JP2021518161A - 免疫療法の改善のための遺伝子調節組成物及び遺伝子調節方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2018年3月15日に出願された米国特許仮出願第62/643,578号、2018年6月29日に出願された米国特許仮出願第62/692,010号、2018年11月16日に出願された米国特許仮出願第62/768,428号、2018年3月15日に出願された米国特許仮出願第62/643,587号、2018年6月29日に出願された米国特許仮出願第62/692,019号、2018年11月16日に出願された米国特許仮出願第62/768,443号、2019年2月12日に出願された米国特許仮出願第62/804,265号、2018年3月15日に出願された米国特許仮出願第62/643,597号、2018年6月29日に出願された米国特許仮出願第62/692,100号、2018年11月16日に出願された米国特許仮出願第62/768,448号、2018年3月15日に出願された米国特許仮出願第62/643,598号、2018年6月29日に出願された米国特許仮出願第62/692,110号、及び2018年11月16日に出願された米国特許仮出願第62/768,458号に基づく優先権を主張するものであり、これらの仮出願はそれぞれ、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本明細書とともに電子的に提出したテキストファイル、すなわち、配列表のコンピューター可読形式のコピー(ファイル名:KSQT_007_04WO_SeqList_ST25.txt、記録日:2019年3月14日、ファイルサイズ308キロバイト)の内容は、参照により、その全体が本明細書に援用される。
本開示は、標的核酸配列を編集するか、または標的核酸配列の発現を調節するための方法、組成物及び構成成分、ならびに、細胞増殖性疾患、炎症性疾患及び/または感染症の治療において、受容体導入免疫エフェクター細胞とともに使用する用途を含め、それらの免疫療法関連用途に関するものである。
がん治療剤としての遺伝子改変免疫細胞の有効性を制限する要因としては、(1)細胞の増殖性、例えば、養子移入後のT細胞の限られた増殖、(2)細胞の生存性、例えば、腫瘍環境における因子によるT細胞のアポトーシスの誘発、ならびに(3)細胞の機能、例えば、宿主免疫細胞及びがん細胞によって分泌される抑制因子による、細胞傷害性T細胞の機能の阻害と、製造プロセス中及び/または移入後における免疫細胞の疲弊が挙げられる。
本明細書及び添付の請求項で使用する場合、「a」、「an」及び「the」という単数形には、文脈上明らかに別段に示されていない限り、複数の言及物が含まれる。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞を提供する。本明細書では、「改変免疫エフェクター細胞」という用語には、1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させる1つ以上のゲノム改変を含む免疫エフェクター細胞、ならびに1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む免疫エフェクター細胞が含まれる。本明細書では、「非改変免疫エフェクター細胞」または「コントロールの免疫エフェクター細胞」は、ゲノムが改変されておらず、遺伝子調節システムを含まないか、またはコントロール遺伝子調節システム(例えば、空ベクターコントロール、非ターゲティングgRNA、スクランブルsiRNAなど)を含む細胞または細胞集団を指す。
(a)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる1つ以上の核酸分子、
(b)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(c)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる1つ以上のタンパク質、
(d)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができるタンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(e)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のガイドRNA(gRNA)、
(f)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のgRNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(g)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することができる1つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
(h)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(i)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のガイドDNA(gDNA)、
(j)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のgDNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(k)gDNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することができる1つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
(l)gDNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(m)内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列に結合できる1つ以上のgRNA、
(n)内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列に結合できる1つ以上のgRNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(o)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列を改変することができる1つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
(p)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、または
(q)上記をいずれかに組み合わせたものを含む遺伝子調節システム、
を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、1つ以上の免疫細胞エフェクター機能が上昇する。本明細書では、「エフェクター機能」という用語は、免疫細胞の機能のうち、標的細胞または標的抗原に対する免疫応答の発生、維持及び/または増強に関連する機能を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞では、非改変免疫エフェクター細胞と比べて、腫瘍への浸潤性もしくは遊走性が向上する特徴、増殖性が向上する特徴、細胞生存能が向上もしくは延長する特徴、周囲の微小環境における抑制因子耐性が向上して、その細胞の活性化状態が延長または増大するようになる特徴、炎症誘発性免疫因子(例えば、炎症誘発性サイトカイン、ケモカイン及び/または酵素)の産生が増加する特徴、細胞傷害性が向上する特徴、及び/または疲弊耐性が向上する特徴のうちの1つ以上が見られる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞は、1つ以上の内在性標的遺伝子の発現もしくは機能が低下され、及び/または1つ以上の内在性標的遺伝子(下に記載されている)の発現及び/または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む。いくつかの実施形態では、その1つ以上の内在性標的遺伝子は、エフェクター細胞応答の活性化及び調節に関連する経路に存在する。このような実施形態では、その1つ以上の内在性標的遺伝子の発現または機能の低下により、その免疫細胞の1つ以上のエフェクター機能が増強される。
表1:例示的な内在性経路
表2:例示的な内在性遺伝子
本明細書では、「遺伝子調節システム」という用語は、細胞に導入したときに、内在性標的DNA配列を改変することによって、コードされる遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸またはそれらを組み合わせたものを指す。本開示の方法で使用するのに適する多くの遺伝子編集システムが、当該技術分野において知られており、そのシステムとしては、shRNA、siRNA、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、TALENシステム及びCRISPR/Casシステムが挙げられるが、これらに限らない。
本明細書で使用する場合、核酸ベースの遺伝子調節システムは、外因性タンパク質を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を調節できる1つ以上の核酸分子を含むシステムである。いくつかの実施形態では、その核酸ベースの遺伝子調節システムは、標的核酸配列と相補的であるRNA干渉分子またはアンチセンスRNA分子を含む。
表4A:例示的なsiRNAコンストラクト
いくつかの実施形態では、タンパク質ベースの遺伝子調節システムは、核酸ガイド分子を必要とせずに、内在性標的遺伝子の発現を配列特異的な形で調節することができる1つ以上のタンパク質を含むシステムである。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、1つ以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの実施形態では、そのタンパク質ベースの遺伝子調節システムは、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このような実施形態は、本明細書では「TALEN」という。
ジンクフィンガーベースのシステムは、ジンクフィンガーDNA結合ドメイン及び酵素ドメインという2つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーDNA結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」または「ZFP」は、1つ以上のジンクフィンガーを通じて、DNAと配列特異的な形で結合するタンパク質、またはより巨大なタンパク質内のドメインであり、その結合ドメイン内のアミノ酸配列領域のうち、亜鉛イオンへの配位を通じて構造が安定化している領域である。ジンクフィンガードメインは、標的DNA配列に結合することによって、その配列近傍の酵素ドメインの活性を誘導し、その結果、標的配列近傍の内在性標的遺伝子の改変を誘導する。ジンクフィンガードメインは、実質的にいずれの所望の配列にも結合するように操作できる。したがって、切断または組み換えを行いたい標的DNA配列を含む標的遺伝子座(例えば、表2または3で言及されている標的遺伝子内の標的座位)を特定した後、1つ以上のジンクフィンガー結合ドメインを操作して、その標的遺伝子座内の1つ以上の標的DNA配列に結合するようにできる。ジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含む融合タンパク質が細胞内で発現すると、その標的遺伝子座で改変が行われる。
表7:例示的なジンクフィンガーシステム
TALENベースのシステムは、TALエフェクターDNA結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。このシステムは、TALエフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメイン(DNA鎖を切断するヌクレアーゼ)に融合することによって作製する。上記のFokI制限酵素は、TALENベースの遺伝子調節システムで用いるのに適する例示的な酵素ドメインである。
複合型遺伝子調節システムは、部位特異的改変ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的改変ポリペプチド」とは、核酸ガイド分子に結合し、標的核酸配列(例えば、内在性標的DNA配列または内在性標的RNA配列)に結合するその核酸ガイド分子によってその標的核酸配列に導かれ、(例えば、その標的核酸配列の切断、変異またはメチル化によって)その標的核酸配列を改変するポリペプチドを指す。
いくつかの実施形態では、その部位特異的改変ポリペプチドは、Casタンパク質である。本明細書に記載されている方法及び組成物では、様々な種のCas分子を使用でき、S.pyogenes、S.aureus、N.meningitidis、S.thermophiles、Acidovorax avenae、Actinobacillus pleuropneumoniae、Actinobacillus succinogenes、Actinobacillus suis、Actinomyces sp.、Cycliphilusdenitrificans、Aminomonas paucivorans、Bacillus cereus、Bacillus smithii、Bacillus thuringiensis、Bacteroides sp.、Blastopirellula marina、Bradyrhizobium sp.、Brevibacillus laterospoxus、Campylobacter coli、Campylobacter jejuni、Campylobacter lari、Candidatus puniceispirillum、Clostridium cellulolyticum、Clostridium perfringens、Corynebacterium accolens、Corynebacterium diphtheria、Corynebacterium matruchotii、Dinoroseobacter shibae、Eubacterium dolichum、Gammaproteobacterium、Gluconacetobacter diazotrophicus、Haemophilus parainfluenzae、Haemophilus sputomm、Helicobacter canadensis、Helicobacter cinaedi、Helicobacter mustelae、Ilyobacter polytropus、Kingella kingae、Lactobacillus crispatus、Listeria ivanovii、Listeria monocytogenes、Listeriaceae bacterium、Methylocystis sp.、Methylosinus trichosporium、Mobiluncus mulieris、Neisseria bacilliformis、Neisseria cinerea、Neisseria flavescens、Neisseria lactamica、Neisseria meningitidis、Neisseria sp.、Neisseria wadsworthii、Nitrosomonas sp.、Parvibaculum lavamentivorans、Pasteurella multocida、Phascolarctobacterium succinatutens、Ralstonia syzygii、Rhodopseudomonas palustris、Rhodovulum sp.、Simonsiella muelleri、Sphingomonas sp.、Sporolactobacillus vineae、Staphylococcus aureus、Staphylococcus lugdunensis、Streptococcus sp.、Subdoligranulum sp.、Tistrella mobilis、Treponema sp.またはVerminephrobacter eiseniaeに由来するCas分子が挙げられる。
(a)ニッカーゼ活性、すなわち、一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖または相補鎖を切断する能力、
(b)二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両方の鎖を切断し、二本鎖切断を起こす能力(一実施形態では、2つのニッカーゼ活性の存在である)、
(c)エンドヌクレアーゼ活性、
(d)エキソヌクレアーゼ活性及び/または
(e)ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力、
という活性のうちの1つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、そのCasポリペプチドは、Casポリペプチドの1つ以上の特性を改変させるために操作されている。例えば、いくつかの実施形態では、そのCasポリペプチドは、酵素特性が改変されており、例えば、(天然のCas分子もしくは他の参照Cas分子と比べて)ヌクレアーゼ活性が改変されているか、またはヘリカーゼ活性が改変されている。いくつかの実施形態では、操作Casポリペプチドは、その大きさを改変させる改変、例えば、そのCasポリペプチドの別の特性に有意な影響を及ぼさずに、その大きさを縮小させる、アミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの実施形態では、操作Casポリペプチドは、PAM認識に影響を及ぼす改変を含む。例えば、操作Casポリペプチドは、対応する野生型Casタンパク質によって認識されるPAM配列以外のPAM配列を認識するように改変させることができる。
