CN110684790A - 抗b7-h3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用 - Google Patents

抗b7-h3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了抗B7‑H3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用，其中，抗B7‑H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于，至少包含了表达IL15和CCL21的人工核苷酸序列。本发明提供的抗B7‑H3嵌合抗原受体的编码基因增强了CIK细胞对实体瘤细胞的杀伤效应。

Description

抗B7-H3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的 质粒、免疫细胞及其应用
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及抗B7-H3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用。
背景技术
恶性肿瘤治疗中，传统疗法包括手术治疗、放射治疗、化疗、中药治疗和免疫疗法。免疫治疗方法抗肿瘤治疗目前正在世界各地的临床试验，如白血病或淋巴瘤。已有两种经FDA批准上市。目前针对CD19、CD22的CAR-T细胞治疗血液系统肿瘤已经取得重大进步，且疗效显著，但是针对实体瘤的CAR-T细胞治疗进展缓慢且效果不佳，缺乏安全有效的特异性肿瘤抗原靶点是重要的阻碍因素之一。
因此，开发一种抗B7-H3嵌合抗原受体、制备方法及其应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供抗B7-H3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用，以提高免疫细胞对实体瘤的治疗效果。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其中，至少包含了表达IL15和CCL21的人工核苷酸序列。
本发明中，作为优选的技术方案，所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因中，包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域。
本发明中，作为优选的技术方案，所述抗B7-H3嵌合抗原受体包括顺序连接的
(1)导引子Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)
(2)Anti-B7-H3 antigen antibody single chain Fv antibody(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.3)
(3)CD8Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.4)
(4)CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)
(5)CD226胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)
(6)CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)
(7)T2A-IL15-CCL21核酸人工序列(SEQ ID NO.8)。
本发明中，作为优选的技术方案，所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO.1所述。
第二方面，本发明提供了抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按融合基因片段导引子Leader的核酸人工序列、Anti-B7-H3的核酸人工序列、CD8的核酸人工序列、linker的核酸人工序列、CD8TM的核酸人工序列、CD226的核酸人工序列、CD3ζ的核酸人工序列、T2A-IL15-CCL21核酸人工序列的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro中，得到pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21；
(2)将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21进行双酶切，利用琼胶电泳将含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段，即为所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因。
更详细的说，步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(Anti-B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ-T2A-IL15-CCL21的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，并插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(B7-H3)-T2A-scFv(CTLA4)；
将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21进行Fast Digest AsiSI和Fast DigestNotI双酶切，37℃，酶切20min，100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳把含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解；
再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心处理DFColumn 1分钟，将过滤液倒掉；
再向DF Column加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心处理DF Column 1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心处理DF Column 2分钟确保乙醇被去除；
最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入30μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段。
第三方面，本发明提供了具有抗B7-H3嵌合抗原受体的质粒，包括如下步骤：分别按融合基因片段Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，转化到E.coli(DH5α)，通过菌液PCR鉴定后，使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21。
更详细的说，步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(Anti-B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ-T2A-IL15-CCL21的顺序插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，并命名为pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21，
同时将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21和pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段和线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段和线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-scFv(B7-H3)-T2A-scFv(CTLA4)。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21DNA：4μl；线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA：4μl。
将上述pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21转化到E.coli(DH5α)。
具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)弃滤过液，再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和已知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒浓度为328ng/μl。
将上述的pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
第四方面，本发明提供了具有抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的免疫细胞，所述免疫细胞选自自体的CIK细胞。
本发明中，作为优选的技术方案，所述免疫细胞采用如下的制备方法得到：
取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞；诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；继续培养，CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，即得到诱导成功的CIK。
第五方面，本发明提供了抗B7-H3嵌合抗原受体在治疗实体瘤方面的应用。
本发明中，作为优选的技术方案，应用的药物形式包括试剂盒。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
B7-H3(CD276)属于B7超家族成员，是一种高表达于多种恶性肿瘤I型跨膜蛋白，如表达93％以上的肝癌、胰腺癌、前列腺癌，90％以上的乳腺癌、骨肉瘤，80％以上的结肠癌、卵巢癌、70％以上的子宫内膜癌、宫颈癌，50％以上的非小细胞肺癌、膀胱癌等。B7-H3(CD276)不仅在多种人类实体瘤中高度过表达，且与癌症严重程度和预后不良呈正相关，同时B7-H3属于B7-CD28途径的免疫检查点分子，与其他免疫检查点相比，B7-H3途径不仅调节先天性和适应性免疫，还通过各种非免疫功能促进癌细胞侵袭性。因此，B7-H3可以作为未来实体瘤免疫疗法的新靶标。
嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞在实体瘤中的浸润，积累和存活对肿瘤清除至关重要。故需要一个更有效的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞来治疗恶性肿瘤，尤其是实体瘤。研究表明，淋巴组织分泌的趋化因子CCL21和IL-15，其中CCL21可以募集外周T淋巴细胞、树突状细胞以及B细胞等进入淋巴组织，而IL-15在T细胞的增值与稳定发挥重要作用。
基于以上思路，本发明设计一种融合表达IL-15、CCL21抗B7-H3(CD276)嵌合抗原受体用来治疗实体瘤。
本发明提供的抗B7-H3嵌合抗原受体的编码基因增强了T细胞对实体瘤的杀伤效应。
附图说明
图1为慢病毒表达载体pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21示意图。
图2为CAR(B7-H3)的CAR模块的示意图。
图3为流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率结果图。
图4为流式检测嵌合抗原受体表达结果图。
图5为抗B7-H3嵌合抗原受体T细胞细胞因子释放检测图。
图6为靶向B7-H3嵌合抗原受体T细胞杀伤活性研究示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其中，至少包含了表达IL15和CCL21的人工核苷酸序列。还要包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域。
本实施例中，所述抗B7-H3嵌合抗原受体包括顺序连接的
(1)导引子Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)
(2)Anti-B7-H3 antigen antibody single chain Fv antibody(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.3)
(3)CD8Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.4)
(4)CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)
(5)CD226胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)
(6)CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)
(7)T2A-IL15-CCL21核酸人工序列(SEQ ID NO.8)。
也就是说，本实施例的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的核苷酸序列表如SEQ IDNO.1所述。
实施例2
抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的制备实施例。
本实施例的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按融合基因片段导引子Leader的核酸人工序列、Anti-B7-H3的核酸人工序列、CD8的核酸人工序列、linker的核酸人工序列、CD8TM的核酸人工序列、CD226的核酸人工序列、CD3ζ的核酸人工序列、T2A-IL15-CCL21核酸人工序列的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro中，得到pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21；
(2)将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21进行双酶切，利用琼胶电泳将含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段，即为所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因。
本实施例中，详细的步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(Anti-B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ-T2A-IL15-CCL21的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，并插入T载体pUC57中，得到pUC57-scFv(B7-H3)-T2A-scFv(CTLA4)；
将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21进行Fast Digest AsiSI和Fast DigestNotI双酶切，37℃，酶切20min，100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积；
利用琼胶电泳把含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段的琼胶部位切下，放在离心管中；
采用DNA extraction kit将DNA从琼胶中溶出，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解；
再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube，8000rpm离心处理DFColumn 1分钟，将过滤液倒掉；
再向DF Column加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心处理DF Column 1分钟，过滤液倒掉；12000rpm离心处理DF Column 2分钟确保乙醇被去除；
最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入30μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心微量离心管2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段，如图2所示。
实施例3
具有抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的质粒的实施例。
具有抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的质粒，采用包括如下步骤的方法制备得到：分别按融合基因片段Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，转化到E.coli(DH5α)，通过菌液PCR鉴定后，使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21，如图1所示。
本实施例中，更详细的步骤为：
分别按融合基因片段Leader-scFv(Anti-B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ-T2A-IL15-CCL21的顺序插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，并命名为pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21，
同时将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21和pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段和线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段和线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-scFv(B7-H3)-T2A-scFv(CTLA4)。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21DNA：4μl；线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA：4μl。
将上述pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21转化到E.coli(DH5α)。
转化的具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)弃滤过液，再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和已知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒浓度为328ng/μl。
将上述的pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例4
具有抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的免疫细胞实施例。
具有抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的免疫细胞，所述免疫细胞选自自体的CIK细胞。
一般而言，免疫细胞采用如下的制备方法得到：将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒转染细胞系293T，然后用上述重组慢病毒感染CIK细胞。
更详细的说，本实施例采用如下详细步骤：
(1)质粒的制备
分别按融合基因片段Leader-scFv(Anti-B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ-T2A-IL15-CCL21的顺序插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，并命名为pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21，
同时将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21和pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段和线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段和线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-scFv(B7-H3)-T2A-scFv(CTLA4)。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21DNA：4μl；线性化的pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro DNA：4μl。
