CN112940137A - 一种pd-1基因敲除的靶向muc1的car-t细胞及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种PD‑1基因敲除的靶向MUC1的CAR‑T细胞及其制备方法和应用。本发明首先制备了靶向MUC1的嵌合抗原受体，包括抗原结合结构域，跨膜结构域，共刺激结构域和细胞内信号传导结构域；以Tn糖基化MUC1为靶点，靶点特异性高，不容易产生脱靶，提高了CAR‑T细胞的安全性。在此基础上，得到了PD‑1基因敲除的靶向MUC1的CAR‑T细胞，敲除了PD‑1基因，回输体内后不会因肿瘤表达的PD‑L1而引起CAR‑T细胞衰竭和失能，从而对肿瘤细胞产生高效特异性细胞杀伤作用，提高其疗效。

Description

一种PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞及其制备方法和 应用
技术领域
本发明属于细胞免疫治疗技术领域，具体涉及一种PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤治疗是困扰人类的最大难题之一，常规治疗手段都各有局限。随着科技的进步，肿瘤免疫治疗正逐渐成为肿瘤治疗的发展方向，被称为第四大肿瘤治疗技术。肿瘤免疫治疗主要包括以CAR-T(Chimeric Antigen Receptor T-Cell)为代表的过继细胞免疫疗法(ACT)和以PD-1/PDL-1抗体为代表的免疫检查点疗法，近年来取得了突破性进展。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)是一种由抗原识别域、铰链区、跨膜区和胞内信号域依次组成的模拟TCR功能的人工受体，其中，抗原识别域通常为特异性结合靶点的单链抗体。嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)是通过将外源性人工设计的CAR基因导入T细胞内进行基因修饰改造后得到的表达有CAR的T细胞。因为在急性B淋巴白血病和非霍奇金淋巴瘤等血液肿瘤的治疗上表现出显著的疗效，诺华与吉利德(收购KitePharma)分别研发的Kymriah和Yescarta两款CAR-T产品在2017年相继被FDA批准上市，给全球成千上万癌症病人带来希望。CAR-T细胞疗法在血液肿瘤治疗中取得空前成功，越来越多的针对实体瘤的CAR-T细胞疗法临床试验也相继开展：靶向神经节苷脂(GD2)治疗神经母细胞瘤，靶向间皮素(meso)治疗胰腺癌，靶向癌胚抗原(CEA)治疗结直肠癌，靶向成纤维细胞活化蛋白(FAP)治疗恶性胸膜间皮瘤，靶向表皮生长因子受体(EGFR)治疗非小细胞肺癌，靶向δ样蛋白3(DLL3)治疗小细胞肺癌，靶向整合素相关蛋白(CD47)治疗卵巢癌和结肠直肠癌等。然而，CAR-T细胞也具有一定的局限性，CAR-T细胞治疗应用于实体瘤不易掌握，虽然临床试验证实CAR-T细胞具有清除肿瘤的能力，但也存在一些严重的安全问题，如靶向非肿瘤毒性、细胞因子释放综合征和神经毒性等。
CAR-T细胞治疗实体瘤存在的一个关键问题是缺乏特异性抗原。肿瘤中稳定并特异高表达的表面蛋白是实体瘤CAR-T细胞理想的靶点，靶点的特异性对CAR-T细胞治疗尤为重要。血液肿瘤的抗原具有特异性，在其他正常组织没有表达，而针对实体瘤的抗原一般在其他部位，如心脏、肺、肝脏等有少量表达，这就伴随了治疗的脱靶效应。黏蛋白1(MUC1)是一种大分子跨膜糖蛋白，是最早发现的黏蛋白家族分子，由胞外域、跨膜域和胞内域三部分非共价连接而成。MUC1的胞内域有多个磷酸化位点，能通过影响胞内信号通路的传递，在肿瘤中起到促进肿瘤增殖、侵袭和转移的作用。MUC1胞外域非常特殊，在正常细胞中，MUC1胞外域大量糖基化，MUC1胞外域主干分子结构被糖基化遮挡；在肿瘤细胞中，由于糖基转移酶等酶的异常表达，MUC1糖基化减少或变异，暴露了原有的主干分子结构并形成新的短小糖链结构，使得MUC1在肿瘤中的表达和正常细胞不同，具有很高的特异性。MUC1一般分布于机体正常黏膜表面，如乳腺、呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道等腺上皮细胞的管腔面顶部。然而在恶性肿瘤组织，特别是在腺癌中MUC1表达极性分布消失，表达量增高，糖基化不完全，暴露抗原决定簇，成为肺癌、乳腺癌、胰腺癌等实体瘤的CAR-T疗法的特异性理想靶点。
CAR-T细胞治疗实体瘤存在的另一关键问题是存在肿瘤免疫抑制微环境。由免疫检查点介导的免疫抑制信号，如PD-1、CTLA-4、LAG-3和TIM-3等组成的肿瘤微环境，在促进肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。在CAR-T细胞被抗原激活后，它们通过和相关配体结合，抑制CAR-T细胞的增殖和细胞因子分泌功能。特别是在肿瘤浸润CAR-T细胞上，这些抑制性分子表达进一步上调，其介导的下游信号大大限制了CAR-T细胞在实体瘤部位的抗肿瘤免疫效应。多个研究表明，使用这些受体的抑制剂可以增强CAR-T细胞疗法的治疗效果。HER2CAR-T细胞和mesothelin CAR-T细胞与PD1抑制剂的联用均在动物实验中表现出显著增强的抗肿瘤效果。为了克服免疫抑制的影响，PD-1/PD-L1抗体在实体瘤免疫治疗取得较好效果，然而免疫检查点抑制剂的长期使用可能破坏免疫耐受，导致严重的副作用。
因此，如何提高CAR-T细胞的安全性、克服免疫抑制的影响，同时保证发挥CAR-T细胞治疗的靶向性、持久性，使其更精确可控成为其临床应用的关键。
发明内容
本发明的旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提供了一种PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞及其制备方法和应用。PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞，不仅可以用于Tn糖基化的MUC1阳性的非小细胞肺癌、食管癌、乳腺癌等多种实体肿瘤的治疗，而且解除PD-1/PD-L1信号通路对CAR-T细胞的抑制作用，提高CAR-T细胞对肿瘤的杀伤作用。本发明提供的PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞，具有适应症多、安全、高效等优点，在实体瘤免疫细胞治疗领域拥有巨大的应用价值。
本发明的技术方案如下文所示。
本发明第一方面提供了一种靶向MUC1的嵌合抗原受体，包括，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的抗原结合结构域。
在本发明的一些实施方式中，编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在本发明的一些实施方式中，所述抗原结合结构域与MUC1的Tn糖基化位点结合。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体还包括跨膜结构域，所述跨膜结构域包含来源于选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ及CD3ζ。
在本发明的一些实施方式中，所述跨膜结构域来源于CD8；优选地，所述跨膜结构域与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在本发明的一些实施方式中，编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明中跨膜结构域用来连接抗原结合域和共刺激结构域。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体还包括共刺激结构域；所述共刺激结构域来源于选自由以下组成的组的蛋白质：CD2、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)。优选地，所述共刺激结构域来源于选自由以下组成的组的蛋白质：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD40、LFA-1；更优选地，所述共刺激结构域来源于CD28和4-1BB中的至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述共刺激结构域来源于4-1BB；优选地，所述共刺激结构域与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在本发明的一些实施方式中，编码SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体还包括细胞内信号传导结构域；所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d；优选地，所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ、CD3γ、CD3δ或CD3ε。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ；优选地，所述细胞内信号传导结构域与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在本发明的一些实施方式中，编码SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
