CN109689694B

CN109689694B - 与其受体IL-2Rβ结合的IL2作为用来增强自然杀伤细胞和调节性T细胞活性的平台

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Publication number: CN109689694B
Application number: CN201780044474.8A
Authority: CN
Inventors: Y·由耐第; S·福曼; K·米勒; J·F·考特恩
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 2016-05-19
Filing date: 2017-05-19
Publication date: 2022-11-22
Anticipated expiration: 2037-05-19
Also published as: EP3458485A4; WO2017201432A2; CN109689694A; US20200316118A1; JP7178906B2; JP2019519215A; EP3458485A2; EP3458485B1; WO2017201432A3

Abstract

融合蛋白，其包含IL2和IL2Rβ(例如CIRB)，包含IL2、IL2Rβ和IL21R(例如CIRB21)，和/或包含IL2、IL2Rβ、和CD28(例如CIRB28)；表达这些融合蛋白的自然杀伤(NK)细胞以及使用这些自然杀伤细胞例如治疗患有癌症的受试者的方法；以及表达包含IL2、L2Rβ、和CD28的融合蛋白的调节性T细胞(T‑reg)以及使用这些调节性T细胞例如治疗患有自身免疫性疾病或GVHD的受试者的方法。

Description

与其受体IL-2Rβ结合的IL2作为用来增强自然杀伤细胞和调节性T细胞活性的平台

优先权要求

本申请要求于2016年5月19日提交的美国临时申请序列号62/338,757、以及于2017年3月15日提交的美国临时申请序列号62/471,456的权益。以上文献的全部内容通过引用结合在此。

技术领域

本文描述了表达包含IL2、IL2Rβ和IL21R的嵌合蛋白(例如CIRB21)和/或包含IL2、IL2Rβ、和CD28的嵌合体(例如CIRB28)的自然杀伤(NK)细胞，以及使用这些自然杀伤细胞例如治疗患有癌症、GVHD、和自身免疫性疾病的受试者的方法。

背景技术

自然杀伤(NK)细胞是在先前没有暴露于特异性抗原(1-3)时被赋予攻击恶性的和病毒感染的细胞的天生能力的淋巴细胞。若干白细胞介素，并且特别是IL2激活并且扩增关键免疫细胞，例如T细胞和NK细胞(4)。因此，在范围从癌症到病毒感染的多种疾病中，全身性IL2补充可以增强免疫力。然而，在癌症患者中，肿瘤细胞及其微环境(TME)通常通过协调多种逃逸机制，抑制NK细胞抗肿瘤活性(5)。

使用高剂量IL2输注的临床试验已经取得了有限的成功，这是由于像脓毒症的严重副作用(6-8)；而因体内IL2的短半衰期(小于10min)(9)并且由于低IL2剂量被T-reg和其他淋巴样细胞耗尽(10)，低剂量IL2功效受限。基于IL2的多种策略旨在增强NK细胞毒性，同时减小患者中的毒性，具有有限的功效。可以将离体培养的NK细胞通过在体内转移之前暴露于IL2来激活并且诱导增殖。与来自同种异体供体的NK细胞相比(12)，离体激活的自体NK细胞显示了更小的抗肿瘤功效(11)，这是因为自身I类HLA信号传导抑制了NK细胞毒性和细胞因子释放(13)。然而，为了使同种异体供体NK细胞是有效的，需要转移前淋巴细胞清除，用来减小对生长因子和细胞因子的竞争(14，15)。此外，在体内转移后，需要全身性IL2给予来维持NK细胞毒性，使患者暴露于全身性副作用。

在过去使用微转移模型用来在NK细胞中表达内源IL2的治疗努力显示了有限的成功，并且并不像用外源IL2刺激的NK细胞那样有效(16)。类似地，用来表达膜结合的内源IL2的努力并未显示高于亲本NK92细胞的任何优势(17)。使用NK细胞的若干免疫疗法策略的成功有限可以通过如下来解释：在宿主中对于细胞因子而言激活的NK细胞不能超过T-reg，并且诱导髓源性抑制细胞(MDSC)的TME有免疫抑制作用。MDSC和T-reg二者通过直接接触或通过TGFβ1的分泌来介导NK细胞功能抑制(18,19)。

发明内容

白细胞介素-2(IL2)是用于关键免疫细胞(包括T细胞和自然杀伤(NK)细胞)的免疫刺激性细胞因子。全身性IL2补充可以在多种疾病(范围从赘生物到病毒感染)中增强NK介导的免疫力。然而，其全身性应用受限于其严重的副作用，并且其功效也受限于调节性T细胞(T-reg)的激活。通过与包含IL2Rα、IL2Rβ和IL2Rγ的高亲和性多亚基受体复合物的相互作用介导IL2信号传导。成人NK细胞可以仅表达IL2Rβ和IL2Rγ亚基并且因此对于IL2是相对不敏感的。为了克服这些限制，我们创造了经由肽接头连接的IL2及其受体IL2Rβ的新型嵌合IL2-IL2Rβ(CIRB)融合蛋白。在没有外源IL2的情况下，表达CIRB的NK92细胞(NK92^CIRB)被高度激活并且无限扩增。它们是高度细胞毒性的，并且对TGF-β1和地塞米松具有抗性。此外，CIRB诱导自然细胞毒性受体NKP44、NKP46和NKP30连同CD16的大量表达，CD16经由针对HER2阳性细胞的抗体依赖性途径与曲妥珠单抗增强了NK细胞毒性。当与分泌IL2的NK92细胞系(NK92^IL2)相比时，NK92^CIRB细胞显示了优越的体内抗肿瘤作用以及小鼠中的生存期(至少3周)。此新型嵌合体消除了对IL2Rα和IL2Rβ二者表达的需要，并且提供了对外源IL2刺激的替代方案。总而言之，本发明数据显示，使IL2与其受体IL2Rβ结合提供了新的平台，该平台在选择性激活并且增强免疫疗法方面会是有用的。

因此，本文提供了融合蛋白，这些融合蛋白包含用其间的间插接头融合至白细胞介素2受体β(IL2Rβ)的N末端的白细胞介素2(IL2)。在一些实施例中，IL2包含SEQ ID NO:34，和/或IL2Rβ包含SEQ ID NO:35的氨基酸27-551。在一些实施例中，IL2和IL2Rβ的N末端之间的间插接头包含IL2Rα的细胞外结构域。在一些实施例中，IL2Rα的细胞外结构域包含SEQ ID NO:28。

在一些实施例中，融合蛋白还包括在IL2Rβ的C末端处的IL21R的细胞质结构域，任选地其间具有间插接头。在一些实施例中，IL21R的细胞质结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸254-538。

在一些实施例中，融合蛋白还包括在IL2Rβ部分的C末端处的CD28的激活结构域，任选地其间具有间插接头。在一些实施例中，CD28的激活结构域包含SEQ ID NO:38的氨基酸180至220。

本文还提供了编码本文描述的融合蛋白的核酸、连同包含这些核酸的表达载体，这些表达载体优选地具有一个或多个调节区，用于表达本文描述的融合蛋白。

另外，本文提供了表达如本文描述的融合蛋白的分离的自然杀伤(NK)细胞(例如CD3-CD56+淋巴细胞)，优选地，其中该NK细胞是CD3-CD56+淋巴细胞，还表达CD16和任选地NKP44、NKP46和NKP30；并且提供了这些分离的自然杀伤细胞在治疗癌症中的用途。

还提供了表达融合蛋白的调节性T细胞(T-reg)，这些融合蛋白包含融合至白细胞介素2受体β(IL2Rβ)的N末端的白细胞介素2(IL2)(其间具有间插接头)、以及在IL2Rβ部分的C末端处的CD28的激活结构域(任选地其间具有间插接头)。优选地，Treg是CD4+CD25+，例如CD4+CD25+CD127-Treg(例如，对于特应性Treg是CD4+CD25高CD127-ICOS，或对于GVHD是CD4+CD25+CD127-CD62L+)，并且任选地也是FOXP3+。还提供了其在治疗GVHD和自身免疫性疾病中的用途，例如用于耗尽同种异体反应性T细胞。

另外，本文提供了用于治疗患有癌症(例如，已经诊断为患有癌症)的受试者的方法，该受试者优选地是人类受试者，这些方法包括给予治疗有效量的表达如本文描述的融合蛋白的自然杀伤(NK)细胞，优选地其中这些NK细胞是CD3-CD56+淋巴细胞，还表达CD16以及任选地NKP44、NKP46和NKP30。可以在生理学上可接受的组合物中配制和/或给予NK细胞，例如，如本文描述，例如配制成用于静脉内给予。

在一些实施例中，该受试者患有实体瘤。

在一些实施例中，这些方法包括给予一种或多种抗肿瘤单克隆抗体或检查点抑制剂。

在一些实施例中，静脉内给予NK细胞。

在一些实施例中，在给予之前，NK细胞经历500至1000cGy的γ辐射。

本文还提供了用于治疗患有GVHD或自身免疫性疾病的受试者的方法，这些方法包括给予治疗有效量的表达融合蛋白的调节性T(T-reg)细胞，这些融合蛋白包含融合至白细胞介素2受体β(IL2Rβ)的N末端的白细胞介素2(IL2)(其间具有间插接头)、以及在IL2Rβ部分的C末端处的CD28的激活结构域(任选地其间具有间插接头)。优选地，Treg是CD4+CD25+，例如CD4+CD25+CD127-Treg(例如，对于特应性Treg是CD4+CD25高CD127-ICOS，或对于GVHD是CD4+CD25+CD127-CD62L+)，并且任选地也是FOXP3+。

在一些实施例中，静脉内给予T-reg细胞。

还提供了表达如本文描述的融合蛋白的NK细胞，其用于治疗患有癌症(例如实体瘤)的受试者，该受试者优选地是人类受试者。在一些实施例中，还给予受试者一种或多种抗肿瘤单克隆抗体或检查点抑制剂。在一些实施例中，将NK细胞配制成用于静脉内给予。在一些实施例中，在给予之前，NK细胞经历500至1000cGy的γ辐射。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。在此描述了用于本发明的方法和材料；还可使用本领域已知的其他合适的方法和材料。这些材料、方法、以及实例仅是说明性的，并且不旨在进行限制。此处提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献通过引用以其整体结合。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。

本发明的其他特征和优点将从下列详述和附图以及从权利要求中显而易见。

附图说明

图1-在慢病毒构建体中，与受体IL2Rβ(CIRB)融合的人类IL2和嵌合体IL2的图。接头(L)由cMyc标签(EQKLISEEDL)和IL2受体α的细胞外结构域的片段(EMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSC)构成，连接IL2及其受体IL2Rβ。

图2A-D-嵌合体CIRB的表面检测和表达。A，通过抗cMyc单克隆抗体，检测在瞬时转染的HEK293细胞的表面上的CIRB表达，以及B，慢病毒转导的NK92细胞。C，使用抗CD122单克隆抗体检测的CD122表达，该抗体识别天然IL2Rβ(CD122)连同嵌合体。CD122存在于NK92^IL2细胞中，并且如预期的，在NK92^CIRB细胞中更高，这是由于CIRB的另外表达。在不存在抗体(Neg)的情况下，检测到表达高于背景。D，使用单克隆抗人类IL2，通过蛋白质印迹进一步检测CIRB。

图3A-C–A，NK92^IL2、NK92^CIRB、和亲本NK92细胞针对在共培养前24小时铺板的多发性骨髓瘤U266GFP细胞的细胞毒性测定。如通过GFP发射荧光量化，E/T比率增加的NK细胞诱导更多的U266GFP细胞死亡。B，针对一组五种人类癌细胞系的细胞毒性测定：在2:1的E/T比率下添加NK细胞系之前24小时，将细胞铺板。同时在C中，在暴露于E/T比率渐增的NK92^IL2(●)、或NK92^CIRB(■)细胞之前仅5小时，将癌细胞铺板。使用结晶紫/醇提取测定，确定此时间后的剩余细胞。数据呈现为相对于无NK细胞对照而言的细胞数，为三个重复样品的平均值+SE值。

