CN117069845A - 一种靶向cd22的嵌合抗原受体及在相关疾病治疗中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种靶向CD22的嵌合抗原受体及在相关疾病治疗中的应用。目前,成人B‑ALL的标准治疗手段具有较为明显的药物毒副作用,并且预后情况不佳。为了改善该现状,本发明以CD22蛋白为靶点,制备靶向CD22的纳米抗体,并将其人源化之后的抗体作为嵌合抗原受体中的抗原结合域,提供了一种靶向CD22的嵌合抗原受体T细胞免疫治疗方式。根据体外和体内实验结果,该靶向CD22的CAR‑T细胞具有良好的淋巴瘤细胞抑制活性,有望应用于B细胞恶性肿瘤或自身免疫疾病的临床治疗及药物开发。
Description
技术领域
本发明属于嵌合抗原受体技术领域,具体涉及一种靶向CD22的嵌合抗原受体、所述嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在治疗B细胞恶性肿瘤、自身免疫疾病领域的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解,而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
B细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)患儿的治愈率接近90%,成人B-ALL患者在接受多药联合方案治疗后存活率低于50%。尽管儿童和成人ALL治疗方面取得了很大进展,但仍有相当数量的患者治疗效果不佳,并且目前的标准治疗存在相当程度的短期和长期毒性。淋巴瘤是称为淋巴细胞的一类白细胞发生的恶性肿瘤。非霍奇金淋巴瘤较霍奇金淋巴瘤多见。在白血病中,大多数癌性白细胞位于血流和骨髓中。而在淋巴瘤中,大部分的恶性白细胞在淋巴结以及脾脏、肝脏等器官内。然而,白血病和非霍奇金淋巴瘤有时是重叠的,因为淋巴瘤患者可能会在血流中有癌性白细胞,而白血病患者的淋巴结和器官内也会出现癌细胞。基于单克隆抗体的治疗有望克服化疗耐药和治疗相关的潜在毒性,其中最有前景的是嵌合抗原受体修饰的T(CAR-T)细胞,它可以突破MHC限制性直接识别肿瘤抗原。
在不同诊疗中心,不同国家,使用不同结构CAR-T、淋巴细胞清除方案、自体或异体T细胞以及不同的CD19 CAR-T回输数量治疗难治复发的B-ALL患者,有50%~90%的患者可达到完全缓解。尽管如此,30-60%的患者治疗后复发。ALL有两种CAR治疗后复发模式,包括CD19阳性复发和CD19阴性复发。对于CD19阳性复发,其关键机制在于CAR-T细胞的持久性较差,CD19仍存在于B-ALL细胞表面,并可通过流式细胞术检测。对于CD19阴性复发,CD19的选择性剪接,移码突变和错义突变,导致肿瘤逃避CAR-T细胞介导的识别和清除,尽管CAR-T细胞持续存在。在CD19 CAR-T细胞治疗引起CD19抗原丢失后,CD22仍然保留。因此,可以通过选择新的靶点,进一步增强CAR-T细胞的抗肿瘤靶向潜力,提高治疗效果。
CD22与CD19一样是B系分化抗原,表达于B细胞发育的各个阶段,B细胞分化为浆细胞后不再表达CD22。60%~80%的B细胞恶性肿瘤表达CD22,几乎所有的前体B-ALL表达CD22;90%以上的弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCLs)和滤泡淋巴瘤(FLs)为CD22阳性;慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)、毛细胞白血病(HCL)也具有高水平的CD22表达。已有许多临床试验研究了靶向CD22的药物的有效性。例如,依他珠单抗(Epratuzumab)是一种CD22单克隆抗体,在成人和儿童B-ALL中均具有一定的效果。更重要的是,与CD19抗原相似,CD22同样是B细胞限制性表达,不表达于其他实质细胞,亦不表达于造血干细胞,因此作为B细胞肿瘤抗原的特异性高,已经成为B细胞恶性肿瘤中的理想治疗靶点。
自身免疫病是由自身免疫失调所致,B细胞异常激活以及致病性自身抗体的生成是自身免疫病的重要特征之一。CD22是特异性表达于B淋巴细胞上的I型跨膜糖蛋白,为免疫蛋白超家族中唾液酸黏附素家族成员。目前靶向CD22的抗体药的临床适应症以自身免疫病为主,其作用机制是通过免疫调节抑制或清除异常B细胞,减少产生自身抗体,组织或缓解自身免疫病的发展。但抗体药对B细胞的清除能力有限且作用时间短,不像CAR-T细胞可以长期在体内生存。另外已有报道,CD19 CAR-T细胞用于治疗系统性红斑狼疮、重症肌无力等自身免疫病,完全缓解,未复发。与CD19抗原相似,CD22同样是B细胞限制性表达。因此,CD22 CAR-T对治疗自身免疫病具备一定的潜力。
发明内容
为了改善成人B-ALL、B-NHL等B细胞恶性肿瘤患者存活率低、多药联合治疗效果不佳的现状。本发明考虑从CD22在B细胞恶性肿瘤疾病中特异性高表达的特性入手,以CD22蛋白为靶点,提供一种嵌合抗原受体T细胞免疫治疗药物。
