CN107916269B - 靶向cd19的tcr基因、制备方法、具有该基因的质粒、试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向CD19的安全、高效型TCR基因，其特征在于：该TCR基因的核酸序列为SEQ ID NO.1，所述TCR基因由CD8leader、CD19scFv、TRBC、T2A、CD8leader、myc‑tag、TRAC依次串联构成。本发明同时公开了该TCR基因制备方法、具有该基因的质粒、试剂盒及应用。本发明提高TCR技术的临床有效性及安全性，同时也避免了繁琐的实验操作。

Description

靶向CD19的TCR基因、制备方法、具有该基因的质粒、试剂盒及 应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种靶向CD19的安全、高效型TCR基因、制备方法、具有该基因的质粒、及应用。
背景技术
白血病分型和预后分层复杂，其治疗已成为难题。CD19是正常和恶性B淋巴细胞特异性表面蛋白，在B细胞的发育、增殖和分化以及恶性转化中发挥重要作用。因CD19在B淋巴细胞表达的特异性和恶性肿瘤表达的广泛性，使其成为一个颇具潜力的B淋巴细胞恶性肿瘤免疫治疗的分子靶点。靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(CD19-CAR-T)治疗儿童及成人难治复发性急性淋巴细胞白血病的完全缓解率可达90％以上，以及治疗慢性B淋巴白血病的完全缓解率是87％，其疗效远高于化疗。专利申请号为201710391644.1的中国专利，公开了一种基于OCTS技术的淋系白血病CAR-T治疗载体，包括慢病毒骨架质粒、人EF1α启动子、OCTS嵌合受体结构域和IL6R单链抗体；OCTS嵌合受体结构域包括：CD8leader嵌合受体信号肽、两组单链抗体：第一组选自以下四组单链抗体的任意一组：CD20单链抗体轻链VL、CD20单链抗体重链VH；CD22单链抗体轻链VL、CD22单链抗体重链VH；CD30单链抗体轻链VL、CD30单链抗体重链VH；CD123单链抗体轻链VL、CD123单链抗体重链VH；第二组为CD19单链抗体轻链VL以及CD19单链抗体重链VH；抗体内铰链Inner-Linker、单链抗体间铰链Inter-Linker、CD8 Hinge嵌合受体铰链、CD8 Transmembrane嵌合受体跨膜区、TCR嵌合受体T细胞激活域以及嵌合受体共刺激因子区域。此外，本发明还公开了该载体的构建方法及其在制备治疗淋系白血病的药物中的应用。
然而，CAR中过多的共刺激信号降低了效应细胞激活所需的阈值，使得基因修饰的T淋巴细胞的过度激活和扩增，引发了细胞因子释放综合征、严重神经毒性、脱靶效应以及疾病复发等不良反应。但CAR中缺乏共刺激信号，导致T细胞在结合肿瘤抗原后很难进一步增殖只能发挥瞬时效应。因此，CAR结构中的共刺激信号严重限制了CAR-T细胞的进一步临床应用。
除CAR-T外，T细胞受体(TCR)嵌合型T细胞(TCR-T)也是目前具有应用前景的靶向免疫治疗。在TCR-T中，接受肿瘤抗原信息的TCR分子本身并不能直接传递信号，CD3分子负责向T细胞传递信号。因此，与CAR-T相比，TCR-T没有加入共刺激信号，其安全性高于CAR-T。
然而，特异性T细胞在白血病细胞上识别癌抗原是由自身MHC分子呈递过表达的自身蛋白，高亲和性T细胞通常会在胸腺选择过程中被清除，所以它们的TCR的亲和力低，其有效性低于CAR-T。
针对这一缺陷，现有技术通常构建TCR突变体文库或者，其经过数轮诱变和随后筛选对靶肽/MHC更高亲和力TCR。另外，在增强亲和力的T细胞受体及其制备方法专利CN201380030757.9中也公开通过用表达Delta-like-1或Delta-like-4的基质细胞培养的表达抗原特异的TCRα的造血祖细胞的激动剂选择产生增强亲和力的T细胞受体的方法。但是上述技术都存在步骤多、流程长、分析操作繁琐、和实验成功率低等问题。
因此，开发一种新的靶向CD19的安全、高效型TCR基因，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和大规模医疗应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供一种靶向CD19的安全、高效型TCR基因、制备方法、具有该基因的质粒、及应用，以降低操作的繁琐度。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了一种靶向CD19的安全、高效型TCR基因，该基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。
本发明中，更详细的说，所述TCR基因由CD8leader、CD19scFv、TRBC、T2A、CD8leader、myc-tag、TRAC依次串联构成；
其中，所述CD8leader的核酸人工序列为SEQ ID NO.2；
所述CD19scFv的核酸人工序列为SEQ ID NO.3；
所述TRBC核酸人工序列为SEQ ID NO.4；
所述自裂解多肽T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.5；
所述myc-tag核酸人工序列为SEQ ID NO.6；
所述TRAC核酸人工序列为SEQ ID NO.7。
因此，所述TCR基因也可称为：CD8leader-CD19scFv-TRBC-T2A-CD8leader-myc-tag-TRAC基因。
本发明中，更具体的说，所述TCR基因是以CD19特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCRβ链的可变区，并将scFv直接和TCRβ链的恒定区(TRBC)连接，形成单链TCR并表达于T细胞表面；再通过T2A将TCRα链的恒定区(TRAC)与单链TCR－起共表达，单链TCR会与导入的α链配对形成二聚体。
本发明中，所述TRAC和TRBC是部分鼠源化的人源TCRα和β链的恒定区域。TRAC中人源氨基酸P-90、E-91、S-92和S-93替换成鼠源氨基酸S-90、D-91、V-92和P-93；TRBC中人源氨基酸E-18,S-22,F-133,E-136和Q-139替换成鼠源氨基酸K-18、A-22、I-133、A-136和H-139。
本发明所述myc-tag来源于细胞凋亡的诱导因子c-myc蛋白，是由16个氨基酸组成(LEQKLISEEDLNSAVD)，myc-tag位于TRAC的N端不但可以被myc-tag抗体特异性识别，而且不干扰TCR的功能。
第二方面，本发明提供了该TCR基因的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上得到pUC-Anti-CD19-TCR；
(2)将pUC-Anti-CD19-TCR进行双酶切，利用琼胶电泳将含有Anti-CD19-TCR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Anti-CD19-TCR DNA片段，即本发明所述的TCR基因。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述TCR基因的制备方法，步骤如下：
分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-Anti-CD19-TCR；
