JPH08511000A

JPH08511000A - リンパ球におけるキメラサイトカインレセプター

Info

Publication number: JPH08511000A
Application number: JP6522480A
Authority: JP
Inventors: ディー．グリーンバーグ，フィリップ; エイチ．ネルソン，ブラッド
Original assignee: フレッドハッチンソンキャンサーリサーチセンター
Priority date: 1993-04-06
Filing date: 1994-04-06
Publication date: 1996-11-19
Also published as: CA2160011A1; WO1994022914A1; EP0693084A1; AU695869B2; US5747292A; EP0693084A4; AU6627194A

Abstract

(57)【要約】キメラサイトカインレセプターをコードする組換えポリヌクレオチドが提供される。このキメラレセプターは、サイトカインＡを結合するサイトカインレセプターA-R由来の細胞外ドメインを含み、これは貫膜ドメインおよびサイトカインＢを結合するサイトカインレセプターB-R由来の細胞質ドメインに融合される。図は、IL-2レセプターの貫膜および細胞質ドメインに融合したGM:GSFレセプターの細胞外ドメインを有するキメラレセプターを示す。このキメラレセプターがリンパ球で発現されるとき、サイトカインＡの存在で、サイトカインＢへのリンパ球の成長依存性が低減される。

Description

【発明の詳細な説明】リンパ球におけるキメラサイトカインレセプター技術分野本発明は、免疫治療の分野、より詳細には活性化リンパ球のＴヘルパー細胞および／またはＴ_H細胞により供給される成長因子への依存性を低減させるように、キメラサイトカインレセプターをコードする遺伝子物質をリンパ球中に導入することに関する。背景技術Ｔリンパ球は細胞内病原体および悪性腫瘍に対する防御に最初に応答する。Ｔ細胞免疫が非常に不足している個体は、しばしば、サイトメガロウイルス、Pneu mocystis carinii、Candida、および他の一見「日和見」病原体（細菌、ウイルス、および真菌を含む）のような生物体による抵抗できない感染に倒れる。免疫抑制は、化学療法の結果としてのウイルス感染（例えば、HIVウイルスで）、および悪性腫瘍（特に造血系に影響を与えるタイプ）を含む種々の原因から生じ得る。Ｔ細胞免疫はまた、同種異系組織または器官の移植の拒絶の主要な機構である。実際、移植治療の主な制限は、生体防御機構を過度に危険にさらすことなく、Ｔ細胞同種異系移植片拒絶反応を抑制することの困難性であった。免疫を確立する抗原（Ag）特異的Ｔ細胞の養子移入は、マウス動物モデルシステムにおいていくつかのウイルス感染および腫瘍に対する効果的な治療のようである。（総説として、P.D．Greenberg、「Advances in Immunology」F．Dixon編 Academic Press，Inc．Orlando Fla．（1991），pp．280-355を参照のこと）。しかし、養子移入法の有効性は、移植されたクローンの寿命および移植された細胞の宿主に対する毒性がないことを含む多くの因子に依存する。成熟Ｔリンパ球は一般的にCD3細胞表面分子を発現するが、細胞表面分子CD4およびCD8の相互排他的発現に基づく２つの基本サブタイプから主としてなる。CD4⁺ Ｔ細胞は一般的に免疫応答での「ヘルパー」機能を包含し、そして細胞傷害性C D8⁺Ｔ細胞が依存するサイトカイン分子、特にインターロイキン２（IL-2）を分泌する。CD4⁺Ｔ細胞はしばしばＴヘルパー（Ｔ_H）細胞と呼ばれる。CD8⁺細胞は、外来抗原を有する標的細胞の直接的細胞傷害性破壊のような免疫応答における「エフェクター」機能を包含し、そしてウイルス感染および腫瘍に対する抵抗性についての重要な機構を表す。CD4⁺とCD8⁺Ｔ細胞との間の機能的差異は、クラス II MHC分子と共に存在する抗原を認識するCD4⁺細胞の能力に基づき、そしてCD8⁺ 細胞はクラスI MHC分子と共に存在する抗原を認識するCD8⁺細胞の能力に基づく。この溶解機能を媒介するCD8⁺細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）と呼ばれる。ほとんどのCTLがCD8⁺の表現型であるが、CD4⁺表現型のいくつかのCTLは記載されている。一般的に、個々のCTL（CD8⁺またはCD4⁺のいずれか）は抗原特異的である。リンパ球は、増殖について多くのサイトカインに依存している。例えば、CTL は、外来抗原に応答した成長および増殖について、IL-2のようなヘルパーＴ（Ｔ_H ）細胞由来のサイトカインに依存する。（ZinkernagelおよびDoherty、Adv．Im munol．27:51，1979；Maleら、Advanced Immunology，第７章，Gower Publ.，Lo ndon，1987；Jacobsonら、J．Immunol．133:754，1984）。例えば、IL-2は細胞傷害性Ｔリンパ球に対する有効なマイトジェンであり（GillisおよびSmith、Nat ure 268:154，1977）、そして抗原とIL-2との組み合わせがインビトロで初代CD8⁺ Ｔ細胞の増殖を引き起こす。インビボでのCD8⁺CTLの成長および維持についての IL-2の重要性は、移植した抗レトロウイルスCD8⁺細胞の治療効果がIL-2の連続投与により増強されることが、養子免疫治療のモデルで証明されている（Cheever ら、J．Exp．Med．155:968，1982；Reddehaseら、J．Virol．61:3102，1987）。 IL-4およびIL-7もまた、成熟CD8⁺CTLの少なくとも１つの亜群の増殖を刺激し得る（Aldersonら、Ｊ．Exp．Med．172:577，1990）。「非自己」抗原に対するＴ細胞の特異性によって、かなりの研究がウイルス感染および悪性腫瘍の治療にＴ細胞を使用することに集中していた。腫瘍抗原の特定のタイプに特異的な細胞傷害性Ｔ細胞は単離され得、そしてCTLが腫瘍を改善する効果で、腫瘍を有する患者に投与され得る。例えば、腫瘍特異的Ｔ細胞がマウスでの実験的腫瘍を生成し得ないのみでなく、一見腫瘍特異性を有するＴ細胞が癌患者から単離され得ることが証明されている。このようなヒト腫瘍浸潤リンパ球（TIL）は、インビトロで増殖されそして癌患者を治療するために用いられ、腫瘍特異的Ｔ細胞でのヒトの養子免疫治療に著しく熱中させる（Rosenbergら、N．Engl．J．Med．319:1767，1988）。ウイルス抗原に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞を用いる同様の研究はまた動物モデルで行われている。CD8⁺（Walkerら、Nature 328:345，1987；Plataら、Nature 328:348，1987）およびCD4⁺（Silicianoら、Cell 54:561，1988）の両方の表現型のヒトHIV特異的CTLが単離されそして特徴づけられている。HIV特異的CD8⁺CTL は古典的CTLであり、その細胞傷害性応答は、ウイルス、腫瘍、または同種異系特異的抗原に特異的であると特徴づけられている多くのマウスおよびヒトCTLクローンと同様に、抗原特異的およびMHC拘束性である（Walkerら、前出；Chencin erら、Eur．J．Immuno．19:1537，1989；Walkerら、Proc．Natl．Acad．Sci．US A86:9514，1989）。多くの抗原特異的Ｔ細胞クローンが単離されているが、インビトロで生成される腫瘍特異的Ｔ細胞クローンの使用は腫瘍治療ではっきりとした制限を有することが示されている。細胞溶解性CD8⁺Ｔ細胞の有効性が、外因性IL-2（通常はＴ_H 細胞により生成される）への依存性、すなわち外因性IL-2の投与が最適な治療効果に不可欠であると考えられるヒト養子治療試験で実証されている結果、により限定されていることが、いくつかの治療モデルで証明されている（Rosenbergら、N.Engl．J．Med．319:1767，1988；Klarn etら、「Role of Interleukin-2 Activated Killer Cells in Cancer」，Lutzov aおよびHerberman編，CRC Press，Florida，第14章，pp．199-218，1990）。したがって、インビトロＴ細胞クローニング法が証明可能な腫瘍またはウイルス特異性を有する大量のＴ細胞を生成するための手段を提供するが、治療にこのような抗原特異的Ｔ細胞を用いる最大の可能性は、通常Ｔ_H細胞により生成されるサイトカインへのそれらの依存性により制限されているようである。いくつかの限定された例では、Ｔ_H依存性の問題はＴ_H細胞に依存しない機能が知られている特定のクラスの細胞を用いることにより回避され得る。これらの細胞は、ヘルパー非依存性細胞溶解性CD8⁺細胞（HIT_c）（Klarnetら、J．Immunol ．142:2187，1989）として知られており、初代（すなわち、インビボ供給源から新鮮に単離された）CD8⁺CTLの集団で同定されている（SprentおよびSchaefer，J ．Exp．Med．162:21068，1985；Andrusら、J．Exp．Med．159:647，1984）。HIT_c 細胞は、CD4⁺細胞およびそれらが産生するサイトカインに非依存的に生育するに十分なIL-2を産生する。HIT_c細胞は、細胞膜IL-1レセプター（IL-1R）を発現し、それらのIL-2非依存的増殖にIL-1を必要とすることが示されている（Klarne tら、1989、前出）。これは、それらの表面上で検出可能なIL-1Rを発現しない従来のCD8⁺CTLとは対照的である（LowenthalおよびMacDonald，1987 ）。HIT_c細胞は、腫瘍、ウイルス、および同種異系抗原を含むある範囲の抗原に特異的なものを生成している（von Boehmerら、J．Immunol．133:59，1984；Kla rnetら、J．Immunol．138:4012，1987；およびAndrusら、J．Exp．Med．149:647 ，1984；Mizouchiら、J．Immunol．142:270，1989）。