为了实现上述技术目的,本发明首先针对CD22中活性抗原区域进行筛选,制备CD22重组蛋白免疫羊驼,得到一种靶向CD22的纳米抗体,并进一步获得人源化纳米抗体。构建二代CAR质粒载体,通过分离T细胞,用编码CAR的慢病毒载体进行编程,从而获得一种表达靶向CD22的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。经验证,本发明提供的靶向CD22 CAR-T细胞能够有效刺激淋巴瘤细胞释放抗肿瘤免疫相关的关键细胞因子IFN-γ及IL-2,促进癌细胞凋亡,激发免疫系统实现机体保护作用。并且在体内实验中,该靶向CD22 CAR-T细胞能够有效抑制小鼠体内移植瘤的生长,具有理想的特异性识别和清除CD22阳性肿瘤细胞的效果。
基于所取得的上述技术效果,本发明具体提供如下的技术方案:
本发明第一方面,提供一种靶向CD22的纳米抗体,所述纳米抗体的互补决定区序列如下:如SEQ ID NO:5所示的CDR1序列、SEQ ID NO:6所示的CDR2序列及SEQ ID NO:7所示的CDR3序列。
上述纳米抗体与人CD22的胞外段Asp20-Arg687(SEQ ID NO:1)具有良好的亲和性,能够发挥CD22靶向活性。
本发明的一种实施方式中,上述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,由SEQ ID NO:1所示的抗原序列与IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330结合免疫羊驼后分离得到,命名为B9-VHH。
实际生产过程中,为了获得更好的成药性,上述纳米抗体通常还需要进行优化,优化方式如人源化、二聚/多聚化或偶联其他功能基团,因此,在本发明的另外一些实施方式中,所述纳米抗体序列与SEQ ID NO:3所示的序列具有80%及以上的相似度,进一步,所述相似度为85%,90%,91%,94%或98%及以上,并且能够具有与B9-VHH基本一致的生理活性,所述相似度可通过Blast工具实现。
上述靶向CD22的纳米抗体,其可行的应用领域如作为一种靶向功能基团用于药物制剂、指示剂等产品的开发,本发明提供的一种实施方式中,上述靶向CD22的纳米抗体应用于制备嵌合抗原受体。
本发明第二方面,提供一种嵌合抗原受体,至少包含抗原结合域、跨膜结构域和胞内结构域,其中,所述抗原结合域为权利要求1中的靶向CD22的纳米抗体。
所述跨膜结构域可以是来源于CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的任意一种,本发明验证的实例中,采用述CD8跨膜结构域,其核苷酸序列如SEQ ID NO:16所示。
所述胞内结构域可以来源于CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD38、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、4-1BB或CD66b的细胞内结构域中的一种或几种;本发明验证的实例中,采用胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ ID NO:17)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:18)组成。
一种实施方式中,上述嵌合抗原受体中还包括铰链区,用于连接抗原结合抗原结合域及跨膜结构域,可行的铰链区如IgG1铰链区、CD8铰链区;本发明验证的实例中,为CD8铰链区,序列如SEQ ID NO:15所示。
又一种实施方式中,该嵌合抗原受体中还具有信号肽,所述信号肽的实例如CD8α,其序列如SEQ ID NO:14所示。
在嵌合抗原受体中,该抗原结合域优选采用人源化之后的纳米抗体,具体的实例中,上述B9-VHH的人源化抗体序列如SEQ ID NO:8(命名为B9-HM1)、SEQ ID NO:10(命名为B9-HM2)或SEQ ID NO:11(命名为B9-HM3)所示;因此,一个实例中,所述嵌合抗原受体命名为CAR02,由CD8α信号肽、B9-HM1、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1BB以及CD3的胞内段CD3ξ组成。
又一个实例中,所述嵌合抗原受体命名为CAR03,由CD8α信号肽、B9-HM2、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1BB以及CD3的胞内段CD3ξ组成。
又一个实例中,所述嵌合抗原受体命名为CAR04,由CD8α信号肽、B9-HM3、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1BB以及CD3的胞内段CD3ξ组成。
第三方面,提供编码上述嵌合抗原受体的核苷酸。
上述核苷酸应当适用于转导或转化细胞,优选的方案中,上述核苷酸应用能够与模块化组件连接并能够在宿主细胞中进行表达,所述宿主细胞的实例如T细胞,可行的表达方式如通过重组载体转染T细胞进行表达。
因此,本发明第四方面,提供一种重组载体,所述重组载体具有在T细胞中表达上述嵌合抗原受体的能力或包含第三方面所述的核苷酸。
所述重组载体优选为病毒载体,如通过γ-逆转录病毒或慢病毒方面转染T细胞,第三方面所示的核苷酸可能通过DNA转座子、RNA转染或基因组编辑技术(如TALEN、ZFN和CRISPR/Cas9)插入T细胞中。本发明验证的实施方式中,所述重组载体为慢病毒载体。
