CN111556789A - 封闭系统低温器皿 - Google Patents

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Abstract

本公开文本涉及用于生物医学材料的无针移取的封闭系统低温器皿。所述无针移取可以减少对所述器皿内部的生物医学材料的损害，允许从所述器皿更多地回收生物医学材料，以及降低从所述器皿移取所述生物医学材料的过程中所述封闭系统低温器皿的用户的暴露风险。在一些方面，所述器皿可以用于储存或包装细胞的组合物，如含有工程化细胞的组合物，所述工程化细胞包括与过继细胞疗法结合的工程化细胞。还提供了制品、试剂盒和方法。

Description

封闭系统低温器皿
相关申请的交叉引用
本申请要求于2017年11月10日提交的标题为“封闭系统低温器皿(CLOSED-SYSTEMCRYOGENIC VESSELS)”的美国临时申请62/584,722的优先权，将其内容通过引用以其整体并入。
技术领域
本公开文本在一些方面涉及用于生物医学材料的器皿。更具体地，本公开文本在某些方面涉及用于生物医学材料的无针移取的封闭系统低温器皿。在一些方面，所述器皿可以用于储存或包装细胞的组合物，如含有工程化细胞的组合物，所述工程化细胞包括与过继细胞疗法结合的工程化细胞。
背景技术
可以将各种生物医学材料(如细胞和组织)插入各种器皿中，如用于低温保存，以扩展生物医学材料的活力以用于生物医学应用。当准备使用时，可以从器皿移取生物医学材料，如通过使用注射器针。本文公开了用于储存生物医学材料(包括细胞)的改进的器皿。
发明内容
提供了用于生物医学材料的无针移取的低温器皿。在一些实施方案中，所述低温器皿是封闭系统器皿。本文公开的生物医学材料器皿可以降低生物医学材料的移取过程中的风险。具体地，无针移取可以减少对器皿内部的生物医学材料的损害，允许从器皿更多地回收生物医学材料，和/或可以降低从器皿移取生物医学材料的过程中生物医学材料器皿的用户的风险。另外，当与需要注射器针的提取端口相比时，本文公开的生物医学材料器皿的提取端口可以提高用户效率。
在一些实施方案中，生物医学材料器皿包括具有顶部和开放底部的小瓶；由所述小瓶的顶部支持的入口管，其中所述入口管与所述小瓶的内部流体地连接并且包括加载端口；以及与所述小瓶的开放底部流体地连接的无针提取端口，其中所述无针提取端口提供直接接近所述小瓶中的生物医学材料的途径。在一些实施方案中，所述加载端口是无针加载端口。在一些实施方案中，所述无针加载端口包括鲁尔(luer)锁连接配件。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿包括配置成与所述无针加载端口的鲁尔锁连接配件接合的帽。在一些实施方案中，所述无针提取端口包括鲁尔锁连接配件。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿包括配置成与所述无针提取端口的鲁尔锁连接配件接合的帽。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿包括通气管，所述通气管由所述小瓶的顶部支持并且与所述小瓶的内部流体地连接。在一些实施方案中，所述通气管包括过滤器。在一些实施方案中，所述过滤器是微生物屏障过滤器。在一些实施方案中，所述小瓶的顶部包括在所述入口管与所述小瓶的内部之间流体地连接的管适配器。在一些实施方案中，所述小瓶的顶部包括在所述通气管与所述小瓶的内部之间流体地连接的管适配器。在一些实施方案中，所述两个管适配器进入所述小瓶的内部的开口通过壁隔开。在一些实施方案中，所述提取端口是自封闭的无针提取端口。在一些实施方案中，所述生物医学材料器皿由符合USP VI级的材料制成。
在一些实施方案中，储存和提取生物医学材料的方法包括：经由入口管的加载端口将生物医学材料注入小瓶中，其中所述入口管由所述小瓶的顶部支持；以及经由与所述小瓶的开放底部流体地连接的无针提取端口从所述小瓶提取生物医学材料，其中所述无针提取端口提供直接接近所述小瓶中的生物医学材料的途径。在一些实施方案中，所述方法包括将所述小瓶中的生物医学材料低温冷冻和将所述小瓶中的低温冷冻的生物医学材料解冻。在一些实施方案中，所述方法包括密封所述入口管。在一些实施方案中，所述方法包括密封通气管，所述通气管由所述小瓶的顶部支持并且与所述小瓶的内部流体地连接。在一些实施方案中，所述方法包括切开所述通气管，使得可以从所述小瓶排出空气。在一些实施方案中，所述加载端口是无针加载端口。在一些实施方案中，所述无针加载端口包括鲁尔(luer)锁连接配件。在一些实施方案中，所述无针提取端口包括鲁尔锁连接配件。在一些实施方案中，所述通气管包括过滤器，并且所述通气管在所述通气管中过滤器的位置上方被密封。
本领域技术人员将从以下详细描述中容易明白另外的优点。本文中的例子和描述应被视为是说明性质而不是限制性的。
附图说明
参考附图描述示例性实施方案，其中：
图1展示了本文公开的生物医学材料器皿的例子。
图2展示了具有本文公开的帽的生物医学材料器皿的例子。
图3A展示了本文公开的第一自封闭提取端口的截面。
图3B展示了当注射器附接至第一自封闭提取端口时，所述提取端口的截面。
图4A展示了本文公开的第二自封闭提取端口的截面。
图4B展示了当注射器附接至第二自封闭提取端口时所述提取端口的截面。
在附图中，除非另有说明，否则相似附图标记对应于相同部件。例如，小瓶101可以与小瓶201相同。另外，附图未按比例绘制。
具体实施方式
在其中针是外部针和/或未与器皿连接的针的一些实施方案中，本文公开的生物医学材料器皿可以降低需要经由针进行生物医学材料提取的器皿的一种或多种风险。在一些情况下，针可能损害器皿内部的生物医学材料。例如，针可能通过剪切、破坏或意外污染生物医学材料而对器皿内部的生物医学材料造成损害和/或应力。第二，例如，当针刺入器皿中时，注射器针可能无法从器皿移取全部生物医学材料。此外，在一些方面，由于意外的针刺，针(例如外部针)可能对于针的操作者存在危险。
本文公开的生物医学材料器皿可以通过提供无针提取端口来减少或消除对生物医学材料的应力和/或损害。在一些实施方案中，本文公开的生物医学材料器皿可以通过提供直接接近器皿中的生物医学材料的途径而允许生物医学材料的更大和/或完全的回收。本文公开的生物医学器皿可以降低在移取生物医学材料的过程中对用户的意外针刺风险，并且可以提高移取效率。
本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。
I.生物材料器皿
本文所述的器皿可以用于各种生物医学材料，如人、动物、昆虫和植物细胞和/或组织。在一些实施方案中，本文所述的器皿用于此类生物医学材料的储存，包括生物医学材料的低温储存。图1展示了本文公开的生物医学材料器皿的例子。生物医学材料器皿可以包括小瓶，如小瓶101。插入器皿中的任何生物医学材料都可以储存在小瓶中以供冷冻、解冻和/或后续的移取。这样，小瓶的大小可以设置成接受液体生物医学材料样品。在一些实施方案中，小瓶的储存体积为约1mL至100mL，如为或为至少或为至少约或为约1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，小瓶的储存体积为约1-10mL、约2-10、约1-5mL、约2-5mL、约10mL、约5mL或约2mL。在一些实施方案中，小瓶是有刻度的。另外，小瓶的大小可以设置成适合放入器皿储存装置(如盒或罐)中，使得多个生物医学器皿可以被运输、冷冻和/或解冻。
小瓶可以具有顶部102和底部103。在一些实施方案中，顶部可以是开放的顶部和/或底部可以是开放的底部。当顶部打开时，小瓶的开放顶部可以通过帽密封。在一些实施方案中，将帽气密地密封至小瓶。在一些实施方案中，将帽热密封至小瓶。帽和小瓶可以共同形成不透流体的连接。在一些实施方案中，可以将帽可以内置到小瓶中，使得它们形成为单件。
小瓶的顶部可以支持通气管104和/或入口管105。通气管和/或入口管可以与小瓶101的内部流体地连接。小瓶的顶部可以包括管适配器，所述管适配器可以在通气管与小瓶内部之间以及在入口管与小瓶内部之间流体地连接(即，不透流体的连接)。另外，两个管适配器进入小瓶内部的开口可以通过壁隔开。壁可以防止通过管适配器从入口管进入的流体从另一适配器向通气管抽出。
在一些实施方案中，通气管和/或入口管可以是柔性的。这样，可以操纵入口管以更好地将生物医学材料样品插入小瓶中。另外，可以操纵柔性通气管和/或柔性入口管以避免互相妨碍或妨碍其他生物医学材料器皿。入口管可以包括用于接受生物医学材料样品的加载端口106。加载端口可以气密地密封至入口管。在一些实施方案中，将加载端口热密封至入口管。入口管和加载端口可以共同形成不透流体的连接。
加载端口可以是多种加载端口。例如，加载端口可以是用于标准针的加载端口，如针隔膜。在针隔膜的情况下，针隔膜可以配置成与入口管一起提供不透空气和液体的密封。可以通过注射器针将针隔膜刺破，使得可以将生物医学材料样品注入小瓶中。在一些实施方案中，一旦移除针，针隔膜就可以是自密封针隔膜。
在一些实施方案中，加载端口可以是无针加载端口。例如，无针加载端口可以是如图1所示的鲁尔锁连接配件。这样，可以将具有鲁尔锁连接配件的注射器拧到加载端口的鲁尔锁连接配件上，并将生物医学材料样品通过加载端口和入口管105插入小瓶中。在一些实施方案中，加载端口鲁尔锁连接配件可以是凹形鲁尔锁连接配件。这样，可以将具有凸形鲁尔锁连接配件的注射器拧到加载端口的凹形鲁尔锁连接配件上。一旦注射器与加载端口连接，就可以将生物医学材料样品通过加载端口和入口管插入小瓶中。
当将生物医学材料样品经由加载端口和入口管插入小瓶中时，可能需要样品的节段。如果需要节段，则用户可以往回拉动注射器柱塞，以在入口管中节段的液体上方和下方产生空隙。然后，用户可以将空气推入入口管中，以将液柱节段置于所需的水平处。如果需要节段，则用户可以在入口管中液体节段的上方和下方密封(例如，使用设计用于EVA管路的密封器)入口管。另外，用户也可以在下部密封件下方放置另外的密封件，使得可以容易地折叠节段以进行储存。如果不需要节段，则用户可以在小瓶主体附近放置单个密封件。
在一些实施方案中，通气管可以包括在通气管内的过滤器。在一些实施方案中，过滤器可以是透气的，但是对于储存在小瓶内的生物医学材料样品是不可渗透的。过滤器也可以是微生物屏障过滤器。通气管也可以类似于入口管被密封。在一些实施方案中，将通气管在过滤器上方密封。一旦通气管和入口管密封，器皿就可以是封闭系统。封闭系统可以防止样品暴露于有害污染物和样品泄漏。一旦形成封闭系统，就可以去除多余的管路，以便于储存。然后可以将器皿置于盒或罐中以在低温下储存。
当需要节段时，可从储存处移取器皿，并在移取后可立即将节段切掉。当需要小瓶中的生物医学材料样品时，可以从低温储存处移取器皿并将其解冻。解冻后，可以将通气管切开以打开通气通道。器皿可以包括与小瓶的底部流体地连接的提取端口107。提取端口可以用于在储存后从小瓶移取生物医学材料样品。提取端口可以气密地密封至小瓶的底部。在一些实施方案中，将提取端口热密封至小瓶的底部。在一些实施方案中，提取端口可以封闭小瓶的开放底部。小瓶的底部和提取端口可以共同形成不透流体的连接。在一些实施方案中，提取端口可以包括可移除的盖以保护提取端口。
在一些实施方案中，提取端口可以是无针提取端口。这样，无针提取端口可以提供直接接近小瓶内生物医学材料样品的途径。因此，生物医学材料样品的提取不需要刺穿针隔膜。无针提取端口可以消除在提取过程中由尖锐针引起的对小瓶内部的生物医学材料的应力和/或损害(即，剪切或破坏)。无针提取端口可以减小通过引入针而意外污染生物医学材料样品的机会。另外，由于不需要将针刺入小瓶中，因此可以从小瓶移取更多的生物医学材料。申请人已经发现，当使用针注射器从针隔膜端口移取样品时，平均约0.3mL的生物医学材料样品留在小瓶中。因此，无针提取端口可以将移取后的小瓶中剩余的生物医学材料的量减少至小于约0.3mL、约0.25mL、约0.2mL、约0.15mL、约0.1mL、约0.05mL或约0.025mL。在一些实施方案中，无针提取端口可以移取小瓶中的全部生物医学材料样品。此外，无针提取端口可以消除正在实际从小瓶移取生物医学材料样品的用户的暴露风险(即，针戳)的可能性。
在一些实施方案中，提取端口可以是如图1所示的鲁尔锁连接配件。这样，可以将具有鲁尔锁连接配件的注射器拧到提取端口的鲁尔锁连接配件上，并且可以通过提取端口移取生物医学材料样品。在一些实施方案中，提取端口鲁尔锁连接配件可以是凹形鲁尔锁连接配件。这样，可以将具有凸形鲁尔锁连接配件的注射器拧到提取端口的凹形鲁尔锁连接配件上。一旦注射器与提取端口连接，就可以从小瓶通过提取端口移取生物医学材料样品。
在一些实施方案中，无针提取端口可以是自封闭的提取端口。例如，自封闭提取端口可以是自封闭凹形鲁尔接头。这样，当将注射器附接至自封闭的凹形鲁尔接头时，液体自由地流过提取端口。然而，当移除注射器时，提取端口可以紧密地封闭以消除液体损失并防止潜在的感染。因此，具有自封闭的提取端口可使得用户能够在移除注射器时在没有内容物泄露风险的情况下接近器皿的内容物。
图3A至图3B和图4A至图4B展示了有和没有附接有注射器的自封闭提取端口的截面。如图3A所示，提取端口307封闭。这样，可压缩元件311未被压缩，从而封闭提取端口。当注射器310附接至提取端口307时，可压缩元件311被压缩，从而打开提取端口，如图3B所示。当移除注射器310时，可压缩元件311将解压缩并封闭提取端口。关于图4A，提取端口407封闭。这样，可压缩元件411覆盖流体路径窗口412。当注射器410附接至提取端口408时，可压缩元件411被压缩，使得可压缩元件411不再覆盖流体路径窗口412，如图4B所示，从而允许流体通过流体路径窗口412。一旦移除注射器410，可压缩元件411将解压缩以覆盖流体路径窗口412，从而封闭提取端口。自封闭的提取端口的例子包括但不限于ICU Medical的无针连接器；Vygon的Vadsite无针连接器；Quest Medical的无针注射部位；和BectonDickinson的SmartSiteTM无针阀。
如图2所示，提取端口和/或加载端口可以分别包括帽209和208。端口的帽可以保护端口免受损害。另外，提取端口上的帽可以充当器皿可直立抵靠的支架。这样，帽可以提供比提取端口本身更平衡的表面以供器皿直立地抵靠。在一些实施方案中，帽被配置成用于鲁尔锁连接配件的帽。例如，帽可以被配置成用于凹形鲁尔锁连接配件的帽。这样，帽可以是螺帽以拧到凹形鲁尔锁连接配件上。
在一些实施方案中，本文公开的生物医学材料器皿的所有部件都能够承受低温(即，低至-196℃的温度)和后续的解冻。另外，本文公开的生物医学器皿的所有部件都可以由符合USP VI级的材料制造。另外，本文公开的生物医学器皿可以满足ISO 10993-17和18中制定的关于可滤取物质的容许极限的要求。本文公开的生物医学材料器皿的所有部件都可以由合适的塑料(如聚苯乙烯或聚丙烯)形成。另外，本文公开的管可以能够在不损失热密封能力的情况下承受低温。在一些实施方案中，本文公开的柔性管路可以由
Figure BDA0002571820830000071
或类似材料形成。
另外，可以使用一定剂量的电离辐射(如γ射线、电子束或高能x射线)来辐照生物医学材料器皿，以确保生物医学材料器皿的无菌性。此外，器皿的所有各种部件都可以由抗辐射的材料(例如，乙烯共聚物、硅酮、苯乙烯共聚物、聚砜等)制成。在一些实施方案中，可以对本文公开的器皿进行灭菌，并且备用而无需另外的灭菌。
II.用于产生和制备细胞组合物的方法
在一些实施方案中，本文提供的生物医学材料器皿可以用于储存细胞，如与包括制造、生成或产生细胞疗法的过程结合的细胞。在一些实施方案中，细胞疗法包括用重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞(如T细胞)，例如CAR T细胞。在一些实施方案中，可以将细胞从封闭系统挤压到本文所述的多个生物医学材料器皿中的一个或多个中。在一些实施方案中，可以将细胞以用于剂量给予(如用于单个单位剂量给予或多剂量给予)的量配制到小瓶中。
在一些实施方案中，生物材料器皿与制造、生成或产生细胞疗法结合使用，所述制造、生成或产生细胞疗法可以经由如下过程进行，所述过程包括一个或多个另外的处理步骤，如细胞的分离、分开、选择、激活或刺激、转导、培育、扩增、洗涤、悬浮、稀释、浓缩和/或配制步骤。在一些实施方案中，生成或产生细胞疗法的方法包括从受试者分离细胞，在一种或多种刺激条件下制备、处理、培养。在一些实施方案中，所述方法包括按以下顺序进行的处理步骤，其中：首先将细胞(例如原代细胞)从生物样品分离(如选择或分开)；将选择的细胞与病毒载体颗粒一起孵育用于转导，任选地在刺激试剂的存在下刺激所分离的细胞的步骤之后；培养所转导的细胞，例如以扩增细胞；将所转导的细胞配制在组合物中并将组合物引入所提供的生物医学材料器皿中。在一些实施方案中，在低温保存之前或之后将生成的工程化细胞重新引入同一受试者中。在一些实施方案中，在所述步骤的一个或多个步骤过程中(包括在分离、选择、转导和/或培育之前和/或之后)的细胞，可以将细胞低温保存，然后解冻。
在一些实施方案中，所述一个或多个处理步骤可以包括以下中的一个或多个：(a)洗涤含有细胞的生物样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单核细胞(PBMC)样品、未分级的T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物、或白细胞单采术产物)，(b)从样品分离(例如选择)所希望的细胞子集或群体(例如，CD4+和/或CD8+T细胞)，例如，通过将细胞与选择或免疫亲和试剂一起孵育以进行基于免疫亲和的分离；(c)将分离的(如选择的)细胞与病毒载体颗粒一起孵育，(d)使用如所描述的方法来培养、培育或扩增细胞，和(e)例如在药学上可接受的缓冲液、低温保存剂或其他合适的培养基中配制所转导的细胞。在一些实施方案中，所述方法可以进一步包括(e)通过使细胞暴露于刺激条件来刺激细胞，这可以在将细胞与病毒载体颗粒一起孵育之前、期间和/或之后进行。在一些实施方案中，在任何上述步骤之前或之后也可以进行洗涤或悬浮步骤的一个或多个另外的步骤，例如用于细胞的稀释、浓缩和/或缓冲液交换。在一些方面，将所得的工程化细胞组合物引入一个或多个提供的生物医学培养器皿中。
在一些实施方案中，进行所提供的方法，使得用于临床用途(例如过继细胞疗法中)的细胞的制备中的一个、多个或所有步骤是在未将细胞暴露于非无菌条件下和不需要使用无菌室或无菌柜的情况下进行。在这种方法的一些实施方案中，细胞被分离、分开或选择、转导、洗涤、任选地激活或刺激和配制，都在封闭系统内进行。在这样的过程的一些方面，使细胞从封闭的系统中表达并将其引入一个或多个生物材料器皿中。在一些实施方案中，所述方法是以自动化方式进行的。在一些实施方案中，一个或多个步骤是在封闭的系统或装置之外进行的。
在一些实施方案中，将封闭的系统用于进行用于制造、生成或产生细胞疗法的方法的一个或多个其他处理步骤。在一些实施方案中，一个或多个或所有处理步骤(例如分离、选择和/或富集、处理、与转导和工程化结合的孵育)和配制步骤是使用集成或自含式系统中的系统、装置或设备进行和/或以自动化或可编程方式进行。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户编程、控制、评估处理、分离、工程化和配制步骤的结果和/或调整处理、分离、工程化和配制步骤的各个方面。在一个例子中，所述系统是如国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380A1中所述的系统。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
A.从样品分离或选择细胞
在一些实施方案中，处理步骤包括从生物样品分离细胞或其组合物，所述生物样品例如是获得自或源自受试者(如患有特定疾病或病症或需要细胞疗法或将被给予细胞疗法的受试者)的那些生物样品。在一些方面，受试者是人，如作为需要特定治疗干预(如针对其而将细胞分离、处理和/或工程化的过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。在一些实施方案中，细胞包括CD4+和CD8+T细胞。在一些实施方案中，细胞包括CD4+或CD8+T细胞。样品包括组织、流体和直接取自受试者的其他样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过处理的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的处理样品。
