CN116103240A

CN116103240A - 增强免疫细胞持久性的方法

Info

Publication number: CN116103240A
Application number: CN202210693515.9A
Authority: CN
Inventors: 彭敏; 王丽霞; 金刚; 张光跃
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2021-11-10
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2023-05-12
Also published as: WO2023082640A1

Abstract

本发明提供一种重组免疫细胞及其制备方法、基因调控系统和用途。通过降低或清除BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或其生物学功能，增强了重组免疫细胞的持久性。在一些实施方案中，本发明通过基因编辑获得ZC3H12A和BCOR双基因敲除的CAR‑T细胞，其在体内能够长期存在，解决了CAR‑T治疗长效性的技术问题。在一些实施方案中，经过基因编辑的CAR‑T细胞在体内长期存在并能持续性分泌治疗性生物分子，达到单次给药长期有效的目的。

Description

增强免疫细胞持久性的方法

技术领域

本发明属于细胞技术领域，涉及同时敲除ZC3H12A和BCOR基因的重组免疫细胞及其制备方法、基因调控系统和用途。具体涉及一种增强T细胞持久性和在体内稳定植入且具有分泌功能的T细胞及其制备方法、基因调控系统和用途。

背景技术

细胞过继治疗(Adoptive cell transfer therapy)包括嵌合抗原受体 (CAR)-T和T细胞受体(TCR)-T等，在肿瘤的免疫治疗中具有非常显著的效果，尤其是对于淋巴细胞白血病。

目前CAR-T疗法有两个缺陷：一方面，CAR-T细胞在回输之前需要对患者进行化疗预处理，否则输入的CAR-T细胞不能有效扩增，但该化疗过程具有很大的毒副作用；另一方面，回输的CAR-T细胞在体内的持续时间有限，很多患者会因此复发。在细胞过继治疗中，如何提高重组免疫细胞的持久性是急需解决的技术问题。

人BCOR基因(Gene ID:54880，2022年5月29日更新， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/54880)和鼠Bcor基因(Gene ID: 71458，2022年5月22日更新， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/71458)编码细胞中转录抑制因子 BCOR。人ZC3H12A基因(Gene ID:80149，2022年5月22日更新， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/80149)和鼠Zc3h12a基因(Gene ID: 230738，2022年5月22日更新， https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/230738)编码细胞中参与mRNA降解的蛋白质ZC3H12A。以上基因通过引用的方式全部并入到本发明中。

CN113151178A公开了一种敲除Rc3h1基因和/或Zc3h12a基因的重组T细胞及其应用，敲除Rc3h1和/或Zc3h12a的T细胞在体内持续时间均不超过1个月，治疗效果不佳，需要反复输入重组T细胞。 WO2020163365A2公开了一种降低选自SOCS1、PTPN2和ZC3H12A 的至少两种内源靶基因的表达和/或功能的重组T细胞。目前，尚无使用同时靶向Bcor基因和Zc3h12a基因的重组免疫细胞用于疾病治疗或作为载体的现有技术。

发明内容

本发明发现，单独降低、清除BCOR基因或ZC3H12A基因不能赋予重组免疫细胞持久性或类永生化特性。基于该发现，本发明提供一种重组免疫细胞及其制备方法、基因调控系统和用途。通过降低或清除BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或其生物学功能，增强了本发明重组免疫细胞的持久性，赋予重组免疫细胞极强的干性 (stemness)或类永生(Immortal-like and Functional)特性。

本发明的一个目的是提供一种重组免疫细胞，其BCOR基因和 ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除。

本发明的另一个目的是提供一种制备本发明所述重组免疫细胞的方法，包括采用基因敲除技术、基因沉默技术或失活突变技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因。

本发明的另一个目的是提供一种基因调控系统，用于本发明重组免疫细胞的制备。

本发明的另一个目的是提供一种包含本发明所述基因调控系统的试剂盒。

本发明的另一个目的是提供一种生产本发明所述重组免疫细胞的方法。

本发明的另一个目的是提供一种用于治疗疾病的组合物，其包含本发明所述的重组免疫细胞或基因调控系统。

本发明的另一个目的是提供一种在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，包括向受试者施用本发明所述的重组免疫细胞、组合物或基因调控系统处理受试者的免疫细胞。

本发明的另一个目的是提供一种本发明所述的重组免疫细胞、组合物、基因调控系统处理受试者的免疫细胞，在制备治疗疾病或病症的药物中的用途。

本发明的另一个目的是提供一种本发明所述的重组免疫细胞作为稳定递送治疗疾病的生物分子的载体中的应用。

本发明的另一个目的是提供一种降低或清除免疫细胞中BCOR 基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能的用途。所述用途包括增加免疫细胞干性(stemness)、抑制免疫细胞耗竭、促进免疫细胞扩增、赋予免疫细胞记忆性、延长免疫细胞持久性、增加免疫细胞自我更新能力。

本发明的另一个目的是提供一种动物模型的生产方法，该方法使用本发明所述的制备方法处理动物的免疫细胞或使用本发明所述基因调控系统引入动物的免疫细胞，或使用本发明所述的试剂盒处理动物的免疫细胞。

本发明的另一个目的是提供一种动物模型，该动物模型使用本发明所述的的方法进行生产。

本发明的一个目的是提供一种重组T细胞。

本发明提供的重组T细胞不含BCOR基因和ZC3H12A基因，或所述重组T细胞的BCOR基因产物和ZC3H12A基因产物的生物学功能被抑制。

上述重组T细胞是将靶标T细胞的BCOR基因和ZC3H12A基因敲除，且导入带有作用靶点的CAR结构或TCR结构或其他细胞过继治疗相应结构，得到的重组T细胞。

上述重组T细胞中，所述靶标T细胞为CD8 T细胞或其它类型的T细胞。

上述重组T细胞中，所述带有作用靶点的CAR结构为CD19-CAR 结构或识别其它靶点的CAR或TCR结构。

上述重组T细胞中，所述敲除为通过CRISPR-Cas9方法或其它方法将所述靶标T细胞的BCOR基因和ZC3H12A基因敲除，或通过其它方法抑制BCOR基因产物和ZC3H12A基因产物的功能。

上述重组T细胞中，所述通过CRISPR-Cas9方法将所述靶标T 细胞中BCOR基因敲除时靶向BCOR基因的靶序列为SEQ ID NO:3；所述通过CRISPR-Cas9方法将所述靶标T细胞中ZC3H12A基因敲除时靶向ZC3H12A基因的靶序列为SEQ ID NO:4。

进一步的，所述重组细胞为将带有敲除时靶向BCOR基因的靶序列、靶向ZC3H12A基因的靶序列和表达CD19-CAR结构的载体导入靶标T细胞。

在本发明的实施例中，所述重组细胞为将 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR或 pMSCV-hU6-sgBcor-mU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-人源CD19-CAR导入靶标CD8 T细胞得到的细胞。其中靶标CD8 T细胞来源于Cas9转基因小鼠(来自Jaxson Laboratory，Stock No:026430) 的脾脏分离得到CD8 T细胞。

上述重组T细胞还含有表达用于治疗疾病的相应分子的基因，在本发明的实施例中，治疗疾病的相应分子以治疗肠炎的IL23R融合蛋白质为例。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述重组T细胞的方法。

本发明提供的方法，为将靶标T细胞的BCOR基因和ZC3H12A 基因敲除或抑制靶标T细胞的BCOR基因产物和ZC3H12A基因产物的功能，且导入带有作用靶点的CAR结构或TCR结构或其他细胞过继治疗相应结构，得到的重组T细胞。

本发明提供的方法，为将靶标T细胞的BCOR基因和ZC3H12A 基因敲除或功能抑制，且导入带有作用靶点的CAR结构或TCR结构或其他细胞过继治疗相应结构，且导入表达用于治疗疾病的相关分子的载体，得到的重组T细胞。

在本发明的实施例中，治疗疾病的相应分子以治疗肠炎的IL23R 融合蛋白质为例。

上述重组T细胞在制备预防和/或抗肿瘤的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述的重组T细胞在制备抑制肿瘤生长和/或转移的产品中的应用也是本发明保护的范围。

上述重组T细胞在制备清除机体内CAR结构的靶向细胞的产品也是本发明保护的范围。

上述重组T细胞在作为药物载体中的应用也是本发明保护的范围。

本发明还提供了一种用于治疗疾病的产品，其按照如下方法制备：

1)将靶标T细胞的BCOR基因和ZC3H12A基因敲除或抑制靶标T细胞的BCOR基因产物和ZC3H12A基因产物的功能，且导入带有作用靶点的CAR结构或TCR结构或其他细胞过继治疗相应结构，且导入表达用于治疗疾病的相关分子的载体，得到的重组T细胞；

2)将表达用于治疗疾病的相关分子的载体导入权利要求1-6任一所述的重组T细胞，得到的重组T细胞。

在本发明的实施例中，治疗疾病的相应分子以治疗肠炎的IL23R 和治疗肥胖的GLP1为例。

敲除BCOR基因和ZC3H12A基因的物质或抑制BCOR基因和 ZC3H12A基因表达的物质在如下任一中的应用也是本发明保护的范围：

1)在制备促进T细胞扩增的产品中的应用；

2)在制备抗肿瘤或抗自身免疫疾病产品中的应用；

3)在制备预防肿瘤或预防自身免疫疾病产品中的应用；

4)在制备抑制肿瘤生长和/或转移的产品中的应用；

5)在制备重组T细胞中的应用；

6)在制备延长T细胞在体内存在的持久性和/或稳定性的产品中的应用；

7)在制备具有记忆效应的T细胞中的应用；

8)在制备具有自我更新能力的T细胞中的应用；

9)在制备用于稳定递送治疗性生物制剂的药物载体中的应用。

本发明的实验证明，本发明通过基因编辑获得ZC3H12A/BCOR 双基因敲除的CAR-T细胞，与传统的CAR-T细胞相比具有极大的优势，即1)不需要对患者进行毒副作用极大的预处理；例如，在肿瘤治疗中，可以在不需要化疗预处理的条件下进行CAR-T治疗，并且这些CAR-T在体内永久存在，达到治愈肿瘤、防止复发的目的；在小鼠模型中，经过基因编辑的CAR-T细胞不需要化疗预处理即可在体内大量扩增并杀伤靶细胞；这些细胞具有干细胞性质，可以在体内无限期存在，达到治愈的目的；2)只需要少量的细胞即可进行有效的治疗；3)经过基因编辑的CAR-T细胞在体内长期存在，相当于在体内长期稳定植入了一群细胞，解决CAR-T治疗长效性的问题，单次治疗可达到长期治疗和预防效果。4)这些体内长期存在的CAR-T 细胞也可以作为载体，分泌具有治疗作用的蛋白质，包括抗体、多肽和激素等，这些细胞可以作为一个通用平台分泌各种治疗性生物制剂 (如抗体、多肽、激素等)。该技术将极大地降低反复给药的医疗成本，并达到治愈一些疾病的目的。

发明详述

重组免疫细胞

在一个实施方案中，本发明提供一种重组免疫细胞，重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除。

在一些实施方案中，所述的免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK 细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞中的一种或数种，优选T细胞或 NK细胞；所述T细胞选自CD4+CD8+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T 细胞、效应T细胞、抑制性T细胞、原始T细胞、记忆T细胞、γ- δT细胞、α-βT细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞或NKT细胞中的一种或数种。

在一些实施方案中，所述重组免疫细胞为重组T细胞，重组T细胞不含BCOR基因和ZC3H12A基因，或所述重组T细胞的BCOR基因产物和ZC3H12A基因产物的生物学功能被抑制。

表1靶基因

在一些实施方案中，采用基因敲除技术、基因沉默技术、失活突变技术、PROTAC技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的 BCOR基因和ZC3H12A基因。

在一些实施方案中，与未修饰或对照免疫细胞相比，本发明的重组免疫细胞BCOR基因和ZC3H12A基因的表达或功能分别地被降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少 95％或100％。

在一些实施方案中，本发明所述的重组免疫细胞包括一种或多种用于细胞过继治疗的结构。

在一些实施方案中，用于细胞过继治疗的相应结构为嵌合抗原受体(CAR)结构、T细胞抗原受体(TCR)结构、基于配受体结合的受体结构或T细胞受体和抗原受体(syntheticT cell receptor and antigen receptor，STAR)。对于STAR的描述参见WO2020029774A1和Yue Liu.et,al.Chimeric STAR receptors using TCR machinery mediate robustresponses against solid tumors.Sci Transl Med.2021Mar 24；13(586):eabb5191.doi:10.1126/scitranslmed.abb5191。

在一些实施方案中，抗原受体结合的抗原选自RORl、Her2、 Ll-CAM、CD4、CD5、CD8、CD19、CD20、BCMA、CD7、Clauding 18.2、GPC3、MSLN、AFP、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、 EGFR、EGFRVIII、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、 FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMWMAA、IL-22R-α、 IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞黏附分子(CD171)、 MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、 MART-1、gp100、瘤胚抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、 CD123、CS-1、c-Met、MAGE A3、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、周期蛋白A1(CCNA1)、白细胞介素12或其他肿瘤相关抗原中的一种或数种。