图4A-C–TGFβ1、IL-4和地塞米松对NK细胞活力的影响。A，64x10³个NK92^IL2，以及B，NK92^CIRB细胞与TGFβ1(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)、或Dex(1uM)一起铺板，持续6天生长。使用台盼蓝，将活细胞计数。数据呈现为最终细胞数(10⁵个细胞/ml)，对于三个重复样品，为平均值+SE值。C，暴露于TGFβ1(20ng/ml■)、Dex(0.5uM▲)、或没有药物(UT●)24小时的NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB细胞系。在20IU/ml下，将亲本NK 92细胞与IL2一起孵育。然后以2:1的E/T比率将癌细胞(32x10³个细胞)添加至NK细胞，然后孵育4天。使用结晶紫提取测定，确定癌细胞活力。数据呈现为相对于无NK细胞对照(UT)而言的平均细胞数百分比。

图5A-D–，NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB细胞系表型。A，流式细胞术显示，在NK92^IL2和NK92^CIRB中，CD16的细胞表面密度增加，并且在NK92^CIRB中，CD25低表达。B，与NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB相比，NKG2D、CD25和CD16的人类原代NK细胞(hNK)表型表达。C，当与曲妥珠单抗(1ug/ml)一起孵育时，由NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB效应细胞介导的针对HER2阳性BT474细胞系(E/T比率为2:1)的直接细胞毒性和ADCC活性。数据呈现为相对于无NK细胞对照而言的细胞数百分比，为三个重复样品的平均值+SE值。通过单向方差分析检验，确定统计学差异(*P<0.05)。D，在NK细胞系中NKP30、NKP44、NKP46、颗粒酶-B、穿孔素-1、TNF-α、和INF-γ的表达谱。数据呈现为三个重复样品的平均值+SE值。使用双尾t检验分析来评估统计学差异。

图6A-B–体内未经辐射的NK92^IL2和NK92^CIRB细胞评估。A，当U251肿瘤体积达到约160mm³时，将未经辐射的NK92^IL2和NK92^CIRB细胞(10⁷个细胞)经由尾静脉注射到小鼠体内(箭头)。在4天后，进行未经辐射的NK细胞(5x10⁶个细胞)的第二次注射。监测肿瘤尺寸，直至肿瘤植入后31天。B，在最后一次NK细胞注射后17天，将动物处死，并且在每个组中，从3只动物中收集血液。使用在NK92^IL2和NK92^CIRB中分别与IL2或CIRB共表达的人类特异性标记CD45和mCherry荧光标记，用流式细胞术处理和分析血液样品(0.5ml)。检测的NK92^CIRB细胞(圆圈的)。

图7A-B–体外细胞存活和体内辐射的NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的抗肿瘤功效。A，按10Gy辐射NK细胞(0.83gy持续12min)，并且然后铺板在完全NK92培养基中，从而每24小时使用台盼蓝确定其存活。在第1天和第2天，NK92^CIRB细胞的存活优势具有统计学显著性(单向方差分析检验，*P<0.05)。B，在5周龄雄性Nod/Scid小鼠中，使PC-3肿瘤生长。当肿瘤达到约200mm³，给予用500cGy辐射的NK细胞，为经由尾静脉，按每个小鼠每周注射一次200ul15x10⁶个细胞，四次注射(箭头)。在最后一次NK92^CIRB细胞注射后，相比于未处理组，记录到17天的显著肿瘤生长延迟(**P<0.01)。NK92^IL2处理组肿瘤产生了仅7天的肿瘤延迟(*P<0.05)。使用单向方差分析检验确定统计学差异。

图8-使用服务器确定接头为螺旋为主的预测结构(20)。

图9-NK92^IL2和NK92^CIRB细胞系的细胞生长-NK92^IL2和NK92^CIRB细胞系显示在冷冻后的快速恢复，以及在组织培养中经历多次冷冻和铺板后优异的存活。在六天后，NK92、NK92^IL2、NK92^CIRB和IL2-激活的NK92(10IU/ml)生长是类似的，并且略高于40IU/ml下的NK92。在相同时段期间，NK92-MI细胞显示了最慢生长。

图10A-B-在NK92-MI和NK92中CD 16的表达。A，流式细胞术确认，在NK92和NK92-MI中，CD16的表达缺乏。B，显示了在用100或1000IU/m的糖基化(G)和非糖基化IL2激活的NK92中，CD16的表达缺乏。

图11.示意图，显示了使用共有的信号传导链IL2Rg，通过JAK-STAT途径的信号传导。

图12.当用IL21或IL2刺激时，1:1的比率下，PC-3的NK92CIRB杀伤。

图13.IL2-IL2Rβ-IL21嵌合体(CIRB21)的示例性示意图。

图14.图显示了在1:1的比率下，NK92CIRB和NK92CIRB21对比PC-3细胞的细胞毒性。

图15.图显示了相对于NK92，在NK92CIRB和NK92CIRB21中，激活子和细胞因子的表达倍数。

图16.描绘了具有激活区域的IL2Rβ受体细胞质结构域。对于与Socs 1抑制性基序的JAK-STAT相互作用而言，盒1是必需的。对于STAT5结合和磷酸化，Y536是必需的。

图17.描绘了具有激活区域的IL21受体细胞质结构域。对于与盒2贡献的JAK-STAT相互作用而言，盒1是必需的。对于STAT3和STAT1结合和磷酸化，Y519是必需的。

图18.IL2-IL2Rβ-CD28嵌合体(CIRB28)的示例性示意图。

发明详述

在没有外源IL2的情况下，本发明的组合物和方法选择性地激活并且扩增了NK细胞，同时在体内和体外两种情况下，维持了NK细胞毒性和增殖，规避了在NK细胞中对IL2Rα的要求及其表达的缺乏，因此避免了IL2脱靶效应、细胞因子竞争、和下调性淋巴样细胞(像T-reg)的激活。

IL2将结合低亲和性受体IL2Rα(CD25)(21)，或结合中间亲和性受体IL2Rβ(CD122)和共有的IL2Rγ链(CD132)(22，23)，并且与所有这些结合以形成高亲和性四元复合物(24)。成人NK细胞可能仅表达IL2Rβ和IL2Rγ亚基(25)，并且因此对于低剂量的IL2是相对不敏感的，但是当IL2Rα表达时获得敏感性(26)。在小鼠中，与野生型IL2相比，最近开发的IL2“超级因子(superkine)”(27)通过直接地并且以高亲和性结合IL2Rβ而绕开IL2Rα产生了更好的抗肿瘤作用。然而，它仍然引起了一些形式的肺水肿。

本文描述的新型嵌合体CIRB包含IL2及其受体IL2Rβ，二者通过源自IL2Rα的细胞外结构域的肽接头连接。该接头被计算上确定为合理地柔性的，而没有不利地影响通常与柔性负相关的嵌合体稳定性(28)。当被引入NK92细胞时，CIRB诱导了无限的细胞扩增，并且赋予了与IL2表达引发的体外细胞毒性相比，类似或更高的体外细胞毒性。在体内，针对中等尺寸实体瘤，NK92^CIRB的抗癌活性基本上优于NK92^IL2引发的抗癌活性。另外，与IL2相比，CIRB赋予了对TGFβ1、地塞米松连同IL4的实质顺应性。在TME中，此优点会是关键的，其中TGFβ1是由多种细胞(包括癌症相关成纤维细胞)分泌的(29)，并且在T-reg上以膜结合形式存在，从而诱导NK细胞的无反应性(30)，或在NK细胞中通过MDSC来抑制NKG2D表达以及IFN-γ产生(31)。癌细胞还规则地脱落包含膜结合形式的TGFβ1的肿瘤来源外泌体(TDE)，导致NKG2D的下调(32)和IL2信号传导的抑制(33)。TGFβ1通过诱导的微小RNA(miR)-183介导NK抑制，该诱导的微小RNA(miR)-183抑制共激活子/适配子DAP12表达，因此使NK细胞中的若干激活信号不稳定(34)。在NK92^CIRB细胞中CIRB表达还提供了对dex的抗性，同时消除了NK92^IL2细胞。Dex通过抑制IL2从CD4+T细胞产生，并且减少NK细胞中的激活受体NKG2D和Nkp46，部分损害了淋巴细胞的功能(35)。糖皮质激素可以干扰巨噬细胞激活和抗原呈递，抑制若干促炎细胞因子、趋化因子、细胞粘附分子及炎症性反应中涉及的其他酶的转录(36)。NK92^IL2对dex的极端敏感性可以通过IL2 RNA的先前报道的不稳定来解释(37)。此RNA不稳定可以潜在地发生在NK92^IL2细胞中，但是当在NK92^CIRB细胞中与IL2RβRNA融合时，并不如此。

CIRB和在更小程度上IL2的稳定表达允许在NK92细胞系中实质性CD16的表达。然而，外源重组IL2不能介导这种表达。类似地，发现产生并且分泌IL2的NK92-MI细胞系缺乏CD16，如先前报道(38)。当与曲妥珠单抗组合时，CD16表达通过ADCC进一步增强了NK92^CIRB和NK92^IL2细胞毒性。CIRB诱导了NCR、NKP44(9倍)、NKP46(1.4倍)和NKP30(1.7倍)的大量表达连同INFγ适度但显著的增加。最后，在NK92^IL2中，颗粒酶-B表达实质性地下降。有趣的是，在NK92^CIRB中CD25表达显著下降，因为在嵌合体CIRB存在的情况下，它是不必要的(图5A)。

显示当与艾洛珠单抗组合时，将CD16引入NK细胞的当前遗传修饰增加了NK细胞介导的针对多发性骨髓瘤的ADCC(39)。仅在NK92^CIRB和NK92^IL2中，而不是在用IL2刺激的NK92-MI或NK92中诱导了CD16的事实可能通过以某种方式转化为NK92^CIRB和NK92^IL2的更强激活和生长的持续性IL2信号传导来解释。实际上，NK92^CIRB和NK92^IL2的生长速率是NK92-MI的2倍(图9)，表明更高水平的激活。NK92^CIRB和NK92^IL2的更高激活的另一个指征是与用IL2刺激48小时的亲本NK92相比，NKP44的显著诱导。

另外，与NK92^IL2细胞相比，在辐射后，NK92^CIRB可以在体内增殖远远更长的时间，并且还具有更好的生存期。当暴露于类似条件时，它们还超过了NK92-MI(38)。在体外，NK92^IL2细胞分泌足够的IL2来维持其激活和增殖。然而，在体内，它们并不能产生足够的IL2细胞外浓度来维持激活和增殖。这可能是由于在免疫感受态动物中由T-reg和其他免疫细胞对IL2的竞争造成的。

因此，本文描述的包含CIRB的新型嵌合体赋予NK92细胞非常有用的属性，这些有用的属性改进癌症和潜在病毒感染的免疫疗法。

使用供体NK细胞的细胞免疫疗法是可以实现显著抗癌作用、安全性且没有诱导移植物抗宿主疾病(GVHD)的风险的新兴领域。此安全性特征连同脱肿瘤/中靶毒性目前阻碍了CAR-T技术的成功(40)。目前若干NK细胞系(Khyg-1、NKL、NKG、NK-YS、YT、YTS和HANK-1细胞)用于临床前研究。然而，在临床环境中，已经广泛评估了仅NK92细胞系的安全性和功效(41，42)。NK92细胞是CD56⁺、CD3^-和CD16^-，并且需要IL2进行生长和激活(43)。不像原代NK细胞，NK92细胞和其他NK细胞系构成了稳定并且同源的群体。它们适合用慢病毒(是已经显示针对淋巴细胞的良好安全性特征的基因转移平台)来进行遗传修饰(44)。在NK细胞指导的免疫疗法中，已经实现了很多令人鼓舞的进展(45)。然而，对于NK细胞离体扩增的日益增长的需求需要高度激活的细胞和降低的细胞扩增成本二者。此外，针对在TME中发现的免疫抑制剂，输注的细胞必须具有更高的激活潜能并且拥有有利的特征。