在本发明的一些实施方式中，所述细胞内信号传导结构域与所述共刺激结构域相连。
在本发明的一些实施方式中，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体包含的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
在本发明的一些实施方式中，编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
在本发明的一些实施方式中，当所述靶向MUC1的嵌合抗原受体结合Tn糖基化MUC1的时候，表达本发明的靶向MUC1的嵌合抗原受体的细胞毒性免疫细胞可以被激活或刺激而增殖。当所述靶向MUC1的嵌合抗原受体在细胞毒性免疫细胞的表面上表达时，指导细胞毒性免疫杀伤表达MUC1 Tn糖基化的细胞。
本发明第二方面提供了一种分离的核苷酸序列，所述分离的核苷酸序列编码本发明第一方面任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体。
本发明第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或体外转录载体。
本发明第四方面提供了一种重组或分离的细胞，所述重组或分离的细胞包含本发明第一方面任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核苷酸序列或本发明第三方面所述的载体。
在本发明的一些实施方式中，所述重组或分离的细胞还包括抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，可以通过RNAi技术、CRISPR/Cas9系统、TALEN系统或锌指核酸酶系统使所述重组或分离的细胞中的PD-1基因抑制或沉默。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列为PD-1基因的gRNA或PD-1基因的dsRNA。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列包括SEQ IDNO:52所示的核苷酸序列和选自SEQ ID NO:11～51所示的核苷酸序列中至少一种；优选地，所述抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列和SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述重组或分离的细胞是原代人细胞或其他哺乳动物细胞或来源于所述原代人细胞或其他哺乳动物细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述重组或分离的细胞是免疫细胞，所述免疫细胞任选地选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、NK/T细胞、巨噬细胞及单核细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述重组或分离的细胞选自T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T(TN)细胞、效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞、TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞、δ/γT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞及淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞。优选地，所述重组或分离的细胞是T细胞或T细胞祖细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述重组或分离的细胞为PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞包括本发明第一方面任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核苷酸序列或本发明第三方面所述的载体；以及抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列。
在本发明的一些实施方式中，所述PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞包括与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的氨基酸序列，还包括SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列和选自SEQ IDNO:11～51所示的核苷酸序列中至少一种。
在本发明的一些实施方式中，所述PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞包括还包括Cas9核酸酶元件；优选地，所述Cas9核酸酶元件为质粒、mRNA或蛋白。
本发明第五方面提供了一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的本发明第四方面任一项所述的重组或分离的细胞；优选地，向有需要的受试者施用有效量的PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述癌症为MUC1异常糖基化的癌症；优选地所述癌症包括但不限于肺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌或卵巢癌。
本发明第六方面提供了一种产生PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞的方法，包括如下步骤：
1)向T淋巴细胞中引入本发明第一方面任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核苷酸序列或本发明第三方面所述的载体，得到靶向MUC1的CAR-T细胞；
2)敲除所述靶向MUC1的CAR-T细胞的PD-1基因。
在本发明的一些实施方式中，步骤1)中，通过慢病毒感染或逆转录病毒感染的方法，向T淋巴细胞中引入本发明第一方面任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核苷酸序列或本发明第三方面所述的载体，得到靶向MUC1的CAR-T细胞；优选地，通过慢病毒感染的方法。
在本发明的一些实施方式中，所述慢病毒是三质粒包装系统；进一步地，三质粒包装系统为带有目的基因的慢病毒表达质粒pLVX-EF1α-CAR 5E5、包装质粒pSPAX2和包膜质粒pMD2.G。
在本发明的一些实施方式中，所述T淋巴细胞是由血细胞分离机或Ficoll分离的外周血单核细胞(PBMC)经激活、扩增获得。
在本发明的一些实施方式中，T淋巴细胞的分离培养包括如下步骤：采集肿瘤患者或健康志愿者外周血，离心分离获得自体血浆和细胞沉淀；沉淀细胞用生理盐水稀释后加至装有Ficoll溶液的离心管中，以密度梯度离心法分离得PBMC，用生理盐水洗涤细胞2次，加入含抗人CD3单克隆抗体(OKT3)和重组人白细胞介素2(rhIL-2)的无血清细胞培养基进行培养，以激活PBMC。
在本发明的一些实施方式中，取激活过夜的T细胞，加入负载目的基因(编码本发明CAR的核苷酸序列)的慢病毒液和聚凝胺，离心感染，并培养得到靶向MUC1的CAR-T细胞。