在一些实施方案中，重组免疫细胞是源自哺乳动物的免疫细胞。所述的哺乳动物包括、灵长类动物(例如人、猴子)、牛、绵羊、山羊、羊驼、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。

在一些实施方案中，所述重组免疫细胞还含有表达用于治疗疾病的生物分子的基因。所述表达治疗疾病的生物分子选自：细胞因子、激素、生长因子、凝血因子、血细胞表达的、趋化因子、共刺激分子、活化肽、抗体或其抗原结合片段。具体地，所述治疗疾病的生物分子选自IL-23R蛋白、IL-4R抗体、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、 IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-22、IL-23、IL-24、TNF、 TNF-α、GM-CSF、CD40L、CTLA-4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、GLP1 中的一种或数种。

在一些实施方案中，在给与受试者至少1周、2周、3周、4周、 1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、 18个月、2年、5年、10年、20年、40年之后，在受试者外周血能够检测到所述重组免疫细胞。在一些实施方案中，所述的重组免疫细胞为类永生化的免疫细胞。该类永生化的重组免疫细胞为非肿瘤细胞。

在一些实施方案中，在给与受试者至少1周、2周、3周、4周、 1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月之后，相对于同类免疫细胞总量，所述BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除的重组免疫细胞的比例不低于20％、 30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。

在另一些实施方案中，在给与受试者至少1周、2周、3周、4 周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12 个月之后，相对于外周血细胞总数，所述BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除的重组免疫细胞的比例选自 1％-35％、3-30％、3-20％；具体数值可以是上述数值范围内的任意值，包括但不限于1％、3％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％。

在另一些实施方案中，与未修饰的免疫效应细胞相比，本发明所述的重组免疫效应细胞表现出增加的或延长的细胞存活力。在此类实施方案中，结果是在给定的时间段之后，与未修饰的免疫效应细胞相比，存在的修饰的免疫效应细胞的数目增加。例如，在一些实施方案中，本发明所述的修饰的免疫效应细胞保持活力并持续的时间比未修饰的免疫细胞长1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、 2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、 35、40、45、50、60、70、80、90、100或更多倍。

在一些实施方案中，与未修饰的免疫细胞群体观察到的治疗疾病的生物分子的产量相比，重组免疫效应细胞的治疗疾病的生物分子 (例如，IL23R、TNF或IL-5、GLP1)的产量增加1.1、1.2、1.3、1.4、 1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、6、 7、8、9、10、15、20、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100 或更多倍。

重组免疫细胞的制备方法

在另一个实施方案中，本发明提供一种上述重组免疫细胞的制备方法。该方法包括采用基因敲除技术、基因沉默技术或失活突变技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A 基因。

在一些实施方案中，所述基因敲除技术包括CRISPR/Cas技术、人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术、转录激活样效应因子(transcription activator-like effector，TALE)技术或 TALE-CRISPR/Cas技术。

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas技术选自CRISPR-Cas3、 CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12、CRISPR-Cas13、CRISPR-CasX或 CRISPR-IscB系统。对CRISPR-CasX系统的描述参见Liu J.J.et al., Nature,2019或https://doi.org/10.1016/j.molcel.2022.02.002。对 CRISPR-IscB系统的描述参见Han Altae-Tran.et al.,Science 374, Vol 374,Issue 6563,57–65(2021).DOI:10.1126/science.abj6856.

在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas技术具体选自 CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas12b、CRISPR-Cas13a、 CRISPR-Cas13b、CRISPR-Cas13c、CRISPR-Cas13e或CRISPR-Cas13f 系统。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas技术中使用靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)和Cas核酸内切酶，和靶向ZC3H12A基因的指导 RNA(gRNA)和Cas核酸内切酶。

在一些实施方案中，CRISPR/Cas技术的指导RNA(gRNA)中同时或分别包括靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)和靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)。

本发明提供了将定点修饰多肽定向至具体靶核酸序列的指导 RNA(gRNA)。gRNA包含核酸靶向区段和蛋白质结合区段。gRNA的核酸靶向区段包含与靶核酸序列中的序列互补的核苷酸序列。因此，gRNA的核酸靶向区段经由杂交(即碱基配对)以序列特异性方式与靶核酸相互作用，并且核酸靶向区段的核苷酸序列确定gRNA将结合的靶核酸内的位置。gRNA的核酸靶向区段可以被修饰(例如，通过遗传工程)以与靶核酸序列内的任何所需序列杂交。

指导RNA的蛋白结合区段与定点修饰多肽(例如，Cas蛋白)相互作用以形成复合物。指导RNA通过上述核酸靶向区段将结合的多肽指导至靶核酸内的特定核苷酸序列。指导RNA的蛋白结合区段包含两个核苷酸片段，它们彼此互补并形成双链RNA双链体。

在一些实施方案中，gRNA包含两个单独的RNA分子。在此类实施方案中，两个RNA分子中的每一个都包含一段彼此互补的核苷酸，使得两个RNA分子的互补核苷酸杂交以形成蛋白质结合区段的双链RNA双链体。在一些实施方案中，gRNA包含单个RNA分子 (sgRNA)。

gRNA对靶基因座的特异性由核酸结合区段的序列介导，所述核酸结合区段包含与靶基因座内的靶核酸序列互补的20个核苷酸。在一些实施方案中，对应的靶核酸序列的长度为20个核苷酸。在一些实施方案中，本发明的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列至少90％互补。在一些实施方案中，本发明的gRNA 序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列至少95％、96％、97 ％、98％或99％互补。在一些实施方案中，本发明的gRNA序列的核酸结合区段与靶基因座内的靶核酸序列100％互补。在一些实施方案中，靶核酸序列是RNA靶序列。在一些实施方案中，靶核酸序列是DNA靶序列。

在一些实施方案中，必须改变靶基因座内的靶核酸序列。例如，靶核酸序列可能会发生变化，因为所用的Cas蛋白发生变化并且新的 Cas蛋白具有不同的PAM。本说明书在本文提供的说明书和表格中提供了gRNA的靶核酸序列的许多实例。这些靶核酸序列中的任一个可以通过在给定基因内的靶基因座内的5'或3'移动靶核酸序列来改变。在一些实施方案中，靶核酸序列在给定基因内的靶基因座内的5'或3 '移动至多100bp。在其他实施方案中，靶核酸序列在给定基因内(例如，表1所述的人或小鼠的BCOR基因和/或ZC3H12A基因)的靶基因座内的5'或3'移动至多1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、 40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90或95bp。

在一些实施方案中，靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者BCOR基因(例如，NCBI Gene ID:54880或 NCBI Gene ID:71458)编码的DNA序列具有至少90％、95％、96％、 97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA序列；靶向ZC3H12A基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者ZC3H12A基因 (例如，NCBI Gene ID:80149或NCBIGene ID:230738)编码的DNA 序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA序列。

在一些实施方案中，靶向ZC3H12A基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与WO2020163365A2表7或表8中所示的一组基因组坐标所限定的DNA序列具有至少95％、96％、97％、98％、99 ％或100％同一性的靶DNA序列。或者，靶向ZC3H12A的gRNA分子的核酸结合区段结合与WO2020163365A2表16和17中所示一种具有至少95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA 序列。

在一些实施方案中，靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域包含序列ACTGGGCAATACCGCAACAG(SEQ ID NO:3)或者与SEQ ID NO:3具有至少85％、90％、95％同一性的序列；靶向 ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)的靶向结构域包含序列CTAGGGGAATTGGTGAAGCA(SEQ ID NO:4)或者与SEQ ID NO:4 具有至少85％、90％、95％同一性的序列。

在一些实施方案中，进一步向免疫细胞中进一步导入带有作用靶点的CAR结构或TCR结构或其他细胞过继治疗相应结构的序列。

在一些实施方案中，进一步向免疫细胞中导入表达用于治疗疾病的生物分子。优选的，所述治疗疾病的生物分子选自IL-23R蛋白、 IL-4R抗体、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-12、IL-13、IL-22、IL-23、IL-24、TNF、TNF-α、GM-CSF、CD40L、CTLA-4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、GLP1中的一种或数种。

在一些实施方案中，使用的载体为是病毒载体、类病毒载体或非病毒载体，在一些实施方案中，包含编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸的重组载体是病毒载体。合适的病毒载体包括但不限于基于以下的病毒载体：痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒、和衍生自逆转录病毒的载体，例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)等。合适的非病毒载体选自转座子、脂质纳米颗粒、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。

在一些实施方案中，编码本文描述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到控制元件，例如转录控制元件，诸如启动子。转录控制元件在真核细胞(例如，哺乳动物细胞)或原核细胞(例如，细菌或古细菌细胞)中可以是功能性的。在一些实施方案中，编码本文所述的基因调控系统的一种或多种组分的多核苷酸序列可操作地连接到多个控制元件，其允许多核苷酸在原核和真核细胞中都表达。根据所使用的细胞类型和基因调控系统，许多合适的转录和翻译控制元件中的任一个(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)都可用于表达载体中。

在一些实施方案中，合适的真核启动子(在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自巨细胞病毒(CMV)立即早期、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)和小鼠金属硫蛋白-1的那些。合适的载体和启动子的选择完全在本领域普通技术人员的能力范围内。表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可以包括用于扩增表达的适当序列。表达载体还可包含编码与定点修饰多肽融合的蛋白质标签(例如，6xHis标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生嵌合多肽。

在一些实施方案中，使用的sgRNA表达载体包括：载体-启动子 1-sgZc3h12a-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列、载体-启动子1-sgBcor-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列或 pMSCV-启动子1-sgBcor-启动子2-sgZc3h12a-启动子3-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列基本结构。上述“-”不代表对特定连接顺序的限制，应理解为包含相关元件表达载体。上述治疗疾病的生物分子序列包括本发明所述重组免疫细胞中的过继治疗的结构序列或治疗疾病的生物分子中的一种或数种。具体地，sgRNA表达载体包括pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR、pMSCV-hU6- sgBcor-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR或 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR的基本结构。更进一步地，更进一步地，表达载体中各启动子，如启动子1、启动子2和启动3，可以相同或不同；所述标签任选存在或缺失；所述治疗疾病的生物分子序列任选存在或缺失。

在一些实施方案中，本发明制备重组免疫细胞的方法，包括向重组免疫细胞中导入表达载体的步骤。将多核苷酸和重组表达载体导入宿主细胞的方法是本领域已知的，并且可以使用任何已知方法来将基因调控系统的组分引入细胞。合适的方法包括例如病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送、微流体递送方法等。此外，还可以施用非病毒递送媒介物中引入细胞，所述非病毒递送媒介物诸如转座子、纳米颗粒(例如脂质纳米颗粒)、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样

颗粒。

基因调控系统

在另一个实施方案中，本发明提供一种基因调控系统。所述基因调控系统用于本发明所述重组免疫细胞的制备。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统将免疫细胞中的 BCOR基因和ZC3H12A基因的表达或功能分别地降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。

在一些实施方案中，本发明基因调控系统采用基因敲除技术、基因沉默技术或失活突变技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因。

在一些实施方案中，使用的基因敲除技术包括CRISPR/Cas技术、人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术、转录激活样效应因子(transcription activator-like effector，TALE)技术或TALE-CRISPR/Cas技术。

在一些实施方案中，基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子，并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。

在一些实施方案中，所述酶蛋白选自Cas9、Cas12a、Cas12b、 Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13e或Cas13f蛋白或其直系同源物。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统包括：

(i)靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域序列与第一Cas核酸内切酶蛋白复合以形成第一核糖核蛋白(RNP)复合物；和；

(ii)靶向ZC3H12A基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域序列与第二Cas核酸内切酶蛋白复合以形成第二核糖核蛋白(RNP)复合物。

在一些实施方案中，第一核糖核蛋白(RNP)复合物和第二核糖核蛋白(RNP)复合物可同时、顺序或先后的导入到免疫细胞中。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统中，靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者BCOR基因(例如， NCBI Gene ID:54880或NCBI Gene ID:71458)编码的DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA序列；靶向ZC3H12A基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者ZC3H12A基因(例如，NCBI Gene ID:80149或NCBI Gene ID:230738)编码的DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98 ％、99％或100％同一性的靶DNA序列。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统中，靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域包含序列 ACTGGGCAATACCGCAACAG(SEQ ID NO:3)或者与SEQ ID NO:3 具有至少85％、90％、95％同一性的序列；靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)的靶向结构域包含序列 CTAGGGGAATTGGTGAAGCA(SEQ ID NO:4)或者与SEQ ID NO:4 具有至少85％、90％、95％同一性的序列。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统中，向免疫细胞进一步导入带有作用靶点的CAR结构、TCR结构、基于配受体结合的受体结构、STAR结构或其他细胞过继治疗相应结构的序列。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统中，向免疫细胞进一步导入表达用于治疗疾病的生物分子；优选的，所述治疗疾病的生物分子选自IL-23R蛋白、IL-4R抗体、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、 IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-22、IL-23、IL-24、TNF、TNF-α、GM-CSF、CD40L、CTLA-4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、 GLP1中的一种或数种。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统使用的载体是病毒载体、类病毒载体或非病毒载体。病毒载体优选痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒载体。非病毒载体优选转座子、脂质纳米颗粒、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。