本发明的策略包括，使白细胞介素与在CIRB、CIRB28、和CIRB21嵌合体中的受体融合实现更好的细胞因子激活，具有特异性，并且没有系统性毒性或与免疫系统的其他细胞组分的竞争。NK细胞的自激活提供了若干区别性特征，例如对TGFβ1或糖皮质激素的顺应性、CD16的大量表达、在辐射后的更高存活、以及体内优越的抗肿瘤活性。

嵌合蛋白

本披露提供了如本文描述的嵌合体，例如包含IL2和IL2Rβ的嵌合体(例如CIRB)；包含IL2、IL2Rβ和IL21R的嵌合体(例如CIRB21)；和/或包含IL2、IL2Rβ、和CD28的嵌合体(例如CIRB28)。可以使用例如用于操纵和表达重组DNA的标准分子生物学程序，产生所有本文描述的融合蛋白。参见例如Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],Ausubel,F.M.等人(编辑)John Wiley&Sons[约翰威利父子出版公司](1995)，以及Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册](第四版)，Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012年6月15日)及其增补版，以及其他标准实验室手册。可以在NK细胞例如原代的或培养的NK细胞中表达(例如稳定表达)嵌合体。然后将细胞输注到受试者，例如患有(例如已经诊断为患有)癌症的受试者体内。

下文提供了构成本文描述的嵌合体的不同结构域的示例性序列。在一些实施例中，使用的序列与如本文定义的示例性序列是至少80％相同的。在一些实施例中，这些序列是至少85％、90％、95％、99％或100％相同的。

为了确定两个序列的百分比一致性，出于最佳比对的目的将序列比对(根据最佳比对的需要，在一个第一和第二氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位，并且出于比较目的，非同源序列可以忽略)。进行了比对，出于比较目的而比对的参比序列的长度是至少80％(在一些实施例中，是参考序列的长度的约85％、90％、95％、或100％)。然后比较了在相应位置处的核苷酸或残基。当第一序列中的位置被与在第二序列中的相应位置处相同的核苷酸或残基占据时，则这些分子在那个位置处是相同的。两个序列之间的百分比一致性是所述序列共享的相同位置的数量的函数，考虑了空位数量以及每个空位的长度，需要引入它们以用于两个序列的最佳比对。

序列比较和两个序列之间百分比一致性的测定可以使用数学算法来完成。例如，使用Needleman和Wunsch((1970)J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:444-453)算法，使用Blossum 62打分矩阵，其中空位罚分为12，空位延伸罚分为4，并且移码空位罚分为5，来确定两个氨基酸序列之间的百分比一致性，所述算法已并入GCG软件包中的GAP程序中。

IL2-IL2Rβ(CIRB)

本文描述的融合蛋白尤其包括用间插接头融合在一起的IL2和IL2Rβ。IL2的序列是本领域已知的；示例性人类IL2前体序列显示在SEQ ID NO:34中。

氨基酸1-20是信号序列，并且因此如果需要，可以被其他信号序列替换。人类IL2的示例性核酸序列是：

在融合蛋白的不同结构域之间，可以使用本领域已知的接头序列；例如，可以使用一个、两个、三个、四个、五个或更多个GGGS序列。在优选的实施例中，IL2和IL2Rβ的N末端之间的接头包含IL2Rα的细胞外结构域(EMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSC(SEQ ID NO:28))。例如在IL2与接头之间，还可以添加标签，例如cMyc标签(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:29))。在登录号NM_000586.3下，在GenBank中，可获得编码IL2的示例性核酸序列。

IL2Rβ的序列也是本领域已知的；示例性人类IL2Rβ前体序列显示在SEQ ID NO:35中。

氨基酸1-26是信号序列，并且优选地在本发明的构建体中缺失，例如该序列包含SEQ ID NO:35的氨基酸27-551。在GenBank中，在登录号NM_000878.4(变体1)、NM_001346222.1(变体2)；和NM_001346223.1(变体3)下，可获得编码IL2Rβ的示例性核酸序列。变体1、2和3编码相同的蛋白。

IL2-IL2Rβ-IL-21(CIRB21)

白细胞介素IL4、IL7、IL9、IL15和IL21属于与IL2相同的家族，并且使用同一个共有的IL2Rg。它们都具有其各自专用的受体，除了IL2和IL15，这二者除了其各自的α受体，还使用IL2Rβ(图11)。当将可溶性IL2、IL4、IL7、或IL21添加至表达嵌合体NK92^CIRB的NK92细胞时，仅IL21显著增强了针对PC-3细胞的细胞毒性。因此克隆了IL21R的完整细胞质结构域，然后在嵌合体CIRB中，将其头尾相接地添加至IL2Rβ的C末端。这生成新型IL2-IL2Rβ-IL21R嵌合体(称为CIRB21，在图13中示例性说明)。如本文所示，通过仅使用一个配体和杂合受体有可能模仿来自多种细胞因子(这些细胞因子经由不同受体激活NK细胞)的激活信号。

在一些实施例中，本发明的构建体包括在IL2Rβ部分的C末端处的IL21R的细胞质结构域(任选地其间具有间插接头)。IL21R的序列也是本领域已知的；示例性人类IL21R前体序列显示在SEQ ID NO:36中。

优选地，在这些实施例中，IL21R来源的结构域包含SEQ ID NO:36的氨基酸254-538。在GenBank中，在登录号NM_021798.3下可获得编码IL21R的示例性核酸序列。

NK细胞中的IL2-IL2Rβ-CD28(CIRB28)

当在转化的细胞中下调MHC-1分子表达(Algarra等人，Hum Immunol[人类免疫学]2000；61(1):65-73)时以及在病毒感染期间(Tortorella等人，Annu Rev Immunol[免疫学年鉴]2000；18:861-92)，激活NK细胞(和其他细胞)。然而，通常由来自MHC-1的抑制信号的表达，引起肿瘤细胞的抗性表型的获得(Kochan等人，Oncoimmunology[肿瘤免疫学]2013；2(11):e26491)。具体地，已知HLA-G抑制NK92介导的肿瘤细胞裂解(Lin等人，Ann Oncol[肿瘤学年鉴]2007；18(11):1804-9)。针对此问题的一个潜在解决方案可能是使用多种激活信号来抵消这些抑制信号。其中用于T细胞的最有效共刺激分子是CD28和4-1BB。CD28激活需要在肿瘤细胞上的CD80和CD86刺激性配体表达。结果是，显示肿瘤中的CD80表达导致其排斥(Townsend等人,Science[科学]1993；259(5093):368-70)，相反地，在CD28^-/-小鼠中，细胞的和T细胞依赖的免疫力是相当缺乏的(Shahinian等人，Science[科学]1993；261(5121):609-12)。因此，认为对于若干种癌症的肿瘤，低水平的CD80是一种逃逸机制(Tirapu等人，Cancer Res[癌症研究]2006；66(4):2442-50；Hersey等人，Int J Cancer[国际癌症杂志]1994；58(4):527-32；Bernsen等人，Br J Cancer[英国癌症杂志]2003；88(3):424-31)。例如，使用抗erbB2嵌合受体中的CD28激活结构域允许体内MHC-1⁺淋巴瘤的肿瘤进展的抑制(Pegram等人，J Immunol[免疫学杂志]2008；181(5):3449-55)。尽管CD28是由NK92细胞表达的(Gong等人，Leukemia[白血病]1994；8(4):652-8)，但是其激活不是由所有癌症介导的。

在一些实施例中，本发明的构建体包括在IL2Rβ部分的C末端处的CD28的激活结构域(任选地其间具有间插接头)。CD28的序列也是本领域已知的；示例性人类CD28前体序列显示在SEQ ID NO:38中。

优选地，在这些实施例中，CD28来源的结构域包含细胞内结构域,例如SEQ ID NO:38的氨基酸180至220，即RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS(SEQ ID NO:39)。在GenBank中，在登录号NM_006139.3下，可获得编码CD28的示例性核酸序列。

调节性T细胞(T-reg)中的IL2-IL2Rβ-CD28(CIRB28)

患有血液恶性肿瘤的患者大大受益于同种异体造血干细胞移植(AHSCT)。在此策略中，供体免疫系统将攻击患者肿瘤细胞，在称为移植物抗肿瘤的现象中，具有治疗的潜力。不幸地，供体免疫细胞也会攻击接受者患者的健康组织，这立即发生或发生在之后的100天内，并且引起GVHD。在AHSCT中，这会导致15％的死亡，和/或40％至60％的发病率。免疫抑制目前是护理标准，用来管理GVHD(Luznik和Fuchs，Immunol Res[免疫学研究]2010；47(1-3):65-77；Storb等人，Biol Blood Marrow Transplant[血液和骨髓移植生物学]2010；16(1增补版):S18-27)。然而，已经发现，在AHSCT期间，表达转录因子叉头盒P3(FOXP3)的T-reg细胞(Roncador等人，Eur J Immunol[欧洲免疫学杂志]2005；35(6):1681-91；Hall等人，J Exp Med[实验医学杂志]1990；171(1):141-57)抑制或缓和GVHD(Beres等人，J Immunol[免疫学杂志]2012；189(1):464-74；Brunstein等人，Blood[血液]2011；117(3):1061-70)。通过位于其第一内含子中的保守非编码序列2(CNS2)内的11CpG基序的表观遗传去甲基化，维持FOXP3表达的持久性。此去甲基化模式化持续T-reg的寿命，并且受十-十一-易位DNA双加氧酶保护，该双加氧酶由通过IL2信号传导激活的STAT5募集至CNS2(Nair等人，Mol Cells[分子细胞学]2016；39(12):888-97)，从而保护CNS2中的CpG基序，免于被DNA甲基转移酶重新甲基化。类似地，CTLA-4，T细胞激活的一种重要的下调因子，在T-reg中上调，并且也受IL2控制(Wang等人，Scand J Immunol[斯堪的纳维亚免疫学杂志]2001；54(5):453-8；Bell等人，J Autoimmun[自体免疫杂志]2015；56:66-80；Gasteiger等人，Front Immunol[免疫学前沿]2012；3:179)。T-reg极端响应IL2，这是由于其大量的CD25表达(Dieckmann等人，Exp Med[实验医学]2001；193(11):1303-10)，以及其能够通过趋化因子受体CCR7到达IL2来源(Smigiel等人,J Exp Med[实验医学杂志]2014；211(1):121-36)。然而，激活的T-reg已经显示可降低CD25表达，并且改变其IL2信号传导，有利于ICOS信号传导途径。这导致FOXP3表达的不稳定性，使得可能从激活并且并未终末分化的T-reg(Sharma等人，Immunity[免疫力]2010；33(6):942-54)转化为促炎T细胞效应子或发育成产IFN-γ促炎Th1效应细胞(Zhang等人，J Immunol[免疫学杂志]2017；198(7):2612-25；Feng等人，Gastroenterology[胃肠学]2011；140(7):2031-43；Takahashi等人，J Exp Med[实验医学杂志]2011；208(10):2055-67)或甚至Th17(46)。简而言之，T-reg长期激活和CNS2的去甲基化连同增殖需要IL2和CD28二者共刺激(Tang和Bluestone，Immunol Rev[免疫学综述]2006；212:217-37；Chen等人，J Immunol[免疫学杂志]2011；186(11):6329-37)。