在一些实施方案中，样品是血液或血液来源的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性的样品包括全血、外周血单核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、粘膜相关淋巴组织、脾脏、其他淋巴组织、肝脏、肺、胃、肠、结肠、肾脏、胰腺、乳房、骨、前列腺、宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。
在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。
在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的所述血细胞以例如去除血浆级分，并将所述细胞置于适当缓冲液或介质中用于后续处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一些实施方案中，洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动化“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，洗涤步骤是通过切向流过滤(TFF)根据制造商的说明书完成的。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca++/Mg++的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，制备方法包括在分离、选择和/或富集、和/或用于转导和工程化的孵育之前或之后，和/或在培育和/或收获工程化细胞之后，冷冻(例如低温保存)细胞的步骤。用于生物样品(如T细胞或T细胞组合物)的冷冻、低温保存或低温的保存的示例性方法包括WO 2018170188中描述的那些方法，将其通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，冷冻和后续解冻步骤去除细胞群中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如，在洗涤步骤去除血浆和血小板之后，使所述细胞悬浮于冷冻溶液中。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。在一些实施方案中，将细胞在具有终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％、或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、6％与12％之间、5％与10％之间、或6％与8％之间的DMSO的培养基和/或溶液中冷冻(例如低温保存或低温保护)。在特定实施方案中，将细胞在具有终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％、或0.25％的HSA，或在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA的培养基和/或溶液中冷冻(例如低温保存或低温保护)。一个例子涉及使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以或以约1°/分钟的速率冷冻至-80℃或冷冻至约-80℃，并储存在液氮储罐的气相中。
在一些实施方案中，细胞或群体的分离包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、富集所需组分、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、大小、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过溶解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度进行离心来从外周血制备白细胞。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤包括将细胞与选择试剂一起孵育。与一种或多种选择试剂一起孵育，例如作为选择方法的一部分可以使用一种或多种选择试剂来进行，以用于基于一种或多种特定分子(如表面标记(例如表面蛋白)、细胞内标记或核酸)在细胞中或细胞上的表达或存在来选择一种或多种不同的细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的利用一种或多种选择试剂基于此类标记进行分离的方法。在一些实施方案中，一种或多种选择试剂导致分离，所述分离是基于亲和力或免疫亲和力的分离。例如，在一些方面，选择包括与一种或多种试剂一起孵育，用于基于一种或多种标记(通常是细胞表面标记)的细胞表达或表达水平来分离细胞和细胞群，例如通过与特异性地结合至此类标记的抗体或结合配偶体一起孵育，之后通常进行洗涤步骤并分离已结合抗体或结合配偶体的细胞与未结合至抗体或结合配偶体的那些细胞。在一些实施方案中，选择和/或过程的其他方面如国际专利申请公开号WO/2015/164675中所述。
在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的基于所需亲和力的选择试剂混合。基于免疫亲和力的选择可以使用导致被分离的细胞与特异性结合细胞上的标记的分子(例如抗体或固体表面(例如颗粒)上的其他结合配偶体)之间有利的有力相互作用的任何系统或方法来进行。在一些实施方案中，所述方法是使用包被有对细胞的标记具有特异性的选择剂(例如抗体)的颗粒(如珠，例如磁珠)来进行的。可以将颗粒(例如珠)与细胞在容器(如管或袋)中一起孵育或混合，同时振荡或混合，且细胞密度与颗粒(例如，珠)的比率是恒定的，以帮助促进特别有利的相互作用。在其他情况下，所述方法包括选择细胞，其中全部或部分选择是在离心室的内腔中进行，例如在离心旋转下进行。在一些实施方案中，将细胞与选择试剂(例如基于免疫亲和力的选择试剂)一起孵育是在离心室中进行。在某些实施方案中，使用国际专利申请公开号WO 2009/072003或US 20110003380 A1中描述的系统、装置或设备进行分离或分开。在一个例子中，所述系统是如国际公开号WO 2016/073602中所述的系统。
在一些实施方案中，通过在离心室的腔中实施此类选择步骤或其部分(例如，与抗体涂覆的颗粒(例如磁珠)一起孵育)，用户能够控制某些参数，例如各种溶液的体积、在处理期间溶液的添加及其定时，与其他可用方法相比，这可以提供多种优势。例如，在孵育期间减少腔中液体体积的能力可以增加选择中使用的颗粒(例如珠试剂)的浓度，并由此增加溶液的化学势，而不影响腔中的细胞总数。这又可以增强正在处理的细胞与用于选择的颗粒之间的成对相互作用。在一些实施方案中，例如，在与如本文所述的系统、电路和控制相关联时，在室中进行孵育步骤，允许用户在孵育期间的一个或多个所需时间实现对溶液的搅动，这也可以改善相互作用。
在一些实施方案中，至少一部分选择步骤是在离心室中进行，其包括将细胞与选择试剂一起孵育。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量所需的基于亲和力的选择试剂混合，所述体积和所述量显著少于在管或容器中根据制造商的说明书进行类似选择以选择相同数量的细胞和/或相同体积的细胞时通常所用的量。在一些实施方案中，所采用的一种或多种选择试剂的量为根据制造商的说明书针对相同数量的细胞和/或相同体积的细胞在基于管或容器的孵育中用于选择细胞的相同的一种或多种选择试剂的量的不超过5％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过50％、不超过60％、不超过70％或不超过80％。
在一些实施方案中，对于细胞的选择，例如基于免疫亲和力的选择，将细胞在室腔中在组合物中孵育，所述组合物还含有具有选择试剂的选择缓冲液，所述选择试剂例如为与希望富集和/或耗尽的细胞上(而不是组合物中其他细胞上)的表面标记特异性结合的分子，例如抗体，其任选地偶联到支架(例如聚合物或表面，例如珠，例如磁珠，例如与对CD4和CD8具有特异性的单克隆抗体偶联的磁珠)。在一些实施方案中，如所描述的，将选择试剂添加至室腔中的细胞，所添加的量与在振荡或旋转的管中进行选择时，实现相同数量的细胞或相同体积的细胞的大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的选择试剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和选择试剂添加选择缓冲液的情况下进行孵育，以实现例如10mL至200mL试剂的孵育的目标体积，例如至少或约至少或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL或200mL。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂在添加至细胞之前预先混合。在一些实施方案中，将选择缓冲液和选择试剂单独添加至细胞。在一些实施方案中，选择孵育是在周期性温和混合条件下进行的，这可有助于促进特别有利的相互作用，从而允许在实现高选择效率的同时使用较少的总选择试剂。
在一些实施方案中，与选择试剂一起孵育的总持续时间为5分钟至6小时或为约5分钟至约6小时，如30分钟至3小时，例如至少或约至少30分钟、60分钟、120分钟或180分钟。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或为约或为至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF为从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或为约或为至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，这个过程是在集成有所述室的完全封闭的系统内进行的。在一些实施方案中，这个过程(并且在一些方面还有一个或多个另外的步骤，例如预先洗涤步骤洗涤含有细胞的样品，例如单采术样品)以自动化方式进行，使得将细胞、试剂和其他组分在适当时间吸入和推出所述室并进行离心，以便使用自动化程序在单一封闭系统中完成洗涤和结合步骤。
在一些实施方案中，在孵育和/或混合细胞和一种和/或多种选择试剂后，将所孵育的细胞进行分离，以基于一种或多种特定试剂的存在或不存在来选择细胞。在一些实施方案中，在同一封闭系统中进行分离，在所述封闭系统中将细胞与选择试剂一起进行孵育。在一些实施方案中，在与选择试剂一起孵育之后，将孵育的细胞(包括选择试剂已结合的细胞)转移到系统中以进行基于免疫亲和力的细胞分离。在一些实施方案中，用于基于免疫亲和力的分离的系统是或含有磁分离柱。
此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已结合试剂(例如抗体或结合配偶体)的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留尚未与试剂(例如抗体或结合配偶体)结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在无法获得专门鉴定异质性群体中的细胞类型的抗体，使得最好基于除所需群体之外的细胞表达的标记来实施分离的情况下，阴性选择可以特别有用。
在一些实施方案中，处理步骤进一步包括如使用可进行基于亲和力的选择的系统或设备对孵育的细胞进行阴性和/或阳性选择。在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群，或经由阴性选择耗尽特定细胞群来进行分离。在一些实施方案中，阳性或阴性选择是通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达(标记+)或以相对较高水平表达(标记高)的一种或多种表面标记特异性地结合。可以进行多轮相同的选择步骤(例如阳性或阴性选择步骤)。在某些实施方案中，使阳性或阴性选择的级分经受选择过程，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，将选择重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或多于九次。在某些实施方案中，相同的选择进行多至五次。在某些实施方案中，相同的选择步骤进行三次。
分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记的细胞的完全不存在。同样，特定类型的细胞(如表达标记的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。
在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中使来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一分离步骤，如后续阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记具有特异性)一起孵育。同样，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。在某些实施方案中，一个或多个分离步骤重复和/或进行多于一次。在一些实施方案中，使从分离步骤得到的阳性或阴性选择的级分经受相同的分离步骤，如通过重复阳性或阴性选择步骤。在一些实施方案中，单个分离步骤重复和/或进行多于一次，例如以增加阳性选择细胞的产率，以增加阴性选择细胞的纯度，和/或以进一步从阴性选择的级分去除阳性选择的细胞。在某些实施方案中，一个或多个分离步骤进行和/或重复两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次、十次或多于十次。在某些实施方案中，所述一个或多个选择步骤进行和/或重复一次与十次之间、一次与五次之间或三次与五次之间。在某些实施方案中，一个或多个选择步骤重复三次。
例如，在一些方面，通过阳性或阴性选择技术分离T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞)。在一些实施方案中，通过与特异性结合此类标记的一种或多种抗体或结合配偶体一起孵育来选择此类细胞。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体可以与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)缀合(如直接或间接地)以实现选择。例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，
Figure BDA0002571820830000161
M-450CD3/CD28T细胞扩增器和/或
Figure BDA0002571820830000162
珠)阳性选择CD3+、CD28+T细胞。
在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞)上表达的标记(如CD14)，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4+或CD8+选择步骤用于分离CD4+辅助细胞和CD8+细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记的阳性或阴性选择，可以将此类CD4+和CD8+群体进一步分类成亚群。
在一些实施方案中，如通过基于与相应亚群相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8+T细胞针对幼稚、中枢记忆、效应子记忆和/或中枢记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中枢记忆T(TCM)细胞进行富集以增加功效，如以改善给予后的长期存活、扩增和/或移植，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人,(2012)Blood.1:72-82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含TCM的CD8+T细胞与CD4+T细胞进一步增强功效。
在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-两个子集中。可以例如使用抗CD8和抗CD62L抗体将PBMC针对CD62L-CD8+和/或CD62L+CD8+级分进行富集或耗尽。
在一些实施方案中，中枢记忆T(TCM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD 127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于对表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，通过表达CD4、CD14、CD45RA的细胞的耗尽和表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行富含TCM细胞的CD8+群体的分离。在一个方面，中枢记忆T(TCM)细胞的富集从基于CD4表达选择的阴性细胞级分开始进行，使所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达经受阴性选择且基于CD62L经受阳性选择。
在一些方面，此类选择是同时进行的，并且在其他方面，是以任何顺序依次进行的。在一些方面，用于制备CD8+T细胞群或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于产生CD4+T细胞群或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。在一些实施方案中，对CD4+T细胞群的选择和对CD8+T细胞群的选择同时进行。在一些实施方案中，以任一顺序依次进行CD4+T细胞群和CD8+T细胞群的选择。在一些实施方案中，用于选择细胞的方法可以包括如在公布的美国申请号US 20170037369中描述的那些方法。在一些实施方案中，选择的CD4+T细胞群和选择的CD8+T细胞群可以在选择之后进行组合。在一些方面，选择的CD4+T细胞群和选择的CD8+T细胞群可以在容器或袋(如生物反应器袋)中或在提供的生物医学材料器皿中组合。在一些实施方案中，单独地处理选择的CD4+T细胞群和选择的CD8+T细胞群，由此使选择的CD4+T细胞群富含CD4+T细胞并与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)的病毒载体转导，并在扩增T细胞的条件下培育，并且使选择的CD8+T细胞群富含CD8+T细胞，并与刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28磁珠)一起孵育，用编码重组蛋白(例如CAR)(所述重组蛋白与用于工程化来自同一供体的CD4+T细胞的重组蛋白相同)的病毒载体转导，并在扩增T细胞的条件下培育，如根据提供的方法。
在特定实施方案中，使生物样品(例如PBMC或其他白细胞的样品)经受CD4+T细胞的选择，其中保留阴性和阳性级分二者。在某些实施方案中，CD8+T细胞选自阴性级分。在一些实施方案中，使生物样品经受CD8+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。在某些实施方案中，CD4+T细胞选自阴性级分。
