp Tyr Ser Arg Tyr Cys Pro Thr Asp Gln Ala Ala Ala 
                  35                  40                  45              
          Gly Thr Asp Ala Glu His Val Gln Gln Phe Tyr Asn Leu Leu Thr Ala 
              50                  55                  60                  
          Ser Ile Asp Val Ser Arg Ser Trp Ala Glu Lys Ile Pro Gly Phe Thr 
          65                  70                  75                  80  
          Asp Leu Pro Lys Glu Asp Gln Thr Leu Leu Ile Glu Ser Ala Phe Leu 
                          85                  90                  95      
          Glu Leu Phe Val Leu Arg Leu Ser Ile Arg Ser Asn Thr Ala Glu Asp 
                      100                 105                 110         
          Lys Phe Val Phe Cys Asn Gly Leu Val Leu His Arg Leu Gln Cys Leu 
                  115                 120                 125             
          Arg Gly Phe Gly Glu Trp Leu Asp Ser Ile Lys Asp Phe Ser Leu Asn 
              130                 135                 140                 
          Leu Gln Ser Leu Asn Leu Asp Ile Gln Ala Leu Ala Cys Leu Ser Ala 
          145                 150                 155                 160 
          Leu Ser Met Ile Thr Glu Arg His Gly Leu Lys Glu Pro Lys Arg Val 
                          165                 170                 175     
          Glu Glu Leu Cys Asn Lys Ile Thr Ser Ser Leu Lys Asp His Gln Ser 
                      180                 185                 190         
          Lys Gly Gln Ala Leu Glu Pro Thr Glu Ser Lys Val Leu Gly Ala Leu 
                  195                 200                 205             
          Val Glu Leu Arg Lys Ile Cys Thr Leu Gly Leu Gln Arg Ile Phe Tyr 
              210                 215                 220                 
          Leu Lys Leu Glu Asp Leu Val Ser Pro Pro Ser Ile Ile Asp Lys Leu 
          225                 230                 235                 240 
          Phe Leu Asp Thr Leu Pro Phe 
                          245

Claims

一種細胞組合物，其包含經修飾免疫細胞之群體，該等經修飾免疫細胞表現(i)降低的表現水準之選自由以下組成之群之 核受體亞家族 4 組 A基因及/或蛋白：NR4A成員1 (NR4A1)基因及/或蛋白、NR4A成員2 (NR4A2)基因及/或蛋白、及NR4A成員3 (NR4A3)基因及/或蛋白，及(ii)增加的表現水準之c-Jun蛋白。
如請求項1之細胞組合物，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。
如請求項1之細胞組合物，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。
如請求項1之細胞組合物，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。