将pUC-Anti-CD19-TCR进行Fast Digest AsiSI和Fast Digest NotI双酶切，37℃，酶切20min，100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳把含有Anti-CD19-TCR DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解；
再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心处理DFColumn1分钟，将过滤液倒掉；再向DF Column加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心处理DFColumn1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心处理DF Column2分钟确保乙醇被去除；最后将DFColumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-CD19-TCR DNA片段。
第三方面，本发明提供了具有该基因的质粒，所述质粒为插入所述Anti-CD19-TCRDNA片段的慢病毒表达载体pLent-C-GFP。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述具有该基因的载体的制备方法，包括如下步骤：
分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-Anti-CD19-TCR；
同时将pUC-Anti-CD19-TCR和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI和FastDigest NotI双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳将分别把含有Anti-CD19-TCR DNA片段和线性化的pLent-C-GFPDNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解，再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心DF Column1分钟，将过滤液倒掉，再加入DF Column中500μl Wash Buffer，8000rpm离心DF Column 1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心DF Column 2分钟确保乙醇被去除；
最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-CD19-TCR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段；
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-CD19-TCR质粒，连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Anti-CD19-TCR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA：4μl。
第四方面，本发明提供了基于本发明所述TCR基因的试剂盒，所述试剂盒包括：
稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体；
T淋巴细胞因子，包括抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体及IL-2；
淋巴细胞培养基；
淋巴细胞分离液；
生理盐水；
CCK 8；
myc-tag特异性抗体。
其中，所述稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体采用如下制备方法得到：
采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒，将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染；
取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：1ml；pLent-Anti-CD19-TCR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μl(10μg)；HGTransgeneTM Reagent：60μl；
混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养；
转染24小时后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养；
换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，上清液即含有稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体。
第五方面，本发明提供了所述TCR基因在制备治疗白血病药物中的应用。该药物形式包括试剂盒。
该试剂盒在使用时，首先利用试剂盒中稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体转染PBMC细胞，然后Anti-CD19-TCR基因转染的PBMC细胞作为效应细胞，CD19阳性淋系白血病细胞株Raji会成为靶细胞，效应细胞会对靶细胞产生杀伤作用。
由于采用以上技术方案，本发明具有如下有益效果：
本发明是基于现有CAR-T和TCR-T技术进行改造，从以下三个方面极大的提高TCR技术的临床有效性及安全性。
1.本发明的TCR是以CD19特异性单克隆抗体的单链可变区(scFv)取代TCRβ链的可变区，既增强TCR的亲和力，同时避免了繁琐的实验操作。此外，通过scFv识别CD19特异性抗原，打破MHC限制性，大大提高了TCR识别与结合抗原CD19的能力，从而增强TCR的有效性。
2.本发明的TCR中TRAC和TRBC，二者的共表达防止单链TCR与内源性α链发生错配形成杂合TCR引起新的交叉免疫反应；二者的鼠源化只替换了其中9个关键氨基酸序列，而不是将人恒定区替换成全部鼠恒定区序列，这不但降低了鼠源化TCR分子产生免疫原性的风险，而且鼠源化的TCR分子中的恒定区能优先配对并且具有更高效的结合内源性CD3分子的能力，提供T细胞活化信号，促进T细胞活化，增殖，特异性杀死癌细胞。
3.本发明的TCR带有myc-tag，一旦输入带有本发明的TCR基因修饰T细胞后发生不良反应时，可以马上通过myc-tag特异性抗体诱导细胞凋亡清除体内的细胞，以达到预防作用。
综上所述，本发明提高TCR技术的临床有效性及安全性，同时也避免了繁琐的实验操作。
附图说明
图1为本发明所述安全型嵌合抗原受体原理设计图；
图2为本发明所述的嵌合抗原受体CD8leader-CD19scFv-TRBC-T2A-CD8leader-myc-tag-TRAC的融合基因片段的设计图；
图3为本发明中Anti-CD19-TCR DNA片段(右)和线性化的pLent-C-GFP DNA(左)片段电泳图；
图4为本发明所述的慢病毒CD8leader-CD19scFv-TRBC-T2A-CD8leader-myc-tag-TRAC表达质粒的示意图；