レトロウイルスで形質転換された腫瘍に特異的なHIT_cは、腫瘍細胞を根絶し、それらの移植後にインビボで長期に生存することが示されている（Klarnetら、1989、前出）。しかし、HIV のような多くの重要な抗原に特異性を有する類似のヒトHIT_c細胞は、未だ単離されていない。治療における抗原特異的Ｔ細胞の最大の可能性を認識することは、Ｔ_H細胞への低減した依存性を有するリンパ球、特にCTLのより完全なレパートリー（reper toire）を発達させることにより容易にされ得る。１つのアプローチは、サイトカインレセプター（例えば、IL-1レセプター）を発現する組換えベクターのＴ_H 依存性CTL中への導入であり、低減したIL-2への依存性を有するCTLへの変換を生じる（PCT/US91/06921，W092/05794，1992年4月16日公開）。以下に記載の本発明は、成長および増殖を刺激する１つまたはそれより多い因子への低減した依存性を有するリンパ球の生成への異なるアプローチを呈示する。本発明の一部として、刺激因子への低減した依存性を有するリンパ球は、通常必要とされるサイトカイン（例えばIL-2）の量を制限するにもかかわらず細胞を増殖させ得るキメラサイトカインレセプターの発現を介して生成される。キメラレセプターは、ヘテロローガス（heterologous）サイトカインレセプターのドメインに融合される、サイトカインレセプター鎖（例えばIL-2レセプター（IL-2R））のドメインを含む。IL-2Rの一部を含むキメラレセプターは報告されている。１つのキメラレセプター構築物では、IL-2Rの細胞外ドメイン（現在、α鎖に対応することが知られている）は、上皮成長因子レセプター（EGFR）の貫膜（transmem brane）および細胞内チロシンキナーゼドメインに融合された。ポリペプチドは線維芽細胞で発現し、そして報告によればIL-2に対する高親和性を有し、報告によれば線維芽細胞を形質転換する産物を得た。Bernardら（1987），Proc．Natl ．Acad．Sci．USA 84:2125-2129。しかし、線維芽腫細胞株が増殖によりIL-2に応答しないことが報告されている。（Takeshitaら（1992），Science 257:379-3 82を参照のこと、S．Minamotoら（1990），J．Immunol．145:2177を引用している）。他のキメラ構築物では、IL-2Rのβ鎖の細胞外ドメインはネズミエリトロポエチンレセプター（EPO-R）の細胞質ドメインに融合した。得られた構築物は、報告されているように、IL-2誘導シグナルを形質導入し得なかった。Moriら（ 1991），Int．Immunol．3:149-156。発明の要旨本発明は、通常必要とされる以外の、代わりのサイトカインに応答して活性化リンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）を増殖させ得るキメラレセプターをコードするポリヌクレオチド構築物を提供する。好適には、この代わりのサイトカインは、抗原刺激に応答してリンパ球内で合成されるサイトカインであり、それにより、調節されたオートクリン（autocrine）増殖をするリンパ球を提供し得る。ポリヌクレオチドから発現されるキメラ構築物は、通常必要とされるサイトカインのレセプター（例えばIL-2R）由来の細胞質領域を含み、これは、貫膜ドメインを介して、代わりのサイトカインレセプター（例えばGM-CSF-R）由来の細胞外ドメインに接合される。これらのキメラは、代わりのサイトカインレセプター（例えばGM-CSF-R）の細胞外領域により認識されるサイトカイン（例えばGM-CSF）を結合し、そして普通のサイトカイン（例えばIL-2 ）がそのレセプター（例えばIL-2R）に結合する場合に一般的に生じるシグナルを伝達して増殖が起こる。本発明はまた、サイトカインへの低減した依存性を有するリンパ球を調製するためにキメラレセプターをコードするポリヌクレオチドの使用、およびこのキメラ構築物を含む細胞を包含する。キメラレセプターをコードするポリヌクレオチドを含むリンパ球の免疫治療への使用はまた、本発明の範囲内である。したがって、本発明の１つの実施態様は、１つまたはそれ以上のキメラペプチド鎖を含むキメラレセプターであり、このキメラペプチド鎖は、サイトカインＡを結合するサイトカインレセプターA-R由来の細胞外ドメインを有し、このドメインは貫膜ドメインを介して、サイトカインＢを結合するサイトカインレセプターB-R由来の細胞質ドメインに接合される。ここで、サイトカインＢは、成長および増殖のためにリンパ球により通常必要とされるサイトカインであり、そしてこのリンパ球で発現されるキメラレセプターはサイトカインＡの存在下でリンパ球のサイトカインＢの増殖依存性を低下させる。本発明の他の実施態様は、１つまたはそれ以上の上記ペプチド鎖をコードする組換えポリヌクレオチドである。さらに他の実施態様は、このような組換えポリヌクレオチドを含む細胞である。この組換えポリヌクレオチドは組換え発現ベクターの形態であり得る。この細胞はリンパ球であり得る。本発明のさらに他の実施態様は、第１のペプチド鎖をコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドを使用する方法であり、ここで第１のペプチド鎖は、サイトカインＡを結合するサイトカインレセプターA-R由来の細胞外ドメインを有し、このドメインは貫膜ドメインを介して、サイトカインＢを結合するサイトカインレセプターB-R由来の細胞質ドメインに接合される。ここで、サイトカインＢは、成長および増殖のためにリンパ球により通常必要とされるサイトカインであり、そしてこのリンパ球で発現されるキメラレセプターはサイトカインＡの存在下でリンパ球のサイトカインＢの増殖依存性を低下させ、この方法は組換えポリヌクレオチドで細胞を形質転換する工程を包含する。本発明のさらに他の実施態様は上記方法により生成される細胞、およびその子孫である。図面の簡単な説明図１は、本発明の全体の方法で用いられ得るプロトタイプのキメラレセプターの模式図である。図２は、非IL-2R細胞外ドメインが単一タイプの鎖のc-kitを含むサイトカインレセプター由来であり、２つの異なるIL-2由来細胞内ドメインに結合する、プロトタイプのキメラレセプターの模式図である。図３は、CTLL2細胞のトランスフェクトしたレセプターの表面発現についての蛍光スキャンのトレースを示すグラフである。図４は、c-kit/IL-2RキメラでトランスフェクトしたCTLL2細胞の増殖へのリガンドの効果を示すグラフである。図５は、キメラGM-CSF/IL-2レセプターの概略図である。左上では、ヒトGM-CS F-Rαまたはβ鎖の細胞外領域およびヒトIL-2RβまたはIL-2Rγ鎖の細胞内領域を用いて、それぞれGMβ/2βおよびGMα/2γと命名したキメラレセプターを構築した（右上に示す）；これはGM-CSFを結合するに際しヘテロダイマー化を行う（図５の下部に示す）。図６は、親（CTLL2）Ｔ細胞株の、ならびにGMβ/2βまたはGMα/2γを発現するあるいはGMβ/2βおよびGMα/2γを同時発現するトランスフェクタントの、IL-2およびGM-CSF誘導増殖応答を示すグラフである。発明の詳細な説明本発明は、キメラレセプターをコードする組換えポリヌクレオチドの存在により親リンパ球とは異なる抗原特異的リンパ球を提供する。このキメラレセプターは、代わりのサイトカインに応答してリンパ球を増殖させ得る。サイトカインは、好適には、コグネイト（cognate）抗原刺激に応答してリンパ球中で上昇したレベルで発現され、または例えばIL-2と比較して低減した毒性で投与され得るサイトカインである。キメラレセプターは、１つのレセプター（レセプターA-R）の細胞外領域の、貫膜領域を介する第２のレセプター（レセプターB-R）の細胞内領域への融合物である。以下で述べるように、レセプターは１つまたはそれ以上のペプチド鎖を含み得る。コグネイトサイトカインの細胞外領域（レセプター A-R由来）への結合は、通常レセプターB-Rと関連したシグナルを送達する。このように、例えば、キメラGM-CSF:IL-2レセプターを含む活性化CTLは、GM-CSFのCT L生成の結果として、通常制限されている量のIL-2の存在で（GM-CSFに応答して）増殖し得る。適切なレセプターの細胞質ドメインは刺激されるべきリンパ球のタイプに依存して選択される。例えば、リンパ球がCTLである場合、適切な細胞質領域はサイトカインに対するレセプターから得られ得、その欠如はＴ_H細胞（例えばIL-2）により生成されるサイトカインの非存在下での増殖を制限し得る。細胞外ドメインに対する適切なレセプター領域は、非制限量で存在するサイトカインを認識するレセプターに由来し得る。例えば、CTLについては、レセプターは顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、IL-3、ガンマインターフェロン（IFN-γ）、および腫瘍壊死因子β（TNF-β）を結合するレセプターを含む。当該技術分野で周知のように、適切な貫膜ドメインは細胞膜中へのそれらの安定な導入を促進する疎水性のような特質を示す。論理的には、このような貫膜ドメインの便利な供給源は、レセプターA-RまたはB-Rの貫膜ドメインである。したがって、好適には、貫膜ドメインはサイトカインレセプターA-Rに由来し、さらに好適には、レセプターB-Rに由来する。しかし、多様な他の貫膜ドメインが当該分野で記載されており、これらはまた本発明で用いられ得る。プロトタイプのキメラレセプターを図１に示す。このレセプターは、ヘテロローガスサイトカインレセプター（図中のGM-CSFレセプター（GM-CSF-R））の細胞外領域からなり、この領域は、Ｔ_H細胞の非存在下で通常制限されているサイトカインを認識するサイトカインレセプター（図中のIL-2R）の貫膜および細胞質領域に融合する。このレセプターは、細胞外でヘテロローガスまたは代わりのサイトカイン（図中のGM-CSF）を結合すべきであるが、サイトカインレセプターの増幅シグナルを送達する。このレセプターの細胞質ドメインはキメラ構築物の一部として用いられる。図１の構築物では、それは IL-2Rのドメインであり得る。キメラレセプターは、構成的プロモーター（PRcon ）の制御下でリンパ球で発現され得、それゆえいつも細胞表面上に存在する。細胞の増殖は、細胞外ドメインにより認識されるサイトカインがキメラレセプターに結合するときに起こる。