第五方面,提供一种T细胞,包含第二方面所述的嵌合抗原受体。
该方面所述的T细胞,本申请文件中也称CAR-T,该T细胞的类型可以为幼稚T细胞(T Cells)、活化T细胞(Activated T Cells)、中央记忆T细胞(Central Memory TCells)或效应记忆T细胞(Effector Memory T Cells)。由于上述T细胞应当是受试者自体来源的T细胞,优选从外周血、含有T细胞的细胞群中进行上述T细胞的分离。
第六方面,提供一种药物组合物,所述药物组合物中包括第五方面所述T细胞。
上述药物组合物中,所述T细胞应当是活性剂量,该活性剂量可依据T细胞的添加目的、T细胞类型、药物施用方式等进行常规调整,可行的药物施用方式如静脉注射、腹腔注射或定向注射至骨髓或淋巴结中。
除上述T细胞外,该药物组合物中还包括药学上可接受的载体或稀释剂,所述载体如冷冻保护剂(如蔗糖、葡萄糖、海藻糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、甘氨酸、精氨酸、亮氨酸或丝氨酸等)、表面活性剂(如聚山梨醇酯PS-20或PS-80)、抗氧化剂或稳定剂。
所示稀释剂可以为注射介质或等渗介质,如生理盐水、糖溶液、乳酸林格氏液或注射用脂肪乳。
第七方面,提供第一方面所述靶向CD22的纳米抗体、第二方面所述嵌合抗原受体、第五方面所述T细胞或第六方面所述药物组合物在制备CD22相关疾病治疗药物中的应用。
CD22限制性地表达于成熟B细胞和大多数恶性B淋巴瘤细胞表面,使其成为了自身免疫疾病和B细胞恶性肿瘤治疗的热门靶点之一;上述CD22相关疾病进一步为自身免疫性疾病或B细胞恶性肿瘤。CD22在大多数B细胞恶性肿瘤细胞表面都有高表达,具体实例如急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病。
同样的,作为B细胞限制性抗原,上述纳米抗体及嵌合抗原受体还可应用于自身免疫疾病,实例如系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、原发性干燥综合征或系统性血管炎。
第八方面,提供一种肿瘤治疗方法,包括:获取患者的T细胞,对所述T细胞进行修饰,使其包含第二方面所述的嵌合抗原受体,并将修饰后的T细胞进行回输。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解,本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明,并不构成对本发明的不当限定。
图1为实施例1中所述CD22重组蛋白的SDS-PAGE结果;
图2为实施例1中所述CD22特异的VHH抗体筛选结果;
其中,图2A为阴性对照组CHO-K1细胞株与CD22抗体结合情况;
图2B为CHO-K1-CD22与CD22抗体结合情况;
图3为实施例2中所述靶向CD22 CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性结果;
图4为实施例2中所述靶向CD22 CAR-T细胞对NALM-6的抗肿瘤活性结果;
图5为实施例2中所述靶向CD22 CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性。
具体实施方式
应该指出,以下详细说明都是示例性的,旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明,本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是,这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式,而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的,除非上下文另外明确指出,否则单数形式也意图包括复数形式,此外,还应当理解的是,当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时,其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案,以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
1、CD22重组蛋白的制备
(1)CD22_huFc表达质粒的构建体外合成人CD22的胞外段Asp20-Arg687,该多肽的氨基酸序列如部分SEQ ID NO:1所示,其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。将该基因插入表达人IgG1重链恒定区的Fc段Asp104-Lys330基因的真核表达质粒,中间以“6*His-enterokinase site(ek)”相连接,形成融合表达蛋白载体Lenti-CMV-CD22-huFc-puro。
(2)CD22_huFc病毒包装
a.转染前一天,接种3×105/mL HEK293T细胞于10cm培养皿。
b.转染当天,HEK293T细胞汇合度达到70%左右,吸弃原有培养基,用PBS洗一遍,加入9mLDMEM不完全培养,置于37℃、5% CO2培养箱,待用。