图5为本发明PBMC细胞的表达Anti-CD19-TCR的效率为33.3％。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
一种靶向CD19的安全、高效型TCR基因，该基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。如图1所示，所述TCR基因由CD8leader、CD19scFv、TRBC、T2A、CD8leader、myc-tag、TRAC依次串联构成；其中，所述CD8leader的核酸人工序列为SEQ ID NO.2；所述CD19scFv的核酸人工序列为SEQ ID NO.3；所述TRBC核酸人工序列为SEQ ID NO.4；所述自裂解多肽T2A核酸人工序列为SEQ ID NO.5；所述myc-tag核酸人工序列为SEQ ID NO.6；所述TRAC核酸人工序列为SEQID NO.7。
实施例2
TCR基因的制备方法，包括如下步骤：分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-Anti-CD19-TCR；将pUC-Anti-CD19-TCR进行Fast DigestAsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min，100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积；利用琼胶电泳把含有Anti-CD19-TCR DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中；采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DF buffer(DF缓冲液)，55℃作用10分钟，每2-3(本实施例采用2分钟)分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解；再将琼胶溶液全部吸入DF Column(DF柱)，并套上Collection Tube，8000rpm离心处理DF Column(DF柱)1分钟，将过滤液倒掉；再向DFColumn(DF柱)加入500μl Wash Buffer(漂洗缓冲液)，8000rpm离心处理DF Column(DF柱)1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心处理DF Column(DF柱)2分钟确保乙醇被去除；最后将DFColumn(DF柱)转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer(洗脱液)，室温静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-CD19-TCR DNA片段，即所述的TCR基因。
实施例3
将融合基因片段CD8leader-CD19scFv-TRBC-T2A-CD8leader-myc-tag-TRAC插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP。
分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-Anti-CD19-TCR，同时将pUC-Anti-CD19-TCR和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳分别把含有Anti-CD19-TCR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上CollectionTube，8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-CD19-TCR DNA片段(见图3)和线性化的pLent-C-GFP DNA(见图3)片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-CD19-TCR(见图4)质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Anti-CD19-TCR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。
将上述pLent-Anti-CD19-TCR转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。
次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-Anti-CD19-TCR质粒，具体步骤如下：
(1)取1.5ml菌液室温10000g离心1min。
(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。
(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。
(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000g离心10min。
(5)特别小心吸取上清液，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。
(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。
(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000g离心1min。
(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。
(9)必须将吸收柱10000g离心2min确保乙醇被去除。
(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000g离心5min，收集质粒DNA。
(11)和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-Anti-CD19-TCR质粒浓度为457ng/μl。
将上述的pLent-Anti-CD19-TCR质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例4
慢病毒包装，滴度检测
采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。
取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：1ml；pLent-Anti-CD19-TCR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μl(10μg)；HGTransgeneTM Reagent：60μl。
混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。
转染24小时后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。
换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液即含有稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体(可以作为试剂盒中的成分使用)，其中的病毒颗粒可以直接去检测滴度。