本開示は、部位特異的改変ポリペプチドを所定の標的核酸配列に誘導するガイドRNA(gRNA)を提供する。gRNAは、「核酸ターゲティングドメイン」または「ターゲティングドメイン」、及びタンパク質結合セグメントを含む。そのターゲティングドメインは、「スペーサー」配列と称することもあり、標的核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を含む。したがって、gRNAのターゲティングドメインセグメントは、配列特異的な形で、ハイブリダイゼーション(すなわち塩基対形成)によって標的核酸と相互作用し、gRNAが結合する、標的核酸内の位置を決定する。gRNAのターゲティングドメインセグメントを(例えば遺伝子操作によって)改変して、標的核酸配列内の所望の配列にハイブリダイズさせることができる。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約13〜約22ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21または22ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、そのターゲティングドメイン配列は、約20ヌクレオチド長である。
(a)結合していないリン酸酸素及び/またはホスホジエステル骨格結合において結合しているリン酸酸素のうちの1つ以上のうちの一方または両方の改変、例えば置換、
(b)リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の2’ヒドロキシルの改変、例えば置換、
(c)リン酸部分の「デホスホ」リンカーへの大幅な置換、
(d)天然の核酸塩基の改変または置換、
(e)リボース−リン酸骨格の置換または改変、
(f)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の改変、例えば、末端のリン酸基の除去、改変もしくは置換、またはある部分のコジュゲーション、ならびに
(g)糖の改変、
のうちの1つ以上を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されている遺伝子調節システムをコードするポリヌクレオチドまたは核酸分子を提供する。本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」または「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸(DNA)、リボ核酸(RNA)及びDNA/RNAハイブリッドを指す。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖であってよく、組み換えたもの、合成したもの、単離したもののいずれかであってよい。ポリヌクレオチドとしては、プレメッセンジャーRNA(pre−mRNA)、メッセンジャーRNA(mRNA)、RNA、ゲノムDNA(gDNA)、PCRで増幅したDNA、相補的DNA(cDNA)、合成DNAまたは組み換えDNAが挙げられるが、これらに限らない。ポリヌクレオチドとは、少なくとも5ヌクレオチド長、少なくとも10ヌクレオチド長、少なくとも15ヌクレオチド長、少なくとも20ヌクレオチド長、少なくとも25ヌクレオチド長、少なくとも30ヌクレオチド長、少なくとも40ヌクレオチド長、少なくとも50ヌクレオチド長、少なくとも100ヌクレオチド長、少なくとも200ヌクレオチド長、少なくとも300ヌクレオチド長、少なくとも400ヌクレオチド長、少なくとも500ヌクレオチド長、少なくとも1000ヌクレオチド長、少なくとも5000ヌクレオチド長、少なくとも10000ヌクレオチド長、少なくとも15000ヌクレオチド長、またはこれを上回るヌクレオチド長のヌクレオチドポリマー形態(リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの改変形態のいずれか)、ならびにあらゆる中間の長さのものを指す。この文脈においては、「中間の長さ」とは、示されている値の間のいずれの長さ(6ヌクレオチド長、7ヌクレオチド長、8ヌクレオチド長、9ヌクレオチド長など、101ヌクレオチド長、102ヌクレオチド長、103ヌクレオチド長など、151ヌクレオチド長、152ヌクレオチド長、153ヌクレオチド長など、201ヌクレオチド長、202ヌクレオチド長、203ヌクレオチド長など)も意味することは容易にわかるであろう。
本明細書に記載されている遺伝子調節システムを細胞内で発現させるために、その遺伝子調節システムをコードする発現カセットを適切なベクターに挿入できる。「核酸ベクター」という用語は、本明細書では、別の核酸分子を移入または輸送できる核酸分子を指す目的で用いられている。移入される核酸は概して、ベクター核酸分子に連結、例えば挿入されている。核酸ベクターは、細胞内での自己複製を誘導する配列を含んでも、宿主細胞のDNAへの組み込みを可能にするのに充分な配列を含んでもよい。
いくつかの実施形態では、本開示は、改変免疫エフェクター細胞の作製方法を提供する。いくつかの実施形態では、その方法は、遺伝子調節システムを免疫エフェクター細胞集団に導入することを含み、その遺伝子調節システムは、1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、標的DNA配列と、gRNA及びCasポリペプチドを含む複合体とを接触させることを伴う。上で論じたように、gRNA及びCasポリペプチドが複合体を形成し、そのgRNAのDNA結合ドメインが、その複合体を標的DNA配列に導き、そのCasタンパク質(または酵素活性が不活性なCasタンパク質に融合された異種タンパク質)が、標的DNA配列を改変する。いくつかの実施形態では、この複合体は、gRNA及びCasタンパク質(またはgRNA及びCasタンパク質をコードするポリヌクレオチド)を細胞に導入した後に、細胞内で形成される。いくつかの実施形態では、Casタンパク質をコードする核酸は、DNA核酸であり、細胞にトランスダクションによって導入する。いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas遺伝子編集システムのCas9及びgRNAの構成成分は、単一のポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質及びgRNAの構成成分をコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターに含まれており、ウイルストランスダクションによって細胞に導入する。いくつかの実施形態では、CRISPR/Cas遺伝子編集システムのCas9及びgRNAの構成成分は、異なるポリヌクレオチド分子によってコードされる。いくつかの実施形態では、Casタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、第1のウイルスベクターに含まれ、gRNAをコードするポリヌクレオチドは、第2のウイルスベクターに含まれる。この実施形態のいくつかの態様では、第2のウイルスベクターよりも前に、第1のウイルスベクターを細胞に導入する。この実施形態のいくつかの態様では、第1のウイルスベクターよりも前に、第2のウイルスベクターを細胞に導入する。このような実施形態では、それらのベクターが組み込まれることにより、Cas9及びgRNAの構成成分の発現が持続する。しかしながら、一部の種類の細胞では、Cas9の発現の持続により、オフターゲット変異及びオフターゲット切断が増加し得る。したがって、いくつかの実施形態では、トランスフェクションによって、Casタンパク質をコードするmRNA核酸配列を細胞集団に導入してもよい。このような実施形態では、Cas9の発現は、時間とともに減少することになり、オフターゲット変異部位またはオフターゲット切断部位の数を減少し得る。いくつかの実施形態では、gRNA及びCasタンパク質は、エレクトロポレーションによって別々に導入する。
いくつかの実施形態では、改変免疫エフェクター細胞の作製方法は、標的遺伝子のmRNA転写物と相補的である配列を有する1つ以上のshRNA分子をコードする1つ以上のDNAポリヌクレオチドを細胞に導入することを含む。小さな遺伝子カセットを介して、所定のDNA配列を細胞核に導入することによって、免疫エフェクター細胞を改変して、shRNAを作製することができる。レトロウイルス及びレンチウイルスの両方を用いて、shRNAをコードするDNAを免疫エフェクター細胞に導入することができる。導入されたDNAは、細胞自体のDNAの一部となることも、または核内に存続することもでき、その細胞機構に対して、shRNAを産生するように命令する。shRNAは、その細胞内のダイサーまたはAgo2の媒介によるスライサー活性によって処理して、RNAiの媒介による遺伝子ノックダウンを誘導し得る。
「組成物」という用語は、本明細書で使用する場合、本明細書に記載されている遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の製剤であって、対象または細胞に投与または送達できる製剤を指す。典型的には、製剤は、あらゆる生理学的に許容可能な組成物(その誘導体及び/またはプロドラッグ、溶媒和物、立体異性体、ラセミ体もしくは互変異性体を含む)を、いずれかの生理学的に許容可能な担体、希釈剤及び/または賦形剤とともに含む。「治療用組成物」または「医薬組成物」(本明細書では同義的に用いられている)は、特定の疾患もしくは障害を治療するために、対象に投与するか、または1つ以上の内在性標的遺伝子を改変するために、細胞と接触させることができる、遺伝子調節システムまたは改変免疫エフェクター細胞の組成物である。
(a)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる1つ以上の核酸分子、
(b)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる核酸分子をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(c)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる1つ以上のタンパク質、
(d)1つ以上の内在性標的遺伝子によってコードされる遺伝子産物の発現を低下させるか、もしくはその機能を改変することができる改変タンパク質をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(e)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のgRNA、
(f)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のgRNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(g)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することができる1つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
(h)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(i)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のガイドDNA(gDNA)、
(j)内在性遺伝子内の標的DNA配列に結合できる1つ以上のgDNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(k)gDNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することができる1つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
(l)gDNAと相互作用して、内在性遺伝子内の標的DNA配列を改変することできる部位特異的改変ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(m)内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列に結合できる1つ以上のgRNA、
(n)内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列に結合できる1つ以上のgRNAをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(o)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列を改変することができる1つ以上の部位特異的改変ポリペプチド、
(p)gRNAと相互作用して、内在性遺伝子によってコードされる標的mRNA配列を改変することができる部位特異的改変ポリペプチドをコードする1つ以上のポリヌクレオチド、
(q)本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞、または
(r)上記をいずれかに組み合わせたもの
を含むことができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び遺伝子調節システムは、様々な治療用途で用いてよい。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている改変免疫エフェクター細胞及び/または遺伝子調節システムは、例えば疾患を治療するための遺伝子療法を目的として、抗ウイルス剤として使用するため、抗病原体剤として使用するため、抗がん剤として使用するため、または生物学的研究のために、対象に投与してよい。
本明細書に引用されている参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願はいずれも、参照により、あらゆる目的でその全体が本明細書に援用される。しかしながら、本明細書に引用されているいずれの参照文献、論文、刊行物、特許、特許公報及び特許出願に言及する際も、それらが、世界のいずれの国においても、正当な先行技術を構成したり、または技術常識の一部を形成すると解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりするものでないとともに、そのように解釈したり、認めたりまたはいずれかの形で示唆したりすべきでもない。
本明細書に記載されている実験では、CRISPR/Cas9システムを用いて、それぞれ異なるT細胞集団における1つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節する。
gRNA:別段に示されていない限り、いずれの実験でも、単分子gRNA(sgRNA)を使用する。示されているように、デュアルgRNA分子を使用したが、そのデュアルgRNA分子は、200μMのtracrRNA(IDTカタログ番号1072534)と200μMの標的特異的crRNA(IDT)をNuclease Free Duplex Buffer(IDTカタログ番号11−01−03−01)中で5分、95℃で複合化して、100μMのtracrRNA:crRNA複合体(tracrRNAとcrRNAが1:1の比率で存在する)を形成することによって形成した。下記の実験で使用したgRNAのターゲティング配列は、下記の表10に示されている。
表10:実験gRNAのターゲティングドメインコード配列
表11:例示的なCARコンストラクト
ヒトT細胞の単離及び活性化:ヒト全PBMCを新鮮なロイコパックから、フィコール勾配遠心分離によって単離した。続いて、CD8+ T細胞単離キット(Stemcell Technologiesカタログ番号17953)を用いて、CD8+ T細胞を全PBMCから精製した。T細胞の活性化のために、CD8+ T細胞を2×106細胞/mLで、T175フラスコ内のX−VIVO15T細胞増殖培地(Lonza、カタログ番号04−418Q)に、6.25μL/mLのT細胞活性化因子ImmunoCult(抗CD3/CD28/CD2、StemCell Technologies,Vancouver BC,Canada)及び10ng/mLのヒトIL2とともに播種した。レンチウイルスコンストラクトによるトランスダクションの前に、T細胞を18時間活性化させた。
編集された受容体発現細胞を、細胞表面でのCD3の発現に基づき精製する実験を行った。操作前には、CD8+ T細胞は、TCRα鎖/TCRβ鎖を含む複合体の一部として、細胞表面にCD3分子を発現する(図4A)。そのT細胞に、CAR、TRAC遺伝子を標的とするガイドRNA、及びB2M遺伝子を標的とするガイドRNA(B2M遺伝子を用いて、標的遺伝子の編集の代わりに、非TCR遺伝子の編集を評価した)を発現するレンチウイルスをトランスダクションした。レンチウイルスのトランスダクション及びCas9 mRNAのエレクトロポレーション後、トランスダクションが成功して編集されたT細胞では、TRAC遺伝子の編集により、表面CD3の発現が欠損し、B2M遺伝子の編集により、HLA−ABCの発現が欠損する(図4B)。EasySep Human CD3−Positive Selection Kit(StemCell Techカタログ番号18051)を用いて、そのバルク集団(図4B)からCD3発現細胞を除去した。続いて、細胞に対して、CD3について磁気による陰性選択を2ラウンド行った。このプロセスにより、高精製のCD3陰性T細胞が得られた(図4C)。組み換えCD19−Fc試薬(CD19 CARと結合する)で染色したところ、編集された細胞では、CD19 CARの表面発現が見られるが、非編集細胞では見られないことが示された(図4D)。CD45及びB2Mを標的とするsgRNAの場合でも、同様の実験を行った。96時間後に、CD45及びB2Mの発現をフローサイトメトリーによって評価することによって、T細胞におけるCas9の編集活性を確認し、効率的なCas9機能は、FACSによって求めた場合の、T細胞表面でのCD45の発現の欠損によって示される。Cas9 mRNA及びCas9 RNPの共エレクトロポレーションによって、CD45座及びB2M座で大幅な編集が行われ、細胞の66.3%で、デュアル編集が見られた。