c.准备PEI-DNA复合物:取1mL DMEM至一个1.5mL无菌离心管中,分别加入7.5μgLenti-CMV-CD22-huFc-puro质粒、5.7μg pGP、3.75μg pVSVG,移液枪上下吹打充分混匀后,加入50.75μL 1μg/μL PEI,立即用移液器上下吹打混匀,室温下静置10-15min。
d.转染:将上述DNA-PEI复合物逐滴加入到一个10cm培养皿中,“米”字型轻轻晃动培养皿,充分混匀。将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱,培养6~8h后,将含有转染试剂的培养基去掉,更换为新鲜的完全培养基(DMEM+10%FBS)。将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱,培养48h。
e.首次收毒:收集培养皿中的培养液至50mL无菌离心管中,置于4℃待用。沿培养皿边缘小心的加入10mL新鲜的完全培养基[DMEM+10% FBS],将培养皿置于37℃、5% CO2培养箱,继续培养24h。将收集的病毒液。
d.二次收毒:收集培养皿中的培养液至首次收毒的50mL无菌离心管中,于4℃,6000x g过夜离心16h。
f.吸弃离心后上清,加入300ul PBS重悬,形成CD22_huFc病毒液。
(3)病毒感染表达CD22_huFc
a.用CHO GROW CD1将CHO-S细胞密度调整为1×106/mL,接种于6孔板。
b.将CD22_huFc病毒液逐滴滴加到6孔板内,混匀,置于37℃、5% CO2、130rpm震荡培养箱中培养。
c.24h后,收集六孔板内细胞培养液,200xg、25℃离心5min。
d.离心结束后,吸弃上清,加入2mL含有puromycine的CHO GROW CD1,重悬后转移至6孔板,置于37℃、5% CO2、130rpm摇床上培养箱中培养进行筛选(注意设置一个空白CHO-S细胞对照组)。筛选期间维持细胞密度1×106/mL。
f.对照孔内的细胞基本死亡,筛选结束。将CHO-S-CD22-huFc-Puro细胞株扩大培养,期间加入H410KJ CellTurbo feed1增强蛋白表达。连续培养表达4天,收集培养表达上清,用0.45μm针孔滤器过滤,形成过滤样品。
(4)采用protein A填料预装柱进行亲和纯化
a.平衡:PBS冲洗预装柱至UV曲线平衡;
b.上样:将进样管放入过滤样品内进行上样;
c.洗杂:上样结束后用PBS冲洗至曲线平衡;
d.洗脱:用甘氨酸缓冲液(pH3.0)进行洗脱,出峰收集蛋白液,立即用适量Tris-HCl(pH 9.0)溶液中和;
e.使用截流量为10KD的millipore超滤管进行蛋白洗脱液浓缩,使用超微量核酸蛋白检测仪OD280模块检测蛋白浓度;
f.取2ug跑SDS-PAGE,结果如图1所示。
2.使用噬菌体展示文库筛选针对CD22特异的VHH抗体
(1)使用CD22蛋白(切去huFc tag)免疫羊驼,皮下多点免疫,取外周血测定抗体效价,免疫血清与CD22重组蛋白可以结合,且随着免疫血清的梯度稀释,OD值成梯度变化,符合建库要求,安排构建噬菌体展示库。
(2)采集免疫羊驼的外周血,提取RNA,制备cDNA样品后,PCR克隆VHH抗体编码基因,构建噬菌体展示库,随机挑取十个以上单克隆进行测序,使用Vector NTI进行序列分析,结果显示各单克隆序列差异大,库多样性较好。
(3)使用CD22重组蛋白抗原进行固相淘选,进行2-4轮的噬菌体淘选实验,每轮结束后计算input和output值,在第2轮开始对获取的单克隆噬菌体进行Phage ELISA。
a.用CBS按1μg/mL浓度包被CD22重组蛋白抗原,4℃过夜;
b.弃去抗原,用3% MPBS室温封闭2h,此为Sample板;同时用MPBS封闭一块空白ELISA板,此为Negative control板;
c.弃去MPBS,用0.05% PBST洗涤4次;用0.01% PBST 1:1稀释单克隆噬菌体上清,每孔100μL,4℃孵育1h;
d.弃去一抗,用0.05%PBST洗涤5次;用0.05%的PBST按1:3000稀释anti-M13antibody-HRP,每孔100μL,4℃孵育1h;
f.弃去二抗,PBST洗涤5次;TMB 37℃显色15min,硫酸酸终止反应,读取OD450。g.计算S/N值,挑选比值较大的样品进行Sanger测序;
h.获取候选单域抗体的核酸及氨基酸序列信息,进行序列比对,挑选CDR区域氨基酸序列不同的候选抗体。在候选抗体序列的N端和C端分别通过Overlap PCR引入CMV启动子、信号肽及hu IgG1 Fc标签,将纯化PCR产物瞬时转染293F细胞,收集培养基上清;
i.复苏1×106个处于对数生长期的CHO-K1-CD22重组细胞株,400xg,4℃离心5min。CHO-K1细胞株作为阴性对照组。弃上清后加入上述100uL培养基上清,4℃孵育30min后,加入1mL PBS洗涤细胞3次,然后用100uL PBS重悬细胞,加入5uL PE标记的Anti humanIgG抗体,室温避光孵育30分钟后,加入1mL PBS洗涤三次,最后用500uL PBS重悬细胞。通过流式细胞仪初步确定候选抗体与目的蛋白的结合情况。结果显示培养液CHO-K1与CD22抗体不结合,而与CHO-K1-CD22特异性结合,是CD22的特异性抗体,克隆号为B9(图2)。B9的VHH氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示,基因序列如SEQ ID NO:4。