将上述pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21转化到E.coli(DH5α)。
转化的具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)弃滤过液，再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和已知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒浓度为328ng/μl。
将上述的pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
利用同样的工艺制备B7-H3-CAR(Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ)质粒。
(2)慢病毒包装，病毒滴度检测
将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 6孔板中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。转染前将6孔板中换成2ml新鲜的培养基，将Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ-IL15-CCL21质粒(IL15-CCL21-B7-H3-CAR)和Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ(B7-H3-CAR)质粒分别与慢病毒包装质粒共转染293T细胞。转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，过滤除菌，在-80℃低温冰箱中保存备用。根据Lenti-XTMGo StixTM试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ-IL15-CCL21的滴度2.66×106pfu/mL，重组慢病毒Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-CD3ζ的滴度2.78×106pfu/ml。
(4)慢病毒感染CIK细胞及感染后CIK细胞的扩增培养
取75ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1000IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，并留取该CIK待病毒感染。
如图3所示，CD3+阳性率为97.6％，CD3+CD56+双阳性率为27.1％，即CIK诱导成功，可用于后续实验。
以MOI＝5用上述慢病毒分别感染CIK细胞。感染后的细胞37℃，5％CO2培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液和聚凝胺，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高T细胞的感染效率。吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。如图4所示，通过细胞流式检测嵌合抗原受体表达，由于GFP与CAR共表达，检测GFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞。以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，融合表达IL-15和CCL21抗B7-H3嵌合抗原受体(IL-15-CCL21-B7-H3-CAR)的病毒感染T细胞其阳性率27％，抗B7-H3嵌合抗原受体(B7-H3-CAR)病毒感染T细胞其阳性率29％。
实施例5
抗B7-H3嵌合抗原受体在杀伤和抑制实体瘤方面的应用。
抗B7-H3嵌合抗原受体修饰的免疫细胞体外杀伤活性研究
将IL-15-CCL21-B7-H3-CAR-T细胞(1×105)和B7-H3-CAR-T细胞(1×105))分别与预先铺好的肾癌细胞786-0或者肺癌细胞H23(1×105)共培养在没有外源性细胞因子的平板中，24h后收集细胞上清，ELISA检测细胞因子(干扰素γ(IFN-γ)和白细胞介素2(IL-2)的含量。以上均做3次重复实验。结果如图5所示，IL-15-CCL21-B7-H3-CAR-T细胞与B7-H3-CAR-T细胞均被激活，且IL-15-CCL21-B7-H3-CAR-T细胞比B7-H3-CAR-T细胞细胞因子(IFN-γ、IL-2)释放更多，杀伤活性更强。
实施例6
CAR-CIK细胞对实体瘤治疗作用
1、将肾癌细胞786-0或者肺癌细胞H23肿瘤细胞以1×105/孔的浓度接种在RTCA孔板中，监测培养过夜。
2、在不添加外源细胞因子的情况下，以不同比例(E：T为1：1；1：5或1:10)将IL-15-CCL21-B7-H3-CAR-T细胞与普通抗B7-H3-CAR-T细胞分别加入预先监测过夜的RTCA孔板中，继续监测培养3天。
3、E：T为1：5时，杀伤结果最好，如图6所示：不添加CAR-T细胞的靶细胞增值不受影响，曲线上升，而加入IL-15-CCL21-B7-H3-CAR-T细胞与B7-H3-CAR-T细胞的肿瘤细胞均被杀死，曲线下降，且IL-15-CCL21-B7-H3-CAR-T细胞比普通抗B7-H3-CAR-T细胞杀伤肿瘤细胞的能力更强。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (10)

1.抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于，至少包含了表达IL15和CCL21的人工核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因中，包括抗原结合区、跨膜结构区、共刺激信号传导区和T细胞信号传导区功能结构域。
3.如权利要求2所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：包括顺序连接的
(1)导引子Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)
(2)Anti-B7-H3 antigen antibody single chain Fv antibody(scFv)核酸人工序列(SEQ ID NO.3)
(3)CD8Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.4)
(4)CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)
(5)CD226胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)
(6)CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.7)
(7)T2A-IL15-CCL21核酸人工序列(SEQ ID NO.8)。
4.如权利要求3所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，其特征在于：所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的核苷酸序列表如SEQ ID NO.1所述。
5.制备如权利要求4所述抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别按融合基因片段导引子Leader的核酸人工序列、Anti-B7-H3的核酸人工序列、CD8的核酸人工序列、linker的核酸人工序列、CD8TM的核酸人工序列、CD226的核酸人工序列、CD3ζ的核酸人工序列、T2A-IL15-CCL21核酸人工序列的顺序委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro中，得到pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21；
(2)将pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21进行双酶切，利用琼胶电泳将含有CAR(B7-H3)-IL15-CCL21的DNA片段琼胶部位切下，通过溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的CAR(B7-H3)-IL15-CCL21 DNA片段，即为所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因。
6.质粒，其特征在于：具有如权利要求4所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，且采用包括如下步骤的方法制备得到：
分别按融合基因片段Leader-scFv(B7-H3)-CD8-CD226-4-1BB-CD3ζ-T2A-Leader-scFv(CTLA4)-CD8-CD3ζ的顺序插入pLent-EF1α-FH-CMV-GFP-P2A-Puro载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点，转化到E.coli(DH5α)，通过菌液PCR鉴定后，使用Qiagen公司的质粒提取试剂盒提取质粒，质粒经测序正确后，将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21。
7.免疫细胞，其特征在于：具有如权利要求4所述的抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因，且所述免疫细胞选自自体的CIK细胞。
8.如权利要求7所述的免疫细胞，其特征在于：采用如下的制备方法得到：利用pLent-EF1α-CAR(B7-H3)-IL15-CCL21质粒转染慢病毒包装细胞系293T，然后在慢病毒感染CIK细胞。
9.如权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于：自体的CIK细胞采用如下的方法得到：
取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞；诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；继续培养，CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，即得到诱导成功的CIK细胞。
10.抗B7-H3嵌合抗原受体编码基因在杀伤和抑制实体瘤细胞方面的应用。
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