在一些实施方案中，本发明的基因调控系统中使用的RNA(gRNA) 表达载体包括：载体-启动子1-sgZc3h12a-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列、载体-启动子1-sgBcor-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列或pMSCV-启动子1-sgBcor-启动子2-sgZc3h12a- 启动子3-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列基本结构。上述“-”不代表对特定连接顺序的限制，应理解为包含相关元件表达载体。上述治疗疾病的生物分子序列包括本发明所述重组免疫细胞中的过继治疗的结构序列或治疗疾病的生物分子中的一种或数种。具体地， sgRNA表达载体包括 pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR、pMSCV-hU6- sgBcor-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR或 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR的基本结构。更进一步地，表达载体中各启动子，如启动子1、启动子 2和启动3，可以相同或不同；所述标签任选存在或缺失；所述治疗疾病的生物分子序列任选存在或缺失。

在另一个实施方案中，本发明提供一种包含上述基因调控系统的试剂盒。

生产重组免疫细胞的方法

在另一个实施方案中，本发明提供生产上述重组免疫细胞的方法，其包括：

(1)获得免疫细胞；

(2)使用上述任意一个实施方案所述的制备方法处理免疫细胞，或将上述任意一个实施方案所述的基因调控系统引入免疫细胞，或使用上述任意一个实施方案所述的试剂盒处理免疫细胞；

(3)培养免疫细胞，将免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A 基因的表达和/或功能被降低或清除。

在一些实施方案中，将步骤(3)获得的重组免疫细胞植入到受试者体内进行扩增，并获取体内扩增后的重组免疫细胞。从第一代受试者体内扩增后的获取重组免疫细胞，可用于受试者的自体治疗或用于其他受试者的异体治疗。

在一些实施方案中，免疫细胞对于受试者是自体的免疫细胞，或同种异体的免疫细胞。

组合物

在另一个实施方案中，本发明提供一种用于治疗疾病的组合物。术语“组合物”是指本文所述的基因调控系统或修饰的免疫效应细胞的制剂，其能够施用或递送至受试者或细胞。“治疗性组合物”或“药物组合物”(在本文中可互换使用)是基因调控系统或修饰的重组免疫效应细胞的组合物，其能够施用于受试者以治疗特定的疾病或病症，或者与细胞接触以修饰一种或多种靶基因。

在一些实施方案中，治疗疾病的组合物包含上述任意一个实施方案所述的重组免疫细胞。

在一些实施方案中，治疗疾病的组合物包含上述任意一个实施方案所述的基因调控系统。

治疗疾病或病症的方法

在另一个实施方案中，本发明提供一种在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法。所述方法包括向受试者施用上述任意一个实施方案所述所述的重组免疫细胞，或施用上述任意一个实施方案所述所述的组合物，或使用上述任意一个实施方案所述的基因调控系统处理受试者的免疫细胞。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、炎症性疾病、代谢性疾病、神经退行性疾病、外源性CAR结构靶向细胞引发的疾病、外源性TCR结构靶向细胞引发的疾病。

在一些实施方案中，所述癌症或肿瘤包括以下的一种或多种：白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、和/或间皮瘤；所述自身免疫性疾病包括以下的一种或多种：强直性脊柱炎(AS)，牛皮癣(PS)，乳糜泻(CEL)，系统性红斑狼疮(SLE)，普通变异型免疫缺陷病(CVID)，炎症性肠病(IBD)，溃疡性结肠炎(UC)，I型糖尿病(TlD)，幼年特发性关节炎(JIA)，克罗恩病(CD)，斑秃(AA)，多发性硬化(MS)，原发性胆汁性肝硬化(PBC)，原发性硬化性胆管炎(PSC)，类风湿性关节炎(RA)，干燥综合征(SJO)，系统性硬化病(SSC)，脊柱关节病(SPA)，白癫风(VIT)，哮喘，或甲状腺炎(AITD，THY或TH)。

制药用途

在另一个实施方案中，本发明提供一种制备药物的用途。

在一些实施方案中，本发明提供上述任意一个实施方案所述的的重组免疫细胞，在制备在有需要的受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明提供上述任意一个实施方案所述的组合物，在制备在有需要的受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途。

在一些实施方案中，本发明提供上述任意一个实施方案所述的基因调控系统处理受试者的免疫细胞，在制备在有需要的受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途。

递送载体的应用

在另一个实施方案中，本发明提供一种重组免疫细胞作为稳定递送治疗疾病的生物分子的载体中的应用。

在一些实施方案中，所述重组免疫细胞是上述任意一个实施方案所述的重组免疫细胞，或使用上述任意一个实施方案所述的基因调控系统处理受试者的免疫细胞；所述递送治疗疾病的生物分子选自上述任意一个实施方案所述的任意一种或数种递送治疗疾病的生物分子。

在一些实施方案中，所述表达治疗疾病的生物分子选自：细胞因子、激素、生长因子、凝血因子、血细胞表达的、趋化因子、共刺激分子、活化肽、抗体或其抗原结合片段。具体地，所述治疗疾病的生物分子选自IL-23R蛋白、IL-4R抗体、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-22、IL-23、IL-24、 TNF、TNF-α、GM-CSF、CD40L、CTLA-4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、 GLP1中的一种或数种。

降低或清除目标基因的表达和/或功能的用途

在另一个实施方案中，本发明提供一种降低或清除免疫细胞中 BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能的用途。

在一些实施方案中，所述用途包括增加免疫细胞干性(stemness)、抑制免疫细胞耗竭、促进免疫细胞扩增、赋予免疫细胞记忆性、延长免疫细胞持久性、增加免疫细胞自我更新能力。

在一些实施方案中，所述重组免疫细胞是上述任意一个实施方案所述的重组免疫细胞，或使用上述任意一个实施方案所述的基因调控系统处理受试者的免疫细胞。

在一些实施方案中，所述用途为治疗目的或非治疗目的。在一些实施方案中，所述非治疗目的包括，将免疫细胞用于可被DNA编码的蛋白质的制备或用于治疗性组合物的的制备。优选的，可被DNA 编码的蛋白质包括上述任意一个实施方案所述的任意一种或数种递送治疗疾病的生物分子。

动物模型

在另一个实施方案中，本发明提供一种动物模型的生产方法。

在一些实施方案中，动物模型的生产方法使用上述任意一个实施方案所述的制备方法处理动物的免疫细胞，或将上述任意一个实施方案所述的基因调控系统引入动物的免疫细胞，或使用上述任意一个实施方案所述的试剂盒处理动物的免疫细胞。

在另一个实施方案中，本发明提供一种上述方法生产的动物模型。

在另一个实施方案中，本发明提供上述任意一个实施方案所述的重组免疫细胞、基因调控系统或试剂盒在制备动物模型中的用途。

定义

“BCOR基因”和“Bcor基因”在没有特别定义的前提下可以相互替换使用。所述“BCOR基因是任意目标受试者的BCOR基因。

“ZC3H12A基因”和“Zc3h12a基因”在没有特别定义的前提下可以相互替换使用。所述“ZC3H12A基因”是任意目标受试者的“ZC3H12A基因”。

“干性(stemness)”又称“干细胞特性”，是指细胞具有自我更新能力和向不同的细胞分化的能力。

“类永生化”或“类永生”(Immortal-like and Functional，简写为IF)是指细胞获得持续生长增殖能力的特性，并且没有恶性转化的表型特征、无成瘤性、无肿瘤细胞具有的浸润性和转移性。本文中，使用下标_IF表示同时敲除Bcor和Zc3h12a的具有“类永生化”性质的T细胞，简称T_IF，包括CAR19T_IF、GD2T_IF和EGFRT_IF。

“受试者”或“宿主”是指人类或非人类动物，包括哺乳动物。例如，灵长类动物(如人、猴)、牛、绵羊、山羊、羊驼、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠之类。“受试者”或“宿主”包括治疗型和非治疗型。“受试者”或“宿主”包括实验用动物模型或用于生产表达治疗疾病的生物分子的动物，即“非治疗型宿主”或“非治疗型受试者”。

“用于治疗疾病的相关分子”或“用于治疗疾病的生物分子”在没有特定定义的情况下，是指通过“外源基因”导入免疫细胞并通过重组免疫细胞分泌的相关分子或生物分子。

有益效果

本发明的实验证明，本发明通过基因编辑获得ZC3H12A/BCOR 双基因敲除的CAR-T细胞，与传统的CAR-T细胞相比具有极大的优势，这些优势单独敲除ZC3H12A或BCOR基因无法获得：

1)不需要对患者进行毒副作用极大的预处理；例如，在肿瘤治疗中，可以在不需要化疗预处理的条件下进行CAR-T治疗，并且这些CAR-T细胞在体内永久存在，达到治愈肿瘤、防止复发的目的；在小鼠模型中，经过基因编辑的CAR-T细胞不需要化疗预处理即可在体内大量扩增并杀伤靶细胞；这些细胞具有干细胞性质，可以在体内无限期存在，达到治愈的目的；

2)使用少量的重组细胞即可进行有效的治疗；

3)经过基因编辑的CAR-T细胞在体内长期存在，相当于在体内长期稳定植入了一群细胞，解决CAR-T治疗长效性的问题，单次治疗可达到长期治疗和预防效果。

4)这些体内长期存在的CAR-T细胞也可以作为载体，分泌具有治疗作用的蛋白质，包括抗体、多肽和激素等，这些重组免疫细胞可以作为通用型载体平台，分泌各种治疗性生物分子(如抗体、多肽、激素等)。该技术将极大地降低反复给药的医疗成本，并达到治愈一些疾病的目的。

附图说明

图1.敲除Bcor和/或Zc3h12a的重组CAR-T细胞的鉴定。其中， a为在重组CAR-T细胞中敲除Zc3h12a基因后，免疫印迹检测目标基因编码蛋白质的表达水平；b和c为在重组CAR-T细胞中敲除Bcor 基因后，PCR(b)和基因测序检测(c)目标基因的编辑结果。

图2.CAR19T_IF在无预处理的情况下回输小鼠后高效扩增并持久扩增；单独敲除Zc3h12a的CAR19T细胞不能持久存在，也不能持续杀伤CD19+靶细胞；其中，a为实验流程示意图，b为第7天和2 个月后流式分析小鼠外周血中回输的各组mCD19CAR细胞(即 Thy1.1+细胞)占总CD8T细胞的比例；c为输入各组mCD19CAR 细胞后，第1周至第8周，流式分析小鼠外周血中mCD19CAR细胞占总CD8T细胞的比例的变化统计曲线，PBS组n＝3，其它各组 n＝5-6；d为回输6个月后流式分析小鼠脾中各组mCD19CAR细胞占总脾细胞的比例，sgNT组n＝3，CAR19T_IF组n＝5)。数据为mean± SEM，采用unpaired student’s t-test：NS，无显著差异；*p<0.05； **p<0.01；***p<0.001；****p<0.0001。

图3.CAR19T_IF具有干细胞性质，可在不同批次小鼠中反复传代而不出现耗竭。其中，a为在B6小鼠体内反复传代输入CAR19T_IF细胞的实验设计；b-d为CAR19T_IF细胞在脾中的比例和数量的统计分析；e为CD19+B细胞在脾中的比例的统计分析,n＝4-6。f为体外培养的CAR19细胞和CAR19T_IF细胞的存活时间；g为在B6小鼠体内反复传代输入高复制的CAR19T_IF细胞的实验设计；h和i为 CFSE^-CAR19T_IF细胞在脾中的比例和数量的统计分析。数据为mean± SEM，采用unpaired student’s t-test：NS，无显著差异；*p<0.05； **p<0.01；****p<0.0001。

图4.少量(500个)CAR19T_IF即可在体内无预处理情况下高效扩增并清除所有靶细胞，但CAR19T_IF具有自限性且不会过度增殖。其中，a为在B6小鼠体内数量梯度输入CAR19T_IF细胞的实验设计； b-d为CAR19T_IF细胞在脾中的比例和数量的统计分析；e为CD19+B 细胞在脾中的比例的统计分析。n＝3-5，数据为mean±SEM，采用 unpaired student’s t-test：NS，无显著差异；*p<0.05；**p<0.01； ****p<0.0001。