サイトカインが活性化リンパ球により作成される場合、活性化はオートクリン成長ループを生成する。あるいは、キメラレセプター細胞外ドメイン中で、治療法の一部として提供され得るサイトカインを認識するレセプターフラグメントを含むことが望ましくあり得る。あるいは、誘導または抑制を受けるプロモーターを用いることが望ましくあり得る。このような種々のプロモーターが当該分野で公知である。本明細書中で用いられる「リンパ球」は、大きな丸い核（意図され得る）および少ない細胞質を有する球形細胞である。それらは非自己抗原を特異的に認識しそして応答し、そして特異的免疫の発生の原因である。「リンパ球」の範囲内には種々のクラスのＢリンパ球およびＴリンパ球が含まれる。「細胞傷害性Ｔリンパ球」または「CTL」は、CD3細胞表面決定基を有しそしてコグネイト抗原を有する標的細胞の溶解を媒介するＴ細胞である。CTLは、CD8⁺ またはCD4⁺表現型のいずれかであり得る。CTLは一般に、抗原特異的でありMHCで制限され、標的細胞の表面上で主要組織適合性複合体（MHC）分子と関連する抗原ペプチドのみを認識する。CTLは、HIV、EBV、CMV、および広範な腫瘍抗原を含む、広範なウイルス、腫瘍、または同種異型抗原に特異的であり得る。しかし、いくつかのCTLは、抗原特異的ではなく、例えば、あるクローン化CTLは、異常に高濃度のIL-2中での培養によりそれらのコグネイト抗原に対するいくらかの特異性を失うように誘導し得る（Brooksら、Immunol．Rev．72:43，1983）。「Ｔ_H非依存性」CTLは、それが由来するCTLと比較して、CD4⁺Ｔヘルパー（Ｔ_H ）細胞および／または増殖または成長に通常必要とされるサイトカインの制限量の存在下で、成長または増殖が増強され得る。成長または増殖は、例えば、任意のインビトロ増殖または成長アッセイにより、またはインビボで生存するCTLの能力を測定する任意のアッセイにより、測定され得る。適切なアッセイの特定の実施例は、以下に開示される。成長または生存性を増強し得るCTLは、外来抗原を有する標的細胞を破壊するまたは長期の免疫学的記憶を提供する能力を増強し得る。「サイトカイン」とは、例えば、インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、およびTNFを含む、可溶性細胞内シグナル分子であるポリペプチドをいう。用語「ポリペプチド」とは、アミノ酸のポリマーをいい、特定の長さの産物をいうのではない；したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質がポリペプチドの定義内に含まれる。この用語はまた、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などの、ポリペプチドの発現後修飾に言及するものではなくまたは除外するものでもない。この定義内に含まれるものは、例えば、１つまたはそれ以上のアミノ酸のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、置換された連結を有するポリペプチド、ならびに天然に生じるおよび非天然に生じる両方の当該分野で公知の改変を有するペプチドである。本明細書で用いられる「形質転換」は、例えば、直接取り込み、形質導入、f- 交配、またはエレクトロポレーションなどの挿入に用いられる方法に関わりなく、宿主細胞中への外因性ポリヌクレオチドの挿入をいう。外因性のポリヌクレオチドは、非組み込みベクター（例えばプラスミド）として保持され得、あるいは宿主細胞ゲノム中に組み込まれ得る。本明細書中で用いられる「治療（treatment）」とは、予防および／または治療（therapy）をいう。「ヘルパーＴ細胞」または「ヘルパー細胞」または「Ｔ_H細胞」は、細胞傷害性Ｔ細胞の生成および抗体応答の生成におけるＢ細胞との協力を助け得るＴ細胞の機能的サブクラスである。ヘルパー細胞は通常クラスII MHC分子と関連して抗原を認識する。「抗原特異的Ｔ細胞クローン」は、単細胞の子孫から構成される；このタイプのクローン中の細胞は、同じ表現型であり、同じ抗原に対してすべて標的にされる。抗原特異的Ｔ細胞クローンの調製方法は当該分野で公知である。用語「組換え発現ベクター」とは、形質転換、エレクトロポレーション、形質導入、またはウイルス感染により標的細胞中に導入し得、そしてヘテロローガス構造コーディング配列（例えばサイトカイン）の発現をコードする形態でのDNAまたはRNAの複製可能な単位をいう。これは、mRNAに転写され、そして遺伝子発現で調節の役割を有する要素の制御下でタンパク質に翻訳される。好適には、このようなベクターはまた、適切な転写および翻訳開始配列および終結配列を含む。本明細書で用いられる「組換え」とは、特定のDNA配列が、天然系で見られるホモローガス配列と識別可能な構造コーディング配列を有する構築物を生じる、クローニング、制限分解、連結工程の種々の組み合せの産物であることを意味する。一般に、構造コーディング配列（例えばサイトカイン）をコードするDNA配列は、cDNAフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、あるいは一連のオリゴヌクレオチドから組み立てられ得、組換え転写単位で発現され得る合成遺伝子を提供する。好適には、このような配列は、代表的には真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列、またはイントロンにより中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供される。関連の配列を含むゲノムDNAもまた用いられ得る。非翻訳DNAの配列は、オープンリーディングフレームの5'または3' に存在し得、そこでこのような配列は、コーディング領域の操作または発現を妨害しない。「組換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞株」、「細胞培養」、および単細胞実体として培養された微生物または高等真核細胞株を示す他のこのような用語は、組換えベクターまたは他の転移ポリヌクレオチドの受容体として用いられ得あるいは用いられた細胞をいい、トランスフェクトされた元の細胞の子孫を含む。単一細胞の子孫は、天然の、偶然の、または故意の変異のために、形態が、あるいはゲノムまたは全DNA相補体が元の親と完全に同一である必要がないことが理解される。 CTLが腫瘍またはウイルス抗原を有する細胞を選択的に認識し溶解し得る場合、CTLは腫瘍またはウイルス抗原を発現する細胞の「細胞溶解に特異的」である。CTLがこのような細胞を選択的に認識する能力に関係なく腫瘍またはウイルス抗原を有する細胞を溶解し得る場合、CTLは腫瘍またはウイルス抗原を発現する細胞に対して「細胞溶解反応性」である。「抗原特異的発現」とは、Ｔ細胞がそのコグネイト抗原を認識するときに起こる発現をいう。「コグネイト抗原」とは、リガンドを認識するリンパ球に結合するリガンドを形成し、そして細胞のエフェクター機能のおよび／または増殖の誘引となるシグナルを引き起こすような、MHC分子と関連するペプチドである抗原をいう。「活性化リンパ球」は、コグネイト抗原の結合の結果として、結合したコグネイト抗原のないリンパ球と比較して上昇したレベルで、ポリペプチド因子（例えばサイトカインを含む）を生成しているリンパ球である。「転写調節領域」は、転写に必要なすべての要素を含み、そして調節に必要な要素を含み得る。このように、転写調節領域は少なくともプロモーター配列を含み、そしてエンハンサーのような他の調節配列、および転写因子結合部位もまた含み得る。「作動可能に連結」とは、記載された成分が意図されたように機能させる関係である並置をいう。例えば、プロモーターが転写または発現に影響を与える場合、プロモーターはコーディング配列に作動可能に連結されている。用語「組換え」ポリヌクレオチドまたは核酸とは、天然に存在しない、あるいはそうでなければ２種の別の配列のセグメントの人工的組み合わせにより作成されるものをいう。この人工的組み合わせは、しばしば、化学合成法により、あるいは核酸の単離したセグメントの人工的操作により、例えば、遺伝子工学技法により達成される。このようなことは、通常、同一アミノ酸または保存的アミノ酸をコードする重剰コドンでコドンを置換して、代表的には配列認識部位を導入または除去することにより、行われる。あるいは、所望の機能の核酸セグメントを共に接合して所望の機能の組み合わせを生成することが行われる。核酸の「センス鎖」は、コグネイトmRNAの配列と相同性を有する配列を含む。「アンチセンス鎖」は、「センス鎖」の配列と相補的な配列を含む。本明細書で用いられる「個体」とは、脊椎動物、特に哺乳類種のメンバーをいい、家畜、競技用動物、およびヒトを含む霊長類を含むがこれらに限定されない。本発明の実施は、特に指示がない限り、当該技術分野の範囲内の分子生物学、微生物学、組換えDNA、および免疫学の従来の技法を用いる。このような技法は、文献に十分に記載されている。例えば、を参照のこと。本明細書で先におよび以下の両方で述べるすべての特許、特許出願、および刊行物は、本明細書中に参考として援用される。本発明のいくつかのキメラレセプターの設計は以下の通りであり、例としてIL -2Rを用いる。ヒトIL-2Rを含むIL-2Rは、３つの鎖から構成され、そのうちの２つ（βおよびγ）がシグナル形質導入に必要とされる。（Hatakeyamaら（1989），Science 244:379-382；およびTakeshitaら（1992），Science 257:551-556を参照のこと、IL-2Rβおよびγ鎖のコーディング配列および機能性の記載については、Nelson，B．H.ら（1994）Nature（印刷中）もまた参照のこと）。このように、所定のキメラレセプターは、３つの領域またはドメイン（細胞質、貫膜、および細胞外）を含む２つの鎖から構成される。明らかなように、貫膜ドメインは、便利なことには細胞質ドメインまたは細胞外ドメインと同じ供給源に由来し得るが、他の供給源由来の貫膜ドメインが同様に用いられ得る。IL-2に基づく実施例では、キメラレセプターの１つの鎖は、IL-2Rβ鎖貫膜領域および細胞質領域を有するが、他の鎖はγ鎖貫膜領域および細胞質領域を有する。キメラレセプターの細胞外領域中の鎖のタイプの数は、このドメインに寄与するように選択されたヘテロローガスサイトカインレセプターに依存する。