在特定例子中，使PBMC样品或其他白细胞样品经受CD4+T细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后使阴性级分经受基于CD14和CD45RA或CD19的表达的阴性选择，以及基于中枢记忆T细胞特有的标记(如CD62L或CCR7)的阳性选择，其中阳性和阴性选择是以任一顺序来进行。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，可以将CD4+T辅助细胞分类为幼稚、中枢记忆和效应细胞。CD4+淋巴细胞可通过标准方法获得。在一些实施方案中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-、CD45RA+、CD62L+或CD4+T细胞。在一些实施方案中，中枢记忆CD4+T细胞是CD62L+和CD45RO+。在一些实施方案中，效应CD4+T细胞是CD62L-和CD45RO-。
在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4+T细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许分离细胞以供阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群(综述于Methods in Molecular Medicine,第58卷:Metastasis Research Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑
Figure BDA0002571820830000181
Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦(Totowa,NJ))。
在一些方面，将待分离的所孵育的细胞的样品或组合物与含有小的可磁化或磁响应材料(如磁响应粒子或微粒，如顺磁珠(例如像Dynalbeads或
Figure BDA0002571820830000182
珠))的选择试剂一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附接至结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与需要分离(例如，需要进行阴性或阳性选择)的一种细胞、多种细胞或细胞群上存在的分子(例如，表面标记)特异性地结合。
在一些实施方案中，磁粒或磁珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。用于磁分离方法的许多熟知的磁响应材料是已知的，例如Molday,美国专利号4,452,773中和在欧洲专利说明书EP452342B中描述的那些，将这些专利通过引用特此并入。也可以使用胶体大小的颗粒，如在Owen美国专利号4,795,698和Liberti等人,美国专利号5,200,084中描述的那些。
孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁粒或磁珠的此类抗体或结合配偶体特异性地结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于样品内的细胞上的话)特异性地结合。
在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合配偶体、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，磁粒通过对一种或多种标记具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，链霉亲和素包被的磁粒是与生物素化的一抗或二抗结合使用的。
在一些方面，在程序中实现分离，在所述程序中将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引至磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁体吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性与阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或使其经受进一步的分离步骤。
在一些实施方案中，基于亲和力的选择是通过磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)来进行的。磁激活细胞分选(MACS)(例如CliniMACS系统)能够高纯度选择具有附着其上的磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以如下模式操作，其中在施加外部磁场之后依次洗脱非靶种类和靶种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞被保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成这个第一洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，标记非靶细胞并将其从异质性细胞群耗尽。
在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于细胞，所述细胞随后被孵育、培养和/或工程化；在一些方面，颗粒保持附着于细胞以用于给予患者。在一些实施方案中，从细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。用于从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争性非标记抗体、可磁化颗粒或与可切割接头缀合的抗体等。在一些实施方案中，可磁化颗粒是可生物降解的。
B.细胞的激活和刺激
在一些实施方案中，所述一个或多个处理步骤包括刺激分离的细胞(如选择的细胞群)的步骤。孵育可以在基因工程化之前或与基因工程化(如由上述转导方法的实施方案产生的基因工程化)相结合。在一些实施方案中，刺激导致例如在转导之前细胞的激活和/或增殖。
在一些实施方案中，处理步骤包括孵育细胞(如选择的细胞)，其中孵育步骤可以包括细胞的培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育组合物或细胞。此类条件包括针对以下而设计的那些条件：诱导群体中的细胞的增殖、激活和/或存活，模拟抗原暴露，和/或引发细胞用于基因工程化(如用于引入重组抗原受体)。
在一些实施方案中，用于刺激和/或激活的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够刺激或激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可以包括适合于传递(例如用于启动ITAM诱导的信号的激活的)初级信号的药剂，如抗体，如对TCR具有特异性的那些，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括能够刺激共刺激受体的一种或多种药剂(例如配体)，例如抗CD28或抗4-1BB。在一些实施方案中，此类药剂和/或配体可以与固体支持物(如珠)和/或一种或多种细胞因子结合。刺激剂包括抗CD3/抗CD28珠(例如，
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M-450CD3/CD28T细胞扩增器和/或
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珠)。任选地，扩增方法可以进一步包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/ml的浓度)的步骤。在一些实施方案中，刺激剂包括IL-2、IL-7和/或IL-15，例如，IL-2浓度为至少约10单位/mL、至少约50单位/mL、至少约100单位/mL或至少约200单位/mL。
条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。
在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82，和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。
在一些实施方案中，在一种或多种刺激条件或刺激剂的存在下的孵育的至少一部分是在离心室的内腔中，例如在离心旋转下进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述。在一些实施方案中，在离心室中进行的孵育的至少一部分包括与一种或多种试剂混合以诱导刺激和/或激活。在一些实施方案中，将细胞(如选择的细胞)与刺激条件或刺激剂在离心室中混合。在此类过程的一些方面，将一定体积的细胞与一定量的一种或多种刺激条件或刺激剂混合，所述刺激条件或刺激剂远小于在细胞培养板或其他系统中进行类似刺激时通常使用的刺激条件或刺激剂。
在一些实施方案中，将刺激剂添加至室腔中的细胞，所添加的量与例如在周期性振荡或旋转的管或袋中进行选择而不在离心室中混合时，实现相同数量的细胞或相同体积的细胞的大致相同或类似的选择效率通常使用或将需要的刺激剂的量相比显著较小(例如不大于所述量的5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％)。在一些实施方案中，在向细胞和刺激剂中添加孵育缓冲液的情况下进行孵育，以实现孵育例如约10mL至约200mL或约20mL至约125mL(如至少或至少约或约10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、105mL、110mL、115mL、120mL、125mL、130mL、135mL、140mL、145mL、150mL、160mL、170mL、180mL、190mL、或200mL)试剂的目标体积。在一些实施方案中，在添加细胞之前预先混合孵育缓冲液和刺激剂。在一些实施方案中，将孵育缓冲液和刺激剂单独添加至细胞中。在一些实施方案中，在周期性温和混合条件下进行刺激孵育，这可能有助于促进特别有利的相互作用，并且从而允许使用较少的总体刺激剂，同时实现细胞的刺激和激活。
在一些实施方案中，孵育通常在混合条件下进行，例如在旋转的存在下，通常以相对低的力或速度旋转，例如速度低于用于使细胞沉淀的速度，如从600rpm至1700rpm或从约600rpm至约1700rpm(例如，为或为约或为至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)，如在样品或室壁或其他容器壁处的一定RCF下，所述RCF为从80g至100g或从约80g至约100g(例如，为或为约或为至少80g、85g、90g、95g或100g)。在一些实施方案中，旋转是使用以这种低速旋转和之后的休息时间段的重复间隔来进行，例如旋转和/或休息1、2、3、4、5、6、7、8、9或10秒，例如旋转大约1或2秒，然后休息大约5、6、7或8秒。
在一些实施方案中，例如与刺激剂一起孵育的总持续时间在或在约1小时与96小时之间、1小时与72小时之间、1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间、18小时与30小时之间、或12小时与24小时之间，如为至少或为至少约或为约6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或72小时。在一些实施方案中，进一步孵育进行在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间的时间，包含端值。
C.基因工程化
在一些实施方案中，处理步骤包括引入编码重组蛋白的核酸分子。此类重组蛋白包括重组受体，如第III节所述的任何一种。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任何一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔。
在某些实施方案中，在例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞之前，将细胞的组合物工程化，例如转导或转染。在特定实施方案中，在刺激条件下已经刺激、激活和/或孵育细胞的组合物后，将组合物工程化。在特定实施方案中，组合物是刺激的组合物。在特定实施方案中，刺激的组合物已经预先低温保存和储存，并在工程化之前解冻。
在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(如例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体和人免疫缺陷病毒(HIV))将重组核酸转移至细胞中。
在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy 7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移至T细胞中(参见例如，Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；和Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。
用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中描述的那些。
在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如，T细胞)进行转染。例如，用于引入所需受体的基因的这种转染可以用任何合适的逆转录病毒载体来进行。然后可以使基因修饰的细胞群摆脱初始刺激物(例如CD3/CD28刺激物)，并且随后用第二种类型的刺激物例如经由从头引入的受体进行刺激。该第二种类型的刺激物可以包括肽/MHC分子形式的抗原刺激物、基因引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,ChimericAntigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。
在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的至少一部分的同时或期间将细胞工程化。
在一些方面，细胞被进一步工程化以促进细胞因子或其他因子的表达。另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善疗法功效的那些，如通过促进所转移细胞的活力和/或功能；用来提供用于选择和/或评价细胞(如用于评估体内存活或定位)的遗传标记的基因；用于改善安全性的基因，例如通过使细胞对体内阴性选择易感，如以下文献中所述：Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human GeneTherapy3:319-338(1992)；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开案，所述公开案描述了使用通过将显性的阳性选择标记与阴性选择标记融合而获得的双功能选择融合基因。参见例如Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。
在一些实施方案中，引入是通过使组合物的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如，重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的任何方法。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于
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和
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2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO 00/38762，将其各自的内容通过引用以其整体并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。
在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中进行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中描述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。
在一些实施方案中，系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，容器(如袋)包括一个或多个容器(如袋)，其在同一容器或单独的容器(如同一袋或单独的袋)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，系统进一步包括一个或多个容器(例如袋)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。
在一些实施方案中，室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他处理步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。
在一些实施方案中，可以使含有细胞、病毒颗粒和试剂的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，例如速度低于用于沉淀细胞的速度，如为600rpm至1700rpm或为约600rpm至约1700rpm(例如为或为约或至少600rpm、1000rpm或1500rpm或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转是以为100g至3200g或为约100g至约3200g(例如，为或为约或至少为或为约100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3200g)的力(例如，相对离心力)来进行，如例如在室或腔的内壁或外壁处所测量。术语“相对离心力”或RCF通常被理解为在如与旋转轴相比在空间的特定点处，相对于地球的重力，施加在物体或物质(例如细胞、样品或团粒和/或所旋转的室或其他容器中的点)上的有效力。值可以使用熟知的公式来确定，所述公式考虑到重力、旋转速度和旋转半径(与旋转轴的距离以及测量RCF的物体、物质或颗粒)。
在一些实施方案中，在基因工程的至少一部分(例如转导)期间，和/或在基因工程之后，将细胞转移到容器(如袋，例如生物反应器袋组件)中，用于培养经基因工程化的细胞，例如用于培育或扩增细胞，如上所述。在一些实施方案中，用于培育或扩增细胞的容器是生物反应器袋，如灌注袋。
1.载体和方法
在一些实施方案中，处理步骤包括将编码重组蛋白的核酸分子引入细胞中，并且可以使用许多已知载体中的任何一种来进行。在一些实施方案中，载体含有编码重组受体的核酸。在特定实施方案中，载体是病毒载体、非病毒载体。在一些情况下，载体是病毒载体，如逆转录病毒载体，例如慢病毒载体或γ逆转录病毒载体。
在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如GMCSFRα链信号肽、CD8α信号肽或CD33信号肽。
在一些实施方案中，载体包括病毒载体，例如逆转录病毒或慢病毒、非病毒载体或转座子，例如睡美人(Sleeping Beauty)转座子系统；源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体；慢病毒载体或逆转录病毒载体，如γ-逆转录病毒载体，源自莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)、脾病灶形成病毒(SFFV)或腺相关病毒(AAV)的逆转录病毒载体。