如請求項1之細胞組合物，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。
如請求項1之細胞組合物，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。
如請求項1之細胞組合物，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。
如請求項1之細胞組合物，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白、 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白及 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。
如請求項1至8中任一項之細胞組合物，其中與參考細胞組合物(例如其中該等細胞未經修飾以表現較低水準之該 NR4A基因及/或NR4A蛋白的相應細胞組合物)相比，該經修飾免疫細胞之群體中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白之該表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。
如請求項1至9中任一項之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞包含淋巴球、嗜中性球、單核球、巨噬細胞、樹突細胞及其任一組合。
如請求項10之細胞組合物，其中該等淋巴球包含T細胞、腫瘤浸潤淋巴球(TIL)、淋巴介質活化殺手細胞、自然殺手(NK)細胞及其任一組合。
如請求項11之細胞組合物，其中該等淋巴球係T細胞。
如請求項12之細胞組合物，其中該等T細胞包含嵌合抗原受體(CAR)及/或T細胞受體(TCR)，例如經改造之TCR。
如請求項13之細胞組合物，其中該CAR及/或該TCR特異性結合至腫瘤抗原。
如請求項13或14之細胞組合物，其中該CAR及/或該TCR特異性結合至CD19、TRAC、TCRβ、BCMA、CLL-1、CS1、CD38、CD19、TSHR、CD123、CD22、CD30、CD70、CD171、CD33、EGFRvIII、GD2、GD3、Tn Ag、PSMA、ROR1、ROR2、GPC1、GPC2、FLT3、FAP、TAG72、CD44v6、CEA、EPCAM、B7H3、KIT、IL-13Ra2、間皮素、IL-1 1Ra、PSCA、PRSS21、VEGFR2、LewisY、CD24、PDGFR-β、SSEA-4、CD20、葉酸受體α、ERBB2 (Her2/neu)、MUC1、MUC16、EGFR、NCAM、前列腺酶(Prostase)、PAP、ELF2M、Ephrin B2、IGF-I受體、CAIX、LMP2、gplOO、bcr-abl、酪胺酸酶、EphA2、岩藻糖基GM1、sLe、GM3、TGS5、HMWMAA、鄰-乙醯基-GD2、葉酸受體β、TEM1/CD248、TEM7R、CLDN6、GPRC5D、CXORF61、CD97、CD179a、ALK、多唾液酸、PLAC1、GloboH、NY-BR-1、UPK2、HAVCR1、ADRB3、PANX3、GPR20、LY6K、OR51E2、TARP、WT1、NY-ESO-1、LAGE-1a、MAGE-A1、天冬醯胺內肽酶、HPV E6,E7、MAGE A1、ETV6-AML、精子蛋白17、XAGE1、Tie 2、MAD-CT-1、MAD-CT-2、Fos相關抗原1、p53、p53突變體、前列腺癌相關蛋白(prostein)、生存素及端粒酶、PCTA-1/半乳糖凝集素8、MelanA/MART1、Ras突變體、hTERT、肉瘤易位斷裂點、ML-IAP、ERG (TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、雄激素受體、細胞週期蛋白B1、MYCN、RhoC、TRP-2、CYP1B1、BORIS、SART3、PAX5、OY-TES1、LCK、AKAP-4、SSX2、RAGE-1、人類端粒酶反轉錄酶、RU1、RU2、腸羧基酯酶、mut hsp70-2、CD79a、CD79b、CD72、LAIR1、FCAR、LILRA2、CD300LF、CLEC12A、BST2、EMR2、LY75、GPC3、FCRL5、IGLL1或其任何組合。
如請求項15之細胞組合物，其中該CAR及/或該TCR特異性結合至ROR1。
如請求項16之細胞組合物，其中該CAR包含衍生自R12、R11、2A2或其任一組合之抗原結合結構域。
如請求項16或17之細胞組合物，其中該CAR包含含有SEQ ID NO: 17之重鏈可變結構域及含有SEQ ID NO: 21之輕鏈可變結構域。
如請求項1至18中任一項之細胞組合物，其中該經修飾免疫細胞之群體具有少於約50%、少於約40%、少於約30%、少於約20%、少於約10%或少於約5%之效應T細胞。
如請求項1至19中任一項之細胞組合物，其中該經修飾免疫細胞之群體包含至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%或約100%之幼稚T (T _N)細胞、中央記憶T細胞(T _CM細胞)、幹細胞記憶T (T _SCM)細胞或其任一組合。