图5.CAR19T_IF对初发肿瘤具有治疗效果，并延长荷瘤小鼠生存期。其中，a为实验流程示意图，B6小鼠皮下接种2×10⁵表达mCD19 的MC38(MC38-mCD19)肿瘤细胞，10天后，鼠尾静脉移输入3×10⁶ CAR19T_IF细胞或PBS对照组，并监测肿瘤生长和荷瘤小鼠存活，n＝4。b为肿瘤大小，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test： ***p<0.001；c为荷瘤小鼠生存曲线，采用log-rank(Mantel-Cox)test： **P<0.01。

图6.CAR19T_IF具备对肿瘤的免疫记忆保护作用，可以长期防止肿瘤复发。其中a-c为结肠癌MC38实验:a为流程示意图，鼠尾静脉移输入CAR19T_IF细胞，1个月后B6小鼠皮下接种5×10⁵ MC38-mCD19肿瘤细胞，并监测肿瘤生长和荷瘤小鼠存活；b为肿瘤大小，PBS对照组n＝5,CAR19T_IF预接种组n＝10，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：***p<0.001；c为荷瘤小鼠生存曲线，采用log-rank(Mantel-Cox)test：**P<0.01；d-f为黑色素瘤 B6F10-mCD19模型试验，鼠尾静脉移输入CAR19T_IF细胞，1个月后 B6小鼠尾静脉移植1×10⁵B6F10-mCD19细胞，3周后检查小鼠肺肿瘤负荷，并监测小鼠存活；d为黑色素瘤B6F10实验流程示意图；e 为肺肿瘤负荷照片；f为荷瘤小鼠生存曲线，对照组n＝5,预接种组 n＝6，数据为mean±SEM，采用log-rank(Mantel-Cox)test：**P<0.01。

图7.人源化hCD19小鼠中的hCAR19T_IF细胞的构建和鉴定。其中，a为在人源化CD19(hCD19)小鼠中连续转移hCAR19T_IF细胞的实验设计示意图；b为输入hCAR19T_IF的第一代受体和第二代受体hCD19小鼠脾中hCAR19T_IF(为Thy1.1+)的比例和CD19+B细胞的比例；c和d为的统计分析第一代受体和第二代受体hCD19小鼠脾中hCAR19T_IF的比例和绝对数量，n＝3，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：NS，无显著差异；**p<0.01；****p<0.0001。

图8.CD19CART_IF-IL23R细胞过继疗法对硫酸葡聚糖钠盐(图中DSS)诱导肠炎的治疗作用。a和b为Wstern blot方法检测逆转录病毒包装细胞的细胞碎片(a)和细胞上清(b)中IL23R表达情况。对照泳道是转染了空载体的细胞蛋白样品；c为小鼠肠炎模型的构建和CAR19T_IF-IL23R细胞过继疗法的示意图的；d为CART_IF-IL23R细胞过继疗法对硫酸葡聚糖钠盐(图中DSS)诱导肠炎小鼠体重的影响。 n＝5，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：NS，无显著差异；*p<0.05；***p<0.0001。

图9.同时敲除Bcor和Zc3h12a的诱导GD2T_IF细胞。单独敲除 Bcor或Zc3h12a都不能促进GD2 CAR-T细胞的扩增和持久。其中， a为CAR-T结构和基因敲除载体结构；b为实验流程图；c为代表性流式图；d为统计分析，n＝3，数据为mean±SEM，采用unpaired student’st-test：NS，无显著差异；**p<0.01。

图10.GD2T_IF细胞具有干细胞性质，可在B6小鼠和NSG小鼠中传代，同时保留T细胞的功能；但不会在小鼠体内成瘤，具有安全性。其中，a为实验流程图；b和e为代表性流式图；h为GD2T_IF细胞在体外的存活时间；i为GD2T_IF细胞的表型分析；k为GD2T_IF细胞产生IFN分析；c,d,f,g，j，l，m为统计分析，n＝3-6，数据为 mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：NS，无显著差异；*p<0.05， **p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

图11.同时敲除Bcor和Zc3h12a的诱导EGFRT_IF细胞。单独敲除Bcor或Zc3h12a都不能促进EGFR CAR-T细胞的扩增和持久。其中，a为CAR-T结构和基因敲除载体结构；b为实验流程图；c为代表性流式图；d为统计分析，n＝3，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：***p<0.001。

图12.EGFRT_IF细胞具有干细胞性质，可在B6小鼠中传代，同时保留T细胞的功能；但不会在小鼠体内成瘤，具有安全性。其中， a为实验流程图；b为代表性流式图；c和d为统计分析，n＝6，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：****p<0.0001；e为GD2T_IF细胞在体外的存活时间。

图13.EGFRT_IF细胞在无预处理荷瘤小鼠的情况下抑制结肠癌 CT26肿瘤生长。其中，a为实验流程示意图，B6小鼠皮下接种2×10⁵表达mCD19的MC38(MC38-mCD19)肿瘤细胞，3天后，鼠尾静脉移输入1×10⁶CAR19T_IF细胞或PBS对照组，并监测肿瘤生长和荷瘤小鼠存活，n＝5。b为肿瘤大小，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：***p<0.001。

图14.GD2T_IF细胞作为载体持续分泌TNF诱导慢性炎症模型。其中，a为原理示意图；b为代表性流式图；c和d为统计分析，n＝4，数据为mean±SEM，采用unpaired student’s t-test：****p<0.0001； e为体重变化。

图15.GD2T_IF细胞作为载体持续分泌IL-5诱导嗜酸性粒细胞增多症模型。其中，a为原理示意图；b为代表性流式图；c和d为统计分析，n＝4，数据为mean±SEM，采用unpairedstudent’s t-test： ****p<0.0001。

图16.GD2T_IF细胞作为载体持续分泌GLP1治疗肥胖和糖尿病。其中，a为原理示意图；b和c为小鼠接受治疗后的体重变化图，n＝5，数据为mean±SEM，采用unpairedstudent’s t-test：****p<0.0001， NS，无显著差异。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、敲除Bcor和/或Zc3h12a的重组CAR-T细胞的制备

1、基因敲除载体的构建

本实施例构建了基于逆转录病毒的sgRNA表达载体，即 pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR、pMSCV-hU6-sgBcor-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR、 pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR和， pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR；

其中：

载体pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(SEQ ID NO:1)，其中第257-276位为不靶向任何基因的随机序列SEQ ID NO:2，作为未敲除任何基因的对照；

载体pMSCV-hU6-sgBcor-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(该载体序列为将SEQ ID NO:1第257-276位替换为SEQ ID NO:3，且保持其它序列不变得到的序列，SEQ ID NO:3为用于敲除Bcor的sgBcor的靶序列识别区，用于敲除Bcor；

载体pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR(该载体序列为将SEQ IDNO:1第257-276位替换为SEQ ID NO:4，且保持其它序列不变得到的序列，SEQ ID NO:4为用于敲除Zc3h12a的 sgZc3h12a的靶序列识别区，用于敲除Zc3h12a；

pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR (SEQ ID NO:5)，其中第242-261位为用于敲除Bcor的小鼠sgBcor 的靶序列识别区(SEQ ID NO:3)，第687-706位为用于敲除小鼠Zc3h12a的sgZc3h12a的靶序列识别区(SEQ ID NO:4)用于同时敲除小鼠Bcor和小鼠Zc3h12，所有载体通过全基因合成得到。

上述采用的sgRNA如下表2所示：

表2 sgRNA的靶序列识别区

2、初始CD8 T细胞的分离和激活

通过磁珠分选方法从Cas9转基因小鼠(来自Jaxson Laboratory， #026430)的脾脏分离得到初始CD8 T细胞，将细胞按10⁶个/孔的密度接种到1μg/ml量抗CD3抗体(CD3ε,BioXcell#BE0001-1)包被的 12孔细胞培养皿中，加入2ml RPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和白介素-2)中，同时加入1μg/ml量抗CD28抗体(BioXcell #BE0015-1)进行体外激活，即细胞置于5％二氧化碳37℃孵箱中培养，培养36小时后进行病毒感染。

3、敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞的构建

1)逆转录病毒制备

10⁶Phoenix-Eco细胞(ATCC#CRL-3214)贴壁培养24小时后，磷酸钙沉淀法共转染20μg量上述1制备的sgRNA表达载体 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR和 60μg量包装质粒pCL-Eco(购自Addgene#12371)，转染48小时后收获含有包装病毒的上清，病毒上清0.45μm滤膜过滤以去除死细胞杂质，得到逆转录病毒上清，即敲除Bcor和Zc3h12a的逆转录病毒。

2)逆转录病毒体感染

将步骤2体外培养激活培养36小时后的1×10⁶量CD8 T细胞，加入1ml步骤1)得到的逆转录病毒上清混匀后，于室温2000g水平离心2小时。然后放置于二氧化碳孵箱培养4小时，更换至2ml新鲜RPMI1640培养基(包含5％胎牛血清和2ng/ml量白介素-2)继续培养(此时间记作感染后时间)，使用流式细胞术分选出Thy1.1 阳性细胞(Thy1.1-biotin，BioLegend#202510)，即得到同时敲除 Bcor和Zc3h12a(表示为sgBcor/Zc3h12a)的mCD19CAR细胞，命名为CAR19T_IF，其中IF代表Immortal-like and Functional，中文翻译为“类永生T细胞”。

4、敲除Zc3h12a的CD8 T细胞的构建

与“3、敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞的构建”的区别仅在于：将“sgRNA表达载体 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”替换为“sgRNA表达载体 pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”，其它步骤不变，得到敲除Zc3h12a的mCD19CAR细胞(sgZc3h12a-mCD19CAR)。

5、未敲除基因的mCD19CAR细胞的构建

与“3、敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞的构建”的区别仅在于：将“sgRNA表达载体 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”替换为“sgRNA表达载体pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR”，其它步骤不变，得到未敲除基因的mCD19CAR细胞(sgNT-mCD19CAR)。

6、鉴定敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞

(1)免疫印迹检测敲除Zc3h12a

在上述3敲除Bcor和Zc3h12a的逆转录病毒感染CD8 T细胞后的4天，使用流式细胞术分选出Thy1.1阳性细胞，即为同时敲除 sgBcor/Zc3h12a的mCD19CAR细胞，制备细胞裂解液，采用常规的免疫印迹方法(使用识别Zc3h12a抗体(购自Abcam，#ab211659) 检测Zc3h12a基因敲除效果。以上述5得到的未敲除基因的 mCD19CAR细胞为对照。

感染后4天的结果如图1a所示，可以看出，与未敲除任何基因的mCD19CAR细胞(对照)相比，敲除sgBcor/Zc3h12a的mCD19CAR 细胞(图中表示为sgZc3h12a/Bcor)中Zc3h12a基因编码的蛋白质被完全敲除。

(2)PCR鉴定敲除Bcor

取上述3敲除Bcor和Zc3h12a的逆转录病毒感染CD8 T细胞后的48小时获得的同时敲除sgBcor/Zc3h12a的mCD19CAR细胞并将此细胞回输小鼠28天后，再从小鼠脾中分离获得的同时敲除 sgBcor/Zc3h12a的mCD19CAR细胞，分别提取DNA作为模板用如下引物进行PCR扩增。以上述5得到的未敲除基因的mCD19CAR细胞为对照。小鼠Bcor基因编辑鉴定引物序列P1为SEQ ID NO:6 CCGAAAGAAACACTATCTCC)，小鼠Bcor基因编辑鉴定引物序列 P2为SEQ IDNO:7TGATGGCGTGGTATCCACCG。

结果如图1b所示，上图为引物位置，下图为PCR扩增结果；对照为sgNT-mCD19CAR，48小时为逆转录病毒感染48小时获得的同时敲除sgBcor/Zc3h12a的mCD19CAR细胞(图中表示为 sgZc3h12a/Bcor)，28天为逆转录病毒感染48小时后回输小鼠28天后脾中分离获得的同时敲除sgBcor/Zc3h12a的mCD19CAR细胞(图中表示为sgZc3h12a/Bcor)；可以看出，与未敲除任何基因的mCD19CAR 细胞(对照)相比，敲除sgBcor/Zc3h12a的mCD19CAR细胞中Bcor基因已检测不到正常Bcor基因大小的条带，表明Bcor基因被成功编辑。

将上述PCR产物进行测序，结果如图1c所示，可以看出，Bcor 和Zc3h12a的基因对应位点已经被编辑成功。

实施例2、同时敲除Zc3h12a和Bcor基因在无预处理情况下回输的 mCD19 CAR-T细胞高效扩增，在体内持久存在，并持久性地杀伤 CD19+靶细胞；单独敲除Zc3h12a基因的mCD19 CAR-T细胞不能持久存在，也不能持续行地杀伤CD19+靶细胞

细胞回输流程如图2a所示：从Cas9转基因小鼠脾和淋巴结分离 CD8 T细胞，经CD3/CD28活化24小时，得到活化后CD8 T细胞(方法同实施例1的2)；再将转染 pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR获得的逆转录病毒、转染pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR获得的逆转录病毒和转染 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR获得的逆转录病毒分别感染已活化的CD8 T细胞，得到重组细胞命名为 sgNT-mCD19CAR，sgZc3h12a-mCD19CAR和CAR19T_IF细胞 (sgZc3h12a/sgBcor细胞)(方法同实施例1的3)，将感染24小时获得的上述细胞分别鼠尾静脉输入到C57bl/B6小鼠(以下简称为B6 小鼠)，输入方式具体如下：

