CN117165532A - 具有增强的迁移能力的修饰的细胞 - Google Patents

Abstract

本发明实施方案涉及包含抗原结合分子的修饰的T细胞，其中CDC42在修饰的细胞中的表达和/或功能被增强。在实施方案中，与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，修饰的细胞抗原结合分子响应于其结合的抗原而具有增加的细胞因子释放水平。在实施方案中，细胞因子释放包括IFNγ细胞因子的释放。在实施方案中，与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，修饰的细胞对趋化因子具有增强的迁移能力。

Description

具有增强的迁移能力的修饰的细胞

本申请是针对申请号为201911203998.4发明专利申请的分案申请，原申请的申请日为：2019年11月29日，优先权号为CN201811440257.3，优先权日为2018年11月29日，发明创造名称为：具有增强的迁移能力的修饰的细胞，原申请的全部内容以引用的方式并入本申请。

技术领域

本公开涉及与嵌合抗原受体细胞有关的组合物和方法及其在治疗包括癌症在内的疾病中的用途。

背景技术

癌症被称为恶性肿瘤，涉及异常细胞生长，并有可能侵袭或扩散到身体的其他部位。在人类中，有一百多种癌症。通常，一旦癌细胞脱落，它们就会通过血液和/或淋巴系统扩散到整个身体，从而危及生命。当前，CAR-T疗法似乎对治疗实体癌无效。挑战之一是CAR-T细胞似乎无法有效地向扩散到体内的这些癌细胞迁移。

发明内容

实施方案涉及包含抗原结合分子修饰的T细胞，其中CDC42在修饰的细胞中的表达和/或功能已经增强。在实施方案中，与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，修饰的细胞响应于抗原结合分子结合的抗原而具有增加的细胞因子释放水平。在实施方案中，细胞因子释放包括IFNγ或GRAM B的细胞因子释放。在实施方案中，与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，修饰的细胞对趋化因子具有增强的迁移能力。

本发明内容不旨在标识所要求保护的主题的关键特征或必要特征，也不旨在用于限制所要求保护的主题的范围。

附图说明

参照附图描述具体实施方式。在不同附图中使用相同的参考数字表示类似或相同的项目。

图1显示了CAR构建体的实例和CAR T细胞的实例；

图2显示了细胞计数测定结果，表明CDC42序列不影响CAR在T细胞上的表达；

图3显示了细胞计数测定结果，表明CDC42序列不影响CAR T细胞的活化；

图4显示了CDC42表达增强了CAR活化后GRAM B和IFN-γ的释放；

图5显示CDC42在CAR T细胞中成功表达；

图6显示表达CDC42的GUCY2C CAR T细胞的迁移能力明显强于对照组；

图7显示了指示ShRNA1序列不影响CAR在T细胞上的表达的细胞计数分析结果，并且还显示了指示ShRNA1序列不影响CAR T细胞的活化的细胞计数分析结果；

图8显示ShRNA1表达增强了Gram B和IFN-γ的释放。

具体实施方式

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管可以在本公开的实践或测试中使用与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料，但是还是描述了优选的方法和材料。为了本公开的目的，以下术语定义如下。

本文使用冠词“一个/种(a/an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元件/要素”表示一个元件/要素或多于一个元件/要素。

“约”是指数量，水平，数值，数目，频率，百分比，尺寸，大小，量，重量或长度相对于参考数量，水平，数值，数目，频率，百分比，尺寸，大小，量，重量或长度变化多达20％,15％,10％,9％,8％,7％,6％,5％,4％,3％,2％或1％。

如本文所用，术语“活化”或“激活”是指已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的细胞状态。活化或激活还可以与诱导的细胞因子产生可检测的效应子功能相关联。术语“活化(或激活的)的T细胞”特别指正在进行细胞分裂的T细胞。

术语“抗体”以最广义使用，是指单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物学活性或功能即可。本公开内容中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab、Fab'和F(ab)₂及其片段；以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等人,1999,In:UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等人,1989,In:Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等人,1988,Science242:423-426)。

术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，例如抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的其他实例包括Fab，Fab'，F(ab')₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。

术语“Fv”是指含有完整抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段由紧密，非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。通过这两个结构域的折叠，产生了六个高变环(每3个环各自来自H和L链)，其贡献了用于抗原结合的氨基酸残基并赋予了对抗体的抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包括对抗原具有特异性的三个互补决定区(CDR)的Fv的一半)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力低于整个结合位点(二聚体)。

如本文所用，“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的一种。如本文所用，“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的一种。κ和λ轻链是指两种主要抗体轻链同种型。

术语“合成抗体”是指使用重组DNA技术产生的抗体，例如由噬菌体表达的抗体。该术语还包括通过合成编码抗体的DNA分子和表达DNA分子以获得抗体或获得编码抗体的氨基酸而产生的抗体。使用本领域可获得且众所周知的技术获得合成DNA。

术语“抗原”是指引起免疫应答的分子，其可以涉及抗体产生或特异性免疫能力细胞的活化或两者。抗原包括任何大分子，所述大分子包括所有蛋白质或肽，或衍生自重组或基因组DNA的分子。例如，包含编码引起免疫应答的蛋白质或肽的核苷酸序列或部分核苷酸序列的DNA，因此编码如本文所用的术语“抗原”。抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。抗原可以从生物样品中生成、合成或衍生自生物样品，所述生物样品包括组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

如本文所用，术语“抗肿瘤作用”是指与肿瘤体积减少、肿瘤细胞数目减少、转移数目减少、肿瘤细胞增殖减少、肿瘤细胞存活减少、具有肿瘤细胞的受试者的预期寿命增加或与癌症状况相关的各种生理症状的改善有关的生物学作用。首先，也可以通过肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤发生方面的能力来表现出“抗肿瘤作用”。

术语“自体抗原”是指被免疫系统误认为外来抗原的内源性抗原。自体抗原包括细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，包括细胞表面受体。

术语“自体”用于描述来自同一受试者的材料，其随后被重新引入同一受试者。

术语“同种异体”用于描述衍生自相同物种的不同受试者的移植物。作为例子，供体受试者可以是相关或不相关的或受体受试者，但供体受试者具有与受体受试者相似的免疫系统标志物。

术语“异种”用于描述衍生自不同物种的受试者的移植物。例如，供体受试者来自与受体受试者不同的物种，供体受试者和受体受试者可以是遗传学上和免疫学上不相容的。

术语“癌症”用于指以异常细胞的快速和不受控制的生长为特征的疾病。癌细胞可以局部或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其他部位。各种癌症的实例包括乳腺癌，前列腺癌，卵巢癌，宫颈癌，皮肤癌，胰腺癌，结肠直肠癌，肾癌，肝癌，脑癌，淋巴瘤，白血病，肺癌等。

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”，“包括”和“包括”将被理解为暗示包括所述步骤或要素或步骤或要素的组合，但不排除任何其他步骤或要素或步骤或要素的组合。

短语“由...组成”意味着包括并且限于在短语“由...组成”之后的任何内容。因此，短语“由...组成”表示列出的要素是必需的或强制性的，并且可以不存在其它要素。

短语“基本上由......组成”意味着包括在该短语之后列出的任何要素，并且可以包括不干扰或有助于本公开中针对所列要素指定的活动或行动的其他要素。因此，短语“基本上由......组成”表示所列出的要素是必需的或强制性的，但是其他要素是任选的，并且可以存在或不存在，这取决于它们是否影响所列要素的活性或动作。

术语“互补的”和“互补”是指通过碱基配对规则相关的多核苷酸(即核苷酸序列)。例如，序列“AGT”与序列“TCA”互补。互补可以是“部分的”，其中仅某些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配，或者可存在“核酸之间的“完全”或“全部”互补。核酸链之间的互补程度对核酸链之间的杂交效率和强度具有重要影响。

术语“对应于”或“对应”是指(a)具有与参考多核苷酸序列的全部或一部分基本上相同或互补或编码与肽或蛋白质中氨基酸序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸；或(b)具有与参考肽或蛋白质中的氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的肽或多肽。

术语“共刺激配体”是指抗原呈递细胞(例如，APC，树突状细胞，B细胞等)上的分子，其与T细胞上的同源共刺激分子特异性结合，从而提供除了由例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子结合提供的主要信号外的一种信号，所述信号还介导T细胞应答，包括增殖、激活、分化和其他细胞应答的至少一种。共刺激配体可以包括B7-1(CD80)，B7-2(CD86)，PD-L1，PD-L2、4-1BBL，OX40L，诱导型共刺激配体(ICOS-L)，细胞间粘附分子(ICAM)，CD30L，CD40，CD70，CD83，HLA-G，MICA，MICB，HVEM，淋巴毒素β受体，3/TR6，ILT3，ILT4，HVEM，CD7的配体、与Toll配体受体结合的激动剂或抗体以及与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体还特别包括与T细胞上存在的共刺激分子特异性结合的激动剂或抗体，例如CD27，CD28、4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3以及与CD83特异性结合的配体。

术语“共刺激分子”是指T细胞上的同源结合配偶体，其与共刺激配体特异性结合，由此介导T细胞的共刺激应答，例如增殖。共刺激分子包括MHCⅠ类分子，BTLA和Toll样受体。

术语“共刺激信号”是指与主要信号(例如TCR/CD3连接)结合而导致T细胞增殖和/或关键分子上调或下调的信号。术语“疾病”和“病症”可以互换使用，也可以不同，因为特定的疾病或病症可能没有已知的病原体(因此病因尚未得到解决)，因此尚未被认为是一种公认的疾病，仅是一种不良状况或综合症，其中临床医生已识别出或多或少的特定症状的集合。术语“疾病”是受试者的健康状态，其中受试者不能维持体内稳态，并且其中如果疾病没有得到改善，则受试者的健康继续恶化。相比之下，受试者的“病症”是一种健康状态，其中动物能够维持体内平衡，但是其中动物的健康状态要比没有该疾病的情况下不利。如果不及时治疗，病症不一定会导致动物健康状况进一步下降。