如請求項1至20中任一項之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞已用基因編輯工具修飾以減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現。
如請求項21之細胞組合物，其中該基因編輯工具能夠降低以下之水準：(i)該 NR4A1基因及/或蛋白，(ii)該 NR4A2基因及/或蛋白，(iii)該 NR4A3基因及/或蛋白，或(iv)其任一組合。
如請求項21或22之細胞組合物，其中該基因編輯工具包含shRNA、siRNA、miRNA、反義寡核苷酸、CRISPR、鋅指核酸酶、TALEN、大範圍核酸酶、限制性核酸內切酶或其任一組合。
如請求項23之細胞組合物，其中該基因編輯工具係CRISPR。
如請求項21至24中任一項之細胞組合物，其中該基因編輯工具包含引導RNA，該引導RNA包含以下中之任一者中所述之序列、由其組成或基本上由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。
如請求項1至25中任一項之細胞組合物，其中該c-Jun蛋白包含與SEQ ID NO: 6中所述之胺基酸序列具有至少約70%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之胺基酸序列。
如請求項1至26中任一項之細胞組合物，其中該c-Jun蛋白包含SEQ ID NO: 6中所述之該胺基酸序列。
如請求項1至27中任一項之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞已用編碼該c-Jun蛋白之核苷酸序列修飾，使得該等經修飾免疫細胞過表現該c-Jun蛋白。
如請求項1至28中任一項之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含： (a) 與如SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (b) 與如SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (c) 與如SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (d) 與如SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (e) 與如SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (f) 與如SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (g) 與如SEQ ID NO:14中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (h) 與如SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；或 (i) 與如SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 7中所述之該核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 8中所述之該核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 10中所述之該核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 11中所述之該核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 12中所述之該核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 13中所述之該核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 14中所述之該核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 15中所述之該核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項29之細胞組合物，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含與如SEQ ID NO: 16中所述之該核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%或至少約99%序列一致性之核酸序列。
如請求項1至38中任一項之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞已用能夠增加c-Jun之內源表現之轉錄活化劑修飾。
如請求項1至39中任一項之細胞組合物，其中與參考免疫細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，該經修飾免疫細胞之群體在個體中展現一或多種增強的性質。
如請求項40之細胞組合物，其中該經修飾免疫細胞之該一或多種增強的性質包括(i)增強的增殖，(ii)增強的細胞毒性，(iii)增強的細胞介素表現，(iv)增強的持久性或(v)其任一組合。
如請求項41之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞展現增強的細胞介素表現。