在本发明的一些实施方式中，步骤2)中，通过CRISPR/Cas9技术敲除CAR-T细胞的PD-1基因的方法。优选地，将Cas9蛋白和靶向PD-1基因的gRNA在体外组装成Cas RNP(ribonucleoprotein)复合物，通过电穿孔转染导入已制备的靶向MUC1的CAR-T细胞，得到PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞。
本发明第七方面提供了本发明第一方面任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核苷酸序列、本发明第三方面所述的载体或本发明第六方面所述的产生PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞的方法在制备治疗癌症药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述癌症为MUC1异常糖基化的癌症；优选地所述癌症包括但不限于肺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌或卵巢癌。
本发明的有益效果：
本发明的抗原结合结构域是整个CAR结构的核心元件，以Tn糖基化MUC1为靶点，其在正常细胞和组织中不表达，因此该靶点特异性高，不容易产生脱靶，提高了CAR-T细胞的安全性。
本发明靶向MUC1的CAR-T细胞能用于多种Tn糖基化MUC1阳性的肿瘤的治疗，对多种癌症如非小细胞肺癌、食管癌、乳腺癌等都有效果，适应症广泛。
本发明靶向MUC1的CAR-T细胞中，敲除了PD-1基因，回输体内后不会因肿瘤表达的PD-L1而引起CAR-T细胞衰竭和失能，从而对肿瘤细胞产生高效特异性细胞杀伤作用，提高其疗效。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为重组慢病毒表达载体pLVX-EF1α-CAR 5E5质粒图谱；
图2为流式细胞术检测CAR-T细胞PD-1基因表达；
图3为sanger测序检测PD-1基因敲除；
图4为流式细胞术检测CAR-T细胞阳性率；
图5为非小细胞肺癌患者的肺部变化情况；
图6为患者GZ-18000019和GZ-19000014的肿瘤组织样本中Tn糖基化的MUC1表达；
图7为PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌的DCR与剂量之间的关系；
图8为免疫组化检测食管癌患者的Tn糖基化MUC1表达；
图9为免疫组化检测乳腺癌患者的Tn糖基化MUC1表达；
图10为患者GZ-19000047的计算机断层扫描(Computerized tomography，CT)图像；
图11为患者GZ-19000076的正电子发射计算机断层扫描/计算机断层扫描(Positron emission tomography/Computed tomography，PET/CT)图像。
具体实施方式
以下结合具体的实施例对本发明的技术方案和技术效果做进一步说明和阐释，但本发明并不限于这些具体实施方式。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 负载CAR的慢病毒制备
1、慢病毒表达载体pLVX-EF1α-CAR 5E5构建
CAR结构由抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和细胞内信号传导结构域串联而成，本实施例中CAR的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，由苏州泓迅生物科技股份有限公司人工合成，并克隆到慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-Puro(购自上海林渊生物科技有限公司)的EcoRI和MluI酶切位点之间，构建的重组慢病毒表达载体命名为pLVX-EF1α-CAR 5E5，质粒图谱如图1所示。
用无内毒素质粒大提试剂盒(Endo-free Plasmid Maxi Kit，Omega)进行质粒提取。同时对慢病毒包装的辅助载体质粒(pSPAX2和pMD2.G)进行大量提取。用紫外分光光度计检测提取的质粒的浓度和纯度，然后置于-20℃冰箱中保存，用于后续的慢病毒包装。
2、慢病毒包装与纯化
取冻存的HEK293T细胞(购自ATCC)复苏，用DMEM完全培养基(DMEM培养基(Gibco)+10％FBS)传代培养。将HEK293T细胞以3×106/mL密度接种至10层细胞工厂，加入DMEM完全培养基体积为1L，过夜培养后细胞能达到80-90％的融合度，进行质粒转染。
准备1个T75培养瓶(A瓶)，加入慢病毒表达质粒pLVX-EF1α-CAR 5E5(840μg)、慢病毒包装质粒pSPAX2(840μg)和慢病毒包膜质粒pMD2.G(420μg)，加入无血清DMEM补至60mL。再准备1个T75培养瓶(B瓶)，加入1mg/mL的PEI MAX 40K(polysciences)5.25mL，加入无血清DMEM补至60mL。分别将A、B瓶液体混匀，静置5min。将B液加入A液中，充分混匀，静置20min，形成DNA-PEI复合物。
将DNA-PEI复合物加入1L含5％FBS的DMEM培养基中，充分混匀，替换掉10层细胞工厂中培养液。在转染后的48h收集培养上清液约1L，放入2～8℃冰箱中保存。同时向10层细胞工厂中加入1L新鲜的含5％FBS的DMEM培养基，24h后收集培养上清液约1L，放入2～8℃冰箱中保存，重复该过程一次。将3次收集的约3L培养上清液混合，使用囊式滤器(Sartorius)去掉细胞和细胞碎片。
将澄清过滤的慢病毒上清通过切向流过滤系统(仕必纯
Figure BDA0002939011990000091
KR2I)浓缩到200～300mL。经过0.45μm滤膜过滤后，进行层析纯化。将纯化的慢病毒经过0.22μm滤器(Sartorius)除菌过滤，分装，-80℃冰箱保存。
实施例2 CAR-T细胞制备
(1)取肿瘤患者或者健康志愿者外周血50mL，肝素抗凝，离心分离后获得的血清，经56℃灭活备用。
(2)沉淀细胞用生理盐水稀释后加至装有Ficoll溶液(购自GE)的离心管中，以密度梯度离心法分离得外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，生理盐水洗涤2次，计数备用。
(3)用淋巴细胞培养基KBM 581无血清细胞培养基(Corning)重悬PBMC，调整细胞密度为1～2×106/mL，接种至T75细胞培养瓶，加入抗人CD3单抗(OKT-3)激活PBMC，同时补加500IU/mL的重组人白细胞介素2(rhIL-2)，5～10％血浆，在37℃、5％CO2培养箱培养，得到激活的T细胞。
(4)取激活过夜的T细胞，加入纯化的慢病毒(MOI＝5)，离心感染，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
(5)慢病毒感染24h后离心换液，重悬于KBM581培养基中，加入5-10％血浆和500IU/mL rhIL-2继续扩增。
(6)PBMC经刺激培养过夜后，计数，离心，然后用含有重组人白细胞介素2(rhIL-2)的淋巴细胞培养基KBM 581无血清细胞培养基重悬，使T淋巴细胞密度达到2～5×106/mL，将T淋巴细胞等分至6孔板中，加入纯化的慢病毒液(MOI＝5)和聚凝胺(polybrene，终浓度6μg/ml)。离心感染，700g，1.5h，置于37℃、5％CO2培养箱培养。
(7)慢病毒感染24h后离心换液，重悬于KBM581培养基中，加入5～10％血浆和500IU/mL rhIL-2，于37℃、5％CO2培养箱继续扩增培养，适时换液并将细胞逐步转移到更大体积的培养瓶或培养袋中。
实施例3 CAR-T细胞PD-1基因敲除
(1)取实施例2慢病毒感染2～3天的CAR-T细胞，用OPTI-MEM(Thermo)洗涤3次并用OPTI-MEM重悬，细胞密度为0.5～1x108cells/mL。
(2)在离心过程中，将纯化得到的Cas9蛋白和PD-1-gRNA(金斯瑞生物科技股份有限公司)(SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:52)混合，室温孵育15min，得到Cas9 RNP(Cas9ribonucleoprotein)。
实验组：将100μL细胞悬液和Cas9 RNP混匀，加入到2mm电击杯中，并通过BTX ECM830(Harvard)进行电穿孔转染。
对照组：将100μL细胞悬液和Cas9蛋白混匀，加入到2mm电击杯中，并通过BTX ECM830(Harvard)进行电穿孔转染。