因此，本文描述的IL2-IL2Rβ-CD28嵌合体可以具有双重用途：帮助NK92细胞克服来自MHC-1+癌细胞的抑制信号，并且独立地，出于治疗GVHD的目的，激活T-reg。如本文描述，不希望受理论束缚，将CD28的激活结构域添加至新型嵌合体IL2-IL2Rβ-CD28(图18)，组合来自IL2和CD28的共刺激信号将导致优越的NK92激活，这会帮助克服经由MHC-1+的肿瘤逃逸。此嵌合体还会导致具有长期FOXP3表达的T-reg细胞的增殖。此策略会绕开T-reg激活和扩增所需的人工抗原呈递细胞(aAPC)、树突细胞或抗CD3抗体的使用。

核酸和表达载体

本文描述的组合物可以包括编码如本文描述的嵌合体的核酸分子。包含核酸分子的表达载体可以用于这些嵌合体例如在如本文描述的NK细胞或T-reg细胞中表达。

编码选择的嵌合体的核酸可以插入表达载体中，从而制备表达载体。多个适合的载体是本领域已知的，例如病毒载体，包括重组反转录病毒、腺病毒、腺病毒伴随病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒-1、腺病毒源载体、或重组细菌或真核质粒。例如，表达构建体可以包括嵌合体的编码区，以及一个或多个调节区，例如启动子序列，例如限制选择的细胞类型的表达的启动子序列、条件启动子、或强通用启动子；增强子序列；非翻译调节序列，例如5’非翻译区(UTR)、3'UTR；聚腺苷酸化位点；和/或绝缘子序列，该一个或多个调节区指导嵌合体的表达。此类序列是本领域已知的，并且技术人员将能够选择适合的序列。参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法],Ausubel,F.M.等人(编辑)JohnWiley&Sons[约翰威利父子出版公司](1995)，以及Green和Sambrook，Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆:实验室手册](第四版)，Cold Spring HarborLaboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012年6月15日)及其增补版，以及其他标准实验室手册。

可以在任何生物学有效载体中给予表达构建体，例如能够在体内有效递送组分基因到细胞的任何配制品或组合物。病毒载体直接转染细胞；可以在以下的帮助下递送质粒DNA：例如阳离子脂质体(例如脂质转染)或衍生的(例如抗体缀合的)，聚赖氨酸缀合物，短杆菌肽S，人工病毒包膜或其他此类细胞内载体，连同基因构建体的直接注射，或CaPO₄沉淀。在一些实施例中，将核酸“裸露地”施加到细胞，即在简单缓冲液中施加，而不使用任何另外的试剂来增强摄取。参见例如Current Protocols in Molecular Biology[分子生物学现代方法]，Ausubel,F.M.等人(编辑)Greene Publishing Associates[格林出版联合公司]，(1989)，节段9.10-9.14，以及其他标准实验室手册。

NK细胞和T-reg细胞

本发明的方法包括在NK细胞，例如CD3-CD56+淋巴细胞中表达(稳定地或瞬时地)本文描述的嵌合体；参见Cheng等人，Cellular&Molecular Immunology[细胞与分子免疫学](2013)10,230–252。NK细胞可以是原代细胞，例如源自受试者的外周血液，并且离体增殖，或可以是培养的NK细胞。

当使用原代细胞时，同种异体NK细胞是优选的，因为它们并未暴露于免疫抑制，并且应是完全活性的。在优选的实施例中，可以通过以下获得细胞：针对单倍体相关供体进行单采血液成分术，从而收集外周血液白细胞，然后在任选的扩增和给予之前，将其中的CD3+细胞耗尽。参见例如Davis等人，Cancer J.[癌症杂志]2015年11月-12月；21(6):486–491。可替代地，从外周的或脐带的血液细胞、干细胞或甚至诱导性多能干细胞(iPSC)获得细胞；参见Cheng等人，Cellular&Molecular Immunology[细胞与分子免疫学](2013)10,230–252。

培养的NK细胞系是本领域已知的，例如包括NK-92、KHYG-1、NKL、NKG、NK-YS、YT、YTS和haNK-1细胞，制造新NK细胞系的方法也是已知的。NK-92是从来自患有非霍奇金淋巴瘤的受试者的血液的NK细胞离体永生化的溶细胞性癌细胞系。NK-92细胞保留了大部分激活受体和溶细胞性信号传导途径，但是缺乏由正常NK细胞显示的主要抑制性受体，并且并不表达Fc受体CD16，并且因此也不能介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。在人类中，NK-92细胞是肿瘤选择性的并且是非免疫原性的。在Gong等人，Leukemia.[白血病]8:652-8(1994)；Yan等人，Clin Cancer Res.[临床癌症研究]4:2859-68(1998)；WO 1998/49268和U.S.2002/0068044中描述了NK-92细胞系。已经评估了NK-92细胞在癌症(包括血液恶性肿瘤)中的潜在治疗用途；参见例如Ljunggren和Malmberg，Nat Rev Immunol.[自然综述免疫学]2007年5月；7(5):329-39；Tonn等人，J Hematother Stem Cell Res.[血液疗法与干细胞研究杂志]2001年8月；10(4):535-44；Klingemann,Cytotherapy[细胞疗法].2005；7(1):16-22；Malmberg等人，Cancer Immunol Immunother.[癌症免疫学，免疫疗法]2008年10月；57(10):1541-52。haNK是NK-92变体细胞系，其表达高亲和性Fc受体FcγRIIIa(158V)，并且在临床开发中要与IgG1单克隆抗体(mAb)组合。taNK是已经转染了表达针对给定肿瘤抗原的嵌合抗原受体的基因的被靶向的NK-92细胞。从患有侵袭性NK白血病的患者的血液开发了KHYG-1细胞(Yagita等人，Leukemia[白血病](2000)14,922-930)，该白血病是IL-2依赖的并且产生颗粒酶M。从患有CD3-CD16+CD56+大颗粒淋巴细胞(LGL)白血病的患者的外周血液建立了NKL细胞(Robertson等人，Exp Hematol.[实验血液学]1996Feb；24(3):406-15)。从患有快速进行性非霍奇金淋巴瘤的患者的外周血液建立了NKG细胞(Cheng等人，CellTransplant.[细胞移植]2011；20(11-12):1731-46)。从患有白血病状态鼻血管中心性自然杀伤(NK)细胞白血病(具有全身性皮肤浸润)的患者建立了NK-YS细胞(Tsuchiyama等人，Blood.[血液]1998年8月15；92(4):1374-83)。从患有急性淋巴母细胞性淋巴瘤(ALL)和胸腺瘤的患者的心包液中的细胞建立了YT细胞-一种人类NK样白血病细胞系(Yodoi等人，JImmunol[免疫学杂志]134:1623-1630(1985))；Harnack等人，Anticancer Research[抗癌症研究]31(2):475-479(2011))。YTS是NK细胞白血病系YT的亚克隆。所有这些细胞都是可商购的。对于NK细胞系的另外的信息，参见Klingermann等人，Front.Immunol.[免疫学前沿]7:91(2016)；Dahlberg等人，Front.Immunol.[免疫学前沿]6:605(2015)。可以原样使用这些细胞，或修饰(例如遗传修饰)后使用这些细胞，如US 7618817；US8034332(分泌细胞因子(包括IL2)的NK-92细胞)；US 8313943(表达CD16的NK-92细胞)；WO 2015193411(表达CAR的nk-92细胞)；以及WO 2016160602(表达FcR(包括CD16)的NK-92细胞)中描述的。用于产生和制造培养的NK细胞的另外的方法是本领域已知的；参见例如Chabannon等人，FrontImmunol.[免疫学前沿]2016；7:504，该文献尤其提供了针对培养基、细胞因子、和培养系统的示例性参数。

本发明的方法还包括在T-reg细胞，即CD4+/CD25+T细胞中表达(稳定地或瞬时地)本文描述的嵌合体(例如IL2-IL2Rβ-CD28嵌合体)。T-reg细胞可以是原代细胞，例如源自受试者的外周血液，并且离体增殖，或可以是培养的T-reg细胞。

当使用原代T-reg细胞时，离体扩增的供体T-reg细胞，例如来自外周血液的天然存在的调节性T细胞(nT-reg)是优选的。在优选的实施例中，这些细胞是使用本领域已知的方法，从来自供体的外周血液获得的，并且离体扩增；参见例如Dieckmann等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]193(11):1303–1310(2001)；Chakraborty等人，Haematologica[血液病学]98(4):533-537(2013)；Hippen等人，Sci Transl Med.[科学转化医学]2011年5月18日；3(83):83ra41；以及Taylor等人,Blood.[血液]2002；99:3493-3499。可替代地，细胞可以是从脐带血获得的(参见例如Brunstein等人，Blood.[血液]2011年1月20日；117(3):1061–1070)。

应根据优质生产规范(GMP)，在GMP设施中维持NK细胞和T-reg细胞。

在一些实施例中，NK细胞或T-reg细胞被工程化为包括自杀基因，例如允许通过引入特异性和选择性的试剂，杀灭表达该基因的细胞，作为防止肿瘤发生的安全措施。多个自杀基因系统是本领域已知的，包括胞嘧啶脱氨酶基因、水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶基因、硝基还原酶基因、大肠杆菌gpt基因、大肠杆菌Deo基因(参见例如Yazawa等人,WorldJ.Surg.[世界外科杂志]2002July；26(7):783-9)、诱导型半胱天冬酶9(iCas9)(Di Stasi，N Engl J Med[新英格兰医学杂志]365:1673-1683(2011)和Morgan,Molecular Therapy[分子治疗](2012)；20:11-13)、细胞色素P450、或单纯疱疹病毒的胸苷激酶(TK)基因(它可以是野生型或突变体TK基因(例如tk30、tk75、sr39tk))。可以使用更昔洛韦杀灭表达TK蛋白的细胞，参见例如WO2016160602。

可以将表达本文描述的嵌合体的NK细胞或T-reg细胞连同用于共给予的任何补充活性剂掺入药物组合物中。此类组合物典型地包含细胞和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”包括任何的和所有的与药物给予相容的溶剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂等(Gennaro，2000)。此类载体或稀释剂的优选实例包括但不限于：水、盐水、林格氏溶液、右旋糖溶液和5％人血清白蛋白。还可以使用脂质体和非水运载体，例如固定油。还可以将补充性活性化合物掺入组合物中。

无菌注射溶液可通过将活性化合物(例如，如本文描述的NK细胞或T-reg细胞)以所需的量掺入具有成分中的一种或组合(根据需要)的适当溶剂中来制备；优选地，溶剂是已经灭菌的，或配制后再灭菌。在一些实施例中，细胞是低温保存的。

癌症免疫疗法

本文描述的方法包括用于治疗与异常凋亡过程或分化过程相关联的障碍的方法，这些障碍例如是细胞增殖性障碍或细胞分化障碍，例如癌症，包括实体瘤和造血细胞癌。在一些实施例中，该障碍是实体瘤，例如乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、脑癌、肝癌、肺癌、肾癌、皮肤癌、或结肠癌。通常，这些方法包括向需要、或已经被确定为需要此类治疗的受试者给予治疗有效量的表达如本文描述的嵌合体的NK细胞。

如在此上下文中使用的，“治疗”意指改善与异常凋亡过程或分化过程相关联的障碍的至少一个症状。例如,治疗会导致肿瘤尺寸或生长速率减小。给予治疗有效量的本文描述的化合物用于治疗与异常凋亡过程或分化过程相关联的病症将尤其导致肿瘤尺寸减小或生长速率降低、复发风险或频率降低、复发延迟、转移减少、生存期增加、和/或发病率和死亡率降低。