在一些实施方案中，病毒载体或非病毒DNA含有编码异源重组蛋白的核酸。在一些实施方案中，异源重组分子是或包括重组受体(例如抗原受体)、SB转座子(例如用于基因沉默)、衣壳包封的转座子、同源双链核酸(例如用于基因组重组)或报告基因(例如荧光蛋白，如GFP)或萤光素酶)。
2.用于转导的病毒载体颗粒的制备
在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如像源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp Hematol28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol Ther Nucl Acids 2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.2011年11月29日(11):550-557)。
在一些实施方案中，逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。在一些实施方案中，逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多说明性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)Human Gene Therapy1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109)。
慢病毒转导的方法是已知的。示例性的方法描述在例如Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；和Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505中。
在一些实施方案中，病毒载体颗粒含有源自基于逆转录病毒基因组的载体(例如源自基于慢病毒基因组的载体)的基因组。在提供的病毒载体的一些方面，编码重组受体(如CAR)的异源核酸被包含在和/或位于载体基因组的5'LTR与3'LTR序列之间。
在一些实施方案中，病毒载体基因组是慢病毒基因组，如HIV-1基因组或SIV基因组。例如，已经通过多次减弱毒力基因生成慢病毒载体，例如，可以使基因env、vif、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是已知的。参见Naldini等人,(1996和1998)；Zufferey等人,(1997)；Dull等人,1998,美国专利号6,013,516；和5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801UniversityBlvd.，Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
慢病毒载体的非限制性例子包括源自慢病毒的那些，例如人免疫缺陷病毒1(HIV-1)、HIV-2、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、人嗜T淋巴细胞病毒1(HTLV-1)、HTLV-2或马感染贫血病毒(E1AV)。例如，已经通过多次减弱HIV毒力基因生成慢病毒载体，例如，使基因env、vif、vpr、vpu和nef缺失，使得载体对于治疗目的更安全。慢病毒载体是本领域已知的，参见Naldini等人，(1996和1998)；Zufferey等人，(1997)；Dull等人，1998，美国专利号6,013,516；和5,994,136)。在一些实施方案中，这些病毒载体是基于质粒的或基于病毒的，并且被配置为携带用于掺入外来核酸的基本序列，用于选择和用于将所述核酸转移到宿主细胞中。已知的慢病毒可以容易地从保管机构或保藏中心例如美国典型培养物保藏中心(“ATCC”；10801University Blvd.，Manassas，Va.20110-2209)获得，或使用常用技术从已知来源分离。
病毒载体基因组通常以质粒形式构建，其可以转染到包装细胞系或生产细胞系中。在任何此类例子中，将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸插入或定位于病毒载体的区域中，例如通常在病毒基因组的非必需区域中。在一些实施方案中，将核酸插入病毒基因组的某些病毒序列的位置中以产生具有复制缺陷的病毒。
可以使用多种已知方法中的任何一种来产生逆转录病毒颗粒，其基因组含有病毒载体基因组的RNA拷贝。在一些实施方案中，至少两种组分参与制备基于病毒的基因传递系统：第一，包装质粒，包括结构蛋白以及生成病毒载体颗粒所必需的酶，第二，病毒载体本身，即，要转移的遗传物质。可以在设计这些组分中的一个或两个时引入生物安全保护措施。
在一些实施方案中，包装质粒可以含有除了包膜蛋白以外的所有逆转录病毒(如HIV-1)蛋白(Naldini等人，1998)。在其他实施方案中，病毒载体可能缺乏另外的病毒基因(例如与毒力有关的那些，例如vpr、vif、vpu和nef)和/或Tat(HIV的主要反式激活因子)。在一些实施方案中，慢病毒载体(例如基于HIV的慢病毒载体)仅包含三种亲本病毒的基因：gag、pol和rev，这减少或消除了野生型病毒通过重组而重构的可能性。
在一些实施方案中，将病毒载体基因组引入包装细胞系中，所述细胞系含有将从病毒载体基因组转录的病毒基因组RNA包装至病毒颗粒中所需的所有组分。可替代地，除了一种或多种目标序列(例如重组核酸)以外，病毒载体基因组可包含一种或多种编码病毒组分的基因。然而，在一些方面，为了防止基因组在靶细胞中复制，将复制所需的内源病毒基因去除，并在包装细胞系中单独提供。
在一些实施方案中，用一种或多种含有生成所述颗粒所需组分的质粒载体转染包装细胞系。在一些实施方案中，用含有病毒载体基因组(包括LTR、顺式作用包装序列和目标序列，即编码抗原受体(例如CAR)的核酸)的质粒；以及编码病毒酶和/或结构组分(例如Gag、pol和/或rev)的一种或多种辅助质粒转染包装细胞系。在一些实施方案中，利用多种载体分离生成逆转录病毒载体颗粒的各种遗传组分。在一些此类实施方案中，向包装细胞提供单独的载体减少了重组事件的可能性，否则可能生成有复制能力的病毒。在一些实施方案中，可以使用具有所有逆转录病毒组分的单个质粒载体。
在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)假型化以增加宿主细胞的转导效率。例如，在一些实施方案中，将逆转录病毒载体颗粒(例如慢病毒载体颗粒)用VSV-G糖蛋白假型化，其提供宽细胞宿主范围，从而扩展可以转导的细胞类型。在一些实施方案中，用编码非天然包膜糖蛋白的质粒或多核苷酸转染包装细胞系，以例如包括嗜异性，多嗜性或双嗜性包膜，例如辛德毕斯病毒(Sindbis virus)包膜、GALV或VSV-G。
在一些实施方案中，包装细胞系提供将病毒基因组RNA包装至慢病毒载体颗粒中反式作用所需的组分，包括病毒调节蛋白和结构蛋白。在一些实施方案中，包装细胞系可以是能够表达慢病毒蛋白并产生功能性慢病毒载体颗粒的任何细胞系。在一些方面，合适的包装细胞系包括293(ATCC CCL X)、293T、HeLA(ATCC CCL 2)、D17(ATCC CCL 183)、MDCK(ATCC CCL34)、BHK(ATCC CCL-10)和Cf2Th(ATCC CRL 1430)细胞。
在一些实施方案中，包装细胞系稳定地表达一种或多种病毒蛋白质。例如，在一些方面，可以构建含有gag、pol、rev和/或其他结构基因但不含LTR和包装组分的包装细胞系。在一些实施方案中，可以用编码一种或多种病毒蛋白的核酸分子以及含有编码异源蛋白的核酸分子的病毒载体基因组和/或编码包膜糖蛋白的核酸对包装细胞系进行瞬时转染。
在一些实施方案中，将病毒载体和包装质粒和/或辅助质粒通过转染或感染引入包装细胞系中。包装细胞系产生含有病毒载体基因组的病毒载体颗粒。用于转染或感染的方法是熟知的。非限制性例子包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖和脂质转染方法、电穿孔和显微注射。
在将重组质粒和逆转录病毒LTR和包装序列引入特殊细胞系(例如，通过磷酸钙沉淀)中时，包装序列可以允许待包装至病毒颗粒中的重组质粒的RNA转录，然后所述病毒颗粒可能会被分泌到培养基中。在一些实施方案中，然后收集含有重组逆转录病毒的培养基，任选地将其浓缩，并用于基因转移。例如，在一些方面，在将包装质粒和转移载体共转染至包装细胞系后，从培养基回收病毒载体颗粒，并通过本领域技术人员使用的标准方法进行滴定。
在一些实施方案中，可以通过引入质粒以允许产生慢病毒颗粒，而在包装细胞系(例如示例性HEK 293T细胞系)中产生逆转录病毒载体，例如慢病毒载体。在一些实施方案中，包装细胞被转染和/或含有编码gag和pol的多核苷酸，以及编码重组受体(例如抗原受体，例如CAR)的多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码rev蛋白的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些实施方案中，包装细胞系被任选地和/或另外用编码非天然包膜糖蛋白(例如VSV-G)的多核苷酸转染和/或含有所述多核苷酸。在一些此类实施方案中，在转染细胞(例如，HEK 293T细胞)后大约两天，细胞上清液含有可以回收并滴定的重组慢病毒载体。
所回收和/或产生的逆转录病毒载体颗粒可以用于使用如所述的方法转导靶细胞。一旦进入靶细胞中，病毒RNA就被逆转录，进入细胞核中并稳定整合到宿主基因组中。在病毒RNA整合后一天或两天，可以检测到重组蛋白(例如抗原受体，例如CAR)的表达。
D.细胞的培育和/或扩增
在一些实施方案中，可以在提供的生物医学材料器皿中或在提供的制品中储存或转移的生物医学材料包括已经使用包括用于培育工程化细胞(例如在促进增殖和/或扩增的条件下培育细胞)的一个或多个步骤的方法进行工程化的细胞。在一些实施方案中，在基因工程的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后在促进增殖和/或扩增的条件下培育工程化细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后培育细胞。在一些实施方案中，所述培育产生一种或多种富集T细胞的培育组合物。在一些实施方案中，此类条件可以被设计成诱导群体中的细胞的增殖、扩增、激活和/或存活。在特定实施方案中，刺激条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他被设计成促进细胞的生长、分裂和/或扩增的药剂))。
在一些实施方案中，将工程化细胞在如下容器中培养，所述容器可以例如经由补料端口用细胞培养基和/或细胞填充以用于培养添加的细胞。细胞可以来自需要细胞培养的任何细胞来源，例如以用于细胞的扩增和/或增殖。
在一些方面，培养基是支持细胞(如T细胞)的生长、培育、扩增或增殖的适应性培养基。在一些方面，培养基可以是含有盐、氨基酸、维生素、糖或其任何组合的混合物的液体。在一些实施方案中，培养基进一步含有一种或多种刺激条件或刺激剂，例如在孵育期间刺激细胞的培育、扩增或增殖。在一些实施方案中，刺激条件是或包括如选自IL-2、IL-7或IL-15的一种或多种细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括4-α-螺旋束细胞因子家族的成员。在一些实施方案中，4-α-螺旋束细胞因子家族的成员包括但不限于白细胞介素2(IL-2)、白细胞介素4(IL-4)、白细胞介素7(IL-7)、白细胞介素9(IL-9)、白细胞介素12(IL-12)、白细胞介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。
在一些实施方案中，在培养或孵育期间在培养基中的一种或多种细胞因子的浓度独立地为或为约1IU/mL至1500IU/mL，例如为或为约1IU/mL至100IU/mL、2IU/mL至50IU/mL、5IU/mL至10IU/mL、10IU/mL至500IU/mL、50IU/mL至250IU/mL或100IU/mL至200IU/mL、50IU/mL至1500IU/mL、100IU/mL至1000IU/mL或200IU/mL至600IU/mL。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子的浓度独立地为至少或至少约1IU/mL、5IU/mL、10IU/mL、50IU/mL、100IU/mL、200IU/mL、500IU/mL、1000IU/mL或1500IU/mL。
在一些方面，在转移工程化细胞和培养基之后，将细胞孵育至少一部分时间。在一些实施方案中，刺激条件通常包括适合于初级免疫细胞如人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或约在37摄氏度。在一些实施方案中，将富集的T细胞的组合物在25℃至38℃(如30℃至37℃，例如为或为约37℃±2℃)的温度下孵育。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、浓度、数量或剂量的细胞。在一些实施方案中，将孵育进行一段时间直至培养(例如培育或扩增)产生所希望的或阈值密度、浓度、数量或剂量的活细胞。在一些实施方案中，孵育是大于或大于约或持续约或24小时、48小时、72小时、96小时、5天、6天、7天、8天、9天或更长时间。
在一些实施方案中，在维持细胞培养物中目标量的二氧化碳的条件下孵育细胞。在一些方面，这确保了细胞在生长期间的最佳培育、扩增和增殖。在一些方面，二氧化碳(CO2)的量在所述气体的10％与0％(v/v)之间，如在所述气体的8％与2％(v/v)之间，例如，为或约5％(v/v)CO2的量。
在特定实施方案中，在封闭系统中进行培育。在某些实施方案中，在无菌条件下在封闭系统中进行培育。在特定实施方案中，在与提供的系统的一个或多个步骤相同的封闭系统中进行培育。在一些实施方案中，从封闭系统移取富集的T细胞的组合物，并将其置于生物反应器中和/或与生物反应器连接以进行培育。用于培育的合适生物反应器的例子包括但不限于GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20|50、FinesseSmartRocker生物反应器系统和Pall XRS生物反应器系统。在一些实施方案中，生物反应器用于在培育步骤的至少一部分期间灌注和/或混合细胞。
在一些实施方案中，在封闭、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞比在没有生物反应器的情况下培育的细胞(例如在静态条件(如没有混合、摇摆、运动和/或灌注)下培育的细胞)在培育过程中更快地经历扩增。在一些实施方案中，在封闭、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞在14天、10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时内达到或实现阈值扩增、细胞计数和/或密度。在一些实施方案中，在封闭、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育的细胞达到或实现的阈值扩增、细胞计数和/或密度是在示例性和/或替代性过程(其中细胞未在封闭、连接的生物反应器中和/或在生物反应器的控制下培育)中培育的细胞的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少100％、至少150％、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍。
在一些实施方案中，混合是或包括摇摆和/或运动。在一些实施方案中，使用与生物反应器结合使用的容器(例如袋)孵育细胞。在一些情况下，生物反应器可以经受运动或摇摆，其在一些方面可以增加氧气传递。使生物反应器运动可以包括但不限于沿着水平轴线旋转、沿着竖直轴线旋转、沿着生物反应器的倾斜(tilted或inclined)的水平轴线的摇摆运动、或其任何组合。在一些实施方案中，在摇摆的情况下进行孵育的至少一部分。可以调节摇摆速度和摇摆角度以实现所希望的搅动。在一些实施方案中，摇摆角度为或为约20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°或1°。在某些实施方案中，摇摆角度在6-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在7-16°之间。在其他实施方案中，摇摆角度在8-12°之间。在一些实施方案中，摇摆速率为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpm。在一些实施方案中，摇摆速率在4rpm与12rpm之间，例如在4rpm与6rpm之间，包含端值。在摇摆运动(例如以在5°与10°之间(如6°)的角度，以恒定摇摆速度(例如在5RPM与15RPM之间(如6RMP或10RPM)的速度))的情况下进行至少一部分的细胞培养物扩增。
在一些实施方案中，将包含细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物在表面活性剂的存在下进行培育。在特定实施方案中，培育组合物的细胞减少了例如由于混合、摇摆、运动和/或灌注而在培育过程中可能发生的剪切应力的量。在特定实施方案中，将细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物用表面活性剂培育，并且在培育完成后至少1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天或多于7天，至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或至少99.9％的T细胞存活，例如是活的和/或未经历坏死、程序性细胞死亡或细胞凋亡。在特定实施方案中，将细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物在表面活性剂的存在下培育，并且少于50％、少于40％、少于30％、少于25％、少于20％、少于15％、少于10％、少于5％、少于1％、少于0.1％或少于0.01％的细胞经历如由于剪切或剪切诱导的应力导致的细胞死亡(例如程序性细胞死亡)、细胞凋亡和/或坏死。
在特定实施方案中，将细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、0.5μl/ml与5μl/ml之间、1μl/ml与3μl/ml之间、或2μl/ml与4μl/ml之间的表面活性剂的存在下培育。在一些实施方案中，将细胞(如工程化T细胞，例如工程化CD4+T细胞或工程化CD8+T细胞)的组合物在为、为约、或为至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml、或50μl/ml的表面活性剂的存在下培育。在某些实施方案中，将细胞的组合物在为或为约2μl/ml的表面活性剂的存在下培养。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括降低液体和/或固体的表面张力的药剂。例如，表面活性剂包括脂肪醇(例如甾醇)、聚乙二醇辛基酚醚(例如Triton X-100)或聚乙二醇脱水山梨糖醇烷基酯(例如聚山梨酯20、40、60)。在某些实施方案中，表面活性剂选自聚山梨酯80(PS80)、聚山梨酯20(PS20)、泊洛沙姆188(P188)。在示例性实施方案中，化学成分确定的补料培养基中的表面活性剂的浓度为约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS80；约0.0025％至约0.25％(v/v)的PS20；或约0.1％至约5.0％(w/v)的P188。