3.单域抗体人源化设计
根据单域抗体鉴定结果,对B9-VHH序列进行人源化。抗体B9-VHH的CDR1氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示;CDR2氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示;CDR3氨基酸序列如SEQ IDNO:7所示。采用CDR&SDR Grafting及Back mutation对B9-VHH序列进行人源化得到B9-HM1、B9-HM2及B9-HM3。B9-HM1的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示,B9-HM1的核酸序列如SEQ IDNO:9所示;B9-HM2的氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示,B9-HM2的核酸序列如SEQ ID NO:11所示;B9-HM3的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示,B9-HM3的核酸序列如SEQ ID NO:13所示。
4.CAR-T细胞的制备
选择B9及其人源化序列B9-HM1/B9-HM2/B9-HM3进行CAR-T细胞制备和抗肿瘤活性研究。
(1)靶向CD22的嵌合抗原受体慢病毒表达载体构建
以pCDH-EF1a质粒为载体,构建表达CD22抗体的二代嵌合抗原受体的慢病毒质粒。包括pCDH-EF1a-B9-BBZ、pCDH-EF1a-B9-HM1-BBZ、pCDH-EF1a-B9-HM2-BBZ、pCDH-EF1a-B9-HM3-BBZ,上述质粒中目的核酸序列如下:
a.B9-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:14)、B9-VHH(SEQ ID NO:4)、CD8铰链区(SEQ ID NO:15)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:16)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQ IDNO:17)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:18)组成。
b.B9-HM1-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:14)、B9-HM1(SEQ ID NO:9)、CD8铰链区(SEQ ID NO:15)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:16)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQID NO:17)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:18)组成。
c.B9-HM2-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:14)、B9-HM2(SEQ ID NO:11)、CD8铰链区(SEQ ID NO:15)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:16)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQID NO:17)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:18)组成。
d.B9-HM3-BBZ核酸序列由CD8α信号肽(SEQ ID NO:14)、B9-HM3(SEQ ID NO:13)、CD8铰链区(SEQ ID NO:15)、CD8跨膜区(SEQ ID NO:16)和胞内信号传导结构域4-1BB(SEQID NO:17)以及CD3的胞内段CD3ξ(SEQ ID NO:18)组成。
上述所有质粒经测序正确后,使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒,得到转染级别质粒,用于HEK293F悬浮细胞慢病毒包装实验。
(2)靶向CD22的嵌合抗原受体慢病毒制备
重组表达载体包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒或质粒等,本实施例所使用的原始重组表达载体为慢病毒载体。