如請求項42之細胞組合物，其中該等細胞介素包含介白素-2 (IL-2)、干擾素-γ (IFN-γ)、腫瘤壞死因子-α (TNF-α)或其任一組合。
如請求項43之細胞組合物，其中IL-2之表現水準與參考免疫細胞群體中IL-2之表現水準相比增加至少約2倍至至少約10倍。
如請求項43或44之細胞組合物，其中IFN-γ之表現水準與參考免疫細胞群體中IFN-γ之表現水準相比增加至少約2倍至至少約10倍。
如請求項43至45中任一項之細胞組合物，其中TNF-α之表現水準與參考免疫細胞群體中TNF-α之表現水準相比增加至少約2倍至至少約10倍。
如請求項1至46中任一項之細胞組合物，其中與參考免疫細胞(例如未經修飾以具有增加的c-Jun表現及/或減少的 NR4A基因及/或NR4A蛋白表現之相應細胞)相比，該等經修飾免疫細胞展現減少的耗竭或功能障礙。
如請求項47之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞展現減少的細胞凋亡或不展現細胞凋亡(細胞凋亡抗性)。
如請求項47或48之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞表現減少的免疫檢查點標記物(為免疫檢查點抗性)。
如請求項1至49中任一項之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞在腫瘤微環境(TME)中維持抗腫瘤功能。
如請求項50之細胞組合物，其中該等經修飾免疫細胞展現(i)低氧環境中增強的活性，(ii)低營養環境(即葡萄糖)中增強的活性，(iii)抑制性代謝物/細胞介素(例如腺苷、TGF-β、ROS等)存在下增強的活性，(iv)在暴露於抑制性細胞(例如MDSC、Treg等)時增強的活性，或(v)其任一組合。
一種醫藥組合物，其包含如請求項1至51中任一項之細胞組合物及醫藥學上可接受之載劑。
一種治療有需要之個體之腫瘤的方法，其包括向該個體投與如請求項1至51中任一項之細胞組合物或如請求項52之醫藥組合物。
如請求項53之方法，其中與參考腫瘤體積(例如該投與前該個體之腫瘤體積及/或未接受該投與之個體之腫瘤體積)相比，該投與使該個體之腫瘤體積減小。
如請求項54之方法，其中與該參考腫瘤體積(例如該投與前該個體之腫瘤體積及/或未接受該投與之個體之腫瘤體積)相比，該腫瘤體積在該投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。
如請求項53至55中任一項之方法，其中與參考腫瘤重量(例如該投與前該個體之腫瘤重量及/或未接受該投與之個體之腫瘤重量)相比，該投與使該個體之腫瘤重量減小。
如請求項56之方法，其中與該參考腫瘤重量(例如該投與前該個體之腫瘤重量及/或未接受該投與之個體之腫瘤重量)相比，該腫瘤重量在該投與後減小至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。
如請求項53至57中任一項之方法，其中該投與增強該個體中該等免疫細胞之一或多種性質。
如請求項58之方法，其中該等免疫細胞之該等增強的性質包括(i)增強的增殖，(ii)增強的細胞毒性，(iii)增強的細胞介素表現，(iv)增強的持久性，或(v)其任一組合。
如請求項59之方法，其中該投與增強細胞介素表現。
如請求項60之方法，其中該細胞介素包含IL-2、IFN-γ、TNF-α或其任一組合。
如請求項53至61中任一項之方法，其中該投與減少或防止該等免疫細胞之耗竭或功能障礙。
如請求項62之方法，其中該等免疫細胞展現減少的細胞凋亡或不展現細胞凋亡(細胞凋亡抗性)。
如請求項62或63之方法，其中該等免疫細胞展現減少的免疫檢查點標記物或不展現免疫檢查點標記物(為免疫檢查點抗性)。
如請求項53至64中任一項之方法，其中該等免疫細胞在腫瘤微環境(TME)中維持抗腫瘤功能。
如請求項65之方法，其中該等免疫細胞展現(i)低氧環境中增強的活性，(ii)低營養環境(即葡萄糖)中增強的活性，(iii)抑制性代謝物/細胞介素抗性(腺苷、TGF-β、ROS等)存在下增強的活性，(iv)在暴露於抑制性細胞(MDSC、Treg等)時增強的活性，或其任一組合。
如請求項53至66中任一項之方法，其中該腫瘤衍生自癌症，包含乳癌、頭頸癌、子宮癌、腦癌、皮膚癌、腎癌(renal cancer)、肺癌、結腸直腸癌、前列腺癌、肝癌、膀胱癌、腎癌(kidney cancer)、胰臟癌、甲狀腺癌、食道癌、眼癌、胃(stomach/gastric)癌、胃腸癌、卵巢癌、子宮頸癌、癌瘤、肉瘤、白血病、淋巴瘤、骨髓瘤或其組合。
如請求項53至67中任一項之方法，其包括向該個體投與另一治療劑。
如請求項68之方法，其中該另一治療劑包括化學治療藥物、靶向抗癌療法、溶瘤藥物、細胞毒性劑、基於免疫之療法、細胞介素、手術程序、輻射程序、共刺激分子活化劑、免疫檢查點抑制劑、疫苗、細胞免疫療法或其任一組合。
如請求項69之方法，其中該另一治療劑係免疫檢查點抑制劑。
如請求項69或70之方法，其中該免疫檢查點抑制劑包括抗PD-1抗體、抗PD-L1抗體、抗LAG-3抗體、抗CTLA-4抗體、抗GITR抗體、抗TIM3抗體及其任一組合。
如請求項68至71中任一項之方法，其中該另一治療劑及該細胞組合物係同時投與。
如請求項68至71中任一項之方法，其中該另一治療劑及該細胞組合物係依序投與。
如請求項53至73中任一項之方法，其中該細胞組合物係以腸胃外、肌內、皮下、眼部、靜脈內、腹膜內、真皮內、眶內、大腦內、顱內、脊椎內、室內、鞘內、腦池內、囊內、腫瘤內或其任一組合投與。