腫瘍におけるT細胞の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。プールCRISPRのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするsgRNAのプールを腫瘍特異的T細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のsgRNAが含まれるようにした。腫瘍試料において、特定の遺伝子がT細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、T細胞集団内の各sgRNAの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じsgRNAの頻度と比較した。腫瘍試料におけるT細胞集積を正に調節する遺伝子(例えば、T細胞の増殖性、生存能及び/または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子)を標的とするsgRNAの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるT細胞集積を負に調節する遺伝子(例えば、T細胞の増殖性、生存能及び/または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子)を標的とするsgRNAの頻度は、時間とともに低下すると予測される。
表12:標的遺伝子パーセンタイルスコア
CAR−T細胞腫瘍試料の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。ゲノムワイドなプールCRISPRのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするsgRNAのプールを腫瘍特異的ヒトCAR−T細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のsgRNAが含まれるようにした。特定の遺伝子が、腫瘍試料におけるCAR−T細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、CAR−T細胞集団内の各sgRNAの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じsgRNAの頻度と比較した。腫瘍試料におけるCAR−T細胞集積を正に調節する遺伝子(例えば、T細胞の増殖性、生存能及び/または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子)を標的とするsgRNAの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるCAR−T細胞集積を負に調節する遺伝子(例えば、T細胞の増殖性、生存能及び/または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子)を標的とするsgRNAの頻度は、時間とともに低下すると予測される。
表13:標的遺伝子パーセンタイルスコア
腫瘍の存在下で、CAR−T細胞の集積を調節する標的を特定するために、実験を行った。プールCRISPRのスクリーニングを行い、その際には、それぞれ単一の遺伝子を標的とするsgRNAのプールを腫瘍特異的ヒトCAR−T細胞集団に導入して、その集団内の各細胞に、単一の遺伝子を標的とする単一のsgRNAが含まれるようにした。特定の遺伝子が、腫瘍試料におけるCAR−T細胞の集積に及ぼす作用を明らかにするために、実験の開始時に、CAR−T細胞集団内の各sgRNAの頻度を求め、その実験の事後の時点における同じsgRNAの頻度と比較した。腫瘍試料におけるCAR−T細胞集積を正に調節する遺伝子(例えば、T細胞の増殖性、生存能及び/または腫瘍浸潤性を正に調節する遺伝子)を標的とするsgRNAの頻度は、時間とともに上昇すると予測されるが、腫瘍試料におけるCAR−T細胞集積を負に調節する遺伝子(例えば、T細胞の増殖性、生存能及び/または腫瘍浸潤性を負に調節する遺伝子)を標的とするsgRNAの頻度は、時間とともに低下すると予測される。
表14:標的遺伝子パーセンタイルスコア
マウスOT1/B16−Ova皮下腫瘍モデルにおいて、単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的T細胞において標的遺伝子を編集すると、抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例3〜5においてパーセンタイルスコアが0.6以上であった標的を選択した。
%TGI=(標的TV最終−標的TV初期)/(コントロールTV最終−コントロールTV初期)
式中、TVは、平均腫瘍体積であり、Cblb TGIにおける最終は、T細胞の移入から18日目であり、Zc3h12a、Nr4a3及びMap4k1における最終は、T細胞の移入から14日目であり、初期は、0日目(すなわちT細胞の移入日)である。
抗PD1療法と組み合わせたMap4k1編集細胞の作用を評価するために、さらなる実験を行った。Jackson labsから得た6〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスに、0.5×106個のB16−Ova腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ100mm3の体積に達したら、マウスを10頭からなる群に無作為に分け、編集マウスOT1 CD8+T細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、またはMap4k1遺伝子を編集する単一のガイドのいずれかによって編集した。NGS法を用いて、Map4k1遺伝子を標的とするgRNA/Cas9複合体の編集効率を求めたところ、82%であった。T細胞の移入時に、指定のコホートでは、2.5mg/kgの抗マウスPD1抗体(クローンRMP1−14、BioXcell)による処置も開始し、試験期間中、週に3回注射した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に2回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。14日目〜1日目におけるMap4k1群の平均腫瘍体積/14日目〜1日目におけるコントロール処置群の平均腫瘍体積(1日目は、編集マウスOT1 CD8+T細胞の移入日である)を用いて、腫瘍成長抑制率(TGI)を算出した。この実験の結果は、図8Aに示されている。
単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的T細胞において標的遺伝子を編集すると、大腸癌のマウスMC38gp100皮下同系腫瘍モデル(抗PD1抗体による治療に対して非感受性である)において抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例3〜5においてパーセンタイルスコアが0.6以上であった標的を選択した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
肺転移として顕在化する疾患を伴う侵襲性転移性B16−F10同系腫瘍モデルにおいてZc3h12aを編集する作用を評価するには、追加の実験を行う。
EG7−Ova皮下同系腫瘍モデルを用いて、マウスにおいて、Zc3h12aの抗腫瘍有効性をさらに評価した。Jackson labsから得た6〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスに、1×106個のEG7−Ova腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ100mm3の体積に達したら、マウスを10頭からなる群に無作為に分け、編集マウスOT1 CD8+ T細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、コントロールのガイド、またはZc3h12a遺伝子を編集する単一のガイドのいずれかによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に2回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。
%TGI=(標的TV最終−標的TV初期)/(コントロールTV最終−コントロールTV初期)
式中、TVは、平均腫瘍体積であり、最終TGIは、T細胞の移入から14日目であり、初期は、0日目(すなわちT細胞の移入日)である。
単一ガイドの形態でさらに評価を行って、腫瘍特異的T細胞において標的遺伝子を編集すると、A375異種移植腫瘍モデルにおいて、抗腫瘍有効性が向上するか判断するために、実施例3〜5においてパーセンタイルスコアが0.6以上であった標的を選択した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
Raji皮下細胞由来の異種移植腫瘍モデルを用いて、初代CD19 CAR−T細胞においてMAP4K1及びNR4A3を編集することの抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Raji細胞は、抗PD1抗体による治療に対して非感受性であることが知られているヒトリンパ腫細胞株である。
ダブルsgRNAライブラリーをレトロウイルス骨格で構築した。そのライブラリーは、単一のガイドRNA(ガイド+tracr、sgRNA)の発現をそれぞれ駆動する2つのU6プロモーター(1つのヒトU6プロモーター及び1つのマウスU6プロモーター)で構成させた。それらのガイドをプールとしてクローニングして、すべてのsgRNAそれぞれが、他のすべてのsgRNAそれぞれのと対になるように、ガイドをランダムに組み合わせた。最終的なダブルガイドライブラリーをPhoenix−Eco293T細胞にトランスフェクションして、マウスエコトロピックレトロウイルスを作製した。Cas9を発現するTCRトランスジェニックOT1細胞を、sgRNA発現ウイルスに感染させて、各sgRNAの標的となる2つの遺伝子座を編集した。続いて、400mm3超のB16−Ova腫瘍同種移植片を担持するマウスに、編集されたトランスジェニックT細胞を移入した。2週間後、その腫瘍を切り出し、その腫瘍を消化して、その腫瘍に存在するCD45+細胞を濃縮することによって、腫瘍浸潤T細胞を精製した。Qiagen QUIAamp DNA blood kitを用いて、ゲノムDNAをCD45+細胞から抽出し、レトロウイルス骨格配列に対応するプライマーを用いたPCRによって、レトロウイルスインサートをPCRによって回収した。続いて、得られたPCR産物をシーケンシングして、移入の2週間後に腫瘍に存在するsgRNAを特定した。最終単離細胞集団内のガイドペアの内容を、最初のプラスミド集団、及びマウスに注射する前の感染トランスジェニックT細胞集団と比較した。T細胞の適応性及び/または腫瘍浸潤性を向上させるsgRNAペアの頻度は、時間とともに上昇すると予測され、一方適応性を損なう組み合わせは、時間とともに減少すると予測された。下記の表15には、最終細胞集団におけるsgRNA頻度を、in vivo移入した最初の細胞集団におけるsgRNA頻度と比較した変化倍率の中央値が示されている。
表15:組み合わせのスクリーニングにおけるsgRNA頻度
異種移植腫瘍モデルにおいてT細胞の抗腫瘍有効性を向上させる編集遺伝子の組み合わせを求めるための併用試験で、標的をさらに評価した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
初代CD19 CAR−TをヒトCD8 T細胞から作製し、RNPの形態でCas9と複合化させたガイドRNAを用いたエレクトロポレーションによって、ネガティブコントロール遺伝子、BCOR、CBLB、またはBCOR及びCBLBの両方を編集した。CD19 CAR−TをRajiバーキットリンパ腫細胞と、in vitroにおいて、1:0、0.3:1、1:1、3:1及び10:1の比率で共培養した。24時間後、CAR−T細胞の総細胞数を求め、サイトカインの解析のために、上清を保存した。図15に示されているように、BCOR編集CART及びBCOR+CBLB編集CARTでは、集積性が、コントロールまたはCBLB編集CARTのいずれよりも30%高く、BCORを編集すると、腫瘍の存在下でCAR−T細胞が集積する能力が向上することが示された。さらに、CBLB編集CART及びCBLB+BCOR編集CARTでは、いずれのコントロール編集CARTと比べても、10倍以上のIL−2(図16)及びIFNγ(図17)が産生されたことから、CBLBの編集により、CAR−T細胞によるサイトカイン(T細胞の全体的な適応性及び機能的能力を向上させることが知られている)の産生が増大することが示された。CD8 T細胞は典型的にはIL−2を産生しないので、CD8 T細胞によるIL−2産生の増加は、驚くべきことである。これらのデータにより、いくつかのケースでは、エフェクター機能が増強されたCAR−T細胞の作製には、複数の遺伝子の編集が必要であることが示されている。例えば、この例では、腫瘍の存在下で集積が増大するとともに、サイトカインであるIL−2及びIFNγの産生が増加するCAR−T細胞の作製には、BCOR遺伝子及びCBLB遺伝子の両方の編集が必要であった。
マウスOT1/B16−Ova皮下同系腫瘍モデルにおいてT細胞の抗腫瘍有効性を向上させる編集遺伝子の組み合わせを求めるための併用試験で、標的をさらに評価した。本明細書には、例示的な標的の評価が記載されているが、これらの方法を用いて、上記の標的候補のうちのいずれも評価することができる。
%TGI=(標的TV最終−標的TV初期)/(コントロールTV最終−コントロールTV初期)×100
式中、TVは、平均腫瘍体積であり、最終は、T細胞の移入から7日目であり、初期は、0日目(すなわちT細胞の移入日)である。
MC38gp100皮下同系腫瘍モデルを用いて、Zc3h12a/Cblbデュアル編集型T細胞、Map4k1/Cblbデュアル編集型T細胞及びNr4a3/Cblbデュアル編集型T細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Jackson labsから得た6〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスに、1×106個のMC38gp100腫瘍細胞を皮下注射する。腫瘍が、およそ100mm3の体積に達したら、マウスを10頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスPMEL CD8+ T細胞を尾静脈から静脈内注射する。T細胞は、注射の前に、(i)コントロールのgRNA、(ii)PD1遺伝子を標的とする単一のgRNA、(iii)Zc3h12a遺伝子を標的とする単一のgRNA、(iv)Cblb遺伝子を標的とする単一のgRNA、(v)Map4k1遺伝子を標的とする単一のgRNA、(vi)Nr4a3遺伝子を標的とする単一のgRNA、(vii)Zc3h12a遺伝子及びCblb遺伝子の両方を標的とする2つのgRNA、(viii)Nr4a3遺伝子及びCblb遺伝子の両方を標的とする2つのgRNA、または(ix)Map4k1遺伝子及びCblb遺伝子の両方を標的とする2つのgRNAを含むgRNA/Cas9 RNP複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に2回測定する。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出する。下記の式に従って、平均腫瘍体積を用いて腫瘍成長抑制率(TGI)を算出する。
(標的TV最終−標的TV初期)/(コントロールTV最終−コントロールTV初期)
式中、TVは、平均腫瘍体積であり、最終は、T細胞の移入から21日目であり、初期は、0日目(すなわちT細胞の移入日)である。
肺転移として顕在化する疾患を伴う侵襲性転移性B16−F10同系腫瘍モデルを用いて、Zc3h12a/Cblbデュアル編集型T細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。簡潔に述べると、Jackson labsから得た6〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスに、0.5×106個のB16−F10腫瘍細胞を静脈内注射する。接種の前に、マウスの体重を測定し、無作為化手順を用いてマウスを処置群に割り当てる。腫瘍の接種から3日目に、マウスに、編集型マウスPMEL CD8+ T細胞を尾静脈から静脈内注射する。これらの細胞は、注射の前に、(i)コントロールのgRNA、(ii)Zc3h12a遺伝子を標的とする単一のgRNA、(iii)Cblb遺伝子を標的とする単一のgRNA、(iv)Map4k1遺伝子を標的とする単一のgRNA、(v)Nr4a3遺伝子を標的とする単一のgRNA、(vi)Map4k1遺伝子及びCblb遺伝子のそれぞれを標的とする2つのgRNA、(vii)Nr4a3遺伝子及びCblb遺伝子のそれぞれを標的とする2つのgRNA、または(viii)Zc3h12a遺伝子及びCblb遺伝子のそれぞれを標的とする2つのgRNAを含むgRNA/Cas9 RNP複合体をエレクトロポレーションすることによって編集する。NGS法を用いて、上記の遺伝子を標的とするgRNA/Cas9複合体の編集効率を評価する。体重を少なくとも週に2回モニタリングする。腫瘍の接種から15日目(編集型PMELの移入から12日目)に、マウス肺を10%パラホルムアルデヒドで灌流及び固定する。一晩固定後、肺をさらに保存するために70%EtOHに移す。肺においてがん細胞の黒色コロニーとして見られるB16−F10腫瘍量を目視で評価することによって、腫瘍有効性を評価する。