a.用FreeStyle 293培养基将HEK293F细胞密度调整为4.5×106cells/mL,体积为包装体积的90%。暂置37.0℃大容量50振幅CO2叠加式恒温振荡器培养备用。b.配制质粒/PEI复合物:准备2个无菌离心管,分别加入5%包装体积的FreeStyle293培养基。向第一支离心管中依次加入一定比例的pLP1、pLP2、pLP/VSVG和pCDH-EF1a-CAR质粒,质粒总量180μg/100mL包装体积,轻轻混匀,室温孵育5min。向另一支离心管中加入PEI溶液,PEI用量(μg)=质粒总量(μg)*3,轻轻混匀,室温孵育5min。
c.将上述孵育后的PEI稀释液加入到质粒稀释液中,并迅速充分混匀,垂直层流洁净工作台内室温孵育约12min。
d.转染:取出上述准备好的HEK293F细胞,边轻摇边加入制备好的质粒/PEI复合物,混匀,37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0% CO2培养过夜。
e.转染后约16-18h。加入OPM-CHO PFF06,体积为转染体系的10%,混匀,37.0℃、130rpm、振幅50.0mm、5.0%CO2培养过夜。
f.转染后约48h。3000×g、22.0℃离心15min,收集上清液病毒,用0.65μm针头滤器过滤。
g.核酸酶消化。按100U/mL向上述病毒液添加Super Nuclease溶液,上下颠倒5~8次混匀,4℃过夜处理约16h。
h.6000×g、4℃过夜离心约16h,弃上清。用1%包装体积DPBS(含10%人血白蛋白)重悬。取50ul病毒液检测感染滴度,剩余全部分装后置于-80℃储存。i.将不同稀释梯度的病毒液感染293T细胞,48h后,用流式细胞术检测被感染的阳性细胞率,并换算为病毒液的感染滴度,以便后续转导T细胞。
(3)CAR-T细胞的制备
一种含有上述重组表达载体的宿主细胞,本实施例用到的宿主细胞为人外周血T细胞或含有T细胞的细胞群。
a.外周血T细胞分离
将5mL抗凝血样品转移至一个15mL无菌离心管,离心力800×g、离心降速设为最低,将血样室温离心20min。吸弃血清层,向下层的红色外周血细胞层加入等体积的生理盐水,混匀。
向一个新的15mL离心管中加入5mL淋巴细胞分离液,然后将生理盐水稀释后的血样沿管壁缓慢添加至淋巴细胞分离试剂的上层,离心力800×g,转速下降速度设为最低,室温离心30min。吸取白色单核细胞层吸至一个新的15mL无菌离心管中,加入等体积的生理盐水,混匀。离心力800×g,离心5min。吸弃上清,加入5mL生理盐水,混匀,取部分细胞悬液进行计数,流式细胞检测CD3+T细胞比例。
根据Dynabeads与CD3+T细胞数目比例为1:1,分离T细胞,取部分细胞悬液计数。
b.T细胞激活
加入T细胞生长培养基(含X-Vivo 15培养基、300IU/mL白介素2、10ng/mL白介素7、5ng/mL白介素15、5ng/mL白介素21),调整T细胞密度1E6/mL。将细胞置于37℃、5% CO2培养箱中培养40h。
c.T细胞培转导
从-80℃冰箱中,取出慢病毒,冰上解冻。从培养箱中取出激活的T细胞,向培养器皿中加入polybrene至终浓度为6μg/mL,加入病毒液(MOI约50),充分混匀,使用封口膜将培养器皿密封,800×g室温离心1h。
离心后,将培养器皿于37℃、5% CO2的培养箱中,继续培养24h。400×g离心10min,弃掉含有病毒的培养基上清,用新鲜T细胞生长培养基重悬细胞沉淀,将细胞转移至新的培养器皿中,继续培养。维持细胞密度在1-2x106/mL。
培养4天后,取部分细胞用流式细胞仪检测T细胞表面CAR分子的表达。离心收集制备的CAR-T细胞和NC-T细胞(对照组),PBS洗涤一次后弃上清,加入CD22-huFc蛋白孵育30min;用PBS洗涤两次后弃上清,加入PE anti-human IgGFc抗体避光孵育30min;用PBS洗涤两次后弃上清,重悬,最后流式细胞仪检测流式细胞仪检测CAR阳性的T细胞比例。
实施例2靶向CD22 CAR-T细胞的体外抗肿瘤活性
通过细胞毒实验判断CD22 CAR-T细胞的抗肿瘤活性。比较UTD、CD22CAR01(转染质粒为上述pCDH-EF1a-B9-BBZ)、CD22 CAR02(转染质粒为上述pCDH-EF1a-B9-HM1-BBZ)、CD22CAR03(转染质粒为上述pCDH-EF1a-B9-HM2-BBZ)、CD22 CAR04(转染质粒为上述
pCDH-EF1a-B9-HM3-BBZ)细胞的体外杀伤活性,四种CAR-T细胞中嵌合抗原受体的感染阳性率分别为27.446%、48.920%、50.218%、28.377%。
a.内源性表达CD22的Raji-Luc细胞作为靶细胞,用RPMI1640完全培养基调整密度为5*105个/mL,然后100μL/孔,96孔板,即5*104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD为效应细胞,同时用RPMI1640完全培养基分别调整至合适密度,实验组按照效应细胞:靶细胞=2.5:1,5:1的比例分别加入靶细胞孔内,100μL/孔。同时设置对照组为不加效应细胞组,即靶细胞萤光释放最大孔。每个比例设2个复孔。
c.放置37℃、5% CO2培养箱中培养18h。