例えば、ヘテロオリゴマータイプのサイトカインレセプター（例えば、IL-2R、IL-3R、IL-5R、IFN-γ-R、GM-CS F-R、およびIL-6-R）は、高親和性レセプターを形成する少なくとも２つの異なるサブユニットタイプを必要とする。IL-4およびIL-7レセプターもまた、ヘテロオリゴマータイプのレセプターであり、第２（γ）鎖をシグナリングに利用することが報告され、そのγ鎖はIL-2レセプターの鎖と同じであるようである。（例えば、Kondo，M.ら（1993），Science 262:1874-1877）。他のタイプのサイトカインレセプターは、それ自体による（すなわちモノマー性）高親和性リガンド結合を有するかまたはホモダイマーまたはホモオリゴマーとして高親和性レセプター（例えば、c-kit-R、TNF-R、Epo-R、およびG-CSF-R）を形成する。多くのサイトカインレセプターの特性およびコーディング配列の議論は、Miyajimaら（1992 ），Ann． Rev．Immunol．10:295:331による総説に見られる。図２は、非IL-2R細胞外ドメインが、単一タイプの鎖（例えば、c-kit）を含むサイトカインレセプター由来であるプロトタイプのキメラレセプターの設計を示す。この図は、左に正常なc-kitおよび右に正常なIL-2Rβおよびγ鎖を示す。図の中央は、IL-2Rβ鎖（k:β）およびγ鎖（k:γ）の貫膜および細胞質領域に融合したc-kitの細胞外領域を含む２鎖のキメラレセプターを示す。このタイプの構築物の他の例は、他の１鎖タイプのレセプター（例えば、TNF-RおよびG-CSF-R ）由来の細胞外ドメインを用いて形成され得る。他のタイプのプロトタイプのキメラレセプターの例を、図１の挿入図に示す。この図では、非IL-2R細胞外ドメインは２つのタイプの鎖を含むサイトカインレセプター（例えば、GM-CSF-R）由来である。図において、GM-CSF-Rのαサブユニットの細胞外領域は、IL-2Rのγ鎖の貫膜領域および細胞質領域に融合され；GM- CSF-Rのβサブユニットの細胞外領域はIL-2Rのβ鎖の貫膜領域および細胞質領域に融合される。図５の図もまた参照のこと。キメラレセプターの好適な例は、以下のレセプターに由来するヒトIL-2Rβおよびγ鎖の細胞質および貫膜領域および細胞外ドメインを含む：ヒトおよびネズミのGM-CSF-R；ヒトおよびネズミのIFNγ-R；ヒトおよびネズミのIL-3R；ヒトおよびネズミのG-CSF-R；ヒトおよびネズミのIL-4R；ヒトおよびネズミのIL-7R；ヒトおよびネズミのc-kit-R；ならびにヒトおよびネズミのEpo-R。キメラレセプターは所望のセグメントをコードするcDNAから構築され得るが、他の方法が当業者には容易に明らかである。例えば、１つの方法では、キメラレセプターDNAは、ヘテロローガスサイトカインレセプターの上流の細胞外領域および下流のIL-2R貫膜および細胞質ドメインをコードするクローン化cDNAを提供することにより調製される。制限酵素消化により調製される場合、これらのクローン化cDNAは、融合物の間に入る望ましくない配列を含み得る。望ましくない配列は当業者に公知の技法により除去され得、これには、ループ除去部位特異的変異誘発またはスプライス重複伸長ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）が含まれる。次いで、レセプターをコードするキメラcDNAの配列は標準のDNA配列決定法により確認され得る。このようなキメラレセプターの特定の例を以下により詳細に例示する。キメラレセプターをコードするポリヌクレオチド領域は、一般に、宿主細胞（特にCTL）中でキメラレセプターの発現を可能にする制御領域に作動可能に連結される。制御領域は、少なくともプロモーターおよびリボソーム結合部位を含み、そして特に、エンハンサー領域、スプライス領域、ポリアデニル化領域、転写および／または翻訳終結領域、ならびに転写および／または翻訳因子結合部位も含み得る。これらの制御領域は、組換えベクター中に、特に組換え発現ベクター中に存在し得る。活性化CTLの増殖を援助するキメラレセプターの能力は、当該分野で公知の技法により容易に証明される。例えば、キメラレセプターを発現する活性化細胞株は、シグナルが通常レセプターの細胞質ドメイン部分と関連しているサイトカインの非存在下で、しかしキメラ構築物の細胞外ドメインサイトカインレセプター部分により認識されるサイトカインの存在下で、成長について試験され得る。本発明は、少なくとも１つのタイプのキメラレセプターでリンパ球を形質転換して少なくとも１つのサイトカインへの依存性を低減させることを意図する。しかし、例えば、サイトカインへの低減した依存性を調節し得、および／または２つまたはそれ以上のサイトカインの依存性を低減および／または調節し得る、多くの形態のキメラレセプターでリンパ球を形質転換することもまた、本発明の範囲内である。核酸操作の技法は、例えば、Sambrookら（1989），前出、Ausubelら（1987），前出、およびAnnual Reviews of Biochemistry（1992）61:131-156に一般的に記載されている。制限酵素などのこのような技法を適用するに有用な試薬は、当該分野で広く知られており、多くの販売業者から商業的に入手可能である。本発明の細胞を作成するために用いられる大量のポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞中での複製により生成され得る。所望のフラグメントをコードする天然または合成ポリヌクレオチドフラグメントは、原核または真核生物細胞への導入およびそこでの複製が可能な組換え核酸構築物、代表的にはポリヌクレオチド構築物中に導入され得る。通常、この構築物は、酵母または細菌のような単細胞宿主での複製に適切であるが、培養された哺乳類または植物あるいは他の真核生物の細胞株中に、ゲノムとともにおよびゲノムなしでおよびゲノム内に組み込まれて導入することも意図され得る。本発明の方法により生成される核酸の精製は、当該分野で公知の方法により達成され得、この方法は例えばSambrookら（1989）およびAusubelら（1987）に記載されている。本発明に用いられるポリヌクレオチドはまた、化学合成により（例えば、Beau cageおよびCarruthers（1981）Tetra．Letts．22:1859-1862に記載のホスホルアミデート法またはMatteucciら（1981）J．Am．Chem．Soc．103:3185に従ったトリエステル法により）一部または全体が生成され得、そして市販の自動化オリゴヌクレオチド合成機で行われ得る。二本鎖フラグメントは、相補鎖を合成して適当な条件下で鎖を互いにアニールすること、あるいは適当なプライマー配列とともにDNAポリメラーゼを用いて相補鎖を添加することのいずれかにより、化学合成の一本鎖産物から得られ得る。複製のために原核または真核生物宿主細胞中への導入のために調製されたポリヌクレオチド構築物は、代表的には宿主により認識される複製システムを含み、これは所望のポリペプチドをコードする意図された組換えポリヌクレオチドフラグメントを含む。このようなベクターは、当該分野で周知であり、例えば、Sambrookら（1989）およびAusubelらで議論されている標準的な組換え技法により調製され得る。好適には、ポリヌクレオチド構築物は、ベクターで形質転換された宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする遺伝子である、選択可能なマーカーを含む。この遺伝子の存在は挿入物を発現する宿主細胞のみの成長を確保する。代表的な選択遺伝子は、（a）抗生物質または他の毒性物質（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートなど）への耐性を与え；（b）栄養要求性欠失を補い、または（c）複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、Bacilliに対するD-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。適当な選択可能なマーカーの選択は宿主細胞に依存し、そして種々の宿主に対する適切なマーカーは当該分野で周知である。 CTLへのＴ_H非依存性（すなわち、Ｔ_H細胞またはＴ_H細胞により供給される１つまたはそれ以上のサイトカインへの低減した依存性）を与えるポリヌクレオチドは、当該分野で公知の手段により、所望のタイプのAg特異的Ｔ細胞中に導入され得る。これらの手段には、例えば、形質転換、エレクトロポレーション、リポフェクション、および形質導入が含まれ、アデノ伴生ウイルス（AAV）ベクターの使用、そして特に当該分野で公知のレトロウイルス遺伝子転移の方法を使用することを包含する。遺伝子送達について組換え感染ウイルス粒子を利用する種々の感染技法が開発された。これは本発明の好適なアプローチを呈示する。このようにして用いられるウイルスベクターには、シミアンウイルス40（SV40；Karl ssonら、Proc．Natl．Acad.Sci．USA 84 82:158，1985）、アデノウイルス（Kar lssonら、EMBO J．5:2377，1986）、アデノ伴生ウイルス（AAV）（B．J．Carter 、Current Opinion in Biotechnology 1992，3:533-539）、およびレトロウイルス（Coffin、1985，pp.17-71 Weissら（編），RNA Tumor Viruses，第２版，第２巻，Cold Spring Harbor Laboratory，New York）由来のウイルスベクターが含まれる。このように、遺伝子転移および発現方法は多数あるが、本質的には哺乳類細胞で遺伝子物質を導入し発現するために機能する。上記技法のいくつかは造血細胞またはリンパ様細胞を形質導入するために用いられ、これには、リン酸カルシウムトランスフェクション（Bermanら、前出、1984）、プロトプラスト融合（Deansら、前出、1984）、エレクトロポレーション（Cannら、Oncogene 3:12 3，1988）、ならびに組換えアデノウイルス（Karlssonら、前出；Reutherら、Mo l．Cell．Biol．