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成3组，即对照(sgNT) 组(4只)、sgZc3h12a组(4只)和sgBcor/Zc3h12a组(4只)。

对照(sgNT)组：将实施例1方法制备的未敲除基因的mCD19CAR 细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgNT组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×10⁵个未敲除基因的mCD19CAR细胞；

sgZc3h12a组：将实施例1方法制备的敲除Zc3h12a的mCD19CAR 细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgZc3h12a组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×10⁵个敲除Zc3h12a基因的mCD19CAR细胞；

sgBcor/Zc3h12a组(命名为CAR19T_IF)：将实施例1方法制备的敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgBcor/Zc3h12a组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×10⁵个敲除Bcor和Zc3h12a基因的mCD19CAR细胞。

PBS组不回输T细胞，输入等体积的PBS作为处理对照。

分别在回输后第7天和第2个月时，用Thy1.1抗体(敲除载体上带有Thy1.1筛选标签)每周流式分析每只小鼠的外周血内回输的未敲除基因的mCD19CAR细胞、敲除Bcor的mCD19CAR细胞、敲除 Zc3h12a的mCD19CAR细胞和同时敲除Bcor和Zc3h12a的 mCD19CAR细胞占总CD8 T细胞的比例。

结果如图2b所示，对照组(图中以“sgNT”表示)向小鼠回输 4×10⁵个未敲除基因的mCD19CAR细胞，第7天和第2个月时这些回输的mCD19CAR细胞只占外周血总CD8 T细胞的0和0.64％；第 7天和第2个月sgZc3h12a组(图中以“sgZc3h12a”表示)敲除Bcor 的mCD19CAR细胞占外周血总CD8 T细胞的68.8％和0.35％，第7 天和第2个月sgBcor/Zc3h12a组(图中以“sgBcor/Zc3h12a”表示) 同时敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞占外周血总CD8 T细胞的72.7％和60.2％。

上述结果表明，无需对小鼠进行任何预处理，敲除Zc3h12a后可促进回输的mCD19CAR细胞7天时间内在正常B6小鼠体内高效扩增，但是其在2个月时无法增殖，表明体内持久性差；而同时敲除 Bcor和Zc3h12a无论是回输后7天还是回输后2个月均显著增强mCD19CAR细胞扩增，具有显著的协同效应，其在体内细胞存活时间长。

分别统计回输小鼠后8周内流式分析小鼠外周血中各组回输的 mCD19CAR细胞(Thy1.1+CD8 T细胞)占总CD8T细胞的比例的变化，结果如图2c所示，PBS为PBS对照组，sgNT为sgNT组，sgZc3h12a 为sgZc3h12a组，sgBcor/Zc3h12a为sgBcor/Zc3h12a组，可以看出，同时敲除Bcor和Zc3h12a回输时间增加，其回输细胞仍然显著扩增，表明该细胞在体内存活的持久性显著高于其他组回输细胞。

在回输6个月时，取小鼠脾脏细胞，流式分析检测小鼠脾中内源 CD19+细胞(抗体为CD19-biotin，BioLegend#101504)占总脾细胞的比例，结果如图2d所示，sgNT为sgNT组，sgBcor/Zc3h12a为 sgBcor/Zc3h12a组，可以看出，与sgNT相比，在回输6个月后， sgBcor/Zc3h12a组小鼠脾中仍然检测不到内源性CD19表达B细胞，表明单次回输CAR19T_IF即可长效发挥清除靶向细胞的效应。

实施例3、同时敲除Zc3h12a和Bcor基因产生的CAR19T_IF具有真正的干细胞性质，可在不同批次小鼠中反复传代而不出现耗竭；单独敲除Zc3h12a或Bcor基因的mCD19 CAR-T细胞不具备干细胞性质

基因敲除的mCD19 CAR-T细胞制备方法与实施例2相同。流程图如图3a，从第一代小鼠中取出CAR19T_IF，计数，通过尾静脉输入第二代小鼠(每只小鼠输入10⁶细胞)。一个月后，重复上述操作，将第二代CAR19T_IF输入第三代小鼠，并如此反复6次。野生型mCD19 CAR-T细胞以及单独敲除Zc3h12a或Bcor基因的mCD19 CAR-T细胞在第一代小鼠回输一个月的时候，脾脏中无mCD19 CAR-T细胞，因此无法进行传代实验。

结果如图3b-3e所示，在反复传代的过程中脾脏中CAR19T_IF无明显的比例和数目减少，每一代小鼠中所有CD19+B细胞全部内清除。这里需要指出，真正的干细胞如造血干细胞在类似的条件下只能传3-4代。该实验结果表明CAR19T_IF具有真正的干性，同时保留了成熟T细胞的杀伤功能。

图3f显示了CAR19T_IF细胞在体外不能存活，表明CAR19T_IF没有转化为肿瘤细胞。

如图3g所示，在传代过程中本发明将CAR19T_IF细胞使用CSFE 进行标记，以检测CAR19T_IF的干性是否由一小群增殖缓慢的细胞介导。在该实验中，CSFE的信号与细胞分裂此次成反比，细胞分裂次数越多，CSFE细胞越低。结果如图3h和3i所示，在上一代小鼠中经历过多次分裂的CAR19T_IF仍然能够在下一代小鼠大量扩增。因此， CAR19T_IF细胞的干性不是一小群细胞介导的，整个CAR19T_IF细胞群体均具备干性。

实施例4、少量(500个)CAR19T_IF即可在体内无预处理情况下高效扩增并清除所有靶细胞，但CAR19T_IF具有自限性且不会过度增殖

将上述实施例2回输CAR19T_IF细胞的受体小鼠在回输一个月后，取受体小鼠脾脏细胞，流式无菌分离Thy1.1阳性(敲除载体上带有 Thy1.1筛选标签)的细胞，即为第二代CAR19T_IF细胞；再将分离第 2代CAR19T_IF细胞再次回输到B6小鼠中，再次分离CAR19T_IF细胞即为第三代CAR19T_IF细胞。

向B6小鼠体内按照10倍梯度稀释的回输第三代CAR19T_IF细胞的实验设计流程如图4a所示：将第三代CAR19T_IF细胞用PBS稀释，得到不同浓度的细胞悬液，使细胞数量为5×10⁶-5×10²个；再将不同浓度的细胞悬液鼠尾回输至B6小鼠体内；每个浓度回输3-6只小鼠。回输6周后用Thy1.1抗体流式分析各浓度回输的CAR19T_IF细胞的B6受体小鼠脾中的CAR19T_IF细胞(即为Thy1.1+)占总脾细胞的比例和数量。

回输后6周，用流式分析检测小鼠脾中CD19+细胞和Thy1.1+ CAR19T_IF的比例和数目。结果如图4b，4c和4d所示，尽管细胞输入存在10000倍的差异，CAR19T_IF细胞在不同组之间显示出相似的百分比和细胞数量，表明CAR19T_IF细胞在体内具有可饱和的特性。同时，低至只有500个CAR19T_IF细胞就足以在没有任何预处理的条件下大量扩增并清除小鼠体内所有数亿计的CD19+B细胞，证明了 CAR19T_IF细胞的优越功能。

上述结果表明，CAR19T_IF细胞与干细胞一样具有几乎无限的自我更新能力，仅需少数细胞即可大量扩增并杀伤靶细胞。

实施例5、CAR19T_IF在无预处理情况下回输抑制结肠癌MC38肿瘤生长并延长荷瘤小鼠存活期

图5a为实验流程图，具体如下：

产生表达mCD19的MC38细胞系，即MC38-mCD19。

pMSCV-mCD19-IRES-GFP重组质粒的构建：首先，使用限制性内切酶XhoI(NEB#R0146L)和HpaI(NEB#R0105S)酶切载体pMSCV (Addgene#162750)，胶回收获得pMSCV质粒骨架DNA；通过Q5 聚合酶(NEB#M0491L)体系，以C57BL/6小鼠外周血cDNA为模板，PCR扩增获得携带相应酶切位点的C57BL/6小鼠CD19参见 UniProtKB-P25918(CD19_MOUSE)；将纯化后的携带相应酶切位点的C57BL/6小鼠CD19 cDNA编码序列和pMSCV质粒骨架DNA经 Blunt TA连接酶(NEB#M0367L)，获得重组质粒。最后经酶切鉴定和测序确认，获得pMSCV-mCD19-IRES-GFP重组质粒。

按实施例1中的方法将pMSCV-mCD19-IRES-GFP重组质粒和 pCL-Eco共转染Phoenix-Eco细胞制备表达mCD19的逆转录病毒 (pMSCV-mCD19-IRES-GFP)；再将表达mCD19的逆转录病毒 (pMSCV-mCD19-IRES-GFP)转染MC38细胞(ATCC#CRL-2599)，分选和扩增GFP和mCD19双阳性细胞，即为MC38-mCD19。

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成2组，即对照组(4 只)和CAR19T_IF组(4只)，每组每只皮下接种2×10⁵个MC38-mCD19 肿瘤细胞，接种10天后：将实施例1制备逆转录病毒感染24小时得到的CAR19T_IF细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至CAR19T_IF组的每只小鼠，每只小鼠鼠尾静脉移输入3×10⁶个CAR19T_IF细胞；对照组每只小鼠输入同体积PBS。此后，每三天测量一次所有小鼠的肿瘤大小(肿瘤面积mm²)和最终小鼠的成活率(实验流程如图5a 所示)。

按照接种肿瘤细胞后的不同时间统计各组小鼠肿瘤大小，结果如图5b所示，与对照组小鼠的肿瘤面积相比，回输CAR19T_IF细胞的小鼠的肿瘤面积显著缩小，表明敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞可以显著抑制肿瘤生长。

按照接种肿瘤细胞后的不同时间统计各组小鼠存活率，结果如图 5c所示，可以看出，CAR19T_IF细胞不仅显著抑制了肿瘤的生长，还极大地延长了结肠癌模型小鼠的存活期。

上述结果显示，对照组小鼠皮下接种MC38-mCD19结肠瘤细胞后，MC38-mCD19瘤细胞在皮下迅速成瘤并生长，输入了CAR19T_IF后，小鼠肿瘤的生长被显著抑制，并极大地延长了小鼠的存活期。

实施例6、CAR19T_IF对肿瘤具有免疫记忆保护作用，防止肿瘤复发。预接种CAR19T_IF的小鼠抑制结肠癌MC38的生长以及黑色素瘤 B6F10-mCD19肺转移肿瘤负荷并延长荷瘤小鼠存活期

图6a为流程图：

1、结肠癌模型

为了产生表达mCD19的MC38细胞系，即MC38-mCD19：用表达mCD19的逆转录病毒pMSCV-mCD19-IRES-GFP转染MC38细胞，分选和扩增GFP+和mCD19双阳性MC38细胞。

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成2组：

对照-MC38组(5只)：输入PBS。

CAR19T_IF-MC38组(10只)：将实施例1制备的逆转录病毒感染24小时得到的敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞 (CAR19TIF)用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至CAR19T_IF-MC38 组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×10⁵个CAR19T_IF细胞；

一个月后，每组每只小鼠皮下接种2×10⁵个MC38-mCD19肿瘤细胞。

结肠癌MC38实验每三天测量一次所有小鼠的肿瘤大小(肿瘤面积mm²)和最终小鼠的成活率。

按照接种肿瘤细胞后的不同时间统计各组小鼠肿瘤大小结果如图6b所示，与对照组相比，回输同时敲除Bcor和Zc3h12a的 mCD19CAR细胞(CAR19T_IF)的小鼠的肿瘤面积显著缩小，表明敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR细胞可以显著抑制肿瘤生长。

按照接种肿瘤细胞后的不同时间统计各组小鼠存活率，结果如图 6c所示，可以看出，与对照组的小鼠存活率相比，回输同时敲除Bcor 和Zc3h12a的mCD19CAR细胞(CAR19T_IF)不仅显著抑制了肿瘤的生长，还极大地延长了结肠瘤模型小鼠的存活期。

2、黑色素瘤模型

流程图如图6d所示。

为了产生表达mCD19的B6F10细胞系(来源于ATCC， CRL-6475)，即B6F10-mCD19：用表达mCD19的逆转录病毒 pMSCV-mCD19-IRES-GFP转染B6F10细胞(ATCC Cat#CRL-6475)，分选和扩增GFP+和mCD19双阳性B6F10细胞。

将体重为20-25g的6-8周龄的B6小鼠分成2组：

对照-B6F10组(5只)：输入PBS。

CAR19T_IF-B6F10组(10只)：将实施例1制备的逆转录病毒感染24小时得到的CAR19T_IF细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至CAR19T_IF-B6F10组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×10⁵个 CAR19T_IF细胞；