d.根据板布局,每孔转移100uL细胞悬液至全白酶标板,每孔加入100uL D-luciferin,混匀,全程避光操作,且动作要迅速,静置5min。用多功能酶标仪生物发光信号检测系统进行检测。细胞毒性计算公式为:%细胞毒性=[(对照组-实验组)/对照组]*100。结果显示四个CAR-T均有显著的抗肿瘤活性,CAR01是原始序列,而CAR04是人源化序列的一种,其抗肿瘤活性最强,在E:T为2.5:1和5:1时分别达到60%左右、70%左右的杀伤效果,CAR01在E:T为2.5:1和5:1时均有40%左右的杀伤效果。综合看人源化序列CD22 CAR04比原始序列CD22CAR01的体外抗肿瘤活性更强,CD22 CAR02、CD22 CAR03与原始序列CD22CAR01的体外抗肿瘤活性相当,能够维持原始抗体序列的抗肿瘤活性。其中CD22 CAR04抗肿瘤活性最佳(图3)。
通过细胞毒实验判断CD22 CAR-T细胞对NALM-6的抗肿瘤活性。进一步比较UTD与优选CD22 CAR04(以下命名为CD22 CAR-T)细胞的体外杀伤活性,CD22 CAR-T细胞的感染阳性率为99.72%。内源性表达CD22的NALM-6-Luc细胞作为靶细胞,CAR-T细胞和UTD为效应细胞,具体实验操作同上述RAJI部分。
结果显示:CD22 CAR-T在效靶比1:1时,对靶细胞的杀伤率达到90%以上,表明CD22 CAR-T的抗肿瘤活性强(图4)。后续将CD22 CAR-T进行动物体内抗肿瘤效果评价。
CAR-T与靶细胞共培养后IFN-γ分泌检测
a.Raji-Luc、NALM-6-Luc细胞作为靶细胞(含CD22靶蛋白),用RPMI1640完全培养基调整密度为5*105/mL,然后100μL/孔,96孔板,即5*104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD(对照组)为效应细胞,同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL,加入靶细胞孔内,100μL/孔,设3个复孔。
c.放置37℃、5% CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板,并进行包被、封闭。
包被capture antibody:使用PBS稀释capture antibody至2μg/mL,96孔ELISA板,100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭:先用PBST洗板三次,再使用1%BSA-PBS室温封闭1h,300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机,800×g,室温离心5min,收集培养上清。
f.加样品:先用PBST洗板三次,再分别加入收集的培养上清和标准品【9.38pg/mL-600pg/mL】,100μL/孔,室温孵育2h。
g.加detection antibody:先用PBST洗板三次,再使用PBS稀释detectionantibody至125ng/mL,100μL/孔,室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRPB:先用PBST洗板三次,再使用PBS将Streptavidin-HRP B稀释40倍,100μL/孔,室温孵育20min,注意避光。
i.加显色液:先用PBST洗板三次,再加入显色液,100μL/孔,室温孵育20min,注意避光。
g.终止反应:加入2M H2SO4,50μL/孔,注意避光。
k.检测:用多功能酶标仪读取OD450,参考波长540nm.
分析数据,CAR-T组比UTD组明显增高,说明CAR-T在表达CD22的肿瘤细胞刺激下,能够分泌大量IFN-γ。
CAR-T与靶细胞共培养后IL-2释放情况
a.Raji-Luc、NALM-6-Luc细胞作为靶细胞(含CD22靶蛋白),用RPMI1640完全培养基调整密度为5×105/mL,然后100μL/孔,96孔板,即5×104个/孔。
b.CAR-T细胞和UTD(对照组)为效应细胞,同时用RPMI1640完全培养基分别调整至2.5×106/mL,加入靶细胞孔内,100μL/孔,每个比例设3个复孔。
c.放置37℃、5% CO2培养箱中培养18h。
d.准备ELISA板,并进行包被、封闭。
包被capture antibody:PBS稀释capture antibody至4μg/mL,96孔ELISA板,100μL/孔。4℃孵育过夜。
封闭:先用PBST洗板三次,再使用1%BSA-PBS室温封闭1h,300μL/孔。
e.将96孔细胞板置于离心机,800×g,室温离心5min,收集培养上清。
f.加样品:先用PBST洗板三次,再分别加入收集的培养上清和标准品【15.6pg/mL-1000pg/mL】,100μL/孔,室温孵育2h。
g.加detection antibody:先用PBST洗板三次,再使用PBS稀释detectionantibody至100ng/mL,100μL/孔,室温孵育2h。
h.加Streptavidin-HRP B:先用PBST洗板三次,再使用PBS将Streptavidin-HRPB稀释40倍,100μL/孔,室温孵育20min,注意避光。
i.加显色液:先用PBST洗板三次,再加入显色液,100μL/孔,室温孵育20min,注意避光。
g.终止反应:加入2M H2SO4,50μL/孔,注意避光。
k.检测:用多功能酶标仪读取OD450,参考波长540nm.