一種製備如請求項1至51中任一項之細胞組合物之方法，其包括用基因編輯工具修飾免疫細胞，其中該基因編輯工具減少該等 NR4A基因及/或NR4A蛋白中任一者之表現，及修飾該等免疫細胞以過表現c-Jun。
如請求項75之方法，其中修飾該等免疫細胞以過表現c-Jun包括使該等免疫細胞與編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列接觸。
如請求項75或76之方法，其中修飾該等免疫細胞以過表現c-Jun包括使該等免疫細胞與能夠增加內源c-Jun蛋白之表現之轉錄活化劑接觸。
如請求項77之方法，其中該轉錄活化劑連接至已經修飾以缺乏核酸內切酶活性之Cas蛋白。
一種產生過表現c-Jun蛋白且具有降低的 NR4A基因及/或NR4A蛋白水準之細胞之方法，其包括用(i)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列及(ii)基因編輯工具修飾該細胞，其中該基因編輯工具包含引導RNA (gRNA)且能夠減少該 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現，且其中該gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。
一種減少或抑制表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞之耗竭的方法，其包括修飾該等細胞以降低 NR4A基因及/或蛋白之表現水準，及修飾該等細胞以過表現c-Jun蛋白。
如請求項80之方法，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A1基因及/或NR4A1蛋白。
如請求項80或81之方法，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A2基因及/或NR4A2蛋白。
如請求項80至82中任一項之方法，其中該 NR4A基因及/或NR4A蛋白包含 NR4A3基因及/或NR4A3蛋白。
如請求項80至83中任一項之方法，其中該 NR4A基因及/或蛋白之減少的表現減少或抑制該等細胞之耗竭。
如請求項79至84中任一項之方法，其中該等細胞係免疫細胞。
如請求項79至85中任一項之方法，其中與參考細胞組合物(例如其中該等細胞未經修飾以表現較低水準之該 NR4A基因及/或NR4A蛋白之相應細胞組合物)相比，該等細胞中該 NR4A基因及/或蛋白之表現水準降低至少約5%、至少約10%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%或至少約100%。
如請求項79至86中任一項之方法，其中修飾該等細胞包括使該細胞與能夠降低該細胞中該 NR4A基因及/或蛋白之表現水準的基因編輯工具接觸。
如請求項80至87中任一項之方法，其中修飾該等細胞以過表現c-Jun蛋白包括使該等免疫細胞與編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列接觸。
如請求項80至88中任一項之方法，其中修飾該等免疫細胞以過表現c-Jun包括使該等免疫細胞與能夠增加內源c-Jun蛋白之表現之轉錄活化劑接觸。
如請求項89之方法，其中該轉錄活化劑連接至已經修飾以缺乏核酸內切酶活性之Cas蛋白。
一種增加表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞因應抗原刺激之細胞介素產生之方法，其包括用以下修飾該等細胞：(i)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，使得該細胞在該修飾後過表現該c-Jun蛋白，及(ii)基因編輯工具，其中該基因編輯工具包含引導RNA (gRNA)且能夠減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現，且其中該gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。
如請求項91之方法，其中該細胞介素包含IFN-γ、IL-2、TNF-α或其組合。
如請求項91或92之方法，其中在該修飾後，與參考細胞(例如未用該c-Jun核苷酸序列及/或基因編輯工具修飾之相應細胞)相比，因應該抗原刺激之該細胞介素之產生增加至少約1倍、至少約2倍、至少約3倍、至少約4倍、至少約5倍、至少約6倍、至少約7倍、至少約8倍、至少約9倍、至少約10倍、至少約11倍、至少約12倍、至少約13倍、至少約14倍、至少約15倍、至少約16倍、至少約17倍、至少約18倍、至少約19倍、至少約20倍、至少約25倍、至少約30倍、至少約35倍、至少約40倍、至少約45倍或至少約50倍。
一種增加表現嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之細胞因應持續抗原刺激之效應功能之方法，其包括用以下修飾該等細胞：(i)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，使得該細胞在該修飾後過表現該c-Jun蛋白，及(ii)基因編輯工具，其中該基因編輯工具包含引導RNA (gRNA)且能夠減少 NR4A基因及/或NR4A蛋白之表現，且其中該gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、基本上由其組成或由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。
