KR20200130826A - 개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법 - Google Patents

개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20200130826A
KR20200130826A KR1020207026518A KR20207026518A KR20200130826A KR 20200130826 A KR20200130826 A KR 20200130826A KR 1020207026518 A KR1020207026518 A KR 1020207026518A KR 20207026518 A KR20207026518 A KR 20207026518A KR 20200130826 A KR20200130826 A KR 20200130826A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gene
immune effector
seq
group
nos
Prior art date
Application number
KR1020207026518A
Other languages
English (en)
Inventor
미카 벤슨
제이슨 머킨
그레고리 브이 크류코프
솔로몬 마틴 쉔커
마이클 슐라바흐
노아 튜보
Original Assignee
케이에스큐 세러퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 케이에스큐 세러퓨틱스 인코포레이티드 filed Critical 케이에스큐 세러퓨틱스 인코포레이티드
Publication of KR20200130826A publication Critical patent/KR20200130826A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4632—T-cell receptors [TCR]; antibody T-cell receptor constructs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464404—Epidermal growth factor receptors [EGFR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464403—Receptors for growth factors
    • A61K39/464406—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464452—Transcription factors, e.g. SOX or c-MYC
    • A61K39/464453—Wilms tumor 1 [WT1]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
    • A61K39/464488—NY-ESO
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464491—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464492—Glycoprotein 100 [Gp100]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4728—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/72—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for hormones
    • C07K14/723—G protein coupled receptor, e.g. TSHR-thyrotropin-receptor, LH/hCG receptor, FSH receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8121—Serpins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1077—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y204/00—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12Y204/02—Pentosyltransferases (2.4.2)
    • C12Y204/0201—Orotate phosphoribosyltransferase (2.4.2.10)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/11—Protein-serine/threonine kinases (2.7.11)
    • C12Y207/11001—Non-specific serine/threonine protein kinase (2.7.11.1), i.e. casein kinase or checkpoint kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04001—Phosphodiesterase I (3.1.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y401/00—Carbon-carbon lyases (4.1)
    • C12Y401/01—Carboxy-lyases (4.1.1)
    • C12Y401/01023—Orotidine-5'-phosphate decarboxylase (4.1.1.23)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/28—Expressing multiple CARs, TCRs or antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/29—Multispecific CARs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/38—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/48—Blood cells, e.g. leukemia or lymphoma
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/50—Colon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/57—Skin; melanoma
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/09—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a nuclear localisation signal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

본 개시내용은 치료 효능을 증가시키기 위한 면역 효과기 세포의 변형에 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시키도록, 또는 면역 세포의 효과기 기능을 향상시키기 위해서 내인성 단백질의 하나 이상의 기능을 감소시키도록 변형된 면역 효과기 세포가 제공된다. 일부 실시형태에서, 항원 특이성을 부여하는 트랜스젠, 예컨대, 외인성 T 세포 수용체(TCR) 또는 키메라 항원 수용체(CAR)의 도입에 의해서 추가로 변형된 면역 효과기 세포가 제공된다. 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포를 사용하여 세포 증식성 장애, 예컨대, 암을 치료하는 방법이 제공된다.