6:123，1986）、アデノ伴生ウイルス（LaFaceら、前出）、およびレトロウイルスベクター（Overellら、Oncogene 4:1425，1989）での感染が挙げられる。初代Ｔリンパ球はエレクトロポレーション（Cannら、前出、1988）により、およびレトロウイルス感染（Nishiharaら、Cancer Res．48:4730，1988； Kasidら、前出、1990；およびRiddel，S.ら、Human Gene Therapy 3:319-338，1 992）により良好に形質導入された。レトロウイルスベクターは、真核生物細胞への遺伝子転移のための非常に有効な方法を提供し、そしてＴ_H依存性CTL中への本発明のポリヌクレオチドの送達のための好適な方法である。さらに、レトロウイルス組み込みは制御された様式で起こり、そして細胞あたり１つまたは２〜３のコピーの新しい遺伝情報の安定な組み込みを得る。レトロウイルスは、ウイルスがコードする、RNA特異的DNAポリメラーゼ、または逆転写酵素を用いて複製する１つのクラスのウイルスであり、ウイルスのRNA ゲノムを複製して鳥類または哺乳類宿主細胞の染色体DNAに組み込まれる二本鎖D NA中間体を提供する。ほとんどのレトロウイルスベクターはネズミのレトロウイルスに由来する。しかし、本発明に従って用いるに適用可能なレトロウイルスは、任意の鳥類または哺乳類細胞源に由来し得る。これらのレトロウイルスは、好適には両種性（amphotropic）であり、これはヒトを含む数種の宿主細胞を感染し得る。レトロウイルスゲノム（および本明細書に記載されたように用いられるレトロウイルスベクター）の特有の特徴は、レトロウイルスの長い端末反復（lo ng terminal repeat）、またはLTRであり、これはレトロウイルスゲノムの5'および3'末端でわずかに異なる形態で見られる約600塩基対の非翻訳領域である。プロウイルスとしてDNAに組み込まれると、レトロウイルスLTRは、各末端に短い直接反復配列（short direct repeat sequence）を含み、そしてRNAポリメラーゼIIによる転写の開始ならびにRNA転写物の3'開裂およびポリアデニル化のためにシグナルを送る。LTRはウイルスの複製に必要なすべての他のシスに作用する（cis-acting）配列を含む。「プロウイルス」とは、レトロウイルスのDNA逆転写物をいい、これは適切な宿主細胞、またはそのクローン化コピー、またはレトロウイルスDNAの組み込まれていない中間形態のクローン化コピーで、染色体DNA中に安定に組み込まれる。プロウイルスの前進的な転写および感染性ウイルスへのアセンブリは、適当なヘルパーウイルスの存在下、またはキャプシド化を可能にし得る適切な配列を含む細胞株中で、夾雑するヘルパーウイルスを同時生成することなく起こる。Mann ら（Cell 33:153，1983）は、ヘルパーを含まない組換えレトロウイルスストックを生成するに用いられ得る細胞株（例えば、ψ2）の開発を記載している。これらの細胞株は、キャプシド形成にインシスで（in cis）必要とされる配列を欠失しているが、インタクトのビリオンを生成するためにイントランスで（in tra ns）すべての必要な遺伝子産物を提供する、組み込まれたレトロウイルスゲノムを含む。組み込まれた変異プロウイルスから転写されたRNAは、それ自体はパッケージングされ得ないが、これらの細胞は、同じ細胞中に導入された組換えレトロウイルスから転写されたRNAをキャプシド形成し得る。得られるウイルス粒子は、感染性であるが複製に欠陥があり、キャプシド形成を可能にする相補的遺伝情報を欠如する細胞中への導入後に感染性ウイルスを生成し得ない有用なベクターにする。エコトロピックウイルスエンベロープをコードするトランス作用（trans-acting）成分を有する細胞株（例えば、ψ2）におけるキャプシド形成は、エコトロピック（限定された宿主範囲の）子孫ウイルスを提供する。あるいは、両種性のパッケージング遺伝子を含む細胞株（例えば、PA317、ATCC CRL 9078；MillerおよびButtim ore，Mol．Cell．Biol．6:2895，1986）中のアセンブリは、両種性の（広い宿主範囲の）子孫ウイルスを提供する。このようなパッキング細胞株は、必要なレトロウイルスのgag、pol、およびenvタンパク質をイントランスで提供する。この方法により、哺乳類細胞に非常に感染性であるが標的細胞のゲノム中に組み込まれた後にさらに複製できないレトロウイルス粒子を生成する。env遺伝子の産物は、標的細胞の表面上のウイルスレセプターへのレトロウイルスの結合に応答性であり、したがってレトロウイルスの宿主範囲を決定する。PA 317細胞は両種性エンベロープタンパク質を有するレトロウイルス粒子を生成し、これはヒトおよび他の種源の細胞を形質導入し得る。他のパッケージング細胞株は、エコトロピックエンベロープタンパク質を有する粒子を生成し、マウスおよびラットの細胞のみを形質導入し得る。多くのレトロウイルスベクター構築物が多くの外来遺伝子を発現されるためにうまく用いられている（例えば、Coffin、Weissら（編）、RNA Tumor Viruses，第2版，第2巻，Cold Spr ing Harbor Laboratory，New York，1985，pp．17-71を参照のこと）。挿入された配列を有するレトロウイルスベクターは一般的に機能的であり、そしてレトロウイルス感染に一貫して阻害性である配列はほとんど同定されていない。機能的ポリアデニル化モチーフはレトロウイルスのRNA合成を遮断することによりレトロウイルスの複製を阻害し、そしてレトロウイルス粒子中にパッケージされ得る約11kbの配列のサイズの上限がある（Coffin、前出、1985）；しかし、問題があると最初に考えられた（Coffin、前出、1985）多数の内部プロモーターの存在は、いくつかのレトロウイルス構築物中に十分に寛容されていることが見出された（Overellら、Mol．Cell．Biol．8:1803，1983）。レトロウイルスベクターは、レトロウイルスベクターを用いてインビトロで形質導入して受容体マウス中に移植したネズミ造血幹細胞の発達を追跡するために、いくつかのグループにより、遺伝子標識として用いられている（Williamsら、 Nature 310:476，1984；Dickら、Cell 42:71，1985；Kellerら、Nature 318:149 ，1985）。これらの研究は、感染した造血細胞が受容体動物の造血組織およびリンパ様組織を再構成すること、ならびに細胞がインビボで正常な発達ポテンシャルを示すことを証明している。マークされた細胞は、レトロウイルスベクター配列の存在を証明し得る任意の多くの分子生物学的技法、最も著名にはサザン分析およびPCR（ポリメラーゼ連鎖反応）を用いて視覚化され得る。レトロウイルスベクターを用いて遺伝的に細胞をマークする能力はまた、この技法がオートロガス（autologous）細胞の移植物を追跡するために用いられ得る臨床環境（setting ）にも有用である。このアプローチは、既に、Rosenbergら（N．Engl．J．Med． 323:570，1990）により、末期癌処置についてのTIL（腫瘍浸潤リンパ球）治療を受けた患者におけるTILの追跡に用いられている。これらの細胞のマーカー遺伝子での形質導入は、インビトロ細胞機能不全に関連しなかった（Kasidら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 87:473，1990）。多くの遺伝子産物がレトロウイルス中で発現されている。これは、レトロウイルスLTRに組み込まれたプロモーターの転写制御下で発現される配列を配置すること、あるいはそれらをLTR間に挿入したヘテロローガスプロモーターの制御下に配置することによるいずれかにより達成され得る。後者の方法は、ベクター中で優先的に選択可能なマーカー遺伝子を同時発現する方法を提供し、このようにして特定のベクター配列を発現する細胞の選択を可能にする。刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現が、処理された個体に毒性であり得ることが予期される。したがって、本発明のＴ細胞クローンにインビボでのネガティブ選択を受けるようにする遺伝子セグメントを含むことは、本発明の範囲内である。「ネガティブ選択」とは、注入された細胞が個体のインビボ条件の変化の結果として除去され得ることを意味する。ネガティブ選択可能な表現型は、投与した因子（例えば、化合物）に感受性を与える遺伝子の挿入から生じ得る。ネガティブ選択可能な遺伝子は当該分野で公知であり、特に以下のものが含まれる：ガンシクロビル（ganciclovir）感受性を与える単純ヘルペスウイルスタイプＩチミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子（Wiglerら、Cell 11:223，1977）；細胞性ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞性アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、細菌性シトシンデアミナーゼ、（Mullenら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA．89:33（1992））。さらに、インビトロでネガティブ選択可能な表現型の細胞の選択を可能にするポジティブマーカーをＴ細胞中に含むことは有用である。ポジティブ選択可能なマーカーは、宿主細胞中に導入されて、遺伝子を有する細胞のポジティブ選択を可能にする優性表現型を発現する遺伝子であり得る。このタイプの遺伝子は当該分野で公知であり、特に、ハイグロマイシンＢ（hygromycin B）への耐性を与えるハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（hph）、抗生物質G418 への耐性をコードするTn5由来のアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（neoまたはaph）、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子、アデノシンデアミナーゼ遺伝子（ADA）、および多剤耐性（MDR）遺伝子。