CN116574194A - 嵌合抗原受体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种嵌合抗原受体，涉及生物医药技术领域。所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；所述增强子选自IL‑2，IL‑3，IL‑4，IL‑6，IL‑7，IL‑8，IL‑10，IL‑11，IL‑12，IL‑15，IL‑17，IL‑18，IL‑21，IL‑23，其受体，其功能变体或它们的组合。本申请还涉及包含所述嵌合抗原受体的CAR‑NK细胞，该靶向肿瘤的CAR‑NK杀伤肿瘤细胞的效果较好，能够作为一款CAR‑NK细胞药物用于肿瘤的治疗。

Description

嵌合抗原受体及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
免疫治疗的两种主要手段是免疫检查点抑制剂，如抗PD1/PDL1抗体、抗CTLA4抗体等，和嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)。CAR-T治疗流程是从人外周血分离出T细胞，在体外进行CAR基因修饰，扩增培养到一定数量后，回输患者。其中，CAR基因的设计研发是CAR-T的核心技术。将设计好的CAR基因转入T细胞的基因组中，T细胞就可以表达相应的CAR分子。CAR分子将使T细胞无需MHC限制性，通过单链可变区片段scFv直接识别肿瘤细胞，同时获得第一刺激信号和共刺激信号，被“一键激活”。CAR-T可在体内增殖，为“活的药物”，形成持续的杀伤力，CAR-T还可以体内释放细胞因子召集活化更多的免疫细胞协同杀死肿瘤细胞。
虽然现有CAR-T药物技术成熟，疗效显著，但是仍存在较多问题，如患者需等待制备时间(非现货)，期间可能肿瘤出现进展致使治疗风险增加或失去治疗机会；也可能制备失败致使无药可用；还存在安全性问题、售价高问题等。如要解决目前自体CAR-T细胞药物的主要不足(非现货、价格高)，是研制通用现货型的细胞药物，如通用型CAR-T、通用型CAR-NK等，使用同种异体的T细胞、或NK细胞，或由iPS细胞诱导分化得到T细胞或NK细胞，制备成现货的CAR-T、CAR-NK，可以一批次制备几十份细胞药物，相比自体CART细胞药物一批次制备一份药物，通用型CAR-T、或CAR-NK降低了成本，使售价可以降低。
CAR-NK技术是伴随自体CAR-T技术同时出现的免疫细胞治疗策略，最初，为了实现现货细胞药物的目的，CAR修饰的NK细胞主要使用NK细胞系NK-92(能够无限扩增)，但因为NK-92的成瘤风险，在使用前需进行辐照，该CAR-NK-92无法体内实现扩增，报道的临床疗效不理想。NK细胞使用的CAR结构，需要特殊的设计。目前仍需要新的CAR-NK疗法来满足患者的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种嵌合抗原受体，该靶向BCMA的CAR-NK杀伤肿瘤细胞的效果较好。
为了实现上述的发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了一种融合多肽，其包含本发明所述的嵌合抗原受体(CAR)和能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；所述增强子选自IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-21，IL-23，其受体，其功能变体中的一种或多种。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述HCDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述HCDR1包含与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，所述HCDR2包含与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列，且所述HCDR3包含与SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包括单域抗体。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列；
或与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述CD3ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述非抗原结合结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤抗原。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与非实体瘤相关。
在某些实施方式中，其中所述非实体瘤选自以下组：淋巴细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性和急性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病、急性髓样白血病和多发性骨髓瘤。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
在某些实施方式中，其中所述实体瘤选自以下组：肝癌、胃癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、食道癌、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌和卵巢癌。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原包括肿瘤抗原选自以下组：CD5、CD7、CD38、CS1、BAFFR、TACI、CD19、CD20、CD22、BCMA、GPRC5D、Mesothelin、DLL1、GPC3、EGFR、PSMA、PSCA、Claudin18.2、HER2和CD70。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述BCMA结合结构域的N端连接；所述信号肽片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述增强子包括细胞因子和/或细胞因子受体。