Description

개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법
관련 출원의 상호 참조
본 출원은 미국 가출원 제62/643,578(출원일: 2018년 3월 15일); 미국 가출원 제62/692,010호(출원일: 2018년 6월 29일); 미국 가출원 제62/768,428호(출원일: 2018년 11월 16일); 미국 가출원 제62/643,587호(출원일: 2018년 3월 15일); 미국 가출원 제62/692,019호(2018년 6월 29일); 미국 가출원 제62/768,443호(출원일: 2018년 11월 16일); 미국 가출원 제62/804,265호(출원일: 2019년 2월 12일); 미국 가출원 제62/643,597호(출원일: 2018년 3월 15일); 미국 가출원 제62/692,100호(출원일: 2018년 6월 29일); 미국 가출원 제62/768,448호(출원일: 2018년 11월 16일); 미국 가출원 제62/643,598호(출원일: 2018년 3월 15일); 미국 가출원 제62/692,110호(출원일: 2018년 6월 29일); 및 미국 가출원 제62/768,458호(출원일: 2018년 11월 16일)에 대한 우선권을 주장하며, 이들은 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
전자 제출된 텍스트 파일의 설명
첨부된 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 이의 전문이 참조에 의해 본 명세서에 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능한 포맷 카피(파일명: KSQT_007_04WO_SeqList_ST25.txt; 기록일: 2019년 3월 14일; 파일 크기 308킬로바이트).
기술분야
본 개시내용은 표적 핵산 서열을 편집하거나, 표적 핵산 서열의 발현을 조절하기 위한 방법, 조성물 및 성분, 및 세포 증식성 질환, 염증 질환 및/또는 감염성 질환의 치료에서, 수용체-조작된 면역 효과기 세포와 함께 사용하는 것을 포함하는, 면역요법과 함께 이를 응용하는 것에 관한 것이다.
유전자 변형된 T 세포, 특히 CAR-T 세포를 사용하는 입양 세포 전달(adoptive cell transfer)은 고형 악성종양 및 혈액 악성종양을 위한 치료제로서 임상 시험에 진입하였다. 현재까지의 결과는 혼합적이다. 혈액 악성종양(특히 림프종, CLL 및 ALL)에서, 몇몇 1상 및 2상 시험에서 대부분의 환자는 적어도 부분적인 반응을 나타내었고, 일부는 완전 반응을 나타낸다(Kochenderfer et al., 2012 Blood 1 19, 2709-2720). 2017년에, FDA는 혈액암의 치료를 위해서, 2개의 CAR-T 요법, Kymriah(상표명) 및 Yescarta(상표명)을 승인하였다. 그러나, 대부분의 종양 유형(흑색종, 신장 세포 암종 및 결장직장암 포함)에서, 더 낮은 반응이 관찰되었다(Johnson et al., 2009 Blood 1 14, 535-546; Lamers et al., 2013 Mol. Ther. 21, 904-912; Warren et al., 1998 Cancer Gene Ther. 5, S1-S2). 이와 같이, B 세포 계통의 혈액 악성종양을 표적으로 하는 CAR-T 세포 접근법에 성공이 크게 제한되었기 때문에 입양 T 세포 요법으로의 개선은 상당한 개선의 여지가 있다.
암 치료에서 변형된 면역 세포의 입양 전달의 효능을 개선시키고, 특히 고형 악성종양에 대한 입양 세포 요법의 효능을 증가시킬 필요성이 있는데, 그 이유는 이러한 종양 유형(흑색종, 신장 세포 암종 및 결장직장암; Yong, 2017, Imm Cell Biol., 95:356-363)에서 감소된 반응이 관찰되기 때문이다. 또한, 입양 전달의 이점이 관찰된 혈액 악성종양에서도, 입양 전달된 T 세포의 기능 감소로 인해서, 모든 환자가 반응하는 것은 아니며, 목적하는 빈도보다 더 높은 빈도로 재발이 일어난다.
암 치료제로서의 유전자 변형된 면역 세포의 효능을 제한하는 요소는 (1) 세포 증식, 예를 들어, 입양 전달 후 T 세포의 제한된 증식; (2) 세포 생존, 예를 들어, 종양 환경에서 인자에 의한 T 세포 아포토시스의 유도; 및 (3) 세포 기능, 예를 들어, 제조 과정 및/또는 전달 후 면역 세포의 소진 및 숙주 면역 세포 및 암 세포에 의해서 분비된 저해 인자에 의한 세포독성 T 세포 기능의 저해를 포함한다.
면역 세포의 항-종양 효과를 증가시킨다고 생각되는 특정 특징부는, 1) 입양 전달 후 숙주에서 증식하는 세포의 능력; 2) 종양을 침윤하는 세포의 능력; 3) 숙주에서 지속되고/되거나 면역 세포 소모에 대해서 저항성을 나타내는 세포의 능력; 및 4) 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 방식으로 기능하는 세포의 능력을 포함한다. 본 개시내용은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 면역 세포를 제공하며, 여기서 변형된 면역 세포는 증가된 증식, 종양 내로의 증가된 침윤, 대상체에서 면역 세포의 지속성 및/또는 면역 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 포함하는 하나 이상의 효과기 기능의 향상을 나타낸다. 본 개시내용은 또한 종양 세포에 대해서 향상된 면역 세포 활성도를 도출하기 위해서 면역 효과기 세포를 변형시키기 위한 방법 및 조성물뿐만 아니라 입양 면역 세포 전달 요법의 맥락에서 사용에 적합한 방법 및 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 ZC3H12A 핵산 또는 단백질(Regnase-1이라고도 공지됨)의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다. 본 개시내용은 CRISPR/Cas 시스템, 아연-핑거 시스템 및 siRNA/shRNA 시스템을 비롯한 다양한 양상에 의한 ZC3H12A의 저해를 기재하고, 입증한다. 일부 실시형태에서, ZC3H12A의 감소된 발현/기능은 항체, 소분자 또는 펩타이드에 의해서 매개된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 암성 세포를 ZC3H12A 단백질 저해제에 노출시키는 단계를 포함하는 암성 세포의 사멸 방법을 제공하며, 여기서 상기 저해제는 ZC3H12A에 결합하여, ZC3H12A 기능을 감소시키는 항체, 소분자 또는 펩타이드이고, 상기 저해제는 상기 암성 세포를 사멸시키는 데 효과적인 양으로 존재한다. 일부 실시형태에서, 노출은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 표적 유전자 중 2종 이상의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 내인성 표적 유전자 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A 및 BCOR의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A 및 TNFAIP3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 MAP4K1 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 MAP4K1 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 MAP4K1 및 BCOR의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 MAP4K1 및 TNFAPI3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 NR4A3 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 NR4A3 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 NR4A3 및 BCOR의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 NR4A3 및 TNFAPI3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 (i) 1종 이상의 핵산 분자; (ii) 1종 이상의 효소 단백질; 또는 (iii) 1종 이상의 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 효소 단백질을 포함하고, 효소 단백질은 내인성 유전자 중 하나 이상 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하도록 조작되어 있다. 일부 실시형태에서, 단백질은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하고, 핵산 분자는 가이드 RNA(gRNA) 분자이고, 효소 단백질은 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 분자 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, gRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 분자 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, gRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 분자 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 ZC3H12A이고, gRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 분자 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 MAP4K1이고, gRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 하나의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 분자 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 NR4A3이고, gRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 2개의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 gRNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 2개의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 gRNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 2개의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 gRNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 2개의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 gRNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 적어도 2개의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 gRNA 및 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 (a) Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크(break)를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질이거나; (b) Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제(nickase) 돌연변이체이거나; 또는 (c) Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(deactivated Cas protein: dCas)이고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MAX-interacting protein 1: MXI1), 크루펠-연관 박스(
Figure pct00001
-associated box: KRAB) 도메인, 메틸-CpG 결합 단백질 2(methyl-CpG binding protein 2: MECP2) 및 4개의 이어진(concatenated) mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 도입한다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 2종 이상의 내인성 유전자의 게놈 서열 내에 하나의 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 결실은 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 부분 또는 완전 결실이다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation)이다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 형질주입, 형질도입, 전기천공, 또는 마이크로유체 디바이스(microfluidics device)에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 면역 효과기 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 시스템의 1종 이상의 성분, 단백질 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (b) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택된 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 CBLB 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 ZC3H12A 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 ZC3H12A 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 ZC3H12A 및 TNFAIP3의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 MAP4K1이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 MAP4K1 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 MAP4K1 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 MAP4K1 및 TNFAIP3의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 NR4A3으로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 NR4A3 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 NR4A3 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 NR4A3 및 TNFAIP3의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (b) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택된 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 CBLB 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 ZC3H12A이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 ZC3H12A 및 CBLB 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 ZC3H12A 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 ZC3H12A 및 TNFAIP3 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 MAP4K1이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 MAP4K1 및 CBLB 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 MAP4K1 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 MAP4K1 및 TNFAIP3 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 적어도 1종의 표적 유전자는 NR4A3이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 NR4A3 및 CBLB 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 NR4A3 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기는 NR4A3 및 TNFAIP3 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 2종 이상의 내인성 유전자의 게놈 서열 내에 하나의 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 결실은 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 부분 또는 완전 결실이다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation)이다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킨다.
일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현은 비변형된 또는 대조군 면역 효과기 세포에 비해서 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 기능은 비변형된 또는 대조군 면역 효과기 세포에 비해서 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%만큼 감소된다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 세포 표면 상에서 제시되는 조작된 면역 수용체를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 항원-결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 조작된 TCR이다. 일부 실시형태에서, 조작된 면역 수용체는 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하고, 여기서 항원은 종양-연관 항원이다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 면역 활성화 분자를 발현하는 외인성 트랜스젠(exogenous transgene)을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 활성화 분자는 사이토카인, 케모카인, 공자극성 분자, 활성화 펩타이드, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 이의 결합 단편은 NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4 또는 PDCD1에 의해서 암호화된 단백질에 특이적으로 결합하고, 이의 기능을 저해한다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포이며, 여기서 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NKT 세포로부터 선택된 림프구이다. 일부 실시형태에서, 림프구는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)이다.
일부 실시형태에서, 효과기 기능은 세포 증식, 세포 생존, 종양 침윤, 세포독성, 항-종양 면역 반응 및/또는 소모에 대한 저항성으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 적어도 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 또는 1×1011개의 변형된 면역 효과기 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 조성물은 이를 필요로 하는 대상체로부터 유래된 자가유래 면역 효과기 세포를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조성물은 공여자 대상체로부터 유래된 동종이계 면역 효과기 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (b) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소; 또는 (iii) 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소; 또는 (iii) 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 세포에서 하나 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로부터 선택되거나, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되고, gRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로부터 선택되고, 상기 gRNA 분자는 서열번호 154 내지 498로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 154 내지 498로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되고, 여기서 gRNA 분자는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로부터 선택되고, gRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 ZC3H12A이고, gRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 MAP4K1을 포함하고, gRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 NR4A3을 포함하고, gRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로부터 선택되거나, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되고, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, 및 IKZF2로부터 선택되고, 여기서 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 154 내지 498로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되고, 여기서 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택되고, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 ZC3H12A이고, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 MAP4K1을 포함하고, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 NR4A3을 포함하고, siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며 여기서 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 (e) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (f) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소; 또는 (iii) 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 복수의 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 복수의 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하고, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 복수의 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하고, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 복수의 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하고, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 시스템은 복수의 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하고, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 Cas 단백질을 포함하고, 여기서 Cas 단백질은 (a) 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질이거나; (b) 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체이거나; (c) 비활성화된 Cas 단백질(dCas)이고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합된다. 일부 실시형태에서, 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MXI1), 크루펠-연관 박스(KRAB) 도메인 및 4개의 이어진 mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 Cas9 단백질이다.
일부 실시형태에서, 유전자 조절 시스템은 핵산 분자를 포함하고, 상기 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA이다. 일부 실시형태에서, 유전자 조절 시스템은 복수의 shRNA 또는 siRNA 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 shRNA 또는 siRNA 분자를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 shRNA 또는 siRNA 분자를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 shRNA 또는 siRNA 분자를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 유전자-조절 시스템은 복수의 shRNA 또는 siRNA 분자를 포함하고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 여기서 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함하고, 아연 핑거 뉴클레아제 및 전사-활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN)로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 복수의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538 또는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 복수의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538 또는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 1종 이상의 gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 1종 이상의 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하며, 여기서 1종 이상의 gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질은 복합체를 이루어 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 복수의 gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 포함하는 유전자-조절 시스템을 제공하며, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538 또는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 여기서 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 1종 이상의 gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질은 복합체를 이루어 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군; (b)ZC3H12A; (c)MAP4K1; (d)NR4A3; (e) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2; 또는 (f) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택된 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열에 결합하는 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하는 gRNA 핵산 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, (a) 내인성 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, gRNA는 표 6A 및 표 6B에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나; (b) 내인성 유전자는 ZC3H12A이고, gRNA는 표 6C 및 표 6D에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나; (c) 내인성 유전자는 MAP4K1이고, gRNA는 표 6E 및 표 6F에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나; (d) 내인성 유전자는 NR4A3이고, gRNA는 표 6G 및 표 6H에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나; (e) 내인성 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2 로 이루어진 군으로부터 선택되고, gRNA는 표 5A 및 표 5B에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나; 또는 (f) 내인성 유전자는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, gRNA는 표 5A 및 표 5B에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 PAM 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA는 모듈식(modular) gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, gRNA는 이중 gRNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자는 이의 5' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 이의 5' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형 및/또는 이의 3' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 이의 3' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 뉴클레아제에 대한 증가된 안정성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 감소된 선천 면역 반응을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 gRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자를 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 1종 이상의 gRNA 분자 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 1종 이상의 gRNA 분자 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 키트를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 대상체로부터 면역 효과기 세포를 얻는 단계; (b) 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계; 및 (c) 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 면역 효과기 세포에 비해서 감소되도록 면역 효과기 세포를 배양하는 단계를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 CAR 및 TCR로부터 선택된 조작된 면역 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템 및/또는 조작된 면역 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 형질주입, 형질도입, 전기천공, 또는 마이크로유체 디바이스에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 면역 효과기 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 단백질로서 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법을 제공하며, 이 방법은 (a) 면역 효과기 세포의 집단을 배양물에서 확장시키는 단계; 및 (b) 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포의 집단 내에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 방법은 면역 효과기 세포의 집단을 대상체로부터 얻는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 확장 전에, 확장 중에 또는 확장 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단의 확장은 제1 라운드의 확장 및 제2 라운드의 확장을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드의 확장 전에, 확장 중에 또는 확장 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제2 라운드의 확장 전에, 확장 중에 또는 확장 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 전에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드의 확장 후 그리고 제2 라운드의 확장 전에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공하며, 이 방법은 유효량의 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 또는 이들의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 세포 증식성 장애, 염증 장애 또는 감염성 질환이다. 일부 실시형태에서, 질환 또는 장애는 암 또는 바이러스 감염이다. 일부 실시형태에서, 암은 백혈병, 림프종 또는 고형 종양으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 고형 종양은 흑색종, 췌장 종양, 방광 종양, 폐 종양 또는 전이, 결장직장암 또는 두경부암이다. 일부 실시형태에서, 암은 PD1 저항성 또는 비민감성 암이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 PD1 저해제 또는 PDL1 저해제로 이전에 치료된 적이 있다. 일부 실시형태에서, 방법은 대상체에게 NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4 또는 PDCD1에 의해서 암호화된 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 기능을 저해하는 항체 또는 이의 결합 단편을 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 대상체에 대해서 자가유래이다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 대상체에 대해서 동종이계이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 변형된 면역 효과기 세포 또는 이들의 조성물의 투여 전에 림프구제거(lymphodepletion)를 겪지 않았다. 일부 실시형태에서, 대상체는 변형된 면역 효과기 세포 또는 이들의 조성물의 투여와 함께 또는 투여 후에 고용량 IL-2 치료를 제공받지 않는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 변형된 면역 효과기 세포 또는 이들의 조성물의 투여와 함께 또는 투여 후에 저용량 IL-2 치료를 제공받는다. 일부 실시형태에서, 대상체는 변형된 면역 효과기 세포 또는 이들의 조성물의 투여와 함께 또는 투여 후에 IL-2 치료를 제공받지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 암성 세포를 사멸시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 암성 세포에 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포에 또는 이들의 조성물을 노출시키는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 노출은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시키는 방법을 제공하며, 이 방법은 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계를 포함하며, 여기서 변형된 면역 효과기 세포는 변형되지 않은 면역 효과기 세포에 비해서 하나 이상의 향상된 효과기 기능을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 효과기 기능은 세포 증식, 세포 생존, 세포독성, 종양 침윤, 증가된 사이토카인 생산, 항-종양 면역 반응 및/또는 소모에 대한 저항성으로부터 선택된다.
도 1a 및 도 1b는 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 변형될 수 있는 내인성 표적 유전자의 조합을 도시한 도면.
도 2a 및 도 2b는 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 변형될 수 있는 내인성 표적 유전자의 조합을 도시한 도면.
도 3a 및 도 3b는 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 변형될 수 있는 내인성 표적 유전자의 조합을 도시한 도면.
도 4A 및 도 4D는 본 명세서에 기재된 방법을 사용한 TRAC 유전자 및 B2M 유전자의 편집을 도시한 도면.
도 5A 및 도 5B는 일차 인간 T 세포에서 CBLB의 편집을 위한 TIDE 분석 데이터를 도시한 도면.
도 6은 비편집된 대조군(D6551-WT)과 비교하여 CBLB gRNA로 편집된 일차 인간 T 세포(D6551-CBLB)에서 CBLB 단백질의 웨스턴 블롯을 도시한 도면.
도 7A 내지 도 7E는 뮤린 B16/Ova 동계(syngeneic) 종양 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면. 도 7A는 비편집된 OT1 T 세포와 비교하여 CBLB-편집된 OT1 T 세포로 처리된 마우스에서의 종양 성장을 도시한 도면. 도 7B 및 도 7C는 비편집된 OT1 T 세포와 비교하여 ZC3H12A-편집된 OT1 T 세포로 처리된 마우스에서의 종양 성장을 도시한 도면. 도 7D는 비편집된 OT1 T 세포와 비교하여 MAP4K1-편집된 OT1 T 세포로 처리된 마우스에서의 종양 성장을 도시한 도면. 도 7E는 비편집된 OT1 T 세포와 비교하여 NR4A3-편집된 OT1 T 세포로 처리된 마우스에서의 종양 성장을 도시한 도면.
도 8A 및 도 8B는 단일-편집된 T 세포로 그리고/또는 항-PD1 요법과 조합하여 처리된 마우스에서 뮤린 B16/Ova 동계 종양 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면. 도 8A는 대조군 및 MAP4K1-편집된 OT1 세포 단독과 비교하여 MAP4K1-편집된 OT1 T 세포 및 항-PD1 요법의 조합물로 처리된 마우스에서 종양 성장을 도시한 도면. 도 8B는 대조군 및 NR4A3-편집된 OT1 세포 단독과 비교하여 NR4A3-편집된 OT1 T 세포 및 항-PD1 요법의 조합물로 처리된 마우스에서 종양 성장을 도시한 도면.
도 9는 Zc3h12a-편집된 PMEL T 세포로 처리된 마우스에서 뮤린 MC38/gp100 동계 종양 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면.
도 10은 B16F10 폐 전이 모델에서 Zc3h12a-편집된 PMEL T 세포 및 PD1-편집된 PMEL T 세포로 처리된 마우스의 생존 곡선을 도시한 도면.
도 11은 Zc3h12a-편집된 T 세포로 처리된 마우스에서 뮤린 Eg7 Ova 동계 종양 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면.
도 12A 및 도 12B는 마우스에 대한 뮤린 A375 이종이식 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면. 도 12A는 비편집된 NY-ESO-1-특이적 TCR 트랜스제닉 T 세포와 비교하여 CBLB-편집된 NY-ESO-1-특이적 TCR 트랜스제닉 T 세포로 처리된 마우스에 대한 뮤린 A375 이종이식 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면. 도 12B는 대조군 편집된 T 세포와 비교하여 ZC3H12A-편집된 NY-ESO-1-특이적 TCR 트랜스제닉 T 세포로 처리된 마우스에 대한 뮤린 A375 이종이식 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면.
도 13A 및 도 13B는 Raji 세포를 사용한 버킷 림프종(Burkitt's lymphoma)의 피하 모델에서 단일-편집된 CD19 CAR T 세포로의 치료 후 종양 성장을 도시한 도면. 도 13A는 비편집된 CD19 CAR T 세포와 비교하여 MAP4K1-편집된 CD19 CAR T 세포로의 처리 후 종양 성장을 도시한 도면. 도 13B는 비편집된 CD19 CAR T 세포와 비교하여 NR4A3-편집된 CD19 CAR T 세포로의 처리 후 종양 성장을 도시한 도면.
도 14는 BCOR-편집된, CBLB-편집된 또는 BCOR/CBLB 이중-편집된 항-CD19 CAR T 세포로 처리된 마우스에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면. 종양 성장은 CAR T 세포 또는 비편집된 항-CD19 CAR T 세포로 처리되지 않은 마우스에 대해서 비교한다.
도 15는 시험관내 배양 시스템에서 BCOR-편집된 또는 BCOR/CBLB-편집된 CD19 CAR T 세포의 축적을 도시한 도면.
도 16은 시험관내 배양 시스템에서 BCOR-편집된 또는 BCOR/CBLB-편집된 CD19 CAR T 세포에 의한 IL-2 생산을 도시한 도면.
도 17은 시험관내 배양 시스템에서 BCOR-편집된 또는 BCOR/CBLB-편집된 CD19 CAR T 세포에 의한 IFNγ 생산을 도시한 도면.
도 18은 이중-편집된 Zc3h12a/Cblb OT1 T 세포로 처리된 마우스에서 뮤린 B16/Ova 동계 종양 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면.
도 19는 Pd1/Lag3 이중-편집된 OT1 T 세포로 처리된 마우스에서 뮤린 B16/Ova 동계 종양 모델에서 시간에 따른 종양 성장을 도시한 도면.
도 20은 항-종양 기억 및 에피토프 확산을 부여하는 표적으로서 Zc3h12a의 검증을 도시한 도면.
도 21은 MAP4K1-편집된 PBMC에서 IFNγ, IL-2 및 TNFα의 생산을 도시한 도면.
도 22는 Zc3h12a-편집된 뮤린 CD8 T 세포에서 Icos, Il6, Il2, Ifng 및 Nfkbiz의 mRNA 발현을 도시한 도면.
도 23은 Zc3h12a-편집된 뮤린 CD8 T 세포에서 ICOS의 세포 표면 발현을 도시한 도면.
도 24는 항-CD3/CD28 자극 후 Zc3h12a-편집된 뮤린 CD8 T 세포에 의한 IL-2 및 IFNγ의 생산을 도시한 도면.
도 25A 및 도 25B는 ZC3H12A-편집된 1차 인간 T 세포에서 IL6의 증가된 발현을 도시한 도면. 도 25A는 공여자로부터 유래된 ZC3H12A-편집된 PBMC로부터의 IL-6 단백질 생산을 도시한 도면. 도 25B는 ZC3H12A-편집된 PBMC에서 IL6 mRNA 발현을 도시한 도면.
본 개시내용은 면역요법의 맥락에서 치료 효능을 증가시키기 위한 면역 효과기 세포의 변형에 관련된 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 면역 세포의 하나 이상의 효과기 기능이 향상되도록 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시키도록, 또는 내인성 단백질의 하나 이상의 기능을 감소시키도록 본 발명의 방법에 의해서 변형된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 항원 특이성을 부여하는 트랜스젠의 도입, 예컨대, T 세포 수용체(T cell receptor: TCR) 또는 키메라 항원 수용체(chimeric antigen receptor: CAR) 발현 작제물의 도입에 의해서 추가로 변형된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포를 변형시키기 위한 조성물 및 방법, 예컨대, 유전자-조절 시스템의 조성물을 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 세포 증식성 장애, 예컨대, 암의 치료 방법을 제공하며 이 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포를 투여하는 단계를 포함한다.
I. 정의
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태는 그 문맥이 달리 명백하게 제시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "및/또는"은 달리 제시되지 않는 한 "및" 또는 "또는"을 의미하도록 본 명세서에서 사용된다.
본 명세서 전체에서, 그 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함한다", 또는 변형, 예컨대, "포함한다" 또는 "포함하는"은, 언급된 요소 또는 정수 또는 요소의 군 또는 정수들의 포함을 의미하지만, 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소의 군 또는 정수들을 제외하지 않는다.
본 출원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "약" 및 "대략"은 동의어로서 사용된다. 약/및 대략과 함께 또는 이러한 용어 없이 본 출원에서 사용되는 임의의 수치는 당업자에 의해서 인식되는 임의의 일반적인 변동을 포함하는 의미이다. 특정 실시형태에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 제시되지 않는 한 또는 그 문맥으로부터 명백하지 않는 한 언급된 참조값의 양 방향의 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% 또는 그 미만(더 크거나 또는 더 작음)에 포함되는 값의 범위를 지칭한다(이러한 수가 가능한 값의 100% 를 초과할 경우 제외).
"감소시킨다" 또는 "저감시킨다"는 참조값과 비교할 때 특정값에서의 적어도 5%, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% 또는 100% 감소 또는 저감을 지칭한다. 특정값의 감소 또는 저감은 또한 참조값과 비교하여 값의 배수 변화로서, 예를 들어, 참조값과 비교할 때 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 또는 그 초과의 감소로서 표현될 수 있다.
"증가시킨다"는 참조값과 비교할 때 특정값에서의 적어도 5%, 예를 들어, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 또는 그 초과의 증가를 지칭한다. 특정값의 증가는 또한 참조값과 비교하여 값의 배수 변화로서, 예를 들어, 참조값과 비교할 때 적어도 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 500, 1000배 또는 그 초과의 증가로서 표현될 수 있다.
용어 "펩타이드", "폴리펩타이드" 및 "단백질"은 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되며, 임의의 길이의 아미노산의 중합체 형태를 지칭하는데, 이것은 암호화된 및 비암호화된 아미노산, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된 또는 유도체화된 아미노산 및 변형된 펩타이드 골격을 갖는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용되는 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체 형태를 지칭한다. 따라서, 이 용어는 단일-, 이중-, 또는 다중-가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 혼성체, 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연, 화학적으로 또는 생화학적으로 변형된, 비-자연 또는 유도체화된 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 중합체를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로 단일- 또는 이중-가닥 DNA의 약 5 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 그러나, 본 개시내용의 목적을 위해서, 올리고뉴클레오타이드의 길이에 대한 상한은 존재하지 않는다. 올리고뉴클레오타이드는 "올리고머" 또는 "올리고"라고도 공지되며, 유전자로부터 또는 당업계에 공지된 방법에 의해서 화학적으로 합성될 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 기재될 실시형태에 적용 가능한 경우, 단일-가닥(예컨대, 센스 또는 안티센스) 및 이중-가닥 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"단편"은 전체 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열보다 작은 것을 함유하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 분자의 일부를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 단편은 참조 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 전체 길이의 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 포함한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 단편은 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 또는 아미노산을 함유할 수 있다.
용어 "서열 동일성"은 동일한 그리고 동일한 상대적인 위치의 2개의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 간의 염기 또는 아미노산의 백분율을 지칭한다. 따라서 하나의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열은 또 다른 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 서열 동일성의 특정 백분율을 갖는다. 서열 비교를 위해서, 전형적으로 하나의 서열이, 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 기능한다. 용어 "참조 서열"은 시험 서열이 비교되는 분자를 지칭한다.
"상보적"은 염기 적층 및 특이적 수소 결합을 통해서 자연 또는 비자연 발생 염기 또는 이의 유사체를 포함하는 2개의 서열 간의 짝지움에 대한 능력을 지칭한다. 예를 들어, 핵산의 하나의 위치에서의 염기가 표적의 상응하는 위치에서의 염기와 수소 결합할 수 있으면, 그 염기는 그 위치에서 서로에 상보적이라고 간주된다. 핵산은 수소 결합에 대한 긍정적인 기여도 제공하지 않고 부정적인 기여도 제공하지 않는 범용(universal) 염기, 또는 불활성 무염기(abasic) 스페이서를 포함할 수 있다. 염기 짝지움은 정규 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 짝지움 및 비-왓슨-크릭 염기 짝지움(예를 들어, 워블(Wobble) 염기 짝지움 및 후그스틴(Hoogsteen) 염기 짝지움)을 포함할 수 있다. 상보적 염기 짝지움의 경우, 아데노신-유형 염기(A)가 티미딘-유형 염기(T) 또는 우라실-유형 염기(U)에 상보적이고, 사이토신-유형 염기(C)가 구아노신-유형 염기(G)에 상보적이라고 이해되며, 범용 염기, 예컨대, 3-나이트로피롤 또는 5-나이트로인돌이 임의의 A, C, U 또는 T에 혼성화할 수 있고, 상보적이라고 고려된다(Nichols et al., Nature, 1994;369:492-493 및 Loakes et al., Nucleic Acids Res., 1994;22:4039-4043). 이노신(I)은 또한 당업계에서 범용 염기인 것으로 간주되었고, 임의의 A, C, U 또는 T에 상보적이라고 간주된다(문헌[Watkins and SantaLucia, Nucl. Acids Research, 2005; 33 (19): 6258-6267] 참고).
본 명세서에서 지칭되는 바와 같이, "상보적 핵산 서열"은 적절한 시험관내 및/또는 생체내 온도 조건 및 용액 이온 강도 하에서 서열-특이적인 역평행 방식으로 또 다른 핵산에 비-공유적으로 결합할 수 있게 하는 뉴클레오타이드의 서열을 포함하는 핵산 서열(즉, 핵산은 상보성 핵산에 특이적으로 결합함)이다.
서열 동일성 백분율 및 상보성 백분율의 비교 및 결정을 위한 서열 정렬 방법은 당업계에 널리 공지되어 있다. 비교를 위한 최적의 서열 정렬은 예를 들어, 문헌[Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해서, 문헌[Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444]의 유사성 방법에 대한 탐색에 의해서, 이들 알고리즘(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재))의 컴퓨터 구현에 의해서, 수동 정렬 및 육안 검사(예를 들어, 문헌[Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biology])에 의해서, 각각 문헌[Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402; 및 Altschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410]에 기재된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘을 비롯한 당업계에 공지된 알고리즘의 사용에 의해서 수행될 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 미국 국립 생물공학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)를 통해서 공개적으로 입수 가능하다.
본 명세서에서, 용어 "혼성화하다"는 상보적 뉴클레오타이드 염기들 간에 짝을 지워서(예를 들어, 아데닌(A)은 DNA 분자에서는 티민(T)과, RNA 분자에서는 우라실(U)과 염기쌍을 형성하고, 구아닌(G)은 DNA 및 RNA 분자 둘 다에서 사이토신(C)과 염기상을 형성함) 이중-가닥 핵산 분자를 형성하는 것을 지칭한다(예를 들어, 문헌[Wahl and Berger (1987) Methods Enzymol. 152:399; Kimmel, (1987) Methods Enzymol. 152:507] 참고). 또한, 2개의 RNA 분자(예를 들어, dsRNA) 간의 혼성화를 위해서, 구아닌(G) 염기가 우라실(U)과 짝지워지는 것이 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, G/U 염기 짝지움은 부분적으로 mRNA 내의 코돈과 tRNA 항-코돈 염기 짝지움의 관점에서 유전자 암호의 축퇴(즉, 과잉)의 원인이다. 본 개시내용의 맥락에서, 가이드 RNA 분자의 단백질-결합 분절(dsRNA 듀플렉스)의 구아닌(G)은 우라실(U)에 상보적인 것으로 간주되고, 그 반대로 마찬가지이다. 이와 같이, G/U 염기-쌍이 주어진 뉴클레오타이드 위치에서 가이드 RNA 분자의 단백질 결합 분절(dsRNA 듀플렉스)를 제조할 수 있는 경우, 그 위치는 비상보적인 것으로 간주되지 않고, 대신 상보적인 것으로 간주된다. 폴리뉴클레오타이드의 서열은 특이적으로 혼성화 가능한 표적 핵산의 서열에 100% 상보적일 필요는 없다고 이해된다. 또한, 폴리뉴클레오타이드는 하나 이상의 분절 상에 혼성화되어 개재 또는 인접한 분절이 혼성화 사건(예를 들어, 루프 구조 또는 헤어핀 구조)에 연관되지 않도록 할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 표적화되는 표적 핵산 서열 내의 표적 영역과 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 99% 또는 100% 서열 상보성을 포함할 수 있다.
용어 "변형된"은 상응하는 비변형된 물질 또는 화합물과 비교할 때 변경되거나 변화된 물질 또는 화합물(예를 들어, 세포, 폴리뉴클레오타이드 서열, 및/또는 폴리펩타이드 서열)을 지칭한다.
핵산, 폴리펩타이드, 세포 또는 유기체에 적용될 때 본 명세서에 사용된 용어 "자연 발생"은 자연에서 발견되는 핵산, 폴리펩타이드, 세포 또는 유기체를 지칭한다. 예를 들면, 자연의 공급원으로부터 단리될 수 있고, 실험실에서 인간에 의해 의도적으로 변형되지 않은 유기체(바이러스 포함)에 존재하는 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 자연 발생적이다.
"단리된"은 네이티브 상태로 발견될 때 일반적으로 동반되는 성분으로부터 존재하지 않거나 다양한 정도로 존재하는 물질을 지칭한다.
"발현 카세트" 또는 "발현 작제물"은 프로모터에 작동 가능하게 연결된 DNA 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다. "작동 가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하는 관계로 존재한다는 것을 지칭한다. 예를 들어, 프로모터는, 프로모터가 폴리뉴클레오타이드 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치면 폴리뉴클레오타이드 서열에 작동 가능하게 연결된다.
용어 "재조합 벡터"는 벡터에 삽입된 또 다른 폴리뉴클레오타이드를 전달 또는 수송할 수 있는 폴리뉴클레오타드 분자를 지칭한다. 삽입된 폴리뉴클레오타이드는 발현 카세트일 수 있다. 일부 실시형태에서, 재조합 벡터는 바이러스 벡터 또는 비-바이러스 벡터(예를 들어, 플라스미드)일 수 있다.
용어 "샘플"은 분석 및/또는 유전자 변형에 적용되는 생물학적 조성물(예를 들어, 세포 또는 조직의 일부)을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 샘플은 대상체로부터 직접 획득된다는 점에서 "일차 샘플"이고; 일부 실시형태에서, "샘플"은 예를 들어, 특정 성분을 제거하고/하거나 특정 관심대상 성분을 단리 또는 정제시키기 위한 일차 샘플의 처리 결과이다.
용어 "대상체"는 동물, 예컨대, 예를 들어, 포유동물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 영장류이다. 일부 실시형태에서, 포유동물은 인간이다. 일부 실시형태에서, 대상체는 가축, 예컨대, 소, 양, 염소, 소, 돼지 등; 또는 개와 고양이와 같은 길들여진 동물이다. 일부 실시형태에서 (예를 들어, 특히 연구 맥락에서) 대상체는 설치류(예를 들어, 마우스, 래트, 햄스터), 토끼, 영장류 또는 돼지, 예컨대, 근친 돼지 등이다. 용어 "대상체"및 "환자"는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다.
"투여"는 본 명세서에서 작용제 또는 조성물을 대상체에게 도입하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "치료하는"은 생리학적 결과에 영향을 주기 위해 작용제 또는 조성물을 대상체에게 전달하는 것을 지칭한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 용어 "유효량"은 특정 생리학적 효과를 초래하는데 필요한 최소량의 작용제 또는 조성물을 지칭한다. 특정 작용제의 유효량은 작용제의 본성, 예를 들어, 질량/부피, 세포/부피 수, 입자/부피, (작용제의 질량)(대상체의 질량), 세포 수/(대상체 질량) 또는 입자/(대상체의 질량)으로 표현될 수 있다. 특정 작용제의 유효량은 또한 절반-최대 유효 농도(half-maximal effective concentration)(EC50)로 표현될 수 있으며, 이는 참조 수준과 최대 반응 수준 사이의 절반인 특정 생리학적 반응의 크기를 초래하는 작용제의 농도를 지칭한다.
세포의 "집단"은 1개를 초과하지만, 바람직하게는 적어도 1×103개 세포, 적어도 1×104개 세포, 적어도 1×105개 세포, 적어도 1×106개 세포, 적어도 1×107개 세포, 적어도 1×108 개 세포, 적어도 1×109개 세포, 적어도 1×1010개 세포, 적어도 1×1011개 세포 또는 그 초과의 세포의 임의의 수의 세포를 지칭한다. 세포의 집단은 시험관내 집단(예를 들어, 배양물 중의 세포의 집단) 또는 생체내 집단(예를 들어, 특정 조직에 존재하는 세포의 집단)을 지칭할 수 있다.
분자 및 세포 생화학에서의 일반적인 방법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. (Sambrook et al., HaRBor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons 1999); Protein Methods (Bollag et al., John Wiley & Sons 1996); Nonviral Vectors for Gene Therapy (Wagner et al. eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplift & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (I. Lefkovits ed., Academic Press 1997); 및 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998)]와 같은 표준 교과서에서 찾아볼 수 있고, 이들의 본 개시내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
II. 변형된 면역 효과기 세포
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 효과기 세포를 제공한다. 본 명세서에서, 용어 "변형된 면역 효과기 세포"는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하는 하나 이상의 변형을 포함하는 면역 효과기 세포뿐만 아니라 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하는 면역 효과기 세포를 포함한다. 본 명세서에서, "비변형된 면역 효과기 세포" 또는 "대조군 면역 효과기 세포"는, 게놈이 변형되지 않았고, 유전자-조절 시스템을 포함하지 않거나 대조군 유전자-조절 시스템(예를 들어, 빈 벡터 대조군, 비-표적화 gRNA, 스크램블드(scrambled) siRNA 등)을 포함하는 세포 또는 세포의 집단을 지칭한다.
용어 "면역 효과기 세포"는 림프구(예컨대, T-세포(흉선세포) 및 B-세포), 자연 살해(NK) 세포, NKT 세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호염기, 호중구, 수지상 세포 및 비만 세포를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 선천 면역 반응 및 적응 면역(adaptive immune) 반응의 정착에 관여하는 세포를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 T 세포, 예컨대, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포(세포독성 T 세포 또는 CTL로서도 지칭됨), 조절 T 세포(Treg), Th1 세포, Th2 세포 또는 Th17 세포이다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 종양 샘플로부터 단리된 T 세포(본 명세서에서 "종양 침윤 림프구" 또는 "TIL"로서 지칭됨)이다. 이론에 얽매이고자 함은 아니지만, TIL은 종양 항원에 대한 특이성을 증가시키고(Radvanyi et al., 2012 Clin Canc Res 18:6758-6770), 따라서 종양 항원-특이적 면역 반응(예를 들어, 활성화, 증식 및 암 세포에 대한 세포독성 활성)을 매개하여 외인성의 조작된 수용체를 도입하지 않으면서 암 세포 파괴(Brudno et al., 2018 Nat Rev Clin Onc 15:31-46))로 이어질 수 있다고 생각된다. 따라서, 일부 실시형태에서, TIL은 대상체에서 종양으로부터 단리되고, 생체외에서 확장되고, 대상체에 재주입된다. 일부 실시형태에서, TIL은 자가유래 종양 항원에 대해서 특이적인 1종 이상의 외인성 수용체를 발현하도록 변형되고, 생체외에서 확장되고, 대상체에 재주입된다. 이러한 실시형태는 생체내 마우스 모델을 사용하여 모델링될 수 있는데, 여기서 마우스에 암 항원(예를 들어, CD19)을 발현하는 암 세포주가 이식하고, 암 항원에 특이적인 외인성 수용체를 발현하는 변형된 T 세포로 치료한다(예를 들어, 실시예 10 및 11 참고).
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 동물 세포이거나 또는 무척추 동물 및 척추 동물(예를 들어, 어류, 양서류, 파충류, 조류 또는 포유동물)을 비롯한 동물 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 포유동물 세포이거나 또는 포유동물세포(예를 들어, 돼지, 소, 염소, 양, 설치류 비-인간 영장류, 인간 등)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 설치류 세포이거나 또는 설치류 세포(예를 들어, 래트 또는 마우스)로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 인간 세포이거나 또는 인간 세포로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 내인성 표적 유전자의 게놈 DNA 서열 내에 하나 이상의 변형(예를 들어, 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이)을 포함하여 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래한다. 이러한 변형은 본 명세서에서 "불활성화 돌연변이"로 지칭되고, 불활성화 돌연변이를 포함하는 내인성 유전자는 "변형된 내인성 표적 유전자"로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 mRNA 전사를 감소 또는 저해하여, 암호화된 mRNA 전사체 및 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 mRNA 번역을 감소 또는 저해하여, 암호화된 단백질의 발현 수준을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 불활성화 돌연변이는 내인성 단백질의 비변형된(즉, 야생형) 버전(예를 들어, 하기에 기재된 음성-우세(dominant-negative) 돌연변이체)에 비해서 감소된 또는 변경된 기능을 갖는 변형된 내인성 단백질을 암호화한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래하거나 또는 내인성 단백질의 변형된 버전의 발현을 초래하는 내인성 표적 유전자 이외의 게놈 위치에 하나 이상의 게놈 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 게놈 내의 하나 이상의 위치에 삽입되어, 유전자-조절 시스템의 발현 시 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킨다. 일부 실시형태에서, 내인성 단백질의 변형된 버전을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 게놈의 하나 이상의 위치에 삽입되며, 여기서 단백질의 변형된 버전의 기능은 단백질의 비변형된 또는 야생형 버전(예를 들어, 하기에 기재된 음성-우세 돌연변이체)에 비해서 감소된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함하며, 여기서 하나 이상의 변형은 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물(즉, mRNA 전사체 또는 단백질)의 감소된 발현 및/또는 기능을 초래한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 단백질의 mRNA 전사체 및/또는 감소된 발현의 감소된 발현을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포 내의 유전자 생성물의 발현은 비변형된 면역 효과기 세포 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 적어도 5% 감소된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포 내의 유전자 생성물의 발현은 비변형된 면역 효과기 세포 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 초과만큼 감소된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 복수(예를 들어, 2개 이상)의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 감소된 발현 및/또는 기능을 나타낸다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포 내의 유전자 생성물의 발현에 비해서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자로부터의 유전자 생성물의 감소된 발현 및/또는 기능을 나타낸다,
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 효과기 세포를 제공하며, 여기서 1종 이상의 내인성 표적 유전자, 또는 이의 일부는 변형된 면역 효과기 세포가 mRNA 전사체 또는 단백질을 발현하지 않도록 삭제된다(즉, "넉-아웃된다"). 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 복수의 내인성 표적 유전자 또는 이의 부분의 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 결실을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 하나 이상의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함하며, 여기서 표적 DNA 서열 내의 하나 이상의 변형은 비변형된 면역 효과기 세포에서 발현되는 상응하는 단백질(예를 들어, "비변형된 내인성 단백질")의 기능에 비해서 감소된 또는 변경된 기능을 갖는 단백질(예를 들어, "변형된 내인성 단백질")의 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 변형된 내인성 단백질을 암호화하는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 변형된 내인성 표적 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 내인성 단백질은, 변형된 면역 효과기 세포에 의해서 발현되거나 또는 또 다른 세포에 의해서 발현되는 또 다른 단백질에 대해서 감소된 또는 변경된 결합 친화도를 나타내거나; 감소된 또는 변경된 신호전달 능력을 나타내거나; 감소된 또는 변경된 효소 활성도를 나타내거나; 감소된 또는 변경된 DNA-결합 활성도를 나타내거나; 또는 스캐폴드 단백질로서 기능하는 감소된 또는 변경된 능력을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 변형된 내인성 표적 유전자는 하나 이상의 음성 우세 돌연변이(dominant negative mutation)를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "음성-우세 돌연변이"는 암호화된 단백질이 비변형된 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질에 길항적으로 작용하도록 하는 표적 유전자의 1종 이상의 뉴클레오타이드의 치환, 결실 또는 삽입을 지칭한다. 돌연변이는, 음성 표현형이 상응하는 비변형된 유전자의 양성 표현형보다 유전자 우세하기 때문에 음성-우세이다. 하나 이상의 음성-우세 돌연변이를 포함하는 유전자 및 이에 의해서 암호화된 단백질은 "음성-우세 돌연변이체", 예를 들어, 음성-우세 유전자 및 음성-우세 단백질로서 지칭된다. 일부 실시형태에서, 음성 우세 돌연변이체 단백질은 면역 효과기 세포의 게놈 내의 하나 이상의 위치에 삽입된 외인성 트랜스젠에 의해서 암호화된다.
음성 우세에 대한 다양한 기전이 공지되어 있다. 전형적으로, 음성 우세 돌연변이체의 유전자 생성물은 비변형된 유전자 생성물의 일부 기능을 보유하지만, 비변형된 유전자 생성물의 하나 이상의 중요한 다른 기능이 결핍되어 있다. 이는 음성-우세 돌연변이체가 비변형된 유전자 생성물을 길항작용하도록 한다. 예를 들어, 예시적인 실시형태로서, 전사 인자의 음성-우세 돌연변이체는 기능성 활성화 도메인이 결핍될 수 있지만 기능성 DNA 결합 도메인을 유지할 수 있다. 이러한 예에서, 음성-우세 전사 인자는 비변형된 전사 인자로서 DNA의 전사를 활성화시킬 수 없지만, 음성-우세 전사 인자는 비변형된 전사 인자가 전사 인자 결합 부위에 결합하는 것을 예방함으로써 유전자 발현을 간접적으로 저해할 수 있다. 또 다른 예시적인 실시형태로서, 이량체로서 기능하는 단백질의 음성-우세 돌연변이가 공지되어 있다. 이러한 이량체 단백질의 음성-우세 돌연변이체는 비변형된 단백질과 이량체화하는 능력을 보유할 수 있지만, 달리 기능할 수 없다. 음성-우세 단량체는, 비변형된 단량체와 이량체화하여 이종이량체를 형성함으로써, 비변형된 단량체의 기능성 동종이량체의 형성을 방지한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함한다. 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자의 게놈 DNA 서열을 변형시킴으로써(예를 들어, 게놈 DNA 서열 내의 하나 이상의 핵산의 삽입, 결실 또는 돌연변이에 의해서); 내인성 표적 유전자의 전사를 조절(예를 들어, mRNA 전사의 저해 또는 억제)함으로써; 그리고/또는 내인성 표적 유전자의 번역(예를 들어, mRNA 분해에 의해서)을 조절함으로써 다양한 기전에 의해서 내인성 표적 유전자 변형의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 유전자-조절 시스템(예를 들어, 핵산-기반 유전자-조절 시스템, 단백질-기반 유전자-조절 시스템 또는 조합 단백질/핵산-기반 유전자-조절 시스템)을 포함한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포에 포함된 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자를 변경시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 하기를 포함하는 유전자-조절 시스템을 포함한다:
(a) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 핵산 분자;
(b) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 핵산 분자를 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(c) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 단백질;
(d) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 단백질을 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(e) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 RNA(gRNA);
(f) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(g) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(h) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(i) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 DNA(gDNA);
(j) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gDNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(k) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(l) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(m) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
(n) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(o) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(p) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(q) 이들의 임의의 조합물.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드가 면역 효과기 세포의 게놈 내에 삽입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드는 에피솜에 의해서(episomaly) 발현되고, 면역 효과기 세포의 게놈에 삽입되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하고, 1종 이상의 게놈 유전자좌에 삽입된 하나 이상의 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다(예를 들어, 유전자 "넉-인"). 일부 실시형태에서, 하나 이상의 외인성 트랜스젠은 검출 가능한 표지, 안정성-스위치 시스템, 키메라 스위치 수용체 및/또는 조작된 항원-특이적 수용체를 암호화한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 검출 가능한 태그를 암호화하는 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다. 검출 가능한 태그는 FLAG 태그, 폴리-히스티딘 태그(예를 들어, 6xHis), SNAP 태그, Halo 태그, cMyc 태그, 글루타티온-S-트랜스퍼라제 태그, 아비딘, 효소, 형광 단백질, 발광 단백질, 화학발광 단백질, 생물발광 단백질 및 인광 단백질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서 형광 단백질은 청색/UV 단백질(예컨대, BFP, TagBFP, mTagBFP2, Azurite, EBFP2, mKalama1, Sirius, 사파이어 및 T-사파이어); 시안 단백질(예컨대, CFP, eCFP, Cerulean, SCFP3A, mTurquoise, mTurquoise2, 단량체 Midoriishi-Cyan, TagCFP 및 mTFP1); 녹색 단백질(예컨대: GFP, eGFP, meGFP(A208K 돌연변이), Emerald, Superfolder GFP, Monomeric Azami Green, TagGFP2, mUKG, mWasabi, Clover 및 mNeonGreen); 황색 단백질(예컨대, YFP, eYFP, Citrine, Venus, SYFP2, 및 TagYFP); 주황색 단백질(예컨대, Monomeric Kusabira-Orange, mKOκ, mKO2, mOrange 및 mOrange2); 적색 단백질(예컨대, RFP, mRaspberry, mCherry, mStrawberry, mTangerine, tdTomato, TagRFP, TagRFP-T, mApple, mRuby 및 mRuby2); 원적(far-red) 단백질(예컨대, mPlum, HcRed-Tandem, mKate2, mNeptune 및 NirFP); 근적(near-infrared) 단백질(예컨대, TagRFP657, IFP1.4 및 iRFP); 긴 스트로크 이동 단백질(long stokes shift protein)(예컨대, mKeima Red, LSS-mKate1, LSS-mKate2 및 mBeRFP); 광활성화 가능한(photoactivatible) 단백질(예컨대, PA-GFP, PAmCherry1 및 PATagRFP); 광전환 가능한(photoconvertible) 단백질(예컨대, Kaede(녹색), Kaede(적색), KikGR1(녹색), KikGR1(적색), PS-CFP2, PS-CFP2, mEos2(녹색), mEos2(적색), mEos3.2(녹색), mEos3.2(적색), PSmOrange 및 PSmOrange); 및 광스위치 가능한(photoswitchable) 단백질(예컨대, Dronpa)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 검출 가능한 태그는 AmCyan, AsRed, DsRed2, DsRed Express, E2-Crimson, HcRed, ZsGreen, ZsYellow, mCherry, mStrawberry, mOrange, mBanana, mPlum, mRasberry, tdTomato, DsRed Monomer 및/또는 AcGFP로부터 선택될 수 있고, 이들 모두는 클론테크사(Clontech)로부터 입수 가능하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 안전성-스위치 시스템을 암호화하는 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다. 안전성-스위치 시스템(당업계에서 자살 유전자 시스템이라고 지칭됨)은 세포가 대상체에 투여된 후 변형된 면역 효과기 세포의 제거를 가능하게 하는 1종 이상의 단백질을 암호화하는 외인성 트랜스젠을 포함한다. 안전성-스위치 시스템의 예는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 안전성-스위치 시스템은 비독성 전구약물을 독성 화합물로 전환시키는 단백질, 예컨대, 단순 포진 티미딘 키나제(Hsv-tk) 및 간시클로비어(GCV) 시스템을 암호화하는 유전자(Hsv-tk/GCV)를 포함한다. Hsv-tk는 비독성 GCV를 세포독성 화합물로 전환시키는데, 이것은 세포 아포토시스를 일으킨다. 이와 같이, GCV를, Hsv-tk 단백질을 암호화하는 트랜스젠을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포로 치료된 대상체에 투여하는 것은 내인성 면역 효과기 세포를 절약하게 하면서 변형된 면역 효과기 세포를 선택적으로 제거할 수 있다(예를 들어, 문헌[Bonini et al., Science, 1997, 276(5319):1719-1724; Ciceri et al., Blood, 2007, 109(11):1828-1836; Bondanza et al., Blood 2006, 107(5):1828-1836] 참고).
추가의 안전성-스위치 시스템은 ADCC를 통해서 세포-표면 마커에 특이적인 단클론성 항체의 투여에 의해서 변형된 면역 효과기 세포의 제거를 가능하게 하는 세포-표면 마커를 암호화하는 유전자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포-표면 마커는 CD20이고, 변형된 면역 효과기 세포는 항-CD20 단클론성 항체, 예컨대, 리툭시맙의 투여에 의해서 제거될 수 있다(예를 들어, 문헌[Introna et al., Hum Gene Ther, 2000, 11(4):611-620; Serafini et al., Hum Gene Ther, 2004, 14, 63-76; van Meerten et al., Gene Ther, 2006, 13, 789-797] 참고). EGF-R 및 세툭시맙 또는 페니투무맙을 사용한 유사한 시스템은 PCT 공개 제WO 2018006880호에 기재되어 있다. 추가적인 안전성-스위치 시스템은 이량체화의 화학 유도기(chemical inducer of dimerization: CID)에 대한 하나 이상의 결합 부위를 포함하는 프로-아포토시스(pro-apoptotic) 분자를 암호화하는 트랜스젠을 포함하는데, 이것은 프로-아포토시스 분자의 올리고머화 및 아포토시스 경로의 활성화를 유도하는 CID의 투여에 의해서 변형된 면역 효과기 세포의 제거를 가능하게 한다. 일부 실시형태에서, 프로-아포토시스 분자는 Fas(CD95라고도 공지됨)이다(Thomis et al., Blood, 2001, 97(5), 1249-1257). 일부 실시형태에서, 프로-아포토시스 분자는 카파제-9이다(Straathof et al., Blood, 2005, 105(11), 4247-4254).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 키메라 스위치 수용체를 암호화하는 외인성 트랜스젠을 추가로 포함한다. 키메라 스위치 수용체는 내인성 세포-표면 수용체로부터의 세포외 도메인 및 이종 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 조작된 세포-표면 수용체여서, 세포외 도메인에 의한 리간드 인식은 세포-표면 수용체의 야생형 형태에 의해서 활성화되는 것보다 상이한 신호전달 캐스케이드 활성화를 초래한다. 일부 실시형태에서, 키메라 스위치 수용체는 저해성 세포-표면 수용체에 의해서 일반적으로 전달되는 저해성 신호가 아닌 활성화 신호의 전달로 이어지는 세포내 도메인에 융합된 저해성 세포-표면 수용체의 세포외 도메인을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포 활성화를 저해한다고 공지된 세포-표면 수용체로부터 유래된 세포외 도메인은 활성화 세포내 도메인에 융합될 수 있다. 이어서, 상응하는 리간드의 맞물림이 면역 효과기 세포의 활성화를 저해하기 보다는 증가시키는 신호전달 캐스케이드를 활성화시킬 것이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 PD1-CD28 스위치 수용체를 암호화하는 트랜스젠을 포함하며, 여기서 PD1의 세포외 도메인은 CD28의 세포내 신호전달 도메인에 융합된다(예를 들어, 문헌[Liu et al., Cancer Res 76:6 (2016), 1578-1590 및 Moon et al., Molecular Therapy 22 (2014), S201] 참고). 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 CD200R의 세포외 도메인 및 CD28의 세포내 신호전달 도메인을 암호화하는 트랜스젠을 포함한다(문헌[Oda et al., Blood 130:22 (2017), 2410-2419] 참고).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 본 명세서에서 "변형된 수용체-조작된 세포" 또는 "변형된 RE-세포"로서 지칭되는, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 또는 항원 제시 세포(APC)에 의해서 발현되는 단백질 표적을 인식하는 조작된 항원-특이적 수용체를 추가로 포함한다. 용어 "조작된 항원 수용체"는 비자연 발생 항원-특이적 수용체, 예컨대, 키메라 항원 수용체(CAR) 또는 재조합 T 세포 수용체(TCR)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 힌지 및 막관통 도메인을 통해서 신호전달 도메인을 포함하는 세포질 도메인에 융합된 세포외 항원 결합 도메인을 포함하는 CAR이다. 일부 실시형태에서, CAR 세포외 도메인은 MHC-독립적인 방식으로 표적 세포에 의해서 발현되는 항원에 결합하고, 이것은 RE 세포의 활성화 및 증식으로 이어진다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 융합된 태그를 인식한다. 이러한 실시형태에서, CAR의 항원-특이성은 표지된 항체의 항원-특이성에 좌우되어, 또 다른 항체를 하나의 항체로 대체함으로써 단일 CAR 작제물을 사용하여 다수의 상이한 항원을 표적화할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제9,233,125호 및 제9,624,279호; 미국 특허 출원 공개 제20150238631호 및 제20180104354호 참고). 일부 실시형태에서, CAR의 세포외 도메인은 항체로부터 유래된 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 본 개시내용에 유용한 항원 결합 도메인은 예를 들어, scFv; 항체; 항체의 항원 결합 영역; 중쇄/경쇄의 가변 영역; 및 단일 쇄 항체를 포함한다.
일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 TCR 복합체 제타 쇄(예컨대, CD3ξ 신호전달 도메인), FcγRIII, FcεRI 또는 T-림프구 활성화 도메인으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, CAR의 세포내 신호전달 도메인은 2개의 공자극성 도메인, 예를 들어, 4-1BB, CD28, CD40, MyD88 또는 CD70 도메인 중 임의의 2개를 추가로 포함한다. 예시적인 CAR 구조 및 세포내 신호전달 도메인은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 WO 2009/091826; US 20130287748; WO 2015/142675; WO 2014/055657; 및 WO 2015/090229 참조).
다양한 종양 항원에 특이적인 CAR은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, CD171-특이적 CAR(Park et al., Mol Ther (2007) 15(4):825-833), EGFRvIII-특이적 CAR(Morgan et al., Hum Gene Ther (2012) 23(10):1043-1053), EGF-R-특이적 CAR(Kobold et al., J Natl Cancer Inst (2014) 107(1):364), 탄산무수화효소 K-특이적 CAR(Lamers et al., Biochem Soc Trans (2016) 44(3):951-959), FR-α-특이적 CAR(Kershaw et al., Clin Cancer Res (2006) 12(20):6106-6015), HER2-특이적 CAR(Ahmed et al., J Clin Oncol (2015) 33(15)1688-1696; Nakazawa et al., Mol Ther (2011) 19(12):2133-2143; Ahmed et al., Mol Ther (2009) 17(10):1779-1787; Luo et al., Cell Res(2016) 26(7):850-853; Morgan et al., Mol Ther (2010) 18(4):843-851; Grada et al., Mol Ther Nucleic Acids (2013) 9(2):32), CEA-특이적 CAR(Katz et al., Clin Cancer Res (2015) 21(14):3149-3159), IL13Rα2-특이적 CAR(Brown et al., Clin Cacner Res (2015) 21(18):4062-4072), GD2-특이적 CAR(Louis et al., Blood (2011) 118(23):6050-6056; Caruana et al., Nat Med (2015) 21(5):524-529), ErbB2-특이적 CAR(Wilkie et al., J Clin Immunol (2012) 32(5):1059-1070), VEGF-R-특이적 CAR(Chinnasamy et al., Cancer Res (2016) 22(2):436-447), FAP-특이적 CAR(Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(2):154-166), MSLN-특이적 CAR(Moon et al, Clin Cancer Res (2011) 17(14):4719-30), NKG2D-특이적 CAR(VanSeggelen et al., Mol Ther (2015) 23(10):1600-1610), CD19-특이적 CAR(Axicabtagene ciloleucel(Yescarta(등록상표)) 및 Tisagenlecleucel(Kymriah(등록상표))이다(예를 들어, 종양-특이적 CAR의 임상 시험을 검토한 CAR 문헌[Li et al., J Hematol and Oncol (2018) 11(22)] 참고).
일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 조작된 TCR이다. 조작된 TCR은 특정 표적 항원을 인식하는 T 세포 집단으로부터 단리 및 클로닝된 TCRα 및/또는 TCRβ 쇄를 포함한다. 예를 들어, TCRα 및/또는 TCRβ 유전자(즉, TRAC 및 TRBC)는 특정 종양 항원 또는 종양 세포로 면역화된 인간화된 마우스로부터 단리된 특정 악성종양 또는 T 세포 집단을 갖는 개체로부터 단리된 T 세포 집단으로부터 클로닝될 수 있다. 조작된 TCR은 (예를 들어, 표적 세포의 표면 상에서 발현되는 주 조직적합성 복합체(MHC) 단백질의 맥락에서 제시된 동족 항원의 인식에 의해서) 내인성 반대부분과 동일한 기전을 통해서 항원을 인지한다. 이러한 항원 맞물림은 내인성 신호전달 경로를 자극하여, TCR-조작된 세포의 활성화 및 증식으로 이어진다.
종양 항원에 특이적인 조작된 TCR, 예를 들어, WT1-특이적 TCR(JTCR016, 주노 쎄라퓨틱스사(Juno Therapeutics); WT1-TCRc4, 미국 특허 출원 제20160083449호에 기재됨), MART-1 특이적 TCR(문헌[Morgan et al., Science 314 (2006) 126-129]에 기재된 DMF4T 클론 포함); 문헌[Johnson et al., Blood 114 (2009) 535-546]에 기재된 DMF5T 클론); 및 문헌[van den Berg et al., Mol. Ther. 23 (2015) 1541-1550]에 기재된 ID3T), gp100-특이적 TCR(Johnson et al., Blood 114 (2009) 535-546), CEA-특이적 TCR(Parkhurst et al., Mol Ther. 19 (2011) 620-626), NY-ESO 및 LAGE-1 특이적 TCR(문헌[Robbins et al., J Clin Oncol 26 (2011) 917-924; Robbins et al., Clin Cancer Res 21 (2015) 1019-1027; 및 Rapoport et al., Nature Medicine 21 (2015) 914-921]에 기재된 1G4T 클론), 및 MAGE-A3-특이적 TCR(Morgan et al., J Immunother 36 (2013) 133-151) 및 Linette et al., Blood 122 (2013) 227-242)은 당업계에 공지되어 있다(또한 문헌[Debets et al., Seminars in Immunology 23 (2016) 10-21] 참고).
일부 실시형태에서, 조작된 항원 수용체는 분화 분자의 클러스터, 예컨대, CD3, CD4, CD8, CD16, CD24, CD25, CD33, CD34, CD45, CD64, CD71, CD78, CD80(B7-1이라고도 공지됨), CD86(B7-2라고도 공지됨), CD96, CD116, CD117, CD123, CD133 및 CD138, CD371(CLL1이라고도 공지됨); 종양-연관 표면 항원, 예컨대, 5T4, BCMA(CD269 및 TNFRSF17이라고도 공지됨, 유니프로트 번호 Q02223), 암배아 항원(CEA), 탄산무수화효소 9(CAIX 또는 MN/CAIX), CD19, CD20, CD22, CD30, CD40, 다이시알로강글리오사이드, 예컨대, GD2, ELF2M, 관상피 뮤신(ductal-epithelial mucin), 에프린 B2, 상피 세포 접착 분자(EpCAM), ErbB2(HER2/neu), FCRL5(유니프로트 번호 Q68SN8), FKBP11(유니프로트 번호 Q9NYL4), 글리오마-연관 항원, 글리고스핑고리피드, gp36, GPRC5D(유니프로트 번호 Q9NZD1), mut hsp70-2, 장 카복실 에스터라제(intestinal carboxyl esterase), IGF-I 수용체, ITGA8(유니프로트 번호 P53708), KAMP3, LAGE-1a, MAGE, 메소텔린, 호중구 엘라스타제, NKG2D, Nkp30, NY-ESO-1, PAP, 프로스타제(prostase), 전립선-암종 종양 항원-1(PCTA-1), 전립선 특이적 항원(PSA), PSMA, 프로스테인, RAGE-1, ROR1, RU1(SFMBT1), RU2(DCDC2), SLAMF7(유니프로트 번호 Q9NQ25), 서바이빈, 태그-72 및 텔로머라제; 주 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex: MHC) 분자 제시 종양-특이적 펩타이드 에피토프; 종양 기질 항원, 예컨대, 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 A(EDA) 및 엑스트라 도메인 B(EDB); 테나신-C의 A1 도메인(TnC A1) 및 섬유모세포 연관 단백질(FAP); 사이토카인 수용체, 예컨대, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), EGFR 변이체 III(EGFRvIII), TFGβ-R 또는 이의 성분, 예컨대, 엔도글린; 주 조직적합성 복합체(MHC) 분자; 바이러스-특이적 표면 항원, 예컨대, HIV-특이적 항원(예컨대, HIV gp120); EBV-특이적 항원, CMV-특이적 항원, HPV-특이적 항원, 라사 바이러스-특이적 항원, 인플루엔자 바이러스-특이적 항원뿐만 아니라 이들 표면 항원의 임의의 유도체 또는 변이체로부터 선택된 표적 항원에 지향된다.
A. 효과기 기능
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 1종 이상의 면역 세포 효과기 기능의 증가를 나타낸다. 본 명세서에서, 용어 "효과기 기능"은 표적 세포 또는 표적 항원에 대한 면역 반응의 생성, 유지 및/또는 향상과 관련된 면역 세포의 기능을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 하기 특징 중 하나 이상을 나타낸다: 종양 내로의 증가된 침윤 또는 이동, 증가된 증식, 증가된 또는 연장된 세포 생존, 세포의 활성화 상태가 연장되거나 증가되도록 하는 주변 미세환경 내의 저해성 인자에 대한 증가된 저항성, 전염증성 면역 인자(예를 들어, 전염증성 사이토카인, 케모카인, 및/또는 효소)의 증가된 생산, 증가된 세포독성 및/또는 소포에 대한 증가된 저항성.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 종양 내로의 증가된 침윤을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포에 의한 증가된 종양 침윤은 동일한 시간 기간 동안 종양 내로 침윤하는 비변형된 면역 효과기 세포의 수에 비해서 주어진 시간 기간 동안 종양 내로 침윤하는 변형된 면역 효과기 세포의 수를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 세포에 비해서 종양 침윤에서 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과의 배수 증가를 나타낸다. 종양 침윤은 대상체로부터 하나 이상의 종양을 단리시키고, 유세포 분석법, 면역조직화학 및/또는 면역형광에 의해서 샘플에서 변형된 면역 세포의 수를 평가함으로써 측정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 세포 증식의 증가를 나타낸다. 이들 실시형태에서, 이러한 결과는 주어진 시간 기간 후에 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 존재하는 변형된 면역 효과기 세포의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 증가된 증식 속도를 나타내고, 여기서 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포보다 더 신속한 속도로 분화된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 세포에 비해서 증식 속도에서 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과의 배수 증가를 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 연장된 증식 기간을 나타내는데, 여기서 변형된 면역 효과기 세포 및 비변형된 면역 효과기 세포는 유사한 속도로 분화하지만, 변형된 면역 효과기 세포는 더 긴 시간 기간 동안 증식성 상태를 유지한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 세포보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 더 긴 시간 동안 증식성 상태를 유지한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 증가된 또는 연장된 세포 생존을 나타낸다. 이러한 실시형태에서, 이러한 결과는 주어진 시간 기간 후에 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 존재하는 변형된 면역 효과기 세포의 수를 증가시킨다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 세포보다 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20,25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 더 긴 시간 동안 생존을 유지하고, 지속된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 저해성 인자에 대해서 증가된 내성을 나타낸다. 예시적인 저해성 인자는 면역 관문 분자(예를 들어, PD1, PDL1, CTLA4, LAG3, IDO) 및/또는 저해성 사이토카인(예를 들어, IL-10, TGFβ)에 의한 신호전달을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 T 세포는 비변형된 T 세포에 비해서 T 세포 소모에 대해서 저항성을 나타낸다. T 세포 소모는 감소된 효과기 기능을 특징으로 하는 항원-특이적 T 세포 이상기능의 상태이고, 이것은 항원-특이적 T 세포의 후속 결실로 이어진다. 일부 실시형태에서, 소모된 T 세포는 항원에 반응하여 증식하는 능력이 결핍되고/되거나 감소된 사이토카인 생산을 나타내고/나타내거나 표적 세포, 예컨대, 종양 세포에 대해서 감소된 세포독성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 소모된 T 세포는 세포 표면 마커 및 전사 인자의 변경된 발현, 예컨대, CD122 및 CD127의 감소된 세포 표면 발현; 저해성 세포 표면 마커, 예컨대, PD1, LAG3, CD244, CD160, TIM3, 및/또는 CTLA4의 증가된 발현; 및/또는 전사 인자, 예컨대, Blimp1, NFAT, 및/또는 BATF의 증가된 발현에 의해서 식별된다. 일부 실시형태에서, 소모된 T 세포는 사이토카인 신호전달의 변경된 민감성, 예컨대, TGFβ 신호전달에 대한 증가된 민감성 및/또는 IL-7 및 IL-15 신호전달에 대한 감소된 민감성을 나타낸다. T 세포 소모는 예를 들어, T 세포를 표적 세포의 집단과 공배양하고, T 세포 증식, 사이토카인 생산 및/또는 표적 세포의 용해를 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포를 표적 세포(예를 들어, 표적 종양 항원을 발현하도록 조작된 자가유래 종양 세포 또는 세포주)의 집단과 공동 배양하고, 효과기 세포 증식, 사이토카인 생산 및/또는 표적 세포 용해를 측정한다. 이어서, 이러한 결과를 표적 세포와 대조군 면역 세포의 집단(예컨대, 대조군 변형을 갖는 비변형된 면역 효과기 세포 또는 면역 효과기 세포)의 공배양으로부터 얻은 결과와 비교한다.
일부 실시형태에서, T 세포 소모에 대한 저항성은, 대조군 면역 세포 집단으로부터 관찰된 사이토카인 생산과 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포로부터의 1종 이상의 사이토카인(예를 들어, IFNγ, TNFα 또는 IL-2)의 증가된 생산에 의해서 입증된다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단으로부터의 사이토카인 생산과 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포로부터의 사이토카인 생산에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, T 세포 소모에 대한 저항성은, 대조군 면역 세포 집단으로부터 관찰된 증식과 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포의 증가된 증식에 의해서 입증된다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단의 증식과 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포의 증식에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, T 세포 소모에 대한 저항성은, 대조군 면역 세포 집단에 의해서 관찰된 표적 세포 용해와 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포에 의한 증가된 표적 세포에 용해 의해서 입증된다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단에 의한 표적 세포 용해와 비교하여, 변형된 면역 효과기 세포에 의한 표적 세포 용해에서의 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 1.6, 1.7, 1.8, 1.9, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 증가는 T 세포 소모에 대한 증가된 저항성을 나타낸다.
일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단과 비교된 변형된 면역 효과기 세포의 소모는 시험관내 또는 생체외 제조 과정 동안 측정된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 종양 단편으로부터 단리된 TIL은 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 단리되고, 이어서 하나 이상의 라운드의 확장으로 확장되어 변형된 TIL의 집단을 생성한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 TIL의 소모는 수거 직후 및 제1 라운드의 확장 전, 제2 라운드의 확장 전의 제1 라운드의 확장 후, 그리고/또는 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 후에 결정될 수 있다. 일부 실시형태에서, 대조군 면역 세포 집단과 비교된 변형된 면역 효과기 세포의 소모를 대상체에게 변형된 면역 효과기 세포를 전달한 후 하나 이상의 시간 지점에서 측정한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 본 명세서에 기재된 방법에 따라서 생산되고, 대상체에게 투여된다. 이어서 샘플을 전달 후 다양한 시간 지점에서 대상체로부터 채취하여 시간에 따라서 생체내에서 변형된 면역 효과기 세포의 소모를 결정할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 전염증성 면역 인자의 증가된 발현 또는 생산을 나타낸다. 전염증성 면역 인자의 예는 세포용해 인자, 예컨대, 그랜자임 B, 퍼포린 및 그래눌리신; 전염증성 사이토카인, 예컨대, 인터페론(IFNα, IFNβ, IFNγ), TNFα, IL-1β, IL-12, IL-2, IL-17, CXCL8, 및/또는 IL-6을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 효과기 세포에 비해서 표적 세포에 대해서 증가된 세포독성을 나타낸다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 비변형된 면역 세포에 비해서 표적 세포에 대한 세포독성에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과의 배수 증가를 나타낸다.
면역 효과기 기능을 측정하기 위한 검정은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 종양 침윤은 대상체로부터 종양을 단리시키고, 유세포 분석법, 면역조직화학, 및/또는 면역형광에 의해서 종양에 존재하는 림프구의 총 수 및/또는 표현형을 결정함으로써 측정될 수 있다. 세포-표면 수용체 발현은 유세포 분석법, 면역조직화학, 면역형광, 웨스턴 블롯 및/또는 qPCR에 의해서 결정될 수 있다. 사이토카인 및 케모카인 발현 및 생산은 유세포 분석법, 면역조직화학, 면역형광, 웨스턴 블롯, ELISA, 및/또는 qPCR에 의해서 측정될 수 있다. 세포외자극(예를 들어, 사이토카인, 저해성 리간드 또는 항원)에 대한 반응 또는 민감성은 자극에 반응한 하류 신호전달 경로(예를 들어, 하류 신호전달 중간체의 포스포릴화)의 세포 증식 및/또는 활성화를 검정함으로써 측정될 수 있다. 세포독성은 변형된 면역 효과기 세포와 표적 세포의 시험관내 또는 생체외 공배양 및 생체내 뮤린 종양 모델, 예컨대, 실시예 전체에 기재된 것을 비롯한, 당업계에 공지된 표적-세포 용해 검정에 의해서 측정될 수 있다.
B. 내인성 경로 및 유전자의 조절
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 또는 기능을 나타내고/내거나 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템(하기에 기재됨)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 효과기 세포 반응의 활성화 및 조절에 관련된 경로에 존재한다. 이러한 실시형태에서, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 또는 기능은 면역 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시킨다.
본 명세서에 기재된 방법에 의한 조절에 적합한 예시적인 경로를 표 1에 제시한다. 일부 실시형태에서, 특정 경로에서의 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 면역 효과기 세포에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 특정 경로에서의 복수의(예를 들어, 2개 이상의) 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 면역 효과기 세포에서 감소된다. 예를 들어, 특정 경로에서 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나의 경로에서의 내인성 표적 유전자의 발현 및 또 다른 경로에서의 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 면역 효과기 세포에서 감소된다. 일부 실시형태에서, 하나의 경로에서의 복수의 내인성 표적 유전자의 발현 및 또 다른 경로에서의 복수의 내인성 표적 유전자의 발현은 변형된 면역 효과기 세포에서 감소된다. 예를 들어, 하나의 경로에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있고, 또 다른 특정 경로에서의 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소될 수 있다.
일부 실시형태에서, 복수의 경로에서의 복수의 내인성 표적 유전자의 발현이 감소된다. 예를 들어, 복수의 경로(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 경로) 각각으로부터의 하나의 내인성 유전자가 감소될 수 있다. 추가 양상에서, 복수의 경로(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 경로) 각각으로부터의 복수의 내인성 유전자(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 유전자)가 감소될 수 있다.
Figure pct00002
예시적인 내인성 표적 유전자를 하기 표 2 및 표 3에 제시한다.
일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자) 중 1종 이상의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR 중 1종 이상의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 적어도 2개의 유전자)로부터 선택된 적어도 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 1a 및 도 1b에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1 내지 600으로부터 선택된 적어도 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및/또는 BCOR의 발현을 변형시키는 예시적인 방법이 본 명세서에 기재되어 있지만, 이들 내인성 표적 유전자의 발현은 당업계에 공지된 방법에 의해서 또한 변형될 수 있다. 예를 들어, PD1(PDCD1에 의해서 암호화됨)에 대한 저해성 항체, NRP1, HACR2, LAG3, TIGIT 및 CTLA4가 당업계에 공지되어 있고, 일부는 종양학 적응증에 대해서 FDA 승인되어 있다(예를 들어, PD1의 경우 니볼루맙 및 펨브롤리주맙).
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자) 중 1종 이상의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 CD108이라고도 공지된 Semaphorin 7A(SEMA7A) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 SEMA7A 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 RNA-결합 단백질 39(RBM39) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. RBM39 단백질은 핵에서 발견되는데, 여기서 그것은 스플라이소솜 단백질과 공동화한다(colocalize). 이러한 단백질과 높은 서열 유사성을 갖는 마우스 단백질의 연구는, 이러한 단백질이 JUN/AP-1 및 에스트로겐 수용체에 대한 전사 보조활성화제로서 작용할 수 있다는 것을 시사한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 RBM39 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 BIM이라고도 일반적으로 불리는 Bcl-2-유사 단백질 11(BCL2L11) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 BCL2L11 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포 전사 인자 ERGB라고도 공지된 프리엔드 백혈병 통합 1 전사 인자(Friend leukemia integration 1 transcription factor: FLI1) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 FLI1 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 칼모듈린 2(CALM2) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 CALM2 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 다이하이드로오로테이트 데하이드로게나제 유전자(Dihydroorotate dehydrogenase gene: DHODH) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. DHODH 단백질은 내부 미토콘드리아막의 외부 표면 상에 위치된 미토콘드리아 단백질이고, 신생 피리미딘 생합성에서 다이하이드로오로테이트의 오로테이트로의 유비퀴논-매개된 산화를 촉매한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 DHODH 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 오로테이트 포스포리보실 트랜스퍼라제 또는 오로티딘-5'-데카복실라제라고도 지칭되는 유리딘 모노포스페이트 합성효소(UMPS)의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. UMPS 단백질은 다수의 중요한 생합성 경로에서 에너지-보유 분자인 유리딘 모노포스페이트(UMP)의 형성을 촉매한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 UMPS 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 시스테인 풍부 소수성 도메인 2(cysteine rich hydrophobic domain 2: CHIC2) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 암호화된 CHIC2 단백질은 시스테인-풍부 소수성(CHIC) 모티프를 함유하고, 소수포 구조 및 원형질막에 국지화되며, 급성 골수성 백혈병의 일부 케이스와 연관된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 CHIC2 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 폴리(rC)-결합 단백질 1(Poly(rC)-binding protein 1: PCBP1) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 PCBP1 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 BRG1-연관된 인자 180(BAF180)이라고도 공지된 단백질 폴리브로모-1(Protein polybromo-1: PBRM1)) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. PBRM1은 SWI/SNF-B 크로마틴-리모델링 복합체의 성분이며, 다수의 암 하위유형에서 종양 억제제 유전자이다. 돌연변이는 특히 투명 세포 신장 세포 암종에서 지배적이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 PBRM1 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 성인 및 태아 조직에서 어디에나 발현되는 WD 반복부 단백질 패밀리의 구성원인 WD 반복부-함유 단백질 6(WDR6) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. WD 반복부는 gly-his 및 trp-asp(GH-WD)에 의해서 전형적으로 둘러싸인 대략 40개의 아미노산의 최소한으로 보존되는 영역이며, 이것은 이종삼량체 또는 멀티단백질 복합체의 형성을 용이하게 할 수 있다. 이러한 패밀리의 구성원은 세포 주기 진행, 신호 형질도입, 아포토시스 및 유전자 조절을 비롯한, 다양한 세포 과정에 관여된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 WDR6 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 E2F 전사 인자 8(E2F8) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 암호화된 E2F8 단백질은 적절한 시간에 핵이 분화하는 것을 보장함으로써 G1기에서 S기로의 기능을 조절한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 E2F8 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 세르핀 패밀리 A 구성원 3(SERPINA3) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. SERPINA3은 알파 1-안티키모트립신(α1AC, A1AC 또는 a1ACT) 단백질을 암호화하는데, 이것은 특정 프로테아제, 예컨대, 카텝신 G 및 키마제(chymase)의 활성을 저해한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 SERPINA3유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 GNAS 복합체 유전자좌(GNAS) 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 그것은 다수의 신호 형질도입 경로의 주요 성분인 자극성 G-단백질 알파 소단위(Gs-α)이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 GNAS 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 ZC3H12A 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. MCPIP1 및 Regnase-1이라고도 지칭되는 Zc3h12a는 CCCH-유형 아연-핑거 모티프의 바로 상류에 RNase 도메인을 보유하는 RNase이다. 뉴클레아제 활성을 통해서, Zc3h12a는 이들 유전자의 3' UTR 내의 보존된 줄기 루프 구조에 결합함으로써, 전사체, 예컨대, IL-6의 mRNA를 표적으로 하여, 이를 탈안정화시킨다. T 세포에서, Zc3h12a는 c-Rel, Ox40 및 IL-2를 비롯한, 다수의 전염증성 유전자의 전사체 수준을 제어한다. 단핵구에서, Zc3h12a는 IL-6 및 IL-12B mRNA를 하향조절하여, 염증을 완화시킨다. 암 세포에서, Zc3h12a는 Bcl2L1, Bcl2A1, RelB 및 Bcl3을 비롯한 항-아포토시스 유전자를 저해함으로써 아포토시스를 촉진시킨다. Zc3h12a 활성화는 일시적이고, 프로테아솜-매개된 분해 또는 점막-연관된 림프 조직 1(mucosa-associated lymphoid tissue 1: MALT1) 매개된 절단을 비롯한 음성 피드백 기전에 적용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 ZC3H12A 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 MAP4K1 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. HPK1이라고도 지칭되는 MAP4K1은 포유동물 Ste20-관련 단백질 키나제의 MAP4K 패밀리의 구성원이며, 조혈 기관에서 주로 발현되는 단백질 세린-트레오닌 키나제이다. MAP4K1 단백질은 N-말단 키나제 도메인, 그 다음 Src 상동성 3 도메인을 함유하는 단백질에 결합할 수 있는 4개의 프롤린-풍부 모티프를 포함한다. 키나제, 예컨대, 예컨대, Lck 및 Zap70에 의해서 그리고 ATP의 존재 하에서의 포스포릴화 시, MAP4K1은 촉매 활성을 보유하고, 오토포스포릴화뿐만 아니라 하류 기질 단백질, 예컨대, SLP-76 및 MAP3K 단백질의 포스포릴화를 매개한다. Ser-376에서의 SLP-76의 포스포릴화는 SLP-76의 유비퀴틴화 및 프로테아솜 절단뿐만 아니라 SLP-76과 14-3-3τ의 증가된 상호작용으로 이어지는데, 이것은 TCR 신호전달을 부정적으로 조절한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 MAP4K1 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 NR4A3 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. NR4A3은 유도성 희귀 수용체이고, 스테로이드-갑상선 호르몬-레티노이드 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이고, 전사 활성화인자이다. 다양한 자극에 의해서 발현이 유도되는 경우, NR4A3은 세포질로부터 핵으로의 전좌 및 단량체로서의 NR4A1 반응 요소(NBRE) 및 동종이량체로서의 Nur 반응 요소(NurRE)에 대한 결합에 의해서 리간드-의존적인 방식으로 유전자 발현을 유도한다. 이어서, NR4A3은 면역계의 내부 및 외부 둘 다에서 세포 생존 및 분화를 제어하는 별개의 유전자 세트의 전사를 유도한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 효과기 세포는 NR4A3 유전자에서 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1, 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 2개 이상의 유전자)로부터 선택된 적어도 2종의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 3a 및 도 3b에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1176 내지 1681으로부터 선택된 적어도 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 3a에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1176 내지 1483으로부터 선택된 적어도 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 3b에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1250 내지 1265로부터 선택된 적어도 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 3b에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1266 내지 1281로부터 선택된 적어도 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 3b에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1282-1297로부터 선택된 적어도 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 1종 이상의 유전자) 중 1종 이상 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 하나 이상의 유전자) 중 1종 이상의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 예를 들어, 변형된 면역 효과기 세포는 조합물 번호 601 내지 1025로부터 선택된 내인성 표적 유전자의 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 조합물 번호 601 내지 950(도 2a에 제시된 바와 같음)으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자의 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 조합물 번호 951 내지 975(도 2b에 제시된 바와 같음)으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자의 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 조합물 번호 976 내지 1000(도 2b에 제시된 바와 같음)으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자의 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 조합물 번호 1001 내지 1025(도 2b에 제시된 바와 같음)으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자의 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 적어도 1종의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능 및 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 ZC3H12A 및 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 ZC3H12A 및 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 MAP4K1 및 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 MAP4K1 및 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 NR4A3 및 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR로부터 선택된 적어도 하나의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 NR4A3 및 TNFAIP3, CBLB 또는 BCOR로부터 선택된 적어도 하나의 유전자에서의 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3으로부터 선택된 적어도 1종의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 적어도 1종의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 ZC3H12A 및 CBLB 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 ZC3H12A 및 CBLB에서의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 MAP4K1 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 MAP4K1 및 CBLB에서의 불활성화 돌연변이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 NR4A3 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 효과기 세포는 NR4A3 및 CBLB에서의 불활성화 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 1종 이상의 유전자)로부터 선택된 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능 및 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 1종 이상의 유전자)로부터 선택된 2종의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 조합물 번호 1026 내지 1297(도 3a 및 도 3b에 제시된 바와 같음)로부터 선택된 2종의 내인성 표적 유전자 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능에 더하여 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 및 BCOR로부터 선택된 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3 (예를 들어, 표 3으로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 하나 이상의 유전자)로부터 선택된 2종의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 1a 및 도 1b에 제시된 조합물 번호 1 내지 600으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능에 더하여 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3중 임의의 하나의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 1a 및 도 1b에 제시된 조합물 번호 1 내지 600으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능에 더하여 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 1a 및 도 1b에 제시된 조합물 번호 1 내지 600으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능에 더하여 ZC3H12A의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 1a 및 도 1b에 제시된 조합물 번호 1 내지 600으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능에 더하여 MAP4K1의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 1a 및 도 1b에 제시된 조합물 번호 1 내지 600으로부터 선택된 2개의 내인성 표적 유전자 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능에 더하여 NR4A3의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 표 2로부터 선택된 복수의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능 및 표 3으로부터 선택된 복수의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 표 2로부터 선택된 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능 및 표 3으로부터 선택된 2개의 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 도 3a 및 도 3b에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1026 내지 1297로부터 선택된 2개의 유전자의 조합물 및 도 1a 및 도 1b에 제시된 바와 같은 조합물 번호 1 내지 600으로부터 선택된 2종의 유전자의 조합물의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1, 또는 BCOR 중 3개 이상의 감소된 발현 및/또는 기능 및 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3 중 3개 이상의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함할 수 있다.
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
III. 유전자-조절 시스템
본 명세서에서, 용어 "유전자-조절 시스템"은 세포에 도입될 때 내인성 표적 DNA 서열을 변형시켜서 암호화된 유전자 생성물의 발현 또는 기능을 조절할 수 있는 단백질, 핵산 또는 이들의 조합물을 지칭한다. shRNA, siRNA, 아연-핑거 뉴클레아제 시스템, TALEN 시스템 및 CRISPR/Cas 시스템을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 본 개시내용의 방법에 사용하기에 적합한 다수의 유전자 편집 시스템이 당업계에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "조절한다"는, 내인성 표적 유전자에 대한 유전자-조절 시스템의 효과와 관련하여 사용되는 경우, 내인성 표적 유전자의 서열에서의 임의의 변화, 내인성 표적 유전자의 후성적 상태에서의 변화 및/또는 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 발현 또는 기능에서의 임의의 변화를 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 예를 들어, 내인성 표적 서열 내의 하나 이상의 돌연변이의 도입에 의해서, 예컨대, 내인성 표적 서열 내의 하나 이상의 핵산의 삽입 또는 결실에 의해서, 내인성 표적 유전자의 서열에서의 변화를 매개할 수 있다. 내인성 표적 서열의 변경을 매개할 수 있는 예시적인 기전은 비-상동성 말단 연결(non-homologous end joining: NHEJ)(예를 들어, 통상적이거나 대안적임), 마이크로상동성-매개된 말단 연결(microhomology-mediated end joining: MMEJ), 상동성-유도된 수선(homology-directed repair)(예를 들어, 내인성 공여자 주형 매개된), SDSA(합성 의존성 가닥 어닐링), 단일 가닥 어닐링 또는 단일 가닥 침범을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 서열의 후성적 상태에서의 변화를 매개할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자 DNA의 공유 변형(예를 들어, 사이토신 메틸화 및 하이드록시메틸화) 또는 연관된 히스톤 단백질의 공유 변형(예를 들어, 라이신 아세틸화, 라이신 및 아르기닌 메틸화, 세린 및 트레오닌 포스포릴화 및 라이신 유비퀴틴화 및 수모화(sumoylation))을 매개할 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 단백질의 발현의 변화를 매개할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 내인성 표적 DNA 서열의 변형에 의해서, 또는 DNA 서열에 의해서 암호화된 mRNA 생성물에 작용함으로써 암호화된 단백질의 발현을 조절할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 변형된 내인성 단백질의 발현을 초래할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템에 의해서 매개된 내인성 DNA 서열에 대한 변형은 내인성 단백질의 발현을 초래하는데, 이는 비변형된 면역 효과기 세포에서 상응하는 내인성 단백질과 비교할 때 감소된 기능을 입증한다. 이러한 실시형태에서, 변형된 내인성 단백질의 발현 수준은 증가되거나 감소될 수 있고, 비변형된 면역 세포에서 상응하는 내인성 단백질의 발현 수준과 동일하거나 실질적으로 유사할 수 있다.
A. 핵산-기반 유전자-조절 시스템
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 외인성 단백질에 대한 요건 없이 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 1종 이상의 핵산 분자를 포함하는 시스템이다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표적 핵산 서열에 상보적인 RNA 간섭 분자 또는 안티센스 RNA 분자를 포함한다.
"안티센스 RNA 분자"는 mRNA 전사체와 상보적인, 길이에 무관한 RNA 분자를 지칭한다. 안티센스 RNA 분자는 세포, 조직 또는 대상체에 도입되어 내인성 유전자 침묵 경로에 좌우되지 않지만, 그 보다는 표적 mRNA 전사체의 RNAeH-매개된 분해에 좌우되는 기전을 통해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현을 감소시킬 수 있는 단일 가닥 RNA 분자를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산은 변형된 골격, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트 또는 당업계에 공지된 다른 것을 포함하거나, 또는 비-자연 인터뉴클레오사이드 링키지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 안티센스 핵산은 잠금 핵산(LNA)을 포함할 수 있다.
"RNA 간섭 분자"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 내인성 유전자 침묵 경로(예를 들어, Dicer 및 RNA-유도된 침묵 복합체(RNA-induced silencing 복합체: RISC))를 통한 표적 mRNA의 분해에 의해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현 감소를 매개하는 RNA 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 예시적인 RNA 간섭제는 마이크로 RNA(본 명세서에서 "miRNA"라고도 지칭됨), 짧은 헤어-핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA), RNA 압타머 및 몰폴리노를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 miRNA를 포함한다. miRNA는 약 21 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 자연 발생, 작은 비-암호 RNA 분자를 지칭한다. miRNA는 1종 이상의 표적 mRNA 분자에 적어도 부분적으로 상보적이다. miRNA는 번역 억압, mRNA의 절단 및/또는 탈아데닐화를 통해서 내인성 표적 유전자 생성물의 발현을 하향조절(예를 들어, 감소)할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 shRNA를 포함한다. shRNA는 줄기-루프 구조를 형성하고, 상보적 mRNA 서열의 분해를 유발하는 약 50 내지 70개 뉴클레오타이드 길이의 단일 가닥 RNA 분자이다. shRNA는 플라스미드 또는 비-복제 재조합 바이러스 벡터에서 클로닝되어 세포내로 도입되어, 게놈 내의 shRNA-암호화 서열의 통합을 초래할 수 있다. 이와 같이, shRNA는 내인성 표적 유전자 번역 및 발현의 안정적이고 일관된 억제를 제공할 수 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 siRNA를 포함한다. siRNA는 전형적으로 약 21 내지 23개 뉴클레오타이드 길이의 이중 가닥 RNA 분자를 지칭한다. siRNA는 RNA-유도된 침묵 복합체(RISC)라고 불리는 멀티 단백질 복합체와 회합하고, 그 동안 "패신저" 센스 가닥이 효소에 의해서 절단된다. 이어서 서열 상동성으로 인해서, 활성화된 RISC에 함유된 안티센스 "가이드" 가닥이 RISC를 상응하는 mRNA로 안내하고, 동일한 뉴클레아제가 표적 mRNA를 절단하여, 특이적 유전자 침묵을 초래한다. 최적으로, siRNA는 18, 19, 20, 21, 22, 23 또는 24개의 뉴클레오타이드 길이이고, 3' 단부에 2 염기 오버행을 갖는다. siRNA는 개별 세포 및/또는 배양 시스템에 도입되어, 표적 mRNA 서열의 분해를 초래할 수 있다. siRNA 및 shRNA는 문헌[Fire et al., Nature, 391:19, 1998] 및 미국 특허 제7,732,417호; 제8,202,846호; 및 제8,383,599호에 추가로 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 몰폴리노를 포함한다. "몰폴리노"는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 변형된 핵산 올리고머를 지칭하며, 여기서 표준 핵산 염기가 몰폴리노 고리에 결합되어 있고, 포스포로다이아미데이트 링키지를 통해서 연결된다. siRNA 및 shRNA에 유사하게, 몰폴리노는 상보적 mRNA 서열에 결합한다. 그러나, 몰폴리노는 분해를 위해서 상보성 mRNA 서열을 표적화하기 보다는 mRNA 번역 및 mRNA 스플라이싱의 변경을 통해서 기능한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR(즉, 표 2에 열거된 것)로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 본 출원 전체에서, 언급된 게놈 좌표는 미국 국립생물공학정보센터(National Center for Biotechnology Information) 웹사이트에서 입수 가능한 Genome Reference Consortium으로부터의 인간 게놈의 GRCh38(hg38이라고도 지칭됨) 어셈블리의 게놈 주석에 기초한다. 하나의 어셈블리와 또 다른 것 간의 게놈 좌표를 전환시키는 툴(tool) 및 방법은 당업계에 공지되어 있고, 이를 사용하여 본 명세서에 제공된 게놈 좌표를 인간 게놈의 또 다른 어셈블리에서 상응하는 좌표로 전환시킬 수 있으며, 이는 동일한 기관에 의해서 또는 동일한 알고리즘을 사용하여 생성된 초기 어셈블리에 대한 전환(예를 들어, GRCh38로부터 GRCh37로), 및 상이한 기관 또는 알고리즘에 의해서 생성된 어셈블리의 전환(예를 들어, GRCh38로부터 NCBI33으로, International Human Genome Sequencing Consortium에 의해서 생성됨)을 포함한다. 당업계에 공지된 사용 가능한 방법 및 툴은 NCBI Genome Remapping Service(미국 국립생물공학정보센터로부터 입수 가능), UCSC LiftOver(UCSC Genome Brower 웹사이트로부터 입수 가능), 및 Assembly Converter(Ensembl.org 웹사이트에서 입수 가능)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 서열번호 499 내지 524 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 BCOR의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 서열번호 708 내지 772 또는 서열번호 708 내지 764 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 TNFAIP3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있고, 서열번호 348 내지 396 또는 서열번호 348 내지 386 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 당업계에 공지된 것으로부터 선택된 siRNA 분자 또는 shRNA 분자, 예컨대, 상업 공급원, 예컨대, 시그마 알드리치사(Sigma Aldrich), 다마콘사(Dharmacon), 써모피셔사(ThermoFisher) 등으로부터 입수 가능한 siRNA 및 shRNA 작제물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 CBLB이고, 핵산 분자는 서열번호 41 내지 44(국제 PCT 공개 제2018156886호 참고)로부터 선택된 또는 서열번호 45 내지 53(국제 PCT 공개 제WO 2017120998호)으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 shRNA이다. 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 CBLB이고, 핵산 분자는 서열번호 54 내지 63(국제 PCT 공개 제WO 2018006880호 참고)으로부터 선택된 또는 서열번호 64 내지 73(국제 PCT 공개 제WO2018120998호 및 제WO 2018137293호)으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 siRNA이다.
일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 TNFAIP3이고, 핵산 분자는 서열번호 74 내지 95로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 shRNA이다(미국 특허 제8,324,369호 참고). 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 TNFAIP3이고, 핵산 분자는 서열번호 96 내지 105로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 siRNA이다(국제 PCT 공개 제WO 2018006880호 참고).
일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 CTLA4이고, 핵산 분자는 서열번호 128 내지 133으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 shRNA이다(국제 PCT 공개 제WO 2017120996호 참고). 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 CTLA4이고, 핵산 분자는 서열번호 134 내지 143(국제 PCT 공개 제WO2017120996호, 제WO 2017120998호, 제WO 2018137295호 및 제WO 2018137293호 참고)으로부터 선택된 또는 서열번호 144 내지 153(국제 PCT 공개 제WO 2018006880호)으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 siRNA이다.
일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 PDCD1이고, 핵산 분자는 서열번호 106 내지 107로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 shRNA이다(국제 PCT 공개 제WO 2017120996호 참고). 일부 실시형태에서, 내인성 표적 유전자는 PDCD1이고, 핵산 분자는 서열번호 108 내지 117(국제 PCT 공개 제WO2017120996호, 제WO 201712998호, 제WO 2018137295호 및 제WO 2018137293호 참고)으로부터 선택된 또는 서열번호 118 내지 127(국제 PCT 공개 제WO 2018006880호)으로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 siRNA이다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(즉, 표 3에 열거된 것)로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 6A 내지 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 서열번호 814 내지 1566 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 6A 또는 표 6B 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 서열번호 814 내지 1064 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 6C 또는 표 6D 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 서열번호 1065 내지 1509 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 서열번호 1065 내지 1264 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 MAP4K1의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 6E 또는 표 6F 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 서열번호 510 내지 1538 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 NR4A3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 표 6G 또는 표 6H 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 서열번호 1539 내지 1566 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하는 핵산 분자(예를 들어, siRNA, shRNA, RNA 압타머 또는 몰폴리노)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 당업계에 공지된 것으로부터 선택된 siRNA 분자 또는 shRNA 분자, 예컨대, 상업 공급원, 예컨대, 시그마 알드리치사, 다마콘사, 써모피셔사 등으로부터 입수 가능한 것을 포함한다. 예시적인 siRNA 및 shRNA 작제물은 하기 표 4A 및 표 4B에 기재되어 있다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 당업계에 공지된 것으로부터 선택된 2개 이상의 siRNA 분자, 예컨대, 표 4A에 기재된 siRNA 작제물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산-기반 유전자-조절 시스템은 당업계에 공지된 것으로부터 선택된 2개 이상의 shRNA 분자, 예컨대, 표 4B에 기재된 shRNA 작제물을 포함한다.
[표 4a]
Figure pct00006
Figure pct00007
'
Figure pct00008
[표 4b]
Figure pct00009
Figure pct00010
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 핵산 분자(예를 들어, 2종 이상의 siRNA, 2종 이상의 shRNA, 2종 이상의 RNA 압타머 또는 2종 이상의 몰폴리노)를 포함하며, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA에 결합하고, 핵산 분자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA에 결합한다.
일부 실시형태에서, 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 대한 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나 및 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 6A 내지 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1566 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 대한 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나 및 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 6A 내지 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 CBLB의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 ZC3H12A의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 대한 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나 및 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 6C 또는 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 ZC3H12A 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1264 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 MAP4K1의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 대한 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나 및 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 6E 또는 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 MAP4K1의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 NR4A3의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 대한 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나 및 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 표 6G 또는 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2개 이상의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합하고, 여기서 핵산 분자 중 적어도 하나는 NR4A3의 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적 RNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 핵산 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나에 의해서 암호화된 RNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 RNA 서열에 결합한다.