细胞增殖性障碍和/或分化障碍的实例包括癌症，例如癌、肉瘤、转移性障碍或造血肿瘤性障碍(例如白血病)。转移性肿瘤可以源自多种原发性肿瘤类型，包括但不限于前列腺、结肠、肺、乳腺和肝来源的那些。

如本文所用，术语“癌症”、“过度增殖性”和“肿瘤性”是指具有自主生长能力的细胞，即以快速增殖的细胞生长为特征的异常状态或病症。过度增殖性或肿瘤性疾病状态可以被分类为病理的，即表征或构成疾病状态，或可以被分类为非病理的，即偏离正常但与疾病状态无关。该术语意在包括所有类型的癌性生长或致癌过程、转移性组织或恶性转化的细胞、组织或器官，而不论组织病理学类型或侵袭性阶段。“病理过度增殖性”细胞存在于表征为恶性肿瘤生长的疾病状态中。非病理过度增殖性细胞的实例包括与伤口修复相关联的细胞的增殖。

术语“癌症”或“赘生物”包括各种器官系统的恶性肿瘤，诸如影响肺、乳腺、甲状腺、淋巴、胃肠道和生殖泌尿道的那些，以及包括诸如大多数结肠癌、肾细胞癌、前列腺癌和/或睾丸肿瘤、非小细胞肺癌、小肠癌和食道癌的恶性肿瘤的腺癌。

术语“癌”是领域公认的，并且是指上皮或内分泌组织的恶性肿瘤，包括呼吸系统癌、胃肠道系统癌、泌尿生殖系统癌、睾丸癌、乳腺癌、前列腺癌、内分泌系统癌、和黑色素瘤。在一些实施例中，疾病是肾癌或黑色素瘤。示例性癌包括从子宫颈、肺、前列腺、乳腺、头颈部、结肠和卵巢组织形成的癌。术语还包括癌肉瘤，例如，其包括由癌性和肉瘤组织构成的恶性肿瘤。“腺癌”是指源自腺体组织的癌或其中肿瘤细胞形成可识别的腺体结构的癌。

术语“肉瘤”是领域公认的，并且是指间充质衍生的恶性肿瘤。

增殖性障碍的另外的实例包括造血肿瘤性障碍。如本文所用，术语“造血肿瘤性障碍”包括涉及造血来源的增生性细胞/赘生性细胞的疾病，这些细胞例如源自骨髓、淋巴或红细胞系、或其前体细胞。优选地，疾病源自低分化急性白血病，例如成红细胞白血病和急性巨核细胞白血病。另外的示例性骨髓障碍包括但不限于急性早幼粒细胞白血病(APML)、急性骨髓性白血病(AML)和慢性骨髓性白血病(CML)(综述于Vaickus、L.(1991)CritRev.in Oncol./Hemotol.[肿瘤学/血液学评论性综述]11:267-97)；淋巴恶性肿瘤，包括但不限于急性淋巴母细胞性白血病(ALL)，其包括B系ALL和T系ALL、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、幼淋巴细胞白血病(PLL)、毛细胞白血病(HLL)和华氏巨球蛋白血症(WM)。另外形式的恶性淋巴瘤包括但不限于非霍奇金淋巴瘤及其变体、外周T细胞淋巴瘤、成人T细胞白血病/淋巴瘤(ATL)、皮肤T淋巴细胞瘤(CTCL)、大颗粒淋巴细胞性白血病(LGF)、霍奇金病和里-斯二氏病(Reed-Sternberg disease)。

GVHD和自身免疫性疾病

本文描述的方法包括治疗与异常免疫应答相关联的障碍，例如移植物抗宿主疾病或GVHD或自身免疫性疾病。这些方法可以包括向有需要的受试者给予表达如本文描述的IL2-IL2Rβ-CD28嵌合体的调节性T细胞。

同种异基因骨髓移植(BMT)已经显示在血液恶性肿瘤和一些实体瘤中有效，但是GVHD的高发病率已经限制了BMT的有效性和使用。T-reg细胞已经显示在抑制GVHD中的功效；参见Olson等人，Blood.[血液]2010年5月27日；115(21):4293-301；Sung和Chao，STEMCELLS TRANSLATIONAL MEDICINE[干细胞转化医学]，2013；2:25–32；Dieckmann等人，J.Exp.Med.[实验医学杂志]193(11):1303–1310(2001)；Chakraborty等人，Haematologica[血液病学]98(4):533-537(2013)；Hippen等人，Sci Transl Med.[科学转化医学]2011年5月18日；3(83):83ra41；Taylor等人，Blood.[血液]2002；99:3493-3499；以及Brunstein等人，Blood.[血液]2011；117(3):1061–1070。

在很多自身免疫性疾病，例如1型糖尿病(T1D)(Brusko等人，Diabetes[糖尿病]2005；54(5):1407-14)、类风湿关节炎(van Amelsfort等人，Arthritis Rheum[关节炎与风湿病]2004；50(9):2775-85)、多发性硬化症(Fletcher等人，J Immunol[免疫学杂志]2009；183(11):7602-10)、系统性红斑狼疮(Lyssuk等人，Adv Exp Med Biol[实验医学与生物学研究进展]2007；601:113-9)和银屑病(Sugiyama等人，J Immunol[免疫学杂志]2005；174(1):164-73)、连同特应性疾病(Singer等人，Front Immunol.[免疫学前沿]2014；5:46)中，已经报道了T-reg功能的损害或效应T细胞对T-reg的抗性。在T-reg中升高的CD25表达使得它们特别响应于IL2，并且例如在T1D的情况下利用了这一点，其中给予低剂量IL-2促进了T-reg存活，并且针对糖尿病保护了NOD小鼠(Tang等人，Immunity[免疫力]2008；28(5):687-9；Grinberg-Bleyer等人，J Exp Med[实验医学杂志]2010；207(9):1871-8)，并且在儿童中，在1型糖尿病中，输注T-reg保持了β细胞功能(Marek-Trzonkowska等人,DiabetesCare[糖尿病护理](2012)35:1817–2010)。

T-reg，例如CD4+CD25+，例如CD4+CD25+CD127-调节性T细胞(例如，对于特应性调节性T细胞是CD4+CD25^高CD127-ICOS+，或对于GVHD是CD4+CD25+CD127-CD62L⁺)，其任选地也是FOXP3+，表达IL2-IL2Rβ-CD28嵌合体，可以用于减少同种异体反应性T-细胞(认为这些T细胞介导GVHD和自身免疫，并且损坏宿主组织)。在一些实施例中，表达如本文描述的IL2-IL2Rβ-CD28嵌合体的T-reg细胞的有效量是足以减少同种异体反应性T-细胞的数量并减少自身免疫应答(例如通过减少供体T细胞增殖并且增加T细胞凋亡)的量。参见例如Singer等人，Front Immunol.[免疫学前沿]2014；5:46；Riley等人，Immunity[免疫力]2009年5月；30(5):656–665。

给药和配量的方法

这些方法包括给予(优选地通过静脉内输注)治疗有效量的本文描述的NK细胞。可以凭经验确定治疗有效剂量，例如基于动物实验或临床研究。在一些实施例中，这些方法包括每个剂量至少10⁴并且高达1x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷、1x10⁸、3x10⁸、5x10⁸、1x10⁹、或5x10⁹个细胞(例如在10亿和30亿个细胞之间，或这些数量中任两个之间的任何范围，包括端点)的一次或多次输注。在治疗期间，可以将这些细胞给予受试者一次，或可以多次给予，例如每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个小时一次，或每1、2、3、4、5、6或7天一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多周一次，或这些数量中任两个之间的任何范围，包括端点。参见例如Ljunggren和Malmberg，Nat Rev Immunol.[自然综述免疫学]2007年5月；7(5):329-39；Tonn等人，J Hematother Stem Cell Res.[血液疗法与干细胞研究杂志]2001年8月；10(4):535-44；Klingemann，Cytotherapy.[细胞疗法]2005；7(1):16-22；Malmberg等人，Cancer Immunol Immunother.[癌症免疫学，免疫疗法]2008年10月；57(10):1541-52；Cheng等人，Cellular&Molecular Immunology[细胞与分子免疫学](2013)10,230–252。

在优选的实施例中，在输注到受试者体内之前，处理这些细胞，这样使得它们不再能够增殖，但是保留了细胞毒性活性。实现此状态的一个方式是通过例如500至1000cGy或500、1000、2000、或3000cGy的γ辐射。按约750和1000戈瑞之间的剂量，例如750、800、850、900和950戈瑞的NK-92细胞的γ辐射，被认为满足此目的。可以采用另外形式的辐射，包括例如紫外线辐射。用于此目的的适合的来源包括例如137Cs源(Cis-US公司，贝德福德，马萨诸塞州；Gammacell 40，加拿大原子能有限公司(Atomic Energy of Canada Ltd.)，加拿大)。可替代地，这些细胞可以包含如以上描述的自杀基因。

在一些实施例中，在NK细胞输注之前，可以用预备化疗方案治疗受试者，例如高环磷酰胺和氟达拉滨(Hi-Cy[60mg/kg×2天]/Flu[25mg/m²×5天])、低环磷酰胺(750mg/m²)和甲基强的松(1000mg/m²)、或单独氟达拉滨(25mg/m²×5天)，或用全身辐射，例如200-500的剂量(例如400cGy)辐射。

组合疗法：检查点抑制剂和抗肿瘤单克隆mAb

在一些实施例中，可以作为治疗方案(包括给予一种或多种检查点阻断剂和/或抗肿瘤抗体)的一部分，给予本文描述的表达嵌合体的NK细胞。NK细胞可以与检查点阻断剂和/或抗肿瘤抗体同时给予，例如基本上同时地或顺序地，例如在给予检查点阻断剂和/或抗肿瘤抗体的48、24、12、6、5、4、3、2、或1小时内，或45、30、20、或15分钟内。

如本文所用，术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或其免疫活性部分，即抗原结合部分。免疫球蛋白分子的免疫活性部分的实例包括F(ab)和F(ab')₂片段，其保留了结合抗原的能力。可以商业上或使用本领域已知的方法获得此类片段。例如，可以通过用酶(例如胃蛋白酶)正常产生一个F(ab)2片段和Fc部分的许多小肽的非特异性内肽酶处理抗体来产生F(ab)2片段。所得F(ab)2片段由两个二硫键连接的Fab单元构成。Fc片段广泛降解并且可以通过透析、凝胶过滤或离子交换色谱法从F(ab)2分离。可以使用木瓜蛋白酶(一种非特异性硫醇内肽酶，其在还原剂的存在下，将IgG分子消化成类似尺寸的三个片段：两个Fab片段和一个Fc片段)，产生F(ab)片段。当感兴趣的是Fc片段时，木瓜蛋白酶是选择的酶，因为它产生50,00道尔顿Fc片段；为了分离F(ab)片段，可以去除Fc片段，例如通过使用蛋白A/G的亲和纯化。对于产生F(ab)片段，多种试剂盒是可商购的，包括ImmunoPure IgG1Fab和F(ab’)₂制备试剂盒(皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology)，罗克福德，伊利诺伊州)。此外，可以使用可商购服务来产生抗原结合片段，例如Bio Express公司，西黎巴嫩，新罕布什尔州。

抗体可以是多克隆的、单克隆的、重组的，例如嵌合的、去免疫化的或人源化的、完全人类的、非人类的(例如鼠科动物的)或单链的抗体。在一些实施例中，抗体具有效应子功能并且可以固定补体。在一些实施例中，抗体结合Fc受体的能力已经降低或没有这种能力。例如，抗体可以是不支持与Fc受体结合的同种型或亚型、片段或其他突变体，例如，它具有诱变的或缺失的Fc受体结合区。抗体可以偶联毒素或成像剂。