在某些实施方式中，其中所述增强子包括IL-15或其功能变体，或包含IL-15受体(IL15R)的嵌合细胞因子受体。
在某些实施方式中，其中所述增强子包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体和所述增强子通过接头连接。
在某些实施方式中，其中所述接头包括可切割的接头。
在某些实施方式中，其中所述接头包括自切割肽。
在某些实施方式中，其中所述自切割肽包括P2A，F2A，E2A或T2A。
在某些实施方式中，其中所述自切割肽为T2A，所述嵌合抗原受体的N端与所述增强子的C端可以通过T2A连接，并具有如下结构：IL-15-T2A-CD8SP-anti-BCMA sdAb-CD28(hinge/TM/Intracellular)-CD3ζ；或，所述嵌合抗原受体的C端与所述增强子的N端可以通过T2A连接，并具有如下结构：CD8SP-anti-BCMA sdAb-CD28(hinge/TM/Intracellular)-CD3ζ-T2A-IL-15。
在某些实施方式中，其中所述接头包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；或与SEQID NO:6所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述融合多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列；或与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少约50％同一性的氨基酸序列。
另一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其编码本发明所述的融合多肽。
另一方面，本发明提供分离的一种或多种核酸分子，其包含：编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和编码能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:17所述的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述CD3ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:18所述的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述非抗原结合结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述抗原结合结构域特异性地结合肿瘤抗原。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与非实体瘤相关。
在某些实施方式中，其中所述非实体瘤选自以下组：B淋巴细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性髓性白血病和急性髓样白血病。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
在某些实施方式中，其中所述实体瘤选自以下组：肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。
在某些实施方式中，其中所述肿瘤抗原包括肿瘤抗原选自以下组：CD5、CD19、CD20和BCMA。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述
HCDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包括单域抗体。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:16所述的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述BCMA结合结构域的N端连接。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述核酸分子可以包含SEQ ID NO:21所述的核苷酸序列；或与SEQ ID NO:21所示的核苷酸酸序列具有50％同一性的核苷酸分子。
在某些实施方式中，其中所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列包含与SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列具有50％同一性的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述增强子包括细胞因子和/或细胞因子受体。
在某些实施方式中，其中所述增强子选自IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-21，IL-23，其受体，其功能变体及它们的组合。
在某些实施方式中，其中所述增强子包括IL-15或其功能变体，或包含IL-15受体(IL15R)的嵌合细胞因子受体。
在某些实施方式中，其中所述增强子包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中编码所述增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体和所述增强子通过接头连接。
在某些实施方式中，其中所述接头包括可切割的接头。
在某些实施方式中，其中所述接头包括自切割肽。
在某些实施方式中，其中所述自切割肽包括P2A，F2A，E2A或T2A。
在某些实施方式中，其中所述接头包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中编码所述接头的核酸包含SEQ ID NO:19所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述核酸分子包含SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种分离的一种或多种构建体，其包含本发明所述的核酸分子或分离的一种或多种核酸分子。