B. 단백질-기반 유전자-조절 시스템
일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 핵산 가이드 분자에 대한 요건 없이 서열 특이적 방식으로 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 1종 이상의 단백질을 포함하는 시스템이다. 일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 아연-핑거 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질-기반 유전자-조절 시스템은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(TALEN) 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 이러한 실시형태를 본 명세서에서 "TALEN"로 지칭한다.
1. 아연 핑거 시스템
아연 핑거-기반 시스템은 2개의 단백질 도메인: 아연 핑거 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. "아연 핑거 DNA 결합 도메인", "아연 핑거 단백질", 또는 "ZFP"는 하나 이상의 아연 핑거를 통해서 서열 특이적 방식으로 DNA에 결합하는 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인인데, 이것은 구조가 아연 이온의 배위를 통해서 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 표적 DNA 서열에 대한 결합에 의해서, 아연 핑거 도메인은 그 서열 부근에서 효소 도메인의 활성도를 지시하고, 따라서 표적 서열 부근에서 내인성 표적 유전자의 변형을 유도한다. 아연 핑거 도메인은 사실상 임의의 목적하는 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 따라서, 절단 또는 재조합이 바람직한 표적 DNA 서열을 함유하는 표적 유전자 유전자좌(예를 들어, 표 2 또는 표 3에 언급된 표적 유전자에서의 표적 유전자좌)를 식별한 후, 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인은 표적 유전자 유전자좌에서 하나 이상의 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 세포에서 아연 핑거 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 융합 단백질의 발현은, 표적 유전자 유전자좌에서 변형을 달성한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 1종 이상의 아연 핑거를 포함한다(Miller et al. (1985) EMBO J. 4:1609-1614; Rhodes (1993) Scientific American Febuary:56-65; 미국 특허 제6,453,242호). 전형적으로, 단일 아연 핑거 도메인은 약 30개 아미노산 길이이다. 개별 아연 핑거는 3개-뉴클레오타이드(즉, 삼중) 서열(또는 1개 뉴클레오타이드에 의해서, 인접한 아연 핑거의 4개-뉴클레오타이드 결합 부위와 중첩할 수 있는 4개-뉴클레오타이드 서열)에 결합한다. 따라서 결합하도록 아연 핑거 결합 도메인이 조작된 서열(예를 들어, 표적 서열)의 길이는 조작된 아연 핑거 결합 도메인에서 아연 핑거의 수를 결정할 것이다. 예를 들어, 핑거 모티프가 중첩 하위부위에 결합하지 않은 ZFP의 경우, 6개-뉴클레오타이드 표적 서열이 2개-핑거 결합 도메인에 의해서 결합되고; 9개-뉴클레오타이드 표적 서열이 3개-핑거 결합 도메인에 의해서 결합되고, 그 등등이다. 표적 부위 내의 개별 아연 핑거에 대한 결합 부위(즉, 하위부위)는 인접할 필요는 없지만, 멀티-핑거 결합 도메인 내의 아연 핑거 사이(즉, 인터-핑거 링커)의 아미노산 서열의 길이 및 본성에 따라서, 하나 또는 몇몇 뉴클레오타이드에 의해서 분리될 수 있다. 일부 실시형태에서, 개별 ZFN의 DNA-결합 도메인은 3 내지 6개의 개별 아연 핑거 반복부를 포함하고, 이것은 각각 9 내지 18개 염기쌍을 인식할 수 있다.
아연 핑거 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다(예를 들어, 문헌[Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416] 참고). 조작된 아연 핑거 결합 도메인은 자연 발생 아연 핑거 단백질에 비해서 신규한 결합 특이성을 가질 수 있다. 조작 방법은 합리적 설계 및 다양한 유형의 선택을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
아연 핑거 도메인에 의한 결합을 위한 표적 DNA 서열의 선택은 예를 들어, 미국 특허 제6,453,242호에 개시된 방법에 따라 달성될 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 간단한 육안 검사를 표적 DNA 서열의 선택에 또한 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 본 명세서에 기재된 방법에서 표적 DNA 서열 선택을 위한 임의의 수단이 사용될 수 있다. 표적 부위는 일반적으로 길이가 적어도 9개 뉴클레오타이드이고, 따라서 적어도 3개의 아연 핑거를 포함하는 아연 핑거 결합 도메인에 의해 결합된다. 그러나, 예를 들어, 4개-핑거 결합 도메인의 12개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합, 5개-핑거 결합 도메인의 15개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합, 또는 6개-핑거 결합 도메인의 18개-뉴클레오타이드 표적 부위에 대한 결합이 또한 가능하다. 보다 큰 결합 도메인(예컨대, 7개-, 8개-, 9개-핑거 및 그 초과)의 보다 긴 표적 부위에 대한 결합이 또한 가능하다는 것이 명백할 것이다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 CBLB의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 BCOR의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 708 내지 772 또는 서열번호 708 내지 764 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 TNFAIP3의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 348 내지 396 또는 서열번호 348 내지 386 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 6A 내지 표 6H 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 814 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 6A 또는 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 ZC3H12A의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 6C 또는 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 1065 내지 1264 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 MAP4K1 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 6E 또는 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 NR4A3 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 표 6G 또는 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인은 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 아연 핑거 시스템은 당업계에 공지된 것, 예컨대, 상업적인 공급원, 예컨대, 시그마 알드리치사로부터 입수 가능한 것으로부터 선택된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 아연 핑거 시스템은 본 명세서에 공지된 것, 예컨대, 하기 표 7에 기재된 것으로부터 선택된다.
Figure pct00011
Figure pct00012
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2종 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하며, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 6A 내지 표 6H 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 6A 또는 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 ZC3H12A의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 6C 또는 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 ZC3H12A 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1264 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 MAP4K1 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 6D 또는 표 6E에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 선택된 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 MAP4K1 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 NR4A3 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 표 6F 또는 표 6G에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 아연 핑거 결합 도메인을 포함하는 2개 이상의 ZFP-융합 단백질을 포함하고, 여기서 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 선택된 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 NR4A3 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 아연 핑거 결합 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
아연 핑거 융합 단백질의 효소 도메인 부분은 엔도- 또는 엑소뉴클레아제로부터 얻을 수 있다. 효소 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소 엔도뉴클레아제를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다(예를 들어, 문헌[2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, Mass.; 및 Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388] 참고). DNA를 절단하는 추가적인 효소가 공지되어 있다(예를 들어, 51 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNaseI; 마이크로코쿠스 뉴클레아제(micrococcal nuclease); 효모 HO 엔도뉴클레아제(또한 문헌[Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993] 참고). 이들 효소(또는 이의 기능성 단편) 중 1종 이상은 절단 도메인의 공급원으로서 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 ZFP의 효소 도메인으로서 사용하기에 적합한 예시적인 제한 엔도뉴클레아제(제한 효소)는 다수의 종에서 존재하고, DNA에(인식 부위에서) 서열 특이적으로 결합할 수 있고, 결합 부위에서 또는 그 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소(예를 들어, 타입 IIS)는 인식 부위로부터 제거된 부위에서 DNA를 절단하고, 분리 가능한 절단 도메인 및 결합 도메인을 갖는다. 예를 들어, 타입 IIS 효소 FokI은 하나의 가닥 상의 인식 부위로부터의 9개 뉴클레오타이드에서 그리고 나머지 상의 인식 부위로부터의 13개 뉴클레오타이드에서, DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다(예를 들어, 미국 특허 제5,356,802호; 제5,436,150호 및 제5,487,994호뿐만 아니라; 문헌[Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31, 978-31, 982] 참고). 따라서, 일 실시형태에서, 융합 단백질은 적어도 하나의 타입 IIS 제한 효소로부터의 효소 도메인 및 하나 이상의 아연 핑거 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리 가능한 예시적인 타입 IIS 제한 효소는 FokI이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다(문헌[Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575] 참고). 따라서, 아연 핑거-FokI 융합체를 사용한 표적화된 이중 가닥 DNA 절단을 위해서, 각각 FokI 효소 도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질을 사용하여 촉매 활성 절단 도메인을 재구성할 수 있다. 대안적으로, 아연 핑거 결합 도메인 및 2개의 FokI 효소 도메인을 함유하는 단일 폴리펩타이드 분자를 또한 사용할 수 있다. FokI 효소 도메인을 포함하는 예시적인 ZFP가 미국 특허 제9,782,437호에 기재되어 있다.
2. TALEN 시스템
TALEN-기반 시스템은 TAL 효과기 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함한다. 이것은 TAL 효과기 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인(DNA 가닥을 절단하는 뉴클레아제)에 융합시킴으로써 제조된다. 위에서 기재된 FokI 제한 효소는 TALEN-기반 유전자-조절 시스템에 사용하기에 적합한 예시적인 효소 도메인이다.
TAL 효과기는 식물을 감염시키는 타입 III 분비 시스템을 통해서 잔토모나스(Xanthomonas) 박테리아에 의해서 분비되는 단백질이다. DNA 결합 도메인은 분기하는 제12 및 제13 아미노산을 갖는 반복되고 고도로 보존된 33 내지 34 아미노산 서열을 함유한다. 반복 가변 이잔기(Repeat Variable Diresidue: RVD)라고 지칭되는 이러한 2개의 위치는 고도로 가변성이고, 특이적 뉴클레오타이드 인식과 강하게 상관관계가 있다. 따라서, TAL 효과기 도메인은 적절한 RVD를 함유하는 반복 분절의 조합물을 선택함으로써 특이적 표적 DNA 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. RVD 조합물에 대한 핵산 특이성은 하기와 같다: HD는 사이토신을 표적으로 하고, NI 표적은 아데닌을 표적으로 하고, NG는 티민을 표적으로 하고, NN은 구아닌을 표적으로 한다(하지만, 일부 실시형태에서, NN은 더 낮은 특이성로 아데닌에 결합할 수 있다).
일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 BCOR 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 서열번호 708 내지 772 또는 서열번호 708 내지 764 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 TNFAIP3의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 서열번호 348 내지 396 또는 서열번호 348 내지 386 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 6A 내지 표 6H 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 814 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 6A 또는 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 ZC3H12A의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 6C 또는 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 1065 내지 1264 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 MAP4K1 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 6E 또는 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 NR4A3 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 표 6G 또는 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인은 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하며, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1, 및 NR4A3으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 6A 내지 표 6H 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 6A 또는 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 CBLB의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 ZC3H12A의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 6C 또는 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 ZC3H12A 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1264 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 MAP4K1 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 6D 또는 표 6E에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 MAP4K1 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 NR4A3 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 표 6F 또는 표 6G에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 각각 TAL 효과기 도메인을 포함하는 2개 이상의 TAL 효과기-융합 단백질을 포함하고, 여기서 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열에 결합하고, TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 NR4A3 유전자의 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하고, 2개 이상의 TAL 효과기 도메인 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
TAL-효과기 반복부를 조립하기 위한 방법 및 조성물은 당업계에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Cermak et al, Nucleic Acids Research, 39:12, 2011, e82] 참고). TAL-효과기 반복부의 작제를 위한 플라스미드는 애드젠사(Addgene)로부터 상업적으로 입수 가능하다.
C. 조합 핵산/단백질-기반 유전자-조절 시스템
조합 유전자-조절 시스템은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드 및 핵산 가이드 분자를 포함한다. 본 명세서에서, "부위-지향된 변형 폴리펩타이드"는 핵산 가이드 분자에 결합하고, 결합되는 핵산 가이드 분자에 의해서 표적 핵산 서열(예를 들어, 내인성 표적 DNA 또는 RNA 서열)에 표적화되고, (예를 들어, 표적 핵산 서열의 절단, 돌연변이 또는 메틸화에 의해서) 표적 핵산 서열을 변형시키는 폴리펩타이드를 지칭한다.
부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 2개의 부분, 즉, 핵산 가이드에 결합하는 부분 및 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 부위-지향 효소 활성(예를 들어, DNA 메틸화, DNA 또는 RNA 절단, 히스톤 아세틸화, 히스톤 메틸화 등)을 나타내는 활성 부분을 포함하며, 여기서 효소 활성 부위는 가이드 핵산에 의해서 결정된다. 일부 경우에, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 내인성 표적 핵산 서열을 변형시키는 효소 활성(예를 들어, 뉴클레아제 활성, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, DNA 수선 활성, DNA 손상 활성, 탈아민화 활성, 디스무타제(dismutase) 활성, 알킬화 활성, 탈퓨린화(depurination) 활성, 산화 활성, 피리미딘 이량체 형성 활성, 인테그라제 활성, 트랜스포사제 활성, 재조합효소 활성, 중합효소 활성, 리가제 활성, 헬리카제 활성, 포톨리아제(photolyase) 활성 또는 글리코실라제 활성)을 갖는 활성 부분을 포함한다. 다른 경우에, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 내인성 표적 핵산 서열과 회합되는 폴리펩타이드(예를 들어, 히스톤)를 변형시키는 효소 활성(예를 들어, 메틸트랜스퍼라제 활성, 데메틸라제 활성, 아세틸트랜스퍼라제 활성, 데아세틸라제 활성, 키나제 활성, 포스파타제 활성, 유비퀴틴 리가제 활성, 탈유비퀴틴화 활성, 아데닐화 활성도, 탈아데닐화 활성, 수모화 활성, 탈수모화 활성, 리보실화 활성, 탈리보실화 활성, 미리스토일화 활성 또는 탈미리스토일화 활성)을 갖는 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 표적 DNA 서열의 전사를 조절(예를 들어, 전사를 증가시키거나 감소시킴)하는 활성 부분을 포함한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 표적 RNA 서열의 발현 또는 번역을 조절(예를 들어, 전사를 증가시키거나 감소시킴)하는 활성 부분을 포함한다.
핵산 가이드는 2개의 부분, 즉, 내인성 표적 핵산 서열과 상보적이고, 이와 결합할 수 있는 제1 부분(본 명세서에서 "핵산-결합 분절"이라고 지칭), 및 부위-지향된 변형 폴리펩타이드와 상호작용할 수 있는 제2 부분(본 명세서에서 "단백질-결합 분절"이라고 지칭)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 핵산 가이드의 핵산-결합 분절 및 단백질-결합 분절은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 핵산 가이드의 핵산-결합 분절 및 단백질-결합 분절은 각각 별개의 폴리뉴클레오타이드 분자 내에 포함되어, 핵산 가이드는 서로와 회합되어 기능성 가이드를 형성하는 2개의 폴리뉴클레오타이드 분자를 포함한다.
핵산 가이드는 표적 핵산 서열과 특이적으로 혼성화함으로써 조합된 단백질/핵산 유전자-조절 시스템의 표적 특이성을 매개한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 RNA 서열, 예컨대, 표적 유전자의 mRNA 전사체 내에 포함된 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 표적 유전자의 DNA 서열 내에 포함된 DNA 서열이다. 본 명세서에서 표적 유전자에 대한 언급은 복수의 표적 유전자 유전자좌(즉, 특정 표적 유전자 서열의 부분(예를 들어, 엑손 또는 인트론))를 포함하는 특정 유전자에 대한 전장 DNA 서열을 포함한다. 각각의 표적 유전자 유전자좌 내에는 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템에 의해서 변형될 수 있는 본 명세서에서 "표적 DNA 서열"이라고 지칭되는 DNA 서열의 더 짧은 스트레치가 존재한다 추가로, 각각의 표적 유전자 유전자좌는 "표적 변형 부위"를 포함하는데, 이것은 유전자-조절 시스템에 의해서 유도된 변형의 정확한 위치(예를 들어, 삽입, 결실 또는 돌연변이의 위치, DNA 브레이크의 위치 또는 후성적 변형의 위치)를 지칭한다.
본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 단일 핵산 가이드를 포함할 수 있거나 또는 복수의 핵산 가이드(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 초과의 핵산 가이드)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 조합된 단백질/핵산 유전자-조절 시스템은 알고너트(Argonaute)(Ago) 단백질(예를 들어, 티. 써모필레스(T. thermophiles) Ago 또는 TtAgo)로부터 유래된 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 티. 써모필레스 Ago DNA 엔도뉴클레아제이고, 핵산 가이드는 가이드 DNA(gDNA)이다(문헌[Swarts et al., Nature 507 (2014), 258-261] 참고). 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 gDNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, gDNA-암호화 핵산은 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 TtAgo 부위-지향된 변형 폴리펩타이드 또는 이의 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, TtAgo 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 편집 시스템은 CRISPR(짧은 회문 구조 반복 서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats))/Cas (CRISPR 연관된) 뉴클레아제 시스템이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 클래스 2 시스템이다. 클래스 2 CRISPR/Cas 시스템은 3개의 유형으로 나뉜다: 타입 II, 타입 V 및 타입 VI 시스템. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas9 단백질을 사용하는 클래스 2 타입 II 시스템이다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas9 DNA 엔도뉴클레아제(또는 이의 변이체)이고, 핵산 가이드 분자는 가이드 RNA(gRNA)이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas12 단백질(예를 들어, Cas12a(Cpf1이라고도 공지됨), Cas12b(C2c1이라고도 공지됨), Cas12c(C2c3이라고도 공지됨), Cas12d(CasY라고도 공지됨), 및 Cas12e(CasX라고도 공지됨))를 사용하는 클래스 2 타입 V 시스템이다. 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas12 DNA 엔도뉴클레아제(또는 이의 변이체)이고, 핵산 가이드 분자는 gRNA이다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 시스템은 Cas13 단백질(예를 들어, Cas13a(C2c2라고도 공지됨), Cas13b 및 Cas13c)을 사용하는 클래스 2 및 타입 VI 시스템이다(문헌[Pyzocha et al., ACS Chemical Biology, 13(2), 347-356] 참고). 이러한 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas13 RNA 리보엔도뉴클레아제이고, 핵산 가이드 분자는 gRNA이다.
Cas 폴리펩타이드는 gRNA 분자와 상호작용할 수 있거나 gRNA 분자와 협력하여, 표적 DNA 또는 표적 RNA 서열에 귀소 또는 국지화할 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. Cas 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas 단백질 및 자연 발생 Cas 서열로부터 1개 이상의 아미노산 잔기가 다른 조작된, 변경된 또는 달리 변형된 Cas 단백질을 포함한다.
가이드 RNA(gRNA)는 2개의 분절, DNA-결합 분절 및 단백질-결합 분절을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA의 단백질-결합 분절은 하나의 RNA 분자에 포함되고, DNA-결합 분절은 또 다른 별개의 RNA 분자에 포함된다. 이러한 실시형태를 본 명세서에서 "이중-분자 gRNA" 또는 "2-분자 gRNA" 또는 "이중 gRNA"로 지칭한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 RNA 분자이고, 본 명세서에서 "단일-가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로 지칭된다. 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 2-분자 가이드 RNA 및 sgRNA로 지칭되는 것 둘 다를 포함한다.
gRNA의 단백질-결합 분절은 서로에 혼성화하여 이중 가닥 RNA 듀플렉스(dsRNA 듀플렉스)를 형성하는 뉴클레오타이드의 2개의 상보적인 스트레치를 부분적으로 포함하며, 이것은 Cas 단백질에 대한 결합을 용이하게 한다. gRNA의 핵산-결합 분절(또는 "핵산-결합 서열")은 특이적 표적 핵산 서열에 상보적이고, 이와 결합할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. gRNA의 단백질-결합 분절은 Cas 폴리펩타이드와 상호작용하고, gRNA 분자와 부위-지향된 변형 폴리펩타이드의 상호작용은 내인성 핵산 서열에 대한 Cas 결합을 야기하여, 표적 핵산 서열 내에 또는 그 주변에 하나 이상의 변형을 생성시킨다. 표적 변형 부위의 정확한 위치는 (i) gRNA와 표적 핵산 서열 간의 염기-짝지움 상보성; 및 (ii) 표적 DNA 서열 내의 프로토스페이서 인접한 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)로서 지칭되는, 짧은 모티프의 위치(표적 RNA 서열 내의 프로토스페이서 측접 서열(protospacer flanking sequence: PFS)로서 지칭됨)에 의해서 결정된다. PAM/PFS 서열은 표적 핵산 서열에 대한 Cas 결합에 필요하다. 다양한 PAM/PFS 서열은 당업계에 공지되어 있고, 특정 Cas 엔도뉴클레아제(예를 들어, Cas9 엔도뉴클레아제)와의 사용에 적합하다(예를 들어, 문헌[Nat Methods. 2013 Nov; 10(11): 1116-1121 및 Sci Rep. 2014; 4: 5405] 참고). 일부 실시형태에서, PAM 서열은 표적 DNA 서열 내의 표적 변형 부위의 50개 염기쌍 내에 위치된다. 일부 실시형태에서, PAM 서열은 표적 DNA 서열 내의 표적 변형 부위의 10개 염기쌍 내에 위치된다. 이러한 방법에 의해서 표적화될 수 있는 DNA 서열은 표적 변형 부위에 대한 PAM 서열의 상대적인 거리 및 서열-특이적, gRNA-매개된 Cas 결합을 매개하는 고유한 20개 염기쌍 서열의 존재에 의해서만 제한된다. 일부 실시형태에서, PFS 서열은 표적 RNA 서열의 3' 단부에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 5' 말단에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 3' 단부에 위치된다. 일부 실시형태에서, 표적 변형 부위는 표적 유전자좌의 인트론 또는 엑손 내에 위치된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, gRNA-암호화 핵산은 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터에 포함된다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 발현 벡터, 예를 들어, 재조합 발현 벡터 내에 포함된다.
1. Cas 단백질
일부 실시형태에서, 부위-지향된 변형 폴리펩타이드는 Cas 단백질이다. 다양한 종의 Cas 분자가 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물에 사용될 수 있고, 에스. 피오게네스(S. pyogenes), 에스. 아우레우스(S. aureus), 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis), 에스. 써모필레스(S. thermophiles), 아시도보락스 아베내(Acidovorax avenae), 악티노바실루스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 악티노바실루스 수시노게네스(Actinobacillus succinogenes), 악티노바실루스 수이스(Actinobacillus suis), 악티노마이세스 종(Actinomyces sp.), 시클리필루스데니트리피칸스(Cycliphilusdenitrificans), 아미노모나스 파우시보란스(아미노monas paucivorans), 바실루스 세레우스(Bacillus cereus), 바실루스 스미티이(Bacillus smithii), 바실루스 투린기엔시스(Bacillus thuringiensis), 박테로이데스 종(Bacteroides sp.), 블라스토피렐룰라 마리나(Blastopirellula marina), 브라디리조븀 종(Bradyrhizobium sp.), 브레비바실루스 라테로스폭수스(Brevibacillus laterospoxus), 캄필로박터 콜라이(Campylobacter coli), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 칸디다투스 푸니세이스피릴룸(Candidatus Puniceispirillum), 클로스트리디움 셀룰로리티쿰(Clostridium cellulolyticum), 클로스트리디움 페르프린겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 악콜렌스(Corynebacterium accolens), 코리네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 코리네박테리움 마트루코티(Corynebacterium matruchotii), 디노로세오박터 쉬배(Dinoroseobacter shibae), 유박테리움 돌리춤(Eubacterium dolichum), 감마 프로테오박테리움(Gamma proteobacterium), 글루코나세토박터 디아조트로피쿠스(Gluconacetobacter diazotrophicus), 헤모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 헤모필루스 스푸토룸(Haemophilus sputorum), 헬리코박터 카나덴시스(Helicobacter canadensis), 헬리코박터 시나에디(Helicobacter cinaedi), 헬리코박터 무스텔라(Helicobacter mustelae), 일리오박터 폴리트로푸스(Ilyobacter polytropus), 킨겔라 킨가에(Kingella kingae), 락토바실러스 크리스파투스(Lactobacillus crispatus), 리스테리아 이바노비(Listeria ivanovii), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 리스테리아세 박테리움(Listeriaceae bacterium), 메틸로시스티스 종(Methylocystis sp.) 메틸로시너스 트리코스포리움(Methylosinus trichosporium), 모빌룬커스 물리에리스(Mobiluncus mulieris), 네이세리아 바실리포미스(Neisseria bacilliformis), 네이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 네이세리아 플라베센스(Neisseria flavescens), 네이세리아 락타미카, 네이세리아 메닌기티디스, 네이세리아 종(Neisseria sp.) 네이세리아 와드워티(Neisseria wadsworthii), 니트로소모나스 종(Nitrosomonas sp.), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 파스테우렐라 물토시다(Pasteurella multocida), 파스콜락토박테리움 숙시나투텐스(Phascolarctobacterium succinatutens), 랄스토니아 시지기(Ralstonia syzygii), 로도슈모나스 팔루스트리스(Rhodopseudomonas palustris), 로도불룸 종(Rhodovulum sp.), 시몬시엘라 무엘레리(Simonsiella muelleri), 스핑고모나스 종(Sphingomonas sp.), 스포로락토바실러스 비니애(Sporolactobacillus vineae), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 루그두넨시스(Staphylococcus lugdunensis), 스트렙토코커스 종(Streptococcus sp.), 서브돌리그라눌룸 종(Subdoligranulum sp.), 티스텔라 모빌리스(Tistrella mobilis), 트레포네마 종(Treponema sp.) 또는 베르미네프로박터 에이세니아(Verminephrobacter eiseniae)로부터 유래된 Cas 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 자연 발생 Cas 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas 엔도뉴클레아제는 C2C1, C2C3, Cpf1(Cas12a라고도 지칭됨), Cas12b, Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas13a, Cas13b, Cas13c, Cas13d, Casl, CaslB, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9(Csnl 및 Csx12라고도 공지됨), Cas10, Csyl, Csy2, Csy3, Csel, Cse2, Cscl, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmrl, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csbl, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csxl, Csxl5, Csfl, Csf2, Csf3 및 Csf4로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 엔도리보뉴클레아제, 예컨대, Cas13 단백질이다. 일부 실시형태에서, Cas13 단백질은 Cas13a(Abudayyeh et al., Nature 550 (2017), 280-284), Cas13b(Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027), Cas13c(Cox et al., Science (2017) 358:6336, 1019-1027) 또는 Cas13d(Zhang et al., Cell 175 (2018), 212-223) 단백질이다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 야생형 또는 자연 발생 Cas9 단백질 또는 Cas9 오쏘로그이다. 야생형 Cas9는 HNH 뉴클레아제 도메인을 사용하여 DNA의 표적 가닥을 절단하고, RuvC-유사 도메인을 사용하여 비-표적 가닥을 절단하는 멀티-도메인 효소이다. gRNA 특이성에 기초한 DNA에 대한 WT Cas9의 결합은 비-상동 말단 연결(NHEJ) 또는 상동성-유도된 수선(HDR)에 의해서 수선될 수 있는 이중 가닥 DNA 브레이크를 초래한다. 예시적인 자연 발생 Cas9 분자는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재되어 있고, 추가적인 Cas9 오쏘로그는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호에 기재되어 있다. 이러한 Cas9 분자는 클러스터 1 박테리아 패밀리, 클러스터 2 박테리아 패밀리, 클러스터 3 박테리아 패밀리, 클러스터 4 박테리아 패밀리, 클러스터 5 박테리아 패밀리, 클러스터 6 박테리아 패밀리, 클러스터 7 박테리아 패밀리, 클러스터 8 박테리아 패밀리, 클러스터 9 박테리아 패밀리, 클러스터 10 박테리아 패밀리, 클러스터 11 박테리아 패밀리, 클러스터 12 박테리아 패밀리, 클러스터 13 박테리아 패밀리, 클러스터 14 박테리아 패밀리, 클러스터 15 박테리아 패밀리, 클러스터 16 박테리아 패밀리, 클러스터 17 박테리아 패밀리, 클러스터 18 박테리아 패밀리, 클러스터 19 박테리아 패밀리, 클러스터 20 박테리아 패밀리, 클러스터 21 박테리아 패밀리, 클러스터 22 박테리아 패밀리, 클러스터 23 박테리아 패밀리, 클러스터 24 박테리아 패밀리, 클러스터 25 박테리아 패밀리, 클러스터 26 박테리아 패밀리, 클러스터 27 박테리아 패밀리, 클러스터 28 박테리아 패밀리, 클러스터 29 박테리아 패밀리, 클러스터 30 박테리아 패밀리, 클러스터 31 박테리아 패밀리, 클러스터 32 박테리아 패밀리, 클러스터 33 박테리아 패밀리, 클러스터 34 박테리아 패밀리, 클러스터 35 박테리아 패밀리, 클러스터 36 박테리아 패밀리, 클러스터 37 박테리아 패밀리, 클러스터 38 박테리아 패밀리, 클러스터 39 박테리아 패밀리, 클러스터 40 박테리아 패밀리, 클러스터 41 박테리아 패밀리, 클러스터 42 박테리아 패밀리, 클러스터 43 박테리아 패밀리, 클러스터 44 박테리아 패밀리, 클러스터 45 박테리아 패밀리, 클러스터 46 박테리아 패밀리, 클러스터 47 박테리아 패밀리, 클러스터 48 박테리아 패밀리, 클러스터 49 박테리아 패밀리, 클러스터 50 박테리아 패밀리, 클러스터 51 박테리아 패밀리, 클러스터 52 박테리아 패밀리, 클러스터 53 박테리아 패밀리, 클러스터 54 박테리아 패밀리, 클러스터 55 박테리아 패밀리, 클러스터 56 박테리아 패밀리, 클러스터 57 박테리아 패밀리, 클러스터 58 박테리아 패밀리, 클러스터 59 박테리아 패밀리, 클러스터 60 박테리아 패밀리, 클러스터 61 박테리아 패밀리, 클러스터 62 박테리아 패밀리, 클러스터 63 박테리아 패밀리, 클러스터 64 박테리아 패밀리, 클러스터 65 박테리아 패밀리, 클러스터 66 박테리아 패밀리, 클러스터 67 박테리아 패밀리, 클러스터 68 박테리아 패밀리, 클러스터 69 박테리아 패밀리, 클러스터 70 박테리아 패밀리, 클러스터 71 박테리아 패밀리, 클러스터 72 박테리아 패밀리, 클러스터 73 박테리아 패밀리, 클러스터 74 박테리아 패밀리, 클러스터 75 박테리아 패밀리, 클러스터 76 박테리아 패밀리, 클러스터 77 박테리아 패밀리, 또는 클러스터 78 박테리아 패밀리의 Cas9 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 자연 발생 Cas9 폴리펩타이드는 SpCas9, SpCas9-HF1, SpCas9-HF2, SpCas9-HF3, SpCas9-HF4, SaCas9, FnCpf, FnCas9, eSpCas9 및 NmeCas9로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, Cas9 단백질은 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737; Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6]에 기재된 Cas9 아미노산 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 하기 활성 중 하나 이상을 포함한다:
(a) 닉카제 활성, 즉, 핵산 분자의 단일 가닥, 예를 들어, 비-상보적 가닥 또는 상보적 가닥을 절단하는 능력;
(b) 이중 가닥 뉴클레아제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 두 가닥을 절단하고, 이중 가닥 브레이크를 생성하는 능력(이것은 실시형태에서 2개의 닉카제 활성의 존재임);
(c) 엔도뉴클레아제 활성;
(d) 엑소뉴클레아제 활성; 및/또는
(e) 헬리카제 활성, 즉, 이중 가닥 핵산의 나선 구조를 푸는 능력.
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 DNA-손상 신호전달 단백질, 엑소뉴클레아제 또는 포스파타제를 동원하여 하나의 수선 기전 또는 또 다른 것에 의한 표적 서열의 수선 가능성 또는 속도를 추가로 증가시키는 이종 단백질에 융합된다. 일부 실시형태에서, WT Cas 폴리펩타이드는 핵산 수선 주형과 공동 발현되어 상동성-유도된 수선에 의해서 외인성 핵산 서열의 혼입을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 상이한 Cas 단백질(즉, 다양한 종으로부터의 Cas9 단백질)은 상이한 Cas 단백질의 다양한 효소 특징을 활용하기 위해서(예를 들어, 상이한 PAM 서열 선호도를 위해서; 증가된 또는 감소된 효소 활성도를 위해서; 세포 독성의 증가된 또는 감소된 수준을 위해서; NHEJ, 상동성-유도된 수선, 단일 가닥 브레이크, 이중 가닥 브레이크 등 간의 균형을 변화시키기 위해서) 다양한 제공된 방법에서 사용하는 것이 이로울 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 피오게네스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGG, NAG, NGA를 인식한다(Mali et al, Science 2013; 339(6121): 823-826). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 써모필레스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGGNG 및/또는 NNAGAAW(W = A 또는 T임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Horvath et al, Science, 2010; 327(5962): 167-170 및 Deveau et al, J Bacteriol 2008; 190(4): 1390-1400] 참고). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 뮤탄스(S. mutans)로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NGG 및/또는 NAAR(R = A 또는 G임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Deveau et al, J BACTERIOL 2008; 190(4): 1390-1400] 참고). 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 NNGRR(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GRRT(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 에스. 아우레우스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GRRV(R = A 또는 G임)을 인식한다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 엔. 메닌기티디스로부터 유래된 Cas9 단백질이고, PAM 서열 모티프 N GATT 또는 N GCTT(R = A 또는 G, V = A, G 또는 C임)를 인식한다(예를 들어, 문헌[Hou et ah, PNAS 2013, 1-6] 참고). 상기에 언급된 실시형태에서, N은 임의의 뉴클레오타이드 잔기, 예를 들어, A, G, C 또는 T 중 임의의 것일 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 렙토트리치아 사히(Leptotrichia shahii)로부터 유래된 Cas13a 단백질이고, 단일 3' A, U 또는 C의 PFS 서열 모티프를 인식한다.
일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 90% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 국제 PCT 공개 제WO 2015/071474호 또는 문헌[Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737]에 기재된 Cas 단백질과 적어도 100% 동일한 Cas 단백질을 암호화한다.
2. Cas 돌연변이체
일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 Cas 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 변경시키도록 조작된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 변경된 효소 특성, 예를 들어, 변경된 뉴클레아제 활성(자연 발생 또는 다른 참조 Cas 분자와 비교할 때) 또는 변경된 헬리카제 활성를 포함한다. 일부 실시형태에서, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 크기를 변경시키는 변경, 예를 들어, Cas 폴리펩타이드의 또 다른 특성에 상당한 효과를 갖지 않으면서 크기를 감소시키는 아미노산 서열의 결실을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 PAM 인식에 영향을 미치는 변경을 포함한다 예를 들어, 조작된 Cas 폴리펩타이드는 상응하는 야생형 Cas 단백질에 의해서 인식된 PAM 서열 이외의 PAM 서열을 인식하도록 변경될 수 있다.
목적하는 특성을 갖는 Cas 폴리펩타이드는 목적하는 특성을 갖는 돌연변이체 또는 변경된 Cas 폴리펩타이드를 제공하기 위해서, 자연 발생 Cas 폴리펩타이드 또는 모 Cas 폴리펩타이드의 변경을 비롯한, 다수의 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 모 Cas 폴리펩타이드(예를 들어, 자연 발생 또는 조작된 Cas 폴리펩타이드)의 서열 내에 도입될 수 있다. 이러한 돌연변이 및 차이는 치환(예를 들어, 보존적 치환 또는 비필수 아미노산의 치환); 삽입; 또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 모 Cas 폴리펩타이드에 비해서 하나 이상의 돌연변이(예를 들어, 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 또는 50개의 돌연변이)를 포함한다.
실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 자연 발생 Cas 폴리펩타이드와 상이한 절단 특성을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas는 비활성화된 Cas(dCas) 돌연변이체이다. 이러한 실시형태에서, Cas 폴리펩타이드는 어떠한 고유한 효소 활성도 포함하지 않고, 표적 핵산 절단을 매개할 수 없다. 이러한 실시형태에서, dCas는 비-절단성 기반 방식으로 표적 핵산을 변형시킬 수 있는 이종 단백질과 융합될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, dCas 단백질은 전사 활성화제 또는 전사 리프레서 도메인(예를 들어, 크루펠 연관 박스(KRAB 또는 SKD); Mad mSIN3 상호작용 도메인(SID 또는 SID4X); ERF 리프레서 도메인(ERD); MAX-상호작용 단백질 1(MXI1); 메틸-CpG 결합 단백질 2(MECP2); 등)에 융합된다. 일부 이러한 경우에, dCas 융합 단백질은 ggRNA에 의해서, 표적 핵산 내의 특이적 위치(즉, 서열)에 표적화되고, 유전자좌-특이적 조절을 발휘하고, 예컨대, 프로모터에 대한 RNA 중합효소 결합을 차단(이것은 전사 활성화제 기능을 선택적으로 저해함)하고/하거나 국지적 크로마틴 상태를 변형시킨다(예를 들어, 융합 서열이 사용되는 경우 표적 DNA를 변형시키거나 또는 표적 DNA와 회합된 폴리펩타이드를 변형시킴). 일부 경우에, 변화는 일시적이다(예를 들어, 전사 억제 또는 활성화). 일부 경우에, 변화는 유전성이다(예를 들어, 후성적 변형이 표적 DNA 또는 표적 DNA와 회합된 단백질, 예를 들어, 뉴클레오솜 히스톤에 일어난 경우).
일부 실시형태에서, dCas는 dCas13 돌연변이체이다(Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676). 이어서, 이들 dCas13 돌연변이체는 아데노신 데아미나제(예를 들어, ADAR1 및 ADAR2)를 비롯한, RNA를 변형시키는 효소에 융합될 수 있다. 아데노신 데아미나제는 아데닌을 이노신으로 전환시키는데, 여기서 번역 머시너리가 유사한 구아닌을 처리함으로써, RNA 서열에서 기능성 A→G를 생성시킨다. 일부 실시형태에서, dCas는 dCas9 돌연변이체이다.
일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas9는 Cas9 닉카제 돌연변이체이다. Cas9 닉카제 돌연변이체는 단지 하나의 촉매 활성 도메인(HNH 도메인 또는 RuvC 도메인)을 포함한다. Cas9 닉카제 돌연변이체는 gRNA 특이성에 기초한 DNA 결합을 보유하지만, DNA의 단지 하나의 가닥을 절단하여 단일 가닥 브레이크(예를 들어, "닉(nick)")를 생성한다. 일부 실시형태에서, 2개의 상보성 Cas9 닉카제 돌연변이체(예를 들어, 불활성화된 RuvC 도메인을 갖는 하나의 Cas9 닉카제 돌연변이체, 및 불활성화된 HNH 도메인을 갖는 하나의 Cas9 닉카제 돌연변이체)는 2개의 각각의 표적 서열에 상응하는 2개의 gRNA를 갖는 동일한 세포에서 발현되는데; 하나의 표적 서열은 센스 DNA 가닥 상에서, 그리고 하나는 안티센스 DNA 가닥 상에서 발현된다. 이러한 이중-닉카제 시스템은 스태거드(staggered) 이중 가닥 브레이크를 생성시키고, 표적 특이성을 증가시킬 수 있는데, 그 이유는 2개의 표적외 닉이 이중 가닥 브레이크를 생성시키기에 충분히 가깝게 생성될 것 같지 않기 때문이다. 일부 실시형태에서, Cas9 닉카제 돌연변이체는 핵산 수선 주형과 공동 발현되어 상동성-유도된 수선에 의해서 외인성 핵산 서열의 혼입을 용이하게 한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 Cas 폴리펩타이드는 Cas 폴리펩타이드의 PAM/PFS 특이성을 변경시키도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드는 모 Cas 폴리펩타이드의 PAM/PFS 특이성과 상이한 PAM/PFS 특이성을 갖는다. 예를 들어, 돌연변이체 Cas 폴리펩타이드가 표적 부위를 감소시키거나 특이성을 개선시키거나 PAM/PFS 인식 요건을 제거하도록 인식하는 PAM/PFS 서열을 변경하도록 자연 발생 Cas 단백질을 변형시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질은 PAM/PFS 인식 서열의 길이를 증가시키도록 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, PAM 인식 서열의 길이는 적어도 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 15개 아미노산 길이이다. 상이한 PAM/PFS 서열을 인식하고/하거나 감소된 표적외 활성을 갖는 Cas 폴리펩타이드는 유도 분화(directed evolution)를 사용하여 생성될 수 있다. Cas 폴리펩타이드의 유도 분화를 위해서 사용될 수 있는 예시적인 방법 및 시스템은 예를 들어, 문헌[Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503]에 기재되어 있다.
예시적인 Cas 돌연변이체는 국제 PCT 공개 제WO 2015/161276호 및 문헌[Konermann et al., Cell 173 (2018), 665-676]에 기재되어 있고, 이들은 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
3. gRNA
본 개시내용은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 특정 표적 핵산 서열에 안내하는 가이드 RNA(gRNA)를 제공한다. gRNA는 "핵산-표적화 도메인" 또는 "표적화 도메인" 및 단백질-결합 분절을 포함한다. 표적화 도메인은 또한 "스페이서" 서열로서 지칭될 수 있고, 표적 핵산 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 이와 같이, gRNA의 표적화 도메인 분절은 혼성화(즉, 염기 짝지움)를 통해서 서열-특이적 방식으로 표적 핵산과 상호작용하고, gRNA가 결합할 표적 핵산 내의 위치를 결정한다. gRNA의 표적화 도메인 분절은 표적 핵산 서열 내의 목적하는 서열에 혼성화하도록 (예를 들어, 유전자 조작에 의해서) 변형될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 약 13 내지 약 22개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 약 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 약 20개 뉴클레오타이드 길이이다.
gRNA의 단백질-결합 분절은 부위-지향된 변형 폴리펩타이드(예를 들어, Cas 단백질)와 상호작용하여 gRNA 및 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 포함하는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성한다. 이어서 gRNA의 표적화 도메인 분절은 상기에 기재된 스페이서 서열을 통해서 결합된 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 표적 핵산 내의 특정 뉴클레오타이드 서열에 안내한다. gRNA의 단백질-결합 분절은 서로에 상보적이고, 이중 가닥 RNA 듀플렉스를 형성하는 뉴클레오타이드의 적어도 2개의 스트레치를 포함한다. gRNA의 단백질-결합 분절은 또한 "스캐폴드" 분절 또는 "tracr RNA"로서 지칭될 수 있다. 일부 실시형태에서, tracr RNA 서열은 약 30 내지 약 180개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, tracr RNA 서열은 약 40 내지 약 90개 뉴클레오타이드, 약 50 내지 약 90개 뉴클레오타이드, 약 60 내지 약 90개 뉴클레오타이드, 약 65 내지 약 85개 뉴클레오타이드, 약 70 내지 약 80개 뉴클레오타이드, 약 65 내지 약 75개 뉴클레오타이드 또는 약 75 내지 약 85개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, tracr RNA 서열은 약 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88 또는 약 90개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, tracr RNA는 서열번호 34(문헌[Mali et al., Science (2013) 339(6121):823-826] 참고), 서열번호 35 내지 36(PCT 공개 제WO 2016/106236호 참고), 서열번호 37 내지 39(문헌[Deltcheva et al., Nature. 2011 Mar 31; 471(7340): 602-607] 참고) 또는 서열번호 40(문헌[Chen et al., Cell. 2013; 155(7); 1479-1491] 참고)의 DNA 서열에 의해서 암호화된 핵산 서열을 포함한다. 상기 tracr 서열 중 임의의 것이 본 명세서에 기재된 gRNA 표적화 도메인 실시형태 중 임의의 것과 조합하여 사용하기에 적합하다.
일부 실시형태에서, gRNA는 2개의 별개의 RNA 분자(즉, "이중 gRNA")를 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA는 단일 RNA 분자(즉, "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA")를 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"의 사용은 이중 gRNA 및 sgRNA 둘 다를 포함한다. 이중 gRNA는 2개의 개별 RNA 분자: "crispr RNA"(또는 "crRNA") 및 "tracr RNA"를 포함한다. crRNA 분자는 "tracr 메이트" 서열에 공유 연결된 스페이서 서열을 포함한다. tracer 메이트 서열은 tracr RNA 분자 내의 상응하는 서열에 상보적인 뉴클레오타이드의 스트레치를 포함한다. crRNA 분자 및 tracr RNA 분자는 tracr 및 tracer 메이트 서열의 상보성을 통해서 서로에 혼성화된다.
일부 실시형태에서, gRNA는 sgRNA이다. 이러한 실시형태에서, 핵산-표적화 서열 및 단백질-결합 서열은 tracr RNA 서열에 대한 스페이서 서열의 융합에 의해서 단일 RNA 분자에 존재한다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 약 50 내지 약 200개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 약 75 내지 약 150 또는 약 100 내지 약 125개 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, sgRNA는 약 100개 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용의 gRNA는 표적 유전자좌 내의 표적 핵산 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 상보적이거나, 100% 상보적인 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 RNA 표적 서열이다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산 서열은 DNA 표적 서열이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. CBLB를 표적화하기에 적합한 추가적인 gRNA는 미국 특허 출원 공개 제2017/0175128호에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 TNFAIP3 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 서열번호 348 내지 396 또는 서열번호 348 내지 3486 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 BCOR 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 서열번호 708 내지 772 또는 서열번호 708 내지 764 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및 NR4A3(예를 들어, 표 3으로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 표 6A 내지 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 서열번호 814 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택된 표적 유전자의 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 표 6A 또는 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 ZC3H12A의 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 표 6C 또는 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 서열번호 1065 내지 1264 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 MAP4K1 유전자의 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 표 6E 또는 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 서열번호 510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 gRNA는 NR4A3 유전자의 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 표 6G 또는 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적화 도메인 서열은 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR(예를 들어, 표 2로부터 선택된 유전자)로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1, 및 NR4A3(표 3으로부터 선택된 유전자)으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 표 6A 내지 표 6H 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 표 6A 또는 표 6B 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 CBLB의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS으로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 ZC3H12A의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 표 6C 또는 표 6D 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 ZC3H12A의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1264 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1264 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 MAP4K1 유전자의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 표 6E 또는 표 6F 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 MAP4K1의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1510 내지 1538 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 또는 BCOR로부터 선택된 표적 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 NR4A3 유전자의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 또는 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 표 6G 또는 표 6H 중 하나에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 2종 이상의 gRNA 분자를 포함하며, 여기서 gRNA 중 적어도 하나는 CBLB 유전자의 표적 DNA 서열과 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 분자는 NR4A3의 표적 DNA 서열의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함하고, gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566 중 하나와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일하거나 또는 100% 동일한 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA 서열의 핵산-결합 분절은 당업계에 공지된 알고리즘(예를 들어, Cas-OFF 파인더)을 사용하여 표적외 결합을 최소화하여 특정 표적 유전자좌 또는 표적 유전자에 고유한 표적 서열을 식별하도록 설계된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 뉴클레아제에 대해서 안정성을 도입하는 하나 이상의 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이러한 실시형태에서, 이들 변형된 gRNA는 비-변형된 gRNA와 비교할 때 감소된 선천 면역을 도출할 수 있다. 용어 "선천성 면역 반응"은 일반적으로 바이러스 또는 박테리아 기원의 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함하며, 이는 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 gRNA는 5' 단부에서 또는 그 근처에서(예를 들어, 5' 단부의 1 내지 10개, 1 내지 5개 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드) 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA의 5' 단부는 진핵 생물 mRNA 캡 구조 또는 캡 유사체(예를 들어, G(5')ppp(5')G 캡 유사체, m7G(5')ppp(5')G 캡 유사체 또는 3'-0-Me-m7G(5')ppp(5')G 안티 리버스 캡 유사체(anti reverse cap analog: ARCA))의 포함에 의해서 변형된다. 일부 실시형태에서, 시험관내 전사된 gRNA는 5' 트라이포스페이트기를 제거하기 위해 포스파타제(예를 들어, 송아지 장 알칼리성 포스파타제)로 처리함으로써 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA는 이의 3' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 이의 3' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, gRNA의 3' 단부는 하나 이상의(예를 들어, 25 내지 200개의) 아데닌(A) 잔기의 첨가에 의해서 변형된다.
일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 및 변형된 뉴클레오타이드는 gRNA에 존재할 수 있지만, 또한 다른 유전자-조절 시스템, 예를 들어, mRNA, RNAi 또는 siRNA-기반 시스템에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다:
(a) 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 포스포다이에스터 골격 링키지 내의 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체;
(b) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체;
(c) 포스페이트 모이어티의 "탈포스포(dephospho)" 링커로의 대량 대체;
(d) 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체;
(e) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형;
(f) 올리고뉴클레오타이드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트기의 제거, 변형 또는 대체 또는 모이어티의 접합; 및
(g) 당의 변형.
일부 실시형태에서, 상기에 열거된 변형을 조합하여 2개, 3개, 4개 또는 그 초과의 변형을 가질 수 있는 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA의 모든 염기는 변형된다. 일부 실시형태에서, gRNA 분자의 포스페이트기 각각은 포스포로티오에이트기로 대체된다.
일부 실시형태에서, 소프트웨어 툴을 사용하여 사용자의 표적 서열 내의 gRNA의 선택을 최적화하여, 예를 들어, 게놈 전체의 총 표적외 활성을 최소화할 수 있다. 표적외 활성은 절단 이외의 것일 수 있다. 예를 들어, 에스. 피오게네스 Cas9를 사용하여 각각의 가능한 gRNA를 선택하는 경우, 소프트웨어 툴은 특정 수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10) 이하의 미스매칭된 염기쌍을 함유하는 게놈에 걸쳐서 모든 잠재적인 표적외 서열(상기 NAG 또는 NGG PAM)을 식별할 수 있다. 각각의 표적외 서열에서의 절단 효율은 예를 들어, 실험 유래된 가중식을 사용하여 예측될 수 있다. 이어서 각각의 가능한 gRNA를 이의 총 예측된 표적외 절단에 따라서 순위매길 수 있고; 상위 순위의 gRNA는 가장 큰 표적내 및 가장 적은 표적외 절단을 가질 가능성이 있는 것을 나타낸다. 다른 기능, 예를 들어, gRNA 벡터 작제를 위한 자동화 시약 설계, 표적내 서베이어(Surveyor) 검정을 위한 프라이머 설계 및 고속대량 검출(high-throughput detection)을 위한 프라이머 설계 및 차세대 서열결정을 통한 표적외 절단의 정량이 또한 툴에 포함될 수 있다.
IV. 폴리뉴클레오타이드
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산 분자를 제공한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA) 및 DNA/RNA 혼성체를 지칭한다. 폴리뉴클레오타이드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있거나, 재조합, 합성 또는 단리된 것일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 프리-메신저(pre-messenger) RNA(프리-mRNA), 메신저 RNA(mRNA), RNA, 게놈 DNA(gDNA), PCR 증폭된 DNA, 상보성 DNA(cDNA), 합성 DNA 또는 재조합 DNA를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 폴리뉴클레오타이드는 적어도 5, 적어도 10, 적어도 15, 적어도 20, 적어도 25, 적어도 30, 적어도 40, 적어도 50, 적어도 100, 적어도 200, 적어도 300, 적어도 400, 적어도 500, 적어도 1000, 적어도 5000, 적어도 10000 또는 적어도 15000개 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 길이의 뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드의 중합체 형태, 또는 두 유형의 뉴클레오타이드의 변형된 형태뿐만 아니라 중간 길이의 중합체 형태를 지칭한다. 이와 관련하여 "중간 길이"는 지칭된 값, 예컨대, 6, 7, 8, 9 등, 101, 102, 103 등; 151, 152, 153 등; 201, 202, 203 등 사이의 임의의 길이를 의미한다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 코돈 최적화될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "코돈 최적화된"은 폴리펩타이드의 발현, 안정성 및/또는 활성을 증가시키기 위해서 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에서 코돈을 치환시킨 것을 지칭한다. 코돈 최적화에 영향을 미치는 인자는 하기 중 하나 이상을 포함한다: (i) 둘 이상의 유기체 또는 유전자 또는 합성에 의해서 작제된 편향 표 사이의 코돈 편향의 변화, (ii) 유기체, 유전자 또는 유전자 세트 내에서 코돈 편향의 정도의 변화, (iii) 콘텍스트(context)를 포함하는 코돈의 체계적인 변화, (iv) 탈암호화 tRNA에 따른 코돈의 변화, (v) 삼중항의 전체 또는 하나의 위치에서 GC%에 따른 코돈 변화, (vi) 참조 서열, 예를 들어, 자연 발생 서열에 대한 유사도의 변화, (vii) 코돈 주파수 컷오프의 변화, (viii) DNA 서열로부터 전사 된 mRNA의 구조적 특성, (ix) 코돈 치환 세트의 설계가 기초가 될 DNA 서열의 기능에 대한 사전 지식, (x) 각각의 아미노산에 대한 코돈 세트의 체계적인 변화, (xi) 가짜 번역 개시 부위의 단리된 제거 및/또는 (xii) 우발적인 폴리아데닐화 부위의 제거(그렇지 않았으면 절두된 RNA 전사체를 초래함).
본 명세서에서 사용된 바와 같이 "서열 동일성" 또는 예를 들어, "와 50% 동일한 서열"을 포함하는 언급은, 서열이 뉴클레오타이드별로 또는 아미노산별로 비교 창에 걸쳐서 동일한 정도를 지칭한다. "비교 창"는 적어도 6개의 연속 위치, 일반적으로 약 50 내지 약 100, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150의 개념적 분절을 지칭하며, 여기서 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후에 동일한 수의 연속 위치의 참조 서열과 비교된다. 따라서, "서열 동일성 백분율"은 비교 창에 대해 두 개의 최적으로 정렬된 서열을 비교하고, 두 서열에서 동일한 핵산 염기(예를 들어, A, T, C, G, I) 또는 동일한 아미노산 잔기(예를 들어, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys 및 Met)가 발생하는 위치의 수를 결정하여 일치되는 위치의 수를 산출하고, 비교 창(즉, 창 크기)에서 위치의 전체 수에 의해 일치되는 위치의 수를 나누고, 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 얻음으로써 계산될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오타이드 변이체" 및 "변이체" 등은 하기에 정의된 엄격한 조건 하에서 참조 서열과 혼성화하는 참조 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드와 상당한 서열 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드를 지칭한다. 이들 용어는 1종 이상의 뉴클레오타이드가 참조 폴리뉴클레오타이드와 비교하여 1종 이상의 뉴클레오타이드가 첨가 또는 결실되거나 상이한 뉴클레오타이드로 대체된 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 이와 관련하여, 돌연변이, 첨가, 결실 및 치환을 포함하는 특정 변경이 참조 폴리뉴클레오타이드에 이루어질 수 있고, 이에 의해 변경된 폴리뉴클레오타이드가 참조 폴리뉴클레오타이드의 생물학적 기능 또는 활성을 보유할 수 있음이 당업계에 널리 이해되어 있다.
특정 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드 또 변이체는 참조 서열에 대해 적어도 또는 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는다.
또한, 유전자 암호의 축퇴의 결과, 본 명세서에 기재된 바와 같이 폴리펩타이드 또는 그의 변이체의 단편을 암호화하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 네이티브 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용의 차이로 인해 변하는 폴리뉴클레오타이드가 특정 실시형태에서 구체적으로 고려되며, 예를 들어, 인간 및/또는 영장류 코돈 선택에 최적화된 폴리뉴클레오타이드가 고려된다. 또한, 본 명세서에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립 유전자가 또한 사용될 수 있다. 대립 유전자는 뉴클레오타이드의 결실, 첨가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로 변경된 내인성 유전자이다.
암호 서열 자체의 길이에 관계 없이 본 명세서에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서의 다른 곳에 또는 당업계에 공지된 바와 같이 다른 DNA 서열, 예를 들어, 프로모터 및/또는 인핸서, 비번역 영역(untranslated region: UTR), 신호 서열, 코작 서열, 폴리아데닐화 신호, 추가 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 내부 리보솜 도입 부위(internal ribosomal entry site: IRES), 재조합 효소 인식 부위(예를 들어, LoxP, FRT 및 Att 부위), 종결 코돈, 전사 종결 신호 및 자가-절단 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 에피토프 태그와 조합되어, 이들의 전체 길이가 상당히 변할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 폴리뉴클레오타이드 단편이 특정 실시형태에서 사용될 수 있으며, 총 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해 제한되는 것으로 고려된다.
폴리뉴클레오타이드는 당업계에 공지되어 있고 이용 가능한 다양한 잘 확립된 기술 중 임의의 것을 사용하여 제조, 조작 및/또는 발현될 수 있다.
벡터
본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 세포에서 발현시키기 위해, 유전자-조절 시스템을 암호화하는 발현 카세트를 적절한 벡터에 삽입할 수 있다. 본 명세서에서 용어 "핵산 벡터"는 다른 핵산 분자를 전달 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 사용된다. 전달된 핵산은 일반적으로 벡터 핵산 분자에 연결, 예를 들어, 삽입된다. 핵산 벡터는 세포에서 자율 복제를 지시하는 서열을 포함할 수 있거나, 또는 숙주 세포 DNA로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 카세트"는 RNA 및 이어서 단백질을 발현할 수 있는 벡터 내의 유전자 서열을 지칭한다. 핵산 카세트는 관심대상 유전자, 예를 들어, 유전자-조절 시스템을 함유한다. 핵산 카세트는 카세트 내의 핵산이 RNA로 전사될 수 있고 필요한 경우 단백질 또는 폴리펩타이드로 번역될 때 형질전환된 세포에서의 활성에서 요구되는 적절한 번역 후 변형을 겪고, 적절한 세포 내 구획 또는 세포외 구획으로의 분비를 표적화함으로써 생물학적 활성을 위한 적절한 구획으로 전좌되도록 벡터 내에서 위치적으로 및 순차적으로 배향된다. 바람직하게는, 카세트는 벡터 내로의 즉시 삽입에 적합한 3' 단부 및 5'단부를 가지며, 예를 들어, 각 단부에 제한 엔도뉴클레아제 부위를 갖는다. 카세트는 제거되고, 단일 유닛으로서 플라스미드 또는 바이러스 벡터에 삽입될 수 있다.
특정 실시형태에서, 벡터는 플라스미드, 파지미드, 코스미드, 인공 염색체, 예컨대, 트랜스포손, 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC) 또는 P1-유래 인공 염색체(PAC), 박테리오파지, 예컨대, 람다 파지 또는 M13 파지 및 동물 바이러스를 비제한적으로 포함한다. 특정 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자-조절 시스템의 암호 서열은 포유동물 세포에서 유전자-조절 시스템의 발현을 위해 이러한 벡터에 결찰될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비-바이러스성 벡터는 본 명세서에서 고려되는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드를 면역 효과기 세포, 예를 들어, T 세포에 전달하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 플라스미드이다. 다수의 적합한 플라스미드 발현 벡터가 당업자에게 공지되어 있으며, 다수가 상업적으로 이용 가능하다. 하기 벡터가 예로서 제공된다; 진핵 생물 숙주 세포: pXT1, pSG5(스트라타젠사(Stratagene)), pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVLSV40(파마시아사(Pharmacia)). 그러나, 임의의 다른 플라스미드 벡터가 숙주 세포와 상용성인 한 사용될 수 있다. 이용된 세포 유형 및 유전자-조절 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544)] 참고).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 바이러스 벡터이다. 적합한 바이러스 벡터는 백시나 바이러스; 폴리오바이러스; 아데노바이러스(예를 들어, 문헌[Li et al., Invest Opthalmol Vis Sci 35:2543 2549, 1994; Borras et al., Gene Ther 6:515 524, 1999; Li and Davidson, PNAS 92:7700 7704, 1995; Sakamoto et al., H Gene Ther 5:1088 1097, 1999]; WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655 참고); 아데노-연관 바이러스(예를 들어, 미국 특허 제7,078,387호; 문헌[Ali et al., Hum Gene Ther 9:81 86, 1998, Flannery et al., PNAS 94:6916 6921, 1997; Bennett et al., Invest Opthalmol Vis Sci 38:2857 2863, 1997; Jomary et al., Gene Ther 4:683 690, 1997, Rolling et al., Hum Gene Ther 10:641 648, 1999; Ali et al., Hum Mol Genet 5:591 594, 1996]; WO 93/09239, 문헌[Samulski et al., J. Vir. (1989) 63:3822-3828; Mendelson et al., Virol. (1988) 166:154-165; 및 Flotte et al., PNAS (1993) 90:10613-10617)]의 스리바스타바(Srivastava); SV40; 단순 포진 바이러스; 인간 면역결핍 바이러스(예를 들어, 문헌[Miyoshi et al., PNAS 94:10319 23, 1997; Takahashi et al., J Virol 73:7812 7816, 1999] 참고)에 기반한 바이러스 벡터; 레트로바이러스 벡터(예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스 및 레트로바이러스, 예컨대, 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스(Harvey Sarcoma Virus), 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus), 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수 증식 육종 바이러스 및 유선 종양 바이러스로부터 유래된 벡터) 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 벡터의 예는 포유동물 세포에서의 발현을 위한 pClneo 벡터(프로메가사(Promega)); 포유동물 세포에서 렌티바이러스 매개된 유전자 전달 및 발현을 위한 pLenti4/V5-DEST(상표명), pLenti6/V5-DEST(상표명) 및 pLenti6.2/V5-GW/lacZ(인비트로젠사(Invitrogen))이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 에피솜 벡터 또는 염색체 외적으로 유지되는 벡터를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 비-통합 벡터이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "에피소멀"은 숙주의 염색체 DNA에 통합되지 않고 분열 숙주 세포로부터 점진적인 손실 없이 복제할 수 있는 벡터를 지칭하며, 이는 또한 상기 벡터가 염색체외에서 또는 에피솜에 의해서 복제됨을 의미한다. 이러한 벡터는 림프모구성 헤르페스 바이러스 또는 감마 헤르페스 바이러스, 아데노 바이러스, SV40, 소 유두종 바이러스 또는 효모, 특히 림프구 헤르페스 바이러스 복제 기원 또는 EBV의 oriP에 상응하는 감마 헤르페스 바이러스로부터의 DNA 복제 기원 또는 "ori"를 암호화하는 서열을 보유하도록 조작된다. 특정 양상에서, 림프구성 헤르페스 바이러스는 엡스타인 바 바이러스(EBV), 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV), 헤르페스 바이러스 사이 미리(HS) 또는 마렉병 바이러스(MDV)일 수 있다. 엡스타인 바 바이러스(EBV)와 카포시 육종 헤르페스 바이러스(KSHV)도 감마 헤르페스 바이러스의 예이다.
일부 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 트랜스포손 벡터 시스템을 사용하여 표적 또는 숙주 세포로 도입된다. 특정 실시형태에서, 트랜스포손 벡터 시스템은 이식 가능한 요소 및 본 명세서에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터; 및 트랜스포사제를 포함한다. 일 실시형태에서, 트랜스포손 벡터 시스템은 단일 트랜스포사제 벡터 시스템이다(예를 들어, WO 2008/027384 참조). 예시적인 트랜스포사제는 비제한적으로 피기백(piggyBac), 슬리핑 뷰티(Sleeping Beauty), Mos1, Tc1/mariner, Tol2, mini-Tol2, Tc3, MuA, Himar I, 프로그 프린스(Frog Prince) 및 이들의 유도체를 포함한다. 피기백 트랜스포손 및 트랜스포사제는 예를 들어, 미국 특허 제6,962,810호에 기재되어 있으며, 이는 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 슬리핑뷰티 트랜스포손 및 트랜스포사제는 예를 들어, 문헌[Izsvak et al., J. Mol. Biol. 302: 93-102 (2000)]에 기술되어 있으며, 이는 그 전문이 본 명세서에 참조에 의해 포함된다. 메다카 물고기 오리지아스 라티페스(Oryzias latipes)에서 처음 단리되고 hAT 패밀리의 트랜스포손에 속하는 Tol2 트랜스포손은 문헌[Kawakami et al. (2000)]에 기재되어 있다. Mini-Tol2는 Tol2의 변이체이며, 문헌[Balciunas et al. (2006)]에 기재되어 있다. Tol2 및 Mini-Tol2 트랜스포손은 Tol2 트랜스포사제와 공동 작용할 때 트랜스젠의 유기체 게놈으로의 통합을 촉진한다. 프로그 프린스 트랜스포손 및 트랜스포사제는 예를 들어, 문헌[Miskey et al., Nucleic Acids Res. 31:6873-6881 (2003)]에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 제어 요소, 예를 들어, 프로모터와 같은 전사 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다. "제어 요소"는 벡터의 비번역 영역(예를 들어, 복제 기원, 선택 카세트, 프로모터, 인핸서, 번역 개시 신호(샤인 달가노(Shine Dalgarno) 서열 또는 코작(Kozak) 서열) 인트론, 폴리아데닐화 서열, 5' 및 3' 비번역 영역)을 지칭하는데, 이것은 숙주 세포 단백질과 상호 작용하여 전사 및 번역을 수행한다. 이러한 요소는 강도와 특이성이 다를 수 있다. 전사 제어 요소는 진핵 세포(예를 들어, 포유동물 세포) 또는 원핵 세포(예를 들어, 박테리아 또는 고신 세포)에서 기능적일 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 원핵 세포 및 진핵 세포 둘 다에서 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 다중 제어 요소에 작동 가능하게 연결된다.
이용된 세포 유형 및 유전자-조절 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 포함하는 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소가 발현 벡터에 사용될 수 있다(예를 들어, 문헌[Bitter et al. (1987) Methods in Enzymology, 153:516-544)] 참고). 본 명세서에 사용된 용어 "프로모터"는 RNA 폴리머라제가 결합하는 폴리뉴클레오타이드(DNA 또는 RNA)의 인식 부위를 지칭한다. RNA 폴리머라제는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드를 개시하고 전사한다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포에서 작동하는 프로모터는 전사가 개시되는 부위로부터 상류에 대략 25 내지 30개 염기에 위치한 AT-풍부 영역 및/또는 전사 개시로부터 상류에 70 내지 80개 염기가 발견되는 다른 서열, CNCAAT 영역(N은 임의의 뉴클레오타이드일 수 있음)을 포함한다. 용어 "인핸서"는 향상된 전사를 제공할 수 있는 서열을 함유하는 DNA의 분절을 지칭하며, 어떤 경우에는 다른 제어 서열에 대한 배향과 무관하게 기능할 수 있다. 인핸서는 프로모터 및/또는 다른 인핸서 요소와 협력적으로 또는 부가 적으로 기능할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 이렇게 기재된 성분이 의도된 방식으로 기능하는 것을 허용하는 관계로 존재한다는 것을 지칭한다. 일 실시형태에서, 이 용어는 핵산 발현 제어 서열(예컨대, 프로모터 및/또는 인핸서)과 제2 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어, 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 사이의 기능적 연결을 의미하고, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 상응하는 핵산의 전사를 지시한다.
적합한 진핵생물 프로모터(진핵생물 세포에서 기능성인 프로모터)의 비제한적인 예는 사이토메갈로바이러스(CMV) 극초기, 단순 포진 바이러스(HSV) 티미딘 키나제, 바이러스성 시미안 바이러스 40(SV40)(예를 들어, 초기 및 후기 SV40), 비장 초점 형성 바이러스(spleen focus forming virus: SFFV) 프로모터로부터의 것, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부(long terminal repeat: LTR)(예를 들어, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MoMLV) LTR 프로모터 또는 라우스 육종 바이러스(RSV) LTR), 단순 포진 바이러스(HSV)(티미딘 키나제) 프로모터, H5, 박시나 바이러스로부터의 P7.5 및 P11 프로모터, 연장 인자 1-알파(EF1α) 프로모터, 초기 성장 반응 1(EGR1) 프로모터, 페리틴 H(FerH) 프로모터, 페리틴 L(FerL) 프로모터, 글리세르알데하이드 3-포스페이트 데하이드로게나제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase: GAPDH) 프로모터, 진핵 생물 번역 개시 인자 4A1(eukaryotic translation initiation factor 4A1: EIF4A1) 프로모터, 열 충격 70kDa 단백질 5(HSPA5) 프로모터, 열 충격 단백질 90kDa 베타, 구성원 1(HSP90B1) 프로모터, 열 충격 단백질 70kDa(HSP70) 프로모터, β-키네신(β-KIN) 프로모터, 인간 ROSA 26 유전자좌(Irions et al., Nature Biotechnology 25, 1477-1482 (2007)), 유비퀴틴 C(UBC) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제-1(PGK) 프로모터, 사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 β-액틴(CAG) 프로모터, β-액틴 프로모터 및 골수 증식 육종 바이러스 인핸서, 음성 대조군 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된(MND) 프로모터, 및 마우스 메탈로티오네인-l을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에 있다. 발현 벡터는 또한 번역 개시 및 전사 종결자를 위한 리보솜 결합 부위를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 부위-지향된 변형 폴리펩타이드에 융합되어 키메라 폴리펩타이드를 생성하는 단백질 태그(예를 들어, 6xHis 태그, 헤마글루티닌 태그, 녹색 형광 단백질 등)를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 구성적 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 세포에서 구성적이고/이거나 어디에서든 발현된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 유도성 프로모터에 작동 가능하게 연결된다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 조건부로 발현된다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 "조건부 발현"은 유도성 발현; 억압성 발현; 특정 생리학적, 생물학적 또는 질병 상태를 갖는 세포 또는 조직에서의 발현(예를 들어, 세포 유형 또는 조직 특이적 발현) 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 유형의 조건부 발현을 지칭할 수 있다. 유도성 프로모터/시스템의 예시적인 예는 스테로이드-유도성 프로모터, 예컨대, 글루코코티코이드 또는 에스트로겐 수용체를 암호화하는 유전자를 위한 프로모터(해당 호르몬으로의 치료에 의해서 유도성임), 메탈로티오닌 프로모터(다양한 중금속으로 치료에 의해서 유도성임), MX-1 프로모터(인터페론에 의해서 유도성임), "GeneSwitch" 미페프리스톤 조절 시스템(Sirin et al., 2003, Gene, 323:67), 큐메이트 유도성 유전자 스위치(cumate inducible gene switch)(WO 2002/088346), 테트라사이클린-의존적 조절 시스템 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 벡터는 전사 종결 신호를 추가로 포함한다. 이종 핵산 전사체의 효율적인 종결 및 폴리아데닐화를 지시하는 요소는 이종 유전자 발현을 증가시킨다. 전사 종결 신호는 일반적으로 폴리아데닐화 신호의 하류에서 발견된다. 특히 실시형태에서, 벡터는 발현될 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 폴리아데닐화 서열 3'를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이 용어 "polyA 부위"또는 "polyA 서열"은 RNA 폴리머라제 II에 의한 초기 RNA 전사체의 종결 및 폴리아데닐화 둘 다를 지시하는 DNA 서열을 나타낸다. 폴리아데닐화 서열은 암호 서열의 3'단부에 polyA 테일을 첨가함으로써 mRNA 안정성을 증진시킬 수 있고, 따라서 번역 효율 증가에 기여한다. 절단 및 폴리아데닐화는 RNA에서 poly(A) 서열에 의해 지시된다. 포유류 프리-mRNA에 대한 코어 poly(A) 서열은 절단 폴리아데닐화 부위에 측접하는 2개의 인식 요소를 갖는다. 전형적으로, 거의 변하지 않은 AAUAAA 육량체는 U 또는 GU 잔기가 풍부한 보다 가변적인 요소의 상류에 20 내지 50 개의 뉴클레오타이드에 놓여있다. 초기 전사체의 절단은 이들 두 요소 사이에서 발생하고 5' 절단 생성물에 최대 250 개의 아데노신을 첨가하는 것과 결합된다. 특정 실시형태에서, 코어 poly(A) 서열은 이상적인 polyA 서열(예를 들어, AATAAA, ATTAAA, AGTAAA)이다. 특정 실시형태에서, poly(A) 서열은 SV40 polyA 서열, 소 성장 호르몬 polyA 서열(BGHpA), 토끼 β-글로빈 polyA 서열(rβgpA), 이의 변이체 또는 당업계에 공지된 다른 적합한 이종성 또는 내인성 polyA 서열이다.
일부 실시형태에서, 벡터는 또한 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 융합된 신호 펩타이드를 암호화하는 서열(예를 들어, 핵 국지화, 핵 국지화, 미토콘드리아 국지화)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 융합된 핵 국지화 서열(예를 들어, SV40으로부터)을 포함할 수 있다.
폴리뉴클레오타이드 및 재조합 벡터를 숙주 세포 내로 도입하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 유전자-조절 시스템의 성분을 세포 내로 도입하기 위해 임의의 공지된 방법을 사용할 수 있다. 적합한 방법은 예를 들어, 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질주입, 접합, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 인산 칼슘 침전, 폴리에틸렌 이민(PEI)매개된 형질주입, DEAE-덱스트란 매개된 형질주입, 리포솜 매개된 형질주입, 입자 총 기술, 인산 칼슘 침전, 직접 미세 주사, 나노입자-매개된 핵산 전달(예를 들어, 문헌[Panyam et al., Adv Drug Deliv Rev. 2012 Sep 13. pii: S0169-409X(12)00283-9) 참고), 미세 유체 전달 방법(예를 들어, 국제 PCT 공개 제WO 2013/059343호) 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 전기천공을 통한 전달은 세포를 카트리지, 챔버 또는 큐벳에서 유전자-조절 시스템의 성분과 혼합하고, 정의된 지속 시간 및 진폭의 하나 이상의 전기 임펄스를 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포는 혼합물을 카트리지, 챔버 또는 큐벳에 공급하는 장치(예를 들어, 펌프)에 연결된 용기에서 유전자-조절 시스템의 성분과 혼합되며, 여기서 정의된 지속 시간 및 진폭의 1회 이상의 전기 자극이 적용되고, 그 후 세포가 제2 용기로 전달된다. 특정 실시형태에서 고려되는 특정 실시형태에서 사용하기에 적합한 폴리뉴클레오타이드 전달 시스템의 예시적인 예는 아막사 바이오시스템즈사(Amaxa Biosystems), 맥스사이트사(Maxcyte, Inc.), 비티엑스 몰레큘러 딜리버리 시스템즈사(BTX Molecular Delivery Systems), Neon(상표명) 형질주입 시스템, 및 코퍼니쿠스 쎄라퓨틱스사(Copernicus Therapeutics Inc.)에 의해 제공되는 것을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 리포펙션 시약은 상업적으로 시판된다(예를 들어, Transfectam(상표명) 및 Lipofectin(상표명)). 폴리뉴클레오타이드의 효율적인 리포펙션에 적합한 양이온성 지질 및 중성 지질은 문헌에 기재되어 있다(예를 들어, 문헌[Liu et al. (2003) Gene Therapy. 10:180-187; 및 Balazs et al. (2011) Journal of Drug Delivery. 2011:1-12] 참고).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 바이러스 전달 방법에 의해서, 예를 들어, 바이러스 형질도입에 의해서 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터는 비바이러스 전달 방법에 의해서 세포에 도입된다. 특정 실시형태에서 고려되는 폴리뉴클레오타이드의 비바이러스 전달의 예시적인 방법은 전기천공, 소노포레이션, 리포펙션, 미세주입, 생물리학, 바이로솜, 리포솜, 면역리포솜, 나노입자, 다중양이온 또는 지질:핵산 접합체, 네이키드 DNA, 인공 비리온, DEAE-덱스트란-매개 전달, 유전자 총 및 열충격을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분 또는 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 하나 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열은 비바이러스 전달 비히클, 예를 들어, 트랜스포손, 나노입자(예를 들어, 지질 나노 입자), 리포솜, 엑소좀, 약독화된 박테리아 또는 바이러스 유사 입자로 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, 비히클은 약독화 박테리아(예를 들어, 리스테리아 모노사이토제네스(Listeria monocytogenes), 특정 살모넬라 균주, 비피도박 테리움 롱검(Bifidobacterium longum) 및 변형 대장균을 포함하는 병원체를 예방하기 위해 침습적이지만 약화되도록 자연적으로 또는 인공적으로 조작됨), 특이적 세포를 표적으로 하기 위한 영양 및 조직-특이적 성향을 갖는 박테리아, 표적 세포 특이성을 변경하기 위해 변형된 표면 단백질을 갖는 박테리아이다. 일부 실시형태에서, 비히클은 유전적으로 변형된 박테리오파지(예를 들어, 큰 패키징 능력, 낮은 면역원성을 갖고 포유동물 플라스미드 유지 서열을 함유하고, 표적화된 리간드를 포함하는 조작된 파지)이다. 일부 실시형태에서, 비히클은 포유동물 바이러스-유사 입자이다. 예를 들어, 변형된 바이러스 입자가 생성될 수 있다(예를 들어, "빈" 입자의 정제에 이어 원하는 카고와 바이러스의 생체외 조립에 의해). 비히클은 또한 표적 조직 특이성을 변경시키기 위해 표적화 리간드를 포함하도록 조작될 수 있다. 일부 실시형태에서, 비히클은 생물학적 리포솜이다. 예를 들어, 생물학적 리포좀은 인간 세포(예를 들어, 적혈구 고스트, 이것은 대상체로부터 유래된 구형 구조로 분해되는 적혈구이며, 여기서 조직 표적화는 다양한 조직 또는 세포-특이적 리간드의 부착에 의해 달성될 수 있음)로부터 유래된 인지질계 입자, 세포 내 기원의 분비 엑소좀 또는 대상체 유래된 막-결합 나노소포(30 내지 100㎚)(예를 들어, 다양한 세포 유형으로부터 생성될 수 있고 따라서 리간드를 표적화할 필요 없이 세포에 의해 흡수될 수 있음)이다.
V. 변형된 면역 효과기 세포의 생산 방법
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 효과기 세포의 생산 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, 방법은 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포의 집단에 도입하는 단계를 포함하고, 여기서 유전자-조절 시스템은 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템의 성분, 예를 들어, 핵산-, 단백질- 또는 핵산/단백질-기반 시스템은 다양한 전달 방법 및 제형을 사용하여 다양한 형태로 표적 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 재조합 벡터(예를 들어, 상기에 기재된 바이러스 벡터 또는 플라스미드)에 의해서 전달된다. 일부 실시형태에서, 시스템이 단일 성분보다 많은 성분을 포함하는 경우, 벡터는 각각 시스템의 성분을 암호화하는 복수의 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 시스템이 단일 성분보다 많은 성분을 포함하는 경우, 복수의 벡터가 사용될 수 있으며, 각각의 벡터는 시스템의 특정 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 시험관내에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 생체내에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 생체외에서 일어난다.
특정 실시형태에서, 세포로의 유전자-조절 시스템의 도입은 시험관내 또는 생체외에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 배양 시에 추가 조작 없이 시험 관내 또는 생체 외에서 변형된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형 면역 효과기 세포를 생산하는 방법은 추가의 활성화 및/또는 확장 단계 없이 시험관내 또는 생체외에서 유전자-조절 시스템을 도입하는 단계를 포함한다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 변형되고 시험관내 또는 생체외에서 추가로 조작된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 유전자-조절 시스템의 도입 전에 시험관내 또는 생체외에서 활성화 및/또는 확장된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 면역 효과기 세포에 도입된 후 시험관내 또는 생체외에서 활성화 및/또는 확장된다. 일부 실시형태에서, 성공적으로 변형된 세포는 불완전하게 변형된 세포로부터 분류 및/또는 단리되어(예를 들어, 유세포 분석에 의해) 정제된 면역 효과기 세포 집단을 생산할 수 있다. 이어서, 성공적으로 변형된 세포는 추가로 증식되어 변형된 세포의 수를 증가시키고/거나 추후 사용을 위해 동결보존될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 면역 효과기 세포의 집단을 얻는 단계를 포함하는 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법을 제공한다. 면역 효과기 세포의 집단은, 예를 들어, 적절한 온도(예를 들어, 37℃) 및 분위기(예를 들어, 공기+5% CO2) 및 적절한 배양 배지에서 성장을 지지하는데 필요한 다양한 배양 조건 하에서 시험관 내에서 배양될 수 있다. 배양 배지는 예를 들어, 아가, 메틸셀룰로스 등을 함유하는 액체 또는 반고체일 수 있다. 세포 배양 배지의 예시적인 예는 아미노산, 피루브산나트륨 및 비타민이 첨가되고, 혈청-무함유이거나, 적절한 양의 혈청(혈장) 또는 정의된 세트의 호르몬 및/또는 면역 효과기 세포의 성장 및 확장에 충분한 양의 사이토카인(들)이 보충된 최소 필수 배지(Minimal Essential Media: MEM), 이스코브(Iscove)의 변형된 DMEM, RPMI 1640Clicks, AIM-V, F-12, X-Vivo 15, X-Vivo 20 및 옵티마이저(Optimizer)를 포함한다.
배양 배지에는 성장 인자, 예컨대, 혈청(예를 들어, 약 5% 내지 10%의 태아 소 또는 인간 혈청), 인터류킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, IL-21, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ 및 TNF-α를 포함하지만 이들로 제한되지 않는 증식 및 생존에 필수적인 하나 이상의 인자가 보충될 수 있다. T 세포 확장을 위한 다른 첨가제의 예시적인 예는 계면활성제, 플라스마네이트(piasmanate), pH 완충제, 예컨대, HEPES 및 환원제, 예컨대, N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토 에탄올 또는 당업계에 공지된 세포의 성장에 적합한 임의의 다른 첨가제, 예컨대, L-글루타민, 티올, 특히 2-머캅토 에탄올 및/또는 항생제, 예를 들어, 페니실린과 스트렙토마이신을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 전형적으로, 항생제는 대상체에 주입될 세포의 배양물이 아닌 실험 배양물에만 포함된다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 대상체로부터의 샘플로부터 획득된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 제1 대상체로부터 획득되고, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 변형된 면역 효과기 세포 집단은 제2의 상이한 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 대상체로부터 획득되고, 본 명세서에 기재된 방법에 의해 생산된 변형된 면역 효과기 세포 집단은 동일한 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 샘플은 조직 샘플, 유체 샘플, 세포 샘플, 단백질 샘플 또는 DNA 또는 RNA 샘플이다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 피부, 모발(뿌리 포함), 골수, 뼈, 근육, 침샘, 식도, 위, 소장(예를 들어, 십이지장, 공장 또는 회장으로부터의 조직), 대장, 간, 쓸개, 췌장, 폐, 신장, 방광, 자궁, 난소, 질, 태반, 고환, 갑상선, 부신, 심장 조직, 흉선, 비장, 림프절, 척수, 뇌, 눈, 귀, 혀, 연골, 백색 지방 조직 또는 갈색 지방 조직을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 임의의 조직 유형으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조직 샘플은 암성, 전암성 또는 비암성 종양으로부터 유래될 수 있다. 일부 실시형태에서, 유체 샘플은 협측 면봉, 혈액, 혈장, 구강 점막, 질 점막, 말초 혈액, 제대혈, 타액, 정액, 소변, 복수액, 흉막액, 척수액, 폐 세척액, 눈물, 땀, 정액, 정액 유체, 정액 혈장, 전립선 유체, 사정전 유체(pre-ejaculatory fluid)(쿠퍼액(Cowper's fluid)), 배설물, 뇌척수액, 림프액, 하나 이상의 세포 집단을 포함하는 세포 배양 배지, 하나 이상의 세포 집단을 포함하는 완충 용액 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 샘플은 나머지 샘플로부터 면역 효과기 세포 집단을 농축 또는 단리시키기 위해 처리된다. 특정 실시형태에서, 샘플은 말초 혈액 샘플이며, 이어서 이것은 적혈구 및 혈소판을 분리하고 림프구를 단리시키기 위해 백혈구 형성술을 받는다. 일부 실시형태에서, 샘플은 면역 효과기 세포가 단리 및 농축될 수 있는 류코팩(leukopak)이다. 일부 실시형태에서, 샘플은 종양에 존재하는 림프구를 단리시키기 위해(즉, 종양 침윤 림프구의 세포 현탁액을 수득하기 위해 종양의 단편화 및 효소 분해에 의해) 추가 처리되는 종양 샘플이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 고려되는 변형된 면역 효과기 세포의 제조 방법은 예를 들어, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허 출원 공개 제20060121005호에 기재된 바와 같은 면역 효과기 세포의 집단의 활성화 및/또는 확장을 포함한다.
다양한 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 변형된 면역 효과기 세포의 제조 방법은 면역 효과기 세포를 포함하는 세포 집단을 활성화시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 T 세포이다. T 세포 활성화는 1차 자극 신호(예를 들어, T 세포 TCR/CD3 복합체를 통해 또는 CD2 표면 단백질의 자극을 통해)를 제공하고 보조 분자를 통해 2차 공자극 신호를 제공함으로써 달성될 수 있다.
일부 실시형태에서, TCR/CD3 복합체는 T 세포를 적합한 CD3 결합제, 예를 들어, CD3 리간드 또는 항-CD3 단클론성 항체와 접촉시킴으로써 자극될 수 있다. CD3 항체의 예시적인 예는 OKT3, G19-4, BC3, CRIS-7 및 64.1을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, CD2 결합제는 1차 자극 신호를 T 세포에 제공하기 위해 사용될 수 있다. CD2 결합제의 예시적인 예는 CD2 리간드 및 항-CD2 항체, 예를 들어, T11.1 또는 T11.2 항체와 조합된 T11.3 항체(Meuer, S. C. et al. (1984) Cell 36:897-906) 및 9-1 항체와 조합된 9.6 항체(이것은 TI 1.1과 동일한 에피토프를 인식함)(Yang, S. Y. et al. (1986) J. Immunol. 137:1097-1100)를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
TCR/CD3 복합체 또는 CD2를 통해 제공되는 자극 신호 이외에, T 세포 반응의 유도는 전형적으로 T 세포 상에서 공자극 분자에 특이적으로 결합하는 리간드에 의해 제공되는 제2의 공자극 신호를 필요로 하여, 예를 들어, TCR/CD3 복합체의 결합에 의해 제공되는 1차 신호외에, 원하는 T 세포 반응을 매개한다. 적합한 공자극성 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극성 리간드(inducible costimulatory ligand: ICOS-L), 세포간 접착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림포톡신 베타 수용체, ILT3, ILT4, Toll 리간드 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체, 및 B7-H3과 특이적으로 결합하는 리간드를 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 공자극성 리간드는 T 세포 상에 존재하는 공자극성 분자, CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, ICOS, 림프구 기능-연관 항원-1(LFA-1), CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 특정 실시형태에서, CD28 결합제는 공자극성 신호를 제공하기 위해 사용될 수 있다. CD28 결합제의 예시적인 예는 천연 CD28 리간드, 예를 들어, CD28에 대한 천연 리간드(예를 들어, B7-1 패밀리의 단백질의 구성원, 예컨대, B7-1(CD80) 및 B7-2(CD86)); 및 CD28 분자를 가교시킬 수 있는 항-CD28 단클론성 항체 또는 이의 단편, 예를 들어, 단클론성 항체 9.3, B-T3, XR-CD28, KOLT-2, 15E8, 248.23.2 및 EX5.3D10을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 자극성 신호 및 공자극성 신호를 제공하는 결합제는 세포의 표면에 위치한다. 이는 세포 표면 상에서의 발현에 적합한 형태로 결합제를 암호화하는 핵산을 세포에 형질주입 또는 형질도입함으로써 또는 대안적으로 결합제를 세포 표면에 커플링함으로써 달성될 수 있다. 일부 실시형태에서, 공동 자극 신호는 인공 APC(aAPC)와 같은 항원 제시 세포 상에 제시된 공자극성 리간드에 의해 제공된다. 인공 APC는 K562, U937, 721.221, T2 또는 C1R 세포를 조작하여 생체외 성장 및 유전자 변형된 T 세포의 장기 확장을 지원하기 위해 다양한 공자극성 분자 및 사이토카인을 안정적으로 발현 및/또는 분비하도록 제조될 수 있다. 특정 실시형태에서, K32 또는 U32 aAPC는 aAPC 세포 표면 상에 하나 이상의 항체-기반 자극 분자의 디스플레이를 지시하기 위해 사용된다. T 세포의 집단은 CD137L(4-1BBL), CD134L(OX40L) 및/또는 CD80 또는 CD86을 포함하지만 이들로 제한되지 않는 다양한 공자극성 분자를 발현하는 aAPC에 의해 확장될 수 있다. 예시적인 aAPC는 전문이 참조에 의해 포함된 국제 특허 제WO 03/057171호 및 미국 특허 제US2003/0147869호에 제공되어 있다.
일부 실시형태에서, 활성화 및 공자극 신호를 제공하는 결합제는 고체 표면 (예를 들어, 비드 또는 플레이트)에 국한된다. 일부 실시형태에서, 활성화 신호 및 공자극성 신호를 제공하는 결합제 둘 다는 가용성 형태로 제공된다(용액으로 제공됨).
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 하나 이상의 확장 단계의 배양에서 확장된다. "확장"은 면역 효과기 세포의 수를 증가시키기 위해 예정된 시간 동안 면역 효과기 세포 집단을 배양하는 것을 지칭한다. 면역 효과기 세포의 확장은 상기에 기재된 활성화 인자 중 하나 이상의 첨가 및/또는 하나 이상의 성장 인자, 예컨대, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-15, IL-21 및/또는 IL-7)의 첨가를 포함하여 세포 증식 및/또는 생존을 향상 또는 촉진시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, IL-2, IL-15 및/또는 IL-21의 조합은 하나 이상의 확장 단계 동안 배양물에 첨가될 수 있다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 확장 단계 동안 첨가되는 IL-2의 양은 6000U/㎖ 미만이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 확장 단계 동안 첨가되는 IL-2의 양은 약 5500U/㎖, 약 5000U/㎖, 약 4500U/㎖, 약 4000U/㎖, 약 3500U/㎖, 약 3000U/㎖, 약 2500U/㎖, 약 2000U/㎖, 약 1500U/㎖, 약 1000U/㎖ 또는 약 500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 하나 이상의 확장 단계 동안 첨가되는 IL-2의 양은 약 500U/㎖ 내지 약 5500U/㎖이다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 확장 과정 동안 피더 세포와 공배양될 수 있다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 미리 결정된 시간 기간 동안 확장되며, 여기서 미리 결정된 시간 기간은 약 30일 미만이다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 시간 기간은 30일 미만, 25일 미만, 20일 미만, 18일 미만, 15일 미만 또는 10일 미만이다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 시간 기간은 4주 미만, 3주 미만, 2주 미만 또는 1주 미만이다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 시간 기간은 약 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 또는 21일이다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 시간 기간은 약 5일 내지 약 25일, 약 10 내지 약 28일, 약 10 내지 약 25일, 약 10 내지 약 21일, 약 10 내지 약 20일, 약 10 내지 약 19일, 약 11 내지 약 28일, 약 11 내지 약 25일, 약 11 내지 약 21일, 약 11 내지 약 20일, 약 11 내지 약 19일, 약 12 내지 약 28일, 약 12 내지 약 25일, 약 12 내지 약 21일, 약 12 내지 약 20일, 약 12 내지 약 19일, 약 15 내지 약 28일, 약 15 내지 약 25일, 약 15 내지 약 21일, 약 15 내지 약 20일 또는 약 15 내지 약 19일이다. 일부 실시형태에서, 미리 결정된 시간 기간은 약 5일 내지 약 10일, 약 10일 내지 약 15일, 약 15일 내지 약 20일 또는 약 20일 내지 약 25일이다.
일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 세포의 수가 미리 결정된 역치에 도달할 때까지 확장된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 배양물이 적어도 5×106, 1×107, 5×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 5×1012, 1×1013 또는 적어도 5×1013개의 총 세포를 포함할 때까지 확장된다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 배양물이 약 1×109개의 총 세포 내지 약 1×1011개의 총 세포를 포함할 때까지 확장된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 적어도 2개의 확장 단계를 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포의 집단은 샘플로부터 단리된 후 확장될 수 있고, 휴식을 취한 후 다시 확장될 수 있다. 일부 실시형태에서, 면역 효과기 세포는 한 세트의 확장 조건에서 확장된 후, 제2의 상이한 세트의 확장 조건에서 제2 확장 라운드가 이어질 수 있다. 면역 세포의 생체외 확장 방법은 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 제2018-0207201호, 제20180282694호 및 제20170152478호 및 미국 특허 제8,383,099호 및 제8,034,334호에 기재된 바와 같이 당업계에 공지되어 있으며, 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
활성화 및/또는 확장 과정 동안 임의의 시점에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 면역 효과기 세포에 도입되어 변형된 면역 효과기 세포 집단을 생산할 수 있다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 샘플로부터의 농축 직후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 하나 이상의 확장 과정 전에, 확장 과정 중에 또는 확장 과정 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 샘플로부터의 농축 또는 대상체로부터의 수거 직후에 그리고 임의의 확장 라운드 전에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드의 확장 후 그리고 제2 라운드의 확장 전에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다. 일부 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 후에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 변형된 면역 효과기 세포의 집단을 제조하는 방법을 제공하며, 이 방법은 면역 효과기 세포의 집단을 얻는 단계, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포의 집단에 도입하는 단계, 및 면역 효과기 세포의 집단을 하나 이상의 라운드의 확장으로 확장시키는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태의 일부 양상에서, 면역 효과기 세포의 집단은 유전자-조절 시스템의 도입 전에 제1 라운드의 확장으로 확장되고, 유전자-조절 시스템의 도입 후에 제2 라운드의 확장으로 확장된다. 이러한 실시형태의 일부 양상에서, 면역 효과기 세포의 집단은 유전자-조절 시스템의 도입 전에 제1 라운드의 확장 및 제2 라운드의 확장으로 확장된다. 이러한 실시형태의 일부 양상에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 전에 면역 효과기 세포의 집단에 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 대상체로부터 종양을 제거하는 단계 및 종양 샘플을 가공하여 종양 침윤 림프구의 집단을 획득하는 단계(예를 들어, 종양의 단편화 및 효소 소화에 의해서 세포 현탁물을 획득함), 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템을 면역 효과기 세포의 집단에 도입하는 단계 및 면역 효과기 세포의 집단을 1회 이상의 라운드의 확장으로 확장시키는 단계를 포함한다. 이러한 실시형태의 일부 양상에서, 종양 침윤 림프구의 집단은 유전자-조절 시스템의 도입 전에 제1 라운드의 확장으로 확장되고, 유전자-조절 시스템의 도입 후에 제2 라운드의 확장으로 확장된다. 이러한 실시형태의 일부 양상에서, 종양 침윤 림프구의 집단은 유전자-조절 시스템의 도입 전에 제1 라운드의 확장 및 제2 라운드의 확장으로 확장된다. 이러한 실시형태의 일부 양상에서, 유전자-조절 시스템은 제1 라운드 및 제2 라운드의 확장 전에 종양 침윤 림프구의 집단에 도입된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 생산된 변형된 면역 효과기 세포는 즉시 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에서 고려되는 제조 방법은 대상체에서의 사용을 위한 저장 및/또는 제조를 위해서 변형된 면역 세포를 저온보존하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "저온보존"은 0도 미만의 온도, 예컨대, (전형적으로) 77K 또는 -196℃(액체 질소의 비등점)까지 냉각시키는 세포의 보존을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포의 저장 방법은 세포가 해동 시 살아있도록 면역 효과기 세포를 저온보존하는 단계를 포함한다. 필요한 경우, 저온보존된 변형된 면역 효과기 세포를 해동시키고, 성장시키고, 보다 이러한 세포를 위해서 확장시킬 수 있다. 보존될 세포가 저온에서의 동결 또는 실온에서의 가온으로 인해서 손상되는 것을 예방하기 위해서 저온보호제를 종종 0도 미만의 온도에서 사용한다. 저온보존제 및 최적의 냉각 속도는 세포 손상에 대해서 보호할 수 있다. 사용될 수 있는 저온보호제는 다이메틸 설폭사이드(DMSO)(Lovelock and Bishop, Nature, 1959; 183: 1394-1395; Ashwood-Smith, Nature, 1961; 190: 1204-1205), 글리세롤, 폴리바이닐피롤리딘(Rinfret, Ann. N.Y. Acad. Sci., 1960; 85: 576) 및 폴리에틸렌 글리콜(Sloviter and Ravdin, Nature, 1962; 196: 48)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 세포는 10% 다이메틸 설폭사이드(DMSO), 50% 혈청, 40% 완충 배지, 또는 이러한 동결 온도에서 세포를 보존하기 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 방식으로 일부 다른 용액에서 냉동되고, 냉동 배양된 세포를 해동시키기 위해 당업계에 통상적으로 공지된 바와 같이 해동된다.
A. CRISPR/Cas 시스템을 사용한 변형된 면역 효과기 세포의 생산
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법은 표적 DNA 서열을 gRNA 및 Cas 폴리펩타이드를 포함하는 복합체와 접촉시키는 단계를 포함한다. 상기에 논의된 바와 같이, gRNA 및 Cas 폴리펩타이드는 복합체를 형성하는데, 여기서 gRNA의 DNA-결합 도메인은 복합체를 표적 DNA 서열에 표적화하고, Cas 단백질(또는 효소적으로 불활성인 Cas 단백질에 융합된 이종 단백질)은 표적 DNA 서열을 변형시킨다. 일부 실시형태에서, 이 복합체는 gRNA 및 Cas 단백질(또는 gRNA 및 Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)을 세포에 도입한 후 세포 내로 형성된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 핵산은 DNA 핵산이고, 형질도입에 의해 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템의 Cas9 및 gRNA 성분은 단일 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질 및 gRNA 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 바이러스 벡터에 포함되고, 바이러스 형질도입에 의해 세포에 도입된다. 일부 실시형태에서, CRISPR/Cas 유전자 편집 시스템의 Cas9 및 gRNA 성분은 상이한 폴리뉴클레오타이드 분자에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제1 바이러스 벡터에 포함되고 gRNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 제2 바이러스 벡터에 포함된다. 이 실시형태의 일부 양상에서, 제1 바이러스 벡터는 제2 바이러스 벡터 전에 세포에 도입된다. 이 실시형태의 일부 양상에서, 제2 바이러스 벡터는 제1 바이러스 벡터 전에 세포에 도입된다. 이러한 실시형태에서, 벡터의 통합은 Cas9 및 gRNA 성분의 지속적인 발현을 초래한다. 그러나, Cas9의 지속적인 발현은 표적외 돌연변이 증가 및 일부 세포 유형에서의 절단을 야기할 수 있다. 따라서, 일부 실시형태에서, Cas 단백질을 암호화하는 mRNA 핵산 서열이 형질감염에 의해 세포 집단에 도입될 수 있다. 이러한 실시형태에서, Cas9의 발현은 시간에 따라 감소할 것이고, 표적외 돌연변이 또는 절단 부위의 수를 감소시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, gRNA 및 Cas 단백질은 전기천공에 의해 개별적으로 도입된다.
일부 실시형태에서, 이 복합체는 gRNA 분자 및 Cas 단백질을 함께 혼합하고, 복합체 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안 인큐베이션시킴으로써 무세포 시스템에서 형성된다. 이어서 gRNA 및 Cas 단백질을 포함하고, 본 명세서에서 CRISPR-리보핵단백질(CRISPR-RNP)로 지칭되는 이러한 미리 형성된 복합체는 표적 DNA 서열을 변형시키기 위해 세포에 도입될 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR-RNP는 전기천공에 의해 세포에 도입된다.
CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 변형된 면역 효과기 세포를 생산하기 위한 상기에 기재된 임의의 실시형태에서, 시스템은 예를 들어, 단일-편집된 변형 면역 효과기를 생성하기 위해 단일 내인성 표적 유전자를 표적화하는 1종 이상의 gRNA를 포함할 수 있다. 대안적으로, CRISPR/Cas 시스템을 사용하여 변형된 면역 효과기 세포를 생산하기 위한 임의의 상기 기재된 실시형태에서, 시스템은 예를 들어, 이중-편집된 변형된 면역 효과기 세포를 생산하기 위해 2종 이상의 내인성 표적 유전자를 표적화하는 2종 이상의 gRNA를 포함할 수 있다.
B. shRNA 시스템을 사용한 변형된 면역 효과기 세포의 생산
일부 실시형태에서, 표적 유전자의 mRNA 전사체에 상보적인 서열을 갖는 하나 이상의 shRNA 분자를 암호화하는 하나 이상의 DNA 폴리뉴클레오타이드를 세포 내로 도입하는 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법이 제공된다. 면역 효과기 세포는 작은 유전자 카세트를 통해 세포핵에 특이적 DNA 서열을 도입함으로써 shRNA를 생성하도록 변형될 수 있다. 레트로바이러스 및 렌티바이러스 둘 다는 shRNA-암호화 DNA를 면역 효과기 세포에 도입하는데 사용될 수 있다. 도입된 DNA는 세포 자신의 DNA의 일부가 되거나 핵에서 지속될 수 있으며, 세포 머시너리에 shRNA를 생산하도록 지시한다. shRNA는 RNAi-매개된 유전자 넉다운을 유도하도록 세포 내부의 다이서 또는 AGO2-매개 슬라이서 활성에 의해 처리될 수 있다.
VI. 조성물 및 키트
용어 "조성물"은 대상체 또는 세포에 투여 또는 전달될 수 있는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 유전자-조절 시스템 또는 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포의 제형을 지칭한다. 전형적으로, 제형은 임의의 생리학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 및/또는 부형제와 함께 그의 유도체 및/또는 전구 약물, 용매화물, 입체이성질체, 라세미체 또는 호변이성질체를 포함하는 모든 생리학적으로 허용되는 조성물을 포함한다. "치료용 조성물"또는 "약제학적 조성물"(본 명세서에서 상호 교환적으로 사용됨)은 특정 질환 또는 장애의 치료를 위해 대상체에게 투여될 수 있거나 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 변형을 위해서 세포와 접촉될 수 있는 유전자-조절 시스템 또는 변형된 면역 효과기 세포의 조성물이다.
구 "약제학적으로 허용 가능한"은 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 또는 기타 문제 또는 합병증 없이, 합리적인 유익/유해비에 상응하면서, 본 명세서에서 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 인간의 조직과의 접촉에 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 지칭하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제"는 인간 또는 가축에서 사용하기에 허용 가능한 것으로 미국 식품의약품 안전청에 의해 승인된 임의의 아주반트, 담체, 부형제, 활택제, 감미제, 희석제, 보존제, 염료/착색제, 향미 증강제, 계면활성제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 안정화제, 등장화제, 용매, 계면활성제 및/또는 유화제를 포함한다. 예시적인 약제학적으로 허용 가능한 담체는 당, 예컨대, 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대, 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 트래거캔스; 맥아; 젤라틴; 탤크; 코코아 버터, 왁스, 동물 및 식물성 지방, 파라핀, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 산화아연; 오일, 예컨대, 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 콩기름; 글리콜, 예컨대, 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대, 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예컨대, 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예컨대, 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 무발열원 수; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알코올; 포스페이트 완충 용액; 및 약제학적 제형에 사용되는 임의의 다른 상용성 물질을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 임의의 통상적인 매질 및/또는 작용제가 본 발명의 작용제와 비상용성인 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 그의 사용이 고려된다. 보충 활성 성분이 또한 조성물에 혼입될 수 있다.
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 산 부가염 및 염기 부가염 둘 다를 포함한다. 약제학적으로-허용 가능한 염은 산부가염(단백질의 유리 아미노기로 형성됨) 을 포함하고, 이것은 무기산, 예를 들어, 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산 등, 및 유기산, 예를 들어, 비제한적으로, 아세트산, 2,2-다이클로로아세트산, 아디프산, 알긴산, 아스코르브산, 아스파트산, 벤젠설폰산, 벤조산, 4-아세트아미도벤조산, 캄포산, 캄포-10-설폰산, 카프르산, 카프로산, 카프릴산, 탄산, 신남산, 시트르산, 사이클람산, 도데실황산, 에탄-1,2-다이설폰산, 에탄설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 폼산, 퓨마르산, 갈락타르산, 겐티신산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루쿠론산, 글루탐산, 글루타르산, 2-옥소-글루타르산, 글리세로인산, 글리콜산, 히푸르산, 아이소부티르산, 락트산, 락토비온산, 라우르산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 점액산, 나프탈렌-1,5-다이설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 1-하이드록시-2-나프토산, 니코틴산, 올레산, 오로트산, 옥살산, 팔미트산, 팜산, 프로피온산, 피로글루탐산, 피루브산, 살리실산, 4-아미노살리실산, 아세토살리실산, 세바스산, 스테아르산, 석신산, 타타르산, 티오사이안산, p-톨루엔설폰산, 트라이플루오로아세트산 및 운데실렌산 등으로 형성된다. 유리 카복실기로 형성된 염은 또한 무기 염기, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄염 등으로부터 유래될 수 있다. 유기 염기로부터 유래된 염은 1차, 2차 및 3차 아민, 치환된 아민, 예컨대, 자연 발생 치환된 아민, 환식 아민 및 염기성 이온 교환 수지, 예컨대, 암모니아, 아이소프로필아민, 트라이메틸아민, 다이에틸아민, 트라이에틸아민, 트라이프로필아민, 다이에탄올아민, 에탄올아민, 데칸올, 2-다이메틸아미노에탄올, 2-다이에틸아미노에탄올, 다이사이클로헥실아민, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 카페인, 프로카인, 하이드라바민, 콜린, 베타인, 베네타민, 벤자틴, 에틸렌다이아민, 글루코사민, 메틸글루카민, 테오브로민, 트라이에탄올아민, 트로메타민, 퓨린, 피페라진, 피페리딘, N-에틸피페리딘, 폴리아민 수지 등을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 특히 바람직한 유기 염기는 아이소프로필아민, 다이에틸아민, 에탄올아민, 트라이메틸아민, 다이사이클로헥실아민, 콜린 및 카페인이다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예컨대, 소듐 라우릴 설페이트 및 스테아르산마그네슘, 뿐만 아니라 착색제, 방출제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 향수, 보존제 및 항산화제가 또는 조성물에 존재할 수 있다.
약제학적으로-허용 가능한 항산화제의 예는 하기를 포함한다: (1) 수용성 항산화제, 예컨대, 아스코르브산, 시스테인 염산염, 소듐 바이설페이트, 소듐 메타바이설파이트, 소듐 설파이트 등; (2) 유용해성(oil-soluble) 항산화제, 예컨대, 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 하이드록시아니솔(BHA), 부틸화 하이드록시톨루엔(BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이팅제, 예컨대, 시트르산, 에틸렌다이아민 테트라아세트산(EDTA), 솔비톨, 타타르산, 인산 등.
다양한 유형의 투여에 적합한 제형과 관련한 추가 지침은 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mace Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed. (1985)]에서 찾아볼 수 있다. 약물 전달 방법의 간략한 검토를 위해서, 문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]을 참고하기 바란다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위한 키트를 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트는 하기를 포함할 수 있다:
(a) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 핵산 분자;
(b) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 핵산 분자를 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(c) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 단백질;
(d) 1종 이상의 내인성 표적 유전자에 의해서 암호화된 유전자 생성물의 발현을 감소시키거나 기능을 변형시킬 수 있는 변형 단백질을 암호화하는 1종 이상의 뉴클레오타이드;
(e) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
(f) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(g) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(h) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(i) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 가이드 DNA(gDNA);
(j) 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gDNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(k) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(l) gDNA와 상호작용하여 내인성 유전자 내의 표적 DNA 서열을 변형시킬 수 있는 폴리펩타이드를 변형시키는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드;
(m) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA;
(n) 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열에 결합할 수 있는 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드;
(o) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 1종 이상의 부위-지향된 변형 폴리펩타이드;
(p) gRNA와 상호작용하여 내인성 유전자에 의해서 암호화된 표적 mRNA 서열을 변형시킬 수 있는 부위-지향된 변형 폴리펩타이드를 암호화하는 1종 이상의 폴리펩타이드; 또는
(q) 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포; 또는
(r) 이들의 임의의 조합물.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 1종 이상의 면역 관문 저해제를 추가로 포함한다. 몇몇 면역 관문 저해제가 당업계에 공지되어 있고, 1종 이상의 암의 치료를 위해서 FDA 승인되었다. 예를 들어, FDA-승인된 PD-L1 저해제는 아테졸리주맙(Tecentriq(등록상표), 제넨테크사(Genentech)), 아벨루맙(Bavencio(등록상표), 파이자사(Pfizer)), 및 더발루맙(Imfinzi(등록상표), 아스트라제네카(AstraZeneca))을 포함하고; FDA-승인된 PD-1 저해제는 펨브롤리주맙(Keytruda(등록상표), 머크사(Merck)) 및 니볼루맙(Opdivo(등록상표), 브리스톨-마이어스 스큅사(Bristol-Myers Squibb))을 포함하고; FDA-승인된 CTLA4 저해제는 이필리무맙(Yervoy(등록상표), 브리스톨-마이어스 스큅사)을 포함한다. 추가 치료제의 표적일 수 있는 추가적인 저해성 면역 관문 분자는 A2AR, B7-H3, B7-H4, BTLA, IDO, LAG3(예를 들어, BMS-986016, BSM에 의해서 개발 중임), KIR(예를 들어, 리릴루맙, BSM에 의해서 개발 중임), TIM3, TIGIT 및 VISTA를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분(또는 1종 이상의 성분을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드) 및 당업계에 공지된 1종 이상의 면역 관문 저해제(예를 들어, PD1 저해제, CTLA4 저해제, PDL1 저해제 등)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분(또는 1종 이상의 성분을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드) 및 항-PD1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포(또는 이의 집단) 및 당업계에 공지된 1종 이상의 면역 관문 저해제(예를 들어, PD1 저해제, CTLA4 저해제, PDL1 저해제 등)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 키트는 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포(또는 이의 집단) 및 항-PD1 항체(예를 들어, 펨브롤리주맙 또는 니볼루맙)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 키트는 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분(또는 1종 이상의 성분을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드) 및 성분을 재구성 및/또는 희석시키기 위한 시약을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 유전자-조절 시스템 중 1종 이상의 성분(또는 1종 이상의 성분을 암호화하는 1종 이상의 폴리뉴클레오타이드)을 포함하고, 1종 이상의 추가 시약을 추가로 포함하며, 여기서 이러한 추가 시약은 세포에 유전자-조절 시스템을 도입하기 위한 완충제; 세척 완충제; 대조군 시약; 대조군 발현 벡터 또는 RNA 폴리뉴클레오타이드; DNA로부터 유전자-조절 시스템의 시험관내 생산을 위한 시약 등으로부터 선택될 수 있다. 키트의 성분은 별개의 용기에 존재할 수 있거나 단일 용기에 조합될 수 있다.
상기에 언급된 성분에 더하여, 일부 실시형태에서 키트는 본 개시내용의 방법을 실시하기 위해서 키트의 성분을 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함한다. 방법을 실시하기 위한 설명서는 일반적으로 적합한 기록 매체에 기록된다. 예를 들어, 설명서는 종이 또는 플라스틱 등과 같은 기판 상에 인쇄될 수 있다. 이와 같이 설명서는 키트에 패키지 삽입물로서 또는 키트의 용기 또는 그 구성 요소의 라벨링으로서 존재할 수 있다(즉, 포장 또는 하위 포장과 관련됨). 다른 실시형태에서, 설명서는 예를 들어, 컴퓨터 판독 가능 매체와 같은 적절한 컴퓨터 판독 가능 저장 매체, CD-ROM, 디스켓, 플래시 드라이브 등 상에 존재하는 전자 저장 데이터 파일로서 존재한다. 다른 실시형태에서, 실제 설명서는 키트에 존재하지 않지만, 예를 들어, 인터넷을 통해서 원격 소스로부터 설명서를 얻는 수단이 제공된다. 이 실시형태의 예는 설명서를 볼 수 있고/있거나 설명서를 다운로드할 수 있는 웹 주소를 포함하는 키트이다. 설명서와 마찬가지로, 설명서를 얻기 위한 이러한 수단은 적절한 기판에 기록된다.
VII. 치료 방법 및 응용
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포 및 유전자-조절 시스템은 다양한 치료 응용에 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포 및/또는 유전자-조절 시스템은 유전자 요법과 같은 목적을 위해, 예를 들어, 질환을 치료하기 위해서, 항바이러스제로 사용하기 위해, 항-병원체로 사용하기 위해, 항암 치료제로 사용하기 위해, 또는 생물학적 연구를 위해서 대상체에게 투여될 수 있다.
일부 실시형태에서, 대상체는 신생아, 청소년 또는 성인일 수 있다. 포유동물 대상체가 특히 중요하다. 본 방법으로 치료될 수 있는 포유동물 종은 개 및 고양이; 말; 소; 양 등 및 영장류, 특히 인간을 포함한다. 동물 모델, 특히 작은 포유동물(예를 들어, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터, 토끼 등)이 실험 조사에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포, 이의 집단 및 이의 조성물의 투여는 주사, 관개, 흡입, 소비, 전기 삼투, 혈액 투석, 이온 삼투 및 기타 당업계에 공지된 다른 방법에 의해 일어날 수 있다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 국소적이거나 전신적이다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 동맥내, 두개내, 피부내, 십이지장내, 유방내, 수막내, 복강내, 척수강내, 종양내, 정맥내, 유리체내, 안내, 비경구, 척추, 피하, 요관, 요도, 질 또는 자궁내이다.