术语“有效”是指足以实现期望的、预计的或预期的结果。例如，治疗背景下的“有效量”可以是足以产生治疗或预防益处的化合物的量。

术语“编码”是指多核苷酸例如基因，cDNA或mRNA中特定核苷酸序列在生物过程中用作合成其他聚合物和大分子的模板的固有特性，所述生物过程具有确定的核苷酸序列(即rRNA，tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列和由此产生的生物学特性。因此，如果对应于该基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物系统中产生蛋白质，则所述基因编码蛋白质。编码链、与mRNA序列相同(除了“T”被“U”代替)的核苷酸序列通常提供在序列表中，并且用作基因或cDNA的转录模板的非编码链，可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白质或其他产物。

术语“外源的”是指并非天然存在于野生型细胞或生物中，但通常通过分子生物学技术引入细胞中的分子。外源多核苷酸的实例包括编码所需蛋白质的载体，质粒和/或人造核酸的构建体。关于多核苷酸和蛋白质，术语“内源的”或“天然的”是指可以在给定的野生型细胞或生物体中发现的天然存在的多核苷酸或氨基酸序列。同样，从第一生物体中分离并通过分子生物学技术转移至第二生物体的特定多核苷酸序列通常被认为是关于第二生物体的“外源”多核苷酸或氨基酸序列。在具体的实施方案中，可以通过分子生物学技术将多核苷酸序列“引入”已经含有这种多核苷酸序列的微生物中，以产生原本天然存在的多核苷酸序列的一个或多个另外的拷贝，并且由此有助于编码多肽的过表达。

术语“表达或过表达”是指例如由其启动子驱动的特定核苷酸序列转录和/或翻译成前体或成熟蛋白。“过表达”是指基因产物在转基因生物或细胞中的产量超过正常或非转化生物或细胞中的产量。如本文所定义，术语“表达”是指表达或过表达。

术语“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制(调节)序列。表达载体包括足够的顺式作用要素用于表达；用于表达的其他要素可以由宿主细胞或体外表达系统提供。表达载体包括本领域已知的所有载体，例如粘粒，质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和掺入重组多核苷酸的病毒(例如，慢病毒，逆转录病毒，腺病毒和腺相关病毒)。

术语“同源的”是指当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚基占据时，两个多肽之间或两个多核苷酸之间的序列相似性或序列同一性，例如，如果两个DNA分子中的每一个中的一个位置被腺嘌呤占据，那么该分子在该位置同源。两个序列之间的同源性百分比是两个序列共有的匹配或同源位置数除以相比的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配的或同源的，那么这两个序列是60％同源的。举例来说，DNA序列ATTGCC和TATGGC具有50％的同源性。当两个序列比对时进行比较，以得到最大同源性。

术语“免疫球蛋白”或“Ig”是指起抗体作用的一类蛋白质。包括在这类蛋白质中的五个成员是IgA，IgG，IgM，IgD和IgE。IgA是存在于体内分泌物中的一级抗体，例如唾液，泪液，母乳，胃肠分泌物和呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物。IgG是最常见的循环抗体。IgM是大多数受试者在初次免疫应答中产生的主要免疫球蛋白，它是凝集、补体固定和其他抗体反应中最有效的免疫球蛋白，并且对于防御细菌和病毒方面很重要。IgD是免疫球蛋白，其没有已知的抗体功能，但可以作为抗原受体。IgE是免疫球蛋白，其通过在暴露于过敏原时引起肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介质而介导速发型超敏反应。

术语“分离的”是指基本上或实质上不含在其天然状态下通常伴随的组分的材料。该材料可以是细胞或大分子，如蛋白质或核酸。例如，如本文所用的“分离的多核苷酸”是指已经从天然存在状态的侧翼序列中纯化的多核苷酸，例如已经从通常与片段相邻的正常序列中去除的DNA片段。或者，本文所用的“分离的肽”或“分离的多肽”等是指从其天然细胞环境以及从其与细胞的其他组分的缔合中体外分离和/或纯化的肽或多肽分子。

术语“基本上纯化的”是指基本上不含通常与其天然状态相关的组分的物质。例如，基本上纯化的细胞是指已经与其通常以其天然存在或天然状态相关联的其他细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群是指同质的细胞群。在其他情况下，该术语仅指已经从与其天然状态下天然相关的细胞中分离的细胞。在一些实施方案中，细胞在体外培养。在其他实施方案中，细胞不在体外培养。

在本公开的上下文中，使用下列普遍存在的核酸碱基的缩写。“A”指的是腺苷酸，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷酸，“T”指的是胸腺嘧啶，以及“U”指的是尿苷酸。

除非另有说明，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此互为简并形式并且编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或RNA的核苷酸序列也可包括内含子，在一定程度上编码蛋白质的核苷酸序列可在某些形式中包含一个或多个内含子。

术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞。它们可以将大量遗传信息传递到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因传递载体中最有效的方法之一。此外，慢病毒的使用能够将遗传信息整合到宿主染色体中，从而稳定地转导遗传信息。HIV，SIV和FIV都是慢病毒的例子。源自慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。

术语“调节”是指与不存在治疗或化合物的情况下受试者的反应水平相比，和/或与受试者的水平相比，和/或与其他相同但未治疗的受试者中的应答水平进行比较，在受试者中应答水平可检测到的增加或减少。该术语包括干扰和/或影响天然信号或反应，从而在受试者，优选人中介导有益的治疗反应。

当核酸与另一个多核苷酸处于功能关系时，核酸被“可操作地连接”。例如，如果前序列或分泌前导序列的DNA表达为参与多肽分泌的前蛋白，则该DNA可操作地连接至该多肽的DNA。如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地与其连接；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点被可操作地连接至编码序列。

术语“在转录控制下”是指启动子可操作地连接至多核苷酸并且处于与多核苷酸相关的正确位置和方向上，以控制(调节)RNA聚合酶的转录起始和多核苷酸的表达。

术语“过度表达”的肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”旨在表示相对于来自特定组织或器官的正常细胞中的表达水平，来自疾病区域的细胞中肿瘤抗原的异常表达水平，所述疾病区域为例如患者相关的特定组织或器官内的实体肿瘤。可以通过本领域已知的标准测定来确定患有特征为肿瘤抗原过表达的实体瘤或血液恶性肿瘤的患者。

可以治疗的癌症包括未血管化或尚未充分血管化的肿瘤以及血管化肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如血液肿瘤，例如白血病，淋巴瘤和多发性骨髓瘤)，或者可以包括实体瘤。用本公开的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌瘤，母细胞瘤和肉瘤，以及某些白血病或淋巴样恶性肿瘤，良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤，癌瘤和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。

血液性癌症为血液或骨髓的癌症。血液性(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性白血病、早幼粒细胞性白血病、骨髓单核单核细胞性白血病、单核细胞性白血病和红血球性白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(惰性和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。

实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤，癌瘤和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌瘤的实例包括纤维肉瘤，粘液肉瘤，脂肪肉瘤，软骨肉瘤，骨肉瘤和其他肉瘤，滑膜瘤，间皮瘤，尤因氏瘤，平滑肌肉瘤，横纹肌肉瘤，结肠癌，淋巴恶性肿瘤，胰腺癌，乳腺癌，肺癌，卵巢癌，前列腺癌，肝细胞癌，鳞状细胞癌，基底细胞癌，腺癌，汗腺癌，甲状腺髓样癌，乳头状甲状腺癌，嗜铬细胞瘤皮脂腺癌，乳头状癌，乳头状腺癌，髓样癌，支气管癌，肾细胞癌，肝癌，胆管癌，绒毛膜癌，肾母细胞瘤，宫颈癌，睾丸肿瘤，精原细胞瘤，膀胱癌，黑色素瘤和中枢神经系统肿瘤(如神经胶质瘤(如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤))，胶质母细胞瘤(也是称为多形性胶质母细胞瘤)，星形胶质细胞瘤，中枢神经系统淋巴瘤，生殖细胞瘤，髓母细胞瘤，神经鞘瘤，颅咽管瘤，室管膜瘤，松果体瘤，血管母细胞瘤，听神经瘤，少突神经胶质瘤，脑膜瘤，神经母细胞瘤，视网膜母细胞瘤和脑转移瘤。

实体瘤抗原是在实体瘤上表达的抗原。在实施方案中，实体瘤抗原还以低水平在健康组织上表达。表1提供了实体瘤抗原及其相关疾病肿瘤的实例。

表1

组合物的术语“肠胃外施用”包括例如皮下(sc)，静脉内(iv)，肌内(im)，胸骨内注射或输注技术。

术语“患者”，“受试者”和“个体”等在本文可互换使用，是指适合本文所述方法的任何人或动物。在某些非限制性实施方案中，患者、受试者或个体是人或动物。在实施方案中，术语“受试者”旨在包括其中可以引发免疫应答的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人和动物，例如狗，猫，小鼠，大鼠及其转基因物种。

需要治疗或其有需要的受试者包括患有需要治疗的疾病、病状或病症的受试者。需要其的受试者还包括需要治疗以预防疾病、病状或病症的受试者。在实施方案中，所述疾病、病状或病症是癌症。

术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA，RNA，cRNA，rRNA，cDNA或DNA。该术语通常是指长度为至少10个碱基的聚合形式的核苷酸，核糖核苷酸或脱氧核苷酸或任一类型核苷酸的修饰形式。该术语包括所有形式的核酸，包括单链和双链形式的核酸。

术语“多核苷酸变体”和“变体”等是指与参考多核苷酸序列显示出基本序列同一性的多核苷酸或在下文定义的严格条件下与参考序列杂交的多核苷酸。这些术语还包括通过添加、缺失或取代至少一个核苷酸而与参考多核苷酸不同的多核苷酸。因此，术语“多核苷酸变体”和“变体”包括其中一个或多个核苷酸已被添加或缺失或被不同核苷酸取代的多核苷酸。就这一点而言，本领域众所周知的是，可以对参照多核苷酸进行包括突变、添加、缺失和取代的某些改变，由此改变的多核苷酸保留参照多核苷酸的生物学功能或活性或具有与参考多核苷酸的具有增加的活性(即优化的)。多核苷酸变体包括例如与本文描述的参考多核苷酸序列具有至少50％(以及至少51％至至少99％以及其间的所有整数百分比，例如90％，95％或98％)序列同一性的多核苷酸。术语“多核苷酸变体”和“变体”还包括天然存在的等位基因变体和直系同源物。