在某些实施方式中，其包含第一核酸分子和第二核酸分子，其中所述第一核酸分子包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，其中所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。
在某些实施方式中，其中所述CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述CD3ζ的信号传导结构域包含SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含SEQ ID NO:18所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述非抗原结合结构域包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包含重链互补决定区1(HCDR1)，重链互补决定区2(HCDR2)和重链互补决定区3(HCDR3)，所述
HCDR1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述HCDR2包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，且所述HCDR3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述第二核酸分子包含编码能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包括单域抗体。
在某些实施方式中，其中所述BCMA结合结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含SEQ ID NO:16所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子可包含SEQ ID NO:21所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述BCMA结合结构域的N端连接。
在某些实施方式中，所述信号肽片段包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述增强子包括细胞因子和/或细胞因子受体。
在某些实施方式中，其中所述增强子选自IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-21，IL-23，其受体，其功能变体或它们的组合。
在某些实施方式中，其中所述增强子包括IL-15或其功能变体，或包含IL-15受体(IL15R)的嵌合细胞因子受体。
在某些实施方式中，其中所述增强子包含SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第二核酸分子包含SEQ ID NO:20所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子位于同一构建体中。
在某些实施方式中，其中所述嵌合抗原受体和所述增强子通过接头连接。
在某些实施方式中，其中所述接头包括可切割的接头。
在某些实施方式中，其中所述接头包括自切割肽。
在某些实施方式中，其中所述自切割肽包括P2A，F2A，E2A或T2A。
在某些实施方式中，其中所述接头包含SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，其包含SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，其中所述第一核酸分子和第二核酸分子位于独立构建体中。
本发明所述的构建体可以存在于载体中，或可以整合进基因组中。
在某些实施方式中，所述的载体选自DNA载体，RNA载体，质粒，慢病毒载体，腺病毒载体和逆转录病毒载体。
另一方面，本发明提供一种细胞，其包含本发明所述的核酸分子或上述的分离的一种或多种核酸分子或本发明所述的构建体，和/或表达本发明所述的嵌合抗原受体或本发明的融合多肽。
在某些实施方式中，其中所述细胞包括免疫效应细胞。
在某些实施方式中，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些实施方式中，其包括工程化的免疫效应细胞。
在某些实施方式中，其中所述工程化免疫效应细胞包括CAR-T细胞或CAR-NK细胞。
在某些实施方式中，所述的细胞表达：
(i)能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子；(ii)嵌合抗原受体，其包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。
所述的细胞可以是CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞表达：(i)能够增强所述CAR-NK细胞的一种或多种活性的增强子；(ii)嵌合抗原受体，其包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。
在某些实施方式中，所述的细胞表达：(i)IL-15或其功能性变体；(ii)嵌合抗原受体，其包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。
所述的细胞可以是CAR-NK细胞，所述CAR-NK细胞表达：(i)IL-15或其功能性变体；(ii)嵌合抗原受体，其包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。
本发明提供了一种表达IL-15的免疫效应细胞，所述细胞表达IL-15和嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体。
在某些实施方式中，其中所述IL-15或其功能性变体作为膜结合多肽和/或分泌多肽表达。在一些实施方式中，所述IL-15或其功能性变体可以作为分泌多肽表达。在另一些实施方式中，所述IL-15或其功能性变体与跨膜蛋白融合。IL-15的“功能性变体”包括保持全长或成熟IL-15的一种或更多种功能的IL-15的一部分。