一个月后，每组每只小鼠鼠尾注射1×10⁵个B6F10-mCD19肿瘤细胞。

3周后检查小鼠肺肿瘤负荷，并监测小鼠存活。

3周后取小鼠肺组织，检测小鼠肺肿瘤负荷结果如图6e所示，可以看出，与对照组相比，回输同时敲除Bcor和Zc3h12a的mCD19CAR 细胞(CAR19T_IF)肺组织没有黑色素瘤富集，表明CAR19T_IF抑制黑色素瘤肺转移。

统计接种B6F10-mCD19细胞后不同时间小鼠存活率，结果如图6f所示，可以看出，与对照组相比，回输同时敲除Bcor和Zc3h12a 的mCD19CAR细胞(CAR19T_IF)不仅显著抑制了肿瘤的生长和转移，还极大地延长了黑色素瘤模型小鼠的存活期。

上述结果显示，少量预注射CAR19T_IF细胞的小鼠，几周后仍能有效地阻断移植MC38瘤细胞或黑色素瘤B16F10-mCD19的生长和转移，表明CAR19T_IF细胞有记忆效应，能够提供针对肿瘤的长期免疫记忆。

实施例7、使用靶向人hCD19分子的CAR诱导CAR19T_IF细胞的构建和鉴定

图7a为在人源化CD19(hCD19)小鼠中连续转移hCAR19T_IF细胞的实验设计示意图，具体如下：

从Cas9+B6小鼠脾和淋巴结分离CD8 T细胞，经CD3/CD28活化24小时后，得到活化后CD8 T细胞(方法同实施例1的2)；再将转染pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-人源CD19-CAR或 pMSCV-hU6-sgBcor-mU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-人源 CD19-CAR获得的逆转录病毒分别感染已活化的CD8 T细胞，分别命名为sgNT-hCD19CAR和hCAR19T_IF(sgZc3h12a/sgBcor)细胞，将感染24小时获得的上述细胞分别鼠尾静脉输入感染后的细胞到人源化CD19转基因B6小鼠(hCD19)中，1个月后在第一代受体小鼠中检测并分离hCAR19T_IF并鼠尾输入到新的hCD19小鼠受体(即为第二代受体)，1个月后流式分析检测。

具体如下：

1、人源化基因敲除载体的构建

本实施例构建了基于逆转录病毒的sgRNA表达载体，即 pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-人源CD19-CAR和， pMSCV-hU6-sgBcor-mU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-人源CD19-CAR；

pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-人源CD19-CAR与实施例1 中的pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR区别仅在于将 SEQ ID NO:1第1265-2692位的鼠源CD19-CAR替换为人源 CD19-CAR；人源CD19-CAR的核苷酸序列为SEQ ID No:8 (Hu19-CD828Z)。

pMSCV-hU6-sgBcor-mU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-人源 CD19-CAR与实施例1中的 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR区别仅在于该载体中鼠源CD19-CAR替换为人源CD19-CAR；人源 CD19-CAR的核苷酸序列为hCD19-CAR(Hu19-CD828Z)的cDNA 序列。

2、初始CD8 T细胞的分离和激活

与实施例1的1相同。

3、敲除Bcor和Zc3h12a的人源CD19-CAR细胞的构建

与实施例1的1相同，不同的仅是逆转录病毒载体 pMSCV-hU6-sgBcor-mU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-人源 CD19-CAR替换pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A，得到同时敲除Bcor和Zc3h12a(表示为sgBcor/Zc3h12a) 的人源CD19CAR细胞，命名为hCAR19T_IF。

4、未敲除基因的CD8 T细胞的构建

与实施例1的1相同，不同的仅是将逆转录病毒载体 pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-人源CD19-CAR替换 pMSCV-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR，得到未敲除基因的人源CD19CAR细胞(sgNT-hCD19CAR)。

上述细胞鉴定方式与实施例1相同。

5、敲除Zc3h12a和Bcor基因在无预处理的情况下回输的 hCAR19T_IF细胞高效扩增

经上述逆转录病毒感染已活化的CD8T细胞24小时后得到的 hCAR19T_IF，鼠尾静脉输入到人源化CD19转基因B6小鼠(hCD19 小鼠)中。具体如下：

将体重为20-25g的6-8周龄的hCD19小鼠分成2组，即sgNT 组(3只)和sgBcor/Zc3h12a组(3只)；

sgNT组：将上述未敲除基因的hCD19CAR细胞 (sgNT-hCD19CAR)用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgNT组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至4×10⁵个未敲除基因的 sgNT-hCD19CAR细胞；

sgBcor/Zc3h12a组：将上述hCAR19T_IF细胞用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至sgBcor/Zc3h12a组的每只小鼠，每只小鼠尾回输至 4×10⁵个敲除Bcor和Zc3h12a基因的hCD19CAR细胞。

PBS组不回输T细胞，输入等体积的PBS作为处理对照。

1个月后在第一代受体小鼠中检测并分离hCAR19T_IF，再次按照第一代输入方式鼠尾输入到新的hCD19小鼠受体(即为第二代受体)， 1个月后流式分析检测。

在第一代回输和第二代回输后1个月分别用流式分析小鼠外周血，Thy1.1+和hCD19+阳性B细胞(APC抗人CD19，Biolegend #302212)的比例，结果如图7b所示，可以看出，在没有对小鼠进行任何预处理的条件下，PBS对照组无Thy1.1阳性细胞，为57.4％的脾细胞为hCD19+B细胞；第一代(图中为1°)中脾中19.8％左右的细胞为Thy1.1+hCAR19T_IF，0.1％hCD19+B细胞；第二代(图中为2°) 中脾中29.1％左右的细胞为Thy1.1+hCAR19T_IF，0％hCD19+B细胞。

在第一代回输和第二代回输后1个月分别用流式分析小鼠脾中 hCAR19T_IF的比例和绝对数量进行统计学分析，结果如图7c和7d所示，可以看出，在没有对小鼠进行任何预处理的条件下，PBS对照组无Thy1.1阳性细胞，第一代(图中为1°)中脾中20％左右的细胞为Thy1.1阳性，第二代(图中为2°)中脾中40％左右的细胞为Thy1.1 阳性细胞(即hCAR19T_IF细胞)。

上述结果表明，与mCAR19-T_IF细胞(即CAR19T_IF)一致， hCAR19-T_IF细胞(即hCAR19T_IF)可以在人源化CD19小鼠中保持其干细胞样的活性，Zc3h12a和Bcor两个基因同时敲除的hCD19CART 细胞展现了与干细胞一样具有几乎无限的自我更新能力，但保留了成熟T细胞的功能。

实施例8、CAR19T_IF表达分泌型IL23R融合蛋白质的mCD19CAR (CAR19T_IF-IL23R)细胞构建和CAR19T_IF-IL23R细胞过继治疗对小鼠硫酸葡聚糖诱导肠炎的抑制作用

1、CAR19T_IF-IL23R细胞制备

1)pMSCV-EFS-spIl2-IL23R-mIgG2a-Fc重组质粒的构建

首先，使用基因合成的方法得到分泌型的IL23R-mIgG2a-Fc质粒。 IL2分泌肽-IL23R-mIgG2a-Fc融合蛋白质的序列为SEQ ID NO:9。获得重组质粒。最后经酶切鉴定和测序确认，获得 pMSCV-EFS-spIl2-IL23R-mIgG2aFc重组质粒。

2)CD8 T细胞活化

与实施例1的2相同：从Cas9+B6小鼠脾和淋巴结分离CD8 T 细胞，经CD3/CD28活化24小时，得到活化后CD8 T细胞；

3)CAR19T_IF-IL23R细胞

将

pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR转染Phoenix-Eco细胞，得到表达 pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR的逆转录病毒；

将pMSCV-EFS-spIl2-IL23R-mIgG2aFc转染Phoenix-Eco细胞，得到表达pMSCV-EFS-spIl2-IL23R-mIgG2aFc的逆转录病毒；

再将上述2种逆转录病毒共感染已活化的CD8 T细胞，得到重组细胞命名为CAR19T_IF-IL23R，感染24小时后鼠尾静脉输入感染后的细胞到B6小鼠。

上述CAR19T_IF-IL23R也可以将pMSCV-EFS-spIl2-IL23R-mIgG2aFc通过逆转录病毒转染CAR19T_IF细胞得到。

2、Western blot蛋白检测

将上述1制备的CAR19T_IF-IL23R细胞，分别收获细胞培养上清和细胞，将细胞用细胞裂解液RIPA冰上裂解。随后经4℃，12,000rpm 离心后，小心吸取细胞裂解液上清。将蛋白样品经SDS-PAGE进行分离，后经半干转转膜仪转至PVDF膜上。随后，将PVDF封闭后，孵育抗体后显色。以实施例1制备的CAR19T_IF细胞为对照。

结果如图8a和图8b所示，可以看出，与对照相比， CAR19T_IF-IL23R细胞(图中以IL23R表示)分泌IL23R蛋白。

3、CAR19T_IF-IL23R回输抑制硫酸葡聚糖诱导的肠炎

流程如图8c所示，具体如下：

将体重为25g左右的8-10周龄的B6小鼠分成2组：

CAR19T_IF组(5只)：B6小鼠鼠尾静脉回输1×10⁶CAR19T_IF细胞，具体方法同前。

CAR19T_IF-IL23R组(5只)：B6小鼠鼠尾静脉回输1×10⁶ CAR19T_IF-IL23R细胞，具体方法同前。

在细胞回输后的4周，饲喂小鼠4％硫酸葡聚糖(DSS)5天，诱导引发肠炎。

饲喂后，每日称量小鼠体重，计算不同时间小鼠体重和其起始体重的比例；观察小鼠体征并监测小鼠粪便是否异常。

饲喂后不同时间的小鼠体重和其起始体重的比例结果如图8d可以看出，与回输CAR19T_IF组相比，回输CAR19T_IF-IL23R细胞的小鼠体重下降，表明分泌IL23R的CAR19T_IF-IL23R细胞可显著抑制硫酸葡聚糖诱导的肠炎。

实施例9、同时敲除Bcor和Zc3h12a促进GD2 CAR-T细胞扩增并持久存在(GD2T_IF)，单独敲除Bcor或Zc3h12a不能促进GD2 CAR-T 细胞扩增

图9a显示了GD2 CAR的结构，其中靶向GD2抗原的scFv是来源于单克隆抗体14g2的识别GD2的scFv蛋白质，其核酸序列为SEQ ID NO:10(参见A chimeric T cell antigenreceptor that augments cytokine release and supports clonal expansion ofprimary human T cells. Mol.Ther.12,933–941(2005))。

流程图如图9b所示，GD2 CAR-T细胞的制备方法与实施例1相同，仅使用的scFv不同。

输入细胞后28天，检测脾脏中的GD2 CAR-T细胞比例。结果如图9c和9d所示，只有同时敲除Bcor和Zc3h12a的GD2 CAR-T才能在无预处理的情况下在小鼠体内扩增，单独敲除Bcor或Zc3h12a无任何效应。同时敲除Bcor和Zc3h12a的GD2 CAR-T细胞命名为 GD2T_IF。

实施例10.GD2T_IF具有干细胞性质，可在B6小鼠和NSG小鼠中传代，同时保留T细胞的功能；但不会在小鼠体内成瘤，具有安全性

流程图如图10a所示，GD2 CAR-T细胞的制备方法与实施例1 相同。将第一代GD2T_IF在无预处理情况下输入第二代小鼠，并重复该实验到第三代和第四代小鼠。第一代的受体小鼠为B6小鼠，第二代起受体小鼠分为两种，一种为B6小鼠，另外一种为免疫缺陷的NSG(购自南模生物)。

每一代输入细胞后一个月，检测脾脏中的GD2T_IF比例和数目(图 10b-10g)，以及表型(图10i和10j)和功能(图10k-10m)。结果如图10b-10g所示，在无任何预处理的条件下，GD2T_IF能够在B6小鼠和NSG小鼠中反复传代，表明GD2T_IF具备真正的干性，这与 CAR19T_IF(实施例3)相似。该实验结果表明，同时敲除Bcor和Zc3h12a 诱导的T细胞干性具有普适性，不局限于特定的CAR。同时，GD2T_IF不能在高度免疫缺陷的NSG小鼠中成瘤，表明GD2T_IF没有转化为肿瘤细胞，具有安全性。

如图10h所示，GD2T_IF不能在体外存活，表明GD2T_IF没有转化为肿瘤细胞，具有安全性。

如图10i和10j所示，流式细胞分析显示，GD2T_IF表现为 CD44+CD62L+的记忆性T细胞表型，符合其干细胞性质。

如图10k-10m所示，流式细胞分析显示，GD2T_IF能够分泌IFNg，表明GD2T_IF具有T细胞功能。

实施例11、同时敲除Bcor和Zc3h12a促进EGFR CAR-T细胞扩增并持久存(EGFRT_IF)，单独敲除Bcor或Zc3h12a不能促进EGFR CAR-T细胞扩增