将上述病毒采用TCID50测定滴度，将处于对数生长期的293T细胞以1×104Cells/孔的量接种于96孔细胞培养板，样品用5％FBS DMEM按10倍倍比稀释系列浓度，加样于96孔细胞中，每个浓度加样10孔，设2孔空白对照。于37℃、5％CO2培养，逐日观察细胞出现毒斑情况，一般需要观察5-7天，据出现毒斑的浓度和孔数计算样品的TCID50结果。结果表明，重组慢病毒的滴度5.45×106TCID50/ml。
实施例5
PBMC细胞的制备
取75ml癌症患者手术一个月后，采集的新鲜外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞PBMC(PBMC也可来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等的单个核细胞。优选，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓)。
方法如下：
(1)将外周血75ml与生理盐水按1:1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心800rpm/min，20min。此时离心管中自上而下形成5层；血清、由PBMC构成的白膜层，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层。
(2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出PBMC。加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、800rpm/min，10min。低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板和淋巴细胞分离液，离心后弃去上清。
实施例6
慢病毒感染PBMC细胞及其检测
分离获得PBMC细胞，加入新鲜的88-551-CM培养基(购自CORNING公司)并放在37℃、5％CO2培养箱中培养。
(1)初次刺激：完成于分离后第1天。抗人CD3单克隆抗体(OKT3，30ng/ml)(购自R&D公司)、抗人CD28单克隆抗体(1ng/ml)(购自R&D公司)及300IU/ml IL-2(购自沈阳三生制药)完成刺激。
(2)维持培养：每3天半量换液。将细胞液用巴氏吸管移入50ml离心管，封口后离心1500rpm 5min。先计算好要去除的旧培养液的量并吸去，重悬后补加新培养液。如密度超过2×106/ml,则无须离心，可直接补加需要量的新培养液。补加IL-2(终浓度为50IU/ml)。
(3)刺激13天后，按MOI＝8的比例将重组慢病毒感染PBMC，感染24h后换新鲜培养基，继续扩大培养至足够的用量。通过FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FL1通道检测嵌合抗原受体表达(图5)。
以未感染的PBMC细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染PBMC其阳性率33.3％。
实施例7
Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞的杀伤活性分析
CD19阳性淋系白血病细胞株Raji作为靶细胞，效应细胞为Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞和未转染PBMC细胞。
按E：T(效应细胞和靶细胞比)为1：6.25，加入6.25×106个Raji细胞待细胞完全贴壁后，收集Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞和未转染PBMC细胞，分别调整细胞浓度为1×107/ml，每孔加入100μL，37℃，5％的CO2条件下培养12h。弃上清加入20μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。杀伤率＝[1-(效应细胞+靶细胞孔OD值-单独效应细胞的OD值)/单独靶细胞的OD值]×100％。Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞对Raji细胞的杀伤效率为96.23±3.09％明显高于未转染PBMC细胞(未转染PBMC细胞对Raji细胞的杀伤效率为15.78±1.35％)。
实施例8
转染Anti-CD19-TCR PBMC细胞活性“开关”的分析
每孔加入1×106Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞待细胞完全贴壁后，再加入1μgmyc-tag特异性抗体(购自U.S.Biologicals公司)，37℃，5％的CO2条件下培养12h。弃上清加入10μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。myc-tag对Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞活性控制率＝[1-(加入myc-tag特异性抗体孔OD值/未加入myc-tag特异性抗体孔OD值)]/重组慢病毒感染PBMC的阳性率＝97.21±4.82％。
由上述结果可知，本发明Anti-CD19-TCR分子，设计合理，安全有效，为治疗白血病奠定基础。
实施例9
本发明提供了基于本发明所述TCR基因的试剂盒，所述试剂盒包括
稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体；
T淋巴细胞因子，包括抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体及IL-2；
淋巴细胞培养基；
淋巴细胞分离液；
生理盐水；
CCK 8；
myc-tag特异性抗体。
实施例10
所述TCR基因在制备治疗白血病药物中的应用。本实施例以实施例9的试剂盒为例。
按照实施例5的方法制备PBMC细胞，按照实施例6的方法利用试剂盒中含有的稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体来转染PBMC细胞，并以Anti-CD19-TCR转染PBMC细胞作为效应细胞；CD19阳性淋系白血病细胞株Raji作为靶细胞；按E：T(效应细胞和靶细胞比)为1：6.25，加入6.25×106个Raji细胞待细胞完全贴壁后，收集Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞，调整细胞浓度为1×107/ml，每孔加入100μL，37℃，5％的CO2条件下培养12h。弃上清加入20μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。杀伤率＝[1-(效应细胞+靶细胞孔OD值-单独效应细胞的OD值)/单独靶细胞的OD值]×100％。Anti-CD19-TCR基因转染PBMC细胞对Raji细胞的杀伤效率为96.23±3.09％。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Figure IDA0001472362580000011
Figure IDA0001472362580000021