IL-15或其功能性变体可以由一种或更多种NK细胞以多种方式表达。IL-15可以在NK细胞内表达并由NK细胞分泌和/或可以使用本领域已知的多种接头中的任一种直接或间接地连接。在一些具体方面，IL-15可以与跨膜蛋白的全部或一部分连接。在一个方面，NK细胞表达包含与跨膜蛋白或其跨膜结构域融合的IL-15的融合蛋白。
在某些实施方式中，所述的细胞包含：(i)第一核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和(ii)第二核酸分子，其包含编码能够增强所述工程化免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述的细胞包含：(i)第一核酸分子，其包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和(ii)第二核酸分子，其包含编码外源细胞因子IL-15或其功能变体的核苷酸序列或编码包含IL-15受体的嵌合细胞因子受体的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种改造细胞的方法，所述方法包括：将第一核酸分子和第二核酸分子引入所述细胞，其中：
(i)所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和(ii)所述第二核酸分子编码能够增强所述工程化免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的融合多肽，本发明所述的核酸分子，本发明所述的分离的一种或多种构建体或本发明所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供本发明所述的融合多肽，本发明所述的核酸分子，本发明所述的分离的一种或多种核酸分子，本发明所述的分离的一种或多种构建体，或本发明所述的细胞用于制备药物的用途，其中所述药物用于治疗肿瘤。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一种嵌合抗原受体，该CAR分子使用单域抗体靶向识别BCMA，胞外铰链区、跨膜区和胞浆区使用CD28分子的胞外区、跨膜区和胞浆区，连接CD3ζ的胞内域，通过T2A连接野生型IL-15细胞因子，通过细胞实验和动物实验表明，该靶向BCMA的CAR-NK杀伤肿瘤细胞的效果较好，进一步开发，能够作为一款CAR-NK细胞药物用于多发性骨髓瘤的治疗。无论细胞因子扩增制备的CAR-NK，或由表达mbIL-21、CD137L和CD86基因改造的K562饲养细胞孵育活化制备的CAR-NK，靶向BCMA的CAR-NK均具有较好的杀伤效果。动物实验显示饲养细胞活化制备的CAR-NK能有效抑制骨髓瘤细胞系MM.1S的增殖。
附图说明
本发明所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本发明所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本发明所述抗BCMA CAR-NK结构示意图；其中CD8SP代表CD8分子的信号肽；BCMA sdAb代表靶向BCMA的单域抗体序列；CD28Hinge+TM+Intracellular代表CD28分子的胞外区、跨膜区和胞浆区序列；CD3ζ代表CD3ζ分子的胞浆区序列；T2A代表自剪切序列；IL-15代表IL-15序列；IgG1hinge代表IgG1铰链区；2B4 Intracellular代表2B4胞浆区序列。
图2A-图2B显示的是本发明实施例2制备的所述抗BCMA CAR-NK(CD28hinge)细胞的阳性率检测结果。
图3显示的是本发明实施例2制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞体外杀伤多发性骨髓瘤细胞系MM.1S的杀伤率。
图4A-图4B显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞的阳性率检测结果。
图5显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞体外杀伤多发性骨髓瘤细胞系MM.1S的杀伤率。
图6显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞与抗BCMACAR-NK(IgG1 hinge)细胞体外杀伤多发性骨髓瘤细胞系MM.1S的杀伤率对比结果。
图7显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞与抗BCMACAR-NK(2B4 Intracelluar)细胞体外杀伤多发性骨髓瘤细胞系MM.1S的杀伤率对比结果。
图8显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞与抗BCMACAR-NK(CD28 hinge+no IL-15)细胞体外杀伤多发性骨髓瘤细胞系MM.1S的杀伤率对比结果。
图9显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞与抗BCMACAR-NK(IgG1 hinge)细胞的细胞因子IFN-γ的表达量结果。
图10显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞体外杀伤BCMA表达不同水平的肿瘤细胞的结果。
图11显示的是本发明实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞的MM.1S的动物实验效果。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。下述实施例中，若无特殊说明，所用的操作方法均为常规操作方法，所用设备均为常规设备，各个实施例所用设备材料均相同。
术语定义
本发明中，术语“BCMA”通常是指细胞成熟抗原，其属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。
在本发明中，术语“BCMA结合结构域”通常是指包含能特异性结合B细胞上表达的BCMA多肽的人源化的抗BCMA抗体或者其抗原结合片段。