图11a显示了EGFR CAR的结构，其中靶向EGFR抗原的scFv 是来源于单克隆抗体Cetuximab的识别EGFR的scFv蛋白质，其核苷酸序列为SEQ ID NO:11(参见H.G.Caruso,L.V.Hurton,A.Najjar, D.Rushworth,S.Ang,S.Olivares,T.Mi,K.Switzer,H.Singh,H.Huls, D.A.Lee,A.B.Heimberger,R.E.Champlin,L.J.N.Cooper,Tuning sensitivityof CAR to EGFR density limits recognition of normal tissue while maintainingpotent antitumor activity.Cancer Res.75,3505–3518 (2015))。实验流程图如图11b所示，EGFR CAR-T细胞的制备方法与实施例1类似。输入细胞后28天，检测脾脏和骨髓中的EGFR CAR-T细胞比例。结果如图11c和11d所示，只有同时敲除Bcor和 Zc3h12a的EGFR CAR-T才能在无预处理的情况下在小鼠体内扩增，单独敲除Bcor或Zc3h12a无任何效应。同时敲除Bcor和Zc3h12a的 EGFR CAR-T细胞命名为EGFRT_IF。

实施例12、EGFRT_IF细胞具有干细胞性质，可在B6小鼠中传代，同时保留T细胞的功能；但不会在小鼠体内成瘤，具有安全性

流程图如图12a所示，EGFR CAR-T细胞的制备方法与实施例9 相同。将第一代GD2T_IF在无预处理情况下输入第二代小鼠。

每一代输入细胞后一个月，检测脾脏中的GD2T_IF比例和数目。如图12b-12d所示，在无任何预处理的条件下，EGFRT_IF能够在B6 中传代，表明EGFRT_IF具备干性，这与CAR19T_IF(实施例3)相似。该实验结果再次表明，同时敲除Bcor和Zc3h12a诱导的T细胞干性具有普适性，不局限于特定的CAR。

如图12e所示，GD2T_IF不能在体外存活，表明GD2T_IF没有转化为肿瘤细胞，具有安全性。

实施例13、EGFRT_IF在无预处理条件下抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长

如实施例11所示，野生型EGFR CAR-T细胞，单独敲除Bcor 或Zc3h12a的EGFR CAR-T细胞在无预处理的条件下均不能在免疫正常的小鼠体内扩增(图11)。因此，在本实施例中，没有使用这三种细胞作为对照，仅以PBS作为对照。

图13a为实验流程图，具体如下：

制备表达EGFR的CT26细胞系，即CT26-EGFR. LentiCas9-EGFR-T2A-Thy1.1重组质粒的构建：首先，使用限制性内切酶AgeI(NEB#R3552L)和EcoRI(NEB#R3101L)酶切载体lentiCas9-Blast(Addgene#52962)，胶回收获得LentiCas9质粒骨架 DNA；通过Q5聚合酶(NEB#M0491L)体系，以质粒 pHAGE-CMV-EGFR-puro和pMIG-hU6-sgNT-EFS-Thy1.1-鼠源CD19-CAR为模板，通过巢氏PCR扩增获得携带相应酶切位点的 EGFR-T2A-Thy1.1 cDNA编码序列；将纯化后的携带相应酶切位点的 EGFR-T2A-Thy1.1 cDNA编码序列和LentiCas9质粒骨架DNA经 Blunt TA连接酶(NEB#M0367L)，获得重组质粒。最后经酶切鉴定和测序确认，获得LentiCas9-EGFR-T2A-Thy1.1重组质粒。

将LentiCas9-EGFR-T2A-Thy1.1重组质粒和病毒包装质粒 psPAX2/pMD2.G共转染293T细胞制备表达EGFR的慢病毒 (LentiCas9-EGFR-T2A-Thy1.1)；再将表达EGFR的逆转录病毒 (LentiCas9-EGFR-T2A-Thy1.1)转染CT26细胞(ATCC#CRL-2638)，分选和扩增Thy1.1阳性细胞，即为CT26-EGFR。

将体重为20-25g的6-8周龄的Balb/c和B6的F1小鼠分成2组，即对照组(8只)和EGFRT_IF组(6只)，每组每只皮下接种1×10⁶个 CT26-EGFR肿瘤细胞。接种肿瘤3天后，制备EGFRT_IF细胞，方法与实施例11类似，其中CD8 T细胞来自Balb/c和B6的F1代小鼠。 EGFRT_IF用PBS配置成细胞悬液，鼠尾回输至EGFRT_IF组的每只小鼠，每只小鼠鼠尾静脉移输入7×10⁵个CAR19T_IF细胞；对照组每只小鼠输入同体积PBS。此后，每三天测量一次所有小鼠的肿瘤大小(肿瘤面积mm2)(实验流程如图13a所示)。

按照接种肿瘤细胞后的不同时间统计各组小鼠肿瘤大小，结果如图13b所示，与对照组小鼠的肿瘤面积相比，回输EGFRT_IF细胞的小鼠的肿瘤面积显著缩小，EGFRT_IF细胞可以显著抑制肿瘤生长。

上述结果显示，对照组小鼠皮下接种CT26-EGFR结肠瘤细胞后， CT26-EGFR瘤细胞在皮下迅速成瘤并生长，输入了EGFRT_IF细胞后，小鼠肿瘤的生长被显著抑制。

实施例14.GD2T_IF作为载体持续体内分泌TNF诱导慢性炎症的疾病模型(GD2T_IF-TNF)

图14a为实验原理图，通过在GD2T_IF细胞中过表达炎症因子 TNF，作为简单快速建立炎症疾病模型的方法。GD2T_IF的制备方法与实施例9类似，制备过程同时感染过表达TNF的病毒。本发明构建了pMSCV-EF1a-GFP-P2A-TNF重组质粒的构建。其中人TNF参见UniProtKB-P01375(TNFA_HUMAN)。将基因敲除病毒与 pMSCV-EF1a-GFP-P2A-TNF病毒共感染小鼠T细胞，Thy1.1+GFP+ 双阳性的CD8 T细胞即为GD2T_IF-TNF。将GD2T_IF-TNF或GD2T_IF(对照)回输入小鼠，检测外周血细胞的比例，并记录小鼠的体重变化。

实验结果如图14b-14d所示，输入GD2T_IF-TNF的小鼠出现显著的炎症性髓系细胞增多(CD11b+)，这些小鼠出现体重下降(图14e)。这些结果表明，GD2T_IF-TNF回输导致小鼠出现慢性炎症。因此， GD2T_IF可以作为一种细胞载体，在体内持续分泌炎症因子，用于建立各种疾病模型。本方法的优势在于只需要一次输入细胞，不需要反复给药。

实施例15.GD2T_IF细胞作为载体持续分泌IL-5诱导嗜酸性粒细胞增多症模型(GD2T_IF-IL-5)

图15a为实验原理图，通过在GD2T_IF细胞中过表达嗜酸性粒细胞的生长因子IL-5，作为简单快速建立嗜酸性粒细胞增多症的方法。整体实施过程与实施例14类似。GD2T_IF的制备方法与实施例9类似，制备过程过同时感染过表达IL-5的病毒。本发明构建了 pMSCV-EF1a-GFP-P2A-IL-5重组质粒的构建。其中小鼠IL-5参见 UniProtKB-P04401(IL5_MOUSE)。将基因敲除病毒与 pMSCV-EF1a-GFP-P2A-IL-5病毒共感染小鼠T细胞，Thy1.1+GFP+ 双阳性的CD8 T细胞即为GD2T_IF-IL-5。将GD2T_IF-IL-5或GD2T_IF(对照)回输入小鼠，检测外周血细胞的比例。

实验结果如图15b-15d所示，输入GD2T_IF-IL-5的小鼠外周血嗜酸性粒细胞(SiglecF+)显著增多。因此，GD2T_IF可以作为一种细胞载体，在体内分泌各种生长因子，用于建立各种疾病模型和治疗疾病。本方法的优势在于只需要一次输入细胞，不需要反复给药。

实施例16.GD2T_IF细胞作为载体持续分泌GLP1治疗肥胖和糖尿病 (GD2T_IF-GLP1)

图16a为实验原理图，通过在GD2T_IF细胞中过表达GLP1，用于治疗肥胖和糖尿病。GLP1及其受体的激动剂已经被FDA批准用于治疗肥胖和糖尿病，但是所有这些药物均需要反复给药。本实施例利用GD2T_IF细胞在体内持续分泌GLP1，通过一次给药达到治愈的目的。

整体实施过程与实施例14类似。GD2T_IF的制备方法与实施例9 类似，制备过程过同时感染过表达GLP1的病毒。本发明构建了 pMSCV-EF1a-GFP-P2A-GLP1重组质粒的构建。分泌型GLP1(sGLP1) 序列经全基因合成，其核苷酸序列为SEQ ID NO:12，此序列带有DPP4 识别位点点突变的序列，并融合到mIgG2a-Fc段，以此增加GLP1的半衰期。将基因敲除病毒与pMSCV-EF1a-GFP-P2A-GLP1病毒共感染小鼠T细胞，Thy1.1+GFP+双阳性的CD8 T细胞即为GD2T_IF-GLP1。将GD2T_IF-GLP1或GD2T_IF(对照)回输入5周龄小鼠，一周后小鼠开始喂食高脂饲料。同周龄的喂食正常饲料小鼠作为检测治疗效果的基线。

实验结果如图16b和16c所示，喂食高脂饲料后，输入 GD2T_IF-GLP1小鼠的体重增加显著低于输入GD2T_IF的小鼠，且输入 GD2T_IF-GLP1小鼠的体重增加与同周龄的喂食正常饲料小鼠无差别。该结果表明，GD2T_IF-GLP1对于高脂饲料引起的肥胖具有显著的治疗作用，该疗法只需给药一次，药效持久。因此，GD2T_IF可以作为一种细胞载体，在体内分泌各种具有治疗作用的分子，用于治疗各种需要反复给药的慢性疾病。本方法的优势在于只需要一次输入细胞即可长期有效，不需要反复给药。

本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请出于所有目的以引用的方式整体并入本文。但是，本文中引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开和专利申请的提及均不是并且不应当被认为承认或以任何形式暗示它们构成了有效的现有技术或构成世界上任何国家的公知常识的一部分。

Claims

1.一种重组免疫细胞，其中BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除。

2.根据权利要求1所述的重组免疫细胞，其特征在于：所述的免疫细胞选自T细胞、B细胞、NK细胞、肥大细胞、肿瘤浸润淋巴细胞中的一种或数种，优选T细胞或NK细胞；所述T细胞选自CD4+CD8+T细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、效应T细胞、抑制性T细胞、原始T细胞、记忆T细胞、γ-δT细胞、α-βT细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞或NKT细胞中的一种或数种。

3.根据权利要求1或2所述的重组免疫细胞，所述重组免疫细胞为重组T细胞，重组T细胞不含BCOR基因和ZC3H12A基因，或所述重组T细胞的BCOR基因产物和ZC3H12A基因产物的生物学功能被抑制。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：采用基因敲除技术、基因沉默技术、失活突变技术、PROTAC技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：与未修饰或对照免疫细胞相比，BCOR基因和ZC3H12A基因的表达或功能分别地被降低了至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组免疫细胞，所述重组免疫细胞进一步包括一种或多种用于细胞过继治疗的结构。

7.根据权利要求6中所述的重组免疫细胞，所述用于细胞过继治疗的相应结构为嵌合抗原受体(CAR)结构、T细胞抗原受体(TCR)结构、基于配受体结合的受体结构或T细胞受体和抗原受体(synthetic T cell receptor and antigen receptor，STAR)。

8.根据权利要求7所述的重组免疫细胞，所述抗原受体结合的抗原选自RORl、Her2、Ll-CAM、CD4、CD5、CD8、CD19、CD20、BCMA、CD7、Clauding 18.2、GPC3、MSLN、AFP、CD22、间皮素、CEA、乙型肝炎表面抗原、抗叶酸受体、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、EGFR、EGFRVIII、EGP-2、EGP-4、EPHa2、ErbB2、ErbB3、ErbB4、FBP、胎儿型乙酰胆碱受体、GD2、GD3、HMWMAA、IL-22R-α、IL-13R-α2、kdr、κ轻链、Lewis Y、L1-细胞黏附分子(CD171)、MAGE-A1、间皮素、MUC1、MUC16、PSCA、NKG2D配体、NY-ESO-1、MART-1、gp100、瘤胚抗原、TAG72、VEGF-R2、癌胚抗原(CEA)、前列腺特异性抗原、PSMA、雌激素受体、孕酮受体、肝配蛋白B2、CD123、CS-1、c-Met、MAGE A3、CE7、肾母细胞瘤1(WT-1)、周期蛋白A1(CCNA1)、白细胞介素12或其他肿瘤相关抗原中的一种或数种。