일부 실시형태에서, 투여 경로는 주입에 의한 것이다(예를 들어, 연속적 또는 볼러스(bolus)). 국소 투여 방법, 즉, 부상 또는 질환 부위로의 전달의 예는, 예를 들어, 옴마야(Ommaya) 저장소를 통한 것, 예를 들어, 척수강내 전달을 위한 것(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 제5,222,982호 및 제5,385,582호 참조); 볼러스 주사에 의한 것, 예를 들어, 주사기에 의한 것, 예를 들어, 관절 내로; 연속 주입에 의한 것, 예를 들어, 대류(convection)과 같은 것을 사용한 배관 삽입에 의한 것(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 공개 제2007-0254842호 참조); 또는 세포가 가역적으로 부착된 장치를 이식하는 것에 의한 것(예를 들어, 본 명세서에 참조에 의해 포함된 미국 특허 출원 공개 제2008-0081064호 및 제2009-0196903호 참조)을 포함한다. 일부 실시형태에서, 투여 경로는 국소 투여 또는 직접 주사에 의한 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 대상체에게 단독으로 또는 적합한 기질 또는 매트릭스와 함께 제공되어, 예를 들어, 이식될 조직에서 성장 및/또는 조직을 지원할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 1×103개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 적어도 5×103개 세포, 1×104개 세포, 5×104개 세포, 1×105개 세포, 5×105개 세포, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 1×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 5×1012 또는 그 초과의 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×108 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×109 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×1010 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×1011 내지 약 1×1012개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×1011개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×1010개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×109개 세포가 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 약 1×107 내지 약 1×108개 세포가 대상체에게 투여된다. 대상체에 대한 치료의 투여 횟수는 달라질 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포를 대상체 내로 도입하는 것은 일회성 사건일 수 있다. 일부 실시형태에서, 이러한 치료는 진행 중인 일련의 반복 치료를 요구할 수 있다. 일부 실시형태에서, 효과가 관찰되기 전에 변형된 면역 효과기 세포의 다중 투여가 필요할 수 있다. 정확한 프로토콜은 질환 또는 병태, 질환의 단계 및 치료될 개별 대상체의 파라미터에 따라 달라진다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 유전자 치료 또는 생물학적 연구와 같이 생체내에서 세포 DNA 또는 RNA를 변형시키기 위해 사용된다. 이러한 실시형태에서, 유전자-조절 시스템은 상기에 기재된 방법에서와 같이 대상체에게 직접 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 면역 효과기 세포 집단의 생체외 또는 시험관내 변형에 사용된다. 이러한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 유전자-조절 시스템은 면역 효과기 세포를 포함하는 샘플에 투여된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 자가유래 면역 효과기 세포이다. 이와 관련하여 용어 "자가유래"는 이들이 투여된 동일한 대상체로부터 유래된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 효과기 세포는 대상체로부터 얻어지고, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생체외에서 변형된 후, 질환을 치료하기 위해 동일한 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 세포는 자가유래 면역 효과기 세포이다. 일부 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 변형된 면역 효과기 세포 또는 이의 조성물은 동종이계 면역 효과기 세포이다. 이와 관련하여 용어 "동종이계"는 한 대상체로부터 유래되고 다른 대상체에게 투여된 세포를 지칭한다. 예를 들어, 면역 효과기 세포는 제1 대상체로부터 얻어지고, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 생체외에서 변형된 후, 질환을 치료하기 위해 제2 대상체에게 투여될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 대상체에게 투여되는 세포는 동종이계 면역 효과기 세포이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포는 질환을 치료하기 위해서 대상체에게 투여된다. 일부 실시형태에서, 치료는 유효량의 세포의 집단(예를 들어, 변형된 면역 효과기 세포의 집단) 또는 이들의 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하는 것을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료는 (a) 질환의 저해, 즉, 질환 발달의 정지 또는 질환 진행의 예방; (b) 질환을 완화시키는 것, 즉 질환 상태의 퇴행을 유발하거나 질환의 하나 이상의 증상을 완화시키는 것; 및 (c) 질환 치료, 즉, 하나 이상의 질환 증상의 완화를 포함하는, 포유동물, 예를 들어, 인간에서 질환의 치료를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 치료는 하나 이상의 질환 증상에서의 단기(예를 들어, 일시적 및/또는 급성) 및/또는 장기(예를 들어, 지속) 감소를 지칭할 수 있다. 일부 실시형태에서, 치료는 질환 증상의 개선 또는 향상을 초래한다. 개선은 관찰 가능하거나 측정 가능한 개선이거나, 또는 대상체의 전반적인 건강 느낌의 개선일 수 있다.
특정 대상체에게 투여되는 변형된 면역 효과기 세포의 유효량은 다양한 인자에 좌우될 것이며, 그 중 몇몇은 치료될 장애 및 장애의 중증도; 사용되는 특정 작용제(들)의 활성; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이; 투여 시기, 투여 경로; 치료 기간; 조합하여 사용되는 약물; 처방 의사의 판단; 의학 분야에 공지된 유사한 인자를 포함하여 환자마다 상이할 것이다.
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포의 유효량은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 초과 배수의 종양 질량 또는 부피 감소, 종양 세포 수 감소 또는 전이 횟수 감소일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유효량의 변형된 면역 효과기 세포는 기대 수명의 증가, 무진행 또는 무질환 생존의 증가 또는 치료될 질환과 연관된 다양한 생리학적 증상의 개선을 달성하는데 필요한 세포의 수일 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포의 유효량은 적어도 1×103개 세포, 예를 들어, 5×103개 세포, 1×104개 세포, 5×104개 세포, 1×105개 세포, 5×105개 세포, 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 1×107, 1×108, 5×108, 1×109, 5×109, 1×1010, 5×1010, 1×1011, 5×1011, 1×1012, 5×1012 또는 그 초과의 세포일 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포 및 유전자-조절 시스템은 세포-증식성 장애, 예컨대, 암의 치료에 사용될 수 있다. 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암은 혈액 암 및 고형 종양을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에 개시된 조성물 및 방법을 사용하여 치료될 수 있는 암은 선종, 암종, 육종, 백혈병 또는 림프종을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 암은 만성 림프구성 백혈병(chronic lymphocytic leukemia: CLL), B 세포 급성 림프구성 백혈병(B cell acute lymphocytic leukemia: B-ALL), 급성 림프모구성 백혈병(acute lymphoblastic leukemia: ALL), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia: AML), 비호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma: NHL), 확산성 대세포 림프종(diffuse large cell lymphoma: DLCL), 확산성 거대 B 세포 림프종(diffuse large B cell lymphoma: DLBCL), 호지킨 림프종, 다발성 골수종, 신장 세포 암종(RCC), 신경 모세포종, 결장직장암, 방광암, 유방암, 결장직장암, 난소암, 흑색종, 육종, 전립선암, 폐암, 식도암, 간세포 암종, 췌장암, 성상세포종, 중피종, 두경부암 및 수모세포종 및 간암이다. 일부 실시형태에서, 암은 흑색종, 두경부암, 방광암, 폐암, 자궁경부암, 췌장암, 유방암 및 결장직장암으로부터 선택된다. 일부 실시형태에서, 암은 PD1 저해제로의 치료에 비민감성이거나 내성이 있다. 일부 실시형태에서, 암은 PD1 저해제로의 치료에 비민감성이거나 내성이 있고, 흑색종, 두경부암, 방광암, 폐암, 자궁경부암, 췌장암, 유방암 및 결장직장암으로부터 선택된다.
상기에 기재된 바와 같이, 몇몇 면역 관문 저해제는 현재 다양한 종양학적 적응증(예를 들어, CTLA4 저해제, PD1 저해제, PDL1 저해제 등)에 사용하기 위해 승인되어 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 내인성 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는 변형된 면역 효과기 세포의 투여는 면역 관문 저해제로 처리한 후 관찰되는 것보다 개선된 치료 효과(예를 들어, 종양 성장의 보다 현저한 감소, 림프구에 의한 종양 침윤의 증가, 무진행 생존 기간의 증가 등)를 초래한다.
또한, 일부 종양학적 적응증은 면역 관문 저해제로의 치료에 반응하지 않는다(즉, 비민감성이다). 또한 여전히, 면역 관문 저해제로의 치료에 초기에 반응성인(즉, 민감한) 일부 종양학적 적응증은 치료 과정 동안 저해제-내성 표현형을 발생시킨다. 따라서, 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포 또는 이의 조성물은 1종 이상의 면역 관문 저해제로의 치료에 내성(또는 부분적으로 내성) 또는 비민감성인(또는 부분적으로 비민감성인) 암을 치료하기 위해 투여된다. 일부 실시형태에서, 1종 이상의 면역 관문 저해제로의 치료에 내성(또는 부분적으로 내성) 또는 비민감성인(또는 부분적으로 비민감성인) 암을 앓고 있는 대상체에게 변형된 면역 효과기 세포 또는 이의 조성물을 투여하면 암의 치료(예를 들어, 종양 성장의 감소, 무진행 생존 기간의 증가 등)를 초래한다. 일부 실시형태에서, 암은 PD1 저해제에 의한 치료에 내성(또는 부분적으로 내성) 또는 비민감성이다(또는 부분적으로 비민감성이다).
일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포 또는 이들의 조성물은 면역 관문 저해제와 조합하여 투여된다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포 또는 이의 조성물은 면역 관문 저해제와 조합하여 투여하면, 변형된 면역 효과기 세포 또는 면역 관문 저해제 단독으로의 치료에 의해 관찰되는 것보다 면역 관문 저해제에 의한 치료에 대해 내성, 불치성 또는 비민감성인 암에서의 치료 효과를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 변형된 면역 효과기 세포 또는 이의 조성물은 면역 관문 저해제와 조합하여 투여하면, 변형된 면역 효과기 세포 또는 면역 관문 저해제 단독으로의 치료에 의해 관찰되는 것보다 면역 관문 저해제에 의한 치료에 대해 부분적으로 내성, 부분적으로 불치성 또는 부분적으로 비민감성인 암에서의 치료 효과를 향상시킨다. 일부 실시형태에서, 암은 PD1 저해제에 의한 치료에 내성(또는 부분적으로 내성), 불치성(부분적으로 불치성) 또는 비민감성이다(또는 부분적으로 비민감성이다).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형 면역 효과기 세포 또는 이의 조성물을 항-PD1 항체와 조합하여 투여하면, 항-PD1 항체 단독에 의한 치료에 내성이거나 비민감성인 암에서의 치료 효과가 향상된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형 면역 효과기 세포 또는 이의 조성물을 항-PD1 항체와 조합하여 투여하면, 항-PD1 항체 단독에 의한 치료에 부분적으로 내성이거나 부분적으로 비민감성인 암에서의 치료 효과가 향상된다.
면역 관문 저해에 대한 내성 또는 민감성을 나타내는 암은 당업계에 공지되어 있으며, 다양한 생체내 및 시험관내 모델에서 시험될 수 있다. 예를 들어, 일부 흑색종은 항-PD1 항체와 같은 면역 관문 저해제로의 치료에 민감하고, 생체내 B16-Ova 종양 모델에서 모델링될 수 있다(실시예 6, 7, 16 및 19 참조). 또한, 일부 결장직장암은 항-PD1 항체와 같은 면역 관문 저해제로의 치료에 내성이 있는 것으로 공지되어 있으며, PMEL/MC38-gp100 모델로 모델링될 수 있다(실시예 8 및 17 참조). 또한, 일부 림프종은 항-PD1 항체와 같은 면역 관문 저해제로의 치료에 비민감성인 것으로 공지되어 있으며, Raji 세포와 같은 림프종 세포주의 입양 전달 또는 피하 투여에 의해 다양한 모델로 모델링될 수 있다(실시예 12, 14, 15, 21 및 22 참조).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 변형된 면역 효과기 세포 및 유전자-조절 시스템은 바이러스 감염의 치료에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 바이러스는 아데노바이러스, 헤르페스 바이러스(예를 들어, 단순 포진 바이러스 및 엡스타인 바 바이러스 및 대상 포진 바이러스 포함), 폭스바이러스, 파포바 바이러스, 간염 바이러스(예를 들어, B형 간염 바이러스 포함) 및 C형 간염 바이러스), 유두종 바이러스, 오쏘믹소 바이러스(예를 들어, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 인플루엔자 C 포함), 파라믹소바이러스, 코로나 바이러스, 피코르나 바이러스, 레오바이러스, 토가바이러스, 플라비 바이러스, 부니아비리대(bunyaviridae), 랍도바이러스, 로타바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스 또는 레트로바이러스 중 하나로부터 선택된다.
참조에 의한 포함
본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원은 이들의 전문이 모든 목적을 위해서 참조에 의해서 본 명세서에 포함된다. 그러나, 본 명세서에 인용된 모든 참고 문헌, 기사, 간행물, 특허, 특허 공개 및 특허 출원에 대한 언급은 이들이 유효한 선행 기술을 구성하거나 전 세계 모든 국가의 일반적인 지식의 공통의 일부를 구성한다는 인정 또는 어떠한 형태의 제안도 아니며, 그렇게 간주되어서는 안 된다.
실시예
실시예 1: 물질 및 방법
본 명세서에 기재된 실험은 상이한 T 세포 집단에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절하기 위해서 CRISPR/Cas9 시스템을 사용한다.
I. 물질
gRNA: 달리 제시되지 않는 한, 모든 실험은 단일-분자 gRNA(sgRNA)를 사용한다. 이중 gRNA 분자를 제시된 바와 같이 사용하였고, 200μM tracrRNA(IDT 카탈로그 번호 1072534)를 뉴클레아제 무함유 듀플렉스 완충제(IDT 카탈로그 번호11-01-03-01) 중에서 5분 동안 95℃에서 200μM의 표적-특이적 crRNA(IDT)와 듀플렉싱(duplexing)시켜서 100μM의 tracrRNA:crRNA 듀플렉스를 형성함으로써 이중 gRNA 분자를 형성하였으며, 여기서 tracrRNA 및 crRNA는 1:1비로 존재한다. 하기 실험에서 사용되는 gRNA의 표적화 서열을 하기 표 10에 제공한다.
Figure pct00013
Cas9: Cas9를 Cas9 mRNA 또는 Cas9 단백질의 도입에 의해서 표적 세포에 발현시켰다. 달리 제시되지 않는 한, 에스. 피오게네스(Trilink L-7206)로부터 유래된 핵 국지화 서열을 포함하는 Cas9-암호화 mRNA(Cas9-NLS mRNA) 또는 에스. 피오게네스(IDT 카탈로그 번호 1074182)로부터 유래된 Cas9 단백질을 하기 실험에서 사용하였다.
RNP: 1.2㎕의 100μM의 tracrRNA:crRNA 듀플렉스를 1㎕의 20μM의 Cas9 단백질 및 0.8㎕의 PBS와 조합함으로써 gRNA-Cas9 리보뉴클레오단백질(RNP)을 형성하였다. 혼합물을 RT에서 20분 동안 인큐베이션시켜 RNP 복합체를 형성하였다. 1부피의 44μM tracrRNA:crRNA 듀플렉스를 1부피의 36μM Cas9를 조합함으로써 뮤린 RNP를 형성하였다. 혼합물을 RT에서 20분 동안 인큐베이션시켜 RNP 복합체를 형성하였다.
마우스 : 야생형 CD8+ T 세포는 C57BL/6J 마우스(더 잭슨 래보러토리사(The Jackson Laboratory)(미국 메인주 바 하버 소재))로부터 유래되었다. 오브알부민(Ova)-특이적 CD8+ T 세포는 OT1 마우스(C57BL/6-Tg(TcraTcrb) 1100Mjb/J; 잭슨 래보러토리사)로부터 유래되었다. OT1 마우스는 오브알부민(Ova) 단백질의 잔기 257 내지 264를 인식하는 트랜스제닉 TCR을 포함한다. gp100-특이적 CD8+ T 세포는 PMEL 마우스(B6.Cg-Thy1<a>/CyTg(TcraTcrb) 8Rest/J; 더 잭슨 래보러토리사(미국 메인주 바 하버 소재), 카탈로그 번호 005023)로부터 유래되었다. Cas9 단백질을 구성적으로 발현하는 마우스는 잭슨 랩스(B6J.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm1.1(CAG-cas9*,-EGFP)Fezh/J; 더 잭슨 래보러토리사(미국 메인주 바 하버 소재), ME 균주 # 026179)로부터 입수하였고, Cas9를 구성적으로 발현하는 TCR-트랜스제닉 마우스는 OT1 및 PMEL 마우스를 Cas9 마우스와 번식시킴으로써 입수하였다.
CAR 발현 작제물: 인간 CD19, Her2/Erbb2 및 EGFR 단백질에 특이적인 CAR을 생성시켰다. 요약하면, 인간 과립구-대식세포 집락 자극 인자 수용체 소단위 알파(GMSCF-Rα)의 22개 아미노산 신호 펩타이드를 CD19, Her2/Erbb2 또는 EGFR 중 하나에 특이적으로 결합하는 항원-특이적 scFv 도메인에 융합시켰다. 인간 CD8α 줄기를 막관통 도메인으로서 사용하였다. CD3ξ 쇄의 세포내 신호전달 도메인을 CD8α 줄기의 세포질 단부에 융합시켰다. 항-CD19 CAR의 경우, scFv는 항-인간 CD19 클론 FMC63으로부터 유래되었다. 인간 HER2/ERBB2에 특이적인 CAR을 생성하기 위해, 트라스투주맙으로부터 유래된 항-인간 HER2 scFv를 사용하였다. 유사하게, EGFR에 특이적인 CAR을 생성시키기 위해, 세툭시맙으로부터 유래된 항-EGFR scFv를 사용하였다. 예시적인 CAR 작제물의 요약이 하기에 제시되어 있고, 전장 CAR 작제물의 아미노산 서열이 서열번호 26, 28 및 30에 제공되어 있고, 전장 CAR 작제물의 핵산 서열이 27, 29 및 31에 제공되어 있다.
Figure pct00014
조작된 TCR 발현 작제물: NY-ESO1, MART-1 및 WT-1에 특이적인 재조합 TCR을 생성시켰다. NY-ESO-1 펩타이드 SLLMWITQC(서열번호 2)에 특이적인 1G4 TCR, MART-1 펩타이드 AAGIGILTV(서열번호 3)에 특이적인 DMF4 및 DMF5 TCR을 암호화하는 쌍을 이룬 TCR-α:TCR-β 가변 영역 단백질 서열, 및 각각 HLA-A*02:01로 제시되는 WT-1 펩타이드에 특이적인 DLT 및 고-친화성 DLT TCR을 문헌으로부터 확인하였다(Robbins et al, Journal of Immunology 2008 180:6116-6131). TCRα 쇄는 V 및 J 유전자 분절 및 CDR3α 서열로 구성되었고, TCRβ 쇄는 V, D 및 J 유전자 분절 및 CDR3-β 서열로 구성되었다. 네이티브 TRAC(서열번호 22) 및 TRBC(서열번호 24) 단백질 서열을 각각 α 및 β 쇄 가변 영역의 C-말단 단부에 융합시켜 1G4-TCR α/β 쇄(각각 서열번호 11 및 12), 95:LY 1G4-TCR α/β 쇄(각각 서열번호 14 및 13), DLT-TCR α/β 쇄(각각 서열번호 5 및 4), 고-친화성 DLT-TCR α/β 쇄(각각 서열번호 8 및 7), DMF4-TCR α/β 쇄(각각 서열번호 17 및 16) 및 DMF5-TCR α/β 쇄(각각 서열번호 20 및 19)을 생성시켰다.
조작된 TCRα 및 TCRβ 쇄 단백질을 암호화하는 코돈-최적화된 DNA 서열을 생성시켰는데, 여기서 P2A 서열(서열번호 1)을 TCRβ 및 TCRα 쇄를 암호화하는 DNA 서열 사이에 삽입시켜, 양쪽 TCR 쇄의 발현을 화학량론적 방식으로 단일 프로모터로부터 제거하였다. 따라서, 조작된 TCR 쇄를 암호화하는 발현 카세트는 다음 포맷을 포함하였다: TCRβ - P2A - TCRα. 각각의 TCR 작제물에 대한 최종 단백질 서열을 서열번호 12(1G4), 서열번호 15(95:LY 1G4), 서열번호 6(DLT), 서열번호 9(고-친화성 DLT), 서열번호 18(DMF4) 및 서열번호 21(DMF5)에 제공한다.
CAR 및 TCR 작제물의 렌티바이러스 발현: 이어서, 상기에 기재된 CAR 및 조작된 TCR 발현 작제물을, 조작된 수용체의 발현을 유도하는 SFFV 프로모터, T2A 서열 및 퓨로마이신 내성 카세트를 포함하는 플라스미드에 삽입하였다. 달리 제시되지 않는 한, 이들 플라스미드는 1종 이상의 sgRNA의 발현을 유도하는 인간 또는 뮤린(T 세포가 유래되는 종에 따라서) U6 프로모터를 추가로 포함하였다. 조작된 TCR 발현 작제물을 포함하는 렌티바이러스 작제물은 내인성 TRAC 유전자를 표적화하는 sgRNA를 추가로 포함할 수 있는데, 이것은 T 세포 수용체의 α 쇄의 불변 영역을 암호화한다. 상기에 기재된 조작된 수용체를 암호화하는 렌티바이러스를 하기와 같이 생성시켰다. 간략하면, 289×106개의 LentiX-293T 세포를 형질주입 24시간 전에 5-층 CellTACK에 플레이팅하였다. 무혈청 OptiMEM과 TransIT-293을 합하고, 5분 동안 인큐베이션시키고, 그 후에 헬퍼 플라스미드(58㎍ VSVG 및 115㎍ PAX2-Gag-Pol)를 231㎍의 상기에 기재된 조작된 수용체- 및 sgRNA-발현 플라스미드와 조합하였다. 20분 후, 이 혼합물을 새로운 배지와 함께 LentiX-293T 세포에 첨가하였다. 배지를 형질주입 18시간 후에 교체하고, 바이러스 상청액을 형질주입 후 48시간에 수집하였다. 상청액을 Benzonase(등록상표) 뉴클레아제로 처리하고, 0.45㎛ 필터에 통과시켜 바이러스 입자를 단리시켰다. 이어서 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration: TFF)에 의해서 농축시키고, 분취하고, 역가하고, -80℃에서 저장하였다.
레트로바이러스 s gRNA 발현 및 작제물 및 생산: sgRNA 서열을 뮤린 U6 프로모터의 하류에서 플라스미드 내에 삽입하였다. 인간 CD2를 선택 가능한 마커로서 sgRNA의 하류에서 UbiC 프로모터 하에서 삽입하였다. 구제 실험을 수행하는 경우, 플라스미는 상기 요소뿐만 아니라 야생형 뮤린 Zc3h12a를 암호화하는 코돈 최적화된, gRNA-내성 cDNA를 포함하였다 레트로바이러스를 하기와 같이 생성시켰다. Phoenix-GP 세포(ATCC(등록상표) CRL-3215(상표명))를 생산자 세포로서 사용하였다. 80% 컨플루언트일 때, TransIT(등록상표)-293 형질주입 시약(미러스바이오사(Mirusbio), 카탈로그 번호 2706)을 사용하여 생산자 세포에 pCL-Eco 레트로바이러스 패키징 벡터, sgRNA를 암호화하는 플라스미드 및 상기에 기재된 표면 선택 마커를 형질주입시켰다. 형질주입 18시간 후, 배지를 완전 T 세포 배지(RPMI + 10% 열 불활성화 FBS, 20mM HEPES, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50μM 베타-머캅토에탄올)로 변화시켰다. 바이러스 상청액을 12시간마다 총 3회 수거물로 수거하고, 회전시키고, -80℃에서 동결시켰다.
II. 방법
인간 T 세포 단리 및 활성화: 전체 인간 PBMC를 Ficoll 구배 원심분리에 의해 신선한 류코팩으로부터 단리시켰다. CD8+ T-세포를 CD8+ T-세포 단리 키트(스템셀 테크놀로지즈사(Stemcell Technologies) 카탈로그 번호 17953)를 사용하여 전체 PBMC로부터 정제시켰다. T 세포 활성화를 위해, CD8+ T세포를 6.25㎕/㎖의 ImmunoCult T-세포 활성화제(항-CD3/CD28/CD2, 스템셀 테크놀로지즈사(캐나다 뱅쿠버 BC 소재)) 및 10ng/㎖의 인간 IL2를 함유한, T175 플라스크에서 X-VIVO 15 T Cell Expansion Medium(론자사, 카탈로그 번호 04-418Q)에 2×106개 세포/㎖로 플레이팅하였다. T-세포를 렌티바이러스 작제물로 형질도입하기 전에 18시간 동안 활성화시켰다.
인간 TIL 단리 및 활성화: 종양 침윤 림프구를 또한 본 명세서에 기재된 방법에 의해서 변형시킬 수 있다. 이러한 경우, 종양을 인간 환자로부터 외과적으로 절제하고, 메스 블레이드(scalpel blade)로 1㎣ 조각으로 절단하고, 단일 조각의 종양을 24 플레이트의 각각의 웰에 넣는다. 6000U/㎖의 재조합 인간 IL-2가 보충된 2㎖의 완전 TIL 배지(RPMI + 10% 열 불활성화된 인간 남성 AB 혈청, 1mM 피루베이트, 20㎍/㎖ 젠타마이신, 1X 글루타맥스)를 분리된 TIL의 각각의 웰에 첨가한다. 1㎖의 배지를 웰에서 제거하고, 필요에 따라 주당 3회까지 새로운 배지 및 IL-2로 교체하였다. 웰이 컨플루언스에 도달할 때, 그것을 새로운 배치 + IL-2에 1:1로 나눈다. 4 내지 5주 배양 후, 세포를 신속한 확장을 위해서 수거한다.
TIL 신속한 확장: 20㎖ TIL 배지 + 20㎖의 Aim-V 배지(인비트로젠사) + 30ng/㎖ OKT3 mAb에서 26×106개의 동종이계의 조사된(5000cGy) PBMC 피더 세포로 500,000개의 TIL을 활성화시킴으로써 TIL을 빠르게 확장시킨다. 48시간 후(2일), 6000U/㎖의 IL-2를 배양물에 첨가한다. 5일째에, 20㎖의 배지를 제거하고, 20㎖의 새로운 배지(+ 30ng/㎖ OKT3)를 첨가한다. 7일째에, 세포수를 계수하고, 사용 가능한 세포수에 따라서, G-Rex6M 웰 플레이트(윌슨 울프사(Wilson Wolf), 카탈로그 번호 80660M) 또는 G-Rex100M(윌슨 울프사, 카탈로그 번호 81100S)에서 60×106개 세포/ℓ로 재시딩한다. 6000U/㎖의 신선한 IL-2를 9일에 추가하고, 3000U/㎖의 신선한 IL-2를 12일에 추가한다. TIL을 14일에 수거한다. 이어서, 확장된 세포를 Coolcell Freezing 컨테이너(코닝사)를 사용하여 Cryostor CS-10(스템셀 테크놀로지즈사 카탈로그 번호 07930)에서 서서히 냉동하고, 액체 질소에서 장기간 저장한다.
뮤린 T 세포 단리 및 활성화: 제조사의 권고에 따라, WT 또는 트랜스제닉 마우스로부터의 비장을 GentleMACS 시스템을 사용하여 수거하고, 단일 세포 현탁액으로 감소시켰다. 정제된 CD8+ T 세포를 EasySep 마우스 CD8+ T Cell Isolation Kit(스템셀사 카탈로그 번호 19853)를 사용하여 수득하였다. CD8 T-세포를 2ng/㎖의 재조합 마우스 IL-2(바이오레전드사 카탈로그 번호 575406)가 보충된 완전 T 세포 배지(RPMI + 10% 열 불활성화된 FBS, 20mM HEPES, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50μM 베타-머캅토에탄올)에서 1×106개 세포/㎖로 배양하고, 항-CD3/항-CD28 비드(T-세포 확장 및 활성화를 위한 Dynabeads(상표명) 마우스 T-활성화제 CD3/CD28, 카탈로그 번호 11456D)로 활성화시켰다.
인간 T 세포의 렌티바이러스 형질도입: 18시간 전에 활성화된 T-세포를, 1.5㎖ 부피의 X-VIVO 15 배지, 10ng/㎖ 인간 IL-2 및 12.5㎕ Immunocult Human CD3/CD28/CD2 T-세포 활성화제로, 6웰 플레이트에서, 웰당 5×106개 세포로 시딩하였다. 조작된 수용체를 발현하는 렌티바이러스를 모든 세포의 80%를 감염시킬 수 있는 MOI로 첨가하였다. 25㎕의 레트로넥틴(Retronectin)(1mg/㎖)을 각각의 웰에 첨가하였다. XVIVO-15 배지를 웰당 2.0㎖의 최종 부피에 첨가하였다. 달리 제시되지 않는 한, 렌티바이러스를 또한 sgRNA를 발현하였다. 플레이트를 600xg로 1.5시간 동안 실온에서 회전시켰다. 18시간(2일) 후, 세포를 세척하고, 1×106개 세포/㎖로 X-VIVO 15, 10ng/㎖ IL2 + T-세포 활성화제에 시딩하였다.
뮤린 T 세포의 레트로바이러스 형질도입: 제시된 경우, 레트로바이러스 형질도입에 의해서 gRNA를 Cas9 트랜스제닉 T 세포에 도입하였다. 24시간 전에 활성화된 뮤린 T-세포를, 5㎍/㎖ RetroNectin(타카라 클론테크사(Takara Clontech) 카탈로그 번호 T100B)으로 코팅된 6웰 플레이트 내에서, 5㎍/㎖ 프로타민 설페이트 및 2ng/㎖의 재조합 마우스 IL-2를 함유한 2㎖ 레트로바이러스 상청액 중에, 웰당 3×106개 세포로 시딩하였다. 레트로바이러스는 gRNA 및 표면 선택 마커(hCD2 또는 CD90.1)를 발현한다. 플레이트를 600xg로 1.5시간 동안 실온에서 회전시켰다. 18시간(2일차) 후, 세포를 세척하고, 2ng/㎖의 재조합 마우스 IL-2가 보충된 완전 T 세포 배지 중에 1×106개 세포/㎖로 시딩하였다. 24시간 감염 후, 세포를 세척하고, IL-2가 보충된 완전 T 세포 배지 중에서 배양하였다. 24시간 후, 활성화 비드를 제거하고, 감염된 세포를 EasySep 인간 CD2 양성 선택 키트(스템셀사 카탈로그 번호 18657) 또는 EasySep 마우스 CD90.1 양성 선택 키트(스템셀사 카탈로그 번호 18958)를 사용하여 정제시켰다. 편집된 뮤린 CD8 T를 IL-2가 보충된 완전 T 세포 배지에서 추가 1 내지 4일 동안 1×106개 세포/㎖로 배양하였다.
인간 T 세포의 전기천공: T 세포 활성화 후 3일째에, T 세포를 수거하고, 뉴클레오펙션 완충제(18% 보충 1, Amaxa P3 일차 세포 4D-Nuclefector X 키트 S로부터의 82% P3 완충제)에 100×106개 세포/㎖로 재현탁하고, 1.5㎕의 sgRNA/Cas9 RNP 복합체(120p㏖의 crRNA:tracrRNA 듀플렉스 및 20p㏖의 Cas9 뉴클레아제 함유)를 첨가하고, 2.1㎕(100p㏖)의 전기천공 인핸서를 20㎕의 세포 용액당 첨가하였다. 이어서 25㎕의 세포/RNP/인핸서 혼합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 세포를 "EO-115" 프로그램으로 론자 전기천공기를 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 후, 80㎕의 따뜻한 X-VIVO 15 배지를 각각의 웰에 첨가하고, 세포를 배양 플라스크에 IL-2를 함유하는 X-VIVO 15 배지(10ng/㎖) 중에서 2×106개 세포/㎖의 밀도로 풀링(pooling)시켰다. 4일째에, 세포를 세척하고, 세포수를 계수하고, 사용 가능한 세포수에 따라서, G-Rex6M 웰 플레이트 또는 G-Rex100M에서 IL-2를 함유하는 X-VIVO 15 배지(10ng/㎖)에서 50 내지 100×106개 세포/ℓ로 시딩하였다. 6일 및 8일에, 10ng/㎖의 새로운 재조합 인간 IL-2를 배양물에 첨가하였다.
마우스 T 세포의 전기천공: 48시간 전에 활성화된 뮤린 T-세포를 수거하고, 활성화 비드를 제거하고, 세포를 세척하고, Neon 뉴클레오펙션 완충제에 재현탁시켰다. 9uL 완충제 T에 재현탁된 최대 2×106개 세포 및 90㎕ 완충제 T에 재현탁된 20×106개 세포를 각각 Neon(상표명) 10-㎕ 팁 및 Neon(상표명) 100-㎕ 팁을 사용하여 전기천공할 수 있다. gRNA/Cas9 RNP 복합체 또는 ZFN mRNA(10㎕ 팁당 1㎕ 또는 100㎕ 팁당 10㎕) 및 10.8μM 전기천공 인핸서(10㎕ 팁당 2㎕ 또는 100㎕ 팁당 20㎕)를 세포에 첨가하였다. gRNA/Cas9 RNP 복합체 또는 ZFN mRNA와 혼합된 T-세포를 Neon(상표명) 팁에 피펫팅하고, Neon 형질주입 시스템(1700V/20ms/1펄스)을 사용하여 전기천공하였다. 전기천공 직후에, 세포를 2ng/㎖의 재조합 마우스 IL-2가 보충된 따뜻한 완전 T 세포 배지에 1.6×106개 세포/㎖의 밀도로 배양 플라스크로 옮겼다. 편집된 뮤린 CD8 T 세포를 IL-2가 보충된 완전 T 세포 배지에서 추가 1 내지 4일 동안 1×106개 세포/㎖로 추가로 배양하였다.
조작된 T 세포의 정제 및 특징규명: T 세포 활성화 10일 후, 세포를 배양 플라스크로부터 제거하고, 편집된 조작된 수용체-발현 CD8+ T 세포를 정제시켰다. 조작된 수용체의 발현을 항체 염색, 예를 들어, DMF4 TCR의 경우 Vβ12 또는 NY-ESO-1 또는 1G4의 경우 Vβ13/13.1에 대한 항체에 의해서 결정할 수 있다. 표적 유전자의 편집의 추가 결정을 표면 단백질(예를 들어, CD3)의 FACS 분석, 표적 단백질의 웨스턴 블롯 및/또는 게놈 절단-부위의 TIDE/NGS 분석에 의해서 평가할 수 있다. 이어서, 정제된 세포를 추가 사용을 위해서 Cryostor CS-10(스템셀 테크놀로지즈사, 카탈로그 번호 07930)에서 서서히 냉동하고, 추가 사용을 위해서 액체 질소에서 장기간 저장할 수 있다.
실시예 2: 편집된, 수용체-조작된 T 세포의 특징규명
편집된 수용체-발현 세포를 CD3의 세포 표면 발현에 기초하여 정제시켜 실험을 수행하였다. 조작 전에, CD8+ T 세포는 TCR α/β 쇄를 포함하는 복합체의 부분으로서 세포 표면 상에서 CD3 분자를 발현한다(도 4A). T 세포에 CAR, TRAC 유전자를 표적화하는 가이드 RNA, 및 B2M 유전자를 표적화하는 가이드 RNA를 발현하는 렌티바이러스를 형질도입하였는데, 이것을 사용하여 표적 유전자 편집에 대한 대용물(proxy)로서 비-TCR 유전자의 편집을 평가하였다. 렌티바이러스 형질도입 및 Cas9 mRNA 전기천공 후, 성공적으로 형질도입되고 편집된 T 세포는TRAC 유전자의 편집으로 인해서 표면 CD3 발현의 손실을 나타내고, B2M 유전자의 편집으로 인해서 HLA-ABC 발현의 손실을 나타낸다(도 4B). CD3-발현 세포를 EasySep 인간 CD3-양성 선택 키트(스템셀 테크사, 카탈로그 번호 18051)를 사용하여 벌크 집단으로부터 제거하였다(도 4B). 이어서, 세포를 CD3에 대한 2회 라운드의 음성 자성 선택에 적용하였다. 이 과정은 상당히 정제된 CD3-음성 T 세포 발현을 나타내었다(도 4C). 재조합 CD19-Fc 시약(이것은 CD19 CAR에 결합함)으로의 염색은, 편집된 세포가 CD19 CAR의 표면 발현을 나타내지만, 비편집된 세포는 그렇지 않음을 입증하였다(도 4D). CD45 및 B2M 표적화 sgRNA를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. CD45를 평가함으로써 T 세포에서 Cas9 편집 활성을 확인하였고, 유세포 분석법에 의한 B2M 발현을 96시간 후에 평가하였고, FACS에 의해서 결정된 바와 같이 T 세포의 표면 상에서의 CD45 발현의 손실에 의해서 효율적인 Cas9 기능이 제시된다. Cas9 mRNA 및 Cas9 RNP를 사용한 공동-전기천공은 CD45 및 B2M 유전자좌에서의 실질적인 편집으로 이어졌고, 세포의 66.3%가 이중 편집을 나타내었다.
상기 실시예에서 기재된 바와 같이 표적 편집을 수행하였고, 분해에 의한 인델 추적(Tracking of Indels by Decomposition: TIDE) 분석 방법 및 웨스턴 블롯 분석을 사용하여 단일 예시적 유전자 CBLB의 편집을 확인하였다. TIDE는 편집 효능을 정량하고, 표적화된 세포 풀의 DNA에서 주요 유형의 삽입 및 결실(인델)을 식별한다.
공급업체 권고 프로토콜에 따라 Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit(카탈로그 번호: 13323)를 사용하여 편집된 T 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 단리시키고, 정량하였다. gDNA 단리 후, PCR을 수행하여 유전자좌 특이적 PCR 프라이머(F: 5'-CCACCTCCAGTTGTTGCATT-3'(서열번호 32); R: 5'-TGCTGCTTCAAAGGGAGGTA-3'(서열번호 33)를 사용하여 편집된 DNA의 영역을 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔에서 전개시키고, 추출시키고, QIAquick Gel Extraction Kit(카탈로그 번호: 28706)를 사용하여 정제시켰다. 추출된 산물을 생어 서열결정에 의해서 서열결정하였고, 생어 서열결정 크로마토그램 서열 파일을 TIDE로 분석하였다. gRNA/Cas9 RNP 복합체 또는 gRNA 발현 렌티바이러스(각각의 경우에, 사용된 CBLB gRNA는 서열번호 288임)가 도입된 Cas9 mRNA를 사용하는 방법에 의해 편집된 CBLB-편집 T 세포에서, 생성된 TIDE 분석은 CBLB 표적 유전자의 편집을 확인하였다. TIDE 이외에, CBLB 단백질 수준의 고갈은 항-CBLB 항체(SCT 카탈로그 번호 9498)를 사용하여 웨스턴 블롯에 의해서 확인하였다. 데이터를 도 5A 및 5B 및 도 6에 제공한다.
유전자의 편집이 평가되는 또 다른 방법은 차세대 서열결정이다. 이러한 방법을 위해서, 공급업체 권고 프로토콜에 따라 Qiagen Blood and Cell Culture DNA Mini Kit(카탈로그 번호: 13323)를 사용하여 편집된 T 세포로부터 게놈 DNA(gDNA)를 단리시키고, 정량하였다. gDNA 단리 후, PCR을 수행하여, 일루미나 차세대 서열결정 어댑터의 첨가를 위해서 필요한 오버행을 함유하는 유전자좌 특이적 PCR 프라이머를 사용하여 편집된 DNA의 영역을 증폭시켰다. 생성된 PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켜, Monarch PCR & DNA Cleanup Kit(카탈로그 번호: T1030S)를 사용하여 공급업체 권고된 프로토콜에 따라서 PCR 세척을 수행하기 전에 일어난 게놈 유전자좌의 특이적이고 적절한 증폭을 보장한다. 이어서, 정제된 PCR 생성물을 정량하고, 제2 PCR을 수행하여 일루미나 서열결정 어댑터를 어닐링하고, 멀티플렉싱에 필요한 특이적 인덱싱 서열을 샘플링하였다. 그후, PCR 생성물을 1% 아가로스 겔 상에서 전개시켜 크기를 평가하고, 그 후 AMPure XP 비드(내부에서 제조)를 사용하여 정제시켰다. 이어서, 정제된 PCR 생성물을 Kapa Illumina Library Quantification Kit(카탈로그 번호: KK4923) 및 Kapa Illumina Library Quantification DNA Standards(카탈로그 번호: KK4903)를 사용하여 qPCR을 통해서 정량하였다. 이어서, 정량화 생성물을 Illumina NextSeq 500/550 Mid Output Reagent Cartridge v2(카탈로그 번호: FC-404-2003)를 사용하여 Illumina NextSeq 500 시스템 상에 로딩하였다. 생성된 서열결정 데이터의 분석을 수행하여 편집된 T 세포 풀의 DNA에서 예상된 절단 부위에서 삽입 및 결실(인델)을 평가하였다.
실시예 3: OT1/B16-Ova CRISPR/Cas9 기능성 게놈 스크린을 통한 입양 T 세포 전달 요법 표적의 식별
종양에서 T 세포의 축적을 조절하는 표적을 식별하기 위해 실험을 수행하였다. 풀링된 CRISPR 스크린을 수행하였는데, 여기서 각각이 단일 유전자를 표적화하는 sgRNA 풀을 종양-특이적 T 세포의 집단에 도입하여, 집단 내의 각각의 세포는 단일 유전자를 표적화하는 단일 sgRNA를 포함하였다. 종양 샘플에서 T 세포의 축적에 대한 특정 유전자의 효과를 결정하기 위해서, T 세포 집단에서 각각의 sgRNA의 빈도를 실험 시작 시에 결정하고, 실험에서 추후 시간 지점에서 동일한 sgRNA의 빈도와 비교하였다. 종양 샘플에서 T 세포 축적을 양으로 조절하는 유전자(예를 들어, T 세포 증식, 생존력 및/또는 종양 침윤을 양으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 시간이 따라 증가할 것으로 예상되는 반면, 종양 샘플에서 T 세포 축적을 음으로 조절하는 유전자(예를 들어, T 세포 증식, 생존력 및/또는 종양 침윤을 음으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 종양 샘플에서 시간에 따라 감소할 것으로 예상된다.
풀링된 CRISPR 스크린을 실시예 1에 기재된 방법에 따라 Cas9 발현 OT1 마우스로부터 유래된 CD8+ T 세포로 수행하였다. 풀링된 sgRNA 라이브러리를 시험관내 배양된 정제된 OTI CD8+ T 세포에 도입하여 편집된 CD8+ T 세포의 집단을 생성시켰다 시험관내 조작 후, 편집된 OT1 CD8+ T 세포를 B16/Ova 종양 보유 C56BL/6 마우스에 정맥내로(iv) 투여하였다. 생체내 확장 후, 기관을 수거하고, CD45+ 세포를 농축시켰다. 단리된 CD45+ 세포로부터의 게놈 DNA를 Qiagen DNA 추출 키트를 사용하여 단리시켰다. 이어서 sgRNA 라이브러리를 PCR에 의해 증폭시키고, 일루미나 차세대 서열결정(NGS)을 사용하여 서열결정하였다.
종양-보유 마우스로부터 수거된 샘플에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도를 분석하고, 초기 T 세포 집단에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도와 비교하였다. 각각의 개별 sgRNA에 대해서 통계학적 분석을 수행하여 종양 보유 마우스로부터 수거된 T 세포 집단에서 상당히 농축된 가이드를 식별하고, 가이드 각각에 대해서 농축 점수를 배정하였다. 동일한 유전자를 표적화하는 개별 sgRNA에 대한 농축 점수를 모아서 다수의 sgRNA 및 다수의 OT1 공여자 마우스에 걸쳐 T 세포 축적에 일관되고 재현 가능한 효과를 갖는 표적 유전자를 확인하였다. 이 실험의 결과를 하기 표 12에 나타낸다. 표 12에서의 백분율은 하기 식을 사용하여 계산하였다: 백분위수 점수 = 1-(유전자 농축 순위/스크리닝된 유전자의 총 수).
Figure pct00015
실시예 4: 시험관내 CAR-T 및 CRISPR/Cas9 기능성 게놈 스크린을 통한 입양 T 세포 전달 요법 표적의 식별
CAR-T 세포 종양 샘플의 축적을 조절하는 표적을 식별하기 위해 실험을 수행하였다. 풀링된 전체 게놈(genome-wide) CRISPR 스크린을 수행하였는데, 여기서 각각이 단일 유전자를 표적화하는 sgRNA 풀을 종양-특이적 CAR-T 세포의 집단에 도입하여, 집단 내의 각각의 세포는 단일 유전자를 표적화하는 단일 sgRNA를 포함하였다. 종양 샘플에서 CAR-T 세포 축적에서 특정 유전자의 효과를 결정하기 위해서, CAR-T 세포 집단에서 각각의 sgRNA의 빈도를 실험 시작 시에 결정하고, 실험에서 추후 시간 지점에서 동일한 sgRNA의 빈도와 비교하였다. 종양 샘플에서 CAR-T 세포 축적을 양으로 조절하는 유전자(예를 들어, T 세포 증식, 생존력 및/또는 종양 침윤을 양으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 시간이 따라 증가할 것으로 예상되는 반면, 종양 샘플에서 CAR-T 세포 축적을 음으로 조절하는 유전자(예를 들어, T 세포 증식, 생존력 및/또는 종양 침윤을 음으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 종양 샘플에서 시간에 따라 감소할 것으로 예상된다.
인간 CD19에 특이적인 CAR-T 세포를 사용하여 시험관내 스크린을 수행하였다. 풀링된 sgRNA 라이브러리를 상기에 기재된 바와 같은 CD19 CART에 도입하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 세포를 Cas9 mRNA로 전기천공하여 Cas9-편집된 CD19 CART의 집단을 생성시켰다. 이어서, 편집된 CD19 CART를 CD19 또는 내인성 CD19를 발현하는 버킷 림프종 세포주를 발현하도록 조작된 부착성 결장직장암종(CRC) 세포주와 공배양하였다. 공배양 기간 동안 다양한 시간 지점에서 CART를 수거하고, 세포 펠릿을 동결시켰다. Qiagen DNA 추출 키트를 사용하여 이들 세포 펠릿으로부터 게놈 DNA(gDNA)를 단리시키고, 일루미나 차세대 서열결정을 사용하여 서열결정하였다.
CART/종양 세포 공배양물로부터 취한 분취물에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도를 분석하고, 초기 편집된 CAR-T 세포 집단에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도와 비교하였다. 각각의 개별 sgRNA에 대해서 통계학적 분석을 수행하여 종양 세포 공배양 후 CAR-T 세포 집단에서 상당히 농축된 sgRNA를 식별하고, 가이드 각각에 대해서 농축 점수를 배정하였다. 동일한 유전자를 표적화하는 개별 sgRNA에 대한 농축 점수를 모아서 다수의 sgRNA 및 CAR-T 세포 집단에 걸쳐 종양 샘플에서 CAR-T 세포 축적에 일관되고 재현 가능한 효과를 갖는 표적 유전자를 확인하였다. 표적을 순위매기고, 백분율에 기초하여 추가 조사를 위해서 콜링하였다. 이 실험의 결과를 하기 표 13에 나타낸다. 표 13에서의 백분율은 하기 식을 사용하여 계산하였다: 백분위수 점수 = 1-(유전자 농축 순위/스크리닝된 유전자의 총 수).
Figure pct00016
실시예 5: 생체내 CAR-T/종양 CRISPR/Cas9 기능성 게놈 스크린을 통한 입양 T 세포 전달 요법 표적의 식별
종양의 존재 하에서 CAR-T 세포 축적을 조절하는 표적을 식별하기 위해 실험을 수행하였다. 풀링된 CRISPR 스크린을 수행하였는데, 여기서 각각이 단일 유전자를 표적화하는 sgRNA 풀을 종양-특이적 CAR-T 세포의 집단에 도입하여, 집단 내의 각각의 세포는 단일 유전자를 표적화하는 단일 sgRNA를 포함하였다. 종양 샘플에서 CAR-T 세포 축적에서 특정 유전자의 효과를 결정하기 위해서, CAR-T 세포 집단에서 각각의 sgRNA의 빈도를 실험 시작 시에 결정하고, 실험에서 추후 시간 지점에서 동일한 sgRNA의 빈도와 비교하였다. 종양 샘플에서 CAR-T 세포 축적을 양으로 조절하는 유전자(예를 들어, T 세포 증식, 생존력 및/또는 종양 침윤을 양으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 시간이 따라 증가할 것으로 예상되는 반면, 종양 샘플에서 CAR-T 세포 축적을 음으로 조절하는 유전자(예를 들어, T 세포 증식, 생존력 및/또는 종양 침윤을 음으로 조절하는 유전자)를 표적화하는 sgRNA의 빈도는 종양 샘플에서 시간에 따라 감소할 것으로 예상된다.
생체내 스크린을 2개의 별개의 피하 이종이식 모델: 버킷 림프종 모델 및 결장직장암(CRC) 모델로 수행하였다. 버킷 모델의 경우, 마트리겔(Matrigel) 중의 1×106개의 버킷 림프종 종양 세포를 6 내지 8주령의 NOD/SCID 감마(NSG) 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 대략 200㎣의 부피에 도달했을 때, 접종 후 13일에 마우스를 모니터링하고, 무작위화하고, 연구에 등록하였다. CRC 모델의 경우, CRC 세포를 CD19를 발현하도록 조작하였고, 마트리겔 중의 5×106개의 종양 세포를 6 내지 8주령의 NSG 마우스의 우측 옆구리에 피하 주사하였다. 종양이 대략 200㎣의 부피에 도달했을 때, 접종 후 12일에 마우스를 모니터링하고, 무작위화하고, 연구에 등록하였다. Cas9-조작된 CD19 CAR-T 세포를 3×106 및 10×106/마우스(3M 및 10M)로 고리 정맥을 통해서 iv 투여하였다. CAR-T 주사 후 8 내지 10일째에 종양을 수집하고, 액체 질소에서 동결시켰다. 이들 조직을 추후에 해리시키고, 게놈 DNA 추출을 위해 처리하였다.
연구 마지막에 취한 게놈 DNA 샘플에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도를 분석하고, 초기 편집된-CAR-T 세포 집단에서 각각의 sgRNA의 분포 및/또는 빈도와 비교하였다. 각각의 개별 sgRNA에 대해서 통계학적 분석을 수행하여 연구 마지막에 취한 게놈 DNA 샘플에서 상당히 농축된 sgRNA를 식별하고, 가이드 각각에 대해서 농축 점수를 배정하였다. 동일한 유전자를 표적화하는 개별 sgRNA에 대한 농축 점수를 모아서 다수의 sgRNA 및 CAR-T 세포 집단에 걸쳐 CAR-T 세포 풍부도에 대해서 일관되고 재현 가능한 효과를 갖는 표적 유전자를 확인하였다. 표적을 순위매기고, 백분율에 기초하여 추가 조사를 위해서 콜링하였다. 이 실험의 결과를 하기 표 14에 나타낸다. 표 14에서의 백분율은 하기 식을 사용하여 계산하였다: 백분위수 점수 = 1-(유전자 농축 순위/스크리닝된 유전자의 총 수).
Figure pct00017
실시예 6: 뮤린 OT1/B16-Ova 동계 종양 모델에서 단일-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
뮤린 OT1/B16-Ova 피하 종양 모델에서 종양-특이적 T 세포에서 표적 유전자를 편집하는 것이 항-종양 효능의 증가를 부여하는지를 결정하기 위해서, 단일-가이드 포맷으로의 추가 평가를 위해 실시예 3 내지 5에서 0.6 이상의 백분위수 점수를 갖는 표적을 선택하였다. 예시적인 표적의 평가가 본 명세서에 기술되어 있지만, 이들 방법은 상기에 기재된 임의의 잠재적인 표적을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
단일-편집 T 세포의 항-종양 효능을 항 -PD1 항체로의 치료에 민감한 B16-Ova 피하 동계 종양 모델을 사용하여 마우스에서 평가하였다. 간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16-Ova 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양이 대략 100㎣의 부피에 도달했을 때 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에, OT1 T 세포를 (i) 대조군 gRNA; (ii) 단일 Map4k1-표적화 gRNA, (iii) 단일 Zc3h12a-표적화 gRNA; (iv) 단일 Cblb-표적화 gRNA; (v) 단일 Nr4a3-표적화 gRNA; 또는 (vi) 단일 PD1-표적화 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. 편집된 표적 유전자를 갖는 종양-특이적 CD8+ T 세포 집단을 생성시키기 위해, 암컷 OT1 마우스로부터의 비장을 수거하고, CD8 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리시키고, 편집하였다. 이어서 편집된 OT1 CD8+ T 세포를 B16-Ova 종양-보유 C56BL/6 마우스에 정맥내 투여하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다. 종양 성장 저해 백분율(percentage tumor growth inhibition)(TGI)을 하기 수학식에 따라 평균 종양 부피(TV)를 사용하여 계산하였다:
TGI % = (TV-표적최종 - TV-표적초기) / (TV-대조군최종 - TV-대조군초기),
식 중, TV = 평균 종양 부피, Cblb TGI에 대한 최종 = T 세포 전달 후 18일, Zc3h12a, Nr4a3 및 Map4k1에 대한 최종 = T 세포 전달 후 14일 및 초기 = 0일(즉, T 세포 전달일).
Cblb-편집된 T 세포의 결과를 도 7A에 도시한다. 이들 데이터는, T 세포에서 Cblb 유전자의 편집이 18일에 85%의 TGI로 항-종양 효능을 나타낸다는 것을 입증한다. Zc3h12a-편집된 T 세포의 결과를 도 7B에 도시한다. 이들 데이터는, T 세포에서 Zc3h12a 유전자의 편집이 14일에 106%의 TGI로 T 세포의 항-종양 효능을 향상시킨다는 것을 입증한다. Zc3h12a-편집된 세포를 사용한 추가 실험으로부터의 데이터를 도 7C에 도시한다. Map4k1-편집된 T 세포의 결과를 도 7D에 도시한다. 이들 데이터는, T 세포에서 Map4k1 유전자의 편집이 14일에 72%의 TGI로 T 세포의 항-종양 효능을 향상시킨다는 것을 입증한다. Nr4a3-편집된 T 세포의 결과를 도 7E에 도시한다. 이들 데이터는, T 세포에서 Nr4a3 유전자의 편집이 14일에 56%의 TGI로 T 세포의 항-종양 효능을 향상시킨다는 것을 입증한다.
실시예 7: 항-PD1 요법과의 조합에서의 뮤린 OT1/B16-OVA 동계 종양 모델에서 단일-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
항-PD1 요법과의 조합에서 Map4k1-편집된 세포의 효과를 평가하기 위해서 추가 실험을 수행하였다. 간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16-Ova 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양이 대략 100㎣의 부피에 도달했을 때 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에, 이들 세포를 대조군 가이드 또는 Map4k1 유전자에 대한 단일 가이드 편집으로 편집하였다. Map4k1 유전자를 표적화하는 gRNA/Cas9 복합체의 편집 효율은 NGS 방법을 사용하여 82%인 것으로 결정되었다. T 세포 전달 시에, 설계된 코호트를 또한 연구 기간 동안 주 3× 주사되는 2.5mg/kg의 항-마우스 PD1 항체(클론 RMP1-14, 바이오엑스셀사(BioXcell))로의 치료를 시작하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다. 14일째에 Map4k1 군으로부터의 평균 종양 부피 - 1일째에 Map4k1 군으로부터의 평균 종양 부피/14일째에 대조군 처리된 군으로부터의 평균 종양 부피 - 1일째에 대조군 처리된 군으로부터의 평균 종양 부피를 사용하여 종양 성장 저해 백분율(TGI)을 계산하였고, 여기서 1일째는 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포 전달일이다. 이러한 실험의 결과를 도 8A에 도시한다.
Nr4a3-편집된 세포를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. Nr4a3 유전자를 표적화하는 gRNA/Cas9 복합체의 편집 효율은 NGS 방법을 사용하여 28%인 것으로 결정되었다. 14일째에 Nr4a3 군으로부터의 평균 종양 부피 - 1일째에 Nr4a3 군으로부터의 평균 종양 부피/14일째에 대조군 처리된 군으로부터의 평균 종양 부피 - 1일째에 대조군 처리된 군으로부터의 평균 종양 부피를 사용하여 종양 성장 저해 백분율(TGI)을 계산하였고, 여기서 1일째는 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포 전달일이다. 이러한 실험의 결과를 도 8B에 도시한다.
항-종양 효능에 대한 항-PD1 요법과 조합된 Zc3h12a-편집된 세포의 효과를 평가하기 위해서 유사한 실험을 수행하였다.
실시예 8: 뮤린 PMEL 및 MC38/gp100 동계 종양 모델에서 단일-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
결장직장암(항-PD1 항체로의 치료에 비민감성임)의 뮤린 MC38gp100 피하 동계 종양 모델에서 종양-특이적 T 세포에서 표적 유전자를 편집하는 것이 항-종양 효능의 증가를 부여하는지를 결정하기 위해서, 단일-가이드 포맷으로의 추가 평가를 위해 실시예 3 내지 5에서 0.6 이상의 백분위수 점수를 갖는 표적을 선택하였다. 예시적인 표적의 평가가 본 명세서에 기술되어 있지만, 이들 방법은 상기에 기재된 임의의 잠재적인 표적을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 1×106개의 MC38gp100 종양 세포를 피하 주사하였다. 주사 전에, T 세포를 (i) 대조군 gRNA 또는 (ii) 단일 Zc3h12a-표적화 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. 종양이 대략 100㎣의 부피에 도달했을 때 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해서 Zc3h12a-편집된 마우스 PMEL CD8+ T 세포를 정맥내 주사하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다.
Zc3h12a-편집된 T 세포의 결과를 도 9에 도시한다. 이들 데이터는, T 세포에서 Zc3h12a 유전자의 편집이 20일에 77%의 TGI로 T 세포의 항-종양 효능을 향상시킨다는 것을 입증한다. 유사한 실험을 수행하여 PMEL/MC38 동계 종양 모델에서 항-종양 효능에 대한 Nr4a3-편집된 세포 및 Map4k1-편집된 세포의 효과를 평가한다.
실시예 9: 뮤린 B16-F10 동계 종양 모델에서 단일-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
폐 전이를 나타내는 질환을 갖는 공격적인 전이성 B16-F10 동계 종양 모델로 편집 Zc3h12a의 효과를 평가하기 위해서 추가 실험을 수행한다.
간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16-F10 종양 세포를 정맥내로 주사한다. 마우스의 체중을 재고, 접종 전 무작위화 절차를 사용하여 치료군에 배정한다. 종양 접종 후 D3에, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해서 뮤린 PMEL CD8+ T 세포를 정맥내로 주사한다. 주사 전에 이들 세포를 (i) 대조군 gRNA; (ii) PD-1 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; 또는 (iii) Zc3h12a 유전자를 표적화하는 단일 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. 체중을 적어도 주당 2회 모니터링한다. 종양 접종 후 15일(편집된 PMEL 전달 후 12일)에, 마우스 폐를 관류시키고, 10% 파라-폼알데하이드로 고정시킨다. 밤새 고정 후, 폐를 추가 보존을 위해서 70% EtOH로 옮긴다. 폐 상의 암세포의 흑색 집락으로 식별될 수 있는 B16-F10 종양 부하를 육안으로 평가함으로써 종양 효능을 평가할 수 있다.
생존율을 백분율로서 그래프로 도시한다(도 10). 도 10A에 도시된 바와 같이, Zc3h12a-편집된 PMEL T 세포는 B16F10 폐 전이 모델에서 대조군 및 PD1-편집된 PMEL T 세포에 비해서 증가된 생존율을 제공할 수 있다. 유사한 실험을 수행하여 B16-F10 동계 종양 모델에서 Nr4a3-편집된 세포 및 Map4k1-편집된 세포의 효과를 평가한다.
실시예 10: 뮤린 OT1/EG7-Ova 피하 동계 종양 모델에서 단일-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
Zc3h12a의 항-종양 효능을 Eg7-Ova 피하 동계 종양 모델을 사용하여 마우스에서 추가로 평가하였다. 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 1×106개의 Eg7-Ova 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양이 대략 100㎣의 부피에 도달했을 때 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에, 이들 세포를 대조군 가이드 또는 Zc3h12a 유전자에 대한 단일 가이드 편집으로 편집하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다.
종양 성장 저해 백분율(TGI)을 하기 수학식에 따라 평균 종양 부피(TV)를 사용하여 계산하였다:
TGI % = (TV-표적최종 - TV-표적초기) / (TV-대조군최종 - TV-대조군초기),
식 중, TV = 평균 종양 부피, 최종 TGI = T 세포 전달 후 14일 및 초기 = 0일(즉, T 세포 전달일).
이들 데이터는, T 세포에서 Zc3h12a의 편집이 도 11에 도시된 바와 같이 88%의 TGI로 T 세포의 항-종양 효능을 향상시킨다는 것을 입증한다. 유사한 실험을 수행하여 OT1/EG7OVA 피하 동계 종양 모델에서 항-종양 효능에 대한 Nr4a3-편집된 세포 및 Map4k1-편집된 세포의 효과를 평가한다.
실시예 11: A375 이종이식 종양 모델에서 단일-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
A375 이종이식 종양 모델에서 종양-특이적 T 세포에서 표적 유전자를 편집하는 것이 항-종양 효능의 증가를 부여하는지를 결정하기 위해서, 단일-가이드 포맷으로의 추가 평가를 위해 실시예 3 내지 5에서 0.6 이상의 백분위수 점수를 갖는 표적을 선택하였다. 예시적인 표적의 평가가 본 명세서에 기술되어 있지만, 이들 방법은 상기에 기재된 임의의 잠재적인 표적을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 12주령의 NSG 마우스에게 5×106개의 A375 세포를 피하 주사하였다. 종양이 대략 200㎣의 부피에 도달했을 때 마우스를 8개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 18.87×106개의 CBLB -편집된 NY-ESO-1-특이적 TCR 트랜스제닉 T 세포 또는 5.77×106개의 ZC3H12A-편집된 NY-ESO-1-특이적 TCR 트랜스제닉 T 세포를 정맥내 주사하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하고, 효능을 대조군 및 편집된 세포와 비교하여 평균 종양 부피의 감소 및 생존율 증가로서 평가하였다. 19일째에 ZC3H12A 군으로부터의 평균 종양 부피 - 0일째에 ZC3H12A 군으로부터의 평균 종양 부피/19일째에 대조군 처리된 군으로부터의 평균 종양 부피 - 0일째에 대조군 처리된 군으로부터의 평균 종양 부피를 사용하여 종양 성장 저해 백분율(TGI)을 계산하였고, 여기서 0일째는 인간 TCR 트랜스제닉 T 세포 전달일이다.
이러한 실험의 결과를 도 12에 도시한다. 이들 데이터는, T 세포에서 CBLB(도 12A) 및 ZC3H12A(도 12B) 유전자의 편집이 A375 이종이식 모델에서 항-종양 효능으로 이어진다는 것을 입증한다. 유사한 실험을 수행하여 A375 이종이식 모델에서 MAP4K1-편집된 T 세포 및 NR4A3-편집된 T 세포의 효능을 평가한다.
실시예 12: Raji 이종이식 모델에서 단일-편집된 입양 전달된 CD19 CAR-T 세포의 검증
1세대 CD19 CAR-T 세포에서 편집 Map4k1 및 NR4A3의 항-종양 효능을 Raji 피하 세포 유래 이종이식 종양 모델을 사용하여 마우스에서 평가하였다. Raji 세포는 항-PD1 항체로의 치료에 비민감성이라고 공지된 인간 림프종 세포주이다.
간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 NGS 마우스에게 3×106개의 Raji 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양이 대략 200㎣의 부피에 도달하면, 마우스를 5개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 인간 CD19 CART 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에, 이들 세포를 대조군 가이드 또는 Map4k1 또는 NR4A3에 대한 가이드 편집으로 편집하였다. NGS 방법을 사용하여, MAP4K1 유전자 및 NR4A3을 표적화하는 gRNA/Cas9 복합체의 편집 효율은 각각 83% 및 71%인 것으로 결정되었다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다. 입양 T 세포 전달 모델에서 MAP4K1 및 NR4A3의 편집은 MAP4K1의 경우 65% TGI(도 13A) 및 NR4A3의 경우 81% TGI(도 13B)로 증가된 효능으로 이어진다. 유사한 실험을 수행하여 Raji 세포-유래된 이종이식 피하 종양 모델에서 ZC3H12A-편집된 1세대 CD19 CAR-T 세포(인간)의 항-종양 효능을 평가한다.
실시예 13: 이중-편집 조합물을 위한 스크린
이중 sgRNA 라이브러리를 렌티바이러스 골격으로 작제하였다. 라이브러리는 2개의 U6 프로모터(하나의 인간 및 하나의 마우스)로 이루어졌고, 각각은 단일 가이드 RNA(가이드+tracr, sgRNA)의 발현을 유도한다. 가이드를 풀로 클로닝시켜 가이드 사이에 무작위 짝지움을 제공하여, 모든 sgRNA가 다른 모든 sgRNA와 짝을 이룰 것이다.　최종 이중 가이드 라이브러리를 Phoenix-Eco 293T 세포로 형질주입시켜 뮤린 에코트로픽 레트로 바이러스를 생성시켰다. Cas9를 발현하는 TCR 트랜스제닉 OT1 세포를 sgRNA-발현 바이러스로 감염시켜 각각의 sgRNA에 의해 표적화된 2개의 유전자좌를 편집하였다. 이어서, 편집된 트랜스제닉 T-세포를 400㎣ 초과의 B16-Ova 종양 동종이식편을 갖는 마우스로 옮겼다. 2주 후, 종양을 절제하고, 종양을 소화시키고, 종양에 존재하는 CD45+ 세포를 농축시켜 종양-침윤 T-세포를 정제시켰다.　Qiagen QUIAamp DNA 혈액 키트를 사용하여 CD45+ 세포로부터 게놈 DNA를 추출하고, 레트로바이러스 삽입물을 레트로바이러스 골격 서열에 상응하는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 회수하였다.　이어서, 생성된 PCR 생성물을 서열결정하여 전달 2주 후 종양에 존재하는 sgRNA를 식별하였다. 최종 단리된 세포 집단에서 가이드 쌍의 표현을 마우스에 주사하기 전에 초기 플라스미드 집단 및 감염된 트랜스제닉 T-세포 집단과 비교하였다.　T-세포 적합성 및/또는 종양 침윤을 개선시킨 sgRNA 쌍의 빈도는 시간에 따라 증가할 것으로 예상되는 반면, 적합성을 손상시키는 조합은 시간에 따라 감소할 것으로 예상되었다. 하기 표 15는 생체내 전달된 초기 세포 집단에서 sgRNA 빈도와 비교하여 최종 세포 집단에서 sgRNA 빈도의 중위 배수 변화를 나타낸다.
Figure pct00018
실시예 14: Raji 이종이식 모델에서 이중-편집된 Cd19 CAR-T 세포의 검증
이종이식 종양 모델에서 T 세포의 항-종양 효능을 증가시키는 편집된 유전자의 조합을 결정하기 위해 조합 연구에서 표적을 추가로 평가하였다. 예시적인 표적의 평가가 본 명세서에 기술되어 있지만, 이들 방법은 상기에 기재된 임의의 잠재적인 표적을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
편집의 항-종양 효능에 대한 조합 효과의 예로서, CBLB 및 BCOR을 1세대 CD19 CAR-T 세포에서 독립적으로 또는 함께 편집하고, Raji 피하 세포 유래 이종이식 종양 모델을 사용하여 마우스에서 평가하였다. Raji 세포는 항-PD1 항체로의 치료에 비민감성이라고 공지된 림프종 세포주이다. 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 NSG 마우스에게 3×106개의 Raji 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양이 대략 200㎣의 부피에 도달하면, 마우스를 5개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 인간 CD19 CART 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에, 입양 전달된 세포를 (i) 대조군 gRNA; (ii) CBLB를 표적화하는 단일 gRNA; (iii) BCOR을 표적화하는 단일 gRNA; 또는 (iv) CBLB 및 BCOR를 표적화하는 2개의 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 대조군 가이드와 비교할 때, 표적 유전자가 지시된 바와 같이 단독으로 또는 함께 편집된 BCOR/CBLB 이중 -편집된 인간 CD19 CART 세포의 입양 전달은 피하 버킷 림프종 Raji 마우스 모델에서 항-종양 반응을 초래하였다. 항-종양 효능은 표적 단독과 비교할 때 또는 대조군 가이드와 비교할 때 두 표적을 조합하여 편집하는 경우 더 컸다. 유사한 실험을 수행하여 CD19 CAR-T Raji 세포 이종이식 모델에서 ZC3H12A/CBLB 이중-편집된 T 세포, MAP4K1/CBLB 이중-편집된 T 세포, 및 NR4A3/CBLB 이중-편집된 T 세포의 효능을 평가한다.
실시예 15: CAR-T에서 BCOR 및 CBLB의 이중-편집은 종양의 존재 하에서 축적 및 사이토카인 생산을 향상시킨다.
1세대 CD19 CAR-T를 인간 CD8 T 세포로부터 생성시켰고, 음성 대조군 유전자, BCOR, CBLB 또는 BCOR 및 CBLB 둘 다를 RNP 포맷으로 Cas9에 복합체화된 가이드 RNA를 사용하여 전기천공에 의해 편집하였다. CD19 CAR-T를 시험관내에서 1:0, 0.3:1, 1:1, 3:1 및 10:1 비로 Raji 버킷 림프종 세포와 공배양하였다. 24시간 후, CAR-T 세포의 총 세포 수를 결정하고, 상청액을 사이토카인 분석을 위해 저장하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, BCOR 및 BCOR + CBLB-편집된 CART는 대조군 또는 CBLB- 편집된 CART와 비교하여 30% 더 큰 축적을 나타내었는데, 이는, BCOR의 편집이 종양의 존재 하에서 축적되는 CAR-T 세포의 향상된 능력을 부여한다는 것을 입증한다. 또한, CBLB 및 CBLB + BCOR- 편집된 CART는 대조군-편집된 CART에 비해서 10배 이상의 IL-2(도 16) 및 IFNγ(도 17)를 생산하였는데, 이는 CBLB의 편집이 전체 T 세포 적합성 및 기능성 능력을 증가시킨다고 공지된 사이토카인의 향상된 CAR-T 세포 생산을 초래하였다는 것을 입증한다. CD8 T 세포에 의한 IL-2의 증가된 생산은 이들 세포가 전형적으로 IL-2를 생산하지 않기 때문에 놀랍다. 이들 데이터는 일부 경우에, 향상된 효과기 기능을 갖는 CAR-T 세포의 생산이 다수의 유전자의 편집을 필요로 한다는 것을 입증한다. 예를 들어, 본 실시예에서, 종양의 존재 하의 향상된 축적 및 IL-2 및 IFNγ 사이토카인의 향상된 생산 둘 다를 나타낸 CAR-T 세포의 생산은 BCOR 및 CBLB 유전자 둘 다의 편집을 필요로 하였다.
실시예 16: 뮤린 OT1/B16-Ova 동계 종양 모델에서 이중-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
뮤린 OT1/B16-Ova 피하 동계 종양 모델에서 T 세포의 항-종양 효능을 증가시키는 편집된 유전자의 조합을 결정하기 위해 조합 연구에서 표적을 추가로 평가하였다. 예시적인 표적의 평가가 본 명세서에 기술되어 있지만, 이들 방법은 상기에 기재된 임의의 잠재적인 표적을 평가하기 위해 사용될 수 있다.
Zc3h12a/Cblb 이중-편집된 T 세포의 항-종양 효능을 마우스에서 B16Ova 피하 동계 종양 모델을 사용하여 평가하였다. 간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16Ova 종양 세포를 피하 주사하였다. 마우스의 전체 코호트의 종양이 대략 378.3㎣의 평균 부피에 도달했을 때 마우스를 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 뮤린 OT1 CD8+ T 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에 이들 세포를 (i) 대조군 gRNA; (ii) Cblb 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (iii) Zc3h12a 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; 또는 (iv) Cblb 및 Zc3h12a 유전자를 표적화하는 2개의 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. Cblb 및 Zc3h12a 유전자를 표적화하는 gRNA/Cas9 복합체의 편집 효율은 NGS 방법을 사용하여 평가되는 경우 각각 82% 및 80%인 것으로 결정되었다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다. 종양 성장 저해 백분율(percentage tumor growth inhibition)(TGI)을 하기 수학식에 따라 평균 종양 부피를 사용하여 계산하였다:
TGI % = (TV-표적최종 - TV-표적초기) / (TV-대조군최종 - TV-대조군초기) * 100
식 중, TV = 평균 종양 부피, 최종 = T 세포 전달 후 7일 및 초기 = 0일(즉, T 세포 전달일).
도 18에 도시된 바와 같이, Zc3h12a/Cblb 이중-편집된 T 세포의 전달은 Cblb 단일-편집된 T 세포 또는 Zc3h12a 단일-편집된 T 세포 또는 Cblb 단일-편집된 T 세포의 전달에 비해서 향상된 TGI를 야기하였다(각각 Cblb 및 Zc3h12a 단일 편집의 경우 46% 및 99%에 비해서 Zc3h12a/Cblb TGI = 107%).
유사한 실험을 수행하여 OT1/B16 Ova 동계 종양 모델에서 Map4k1/Cblb 이중-편집된 T 세포 및 Nr4a3/Cblb 이중-편집된 T 세포의 효능을 평가한다.
실시예 17: 뮤린 PMEL/MC38-gp100 종양 모델에서 이중-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
Zc3h12a/Cblb 이중-편집된 T 세포, Map4k1/Cblb 이중-편집된 T 세포 및 Nr4a3/Cblb 이중-편집된 T 세포의 항-종양 효능을 MC38gp100 피하 동계 종양 모델을 사용하여 마우스에서 평가한다. 간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 1×106개의 MC38gp100 종양 세포를 피하 주사한다. 종양이 대략 100㎣의 부피에 도달한 경우, 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 뮤린 PMEL CD8+ T 세포를 정맥내 주사한다. 주사 전에, 이들 세포를 (i) 대조군 gRNA; (ii) PD1 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (iii) Zc3h12a 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (iv) Cblb 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (v) Map4k1 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (vi) Nr4a3 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (vii) Zc3h12a 및 Cblb 유전자를 표적화하는 2개의 gRNA; (viii) Nr4a3 및 Cblb 유전자 둘 다를 표적화하는 2개의 gRNA; 또는 (ix) Map4k1 및 Cblb 유전자 둘 다를 표적화하는 2개의 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집한다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정한다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산한다. TGI 백분율을 하기 수학식에 따라 평균 종양 부피를 사용하여 계산한다.
(TV-표적최종 - TV-표적초기) / (TV-대조군최종 - TV-대조군초기),
식 중, TV = 평균 종양 부피, 최종 = T 세포 전달 후 21일 및 초기 = 0일(즉, T 세포 전달일).
이들 실험으로, PD1 단일-편집된 T 세포, Zc3h12a 단일-편집된 T 세포, Map4k1 단일-편집된 T 세포 또는 Nr4a3 단일-편집된 T 세포의 전달에 비해서 Zc3h12a/Cblb, Map4k1/Cblb 또는 Nr4a3/Cblb 이중-편집된 T 세포의 전달 후에 향상된 TGI를 나타낸다고 예상된다.
실시예 18: 뮤린 B16-F10 동계 종양 모델에서 이중-편집된 입양 전달된 T 세포의 검증
Zc3h12a/Cblb 이중-편집된 T 세포의 항-종양 효능을 폐 전이를 나타내는 질환을 갖는 공격적인 전이성 B16-F10 동계 종양 모델을 사용하여 마우스에서 평가한다. 간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16-F10 종양 세포를 정맥내로 주사한다. 마우스의 체중을 재고, 접종 전 무작위화 절차를 사용하여 치료군에 배정한다. 종양 접종 후 3일에, 마우스에게 꼬리 정맥을 통해서 뮤린 PMEL CD8+ T 세포를 정맥내로 주사한다. 주사 전에, 이들 세포를 (i) 대조군 gRNA; (ii) Zc3h12a 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (iii) Cblb 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (iv) Map4k1 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (v) Nr4a3 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (vi) Map4k1 및 Cblb 유전자 각각을 표적화하는 2개의 gRNA; (vii) Nr4a3 및 Cblb 유전자 각각을 표적화하는 2개의 gRNA; (viii) Zc3h12a 및 Cblb 유전자 각각을 표적화하는 2개의 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집한다. 상기에 언급된 유전자를 표적화하는 gRNA/Cas9 복합체의 편집 효율을 NGS 방법을 사용하여 평가한다. 체중을 적어도 주당 2회 모니터링할 것이다. 종양 접종 후 15일(편집된 PMEL 전달 후 12일)에, 마우스 폐를 관류시키고, 10% 파라-폼알데하이드로 고정시킨다. 밤새 고정 후, 폐를 추가 보존을 위해서 70% EtOH로 옮긴다. 폐 상의 암세포의 흑색 집락으로 식별될 B16-F10 종양 부하를 육안으로 평가함으로써 종양 효능을 평가한다.
이들 실험으로, 대조군 및 단일-편집된 세포에 비해서 이중-편집된 세포가 증가된 항-종양 효능을 나타낸다고 예측된다.
실시예 19: B16-Ova 뮤린 종양 모델에서 PD1/Lag3 이중-편집된 트랜스제닉 T 세포의 효능
PD-1/Lag3 이중-편집된 T 세포의 항-종양 효능을 마우스에서 B16Ova 피하 동계 종양 모델을 사용하여 평가하였다. 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16Ova 종양 세포를 피하 주사하였다. 마우스의 전체 코호트의 종양이 대략 485㎣의 평균 부피에 도달했을 때 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에 이들 세포를 (1) 비-표적화 대조군 gRNA; (2) PD1 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (3) Lag3 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (4) 각각이 PD1 및 Lag3 유전자 각각을 표적화하는 2개의 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다. 종양 성장 저해 백분율(TGI)을 하기 수학식에 따라 계산하였다:
TGI % = (PD1/Lag3 TV최종) - PD1/Lag3 TV 초기 ) / (대조군 TV최종 - 대조군 TV 초기 ),
식 중, TV = 평균 종양 부피, 최종 = 10일 및 초기 = 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포 전달일.
도 19에서의 데이터는, PD1 단일-편집된 T 세포의 입양 전달이 70%의 TGI를 초래하였고, Lag3 단일-편집된 T 세포의 입양 전달이 36%의 TGI를 초래하였음을 나타낸다. 놀랍게도, PD1과 Lag3의 조합 편집은 향상된 종양 성장 저해를 초래하지 않았고, 38%의 TGI를 나타내었다.
실시예 20: 종양 침윤 림프구의 입양 T 세포 전달을 위한 표적의 검증
Zc3h12, Map4k1 및 Nr4a3/Cblb 단일 및 이중-편집된 종양 침윤 림프구(TIL)의 항-종양 효능을 B16Ova 피하 동계 종양 모델을 사용하여 마우스에서 평가한다. 2마리의 마우스 코호트를 본 실험에서 사용한다: CD45.1 Pep Boy 마우스(B6.SJL-Ptprc a 　Pepc b /BoyJ)의 공여자 코호트 및 CD45.2 C57BL/6J 마우스(잭슨 실험실)의 수용자 코호트, 각각 6 내지 8주령의 암컷 마우스로 구성됨.
TIL을 생성시키기 위해서, 공여자 CD45.1 Pep Boy 마우스(B6.SJL-Ptprc a 　Pepc b /BoyJ)에게 0.5×106 B16-Ova 세포를 피하로 주사한다. 종양 세포 접종 후 14일에, 종양을 수거하여 편집된 CD45.1 종양 침윤 림프구(TIL)를 생성시켜 마우스의 제2 코호트에 주입한다. 제조사의 권고 사항에 따라 GentleMACS 시스템 및 마우스 종양 분리 키트(밀테니이 바이오테크사(Miltenyi Biotech) 카탈로그 번호 130-096-730)를 사용하여 B16-OVA 종양(200 내지 600㎣)을 수거, 절단 및 단일 세포 현탁액으로 감소시킨다.　종양 현탁액을 70㎛ 세포 스트레이너로 여과시키고, TIL을 CD4/CD8(TIL) 마이크로 비드(밀테니이 바이오테크사 카탈로그 번호 130-116-480)를 사용하여 농축시킨다. 단리된 TIL을 6웰 플레이트 내에서 1.5×106개 세포/㎖로, 3000U/㎖의 재조합 인간 IL-2(페프로테크사(Peprotech) 카탈로그 번호 200-02)이 보충된 완전 mTIL 배지(RPMI + 10% 열 불활성화된 FBS, 20mM HEPES, 100U/㎖ 페니실린, 100㎍/㎖ 스트렙토마이신, 50μM 베타-머캅토에탄올, 1X 글루타맥스) 중에서 배양한다.　3 일에 세포를 수거, 세척 및 뉴클레오펙션 완충액 T에 재현탁시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같은 Neon Transfection System을 사용하여 gRNA/Cas9 RNP로 전기천공시켰다. 전기천공 후, TIL을 3000U/㎖의 재조합 인간 IL-2가 보충된 완전 mTIL 배지 중에서 1.5×106개 세포/㎖로 6웰에서 배양한다.　5일 및 7일에, 3000U/㎖의 재조합 인간 IL-2가 보충된 새로운 완전 mTIL 배지에 세포를 재현탁시키고, 1×106개 세포/㎖의 밀도로 플라스크에 플레이팅한다.　8일에, 세포를 수거하고, 계수하고, 생체내 주사를 위해 PBS에 재현탁시키고, qRT-PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해서 펠릿을 제조하였다.
이들 TIL 세포를 (1) 비-표적화 대조군 gRNA; (2) Zc3h12a 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (3) Map4k1 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (4) Nr4a3 유전자를 표적화하는 단일 gRNA; (5) Cblb를 표적화하는 단일 gRNA; (6) Zc3h12a 유전자 및 Cblb 유전자를 표적화하는 2개의 gRNA; (7) Map4k1 유전자 및 Cblb 유전자를 표적화하는 2개의 gRNA; 또는 (8) Nr4a3 유전자 및 Cblb 유전자를 표적화하는 2개의 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 복합체의 전기천공에 의해서 편집한다.
수용자 CD45.2 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16-Ova 종양 세포를 피하 주사한다. 종양이 대략 100㎣의 부피에 도달했을 때 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 CD45.1 TIL을 정맥내 주사한다. 선택적으로, 마우스에 사이클로포스파마이드(200mg/kg)를 복강내 주사하여 T 세포 전달 전에 림프구 제거를 유도할 수 있으며, 편집된-TIL은 재조합 인간 IL-2(720,000IU/Kg)를 최대 4일 동안 매일 2회 복강내 치료와 함께 정맥내 투여할 수 있다.
체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정한다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하고, TGI %를 하기식에 따라서 계산한다.
TGI % = (TV-표적최종) -TV-표적초기) / (TV-대조군최종 - TV-대조군초기),
식 중, TV = 평균 종양 부피, 최종 = 17일 및 초기 = 편집된 TIL 전달일.
이들 결과는, 대조군 가이드와 비교하여, 단일-편집된 또는 이중-편집된 마우스 TIL의 입양 전달이 대조군-편집된 세포에 의한 처리와 비교하여 B16Ova 피하 마우스 모델에서 향상된 항-종양 반응을 초래한다는 것을 나타낸다고 예측된다.
실시예 21: 조작된 T 세포 요법에 대한 표적의 검증
인공 TCR을 발현하도록 조작된 T 세포 및 CAR T 세포의 항-종양 효능에 대한 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및/또는 NR4A3의 편집 효과를 검증하기 위해서 실험을 수행할 것이다. BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및/또는 NR4A3의 발현을 감소시키기 위해서 표 17에 기재된 조작된 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 편집한다. 이어서, 이들 편집된 T 세포를 지시된 세포 유형을 사용하여 피하 뮤린 이종이식 모델에서 평가한다. 예를 들어, CD19-특이적 CAR 또는 인공 TCR로 조작된 T 세포를 Raji 세포 모델 또는 표 16에 제시된 임의의 다른 세포주에서 상기 실시예 12에 기재된 바와 같이 평가할 수 있거나, 또는 MART1-특이적 CAR 또는 인공 TCR로 조작된 T 세포를 SKMEL5, WM2664 또는 IGR1 세포 모델 등에서 평가할 수 있다.
Figure pct00019
간략하면, 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 NGS 마우스에게 3×106개의 표적 세포를 피하 주사한다. 종양이 대략 200㎣의 부피에 도달하면, 마우스를 5개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 조작된 T 세포를 정맥내 주사한다. 주사 전에, 입양 전달된 세포를 대조군 가이드 또는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및/또는 NR4A3에 대해 편집하는 가이드로 편집한다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정한다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산한다. 이들 실험의 결과는, 생존 및 종양 크기의 감소로 측정되는 경우, 대조군 가이드와 비교할 때 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1, 및/또는 NR4A3-편집된 조작된 T 세포의 향상된 항-종양 효능을 나타낸다고 예측된다.
실시예 22: 수용체-조작된 T 기능에 대한 표적 편집의 검증
조작된 T 세포 사이토카인에 대한 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1 및/또는 NR4A3의 편집 효과를 검증하기 위해서 실험을 수행할 것이다. 간략하면, 상기 표 16에 기재된 조작된 T 세포를 인간 CD8 T 세포로부터 생성시키고, BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1, 및/또는 NR4A3 중 1종 이상을 RNP 포맷으로 Cas9에 복합체화된 가이드 RNA를 사용한 전기천공에 의해서 편집한다. CAR-T를 표 18에 제시된 상응하는 세포주와 함께 시험관내에서 1:0, 0.3:1, 1:1, 3:1 및 10:1비로 공배양한다. 24시간 후, 조작된 T 세포의 총 세포 수를 결정하고, 상청액을 사이토카인 분석을 위해 저장한다. 이들 실험의 결과는, 대조군 편집된 세포에 비해서 편집된 CAR T 세포로부터의 사이토카인의 향상된 축적 및 증가된 수준을 나타낸다고 예측된다.
실시예 23: 이중-편집된 종양 침윤 림프구의 제조
편집된 TIL을 TIL의 단리 및 확장을 위해 FDA 승인 임상 시험에서 이전에 사용된 확립된 프로토콜에 따라 제조한다. 종양 조직의 제거 후, 종양을 2㎣ 조각으로 단편화하고, 기계적으로/효소에 의해서 균질화시키고, 최대 6주 동안 또는 세포 수가 1×108에 도달하거나 이를 초과할 때까지 6,000IU/㎖의 재조합 인간 IL-2에서 배양하는데; 이것은 TIL 제조의 사전-신속한 확장 단계(pre-REP)로 정의된다. pre-REP 단계의 완료 시, TIL을 cGMP 조건 하에서 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, GNAS, ZC3H12A, MAP4K1, 및/또는 NR4A3 유전자를 표적화하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체로 전기천공한다. 세포를 또한 pre-REP 공정 전에 또는 공정 동안에 전기천공할 수 있다. 전기천공 후, 50×106개 세포를 대략 2주 동안 1:100비의 TIL:조사된 피더 세포를 갖는 1L G-Rex(상표명) 배양 플라스크로 옮긴다. 이러한 제조 과정을 신속한 확장 단계(REP)로 정의한다. REP 단계 후, TIL을 수거, 세척하고 환자에게 즉시 주입하기 위해서 용액 중에 현탁시킨다.
실시예 24: 편집된 면역 효과기 세포의 I상 연구
1상, 공개 단일-지점 연구(open-label, single-center study)를 수행할 것인데, 여기서 항 PD-1 요법에 재발 또는 불치성인 전이성 흑색종 환자를 본 명세서에 기재된 변형된 세포로 치료할 것이다. 환자는 세포의 단일 주입을 제공받고, 진행성 질환 또는 요법 불내성(intolerance)을 경험할 때까지 계속 연구될 것이다. 방사선 PD는 연구 참여 중단 전에 지역 방사선 전문의가 결정한다.
연구 목표 : 본 연구의 주요 목표는 (1) 진행된 고형 종양 환자를 위한 향후 연구에 권고되는 최대 내약 용량(maximum tolerated dose: MTD), 용량 제한 독성(dose limiting toxicitiy: DLT) 및 세포 조성물(및 필요한 관련 공동 의약(concomitant medication))의 용량을 결정하는 것; 및 (2) 전달된 편집된 세포의 항암 활성의 임의의 증거를 위해서 환자를 관찰하는 것이다. 연구의 이차 목표는, (1) 세포 조성물의 약동학을 결정하는 것; (2) 생물학적 샘플에서 약력학적 바이오마커의 변화에 의해 결정되는 바와 같은, 세포 조성물의 표적내 활성을 평가하는 것; 및 (3) 치료 후 조작된 TIL 지속성에 의해 결정되는 바와 같은, 변형된 세포의 증식을 평가하는 것이다. 연구의 탐색 목표는 (1) 임의의 근본적인 유전적 돌연변이(들)를 임상 반응과 상관시키는 것이다.
연구 평가 변수 : 본 연구의 1차 평가 변수는 다음과 같다: 국립 암 연구소 위해 사건에 대한 공통 용어 기준(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events: NCI CTCAE), 버전 4.3에 따라 등급이 매겨진 위해 사건(adverse event: AE)의 발생률 및 중증도; 임상 실험실 이상; 12-리드 심전도(ECG) 파라미터의 변화; RECIST v1.1에 따른 객관적 반응률(ORR); CNS 반응(활성 뇌 전이가 있는 환자에서, RECIST v1.1에 따른 ORR 및 무진행생존[PFS]). 본 연구의 2 차 평가 변수는 다음과 같다: 환자 보고 증상 및 건강 관련 삶의 질(HRQoL) 점수; 응답까지의 시간; 응답 기간; RECIST v1.1에 따른 질병 제어율(완전한 반응에 가장 잘 반응한 환자의 백분율[CR], PR 또는 SD); 치료 시간; 면역표현형; 유전자 조작된 TIL의 지속성, 트래피킹(trafficking) 및 기능; 투여 전 및 투여 후 샘플에서의 약력학적 바이오마커. 본 연구의 탐색 평가 변수는 다음과 같다: FoundationOne(등록상표) 암 유전자 패널을 사용하는 암-연관 돌연변이 및/또는 유전자 변경 평가 또는 투여 전 종양 생검 및/또는 말초 혈액에서 대등한 대안.
치료 요법 : 치료 요법의 요약은 다음과 같다:
-7 및 -6일: 사이클로포스파마이드 60mg/kg, i.v.
-5 내지 -1일: 플루다라빈 25mg/m2, i.v.
1일: 세포 주입
1일 내지 15일: 최대 14회 투여까지 IL-2(125,000IU/kg/일)
투여되는 제1 용량의 세포는 총 용량 1×109개 세포를 초과하지 않을 것이다. 환자가 용량 제한 독성(DLT)을 경험하는 경우, 2명의 추가 환자를 이 용량 수준에서 치료할 것이다. 첫 번째 환자가 DLT를 경험하지 않고 DLT 모니터링 기간(21일)을 완료하면, 후속 환자를 1×1011개 TIL을 초과하지 않는 용량으로 치료할 것이다.
공동 치료 : 연구 중에 발생할 수 있는 증상 및 근본적인 의학적 병태를 관리하기 위해 연구 중에 완화 및 지원 치료가 허용된다.
효능 평가 : 종양 반응은 RECIST v1.1에 따라 지역 방사선 전문의 및/또는 조사자가 결정한다. 종양 평가는 질환 진행까지 6주마다 수행되며, 질환 진행 이외의 이유로, 질환 진행까지, 또는 다른 항암 요법의 시작으로 인해 중단된 환자에 대해 계속될 것이다. 생존을 또한 마지막 환자를 연구에 등록한 후 최대 3년 동안 추적할 것이다.
안정성 평가 : 안전성 평가는 신체 검사 및 실험실 검사, 활력 징후 및 ECG를 포함할 것이다. 위해 사건 NCI CTCAE v4.03에 따라 등급을 매길 것이다. 위해 사건 발생률 및 독성 등급(심각도)으로 분류된 전체 독성 발생 빈도를 각각의 연구 코호트에 대해서 설명할 것이다. 실험실 시험 결과의 목록을 또한 생성하며, 시간에 따라 실험실 시험의 변화를 요약하는 설명 통계를 제공할 것이다.
분자 유전학적 평가 : 종양 생물학에 연루된 유전자의 돌연변이 상태를 종양 조직 및 혈장 샘플의 분자 분석을 통해 결정할 것이다. 이러한 시험 결과를 시험 절차에 따라 분석 직후 조사자 및 스폰서에게 제공할 것이다. 분자 분석 방법은 직접 서열결정 및/또는 디지털 중합 효소 연쇄 반응(PCR)을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다.
환자-보고 증상 및 삶의 질 평가 : 환자-보고 증상 및 HRQoL은 검증된 유럽 암 연구 및 치료를 위한 유럽기구(European Organisation for Research and Treatment of Cancer: EORTC) 삶의 질 설문지(Quality of Life Questionnaire: QLQ)-C30(v.3.0)을 제공함으로써 수집될 것인데, 이것은 전세계 임상 연구에서 광범위하게 연구되어 왔다. EORTC QLQ-C30은 5가지 기능 척도(물리적, 역할, 인지, 정서 및 사회적 기능)에 대해 점수 매겨진다; 3가지 증상 척도(피로, 통증 및 구역/구토); 및 전체 건강 상태/QoL 척도. 6가지 단일 항목 척도(호흡 곤란, 불면증, 식욕 상실, 변비, 설사 및 재정적 어려움)도 포함된다.
연구 평가 : 이들 연구에 대한 평가 파라미터는 용량 투여 전 및 그 후의 모든 홀수 사이클의 1일에 방사선 영상, PK 분석을 위한 혈액 샘플 수집(1일, 2일, 3일, 주×4 일, 월×6) 및 약력학 분석 및 사이토카인 패널 분석(1일, 2일, 3일, 주×4, 월×6)을 포함한다.
실시예 25: 항-종양 기억 및 에피토프 확산을 부여하는 표적으로서 Zc3h12a의 검증.
T 세포에서 Zc3h12a 저해 또는 결실에 의해서 유도된 항-종양 기억 및 에피토프 확산을 B16-Ova 피하 동계 종양 모델을 사용하여 마우스에서 평가하였다. 잭슨 연구소로부터의 6 내지 8주령의 암컷 C57BL/6J 마우스에게 0.5×106개의 B16- Ova 종양 세포를 피하 주사하였다. 종양이 대략 100㎣의 부피에 도달했을 때 마우스를 10개의 군으로 무작위화하고, 꼬리 정맥을 통해 편집된 마우스 OT1 CD8+ T 세포를 정맥내 주사하였다. 주사 전에 이들 세포를 (i) 대조군 gRNA; 또는 (ii) Zc3h12a 유전자를 표적화하는 단일 gRNA를 포함하는 gRNA/Cas9 RNP 복합체를 사용한 전기천공에 의해서 편집하였다. 체중 및 종양 부피를 적어도 주당 2회 측정하였다. 종양 부피를 각 처리군에 대한 평균 및 평균의 표준 오차로서 계산하였다.
도 20에 도시된 바와 같이, Zc3h12a-편집된 T 세포를 제공받은 10마리의 마우스 중 9마리는 평가 가능하였고, OT1 CD8+ T 세포의 전달 55일 후(또는 최초 B16-Ova 종양 접종 65일 후)까지 종양이 완전히 거부되었다. 이들 마우스는 완전 반응자(CR)인 것으로 생각되었다. 4마리의 CR 마우스를 제2 B16-Ova 접종으로 재시험감염시키고, 또 다른 4마리의 CR 마우스를 B16F10 접종으로 시험감염시켰다. B16-Ova는 OT1 세포가 특이적인 Ova 항원을 함유하도록 조작된 B16F10의 유도체이다. 또한, 10마리의 미경험 마우스에게 B16-Ova를 접종하고, 또 다른 10마리의 마우스에게 B16F10 종양 세포를 접종하였다. 이들 접종 후, B16-Ova CR 마우스는 B16-Ova 재시험감염 및 B16F10 시험감염 둘 다를 거부하는 것을 발견하였다. B16-Ova 거부는 Zc3h12a-유도된 항-종양 기억 반응을 입증한다. B16F10 거부는, Zc3h12a-편집된 T 세포가 "에피토프 확산"으로 공지된 현상을 통해서 비-Ova 종양 항원에 대한 생산성 항-종양 반응을 장착하도록 숙주 내의 다른 T 세포를 지시한다는 것을 입증한다. 결정기 확산으로도 공지된 에피토프 확산은, 초기 면역 반응에 관여되지 않은 T 세포가 초기 반응에 조직-특이적 방식으로 관련된 에피토프에 대해서 활성화되어 면역 반응에 공격적으로 기여하는 경우이다.
실시예 26: 미경험 인간 T 세포에서의 MAP4K1 의 편집은 사이토카인 생산을 향상시킨다.
일차 인간 T 세포를 해동된 공여자 PBMC로부터 단리시키고, Immunocult + 10ng/㎖ IL-2 중에서 밤새 배양하였다. 다음 날, T 세포를 단일 가이드 대조군 유전자 또는 MAP4K1용 RNP로 전기천공하였다. 유전자 편집을 보장하기 위해서 배양물(Immunocult + 10ng/㎖ IL-2) 중에서 4일 후, 활성화를 위해서 세포를 24시간 동안 Immunocult + CD3/28/2에서 배양하였다. 활성화 24시간 후에 상청액을 수집하고, 메조스케일 발견(mesoscale discovery)(MSD) 플랫폼에 의해서 분비된 사이토카인 수준을 측정하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, MAP4K1-편집된 T 세포는 IFNγ, IL-2 및 TNFα의 증가된 생산을 입증하였다. 유사한 실험을 수행하여 ZC3H12a-편집된 PBMC 및 NR4A3-편집된 PBMC의 사이토카인 생산을 평가할 수 있다.
실시예 27: Zc3h12a-편집된 뮤린 CD8 T 세포에서 T 세포 활성화 마커의 발현
암컷 OT1 또는 pMEL 마우스로부터의 비장을 수거하고, CD8 T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리시켰다. CD8 T 세포를 실시예 1에 기재된 방법에 따라서 Zc3h12a 또는 대조군 유전자를 표적화하는 sgRNA 및 Cas9 단백질을 포함하는 RNP로 전기천공하였다. 다수의 가이드에 걸쳐서, Zc3h12a-편집 효율은 36 내지 69%인 것으로 측정되었다.
Ifng, Gzma 및 Icos의 발현을 RNA-seq에 의해서 측정하였다. 3백만개의 편집된 세포의 펠릿으로부터의 RNA 추출 및 서열결정(RNA-seq)을 Wuxi NextCode에 의해서 수행하였다. 유전자 발현 수준을 Salmon(버전 0.11.2, Patro et al., Nat. Methods (2017) 및 Gencode 마우스 유전자 주석(버전 M15)을 사용하여 TPM(Li et al., in Bioinformatics: The Impact of Accurate Quantification on Proteomic and Genetic Analysis and Research (2014))으로서 정량한다. R 패키지 리마(limma)3(버전 3.38.0, Ritchie et al., Nucleic Acids Res. (2015))를 사용하여 차별적으로 발현되는 유전자(differentially expressed gene: DEG)를 분석하였다. 다수의 가이드를 사용하여 표적을 저해하는 경우, 분석은 각각의 가이드의 영향을 통합하였고, 모든 가이드에 의해서 영향을 받은 유전자만 유의하게 상이하게 발현되는 것으로 간주하였다.
이들 실험은, Zc3h12a-편집된 마우스 OT-1 또는 PMEL 세포가 Ifng(대조군 sgRNA에 비해서 OT-1에서 144.5배; PMEL에서 119.2배) 및 Gzma mRNA(대조군 sgRNA에 비해서 OT-1에서 7.2배 pMEL에서 3.1배)의 상당히 증가된 발현을 나타내었다는 것을 입증하였다. Zc3h12a -편집된 세포에서, 공지된 ZC3H12A 기질인 Icos의 mRNA 발현은 또한 OT-1 및 PMEL 세포 각각에서 11배 및 9.1배 상향조절되었다. 함께, 이들 데이터는, Zc3h12a-편집된 마우스 OT-1 또는 PMEL 세포가 mRNA 발현에 의해서 측정되는 경우 T 세포 활성화 마커인 Ifng, Gzma 및 Icos의 증가된 발현을 입증한다.
실시예 28: Zc3h12a siRNA 변형된 뮤린 T 세포에 의한 ICOS 발현
Zc3h12a mRNA 표적화 siRNA를 사용하여 추가 저해 기전에 의한 Zc3h12a의 발현을 변형시키는 효과를 입증하였다. 대조군(카탈로그 번호: K-005000-G1-02) 또는 Zc3h12a-표적화(카탈로그 번호: E-052076-00-0005) 자가 전달 Accell siRNA를 제조사의 설명서에 따라서 제조하였다. 정제된 뮤린 CD8 T-세포를 10ng/㎖의 재조합 뮤린 IL-2(바이오레전드사(Biolegend) 카탈로그 번호 575406)가 보충된 2.5% 열 활성화된 FBS를 함유하는 siRNA 전달 배지(다마콘사 카탈로그 번호 B-005000-500) 및 1μM의 최종 농도의 자가-전달 Accell siRNA 중에서 항-CD3/항-CD28 비드(T-세포 확장 및 활성화를 위한 Dynabeads(상표명) 마우스 T-활성화제 CD3/CD28, 카탈로그 번호 11456D)로 활성화시켰다. 72시간 후, 활성화 비드를 제거하고, 유세포 분석법에 의해서 표면 ICOS 발현에 대해서 qRT-PCR에 의해서 유전자 발현 분석에 대해서 세포를 평가하였다.
qRT-PCR 분석을 위해서, Qiagen RNeasy 미니프렙 키트(카탈로그 번호: 74104)를 사용하여 RNA를 T-세포로부터 분리시키고, SuperScript IV VILO(카탈로그 번호: 11755-050, 라이프 테크놀로지즈사(Life Technologies)))를 사용하여 제조사의 설명서에 따라서 cDNA를 제조하였다. 마우스 또는 인간 전사체의 검출을 위해서 사용된 taqman 프로브(라이프 테크놀로지즈사)를 하기에 열거한다. GAPDH를 대조군 유전자로서 사용하였고, 델타-델타 Ct 방법을 사용하여 상대적인 발현을 정량하였다. Zc3h12a-특이적 siRNA로의 세포의 처리는 대조군에 비해서 Zc3h12a mRNA 수준에서 30% 감소를 초래하였다.
Figure pct00020
ICOS 표면 발현의 경우, 뮤린 CD8 세포를 제조사의 설명서에 따라서 1:100 희석비로 형광 표지된 항-ICOS 항체(바이오레전드사 카탈로그 번호: 313524)로 염색하였다. FlowJo v10.1 소프트웨어(Treestar)를 사용하여, 형광 항-ICOS 항체로 염색된 세포의 평균 형광 강도를 계산함으로써 세포 표면 ICOS 발현의 상대적인 양을 측정하였다. Zc3h12a의 sgRNA-매개된 저해와 일관되게, ICOS 수준은 Zc3h12a-표적화 siRNA로 처리된 세포에서 1.8배 더 높았다.
실시예 29: Zc3h12a 아연 핑거로 편집된 뮤린 T 세포에서의 T 세포 활성화 마커의 발현
Zc3h12a 유전자의 ZFN-매개된 편집을 수행하여 추가 저해 기전에 의한 Zc3h12a의 발현을 변형시키는 효과를 입증하였다.
조작된 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) 도메인을 플라스미드 쌍(CSTZFN-1KT COMPOZR(등록상표) 커스텀 아연 핑거 뉴클레아제(ZFN) R-3257609)으로 시그마알드리치사에 의해서 생성시켰다. 마우스 Zc3h12a 유전자의 위치 Chr4:125122398-125122394 및 Chr4:125121087-125121084 및 대조군 마우스 유전자 Olfr455의 위치 Chr6:42538446-42538447를 인식하도록 도메인을 커스터마이징하였다. 플라스미드를 제조사의 프로토콜에 따라서 상업적인 NEB Monarch Miniprep 시스템(카탈로그 번호 T1010)을 사용하여 제조하였다. DNA 주형을 10㎍의 총 투입량을 사용하여 선형화하고, NEB Monarch PCR 및 DNA Cleanup 키트(카탈로그 번호 T1030)를 사용하여 정제시켰다. 5'-캡핑된 RNA 전사체를 생산하기 위한 시험관내 전사 반응을 제조사의 조건에 따라서 6㎍의 정제된 DNA 주형 및 Promega T7 RiboMAX 대규모 RNA 생산 시스템(P1300 및 P1712)을 사용하여 수행하였다. Qiagen RNeasy Mini 정제 키트(카탈로그 번호 74104)를 사용하여 전사체를 정제시켰다. 각각의 ZFN 도메인 전사체의 온전성 및 농도는 Agilent 4200 TapeStation 시스템을 사용하여 확인하였다. 정제된 전사체를 반응당 10단위를 사용하여 NEB 이. 콜라이 Poly(A) 폴리머라제(M0276)를 사용하여 폴리아데닐화시켰다. 폴리아데닐화된 테일의 첨가는 Agilent 4200 TapeStation 시스템을 사용한 크기 이동으로 확인하였다. 각각의 성숙한 ZFN 도메인 mRNA 전사체를 상응하는 쌍과 조합하고, 각각의 쌍의 10㎍를 5백만개의 마우스 CD8 T 세포와 혼합하고, 뮤린 T 세포 전기천공을 위해 상기에 기재된 방법에 따라 전기천공하였다.
Zc3h12a 내의 2개의 유전자좌는 각각 3개의 ZFN에 의해서 표적화되었고, 편집 효율을 NGS에 의해서 측정하였다. ZFN-매개된 ZC3H12A 불활성화의 효과를 추적하기 위해서, ZC3H12A 기질 Il6 및 Icos, 뿐만 아니라 T-세포 활성화 마커 Ifng의 mRNA 수준을 qRT-PCR에 의해서 평가하였다. 유전자좌 Chr4:125121088-125121085를 표적화하는 모든 3개의 ZFN은 대조군 ZFN 표적 Olfr455에 비해서 Icos(범위 1.2 내지 2배), Il6(범위 2.3 내지 62.8배) 및 Ifng(2.9 내지 12.8) mRNA의 증가된 발현을 야기하였는데, 이는 Zc3h12a의 ZFN-매개된 편집이 T-세포에 대해서 CRISPR-매개된 저해와 유사한 효과를 유도한다는 것을 확인해 준다.
실시예 30: Zc3h12a-편집된 뮤린 TIL에서 T 세포 활성화 마커의 발현
마우스 CD8 TIL을 단리시키고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 Zc3h12a-표적화 gRNA/Cas9 RNP로 편집하였다. Zc3h12a-특이적 sgRNA는 Zc3h12a의 86% 저해로 이어졌다. FACS 분석은, sgRNA로의 Zc3h12a의 저해가 세포 표면 상에서의 ICOS 발현에서 2.7배 증가로 이어졌다는 것을 확인해 주었다. RNA-seq 분석은, Icos mRNA에서의 유의한 2.7배 증가(p = 1.6×10-71)뿐만 아니라 Ifng(대조군 sgRNA에 비해서 9.3배, p = 0) 및 Gzma(대조군 sgRNA에 비해서 1.2배, p = 6.3×10-6)의 mRNA에서의 유의한 증가를 확인해 주었는데, 이는 마우스 TIL에서의 Zc3h12a 편집이 T-세포를 활성화시킨다는 것을 확인해 준다.
실시예 31: 마우스 CD8 T 세포에서 Zc3h12a의 CRISPR-매개된 편집에 의한 ZC3H12A 활성의 불활성화
마우스 CD8 T 세포의 기능 및 염증성 표현형에 대한 Zc3h12a의 유전자 불활성화의 효과를 평가하였다. 마우스 OT-I CD8 T 세포를 활성화시키고, 실시예 30에 기재된 방법을 사용하여 3종의 상이한 레트로바이러스 상청액 중 하나로 감염시켰다. 레트로바이러스는 1) 후학 수용체 유전자를 표적화하는 sgRNA(음성 대조군), 2) Zc3h12a를 표적화하는 sgRNA(Zc3h12a-편집된 조건), 또는 3) Zc3h12a의 단백질 산물을 암호화하는 유전자와 함께 Zc3h12a를 표적화하는 sgRNA(Zc3h12a 편집됨, WT ZC3H12A 구제 조건)를 암호화하였다. 선택 후 형질도입율이 모든 경우에 91%를 초과하였고, 차세대 서열결정은 게놈 편집율이 모든 경우에 80% 초과하였음을 확인해 주었다.
이어서, CD8 T 세포를 6시간 자극 동안 PMA 및 이오노마이신으로 자극하여 염증성 전사체 발현을 유도하고, 정량적 RT-PCR을 수행하여 mRNA 수준을 평가하였다. 하우스키핑 유전자 Gapdh의 발현에 대해서 전사체 발현 수준을 평가하였다. Zc3h12a 유전자좌의 편집은, Olf421 유전자좌에서 편집된 음성 대조군 세포와 비교할 때 Icos, Il6, Il2, Ifng 및 Nfkbiz 전사체의 수준의 극적인 증가로 이어졌다(도 22). 코돈 최적화된 Zc3h12a 유전자의 내인성 Zc3h12a 편집된 세포 내로의 렌티바이러스 공동 전달에 의한 ZC3H12A 단백질의 발현은 염증성 mRNA 수준의 감소로 이어졌는데(도 22), 이는 기능성 ZC3H12A 단백질의 부재에 대한 관찰된 표현형의 의존성을 입증한다.
관찰된 ZC3H12A-의존적 전사 변화가 세포 표면에 대한 변화로 번역되는지의 여부를 결정하기 위해서, 세포를 형광 항-ICOS 항체로 염색하고, 세포 표면 ICOS 수준을 유세포 분석법을 사용하여 측정하였다. Zc3h12a 유전자좌의 편집은 레트로바이러스 유래된 ZC3H12A의 과발현에 의해서 반전된 세포 표면 Icos 발현의 증가로 이어졌다(도 23).
CD8 T 세포에 의한 사이토카인 분비에 대한 Zc3h12a 유전자의 유전자 불활성화의 효과를 또한 측정하였다. 세포를 IL-2 단독 또는 IL-2 및 항-CD3/CD28 디나비드(dynabead)를 함유하는 배지를 함유하는 웰 내에 48시간 동안 시딩하였다. 세포 상청액을 수거하고, 메조스케일 발견 MSD 플랫폼을 사용하여 분비된 IFNγ 및 IL-6의 수준을 측정하였다. 자극 시, Zc3h12a 편집된 CD8 T 세포는 Olf421-편집된 세포보다 더 많은 양의 IL-6 및 IFNγ를 생산하였다. 추가로, Zc3h12a-편집된 세포는 또한 Olf421 편집된 세포에 비해서 외인성 항-CD3/CD28 자극의 부재 하에서 상당한 양의 IFNγ를 생산하였다(도 24).
실시예 32: 일차 인간 T 세포에서 ZC3H12A 유전자의 CRISPR-매개된 편집에 의한 ZC3H12A의 불활성화
일차 인간 T 세포에 대한 ZC3H12A의 불활성화의 효과를 결정하기 위해서, 게놈-편집된 인간 T 세포에 의한 IL6 mRNA 전사체 및 IL-6 단백질의 생산을 평가하였다. 간략하면, 일차 인간 T 세포를 말초 혈액 단핵구(PBMC)로부터 단리시키고, 실시예 1에 요약된 바와 같은 방법에 따라서, ZC3H12A 또는 OR1A2 유전자좌를 표적화하는 RNP를 사용하여 게놈-편집하였다. 차세대 서열결정에 의해서 결정되는 경우 편집 효율은 30 내지 72% 범위였다.
세포를 동일한 농도로 시딩하고, 항-CD3/CD2/CD28 사량체 시약(스템셀 테크놀로지즈사(Stemcell Technologies))를 함유하는 배양 배지에서 배양하였다. 24시간 후, 세포 상청액을 수거하고, 메조스케일 발견 V-플렉스 인간 전염증성 패널 1을 사용하여 IL-6 수준을 결정하였다. 다수의 공여자에 걸쳐서, ZC3H12A 유전자좌에서 편집된 T 세포는 24시간 기간에 걸쳐서 OR1A2 유전자좌에서 편집된 것보다 배양 배지에 더 많은 IL-6을 분비하였다(도 25A). 24시간 항-CD3/CD28 자극 후에 IL-6 mRNA의 상당히 증가된 생산(공여자 3835 및 6915에서 각각 12.3배 및 5.9배)이 또한 관찰되었다(도 25B).
실시예 33: ZC3H12A -타일링 스크린 및 검증 검정
CRISPR-Cas9 타일링 스크린을 수행하여 ZC3H12A 유전자에 걸친 표적 유전자좌 내의 후보 저해제제 표적 위치를 결정하였다. 일차 인간 CD8+ T 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리시키고, ZC3H12A 유전자의 전장에 걸쳐 게놈 위치를 표적화하도록 설계된 sgRNA를 발현하는 렌티바이러스 라이브러리로 형질도입하였다. 렌티바이러스 라이브러리를 형질도입하고 2일 후, 형질도입된 CD8+ T 세포를 Cas9 mRNA로 전기천공하고, 추가 10일 동안 배양하였다. Cas9 mRNA로 전기천공하고 10일 동안 배양한 후, 스크린을 하기에 기재된 바와 같이 수행하였다. 타일링 스크린에서 식별된 gRNA를 검증하기 위해 추가 검정을 수행하였다. 437개의 구별되는 ZC3H12A-표적화 gRNA를 하기 파라미터에 따라서 검정하였다.
타일링 스크린
증식 판독: Cas9 mRNA 전기천공 후 10일에 제1 아암의 세포를 수거하였다.　DNA를 추출시키고, 라이브러리 내의 다양한 sgRNA에 대한 인식 부위에 걸친 앰플리콘을 PCR로 증폭시키고, 차세대 사열결정(NGS)으로 서열결정하였다. sgRNA 각각의 농축 또는 고갈을 최종 계수치를 참조 계수치로 나눈 로그 비로 결정하였다.
가이드 검증을 위한 추가 검정
상기에 기재된 타일링 스크린에서 식별된 gRNA의 효능 및 표적내 활성을 추가로 특징규명하기 위해 추가 검정을 개발하였다. 세포를 단리시키고, 타일링 스크린에서 식별된 ZC3H12A-특이적 gRNA를 함유하는 Cas9:gRNA RNP로 전기천공시켰다. 세포를 대략 10 일 동안 배양하였고, 이 시점에서 다음 검정을 수행하였다.
DNA 편집 검정: DNA 수준에서 각각의 표적을 직접 편집하는 개별 가이드의 능력을 비교하기 위해 DNA 편집 검정을 개발하였다. Cas9:gRNA RNP로 전기천공한 후, 세포를 대략 10일 동안 배양하였고, 이 시점에 펠렛을 수거하고, DNA를 추출시켰다. 다양한 sgRNA에 대한 게놈 표적 유전자좌에 걸친 앰플리콘을 가이드-특이적 프라이머 세트를 사용하여 PCR로 증폭시키고, NGS로 서열결정하였다. 서열결정 판독을 예측된 가이드 절단 부위에 정렬시키고, 편집된 DNA 서열을 디스플레이하는 판독의 백분율을 결정하였다. 결과를 하기 2가지 기준에 기초하여 평가하였다: 1) 표적외 편집의 전체 백분율 및 2) 표적외 편집된 유전자의 동일성. 최적의 가이드는 최저 수준 백분율의 표적외 편집 및/또는 가장 양성인 표적외 편집된 유전자 프로파일을 갖는 것을 식별하였다. 예를 들어, 유전자 영역에서의 유전자 편집은 양성 효과로 인지되는 반면, 공지된 종양유전자 또는 종양 억제제에서의 편집은 바람직하지 않은 표적외 프로파일로 인지된다.
웨스턴 블롯 검정: 웨스턴 블롯 검정을 사용하여 각각의 표적의 단백질 발현을 감소시키는 개별 가이드의 능력을 비교하였다. Cas9:gRNA RNP로 전기천공한 후, 세포를 대략 10일 동안 배양하고, 이어서 세포 펠릿을 수거하고, 프로테아제 및 포스파타제 저해제를 함유한 RIPA 완충제에서 용해시켰다. 추출된 단백질을 Bradford 검정으로 정량하고, 1㎍을 기계의 표준 12 내지 230kD Wes Separation Module 프로토콜을 사용하여 자동화된 웨스턴 블로팅 기기(Wes Separation Module by Protein Simple)에 로딩하였다. 상업적으로 입수 가능한 표적 특이적 일차 항체를 사용한 후, HRP-접합된 이차 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 표적 가이드당 검출된 신호를 음성 대조군 가이드 샘플에서 인지되는 각각의 신호에 대해 정규화하였다.
타일링 및 검증 결과: 200개의 ZC3H12A-표적화 gRNA(서열번호 1065 내지 1264)가 상기에 기재된 검정에 기초하여 최적의 가이드로서 식별되었다. BCOR 및 TNFAIP3에 대해 유사한 실험을 수행하였으며, 57개의 BCOR gRNA(서열번호 708 내지 764) 및 39개의 TNFAIP3 gRNA(서열번호 348 내지 386)가 잠재적인 최적의 가이드인 것으로 식별되었다.
[표 5a]
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
Figure pct00024
Figure pct00025
[표 5b]
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
[표 6a]
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
[표 6b]
Figure pct00033
[표 6c]
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
[표 6d]
Figure pct00040
[표 6e]
Figure pct00041
[표 6f]
Figure pct00042
[표 6g]
Figure pct00043
[표 6h]
Figure pct00044
SEQUENCE LISTING <110> KSQ Therapeutics, Inc. <120> GENE-REGULATING COMPOSITIONS AND METHODS FOR IMPROVED IMMUNOTHERAPY <130> WO/2019/178421 <140> PCT/US2019/022365 <141> 2019-03-14 <150> US 62/643,578 <151> 2018-03-15 <150> US 62/692,010 <151> 2018-06-29 <150> US 62/768,428 <151> 2018-11-16 <150> US 62/643,587 <151> 2018-03-15 <150> US 62/692,019 <151> 2018-06-29 <150> US 62/768,443 <151> 2018-11-16 <150> US 62/804,265 <151> 2019-02-12 <150> US 62/643,597 <151> 2018-03-15 <150> US 62/692,100 <151> 2018-06-29 <150> US 62/768,448 <151> 2018-11-16 <150> US 62/643,598 <151> 2018-03-15 <150> US 62/768,458 <151> 2018-11-16 <160> 1575 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> P2A linker sequence <400> 1 Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val 1 5 10 15 Glu Glu Asn Pro Gly Pro 20 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Human <400> 2 Ser Leu Leu Met Trp Ile Thr Gln 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Human <400> 3 Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 <210> 4 <211> 310 <212> PRT <213> Human <400> 4 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg 20 25 30 Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His 35 40 45 Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 130 135 140 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 165 170 175 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln 180 185 190 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 225 230 235 240 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 5 <211> 270 <212> PRT <213> Human <400> 5 Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp 1 5 10 15 Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val 20 25 30 Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala 35 40 45 Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln 50 55 60 Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg 65 70 75 80 Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile 85 90 95 Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Tyr Gln Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys 115 120 125 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 130 135 140 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 145 150 155 160 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 165 170 175 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 180 185 190 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 195 200 205 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 210 215 220 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 225 230 235 240 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 245 250 255 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 6 <211> 602 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DLT TCR <400> 6 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg 20 25 30 Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His 35 40 45 Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 130 135 140 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 165 170 175 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln 180 185 190 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 225 230 235 240 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu 305 310 315 320 Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Ser Ile 325 330 335 Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp Leu Val Asn Gly 340 345 350 Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val Gln Glu Gly Asp 355 360 365 Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala Ser Asn Tyr Phe 370 375 380 Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln Leu Ile Ile Asp 385 390 395 400 Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg Ile Ala Val Thr 405 410 415 Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile Thr Glu Thr Gln 420 425 430 Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Glu Asp Tyr Gln 435 440 445 Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro Asp Ile Gln 450 455 460 Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp 465 470 475 480 Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser 485 490 495 Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp 500 505 510 Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn 515 520 525 Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro 530 535 540 Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu 545 550 555 560 Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu 565 570 575 Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn 580 585 590 Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 <210> 7 <211> 310 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg 20 25 30 Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His 35 40 45 Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 130 135 140 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 165 170 175 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln 180 185 190 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 225 230 235 240 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 8 <211> 270 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Thr Ser Ile Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp 1 5 10 15 Leu Val Asn Gly Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val 20 25 30 Gln Glu Gly Asp Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala 35 40 45 Ser Asn Tyr Phe Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln 50 55 60 Leu Ile Ile Asp Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg 65 70 75 80 Ile Ala Val Thr Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile 85 90 95 Thr Glu Thr Gln Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr 100 105 110 Glu Asp Leu Thr Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys 115 120 125 Pro Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 130 135 140 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 145 150 155 160 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 165 170 175 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 180 185 190 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 195 200 205 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 210 215 220 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 225 230 235 240 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 245 250 255 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 9 <211> 602 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> High affinity DLT TCR <400> 9 Met Ser Asn Gln Val Leu Cys Cys Val Val Leu Cys Phe Leu Gly Ala 1 5 10 15 Asn Thr Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg 20 25 30 Lys Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His 35 40 45 Asp Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala 65 70 75 80 Glu Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Val Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Pro Gly Ala Leu Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 130 135 140 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 165 170 175 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln 180 185 190 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 225 230 235 240 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu 305 310 315 320 Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Thr Ser Ile 325 330 335 Arg Ala Val Phe Ile Phe Leu Trp Leu Gln Leu Asp Leu Val Asn Gly 340 345 350 Glu Asn Val Glu Gln His Pro Ser Thr Leu Ser Val Gln Glu Gly Asp 355 360 365 Ser Ala Val Ile Lys Cys Thr Tyr Ser Asp Ser Ala Ser Asn Tyr Phe 370 375 380 Pro Trp Tyr Lys Gln Glu Leu Gly Lys Arg Pro Gln Leu Ile Ile Asp 385 390 395 400 Ile Arg Ser Asn Val Gly Glu Lys Lys Asp Gln Arg Ile Ala Val Thr 405 410 415 Leu Asn Lys Thr Ala Lys His Phe Ser Leu His Ile Thr Glu Thr Gln 420 425 430 Pro Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Ala Thr Glu Asp Leu Thr 435 440 445 Leu Ile Trp Gly Ala Gly Thr Lys Leu Ile Ile Lys Pro Asp Ile Gln 450 455 460 Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp 465 470 475 480 Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser 485 490 495 Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp 500 505 510 Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn 515 520 525 Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro 530 535 540 Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu 545 550 555 560 Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu 565 570 575 Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn 580 585 590 Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 <210> 10 <211> 311 <212> PRT <213> Human <400> 10 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg 115 120 125 Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 11 <211> 274 <212> PRT <213> Human <400> 11 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg 100 105 110 Pro Thr Ser Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser 115 120 125 Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 130 135 140 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 145 150 155 160 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 180 185 190 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 195 200 205 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 210 215 220 Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp 225 230 235 240 Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu 245 250 255 Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 260 265 270 Ser Ser <210> 12 <211> 607 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IG4 TCR <400> 12 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg 115 120 125 Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu 305 310 315 320 Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr 325 330 335 Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser Ser 340 345 350 Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly 355 360 365 Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 370 375 380 Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 385 390 395 400 Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 405 410 415 Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser 420 425 430 Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Thr Ser 435 440 445 Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val 450 455 460 His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp 465 470 475 480 Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 485 490 495 Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 500 505 510 Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 515 520 525 Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn 530 535 540 Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 545 550 555 560 Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu 565 570 575 Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys 580 585 590 Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 605 <210> 13 <211> 311 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 95L TCRb <400> 13 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg 115 120 125 Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 14 <211> 274 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 95L TCRa <400> 14 Met Glu Thr Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp 1 5 10 15 Val Ser Ser Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val 20 25 30 Pro Glu Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala 35 40 45 Ile Tyr Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr 50 55 60 Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg 65 70 75 80 Leu Asn Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile 85 90 95 Ala Ala Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg 100 105 110 Pro Leu Tyr Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser 115 120 125 Leu Ile Val His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln 130 135 140 Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp 145 150 155 160 Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr 165 170 175 Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser 180 185 190 Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn 195 200 205 Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro 210 215 220 Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp 225 230 235 240 Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu 245 250 255 Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp 260 265 270 Ser Ser <210> 15 <211> 607 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 95L IG4 TCR <400> 15 Met Ser Ile Gly Leu Leu Cys Cys Ala Ala Leu Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu 20 25 30 Lys Thr Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His 35 40 45 Glu Tyr Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asn Gly Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg 85 90 95 Leu Leu Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Tyr Val Gly Asn Thr Gly Glu Leu Phe Phe Gly Glu Gly Ser Arg 115 120 125 Leu Thr Val Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu 305 310 315 320 Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Glu Thr 325 330 335 Leu Leu Gly Leu Leu Ile Leu Trp Leu Gln Leu Gln Trp Val Ser Ser 340 345 350 Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu Gly 355 360 365 Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr Asn 370 375 380 Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu Leu 385 390 395 400 Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn Ala 405 410 415 Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala Ser 420 425 430 Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Arg Pro Leu Tyr 435 440 445 Gly Gly Ser Tyr Ile Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Ser Leu Ile Val 450 455 460 His Pro Tyr Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp 465 470 475 480 Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser 485 490 495 Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp 500 505 510 Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala 515 520 525 Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn 530 535 540 Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser 545 550 555 560 Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu 565 570 575 Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys 580 585 590 Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 605 <210> 16 <211> 311 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr 1 5 10 15 Gly His Met Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr 20 25 30 Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His 35 40 45 Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile 100 105 110 Ser Glu Val Gly Val Gly Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 17 <211> 268 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Met Leu Leu Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp 1 5 10 15 Val Ser Gly Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln 20 25 30 Glu Gly Glu Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn 35 40 45 Thr Trp Leu Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu 50 55 60 Ile Ala Leu Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr 65 70 75 80 Ala Gln Phe Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala 85 90 95 Ser Ile Pro Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Thr Gly 100 105 110 Asn Gln Phe Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr Val Ile Pro Asn 115 120 125 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 130 135 140 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 145 150 155 160 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val 165 170 175 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 180 185 190 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 195 200 205 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val 210 215 220 Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln 225 230 235 240 Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly 245 250 255 Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 <210> 18 <211> 601 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMF4 TCR <400> 18 Met Gly Thr Arg Leu Phe Phe Tyr Val Ala Leu Cys Leu Leu Trp Thr 1 5 10 15 Gly His Met Asp Ala Gly Ile Thr Gln Ser Pro Arg His Lys Val Thr 20 25 30 Glu Thr Gly Thr Pro Val Thr Leu Arg Cys His Gln Thr Glu Asn His 35 40 45 Arg Tyr Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly His Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Tyr Gly Val Lys Asp Thr Asp Lys Gly Glu Val Ser 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ser Lys Thr Glu Asp Phe Leu Leu Thr 85 90 95 Leu Glu Ser Ala Thr Ser Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ile 100 105 110 Ser Glu Val Gly Val Gly Gln Pro Gln His Phe Gly Asp Gly Thr Arg 115 120 125 Leu Ser Ile Leu Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala 130 135 140 Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr 145 150 155 160 Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser 165 170 175 Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro 180 185 190 Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu 195 200 205 Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn 210 215 220 His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu 225 230 235 240 Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu 245 250 255 Ala Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln 260 265 270 Gly Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala 275 280 285 Thr Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val 290 295 300 Lys Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu 305 310 315 320 Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Leu Leu 325 330 335 Glu His Leu Leu Ile Ile Leu Trp Met Gln Leu Thr Trp Val Ser Gly 340 345 350 Gln Gln Leu Asn Gln Ser Pro Gln Ser Met Phe Ile Gln Glu Gly Glu 355 360 365 Asp Val Ser Met Asn Cys Thr Ser Ser Ser Ile Phe Asn Thr Trp Leu 370 375 380 Trp Tyr Lys Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Ile Ala Leu 385 390 395 400 Tyr Lys Ala Gly Glu Leu Thr Ser Asn Gly Arg Leu Thr Ala Gln Phe 405 410 415 Gly Ile Thr Arg Lys Asp Ser Phe Leu Asn Ile Ser Ala Ser Ile Pro 420 425 430 Ser Asp Val Gly Ile Tyr Phe Cys Ala Gly Gly Thr Gly Asn Gln Phe 435 440 445 Tyr Phe Gly Thr Gly Thr Ser Leu Thr Val Ile Pro Asn Ile Gln Asn 450 455 460 Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys 465 470 475 480 Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln 485 490 495 Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val Leu Asp Met 500 505 510 Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys 515 520 525 Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu 530 535 540 Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val Lys Leu Val 545 550 555 560 Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser 565 570 575 Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu 580 585 590 Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 <210> 19 <211> 310 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Met Arg Ile Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu 20 25 30 Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His 35 40 45 Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Val Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 130 135 140 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 165 170 175 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln 180 185 190 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 225 230 235 240 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Arg Lys Asp Ser Arg Gly 305 310 <210> 20 <211> 272 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Met Lys Ser Leu Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser 1 5 10 15 Trp Val Trp Ser Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu 20 25 30 Ser Val Pro Glu Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp 35 40 45 Arg Gly Ser Gln Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser 50 55 60 Pro Glu Leu Ile Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly 65 70 75 80 Arg Phe Thr Ala Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu 85 90 95 Ile Arg Asp Ser Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val 100 105 110 Asn Phe Gly Gly Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser 115 120 125 Val Lys Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg 130 135 140 Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp 145 150 155 160 Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr 165 170 175 Asp Lys Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser 180 185 190 Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe 195 200 205 Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser 210 215 220 Ser Cys Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn 225 230 235 240 Leu Asn Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu 245 250 255 Lys Val Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 260 265 270 <210> 21 <211> 604 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> DMF5 TCR <400> 21 Met Arg Ile Arg Leu Leu Cys Cys Val Ala Phe Ser Leu Leu Trp Ala 1 5 10 15 Gly Pro Val Ile Ala Gly Ile Thr Gln Ala Pro Thr Ser Gln Ile Leu 20 25 30 Ala Ala Gly Arg