在本发明中，术语“抗原结合片段”(在本文中也被称作“靶向部分”或“抗原结合部分”)通常是指抗体分子的一部分，其包含负责抗体与抗原之间的特异性结合的氨基酸。抗原中由抗体特异性地识别和结合的部分是称作如上文所述的“表位”。抗原结合结构域可典型地包含抗体轻链可变区(VL)和抗体重链可变区(VH)；然而，其并非必须包含两者。
在本发明中，术语“互补决定区”(CDR)通常是指在抗原结合片段可变区内的互补性决定区。在本发明中，所述重链可变区存在3个CDRs，所述CDRs对于每个可变区命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在本发明中，术语“FR”通常是指抗体可变结构域的更高度保守的部分，其被称为框架区。
在本发明中，术语“单域抗体(sdAb)”或“VHH”通常是指缺失抗体轻链而只有重链可变区的一类抗体。
在本发明中，术语“嵌合抗原受体”或“CAR”通常是指一组多肽，在最简单的实施方案中通常有两种，其当在免疫效应细胞中时，提供细胞对靶细胞(通常为癌细胞)的特异性，并产生细胞内信号。在一些实施方案中，CAR包含至少一个细胞外抗原结合结构域(如VHH、scFv或其部分)，跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文中也称为“胞内信号传导结构域”)，其包含衍生自如下所定义的刺激分子和/或共刺激分子的功能性信号传导结构域。
本发明中，术语“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能且与其具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。
在本发明中，术语“构建体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。
在本发明中，术语“免疫效应细胞”通常是指参与免疫应答，行使效应功能的免疫细胞。
在本发明中，术语“自然杀伤细胞”(“NK细胞”)通常是指免疫系统的一种细胞毒性淋巴细胞。
在本发明中，术语“白介素-15”通常是指调节T和NK细胞活化和增殖的细胞因子。在一个方面，IL-15是野生型IL-15。
在本发明中，术语“表达”通常是指特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
在本发明中，术语“肿瘤”和“癌症”可以互换地使用，通常是指以异常细胞快速且失控生长为特征的疾病。本文中癌症的例子包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。包括恶变前以及恶性癌症和肿瘤，还涵盖实体瘤和非实体肿瘤。
在本发明中，术语“施用”通常是指通过本领域已知的任意途径，将蛋白递送给有此需要的人或动物。药用载体和制剂或组合物也是本领域众所周知的。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”或“药学上可接受的赋形剂”是指任何和所有溶剂，分散介质，防腐剂，抗氧化剂，涂层，等渗和吸收延迟剂，表面活性剂，填充剂，崩解剂，粘合剂，稀释剂与药物施用相容的润滑剂，助流剂，pH调节剂，缓冲剂，增强剂，湿润剂，增溶剂，表面活性剂，抗氧化剂等。
在本发明中，术语“有效量”或“有效剂量”通常是指足以实现或至少部分实现所需效果的量。药物或治疗剂的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”通常是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时促进疾病消退的任何药物量。
在本发明中，术语“包括”通常是指包含、总括、含有或包涵的含义。
在本发明中，术语“受试者”通常是指人类或非人类动物。
实施例1
1.1嵌合抗原受体构建
如图1所示，利用抗BCMA单域抗体序列(SEQ ID NO:8)，结合胞外铰链区、跨膜区和胞浆区使用CD28分子的胞外区、跨膜区和胞浆区(SEQ ID NO:9)，连接CD3ζ的胞内域(SEQID NO:5)，通过T2A(SEQ ID NO:6)连接野生型IL-15细胞因子(SEQ ID NO:7)的结构，构建了能用于NK细胞的靶向BCMA的CAR结构；酶切慢病毒Pre-Lenti-EF1-CAR V2载体和BCMACAR基因(SEQ ID NO:13)，连接，转化，挑克隆，提质粒，测序，得到序列正确慢病毒载体Pre-Lenti-EF1-CAR V2 NCI-NK。
1.2BCMA嵌合抗原受体慢病毒制备
1)293TS细胞培养于37℃，5％ CO2培养箱内，转速为150rpm。取待转染细胞计数，细胞密度为6×106cells/ml-7×106cells/ml左右，细胞活率大于90％可用于转染。
2)将Pre-Lenti-EF1-CAR V2 NCI-NK质粒与包装质粒ZL004：ZL006：包膜质粒ZL003按9:7:7:7的比例混匀，将以上四种质粒的混合物加入含293TS基础培养基的管中。按照质粒：PEIpro＝1:2比例向另一管中加入PEIpro。两管各在室温孵育5min后，将含PEIpro的混合液缓慢加入到含DNA的混合液中，轻轻晃动离心管混合均匀，室温孵育15min左右。将DNA-PEIpro混合液加入待转染细胞中，混匀，37℃、5％CO2震荡培养。6h后补料。48h后，收集含有慢病毒的培养基上清。含病毒培养上清转入50ml离心管内，离心去除293TS细胞，将含病毒上清过滤，浓缩，分装，-80℃保存备用。
实施例2细胞因子扩增活化制备CAR-NK
1)PBMC分离
在无菌环境，抽取志愿者静脉血60ml。移入两个50ml离心管中，混匀，800g，18-22℃，离心15min。吸取血浆于50ml离心管中。去除血浆后加入等体积0.9％NaCl稀释全血，混匀。取新的50ml离心管，分别加入15ml人淋巴细胞分离液，取稀释后的血液20ml沿管的侧壁缓慢加入分离液上；水平转子400g，20℃离心30min(升速3，降速0)。小心吸取白膜层到新的50ml离心管中，用0.9％NaCl注射液稀释到40ml，离心管吹打混匀。水平转子450g，20℃离心10min，弃上清，重复洗涤1次。离心结束，倒掉上清液，加入20ml生理盐水重悬计数。
2)CD3 T细胞去除