9.根据权利要求1-8中任一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：所述重组免疫细胞是源自哺乳动物的免疫细胞。

10.根据权利要求1-9任一所述的重组免疫细胞，其特征在于：所述重组免疫细胞还含有表达用于治疗疾病的生物分子的基因。

11.权利要求10所述的重组免疫细胞，其中所述表达治疗疾病的生物分子选自：细胞因子、激素、生长因子、凝血因子、趋化因子、共刺激分子、活化肽、抗体或其抗原结合片段。

12.权利要求10所述的重组免疫细胞，其中所述治疗疾病的生物分子选自IL-23R蛋白、IL-4R抗体、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-22、IL-23、IL-24、TNF、TNF-α、GM-CSF、CD40L、CTLA-4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、GLP1中的一种或数种。

13.权利要求1-12中任意一项所述的重组免疫细胞，其特征在于：在给与受试者至少1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、18个月、2年、5年、10年、20年、40年之后，在受试者外周血能够检测到所述重组免疫细胞。

14.权利要求13所述的重组免疫细胞，其特征在于：在给与受试者至少1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月之后，相对于同类免疫细胞总量，所述BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除的重组免疫细胞的比例不低于20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％；或者相对于外周血细胞总数，所述BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除的重组免疫细胞的比例为1％-35％、3-30％或3-20％。

15.一种制备权利要求1-14任一所述重组免疫细胞的方法，包括采用基因敲除技术、基因沉默技术、失活突变技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因。

16.根据权利要求15所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：基因敲除技术包括CRISPR/Cas技术、人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术、转录激活样效应因子(transcription activator-like effector，TALE)技术或TALE-CRISPR/Cas技术。

17.根据权利要求16所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：CRISPR/Cas技术选自CRISPR-Cas3、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12、CRISPR-Cas13、CRISPR-CasX、CRISPR-IscB系统。

18.根据权利要求16所述的重组免疫细胞的方法，CRISPR/Cas技术选自CRISPR-Cas9、CRISPR-Cas12a、CRISPR-Cas12b、CRISPR-Cas13a、CRISPR-Cas13b、CRISPR-Cas13c、CRISPR-Cas13e或CRISPR-Cas13f系统。

19.根据权利要求16-18中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：在CRISPR/Cas技术中使用靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)和Cas核酸内切酶，和靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)和Cas核酸内切酶。

20.根据权利要求16-19中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：在CRISPR/Cas技术的指导RNA(gRNA)中同时或分别包括靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)和靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)。

21.根据权利要求16-20中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法,在CRISPR/Cas技术中，靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者BCOR基因(NCBI GeneID:54880或NCBI Gene ID:71458)编码的DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA序列；靶向ZC3H12A基因指导RNA(gRNA)中的核酸结合区段结合与受试者ZC3H12A基因(NCBI Gene ID:80149或NCBI Gene ID:230738)编码的DNA序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的靶DNA序列。

22.根据权利要求16-21中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其中靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域包含序列ACTGGGCAATACCGCAACAG(SEQ ID NO:3)或者与SEQ ID NO:3具有至少85％、90％、95％同一性的序列；其中靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)的靶向结构域包含序列CTAGGGGAATTGGTGAAGCA(SEQ ID NO:4)或者与SEQ ID NO:4具有至少85％、90％、95％同一性的序列。

23.根据权利要求15-22中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：向免疫细胞中进一步导入带有作用靶点的CAR结构、TCR结构、配受体结构、STAR结构或其他细胞过继治疗相应结构的序列。

24.根据权利要求15-23中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：向免疫细胞中进一步导入表达用于治疗疾病的生物分子；优选的，所述治疗疾病的生物分子选自IL-23R蛋白、IL-4R抗体、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-12、IL-13、IL-22、IL-23、IL-24、TNF、TNF-α、GM-CSF、CD40L、CTLA-4、FLT3L、TRAIL、LIGHT、GLP1中的一种或数种。

25.根据权利要求15-24中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其中使用的载体是病毒载体、类病毒载体或非病毒载体，所述病毒载体优选痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒载体；非病毒载体优选转座子、脂质纳米颗粒、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。

26.根据权利要求16-25中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：其sgRNA表达载体包括：载体-启动子1-sgZc3h12a-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列、载体-启动子1-sgBcor-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列或pMSCV-启动子1-sgBcor-启动子2-sgZc3h12a-启动子3-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列基本结构；进一步地，所述治疗疾病的生物分子序列任选权利要求7或8中所述的过继治疗的结构序列或权利要求11或12所述的治疗疾病的生物分子对应的序列；具体地，sgRNA表达载体包括pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR、pMSCV-hU6-sgBcor-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR或pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR的基本结构；更进一步地，各启动子可以相同或不同；所述标签任选存在或缺失；所述治疗疾病的生物分子序列任选存在或缺失。

27.权利要求15-26中任意一项所述的制备重组免疫细胞的方法，其特征在于：向重组免疫细胞中导入权利要求25或26的表达载体；所述导入包括病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂质转染、电穿孔、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接显微注射、纳米颗粒介导的核酸递送、微流体递送方法。

28.一种基因调控系统，所述基因调控系统用于权利要求1-14中任意一项所述重组免疫细胞的制备。

29.根据权利要求28所述的基因调控系统，所述基因调控系统采用基因敲除技术、基因沉默技术、失活突变技术或小分子抑制剂处理所述重组免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因。

30.根据权利要求29所述的基因调控系统，所述基因敲除技术包括CRISPR/Cas技术、人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术、转录激活样效应因子(transcriptionactivator-like effector，TALE)技术或TALE-CRISPR/Cas技术。

31.权利要求28至30中任意一项所述的基因调控系统，所述基因调控系统包含核酸分子和酶蛋白，其中所述核酸分子是指导RNA(gRNA)分子，并且所述酶蛋白是Cas蛋白或Cas直系同源物。

32.根据权利要求30或31所述的基因调控系统，所述酶蛋白选自Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas13a、Cas13b、Cas13c、Cas13e或Cas13f蛋白或其直系同源物。

33.权利要求30至33所述的基因调控系统，其中

(i)靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域序列与第一Cas核酸内切酶蛋白复合以形成第一核糖核蛋白(RNP)复合物；和(ii)靶向ZC3H12A基因指导RNA(gRNA)中的靶向结构域序列与第二Cas核酸内切酶蛋白复合以形成第二核糖核蛋白(RNP)复合物。

34.权利要求30至34中任意一项所述的基因调控系统，其使用权利要求21或22中的靶向BCOR基因指导RNA(gRNA)和靶向ZC3H12A基因的指导RNA(gRNA)，或使用权利要求23所述的向免疫细胞中进一步导入带有作用靶点的CAR结构、TCR结构、配受体结构、STAR结构或其他细胞过继治疗相应结构的序列，或权利要求24所述的向免疫细胞中进一步导入表达用于治疗疾病的生物分子。

35.权利要求28-34中任意一项所述的基因调控系统，其使用的载体为是病毒载体、类病毒载体或非病毒载体，所述病毒载体优选痘苗病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒、逆转录病毒载体；非病毒载体优选转座子、脂质纳米颗粒、脂质体、外泌体、减毒细菌或病毒样颗粒。

36.权利要求35所述的基因调控系统，其特征在于：其中的RNA(gRNA)表达载体包括：载体-启动子1-sgZc3h12a-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列、载体-启动子1-sgBcor-启动子2-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列或载体-启动子1-sgBcor-启动子2-sgZc3h12a-启动子3-标签-P2A-治疗疾病的生物分子序列基本结构；进一步地，所述治疗疾病的生物分子序列任选权利要求7或8中所述的过继治疗的结构序列或权利要求11或12所述的治疗疾病的生物分子对应的序列；具体地，sgRNA表达载体包括pMSCV-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR、pMSCV-hU6-sgBcor-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR或pMSCV-hU6-sgBcor-hU6-sgZc3h12a-EFS-Thy1.1-P2A-CD19-CAR的基本结构；更进一步地，各启动子可以相同或不同；所述标签任选存在或缺失；所述治疗疾病的生物分子序列任选存在或缺失。

37.一种包含如权利要求28-36中任一项所述的基因调控系统的试剂盒。

38.一种生产权利要求1-14中任意一项所述重组免疫细胞的方法，其包括：

(1)获得免疫细胞；

(2)使用权利要求15-27中任一项所述的制备方法处理免疫细胞，或将权利要求28-36中任意一项所述的基因调控系统引入免疫细胞，或使用权利要求37所述的试剂盒处理免疫细胞；

(3)培养免疫细胞，将免疫细胞中的BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能被降低或清除。

39.根据权利要求38所述的生产重组免疫细胞的方法，其特征在于：将步骤(3)获得的重组免疫细胞植入到受试者体内进行扩增，并获取体内扩增后的重组免疫细胞。

40.根据权利要求38或39所述的生产重组免疫细胞的方法，所述免疫细胞对于受试者是自体的免疫细胞，或同种异体的免疫细胞。

41.一种用于治疗疾病的组合物，其包含权利要求1-27或38-40中任意一项所述的重组免疫细胞，或28-36中任意一项所述的基因调控系统。

42.一种在有需要的受试者中治疗疾病或病症的方法，所述方法包括向受试者施用权利要求1-27或38-40中任意一项所述的重组免疫细胞、使用权利要求28-36中任意一项所述的基因调控系统或施用权利要求41所述的组合物处理受试者的免疫细胞。

43.根据权利要求42所述的治疗疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症是癌症、肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病、炎症性疾病、代谢性疾病、神经退行性疾病、外源性CAR结构靶向细胞引发的疾病、外源性TCR结构靶向细胞引发的疾病。

44.根据权利要求42或43所述的方法，其中所述癌症或肿瘤包括以下的一种或多种：白血病、淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、非霍奇金淋巴瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、难治性滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、惰性B细胞淋巴瘤、B细胞恶性肿瘤、结肠癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、皮肤癌、黑色素瘤、骨癌、和脑癌、卵巢癌、上皮癌、肾细胞癌、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、结肠直肠癌、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、尤因肉瘤、髓母细胞瘤、骨肉瘤、滑膜肉瘤、和/或间皮瘤；所述自身免疫性疾病包括以下的一种或多种：强直性脊柱炎(AS)，牛皮癣(PS)，乳糜泻(CEL)，系统性红斑狼疮(SLE)，普通变异型免疫缺陷病(CVID)，炎症性肠病(IBD)，溃疡性结肠炎(UC)，I型糖尿病(TlD)，幼年特发性关节炎(JIA)，克罗恩病(CD)，斑秃(AA)，多发性硬化(MS)，原发性胆汁性肝硬化(PBC)，原发性硬化性胆管炎(PSC)，类风湿性关节炎(RA)，干燥综合征(SJO)，系统性硬化病(SSC)，脊柱关节病(SPA)，白癫风(VIT)，哮喘，或甲状腺炎(AITD，THY或TH)。

45.权利要求1-27或38-40中任意一项所述的重组免疫细胞、权利要求28-36中任意一项所述的基因调控系统处理受试者的免疫细胞或权利要求41所述的组合物，在制备在有需要的受试者中治疗疾病或病症的药物中的用途。

46.一种重组免疫细胞作为稳定递送治疗疾病的生物分子的载体中的应用，其特征在于：所述重组免疫细胞是权利要求1-27或38-40中任意一项所述的重组免疫细胞、使用权利要求28-36中任意一项所述的基因调控系统或权利要求41所述的组合物处理受试者的免疫细胞；所述递送治疗疾病的生物分子选自权利要求11或12所述任意一种或数种递送治疗疾病的生物分子。

47.一种降低或清除免疫细胞中BCOR基因和ZC3H12A基因的表达和/或功能的用途，所述用途包括增加免疫细胞干性(stemness)、抑制免疫细胞耗竭、促进免疫细胞扩增、赋予免疫细胞记忆性、延长免疫细胞持久性、增加免疫细胞自我更新能力；所述重组免疫细胞是权利要求1-27或38-40中任意一项所述的重组免疫细胞或使用权利要求28-36中任意一项所述的基因调控系统处理受试者的免疫细胞；所述用途为治疗目的或非治疗目的。

48.权利要求47所述的用途，其中所述非治疗目的包括，将免疫细胞用于可被DNA编码的蛋白质的制备或用于治疗性组合物的制备；优选的，可被DNA编码的蛋白质包括权利要求11或12所述的任意一种或数种递送治疗疾病的生物分子。

49.一种动物模型的生产方法，其特征在于使用权利要求15-27中任一项所述的制备方法处理动物的免疫细胞，或将权利要求28-36中任意一项所述的基因调控系统引入动物的免疫细胞，或使用权利要求37所述的试剂盒处理动物的免疫细胞。

50.一种使用权利要求49所述方法生产的动物模型。

51.权利要求1-14中任意一项所述的重组免疫细胞、权利要求28-36中任意一项所述的基因调控系统或权利要求37所述的试剂盒在制备动物模型中的用途。