B16Ova皮下同系腫瘍モデルを用いて、PD−1/Lag3デュアル編集型T細胞の抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価した。Jackson labsから得た6〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスに、0.5×106個のB16Ova腫瘍細胞を皮下注射した。全コホートのマウスにおける腫瘍の平均体積がおよそ485mm3に達したら、マウスを10頭からなる群に無作為に分け、編集型マウスOT1 CD8+T細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、(1)非標的化型コントロールのgRNA、(2)PD1遺伝子を標的とする単一のgRNA、(3)Lag3遺伝子を標的とする単一のgRNA、(4)一方はPD1遺伝子を標的とし、もう一方はLag3遺伝子を標的とする2つのgRNAを含むgRNA/Cas9 RNP複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に2回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。下記の式を用いて、腫瘍成長抑制率(TGI)を算出した。
%TGI=(PD1/Lag3 TV最終)−PD1/Lag3 TV初期)/(コントロールTV最終−コントロールTV初期)
式中、TVは、平均腫瘍体積であり、最終は、10日目であり、初期は、編集型マウスOT1 CD8+T細胞の移入日である。
B16Ova皮下同系腫瘍モデルを用いて、Zc3h12、Map4k1及びNr4a3/Cblbの単一編集型腫瘍浸潤リンパ球(TIL)及びデュアル編集型TILの抗腫瘍有効性をマウスにおいて評価する。この実験では、ドナーコホートのCD45.1Pep Boyマウス(B6.SJL−PtprcaPepcb/BoyJ)及びレシピエントコホートのCD45.2 C57BL/6Jマウス(Jackson labs)という2つのマウスコホートを使用し、それぞれ、6〜8週齢の雌マウスで構成される。
%TGI=(標的TV最終−標的TV初期)/(コントロールTV最終−コントロールTV初期)
式中、TVは、平均腫瘍体積であり、最終は、17日目であり、初期は、編集TILの移入日である。
BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、ZC3H12A、MAP4K1及び/またはNR4A3の編集が、CAR T細胞及び人工TCRを発現するように操作したT細胞の抗腫瘍有効性に及ぼす作用を検証するために、実験を行う。表17に記載されている操作T細胞を、実施例1に記載されているようにして編集して、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、ZC3H12A、MAP4K1及び/またはNR4A3の発現を低下させる。続いて、示されている種類の細胞を用いて、皮下マウス異種移植モデルにおいて、これらの操作T細胞を評価する。例えば、CD19特異的なCARまたは人工TCRを有するように操作したT細胞は、実施例12で上記したように、Raji細胞モデルにおいて、または表16に示されている他の細胞株のうちのいずれかにおいて評価でき、MART1特異的なCARまたは人工TCRを有するように操作したT細胞は、SKMEL5、WM2664またはIGR1細胞モデルなどで評価できる。
表16:操作受容体の特異性及び標的細胞株
BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、ZC3H12A、MAP4K1及び/またはNR4A3の編集が、操作T細胞によるサイトカインの産生に及ぼす作用を検証するために、実験を行う。簡潔に述べると、上記の表16に記載されている操作T細胞をヒトCD8 T細胞から作製し、RNPの形態でCas9と複合化したガイドRNAを用いて、エレクトロポレーションによって、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3、GNAS、ZC3H12A、MAP4K1及び/またはNR4A3のうちの1つ以上を編集する。CAR−Tを、表18に示されている対応する細胞株とin vitroにおいて、1:0、0.3:1、1:1、3:1及び10:1の比率で共培養する。24時間後、操作T細胞の総細胞数を求め、サイトカインの解析のために上清を保存する。これらの実験の結果によって、コントロールの編集細胞と比べて、集積が増大し、編集CAR T細胞からのサイトカインの産生のレベルが上昇することが示されることが予測される。
編集TILは、TILを単離及び増殖するために、FDAから認可された臨床試験で以前用いられた確立済みのプロトコールに従って作製する。腫瘍組織を取り出した後、腫瘍を断片化して2mm3の切片にし、機械的/酵素的にホモジナイズし、最長で6週間、または細胞数が1×108個以上になるまで、6,000IU/mLの組み換えヒトIL−2で培養する(これをTIL作製の急速増殖前フェーズ(pre−REP)とする)。pre−REPの段階が完了したら、TILに、cGMPの条件下で、BCL2L11遺伝子、FLI1遺伝子、CALM2遺伝子、DHODH遺伝子、UMPS遺伝子、RBM39遺伝子、SEMA7A遺伝子、CHIC2遺伝子、PCBP1遺伝子、PBRM1遺伝子、WDR6遺伝子、E2F8遺伝子、SERPINA3遺伝子、GNAS遺伝子、ZC3H12A遺伝子、MAP4K1遺伝子及び/またはNR4A3遺伝子を標的とするgRNA/Cas9 RNP複合体をエレクトロポレーションする。細胞には、pre−REPプロセスの前またはその最中にエレクトロポレーションしてもよい。エレクトロポレーション後、1:100の比率のTIL及び照射フィーダー細胞で、50×106個の細胞を1LのG−Rex(商標)培養フラスコに、およそ2週間かけて移す。この作製部分は、急速増殖フェーズ(REP)とする。REPフェーズの後、TILを回収し、洗浄し、患者に即時注入するために溶液に懸濁させる。
再発性であるかまたは抗PD−1療法に対して抵抗性である転移性メラノーマの患者を、本明細書に記載されている改変細胞で処置する第1相、オープンラベル、単一施設試験を行う。患者に細胞を1回注入し、疾患の進行または療法不耐性が見られるまで、試験を続ける。試験への参加を中止する前に、現場の放射線科医が放射線学的PDを定める。
(a)7日前及び6日前:シクロホスファミド60mg/kg(静脈内)
(b)5日前〜1日前:フルダラビン25mg/m2(静脈内)
(c)1日目:細胞注入
(d)1日目〜15日目:IL−2(125,000IU/kg/日)、最大14回投与
B16−Ova皮下同系腫瘍モデルを用いて、T細胞におけるZc3h12aの阻害または欠失によって駆動される抗腫瘍記憶及びエピトープ拡大をマウスにおいて評価した。Jackson labsから得た6〜8週齢の雌のC57BL/6Jマウスに、0.5×106個のB16−Ova腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍が、およそ100mm3の体積に達したら、マウスを10頭からなる群に無作為に分け、編集マウスOT1 CD8+T細胞を尾静脈から静脈内注射した。これらの細胞は、注射の前に、(i)コントロールのgRNA、または(ii)Zc3h12a遺伝子を標的とする単一のgRNAを含むgRNA/Cas9 RNP複合体をエレクトロポレーションすることによって編集した。体重及び腫瘍体積を少なくとも週に2回測定した。腫瘍体積は、各処置群における平均及び平均の標準誤差として算出した。
解凍したドナーPBMCから初代ヒトT細胞を単離し、Immunocult+10ng/mLのIL−2中で一晩培養した。翌日、T細胞に、単一のガイドコントロール遺伝子またはMAP4K1に対するRNPをエレクトロポレーションした。遺伝子編集が行われるように培養液(Immunocult+10ng/mLのIL−2)中で4日経過後、活性化のために、細胞を24時間、Immunocult+CD3/28/2中で培養した。活性化してから24時間後、上清を回収し、分泌されたサイトカインのレベルをMesoScale Discovery(MSD)のプラットフォームによって測定した。図21に示されているように、MAP4K1編集T細胞では、IFNγ、IL−2及びTNFαの産生増加が見られた。ZC3H12a編集PBMC及びNR4A3編集PBMCのサイトカイン産生を評価するためには、同様の実験を行うことができる。
雌のOT1マウスまたはpMELマウスの膵臓を摘出し、実施例1に記載されているようにして、CD8 T細胞を単離した。実施例1に記載されている方法に従って、CD8 T細胞に、Cas9タンパク質、及びZc3h12aまたはコントロール遺伝子のいずれかを標的とするsgRNAを含むRNPをエレクトロポレーションした。複数のガイドにわたって、Zc3h12a編集効率を測定したところ、36〜69%であった。
追加の阻害機序によってZc3h12aの発現を改変することの作用を示すために、Zc3h12a mRNAを標的とするsiRNAを使用した。コントロール(カタログ番号:K−005000−G1−02)またはZc3h12aを標的とする(カタログ番号:E−052076−00−0005)自己送達Accell siRNAをメーカーの指示に従って調製した。抗CD3/抗CD28ビーズ(Dynabeads(商標)Mouse T−Activator CD3/CD28 for T−Cell Expansion and Activation、カタログ番号11456D)を用いて、10ng/mLの組み換えマウスIL−2(Biolegendカタログ番号575406)を添加した2.5%熱不活化FBS及び終濃度1μMの自己送達Accell siRNAを含むsiRNA送達培地(Dharmaconカタログ番号B−005000−500)において、精製マウスCD8 T細胞を活性化させた。72時間後、活性化ビーズを除去し、フローサイトメトリー、またはqRT−PCRによる遺伝子発現解析によって、表面のICOSの発現について細胞を評価した。
追加の阻害機序によってZc3h12aの発現を改変することの作用を示すために、ZFNの媒介によってZc3h12a遺伝子を編集した。
実施例1に記載されているように、マウスCD8 TILを単離し、Zc3h12aを標的とするgRNA/Cas9 RNPで編集した。Zc3h12a特異的sgRNAによって、Zc3h12aが86%阻害される。FACS解析により、Zc3h12aをsgRNAで阻害したところ、細胞表面でICOSの発現が2.7倍増加したことが確認された。RNA−seq解析により、Icos mRNAが有意に2.7倍増加したとともに(p=1.6×10−71)、Ifng mRNAの有意な増加(コントロールsgRNAに対して9.3倍、p=0)及びGzma mRNAの有意な増加(コントロールのsgRNAに対して1.2倍、p=6.3×10−6)が見られたことが確認されたことから、マウスTILにおけるZc3h12aの編集により、T細胞が活性化することが確認された。
Zc3h12aの遺伝子不活化が、マウスCD8 T細胞の機能及び炎症性表現型に及ぼす作用を評価した。実施例30に記載されている方法を用いて、マウスOT−I CD8 T細胞を活性化させ、3つの異なるレトロウイルス上清のうちの1つに感染させた。レトロウイルスは、1)嗅覚受容体遺伝子を標的とするsgRNA(ネガティブコントロール)、2)Zc3h12aを標的とするsgRNA(Zc3h12a編集条件)、または3)Zc3h12a及びZc3h12aのタンパク質産物をコードする遺伝子を標的とするsgRNA、(Zc3h12a編集WT ZC3H12Aレスキュー条件)のいずれかをコードするものであった。選択後、トランスダクション率は、いずれの場合にも91%を超えており、次世代シーケンシングによって、ゲノム編集率が、いずれの場合にも80%を超えていたことが確認された。
ZC3H12Aの不活化が、初代ヒトT細胞に及ぼす作用を判断するために、ゲノム編集型ヒトT細胞によるIL6 mRNA転写産物及びIL−6タンパク質の産生を評価した。簡潔に述べると、初代ヒトT細胞を末梢血単核球(PBMC)から単離し、実施例1に概説されているような方法に従って、ZC3H12AまたはOR1A2の遺伝子座のいずれかを標的とするRNPを用いて、ゲノム編集を行った。編集効率は、次世代シーケンシングによって求めたところ、30〜72%の範囲であった。
CRISPR−Cas9タイリングスクリーニングを行って、ZC3H12A遺伝子にまたがる標的座位内の阻害剤標的位置の候補を定めた。実施例1に記載されているようにして、初代ヒトCD8+ T細胞を単離し、完全長のZC3H12A遺伝子にわたるゲノム位置を標的とするように設計したsgRNAを発現するレンチウイルスライブラリーをトランスダクションした。レンチウイルスライブラリーのトランスダクションから2日後に、トランスダクションしたCD8+細胞に、Cas9 mRNAをエレクトロポレーションし、さらに10日間、培養した。Cas9 mRNAのエレクトロポレーション後に培養してから10日後、下記のようにスクリーニングを行った。追加のアッセイを行って、タイリングスクリーンで特定されたgRNAを検証した。ZC3H12Aを標的とする別個のgRNAを437個、下記のパラメーターに従ってアッセイした。
増殖のリードアウト:Cas9 mRNAのエレクトロポレーションから10日目に、第1のアームの細胞を回収した。DNAを抽出し、そのライブラリーにおける各種sgRNAの認識部位にまたがるアンプリコンをPCRによって増幅し、次世代シーケンシング(NGS)によってシーケンシングした。最終カウント数を参照カウント数で除したもののlog比によって、その各sgRNAの濃縮または枯渇を求めた。
追加のアッセイを開発して、上記のタイリングスクリーンで特定されたgRNAの有効性及びオンターゲット活性をさらに特徴付けた。細胞を単離し、タイリングスクリーンで特定されたZC3H12A特異的gRNAを含むCas9:gRNA RNPをエレクトロポレーションした。細胞をおよそ10日間培養し、10日の時点に、下記のアッセイを行った。
表5A:ヒトゲノム座標
Claims (283)
- (a)BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群、(b)ZC3H12A、(c)MAP4K1、または(d)NR4A3から選択した1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、
前記1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、前記免疫エフェクター細胞のエフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。 - 前記遺伝子調節システムが、(a)BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群、(b)ZC3H12A、(c)MAP4K1、または(d)NR4A3から選択した内在性標的遺伝子のうちの2つ以上の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項1に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる遺伝子調節システムを含む改変免疫エフェクター細胞であって、前記1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した内在性標的遺伝子のうちの2つ以上の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項3に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2からなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項4に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムがさらに、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択した1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項1または請求項2に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択した少なくとも1つの内在性標的遺伝子、ならびにIKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した少なくとも1つの内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項6に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、ZC3H12A、ならびにIKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した少なくとも1つの内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項6に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、ZC3H12A及びCBLBの発現及び/または機能を低下させることができる、請求項8に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、ZC3H12A及びBCORの発現及び/または機能を低下させることができる、請求項8に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、ZC3H12A及びTNFAIP3の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項8に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、MAP4K1、ならびにIKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した少なくとも1つの内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項6に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、MAP4K1及びCBLBの発現及び/または機能を低下させることができる、請求項12に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、MAP4K1及びBCORの発現及び/または機能を低下させることができる、請求項12に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、MAP4K1及びTNFAPI3の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項12に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、NR4A3、ならびにIKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した少なくとも1つの内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項6に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、NR4A3及びCBLBの発現及び/または機能を低下させることができる、請求項16に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、NR4A3及びBCORの発現及び/または機能を低下させることができる、請求項16に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、NR4A3及びTNFAPI3の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項16に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、(i)1つ以上の核酸分子、(ii)1つ以上の酵素タンパク質または(iii)1つ以上のガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、請求項1〜19のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の核酸分子が、siRNA、shRNA、マイクロRNA(miR)、アンタゴmiRまたはアンチセンスRNAから選択されている、請求項20に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、siRNA核酸分子またはshRNA核酸分子を含む、請求項20に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項22に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記siRNAまたはshRNAが、配列番号154〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項23に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項22に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記siRNAまたはshRNAが、配列番号814〜1064からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項25に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、ZC3H12Aであり、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項22に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記siRNAまたはshRNAが、配列番号1065〜1509からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項27に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、MAP4K1であり、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項22に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記siRNAまたはshRNAが、配列番号510〜1538からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項29に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、NR4A3であり、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6G及び表6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項22に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記siRNAまたはshRNAが、配列番号1539〜1566からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項31に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、複数のsiRNA分子またはshRNA分子を含むとともに、2つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項20に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項34に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項34または35に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、ZC3H12Aからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項38に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項39に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、ZC3H12Aからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、MAP4K1であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項42に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項42または請求項43に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、MAP4K1であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、NR4A3であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6G及び表6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項46に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項46または請求項47に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、NR4A3であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項33に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質が、前記内在性遺伝子のうちの1つ以上における標的配列に特異的に結合するように操作されている、請求項20に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記タンパク質が、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼまたはメガヌクレアーゼである、請求項50に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子が、ガイドRNA(gRNA)分子であり、前記酵素タンパク質が、Casタンパク質またはCasオルソログである、請求項20に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、前記gRNA分子が、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項52に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号154〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項53に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号154〜813からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項53に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記gRNA分子が、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項52に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号814〜1064からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項56に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号814〜1064からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項56に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、ZC3H12Aからなる群から選択されており、前記gRNA分子が、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項52に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号1065〜1509からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項59に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、MAP4K1であり、前記gRNA分子が、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項52に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号510〜1538からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項61に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号510〜1538からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項61に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、NR4A3であり、前記gRNA分子が、表6G及び6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項52に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号1539〜1566からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項64に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記gRNA分子が、配列番号1539〜1566からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項64に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、複数のgRNA分子を含むとともに、2つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる、請求項52に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCB1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項68に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項69に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項69に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、ZC3H12Aからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項73に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項74に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択した標的DNA配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択した標的DNA配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項74に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、ZC3H12Aであり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、MAP4K1であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項78に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項79に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項79に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、MAP4K1であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、NR4A3であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6G及び表6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される核酸配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項83に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項84に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜813からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項84に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、NR4A3であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、TNFAIP3、CBLB及びBCORからなる群から選択されている、請求項67に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- a.前記Casタンパク質が、酵素活性ドメインを2つ含むとともに、二本鎖DNA切断を誘導することができる野生型Casタンパク質であるか、
b.前記Casタンパク質が、酵素活性ドメインを1つ含むとともに、一本鎖DNA切断を誘導することができるCasニッカーゼ変異体であるか、または