(3)将细胞迅速转移至添加2mL 37℃预热的KBM581培养基(含500U/mL rhIL-2)的6孔板中，37℃、5％CO2的培养箱内培养。电转后24h，将细胞转移到培养瓶，加入KBM581培养基(5～10％血浆和500IU/ml rhIL-2)，于37℃、5％CO2培养箱继续扩增培养。
电转后第2～3天通过流式细胞术检测CAR-T细胞的PD-1的表达，PD-1基因敲除效率＝(对照组表达量-实验组表达量)/对照组表达量×100％，结果如图2所示，(a)为对照组细胞的PD-1基因表达，(b)图为实验组细胞的PD-1基因表达。可以看出，CAR-T细胞的PD-1表达从20.4％下降到0.72％，PD-1敲除效率达到96.5％，
通过sanger测序验证CAR-T细胞的PD-1基因敲除，结果如图3所示，(a)为对照组细胞测序结果图，(b)为实验组细胞测序结果图；可以看出，实验组(CasRNP)从sgRNA靶序列开始出现明显套峰，说明靶向MUC1的CAR-T细胞的PD-1基因被敲除。
电转后第7天通过流式细胞术检测CAR-T细胞的阳性率，结果如图4所示，(a)为实施例2中步骤(3)得到的T细胞，(b)为实验组CAR-T细胞；可以看出，实验组CAR-T细胞的阳性率能达到90.7％。
实施例4 PD-1基因敲除CAR-T细胞制剂
将按照实施例3制备的PD-1基因敲除的CAR-T细胞继续培养扩增10-14天，根据细胞生长情适时补液(KBM581培养基、500IU/ml rhIL-2、2～5％自体血浆)并将细胞逐步转移到更大体积的培养瓶或培养袋中。
收取细胞悬液并离心洗涤3次，以100mL生理盐水重悬，加入2％人血清白蛋白，即可获得PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞制剂。
在细胞制备过程中以中间控制和终产品质控相结合的形式，对细胞制品进行质量控制。中间控制处于电穿孔转染后的3-7天，检测内容包括CAR阳性率检测、IFN-γ释放、CAR拷贝数、支原体、传染性疾病、CAR基因序列鉴定、CD4+/CD8+细胞比例、残余PD-1+T细胞。细胞灌装后得到的细胞终产品主要进行外观、体积、无菌检测、内毒素检测、CAR阳性细胞量以及细胞活率检测。
细胞制剂质检以及放行标准可参照现行版《中国药典》生物制品相关规程以及《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》，检测项目至少包括内毒素检测、无菌检测、支原体检测、细胞数量、细胞存活率、细胞表型等。具体标准表1所示。本发明的细胞制剂在中间控制和终产品质控方面均能达到质控标准。
表1 PD-1基因敲除CAR-T细胞制剂细胞制剂质控标准
Figure BDA0002939011990000111
Figure BDA0002939011990000121
实施例5 PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌
1、在东莞市第八人民医院，使用PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞(利用待治疗患者自身的外周血按照实施例1-4的方法制备得到)治疗1例非小细胞肺癌患者(GZ-18000001)。
入组：男，47岁，2017年11月23日CT检查确诊为肺癌晚期。入组时已发生全身性广泛骨转移，无手术指征；患者确诊后无放化疗治疗、在家服用中药，病情加重，鼻腔出血、头痛、步态不稳，预计生存期3个月。
治疗：该患者接受三次细胞回输，回输时间分别为2018-1-26(第一次回输总细胞数的30％)和2018-1-28(第一次回输总细胞数的70％)、2018-7-31(第二次)、2018-12-4(第三次)。
治疗效果：该患者经过3次治疗，肺部变化情况如图5所示，可以看出，肺部大面积阴影逐渐缩小至1.3cm×1.4cm，大量小结节消失，截至到2020年8月18日患者仍存活(935天)。在治疗过程中患者出现发烧症状，处理后体温恢复正常。本病例提示PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌患者的有效性和安全性。
2、在上述病例的基础上，在广东药科大学附属第一医院开展临床研究项目“ANTI-MUC1-CAR-T细胞治疗MUC1+非小细胞肺癌的安全性、有效性、单臂临床研究”(伦理批号：医伦审【2018】第(6)号01)，在www.clinicaltrials.gov上进行注册(Anti-MUC1 CAR T Cellsand PD-1Knockout Engineered T Cells for NSCLC，NCT03525782)。
根据临床试验方案入排标准，招募符合标准且自愿参加(签署知情同意书)本临床试验的非小细胞肺癌患者，在入组时对来自部分患者的肿瘤组织样本通过免疫组化检测MUC1的表达，如图6所示，患者GZ-18000019和GZ-19000014的肿瘤组织样本中Tn糖基化的MUC1的阳性率分别为43.05％和38.90％。
为确保治疗的安全性，使用爬坡剂量对患者进行治疗，本试验分为3个剂量组，目前已回输24例，每例患者在第4周(D28)完成首次疗效评价，疗效评价按照免疫相关实体瘤的疗效评价标准(immune related Response Evaluation Criteria in Solid Tumours，irRECIST)严格执行。
如表2所示，为PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌(NCT03525782)的有效性评估；在接受细胞回输的24例患者中，11例疾病稳定(SD，stabledisease)，11例疾病进展(PD，progressive disease)，2例未能进行疗效评价。
如图7所示，为PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌的疾病控制率(Disease Control Rate，DCR)与剂量之间的关系；剂量组A(1.0×107～4.99×107CAR+Cells)、剂量组B(1.0×108～4.99×108CAR+Cells)、剂量组C(5.0×108～9.99×108CAR+Cells)的SD控制率分别为20％(1/5)、50％(6/12)、80％(4/5)，说明临床效果有一定量效关系。通过长时间随访和疗效评价，发现部分患者的疾病稳定状态持续时间长，GZ-18000019和GZ-19000014患者的SD时间分别超过180天和270天(仍在继续随访)，提示PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌的有效性。
在治疗中，还对不良事件进行了监测，结果如表3所示，所有患者均未出现严重不良事件，未发生CRS和神经毒性，仅出现发烧(Fever，5/22)、寒颤(Chill，2/22)、头痛(Headache，1/22)、皮疹(Skinrash，1/22)、腹泻(Diarrhea，1/22)、恶心呕吐(Nausea&vomiting，1/22)等不良事件，证明了PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞在治疗非小细胞肺癌病人中的安全性。
表2 PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌(NCT03525782)的有效性评估
Figure BDA0002939011990000141
表3 PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗非小细胞肺癌出现的不良事件(AE)
Figure BDA0002939011990000151
实施例6 PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗食管癌
在广东药科大学附属第一医院开展临床研究项目“ANTI-MUC1-CAR-T细胞治疗MUC1+食管癌的安全性、有效性、单臂临床研究”(医伦审【2018】第(63)号01)，在www.clinicaltrials.gov上进行注册(CAR T and PD-1Knockout Engineered T Cellsfor Esophageal Cancer，NCT03706326)。
根据临床试验方案入排标准，招募符合标准且自愿参加(签署知情同意书)本临床试验的食管癌患者，在入组时对来自部分患者的肿瘤组织样本通过免疫组化检测MUC1的表达，如图8所示，患者GZ-20000053的肿瘤组织样本中Tn糖基化的MUC1的阳性率为24.57％。