如請求項94之方法，其中在該修飾後，與參考細胞(例如未用該c-Jun核苷酸序列及/或基因編輯工具修飾之相應細胞)相比，該細胞在至少一輪、至少兩輪或至少三輪額外抗原刺激分析中保持該效應功能。
如請求項94或95之方法，其中該效應功能包括以下能力：(i)殺傷靶細胞(例如腫瘤細胞)，(ii)在進一步抗原刺激時產生細胞介素，或(iii) (i)及(ii)二者。
如請求項76至96中任一項之方法，其中編碼該c-Jun蛋白之該核苷酸序列包含： (a) 與如SEQ ID NO: 7中所述之核酸序列具有至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (b) 與如SEQ ID NO: 8中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (c) 與如SEQ ID NO: 10中所述之核酸序列具有至少約30%、至少約40%、至少約50%、至少約60%、至少約70%、至少約80%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (d) 與如SEQ ID NO: 11中所述之核酸序列具有至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (e) 與如SEQ ID NO: 12中所述之核酸序列具有至少88%、至少89%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (f) 與如SEQ ID NO: 13中所述之核酸序列具有至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (g) 與如SEQ ID NO: 14中所述之核酸序列具有至少90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列； (h) 與如SEQ ID NO: 15中所述之核酸序列具有至少55%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列；或 (i) 與如SEQ ID NO: 16中所述之核酸序列具有至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少約90%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或約100%序列一致性之核酸序列。
一種細胞組合物，其係藉由如請求項75至78中任一項之方法製備。
一種細胞組合物，其包含如下細胞：(a)表現配位體結合蛋白(例如CAR或TCR)，(b)具有增加的c-Jun蛋白水準，及(c)表現降低水準之(i) NR4A1基因及/或NR4A1蛋白，(ii) NR4A2基因及/或NR4A2蛋白，(iii) NR4A3基因及/或NR4A3蛋白，或(iv) (i)至(iii)之任一組合，其中該細胞已用gRNA修飾，該gRNA包含以下中之任一者中所述之序列、由其組成或基本上由其組成：SEQ ID NO: 25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO: 27、SEQ ID NO: 28、SEQ ID NO: 29、SEQ ID NO: 30、SEQ ID NO: 52、SEQ ID NO: 53、SEQ ID NO: 54、SEQ ID NO: 55、SEQ ID NO: 56、SEQ ID NO: 57、SEQ ID NO: 58、SEQ ID NO: 61、SEQ ID NO: 65、SEQ ID NO: 67、SEQ ID NO: 68、SEQ ID NO: 70、SEQ ID NO: 71、SEQ ID NO: 75、SEQ ID NO: 76、SEQ ID NO: 82、SEQ ID NO: 83、SEQ ID NO: 86、SEQ ID NO: 94及SEQ ID NO: 96。
如請求項99之細胞組合物，其中該等細胞包含活體內細胞。
如請求項99之細胞組合物，其中該等細胞包含離體細胞或活體外細胞。
一種醫藥組合物，其包含如請求項98至101中任一項之細胞組合物。
一種套組，其包含(i)減少 NR4A基因及/或蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之載體，(iii)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，及根據如請求項53至74中任一項之方法治療腫瘤之說明書。
一種套組，其包含(i)減少 NR4A基因及/或蛋白之表現之基因編輯工具，(ii)包含嵌合抗原受體(CAR)或T細胞受體(TCR)之載體，(iii)編碼c-Jun蛋白之核苷酸序列，及根據如請求項75至78中任一項之方法製備細胞組合物之說明書。
一種如請求項1至51及98至101中任一項之細胞組合物或如請求項52或102之醫藥組合物之用途，其用於製造治療有需要之個體之腫瘤的藥物，該治療包括投與該個體。
如請求項1至51及98至101中任一項之細胞組合物或如請求項52或102之醫藥組合物，其用於治療有需要之個體之腫瘤，該治療包括投與該個體。