在一些实施方案中，表面活性剂是或包括添加到其中的阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性离子表面活性剂或非离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括但不限于烷基磺酸盐、烷基磷酸盐、烷基膦酸盐、月桂酸钾、硬脂酸三乙醇胺、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、烷基聚氧乙烯硫酸盐、海藻酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠、磷脂酰甘油、磷脂酰肌苷、磷脂酰肌醇、双磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸及其盐、羧甲基纤维素钠、胆酸和其他胆汁酸(例如胆酸、脱氧胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、甘氨脱氧胆酸)及其盐(例如脱氧胆酸钠)。
在一些实施方案中，合适的非离子表面活性剂包括：甘油酯、聚氧乙烯脂肪醇醚、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯(聚山梨酯)、聚氧乙烯脂肪酸酯、脱水山梨糖醇酯、单硬脂酸甘油酯、聚乙二醇、聚丙二醇、鲸蜡醇、鲸蜡基硬脂醇、硬脂醇、芳基烷基聚醚醇、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆)、泊洛沙胺、甲基纤维素、羟甲基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、非结晶纤维素、多糖(包括淀粉和淀粉衍生物，如羟乙基淀粉(HES))、聚乙烯醇和聚乙烯吡咯烷酮。在某些实施方案中，非离子表面活性剂是聚氧乙烯和聚氧丙烯共聚物，并且优选地是丙二醇和乙二醇的嵌段共聚物。此类聚合物以商标名泊洛沙姆(POLOXAMER)(有时也称为
Figure BDA0002571820830000341
F68或
Figure BDA0002571820830000342
P188)出售。聚氧乙烯脂肪酸酯包括具有短烷基链的那些。这种表面活性剂的一个例子是
Figure BDA0002571820830000343
HS 15，即聚乙烯-660-羟基硬脂酸酯。
在一些实施方案中，合适的阳离子表面活性剂可以包括但不限于天然磷脂、合成磷脂、季铵化合物、苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵、壳聚糖、月桂基二甲基苄基氯化铵、酰基肉碱盐酸、二甲基双十八烷基溴化铵(DDAB)、二油酰基三甲基铵丙烷(DOTAP)、双十四酰基三甲基铵丙烷(DMTAP)、二甲基氨基乙烷氨基甲酰基胆固醇(DC-Chol)、1,2-二酰基甘油-3-(O-烷基)磷酸胆碱、O-烷基磷脂酰胆碱、烷基吡啶鎓卤化物或长链烷基胺(例如正辛胺和油酰胺)。
两性离子表面活性剂是电中性的，但在同一分子内具有局部正电荷和负电荷。合适的两性离子表面活性剂包括但不限于两性离子磷脂。合适的磷脂包括磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、二酰基-甘油-磷酸乙醇胺(如双十四酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DSPE)和二油酰基-甘油-磷酸乙醇胺(DOPE))。在本发明中可以使用磷脂(包括阴离子磷脂和两性离子磷脂)的混合物。此类混合物包括但不限于溶血磷脂、卵磷脂或大豆磷脂或其任何组合。磷脂(无论是阴离子的磷脂、两性离子磷脂还是磷脂的混合物)可以被盐化或脱盐、氢化或部分氢化或者是天然半合成的或合成的。
在某些实施方案中，表面活性剂是泊洛沙姆，例如泊洛沙姆188。在一些实施方案中，将细胞的组合物在0.1μl/ml与10.0μl/ml之间、0.2μl/ml与2.5μl/ml之间、0.5μl/ml与5μl/ml之间、1μl/ml与3μl/ml之间、或2μl/ml与4μl/ml之间的泊洛沙姆的存在下培育。在一些实施方案中，将细胞的组合物在为、为约、或为至少0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml、或50μl/ml的表面活性剂的存在下培育。在某些实施方案中，将细胞的组合物在为或为约2μl/ml的泊洛沙姆的存在下培养。
在一些方面，CD4+和CD8+细胞各自单独扩增或一起扩增，直至它们各自达到阈值量或细胞密度。在特定实施方案中，当细胞实现阈值量、浓度和/或扩增时，培育结束，如通过收获细胞来结束。在特定实施方案中，当细胞实现或实现例如关于和/或相对于培育开始或起始时的细胞密度的量的约或至少1.5倍扩增、2倍扩增、2.5倍扩增、3倍扩增、3.5倍扩增、4倍扩增、4.5倍扩增、5倍扩增、6倍扩增、7倍扩增、8倍扩增、9倍扩增、10倍扩增或大于10倍扩增时，培育结束。在一些实施方案中，阈值扩增是例如关于和/或相对于培养开始或起始时的细胞密度的量的4倍扩增。在一些实施方案中，当细胞实现阈值总细胞量(例如阈值细胞计数)时，培育结束，如通过收获细胞来结束。在一些实施方案中，当细胞实现阈值总有核细胞(TNC)计数时，培育结束。在一些实施方案中，当细胞实现阈值活细胞量(例如阈值活细胞计数)时，培育结束。在一些实施方案中，阈值细胞计数为或为约或为至少50x106个细胞、100x106个细胞、200x106个细胞、300x106个细胞、400x106个细胞、600x106个细胞、800x106个细胞、1000x106个细胞、1200x106个细胞、1400x106个细胞、1600x106个细胞、1800x106个细胞、2000x106个细胞、2500x106个细胞、3000x106个细胞、4000x106个细胞、5000x106个细胞、10,000x106个细胞、12,000x106个细胞、15,000x106个细胞或20,000x106个细胞，或前述活细胞阈值中的任何一个。
在特定实施方案中，当细胞实现阈值细胞计数时，培育结束。在一些实施方案中，在实现阈值细胞计数之后在以下时间、大约在以下时间或在以下时间内培育结束：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现阈值细胞计数之后1天或约1天，培育结束。在某些实施方案中，阈值密度为、为约或为至少0.1x106个细胞/ml、0.5x106个细胞/ml、1x106个细胞/ml、1.2x106个细胞/ml、1.5x106个细胞/ml、1.6x106个细胞/ml、1.8x106个细胞/ml、2.0x106个细胞/ml、2.5x106个细胞/ml、3.0x106个细胞/ml、3.5x106个细胞/ml、4.0x106个细胞/ml、4.5x106个细胞/ml、5.0x106个细胞/ml、6x106个细胞/ml、8x106个细胞/ml、或10x106个细胞/ml，或前述活细胞阈值中的任何一个。在特定实施方案中，当细胞实现阈值密度时，培育结束。在一些实施方案中，在实现阈值密度之后在以下时间、大约在以下时间或在以下时间内培育结束：6小时、12小时、24小时、36小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天或更多天。在特定实施方案中，在实现阈值密度之后1天或约1天，培育结束。
在一些实施方案中，在静态条件下进行至少一部分的孵育。在一些实施方案中，在灌注(例如在培养期间灌注出用过的培养基并灌注入新鲜培养基)的情况下进行至少一部分的孵育。在一些实施方案中，方法包括将新鲜培养基灌注到细胞培养物中(如通过补料端口)的步骤。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基含有所述一种或多种刺激剂，例如，一种或多种重组细胞因子，如IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，在灌注期间添加的培养基与在静态孵育期间使用的培养基相同。
在一些实施方案中，在孵育之后，将容器(例如袋)重新连接到系统以进行用于制造、生成或产生细胞疗法的一个或多个其他处理步骤的系统上，例如重新连接到含有离心室的系统上。在一些方面，将培养的细胞从袋转移到室的内腔中用于配制培养的细胞。
E.组合物和配制品
在一些实施方案中，提供包含用重组抗原受体(例如，CAR或TCR)工程化的细胞的所述剂量的细胞作为组合物或配制品，如药物组合物或配制品。此类组合物可以根据过继细胞治疗方法(包括用于预防或治疗疾病、病症和障碍的方法)使用，或者在检测、诊断和预后方法中使用。在一些实施方案中，此类组合物或配制品可以在提供的生物医学材料器皿中储存、容纳或转移，和/或作为提供的制品的组分。
在一些情况下，细胞在(例如在离心室和/或封闭系统中进行的)一个或多个步骤中进行处理以用于制造、生成或产生细胞疗法和/或工程化细胞可以包括细胞的配制品，如由在培养(例如培育和扩增)之前或之后的提供的转导处理步骤和/或如所述的一个或多个其他处理步骤产生的基因工程化细胞的配制品。在一些情况下，可以将细胞以用于剂量给予(如用于单个单位剂量给予或多剂量给予)的量配制。在一些实施方案中，提供的与细胞的配制有关的方法包括在封闭系统中处理转导的细胞，如使用上述处理步骤转导和/或扩增的细胞。在一些实施方案中，可以将配制的细胞转移或引入本文提供的生物医学材料器皿(例如小瓶)中。
在某些实施方案中，配制细胞(如工程化和培育的T细胞)的一种或多种组合物。在特定实施方案中，在已经工程化和/或培育所述一种或多种组合物之后，配制细胞(如工程化和培育的T细胞)的一种或多种细胞组合物。
在一些实施方案中，配制通过一个或多个处理步骤生成的T细胞(如CD4+和/或CD8+T细胞)。在一些方面，多种组合物是单独地制造、产生或生成的，各自含有来自受试者的细胞的不同群体和/或亚型，如用于任选在特定时间段内单独地或独立地给予。例如，含有细胞的不同群体或亚型的单独工程化细胞配制品可以分别包括CD8+和CD4+T细胞，和/或分别可富含CD8+和富含CD4+的群体，例如，CD4+和/或CD8+T细胞，其各自单独地包括遗传工程化以表达重组受体的细胞。在一些实施方案中，将至少一种组合物与经基因工程化以表达重组受体的CD4+T细胞一起配制。在一些实施方案中，将至少一种组合物与经基因工程化以表达重组受体的CD8+T细胞一起配制。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予第一组合物，其包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞；以及给予第二组合物，其包含另一剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，在第二组合物之前给予第一组合物，所述第一组合物包含一定剂量的CD8+T细胞或一定剂量的CD4+T细胞，所述第二组合物包含另一剂量的CD4+T细胞和CD8+T细胞。在一些实施方案中，所述剂量的给予包括给予包含一定剂量的CD8+T细胞和一定剂量的CD4+T细胞二者的组合物。
在某些实施方案中，细胞(如工程化和培育的T细胞)的所述一种或多种组合物是或包括细胞的两种单独组合物，例如单独的工程化和/或培育的组合物。在特定实施方案中，单独地配制细胞的两种单独组合物，例如从同一生物样品选择、分离和/或富集的CD4+T细胞和CD8+T细胞的两种单独组合物。在某些实施方案中，这两种单独组合物包括CD4+T细胞的组合物，如工程化和/或培育的CD4+T细胞的组合物。在特定实施方案中，这两种单独组合物包括CD8+T细胞的组合物，如工程化和/或培育的CD8+T细胞的组合物。在一些实施方案中，单独地配制CD4+T细胞和CD8+T细胞的两种单独组合物，如工程化和培育的CD4+T细胞以及工程化和培育的CD8+T细胞的单独组合物。在一些实施方案中，配制细胞的单一组合物。在某些实施方案中，单一组合物是CD4+T细胞的组合物，如工程化和/或培养的CD4+T细胞的组合物。在一些实施方案中，单一组合物是在配制之前已经由单独组合物组合的CD4+和CD8+T细胞的组合物。
在一些实施方案中，将CD4+和CD8+T细胞的单独组合物(如工程化和培育的CD4+和CD8+T细胞的单独组合物)组合成单一组合物并配制。在某些实施方案中，在已经进行和/或完成配制后，将CD4+和CD8+T细胞的单独配制的组合物组合成单一组合物。在特定实施方案中，将CD4+和CD8+T细胞的单独组合物(如工程化和培育的CD4+和CD8+T细胞的单独组合物)单独地配制为单独组合物。
在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器(如小瓶，如本文提供的生物医学材料器皿中的任何小瓶)中。在一些实施方案中，在培育过程中已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增之后0天与10天之间、0与5天之间、2天与7天之间、0.5天与4天之间、或1天与3天之间配制细胞。在某些实施方案中，在培育过程中已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增之后在以下时间、大约在以下时间或在以下时间内配制细胞：12小时、18小时、24小时、1天、2天或3天。在一些实施方案中，在培育过程中已经实现阈值细胞计数、密度和/或扩增之后1天内或约1天内配制细胞。
在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，在一些方面，所述药学上可接受的缓冲液可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，处理包括将介质交换成药学上可接受的或对于给予受试者而言所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，处理步骤可以包括洗涤转导的和/或扩增的细胞以将细胞重新置于药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。此类药物形式(包括药学上可接受的载体或赋形剂)的例子可以是下文结合用于将细胞和组合物给予至受试者的可接受形式所描述的任何一种。在一些实施方案中，药物组合物包含有效治疗或预防疾病或病症的量(例如治疗有效量或预防有效量)的细胞。
“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或给予方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980)。药学上可接受的载体在所用剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲液，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。
在一些方面，组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可给予的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:The Science andPractice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；第21版(2005年5月1日)中。
配制品可以包括水溶液。配制品或组合物还可以含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量合适地组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物进一步包含其他药物活性药剂或药物，如化学治疗剂，例如，天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、道诺霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。
在一些实施方案中，组合物被提供为无菌液体制剂(例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物)，其在一些方面可以被缓冲至选择的pH。液体组合物可以包含载体，所述载体可以是溶剂或分散介质，所述溶剂或分散介质含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。无菌可注射溶液可以通过将细胞掺入溶剂中来制备，如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可以含有辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或粘度增强添加剂、防腐剂、调味剂和/或颜料，这取决于给予途径和所需的制剂。在一些方面，可以查阅标准文本来制备合适的制剂。
可以添加增强组合物的稳定性和无菌性的各种添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保对微生物作用的防止。可以通过使用延迟吸收的药剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长吸收。
在一些实施方案中，配制品缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用含有1.0％至30％DMSO溶液(如5％至20％DMSO溶液或5％至10％DMSO溶液)的低温保存溶液配制细胞。在一些实施方案中，低温保存溶液是或包含例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS或其他合适的细胞冷冻培养基。在一些实施方案中，低温保存溶液是或包含例如至少或约7.5％DMSO。在一些实施方案中，处理步骤可以包括洗涤转导和/或扩增的细胞以将细胞重新置于低温保存溶液中。在一些实施方案中，将细胞在具有终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％、或5.0％的DMSO，或在1％与15％之间、6％与12％之间、5％与10％之间、或6％与8％之间的DMSO的培养基和/或溶液中冷冻(例如低温保存或低温保护)。在特定实施方案中，将细胞在具有终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％、或0.25％的HSA，或在0.1％与5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA的培养基和/或溶液中冷冻(例如低温保存或低温保护)。
在特定实施方案中，将富集的T细胞(例如已经刺激、工程化和/或培育的T细胞)的组合物配制、例如在提供的生物医学材料器皿中低温保存并随后储存一段时间。在某些实施方案中，将配制的低温保存的细胞储存直至释放细胞用于输注。在特定实施方案中，将配制的低温保存细胞储存持续1天与6个月之间、1个月与3个月之间、1天与14天之间、1天与7天之间、3天与6天之间、6个月与12个月之间或超过12个月。在一些实施方案中，将细胞低温保存并储存以下时间、大约以下时间或少于以下时间：1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存后将细胞解冻并给予至受试者。在某些实施方案中，将细胞储存5天或约5天。
在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述一个或多个处理步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞，如培养或扩增的细胞。在一些实施方案中，处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包含用于以给定剂量给予的细胞数量或其级分的单位剂量形式组合物。在一些实施方案中，处理步骤可以包括减小体积从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，处理步骤可以包括增加体积从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，处理包括向转导和/或扩增的细胞添加一定体积的配制品缓冲液。在一些实施方案中，配制品缓冲液的体积为从10mL至1000mL或从约10mL至约1000mL，如至少或至少约或约50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。