术语“多肽”，“多肽片段”，“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物以及其变体和合成类似物。因此，这些术语适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。在某些方面，多肽可以包括通常催化(即增加各种化学反应的速率)多种化学反应的酶促多肽或“酶”。

术语“多肽变体”是指通过添加、缺失或取代至少一个氨基酸残基而与参考多肽序列区分的多肽。在某些实施方案中，通过一个或多个取代将多肽变体与参考多肽区分开来，所述取代可以是保守的或非保守的。在某些实施方案中，多肽变体包含保守取代，并且就此而言，本领域中众所周知可以将一些氨基酸改变为具有广泛相似性质的氨基酸，而不改变多肽活性的性质。多肽变体还包括其中一个或多个氨基酸已被添加或缺失或被不同氨基酸残基取代的多肽。

术语“启动子”是指被细胞的合成机制识别或引入的合成机制，启动多核苷酸序列的特异性转录所需要的DNA序列。术语“表达控制(调节)序列”是指在特定宿主生物中表达可操作连接的编码序列所必需的DNA序列。适用于原核生物的控制(调节)序列例如包括启动子，任选地操纵子序列和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。

术语“结合”或“与...相互作用”是指识别并粘附于样品或生物体中的第二分子但基本上不识别或粘附于样品中的其他结构上不相关分子的分子。如本文关于抗体所用的术语“特异性结合”是指识别特定抗原但基本上不识别或结合样品中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可以结合来自一个或多个物种的抗原。但是，这种跨物种反应性本身并不会改变抗体分类的特异性。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可以结合不同等位基因形式的抗原。然而，这种交叉反应性本身并不会改变抗体分类的特异性。在一些情况下，术语“特异性结合”或“特异性地结合”可用于指抗体、蛋白质或肽与第二化学物质的相互作用，意味着相互作用取决于化学物种上的特定结构(例如，抗原决定簇或表位)存在；例如，抗体识别并结合特定的蛋白质结构而不是结合任何蛋白质。如果抗体对表位“A”具有特异性，则在含有标记的“A”和抗体的反应中，存在含有表位A的分子(或游离的，未标记的A)将减少与抗体结合的标记A的量。

“统计上显著”意味着结果不可能偶然发生。统计显著性可通过本领域已知的任何方法确定。常用的显著性度量包括p值，即如果零假设为真时观察事件发生的频率或概率。如果获得的p值小于显著性水平，则拒绝零假设。在简单的情况下，显著性水平定义为p值为0.05或更小。“减少”或“降低”或“较少”量通常是“统计学上显著的”或生理学上显著的量，并且可以包括约1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、15、20、30、40或50倍或更多倍(例如100、500、1000倍)(包括介于1和大于1的的所有小数和整数，例如1.5、1.6、1.7、1.8等。)本文描述的数量或水平的减少量。

术语“刺激”是指由刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与其同源配体结合而诱导的初级应答，由此介导信号转导事件，例如经由TCR/CD3复合物的信号转导。刺激可以介导某些分子的表达的改变，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的重组。

术语“刺激性分子”是指T细胞上与存在于抗原呈递细胞上的同源刺激性配体特异性结合的分子。例如，源自刺激分子的功能性信号传导域是与T细胞受体复合物相关的ζ链。刺激分子包括负责信号转导的结构域。

术语“刺激配体”是指所述配体当存在于抗原呈递细胞(例如，APC，树突状细胞，B细胞等)上时，可以与细胞例如T细胞上的同源结合配偶体(称为“刺激分子”)特异性结合，从而介导T细胞的初级应答，包括激活、免疫应答的起始、增殖和类似过程。刺激配体，在本领域中是众所周知的，包括装载有肽，抗CD3抗体，抗CD28抗体超激动剂和抗CD2抗体超激动剂的MHC I类分子。

术语“治疗的”是指治疗和/或预防。通过抑制，减轻或消除疾病状态或减轻疾病状态的症状可获得治疗效果。

术语“治疗有效量”是指将在组织、系统或受试者中引起研究者、兽医、医生或另一临床医生预期的生物学或医学反应时的本发明的化合物的量。术语“治疗有效量”包括当给药时足以防止所治疗的疾病或疾病的一种或多种迹象或症状的发展或在某种程度上使其减轻的化合物的量。治疗有效量将取决于化合物、疾病及其严重性以及待治疗受试者的年龄、体重和其他因素。

术语“治疗疾病”是指降低受试者经历的疾病或病症的至少一种病征或症状的频率或严重程度。

术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。所述细胞包括原代受试细胞及其后代。

术语“载体”是指包含分离的核酸并且可用于将分离的核酸递送至细胞内部的多核苷酸。本领域已知许多载体，包括线性多核苷酸，与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还包括促进核酸转移到细胞中的非质粒和非病毒化合物，例如聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体等。例如，慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了常见的逆转录病毒基因gag，pol和env之外，还包含具有调节或结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域熟知的。慢病毒的一些实例包括人类免疫缺陷病毒：HIV-1，HIV-2和猿猴免疫缺陷病毒：SIV。通过多次减毒HIV毒力基因产生慢病毒载体，例如，使基因env，vif，vpr，vpu和nef缺失，使得载体在生物学上是安全的。

范围：在整个本公开中，本公开的各个方面可以以范围格式给出。应当理解，范围格式的描述仅是为了方便和简洁，并且不应当被解释为对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应被认为具有具体公开的所有可能的子范围以及处于所述范围内的单个数值。例如，范围的描述诸如从1至6应被认为具有具体公开的子范围诸如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及所述范围内的单个数值，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点都是适用的。

“嵌合抗原受体”(CAR)分子是至少包括细胞外结构域，跨膜结构域和细胞质结构域或细胞内结构域的重组多肽。在一些实施方案中，CAR的结构域在相同的多肽链上，例如，嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，结构域在不同的多肽链上，例如，结构域不连续。

CAR分子的细胞外结构域包括抗原结合结构域。在实施方案中，抗原结合结构域结合B细胞表面上的抗原，例如细胞表面分子或标记物。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子包括CD19，CD22，CD20，BCMA，CD5，CD7，CD2，CD16，CD56，CD30，CD14，CD68，CD11b，CD18，CD169，CD1c，CD33，CD38，CD138，或CD13。在实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19，CD20，CD22或BCMA。在特定的实施方案中，B细胞的细胞表面分子是CD19。

在实施方案中，抗原结合结构域在肿瘤表面上结合抗原，例如肿瘤抗原或肿瘤标志物。肿瘤抗原是由肿瘤细胞产生的蛋白质，其引起免疫反应，特别是T细胞介导的免疫反应。肿瘤抗原是本领域众所周知的，并且包括例如肿瘤相关的MUC1(tMUC1)、神经胶质瘤相关的抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺激素、α甲胎蛋白(AFP)、凝集素反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人类端粒酶逆转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧基酯酶、muthsp70-2、M-CSF、蛋白酶、前列腺特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-1a、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性粒细胞弹性蛋白酶、ephrinB2，CD22，胰岛素生长因子(IGF)-I，IGF-II，IGF-I受体和间皮素。例如，当肿瘤抗原是CD19时，其CAR可以被称为CD19CAR，而包含CD19CAR的T细胞可以被称为CART19细胞或CD19CAR T细胞。

在实施方案中，CAR的细胞外抗原结合结构域包含至少一个scFv或至少一个单结构域抗体。例如，CAR上可以有两个scFv。scFv包括通过柔性接头连接的靶抗原特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)。可以通过使用短连接肽连接轻链和/或重链可变区来制备单链可变区片段(Bird等，Science 242：423-426，1988)。连接肽的例子是具有氨基酸序列(GGGGS)₃(SEQ ID NO：2)的GS接头，其在一个可变区的羧基末端和另一可变区的氨基末端之间桥接约3.5nm。已经设计和使用了其他序列的接头(Bird等，1988，同上)。通常，接头可以是短的柔性多肽，并且优选包含约20个或更少的氨基酸残基。单链变体可以重组或合成产生。对于scFv的合成产生，可以使用自动合成仪。针对重组产生scFv，可以将合适的含有编码scFv的多核苷酸的质粒引入合适的宿主细胞，所述宿主细胞可以是真核生物，例如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞，或原核生物，例如大肠杆菌。编码目的scFv的多核苷酸可以通过常规操作例如多核苷酸的连接来制备。可以使用本领域已知的标准蛋白质纯化技术分离所得的scFv。

在实施方案中，本文所述的CAR分子包含用于结合目标抗原的一个或多个CDR，例如，用于结合CD19或tMUC1的一个或多个CDR。

本文描述的CAR分子的细胞质结构域包括一个或多个共刺激结构域和一个或多个信号传导结构域。共刺激和信号传导结构域用于响应抗原结合而传递信号并激活分子，例如T细胞。一个或多个共刺激结构域衍生自刺激分子和/或共刺激分子，并且信号结构域衍生自主信号传导结构域，例如CD3ζ结构域。在实施方案中，信号传导结构域还包括衍生自共刺激分子的一个或多个功能信号传导结构域。在实施方案中，共刺激分子是激活对抗原的细胞应答所需的细胞表面分子(抗原受体或其配体除外)。

在实施方案中，共刺激结构域包括CD27，CD28、4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特异性结合CD83的配体或其任何组合的细胞内结构域。在实施方案中，信号传导域包括衍生自T细胞受体的CD3ζ域。

在实施方案中，CAR的细胞质结构域仅包括一个或多个刺激结构域而没有信号传导结构域。

CAR分子还包括跨膜结构域。在CAR分子中掺入跨膜结构域使分子稳定。在实施方案中，CAR分子的跨膜结构域是CD28或4-1BB分子的跨膜结构域。

在CAR的细胞外结构域和跨膜结构域之间，可以掺入间隔结构域。如本文所用，术语“间隔结构域”通常是指用于将跨膜结构域连接至多肽链上的细胞外结构域或细胞质结构域的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括高达300个氨基酸，优选10至100个氨基酸，最优选25至50个氨基酸。