本试验分为4个剂量组，目前已完成回输7例，其中剂量组A(1.0×107～4.99×107CAR+Cells)1例、剂量组B(5.0×107～9.99×107CAR+Cells)1例、剂量组D(5.0×108～9.99×108CAR+Cells)5例。每例患者在第4周完成首次疗效评价，疗效评价按照免疫相关实体瘤的疗效评价标准(immune related Response Evaluation Criteria in SolidTumours，irRECIST)严格执行。
在接受细胞回输的7例患者中，3例疾病稳定(SD，stable disease)，3例疾病进展(PD，progressive disease)，1例未能进行疗效评价。SD都出现在剂量组D，其SD控制率为75％(3/4)。在治疗中，我们还对不良事件进行了监测，主要为发烧(Fever，5/7)、寒颤(Chill，1/7)、皮疹(Skinrash，1/7)，未发生严重不良事件和CRS。
实施例7 PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞治疗乳腺癌
在中山大学孙逸仙纪念医院开展临床研究项目“PD-1基因敲除的靶向MUC1嵌合抗原受体T细胞(AJMUC1)治疗MUC1阳性晚期乳腺癌的早期剂量探索性研究”([2019]伦审研第(01)号)，在中国临床试验注册中心注册(注册号ChiCTR1900025088)。
根据临床试验方案入排标准，招募符合标准且自愿参加(签署知情同意书)本临床试验的乳腺癌患者，在入组时对来自部分患者的肿瘤组织样本通过免疫组化检测MUC1的表达，如图9所示，患者GZ-19000030和GZ-19000064的肿瘤组织样本中Tn糖基化的MUC1的阳性率分别为34.52％和30.67％。
为确保治疗的安全性，使用爬坡剂量对患者进行治疗，本试验分为3个剂量组，本试验分为3个剂量组，剂量组A(1.0×106～2.0×106CAR+Cells/kg)1例、剂量组B(3.0×106～6.0×106CAR+Cells/kg)、剂量组C(0.9×107～1.8×107CAR+Cells/kg)，计划每组招募3例受试者。目前已完成细胞回输6例，剂量组A和剂量组B分别回输3例。每例患者在第4周完成首次疗效评价，疗效评价按照免疫相关实体瘤的疗效评价标准(immune relatedResponse Evaluation Criteria in Solid Tumours，irRECIST)严格执行。
在接受细胞回输的6例患者中，剂量组A有1例(患者GZ-19000047)疾病稳定(SD，stable disease)，2例疾病进展(PD，progressive disease)，剂量组B有2例(患者GZ-19000076和患者GZ-20000088)疾病稳定(SD，stable disease)，1例疾病进展(PD，progressive disease)，其中患者GZ-19000047治疗前后的CT图像如图10所示，患者GZ-19000076的PET/CT图像如图11所示。在治疗中，还对不良事件进行监测，主要为发烧(Fever，2/6)、皮疹(Skinrash，1/6)，未发生严重不良事件和CRS。
本领域技术人员应该理解的是，本发明的使用不受限于上述特定应用。就本文描述或描绘的特定元素和/或特征而言，本发明也不局限于其优选实施方案。应当理解的是，本发明不限于所公开的实施方案例或各个实施方案，且在不脱离由以下权利要求所阐述和限定的本发明的范围的情况下能够进行许多重新布置、修改和替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州安捷生物医学技术有限公司
<120> 一种PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞及其制备方法和应用
<130> 111
<160> 52
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 265
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Thr Asp Ile Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys
165 170 175
Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp
195 200 205
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp
225 230 235 240
Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
245 250 255
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
260 265
<210> 2
<211> 795
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 2
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctgcagca gtccgacgcc gagctggtga agcctggcag ctccgtgaag 120
atctcctgca aggccagcgg ctacacattc accgatcacg ccatccactg ggtgaagcag 180
aagcccgagc agggcctgga gtggatcggc cacttttccc ctggcaatac cgacatcaag 240
tacaatgata agtttaaggg caaggccaca ctgaccgtgg ataggtcctc cagcaccgcc 300
tacatgcagc tgaatagcct gaccagcgag gacagcgccg tgtacttttg taagacatcc 360
acattctttt tcgactactg gggccagggc accacactga ccgtcagctc cggcggcggc 420
ggatctggag gaggaggaag cggcggcggc ggttctgaca tcgtgatgac ccagagcccc 480
tcctccctga ccgtgaccgc cggagagaag gtgaccatga tctgcaagag ctcccagtcc 540
ctgctgaata gcggcgacca gaagaattac ctgacatggt accagcagaa gcctggccag 600
cctcccaagc tgctgatctt ctgggccagc accagggagt ccggcgtgcc tgataggttt 660
acaggcagcg gctccggcac cgacttcaca ctgacaatca gctccgtgca ggccgaggat 720
ctggccgtgt actactgtca gaacgattac agctaccccc tgacctttgg cgccggcacc 780
aagctggagc tgaag 795
<210> 3
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 4
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 4
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 5
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 6
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 7
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Leu Glu Arg Val Lys Phe
35 40 45
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
50 55 60
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
65 70 75 80
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
85 90 95
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