采用Miltenyi CD3 Regent去除CD3 T细胞。取6×107个PBMC细胞，300g，20℃，离心10min。弃上清，加入磁珠分离液(80μl/1×107细胞)重悬混匀细胞，加入CD3 Reagent(5μl/1×107细胞)，混匀，放于2-8℃冰箱中静置15min。加入5ml磁珠分离液于细胞中，吹打混匀，300g，20℃，离心10min。将LS Columns分离柱安装到磁铁上，用3ml磁珠分离液润洗柱子。弃上清，用磁珠分离液重悬细胞(100μl/1×107细胞)，吹打混匀，过柱子。3ml磁珠分离液冲洗3次。收集流出液。
3)NK细胞纯化
T细胞去除后的流出液，取样计数。300g，离心10min。加入磁珠分离液(80μl/1×107细胞)重悬混匀细胞，加入CD56 MicroBeads(20μl/1×107细胞)，混匀，放于2-8℃冰箱中静置15min。加入磁珠分离液重悬混匀细胞，300g，离心10min。将LS Columns分离柱安装到磁铁上，用3ml磁珠分离液润洗柱子。弃上清，用磁珠分离液重悬细胞(500μl/1×108细胞)，吹打混匀，过柱子。3ml磁珠分离液冲洗3次。将柱子拿下来，加5ml磁珠分离液，推至15ml离心管中。300g，20℃，离心10min。弃上清，用10ml 0.9％氯化钠注射液重悬细胞，混匀计数，300g，20℃，离心10min。弃上清，NK培养基重悬(1％of NK MACS Supplement+NK MACSBasal Medium+IL-2(500IU/ml)+IL-15(140IU/ml)+3％自体血浆)。调细胞密度为1×106/ml，接种至12孔板，1ml/孔。
4)慢病毒感染NK细胞
第3天，观察NK细胞，见大部分NK细胞聚集成团，吹打混匀。加入Vectofusin-1，终浓度10μg/ml，按MOI＝15加入病毒；第4天，补加培养基；第5天转至6孔板，补加培养基；第7天，补加培养基；第8天，使用靶点蛋白结合流式细胞术检测BCMA CAR NK细胞的CAR阳性率。
结果如图2A-2B所示，图2A为阴性对照，图2B为使用BCMA靶点蛋白检测识别BCMA的CAR分子表达阳性率(71％)。
实施例3饲养细胞扩增活化制备抗BCMA CAR-NK
1)PBMC分离
采集健康志愿者单采血。转移至50ml离心管，取等倍0.9％ NaCl注射液稀释血样。取新的50ml离心管，分别加入15ml室温人淋巴细胞分离液，取稀释后的血液20ml沿管的侧壁缓慢加入分离液上。放入离心机中，设置离心力400g，温度20℃，离心30分钟(升速3，降速3)。小心吸取白膜层到另两支50ml离心管中。补加0.9％氯化钠注射液至40ml，使用移液枪吹打混匀。400g，温度20℃，离心10min。弃上清，加入0.9％氯化钠注射液重悬淋巴细胞，补加注射液至40ml。400g，温度20℃，离心10min。离心结束，弃上清液，加入20ml 0.9％氯化钠注射液。混匀，取样计数。
2)CD3 T细胞去除
采用Miltenyi CD3 Regent去除CD3 T细胞。取1×108个PBMC细胞，300g，20℃，离心10min。弃上清，加入磁珠分离液(80μl/1×107细胞)重悬混匀细胞，加入CD3 Reagent(5μl/1×107细胞)，混匀，放于2-8℃冰箱中静置15min。加入5ml磁珠分离液于细胞中，吹打混匀，300g，20℃，离心10min。将LS Columns分离柱安装到磁铁上，用3ml磁珠分离液润洗柱子。弃上清，用磁珠分离液重悬细胞(100μl/1×107细胞)，吹打混匀，过柱子。3ml磁珠分离液冲洗3次。收集流出液。
3)NK细胞纯化T细胞去除后的流出液，取样计数。300g，离心10min。加入磁珠分离液(80μl/1×107细胞)重悬混匀细胞，加入CD56 MicroBeads(10μl/1×107细胞)，混匀，放于2-8℃冰箱中静置15min。加入磁珠分离液重悬混匀细胞，300g，离心10min。将LS Columns分离柱安装到磁铁上，用3ml磁珠分离液润洗柱子。弃上清，用磁珠分离液重悬细胞(500μl/1×108细胞)，吹打混匀，过柱子。3ml磁珠分离液冲洗3次。将柱子拿下来，加5ml磁珠分离液，推至15ml离心管中。300g，20℃，离心10min。弃上清，用10ml 0.9％氯化钠注射液重悬细胞，混匀计数，300g，20℃，离心10min。弃上清，NK培养基重悬。
4)NK细胞激活
30ml NK细胞培养基将7.5×106NK细胞(2.5×105/ml)与7.5×106
K562-mbIL-21细胞(辐照，100Gy)(2.5×105/ml)在T-75瓶中1：1混匀。置于37℃，5％CO2培养箱中培养。第2天，第3天，第4天观察细胞。第5天离心换液，将细胞转至50ml离心管中，混匀计数，300g，20℃，离心10min。弃上清，NK细胞培养基(1％of NK MACSSupplement+NK MACS Basal Medium+IL-2(200IU/ml)+5％自体血浆)重悬。调整细胞密度为1×106/ml。
5)慢病毒感染NK细胞
第6天，观察NK细胞，见大部分NK已充分活化，增殖旺盛。Retronectin包被平板，接种细胞，加入Vectofusin-1，终浓度10μg/ml，按MOI＝10加入病毒。
第7天，补加培养基。
第8天，CAR NK细胞二次激活CAR NK细胞与K562-mbIL-21细胞1：1混匀。置于37℃，5％ CO2培养箱中培养。
第9天，第10天观察细胞。
第11天离心换液，将细胞转至50ml离心管中，混匀计数，300g，20℃，离心10min。弃上清，NK细胞培养基(1％of NK MACS Supplement+NK MACS Basal Medium+IL-2(200IU/ml)+3％自体血浆)重悬。调整细胞密度为1×106/ml。
第12天观察细胞。
第13天补液，调整细胞密度为1×106/ml。
第14天，使用靶点蛋白结合流式细胞术检测BCMA CAR NK细胞的CAR阳性率。
结果如图4A-4B所示，图4A为阴性对照，图4B为使用BCMA靶点蛋白检测识别BCMA的CAR分子表达阳性率(62％)。
实施例4抗BCMA CAR-NK细胞功能评价