CAR分子和治疗剂

本公开内容描述了一种细胞，该细胞经修饰以表达一种或多种分子，使该分子的表达水平高于或低于未被修饰以表达一种或多种分子的细胞所表达的所述一种或多种分子的水平，其中所述的一种或多种更多的分子与细胞迁移有关。实施方案还描述了经修饰以表达抗原结合分子的修饰细胞，其中已增强或降低了修饰细胞中所述一个或多个分子的表达和/或功能，其中所述的一个或多个分子与细胞迁移有关。在一些实施方案中，修饰的细胞包含与所述一个或多个分子的生物合成或转运途径相关的内源基因的破坏或外源基因的添加。

术语细胞等的“运输能力”和“迁移能力”在本文中可互换使用，是指细胞(例如T细胞)响应于例如趋化因子和刺激(例如肿瘤环境)而迁移的能力。趋化因子的实例可包括CCL1，CCL5，CCL2，CCL22，CCL17，CXCL9，CXCL10和CXCL11。例如，在迁移分析中，CDC42过表达或LRCH1表达降低的修饰T细胞显示出增强的迁移能力。如以下实施例中所示，修饰的细胞迁移或运输到含有CCL5的培养基的数量大于既不过度表达CDC42也不降低LRCH1表达的T细胞的数量。

实施方案描述了多核苷酸的方法或用途，该方法包括提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV，慢病毒或其变体)，该载体基因组包含编码一种或多种分子的多核苷酸和编码结合分子的多核苷酸，多核苷酸可操作地连接至表达控制要素，以赋予多核苷酸转录；向受试者施用一定量的病毒颗粒，以使多核苷酸在受试者中表达，其中所述一种或多种分子与细胞迁移相关。在一些实施方案中，AAV制剂可以包括AAV载体颗粒，空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供了基本上不含AAV空衣壳的AAV产物。

实施方案描述了包含本文修饰的细胞群体的药物组合物。实施方案还描述了在有需要的受试者中引起或引发T细胞应答和/或治疗该受试者的肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的药物组合物。实施方案还描述了分离的核酸序列，其编码与细胞迁移相关的一种或多种分子。

在一些实施方案中，所述一种或多种分子包含DOCK8、CDC42和LRCH1中的至少一种，一种或多种分子的功能性变体或一种或多种分子的功能性片段。在一些实施方案中，所述一种或多种分子是或包含CDC42，其在修饰的T细胞中过表达。在一些实施方案中，所述一种或多种分子是或包含LRCH1，其在修饰的T细胞中表达降低。在一些实施方案中，修饰的细胞包含编码SEQ ID NO：43和/或39的重组多核苷酸。在一些实施方案中，修饰的细胞包含包含SEQ ID NO：38的重组多核苷酸。在一些实施方案中，修饰的细胞包含编码SEQ ID NO：43和编码抗原结合分子(例如，CAR)的重组多核苷酸。在一些实施方案中，修饰的细胞包含重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含SEQ ID NO：38和编码抗原结合分子(例如，CAR)。在一些实施方案中，修饰的细胞包含SEQ ID NO：44-47中的至少一个。

细胞分裂控制蛋白42的同源物，也称为Cdc42，是一种参与细胞周期调控的蛋白。它最初在酿酒酵母(酵母)中被鉴定为细胞分裂的介体，现在已知它会影响从酵母到哺乳动物的各种生物体中的各种信号传递事件和细胞过程。DOCK8(胞质分裂抑制剂8)，也称为Zir3，是一种参与细胞内信号传导网络的大蛋白(约190kDa)，是鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEFs)DOCK家族DOCK-C亚家族的成员，充当小G蛋白的激活剂。富含亮氨酸的重复序列和含钙蛋白同源性域的蛋白1(LRCH1)包含一个富含亮氨酸的重复序列和钙递蛋白同源性域，并可能通过阻止CDC42-鸟嘌呤交换因子DOCK8，可能是通过阻止CDC42活化，从而作为GTPaseCDC42的负调节剂，并负面调节CD4+T细胞迁移。

在实施方案中，多核苷酸可以整合到修饰的细胞的基因组中，并且修饰的细胞的后代也将表达多核苷酸，从而产生稳定转染的修饰的细胞。在实施方案中，修饰的细胞可以表达编码CAR的多核苷酸，但是多核苷酸不整合到修饰的细胞的基因组中，使得修饰的细胞在有限的时间段(例如几天)表达瞬时转染的多核苷酸。之后多核苷酸通过细胞分裂或其他细胞过程而丢失。例如，多核苷酸以重组DNA构建体，mRNA或病毒载体的形式存在于修饰的细胞中，和/或多核苷酸是不整合到修饰的细胞的基因组中的mRNA。

实施方案涉及本文描述的多核苷酸的方法或用途。所述方法或用途包括：提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV，慢病毒或其变体)，所述载体基因组包含所述多核苷酸，其中所述多核苷酸可操作地连接至赋予所述多核苷酸转录的表达控制要素；向受试者施用一定量的病毒颗粒，以使多核苷酸在受试者中表达。在实施方案中，AAV制剂包括AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供了基本上不含AAV空衣壳的AAV产物。病毒颗粒的给药和制备的更多信息可以在美国专利号：9840719，以及Milani等人发表的Sci.Transl.Med.11,eaav7325(2019)，2019年5月22日一问中找到，其通过引用并入本文。

在实施方案中，可以用细胞活力大于95％的细胞以约0.5×10⁶细胞/mL的密度接种至生物反应器。当细胞密度达到约1.0×10⁶细胞/mL时，可以用聚乙烯亚胺(PEI)/DNA复合物(多聚体)转染细胞，所述PEI与DNA的比率为2：1。在收获时，可以使用Triton X-100方法释放生物反应器中细胞培养物中的AAV。可以将所有溶液直接添加到生物反应器中，并将裂解物以4000×g离心20分钟。上清液可以储存在-80℃下用于进行进一步处理。AAV可以被进一步纯化。例如，可以通过分别使用1、5、7和5mL的浓度梯度分别为15％、25％、40％和54％的一系列碘克沙醇溶液覆盖AAV样品(12.3mL)来纯化。15％碘克沙醇浓度的溶液中还包含1M NaCl，以避免AAV与其他细胞蛋白和带负电荷的核成分聚集。离心完成后，可在标记为40/54的界面下方2毫米处抽出5mL溶液，然后在Sorval超速离心机中的Sorvals T-865转子中以385,000×g的速度超速离心1小时45分钟。然后可以对病毒载体定量。例如，在所有情况下，都可以使用GFP作为报告基因，通过基因转移测定(GTA)确定载体AAV的感染性。AAV感染性测定中，在将样品添加到细胞之前先对其进行稀释，使GFP阳性细胞在2％至20％的范围内，以确保只有一个病毒进入细胞以表达GFP。GFP阳性细胞可以使用悬浮液中的HEK293细胞通过FACS定量。然后可以将AAV施用给实验对象。例如，可以将AAV稀释于0.9％的无菌NaCl盐溶液(补充有0.25％的人血清白蛋白[HSA])中，以向患者输注，并且可以根据患者的体重以3mL/kg计算出最终输注体积。

在一些实施方案中，修饰的细胞包含抗原结合分子，并且抗原结合分子是CAR，其包含抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域选自：TSHR，CD19，CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA，Tn Ag，PSMA，ROR1，FLT3，FAP，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT，IL-13Ra2，间皮素，IL-11Ra，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-beta，SSEA-4，CD20，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，Prostase，PAP，ELF2M，Ephrin B2，IGF-1受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，邻乙酰基GD2，叶酸受体β，TEM1/CD248，TEM7R，CLDN6，GPRC5D，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，聚唾液酸，PLAC1，GloboH，NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR20，LY6K，OR51E2，TARP，WT1，NY-ESO-1，LAGE-1a，MAGE-A1，legumain，HPV E6，E7，MAGE A1，ETV6-AML，精子蛋白17，XAGE1，Tie 2，MAD-CT-1，MAD-CT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，prostein，存活素和端粒酶，PCTA-1/Galectin 8，MelanA/MART1，Ras突变体，hTERT，肉瘤易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PAX3，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK，AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人类端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，肠羧基酯酶，mut hsp70-2，CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2，LY75，GPC3，FCRL5和IGLL1。在一些实施方案中，细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域，或初级信号传导域和共刺激信号传导域，其中所述共刺激信号传导域包括选自以下的蛋白质的功能性信号传导域：CD27，CD28、4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特异性结合CD83，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8alpha，CD8beta，IL2R beta，IL2R gamma，IL7R alpha，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELLPG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46和NKG2D的配体。

在一些实施方案中，修饰的细胞包含抗原结合分子，所述抗原结合分子是修饰的TCR。在一些实施方案中，TCR衍生自患者中自发发生的肿瘤特异性T细胞。在一些实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含CEA，gp100，MART-1，p53，MAGE-A3或NY-ESO-1。在一些实施方案中，TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链，或其组合。

在一些实施方案中，细胞是免疫效应细胞(例如，免疫效应细胞群)。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。在一些实施方案中，免疫效应细胞是T细胞。在一些实施方案中，T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。在一些实施方案中，细胞是人细胞。

在一些实施方案中，通过向重组DNA构建体、mRNA或病毒载体中的修饰细胞中引入编码一种或多种分子和/或结合分子的核酸序列来实现所述一种或多种分子的增强的表达和/或功能。在一些实施方案中，核酸序列是不整合到修饰细胞基因组中的mRNA。在一些实施方案中，核酸序列与氧敏感性多肽结构域相关。在一些实施方案中，氧敏感性多肽结构域包含HIF VHL结合结构域。在一些实施方案中，核酸序列由启动子调节，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中CDC42的表达。在一些实施方案中，转录调节剂是或包括Hif1a、NFAT、FOXP3和/或NFkB。

在实施方案中，一种或多种治疗剂的表达可以通过诱导型表达系统调节。诱导型表达系统允许基因的时间和空间控制的激活和/或表达。例如，四环素控制的转录激活是一种诱导型基因表达的方法，其中在存在抗生素四环素或其一种衍生物(例如强力霉素)的情况下可逆地开启或关闭转录。例如，诱导型自杀基因表达系统允许时间和空间控制的自杀基因的激活和/或表达，这导致细胞通过凋亡杀死自身。