Figure IDA0001472362580000031

Claims (9)

1.一种靶向CD19的TCR基因，其特征在于：该TCR基因的核酸序列为SEQ ID NO.1。
2.制备如权利要求1所述TCR基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上得到pUC-Anti-CD19-TCR；
(2)将pUC-Anti-CD19-TCR进行双酶切，利用琼胶电泳将含有Anti-CD19-TCR DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Anti-CD19-TCR DNA片段，即为所述的TCR基因。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：
步骤如下：
分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，命名为pUC-Anti-CD19-TCR；
将pUC-Anti-CD19-TCR进行Fast Digest AsiSI和Fast Digest NotI双酶切，37℃，酶切20min，100μL酶切体系为：10×buffer：10μL；DNA 6μg；AsiSI酶：3μL；NotI酶：3μL；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳把含有Anti-CD19-TCR DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μL DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解；
再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心处理DFColumn 1分钟，将过滤液倒掉；
再向DF Column加入500μL Wash Buffer，8000rpm离心处理DF Column 1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心处理DF Column 2分钟确保乙醇被去除；
最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μL Elution Buffer，室温 静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti- CD19-TCR DNA片段。
4.一种质粒，其特征在于：所述质粒为插入如权利要求1所述TCR基因的慢病毒表达载体pLent-C-GFP。
5.如权利要求4所述的质粒，其特征在于：所述质粒采用包括如下步骤的方法制备得到：
分别按导引子CD8leader核酸人工序列、CD19scFv核酸人工序列、TRBC核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、myc-tag核酸人工序列、TRAC核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，命名为pUC-Anti-CD19-TCR；
同时将pUC-Anti-CD19-TCR和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI和FastDigest NotI双酶切，37℃，酶切20min；100μL酶切体系为：10×buffer：10μL；DNA 6μg；AsiSI酶：3μL；NotI酶：3μL；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳将分别把含有Anti-CD19-TCR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μL DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解，再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心DF Column1分钟，将过滤液倒掉；
再加入DF Column中500μL Wash Buffer，8000rpm离心DF Column 1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心DF Column 2分钟确保乙醇被去除；
最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μL Elution Buffer，室温 静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti- CD19-TCR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段；
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-CD19-TCR质粒，连接体系为：10×buffer：1μL；T4连接酶：1μL；Anti-CD19-TCR DNA：4μL；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μL。
6.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：
稳定表达如权利要求1所述TCR基因的病毒载体；
抗人CD3单克隆抗体、抗人CD28单克隆抗体及IL-2；
淋巴细胞培养基；
淋巴细胞分离液；
生理盐水；
CCK 8；
myc-tag特异性抗体。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述病毒载体采用如下制备方法得到：
采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒，将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染；
取无菌的1.5mL EP管或15mL离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：1mL；pLent-Anti-CD19-TCR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix： 10μg；HG TransgeneTMReagent：60μL；
混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养；
转染24小时后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15mL含有10％血清新鲜的培养基继续培养；
换液48h后，吸取细胞上清液于50mL离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中，上清液即含有稳定表达Anti-CD19-TCR的病毒载体。
8.如权利要求1所述TCR基因在制备治疗白血病药物中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述治疗白血病药物的形式为试剂盒。
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