治疗性抗肿瘤抗体是本领域已知的，并且包括结合肿瘤抗原的人类的、人源化的和嵌合的抗体。抗体典型地是单克隆的，并且可以例如是裸露的、缀合的、或双特异性的。具体实例包括阿仑单抗、利妥昔单抗、曲妥珠单抗、替伊莫单抗、吉姆单抗、本妥昔单抗、阿曲坦单抗、blinatunomab、达雷木单抗和艾洛珠单抗；阿昔单抗；阿达木单抗；阿法赛特；巴利昔单抗；贝利木单抗；bezlotoxumab；康纳单抗；赛妥珠单抗；西妥昔单抗；达利珠单抗；地诺单抗；依法珠单抗；艾洛珠单抗；戈利木单抗；inflectra；伊匹木单抗；伊珠单抗；那他珠单抗；纳武单抗；阿托珠单抗；olaratumab；奥马珠单抗；帕利珠单抗；帕木单抗；派姆单抗；塔西单抗；苏金单抗；以及优特克单抗。针对癌症相关抗原的多种抗体是已知的；在表2-表3中描述了示例性抗体(Ross等人，Am J Clin Pathol[国临床病理学杂志]119(4):472-485,2003)。例如，该方法可以用于治疗患有癌症的受试者，该癌症是已经批准用抗肿瘤抗体进行治疗的(例如NK细胞与曲妥珠单抗组合用于患有乳腺癌的受试者，与berntuximab组合用于患有霍奇金淋巴瘤的受试者，与达雷木单抗组合用于患有多发性骨髓瘤的受试者，或与艾洛珠单抗组合用于患有多发性骨髓瘤的受试者)。

检查点阻断剂是本领域已知的并且包括针对以下的抗体：CTLA-4(例如伊匹木单抗、曲美木单抗)；PD-1(例如纳武单抗、派姆单抗、BGB-A317)；PD-L1(例如阿特珠单抗、阿维鲁单抗和度伐单抗)。

实例

本发明在以下实例中进一步说明，这些实例不得限制权利要求书中所描述的本发明的范围。

材料与方法

在以下实例中使用以下材料和方法。

试剂-地塞米松(Dex)、氯喹和基质胶(目录号126-2.5)以及人类糖基化的IL2来自西格玛-奥德里奇股份有限公司(Sigma-Aldrich Co.)。马血清(HS)、DMEM/F12培养基、Lipofectamine 2000和TRIzol来自生命技术公司(Life Technologies)。胎牛血清(FBS)来自Atlanta Biologicals公司。RPMI 1640来自龙沙集团(LONZA)。Smartscribe和BlueprintOnestep RT-PCR Takara试剂盒来自CLONTECH实验室公司(Clontech Laboratories)；Platinum SYBR Green qPCR来自英杰公司(invitrogen)，PfuUltraDNA聚合酶来自Stratagene公司。人类TGFβ1来自Antigenix America公司。IL2获得自MGH-DF/HCC重组蛋白中心(波士顿，马萨诸塞州)。人类IL-4来自Shenandoah Biotechnology公司。抗HER2(曲妥珠单抗)、人源化抗体来自BioVision公司。

质粒-包装质粒pVSV来自Clontech实验室(Clontech Laboratories)，pCMV-dR8.2dvpr来自Addgene公司(质粒#8455)。慢病毒载体CSCW-GFP和CSCW-mCherry来自MGH载体中心(波士顿，马萨诸塞州)。

细胞-HEK293T、NK92、NK92-MIU251、PC-3、HepG2、MDA-MB-231、Panc-1、U251、BT474和U266细胞来自ATCC。通过分别使用CSCW-GFP和CSCW-mCherry慢病毒载体的慢病毒转导，产生U266-GFP-Luc和NK92-mCherry-Luc细胞。在完全RPMI1640培养基中培养肿瘤细胞系PC-3、U251、U266、Panc-1、BT474和MDA-MB-231。在完全DMEM/F12中培养HEK293T和HepG2细胞。将NK92和衍生的细胞系在如下中培养：RPMI1640，其具有10％热灭活的FBS、和10％热灭活的马血清，补充有0.2mM I-肌醇、0.02mM叶酸、0.1mM 2-β巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺，添加100IU/ml IL2。所有细胞系和测定培养物都维持在37℃和5％CO2下。

嵌合体CIRB构建-使用正向引物5’-TGCAGGATCCACTCACAGTAACCTCAACTCC-3’(SEQID NO:1)和反向引物5’-TGCACTCGAGAGTGAAACCATTTTAGAGCC-3’(SEQ ID NO:2)，用RTPCR，从人脑总RNA扩增IL2 cDNA，并且克隆到pCDNA4-TO中的BamHI-XhoI中。为了构建CIRB嵌合体，我们首先从IL2及其受体IL2Rα的细胞外结构域构建嵌合体，使用正向寡核苷酸5’-GGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTGAGCAGAAGCTCATTTCGGAAGAAGACCTTGAAATGGAGACCAGTCAGTTTCCAGG-3’(SEQ ID NO:3)，用RT-PC从RNK92总RNA扩增该结构域，桥接IL2 C末端(终止密码子之前的12个氨基酸)，并且包含cMyc标签，在IL2Rα的氨基酸187-194连同以及IL2质粒的非编码3’序列之间的序列。与反向寡核苷酸5’-CCTGATATGTTTTAAGTGGGAAGCACTTAATTATCAGATTGTTCTTCTACTCTTCCTCTGTCTCC-3’(SEQ ID NO:4)一起使用此引物。使用扩增的片段作为寡核苷酸来诱变IL2野生型，生成IL2-IL2Rα嵌合体。为了构建CIRB最终嵌合体构建体，使用正向5’-TGCAGGATCCACTCACAGTAACCTCAACTCC-3’(SEQ ID NO:5)和反向5’-GGGAAGTGCCATTCACCGCGCAGGAAGTCTCACTCTCAGGA-3’(SEQ ID NO:6)，将IL2受体α嵌合体用来扩增IL2，其具有C末端cMyc标签，随后仅是IL2Rα的细胞外结构域，然后随后是IL2Rβ的N末端片段。这稍后引入了IL2Rβ的N末端。然后使用相同的正向引物和反向5’-GGCTCTCGAGTTGTAG AAGCATGTGAACTGGGAAGTGCC ATTCACCGC-3’(SEQ ID NO:7)，重新扩增该产物。首先通过使用正向引物5’-CATCTTCAGTGCCTAGAAGAAGAACTC-3’(SEQ ID NO:8)和反向5’-GAGTTCTTCTTCTAGGCACTGAAGATG-3’(SEQ ID NO:9)的诱变，去除IL2中的XbaI位点。然后使用正向5’-TTCCCAGTTCACATGCTTCTACAAGTCGA CAGCCAACATCTCCTG-3’(SEQ ID NO:10)和反向5’-AGCTTCTAGACTCGAGTTATCACACCAAGTGAGTTGGGTCCTGACCCTGG-3’(SEQ ID NO:11)，扩增IL2Rβ。接下来，片段IL2-cMyc-IL2Rα为开放Xho-XbaI，并且添加IL2Rβ作为SalI-XbaI片段，从而形成最终嵌合体CIRB。使用SpeI(钝端)和XhoI，将IL2和CIRB二者从pcDNA4-TO转移到用BamHI(钝端)和XhoI消化的CSCW-mcherry慢病毒载体。将所有构建体测序，并且验证慢病毒完整性。

慢病毒生产和转导-使用Lipofectamine 2000，使用各自1:0.4:1的比率，采用25uM氯喹，用pVSV、pCMVdr8.2dvrp和慢病毒构建体CSCW-GFP或CSCW-mCherry载体(其表达CIRB或IL2构建体)的2.4μg DNA转染HEK293T细胞。转染后6小时，更换培养基，并且将细胞孵育36小时，之后通过0.45um针筒式滤器收集并且过滤慢病毒上清液。通过mCherry表达型HEK293T细胞的连续稀释和计数，确定病毒滴度。在包含2x10⁵个细胞的2ml Eppendorf管中，以每个细胞46个慢病毒颗粒的最佳感染复数(MOI)，在1800g下离心45min来感染NK92细胞。将感染的细胞铺板在补充有100IU/ml的IL2的6孔板中。两天后，更换培养基，但是没有IL2。然后将表达IL2(NK92^IL2)或CIRB(NK92^CIRB)的NK92细胞系永久性隔绝外源IL2。

将NK92^CIRB生长与NK92^IL2、亲本NK92和IL2非依赖性NK92-MI细胞系相比较。将60x10³个细胞在6孔板中培养3天，此后添加3ml新鲜培养基到旧培养基的顶部，再培养3天。使用Bio-Rad TC20^TM自动细胞计数器，用台盼蓝排除法将活细胞计数。针对通过超声处理获得的总细胞裂解物，用蛋白质印迹检测蛋白质表达。

流式细胞术-使用从BD生物科技公司(BD Biosciences)(圣何塞，加利福尼亚州，美国)购买的、针对CD45-APC-CY7、CD25-FITC、CD16-PE、CD3-PECY7、CD56-PACBLUE和CD122-PE的小鼠抗人类抗体验证NK细胞标记表达。针对NKG2D-APC的抗体来自生物传奇公司(BioLegend)，DAPI来自英杰公司(Invitrogen)，小鼠抗cMyc:sureLight APC来自ColumbiaBiosciences公司。使用氩离子激光激发(用于激发的633nm和35mW)，使用BD 5激光SORPFACS Vantage SE Diva系统(BD生物科技公司(BD Biosciences))，在MGH流式细胞术核心设施上，分选细胞。使用来自488nm激发和320mW的前向和侧向散射，门控完整细胞。通过使用CellQuest软件(BD生物科技公司(BD Biosciences))，分析10⁵个事件/样品，进行数据采集。使用FlowJo软件(Tree Star公司)分析FACS数据。使用Rosettesep^TM人类富集试剂盒(干细胞技术公司(StemCell Technologies))，按照制造商方案，从健康供体的外周血液提取人类原代NK细胞。

NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的细胞毒性活性-与亲本NK92细胞系(用IL2，100IU/ml预刺激24小时)相比，评估NK92IL2和NK92CIRB的溶细胞作用。将8x10³个U266GFP细胞(选择牢固贴壁的)一式三份铺板在96孔板中。24小时后，按1/8、1/4、1/2、1/1和2/1的效应细胞/靶细胞比率，添加NK细胞。在共培养两天后，悬浮NK细胞，从而允许进一步杀灭U266GFP细胞。在总共4天共培养后，使用

M2荧光微板读取仪(分子仪器公司(Molecular Devices))，用485nm下的激发和515nm下的发射，评估U266GFP细胞存活。

另一组实验评估NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB对于一组五种癌细胞系(U251GM、PC-3、Panc-1、MDA-MB-231和HepG2细胞)的抗癌作用。首先对于每个癌细胞系，将32x10³个细胞铺板在24孔板中持续24小时，之后按2/1靶癌细胞的E/T比率，添加NK92(用IL2，以100IU/ml预刺激)、NK92^IL2或NK92^CIRB(图3B)；或仅持续5小时(图3C)，之后对于每个癌细胞系，按0/1、1/1、2/1、和3/1的E/T比率添加NK92^IL2或NK92^CIRB。然后孵育共培养细胞4天。使用在10％醇溶液中的0.1％结晶紫，随后是使用70％乙醇进行提取，并且读取在595nm下的吸光度，确定此时间后的癌细胞的细胞活力。

NK92^IL2和NK92^CIRB针对Her2阳性乳腺癌细胞系BT474的ADCC-

将靶乳腺癌BT474(8x10³个细胞)铺板在96孔板中。24小时后，在室温下，用1ug/ml曲妥珠单抗，将细胞孵育20min，之后按2:1的E/T比率，添加效应细胞。孵育3天后，使用以上描述的结晶紫/醇提取测定，确定癌细胞的活力。