100 105 110
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
115 120 125
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
130 135 140
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
145 150 155
<210> 8
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 8
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactgctcg agagagtgaa gttcagcagg agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc 180
cagaaccagc tctataacga gctcaatcta ggacgaagag aggagtacga tgttttggac 240
aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa 300
ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag atggcggagg cctacagtga gattgggatg 360
aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac gatggccttt accagggtct cagtacagcc 420
accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg caggccctgc cccctcgc 468
<210> 9
<211> 492
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Asp Ala Glu Leu
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Asp His Ala Ile His Trp Val Lys Gln Lys Pro Glu Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Ile Gly His Phe Ser Pro Gly Asn Thr Asp Ile Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Asp Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Arg Ser
85 90 95
Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser
100 105 110
Ala Val Tyr Phe Cys Lys Thr Ser Thr Phe Phe Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro
145 150 155 160
Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly Glu Lys Val Thr Met Ile Cys Lys
165 170 175
Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Gly Asp Gln Lys Asn Tyr Leu Thr
180 185 190
Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Phe Trp
195 200 205
Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp
225 230 235 240
Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe
245 250 255
Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Lys Leu Thr Thr Thr Pro Ala
260 265 270
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
275 280 285
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
290 295 300
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
305 310 315 320
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
325 330 335
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
340 345 350
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
355 360 365
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Leu Glu Arg Val Lys Phe
370 375 380
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu
385 390 395 400
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
405 410 415
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
420 425 430
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
435 440 445
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
450 455 460
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
465 470 475 480
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490
<210> 10
<211> 1479
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 10
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctgcagca gtccgacgcc gagctggtga agcctggcag ctccgtgaag 120
atctcctgca aggccagcgg ctacacattc accgatcacg ccatccactg ggtgaagcag 180
aagcccgagc agggcctgga gtggatcggc cacttttccc ctggcaatac cgacatcaag 240
tacaatgata agtttaaggg caaggccaca ctgaccgtgg ataggtcctc cagcaccgcc 300
tacatgcagc tgaatagcct gaccagcgag gacagcgccg tgtacttttg taagacatcc 360
acattctttt tcgactactg gggccagggc accacactga ccgtcagctc cggcggcggc 420
ggatctggag gaggaggaag cggcggcggc ggttctgaca tcgtgatgac ccagagcccc 480
tcctccctga ccgtgaccgc cggagagaag gtgaccatga tctgcaagag ctcccagtcc 540
ctgctgaata gcggcgacca gaagaattac ctgacatggt accagcagaa gcctggccag 600
cctcccaagc tgctgatctt ctgggccagc accagggagt ccggcgtgcc tgataggttt 660
acaggcagcg gctccggcac cgacttcaca ctgacaatca gctccgtgca ggccgaggat 720