好適には、ポジティブ選択可能マーカーおよびネガティブ選択可能マーカー要素は、ポジティブ選択可能マーカーの消失により、必要なネガティブ選択可能要素の消失も達成されるように連結される。より好適には、ポジティブおよびネガティブ選択可能マーカーは、一方の消失が義務的に他方の消失を導くように融合される。上記の所望のポジティブおよびネガティブ選択特徴の両方を与えるポリペプチドを発現産物として得る融合したポリヌクレオチドの例は、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼチミジンキナーゼ融合遺伝子（HyTK）である。この遺伝子の発現により、インビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性およびインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を与えるポリペプチドを得る。Lupton S．D. ら、Mol．and Cell．Biology 11:3374-3378，1991を参照のこと。さらに、好適な実施態様では、キメラレセプターをコードする本発明のポリヌクレオチドは、融合した遺伝子、特にインビトロでのポジティブ選択のためのハイグロマイシンＢ耐性およびインビボでのネガティブ選択のためのガンシクロビル感受性を与える遺伝子を含むレトロウイルスベクター（例えば、Lupton，S.D.ら（1991）、前出に記載のHyTKレトロウイルスベクター）中にある。Lupton，S.D.，WO 92/0879 6（国際公開日1992年5月29日）によるBlfunctional Selectable Fusion Genesの記載も参照のこと。本発明のリンパ球クローンは、個体に免疫を与えるために用いられ得る。「免疫」とは、病原体による感染への応答、または腫瘍への応答に関連した１つまたはそれ以上の身体の徴候の低下を意味し、これはリンパ球の応答に関する。投与される細胞量は通常、病原体への免疫を有する正常個体に存在する範囲である。したがって、CD8⁺CD 4^-細胞は通常、注入により、各注入が少なくとも10⁶〜10¹⁰細胞／m²の範囲で、好ましくは少なくとも10⁷〜10⁹細胞／m²の範囲で投与される。このクローンは、単回注入により、またはある範囲の時間にわたる多回の注入により投与され得る。しかし、種々の個体が応答性が異なることが予測されるので、注入される細胞のタイプおよび量、ならびに注入回数および多回の注入が行われる時間範囲は、主治医または獣医により決定され、そして日常の実験により決定される。以下に示す実施例は、当業者にさらなる指針として提供されるものであり、本発明をいかなるようにも限定するように解釈されるものではない。実施例１ c-kit:IL-2Rβの構築ほとんどの細胞外コーディング領域および完全な貫膜および細胞質領域を含むヒトIL-2RβcDNAのXho1-BamH1フラグメントを、Not1-Sac1領域が開裂されるプラスミドpBluescript SK-（Stratagene）の改変体のXho1およびBamH1部位にクローン化し、平滑末端にし、再連結した。（ヒトIL-2RβcDNA（例えば、Hatakeyama ，M.ら（1989），Science 244:551-556を参照のこと）は、Tada Taniguchi，Osa ka，Japanにより提供された。）次いで、このプラスミドをKpn1およびHincIIで消化し、そして199bpフラグメントを、完全な細胞外および貫膜コーディング領域ならびに細胞質コーディング領域の一部を含むネズミc-kit cDNAの1995bp Kpn1平滑化Apa1フラグメントで置換した。（ネズミc-kit cDNA（例えば、Qiu，F.ら（1988）EMBO J．7:1003-1011）は、Stewart Lyman，Immunex Corp.，Seattle，Washingtonにより提供された。）このように、得られたプラスミドpBKβがほとんどのIL-2RβcDNAの上流にほとんどのc-kit cDNAを有していた。この融合物は、部位特異的ループ除去変異誘発により完成した。このプラスミドのウラシル含有一本鎖形態を、Muta-Gene Phag emid In Vitro Mutagenesisキット（BioRad）を製造者の指示にしたがって用いて調製した。これを、配列：5’GCC GAG CCA CGG AAT GTG GGC CTG GAT TTG 3’ を有する融合プライマーにアニールした。第２鎖の合成、連結、およびアニールした産物での大腸菌（E．coli）の形質転換を、製造者の指示に従って行った。望ましくない介在cDNA配列がうまく除去されている得られたプラスミドを、Hinc IIおよびSacIで消化し、融合部位を含む859bpフラグメントを、同様に消化した親プラスミドpBKβに戻してクローン化した。この最後の工程は、間違いやすい変異誘発工程を通るcDNA配列の量を最小にした。最終プラスミドpBKβ-EXの配列を、標準的なDNA配列決定法により確認した。 k:βキメラcDNAの完全なコーディング領域を含むpBKβ-EXからの2524bp Kpn1 （平滑化）-BamH1（部分消化）フラグメントを、 Sal1（平滑化）およびBamH1で消化した発現ベクターpHβAPr-1-neo（Gunning，P .ら（1987），P.N.A.S．84:4831-4835）中にクローン化した。次いで、pNkβと命名したこのプラスミドを細胞にトランスフェクトした。実施例２ c-kit:IL-2Rγの構築ヒトIL-2RγcDNA（Takeshita，T.ら（1992），Science 257:379-382）のフラグメントを、プライマー5’CCGTTGAC CCC ACT CTG TGG AAG TGC 3’および5’CC GGATCC GGC TAC AGG ACC CTG GGG 3’（下線を施した塩基は制限酵素部位をコードする）を用いて、ヒトＴ細胞クローン2D5由来の第２鎖cDNAからPCR増幅した。次いで、生成物を上記改変pBluescript SK-プラスミドのHincIIおよびBamH1部位にクローン化し、DNA配列決定を行った。次いで、このプラスミドをKpn1およびH incIIで消化し、そして199bpフラグメントを、完全な細胞外および貫膜コーディング領域ならびに細胞質コーディング領域の一部を含むネズミc-kit cDNAの1995 bp Kpn1平滑化Apa1フラグメントで置換した。得られたプラスミドpBKγがほとんどのIL-2RγcDNAの上流にほとんどのc-kit cDNAを有していた。この融合物は、P CRスプライス重複伸長により完成した。c-kit細胞外領域をコードするプラスミドの一部をプライマーＡ（CCG AGC ACC AGC AGT GG）およびＢ（TGC AAA CAG GA A AGG GTG GGC CTG GAT TTG）を用いてPCRにより増幅した。プライマーＢの下線を施した領域は、IL-2Rγの貫膜領域と実際に相補的である。IL-2Rγ の貫膜および細胞質コーディング領域を、プライマーＣ（CAA ATC CAG GCC CAC CCT TTC CTG TTT GCA ）およびＤ（CCGGATCC GGG GTT CAG GTT TCA GGC）を用いてPCRによりpBkγから増幅した。プライマーＣがプライマーＢと完全に相補的であり、そしてそれらがともに所望の融合部位をコードしていることに留意のこと。次いで、これらの２つのPCR反応の産物を、１本のチューブ中に合わせて、それらをプライマーＡおよびＤを用いる第３のPCR反応における基質として用いた。プライマーＢおよびＣの相補性は、第１の２つのPCR反応の産物を、互いにアニールさせて重複伸長テンプレートを生成することを可能にする。このように、第３のPCR反応の産物は、所望の融合部位およびプライマーＡのアニール部位からプライマーＤのアニール部位までの伸長を有するキメラcDNAをコードしていた。次いで、この産物を、BstX1およびPst1で消化し、同様に消化されているpBkγ 中に戻してクローン化した879bpフラグメントを生成した。最終プラスミドpBkγ -EXの配列を、標準的なDNA配列決定法により確認した。 k:γキメラcDNAの完全なコーディング領域を含むpBKγ-EXからの1977bp Kpn1 （平滑化）-BamH1（部分消化）フラグメントを、Sal1（平滑化）およびBamH1で消化した発現ベクターpHβAPr-1-hygro中にクローン化した（発現ベクターpHβA Pr-1-hygroは、上記の発現ベクターpHβAPr-1-neo中でクローン化したRSV.5（Lo ng，E．O.ら（1991）Human Immunology 31:229-235）由来のハイグロマイシン配列を含む。次いで、pHkγと命名したこのプラスミドを細胞にトランスフェクトした。実施例３ pkitの構築野生型ネズミc-kitをコードするcDNAを、完全なc-kitコーディング領域を含む平滑末端化2970bp Kpn1-Not1フラグメントを、HindIIIで消化され、平滑末端化されそして脱リン酸化されているpHβAPr1-neoに連結することにより、発現ベクターpHβaPr-1-neo中にクローン化した。実施例４細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株におけるサイトカイン依存性の改変Ｔ細胞での発現Ｔ細胞をキメラレセプターをコードするプラスミドでトランスフェクトし、そして薬剤耐性細胞株を選択する。キメラレセプターの発現について試験するために、薬剤耐性細胞株を、細胞外領域を認識する抗体で染色し、そしてフローサイトメトリーでスキャンする。発現はまたウエスタンブロットで検出し得る。キメラレセプターを発現する細胞株を、成長および／または増殖に通常必要とされるサイトカイン（例えばIL-2）の制限量の存在下で、コグネイト代替サイトカイン（すなわち、キメラレセプターの細胞外ドメインにより認識されるもの）に応答しての成長について試験する。Ｔ細胞トランスフェクションプラスミドを、EcoR1（pNkβおよびpNkitについて）またはXmn1（pHkγについて）で消化することにより直鎖状にし、次いでフェノール−クロロホルム抽出により、続いてエタノール沈澱により精製した。それらを蒸留水で１μg/μlの濃度に再懸濁した。 10,000,000個のCTLL2細胞をPBSで１回洗浄し、次いで0.8mlのPBSで再懸濁した。25μgの直鎖状化プラスミドを加えて、細胞を室温で10分間放置した。