在一些实施方案中，在容器(例如袋或离心室)中培养(如刺激、工程化和/或培育)细胞。在一些方面，容器是第一容器并且将培养的细胞从第一容器(例如袋或离心室)挤压或转移到第二容器(如生物医学材料器皿)，所述第二容器与第一容器可操作地连接。在一些实施方案中，生物医学材料器皿被配置成与用于一个或多个先前的处理步骤的第一容器(例如袋或离心室)集成和或可操作的连接和/或进行集成或可操作地连接。在一些实施方案中，生物医学材料器皿与第一容器(例如袋或离心室)在输出管线或输出位置处连接。在一些情况下，第一容器(例如袋或离心室)与生物医学材料器皿的小瓶在入口管处连接。
在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的此类处理步骤在封闭系统中进行。此类处理步骤的例子可以使用结合与细胞处理系统有关的一个或多个系统或试剂盒的离心室(如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括与
Figure BDA0002571820830000421
or Sepax
Figure BDA0002571820830000422
细胞处理系统一起使用的那些)来进行。示例性的系统和过程描述在国际公开号WO 2016/073602中。在一些实施方案中，方法包括从离心室的内腔中挤压或转移配制的组合物，所述配制的组合物是在如上所述的实施方案中在配制品缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制得到的细胞组合物。在一些实施方案中，配制的组合物的挤压或转移是针对作为封闭系统的一部分与离心室可操作连接的容器，如本文所述的生物医学材料器皿的小瓶。在一些实施方案中，生物医学材料器皿被配置成与进行一个或多个处理步骤的封闭系统或装置集成和或可操作的连接和/或进行集成或可操作地连接。在一些实施方案中，生物医学材料器皿与系统在输出管线或输出位置处连接。在一些情况下，封闭系统与生物医学材料器皿的小瓶在入口管处连接。与本文所述的生物医学材料器皿一起使用的示例性封闭系统包括
Figure BDA0002571820830000424
和
Figure BDA0002571820830000423
2系统。
在一些实施方案中，可以将组合物从第一容器(如离心室或细胞处理系统)经由多端口输出试剂盒转移到提供的生物医学材料器皿，所述多端口输出试剂盒含有在管线的每一端与端口相连的多向管路歧管，可以与一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)连接以挤压配制的组合物。在一些方面，可以将所需数量的或多个此类小瓶与多端口输出的一个或多个、通常两个或更多个(如至少3、4、5、6、7、8或更多个)端口无菌地连接。例如，在一些实施方案中，一个或多个容器(例如生物医学材料器皿)可以附接至端口，或者附接至少于所有端口。因此，在一些实施方案中，系统可以实现将输出组合物挤压到生物医学材料器皿的多个小瓶中。
在一些方面，可以将细胞以用于剂量给予(如用于单个单位剂量给予或多剂量给予)的量挤压或转移到所述多个输出容器(例如生物医学材料器皿的小瓶)中的一个或多个。例如，在一些实施方案中，生物医学材料器皿的小瓶可以各自含有用于以给定剂量或其部分给予的细胞数量。因此，在一些方面，每个小瓶可以含有用于给予的单个单位剂量，或可以含有所需剂量的部分，使得所述多个小瓶中的多于一个(如小瓶中的两个或小瓶中的3个)一起构成用于给予的剂量。
因此，本文所述的生物医学材料器皿中的小瓶通常含有待给予的细胞，例如其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是待给予至受试者的细胞的量或数量，或者是待给予的细胞的数量的两倍(或更多)。其可以是将给予至受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。
在一些实施方案中，每个小瓶单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或者大约或基本上相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或至少约1x 106、2x 106、5x 106、1x 107、5x 107、1x 108、2.5x 108、或5x 108个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或至少约2.5x 107、至少或至少约5.0x 107、至少或至少约1.5x 108、至少或至少约3.0x 108、至少或至少约4.5x 108、至少或至少约8.0x 108、或至少或至少约1.2x 109个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个单位剂量含有不多于或不多于约2.5x 107、不多于或不多于约5.0x 107、不多于或不多于约1.5x 108、不多于或不多于约3.0x 108、不多于或不多于约4.5x 108、不多于或不多于约8.0x 108、或不多于或不多于约1.2x 109个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些方面，可容纳在小瓶中的示例性细胞剂量包括本文(例如在第IV节中)所述的任何剂量。在一些方面，可给予至受试者的细胞的示例性剂量包括本文(例如在第IV节中)所述的任何剂量。
在一些实施方案中，每个容器中配制的细胞组合物的体积为10mL至100mL，如至少或至少约或约20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。在一些实施方案中，可以将小瓶中的细胞低温保存。在一些实施方案中，可以将小瓶储存在液氮中直至进一步使用。
在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物给予至受试者以治疗疾病或病症。
III.重组蛋白
在一些实施方案中，本文提供的生物医学材料器皿可用于保存、储存和/或转移生物医学材料，如含有被工程化以表达重组蛋白(如重组受体)的细胞(如与包括制造、生成或产生细胞疗法的过程结合的细胞)的组合物。在一些实施方案中，可以在提供的生物医学材料器皿中储存的组合物或细胞包括用重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞(例如T细胞)，例如CAR T细胞。在一些实施方案中，可以将组合物或细胞以用于剂量给予(如用于单个单位剂量给予或多剂量给予)的量配制到小瓶中以用于疗法，如过继细胞疗法。
在一些实施方案中，可以在提供的生物医学材料器皿中保持、保存、转移或储存的组合物或细胞包括如本文(例如在第II节中)所述已被工程化和/或培育的那些细胞。在一些实施方案中，用于培养(如用于细胞的扩增或培育)的方法是对用重组蛋白基因工程化(例如转导)的细胞进行的。在一些实施方案中，重组蛋白是或包括重组受体，例如抗原受体。抗原受体可以包括功能性非TCR抗原受体，包括嵌合抗原受体(CAR)和其他抗原结合受体，例如转基因T细胞受体(TCR)。受体还可以包括其他受体，如其他嵌合受体，如与特定配体结合并且具有与CAR中存在的那些类似的跨膜和/或细胞内信号传导结构域的受体。
示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO 2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061、美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337、美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP 2537416，和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中所述的CAR以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中所述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci Transl Med.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。
在一些实施方案中，编码重组蛋白的一个或多个核酸进一步编码一种或多种标记，例如用于确认要表达受体的细胞的转导或工程化和/或对表达由多核苷酸编码的一种或多种分子的细胞的选择和/或靶向的目的。在一些方面，这种标记可以由不同的核酸或多核苷酸编码，所述核酸或多核苷酸也可以在基因工程化过程期间被引入，通常通过相同的方法(例如通过本文提供的任何方法转导，例如通过相同的载体或相同类型的载体转导)被引入。
在一些方面，标记(例如转导标记)是蛋白质和/或是细胞表面分子。示例性标记是天然存在的(例如内源性)标记(例如天然存在的细胞表面分子)的截短的变体。在一些方面，与天然或内源细胞表面分子相比，变体具有降低的免疫原性、降低的运输功能和/或降低的信号传导功能。在一些实施方案中，标记是细胞表面受体的截短形式，例如截短的EGFR(tEGFR)。在一些方面，标记包括CD34、NGFR或表皮生长因子受体的全部或部分(例如截短形式)(例如tEGFR)。在一些实施方案中，编码所述标记的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列)的多核苷酸可操作地连接。参见例如WO 2014/031687。在一些实施方案中，单一启动子可以指导RNA的表达，所述RNA在单个开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如，编码参与调节代谢途径的分子和编码重组受体)，所述基因由编码自切割肽(例如2A序列)或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))的序列彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被处理成单一蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与相邻下游肽之间分开(参见例如de Felipe.Genetic Vaccines and Ther.2:13(2004)和deFelipe等人Traffic5:616-626(2004))。已知许多2A元件。可以用于本文公开的方法和核酸中的2A序列的例子包括但不限于来自口蹄疫病毒的2A序列(F2A)、来自马甲型鼻炎病毒的2A序列(E2A)、来自明脉扁刺蛾β四体病毒(Thosea asigna virus)的2A序列(T2A)和来自猪捷申病毒-1的2A序列(P2A)，如美国专利公开号20070116690中所述。
在一些实施方案中，标记是并未在T细胞上天然发现的或并未在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。
在一些实施方案中，分子是非自身分子，例如非自身蛋白，即不被宿主的免疫系统识别为“自身”的分子，所述细胞将被过继转移至所述宿主中。
在一些实施方案中，标记不起任何治疗作用和/或不产生除了用作基因工程化的标记(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，标记可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内将遇到的细胞的配体，如共刺激分子或免疫检查点分子，以在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱所述细胞的应答。
A.嵌合抗原受体
在一些实施方案中，CAR通常是基因工程化受体，其具有细胞外配体结合结构域，例如含有抗体或其片段的细胞外部分，所述细胞外配体结合结构域与一种或多种细胞内信号传导组分连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域和/或细胞内结构域。此类分子通常模拟或接近通过天然抗原受体发出的信号和/或通过这种受体与共刺激受体的组合发出的信号。
在一些实施方案中，CAR被构建具有对特定标记的特异性，例如在过继疗法所靶向的特定细胞类型中表达的标记，例如癌症标记和/或任何所述抗原。因此，CAR通常包括抗体的一个或多个抗原结合片段、结构域或部分，或一个或多个抗体可变结构域和/或抗体分子。在一些实施方案中，CAR包括抗体分子的一个或多个抗原结合部分，例如可变重链(VH)或其抗原结合部分，或源自可变重链(VH)的单链抗体片段(scFv)和单克隆抗体(mAb)的可变轻链(VL)。
在一些实施方案中，CAR含有抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性地识别在细胞表面上表达的抗原(如完整抗原)。
在一些实施方案中，抗原是或包括αvβ6整合素(avb6整合素)、B细胞成熟抗原(BCMA)、B7-H3、B7-H6、碳酸酐酶9(CA9，也称为CAIX或G250)、癌症-睾丸抗原、癌症/睾丸抗原1B(CTAG，也称为NY-ESO-1和LAGE-2)、癌胚抗原(CEA)、细胞周期蛋白、细胞周期蛋白A2、C-C基序趋化因子配体1(CCL-1)、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、硫酸软骨素蛋白聚糖4(CSPG4)、表皮生长因子蛋白(EGFR)、表皮生长因子受体III型突变体(EGFR vIII)、上皮糖蛋白2(EPG-2)、上皮糖蛋白40(EPG-40)、肝配蛋白B2、肝配蛋白受体A2(EPHa2)、雌激素受体、Fc受体样蛋白5(FCRL5；也称为Fc受体同源物5或FCRH5)、胎儿乙酰胆碱受体(胎儿AchR)、叶酸结合蛋白(FBP)、叶酸受体α、神经节苷脂GD2、O-乙酰化GD2(OGD2)、神经节苷脂GD3、糖蛋白100(gp100)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、G蛋白偶联受体5D(GPRC5D)、Her2/neu(受体酪氨酸激酶erb-B2)、Her3(erb-B3)、Her4(erb-B4)、erbB二聚体、人高分子量黑色素瘤相关抗原(HMW-MAA)、乙型肝炎表面抗原、人白细胞抗原A1(HLA-A1)、人白细胞抗原A2(HLA-A2)、IL-22受体α(IL-22Rα)、IL-13受体α2(IL-13Rα2)、激酶插入结构域受体(kdr)、κ轻链、L1细胞粘附分子(L1-CAM)、L1-CAM的CE7表位、含有富亮氨酸重复序列的蛋白8家族成员A(LRRC8A)、路易斯Y、黑色素瘤相关抗原(MAGE)-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、间皮素(MSLN)、c-Met、鼠类巨细胞病毒(CMV)、粘蛋白1(MUC1)、MUC16、自然杀伤细胞2族成员D(NKG2D)配体、黑色素A(MART-1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、癌胚胎抗原、黑色素瘤优先表达抗原(PRAME)、孕酮受体、前列腺特异性抗原、前列腺干细胞抗原(PSCA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、存活蛋白、滋养层糖蛋白(TPBG，也称为5T4)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、酪氨酸酶相关蛋白1(TRP1，也称为TYRP1或gp75)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP2，也称为多巴色素互变异构酶、多巴色素δ异构酶或DCT)、血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Wilms肿瘤1(WT-1)、病原体特异性或病原体表达抗原、或与通用标签相关的抗原、和/或生物素化分子、和/或由HIV、HCV、HBV或其他病原体表达的分子。在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记中的任何一种。在一些实施方案中，抗原是或包括CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。
在一些实施方案中，抗原是或包括病原体特异性抗原或病原体表达的抗原。在一些实施方案中，抗原是病毒抗原(如来自HIV、HCV、HBV等的病毒抗原)、细菌抗原和/或寄生虫抗原。
在一些实施方案中，CAR含有TCR样抗体，如抗体或抗原结合片段(例如scFv)，其特异性地识别作为MHC-肽复合物存在于细胞表面上的细胞内抗原(如肿瘤相关抗原)。在一些实施方案中，识别MHC-肽复合物的抗体或其抗原结合部分可以作为重组受体(如抗原受体)的一部分在细胞上表达。抗原受体包括功能性非TCR抗原受体，如嵌合抗原受体(CAR)。通常，含有针对肽-MHC复合物展现出TCR样特异性的抗体或抗原结合片段的CAR也可以称为TCR样CAR。
在一些实施方案中，CAR的细胞外部分(例如其抗体部分)进一步包括间隔子，例如抗原识别组分(例如scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区域。间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区或其变体或经修饰形式的至少一部分，例如铰链区(例如IgG4铰链区)、和/或CH1/CL和/或Fc区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG(如IgG4或IgG1)的。与不存在间隔子的情况相比，间隔子的长度可以提供在抗原结合后增加的细胞反应性。在一些例子中，间隔子的长度为或为约12个氨基酸或者长度不超过12个氨基酸。示例性间隔子包括具有至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸(并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数)的那些。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括单独的IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153或国际专利申请公开号WO2014/031687。
细胞外配体结合结构域(例如抗原识别结构域)通常与一个或多个细胞内信号传导组分连接，所述一个或多个细胞内信号传导组分例如为在CAR的情况下模拟通过抗原受体复合物(例如TCR复合物)进行激活和/或通过另一细胞表面受体传导信号的信号传导组分。在一些实施方案中，跨膜结构域连接细胞外配体结合结构域与细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR包括与细胞外结构域融合的跨膜结构域。在一个实施方案中，使用天然与受体(例如，CAR)中的一个结构域缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰跨膜结构域，以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。
在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然来源或源自合成来源。在来源是天然的情况下，结构域在一些方面源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下的那些(即，包含以下的至少一个或多个跨膜区)：T细胞受体的α、β或ζ链，CD28，CD3ε，CD45，CD4，CD5，CD8，CD9，CD16，CD22，CD33，CD37，CD64，CD80，CD86，CD134，CD137或CD154。在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。