在实施方案中，修饰的细胞包含编码四环素反式激活剂(rtTA)的核酸序列。在实施方案中，一种或多种治疗剂的表达由rtTA调节，使得一种或多种治疗剂在四环素存在的条件下表达。在实施方案中，细胞培养基中四环素的浓度不小于约2μg/ml。在实施方案中，四环素选自四环素，地美环素，甲氯环素，多西环素，莱美环素，甲环素，米诺环素，土霉素，四环素和金霉素。在实施方案中，四环素是强力霉素。

在实施方案中，诱导型自杀系统是HSV-TK系统或诱导型caspase-9系统。在实施方案中，修饰的细胞包含编码自杀基因的核酸序列，使得修饰的细胞在存在核苷类似物时允许自杀基因表达，使核苷类似物对修饰的细胞具有细胞毒性。在实施方案中，自杀基因选自单纯疱疹病毒的胸苷激酶、水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌胞嘧啶脱氨酶。在实施方案中，自杀基因是单纯疱疹病毒的胸苷激酶。在实施方案中，核苷类似物选自更昔洛韦、阿昔洛韦、比昔洛韦、泛昔洛韦、喷昔洛韦、缬昔洛韦、三氟胸苷、1-[2-脱氧，2-氟，β-D-阿拉伯呋喃氧基]-5-碘尿嘧啶、ara-A、araT1-β-D-阿拉伯呋喃氧基胸腺嘧啶、5-乙基-2'-脱氧尿苷、5-碘-5'-氨基-2,5'-二脱氧尿苷、异氧尿苷、AZT、AIU、双脱氧胞苷和AraC。在实施方案中，核苷类似物是更昔洛韦。

实施方案涉及包含抗原结合分子的修饰的T细胞，其中CDC42在修饰的细胞中的表达和/或功能已经被增强。在实施方案中，修饰的细胞具有增强的T细胞应答。例如，可以基于细胞因子释放水平、蛋白酶释放水平和/或迁移能力来测量T细胞应答。在实施方案中，与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，修饰的细胞响应于抗原结合分子结合的抗原而具有增加的细胞因子释放水平。在实施方案中，细胞因子的释放包括IFNγ的细胞因子的释放。在实施方案中，蛋白酶释放包括颗粒酶B(GRAM B)的释放。颗粒酶B是一种丝氨酸蛋白酶，最常见于自然杀伤细胞(NK细胞)和细胞毒性T细胞的颗粒中。它与孔形成蛋白穿孔素一起分泌，以介导靶细胞的凋亡。最近，还发现粒酶B由多种非细胞毒性细胞产生，从嗜碱性粒细胞和肥大细胞到平滑肌细胞。粒酶B的辅助功能也很多。颗粒酶B已显示出通过刺激细胞因子的释放来诱导炎症，还参与细胞外基质的重塑。在实施方案中，与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，修饰的细胞对趋化因子具有增强的迁移能力。在实施方案中，趋化因子是CCL5。在实施方案中，修饰的细胞包含编码SEQ ID NO：43的多核苷酸和抗原结合分子。在实施方案中，修饰的细胞包含编码SEQ ID NO：43的多核苷酸，所述多核苷酸以重组DNA构建体、mRNA或病毒载体存在于修饰的细胞中。在实施方案中，多核苷酸由启动子调节，所述启动子包括转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中CDC42的表达。在实施方案中，所述转录调节剂是或包括Hif1a，NFAT，FOXP3和/或NFkB。一些实施方案涉及包含多核苷酸的分离的核酸。

修饰的T细胞可以衍生自干细胞。干细胞可以是成体干细胞，胚胎干细胞，更特别地是非人类干细胞，脐带血干细胞，祖细胞，骨髓干细胞，诱导性多能干细胞，全能干细胞或造血干细胞。修饰的细胞也可以是树突状细胞，NK细胞，B细胞或T细胞，该T细胞选自包含炎性T淋巴细胞，细胞毒性T淋巴细胞，调节性T淋巴细胞或辅助性T淋巴细胞的组。在另一个实施方案中，修饰的细胞可以衍生自CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞组成的组。在扩增和遗传修饰本发明的细胞之前，可以通过多种非限制性方法从受试者获得细胞。T细胞可从许多非限制性来源获得，包括外周血单核细胞，骨髓，淋巴结组织，脐带血，胸腺组织，感染部位的组织，腹水，胸腔积液，脾组织和肿瘤。在实施方案中，可以使用本领域技术人员已知的任何数量的T细胞系。在实施方案中，修饰的细胞可源自健康供体、诊断为癌症的患者或诊断为感染的患者。在实施方案中，修饰的细胞是呈现不同表型特征的混合细胞群的一部分。

术语“干细胞”是指具有自我更新能力和分化成其他类型细胞的某些类型的细胞中的任何一种。例如，干细胞会产生两个子干细胞(如体外培养的胚胎干细胞)或一个干细胞和经历分化的细胞(如造血干细胞中产生的细胞)血细胞)。可以基于干细胞的来源和/或它们分化为其他类型细胞的能力范围来区分不同类别的干细胞。例如，干细胞可以包括胚胎干(ES)细胞(即，多能干细胞)，体细胞干细胞，诱导的多能干细胞和任何其他类型的干细胞。

多能胚胎干细胞可能存在于胚泡的内部细胞团中，并具有很高的先天分化能力。例如，多能胚胎干细胞可能会在体内形成任何类型的细胞。当长时间在体外生长时，ES细胞保持多能性：子代细胞保留了多谱系分化的潜力。

体干细胞包括胎儿干细胞(来自胎儿)和成年干细胞(存在于各种组织中，例如骨髓)。这些细胞被认为具有比多能ES细胞低的分化能力，其中胎儿干细胞的分化能力大于成年干细胞的分化能力。它们显然分化为有限类型的细胞，并被描述为多能的。“组织特异性”干细胞通常只产生一种类型的细胞。例如，胚胎干细胞可以分化为血液干细胞(例如，造血干细胞(HSC))，血液干细胞可以进一步分化为各种血细胞(例如，红细胞，血小板，白细胞)。

诱导型多能干细胞(即，iPS细胞或iPSC)可以包括通过诱导特定基因的表达而人工衍生自非多能细胞(例如，成年体细胞)的一种多能干细胞。诱导型多能干细胞在许多方面类似于天然多能干细胞，例如胚胎干(ES)细胞，例如某些干细胞基因和蛋白质的表达，染色质甲基化模式，倍增时间，胚状体形成，畸胎瘤形成，可行的嵌合体形成以及效价和可分化性。诱导型多能细胞可以由成年的胃，肝，皮肤细胞和血细胞制成。

在实施方案中，两个不同的抗原结合结构域可以在同一个CAR和T细胞受体(TCR)上，并由分开的核酸编码。TCR的结合结构域可以靶向肿瘤细胞上的特异性肿瘤抗原或肿瘤标志物。在实施方案中，TCR结合结构域是靶向特定肿瘤抗原的TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域。在实施方案中，TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链。本公开还描述了包含本文所述的分离的核酸的载体。在实施方案中，单个载体包含编码第一CAR和第二CAR或TCR的分离的核酸。在实施方案中，第一载体包含编码第一CAR的第一核酸，第二载体包含编码第二CAR或TCR的核酸。在实施方案中，载体包含双特异性CAR，所述双特异性CAR包含至少两个抗原结合结构域。

受试者中的淋巴细胞或T细胞应答是指与辅助，杀伤，调节和其他类型的T细胞相关的细胞介导的免疫。例如，T细胞应答可以包括诸如在免疫过程中协助其他白细胞(WBC)以及鉴定和破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞的活动。受试者中的T细胞反应可通过多种指标进行测量，例如T细胞杀死的许多病毒感染细胞和/或肿瘤细胞，T细胞与病毒感染细胞和/或肿瘤细胞共培养时释放的细胞因子的量，受试者中T细胞的增殖水平，例如T细胞的表型改变，记忆T细胞的改变以及受试者中T细胞的寿命或寿命水平。

在实施方案中，增强T细胞应答的方法包括治疗需要的受试者，例如，被诊断患有肿瘤的受试者。术语肿瘤是指肿块，其可以是诸如血液之类的流体的集合，或者是实心块。肿瘤可以是恶性(癌性)或良性的。血液癌的例子包括慢性淋巴细胞性白血病，急性骨髓性白血病，急性淋巴细胞性白血病和多发性骨髓瘤。

实体瘤通常不包含囊肿或液体区域。恶性实体瘤的主要类型包括肉瘤和癌。肉瘤是在称为间充质细胞的软组织细胞中发展的肿瘤，可以在血管，骨骼，脂肪组织，韧带淋巴管，神经，软骨，肌肉，韧带或肌腱中发现，而癌是在上皮细胞中形成的肿瘤在皮肤和粘膜中发现。最常见的肉瘤类型包括未分化的多形性肉瘤，涉及软组织和骨细胞。平滑肌肉瘤，其涉及在血管、胃肠道和子宫内衬的平滑肌细胞；涉及骨细胞的骨肉瘤和涉及脂肪细胞的脂肪肉瘤。肉瘤的一些例子包括尤因肉瘤，横纹肌肉瘤，软骨肉瘤，间皮瘤，纤维肉瘤，纤维肉瘤和神经胶质瘤。

五种最常见的癌包括肾上腺癌，其涉及会产生液体或粘液的器官，例如乳房和前列腺。基底细胞癌，涉及皮肤最外层的细胞，例如皮肤癌、鳞状细胞癌，涉及皮肤的基底细胞；移行细胞癌会影响包括膀胱、肾脏和输尿管在内的尿道中的移行细胞。癌的例子包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肠癌、皮肤癌、胰腺癌、肝癌、肾癌和膀胱癌以及胆管癌。

本文描述的方法可以用于治疗诊断为癌症的受试者。癌症可以是血液癌或可以是实体瘤，例如肉瘤或癌。该治疗方法包括向受试者施用有效量的包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的T细胞以提供T细胞应答，其中所述第一抗原结合结构域结合WBC的细胞表面分子，第二抗原结合结构域结合与白细胞(WBC)的细胞表面分子不同的抗原。在实施方案中，在增强受试者T细胞应答包括在体内选择性增强表达第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的T细胞的增殖。

在实施方案中，第一抗原结合结构域在CAR上，并且第二抗原结合结构域在T细胞受体(TCR)上。在实施方案中，TCR是修饰的TCR。在实施方案中，TCR衍生自患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。在实施方案中，TCR结合肿瘤抗原。在实施方案中，肿瘤抗原包含CEA，gp100，MART-1，p53，MAGE-A3或NY-ESO-1。