c.前記Casタンパク質が、不活性型Casタンパク質(dCas)であり、前記1つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している、
請求項52〜87のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。 - 前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、請求項52〜88のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記異種タンパク質が、MAX相互作用タンパク質1(MXI1)、Kruppel関連ボックス(KRAB)ドメイン、メチル−CpG結合タンパク質2(MECP2)及びmSin3 4連結ドメイン(SID4X)からなる群から選択されている、請求項88に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、前記1つ以上の内在性標的遺伝子に不活性化変異を導入する、請求項50〜90のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記不活性化変異が、前記2つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の1つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、請求項91に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記欠失が、前記2つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、請求項92に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、請求項92に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記不活性化変異が、前記2つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させる、請求項91〜94のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入されている、請求項1〜95のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記遺伝子調節システムが、前記システムの1つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド、タンパク質またはリボ核タンパク質(RNP)複合体として導入されている、請求項96に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、前記1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
- (a)IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2からなる群、または(b)CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。 - (a)BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群、(b)ZC3H12A、(c)MAP4K1、または(d)NR4A3から選択した1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、
前記1つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。 - IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択した2つ以上の標的遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、前記2つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
- CBLB及びBCORの発現及び/または機能が低下された、請求項101に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、前記2つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、ZC3H12Aであり、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、前記2つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
- ZC3H12A及びCBLBの発現及び/または機能が低下された、請求項104に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- ZC3H12A及びBCORの発現及び/または機能が低下された、請求項104に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- ZC3H12A及びTNFAIP3の発現及び/または機能が低下された、請求項104に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、MAP4K1であり、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、前記2つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
- MAP4K1及びCBLBの発現及び/または機能が低下された、請求項108に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- MAP4K1及びBCORの発現及び/または機能が低下された、請求項108に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- MAP4K1及びTNFAIP3の発現及び/または機能が低下された、請求項108に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子の発現及び/または機能が低下された改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、NR4A3であり、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、前記2つ以上の内在性遺伝子の発現及び/または機能の低下によって、エフェクター機能が増強される、前記改変免疫エフェクター細胞。
- NR4A3及びCBLBの発現及び/または機能が低下された、請求項112に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- NR4A3及びBCORの発現及び/または機能が低下された、請求項112に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- NR4A3及びTNFAIP3の発現及び/または機能が低下された、請求項112に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した1つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
- (a)IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2からなる群、または(b)CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した1つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
- (a)BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群、(b)ZC3H12A、(c)MAP4K1、または(d)NR4A3から選択した1つ以上の内在性遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
- IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択した2つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞。
- 前記CBLB遺伝子及びBCOR遺伝子に不活性化変異を含む、請求項119に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、ZC3H12Aであり、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
- 前記ZC3H12A遺伝子及びCBLB遺伝子に不活性化変異を含む、請求項122に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記ZC3H12A遺伝子及びBCOR遺伝子に不活性化変異を含む、請求項122に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記ZC3H12A遺伝子及びTNFAIP3遺伝子に不活性化変異を含む、請求項122に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、MAP4K1であり、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
- 前記MAP4K1遺伝子及びCBLB遺伝子に不活性化変異を含む、請求項126に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記MAP4K1遺伝子及びBCOR遺伝子に不活性化変異を含む、請求項126に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記MAP4K1遺伝子及びTNFAIP3遺伝子に不活性化変異を含む、請求項126に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 2つ以上の標的遺伝子に不活性化変異を含む改変免疫エフェクター細胞であって、少なくとも1つの標的遺伝子が、NR4A3であり、少なくとも1つの標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、前記改変免疫エフェクター細胞。
- 前記NR4A3遺伝子及びCBLB遺伝子に不活性化変異を含む、請求項130に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記NR4A3遺伝子及びBCOR遺伝子に不活性化変異を含む、請求項130に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記NR4A3遺伝子及びTNFAIP3遺伝子に不活性化変異を含む、請求項130に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記不活性化変異が、前記2つ以上の内在性遺伝子のゲノム配列内の1つ以上のヌクレオチドの欠失、置換または挿入を含む、請求項116〜133のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記欠失が、前記2つ以上の内在性標的遺伝子の部分欠失または完全欠失である、請求項134に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記不活性化変異が、フレームシフト変異である、請求項134に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記不活性化変異によって、前記2つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能が低下する、請求項116〜136のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子の発現が、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%低下する、請求項1〜137のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子の機能が、非改変免疫エフェクター細胞またはコントロールの免疫エフェクター細胞と比べて、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%低下する、請求項1〜137のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 細胞表面に提示された操作免疫受容体をさらに含む、請求項1〜139のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記操作免疫受容体が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARである、請求項140に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記操作免疫受容体が、操作TCRである、請求項140に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記操作免疫受容体が、標的細胞上に発現する抗原に特異的に結合し、前記抗原が、腫瘍関連抗原である、請求項140〜142のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 免疫活性化分子を発現する外来性導入遺伝子をさらに含む、請求項1〜143のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記免疫活性化分子が、サイトカイン、ケモカイン、共刺激分子、活性化ペプチド、抗体またはその抗原結合断片からなる群から選択されている、請求項144に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記抗体またはその結合断片が、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4またはPDCD1によってコードされるタンパク質に特異的に結合し、前記タンパク質の機能を阻害する、請求項145に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記免疫エフェクター細胞が、T細胞、ナチュラルキラー(NK)細胞、NKT細胞から選択したリンパ球である、請求項1〜146のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記リンパ球が、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)である、請求項147に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 前記エフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、腫瘍への浸潤性、細胞傷害性、抗腫瘍免疫応答性及び/または疲弊耐性から選択されている、請求項1〜148のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞。
- 請求項1〜149のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞を含む組成物。
- 薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含む、請求項150に記載の組成物。
- 少なくとも1×104個、1×105個、1×106個、1×107個、1×108個、1×109個、1×1010個または1×1011個の改変免疫エフェクター細胞を含む、請求項150または151に記載の組成物。
- 前記組成物が必要な対象に投与するのに適する、請求項150〜152のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が必要な前記対象に由来する自己免疫エフェクター細胞を含む、請求項150〜153のいずれか1項に記載の組成物。
- ドナー対象に由来する同種異系免疫エフェクター細胞を含む、請求項150〜153のいずれか1項に記載の組成物。
- (a)IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2からなる群、または(b)CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択した、細胞内の1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
(i)核酸分子、(ii)酵素分子、または(iii)ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。 - (a)BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群、(b)ZC3H12A、(c)MAP4K1、または(d)NR4A3から選択した、細胞内の1つ以上の内在性標的遺伝子の発現を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