２重にトランスフェクトした細胞（すなわち、pNkβおよびpHkγ）は各プラスミド25μ gを受容した。次いで、これらの細胞をキュベットに入れ、室温で１秒間250V.10 80μFにてエレクトロポレートした。次いで、細胞を16〜20時間37℃で完全培地（クリックス（Click's）＋10％FCS、１％グルタミン、１％pen-strep）中に置いた。このとき、細胞を遠心分離し、新鮮な培地で再懸濁し、そして37℃でさらに24時間インキュベートした。トランスフェクションの48時間後、細胞をpNkit 、pNkβ＋pHkγの群についてはネオマイシン（１mg/ml）あるいはpHkγの群についてはハイグロマイシンＢ（0.5mg/ml）の添加により選択した。薬剤耐性細胞株は代表的には１〜２週間で生育した。pNkβ＋pHkγ細胞の場合は、次いで、ネオマイシン耐性株を、IL-2を除去して培養物に組換えネズミ幹細胞因子（200ng/ml）を添加することにより、さらに選択した。フローサイトメトリー： 500,000〜1,000,000個の細胞を、染色溶液（２％ウシ胎児血清を含むハンクス（Hank's）培地）で２回洗浄し、そして0.1mlの染色溶液で再懸濁した。ネズミc -kitの細胞外領域を認識する１μgのモノクローナル抗体ACK-2（Gibco/BRL）を添加して、細胞を氷上に30分間放置した。染色溶液で１回洗浄した後、細胞を、フルオレセイン結合ヤギ抗ラット２次抗体（Tago Immunochemicals）を含む0.1m lの染色溶液で再懸濁し、氷上に30分間放置した。染色溶液で１回洗浄した後、細胞を0.25mlの0.5％パラホルムアルデヒドで再懸濁した。細胞の蛍光強度をBecton-Dickinson FACS Scannerを用いて測定した。増殖アッセイ： CTLL2株をRPM1で２回洗浄し、20,000個/mlの濃度で完全培地（クリックス（Cl ick's）＋10％FCS、１％グルタミン、１％pen-strep）で再懸濁した。細胞を、平底96ウエルプレートに0.2ml/ウエルで、サイトカインなし、または組換えヒト IL-2（100ユニット/ml）、または組換えネズミ幹細胞因子（200ng/ml）のいずれかの添加で入れ、37℃で20時間インキュベートした。次いで、2.5μCiのトリチウム標識チミジンを添加して、インキュベーションをさらに４時間続けた。細胞を採取し、シンチレーション液に入れ、そして取り込まれたチミジンをシンチレーションカウンターを用いて測定した。結果この結果は、c-kit:IL-2キメラレセプターが機能的であるという証拠を提供する。図３は、成長および生存が高度にIL-2依存性であるマウスＴ細胞株であるCT LL2における、キメラレセプターの発現のフローサイトメトリー分析を示す。細胞をc-kitに対する抗体で染色した。親細胞株はc-kitについてネガティブであるが、k:γ単独、k:β単独、およびk:γとk:βとを共に、または正常c-kit単独でトランスフェクトした細胞はすべてポジティブである。図４は、c-kitについての天然リガンドであるネズミ幹細胞因子（SCF）へのこれらの細胞の増殖応答を示す。すべての細胞株はIL-2に応答する。顕著なことには、k:βとk:γとの両方を発現する細胞もまたSCFに応答する。正常CTLL2細胞は IL-2からの回収の24時間以内に死ぬ。しかし、k:β/k:γトランスフェクタントは、SCFの存在および外因的に添加したIL-2の非存在下で１年以上維持された。実施例５プロＢ細胞株におけるサイトカイン依存性の改変実施例４に記載されていると同様の結果が、k:β/k:γキメラレセプターがBAF3細胞（成長が通常IL-3に応答性であるが、IL-2Rがトランスフェクトされた遺伝子で発現される場合にIL-2に応答性であるネズミプロＢ細胞）で発現されたときに得られた。いくつかの細胞増殖もまた、k:β鎖単独でトランスフェクトされたBAF3細胞で観察された。しかし、正常IL-2応答の発生の顕著な指標は、IL-2Rαの上方調節である（例えば、Smith，K．A.ら（1985）P.N.A.S．82:864-868を参照のこと）。k:βおよびk:γ鎖の組み合わせでトランスフェクトしたとき、CTLL2およびBAF 3細胞は両方ともIL-2Rαの上方調節を示した。CTLL2細胞もBAF3細胞も、k:β鎖単独またはk:γ鎖単独でトランスフェクトしたとき、IL-2Rαの上方調節を示さなかった。これらの結果は、IL-2レセプターのβおよびγ鎖のようなヘテロオリゴマーシグナリング鎖を有するレセプターの正常な細胞内応答の再生成ついて、上記のように各タイプの細胞質ドメインをキメラレセプター中に導入することが好ましいことを確証する傾向がある。実施例６ヘルパーＴリンパ球株におけるサイトカイン依存性の改変実施例４に記載されていると同様の結果が、キメラレセプターをD10.G4.1細胞で発現したときに得られた。後者の細胞は、成長に通常IL-2を必要とするネズミ CD4⁺ヘルパーＴ細胞クローン由来である。Kayeら（1983），J．Exp．Med．158:8 3 6-856を参照のこと。実施例７ネズミCD8+ CTL株におけるサイトカイン依存性の改変実施例４に記載されていると同様の結果が、キメラレセプターをL3細胞で発現したときに得られた。後者の細胞は、ネズミCD8⁺Ｔ細胞クローン由来である。Si u，G.ら（1992），Molec．Cell Biol．12:1592-1604を参照のこと。上記の原理および教示は、他の実施態様を生成するために適用されており、そのうちのいくつかを以下に記載し、本発明の有用性をさらに証明する。例えば、Ｔリンパ球において本発明の有用性を証明する他のキメラレセプターが含まれる。実施例８ GMβ/2βの構築ほとんどの細胞外コーディング領域および完全な貫膜および細胞質領域をコードするヒトIL-2RβcDNAのXhol-BamH1フラグメントを、Not1-Sac1領域が開裂され、平滑末端化されそして再連結されたプラスミドpBluescript SK-（Strategene ）の改変休のXho1およびBamH1部位にクローン化した。次いで、このプラスミドをKpn1およびHincIIで消化し、ヒトGM-CSF-Rβ（KH97）の完全な細胞外および貫膜コーディング領域をコードするcDNAのXho1/平滑化EcoR1フラグメントに連結した（Ha yashida，K.ら（1990）P.N.A.S．87:9655-9659）。細胞外領域と貫膜領域との間の正確な融合物は、相補的融合プライマーGCCGAGCCACGGAATCGACTCGGTGTCCCAおよびTGGGACACCGAGTCGATTCCGTGGCTCGGCを用いて重複伸長PCRにより作成した。GMβ/ 2βキメラcDNAの完全なコーディング領域を、発現ベクターpHβAPr-1-neoにクローン化し、プラスミドpNGβを生成した。GMβ/2β構築物の融合部位およびフランキング領域を標準的なDNA配列決定法により確認した。実施例９ GMα/2γの構築ヒトIL-2RγcDNAのフラグメントを、プライマー5’CCGTTGAC CCC ACT CTG TGG AAG TGC 3’および5’CCGGATCC GGC TAC AGG ACC CTG GGG 3’（下線を施した塩基は制限酵素部位をコードする）を用いて、ヒトＴ細胞クローン2D5由来の第２鎖cDNAからPCR増幅した。次いで、生成物を上記改変pBluescript SK-プラスミドのHincIIおよびBamH1部位にクローン化し、DNA配列決定を行った。次いでこのプラスミドをXho1およびHincIIで消化し、完全な細胞外および貫膜コーディング領域および細胞質コーディング領域の一部をコードするヒトGM-CSF-Rα cDNAのX ho1/平滑化EcoR1フラグメントに連結した（Gearing，D．P.ら（1989）EMBO J．8 :3667-3676）。細胞外領域と貫膜領域との間の正確な融合物は、相補的融合プライマーを用いて重複伸長PCRにより作成した。TGCAAACAGGAAAGGCCCG TCGTCAGAACCおよびGGTTCTGACGACGGGCCTTTCCTGTTTGCA。GMα/2γキメラcDNAの完全なコーディング領域を、発現ベクターpHβAPr-1-hygroにクローン化し、プラスミドpHGγを生成した。GMα/2γ構築物の融合部位およびフランキング領域を標準的なDNA配列決定法により確認した。実施例１０細胞傷害性Ｔリンパ球細胞株におけるサイトカイン依存性の改変Ｔ細胞トランスフェクションプラスミドを、EcoR1（pNGβについて）またはXmn1（pHGγについて）で消化することにより直鎖状にし、フェノール−クロロホルム抽出により、続いてエタノール沈澱により精製した。それらを蒸留水で１μg/μlの濃度に再懸濁した。 10,000,000個のCTLL2細胞をPBSで１回洗浄し、次いで0.8mlのPBSで再懸濁した。25μgの直鎖状化プラスミドを加えて、細胞を室温で10分間放置した。次いで、これらの細胞をキュベットに入れ、室温で１秒間250V、980μFにてエレクトロポレートした。次いで、細胞を16〜20時間37℃で完全培地（クリックス（Click' s）＋10％FCS、１％グルタミン、１％pen-strep）中に置いた。このとき、細胞を遠心分離し、新鮮な培地で再懸濁し、そして37℃でさらに24時間インキュベートした。トランスフェクションの48時間後、細胞をpNGβについてはネオマイシン（１mg/ml）あるいはpHGγについてはハイグロマイシンＢ（0.5mg/ml）の添加により選択した。薬剤耐性細胞株は、代表的には１〜２週で成長した。GMβ/2βとGMα/2γの両方を発現する細胞を生成するために、GMβ/2βを発現するネオマイシン耐性株を、プラスミドpHGγでエレクトロポレートし、次いでIL-2を除去して培養物に組換えヒトGM-CSF（100ng/ml）を添加することにより、GMα/2γの発現について選択した。増殖アッセイ CTLL2株をRPMIで２回洗浄し、20,000個/mlの濃度で完全培地（クリックス（Cl ick's）＋10％FCS、１％グルタミン、１％pen-strep）で再懸濁した。細胞を、平底96ウエルプレートに0.2ml/ウエルで、サイトカインなし、または組換えヒト IL-2（５ユニット/ml）、または組換えヒトGM-CSF（10ng/ml）のいずれかの添加で入れ、37℃で20時間インキュベートした。