体外细胞杀伤实验采用LDH检测试剂盒(Promega)进行检测。将实施例2或3制备的抗BCMA CAR-NK细胞和靶细胞(高表达BCMA分子的MM.1S细胞，购自ATCC)按照两者的个数比(即效靶比)为1:2、1:4、1:8、1:16设置四个梯度。其中靶细胞3×104个/孔，用含XVIVO培养基/1640培养基将其余所有孔的体系补足200μL。将96孔板放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。17小时后，在最大释放的孔内加入20μL的裂解液，混匀使细胞完全破裂，将96孔板放入CO2培养箱中孵育2小时。2小时后，观察最大释放的孔，靶细胞全部裂解后从每个孔吸出50μL上清液到平底96孔板中，再在各个孔中加入50μL底物液，避光显色30min。30min之后观察颜色变化，其中最大释放MM.1S孔和含有抗BCMA CAR-NK细胞的孔的颜色比较深。酶标仪进行测量，测量波长为490nm。用LDH检测试剂盒获得杀伤力的检测结果。
实施例2制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞对MM.1S细胞的杀伤作用参见图3。结果说明，实施例2制备的抗BCMA CAR-NK细胞可以特异性杀伤BCMA阳性的细胞，且杀伤活性很高，均在20％以上。
实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞对MM.1S细胞的杀伤作用参见图5。结果说明，实施例3制备的抗BCMA CAR-NK细胞可以特异性杀伤BCMA阳性的细胞，且杀伤活性很高，均在40％以上。
实施例3制备的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge，CAR序列如SEQ ID NO:13所示)细胞，抗BCMA CAR-NK(IgG1 hinge，CAR序列如SEQ ID NO:14所示)细胞，抗BCMA CAR-NK(2B4Intracelluar，CAR序列如SEQ ID NO:15所示)细胞，抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge+no IL-15，CAR序列如SEQ ID NO:12所示)对MM.1S细胞的杀伤作用参见图6-8。结果表明：铰链区为CD28胞外区的抗BCMA CAR-NK细胞体外杀伤效果优于铰链区为IgG1分子铰链区的抗BCMACAR-NK细胞(图6)；胞浆区为CD28的抗BCMA CARNK细胞体外杀伤效果优于胞浆区为2B4的抗BCMA CAR-NK细胞(图7)；能够分泌IL-15的抗BCMA CAR-NK细胞体外杀伤效果优于表达CAR分子，但不分泌IL-15的抗BCMA CAR-NK的杀伤效果(图8)。
杀伤后取上清，测定细胞因子IFN-γ的水平，结果如图9所示，相比于铰链区为IgG1分子铰链区的抗BCMA CAR-NK细胞，铰链区为CD28胞外区的抗BCMA CAR-NK细胞体外能够显著上调具备肿瘤杀伤作用的细胞因子IFN-γ的表达量，验证了抗BCMA CAR-NK(CD28hinge)细胞的特异性杀伤作用。
实施例5
体外细胞杀伤实验采用LDH检测试剂盒(Promega)进行检测。将实施例3制备的抗BCMA CAR-NK细胞和靶细胞(不表达BCMA的RS4；11，表达BCMA的Daudi和NCI-1299肿瘤细胞)按照两者的个数比(即效靶比)为1:2、1:4、1:8、1:16设置四个梯度。其中靶细胞3×104个/孔，用含X-VIVO培养基/1640培养基将其余所有孔的体系补足200μL。将96孔板放置于37℃，5％CO2培养箱中培养。17小时后，在最大释放的孔内加入20μL的裂解液，混匀使细胞完全破裂，将96孔板放入CO2培养箱中孵育2小时。2小时后，观察最大释放的孔，靶细胞全部裂解后从每个孔吸出50μL上清液到平底96孔板中，再在各个孔中加入50μL底物液，避光显色30min。30min之后观察颜色变化，其中最大释放MM.1S孔和含有抗BCMA CAR-NK细胞的孔的颜色比较深。酶标仪进行测量，测量波长为490nm。用LDH检测试剂盒获得杀伤力的检测结果。
图10显示了抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞体外杀伤BCMA表达不同水平的肿瘤细胞。结果显示，对于不表达BCMA的RS4；11没有杀伤，对于表达BCMA的Daudi和NCI-1299肿瘤细胞均有杀伤，本申请的抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞具有BCMA特异性。
实施例6
将人多发性骨髓瘤MM.1S细胞株转导表达荧光素酶报告基因(荧光素酶)(luciferase)，得到MM.1S-luc。用含10％胎牛血清(FBS)的1640培养基，置于5％二氧化碳，37℃培养箱中常规培养。MM.1S-luc细胞系以1.5×106个细胞/200μl PBS尾静脉注射(50只小鼠，雌雄各半)NSG小鼠17天后，对所有动物进行成像，荷瘤均一小鼠进入实验组，随机分为5组(雌雄各半，每组8只小鼠)，分别作为PBS组，NK细胞组，抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞组，BCMA CAR-T(CD28 hinge)细胞组。其中，细胞外液组尾静脉注射PBS，NK细胞组尾静脉注射NK细胞，抗BCMA CAR-NK(CD28 hinge)细胞组尾静脉注射实施例3制备的抗BCMACAR-NK(CD28 hinge)细胞，BCMA CAR-T(CD28 hinge)细胞组尾静脉注射BCMA CAR-T(CD28hinge)细胞。3天后，麻醉小鼠，腹腔注射Luciferase底物，使用小动物体内成像系统观察对照组和治疗组的肿瘤负荷情况，治疗后第3天，第6天，第12天和第30天的结果分别如图11所示。
结果可知，抗BCMA CAR-NK细胞治疗组中几乎无肿瘤细胞成像，而对照组小鼠肿瘤负荷严重，表明抗BCMA CAR-NK细胞能够有效清除BCMA阳性的肿瘤细胞。抗BCMA CAR-NK细胞静脉回输后，第3天小鼠体内的荧光信号强度相对于PBS组、NK细胞组开始降低，表明肿瘤负荷在降低。由图11可知，第6天小鼠体内的荧光信号强度基本检测不到，可见抗BCMA CAR-NK在动物体内实验中也表现出强大的针对BCMA表达相关疾病的治疗效果。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (27)