在实施方案中，可以分离出表达对靶抗原具有高亲和力的TCR的T细胞克隆。可以在具有抗原决定簇呈递多肽的抗原呈递细胞(APC)的存在下培养肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)或PBMC，该具有抗原决定簇呈递多肽的抗原呈递细胞代表一种表位，该表位在已知的HLA等位基因环境中呈递时，会引发显性T细胞应答。然后可以根据MHC-肽四聚体染色和/或识别和裂解低滴定浓度具有同源肽抗原的靶细胞的能力来选择高亲和力克隆。选择克隆后，通过分子克隆鉴定并分离TCRα和TCRβ链或TCRγ和TCRδ链。例如，对于TCRα和TCRβ链，然后将TCRα和TCRβ基因序列用于产生表达构建体，其理想地促进人TC细胞中两条TCR链的稳定、高水平表达。然后可以产生转导载体，例如γ逆转录病毒或慢病毒，并测试其功能性(抗原特异性和功能亲和力)，并用于生产临床上大量的载体。然后可以使用等分试样的最终产品转导目标T细胞群体(通常从患者PBMC中纯化)，然后在输注到患者体内之前将其扩增。

可以实施各种方法以获得编码肿瘤反应性TCR的基因。更多信息在Kershaw等人，Clin Transl Immunology.2014年5月；3(5)：e16中提供。在实施方案中，特异性TCR可以源自患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。包括在该类别中的抗原包括黑素细胞分化抗原MART-1和gp100，以及MAGE抗原和NY-ESO-1，其在更广范围的癌症中表达。只要转化细胞表达病毒蛋白，就可以分离对病毒相关恶性肿瘤具有特异性的TCR。此类恶性肿瘤包括与肝炎和乳头状瘤病毒相关的肝癌和宫颈癌，以及与爱泼斯坦-巴尔病毒相关的恶性肿瘤。在实施方案中，TCR的靶抗原可包括CEA(例如，对于结肠直肠癌)，gp100，MART-1，p53(例如，对于黑素瘤)，MAGE-A3(例如，黑素瘤，食道和滑膜肉瘤)，NY-ESO-1(例如，对于黑素瘤和肉瘤以及多发性骨髓瘤)。

在实施方式中，肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的制备和输注可以通过以下方式实现。例如，可以在无菌条件下获得来自手术或活检标本的肿瘤组织并将其运输到放于冰盒中的细胞培养室中。去除坏死组织和脂肪组织。将肿瘤组织切成约1-3立方毫米的小块。添加胶原酶、透明质酸酶和DNA酶，并在4℃下消化过夜。用0.2μm的过滤器过滤，可通过淋巴细胞分离液(1500rpm，离心5分钟)分离和收集细胞。用包含PHA、2-巯基乙醇和CD3单克隆抗体的培养基扩增细胞，可以加入小剂量的IL-2(10-20IU/ml)以诱导活化和增殖。在37℃，5％CO₂条件下培养7-14天，根据生长情况，检测并使细胞密度保持在0.5-2×10⁶/ml的范围内。TIL阳性细胞具有杀死同源癌细胞的能力，可通过共培养筛选出来。可以在含有高剂量IL2(5000-6000IU/ml)的无血清培养基中扩增阳性细胞，直到获得大于1×10¹¹的TIL。给药TIL时，可以首先使用连续流离心将其收集在盐水溶液中，然后通过血小板施用装置过滤至200-300ml的体积，该体积中包含5％的人血白蛋白和450000IU的IL-2。可以在30-60分钟的时间内通过中央静脉导管将TIL注入患者体内。在实施方案中，可将TILs注入两至四个单独的袋子中；输液可以间隔几个小时。

在实施方案中，分离的T细胞包含程序性死亡受体1(PD-1)、细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)、B-和T-淋巴细胞衰减剂(BTLA)、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3(TIM-3)、淋巴细胞活化蛋白3(LAG-3)、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体(TIGIT)、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、自然杀伤细胞受体2B4(2B4)或CD 160的显性失活变体。在实施方案中，与相应的野生型T细胞相比，分离的T细胞包含减少量的TCR。显性失活变体的基因产物发生改变，其对野生型等位基因起拮抗作用。这些突变通常导致分子功能改变(通常无活性)，并且以显性或半显性表型为特征。

本公开描述了药物组合物。药物组合物包括以下一种或多种：CAR分子、TCR分子、修饰的CAR T细胞，包含CAR或TCR的修饰的细胞、修饰的细胞、核酸和本文所述的载体。药物组合物以与所治疗或预防的疾病相适应的方式施用。可以通过临床试验确定适当的剂量，给药的量和频率将由诸如患者的状况以及患者疾病的类型和严重性等因素确定。

当指示“免疫学有效量”，“抗肿瘤有效量”，“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑患者的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及状况(受试者)的个体差异来确定要施用的本发明组合物的精确量。可以说，包含本文所述的T细胞的药物组合物可以10⁴至10⁹个细胞/kg体重的剂量给药，优选10⁵至10⁶个细胞/kg体重，包括所述范围内的所有整数值。T细胞组合物也可以以这些剂量多次给药。可以通过使用免疫疗法中公知的输注技术来施用细胞(参见，例如，Rosenberg等，New Eng.J.Med.319：1676，1988)。医学领域的技术人员可以通过监测患者的疾病征兆并相应地调整治疗，容易地确定针对特定患者的最佳剂量和治疗方案。在某些实施方案中，可能需要向受试者施用活化的T细胞，然后再抽血(或进行单采)，收集活化并扩增的T细胞，并向患者注入这些活化并扩增的T细胞。此过程每几周可以执行多次。在某些实施方案中，可以从10cc至400cc的抽血中活化T细胞。在某些实施方案中，从20cc，30cc，40cc，50cc，60cc，70cc，80cc，90cc或100cc的抽血中活化T细胞。不受理论的束缚，使用这种多次抽血/多次再输注的方案可以选择出某些T细胞群。

本文描述的药物组合物的施用可以任何方便的方式进行，包括通过雾化吸入、注射、摄取、输注、植入或移植。本文所述的组合物可通过静脉内(iv)注射或皮下、皮内、瘤内、结节内、髓内、肌内、经皮(iv)注射向患者施用。在实施方案中，本文所述的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于受试者。在实施方案中，本发明的T细胞组合物通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。在实施方案中，使用本文所述的方法或本领域已知的将T细胞扩增至治疗水平的其他方法活化和扩增的细胞，结合任何数量的相关治疗方法(例如，在之前、同时或之后)，向患者施用，所述任何数量的相关治疗方法包括但不限于抗病毒治疗药物，针对MS患者的西多福韦和白介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或那他珠单抗治疗；针对牛皮癣患者使用依法利珠单抗治疗或针对PML患者的其他治疗。在进一步的实施方案中，本文所述的T细胞可以与化学疗法、放射线、免疫抑制剂例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯和FK506、抗体或其他免疫消除剂(例如CAMPATH)、抗CD3抗体或其他抗体疗法、细胞毒素、氟达雷滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228、细胞因子和辐射等联合使用。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)。(Liu等人，Cell 66：807-815，1991；Henderson等人，Immun 73：316-321，1991；Bierer等人，Curr.Opin.Immun 5：763-773，1993)。在实施方案中，将本文所述的细胞组合物与骨髓移植、T细胞消融治疗(使用如氟达拉滨，外束放射治疗(XRT)，环磷酰胺，或抗体如OKT3或CAMPATH任一化疗药物)联合(例如，在此之前、同时或之后)向受试者施用。在实施方案中，本文所述的细胞组合物在B细胞消融治疗(例如与CD20反应的试剂，例如利妥昔单抗)后施用于患者。在实施方案中，受试者可以接受高剂量化学疗法的标准治疗，然后进行外周血干细胞移植。在某些实施方案中，在移植后，受试者接受输注本发明的扩增的免疫细胞。在实施方案中，在手术之前或之后施用扩增的细胞。

在实施方案中，可以通过引入巨噬细胞活化将CpG寡核苷酸(例如，B类CpG寡核苷酸)系统地和重复地施用给受试者以增强本文所述的药物(例如，CAR T细胞)的抗肿瘤作用。例如，可以组合施用CAR T细胞和CpG寡核苷酸以治疗患有实体瘤的受试者。关于CpG寡核苷酸施用的信息可在Nat Immunol.2019年3月；20(3)：265-275中找到，全文以引用方式并入。

给予有需要的受试者的上述治疗剂量将随所治疗病症的确切性质和治疗的接受者而变化。用于人类施用的剂量的缩放可以由医生根据各种因素和经验来进行。

美国专利号US8,906,682中提供了关于使用工程化或修饰的T细胞进行癌症治疗的方法的其他信息，所述美国专利通过引用方式整体并入。

本文描述的实施方案涉及用于制备修饰细胞的体外方法。该方法可以包括从受试者获得细胞样品。例如，样品可包括T细胞或T细胞祖细胞。该方法可以进一步包括用编码至少一种CAR的DNA转染细胞样品，并在选择性增强表达CAR的T细胞增殖的培养基中离体培养CAR细胞群。

在实施方案中，样品是冷冻保存的样品。在实施方案中，细胞样品来自脐带血或来自受试者的外周血样品。在实施方案中，通过单采血液成分术或静脉穿刺术获得细胞样品。在实施方案中，细胞样品是T细胞的亚群。

通过参考以下示例性实施例和示例来进一步描述本公开。提供这些示例性实施例和示例仅用于说明的目的，并非旨在限制，除非另有说明。因此，本公开绝不应被解释为限于以下示例性实施例和示例，而是应被解释为包含由于本文提供的教导而变得显而易见的任何和所有变化。

示例性实施例

以下是示例性实施例：

1.一种分离的核酸序列，其包含核酸序列和另外的核酸序列，所述核酸序列编码抗原结合分子，所述另外的核酸序列与LRCH1、DOCK8和Cdc42中的至少一种的内源基因的破坏或外源基因的添加有关。