次いで、2.5μCiのトリチウム標識チミジンを添加して、インキュベーションをさらに４時間続けた。細胞を採取し、シンチレーション液に入れ、そして取り込まれたチミジンをシンチレーションカウンターを用いて測定した。図６は、IL-2およびGM-CSFへのこれらの細胞の増殖応答を示す。すべての細胞株はIL-2に応答する。顕著なことには、GMβ/2βとGMα/2γの両方を発現する細胞は、GM-CSFへの増殖応答を示し、本発明の有用性をさらに証明する。有用性キメラレセプターをコードする本発明のポリヌクレオチドは、増殖のために１つまたはそれ以上のサイトカインに対する低減した必要性を有するリンパ球の生成に有用である。１つまたはそれ以上のサイトカインに対する低減した依存性を有するキメラレセプターを含む細胞は、特に免疫治療に有用である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．第１のペプチド鎖を含むキメラレセプターであって、該第１のペプチド鎖がサイトカインＡを結合するサイトカインレセプターA-R由来の細胞外ドメインを含み、該ドメインが貫膜ドメインを介して、サイトカインＢを結合するサイトカインレセプターB-R由来の細胞質ドメインに接合され、ここでサイトカインＢが成長および増殖のためにリンパ球により通常必要とされるサイトカインであり、そして該リンパ球で発現される該キメラレセプターがサイトカインＡの存在下でサイトカインＢへのリンパ球の成長依存性を低減させる、キメラレセプター。２．請求項１に記載のキメラレセプターであって、前記サイトカインレセプターB-Rがシグナル伝達に必要である２つのペプチド鎖を通常含み、そして該キメラレセプターが第２のペプチド鎖を含み、該第２のペプチド鎖がサイトカインレセプターB-R由来の細胞質ドメインを含む、キメラレセプター。３．請求項２に記載のキメラレセプターであって、前記第２のペプチド鎖がサイトカインＡを結合するサイトカインレセプターA-R由来の細胞外ドメインを含み、該ドメインが貫膜ドメインを介して、サイトカインＢを結合するサイトカインレセプターB-R由来の細胞質ドメインに接合される、キメラレセプター。４．請求項３に記載のキメラレセプターであって、サイトカインレセプターB- Rがヘテロオリゴマータイプのサイトカインレセプターであり、そして前記第２のペプチド鎖の細胞質ドメインが前記第１のペプチド鎖の細胞質ドメインとは異なる、キメラレセプター。５．請求項４に記載のキメラレセプターであって、サイトカインレセプターB- Rが、インターロイキン２レセプター（IL-2R）、インターロイキン３レセプター（IL-3R）、インターロイキン４レセプター（IL-4R）、インターロイキン５レセプター（IL-5R）、インターロイキン６レセプター（IL-6R）、インターロイキン７レセプター（IL-7R）、γインターフェロンレセプター（IFNγ-R）、および顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子レセプター（GM-CSF-R）からなる群から選択される、キメラレセプター。６．請求項４に記載のキメラレセプターであって、前記第１および第２のペプチド鎖の細胞外ドメインが第１のヘテロオリゴマータイプのサイトカインレセプターに由来し、そして前記第１および第２のペプチド鎖の細胞内ドメインが第２のヘテロオリゴマータイプのサイトカインレセプターに由来する、キメラレセプター。７．前記第１および第２のペプチド鎖がインターロイキン２レセプター（IL-2 R）に由来する、請求項６に記載のキメラレセプター。８．請求項７に記載のキメラレセプターであって、前記第１および第２のペプチド鎖の細胞外ドメインが顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子レセプター（GM-CSF-R）、γインターフェロンレセプター（IFNγ-R）、インターロイキン３レセプター（IL-3R）、インターロイキン４レセプター（IL-4R）、およびインターロイキン７レセプター（IL-7R）からなる群から選択されるサイトカインレセプターに由来する、キメラレセプター。９．サイトカインレセプターA-Rが、一本鎖としてまたはホモ多重化による高親和性リガンド結合を有するサイトカインレセプターである、請求項３に記載のキメラレセプター。１０．請求項９に記載のキメラレセプターであって、サイトカインレセプター A-Rが、c-kitレセプター（c-kit-R）、腫瘍壊死因子レセプター（TNF-R）、エリトロポエチンレセプター（Epo-R）、および顆粒球コロニー刺激因子レセプター（G-CSF-R）からなる群から選択される、キメラレセプター。１１．請求項３に記載のキメラレセプターであって、前記第１および第２のペプチド鎖が、一本鎖としてまたはホモ多重化による高親和性リガンド結合を有するサイトカインレセプター由来であり、そして第１および第２のペプチドがヘテロオリゴマータイプのサイトカインレセプターに由来する、キメラレセプター。１２．前記第１および第２のペプチドがインターロイキン２レセプター（IL-2 R）に由来する、請求項１１に記載のキメラレセプター。１３．前記リンパ球がCD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）である、請求項３に記載のキメラレセプター。１４．請求項１３に記載のキメラレセプターであって、前記CTLが、ヘルパーＴ細胞（Ｔ_H）により提供されるサイトカインＢに通常依存的であり、そして該C TLで発現される該キメラレセプターが、サイトカインＡの存在下でＴ_H細胞への該CTLの成長依存性を低減させる、キメラレセプター。１５．サイトカインレセプターB-Rがインターロイキン２レセプター（IL-2R）であり、サイトカインＢがインターロイキン２（IL-2）である、請求項１４に記載のキメラレセプター。１６．サイトカインレセプターA-Rが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子レセプター（GM-CSF-R）、γインターフェロンレセプター（IFNγ-R）、およびインターロイキン３レセプター（IL-3R）からなる群から選択される、請求項１５に記載のキメラレセプター。１７．サイトカインレセプターA-Rが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子レセプター（GM-CSF-R）であり、サイトカインＡが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）である、請求項１６に記載のキメラレセプター。１８．サイトカインレセプターA-Rがγインターフェロンレセプター（IFNγ-R ）であり、サイトカインＡがγインターフェロン（IFNγ）である、請求項１６に記載のキメラレセプター。１９．サイトカインレセプターA-Rがインターロイキン３レセプター（IL-3R）であり、サイトカインＢがインターロイキン３（IL-3）である、請求項１６に記載のキメラレセプター。２０．前記細胞質ドメインおよび貫膜ドメインの両方がサイトカインレセプターB-Rに由来する、請求項１に記載のキメラレセプター。２１．前記細胞質ドメインおよび貫膜ドメインの両方がサイトカインレセプターB-Rに由来する、請求項３に記載のキメラレセプター。２２．請求項１に記載の第１のペプチド鎖をコードする領域を含む、組換えポリヌクレオチド。２３．請求項３に記載の第２のペプチド鎖をコードする領域を含む、組換えポリヌクレオチド。２４．請求項３に記載の第２のペプチド鎖をコードする領域をさらに含む、請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチド。２５．発現ベクターの形態中にある、請求項２２に記載の組換えポリヌクレオチド。２６．発現ベクターの形態中にある、請求項２４に記載の組換えポリヌクレオチド。２７．請求項２５に記載の発現ベクターを含む、細胞。２８．請求項２６に記載の発現ベクターを含む、細胞。２９．前記細胞がCD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）である、請求項２７に記載の細胞。３０．前記細胞がCD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）である、請求項２８に記載の細胞。３１．第１のペプチド鎖をコードする領域を含む組換えポリヌクレオチドを使用する方法であって、該第１のペプチド鎖がサイトカインＡを結合するサイトカインレセプターA-R由来の細胞外ドメインを含み、該ドメインが貫膜ドメインを介して、サイトカインＢを結合するサイトカインレセプターB-R由来の細胞質ドメインに接合され、サイトカインＢが成長および増殖のためにリンパ球により通常必要とされるサイトカインであり、そして該リンパ球で発現される該キメラレセプターがサイトカインＡの存在下でサイトカインＢへのリンパ球の成長依存性を低減させ、該方法が、該組換えポリヌクレオチドで細胞を形質転換する工程を包含する、方法。３２．前記組換えポリヌクレオチドが組み換え発現ベクターの形態中にある、請求項３１に記載の方法。３３．前記細胞がリンパ球である、請求項３２に記載の方法。３４．前記リンパ球がCD8⁺細胞傷害性Ｔリンパ球（CTL）である、請求項３３に記載の方法。３５．サイトカインレセプターB-Rがインターロイキン２レセプター（IL-2R）であり、サイトカインＢがインターロイキン２（IL-2）である、請求項３４に記載の方法。３６．サイトカインレセプターA-Rが、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子レセプター（GM-CSF-R）、γインターフェロンレセプター（IFNγ-R）、およびインターロイキン３レセプター（IL-3R）からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。３７．請求項３０に記載の方法により生成される細胞およびその子孫。３８．請求項３１に記載の方法により生成される細胞およびその子孫。３９．請求項３２に記載の方法により生成される細胞およびその子孫。４０．請求項３３に記載の方法により生成される細胞およびその子孫。４１．請求項３４に記載の方法により生成される細胞およびその子孫。４２．請求項３５に記載の方法により生成される細胞およびその子孫。４３．請求項３６に記載の方法により生成される細胞およびその子孫。