在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头(如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体)，并且在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。
重组受体(例如CAR)通常包括至少一种或多种细胞内信号传导组分。在一些实施方案中，受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，抗原结合部分与一种或多种细胞信号传导模块连接。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)进一步包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，所述CAR或其他嵌合受体包括CD3-ζ(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。
在一些实施方案中，在连接CAR或其他嵌合受体后，所述受体的胞质结构域或细胞内信号传导结构域激活免疫细胞(例如工程化以表达所述CAR的T细胞)的正常效应子功能或应答中的至少一种。例如，在一些背景下，CAR诱导T细胞的功能，如细胞溶解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导结构域的截短部分代替完整的免疫刺激链，例如条件是所述截短部分转导效应子功能信号。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导结构域包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与此类受体并行起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。
在天然TCR的背景下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于产生次级或共刺激信号的组分也被包括在CAR中。在其他实施方案中，CAR不包括用于产生共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于产生次级或共刺激信号的组分。
T细胞激活在一些方面被描述为由至少如下两类胞质信号传导序列介导：通过TCR启动抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式起作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。
在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自以下项的那些：TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD8、CD22、CD79a、CD79b和CD66d。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。
在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40、CD27、DAP10和ICOS)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些方面，相同的CAR包括激活组分和共刺激组分二者。
在一些实施方案中，激活结构域包括在一个CAR中，而所述共刺激组分由识别另一种抗原的另一个CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括在同一细胞上表达的激活或刺激CAR和共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，CAR是刺激性或激活性CAR；在其他方面，其是共刺激性CAR。在一些实施方案中，细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别不同抗原的CAR，其中通过识别第一抗原的CAR递送的激活信号通过抑制性CAR与其配体的结合而被减少或抑制，例如，以减少脱靶效应。
在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号传导结构域与CD4+辅助T细胞的细胞内信号传导结构域相同。在一些实施方案中，CD8+细胞毒性T细胞的细胞内信号传导结构域与CD4+辅助T细胞的细胞内信号传导结构域不同。
在某些实施方案中，细胞内信号传导区域包含与CD3(例如，CD3-ζ)细胞内结构域连接的CD28跨膜和信号传导结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域包含与CD3ζ细胞内结构域连接的嵌合CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。
在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如，初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3-ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。
在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合后仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是在一些方面包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。
在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括细胞外配体结合部分(例如抗原结合部分，例如抗体或其片段)和细胞内结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域VH抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括将细胞外结构域与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。细胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，细胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文所述的任何间隔子)连接。在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域，如在跨膜结构域与细胞内信号传导结构域之间。在一些方面，T细胞共刺激分子是CD28或4-1BB。
在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，受体进一步包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。
在一些实施方案中，受体(例如CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域或其变体，例如人CD28的27个氨基酸的跨膜结构域(登录号：P10747.1)。在一些实施方案中，细胞内结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体，如其41个氨基酸的结构域，和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的这种结构域。在一些实施方案中，细胞内结构域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体，如人4-1BB的42个氨基酸的胞质结构域(登录号Q07011.1)。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域包含人CD3ζ刺激性信号传导结构域或其功能变体，例如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的同种型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些方面，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链。在其他实施方案中，间隔子是与CH2和/或CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是与CH2和CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是仅与CH3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。
例如，在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔子，例如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域，其是CD28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有CD28或其功能变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，CAR包括：细胞外配体结合部分，例如抗原结合部分，例如抗体或其片段，包括sdAb和scFv，其特异性结合抗原，例如本文所述的抗原；间隔子，例如任何含有Ig铰链的间隔子；跨膜结构域，其是CD28或其变体的一部分；细胞内信号传导结构域，其含有4-1BB或其功能变体的信号传导部分；以及CD3ζ信号传导结构域或其功能变体的信号传导部分。在一些实施方案中，此类CAR构建体进一步包括例如CAR下游的T2A核糖体跳跃元件和/或截短的EGFR(例如tEGFR)序列。
B.T细胞受体(TCR)
在一些实施方案中，重组蛋白是或包括重组T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，重组TCR对抗原具有特异性，所述抗原通常是存在于靶细胞上的抗原，例如肿瘤特异性抗原，在与自身免疫或炎性疾病相关的特定细胞类型上表达的抗原，或源自病毒病原体或细菌病原体的抗原。
在一些实施方案中，TCR是已经从天然存在的T细胞克隆的TCR。在一些实施方案中，从患者鉴定并分离针对靶抗原(例如，癌抗原)的高亲和力T细胞克隆。在一些实施方案中，已经在用人免疫系统基因(例如，人白细胞抗原系统或HLA)工程化的转基因小鼠中产生针对靶抗原的TCR克隆。参见例如肿瘤抗原(参见例如Parkhurst等人(2009)Clin CancerRes.15:169-180和Cohen等人(2005)J Immunol.175:5799-5808。在一些实施方案中，使用噬菌体展示来分离针对靶抗原的TCR(参见例如Varela-Rohena等人(2008)Nat Med.14:1390-1395和Li(2005)Nat Biotechnol.23:349-354。
在一些实施方案中，在获得T细胞克隆后，将TCRα和β链分离并克隆到基因表达载体中。在一些实施方案中，TCRα和β基因经由小核糖核酸病毒2A核糖体跳跃肽连接，使得两条链共表达。在一些实施方案中，编码TCR的核酸进一步包括标记以确认细胞经转导或工程化而表达受体。
IV.制品和试剂盒
本文提供了制品，所述制品包括含有细胞(如工程化细胞)的组合物，所述组合物容纳在一个或多个生物医学材料器皿中，例如以用于在小瓶中储存或包装。在一些实施方案中，细胞的组合物含有药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，细胞的组合物含有低温保护剂，如DMSO。制品可以包括标签，所述标签提供关于工程化细胞的信息和/或针对其使用或给予的说明书。制品可以包括在提供的生物医学材料器皿上或与其相关联的标签或包装插页。标签或包装插页可以提供细胞(如工程化细胞)和/或生物医学材料器皿的使用说明书。标签或包装插页可以指示将组合物用于治疗疾病或病症。
还提供了试剂盒，所述试剂盒含有用于与向受试者给予工程化细胞或细胞疗法的剂量(如工程化细胞、用于诊断患有疾病或病症的受试者的试剂、或一种或多种另外的药物组合物(包括含有用于治疗疾病或病症或用于与工程化细胞组合给予的另一种治疗剂的组合物)的一个或多个其他剂量)结合使用的制品和/或一种或多种另外的组分，以及任选的使用说明书(例如用于将工程化细胞组合物例如与过继细胞治疗方法结合给予至患有疾病或病症的受试者的说明书)和/或用于使用或操作提供的生物医学材料器皿的说明书。可以将所述一种或多种其他组分包装在容器(如所提供的其他生物医学材料器皿或另一个小瓶、注射器、瓶子、IV溶液袋等)中。它可以进一步包含其他材料，如其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针和/或注射器。
在一些实施方案中，制品和/或试剂盒包含用于向受试者给予细胞以治疗疾病或病症的说明书。在一些实施方案中，说明书规定给予用于细胞疗法的细胞的具体指导，例如，用于给予的剂量、时间安排、受试者的选择和/或鉴定以及用于给予的条件。在一些实施方案中，说明书可以作为伴随用于给予的组合物的标签或包装插页而包含在内。
在一些实施方案中，说明书规定了待给予的细胞的剂量。例如，在一些实施方案中，说明书中规定的剂量包括在约1x 106与3x 108个之间的总重组受体(例如，CAR)表达细胞，例如，在约1x 107至2x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、5x 107、1x 108或1.5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。
在一些实施方案中，制品包含表达重组受体的多个CD4+T细胞和/或表达重组受体的多个CD8+T细胞。在一些实施方案中，制品包含表达重组受体的多个CD4+T细胞，并且在同一器皿中进一步包含表达重组受体的多个CD8+T细胞。在一些实施方案中，低温保护剂与所述细胞一起被包括。在一些实施方案中，制品包含容纳在单独器皿中的表达重组受体的多个CD4+T细胞和表达重组受体的多个CD8+T细胞。
在一些实施方案中，容器(如生物医学材料器皿的小瓶)包含大于或大于约10x106个T细胞或表达重组受体的T细胞、大于或大于约15x 106个T细胞或表达重组受体的T细胞、大于或大于约25x 106个T细胞或表达重组受体的T细胞。在一些方面，小瓶包含在约1000万个细胞/mL与约7000万个细胞/mL之间、在约1000万个细胞/mL与约5000万个细胞/mL之间、在约1000万个细胞/mL与约2500万个细胞/mL之间、在约1000万个细胞/mL与约1500万个细胞/mL、1500万个细胞/mL与约7000万个细胞/mL、在约1500万个细胞/mL与约5000万个细胞/mL之间、在约1500万个细胞/mL与约2500万个细胞/mL之间、在约2500万个细胞/mL与约7000万个细胞/mL之间、在约2500万个细胞/mL与约5000万个细胞/mL之间、和在约5000万个细胞/mL与约7000万个细胞/mL之间。
在一些实施方案中，试剂盒包含多个生物医学材料器皿，每个生物医学材料器皿含有小瓶，所述小瓶含有多个细胞(例如工程化细胞)或规定用于给予的单位剂量的细胞。
在一些实施方案中，所述多个小瓶或者单位剂量的细胞或者制品或试剂盒中的细胞共同包含如下剂量的细胞，所述剂量含有在或在约1x 106与或与约2x 109个之间的总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，在或在约2.5x 107个此类细胞与或与约1.2x 109个之间的此类细胞、在或在约5.0x 107个此类细胞与或与约4.5x 108个之间的此类细胞、或在或在约1.5x 108个此类细胞与或与约3.0x 108个之间的此类细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述多个小瓶或单位剂量的细胞共同包含如下剂量的细胞，所述剂量含有为或为约2.5x 107、为或为约5.0x 107、为或为约1.5x 108、为或为约3.0x108、为或为约4.5x 108、为或为约8.0x 108、或为或为约1.2x 109个总重组受体表达细胞、总T细胞或总PBMC。在一些实施方案中，所述多个小瓶或单位剂量的细胞共同包含如下剂量的细胞，所述剂量含有从或从约1x 105至5x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、1x 105至5x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、从或从约5x 105至1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、或从或从约1x 106至1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞；或在每个范围内的总PBMC，每个都包含端值。
在一些方面，制品或试剂盒包含一个或多个单位剂量的CD4+和CD8+细胞或CD4+受体+细胞和CD8+受体+细胞，其中所述单位剂量包含在或在约1x107与或与约2x 108个之间的表达重组受体的T细胞、在或在约5x 107与或与约1.5x 108个之间的表达重组受体的T细胞、为或为约5x 107个表达重组受体的T细胞、为或为约1x 108个表达重组受体的T细胞、或为或为约1.5x 108个表达重组受体的T细胞，任选地其中所述制品或试剂盒中的信息或说明书规定给予一个或多个单位剂量和/或对应于此一个或多个单位剂量的体积。在一些情况下，制品或试剂盒包含一个或多个单位剂量的所述CD8+细胞，其中所述剂量包含在或在约5x106与或与约1x 108个之间的表达重组受体的CD8+T细胞，所述剂量包含在或在约1x 107与或与约0.75x 108个之间的表达重组受体的CD8+T细胞，所述剂量包含为或为约2.5x 107个表达重组受体的CD8+T细胞，或所述剂量包含为或为约5x 107个表达重组受体的CD8+T细胞，或所述剂量包含为或为约0.75x 108个表达重组受体的CD8+T细胞，任选地其中所述制品或试剂盒中的信息规定给予一个或多个单位剂量和/或对应于此一个或多个单位剂量的体积。
在一些实施方案中，所述多个小瓶或者单位剂量的细胞或者制品或试剂盒中的细胞共同包含如下剂量的细胞，所述剂量含有不多于或不多于约2.5x107、不多于或不多于约5.0x 107、不多于或不多于约1.5x 108、不多于或不多于约3.0x 108、不多于或不多于约4.5x 108、不多于或不多于约8.0x 108、或不多于或不多于约1.2x 109个总重组受体表达细胞、总T细胞或总PBMC。在一些实施方案中，制品或试剂盒中的细胞共同包含一定剂量的细胞，所述剂量包含不超过1x 108个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过1x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过0.5x 107个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过1x106个总重组受体表达T细胞或总T细胞、不超过0.5x106个总重组受体表达T细胞或总T细胞或每个数量的总PBMC。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，说明书可以规定给予的剂量方案和时间安排。例如，在一些实施方案中，说明书可以规定向所述受试者给予细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量。在一些实施方案中，说明书规定所述多个剂量的时间安排，例如，第二剂量是在第一剂量之后约4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21天时给予；和/或规定每个剂量中的剂量量。