预暴露于免疫抑制剂对NK细胞细胞毒性和活力的影响-将NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB(64x10³个细胞)铺板并且暴露于TGFβ1(20ng/ml)、Il-4(20ng/ml)、或Dex(0.5uM)24小时。在此期间，将亲本NK92细胞与20IU/ml下的IL2一起孵育。然后按2:1的E/T比率，将癌细胞U251GM、PC-3、Panc-1、MDA-MB-231和HepG2细胞(32x10³个细胞)添加至NK细胞。然后孵育共培养细胞4天。使用结晶紫/醇提取测定，确定此时间后的癌细胞的细胞活力。

为了确定免疫抑制剂TGFβ1、IL-4和Dex对NK92^IL2和NK92^CIRB(30x10³个细胞)的生长的影响，将这些NK细胞一式三份铺板在12孔板中，在TGFβ1(10ng/ml)、IL-4(10ng/ml)、或Dex(1uM)下生长3天，然后更新，在相同条件下再生长3天，总共六天。此时间后，用台盼蓝确定细胞活力。

肿瘤生长延迟实验-从克逊实验室(Jackson Laboratory)购买5周龄(24-25g)雄性NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ免疫缺陷小鼠，并且圈养在MGH中心，用于比较药物。这些动物没有B和T细胞连同NK细胞，因此提供了一个适合的平台，来评估修饰的NK细胞的治疗功效。将U251或PC-3细胞悬浮在包含20％基质胶的无血清RPMI中，并且使用0.5英寸29号针和1ml胰岛素注射器，按0.5ml的体积，皮下(s.c.)注射以下：对于PC-3为4x10⁶个细胞，或对于U251为3x10⁶个细胞。使用游标卡尺(Manostat Corp.公司，瑞士)，一周两次测量肿瘤区域(长度x宽度)，并且基于体积＝π/6(长度x宽度)^3/2来计算肿瘤体积。当平均肿瘤体积达到以下：对于PC-3为约200mm³，或对于U251为约160mm³时，开始用NK92^CIRB或NK92^IL2进行治疗。对于荷载PC-3肿瘤的动物，新鲜制备的NK细胞悬浮在PBS中，用500cGy辐射，并且经由尾静脉，每周注射一次(每只小鼠在200ul中15x10⁶个细胞)共注射四次来进行给予。对于荷载U251细胞的动物，NK92^CIRB或NK92^IL2并未经辐射。

在外周血液中，NK92^CIRB和NK92^IL2的检测-在Nod/scid小鼠中，皮下生长U251MG肿瘤细胞。当肿瘤尺寸达到约160mm³，经由尾静脉注射未经辐射的NK92^IL2和NK92^CIRB细胞(每只小鼠，在200u中的10⁷个细胞)。在4天后，进行未经辐射的NK细胞(5x10⁶个细胞)的第二次注射。17天后，杀死动物，并且在每个组中，从3只动物收集心脏血液。使用人类特异性抗CD45和mCherry荧光蛋白(该蛋白经由内部核糖体进入位点与IL2或CIRB排他地共表达)，用流式细胞术加工和分析肝素化的血液。

辐射的NK92^CIRB和NK92^IL2细胞的存活-在10Gy(0.83Gy持续12min)下辐射后，然后培养NK92^CIRB和NK92^IL2，并且每24小时使用台盼蓝确定其存活，持续3天。

在NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB中，细胞毒性效应子的表达谱-通过qRT-PCR，使用表1中列出的引物，量化自然细胞毒性受体NKP30、NKP44、NKP46，细胞溶解酶穿孔素-1和颗粒酶-B，以及细胞因子TNFα和IFN-γ的表达谱。在归一化至每个样品的GAPDH RNA含量后，使用比较C_T(ΔΔC_T)方法分析结果，并且呈现为相对于NK92亲本细胞系的RNA倍数。

表1.用于在NK92、NK92IL2和NK92CIRB中，细胞毒性效应子的表达谱的引物

统计分析-用双尾学生t检验、单向方差分析、配对图基多重比较检验，确定差异的统计显著性。所有检验包括与未处理的样品进行比较，或如在上下文中所示。用*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001、****P<0.001表明统计显著性。使用Prism软件版本6(GraphPad软件公司(GraphPad Software))进行分析。

实例1.CIRB嵌合体的设计和构建

IL2及其受体复合物的四元晶体结构(20)显示，IL2的C末端和IL2Rβ的N末端间隔

对于IL2和IL2Rβ的N末端之间的接头，我们选择IL2Rα的细胞外结构域(EMETSQFPGEEKPQASPEGRPESETSC(SEQ ID NO:28))。将cMyc标签(EQKLISEEDL(SEQ ID NO:29))添加到IL2和接头之间。将完全成熟受体IL2Rβ蛋白编码序列(没有信号肽)放置在接头后，从而产生完全嵌合体CIRB(图1)。将CIRB和IL2二者克隆到共表达mCherry的慢病毒载体中。计算上预测接头折叠为螺旋为主的结构(图5A-D)。使用Karplus和Shultz方法的计算方法，评估接头柔性(47)，其表明在所有肽键处，优于平均柔性(在0至2刻度上为1或更大)。

以下显示了所得序列。

IL2-IL2Rβ的核苷酸序列：

IL2-IL2Rβ的蛋白序列

实例2.嵌合体CIRB的细胞表面表达

在具有46的相同MOI的慢病毒介导的稳定表达后，NK92^IL2和NK92^CIRB细胞系获得了IL2非依赖性并且无限地增殖。在6天时段期间，两个细胞系显示了类似生长，并且快于NK92-MI(另一种IL2非依赖性细胞系)(图6A-B)，相比于亲本NK92细胞和NK92-MI，在培养中，经历多次冷冻和铺板周期后具有稳健的存活。使用抗cMyc单克隆抗体，我们接下来检查了在瞬时转染HEK293细胞(图2A)和稳定NK92^CIRB细胞(图2B)的细胞表面上CIRB的表达。我们发现了在NK92^CIRB中但不是在NK92^IL2细胞中cMyc的表面表达的明确证据。使用抗CD122单克隆抗体进一步确认CIRB表达，该抗体识别天然IL2Rβ连同嵌合体，显示内源CD122存在于NK92^IL2细胞中，如所预期，但是水平低于同时表达IL2Rβ和CIRB二者的NK92^CIRB细胞系。使用单克隆抗人类IL2，通过蛋白质印迹进一步检测全长嵌合体CIRB的表达。图2D显示95kDa的全长尺寸，这高于80kDa的预测尺寸，并且可能是由于翻译后糖基化。

实例3.亲本NK-92和修饰的细胞系的细胞毒性

我们比较了NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB细胞针对贴壁多发性骨髓瘤细胞系U266GFP的细胞毒性。图3A显示，尽管用100IU/ml的IL2预刺激，与NK92^IL2或NK92^CIRB相比，亲本NK92细胞系的细胞毒性远远更小。值得注意的是，在共培养的四天期间，IL2不存在。针对U266GFP，NK92^IL2和NK92^CIRB细胞显示了等同的细胞毒性，表明在体外可比水平的激活。

我们进一步比较了在一组五种人类癌细胞系中，NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的抗癌活性。在一个实验(图3B)中，在添加NK细胞系之前24小时，将细胞铺板。NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的细胞毒性以微弱优势总体上等价于NK92^CIRB。NK92细胞不如另两种NK细胞系。在其他实验中，仅在添加NK细胞之前5小时将癌细胞铺板(图3C)，与铺板后24小时添加的情况相比，NK细胞系的细胞毒性变得更明显。在这些条件下，在大部分E/T比率下，NK细胞系的细胞毒性大于在铺板24小时的细胞中，并且NK92^CIRB显示了大于NK92^IL2细胞的细胞毒性。使用抗性最强的癌细胞系U251GM和Panc-1，此差异更明显。

实例4.NK92^CIRB针对TGFβ1、IL4和地塞米松免疫抑制的抗性

转化生长因子TGFβ1是在TME中过表达的免疫抑制剂，并且已知通过使NK细胞中的若干激活信号不稳定来抑制NK细胞功能(34)。糖皮质激素地塞米松通过抑制来自CD4+T细胞的IL2生产，部分损害了淋巴细胞的功能(35)。报道了IL-4抑制NK细胞的增殖(48)。我们通过在TGFβ1(10ng/ml)、IL4(10ng/ml)、或dex(1uM)的存在下培养细胞6天，测试了在NK92^IL2和NK92^CIRB细胞系二者中，这些免疫抑制剂的作用。图4A显示，暴露于dex时NK92^IL2细胞不能存活，并且其增殖被TGFβ1强烈抑制，并且被IL4在某种程度上抑制。相比之下，NK92^CIRB细胞的增殖并未受TGFβ1或IL4显著影响，并且仅微弱地被dex抑制(图4B)。

然后在2:1的E/T比率下，使用该组五种癌细胞系，评估TGFβ1和dex预处理对NK细胞细胞毒性的影响(图4C)。在这些实验条件下，NK细胞影响更多的杀伤，这是由于将癌细胞添加至已铺板的NK92细胞，并且如果尚未附着，则更易受攻击。另外，在培养基中，将亲本NK92细胞与IL2(20IU/ml)一起铺板，并且因此与在其他实验中相比，活性更强。针对MDA-MB-231、PC-3和HepG2的NK92^CIRB细胞毒性不受影响。Dex严重降低了NK92^IL2细胞针对所有癌细胞系的细胞毒性。类似地，TGFβ1显著降低了NK92^IL2针对大部分癌细胞系(除了MDA-MB-231和HepG2)的细胞毒性。出人意料地，在MDA-MB-231和HepG2中，NK92细胞还显示了对dex抑制的抗性。与NK92和NK92^IL2细胞系相比，NK92^CIRB细胞的总体免疫抑制更弱，并且还取决于靶癌细胞系。

实例5.通过嵌合体CIRB的内源表达，实质性诱导CD16

根据NK92细胞的原始表征(43)，NK92细胞是CD56+、CD3-、CD16-、CD25+、CD45+和NKg2D-(图5A)，相比之下，NK92 ^IL2细胞、NK92^CIRB细胞、以及新鲜分离的人类NK(hNK)显示了不同模式的标记表达。不像NK92，细胞系NK92^IL2、NK92^CIRB、和hNK细胞都是CD16⁺，其中表达水平为hNK>NK92^CIRB>NK92^IL2(图5B)。我们还检查了IL2非依赖性NK92-MI，并且根据先前报道(38)，并未发现CD16的任何表达(图10A)。我们还发现，在用糖基化的或非糖基化的IL2处理的NK92细胞中，没有CD16表达(图10B)。与所有NK92^CIRB细胞系相比，人类NK(hNK)细胞表达远远更高水平的CD16和NKG2D(图5B)，并且实际上是CD25阴性的，而与IL2刺激的NK92或NK92^IL2二者相比，NK92^CIRB细胞表达更低量的CD25。在NK92细胞中，针对CD25和CD16的NK92^CIRB表达最类似于hNK。

实例6.NK92^IL2和NK92^CIRB针对HER2阳性乳腺癌细胞系BT474的ADCC

我们接下来使用曲妥珠单抗针对HER2阳性乳腺癌细胞系BT474，检查了CD16表达对ADCC的影响。图5C显示了在没有曲妥珠单抗的情况下并且当使用2:1的E/T比率时，BT474细胞不受NK细胞的直接细胞毒性影响。然而，在存在1ug/ml曲妥珠单抗的情况下，K92^CIRB和NK92^IL2各自发挥了约60％和50％的实质细胞毒性。1ug/ml下单独的曲妥珠单抗并未显著影响BT474的存活。类似地，在曲妥珠单抗的存在下，针对BT474，亲本NK92并未引起任何显著的细胞毒性。