(i)核酸分子、(ii)酵素分子、または(iii)ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。 - ガイドRNA(gRNA)核酸分子及びCasエンドヌクレアーゼを含む、請求項156または請求項157に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2から選択されているか、またはCBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択されており、前記gRNA分子が、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項158に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2から選択されており、前記gRNA分子が、配列番号154〜498からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項159に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号154〜498からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項159または請求項160に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択されており、前記gRNA分子が、配列番号499〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項159に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号499〜813からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項159または請求項162に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASから選択されており、前記gRNA分子が、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項158に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号814〜1064からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項164に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号814〜1064からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項164または請求項165に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、ZC3H12Aであり、前記gRNA分子が、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項158に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号1065〜1509からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項167に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号1065〜1509からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項167または請求項168に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号1065〜1509からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項169に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、MAP4K1を含み、前記gRNA分子が、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項158に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号510〜1538からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項171に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号510〜1538からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項171または請求項172に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、NR4A3を含み、前記gRNA分子が、表6G及び表6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項158に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号1539〜1566からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項174に記載の遺伝子調節システム。
- 前記gRNA分子が、配列番号1539〜1566からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項174または請求項175に記載の遺伝子調節システム。
- siRNA核酸分子またはshRNA核酸分子を含む、請求項156または請求項157に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2から選択されているか、またはCBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択されており、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項177に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2から選択されており、前記siRNA分子またはshRNA分子が、配列番号154〜498から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項178に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択されており、前記siRNA分子またはshRNA分子が、配列番号499〜813から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項178に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASから選択されており、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項177に記載の遺伝子調節システム。
- 前記siRNA分子またはshRNA分子が、配列番号814〜1064から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項181に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、ZC3H12Aであり、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項177に記載の遺伝子調節システム。
- 前記siRNA分子またはshRNA分子が、配列番号1065〜1509から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項183に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、MAP4K1を含み、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項177に記載の遺伝子調節システム。
- 前記siRNA分子またはshRNA分子が、配列番号510〜1538から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項185に記載の遺伝子調節システム。
- 前記1つ以上の内在性標的遺伝子が、NR4A3を含み、前記siRNA分子またはshRNA分子が、表6G及び表6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項177に記載の遺伝子調節システム。
- 前記siRNA分子またはshRNA分子が、配列番号1539〜1566から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項187に記載の遺伝子調節システム。
- 細胞内の2つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能を低下させることができる遺伝子調節システムであって、
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、(a)BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群、(b)ZC3H12A、(c)MAP4K1、または(d)NR4A3から選択されており、
前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、(e)IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2からなる群、または(f)CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、
前記システムが、(i)核酸分子、(ii)酵素分子、または(iii)ガイド核酸分子及び酵素タンパク質を含む、前記システム。 - 複数のガイドRNA(gRNA)核酸分子及びCasエンドヌクレアーゼを含む、請求項189に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項190に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合し、前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合する、請求項191に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項191または請求項192に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項191または請求項192に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、ZC3H12Aであり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項190に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合し、前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合する、請求項195に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項195または請求項196に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項195または請求項196に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項195または請求項196に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項195または請求項196に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、MAP4K1であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項190に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合し、前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合する、請求項201に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項201または請求項202に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項201または請求項202に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項201または請求項202に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項201または請求項202に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、NR4A3であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項190に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表6G及び表6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合し、前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義される標的DNA配列に結合する、請求項207に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項207または請求項208に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項207または請求項208に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項207または請求項208に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、前記複数のgRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項207または請求項208に記載の遺伝子調節システム。
- 前記Casタンパク質が、
a.酵素活性ドメインを2つ含み、二本鎖DNA切断を誘導することができる野生型Casタンパク質、
b.酵素活性ドメインを1つ含み、一本鎖DNA切断を誘導することができるCasニッカーゼ変異体、
c.前記1つ以上の内在性標的遺伝子の発現を調節することができる異種タンパク質と結合している不活性型Casタンパク質(dCas)である、
請求項156〜212のいずれか1項に記載の遺伝子調節システム。 - 前記異種タンパク質が、MAX相互作用タンパク質1(MXI1)、Kruppel関連ボックス(KRAB)ドメイン及びmSin3 4連結ドメイン(SID4X)からなる群から選択されている、請求項213に記載の遺伝子調節システム。
- 前記Casタンパク質が、Cas9タンパク質である、請求項213または請求項214に記載の遺伝子調節システム。
- 前記システムが、核酸分子を含み、前記核酸分子が、siRNA、shRNA、マイクロRNA(miR)、アンタゴmiRまたはアンチセンスRNAである、請求項189に記載の遺伝子調節システム。
- 複数のshRNA分子またはsiRNA分子を含む、請求項216に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項217に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6A及び表6Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項218に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項218または請求項219に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、ZC3H12Aであり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項217に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6C及び表6Dに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項221に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項221または請求項222に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1065〜1509からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項221または請求項222に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、MAP4K1であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項217に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6E及び表6Fに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項225に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項225または請求項226に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号510〜1538からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項225または請求項226に記載の遺伝子調節システム。