在一些实施方案中，制品或试剂盒包含表达重组受体的多个CD4+T细胞；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述多个CD4+T细胞的全部或一部分以及进一步给予表达重组受体的CD8+T细胞的说明书。在一些实施方案中，说明书规定在给予CD8+细胞之前给予CD4+T细胞。在一些情况下，说明书规定在给予CD4+细胞之前给予CD8+T细胞。在一些实施方案中，制品或试剂盒包含表达重组受体的多个CD8+T细胞；和用于向患有疾病或病症的受试者给予所述多个CD8+T细胞的全部或一部分以及表达重组受体的CD4+T细胞的说明书。在一些实施方案中，说明书规定给予细胞的剂量方案和时间安排。
在一些方面，说明书规定相隔0至12小时、相隔0至6小时或相隔0至2小时给予CD4+T细胞的全部或一部分以及CD8+T细胞的全部或一部分。在一些情况下，说明书规定相隔不超过2小时、不超过1小时、不超过30分钟、不超过15分钟、不超过10分钟或不超过5分钟给予CD4+T细胞和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，说明书规定了细胞或一种或多种细胞类型的剂量或数量和/或细胞类型(例如，单独群体或亚型)的比率，如CD4+与CD8+的比率。在一些实施方案中，细胞的群体或亚型，如CD8+和CD4+T细胞。例如，在一些实施方案中，说明书规定，所述细胞是以多个细胞群体或亚型(如CD4+和CD8+细胞或亚型)的输出比率来给予，或在所述输出比率的容忍范围内给予，所述输出比率是在或在约5:1与或与约5:1之间(或大于约1:5且小于约5:1)，或在或在约1:3与或与约3:1之间(或大于约1:3且小于约3:1)，如在或在约2:1与或与约1:5之间(或大于约1:5且小于约2:1)，如为或为约5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9:1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5或1:5。在一些方面，容忍差异在所需比率的约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％(包括这些范围之间的任何值)内。
在某些实施方案中，说明书规定细胞或单独的细胞亚型群体以约100万至约1000亿个细胞和/或按每公斤体重所述细胞量的范围给予受试者，例如像100万至约500亿个细胞(例如，约500万个细胞、约2500万个细胞、约5亿个细胞、约10亿个细胞、约50亿个细胞、约200亿个细胞、约300亿个细胞、约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如约1000万至约1000亿个细胞(例如，约2000万个细胞、约3000万个细胞、约4000万个细胞、约6000万个细胞、约7000万个细胞、约8000万个细胞、约9000万个细胞、约100亿个细胞、约250亿个细胞、约500亿个细胞、约750亿个细胞、约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下约1亿个细胞至约500亿个细胞(例如，约1.2亿个细胞、约2.5亿个细胞、约3.5亿个细胞、约4.5亿个细胞、约6.5亿个细胞、约8亿个细胞、约9亿个细胞、约30亿个细胞、约300亿个细胞、约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。
在一些实施方案中，例如在受试者是人的情况下，剂量包括少于约2x109个总重组受体(例如，CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如在约1x 106至2x 109个此类细胞的范围内，如5x 106、1x 107、2.5x 107、5x 107、1x 108、1.5x 108、3x 108、4.5x 108、8x 108或1.2x 109个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。例如，在一些实施方案中，如果受试者是人，那么剂量包括少于约5x 108个总重组受体(例如CAR)表达细胞、T细胞或外周血单核细胞(PBMC)，例如，在约1x 106到5x 108个此类细胞的范围内，例如2x 106、5x106、1x 107、5x 107、1x 108或5x 108个或全部此类细胞，或任两个前述值之间的范围。
在一些实施方案中，说明书规定给予包含如下细胞数量的剂量：在或在约1x 106与或与约2x 109个之间的总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，在或在约2.5x 107个此类细胞与或与约1.2x 109个之间的此类细胞、在或在约5.0x 107个此类细胞与或与约4.5x 108个之间的此类细胞、或在或在约1.5x 108个此类细胞与或与约3.0x108个之间的此类细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，说明书规定给予如下剂量，所述剂量包含为或为约2.5x 107、为或为约5.0x 107、为或为约1.5x 108、为或为约3.0x108、为或为约4.5x 108、为或为约8.0x 108、或为或为约1.2x 109个总重组受体表达细胞、总T细胞或总PBMC。在一些实施方案中，说明书规定给予包含如下细胞数量的剂量：从或从约1x105至5x 108个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，从或从约5x 105至1x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，或者从或从约1x106至1x 107个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，每个都包含端值。
在一些实施方案中，细胞疗法包括给予一定剂量的细胞，所述剂量包含如下细胞数量：至少或约至少1x 105个总重组受体表达细胞、总T细胞或总外周血单核细胞(PBMC)，如至少或至少1x 106个、至少或约至少1x 107个、至少或约至少1x 108个此类细胞。在一些实施方案中，数量是关于CD3+或CD8+的总数，在一些情况下也是关于表达重组受体(例如CAR+)的细胞的总数。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予包含如下细胞数量的剂量：从或从约1x 105至5x 108个CD3+或CD8+总T细胞或者CD3+或CD8+重组受体表达细胞、从或从约5x 105至1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或者CD3+或CD8+重组受体表达细胞、或者从或从约1x106至1x 107个CD3+或CD8+总T细胞或者CD3+或CD8+重组受体表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括给予包含如下细胞数量的剂量：从或从约1x 105至5x 108个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、从或从约5x 105至1x 107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞、或从或从约1x 106至1x 107个总CD3+/CAR+或CD8+/CAR+细胞，每个都包含端值。
在一些实施方案中，所述剂量的T细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、或CD4+和CD8+T细胞。
在一些实施方案中，例如在受试者是人的情况下，说明书规定所述剂量的CD8+T细胞(包括在剂量中包括CD4+和CD8+T细胞)包括在约1x 106与5x 108个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD8+细胞，例如在约5x 106至1x 108个此类细胞的范围内，如1x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x108或5x 108个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，给予患者多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括给予从或从约1x 107至0.75x 108个总重组受体表达CD8+T细胞、1x107至2.5x 107个总重组受体表达CD8+T细胞、从或从约1x 107至0.75x 108个总重组受体表达CD8+T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞的剂量包括给予或给予约1x 107、2.5x 107、5x 107、7.5x 107、1x 108或5x 108个总重组受体表达CD8+T细胞。
在一些实施方案中，说明书规定细胞(例如，表达重组受体的T细胞)的剂量作为单剂量给予至受试者，或者在两周、一个月、三个月、六个月、1年或更长的时间段内仅给予一次。
在一些实施方案中，标签或包装插页可以提供用于如根据储存和提取本文提供的生物医学材料的任何方法使用或操作提供的生物医学材料器皿的说明书。在一些实施方案中，标签或包装插页可以提供例如用生物医学材料样品(如本文所述的任何细胞或细胞组合物)加载、插入或填充生物医学材料器皿中的小瓶的说明书。在一些实施方案中，标签或包装插页可以提供用于操纵、储存、冷冻和/或解冻生物医学材料器皿的说明书。在一些实施方案中，标签或包装插页可以提供用于从生物医学材料器皿提取或卸载生物医学材料样品(如本文所述的任何细胞或细胞组合物)的说明书。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语、符号和其他技术和科学术语或用辞旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不一定应当被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。
本文对“约”某个值或参数的提及包括(并且描述)针对所述值或参数本身的变化。例如，提及“约X”的描述包括“X”的描述。另外，对后面跟有值或参数串的短语“少于”、“大于”、“至多”、“至少”、“少于或等于”、“大于或等于”或其他类似的短语的提及意在将短语应用于所述值或参数串中的每个值或参数。例如，声明从小瓶移取后残留的样品体积可以少于约0.3mL、约0.25mL或约0.2mL，这意在指从小瓶移取后残留的样品体积可以少于约0.3mL、少于约0.25mL或少于约0.2mL。
如本文所用，单数形式“一种/一个”(“a”)、“一种/一个”(“an”)和“所述”(“the”)也旨在包括复数形式，除非上下文另有明确说明。还应理解，如本文所用的术语“和/或”是指并涵盖一个或多个相关联的所列项目的任何和所有可能的组合。将进一步理解，术语“包括(includes、including)”、“包含(comprises和/或comprising)”当在本文中使用时，指定所述特征、整数、步骤、操作、元件、组分和/或单元的存在，但不排除一个或多个其他特征、整数、步骤、操作、元件、组分、单元和/或其群组的存在或添加。
如本文所用，术语“载体”是指能够传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。所述载体包括病毒载体，如逆转录病毒(例如，γ逆转录病毒和慢病毒)载体。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，并且是指已引入外源核酸的细胞，包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化细胞”，其包括原代转化细胞和源自其的后代，不考虑传代次数。后代在核酸含量上可能与亲代细胞不完全相同，但可能含有突变。本文包括如在初始转化细胞中所筛选或选择的具有相同功能或生物学活性的突变型后代。
如本文所用，细胞或细胞群针对特定标记呈“阳性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中的可检测存在。当提及表面标记时，所述术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的存在，例如通过用与所述标记特异性地结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平是可检测的，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平与已知对所述标记呈阳性的细胞的水平基本上相似，和/或所述水平基本上高于已知对所述标记呈阴性的细胞的水平。
如本文所用，细胞或细胞群对特定标记呈“阴性”的陈述是指，特定标记(通常是表面标记)在细胞上或细胞中不存在基本上可检测的存在。当提及表面标记时，术语是指如通过流式细胞术检测到的，表面表达的不存在，例如通过用与所述标记特异性地结合的抗体进行染色并检测所述抗体，其中所述染色通过流式细胞术以如下水平没有检测到，所述水平基本上高于在其他方面相同的条件下用同种型匹配对照进行相同程序检测到的染色，和/或所述水平基本上低于已知对所述标记呈阳性的细胞的水平，和/或所述水平与已知对所述标记呈阴性的细胞的水平相比是基本上相似的。
如本文所用的，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。它可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性的、非水性的或其任何组合。
如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。
本申请在文本和附图中公开了若干个数值范围。即使在说明书中没有逐字陈述精确的范围限制，但公开的数值范围固有地支持公开的数值范围内的任何范围或值(包括端点)，因为可以在整个公开的数值范围内实践本公开文本。
给出以上描述以使本领域技术人员能够制造和使用本公开文本，并且在特定应用及其要求的背景下提供了以上描述。本领域技术人员将容易明白对优选实施方案的各种修改，并且在不脱离本公开文本的精神和范围的情况下，本文中定义的一般原理可以应用于其他实施方案和应用。因此，本公开文本不旨在限于所示的实施方案，而是被赋予符合本文公开的原理和特征的最宽范围。

Claims (34)

1.一种生物医学材料器皿，其包括：
包含顶部和开放底部的小瓶；
由所述小瓶的顶部支持的入口管，其中所述入口管与所述小瓶的内部流体地连接并且包括加载端口；和
与所述小瓶的开放底部流体地连接的无针提取端口，其中所述无针提取端口提供直接接近所述小瓶中的生物医学材料的途径。
2.根据权利要求1所述的生物医学材料器皿，其中所述加载端口是无针加载端口。
3.根据权利要求2所述的生物医学材料器皿，其中所述无针加载端口包括鲁尔锁连接配件。
4.根据权利要求3所述的生物医学材料器皿，其进一步包括配置成与所述无针加载端口的鲁尔锁连接配件接合的第一帽。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的生物医学材料器皿，其中所述无针提取端口包括鲁尔锁连接配件。
6.根据权利要求5所述的生物医学材料器皿，其进一步包括配置成与所述无针提取端口的鲁尔锁连接配件接合的第二帽。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的生物医学材料器皿，其进一步包括由所述小瓶的顶部支持并且与所述小瓶的内部流体地连接的通气管。
8.根据权利要求7所述的生物医学材料器皿，其中所述通气管包括过滤器。
9.根据权利要求8所述的生物医学材料器皿，其中所述过滤器是微生物屏障过滤器。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的生物医学材料器皿，其中所述小瓶的顶部包括在所述入口管与所述小瓶的内部之间流体地连接的第一管适配器。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的生物医学材料器皿，其中所述小瓶的顶部包括在所述通气管与所述小瓶的内部之间流体地连接的第二管适配器。
12.根据权利要求11所述的生物医学材料器皿，其中所述第一管适配器和所述第二管适配器进入所述小瓶的内部的开口通过壁隔开。
13.根据权利要求1-12所述的生物医学器皿，其中所述提取端口是自封闭的无针提取端口。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的生物医学材料器皿，其中所述生物医学材料器皿由符合USP VI级的材料制成。
15.一种储存和提取生物医学材料的方法，所述方法包括：
经由入口管的加载端口将生物医学材料注入小瓶中，其中所述入口管由所述小瓶的顶部支持；以及
经由与所述小瓶的开放底部流体地连接的无针提取端口从所述小瓶提取所述生物医学材料，其中所述无针提取端口提供直接接近所述小瓶中的生物医学材料的途径。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括将所述小瓶中的生物医学材料低温冷冻和将所述小瓶中的低温冷冻的生物医学材料解冻。
17.根据权利要求15或权利要求16所述的方法，其进一步包括密封所述入口管。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的方法，其进一步包括密封由所述小瓶的顶部支持并且与所述小瓶的内部流体地连接的通气管。
19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括切开所述通气管，使得可以从所述小瓶排出空气。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其中所述加载端口是无针加载端口。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述无针加载端口包括鲁尔锁连接配件。
22.根据权利要求15-21中任一项所述的方法，其中所述无针提取端口包括鲁尔锁连接配件。
23.根据权利要求18-22中任一项所述的方法，其中所述通气管包括过滤器，并且所述通气管在所述通气管中过滤器的位置上方被密封。
24.根据权利要求15-23所述的方法，其中所述提取端口是自封闭的无针提取端口。
25.一种制品，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的生物医学材料器皿和含有细胞疗法的组合物。
26.根据权利要求25所述的制品，其中所述细胞疗法包括表达重组受体的基因工程化细胞。
27.根据权利要求26所述的制品，其中所述重组抗原受体是T细胞受体(TCR)或嵌合抗原受体(CAR)。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的制品，其中所述基因工程化细胞包括T细胞。
29.根据权利要求28所述的制品，其中所述T细胞是CD4+和/或CD8+。
30.根据权利要求26-29中任一项所述的制品，其中所述基因工程化细胞包括从受试者、任选人受试者分离的细胞。
31.根据权利要求30所述的制品，其中所述基因工程化细胞包括对所述受试者而言自体的细胞。
32.根据权利要求30所述的制品，其中所述基因工程化细胞包括对所述受试者而言同种异体的细胞。
33.根据权利要求25-32中任一项所述的制品，其中所述组合物进一步包含低温保护剂。
34.根据权利要求25-32中任一项所述的制品，其进一步包含标签，所述标签含有关于所述细胞疗法的信息或用于给予所述细胞疗法的说明书。
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