分析数据,CAR-T组比UTD组明显增高,说明CAR-T在表达CD22的肿瘤细胞刺激下,能够分泌大量IL-2。
(5)靶向CD22 CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性
NSG小鼠在NOD-SCID的基础上敲除Il2rg基因,是一种严重免疫缺陷小鼠,缺失成熟T、B、NK细胞,是人源化小鼠、异种移植、免疫重建的重要载体;对于研究人类造血干细胞、肿瘤发生与治疗、免疫缺陷疾病与体内免疫机制研究都具有重要意义。是目前国际公认的免疫缺陷程度较高、较适合人源细胞或组织移植的工具小鼠。
a.收获对数生长期的NALM-6细胞,用PBS重悬细胞,调整细胞密度为1×107/mL,将其与Matrigel基质胶1:1(v:v)混合。以200ul/只体积,接种于6~8周龄雌性NSG小鼠右侧前腋皮下,以建立胶质瘤异种移植小鼠模型。
b.每天观察小鼠的健康状况及成瘤情况,约7天后瘤体积达到100-200mm3。
c.将小鼠平均分为3组,Control-T/CD22 CAR-T/溶媒对照组,每组8只。每只小鼠尾静脉注射4×106个CAR-T细胞进行单次治疗。
d.给药后,每天观察小鼠一般症状,共28天,实验终末安乐死处死小鼠并进行解剖。每隔3天测量NALM-6移植瘤体积的大小,记录每组小鼠瘤体积的变化和存活情况,并绘制瘤体积随时间的生长曲线。结果显示CD22 CAR-T细胞能有效抑制NALM-6细胞增殖(图5)。靶向CD22的CAR-T细胞在动物体内的抗肿瘤活性显著,在12-15天,实验组小鼠移植瘤几乎被完全抑制,瘤体积已经几乎测量不到。非临床药效实验结果充分显示CD22CAR-T在动物体内对杀伤清除CD22阳性肿瘤细胞的有效性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种靶向CD22的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体的互补决定区序列如下:如SEQ ID NO:5所示的CDR1序列、SEQ ID NO:6所示的CDR2序列及SEQ ID NO:7所示的CDR3序列。
2.如权利要求1所述的靶向CD22的纳米抗体,其特征在于,所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示;
或,所述纳米抗体序列与SEQ ID NO:3所示的序列具有80%及以上的相似度,并且能够具有与B9-VHH基本一致的生理活性。
3.一种嵌合抗原受体,其特征在于,包含抗原结合域、铰链区、信号肽、跨膜结构域和胞内结构域;
其中,所述抗原结合域为权利要求1中的靶向CD22的纳米抗体人源化之后的抗体,序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:12所示;
所述跨膜结构域来源于CD28、CD3、CD45、CD4、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137或CD154中的任意一种,
所述胞内结构域来源于CD3ζ、FcRγ、CD3γ、CD38、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、4-1BB或CD66b的细胞内结构域中的一种或几种;
所述铰链区,用于连接抗原结合抗原结合域及跨膜结构域,选自IgG1铰链区、CD8铰链区;;
所述信号肽为CD8α。
4.如权利要求3所述的嵌合抗原受体,其特征在于,所述嵌合抗原受体命名为CAR02,由CD8α信号肽、B9-HM1、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1BB以及CD3的胞内段CD3ξ组成,其中,B9-HM1的序列如SEQ ID NO:8所示;
或,所述嵌合抗原受体命名为CAR03,由CD8α信号肽、B9-HM2、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1BB以及CD3的胞内段CD3ξ组成,其中,B9-HM2的序列如SEQ ID NO:10所示;
或,所述嵌合抗原受体命名为CAR04,由CD8α信号肽、B9-HM3、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内信号传导结构域4-1BB以及CD3的胞内段CD3ξ组成,其中,B9-HM3的序列如SEQ ID NO:12所示。
5.编码权利要求3或4所述嵌合抗原受体的核苷酸。
6.一种重组载体,其特征在于,所述重组载体具有在T细胞中表达权利要求1或2所述嵌合抗原受体的能力,或包含权利要求5所述的核苷酸。
7.一种T细胞,其特征在于,包含权利要求1或2所述的嵌合抗原受体。
8.一种药物组合物,所述药物组合物中包括第权利要求7所述的T细胞。
9.权利要求1或2所述靶向CD22的纳米抗体、权利要求3或4所述嵌合抗原受体、权利要求7所述T细胞或权利要求8所述药物组合物在制备CD22相关疾病治疗药物中的应用。
10.如权利要求10所述的应用,其特征在于,所述CD22相关疾病为自身免疫性疾病或B细胞恶性肿瘤;
其中,B细胞恶性肿瘤选自急性淋巴细胞白血病、非霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病;
所述自身免疫性疾病选自系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、原发性干燥综合征或系统性血管炎。
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