2.一种修饰的细胞，其包含：抗原结合分子；以及与LRCH1、DOCK8和Cdc42中至少一种的生物合成或运输途径有关的内源基因的破坏或外源基因的添加，其中，与野生型细胞相比，修饰细胞的DOCK8或Cdc42的量增多和/或LRCH1的量减少。

3.根据实施方案2所述的修饰的细胞，其中所述修饰的T细胞中LRCH1的生物合成或运输通路相关的内源性基因产生破坏。

4.实施方案3的修饰的细胞，其还包含靶向核酸序列SEQ ID NO：24的TALEN。

5.实施方案3的修饰的细胞，其中TALEN包括包含核酸序列SEQ ID NO：34的左臂和包含核酸SEQ ID NO：35的右臂。

6.实施方案3的修饰的细胞，其还包含靶向核酸序列SEQ ID NO：23的ZFN。

7.根据实施例3所述的修饰细胞，其中所述ZFN包括含有核酸序列SEQ ID NO：26-29的左臂和含有核酸SEQ ID NO：30-33的右臂。

8.实施方案2的修饰的细胞，其中与相应的野生型细胞相比，所述DOCK8或Cdc42是过表达的。

9.根据实施例2所述的经修饰细胞，其中所述DOCK8或Cdc42的表达水平比细胞DOCK8或Cdc42的平均表达水平至少高约10％，20％，30％，40％或50％。

10.实施方案2的修饰的细胞，其中所述细胞的基因组包含编码DOCK8或Cdc42的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作地连接至启动子多核苷酸序列。

11.实施方案2的修饰的细胞，其中所述修饰的是淋巴细胞，白细胞或PBMC。

12.一种药物组合物，其包含实施方案2-11中任一项所述的细胞群。

13.一种在需要的受试者中引起T细胞应答和/或治疗该受试者的肿瘤的方法，所述方法包括向该受试者施用有效量的实施方案10的组合物。

14.根据实施方案1-11中任一项所述的分离的核酸序列、经修饰的细胞或方法，其中所述结合分子是包含细胞外结构域、跨膜结构域和细胞内结构域的CAR，并且所述细胞外结构域结合抗原。

15.实施方案12的分离的核酸序列、修饰的细胞或方法，其中所述细胞内结构域包含共刺激信号传导结构域，所述共刺激信号传导结构域包含选自CD27，CD28、4-1BB，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3及其任何组合。

16.实施方案13的分离的核酸序列、修饰的细胞或方法，其中所述抗原是表皮生长因子受体(EGFR)，表皮生长因子受体的变体III(EGFRvIII)，人表皮生长因子受体2(HER2)，间皮素(MSLN)，前列腺特异性膜抗原(PSMA)，癌胚抗原(CEA)，双唾液酸神经节苷脂2(GD2)，白介素13Ra2(IL13Rα2)，Glypican-3(GPC3)，碳酸酐酶IX(CAIX)，L1细胞粘附分子(L1-CAM)，癌抗原125(CA125)，分化簇133(CD133)，成纤维细胞活化蛋白(FAP)，癌/睾丸抗原1B(CTAG1B)，粘蛋白1(MUC1)，叶酸受体-α(FR-α)，CD19，FZD10，TSHR，PRLR，Muc 17，GUCY2C，CD207，CD3，CD5，B细胞成熟抗原(BCMA)或CD4。

17.实施方案2-14中任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞或方法，其中所述修饰的细胞包含显性失活PD-1突变体，从而干扰细胞的PD-1/PD1-1信号传导途径。

18.实施方案2-15任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞或方法，其中DOCK8或Cdc42存在于修饰的细胞中的重组DNA构建体、mRNA或病毒载体中。

19.实施方案2-15中任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞或的方法，其中所述修饰的细胞包含编码DOCK8或Cdc42的DOCK8或Cdc42 mRNA，并且所述mRNA未整合到修饰细胞的基因组中。

20.实施方案2-19中任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞或的方法，其中所述修饰的细胞包含核酸序列，或所述分离的核酸序列包含启动子，所述启动子包含用于转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中治疗剂的表达。

21.实施方案20所述的分离的核酸序列、修饰的细胞或方法，其中所述转录调节剂是或包括Hif1a、NFAT、FOXP3和/或NFkB。

22.实施方案21所述的分离的核酸序列、修饰的细胞或方法，其中所述启动子对转录调节剂具有反应。

23.实施方案22所述的分离的核酸序列、修饰的细胞或方法，其中所述启动子与编码治疗剂的核酸序列可操作地连接，使得启动子驱动细胞中治疗剂的表达。

24.一种细胞，其经修饰以表达一种或多种分子的水平高于或低于未被修饰以表达所述一种或多种分子的细胞表达的所述一种或多种分子的水平，其中所述一种或多种分子与细胞迁移有关。

25.一种经工程改造以表达抗原结合分子的修饰细胞，所述修饰细胞中一种或多种分子的表达和/或功能被增强或降低，其中所述一种或多种分子与细胞迁移有关。

26.实施方案24和25中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包括与所述一种或多种分子的生物合成或转运途径相关的内源基因的破坏或外源基因的添加。

27.一种多核苷酸的方法或用途，所述方法包括：

提供包含载体基因组的病毒颗粒(例如，AAV，慢病毒或其变体)，该载体基因组包含编码一种或多种分子的多核苷酸和编码一种结合分子的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地连接至表达控制要素，所述表达控制要素赋予所述多核苷酸的转录；和

向受试者施用一定量的病毒颗粒，以使多核苷酸在受试者中表达，其中所述一种或多种分子与细胞迁移相关。

28.实施方案27的方法，其中所述AAV制备物可以包含AAV载体颗粒、空衣壳和宿主细胞杂质，从而提供基本上不含AAV空衣壳的AAV产物。

29.一种药物组合物，其包含实施方案24-26中任一项的细胞群。

30.一种在需要的受试者中引起或引发T细胞应答和/或治疗该受试者的肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的实施方案29的组合物。

31.一种分离的核酸序列，其编码与细胞迁移相关的一种或多种分子。

32.实施方案24-31中任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞、方法或药物组合物，其中所述一种或多种分子包含DOCK8、CDC42和LRCH1、所述一种或多种分子的功能性变体或所述一种或多种分子的功能片段中的一种或多种。

33.实施方案24-32中任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞、方法或药物组合物，其中所述一种或多种分子是或包含CDC42，所述CDC42在所述修饰的T细胞中过表达。

34.实施方案24-33中任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞、方法或药物组合物，其中所述一种或多种分子是或包含LRCH1，所述LRCH1在修饰的T细胞中表达降低。

35.实施方案24-34中任一项所述的分离的核酸序列、修饰的细胞、方法或药物组合物，其中所述修饰的细胞包含编码SEQ ID NO：43和/或39的重组多核苷酸。

36.前述实施方案中任一项所述的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包含抗原结合分子，并且所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

37.实施方案36的修饰的细胞，其中所述抗原结合结构域与肿瘤抗原结合，所述肿瘤抗原选自：TSHR，CD19，CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA，Tn Ag，PSMA，ROR1，FLT3，FAP，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT，IL-13Ra2，间皮素，IL-11Ra，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-beta，SSEA-4，CD20，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，蛋白酶，PAP，ELF2M，Ephrin B2，IGF-1受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，o-乙酰基GD2，叶酸受体β，TEM1/CD248，TEM7R，CLDN6，GPRC5D，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，多唾液酸，PLAC1，GloboH，NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR20，LY6K，OR51E2，TARP，WT1，NY-ESO-1，LAGE-1a，MAGE-A1，legumain，HPV E6，E7，MAGE A1，ETV6-AML，精子蛋白17，XAGE1，Tie 2，MAD-CT-1，MAD-CT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，prostein，存活素和端粒酶，PCTA-1/Galectin 8，Mela nA/MART1，Ras突变体，hTERT，肉瘤易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PAX3，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK，AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人类端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，肠内羧基酯酶，mut hsp70-2，CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2，LY75，GPC3，FCRL5和IGLL1。

38.实施方案36和37中所述的任一项的修饰的细胞，其中所述细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域，或初级信号传导域和共刺激信号传导域，其中所述共刺激信号传导域包括选自以下的蛋白质的功能性信号传导域：CD27，CD28、4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特异性结合CD83，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8alpha，CD8beta，IL2Rbeta，IL2Rγ，IL7R alpha，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLA MF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELLPG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46，和NKG2D的配体。

39.实施方案24-30和31-35中任一项的修饰的细胞，其中所述修饰的细胞包含抗原结合分子，并且抗原结合分子是修饰的TCR。

40.实施方案39所述的修饰的细胞，其中所述TCR衍生自患者中自发产生的肿瘤特异性T细胞。

41.实施方案40所述的修饰的细胞，其中所述TCR结合肿瘤抗原。

42.实施方案41所述的修饰的细胞，其中所述肿瘤抗原包含CEA，gp100，MART-1，p53，MAGE-A3或NY-ESO-1。

43.根据实施方案41所述的修饰细胞，其中所述TCR包含TCRγ和TCRδ链或TCRα和TCRβ链，或其组合。

44.前述实施方案中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞是免疫效应细胞。(例如，免疫效应细胞群)。

45.实施方案44所述的修饰的细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞或NK细胞。

46.实施方案45所述的修饰的细胞，其中所述免疫效应细胞是T细胞。

47.实施方案45所述的修饰的细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞、CD8+T细胞或其组合。

48.前述实施方案中任一项所述的修饰的细胞，其中所述细胞是人细胞。

49.前述实施方案中任一项所述的修饰的细胞，其中所述一种或多种分子的表达和/或功能的增强是通过在重组DNA构建体、mRNA或病毒载体中的修饰细胞中引入编码所述一种或多种分子和/或结合分子的核酸序列来实现的。

50.实施方案49所述的修饰的细胞，其中所述核酸序列是不整合到所述修饰的细胞的基因组中的mRNA。

51.实施方案49所述的修饰的细胞，其中所述核酸序列与氧敏感性多肽结构域相关。

52.实施方案51所述的修饰的细胞，其中所述氧敏感性多肽结构域包含HIF VHL结合结构域。

53.实施方案49所述的修饰的细胞，其中所述核酸序列由启动子调节，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中CDC42的表达。