Arg Met Thr Leu Arg Cys Thr Gln Asp Met Arg His 35 40 45 Asn Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Leu Gly Leu Gly Leu Arg Leu 50 55 60 Ile His Tyr Ser Asn Thr Ala Gly Thr Thr Gly Lys Gly Glu Val Pro 65 70 75 80 Asp Gly Tyr Ser Val Ser Arg Ala Asn Thr Asp Asp Phe Pro Leu Thr 85 90 95 Leu Ala Ser Ala Val Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser 100 105 110 Ser Leu Ser Phe Gly Thr Glu Ala Phe Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu 115 120 125 Thr Val Val Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val 130 135 140 Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu 145 150 155 160 Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp 165 170 175 Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln 180 185 190 Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser 195 200 205 Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His 210 215 220 Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp 225 230 235 240 Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala 245 250 255 Trp Gly Arg Ala Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly 260 265 270 Val Leu Ser Ala Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr 275 280 285 Leu Tyr Ala Val Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys 290 295 300 Arg Lys Asp Ser Arg Gly Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu 305 310 315 320 Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Lys Ser Leu 325 330 335 Arg Val Leu Leu Val Ile Leu Trp Leu Gln Leu Ser Trp Val Trp Ser 340 345 350 Gln Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu 355 360 365 Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln 370 375 380 Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile 385 390 395 400 Met Phe Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala 405 410 415 Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser 420 425 430 Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Asn Phe Gly Gly 435 440 445 Gly Lys Leu Ile Phe Gly Gln Gly Thr Glu Leu Ser Val Lys Pro Asn 450 455 460 Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser 465 470 475 480 Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn 485 490 495 Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Cys Val 500 505 510 Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp 515 520 525 Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile 530 535 540 Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys Asp Val 545 550 555 560 Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn Phe Gln 565 570 575 Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val Ala Gly 580 585 590 Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 595 600 <210> 22 <211> 142 <212> PRT <213> Human <400> 22 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 85 90 95 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 100 105 110 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 23 <211> 142 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cys modified TRAC <400> 23 Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser 1 5 10 15 Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln 20 25 30 Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys 35 40 45 Cys Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 50 55 60 Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn 65 70 75 80 Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Cys 85 90 95 Asp Val Lys Leu Val Glu Lys Ser Phe Glu Thr Asp Thr Asn Leu Asn 100 105 110 Phe Gln Asn Leu Ser Val Ile Gly Phe Arg Ile Leu Leu Leu Lys Val 115 120 125 Ala Gly Phe Asn Leu Leu Met Thr Leu Arg Leu Trp Ser Ser 130 135 140 <210> 24 <211> 178 <212> PRT <213> Human <400> 24 Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg 65 70 75 80 Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln 85 90 95 Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg 100 105 110 Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala 115 120 125 Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala 130 135 140 Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val 145 150 155 160 Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser 165 170 175 Arg Gly <210> 25 <211> 178 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> cys modified TRBC <400> 25 Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe Glu Pro Ser 1 5 10 15 Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ala 20 25 30 Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp Val Asn Gly 35 40 45 Lys Glu Val His Ser Gly Val Cys Thr Asp Pro Gln Pro Leu Lys Glu 50 55 60 Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser Arg Leu Arg 65 70 75 80 Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe Arg Cys Gln 85 90 95 Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr Gln Asp Arg 100 105 110 Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp Gly Arg Ala 115 120 125 Asp Cys Gly Phe Thr Ser Glu Ser Tyr Gln Gln Gly Val Leu Ser Ala 130 135 140 Thr Ile Leu Tyr Glu Ile Leu Leu Gly Lys Ala Thr Leu Tyr Ala Val 145 150 155 160 Leu Val Ser Ala Leu Val Leu Met Ala Met Val Lys Arg Lys Asp Ser 165 170 175 Arg Gly <210> 26 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KSQ CAR017 <400> 26 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile 20 25 30 Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly 50 55 60 Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser 85 90 95 Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 115 120 125 Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr 165 170 175 Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 180 185 190 Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr 195 200 205 Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe 210 215 220 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly 245 250 255 Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro 260 265 270 Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu 275 280 285 Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp 290 295 300 Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly 305 310 315 320 Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Val Lys Phe 325 330 335 Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu 340 345 350 Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp 355 360 365 Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys 370 375 380 Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala 385 390 395 400 Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys 405 410 415 Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr 420 425 430 Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 <210> 27 <211> 1328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSQ CAR017 <400> 27 atgctcctcc tggttactag cttgcttttg tgcgaactgc cgcatcctgc cttccttctc 60 atcccagata tacttctgac acaatctccg gtaatacttt ccgtctcacc gggggagcga 120 gtgtcatttt catgccgggc gagtcaatcc atcgggacga atattcactg gtatcagcaa 180 aggactaacg gctcaccacg ccttctcatc aagtatgcca gtgagtccat aagtggcatt 240 ccctctagat tctcaggatc aggcagtggc acggacttca cattgtcaat taatagcgta 300 gaaagtgagg acatagcaga ttattattgc caacaaaaca ataactggcc taccacattc 360 ggtgcaggca ccaagcttga gttgaagggg ggtggtggtt ctggaggcgg tgggagcggt 420 ggtggtgggt cacaagtgca gcttaagcaa agcggaccag gtctggtcca acctagccag 480 tcactgtcaa tcacatgtac ggtatccggc tttagtctga caaattatgg cgtccactgg 540 gtaaggcaat cccctggaaa gggcctcgag tggttggggg tgatttggag cggaggaaac 600 accgactata ataccccttt cacctccaga ctgtccataa acaaggacaa ctctaaaagt 660 caggtattct tcaaaatgaa cagtctgcaa agtaatgaca cagcgatata ttattgcgcg 720 agagccctta catactacga ttacgagttc gcttattggg gacaaggaac gttggtgacg 780 gtgtctgcca caaccactcc tgctcccagg ccaccaacac cggcgcctac catagcgtca 840 cagccgctta gtctcaggcc ggaagcgtgt cgccccgcag ccggtggggc ggtccacaca 900 cgcgggctgg atttcgcatg cgatatatac atctgggcac cccttgccgg gacctgcggt 960 gttttgctct tgtctctcgt aatcacgctg tactgtcggg ttaagttttc aagatctgcg 1020 gatgccccgg cataccaaca agggcagaat cagttgtaca acgaactgaa cttgggcaga 1080 cgcgaggagt atgatgtctt ggacaagagg cgggggcgcg acccggaaat gggtggcaaa 1140 ccacggcgca agaacccaca agaggggctt tacaacgaat tgcagaaaga caagatggcc 1200 gaggcataca gcgagattgg catgaaagga gagaggagga ggggaaaggg gcatgatggc 1260 ctttatcagg gcctttctac tgccaccaag gacacatacg acgcactgca catgcaggca 1320 ttgccacc 1328 <210> 28 <211> 446 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KSQ CAR1909 <400> 28 Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro 1 5 10 15 Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly 50 55 60 Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln 100 105 110 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 130 135 140 Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 145 150 155 160 Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr 165 170 175 Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu 180 185 190 Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys 195 200 205 Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 210 215 220 Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala 225 230 235 240 Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 245 250 255 Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro 260 265 270 Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro 275 280 285 Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu 290 295 300 Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys 305 310 315 320 Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu Arg Val 325 330 335 Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn 340 345 350 Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val 355 360 365 Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg 370 375 380 Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys 385 390 395 400 Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg 405 410 415 Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys 420 425 430 Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 435 440 445 <210> 29 <211> 1338 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSQ CAR1909 <400> 29 atgctccttc ttgtgacgtc actcctgctt tgtgagctgc cgcacccggc ctttctgctc 60 atacccgaca tacaaatgac acagacgaca agttcccttt ccgcctcctt gggcgaccga 120 gtgacaatca gttgccgagc ttcccaggac atatctaaat atttgaattg gtatcagcaa 180 aagccagatg gtacggttaa acttcttatc taccacacct ccaggctcca ttctggggtt 240 ccgagccgat tctctggatc tggctcaggg accgattatt ctttgactat ttccaatttg 300 gagcaggaag acatcgcaac ctatttctgc caacaaggaa atacgctgcc atacaccttc 360 ggcgggggca ccaaactcga gattactggg ggtgggggga gtggaggagg gggttccggt 420 ggaggtgggt cagaagtcaa gctgcaagag agtgggcccg ggttggttgc tcctagccaa 480 tccttgagtg taacatgcac cgttagcgga gtttcacttc ctgactacgg tgttagctgg 540 ataagacagc ccccgaggaa gggtctggaa tggctggggg tcatttgggg cagtgagacg 600 acatattaca acagtgcctt gaaatccagg cttacgatca taaaagacaa tagtaaaagc 660 caagtgttcc tcaagatgaa ctctcttcag accgacgaca cagccatcta ctattgcgca 720 aaacattatt attatggagg tagttacgct atggactatt ggggccaggg gacttcagtg 780 acggtgagta gtaccacgac tccggcaccg agaccaccaa caccagcccc aacaattgcc 840 tcacagccct tgagccttag acccgaggcc tgtaggcccg ccgcaggagg ggcagttcat 900 acgcgaggat tggactttgc atgtgacatc tatatctggg cgccacttgc gggaacttgc 960 ggtgtccttt tgctctcatt ggtcattacc ctctattgtt tgagagtaaa attttcccgc 1020 tccgctgatg cgcctgcata ccagcaaggt cagaaccaac tctacaatga gcttaacctc 1080 ggtagaagag aggaatatga cgtcttggat aagaggagag gccgagaccc agaaatgggg 1140 ggaaagccgc gccgcaagaa tccacaagaa ggtctttaca atgaactgca gaaggacaaa 1200 atggccgaag cgtatagcga gataggaatg aaaggcgaac ggagacgggg caaggggcat 1260 gacgggcttt accaaggact tagcacagcg acgaaggata catacgacgc actgcatatg 1320 caagcgctgc caccgcgc 1338 <210> 30 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KSQ CAR010 <400> 30 Met Asp Phe Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Ala Thr Gly Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys 20 25 30 Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Cys Ala Gly 35 40 45 Cys Thr Thr Cys Cys Thr Gly Cys Thr Ala Ala Thr Cys Ala Gly Thr 50 55 60 Gly Cys Cys Thr Cys Ala Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 65 70 75 80 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 85 90 95 Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 100 105 110 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val 115 120 125 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 130 135 140 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 145 150 155 160 His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile 165 170 175 Lys Arg Thr Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu 180 185 190 Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 195 200 205 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys 210 215 220 Asp Thr Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 225 230 235 240 Trp Val Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp 245 250 255 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr 260 265 270 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 275 280 285 Tyr Cys Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Val Trp 290 295 300 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro 305 310 315 320 Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu 325 330 335 Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg 340 345 350 Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly 355 360 365 Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Leu 370 375 380 Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly 385 390 395 400 Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr 405 410 415 Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys 420 425 430 Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys 435 440 445 Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg 450 455 460 Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala 465 470 475 480 Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg 485 490 495 <210> 31 <211> 1488 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KSQ CAR010 <400> 31 atggactttc aggtgcagat cttctcattc ctccttatca gtgcgagtgt aattatgtca 60 agaggtgcta caggcggtgc taccacgacg acatgcgcag ggggtaccgg ttgtgcagga 120 gcgaccacga ctacctgcgc aggttgtacc acctgttgta ctggatgtac tgctgcgaca 180 tgtgcgggga cgggttgttg cacttgtgcg gacatacaaa tgacgcaaag cccgtccagc 240 ctgtctgcat cagttgggga tagagtgacg attacatgta gagcaagcca ggatgttaac 300 accgccgtag cgtggtacca acaaaaacca ggtaaagccc cgaagctgct catatactcc 360 gccagctttc tgtattcagg cgttcccagt cggttcagcg gcagcagatc agggacggat 420 tttacgctca ctatctcttc ccttcagcct gaagattttg ctacctatta ttgtcagcag 480 cattacacga ctcccccaac ttttggtcag gggactaaag ttgaaatcaa acgaacgggc 540 tccacctcag gtagcggtaa gccaggcagc ggagaagggt ctgaagtcca gttggttgag 600 agtggaggcg gtcttgtgca acccggtggc agcttgcgac tgagctgtgc agcgtctggc 660 ttcaacataa aagatactta tattcattgg gtaagacagg ctcctggtaa agggctggaa 720 tgggtggcac gaatatatcc gactaacggt tataccagat acgccgattc tgttaagggc 780 aggttcacaa taagcgccga cacaagtaag aatacggcgt atctgcagat gaattcactt 840 cgagctgaag acacagcggt atactactgc tccaggtggg gtggggatgg tttttatgcg 900 atggacgttt ggggtcaagg aacactggta actgttagtt ctaccacgac acctgctcct 960 aggcccccca caccggcacc tacgatcgct tcccagccgc ttagcctccg cccggaggca 1020 tgccggcccg ctgcgggggg agcggtacat actcgcgggt tggacttcgc ttgcgacatc 1080 tacatttggg caccactggc aggcacatgt ggcgttctgt tgcttagtct ggttattaca 1140 ctgtattgcc tgcgagttaa attctcccgc agcgctgatg cgcccgccta tcagcaaggt 1200 caaaaccagc tgtataatga gcttaatttg ggacgccgag aagagtatga cgtccttgac 1260 aagaggcgcg ggcgcgatcc ggagatgggt ggtaaaccgc gccggaaaaa cccccaggaa 1320 ggcctttaca atgagctcca aaaagataaa atggcagagg catactctga aataggaatg 1380 aagggcgaga gacgccgggg taagggacac gatggccttt atcaagggct tagtacagcc 1440 acgaaggata cgtatgacgc tctgcacatg caggctcttc ccccgaga 1488 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 ccacctccag ttgttgcatt 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 33 tgctgcttca aagggaggta 20 <210> 34 <211> 83 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 34 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60 ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83 <210> 35 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 35 gggcttcatg ccgaaatcaa caccctgtca ttttatggca gggtgttttc gttatttaat 60 ttttt 65 <210> 36 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 36 aaatcaacac cctgtcattt tatggcaggg tgttttttt 39 <210> 37 <211> 170 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 37 gtattaagta ttgttttatg gctgataaat ttctttgaat ttctccttga ttatttgtta 60 taaaagttat aaaataatct tgttggaacc attcaaaaca gcatagcaag ttaaaataag 120 gctagtccgt tatcaacttg aaaaagtggc accgagtcgg tgcttttttt 170 <210> 38 <211> 89 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 38 gttggaacca ttcaaaacag catagcaagt taaaataagg ctagtccgtt atcaacttga 60 aaaagtggca ccgagtcggt gcttttttt 89 <210> 39 <211> 76 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 39 aaaacagcat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg 60 agtcggtgct tttttt 76 <210> 40 <211> 93 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tracrRNA <400> 40 gtttaagagc tatgctggaa acagcatagc aagtttaaat aaggctagtc cgttatcaac 60 ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 93 <210> 41 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 41 gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgat cagtgagaat gagtacttta 60 tagtgaagcc acagatgtat aaagtactca ttctcactga gtgcctactg cctcggactt 120 caaggggcta gaattcgagc a 141 <210> 42 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 42 gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgaa ggtgaaaatg tcaaaactaa 60 tagtgaagcc acagatgtat tagttttgac attttcacct gtgcctactg cctcggactt 120 caaggggcta gaattcgagc a 141 <210> 43 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 43 gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgcc cagaaattca ccacagaaaa 60 tagtgaagcc acagatgtat tttctgtggt gaatttctgg ttgcctactg cctcggactt 120 caaggggcta gaattcgagc a 141 <210> 44 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 44 gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac agtgagcgac cagaactgta gacaccaaaa 60 tagtgaagcc acagatgtat tttggtgtct acagttctgg ctgcctactg cctcggactt 120 caaggggcta gaattcgagc a 141 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 45 gtcaattcca gggagataac t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 46 gcctggaagc aatggctcta a 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 47 gcaccaaacc cggaagctat a 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 48 gttgcactcg attgggacag t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 49 ggattatgtg aacctacacc t 21 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 50 ggaatcacag cgagttcaaa t 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 51 gcaaggcata gtctcattga a 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 52 ggtgaagaga gccttagaga t 21 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB shRNA <400> 53 gtgaagagag ccttagagat a 21 <210> 54 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 54 aggagcuaag gucuuuucca aug 23 <210> 55 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 55 augucgaugc aaaaauugca aaa 23 <210> 56 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 56 gucacaugcu ggcagaaauc aaa 23 <210> 57 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 57 uccagguuac auggcauuuc uca 23 <210> 58 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 58 uugaacuuug aaccugugaa aug 23 <210> 59 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 59 uccacaucaa cagcuaaauc auu 23 <210> 60 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 60 augcuggcag aaaucaaagc aau 23 <210> 61 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 61 ugcagagaau gacaaagaug uca 23 <210> 62 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 62 ggcagaacuc accagucaca uca 23 <210> 63 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 63 ucgguccugu gauaaugguc acu 23 <210> 64 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 64 aggagcuaag gucuuuucca aug 23 <210> 65 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 65 augucgaugc aaaaauugca aaa 23 <210> 66 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 66 gucacaugcu ggcagaaauc aaa 23 <210> 67 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 67 uccagguuac auggcauuuc uca 23 <210> 68 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 68 uugaacuuug aaccugugaa aug 23 <210> 69 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 69 uccacaucaa cagcuaaauc auu 23 <210> 70 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 70 augcuggcag aaaucaaagc aau 23 <210> 71 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 71 ugcagagaau gacaaagaug uca 23 <210> 72 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 72 ggcagaacuc accagucaca uca 23 <210> 73 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CBLB siRNA <400> 73 ucgguccugu gauaaugguc acu 23 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 74 agacacacgc aactttaaa 19 <210> 75 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 75 cagacacacg caactttaa 19 <210> 76 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 76 acacacgcaa ctttaaatt 19 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 77 acgaatgctt tcagttcaa 19 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 78 atactcggaa ctggaatga 19 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 79 gaagcttgtg gcgctgaaa 19 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 80 aaagccggct gcgtgtattt t 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 81 aaagggagct ctagtccttt t 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 82 aagggagctc tagtcctttt t 21 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 83 aagccctcat cgacagaaac a 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 84 aaacgaacgg tgacggcaat t 21 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 85 aaacagacac acgcaacttt a 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 86 aacagacaca cgcaacttta a 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 87 aatgtgcagc acaacggatt t 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 88 aaaagccggc tgcgtgtatt t 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 89 aaactcaacc agctgccttt t 21 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 90 aaactcaacc agctgccttt 20 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 91 aagtccttcc tcaggctttg t 21 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 92 aaagccagaa gaaactcaac t 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 93 aatccgagct gttccacttg t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 94 aaggctggga ccatggcaca a 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 shRNA <400> 95 aatgccgcaa agttggatga a 21 <210> 96 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 96 uccucaguuu cgggagauca ucc 23 <210> 97 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 97 gagucucuca aaucucagga auu 23 <210> 98 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 98 agcucuaguc cuuuuugugu aau 23 <210> 99 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 99 cacuggaaau guucagaacu ugc 23 <210> 100 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 100 augaugaaug ggacaaucuu auc 23 <210> 101 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 101 cacacugugu uucaucgagu aca 23 <210> 102 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 102 gcagaaccau ccauggacug uga 23 <210> 103 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 103 aaagaugugg ccuuuuguga ugg 23 <210> 104 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 104 uucagaacuu gccaguuuug ucc 23 <210> 105 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFAIP3 siRNA <400> 105 augagacugg caauggucac agg 23 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 shRNA <400> 106 ggccaggatg gttcttagac t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 shRNA <400> 107 ggatttccag tggcgagaga a 21 <210> 108 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 108 gccuguguuc ucuguggacu aug 23 <210> 109 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 109 ggugcugcua gucugggucc ugg 23 <210> 110 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 110 gacagagaga agggcagaag ugc 23 <210> 111 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 111 cagcuucucc aacacaucgg aga 23 <210> 112 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 112 ccgugucaca caacugccca acg 23 <210> 113 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 113 uaugccacca uugucuuucc uag 23 <210> 114 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 114 ugcuaaacug guaccgcaug agc 23 <210> 115 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 115 gugacagaga gaagggcaga agu 23 <210> 116 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 116 cugaggaugg acacugcucu ugg 23 <210> 117 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 117 aucggagagc uucgugcuaa acu 23 <210> 118 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 118 gccuguguuc ucuguggacu aug 23 <210> 119 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 119 ggugcugcua gucugggucc ugg 23 <210> 120 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 120 gacagagaga agggcagaag ugc 23 <210> 121 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 121 cagcuucucc aacacaucgg aga 23 <210> 122 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 122 ccgugucaca caacugccca acg 23 <210> 123 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 123 uaugccacca uugucuuucc uag 23 <210> 124 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 124 ugcuaaacug guaccgcaug agc 23 <210> 125 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 125 gugacagaga gaagggcaga agu 23 <210> 126 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 126 cugaggaugg acacugcucu ugg 23 <210> 127 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDCD1 siRNA <400> 127 aucggagagc uucgugcuaa acu 23 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 shRNA <400> 128 ggcaacggaa cccagattta t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 shRNA <400> 129 ggaacccaaa ttacgtgtac t 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 shRNA <400> 130 gaacccaaat tacgtgtact a 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 shRNA <400> 131 gggagaagac tatattgtac a 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 shRNA <400> 132 gacgtttata gccgaaatga t 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 shRNA <400> 133 gacactaata caccaggtag a 21 <210> 134 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 134 accucacuau ccaaggacug agg 23 <210> 135 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 135 augaguugac cuuccuagau gau 23 <210> 136 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 136 ggggaaugag uugaccuucc uag 23 <210> 137 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 137 cucuggaucc uugcagcagu uag 23 <210> 138 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 138 cuccucugga uccuugcagc agu 23 <210> 139 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 139 uuugugugug aguaugcauc ucc 23 <210> 140 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 140 caccuccagu ggaaaucaag uga 23 <210> 141 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 141 cacgggacuc uacaucugca agg 23 <210> 142 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 142 uucugacuuc cuccucugga ucc 23 <210> 143 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 143 aagucugugc ggcaaccuac aug 23 <210> 144 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 144 accucacuau ccaaggacug agg 23 <210> 145 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 145 augaguugac cuuccuagau gau 23 <210> 146 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 146 ggggaaugag uugaccuucc uag 23 <210> 147 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 147 cucuggaucc uugcagcagu uag 23 <210> 148 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 148 cuccucugga uccuugcagc agu 23 <210> 149 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 149 uuugugugug aguaugcauc ucc 23 <210> 150 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 150 caccuccagu ggaaaucaag uga 23 <210> 151 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 151 cacgggacuc uacaucugca agg 23 <210> 152 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 152 uucugacuuc cuccucugga ucc 23 <210> 153 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTLA4 siRNA <400> 153 aagucugugc ggcaaccuac aug 23 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 154 gccgcaggag gttgcctttc 20 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 155 tccaagagtg atcgaggcat 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 156 agtgcagctt gatgtgccgc 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 157 cggtgagggc gtccctccgg 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 158 ggccacctga ggacgcactc 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 159 gttgcaaaga tggcatttga 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 160 cctttccagt gcaaccagtg 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 161 caactatgcc tgccgccgga 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 162 gttggtaaac ctcacaaatg 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 163 cgtgatccag gaagagcacc 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 164 tctggagtat cgcttacagg 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 165 ggaagccgtg gcagcccatg 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 166 gcgtgcctgt gaaatgaatg 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 167 cgcgtgcggg gcgatgtggt 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 168 tgagcccatg ccgatccccg 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 169 ctcttaccaa gaaatttctg 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 170 catatggggc tgatgacttt 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 171 ggggcctcat tcacccagaa 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 172 gcctcgggag agaaaatgaa 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 173 cgcgcagcag gtcgtaggcg 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 174 tctctgatcc tatcttgcac 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 175 ggacaggccc ttgtcccctg 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 176 ccgcgtggtc agcaccagcg 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 177 aagatttggg aattattgca 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 178 cttccagtgc aatcagtgcg 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 179 cctcacaaat gtggatattg 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 180 cctcgaaagt ctcggagctc 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 181 ctgcgtcaag actgctacac 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 182 tgctcacagg caagatgtag 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 183 ccggacagcc ctccaccttg 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 184 agacctacca ttgtagttgg 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 185 ccaagtgctc cacgatggcc 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 186 agcctctatc cacggctacc 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 187 gccccaggta agctggtagg 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 188 gcaagcagcg cacctgctgc 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 189 tcaagactgc tacactggcc 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 190 gcaggttgtt ctggaagttg 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 191 gggtgctgat gtcaacgctc 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 192 ccacgatggc caggtagccg 20 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 193 tggtcagcgg cttctcttcg 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 194 aatgtggggc tgatgtcaac 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 195 atttcaacaa gagcgaaacc 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 196 cacctgacca atgacttcca 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 197 gccctggaag cagcagctca 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 198 gctcacaggc aagatgtaga 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 199 cgtccgcgcc atgttccagg 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 200 tggtttcagg agccctgtaa 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 201 acccggatac agcagcagct 20 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 202 ttccagggct ccgagccgcg 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 203 ctgaaggcta ccaactacaa 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 204 gggtatttcc tcgaaagtct 20 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 205 gagccgcagg aggtgccgcg 20 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 206 ctgagtcagg actcccacgc 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 207 cacttacgag tccccgtcct 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 208 ctcaaattcc ttttggtttc 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 209 ggttggtgat cacagccaag 20 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 210 gcaggttgtt ctggaagttg 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 211 cacaggtcat tgatatctta 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 212 catggtgcaa ctcctgctgc 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 213 gtgaacgctc agatgtattc 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 214 atacatctga gcgttcacgt 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 215 gtgcgcagcg gggctgacag 20 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 216 tcacaatgac acacctctca 20 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 217 tagacgtcca taacaacctg 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 218 acgatccagg gccatggggc 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 219 gctggaccgc catggccaga 20 <210> 220 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 220 gttcactgcc acgtgcaggg 20 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 221 gctggtcaac ctcttccagc 20 <210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 222 acaaggcccg cagcgccgcg 20 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 223 caggcctctc catattgctg 20 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 224 gccacccgtg cagatgagga 20 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 225 tcgacatcta caacaaccta 20 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 226 atgtggtgat cacagccagg 20 <210> 227 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 227 gcgcttgcgg agcggcagcg 20 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 228 acaggtcatc gacatcctga 20 <210> 229 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 229 gaccgagcct cacctgccgt 20 <210> 230 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 230 ataccccatg atgtgcccca 20 <210> 231 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 231 gtgaacgcgc aaatgtactc 20 <210> 232 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 232 ttttctatct catgaggttt 20 <210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 233 aggcatccca ttgcgggcct 20 <210> 234 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 234 tcggcccgag taagtgctat 20 <210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 235 gcgatcctcg tggttgctgt 20 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 236 ttctttgttg atcactttga 20 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 237 ttcttccaaa ccagcaagtg 20 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 238 gacagatgct cacttcaaca 20 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 239 tgatgttcac catccacatg 20 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 240 catagtccag gaagaggacg 20 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 241 gataactgga accatctccg 20 <210> 242 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 242 caagcagaga agttcccttg 20 <210> 243 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 243 aaagacctga tgttacctgc 20 <210> 244 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 244 ttcggcgcca agatagctga 20 <210> 245 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 245 gctcatacag acccgcatga 20 <210> 246 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 246 agtgatcaac aaggaagggg 20 <210> 247 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 247 acccgggctg agatgtcaaa 20 <210> 248 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 248 tgtgattctg gcgttcttca 20 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 249 ggtcagtgaa gccgacacca 20 <210> 250 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 250 cttgcagtct tatgccgaga 20 <210> 251 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 251 atgccccaca ctgattacac 20 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 252 attccagtgt aatcagtgtg 20 <210> 253 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 253 aagttccctt gaggagcaca 20 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 254 ggacagatta gcaagcaatg 20 <210> 255 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 255 cttcccaaca ggtctcttga 20 <210> 256 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 256 agcagtctct tcacaactgg 20 <210> 257 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 257 tcacagtcat catgaactca 20 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 258 caactctctg atagtggtaa 20 <210> 259 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 259 aatcggcaat atataacatg 20 <210> 260 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 260 agcacttgct ctgaaatttg 20 <210> 261 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 261 ctaaatgtgt taccatacca 20 <210> 262 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 262 attattgaat ccatacctgg 20 <210> 263 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 263 agaatgggca ggaagaaaag 20 <210> 264 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 264 aaggtcggtt tggagaagtt 20 <210> 265 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 265 attgttcttt gaacaagcag 20 <210> 266 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 266 tggccttggt cctgtggagc 20 <210> 267 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 267 acaacatcag ggtctggatc 20 <210> 268 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 268 atttatgata tgacaacatc 20 <210> 269 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 269 tttatagcag cagacaacaa 20 <210> 270 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 270 gcaatgcaga cgaagcagac 20 <210> 271 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 271 agtttggcga ggcaaatggc 20 <210> 272 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 272 gagctggcag ctgtcattgc 20 <210> 273 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 273 tctgataaat ctctgcctct 20 <210> 274 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 274 gaatagatac actgttactg 20 <210> 275 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 275 gttacgccat gaaaatatcc 20 <210> 276 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 276 gtcagctggc cttggtcctg 20 <210> 277 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 277 aatgctttct tgtaacacaa 20 <210> 278 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 278 gatatgacaa catcagggtc 20 <210> 279 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 279 tggcagaaac actgtaacgc 20 <210> 280 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 280 attgttctct gaacaagcaa 20 <210> 281 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 281 catacaaacg gcctatctcg 20 <210> 282 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 282 gagatgcaga cgaagcacac 20 <210> 283 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 283 attgtgttac aagaaagcat 20 <210> 284 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 284 agaacgttcg tggttccgtg 20 <210> 285 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 285 gtttggagag gaaagtggcg 20 <210> 286 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 286 atttatgata tgacaacgtc 20 <210> 287 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 287 gttgtgtata actttgtctg 20 <210> 288 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 288 gtgcaccctc ttcaaaaact 20 <210> 289 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 289 gaccccaagc tcacctacca 20 <210> 290 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 290 ttctcccaag tgtgtcatga 20 <210> 291 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 291 ttccagagtg aagccgtggt 20 <210> 292 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 292 acggccacgc agacttcatg 20 <210> 293 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 293 ttcatgcggc ttctcacaga 20 <210> 294 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 294 ggacttctgg ttgtcgcaag 20 <210> 295 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 295 catgagcaac tgcagcatca 20 <210> 296 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 296 ccagaggccc ccttaccaca 20 <210> 297 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 297 caacaacagg tcgggactgc 20 <210> 298 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 298 cagcttggcc ttgtagacct 20 <210> 299 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 299 catgacacac ttgggagaag 20 <210> 300 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 300 gttcttgtcg ttcttcctcc 20 <210> 301 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 301 gctggacacg ctggtgggga 20 <210> 302 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 302 ccagaataaa gtcatggtag 20 <210> 303 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 303 cacatgaaga aagtctcacc 20 <210> 304 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 304 ttgagctgga caccctggtg 20 <210> 305 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 305 gcttctgctg ccggttaacg 20 <210> 306 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 306 gaacatactc cagttcctga 20 <210> 307 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 307 gggcagtcct attacagctg 20 <210> 308 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 308 ttctccaaag tgcattatga 20 <210> 309 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 309 tggatgacct ggctaacagt 20 <210> 310 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 310 cctgggaaac cggcaagacg 20 <210> 311 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 311 gaagccacag gaagtctgtg 20 <210> 312 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 312 acagatatgg caactcccag 20 <210> 313 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 313 gcagaagctg agttcaacct 20 <210> 314 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 314 tcatctgccc cagctgtaat 20 <210> 315 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 315 ggggaaaggt cgctttgctg 20 <210> 316 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 316 gcaggatttc tggttgtcac 20 <210> 317 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 317 ccagctcctc tgccttctgc 20 <210> 318 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 318 cagccagatc ccgctgttcc 20 <210> 319 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 319 ggccctcgag ttcaacaggt 20 <210> 320 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 320 gtgaagagct ggctgtggtc 20 <210> 321 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 321 ggccaagctg gacaagggcc 20 <210> 322 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 322 ccaggagaat gaagccctga 20 <210> 323 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 323 tgctggcctc acctgcagga 20 <210> 324 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 324 ccagagggtg ctggcaagaa 20 <210> 325 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 325 gatccagcgg ctcaacaagg 20 <210> 326 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 326 ccaaaaggtc aagtacctgc 20 <210> 327 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 327 acttaacctt cctctctgga 20 <210> 328 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 328 gcagcttcgg aaggagaacg 20 <210> 329 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 329 cacgcgcctc acctgcagaa 20 <210> 330 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 330 gaaggcagag gagctagtga 20 <210> 331 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 331 cctcacttaa ccttcctctc 20 <210> 332 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 332 tgtgcacctt ggatgccagt 20 <210> 333 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 333 ctcaggagag cgttaccatg 20 <210> 334 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 334 cgagaagaag gtgaagatgc 20 <210> 335 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 335 tatacctgtg agctcagcca 20 <210> 336 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 336 ccaggtgaag atcttcgagg 20 <210> 337 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 337 cttcacccac ctgggccgca 20 <210> 338 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 338 gccgggaatt ctccttcact 20 <210> 339 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 339 cccgcagaga tgttctgggt 20 <210> 340 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 340 aaaagagcaa gccttaccat 20 <210> 341 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 341 tgctgcagag ggccttcctc 20 <210> 342 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 342 ctccttctgt cctcaggtga 20 <210> 343 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 343 tacagatatc ccatcgtcct 20 <210> 344 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 344 tgcagcttgt cagtacatgt 20 <210> 345 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 345 tctccttaag ggtgctgcag 20 <210> 346 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 346 agtgatcaca agcaggggcc 20 <210> 347 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 347 cactttcaaa ggagcaaaat 20 <210> 348 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 348 ctcctcaggg ttccacgcca 20 <210> 349 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 349 gccccacatg tactgagaag 20 <210> 350 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 350 cttaccaaaa gaaatcaatc 20 <210> 351 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 351 acactgaatg tgcagcacaa 20 <210> 352 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 352 aagtcagtcc cacagcgtcc 20 <210> 353 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 353 actccaagcc gggccctgag 20 <210> 354 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 354 gctcttaaaa gagtacttaa 20 <210> 355 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 355 atggcaggaa aacagcgagc 20 <210> 356 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 356 gaagtgccaa gcctgcctcc 20 <210> 357 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 357 gacaccagtt gagtttcttc 20 <210> 358 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 358 gaggcaggct tggcacttcc 20 <210> 359 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 359 tcgggccatg ggtgtgtctg 20 <210> 360 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 360 tcacctgaaa tgacaatgat 20 <210> 361 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 361 ccgcattccc tccccaggca 20 <210> 362 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 362 ggccccccag tggactcctc 20 <210> 363 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 363 gtgatagaaa tccccgtcca 20 <210> 364 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 364 ttctggaacc tggacgctgt 20 <210> 365 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 365 agttgtactg aagtccactt 20 <210> 366 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 366 cacacaaggc acttggatcc 20 <210> 367 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 367 agaacaccat tccgtgcctg 20 <210> 368 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 368 catggcgctc ggggcctctc 20 <210> 369 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 369 gccccccagt ggactcctca 20 <210> 370 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 370 gctgtcggtg gggccgaatg 20 <210> 371 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 371 caagtgcctt gtgtggtctg 20 <210> 372 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 372 gccacttctc agtacatgtg 20 <210> 373 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 373 tacagatacc ccattgttct 20 <210> 374 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 374 tagaaatccc cgtccaaggc 20 <210> 375 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 375 aaagccggct gcgtgtattt 20 <210> 376 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 376 tggtctcact gaacagaaaa 20 <210> 377 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 377 tggtgaccct gaaggacagt 20 <210> 378 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 378 agagaaagct ggggcacgga 20 <210> 379 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 379 cgtgccccag ctttctctca 20 <210> 380 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 380 tatgccatga gtgctcagag 20 <210> 381 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 381 agggctgggt gctgtcggtg 20 <210> 382 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 382 ccatgccagg gagcccctca 20 <210> 383 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 383 gagtttcttc tggctttcca 20 <210> 384 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 384 gctgtcatag ccgagaacaa 20 <210> 385 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 385 gggagaagcc tatgagccct 20 <210> 386 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 386 ggggtatctg tagcattcct 20 <210> 387 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 387 tggatgatct cccgaaactg 20 <210> 388 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 388 cttgtggcgc tgaaaacgaa 20 <210> 389 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 389 actgagaagt ggcatgcatg 20 <210> 390 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 390 tgaacatttc cagtgtgtat 20 <210> 391 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 391 ttgctcaaat acaaagcctg 20 <210> 392 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 392 tgagagactc cagttgccag 20 <210> 393 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 393 gcatgagtac aagaaatggc 20 <210> 394 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 394 gaggcaattg ccgtcacctg 20 <210> 395 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 395 ctgtccttca gggtcaccaa 20 <210> 396 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 396 cagaaacatc caggccaccc 20 <210> 397 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 397 gtattcagct taaaaaattc 20 <210> 398 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 398 atccatgcat gcctgccgga 20 <210> 399 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 399 aatataccag acactgcaac 20 <210> 400 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 400 tgtcttgcag ataacaatta 20 <210> 401 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 401 ttgggtgtgt attccaaccg 20 <210> 402 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 402 tttagaaagt gattcaaaag 20 <210> 403 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 403 agtaaaagaa ttacagcaaa 20 <210> 404 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 404 actacagcaa gggaaacagc 20 <210> 405 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 405 ttgctttcta tactacagca 20 <210> 406 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 406 gcagtccttt gctccatgaa 20 <210> 407 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 407 gcagagaata cgtgaacaac 20 <210> 408 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 408 taacatgaac ataccttgag 20 <210> 409 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 409 cctgaaatca ctttatcttg 20 <210> 410 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 410 ataaagcgta tgaagccttc 20 <210> 411 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 411 gtattccaac cgcggtaaga 20 <210> 412 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 412 ccgggccccc agcaggtctg 20 <210> 413 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 413 cctacttagg cactgccagg 20 <210> 414 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 414 gcttacccag cggatgagcg 20 <210> 415 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 415 cttctctgga gcctccagga 20 <210> 416 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 416 tccactgacc tgtccttcct 20 <210> 417 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 417 acccaggcat catccgacaa 20 <210> 418 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 418 catggggttc aaggaagaag 20 <210> 419 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 419 aaaccatcct gccacctgga 20 <210> 420 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 420 tcatggctgg gctctccagg 20 <210> 421 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 421 cagggccgag atcttcgagg 20 <210> 422 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 422 agagtgatga agagtgtgac 20 <210> 423 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 423 tcacatttca gtttaccatt 20 <210> 424 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 424 gctgatgcag tctcatatga 20 <210> 425 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 425 tgacattctg gagatagttg 20 <210> 426 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 426 cactttgact atggaaacag 20 <210> 427 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 427 aagctccaca ctggttacag 20 <210> 428 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 428 tagctacgcc tgtagaagaa 20 <210> 429 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 429 gctgtcatag agaagctcac 20 <210> 430 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 430 ttactgcttg tcatgtgact 20 <210> 431 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 431 aatcacctac cttggagctg 20 <210> 432 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 432 gtaactttat gtgtctcaga 20 <210> 433 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 433 cctcacaagt gcaactactg 20 <210> 434 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 434 tccttacaat cttccatagg 20 <210> 435 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 435 ggaggaatcc ggcttccgaa 20 <210> 436 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 436 acaatgagct ttcacccgaa 20 <210> 437 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 437 acttaccaga atgggtcctg 20 <210> 438 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 438 gccatctcgc cgccacagtg 20 <210> 439 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 439 gggctctatc acaaaatgaa 20 <210> 440 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 440 cccctgacta tgaagaagga 20 <210> 441 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 441 acctgtgctg gaccgggcct 20 <210> 442 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 442 gtagacggag aggggccccg 20 <210> 443 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 443 aagcttgtag tagagcccac 20 <210> 444 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 444 ctggaggagg aatgccaatg 20 <210> 445 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 445 cagccactcc tacatggacg 20 <210> 446 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 446 gaaggggctg agattccagg 20 <210> 447 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 447 ggagctgtac tcgggcacgt 20 <210> 448 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 448 gctttgccgc cgtccagcca 20 <210> 449 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 449 aggcccggtc cagcacaggt 20 <210> 450 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 450 gaggtggcgc ttacctgtgc 20 <210> 451 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 451 gctagacatc ttccggtttc 20 <210> 452 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 452 ggaagctcag tatccgctga 20 <210> 453 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 453 tgtctgggtg ctgaccgttg 20 <210> 454 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 454 aaggcatcca gacccgaaac 20 <210> 455 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 455 caaggtggac tcaccgtggt 20 <210> 456 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 456 agcccacagg cattgcagac 20 <210> 457 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 457 cccctgacta tgaagaaaga 20 <210> 458 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 458 agtccatatg gaacccacgg 20 <210> 459 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 459 agtctgagtg caaattgggc 20 <210> 460 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 460 tacgaattgc accggaccag 20 <210> 461 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 461 ttagaggctt gaggaaaccg 20 <210> 462 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 462 ttagaaccta tgaagctctg 20 <210> 463 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 463 cctgaataaa ctccaccgca 20 <210> 464 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 464 aattcgaaag cccatcagtt 20 <210> 465 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 465 tggccacaac ccaaactgat 20 <210> 466 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 466 cagcatactc tgaggtacga 20 <210> 467 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 467 ttacctctag cactgctgag 20 <210> 468 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 468 tatgcagtcc attattgaca 20 <210> 469 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 469 gtaacacagc ttattccgcg 20 <210> 470 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 470 actttcccta gcaatgcagg 20 <210> 471 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 471 caaatgggca agccttacgg 20 <210> 472 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 472 ctcaatgtcc gtattgatag 20 <210> 473 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 473 agtctgagtg caaattgggc 20 <210> 474 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 474 ccagatagtg caaattgcta 20 <210> 475 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 475 tgatagtggt ctggtcaaat 20 <210> 476 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 476 aattcgaaag cccatcagtt 20 <210> 477 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 477 gcccattact ttgtgtagtg 20 <210> 478 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 478 tggccacagc ccaaactgat 20 <210> 479 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 479 gcattcatac ttgctttcca 20 <210> 480 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 480 ttagatgcag aggaatcact 20 <210> 481 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 481 atggtgaaat gtccaaatga 20 <210> 482 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 482 ttggttgcca tgaaaaggta 20 <210> 483 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 483 tcatttatgg aggagatcca 20 <210> 484 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 484 tgttacagcg ctacaggagc 20 <210> 485 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 485 ctaaactgtg aaaacagctg 20 <210> 486 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 486 aggcgtattg taccctggaa 20 <210> 487 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 487 acgtgagatt ctttctctga 20 <210> 488 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 488 ccagtcacac atgagaatgt 20 <210> 489 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 489 gaagcagtgc aaacgccatg 20 <210> 490 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 490 acattctgaa ggattgtcca 20 <210> 491 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 491 agttgacaat gaaatactgc 20 <210> 492 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 492 aatatcatct gtgaatactg 20 <210> 493 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 493 taaaggctgt ttgcaaaaga 20 <210> 494 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 494 tgcaaacacc atgtggccac 20 <210> 495 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 495 gcgagagatt ctttccctga 20 <210> 496 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 496 atcctcatca gagaacaggt 20 <210> 497 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 497 acggtaaagt gcccaaataa 20 <210> 498 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 498 ttaaactgtg agaacagctg 20 <210> 499 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 499 tctttgttgc aggagtctga 20 <210> 500 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 500 caggggcttg ttatgaggta 20 <210> 501 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 501 ctgattgatg gtagcaggga 20 <210> 502 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 502 ccttatcttc agtcacatgc 20 <210> 503 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 503 tcacatgctg gcagaaatca 20 <210> 504 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 504 ttctgtcgct gtgagataaa 20 <210> 505 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 505 acaaggcagt acctgccacg 20 <210> 506 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 506 tgtgactcac ccgggataca 20 <210> 507 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 507 gaggtccatc agatcagctc 20 <210> 508 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 508 atctccctgg aactggccat 20 <210> 509 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 509 tgcaaaaatt gcaaaactca 20 <210> 510 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 510 tgcacagaac tattgtacca 20 <210> 511 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 511 cagattagtg cttaccttcc 20 <210> 512 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 512 attccgtaaa atagagcccc 20 <210> 513 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 513 ctgcactcgg ctgggacaat 20 <210> 514 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 514 ccttatgaaa aagtcaaaac 20 <210> 515 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 515 aaaatatcaa gtatatatgg 20 <210> 516 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 516 tctagcatcg gcatgccaaa 20 <210> 517 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 517 ttggaagctc atggacaaag 20 <210> 518 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 518 gatttcctcc tcgaccacca 20 <210> 519 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 519 cttcatctct tggatcaaag 20 <210> 520 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 520 aatgtatgaa gaacagtcac 20 <210> 521 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 521 taaacttacc tgaaacagcc 20 <210> 522 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 522 aagaatatga tgttcctccc 20 <210> 523 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 523 agcaagctgc cgcagatcgc 20 <210> 524 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 524 agtactcatt ctcactgagt 20 <210> 525 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 525 gatgaccaga gactatctgt 20 <210> 526 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 526 cctaaacagt gccattatga 20 <210> 527 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 527 ctatctgtcg gtgaaggtct 20 <210> 528 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 528 gaatatatac aagttattgg 20 <210> 529 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 529 tggggtgcca ggctgtgtgg 20 <210> 530 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 530 catgtttcct tgcagaataa 20 <210> 531 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 531 aagttcgagt gctgctggaa 20 <210> 532 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 532 catcaagcca gctaatatgg 20 <210> 533 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 533 aaatgagcag cattctgttg 20 <210> 534 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 534 cttcttgcaa caggagacaa 20 <210> 535 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 535 tggaacggtt cggataggta 20 <210> 536 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 536 catcaagcct gctaacatgg 20 <210> 537 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 537 ggcgtggaga ggagagctcg 20 <210> 538 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 538 atgatcacta tttactgaaa 20 <210> 539 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 539 tcgtctacag cagtagcaaa 20 <210> 540 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 540 cagagactac ctgtcggtga 20 <210> 541 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 541 gtgcttctcg caggtcaagg 20 <210> 542 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 542 tggcggctca gcatgatctg 20 <210> 543 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 543 caacccacat ttcgatttgg 20 <210> 544 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 544 agccattcac acttctcact 20 <210> 545 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 545 ccggctgtca cttaccgctg 20 <210> 546 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 546 tttgtttcac agtcgttcga 20 <210> 547 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 547 tggtaagaat gagggtaacc 20 <210> 548 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 548 gctgcggaaa gcgcccgcca 20 <210> 549 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 549 gttgatcatg attctctggt 20 <210> 550 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 550 ttgttgcaga caaatgtggc 20 <210> 551 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 551 ctatgaccgg ctggagatct 20 <210> 552 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 552 cacatgtccg gctctcatgt 20 <210> 553 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 553 gaggtgtcat cattcagggt 20 <210> 554 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 554 ccagggtacc tcacatctcc 20 <210> 555 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 555 aaacctgtat cctgggaaac 20 <210> 556 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 556 agaccagttg gtgctatact 20 <210> 557 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 557 agtggagtga taaagtcccc 20 <210> 558 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 558 gaccggctag aaatctggga 20 <210> 559 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 559 cctcacattg ggcgttactg 20 <210> 560 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 560 ggatgttctg tcgctacgac 20 <210> 561 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 561 cctgactcaa atcctccagg 20 <210> 562 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 562 agagaatgcc cgatgaggat 20 <210> 563 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 563 tacctgtatc cactctcggt 20 <210> 564 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 564 tgtcctccaa atcgaagtga 20 <210> 565 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 565 cattctcagg gtagttcagg 20 <210> 566 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 566 tactgtggac agaaaacacc 20 <210> 567 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 567 gccctttagc tggtatctgc 20 <210> 568 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 568 atcagaactg ctatccacat 20 <210> 569 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 569 catggcagag acacagacac 20 <210> 570 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 570 cgaggagaac gtatatgaag 20 <210> 571 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 571 aatgtgactc tggatgacca 20 <210> 572 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 572 ggaaaatatc tacaccatcg 20 <210> 573 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 573 gtagtagttg cagcagcagc 20 <210> 574 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 574 ttggagtggg agtctctgct 20 <210> 575 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 575 tccttacttt atagggtcat 20 <210> 576 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 576 caacttgcct ccaggagggt 20 <210> 577 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 577 atgtgactct ggatgaccat 20 <210> 578 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 578 ggggcaaggg attctgtcct 20 <210> 579 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 579 actgctatcc acattggagt 20 <210> 580 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 580 aaccatttct ctccgtggtt 20 <210> 581 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 581 agtgtaactg cagggcagat 20 <210> 582 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 582 agaagtggaa tacagagcgg 20 <210> 583 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 583 atcagaatag gcatctacat 20 <210> 584 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 584 ggtgtagaag cagggcagat 20 <210> 585 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 585 aacctcgtgc ccgtctgctg 20 <210> 586 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 586 aagagaagat acagaattta 20 <210> 587 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 587 atgtgactct agcagacagt 20 <210> 588 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 588 tctacacccc agccgcccca 20 <210> 589 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 589 acatccagat actggctaaa 20 <210> 590 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 590 tgtgtttgaa tgtggcaacg 20 <210> 591 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 591 agtcacattc tctatggtca 20 <210> 592 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 592 agtcggtgca ggggtgacct 20 <210> 593 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 593 tggccaaaga gatgaggctg 20 <210> 594 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 594 actcctgggg gcaaatgaca 20 <210> 595 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 595 tgaagccatc tctgtaggtg 20 <210> 596 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 596 ggctgaagga gcagttcaaa 20 <210> 597 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 597 tgccactctt tccagccacg 20 <210> 598 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 598 aagtcagccc cctggactct 20 <210> 599 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 599 acagtgattg ctagtccctc 20 <210> 600 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 600 agccccaggt cccagagtcc 20 <210> 601 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 601 ctgtgggtct ggcacaggct 20 <210> 602 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 602 gccaagtgga ctcctcctgg 20 <210> 603 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 603 gtaggtgagg acacagcccc 20 <210> 604 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 604 tgcacagaga ctgggcggtc 20 <210> 605 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 605 acgtacaacc tcaaggttct 20 <210> 606 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 606 gctcaatgcc actgtcacgt 20 <210> 607 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 607 agtctctgtg cactggttcc 20 <210> 608 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 608 tgggcggtca ggacggctga 20 <210> 609 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 609 gttccggaac caatgcacag 20 <210> 610 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 610 tgcgaagagc aggggtcact 20 <210> 611 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 611 gcggtccctg aggtgcaccg 20 <210> 612 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 612 tccccacacc agcaggcagg 20 <210> 613 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 613 ccgctacacg gtgctgagcg 20 <210> 614 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 614 ccggtggtgt gggcccagga 20 <210> 615 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 615 gtttggggtg catacctgtc 20 <210> 616 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 616 aggctctgag agatcctggg 20 <210> 617 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 617 gctcaatgcc actgtcacat 20 <210> 618 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 618 gtcccggagg cctgcgcagc 20 <210> 619 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 619 gcagaaggct gagatcctgg 20 <210> 620 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 620 taggtgagga tgcagcccca 20 <210> 621 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 621 ttcagtgatc gggtggtccc 20 <210> 622 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 622 gtctctgaca atgaatgaca 20 <210> 623 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 623 ctgagctttc ttggaccttc 20 <210> 624 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 624 aacatctctg cagaggaagg 20 <210> 625 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 625 caaggggaga atattcctga 20 <210> 626 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 626 cactataaat ggccagaagc 20 <210> 627 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 627 caggcacgat agatacaaag 20 <210> 628 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 628 gtatcctggt gggatttaca 20 <210> 629 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 629 aggcagcctg tatcagcccc 20 <210> 630 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 630 gctgctcctg gtctgggtcc 20 <210> 631 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 631 tctctaggct tctgtagctc 20 <210> 632 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 632 ctgaagcgac atgccacccc 20 <210> 633 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 633 tctctgacaa tgaatgacac 20 <210> 634 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 634 ccatttatag tgttgacctg 20 <210> 635 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 635 tgccttcctc gctacaggta 20 <210> 636 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 636 ttccacagaa tggattctga 20 <210> 637 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 637 gctgaccgtg aacgatacag 20 <210> 638 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 638 cccatccttc aaggatcgag 20 <210> 639 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 639 caccacggca caagtgaccc 20 <210> 640 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 640 atgtcacctc tcctccacca 20 <210> 641 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 641 agtgtacgtc ccatcagggt 20 <210> 642 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 642 gttcacggtc agcgactgga 20 <210> 643 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 643 gcagatgacc accagcgtcg 20 <210> 644 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 644 aacatttctg cagagaaagg 20 <210> 645 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 645 ctgctgctcc cagttgacct 20 <210> 646 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 646 aggccacatc tgcttcctgt 20 <210> 647 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 647 ggtggtcgcg ttgactagaa 20 <210> 648 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 648 aagaagtcct cttacaacag 20 <210> 649 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 649 tccaagacaa gccatggctg 20 <210> 650 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 650 tgctccttct tcttcataaa 20 <210> 651 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 651 acaaaaggcc aagtcctaga 20 <210> 652 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 652 tgaaattgct tttcacattc 20 <210> 653 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 653 cacacaacac tgatgaggtc 20 <210> 654 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 654 gtggtgttgg ctagcagcca 20 <210> 655 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 655 cccatgccca caaagtatgg 20 <210> 656 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 656 aggtccgggt gactgtgctg 20 <210> 657 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 657 aggactgaga gctgttgaca 20 <210> 658 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 658 tgaatattca catggaaagc 20 <210> 659 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 659 attaaaggta ccactgcaga 20 <210> 660 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 660 cacgggactg tacctctgca 20 <210> 661 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 661 acatgagttc caccttgcag 20 <210> 662 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 662 ctagattacc ccttctgcag 20 <210> 663 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 663 gacccaacct tcagtggtgt 20 <210> 664 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 664 ctcaactgca gctgccttct 20 <210> 665 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 665 ccaagacaag ccatggctgg 20 <210> 666 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 666 aaaagaagtc ctcttacaac 20 <210> 667 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 667 gatgaaaaga agagtgagca 20 <210> 668 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 668 atggactctc ttcttcataa 20 <210> 669 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 669 tccttgcagc agttagttcg 20 <210> 670 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 670 ccgccatact acctgggcat 20 <210> 671 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 671 ctgaaatcca aggcaagcca 20 <210> 672 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 672 accccgaact aactgctgca 20 <210> 673 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 673 ttttcacatt ctggctctgt 20 <210> 674 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 674 tggcttgcct tggatttcag 20 <210> 675 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 675 tgcatactca cacacaaagc 20 <210> 676 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 676 cctagatgat tccatctgca 20 <210> 677 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 677 aaacaggaga gtgcagggcc 20 <210> 678 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 678 ctgctggcca gtaccacagc 20 <210> 679 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 679 aagaagccct cttacaacag 20 <210> 680 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 680 cgtcatgact accagagagg 20 <210> 681 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 681 atgatcaggt gactcatatt 20 <210> 682 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 682 gcctcgcagg gtggatgatc 20 <210> 683 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 683 ccggcctttc tccacctctc 20 <210> 684 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 684 ccagtacaag tttatttacg 20 <210> 685 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 685 gtgcccacct cgggccagta 20 <210> 686 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 686 cttctatgac ctgtacggag 20 <210> 687 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 687 tattcggatc cagaactcag 20 <210> 688 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 688 tgggtactta aggtggatga 20 <210> 689 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 689 atgtgtccca tactggcccg 20 <210> 690 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 690 tggtgccatc tcggtcctgc 20 <210> 691 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 691 gtggggtccg agcagttcag 20 <210> 692 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 692 catcgtcatg actaccagag 20 <210> 693 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 693 ggggacttct atgacctgta 20 <210> 694 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 694 ccagggtgga cgctacacag 20 <210> 695 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 695 cattgatgta gtcggacccg 20 <210> 696 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 696 ggtgtcctgc aggaccgcga 20 <210> 697 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 697 gcaggcagag acgctgctgc 20 <210> 698 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 698 gcccccagga tggtgaggta 20 <210> 699 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 699 gatgcagaga ccctgctcaa 20 <210> 700 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 700 ctgagttctg gatccgaata 20 <210> 701 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 701 gatgtgggtg accctgagcg 20 <210> 702 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 702 aacttaagga cacctgcaag 20 <210> 703 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 703 gctccgatcc cactagtgag 20 <210> 704 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 704 cggcccagtc gcaagaacca 20 <210> 705 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 705 gtttgcgact ctgacagagc 20 <210> 706 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 706 tattcggatc cagaactcag 20 <210> 707 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 707 tcacgcacaa gaaacgtcca 20 <210> 708 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 708 agccagtgcc cgggcatgcc 20 <210> 709 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 709 tcttcgttag gacttggccc 20 <210> 710 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 710 cagctggatg aacagcgaga 20 <210> 711 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 711 gaaaattgca gcgaaatatg 20 <210> 712 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 712 actgggcgat accacagcag 20 <210> 713 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 713 agtggcactt gggacttcta 20 <210> 714 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 714 tcttggtagg tcacaaactc 20 <210> 715 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 715 gtgcagactg gagaatacag 20 <210> 716 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 716 tgatccctca ggagtccagg 20 <210> 717 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 717 gatggccctg ctgtaacttt 20 <210> 718 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 718 aacgttagtg atgacagcat 20 <210> 719 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 719 ccatgagaga gcccgttacg 20 <210> 720 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 720 ggataggcgt gggaatcaac 20 <210> 721 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 721 tatcccaagg ctccggaagg 20 <210> 722 