ctggccgtgt actactgtca gaacgattac agctaccccc tgacctttgg cgccggcacc 780
aagctggagc tgaagaagct taccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020
aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080
gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgctcgag 1140
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 1200
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 1260
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 1320
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1380
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1440
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 1479
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 11
cgactggcca gggcgcctgt 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 12
cgtctgggcg gtgctacaac 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 13
tgtagcaccg cccagacgac 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 14
accgcccaga cgactggcca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 15
aggcgccctg gccagtcgtc 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 16
gtctgggcgg tgctacaact 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 17
ggcgccctgg ccagtcgtct 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 18
caccgcccag acgactggcc 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 19
gggcggtgct acaactgggc 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 20
gccctggcca gtcgtctggg 20
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 21
ctacaactgg gctggcggcc 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 22
acgactggcc agggcgcctg 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 23
cggtgctaca actgggctgg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 24
tgcagatccc acaggcgccc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 25
tccaggcatg cagatcccac 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 26
gcctgtggga tctgcatgcc 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 27
aactgggctg gcggccagga 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 28
ggccaggatg gttcttaggt 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 29
tggcggccag gatggttctt 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 30
atgtggaagt cacgcccgtt 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 31
cacgaagctc tccgatgtgt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 32
cctgctcgtg gtgaccgaag 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 33
catgtggaag tcacgcccgt 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 34
cccttcggtc accacgagca 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 35
cggagagctt cgtgctaaac 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 36
gcgtgacttc cacatgagcg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 37
gccctgctcg tggtgaccga 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 38
aggcggccag cttgtccgtc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 39
acttccacat gagcgtggtc 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 40
ggtgccgctg tcattgcgcc 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 41
ccccttcggt caccacgagc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 42
ccctgctcgt ggtgaccgaa 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 43
tctctttgat ctgcgccttg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 44
tgacacggaa gcggcagtcc 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 45
aggtgccgct gtcattgcgc 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 46
gctctctttg atctgcgcct 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 47
ctctctttga tctgcgcctt 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 48
agcttgtccg tctggttgct 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 49
agggcccggc gcaatgacag 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 50