实例7.在NK92、NK92^IL2和NK92^CIRB中，细胞毒性效应子的表达谱

NK92^CIRB细胞的qPCR分析揭示，与NK92^IL2和用IL2刺激48小时的亲本NK92相比，自然细胞毒性受体(NCR)显著增加：NKP30(1.7倍)、NKP44(9倍)和NKP46(1.4倍)。在NK92^IL2中，NKP44表达也增加(3.3倍)。尽管穿孔素-1表达在所有细胞系中类似，在NK92^IL2中，颗粒酶-B表达下降并且TNF-α增加，而在NK92^CIRB中，二者都略有下降而IFN-γ增加。

实例8.循环NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的体内检测

在荷瘤动物的背景下，评估体内NK92^IL2和NK92^CIRB的存活和体循环。在Nod/scid小鼠中，使U251MG肿瘤细胞皮下生长。当肿瘤尺寸达到160mm³的平均值时，动物在4天内经由尾静脉接受未经辐射的NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的两次注射。图6A显示，在活NK92^CIRB细胞的首次注射的24小时内，观察到46％的快速肿瘤体积消退，而NK92^IL2细胞引起35％减小。相比之下，在未处理的动物中，肿瘤继续生长，在消退前达到接近200mm³的最大极限尺寸。先前显示此尺寸依赖性限制生长是由于这些肿瘤的差的血管生成，这可以通过VEGF表达来改进(49)。在第二次注射后，NK92^CIRB处理组的肿瘤消退继续，而在NK92^IL2处理的动物中肿瘤继续生长，并且并未响应，直至第18天。三周后，未处理的和NK92^IL2组显示了类似肿瘤尺寸。相比之下，NK92^CIRB处理组显示了86％的显著肿瘤体积减小。NK细胞注射后第17天，从三个组的小鼠收集血液(0.5ml)，并且用细胞计量术分析表达mCherry、和人类CD45二者的循环细胞。图6B显示，仅在NK92^CIRB处理组中可以检测到循环NK细胞。此结果表明，CIRB表达(而不是IL2分泌)赋予NK细胞在荷瘤动物中持续的能力。

实例9.经辐射的NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的存活

从侵袭性非霍奇金淋巴瘤患者分离NK92细胞系(43)。因此，FDA要求在输注之前5Gy和10Gy之间的NK92细胞辐射，从而防止增殖。在这些条件下，在2天内，经辐射的NK92细胞活力显著下降。以10Gy辐射NK92^IL2和NK92^CIRB(0.83gy持续12min)，并且然后铺板在完全NK92培养基中，从而每24小时使用台盼蓝确定其存活。图7A显示，辐射后24小时，57％的NK92^CIRB细胞和45％的NK92^IL2细胞存活。在第1天和第2天，存活的NK92^CIRB优势是统计学显著的(*P<0.05)。

实例10.经辐射的NK92^IL2和NK92^CIRB细胞的抗肿瘤功效

前列腺癌细胞系PC-3(50)是雄激素受体和PSA阴性的，并且当在Nod/Scid小鼠中生长时，形成非常具侵袭性的肿瘤。肿瘤体积达到约200mm³(第28天)时，经由尾静脉每周注射一次共注射四次，给予经辐射的NK细胞(500cGy)。图7B显示，在首次注射后，在NK92^CIRB处理组中，PC-3肿瘤的生长减慢。在最后一次NK92^CIRB细胞注射后，相比于未处理组，在第1次和第4次NK92^CIRB细胞注射之间的时段内，记录到约17天的显著肿瘤生长延迟(**P<0.01)。相比之下，与未处理的肿瘤组相比，NK92^IL2处理组肿瘤仅产生了7天的肿瘤延迟(*P<0.05)。

实例11.CIRB21嵌合体的设计、构建、和测试

白细胞介素IL4、IL7、IL9、IL15和IL21属于与IL2相同的家族，并且使用同一个共有的IL2Rg。它们都具有其各自专用的受体，除了IL2和IL15，这二者除了其各自的α受体，还使用IL2Rβ(图11)。我们检查了添加的细胞因子(IL2、IL4、IL7、和IL21)对表达嵌合体NK92^CIRB的NK92细胞针对PC-3细胞的细胞毒性的影响。我们发现，仅IL21能够显著增强其细胞毒性(图12显示仅IL21和IL2能影响)。这促使我们询问IL2和IL21是否使用同一IL2Rg，有可能在一个嵌合细胞因子受体中组合二者的信号传导。为了回答此问题，克隆了IL21R的完整细胞质结构域，然后在嵌合体CIRB中，将其头尾相接地添加至IL2Rβ的C末端。这生成新型IL2-IL2Rβ-IL21R嵌合体(称为CIRB21，在图13中示例性说明)，然后将其引入NK92细胞，从而产生NK92^CIRB21。

IL2-IL2Rβ-IL21R(CIRB21)的核苷酸序列

IL2-IL2Rβ-IL21R(CIRB21)的蛋白序列

图14显示，新杂合受体赋予针对PC-3癌细胞系的实质性细胞毒性，该细胞毒性优于原始嵌合体CIRB 5倍，并且还产生CD16。它们还具有更慢的生长，可以通过外源IL2添加至培养基来增强该生长。

尽管IL2已经显示主要激活STAT5(51)，但是IL21优先激活STAT3(52，53)和STAT1(54)。已经显示，此激活导致干扰素-γ(IFN-g)产生(55)，并且这可能解释我们看见的癌细胞杀伤方面的显著增强(图14)。用qPCR进行RNA表达分析揭示，与CIRB相比，杂合受体CIRB21驱动了显著程度的激活。图15显示，与CIRB和NK92中的水平相比，在CIRB21中，IFN-g、颗粒酶-B和穿孔素-1各自增加了5倍、6倍和3倍。这些数据确认，通过杂合受体，IL2信号传导的此新型平台对于优越的NK细胞激活拥有治疗前景。

然而，IL-21还诱导了很多其他基因(综述于(56)中)(包括细胞因子信号传导1(SOCS1)和SOCS3蛋白的抑制物)的转录，这下调JAK–STAT途径并且抑制通过IL2的信号传导(57，58)。此抑制可能在表达嵌合体CIRB21的NK92的较慢生长之后。

首先假设在嵌合体CIRB21中，由IL21R介导的STAT3的激活可能与由IL2Rβ介导的STAT5的激活冲突，导致较慢的NK92CIRB21细胞生长。STAT3是IL21R信号传导的主要副产物，并且其转录活性可能在我们的细胞系中由IL2介导的JAK-STAT信号传导的下调之后。在STAT3有效的和选择性的抑制剂中，5,15-二苯基卟啉(5,15-DPP)在纳摩尔范围起作用并且阻止STAT3核易位。然而，当我们使用特异性5,15-DPP抑制STAT3的二聚化时，我们并未改善NK92CIRB21细胞生长。此结果表明，不存在STAT3同源二聚体以及STAT1和STAT3的可能的异源二聚化，或主要是STAT1同源二聚体。通常STAT1和STAT3具有相反的生物效应。STAT3是癌基因(59，60)，但是STAT1充当了肿瘤抑制剂(61，62)。可以由NK92CIRB21中高度产生的IFNg介导STAT1磷酸化(63)。因此，可能的情况是NK92CIRB21细胞的更慢生长是由STAT1肿瘤抑制剂活性引起的。

使用三种方法来恢复NK92CIRB21的更快生长，而不影响其当前显著的细胞毒性。第一，可能CIRB21的当前构形在空间上不利于IL2Rβ，这是由于在示例性构建体中，在IL2Rβ和IL21R的两个细胞质结构域之间缺乏间隔子。因此，通过在IL2Rβ和IL21R之间添加柔性接头(例如(GGGS)_n接头)来修饰CIRB21嵌合体。这是使用重叠延伸的方法，使用高保真PCR实现的。通过在NK92细胞中所得嵌合体的稳定表达来检查接头的影响。第二，如果添加接头并未恢复NK92细胞生长，则从受体IL2Rβ中去除Socs1基序，该基序下调JAK–STAT途径并且抑制通过IL2的信号传导(57，58)(图16)。使用正义引物5’-GCAGCAACCACTCGCTGACCGCCTGCCAGGTGTACTTTAC-3’(SEQ ID NO:34)和反向引物5’-GTAAAGTACACCTGGCAGGCGGTCAGCGAGTGGTTGCTGC-3’(SEQ ID NO:35)，通过位点诱变高保真PCR实现这一点。我们还通过使IL21R细胞质结构域的盒2区缺失来减弱IL21R的信号转导(图17)。盒1和在更小程度上盒2二者都参与了IL21的信号转导((64))。独立地，我们还将盒2与包含在酪氨酸Y317和Y399之间的区域一起去除，显示该区域略微有助于IL21信号传导的总体强度(53)。第三，如果这些遗传修饰并未恢复NK92细胞生长，则IL2Rβ和IL21R的细胞质结构域的DNA改组可能产生实现NK细胞更快生长的新型嵌合体。

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其他实施方案

应理解，虽然已经结合详细描述对本发明进行了描述，但前面的描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附的权利要求书的范围限定。例如，尽管本文示例性说明了人类细胞和序列(例如用于治疗人类受试者)，但是也可以使用来自其他物种的序列和NK细胞。其他方面、优点以及修饰都在以下权利要求书的范围之内。

Claims

1.一种融合蛋白，该融合蛋白为用间插接头融合至白细胞介素2受体β(IL2Rβ)的N末端的白细胞介素2(IL2)，在IL2Rβ的C末端处为IL21R的细胞质结构域，其中该IL2为SEQ IDNO:34，该IL2Rβ为SEQ ID NO:35的氨基酸27-551，和IL21R的该细胞质结构域为SEQ ID NO:36的氨基酸254-538，在IL2与IL2Rβ的N末端之间的该间插接头为IL2Rα的细胞外结构域，所述IL2Rα的细胞外结构域为SEQ ID NO:28。

2.一种编码如权利要求1所述的融合蛋白的核酸。

3.一种包含如权利要求2所述的核酸的表达载体，该表达载体具有一个或多个调节区，用于表达如权利要求1所述的融合蛋白。

4.一种表达如权利要求1所述的融合蛋白的分离的自然杀伤(NK)细胞。

5.如权利要求4所述的NK细胞，其中该NK细胞还表达CD16，以及任选地NKP44、NKP46和NKP30。

6.权利要求1所述的融合蛋白在制备用于通过以下方法治疗患有癌症的受试者的药物中的用途，该方法包括向有需要的受试者给予治疗有效量的表达如权利要求1所述的融合蛋白的自然杀伤(NK)细胞。

7.如权利要求6所述的用途，其中该受试者患有实体瘤。

8.如权利要求6所述的用途，还包括给予一种或多种抗肿瘤单克隆抗体或检查点抑制剂。

9.如权利要求6所述的用途，其中这些NK细胞是静脉内给予的。

10.如权利要求6所述的用途，其中在给予之前，这些NK细胞经历500至1000cGy的γ辐射。

11.如权利要求6所述的用途，其中该受试者是人类受试者。

12.表达如权利要求1所述的融合蛋白的自然杀伤(NK)细胞，其用于治疗患有癌症的受试者。

13.用于如权利要求12所述使用的NK细胞，其中该受试者患有实体瘤。

14.用于如权利要求12所述使用的NK细胞，其用于在包括给予一种或多种抗肿瘤单克隆抗体或检查点抑制剂的方法中使用。

15.用于如权利要求12所述使用的NK细胞，其中这些NK细胞被配制为用于静脉内给予。

16.用于如权利要求12所述使用的NK细胞，其中在给予之前，这些NK细胞经历500至1000cGy的γ辐射。

17.用于如权利要求12所述使用的NK细胞，其中该受试者是人类受试者。