1.融合多肽，其特征在于，包含嵌合抗原受体和能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；所述增强子选自IL-2，IL-3，IL-4，IL-6，IL-7，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-15，IL-17，IL-18，IL-21，IL-23，其受体，其功能变体中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述BCMA结合结构域包含重链互补决定区1，重链互补决定区2和重链互补决定区3，所述重链互补决定区1包含SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区2包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，所述重链互补决定区3包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的融合多肽，其特征在于，所述BCMA结合结构域包括单域抗体。
4.根据权利要求3所述的融合多肽，其特征在于，所述BCMA结合结构域包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或其功能性变体。
5.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述CD3ζ的信号传导结构域包含SEQID NO:5所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述非抗原结合结构域包含SEQ IDNO:10所示的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包含信号肽片段，所述信号肽片段的C端与所述抗原结合结构域的N端连接；所述信号肽片段包含SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列。
9.根据权利要求8所述的融合多肽，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述增强子包括IL-15或其功能变体，或包含IL-15受体的嵌合细胞因子受体。
11.根据权利要求10所述的融合多肽，其特征在于，所述增强子包含SEQ IDNO:7所示的氨基酸序列。
12.根据权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述融合多肽包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
13.分离的核酸分子，其特征在于，编码权利要求1-12中任一项所述的融合多肽。
14.分离的一种或多种核酸分子，其特征在于，包含：编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和编码能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。
15.根据权利要求14所述的分离的一种或多种核酸分子，其特征在于，所述编码嵌合抗原受体的核苷酸序列包含SEQ ID NO:22所示的核苷酸序列。
16.根据权利要求14所述的分离的一种或多种核酸分子，其特征在于，编码所述增强子的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示。
17.根据权利要求14所述的分离的一种或多种核酸分子，其特征在于，包含SEQ ID NO:23所示的核苷酸序列。
18.分离的一种或多种构建体，其特征在于，包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14-17中任一项所述的分离的一种或多种核酸分子。
19.根据权利要求18所述的分离的一种或多种构建体，其特征在于，包含第一核酸分子和第二核酸分子，所述第一核酸分子包含编码嵌合抗原受体的核苷酸序列，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；所述第二核酸分子包含编码能够增强免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。
20.细胞，其特征在于，包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14-17中任一项所述的分离的一种或多种核酸分子或权利要求18-19中任一项所述的分离的一种或多种构建体，和/或表达权利要求1-12中任一项所述的融合多肽。
21.根据权利要求20所述的细胞，其特征在于，所述细胞包括免疫效应细胞。
22.根据权利要求21所述的细胞，其特征在于，所述免疫效应细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
23.根据权利要求22所述的细胞，其特征在于，包括工程化的免疫效应细胞。
24.根据权利要求23所述的细胞，其特征在于，所述工程化免疫效应细胞包括CAR-T细胞或CAR-NK细胞。
25.一种改造细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：将第一核酸分子和第二核酸分子引入所述细胞，其中：所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含BCMA结合结构域和非抗原结合结构域，其中所述非抗原结合结构域包括CD28的胞外域、跨膜域和胞内共刺激结构域或其功能性变体，以及CD3ζ的信号传导结构域或其功能性变体；和所述第二核酸分子编码能够增强所述工程化免疫效应细胞的一种或多种活性的增强子的核苷酸序列。
26.药物组合物，其特征在于，包含权利要求13所述的核酸分子或权利要求14-17中任一项所述的分离的一种或多种核酸分子或权利要求18-19中任一项所述的分离的一种或多种构建体或权利要求20-25中任一项所述的细胞，以及任选地药学上可接受的载体。
27.权利要求1-12中任一项所述的融合多肽，权利要求13所述的核酸分子或权利要求14-17中任一项所述的分离的一种或多种核酸分子或权利要求18-19中任一项所述的分离的一种或多种构建体或权利要求20-25中任一项所述的细胞用于制备药物的用途，其特征在于，所述药物用于治疗肿瘤。
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