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 722 tgggtaaggg aggtaactcc 20 <210> 723 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 723 tttccaacac tatactcgcc 20 <210> 724 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 724 acgtagtatt cccctgtcag 20 <210> 725 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 725 actgcccaca caaaatggtt 20 <210> 726 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 726 gctttaggtt cttgtcggtg 20 <210> 727 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 727 tgcaaaggtg gatgcgagca 20 <210> 728 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 728 taactcctgg ggtagggaat 20 <210> 729 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 729 ggctttggcg cccttgctgc 20 <210> 730 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 730 ggtaccaaca aagagaacct 20 <210> 731 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 731 gagttcatca tgcccgcgca 20 <210> 732 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 732 tttgccagct tagatggctt 20 <210> 733 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 733 tagatagcac aaccatttcc 20 <210> 734 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 734 agtttcaaag caaacgagaa 20 <210> 735 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 735 ctgccctatg ggcttcccac 20 <210> 736 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 736 gtcaactgta gtgcccagga 20 <210> 737 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 737 tcagtgatgt tagtcccctg 20 <210> 738 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 738 ctaaagagga gaaaccagag 20 <210> 739 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 739 cagcagatgg caaacctggc 20 <210> 740 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 740 cagggcaact gaaggagagg 20 <210> 741 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 741 acgatgggag cagcaggtgt 20 <210> 742 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 742 cccacgtgct gaataacgga 20 <210> 743 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 743 taccaaagat ggagctgatg 20 <210> 744 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 744 caggccactg gtgaccgcct 20 <210> 745 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 745 ctgctgtttg gcaggcggcc 20 <210> 746 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 746 gccgactggg aaaggttgaa 20 <210> 747 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 747 gctgtcatca ctaacgtttc 20 <210> 748 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 748 tccatgtaag gattgaccca 20 <210> 749 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 749 accgaataca cccgagacag 20 <210> 750 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 750 acctggccgg caaagcagga 20 <210> 751 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 751 tactacgtgg agaatgccga 20 <210> 752 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 752 gaaaaccgat tccggagggt 20 <210> 753 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 753 gcactgagca tggaccgcac 20 <210> 754 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 754 gttctctaag gtgcagcaag 20 <210> 755 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 755 agttagcagc gagttccccg 20 <210> 756 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 756 cagaagcgct gggcttggac 20 <210> 757 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 757 cagcggctgg gccaagctgt 20 <210> 758 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 758 actttcgttc tgttctgcaa 20 <210> 759 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 759 cgccttggca gagggaaccc 20 <210> 760 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 760 gatgaggctg aatcaaatga 20 <210> 761 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 761 gcggttcaag acagaaaaga 20 <210> 762 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 762 tcttgttctc taagcagtac 20 <210> 763 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 763 ggtgccatct gcattggcat 20 <210> 764 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 764 tggcaagtat cccaaggctc 20 <210> 765 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 765 gctgccacaa gcactctagg 20 <210> 766 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 766 atagcactga agccatttgg 20 <210> 767 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 767 gaatacaccc gagacagtgg 20 <210> 768 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 768 tccaagtatc tgtggctcag 20 <210> 769 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 769 tcaatggtgc tagttatctg 20 <210> 770 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 770 gtgaacgttc ccatacaggg 20 <210> 771 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 771 gaatcccttg aaccacaacg 20 <210> 772 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 772 gctgtgtgca gacgaagaag 20 <210> 773 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 773 gacacacggc gcaatgacag 20 <210> 774 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 774 cagctgtatg atctggaagc 20 <210> 775 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 775 cagcaaccag actgaaaaac 20 <210> 776 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 776 gcagggagat ggccccacag 20 <210> 777 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 777 acagtggcat ctacctctgt 20 <210> 778 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 778 cggaggatct tatgctgaac 20 <210> 779 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 779 gagccctgga gcagagctcg 20 <210> 780 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 780 gcaaaaatcg aggagagccc 20 <210> 781 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 781 gccaggctgg gtagaaggtg 20 <210> 782 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 782 gctcaaacca ttacagaagg 20 <210> 783 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 783 ggacaagctg caggtgaagg 20 <210> 784 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 784 gagccctgga gcagagctcg 20 <210> 785 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 785 ggacaagctg caggtgaagg 20 <210> 786 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 786 gctcaaacca ttacagaagg 20 <210> 787 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 787 gccaggctgg gtagaaggtg 20 <210> 788 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 788 gacacacggc gcaatgacag 20 <210> 789 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 789 cagctgtatg atctggaagc 20 <210> 790 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 790 cagcaaccag actgaaaaac 20 <210> 791 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 791 gcagggagat ggccccacag 20 <210> 792 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 792 acagtggcat ctacctctgt 20 <210> 793 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 793 cggaggatct tatgctgaac 20 <210> 794 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 794 gcaaaaatcg aggagagccc 20 <210> 795 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 795 cgaccagttg gacaagctgc 20 <210> 796 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 796 catgtggaag tcatgcctgt 20 <210> 797 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 797 agcgggcatc ctggacgggt 20 <210> 798 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 798 ccaggctggg tagaaggtga 20 <210> 799 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 799 gcaccccaag gcaaaaatcg 20 <210> 800 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 800 gctcaaacca ttacagaagg 20 <210> 801 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 801 gacacacggc gcaatgacag 20 <210> 802 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 802 cagctgtatg atctggaagc 20 <210> 803 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 803 cggccagttc caaaccctgg 20 <210> 804 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 804 cagttccaaa ccctggtggt 20 <210> 805 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 805 ctgcagcttc tccaacacat 20 <210> 806 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 806 cgtgtcacac aactgcccaa 20 <210> 807 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 807 agagctcagg gtgacaggtg 20 <210> 808 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 808 gcgtgacttc cacatgagcg 20 <210> 809 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 809 cagcggcacc tacctctgtg 20 <210> 810 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 810 gctgcggtcc tcggggaagg 20 <210> 811 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 811 gcagggctgg ggagaaggtg 20 <210> 812 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 812 catgagcccc agcaaccaga 20 <210> 813 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 813 gccctgtgtc cctgagcaga 20 <210> 814 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 814 taggggcccc aggcctgagc 20 <210> 815 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 815 aagatctgcg cccggagata 20 <210> 816 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 816 gttctgtctg tagggaggta 20 <210> 817 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 817 caacgaaact tacacaagga 20 <210> 818 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 818 cactcagaac ttacatcaga 20 <210> 819 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 819 tctgagtgtg acagagaagg 20 <210> 820 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 820 ttcctcctga gactgtcgta 20 <210> 821 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 821 gacaattgca gcctgctgag 20 <210> 822 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 822 acttacatca gaaggttgct 20 <210> 823 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 823 gcacaggagc tgcggcggat 20 <210> 824 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 824 gttgtaagat aaccatttga 20 <210> 825 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 825 gtttgcaaat gattaccgcg 20 <210> 826 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 826 tcctgtgcaa tccgtatctc 20 <210> 827 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 827 tcgccgtcgg gattaccttg 20 <210> 828 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 828 tcttccgtct ggtatggaga 20 <210> 829 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 829 ttccatacga cagtctcagg 20 <210> 830 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 830 ttctgtctgt agggaggtag 20 <210> 831 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 831 caaccactat ctcagtgcaa 20 <210> 832 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 832 agctggggag gcctctccgc 20 <210> 833 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 833 ccactgaact tccctatgaa 20 <210> 834 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 834 ttaacgctta ctatgcaagg 20 <210> 835 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 835 aaccattcgt gggtggtctt 20 <210> 836 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 836 aggcaatcac ggaggtgaag 20 <210> 837 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 837 tggcttgcag atgactccgc 20 <210> 838 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 838 aaagatcacc tatatcctct 20 <210> 839 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 839 gttgatttgt cacaactcat 20 <210> 840 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 840 gttctgatgc agcttccatg 20 <210> 841 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 841 ttttccagtt agagaaatag 20 <210> 842 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 842 tagtggttga aggcctggca 20 <210> 843 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 843 ttgccttcag gattaccttg 20 <210> 844 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 844 acagtctcac tctgtcaccc 20 <210> 845 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 845 cactcagaac ttacatcaga 20 <210> 846 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 846 cttgggcgat ccatatctct 20 <210> 847 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 847 aggtagacaa ttgcagcctg 20 <210> 848 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 848 acttcctcta tttctctaac 20 <210> 849 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 849 actggaggat cgagacagca 20 <210> 850 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 850 tccctacaga cagagccaca 20 <210> 851 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 851 ttgtggctct gtctgtaggg 20 <210> 852 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 852 gctgttaact ctgttgatgc 20 <210> 853 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 853 ggctcgccgg ctcgggatgg 20 <210> 854 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 854 ccggagccgc ggaccaccac 20 <210> 855 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 855 cgattgagaa gttattagaa 20 <210> 856 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 856 gctcaagtac tcgcccgacc 20 <210> 857 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 857 tccccgcagg actcaccttg 20 <210> 858 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 858 ctgtgctgct gctgcacgtt 20 <210> 859 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 859 ggacgaggag cgggccctgg 20 <210> 860 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 860 cgaaatctat gaggaagagg 20 <210> 861 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 861 actgttaact ctgttgatgc 20 <210> 862 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 862 gcacattagg ttgcagtatg 20 <210> 863 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 863 ggatttcgac gaaatctatg 20 <210> 864 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 864 tctcaatcga tcttcgtgtc 20 <210> 865 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 865 tgcattggag actgagcaaa 20 <210> 866 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 866 gccaacgtac attaacagga 20 <210> 867 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 867 gaattccctt cttcattaac 20 <210> 868 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 868 ccggacccgg tggtcgtccg 20 <210> 869 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 869 gcagctgctc aagtactcgc 20 <210> 870 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 870 aaacaatagg ttataccaca 20 <210> 871 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 871 cggtgacgtg accggagccg 20 <210> 872 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 872 ccactgcaga ccccacactg 20 <210> 873 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 873 tataaaggaa tacggattga 20 <210> 874 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 874 gtggctggag tgggctataa 20 <210> 875 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 875 cggagagtca ttgtgcctgc 20 <210> 876 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 876 cacaggagca cgttcgacag 20 <210> 877 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 877 aatgacggac cctgatgagg 20 <210> 878 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 878 catggtactt actttccctg 20 <210> 879 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 879 ccaacgccag ctgtatcacc 20 <210> 880 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 880 cagcacttcc gtgttgtaga 20 <210> 881 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 881 caaaatgacg gaccccgatg 20 <210> 882 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 882 tggttctcga attacctgcg 20 <210> 883 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 883 tgtgaggcaa tggctggagt 20 <210> 884 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 884 gatcgtttgt gcccctccaa 20 <210> 885 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 885 tcgttggtgg tcatgttggg 20 <210> 886 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 886 tcagtaagaa tacagagcaa 20 <210> 887 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 887 ccagctgtat cacctgggag 20 <210> 888 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 888 tgtcggagag cagctccagg 20 <210> 889 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 889 aacattatga ccaaagtgca 20 <210> 890 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 890 ggcggcactt actttccctg 20 <210> 891 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 891 actgtgtaaa atgaacaagg 20 <210> 892 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 892 atcccccgcc acctggacct 20 <210> 893 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 893 ggaaggcagg tcactattac 20 <210> 894 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 894 ctgatgcacg gaaaggaagt 20 <210> 895 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 895 cctgggcccc ggtgctctcg 20 <210> 896 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 896 accagccgaa gtgtgaccgg 20 <210> 897 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 897 gtcagcgtga tgatcctctc 20 <210> 898 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 898 ctccagcttg tcgatgatca 20 <210> 899 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 899 tcccgtcccg ccgtgcatca 20 <210> 900 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 900 tggcgcgcgg atcaacatct 20 <210> 901 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 901 gagagaatca tcactctgac 20 <210> 902 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 902 tccgtgcata agaagccgaa 20 <210> 903 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 903 aagcatcatt gggaagaaag 20 <210> 904 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 904 ctccatgacc aacagtaccg 20 <210> 905 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 905 atttggaatg gtgagttcat 20 <210> 906 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 906 agagatccgc gagagtacgg 20 <210> 907 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 907 gaaagcctta aagatggcat 20 <210> 908 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 908 cagctcccca gtcatctgcg 20 <210> 909 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 909 acacactcgg tgacagactg 20 <210> 910 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 910 aatcagggag ccgcactggg 20 <210> 911 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 911 gtcggttaag aggatccgcg 20 <210> 912 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 912 ccaaaacata caatgagcct 20 <210> 913 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 913 agactattat gcaataatta 20 <210> 914 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 914 aagactttgc gatctattta 20 <210> 915 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 915 gagcacatca cttaccactt 20 <210> 916 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 916 gtaccaagac atagattcta 20 <210> 917 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 917 cctctgtgag ctgttcatta 20 <210> 918 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 918 aacgggcaag aaggatgaac 20 <210> 919 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 919 gaaaccactt cataatagtc 20 <210> 920 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 920 cacacctggc ggaagatggt 20 <210> 921 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 921 tggagagatt cttctttcac 20 <210> 922 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 922 ggagttgtcg gaataaccaa 20 <210> 923 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 923 caaatcccag agtttgcaag 20 <210> 924 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 924 tcaggcaact cagatctaga 20 <210> 925 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 925 ttacccggtg gtgggatgcc 20 <210> 926 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 926 tcaaccagac tattatgaag 20 <210> 927 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 927 cccttccagc agtgtcagcg 20 <210> 928 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 928 gccaggcact ataatgagga 20 <210> 929 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 929 tcattagggc accaaagcga 20 <210> 930 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 930 ttgagcatcc ccattggtgt 20 <210> 931 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 931 ttgcattgtt aaaaagaagc 20 <210> 932 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 932 aggctgcctt tactgtgtga 20 <210> 933 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 933 tgctgattga gcatccccat 20 <210> 934 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 934 ccagctgcac gctatgaaga 20 <210> 935 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 935 aaaacatttg cataatgatg 20 <210> 936 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 936 ggataggact ccatccaact 20 <210> 937 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 937 atctcaagac cattgcccag 20 <210> 938 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 938 gctcatactc ctcccggtta 20 <210> 939 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 939 aggcgagggg cctgatttac 20 <210> 940 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 940 gttacgggtc tggagtgtgt 20 <210> 941 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 941 tgttggggac aggctgctgg 20 <210> 942 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 942 tctggactct cttcaccatt 20 <210> 943 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 943 gagaatcact tgaacctggg 20 <210> 944 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 944 gcaggatgca ccctactaca 20 <210> 945 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 945 cattaggctc tggccgtacc 20 <210> 946 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 946 ccgtgagggc caccatctcg 20 <210> 947 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 947 agcgttcgta tctggaaggt 20 <210> 948 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 948 ataagctccg aggttgcccg 20 <210> 949 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 949 gctggcagtg actgatacag 20 <210> 950 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 950 acaaagatgg ccttgccaga 20 <210> 951 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 951 aagaagtaaa ctacctcaca 20 <210> 952 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 952 gctacgttct tcatggccgt 20 <210> 953 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 953 aagaattcga ccaagggatt 20 <210> 954 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 954 ttaatggcaa gacttgcaga 20 <210> 955 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 955 tgaaagtatc cagctgatga 20 <210> 956 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 956 ggcgagatgt gtgacagagg 20 <210> 957 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 957 agatgtagag ctttccaagg 20 <210> 958 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 958 tagatcttct tacatggaag 20 <210> 959 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 959 ctttctaggt tcgagatgtg 20 <210> 960 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 960 caacccaatc tttcctcgga 20 <210> 961 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 961 gtagaagcaa agagaggcga 20 <210> 962 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 962 ttcgatctcg acttcttgag 20 <210> 963 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 963 gcttgaggct ccttacaaga 20 <210> 964 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 964 ctgatgatgg acagtgaaac 20 <210> 965 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 965 cataataaca aacaaagcta 20 <210> 966 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 966 aggagatgta gagctttcca 20 <210> 967 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 967 ttggtcagat aatatgatta 20 <210> 968 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 968 gaggcaaccc aatctttcct 20 <210> 969 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 969 aggtgaattc atgggagtag 20 <210> 970 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 970 tacttactat gaagcattta 20 <210> 971 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 971 cagggcgaga tgtgtgacag 20 <210> 972 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 972 agcgaagtag aagcaaagag 20 <210> 973 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 973 agtgatgaac tggaaaggac 20 <210> 974 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 974 atgaagcatt tagggatctt 20 <210> 975 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 975 cttggcacct tgaagagcat 20 <210> 976 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 976 tttaattggg gaggaccatg 20 <210> 977 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 977 gtcattattc acagcagggt 20 <210> 978 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 978 cgtcctagag agtttacata 20 <210> 979 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 979 ctgcagggtg aagtttacaa 20 <210> 980 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 980 tgacatctgc cttgacgaag 20 <210> 981 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 981 aaaacaggta cacttggcac 20 <210> 982 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 982 acttctaggc ttactatctg 20 <210> 983 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 983 cgcaacagag atcagaaaag 20 <210> 984 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 984 aaggctctca gggagagccg 20 <210> 985 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 985 gttcatgtta cagaggaaag 20 <210> 986 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 986 gcaagcatgc tcgaggacag 20 <210> 987 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 987 tgcttgaagt tggacagcaa 20 <210> 988 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 988 cactaaacca tttcaggtaa 20 <210> 989 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 989 ctatttgaca aagatggtga 20 <210> 990 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 990 aagaagttga tgaaatgatc 20 <210> 991 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 991 cgccatgtga tgacaaacct 20 <210> 992 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 992 gtcctgtaac tctgcttctg 20 <210> 993 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 993 tcagcagttc aagaccagcc 20 <210> 994 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 994 tgatggaact ataacaacaa 20 <210> 995 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 995 ccatcattgt cagaaattca 20 <210> 996 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 996 gacgtacctt atcaaacaca 20 <210> 997 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 997 ctttgcacaa caaccctgca 20 <210> 998 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 998 aaggcggtgg agatgctcag 20 <210> 999 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 999 aggtgatgca aactcatcat 20 <210> 1000 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1000 cggattagcc tccgccaacg 20 <210> 1001 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1001 tgctcccaga gaccctgaag 20 <210> 1002 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1002 tgacgaggag aatctgaccc 20 <210> 1003 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1003 gctgaaagcg aagtccacgt 20 <210> 1004 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1004 aggcctcaag ttcaacctca 20 <210> 1005 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1005 agctgagtcc tgaaagtcag 20 <210> 1006 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1006 tctgctggac aggttcacgg 20 <210> 1007 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1007 ccccagagac aggaaggcca 20 <210> 1008 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1008 cctaccttca aacagaacca 20 <210> 1009 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1009 atggtggctt tgatgaactg 20 <210> 1010 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1010 attgtattcc tgcttccgga 20 <210> 1011 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1011 gatctactac ttcttccgag 20 <210> 1012 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1012 gttcactgtc agtctccaag 20 <210> 1013 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1013 tagacctcac acaggtccag 20 <210> 1014 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1014 ggaatacacc tcgtcccctg 20 <210> 1015 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1015 actcaagcct tcccaacccg 20 <210> 1016 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1016 aatacaatgg gaagatccct 20 <210> 1017 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1017 gtgtccagtc ccaacactgc 20 <210> 1018 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1018 agcggtggaa cacaggctac 20 <210> 1019 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1019 aatccagtag ggattgctgc 20 <210> 1020 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1020 ttaataacag cttggtcctc 20 <210> 1021 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1021 aagtgtgact ccccagcctc 20 <210> 1022 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1022 gggtttcctt cctgaggctg 20 <210> 1023 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1023 ggggaagaat aagacttcgg 20 <210> 1024 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1024 gggtttatgt gcaccaggta 20 <210> 1025 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1025 ttcccaggaa gtgagagttc 20 <210> 1026 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1026 cactcgcggg actcactttc 20 <210> 1027 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1027 atagaaacgc tcatctcccg 20 <210> 1028 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1028 ggatgctgtg atcatcctgg 20 <210> 1029 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1029 cctcaccagc caggataagg 20 <210> 1030 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1030 aatccagtag gaattgctgc 20 <210> 1031 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1031 tgacaagcat ggggaagccg 20 <210> 1032 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1032 tctcttcgcc tcctacctga 20 <210> 1033 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1033 acctgatgcc gactctgcag 20 <210> 1034 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1034 cagtcacggg ctttcagtgg 20 <210> 1035 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1035 cactcgcggg actcacttgc 20 <210> 1036 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1036 ccgtggaagg agccccaggg 20 <210> 1037 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1037 cataaattcc gaaatccagt 20 <210> 1038 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1038 cactcgcggg actcactttc 20 <210> 1039 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1039 gtggacggac tttataagat 20 <210> 1040 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1040 gatgaaggag ttgataactc 20 <210> 1041 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1041 cccatctaca tcgatctgcg 20 <210> 1042 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1042 gttgaggttc ttcagaagga 20 <210> 1043 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1043 gcacccaaag aactcagctt 20 <210> 1044 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1044 gaacagataa ctgtagccaa 20 <210> 1045 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1045 cactttcctt tctcaggtgc 20 <210> 1046 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1046 cagctacaac atggtcattc 20 <210> 1047 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1047 cccgggccaa gtacttcatt 20 <210> 1048 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1048 gaatgtagtc cactctgaac 20 <210> 1049 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1049 gaccgtacca tcctcaggag 20 <210> 1050 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1050 gtggtgtagc gagcgaactc 20 <210> 1051 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1051 tgaagcactg gatccacttg 20 <210> 1052 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1052 tgaggatcct gcatgttaat 20 <210> 1053 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1053 cattaaaccc attaacatgc 20 <210> 1054 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1054 gggcaccagg ttgctcatgg 20 <210> 1055 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1055 actgggcaca gtcaatcagc 20 <210> 1056 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1056 ggaatctgac cacgagcacg 20 <210> 1057 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1057 tgcctaagag gatggatcgg 20 <210> 1058 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1058 cgcccgtgcc cagcagcgcg 20 <210> 1059 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1059 gaaggacaag caggtctacc 20 <210> 1060 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1060 ggaccagcgc aacgaggaga 20 <210> 1061 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1061 cgaggagaag gcgcagcgtg 20 <210> 1062 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1062 ggagagccag aggagcgcgg 20 <210> 1063 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1063 actgttcccg aggcagccca 20 <210> 1064 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1064 gcaggagagc cagaggagcg 20 <210> 1065 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1065 gtcctctccc tcccagccat 20 <210> 1066 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1066 tccccagggt cccgccaaga 20 <210> 1067 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1067 agtgagcagt gcagcctgga 20 <210> 1068 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1068 tgtcctctcc ctcccagcca 20 <210> 1069 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1069 ctggactggg atgaaggtga 20 <210> 1070 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1070 ggggtgggcc cggctcacca 20 <210> 1071 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1071 caccaccccg cgggactaga 20 <210> 1072 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1072 ctgctgccac tgcccccgct 20 <210> 1073 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1073 cggcccgacg tgcccatcac 20 <210> 1074 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1074 cactgccccc gctaggtgcg 20 <210> 1075 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1075 atacacgctg gcctgctcct 20 <210> 1076 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1076 caaacactgt gatgtctgtg 20 <210> 1077 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1077 gcgggaccct ggggatgcct 20 <210> 1078 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1078 gcgggagcgc cagacctcac 20 <210> 1079 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1079 aggacaggct tctctccaca 20 <210> 1080 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1080 gcagacacca acacggtgct 20 <210> 1081 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1081 ccaccacccc gcgggactag 20 <210> 1082 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1082 atccccaggg tcccgccaag 20 <210> 1083 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1083 cctggaggaa ggagcagcct 20 <210> 1084 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1084 agagccagat gtcggaactt 20 <210> 1085 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1085 atgacccact gggccggcac 20 <210> 1086 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1086 gcagctttgg gcccacagac 20 <210> 1087 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1087 actctctgtt agcagagagc 20 <210> 1088 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1088 ccaggaagga aatgcaccta 20 <210> 1089 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1089 aggcaccact cacctgtgat 20 <210> 1090 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1090 ctgggcccgt gccggcccag 20 <210> 1091 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1091 cagccagctg ctgggggtcc 20 <210> 1092 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1092 tccactcctg ccgctcgcct 20 <210> 1093 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1093 cgtccaggca gacaccaaca 20 <210> 1094 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1094 cccacccaca tcagtccttc 20 <210> 1095 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1095 gccagctctt gacccggcct 20 <210> 1096 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1096 ctgccctcct tttcctcttc 20 <210> 1097 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1097 ccagccccac catgagtctg 20 <210> 1098 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1098 gccgattctt ccacccagag 20 <210> 1099 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1099 ctcccagaag aggaaaagga 20 <210> 1100 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1100 gtggggcagg gcaggcagcc 20 <210> 1101 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1101 gggtcaagag ctggccgctg 20 <210> 1102 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1102 atgccccctg atgacccact 20 <210> 1103 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1103 agccttctct gcctttggcc 20 <210> 1104 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1104 ctctgccttt ggccgggcca 20 <210> 1105 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1105 ggaacccagc ctgccctccc 20 <210> 1106 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1106 ggcaggagcc tcgcacctag 20 <210> 1107 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1107 tcccagacca gcacatcctg 20 <210> 1108 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1108 gtgagcagtg cagcctggat 20 <210> 1109 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1109 gagccagatg tcggaacttt 20 <210> 1110 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1110 ggccgatggc aagccttgct 20 <210> 1111 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1111 aggagcctcg cacctagcgg 20 <210> 1112 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1112 aggtccccaa gaggaaaaca 20 <210> 1113 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1113 cgctgaggag gcctcggccc 20 <210> 1114 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1114 gaggacagcc acagccgtca 20 <210> 1115 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1115 cagccccacc atgagtctgt 20 <210> 1116 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1116 accccccaga gccccaagca 20 <210> 1117 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1117 gaggcaccac tcacctgtga 20 <210> 1118 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1118 ccaagaggaa aacagggcac 20 <210> 1119 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1119 gtacgtctcc caggattgcc 20 <210> 1120 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1120 cacagcctcc accaggtgcg 20 <210> 1121 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1121 gatctcggca gccagctgct 20 <210> 1122 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1122 cagccttctc tgcctttggc 20 <210> 1123 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1123 cagaagtgac acttacctca 20 <210> 1124 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1124 gctggccgct gaggaggcct 20 <210> 1125 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1125 cagctccctc tagtcccgcg 20 <210> 1126 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1126 cggggtgggc ccggctcacc 20 <210> 1127 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1127 gacacatacc gtgacctcca 20 <210> 1128 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1128 caggaaggaa atgcacctat 20 <210> 1129 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1129 agtggccagc acccatggcc 20 <210> 1130 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1130 ctctcctatt cttcccagca 20 <210> 1131 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1131 gcccgagtcc aggcaatcct 20 <210> 1132 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1132 caccttcatc tgcagttcca 20 <210> 1133 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1133 ggcacaggca gacaggtgag 20 <210> 1134 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1134 agcacccatg gcccggccaa 20 <210> 1135 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1135 ccacaggcag cttactcact 20 <210> 1136 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1136 ttcctgtgct ccaaagtgag 20 <210> 1137 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1137 accgcagcct tctctgcctt 20 <210> 1138 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1138 gggagccaat gcccgagtcc 20 <210> 1139 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1139 ttcccagcaa ggcttgccat 20 <210> 1140 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1140 agccagatgt cggaactttg 20 <210> 1141 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1141 tacacgggct acagtcccta 20 <210> 1142 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1142 tctgtgttag accctcttgg 20 <210> 1143 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1143 aagctgcccc cagcgctctg 20 <210> 1144 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1144 ctttgggggg ttcgaggagg 20 <210> 1145 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1145 gggccgatgg caagccttgc 20 <210> 1146 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1146 cacaggcagc ttactcactg 20 <210> 1147 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1147 cccagaccag cacatcctgc 20 <210> 1148 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1148 aggctgggtt ccataccata 20 <210> 1149 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1149 ggacttctaa ttgctgagaa 20 <210> 1150 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1150 ctcaaattcc cacagactca 20 <210> 1151 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1151 aaaacagggc acaggcagac 20 <210> 1152 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1152 ccagatgtcg gaactttggg 20 <210> 1153 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1153 ctccctctag tcccgcgggg 20 <210> 1154 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1154 agcccccagt gcagagccca 20 <210> 1155 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1155 cctggacgcc cagcttctgc 20 <210> 1156 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1156 caggggctgg caggagcccg 20 <210> 1157 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1157 ccttgttccc atggctggga 20 <210> 1158 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1158 ctcatctgcc acagagcgct 20 <210> 1159 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1159 ggcagacacc aacacggtgc 20 <210> 1160 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1160 tccctcttga ttcctcttcc 20 <210> 1161 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1161 ccctcccagc catgggaaca 20 <210> 1162 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1162 gcgtaagaag ccactcactt 20 <210> 1163 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1163 tgtgtttccc ccgcacctgg 20 <210> 1164 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1164 ctgagaccag tggtcatcga 20 <210> 1165 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1165 gggcagcgac ctgagaccag 20 <210> 1166 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1166 agcaattaga agtccctgca 20 <210> 1167 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1167 tgggtgagct ggtgaaacac 20 <210> 1168 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1168 ctgttagcag agagctggac 20 <210> 1169 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1169 cccctgatga cccactgggc 20 <210> 1170 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1170 gttcacacca tcacgacgcg 20 <210> 1171 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1171 tgtccaggct gggcccgtgc 20 <210> 1172 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1172 acacagacct atgccccatc 20 <210> 1173 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1173 ggctgcctgc cctgccccac 20 <210> 1174 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1174 ccataggtgc atttccttcc 20 <210> 1175 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1175 caggctgggt tccataccat 20 <210> 1176 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1176 gccccatcac agcctccacc 20 <210> 1177 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1177 tgccctcctt ttcctcttct 20 <210> 1178 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1178 gccagatgtc ggaactttgg 20 <210> 1179 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1179 caggcagaca ggtgagagga 20 <210> 1180 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1180 ccaggagtct gagctatgag 20 <210> 1181 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1181 gctccaggtt gggagcctta 20 <210> 1182 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1182 ctcacctgtg atgggcacgt 20 <210> 1183 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1183 agctggccta cgagtctgac 20 <210> 1184 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1184 gtgggtgggg gcagtgggta 20 <210> 1185 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1185 catctgcagt tccagggccg 20 <210> 1186 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1186 gatgacccac tgggccggca 20 <210> 1187 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1187 tgacctccaa ggcgagcggc 20 <210> 1188 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1188 ggatctcggc agccagctgc 20 <210> 1189 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1189 tccttttcct cttctgggag 20 <210> 1190 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1190 cacgacgcgt gggtggcaag 20 <210> 1191 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1191 ttcacaccat cacgacgcgt 20 <210> 1192 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1192 gcaggagcct cgcacctagc 20 <210> 1193 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1193 cacccctaag gctcccaacc 20 <210> 1194 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1194 ttgtccttgc ttggggctct 20 <210> 1195 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1195 caggacaggc ttctctccac 20 <210> 1196 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1196 cacctggtgg aggctgtgat 20 <210> 1197 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1197 cgtctgtggg agccagtctg 20 <210> 1198 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1198 ccccccaaag ttccgacatc 20 <210> 1199 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1199 aggcagcctg gccaaggagc 20 <210> 1200 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1200 tctgcctttg gccgggccat 20 <210> 1201 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1201 ggacaggctt ctctccacag 20 <210> 1202 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1202 acgtgcccat cacaggtgag 20 <210> 1203 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1203 agagagtgag cagtgcagcc 20 <210> 1204 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1204 cgcaggaagt tgtccaggct 20 <210> 1205 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1205 ggctgggagc tcagatccat 20 <210> 1206 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1206 cagctcaccc agcaccgtgt 20 <210> 1207 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1207 ccagcacatc ctgcgggaac 20 <210> 1208 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1208 gacctccttg ttcccatggc 20 <210> 1209 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1209 ggggttcgag gaggaggccc 20 <210> 1210 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1210 cagagaaggc tgcggtggct 20 <210> 1211 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1211 gggagtgagt ccagcgtctg 20 <210> 1212 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1212 caggagcctc gcacctagcg 20 <210> 1213 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1213 ggaggaggcc ctggtgagcc 20 <210> 1214 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1214 caagcaagga caaaaatggc 20 <210> 1215 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1215 cgtcagggca ccccaaggcc 20 <210> 1216 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1216 gctggcagtg aactggtttc 20 <210> 1217 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1217 acctccttgt tcccatggct 20 <210> 1218 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1218 tcccgcagga tgtgctggtc 20 <210> 1219 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1219 agggactgta gcccgtgtaa 20 <210> 1220 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1220 ccagtactct cgaggtggaa 20 <210> 1221 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1221 aattcccaca gactcatggt 20 <210> 1222 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1222 cccaccccga gccccttaca 20 <210> 1223 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1223 gtgcatttcc ttcctggaag 20 <210> 1224 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1224 tcagcggcca gctcttgacc 20 <210> 1225 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1225 ggcccggcca aaggcagaga 20 <210> 1226 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1226 acagagcgct gggggcagct 20 <210> 1227 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1227 tcttgattcc tcttccagga 20 <210> 1228 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1228 gcaaggacaa aaatggccgg 20 <210> 1229 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1229 cagggcaggc agcctggcca 20 <210> 1230 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1230 atctcggcag ccagctgctg 20 <210> 1231 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1231 cccgcaggat gtgctggtct 20 <210> 1232 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1232 ggctccaggt tgggagcctt 20 <210> 1233 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1233 caacacggtg ctgggtgagc 20 <210> 1234 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1234 gcagccgtgt ccctatggta 20 <210> 1235 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1235 tgtccttgct tggggctctg 20 <210> 1236 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1236 tcatggtggg gctggcttcc 20 <210> 1237 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1237 gaagctgggc tattcatcca 20 <210> 1238 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1238 gaccctcttg gcgggaccct 20 <210> 1239 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1239 ggaaaggcag ggggcgcggg 20 <210> 1240 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1240 aggtctgtgt tagaccctct 20 <210> 1241 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1241 ctcagctccc tctagtcccg 20 <210> 1242 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1242 tagggactgt agcccgtgta 20 <210> 1243 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1243 agggggcata aacctgcaga 20 <210> 1244 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1244 ctcccaggat tgcctggact 20 <210> 1245 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1245 gggatgaagg tgaaggccgc 20 <210> 1246 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1246 tgcagagccc aggggctggc 20 <210> 1247 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1247 gaatcggcac ttgatcccat 20 <210> 1248 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1248 ccgaggctgc tccttcctcc 20 <210> 1249 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1249 ccagcttctg caggacgctg 20 <210> 1250 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1250 gggccggcac gggcccagcc 20 <210> 1251 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1251 tgaggtctgg cgctcccgct 20 <210> 1252 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1252 ttggggtgcc ctgacggctg 20 <210> 1253 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1253 actagaggga gctgagggca 20 <210> 1254 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1254 ccagttcccg caggatgtgc 20 <210> 1255 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1255 tatgccccct gatgacccac 20 <210> 1256 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1256 gtgagaggag agcattggca 20 <210> 1257 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1257 agcttactca ctggggtgct 20 <210> 1258 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1258 atcacagcct ccaccaggtg 20 <210> 1259 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1259 actgaagtgg ccagcaccca 20 <210> 1260 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1260 gccggcccag tgggtcatca 20 <210> 1261 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1261 cctgcagaag ctgggcgtcc 20 <210> 1262 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1262 gcaccgtgtt ggtgtctgcc 20 <210> 1263 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1263 ggccctggaa ctgcagatga 20 <210> 1264 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1264 gtccttgctt ggggctctgg 20 <210> 1265 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1265 ctccctggag agccagatgt 20 <210> 1266 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1266 aaattcccac agactcatgg 20 <210> 1267 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1267 tcatctgcca cagagcgctg 20 <210> 1268 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1268 agtcggcagg gacactgaag 20 <210> 1269 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1269 actctcgagg tggaaaggca 20 <210> 1270 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1270 cccagtgagt aagctgcctg 20 <210> 1271 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1271 agagggtgca aagaactctc 20 <210> 1272 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1272 cacgatcccg tcagactcgt 20 <210> 1273 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1273 tctgcactgg gggctcctga 20 <210> 1274 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1274 cagggggcat aaacctgcag 20 <210> 1275 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1275 tgaggacagc cacagccgtc 20 <210> 1276 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1276 gtttcccccg cacctggtgg 20 <210> 1277 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1277 ttaggggtgc caccaccccg 20 <210> 1278 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1278 actggggtgc tgggacttgt 20 <210> 1279 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1279 ctcactcccg tacgtctccc 20 <210> 1280 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1280 aggggctggc aggagcccgt 20 <210> 1281 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1281 tccttgttcc catggctggg 20 <210> 1282 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1282 gccaaaggca gagaaggctg 20 <210> 1283 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1283 cacgggctcc tgccagcccc 20 <210> 1284 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1284 ccacagcgtc ctgcagaagc 20 <210> 1285 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1285 acgggctcct gccagcccct 20 <210> 1286 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1286 atgggagcaa cgtggccatg 20 <210> 1287 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1287 cccaaggccg ggtcaagagc 20 <210> 1288 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1288 aattgctgag aaggggccga 20 <210> 1289 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1289 gggcaggagt gaggagggcc 20 <210> 1290 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1290 ggcgggaccc tggggatgcc 20 <210> 1291 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1291 ggggctggca ggagcccgtg 20 <210> 1292 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1292 ttccgacatc tggctctcca 20 <210> 1293 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1293 gtgctgccct tgccagccac 20 <210> 1294 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1294 actcctgccg ctcgccttgg 20 <210> 1295 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1295 gtggacttct tccggaagct 20 <210> 1296 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1296 ccagtgcaga gcccaggggc 20 <210> 1297 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1297 ggggcagtgg cagcagcttt 20 <210> 1298 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1298 gggactgtag cccgtgtaag 20 <210> 1299 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1299 ccacagactc atggtggggc 20 <210> 1300 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1300 aacacgggac agccaccgag 20 <210> 1301 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1301 gcaaagaact ctctggaggt 20 <210> 1302 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1302 tgggcccgtg ccggcccagt 20 <210> 1303 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1303 ctcctgccgg ggcatcctgc 20 <210> 1304 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1304 aggcagacag gtgagaggaa 20 <210> 1305 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1305 aggcaatcct gggagacgta 20 <210> 1306 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1306 tcagaccagt actctcgagg 20 <210> 1307 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1307 aacatacttg tcattgacga 20 <210> 1308 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1308 ggcagcttgg ccgctctggg 20 <210> 1309 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1309 gagttctttg caccctctgc 20 <210> 1310 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1310 gccacaggca gcttactcac 20 <210> 1311 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1311 aggctgcctg ccctgcccca 20 <210> 1312 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1312 ccggcccagt gggtcatcag 20 <210> 1313 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1313 ctctcgaggt ggaaaggcag 20 <210> 1314 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1314 gattgcctgg actcgggcat 20 <210> 1315 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1315 tccttgcttg gggctctggg 20 <210> 1316 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1316 gcagagaagg ctgcggtggc 20 <210> 1317 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1317 accgtgacct ccaaggcgag 20 <210> 1318 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1318 caggacgctg tggatctccg 20 <210> 1319 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1319 aggaagcagc cgtgtcccta 20 <210> 1320 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1320 acgcaggaag ttgtccaggc 20 <210> 1321 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1321 gaggtcccca agaggaaaac 20 <210> 1322 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1322 cccccagctt cttcccatcc 20 <210> 1323 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1323 attcccacag actcatggtg 20 <210> 1324 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1324 tccaaggcga gcggcaggag 20 <210> 1325 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1325 gctgggagct cagatccata 20 <210> 1326 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1326 tgggggccca ggcatcccca 20 <210> 1327 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1327 gggtgcaaag aactctctgg 20 <210> 1328 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1328 gcgggactag agggagctga 20 <210> 1329 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1329 actggagaag aagaagatcc 20 <210> 1330 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1330 ccagctcttg acccggcctt 20 <210> 1331 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1331 gaactttggg gggttcgagg 20 <210> 1332 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1332 gaaaccagtt cactgccagc 20 <210> 1333 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1333 acagccgtca gggcacccca 20 <210> 1334 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1334 ccaccccgag ccccttacac 20 <210> 1335 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1335 tctcggcagc cagctgctgg 20 <210> 1336 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1336 agagagctgg actgggatga 20 <210> 1337 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1337 cctttccacc tcgagagtac 20 <210> 1338 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1338 aagctggcct acgagtctga 20 <210> 1339 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1339 gtctgtggga gccagtctgt 20 <210> 1340 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1340 agacctatgc cccatcaggc 20 <210> 1341 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1341 tgggaagaag ctgggggccc 20 <210> 1342 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1342 ctgtggagag aagcctgtcc 20 <210> 1343 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1343 gggacttcta attgctgaga 20 <210> 1344 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1344 ggactcgggc attggctccc 20 <210> 1345 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1345 catctgccac agagcgctgg 20 <210> 1346 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1346 cttctgggag tggaggctcc 20 <210> 1347 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1347 gcccccagtg cagagcccag 20 <210> 1348 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1348 tttgtccttg cttggggctc 20 <210> 1349 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1349 gtggggctgg cttccaggac 20 <210> 1350 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1350 tcaagagctg gccgctgagg 20 <210> 1351 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1351 cctctagtcc cgcggggtgg 20 <210> 1352 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1352 gctcatctgc cacagagcgc 20 <210> 1353 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1353 catgagtctg tgggaatttg 20 <210> 1354 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1354 tgcgaggctc ctgcctgatg 20 <210> 1355 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1355 ggagtgagtc cagcgtctgt 20 <210> 1356 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1356 tgcaaagaac tctctggagg 20 <210> 1357 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1357 cacagcgtcc tgcagaagct 20 <210> 1358 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1358 cagcttactc actggggtgc 20 <210> 1359 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1359 actgatgtgg gtgggggcag 20 <210> 1360 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1360 gcaggatgtg ctggtctggg 20 <210> 1361 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1361 tcacagtgtt tgtgccatcc 20 <210> 1362 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1362 gtttgtgcca tcctggagga 20 <210> 1363 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1363 tcctgaagga ctgatgtggg 20 <210> 1364 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1364 tgttagcaga gagctggact 20 <210> 1365 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1365 cagtgtttgt gccatcctgg 20 <210> 1366 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1366 agtctgtcag ggcctctggg 20 <210> 1367 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1367 tctcgaggtg gaaaggcagg 20 <210> 1368 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1368 agactggctc ccacagacgc 20 <210> 1369 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1369 agccactcac tttggagcac 20 <210> 1370 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1370 tcccaggatt gcctggactc 20 <210> 1371 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1371 cctggaactg cagatgaagg 20 <210> 1372 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1372 ggggcgcttc ccacagctcc 20 <210> 1373 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1373 cagcccctgg gctctgcact 20 <210> 1374 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1374 gcgcgggtgg gtagtcggca 20 <210> 1375 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1375 gccccaagca aggacaaaaa 20 <210> 1376 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1376 agcctggatg ggaagaagct 20 <210> 1377 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1377 cagctcttga cccggccttg 20 <210> 1378 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1378 taggggtgcc accaccccgc 20 <210> 1379 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1379 tccactccca gaagaggaaa 20 <210> 1380 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1380 ggaagcgctt catcgaggag 20 <210> 1381 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1381 gcatcctgct ggcagtgaac 20 <210> 1382 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1382 tggatgaata gcccagcttc 20 <210> 1383 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1383 acacgggaca gccaccgagc 20 <210> 1384 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1384 gggctcctga aggactgatg 20 <210> 1385 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1385 cagcctggat gggaagaagc 20 <210> 1386 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1386 ttttcctctt ctgggagtgg 20 <210> 1387 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1387 ctccaggttg ggagccttag 20 <210> 1388 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1388 gggagctgag ggcaggggtc 20 <210> 1389 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1389 agatgaaggt ggacttcttc 20 <210> 1390 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1390 tttggccggg ccatgggtgc 20 <210> 1391 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1391 ctcgcaccta gcgggggcag 20 <210> 1392 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1392 cccgtgtaag gggctcgggg 20 <210> 1393 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1393 tgccggccca gtgggtcatc 20 <210> 1394 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1394 aaaggcagag aaggctgcgg 20 <210> 1395 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1395 aggagcccgt ggggcagggc 20 <210> 1396 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1396 taaggggctc ggggtgggcc 20 <210> 1397 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1397 acaccatcac gacgcgtggg 20 <210> 1398 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1398 ctggcaggag cccgtggggc 20 <210> 1399 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1399 ccggccttgg ggtgccctga 20 <210> 1400 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1400 ctgtgttaga ccctcttggc 20 <210> 1401 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1401 gtgatgggca cgtcgggccg 20 <210> 1402 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1402 gcccctgggc tctgcactgg 20 <210> 1403 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1403 ctgggtgagc tggtgaaaca 20 <210> 1404 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1404 ggctgctcct tcctccagga 20 <210> 1405 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1405 acagcctcca ccaggtgcgg 20 <210> 1406 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1406 tgcccgagtc caggcaatcc 20 <210> 1407 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1407 aggtggaaag gcagggggcg 20 <210> 1408 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1408 cgacagattc attgtgaagc 20 <210> 1409 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1409 gcggggtggt ggcaccccta 20 <210> 1410 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1410 ggcaatcctg ggagacgtac 20 <210> 1411 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1411 gccgctcgcc ttggaggtca 20 <210> 1412 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1412 tcactgccag caggatgccc 20 <210> 1413 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1413 cctgaaggac tgatgtgggt 20 <210> 1414 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1414 gtgcgaggct cctgcctgat 20 <210> 1415 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1415 gcacctggtg gaggctgtga 20 <210> 1416 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1416 tcacagcctc caccaggtgc 20 <210> 1417 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1417 gccgctctgg gtggaagaat 20 <210> 1418 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1418 gactagaggg agctgagggc 20 <210> 1419 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1419 tcagctccct ctagtcccgc 20 <210> 1420 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1420 ggagcctcca ctcccagaag 20 <210> 1421 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1421 agaccctctt ggcgggaccc 20 <210> 1422 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1422 ccaccttcat ctgcagttcc 20 <210> 1423 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1423 gggagtggag gctccaggtt 20 <210> 1424 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1424 cagtgaactg gtttctggag 20 <210> 1425 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1425 tcacctgtga tgggcacgtc 20 <210> 1426 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1426 tgccagcagg atgccccggc 20 <210> 1427 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1427 accctcttgg cgggaccctg 20 <210> 1428 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1428 tgggggcagc ttggccgctc 20 <210> 1429 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1429 aggaggaggc cctggtgagc 20 <210> 1430 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1430 ctggaggtgg gagccatgca 20 <210> 1431 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1431 tctggaggtg ggagccatgc 20 <210> 1432 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1432 cctggatggg aagaagctgg 20 <210> 1433 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1433 ccagcccctg ggctctgcac 20 <210> 1434 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1434 ggagtggaag cgcttcatcg 20 <210> 1435 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1435 tgtagcccgt gtaaggggct 20 <210> 1436 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1436 ggagtgagga gggccgggga 20 <210> 1437 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1437 gaggtcacgg tatgtgtcgt 20 <210> 1438 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1438 ctagagggag ctgagggcag 20 <210> 1439 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1439 tggtgtgttt cccccgcacc 20 <210> 1440 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1440 ctgatgtggg tgggggcagt 20 <210> 1441 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1441 agggccgggg agggcaggct 20 <210> 1442 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1442 tgagctatga gtggcccctg 20 <210> 1443 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1443 tcttacgcag gaagttgtcc 20 <210> 1444 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1444 gttccgacat ctggctctcc 20 <210> 1445 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1445 agggggcgcg ggtgggtagt 20 <210> 1446 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1446 cgctggcctg ctccttggcc 20 <210> 1447 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1447 gaaaggcagg gggcgcgggt 20 <210> 1448 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1448 tagcccgtgt aaggggctcg 20 <210> 1449 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1449 ctgagggcag gggtccggtg 20 <210> 1450 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1450 acacagctta gtatacacgc 20 <210> 1451 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1451 ccgtcagggc accccaaggc 20 <210> 1452 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1452 ggcaggggtc cggtgaggtc 20 <210> 1453 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1453 ggacttgtag gagaggatct 20 <210> 1454 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1454 tcccagccat gggaacaagg 20 <210> 1455 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1455 gacttctaat tgctgagaag 20 <210> 1456 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1456 ggctcctgaa ggactgatgt 20 <210> 1457 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1457 tggcaggagc ccgtggggca 20 <210> 1458 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1458 agacaggtga gaggaagggc 20 <210> 1459 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1459 tcggaacttt ggggggttcg 20 <210> 1460 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1460 gcctggatgg gaagaagctg 20 <210> 1461 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1461 tgaaggactg atgtgggtgg 20 <210> 1462 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1462 ctgggggccc aggcatcccc 20 <210> 1463 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1463 gagcccccag tgcagagccc 20 <210> 1464 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1464 ggcgcgggtg ggtagtcggc 20 <210> 1465 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1465 ccgtgtaagg ggctcggggt 20 <210> 1466 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1466 gtcgtgatgg tgtgaacacc 20 <210> 1467 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1467 acgacgcgtg ggtggcaagc 20 <210> 1468 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1468 gggggcagtg gcagcagctt 20 <210> 1469 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1469 agcgtgtata ctaagctgtg 20 <210> 1470 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1470 gctcctgcct gatggggcat 20 <210> 1471 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1471 gtctgtcagg gcctctggga 20 <210> 1472 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1472 gtagcccgtg taaggggctc 20 <210> 1473 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1473 agcccctggg ctctgcactg 20 <210> 1474 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1474 gtgaactggt ttctggagcg 20 <210> 1475 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1475 ctacgagtct gacgggatcg 20 <210> 1476 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1476 agtgaactgg tttctggagc 20 <210> 1477 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1477 acgcgtgggt ggcaagcggg 20 <210> 1478 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1478 cgcgggacta gagggagctg 20 <210> 1479 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1479 ggcaggagtg aggagggccg 20 <210> 1480 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1480 aagtgagtgg cttcttacgc 20 <210> 1481 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1481 ctgaaggact gatgtgggtg 20 <210> 1482 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1482 ttgccaccca cgcgtcgtga 20 <210> 1483 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1483 agggcaggag tgaggagggc 20 <210> 1484 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1484 tcttcttctc cagttcccgc 20 <210> 1485 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1485 aggagtgagg agggccgggg 20 <210> 1486 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1486 actcccagaa gaggaaaagg 20 <210> 1487 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1487 tgaggagggc cggggagggc 20 <210> 1488 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1488 acctggtgga ggctgtgatg 20 <210> 1489 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1489 cagggccgag gcctcctcag 20 <210> 1490 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1490 tactctcgag gtggaaaggc 20 <210> 1491 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1491 ttggggctct ggggggtgag 20 <210> 1492 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1492 gctcctggac ccccagcagc 20 <210> 1493 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1493 ggggggtgag aggagagcat 20 <210> 1494 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1494 cggcccagtg ggtcatcagg 20 <210> 1495 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1495 aggaagggca ggagtgagga 20 <210> 1496 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1496 gagggccggg gagggcaggc 20 <210> 1497 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1497 tgctgggggt ccaggagctg 20 <210> 1498 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1498 gctgggggtc caggagctgt 20 <210> 1499 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1499 tgagaggaag ggcaggagtg 20 <210> 1500 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1500 tgggagtgga ggctccaggt 20 <210> 1501 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1501 gaggaagggc aggagtgagg 20 <210> 1502 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1502 gctggctgtg aactggtttc 20 <210> 1503 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1503 ctagttcccg aaggatgtgc 20 <210> 1504 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1504 attggagacc accactccgt 20 <210> 1505 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1505 ttccctcctc tgccagccat 20 <210> 1506 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1506 cgaaggaagt tgtccaggct 20 <210> 1507 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1507 atacctgtga taggcacatc 20 <210> 1508 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1508 gacttccttg ttcccatggc 20 <210> 1509 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1509 ggccttcgaa tccgacggag 20 <210> 1510 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1510 atcaccagag gtaactgcca 20 <210> 1511 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1511 ggctttgaag atggtgaaga 20 <210> 1512 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1512 atgggctaag acatcaccag 20 <210> 1513 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1513 ctatgatcta ctgcaacgac 20 <210> 1514 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1514 ttctcatgct gaaaacttgc 20 <210> 1515 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1515 ttgccggcac gccaacatcg 20 <210> 1516 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1516 gagaatctcc ttctgaaggg 20 <210> 1517 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1517 ggctcgcgac aaggtgtcta 20 <210> 1518 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1518 ctgtggagct ggttctctcc 20 <210> 1519 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1519 tctaaccttg gtagatgtcc 20 <210> 1520 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1520 cgactgggtg gtggaactta 20 <210> 1521 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1521 cttcttctct gaatgcaggt 20 <210> 1522 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1522 gccaacatcg tggcttacca 20 <210> 1523 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1523 cgacaaggtg tctaaggacc 20 <210> 1524 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1524 atcaccagag gtaactgcca 20 <210> 1525 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1525 atgggctaag acatcaccag 20 <210> 1526 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1526 atggggaagt ctttaaggtg 20 <210> 1527 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1527 gggtgcacat caaagagcgg 20 <210> 1528 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1528 tacacccacg tagtccggct 20 <210> 1529 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1529 cctttgcaag gctcgagaca 20 <210> 1530 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1530 gttgcttcct gaagggtgac 20 <210> 1531 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1531 ctgggcgcca ctcaccagta 20 <210> 1532 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1532 agggtgacag gtatgagcct 20 <210> 1533 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1533 tatgacctgc tacagcggct 20 <210> 1534 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1534 gatctgcatg gaattctgtg 20 <210> 1535 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1535 gctgggatac cagttgatgc 20 <210> 1536 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1536 ctttcctagc cggactacgt 20 <210> 1537 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1537 agagggtgca catcaaagag 20 <210> 1538 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1538 cccatggtag gccacgatgt 20 <210> 1539 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1539 tggacggctg ctgttgctgg 20 <210> 1540 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1540 ccttgcagcc ctcgcaggtg 20 <210> 1541 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1541 aaatgcaaaa tatgtttgcc 20 <210> 1542 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1542 gaagtgtctc agtgtcggga 20 <210> 1543 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1543 atggaagagg gtcgcgagca 20 <210> 1544 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1544 ggcagcgttg tcgccgcaca 20 <210> 1545 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1545 ttccgagcca taagtctgcg 20 <210> 1546 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1546 gaaggcacat gtgccgtgtg 20 <210> 1547 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1547 tgcgtggcgt aagtggaccc 20 <210> 1548 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1548 tggacggctg ctgttgctgg 20 <210> 1549 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1549 ccttgcagcc ctcgcaggtg 20 <210> 1550 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1550 catggtcagc ttggtgtagt 20 <210> 1551 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1551 gctatactgg gcttgcacgc 20 <210> 1552 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1552 ccccgtgcta ccgaggtcca 20 <210> 1553 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1553 ttcagaagtg tctcagtgtc 20 <210> 1554 <211> 20 <212> DNA <213> Murine <400> 1554 ttcggcgtct cttgtccact 20 <210> 1555 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1555 tcaatcagat ttggaaatgt 20 <210> 1556 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1556 ctacggcgtg cgaacctgcg 20 <210> 1557 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1557 atacagctcg gaatacacca 20 <210> 1558 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1558 ctgattgagt catgcatgta 20 <210> 1559 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1559 tggtgatggt gatggtagct 20 <210> 1560 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1560 gaaatcgaca gtactgacat 20 <210> 1561 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1561 cctgcgtgta ccaaatgcag 20 <210> 1562 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1562 gggcacgtgt gccgtgtgcg 20 <210> 1563 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1563 ataacgcccc cgcctgcggg 20 <210> 1564 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1564 ggactgcttg aagtacatgg 20 <210> 1565 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1565 ccacctcggc tacgacccga 20 <210> 1566 <211> 20 <212> DNA <213> Human <400> 1566 aaatgcaaaa tatgtttgcc 20 <210> 1567 <211> 25 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zc3h12a siRNA <400> 1567 ccuggacaac uuccuucgua agaaa 25 <210> 1568 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zc3h12a siRNA <400> 1568 gugucccuau ggaaggaaa 19 <210> 1569 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zc3h12a siRNA <400> 1569 caacuuccuu cguaagaaa 19 <210> 1570 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zc3h12a shRNA <400> 1570 agcgaggcca cacagatatt a 21 <210> 1571 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zc3h12a shRNA <400> 1571 gctatgatga ccgcttcatt g 21 <210> 1572 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zc3h12a shRNA <400> 1572 tggtctgagc cgtacccatt a 21 <210> 1573 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Zc3h12a shRNA <400> 1573 ctgtgtacag aggcgagatt t 21 <210> 1574 <211> 20 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1574 agatgatgtc aaccaaggag 20 <210> 1575 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 1575 ggaagaagta catctgcaag 20