- 前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、NR4A3であり、前記内在性標的遺伝子のうちの少なくとも1つが、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6、IKZF2、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されている、請求項217に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表6G及び表6Hに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、表5A及び表5Bに示されている一連のゲノム座標によって定義されるDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項229に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項229または230に記載の遺伝子調節システム。
- 前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号1539〜1566からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含み、前記複数のsiRNA分子またはshRNA分子のうちの少なくとも1つが、配列番号499〜524からなる群から選択したDNA配列によってコードされるRNA配列に結合する約19〜30個のヌクレオチドを含む、請求項229または230に記載の遺伝子調節システム。
- 前記システムが、DNA結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含み、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及び転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)から選択されている、請求項156、157または189に記載の遺伝子調節システム。
- 1つ以上のgRNAをコードするベクター、及びCasエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、前記1つ以上のgRNAが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538、配列番号1539〜1566、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
- 複数のgRNAをコードするベクター、及びCasエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするベクターを含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538または配列番号1539〜1566から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。 - 1つ以上のgRNAをコードするベクター、及びCasエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするmRNA分子を含む遺伝子調節システムであって、前記1つ以上のgRNAが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538、配列番号1539〜1566、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。
- 複数のgRNAをコードするベクター、及びCasエンドヌクレアーゼタンパク質をコードするmRNA分子を含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538または配列番号1539〜1566から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、前記遺伝子調節システム。 - 1つ以上のgRNA及びCasエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、
前記1つ以上のgRNAが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538、配列番号1539〜1566、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記1つ以上のgRNAと、前記Casエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質(RNP)複合体を形成する、前記遺伝子調節システム。 - 複数のgRNA及びCasエンドヌクレアーゼタンパク質を含む遺伝子調節システムであって、
前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538または配列番号1539〜1566から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記複数のgRNAのうちの少なくとも1つが、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した核酸配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含み、
前記1つ以上のgRNAと、前記Casエンドヌクレアーゼタンパク質が複合化して、リボ核タンパク質(RNP)複合体を形成する、前記遺伝子調節システム。 - 請求項156〜239のいずれか1項に記載の遺伝子調節システムを含むキット。
- (a)BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群、(b)ZC3H12A、(c)MAP4K1、(d)NR4A3、(e)IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2、または(f)CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORから選択した内在性標的遺伝子内の標的配列に結合するターゲティングドメイン核酸配列を含むgRNA核酸分子。
- a.前記内在性遺伝子が、BCL2L11、FLI1、CALM2、DHODH、UMPS、RBM39、SEMA7A、CHIC2、PCBP1、PBRM1、WDR6、E2F8、SERPINA3及びGNASからなる群から選択されており、前記gRNAが、表6A及び6Bに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
b.前記内在性遺伝子が、ZC3H12Aであり、前記gRNAが、表6C及び表6Dに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
c.前記内在性遺伝子が、MAP4K1であり、前記gRNAが、表6E及び表6Fに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
d.前記内在性遺伝子が、NR4A3であり、前記gRNAが、表6G及び表6Hに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、
e.前記内在性遺伝子が、IKZF1、IKZF3、GATA3、BCL3、TNIP1、TNFAIP3、NFKBIA、SMAD2、TGFBR1、TGFBR2、TANK、FOXP3、RC3H1、TRAF6及びIKZF2からなる群から選択されており、前記gRNAが、表5A及び表5Bに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含むか、または
f.前記内在性遺伝子が、CBLB、PPP2R2D、NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4、PTPN6、PDCD1及びBCORからなる群から選択されており、前記gRNAが、表5A及び表5Bに示されているゲノム座標から選択したゲノム座標に位置する標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、
請求項241〜247のいずれか1項に記載のgRNA分子。 - 前記gRNAが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538、配列番号1539〜1566、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した標的DNA配列に結合するターゲティングドメイン配列を含む、請求項241〜247のいずれか1項に記載のgRNA分子。
- 前記gRNAが、配列番号814〜1064、配列番号1065〜1509、配列番号510〜1538、配列番号1539〜1566、配列番号154〜498または配列番号499〜813から選択した配列によってコードされるターゲティングドメイン配列を含む、請求項241〜247のいずれか1項に記載のgRNA分子。
- 前記標的配列が、PAM配列を含む、請求項241〜244のいずれか1項に記載のgRNA分子。
- 前記gRNAが、モジュラーgRNA分子である、請求項241〜245のいずれか1項に記載のgRNA分子。
- 前記gRNAが、デュアルgRNA分子である、請求項241〜245のいずれか1項に記載のgRNA分子。
- 前記ターゲティングドメインが、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、21ヌクレオチド長、22ヌクレオチド長、23ヌクレオチド長、24ヌクレオチド長、25ヌクレオチド長、26ヌクレオチド長またはそれを上回るヌクレオチド長である、請求項241〜247のいずれか1項に記載のgRNA分子。
- その5’末端もしくはその5’末端近傍(例えば、その5’末端から1〜10ヌクレオチド、1〜5ヌクレオチドもしくは1〜2ヌクレオチド以内)の改変、及び/またはその3’末端もしくはその3’末端近傍(例えば、その3’末端から1〜10ヌクレオチド、1〜5ヌクレオチドもしくは1〜2ヌクレオチド以内)の改変を含む、請求項241〜248のいずれか1項に記載のgRNA分子。
- 前記改変gRNAをT細胞に導入すると、ヌクレアーゼに対する安定性が向上する、請求項249に記載のgRNA分子。
- 前記改変gRNAをT細胞に導入すると、自然免疫応答が軽減される、請求項249または請求項250に記載のgRNA分子。
- 請求項241〜251のいずれか1項に記載のgRNA分子をコードするポリヌクレオチド分子。
- 請求項241〜251のいずれか1項に記載の1つ以上のgRNA分子、または請求項252に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。
- 請求項241〜251のいずれか1項に記載のgRNA分子、または請求項252に記載のポリヌクレオチドを含むキット。
- 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
a.免疫エフェクター細胞を対象から採取すること、
b.請求項156〜239のいずれか1項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入すること、ならびに
c.前記免疫エフェクター細胞を培養して、1つ以上の内在性標的遺伝子の発現及び/または機能が、改変していない免疫エフェクター細胞と比べて低下するようにすること、
を含む、前記方法。 - 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、請求項156〜239のいずれか1項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含む、前記方法。
- CAR及びTCRから選択した操作免疫受容体をコードするポリヌクレオチド配列を導入することをさらに含む、請求項255または256に記載の方法。
- 前記遺伝子調節システム及び/または前記操作免疫受容体をコードする前記ポリヌクレオチドを、前記免疫エフェクター細胞に、トランスフェクション、トランスダクション、エレクトロポレーションまたはマイクロフルイディクスデバイスによる細胞膜の物理的破壊によって導入する、請求項257に記載の方法。
- 前記遺伝子調節システムの1つ以上の構成成分をコードするポリヌクレオチド配列として、タンパク質として、またはリボ核タンパク質(RNP)複合体として、前記システムを導入する、請求項255〜258のいずれか1項に記載の方法。
- 改変免疫エフェクター細胞の作製方法であって、
a.免疫エフェクター細胞集団を培養液で増殖させること、
b.請求項156〜239のいずれか1項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入すること、
を含む、前記方法。 - 前記免疫エフェクター細胞集団を対象から採取することをさらに含む、請求項260に記載の方法。
- 増殖前、増殖中または増殖後に、前記遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項260または請求項261に記載の方法。
- 前記免疫エフェクター細胞集団の前記増殖が、第1ラウンドの増殖及び第2ラウンドの増殖を含む、請求項260または請求項261に記載の方法。
- 前記遺伝子調節システムを、前記第1ラウンドの増殖前、前記第1ラウンドの増殖中、または前記第1ラウンドの増殖後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項263に記載の方法。
- 前記遺伝子調節システムを、前記第2ラウンドの増殖前、前記第2ラウンドの増殖中、または前記第2ラウンドの増殖後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項263に記載の方法。
- 前記遺伝子調節システムを、前記第1ラウンド及び前記第2ラウンドの増殖の前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項263に記載の方法。
- 前記遺伝子調節システムを、前記第1ラウンド及び前記第2ラウンドの増殖の後に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項263に記載の方法。
- 前記遺伝子調節システムを、前記第1ラウンドの増殖後、かつ前記第2ラウンドの増殖前に、前記免疫エフェクター細胞集団に導入する、請求項263に記載の方法。
- 治療の必要な対象の疾患または障害の治療方法であって、請求項1〜149のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または請求項150〜155のいずれか1項に記載の組成物を有効量投与することを含む、前記方法。
- 前記疾患または障害が、細胞増殖性障害、炎症性障害または感染症である、請求項269に記載の方法。
- 前記疾患または障害が、がんまたはウイルス感染症である、請求項269に記載の方法。
- 前記がんが、白血病、リンパ腫または固形腫瘍から選択される、請求項271に記載の方法。
- 前記固形腫瘍が、メラノーマ、膵臓腫瘍、膀胱腫瘍、肺腫瘍もしくは肺転移、大腸癌または頭頸部癌である、請求項272に記載の方法。
- 前記がんが、PD1耐性またはPD1非感受性のがんである、請求項271〜273のいずれか1項に記載の方法。
- 前記対象が以前に、PD1阻害剤またはPDL1阻害剤による治療を受けたことがある、請求項271〜274のいずれか1項に記載の方法。
- NRP1、HAVCR2、LAG3、TIGIT、CTLA4またはPDCD1によってコードされるタンパク質に特異的に結合して、そのタンパク質の機能を阻害する抗体またはその結合断片を前記対象に投与することをさらに含む、請求項271〜275のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して自家である、請求項269〜276のいずれか1項に記載の方法。
- 前記改変免疫エフェクター細胞が、前記対象に対して同種異系である、請求項269〜276のいずれか1項に記載の方法。
- がん細胞の殺傷方法であって、請求項1〜149のいずれか1項に記載の改変免疫エフェクター細胞、または請求項150〜155のいずれか1項に記載の組成物に、前記がん細胞を暴露することを含む、前記方法。
- 前記暴露が、in vitro、in vivoまたはex vivoでの暴露である、請求項279に記載の方法。
- 免疫エフェクター細胞の1つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、請求項156〜239のいずれか1項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含む、前記方法。
- 免疫エフェクター細胞の1つ以上のエフェクター機能の増強方法であって、請求項156〜239のいずれか1項に記載の遺伝子調節システムを前記免疫エフェクター細胞に導入することを含み、前記改変された免疫エフェクター細胞において、1つ以上のエフェクター機能が、改変しなかった前記免疫エフェクター細胞と比べて増強される、前記方法。
- 前記1つ以上のエフェクター機能が、細胞増殖性、細胞生存能、細胞傷害性、腫瘍への浸潤性、サイトカイン産生の増加、抗腫瘍免疫応答性及び/または疲弊耐性から選択される、請求項282に記載の方法。
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