cagcttgtcc gtctggttgc 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 51
gggccctgac cacgctcatg 20
<210> 52
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<400> 52
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgctttt tt 82

Claims (10)

1.一种靶向MUC1的嵌合抗原受体，其特征在于，包括，与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的抗原结合结构域。
2.根据权利要求1所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体，其特征在于，还包括跨膜结构域，共刺激结构域和细胞内信号传导结构域；
优选地，所述跨膜结构域包含来源于选自由以下组成的组的蛋白质的跨膜结构域：CD8、CD28、CD3ε、CD4、CD5、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、TCRα、TCRβ及CD3ζ；更优选地，所述跨膜结构域来源于CD8；最优选地，所述跨膜结构域与SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；
优选地，所述共刺激结构域来源于选自由以下组成的组的蛋白质：CD2、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、LFA-1(CD11a/CD18)、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103、OX40(CD134)、4-1BB(CD137)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、CD160(BY55)、SELPLG(CD162)、DNAM1(CD226)、Ly9(CD229)、SLAMF4(CD244、2B4)、ICOS(CD278)、CEACAM1、CDS、CRTAM、DAP10、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、LAT、淋巴细胞功能相关抗原(LFA-1)；更优选地，所述共刺激结构域来源于选自由以下组成的组的蛋白质：CD27、CD28、4-1BB、OX40、ICOS、CD40、LFA-1；更优选地，所述共刺激结构域来源于4-1BB；最优选地，所述共刺激结构域与SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性；
优选地，所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε，CD5、CD22、CD79a、CD79b或CD66d；更优选地，所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ、CD3γ、CD3δ或CD3ε；更优选地，所述细胞内信号传导结构域来源于CD3ζ；最优选地，所述细胞内信号传导结构域与SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
3.根据权利要求1或2所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体，其特征在于，所述靶向MUC1的嵌合抗原受体包含的氨基酸序列具有与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性。
4.一种分离的核苷酸序列，其特征在于，所述分离的核苷酸序列编码如权利要求1至3任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体。
5.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求4所述的核苷酸序列；优选地，所述载体选自由以下组成的组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或体外转录载体。
6.一种重组或分离的细胞，其特征在于，所述重组或分离的细胞包含如权利要求1至3任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核苷酸序列或如权利要求5所述的载体；优选地，所述重组或分离的细胞还包括抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列；更优选地，所述抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列和选自SEQ ID NO:11～51所示的核苷酸序列中至少一种；最优选地，所述抑制或沉默PD-1基因的核苷酸序列包括SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
7.根据权利要求6所述的重组或分离的细胞，其特征在于，所述重组或分离的细胞是原代人细胞或其他哺乳动物细胞或来源于所述原代人细胞或其他哺乳动物细胞；优选地，所述重组或分离的细胞是免疫细胞，所述免疫细胞任选地选自T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤细胞、嗜酸性粒细胞、NK/T细胞、巨噬细胞及单核细胞；更优选地，所述重组或分离的细胞选自T细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、初始T(TN)细胞、效应T(TEFF)细胞、记忆T细胞、干细胞记忆T(TSCM)细胞、中枢记忆T(TCM)细胞、效应记忆T(TEM)细胞、终末分化的效应记忆T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关不变T(MAIT)细胞、调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞、TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞、α/βT细胞、δ/γT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞及淋巴因子激活的杀伤(LAK)细胞；最优选地，所述重组或分离的细胞是T细胞或T细胞祖细胞；最优选地，所述重组或分离的细胞为PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞。
8.一种治疗受试者中的癌症的方法，其特征在于，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的如权利要求6或7所述的重组或分离的细胞；优选地，向有需要的受试者施用有效量的PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞；优选地，所述癌症为MUC1异常糖基化的癌症；最优选地所述癌症选自肺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌或卵巢癌。
9.一种产生PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)向T淋巴细胞中引入如权利要求1至3任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核苷酸序列或如权利要求5所述的载体，得到靶向MUC1的CAR-T细胞；
2)敲除所述靶向MUC1的CAR-T细胞的PD-1基因。
10.如权利要求1至3任一项所述的靶向MUC1的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的核苷酸序列或如权利要求5所述的载体或如权利要求9所述的产生PD-1基因敲除的靶向MUC1的CAR-T细胞的方法在制备治疗癌症的药物中的应用，优选地，所述癌症为MUC1异常糖基化的癌症；更优选地所述癌症选自肺癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌或卵巢癌。
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