Claims (283)

  1. 변형된 면역 효과기 세포로서, (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 1종 이상의 내인성
    표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하되,
    상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 내인성 표적 유전자 중 2종 이상의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  3. 변형된 면역 효과기 세포로서, IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는 유전자-조절 시스템을 포함하되, 상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  4. 제3항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 내인성 표적 유전자 중 2종 이상의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  5. 제4항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택된 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 더 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  7. 제6항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종 내인성 표적 유전자 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  8. 제6항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A, 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  10. 제8항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A 및 BCOR의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  11. 제8항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 ZC3H12A 및 TNFAIP3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  12. 제6항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 MAP4K1, 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 MAP4K1 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  14. 제12항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 MAP4K1 및 BCOR의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  15. 제12항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 MAP4K1 및 TNFAPI3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  16. 제6항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 NR4A3, 및 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1종의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 NR4A3 및 CBLB의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  18. 제16항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 NR4A3 및 BCOR의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  19. 제16항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 NR4A3 및 TNFAPI3의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 (i) 1종 이상의 핵산 분자; (ii) 1종 이상의 효소 단백질; 또는 (iii) 1종 이상의 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  21. 제20항에 있어서, 상기 1종 이상의 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  22. 제20항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  23. 제22항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  24. 제23항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  25. 제22항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  26. 제25항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  27. 제22항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 ZC3H12A이되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  28. 제27항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  29. 제22항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 MAP4K1이되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  30. 제29항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  31. 제22항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 NR4A3이되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  32. 제31항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  33. 제20항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자를 포함하고, 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  34. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  35. 제34항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  37. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  38. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  39. 제38항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  40. 제39항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  41. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  42. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  43. 제42항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  44. 제42항 또는 제43항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  45. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  46. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  47. 제46항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  49. 제33항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  50. 제20항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 효소 단백질을 포함하되, 상기 효소 단백질은 상기 내인성 유전자 중 하나 이상 내의 표적 서열에 특이적으로 결합하도록 조작되어 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  51. 제50항에 있어서, 상기 단백질은 전사 활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(Transcription activator-like effector nuclease: TALEN), 아연-핑거 뉴클레아제, 또는 메가뉴클레아제인, 변형된 면역 효과기 세포.
  52. 제20항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하되, 상기 핵산 분자는 가이드 RNA(gRNA) 분자이며, 상기 효소 단백질은 Cas 단백질 또는 Cas 오쏘로그인, 변형된 면역 효과기 세포.
  53. 제52항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 gRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  54. 제53항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  55. 제53항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  56. 제52항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 gRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  57. 제56항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  58. 제56항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  59. 제52항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택되되, 상기 gRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  60. 제59항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  61. 제52항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 MAP4K1이되, 상기 gRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  62. 제61항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  63. 제61항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  64. 제52항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 NR4A3이고, gRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  65. 제64항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  66. 제64항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  67. 제52항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 복수의 gRNA 분자를 포함하고, 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있는, 변형된 면역 효과기 세포.
  68. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  69. 제68항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  70. 제69항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  71. 제69항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  72. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  73. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  74. 제73항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  75. 제74항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  76. 제74항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  77. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  78. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  79. 제78항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  80. 제79항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  81. 제79항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  82. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  83. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  84. 제83항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 핵산 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  85. 제84항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  86. 제84항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  87. 제67항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 TNFAIP3, CBLB 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  88. 제52항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 상기 Cas 단백질은 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크(break)를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질이거나;
    b. 상기 Cas 단백질은 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제(nickase) 돌연변이체이거나; 또는
    c. 상기 Cas 단백질은 비활성화된 Cas 단백질(deactivated Cas protein: dCas)이고, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  89. 제52항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 변형된 면역 효과기 세포.
  90. 제88항에 있어서, 상기 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MAX-interacting protein 1: MXI1), 크루펠-연관 박스(
    Figure pct00045
    -associated box: KRAB) 도메인, 메틸-CpG 결합 단백질 2(methyl-CpG binding protein 2: MECP2) 및 4개의 이어진(concatenated) mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  91. 제50항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 도입하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  92. 제91항에 있어서, 상기 불활성화 돌연변이는 2종 이상의 내인성 유전자의 게놈 서열 내에 하나의 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 삽입을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  93. 제92항에 있어서, 상기 결실은 상기 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 부분 또는 완전 결실인, 변형된 면역 효과기 세포.
  94. 제92항에 있어서, 상기 불활성화 돌연변이는 프레임 이동 돌연변이(frame shift mutation)인, 변형된 면역 효과기 세포.
  95. 제91항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불활성화 돌연변이는 상기 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  96. 제1항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 형질주입, 형질도입, 전기천공, 또는 마이크로유체 디바이스(microfluidics device)에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 상기 면역 효과기 세포에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  97. 제96항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 시스템의 1종 이상의 성분, 단백질 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로서 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  98. 변형된 면역 효과기 세포로서, IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  99. 변형된 면역 효과기 세포로서, (a) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (b) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되,
    상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  100. 변형된 면역 효과기 세포로서, (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되,
    상기 1종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  101. 변형된 면역 효과기 세포로서, IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택된 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 상기 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  102. 제101항에 있어서, CBLB 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  103. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  104. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 ZC3H12A로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  105. 제104항에 있어서, ZC3H12A 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  106. 제104항에 있어서, ZC3H12A 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  107. 제104항에 있어서, ZC3H12A 및 TNFAIP3의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  108. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 MAP4K1로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 상기 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  109. 제108항에 있어서, MAP4K1 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  110. 제108항에 있어서, MAP4K1 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  111. 제108항에 있어서, MAP4K1 및 TNFAIP3의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  112. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 NR4A3이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되며, 상기 2종 이상의 내인성 유전자의 감소된 발현 및/또는 기능은 변형된 면역 효과기 세포의 효과기 기능을 향상시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  113. 제112항에 있어서, NR4A3 및 CBLB의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  114. 제112항에 있어서, NR4A3 및 BCOR의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  115. 제112항에 있어서, NR4A3 및 TNFAIP3의 감소된 발현 및/또는 기능을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  116. 변형된 면역 효과기 세포로서, IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  117. 변형된 면역 효과기 세포로서, (a) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (b) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  118. 변형된 면역 효과기 세포로서, (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 1종 이상의 내인성 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  119. 변형된 면역 효과기 세포로서, IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택된 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  120. 제119항에 있어서, CBLB 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  121. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  122. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 ZC3H12A이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  123. 제122항에 있어서, ZC3H12A 및 CBLB 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  124. 제122항에 있어서, ZC3H12A 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  125. 제122항에 있어서, ZC3H12A 및 TNFAIP3 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  126. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 MAP4K1이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  127. 제126항에 있어서, MAP4K1 및 CBLB 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  128. 제126항에 있어서, MAP4K1 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  129. 제126항에 있어서, MAP4K1 및 TNFAIP3 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  130. 변형된 면역 효과기 세포로서, 2종 이상의 표적 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하되, 적어도 1종의 표적 유전자는 NR4A3이고, 적어도 1종의 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  131. 제130항에 있어서, NR4A3 및 CBLB 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  132. 제130항에 있어서, NR4A3 및 BCOR 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  133. 제130항에 있어서, NR4A3 및 TNFAIP3 유전자 내에 불활성화 돌연변이를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  134. 제116항 내지 제133항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불활성화 돌연변이는 2종 이상의 내인성 유전자의 게놈 서열 내에 하나의 이상의 뉴클레오타이드의 결실, 치환 또는 삽입을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  135. 제134항에 있어서, 상기 결실은 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 부분 또는 완전 결실인, 변형된 면역 효과기 세포.
  136. 제134항에 있어서, 상기 불활성화 돌연변이는 프레임 이동 돌연변이인, 변형된 면역 효과기 세포.
  137. 제116항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 불활성화 돌연변이는 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시키는, 변형된 면역 효과기 세포.
  138. 제1항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현은 비변형된 또는 대조군 면역 효과기 세포에 비해서 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%만큼 감소되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  139. 제1항 내지 제137항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 기능은 비변형된 또는 대조군 면역 효과기 세포에 비해서 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는 적어도 90%만큼 감소되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  140. 제1항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포 표면 상에서 제시되는 조작된 면역 수용체를 더 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  141. 제140항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 항원-결합 도메인, 막관통 도메인 및 세포내 신호전달 도메인을 포함하는 CAR인, 변형된 면역 효과기 세포.
  142. 제140항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 조작된 TCR인, 변형된 면역 효과기 세포.
  143. 제140항 내지 제142항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조작된 면역 수용체는 표적 세포 상에서 발현되는 항원에 특이적으로 결합하되, 상기 항원은 종양-연관 항원인, 변형된 면역 효과기 세포.
  144. 제1항 내지 제143항 중 어느 한 항에 있어서, 면역 활성화 분자를 발현하는 외인성 트랜스젠(exogenous transgene)을 더 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  145. 제144항에 있어서, 상기 면역 활성화 분자는 사이토카인, 케모카인, 공자극성 분자, 활성화 펩타이드, 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  146. 제145항에 있어서, 상기 항체 또는 이의 결합 단편은 NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4 또는 PDCD1에 의해서 암호화된 단백질에 특이적으로 결합하고, 이의 기능을 저해하는, 변형된 면역 효과기 세포.
  147. 제1항 내지 제146항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포이되, 상기 면역 효과기 세포는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, NKT 세포로부터 선택된 림프구인, 변형된 면역 효과기 세포.
  148. 제147항에 있어서, 상기 림프구는 종양 침윤 림프구(tumor infiltrating lymphocyte: TIL)인, 변형된 면역 효과기 세포.
  149. 제1항 내지 제148항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효과기 기능은 세포 증식, 세포 생존, 종양 침윤, 세포독성, 항-종양 면역 반응 및/또는 소모에 대한 저항성으로부터 선택되는, 변형된 면역 효과기 세포.
  150. 제1항 내지 제149항 중 어느 한 항의 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는, 조성물.
  151. 제150항에 있어서, 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 더 포함하는, 조성물.
  152. 제150항 또는 제151항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 1×104, 1×105, 1×106, 1×107, 1×108, 1×109, 1×1010, 또는 1×1011개의 변형된 면역 효과기 세포를 포함하는, 조성물.
  153. 제150항 내지 제152항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하기에 적합한, 조성물.
  154. 제150항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 필요로 하는 대상체로부터 유래된 자가유래 면역 효과기 세포를 포함하는, 조성물.
  155. 제150항 내지 제153항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 대상체로부터 유래된 동종이계 면역 효과기 세포를 포함하는, 조성물.
  156. 유전자-조절 시스템으로서, (a) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (b) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택된 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있되,
    상기 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소; 또는 (iii) 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  157. 유전자-조절 시스템으로서, (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택된 세포에서 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 감소시킬 수 있되,
    상기 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소; 또는 (iii) 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  158. 제156항 또는 제157항에 있어서, 상기 시스템은 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  159. 제158항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로부터 선택되거나, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되되, 상기 gRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  160. 제159항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로부터 선택되되, 상기 gRNA 분자는 서열번호 154 내지 498로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  161. 제159항 또는 제160항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 154 내지 498로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  162. 제159항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되되, 상기 gRNA 분자는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  163. 제159항 또는 제162항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  164. 제158항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택되되, 상기 gRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  165. 제164항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  166. 제164항 또는 제165항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  167. 제158항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 ZC3H12A이고, 상기 gRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  168. 제167항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  169. 제167항 또는 제168항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  170. 제169항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  171. 제158항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 MAP4K1을 포함하되, 상기 gRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  172. 제171항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  173. 제171항 또는 제172항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  174. 제158항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 NR4A3을 포함하되, 상기 gRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  175. 제174항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  176. 제174항 또는 제175항에 있어서, 상기 gRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  177. 제156항 또는 제157항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 siRNA 또는 shRNA 핵산 분자를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  178. 제177항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로부터 선택되거나, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  179. 제178항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, 및 IKZF2로부터 선택되되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 154 내지 498로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  180. 제178항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택되되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  181. 제177항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로부터 선택되되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  182. 제181항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 814 내지 1064로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  183. 제177항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 ZC3H12A이되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  184. 제183항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 1065 내지 1509로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  185. 제177항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 MAP4K1을 포함하되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  186. 제185항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 510 내지 1538로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  187. 제177항에 있어서, 상기 1종 이상의 내인성 표적 유전자는 NR4A3을 포함하되, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합되는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  188. 제187항에 있어서, 상기 siRNA 또는 shRNA 분자는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  189. 유전자-조절 시스템으로서, 세포에서 2종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능을 감소시킬 수 있되,
    상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; 또는 (d) NR4A3으로부터 선택되고,
    상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 (e) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, 및 IKZF2로 이루어진 군; 또는 (f) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되며,
    상기 시스템은 (i) 핵산 분자; (ii) 효소; 또는 (iii) 가이드 핵산 분자 및 효소 단백질을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  190. 제189항에 있어서, 상기 시스템은 복수의 가이드 RNA(gRNA) 핵산 분자 및 Cas 엔도뉴클레아제를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  191. 제190항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  192. 제191항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하되, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는, 유전자-조절 시스템.
  193. 제191항 또는 제192항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  194. 제191항 또는 제192항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  195. 제190항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  196. 제195항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하고, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는, 유전자-조절 시스템.
  197. 제195항 또는 제196항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  198. 제195항 또는 제196항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  199. 제195항 또는 제196항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  200. 제195항 또는 제196항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  201. 제190항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  202. 제201항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하고, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는, 유전자-조절 시스템.
  203. 제201항 또는 제202항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  204. 제201항 또는 제202항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  205. 제201항 또는 제202항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  206. 제201항 또는 제202항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  207. 제190항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  208. 제207항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하고, 상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 표적 DNA 서열에 결합하는, 유전자-조절 시스템.
  209. 제207항 또는 제208항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  210. 제207항 또는 제208항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  211. 제207항 또는 제208항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  212. 제207항 또는 제208항에 있어서, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고, 상기 복수의 gRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  213. 제156항 내지 제212항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Cas 단백질은,
    a. 2개의 효소 활성 도메인을 포함하고, 이중 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 야생형 Cas 단백질이고;
    b. 하나의 효소 활성 도메인을 포함하고, 단일 가닥 DNA 브레이크를 유도할 수 있는 Cas 닉카제 돌연변이체이고;
    c. 비활성화된 Cas 단백질(dCas)이고, 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 이종 단백질과 회합되는, 유전자-조절 시스템.
  214. 제213항에 있어서, 상기 이종 단백질은 MAX-상호작용 단백질 1(MXI1), 크루펠-연관 박스(KRAB) 도메인 및 4개의 이어진 mSin3 도메인(SID4X)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  215. 제213항 또는 제214항에 있어서, 상기 Cas 단백질은 Cas9 단백질인, 유전자-조절 시스템.
  216. 제189항에 있어서, 상기 시스템은 핵산 분자를 포함하고, 상기 핵산 분자는 siRNA, shRNA, 마이크로RNA(miR), antagomiR 또는 안티센스 RNA인, 유전자-조절 시스템.
  217. 제216항에 있어서, 상기 시스템은 복수의 shRNA 또는 siRNA 분자를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  218. 제217항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  219. 제218항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6A 및 표 6B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  220. 제218항 또는 제219항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  221. 제217항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 ZC3H12A이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  222. 제221항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6C 및 표 6D에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  223. 제221항 또는 제222항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  224. 제221항 또는 제222항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1065 내지 1509로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  225. 제217항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 MAP4K1이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  226. 제225항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6E 및 표 6F에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  227. 제225항 또는 제226항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  228. 제225항 또는 제226항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 510 내지 1538로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  229. 제217항에 있어서, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 NR4A3이고, 상기 내인성 표적 유전자 중 적어도 하나는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6, IKZF2, CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  230. 제229항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 6G 및 표 6H에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 표 5A 및 표 5B에 제시된 게놈 좌표의 세트에 의해서 정의된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  231. 제229항 또는 제230항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  232. 제229항 또는 제230항에 있어서, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 1539 내지 1566으로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고, 상기 복수의 siRNA 또는 shRNA 분자 중 적어도 하나는 서열번호 499 내지 524로 이루어진 군으로부터 선택된 DNA 서열에 의해서 암호화된 RNA 서열에 결합하는 약 19 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  233. 제156항, 제157항 및 제189항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 DNA 결합 도메인 및 효소 도메인을 포함하는 단백질을 포함하고, 아연 핑거 뉴클레아제 및 전사-활성화제-유사 효과기 뉴클레아제(transcription-activator-like effector nuclease: TALEN)로부터 선택되는, 유전자-조절 시스템.
  234. 유전자-조절 시스템으로서, 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하되, 상기 1종 이상의 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  235. 유전자-조절 시스템으로서, 복수의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 벡터를 포함하되,
    상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538 또는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고,
    상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  236. 유전자-조절 시스템으로서, 1종 이상의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하되, 상기 1종 이상의 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  237. 유전자-조절 시스템으로서, 복수의 gRNA를 암호화하는 벡터 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 포함하되,
    상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538 또는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고,
    상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, 유전자-조절 시스템.
  238. 유전자-조절 시스템으로서, 1종 이상의 gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 포함하되,
    상기 1종 이상의 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하며,
    상기 1종 이상의 gRNA 및 상기 Cas 엔도뉴클레아제 단백질은 복합체를 이루어 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성하는, 유전자-조절 시스템.
  239. 유전자-조절 시스템으로서, 복수의 gRNA 및 Cas 엔도뉴클레아제 단백질을 포함하되,
    상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538 또는 서열번호 1539 내지 1566으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고,
    상기 복수의 gRNA 중 적어도 하나는 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 핵산 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하고,
    상기 1종 이상의 gRNA 및 상기 Cas 엔도뉴클레아제 단백질은 복합체를 이루어 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체를 형성하는, 유전자-조절 시스템.
  240. 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 포함하는, 키트.
  241. gRNA 핵산 분자로서, (a) BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3, 및 GNAS로 이루어진 군; (b) ZC3H12A; (c) MAP4K1; (d) NR4A3; (e) IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2; 또는 (f) CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로부터 선택된 내인성 표적 유전자 내의 표적 서열에 결합하는 표적화 도메인 핵산 서열을 포함하는, gRNA 핵산 분자.
  242. 제241항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서,
    a. 상기 내인성 유전자는 BCL2L11, FLI1, CALM2, DHODH, UMPS, RBM39, SEMA7A, CHIC2, PCBP1, PBRM1, WDR6, E2F8, SERPINA3 및 GNAS로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 gRNA는 표 6A 및 표 6B에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나;
    b. 상기 내인성 유전자는 ZC3H12A이고, 상기 gRNA는 표 6C 및 표 6D에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나;
    c. 상기 내인성 유전자는 MAP4K1이고, 상기 gRNA는 표 6E 및 표 6F에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나;
    d. 상기 내인성 유전자는 NR4A3이고, 상기 gRNA는 표 6G 및 표 6H에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나;
    e. 상기 내인성 유전자는 IKZF1, IKZF3, GATA3, BCL3, TNIP1, TNFAIP3, NFKBIA, SMAD2, TGFBR1, TGFBR2, TANK, FOXP3, RC3H1, TRAF6 및 IKZF2로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 gRNA는 표 5A 및 표 5B에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하거나; 또는
    f. 상기 내인성 유전자는 CBLB, PPP2R2D, NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4, PTPN6, PDCD1 및 BCOR로 이루어진 군으로부터 선택되고, 상기 gRNA는 표 5A 및 표 5B에 제시된 것으로부터 선택된 게놈 좌표에 위치된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, gRNA 분자.
  243. 제241항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 표적 DNA 서열에 결합하는 표적화 도메인 서열을 포함하는, gRNA 분자.
  244. 제241항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 서열번호 814 내지 1064, 서열번호 1065 내지 1509, 서열번호 510 내지 1538, 서열번호 1539 내지 1566, 서열번호 154 내지 498 또는 서열번호 499 내지 813으로부터 선택된 서열에 의해서 암호화된 표적화 도메인 서열을 포함하는, gRNA 분자.
  245. 제241항 내지 제244항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 PAM 서열을 포함하는, gRNA 분자.
  246. 제241항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 모듈식(modular) gRNA 분자인, gRNA 분자.
  247. 제241항 내지 제245항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA는 이중 gRNA 분자인, gRNA 분자.
  248. 제241항 내지 제247항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적화 도메인은 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 또는 그 초과의 뉴클레오타이드 길이인, gRNA 분자.
  249. 제241항 내지 제248항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 5' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형 및/또는 3' 단부에 또는 그 근처에(예를 들어, 3' 단부의 1 내지 10, 1 내지 5 또는 1 내지 2개의 뉴클레오타이드 이내에) 변형을 포함하는, gRNA 분자.
  250. 제249항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 뉴클레아제에 대한 증가된 안정성을 나타내는, gRNA 분자.
  251. 제249항 또는 제250항에 있어서, 상기 변형된 gRNA는 T 세포 내에 도입될 때 감소된 선천 면역 반응을 나타내는, gRNA 분자.
  252. 제241항 내지 제251항 중 어느 한 항의 gRNA 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 분자.
  253. 제241항 내지 제251항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 gRNA 분자 또는 제252항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 조성물.
  254. 제241항 내지 제251항 중 어느 한 항의 gRNA 분자 또는 제252항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 키트.
  255. 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법으로서,
    a. 대상체로부터 면역 효과기 세포를 얻는 단계;
    b. 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 상기 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계; 및
    c. 1종 이상의 내인성 표적 유전자의 발현 및/또는 기능이 변형되지 않은 면역 효과기 세포에 비해서 감소되도록 상기 면역 효과기 세포를 배양하는 단계
    를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  256. 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법으로서, 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 상기 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  257. 제255항 또는 제256항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 및 TCR로부터 선택된 조작된 면역 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 도입하는 단계를 더 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  258. 제257항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템 및/또는 상기 조작된 면역 수용체를 암호화하는 상기 폴리뉴클레오타이드는 형질주입, 형질도입, 전기천공, 또는 마이크로유체 디바이스에 의한 세포막의 물리적 파괴에 의해서 면역 효과기 세포에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  259. 제255항 내지 제258항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 시스템의 1종 이상의 성분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 단백질로서 또는 리보뉴클레오단백질(RNP) 복합체로서 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  260. 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법으로서,
    a. 면역 효과기 세포의 집단을 배양물에서 확장시키는 단계; 및
    b. 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 상기 면역 효과기 세포의 집단 내에 도입하는 단계
    를 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  261. 제260항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포의 집단을 대상체로부터 얻는 단계를 더 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  262. 제260항 또는 제261항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 확장 전에, 확장 중에 또는 확장 후에 상기 면역 효과기 세포의 집단에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  263. 제260항 또는 제261항에 있어서, 상기 면역 효과기 세포의 집단의 확장은 제1 라운드의 확장 및 제2 라운드의 확장을 포함하는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  264. 제263항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 제1 라운드의 확장 전에, 확장 중에 또는 확장 후에 상기 면역 효과기 세포의 집단에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  265. 제263항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 제2 라운드의 확장 전에, 확장 중에 또는 확장 후에 상기 면역 효과기 세포의 집단에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  266. 제263항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 제1 라운드 및 상기 제2 라운드의 확장 전에 상기 면역 효과기 세포의 집단에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  267. 제263항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 제1 라운드 및 상기 제2 라운드의 확장 후에 상기 면역 효과기 세포의 집단에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  268. 제263항에 있어서, 상기 유전자-조절 시스템은 상기 제1 라운드의 확장 후 그리고 상기 제2 라운드의 확장 전에 상기 면역 효과기 세포의 집단에 도입되는, 변형된 면역 효과기 세포를 생산하는 방법.
  269. 질환 또는 장애의 치료를 필요로 하는 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제149항 중 어느 한 항의 변형된 면역 효과기 세포 또는 제150항 내지 제155항 중 어느 한 항의 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 치료하는 방법.
  270. 제269항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 세포 증식성 장애, 염증 장애 또는 감염성 질환인, 치료하는 방법.
  271. 제269항에 있어서, 상기 질환 또는 장애는 암 또는 바이러스 감염인, 치료하는 방법.
  272. 제271항에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종 또는 고형 종양으로부터 선택되는, 치료하는 방법.
  273. 제272항에 있어서, 상기 고형 종양은 흑색종, 췌장 종양, 방광 종양, 폐 종양 또는 전이, 결장직장암 또는 두경부암인, 치료하는 방법.
  274. 제271항 내지 제273항 중 어느 한 항에 있어서, 암은 PD1 저항성 또는 비민감성 암인, 치료하는 방법.
  275. 제271항 내지 제274항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 PD1 저해제 또는 PDL1 저해제로 이전에 치료된 적이 있는, 치료하는 방법.
  276. 제271항 내지 제275항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체에게 NRP1, HAVCR2, LAG3, TIGIT, CTLA4 또는 PDCD1에 의해서 암호화된 단백질에 특이적으로 결합하여 이의 기능을 저해하는 항체 또는 이의 결합 단편을 투여하는 단계를 더 포함하는, 치료하는 방법.
  277. 제269항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 효과기 세포는 상기 대상체에 대해서 자가유래인, 치료하는 방법.
  278. 제269항 내지 제276항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 변형된 면역 효과기 세포는 상기 대상체에 대해서 동종이계인, 치료하는 방법.
  279. 암성 세포를 사멸시키는 방법으로서, 상기 암성 세포를 제1항 내지 제149항 중 어느 한 항에 따른 변형된 면역 효과기 세포 또는 제150항 내지 제155항 중 어느 한 항의 조성물에 노출시키는 단계를 포함하는, 암성 세포를 사멸시키는 방법.
  280. 제279항에 있어서, 상기 노출은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 일어나는, 암성 세포를 사멸시키는 방법.
  281. 면역 효과기 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시키는 방법으로서, 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 상기 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계를 포함하는, 면역 효과기 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시키는 방법.
  282. 면역 효과기 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시키는 방법으로서, 제156항 내지 제239항 중 어느 한 항의 유전자-조절 시스템을 상기 면역 효과기 세포 내에 도입하는 단계를 포함하되, 상기 변형된 면역 효과기 세포는 변형되지 않은 면역 효과기 세포에 비해서 하나 이상의 향상된 효과기 기능을 나타내는, 면역 효과기 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시키는 방법.
  283. 제282항에 있어서, 상기 하나 이상의 효과기 기능은 세포 증식, 세포 생존, 세포독성, 종양 침윤, 증가된 사이토카인 생산, 항-종양 면역 반응 및/또는 소모에 대한 저항성으로부터 선택되는, 면역 효과기 세포의 하나 이상의 효과기 기능을 향상시키는 방법.
KR1020207026518A 2018-03-15 2019-03-14 개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법 KR20200130826A (ko)