54.实施方案53所述的修饰的细胞，其中所述转录调节剂是或包括Hif1a、NFAT、FOXP3和/或NFkB。

55.一种药物组合物，其包含实施方案1-54中任一项的细胞群。

56.一种在有需要的受试者中引起或引发T细胞应答和/或治疗该受试者的肿瘤的方法，该方法包括向该受试者施用有效量的实施方案55的组合物。

例子

表达嵌合受体的细胞

生成编码单个CAR分子的慢病毒载体，并用于T细胞转染，下面将对其进行详细说明。与细胞培养相关的技术、细胞毒性T淋巴细胞测定的构建可以在“Control of large,established tumor xenografts with genetically retargeted human T cellscontaining CD28 and CD137 domains,”PNAS,March 3,2009,vol.106no.9,3360-3365和“Chimeric Receptors Containing CD137 Signal Transduction Domains MediateEnhanced Survival of T Cells and Increased Antileukemic Efficacy In Vivo,”Molecular Therapy,Aug.2009,vol.17no.8,1453-1464,中找到，所述参考文献以引用的方式将其全部内容并入本文。相应的序列见表2。

表2：序列和标识符

CART细胞过表达CDC42

从志愿者获得PBMC，并在第1天分选出T细胞。分别将含有GUCY2C CAR的载体和含有GUCY2C CAR-CDC42的载体导入T细胞(相应结构参见表3)。将感染的T细胞培养至第7天。第7天，将2×10⁵个T84细胞接种到24孔板中。第8天，取出8×10⁵个GUCY2C CAR T细胞和GUCY2C CAR-CDC42 T细胞，并将其添加到T84包被的24孔板中。共培养24小时后，取3×10⁵个细胞以确定表型，取上清液确定GramB和IFN-γ的释放。表型使用流式细胞仪测定。图2显示了细胞测定结果，表明CDC42序列不影响CAR在T细胞上的表达。图3显示了细胞测定结果，表明CDC42序列不影响CAR T细胞的活化。图4显示了CDC42的表达增强了CAR活化后GramB和IFN-γ的释放。采用qPCR验证过表达CDC42的效率。图5显示CDC42在CAR T细胞中成功过表达。第7天，分别使用2×10⁶GUCY2C CAR T细胞和GUCY2C CAR-CDC42细胞来验证过表达CDC42的效率。使用TRAzol提取RNA，以该RNA为模板进行逆转录，以逆转录为模板进行qPCR，测定CDC42的过表达。

表3

ID	结构
		GUCY2C	5F9-CD8hinge-41BB-CD3Z
GUC-CDC42	5F9-CD8hinge-41BB-CD3Z-P2A-CDC42
		GUCY2C	5F9-CD8hinge-41BB-CD3Z
GUC-SCR	U6-shRNA-Scremble-5F9-CD8hinge-41BB-CD3Z

过表达CDC42增强CAR T细胞的迁移能力

通过Transwell法证实过表达CDC42对细胞迁移能力的影响。第9天，将2x10⁵GUCY2C CAR T细胞和GUCY2C CAR-CDC42细胞分别置于Transwell上层板中。将600μL含50ng/mL CCL5的X-VIVO放入Transwell下层板中。在4小时后进行流式细胞仪测定，以测量在下层的培养基中迁移的CAR+细胞的数量。图6显示过表达CDC42的GUCY2C CAR T细胞的迁移能力明显强于对照组。

CAR T细胞过表达shRNA-LRCH1和增强的细胞因子释放

从志愿者获得PBMC，并在第1天分选出T细胞。分别用含有GUC-SCR的载体和含有ShRNA1的载体导入T细胞(参见表3)。将感染的T细胞培养至第7天。第7天，将2×10⁵个T84细胞接种到24孔板中。第8天，取8×10⁵GUC-SCR CAR T细胞(U6-shRNA-Scremble-5F9-CD8hinge41BB-CD3Z；SEQ ID No.37和44)和ShRNA1 CAR T细胞(U6-shRNA1-5F9-CDShinge41BB-CD3Z；SEQ ID No.38和44)，并将其添加到T84包被的24孔板中。共培养24小时后，取3×10⁵个细胞以确定表型，取上清液确定GramB和IFN-γ的释放。表型使用流式细胞仪测定。图7显示了细胞测定结果，表明ShRNA1序列不影响CAR在T细胞上的表达。图7的细胞测定结果还表明ShRNA1序列不影响CAR T细胞的活化。图8显示了ShRNA1表达增强了CAR活化后GramB和IFN-γ的释放。

本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用的方式整体并入本文，就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地和单独地指示以通过引用的方式并入。尽管已经根据各种实施方案描述了前述内容，但是本领域技术人员将认识到，在不脱离其精神的情况下可以进行各种修改、替换、省略和改变。

Claims (10)

1.一种包含抗原结合分子的修饰的T细胞，其中所述修饰的T细胞包含抗原结合分子，并且所述抗原结合分子是嵌合抗原受体(CAR)；

其中所述修饰的T细胞中CDC42的表达和/或功能被增强；

所述修饰的T细胞包含编码SEQ ID NO:38的多核苷酸，所述修饰的T细胞含有表达CAR分子的载体，其结构为5F9-CD8hinge-41BB-CD3ζ，所述5F9所示的scFV的核苷酸序列为SEQID NO.39。

2.根据权利要求1所述的修饰的T细胞，其中与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，所述修饰的T细胞抗原结合分子响应于其结合的抗原而具有增加的细胞因子释放水平和/或蛋白酶释放水平。

3.权利要求2所述的修饰的T细胞，其中所述细胞因子释放包括IFNγ细胞因子的释放，其中所述蛋白酶释放包括GRAM B蛋白酶的释放。

4.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中与不过度表达CDC42的相应T细胞相比，所述修饰的细胞对趋化因子具有增强的迁移能力。

5.权利要求4所述的修饰的T细胞，其中所述趋化因子是CCL5。

6.权利要求1所述的修饰的T细胞，所述嵌合抗原受体包含抗原结合结构域，跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。

7.权利要求6的修饰的T细胞，其中与肿瘤抗原结合的抗原结合结构域选自：TSHR，CD19，CD123，CD22，CD30，CD171，CS-1，CLL-1，CD33，EGFRvIII，GD2，GD3，BCMA，Tn Ag，PSMA，ROR1，FLT3，FAP，TAG72，CD38，CD44v6，CEA，EPCAM，B7H3，KIT，IL-13Ra2，间皮素，IL-11Ra，PSCA，PRSS21，VEGFR2，LewisY，CD24，PDGFR-beta，SSEA-4，CD20，叶酸受体α，ERBB2(Her2/neu)，MUC1，EGFR，NCAM，蛋白酶，PAP，ELF2M，Ephrin B2，IGF-1受体，CAIX，LMP2，gp100，bcr-abl，酪氨酸酶，EphA2，岩藻糖基GM1，sLe，GM3，TGS5，HMWMAA，o-乙酰基GD2，叶酸受体β，TEM1/CD248，TEM7R，CLDN6，GPRC5D，CXORF61，CD97，CD179a，ALK，多唾液酸，PLAC1，GloboH，NY-BR-1，UPK2，HAVCR1，ADRB3，PANX3，GPR20，LY6K，OR51E2，TARP，WT1，NY-ESO-1，LAGE-1a，MAGE-A1，legumain，HPV E6，E7，MAGE A1，ETV6-AML，精子蛋白17，XAGE1，Tie 2，MAD-CT-1，MAD-CT-2，Fos相关抗原1，p53，p53突变体，prostein，存活素和端粒酶，PCTA-1/Galectin8，MelanA/MAR T1，Ras突变体，hTERT，肉瘤易位断点，ML-IAP，ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)，NA17，PAX3，雄激素受体，细胞周期蛋白B1，MYCN，RhoC，TRP-2，CYP1B1，BORIS，SART3，PAX5，OY-TES1，LCK，AKAP-4，SSX2，RAGE-1，人类端粒酶逆转录酶，RU1，RU2，肠羧化酶，mut hsp70-2，CD79a，CD79b，CD72，LAIR1，FCAR，LILRA2，CD300LF，CLEC12A，BST2，EMR2，LY75，GPC3，FCRL5和IGLL1；其中所述细胞内信号传导域包含共刺激信号传导域，或初级信号传导域和共刺激信号传导域，其中所述共刺激信号传导域包括选自以下的蛋白质的功能性信号传导域：CD27，CD28、4-1BB(CD137)，OX40，CD30，CD40，PD-1，ICOS，淋巴细胞功能相关抗原1(LFA-1)，CD2，CD7，LIGHT，NKG2C，B7-H3，特异性结合CD83，CDS，ICAM-1，GITR，BAFFR，HVEM(LIGHTR)，SLAMF7，NKp80(KLRF1)，CD160，CD19，CD4，CD8alpha，CD8beta，IL2R beta，IL2Rγ，IL7R alpha，ITGA4，VLA1，CD49a，ITGA4，IA4，CD49D，ITGA6，VLA-6，CD49f，ITGAD，CD11d，ITGAE，CD103，ITGAL，CD11a，LFA-1，ITGAM，CD11b，ITGAX，CD11c，ITGB1，CD29，ITGB2，CD18，LFA-1，ITGB7，TNFR2，TRANCE/RANKL，DNAM1(CD226)，SLAMF4(CD244、2B4)，CD84，CD96(触觉)，CEACAM1，CRTAM，Ly9(CD229)，CD160(BY55)，PSGL1，CD100(SEMA4D)，CD69，SLAMF6(NTB-A，Ly108)，SLAM(SLAMF1，CD150，IPO-3)，BLAME(SLAMF8)，SELLPG(CD162)，LTBR，LAT，GADS，SLP-76，PAG/Cbp，NKp44，NKp30，NKp46和NKG2D的配体。

8.权利要求1所述的修饰的T细胞，其中所述修饰的T细胞包含编码SEQ ID NO：38的多核苷酸，并且所述多核苷酸以重组DNA构建体或mRNA的形式存在于修饰的细胞中。

9.权利要求8所述的修饰的T细胞，其中所述多核苷酸由启动子调节，所述启动子包含转录调节剂的结合位点，所述转录调节剂调节细胞中CDC42的表达。

10.权利要求9所述的修饰的T细胞，其中所述转录调节剂选自Hif1a、NFAT、FOXP3和NFkB。