Applications Claiming Priority (25)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862643597P 2018-03-15 2018-03-15
US201862643578P 2018-03-15 2018-03-15
US201862643587P 2018-03-15 2018-03-15
US201862643598P 2018-03-15 2018-03-15
US62/643,598 2018-03-15
US62/643,597 2018-03-15
US62/643,587 2018-03-15
US62/643,578 2018-03-15
US201862692100P 2018-06-29 2018-06-29
US201862692010P 2018-06-29 2018-06-29
US201862692019P 2018-06-29 2018-06-29
US62/692,100 2018-06-29
US62/692,010 2018-06-29
US62/692,019 2018-06-29
US201862768443P 2018-11-16 2018-11-16
US201862768458P 2018-11-16 2018-11-16
US201862768428P 2018-11-16 2018-11-16
US201862768448P 2018-11-16 2018-11-16
US62/768,448 2018-11-16
US62/768,428 2018-11-16
US62/768,443 2018-11-16
US62/768,458 2018-11-16
US201962804265P 2019-02-12 2019-02-12
US62/804,265 2019-02-12
PCT/US2019/022365 WO2019178421A1 (en) 2018-03-15 2019-03-14 Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200130826A true KR20200130826A (ko) 2020-11-20

Family

ID=67906919

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020207026518A KR20200130826A (ko) 2018-03-15 2019-03-14 개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법

Country Status (6)

Country Link
JP (1) JP2021518161A (ko)
KR (1) KR20200130826A (ko)
CN (1) CN112040987A (ko)
AU (1) AU2019236204A1 (ko)
CA (1) CA3093919A1 (ko)
WO (1) WO2019178421A1 (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109517820B (zh) 2017-09-20 2021-09-24 北京宇繁生物科技有限公司 一种靶向HPK1的gRNA以及HPK1基因编辑方法
AU2020392094A1 (en) * 2019-11-25 2022-06-23 KSQ Therapeutics, Inc. Methods for activation and expansion of tumor infiltrating lymphocytes
CN110777147A (zh) * 2019-11-29 2020-02-11 上海科技大学 一种ikzf3基因沉默的t细胞及其应用
JP2023542348A (ja) 2020-09-23 2023-10-06 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト Ｒｅｇｎａｓｅ－１及び／又はＴＧＦＢＲＩＩを破壊した遺伝子操作されたＴ細胞は機能性及び持続性を改善させた
CN116997651A (zh) * 2021-01-19 2023-11-03 J·大卫格莱斯顿研究所-根据J·大卫格莱斯顿遗嘱的遗嘱信托 用于增强人t细胞功能的基因激活靶标
KR20240010717A (ko) * 2021-05-20 2024-01-24 우시 바이올로직스 아일랜드 리미티드 유전적으로 변형된 nk 세포들 및 이들의 용도
CN117616115A (zh) * 2021-08-03 2024-02-27 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
CN113750218B (zh) * 2021-08-10 2022-05-20 南通市肿瘤医院 多肽zc3h12a及其突变体在制备抗肝癌药物中的应用
WO2023082640A1 (zh) * 2021-11-10 2023-05-19 清华大学 增强免疫细胞持久性的方法
WO2023143515A1 (zh) * 2022-01-29 2023-08-03 苏州沙砾生物科技有限公司 一种修饰的肿瘤浸润淋巴细胞及其用途
WO2023225665A1 (en) * 2022-05-19 2023-11-23 Lyell Immunopharma, Inc. Polynucleotides targeting nr4a3 and uses thereof
WO2024011335A1 (zh) * 2022-07-10 2024-01-18 清华大学 经修饰的免疫细胞

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999014321A1 (en) * 1997-09-17 1999-03-25 The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research Novel therapeutic molecules
CN102378633A (zh) * 2009-02-27 2012-03-14 国立大学法人大阪大学 免疫佐剂组合物及其应用
US20150218636A1 (en) * 2012-04-12 2015-08-06 Aarhus Universitet Mutations In Calmodulin Genes
AU2014361781B2 (en) * 2013-12-12 2021-04-01 Massachusetts Institute Of Technology Delivery, use and therapeutic applications of the CRISPR -Cas systems and compositions for genome editing
US20180161369A1 (en) * 2015-05-29 2018-06-14 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions for cellular immunotherapy
EP4043556B1 (en) * 2015-06-30 2024-02-07 Cellectis Methods for improving functionality in nk cell by gene inactivation using specific endonuclease
AU2016317574A1 (en) * 2015-08-28 2018-03-29 Bioincept, Llc Compositions and methods for the treatment of neurodamage
WO2017048995A1 (en) * 2015-09-15 2017-03-23 Mirimus, Inc. Inducible crispr/cas9 and rnai systems and methods of use
US11020430B2 (en) * 2015-11-04 2021-06-01 Emory University Immune cells with DNMT3A gene modifications and methods related thereto
BE1023924B1 (nl) * 2015-12-09 2017-09-13 Stairsolutions Vof Systeem van elementen voor het samenstellen van een trap en een trap samengesteld met elementen van zulk systeem

Also Published As

Publication number Publication date
JP2021518161A (ja) 2021-08-02
CN112040987A (zh) 2020-12-04
WO2019178421A1 (en) 2019-09-19
AU2019236204A1 (en) 2020-10-08
CA3093919A1 (en) 2019-09-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230088186A1 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
US11421228B2 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
US11459544B2 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
KR20200130826A (ko) 개선된 면역요법을 위한 유전자-조절 조성물 및 방법
US20200347386A1 (en) Combination gene targets for improved immunotherapy
JP2021518161A6 (ja) 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法
US11332713B2 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy