KR102275668B1 - 면역신호의 변환이 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역세포 및 이의 항암 용도 - Google Patents

면역신호의 변환이 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역세포 및 이의 항암 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역 세포 및 이 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 면역억제성 사이토카인이 존재하는 미세종양환경하에서 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환함으로써 암에 대한 보다 강력한 세포독성효과를 발휘할 수 있다. 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 암 치료용 세포치료제로 사용할 수 있다.

Description

면역신호의 변환이 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역세포 및 이의 항암 용도{Chimeric Cytokine Receptor Capable of Converting Immunosuppressive Signal to Immunostimmulatory Signal, Immune Cell Expressing the Same, and Anti-Cancer Use Thereof}
본 발명은 키메릭 사이토카인 수용체 및 이의 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역 세포 및 이의 항암 용도에 관한 것이다.
최근 들어 면역세포들의 항암효과에 대한 연구가 활발하게 진행되어 왔다. NK (Natural Killer) 세포는 선천성 면역체계(innate immune system)에 특화된 효과기 세포(effector cell) 이며 암세포 및 바이러스 감염에 대한 방어에 중요한 역할을 한다. NK 세포가 가지고 있는 자연 세포독성은 적절한 세포막의 자극에 의하여 빠르게 반응하며, 활성화 수용체 (activating receptor) 또는 억제 수용체 (inhibitory receptor)의 복잡한 신호전달에 의하여 조절된다. NK 세포는 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell)와 유사하게 퍼포린(perforin)과 그랜자임(granzyme)을 통해 세포독성을 나타낸다.
NK 세포의 분화와 증식, 생존 그리고 기능을 활성화시키는 것에 있어서 다양한 사이토카인이 영향을 미치는 것으로 보고되어 있으며, 연구결과에 따르면 IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등의 사이토카인이 NK 세포의 기능과 활성을 증가시킨다고 보고되어 있다. IL-2(Interleukin-2)는 휴지기 상태의 NK 세포에 직접적으로 작용하여 NK 세포의 증식에 영향을 미치고 세포독성 능력을 증가시키며, 퍼포린과 IFN-γ의 발현을 증가시킨다. IL-15(Interleukin-15)는 NK 세포의 세포독성 능력을 증가시키며, T/NK 전구 세포로부터 NK 세포로 분화되는 과정에 영향을 미치고, NK 세포의 생존과 증식에 중요한 역할을 한다.
IL-21 (Interleukin-21)은 활성화된 CD4+ T 세포에 의해 분비되는 사이토카인이며, IL-21 수용체 (IL-21R, IL-21 receptor)는 수지상세포, NK, T, B 세포와 같은 림프구에서 발현되어 있다. IL-21은 구조적으로 IL-2 및 IL-15와 매우 유사하며, IL-21R는 IL-2R, IL-15R, IL-7R 또는 IL-4R 등과 γ-사슬을 공유하고 있다. IL-21은 골수로부터의 NK 세포 전구체의 성숙을 유도하는 것으로 보고되었으며, 특히 NK 세포의 사이토카인 생성능과 세포사멸능과 같은 효과 기능(effector functions)을 증가시키는 것으로 보고되었으며, CD8+ T 세포의 효과 기능도 증가시킴으로써 내재, 적응면역계의 항암반응을 촉진시키는 것으로 보고되었다. 또한, 인간의 말초혈액에서 분리한 NK 세포를 활성화시키며, 제대혈에서 분리한 조혈 줄기세포로부터 성숙한 NK 세포를 유도하는데 중요한 역할을 하는 것이 보고되었다.
면역억제성 사이토카인으로 IL-4, IL-6, IL-10, TGF-β 등이 존재한다. IL-4는 T 세포 분화 동안 pro-Th2 효과로 잘 알려진 γc 계열의 사이토카인의 구성원이다. IL-4의 부재는 NK 세포 생성 및 항상성에 영향을 미치지 않는다. 그러나, NK 세포는 인 비트로(in vitro) 에서 IL-4 수용체를 발현한다. 주목할 것은 IL-4가 사이토카인 생산이나 세포독성과 같은 주요 NK 효과 기능(effector function)을 억제하는 능력이다. 실제로, IL-4는 인간 NK 세포에서 IL-12 처리 후에 유도된 염증성 사이토카인 (IFN-γ, TNFα 및 GM-CSF) 생산 증가를 억제한다는 것이 증명되었다. IL-4의 또 다른 측정 가능한 효과는 인 비트로(in vitro) 및 인 비보(in vivo) 에서 NKG2D 및 다른 NK 세포 활성 마커 발현을 하향 조절하여, 결과적으로 NKG2D 의존성 세포 살상을 감소시키는 것이다. IL-4는 암 발병에도 중요한 영향을 미친다. 유방암, 전립선, 폐암, 신장암 등에서 IL-4R가 많이 증가된 것이 발견되었으며, 또한 많은 종류의 암에서 과발현됨이 발견되었다. IL-4는 면역억제성 사이토카인으로, 췌장암의 경우 면역회피 전략을 이용, 억제성 사이토카인을 생산하여 NK, CAR-T 세포의 지속성과 기능을 제한시킨다.
IL-10은 Th2 세포에서 발현 및 분비되어서 Th1 세포의 사이토카인 합성을 저해하는 것으로 처음에는 알려졌으나 (J.Exp.Med. 170,2081-2095), 지금은 대식세포(Macrophage), 수지상 세포(Dendritic cell, DC), B 세포는 물론 여러 종류의 CD4+ 및 CD8+ T 세포들에 의하여서도 생성되는 것으로 보고되고 있다. IL-10의 작용은 주로 단핵구(Monocyte) 또는 대식세포(Macrophage)가 항원을 제시하거나 T 세포를 자극하는데 필요한 MHCⅡ 및 B7-1/2의 발현을 방해함은 물론 IL-1α/β, IL-6, IL-12, IL-18, TNF-α등과 같은 여러 염증유발 사이토카인(pro-inflammatory cytokine) 그리고 MCP1, MCP5, RANTES, IL-8 등의 염증유발 케모카인(pro-inflammatory chemokine) 들의 생성을 억제함으로서 궁극적으로는 T 세포 및 NK 세포의 기능을 방해하게 된다.
본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.
WO 2017/029512
1. Vosshenrich CAJ, Ranson T, Samson SI, Corcuff E, Colucci F, Rosmaraki EE, et al. Roles for common cytokine receptor gamma-chain-dependent cytokines in the generation, differentiation, and maturation of NK cell precursors and peripheral NK cells in vivo. J Immunol (2005) 174:1213-21. 2. Marcenaro E, Della Chiesa M, Bellora F, Parolini S, Millo R, Moretta L, et al. IL-12 or IL-4 prime human NK cells to mediate functionally divergent interactions with dendritic cells or tumors. J Immunol (2005) 1950(174):3992-8. 3. Brady J, Carotta S, Thong RPL, Chan CJ, HayakawaY, Smyth MJ, et al. The inter*?*actions of multiple cytokines control NK cell maturation. J Immunol (2010) 185:6679-88. doi:10.4049/jimmunol.0903354 4. Kawakami K, Kawakami M, Puri RK (2001) Overexpressed cell surface interleukin-4 receptor molecules can be successfully targeted for antitumor cytotoxin therapy. Crit Rev Immunol 21: 299-310. 5. Gooch JL, Christy B, Yee D (2002) STAT6 mediates interleukin-4 growth inhibition in human breast cancer cells. Neoplasia 4: 324-331.
본 발명자는 유전자 재조합 기술을 이용하여 면역세포에서 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환시킬 수 있는 키메릭 사이토카인 수용체를 개발하기 위해 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 면역억제성 사이토카인과 반응할 수 있는 사이토카인 수용체의 세포외 도메인(extracellular domain)과 면역활성화 사이토카인 수용체의 막 관통―세포내 도메인(TM-cytoplasmic domain)을 가지는 인버티드 사이토카인 수용체(inverted cytokine receptor, ICR)을 제작하였고, 이를 NK (natural killer) 세포에서 성공적으로 발현시킨 후, 이의 면역신호 반응 및 우수한 면역 활성을 실험적으로 증명하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것에 있다.
상기 과제를 해결하기 위해,
본 발명은 (ⅰ) 사이토카인 결합 도메인; (ⅱ) 막 관통 도메인; 및 (ⅲ) 세포내 도메인;을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체로서, 상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 제공한다.
또한 본 발명은 (ⅰ) 사이토카인 결합 도메인; (ⅱ) 막 관통 도메인; 및 (ⅲ) 세포내 도메인;을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체로서, 상기 세포내 도메인은 NK 세포의 면역활성화 신호를 유도하는 사이토카인인 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 또는 IL-21 수용체의 세포내 도메인을 포함하는, 키메릭 사이토카인 수용체를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 양태에 따르면, (ⅰ) 사이토카인 결합 도메인; (ⅱ) 막 관통 도메인; 및 (ⅲ) 세포내 도메인을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체로서, 상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 제공한다.
본 발명에서 용어 “키메릭 사이토카인 수용체(chimeric cytokine receptor)”는 서로 다른 기원(origin)에서 유래한 (i) 사이토카인 결합 도메인; (ⅱ) 막 관통 도메인; 및 (ⅲ) 세포내 도메인이 조합되어 연결된 수용체를 의미한다.
본 발명에서 용어 “사이토카인 결합 도메인 (cytokine binding domain)”은 세포외에서 특정 사이토카인에 특이적으로 결합하는 부위를 의미하여, 본 명세서에서 용어 “세포외 도메인(ectodomain)”으로도 지칭될 수 있다.
본 발명에서 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합한다.
본 발명에서 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 또는 TGF-β에 특이적으로 결합할 수 있는 물질 부위이면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 사이토카인 결합 도메인은 IL-4, IL-6, IL-10, 및 TGF-β 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 세포외 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-4 수용체의 세포외 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-6 수용체의 세포외 영역은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-10 수용체의 세포외 영역은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TGF-β 수용체의 세포외 영역은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어 “막 관통 도메인 (transmembrane domain)”은 세포막을 관통하여 사이토카인 결합 도메인과 세포내 도메인을 연결하는 부위를 의미한다.
본 발명에서 막 관통 도메인은 세포막을 관통하여 사이토카인 도메인과 세포내 도메인을 연결하며, 사이토카인 결합에 의한 신호를 세포내 도메인으로 전달할 수 있는 물질 부위라면 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 막 관통 도메인은 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 및 IL-21 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 막 관통 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-7 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 14의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-12 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-2/15 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-18 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-21 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에서 용어 “세포내 도메인 (endodomain)”은 세포 내에 위치하여 상기 막 관통 도메인을 통해 전달되는 사이토카인 결합 신호를 세포 내부의 신호로 변환시키는 기능을 하는 부위를 의미한다.
본 발명에서 세포내 도메인은 사이토카인 결합에 의한 신호를 세포 내부로 변환 및 전달하는 기능을 하는 부위라면 어떠한 물질 부위도 제한 없이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포내 도메인은 IL-7, IL-12, IL-2/15, IL-18, 및 IL-21 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 세포내 영역을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-7 수용체의 세포내 영역은 서열번호 15의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-12 수용체의 세포내 영역은 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-2/15 수용체의 세포내 영역은 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-18 수용체의 세포내 영역은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-21 수용체의 세포내 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체는 신호 펩타이드(signal peptide)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 “신호 펩타이드(signal peptide)”는 발현된 키메릭 사이토카인 수용체를 세포막 부위로 이동 및 위치화(localization) 시키는 기능을 하는 펩타이드를 의미하며, 당업계에서 알려진 다른 용어 “신호 서열(signal sequence)”, “표적화 신호(targeting signal)”, 및 “위치화 신호(localization signal)” 등으로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호 펩타이드는 키메릭 사이토카인 수용체의 사이토카인 결합 도메인에 연결되며, 바람직하게는 사이토카인 결합 도메인의 N-말단에 연결된다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 신호 펩타이드는 IL-4, IL-6, IL-10, 및 TGF-β 수용체로 이루어지는 군에서 선택되는 하나 이상의 수용체의 신호 펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-4 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-6 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 IL-10 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 TGF-β 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체는 면역억제성 사이토카인의 신호를 면역활성화 신호로 변환시킬 수 있으며, 이러한 의미에서 다른 용어“인버티드 키메릭 수용체(inverted chimeric receptor)”로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
본 발명에서 용어 “코딩”은 천연 상태에서 또는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩티드 및/또는 그의 단편에 대한 mRNA를 제조하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 경우, 폴리펩티드를 “코딩”한다고 언급되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.
본 발명에서 용어 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 상호 교환적으로 사용되며 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머형태를 지칭한다. 상기 용어 폴리뉴클레오타이드는 단일, 이중, 또는 다중가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드(hybrid), 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적, 또는 유도체화된(derivatized) 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈(codon)의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 키메릭 사이토카인 수용체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명에서 사용되는 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터 (promoter), 종결자 (terminator), 인핸서 (enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명에서 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 재조합 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서와 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.
본 발명에서 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 푸로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 세포는 본 발명의 재조합 벡터로 형질전환된 세포일 수 있다.
본 발명에서 재조합 벡터를 세포내로 도입하는 방법은 공지된 트랜스펙션(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell 22, 479 (1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology 52, 456 (1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10, 87 (1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 재조합 벡터가 도입될 수 있는 세포는 면역 세포일 수 있고, 보다 바람직하게는 NK (natural killer) 세포, T 세포, 세포독성 (cytotoxic) T 세포, 조절 (regulatory) T 세포, B 세포, 또는 NK-T 세포이며, 보다 바람직하게는 NK 세포 또는 T 세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 인간 유래 면역 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 NK 세포일 수 있다.
본 발명에서 용어 “T 세포”는 흉선에서 성숙하는 림프구의 종류를 지칭한다. T 세포는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 B 림프구와 같은 다른 림프구와 구별된다. T 세포는 또한 분리되거나 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(CD4+ 세포), 세포독성(cytotoxic) T 세포(CD8+ cells), 자연살해 T 세포, 조절 T 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3을 발현하는 모든 종류의 면역세포를 포함한다. “세포독성 세포”는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, NK(natural-killer) 세포, 및 호중구를 포함한다.
본 발명에서 용어 “NK 세포”는 자연살해세포(natural killer cell)로도 알려져 있으며, 선천성 면역 체계(innate immune system)에서 중요한 역할을 하는, 골수에서 유래한 림프구의 종류를 지칭한다. 세포 표면에 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex) 또는 항체가 없어도, NK 세포는 바이러스 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스를 받은 세포(stressed cell)에 대한 빠른 면역 반응을 제공한다. 상업적 NK 세포주의 비제한적 예시는 NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)을 포함한다. 추가적인 예시는 NK 세포주 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, YT 및 NK101을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주의 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.
본 발명에서 형질전환된 세포를 선별하는 단계는 상술한 벡터의 선택표지에 의해 발현되는 표현형(phenotype)을 이용하여, 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선택표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환된 세포를 용이하게 선별할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 상술한 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어 “치료”는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.
본 발명에서 용어 "예방" 은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 암은 비제한적 예로서, 유방암, 폐암, 위암, 간암, 담낭암, 혈액암, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 골수암, 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 암일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 세포를 포함하는 현탁액 형태의 주사제로 제조될 수 있다. 주사에 적합한 제약 형태는 용액 또는 분산액의 즉시 준비가 가능한 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 모든 경우에 주사액 형태의 제약제는 멸균되어야 하며, 주사가 용이할 정도로 유동성이 있어야 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.
상기 용어 "약학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 담체로는 특정 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다.
약학적 조성물의 담체는, 예를 들어 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 오염을 막기 위해 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제가 포함될 수 있으며, 당 또는 염화나트륨 등의 등장제도 포함될 수 있다. 또한, 체내 투여시 흡수작용을 연장시키기 위해 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴를 포함시킬 수 있다. 멸균 주사 용액은, 필요에 따라 상기 언급된 여러 다른 성분들을 가진 적합한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조된다.
본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 정맥내 경로로 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 또한, 치료될 대상의 상태 또는 조건에 따라 투여량을 조절할 수 있다. 수성의 주사 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다.
본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 담체 및 제제, 매질에 대한 내용은 당업계에 공지되어 있다 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15판 참조).
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환 가능한 키메릭 사이토카인 수용체, 이를 발현하는 면역 세포 및 이 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 면역억제성 사이토카인이 존재하는 미세종양환경하에서 면역억제 신호를 면역활성화 신호로 변환함으로써 암에 대한 보다 강력한 세포독성효과를 발휘할 수 있다.
(ⅲ) 본 발명의 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 면역세포는 암 치료용 세포치료제로 사용할 수 있다.
도 1a 및 도 1b은 본 발명에서 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하도록 제작한 NK 세포들에서의 각 수용체 발현을 RT-PCR로 RNA 레벨에서 확인한 결과이고(도 1a), 유세포 분석으로 NK 세포의 세포막에서 발현되는 수용체를 확인한 결과이다(도 1b).
도 2는 미세종양환경과 같이 면역억제 신호가 존재하는 환경에서의 키메릭 사이토카인 수용체 발현 NK 세포의 면역활성을 확인하고자, 면역억제성 사이토카인인 IL-4를 처리한 후 NK 세포에서 생성하는 인터페론-감마(IFN-γ)의 양을 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)로 측정한 결과이다.
도 3a 및 도 3b은 각각 면역억제성 사이토카인인 IL-4에 의한 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 NK 세포에서 DNAM-1, NKp46와 같은 면역활성화 마커들의 발현 변화를 확인한 결과이다.
도 4a, 도 4b, 및 도 4c는 각각 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 NK 세포를 K562 암세포와 반응시켜 NK 세포에서 생성하는 그랜자임 B(Granzyme B)(도 4a), 인터페론-감마(IFN-γ)의 변화(도 4b) 및 암세포 살해능(도 4c) 확인함으로써 키메릭 사이토카인 수용체 발현 NK 세포의 세포독성을 확인한 결과이다.
본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.
실시예
실시예 1. 인버티드 사이토카인 수용체(Inverted Cytokine Receptor, ICR) 발현 NK 세포의 제조
본 발명에서의 키메릭 사이토카인 수용체 또는 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)들 구성에 사용할 수 있는 사이토카인 수용체들의 아미노산 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
미세종양환경에서 면역억제성 사이토카인인 IL-4와 결합하여 NK 세포내에 면역활성화 신호를 전달할 수 있는 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 NK 세포를 제조하기 위하여, 사이토카인 수용체를 구성하는 펩타이드들의 조합으로 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)를 고안하였고, 이 ICR을 코딩하는 ICR_1, ICR_2, 그리고 ICR_3, 3 종의 유전자를 합성하였다. 각 유전자의 구조는 다음과 같고 각 아미노산 서열은 하기 표 1에 나타내었다.
ICR_1은 IL-4 수용체의 신호 펩타이드(서열번호 1)와 세포외 도메인(서열번호 2), 그리고 IL-7 수용체의 막관통 도메인(서열번호 14)과 세포내 도메인(서열번호 15)으로 이루어졌다.
ICR_2는 본 실시예의 대조군으로서 IL-4 수용체의 세포내 도메인이 삭제된, IL-4 수용체의 신호 펩타이드(서열번호 1)와 세포외 도메인(서열번호 2), 막관통 도메인(서열번호 3)으로 이루어졌다.
ICR_3는 IL-4 수용체의 신호 펩타이드(서열번호 1)와 세포외 도메인(서열번호 2), 그리고 IL-21 수용체의 막관통 도메인(서열번호 22)과 세포내 도메인(서열번호 23)으로 구성되었다.
여러 사이토카인 수용체들의 조합으로 구성된 각 아미노산 서열은 사람에 최적화된 코돈(codon) 서열을 가지는 뉴클레오타이드 서열로 변환하여 합성하고 이를 벡터에 클로닝하여 각 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 유전자를 확보하였다.
면역억제성 사이토카인과 결합하여 면역세포 내부로 면역활성화 신호를 전달할 수 있는 키메릭 사이토카인 수용체 또는 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)를 발현하는 NK 세포를 제작하기 위하여 LONZA사의 Nucleofector Cell Line Nucleofector® Kit를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NK 세포에 각각의 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 유전자를 도입(transfection)하였다. 형질전환 후 세포는 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 100 U/ml의 재조합 인터루킨-2(IL-2)가 포함된 MEM alpha 배지에서 48시간 안정화시킨 후 푸로마이신(puromycin), 또는 게네티신(Geneticin, G418) 과 같은 항생제를 사용하여 형질 전환된 세포만을 선별(selection) 배양하여 세포주를 확립하였다.
Figure 112019098583164-pat00001
Figure 112019098583164-pat00002
Figure 112019098583164-pat00003
실시예 2. 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 도입 NK 세포의 키메릭 수용체 발현 확인
본 실험에서 제작한 ICR이 도입된 NK 세포들에서 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)의 발현을 확인하고자 다음과 같이 mRNA 발현과 유세포분석을 수행하였다.
NK 세포로부터 mRNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후 수용체의 발현을 확인하기위한 프라이머 세트인 정방향 프라이머(primer) 5'-GCCTCAGACAGTGGTTCAAAC-3' (서열번호 24)와 역방향 프라이머 5'-AGGCACAGTCGAGGCTGAT-3' (서열번호 25)를 사용하여 RT-PCR로 각 NK 세포에서의 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현을 확인하였다(도 1a). 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포들(ICR_1, ICR_2, ICR_3)에서 공통으로 가지고 있는, 사이토카인과 결합하는 부위인, IL-4 수용체의 세포외 도메인에 결합하는 항체를 이용하여 각각의 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현을 유세포분석(NovoCyte Flow Cytometer, ACEA Biosciences Inc.)으로 확인하였다(도 1b).
실시예 3. 면역억제성 사이토카인에 의한 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포의 특성 변화 확인
면역억제성 사이토카인이 다량 존재하는 종양미세환경과 유사한 환경 하에서 NK 세포와 ICR-NK 세포의 기능 및 활성을 비교하기 위하여, 인위적으로 면역억제성 사이토카인인 IL-4 을 처리하였을 때 NK 세포의 특성 및 활성 변화를 확인하였다.
먼저, 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현을 확인한 ICR_1, ICR_2, ICR_3, 3종의 NK 세포들의 면역억제성 사이토카인에 의한 면역 활성을 확인하기 위하여, 각 NK 세포에 5 ng/㎖ 의 IL-4 사이토카인을 24 시간 동안 처리한 후 인터페론-감마(IFN-γ)의 양을 측정하여 각 NK 세포의 면역 활성을 비교하였다. 그 결과, IL-21 수용체의 세포내 도메인을 가지고 있는 키메릭 수용체를 발현하는 ICR_3 NK 세포에서 다른 NK 세포들에 비해 인터페론-감마(IFN-γ) 생성량이 현저히 증가하였음을 확인하였다(도 2).
NK 세포의 수용체 중에는 표적 세포와 반응하여 NK 세포를 활성화하는 신호를 보내는 활성화 수용체(activating receptors)와 이와는 반대로 NK 세포의 활성을 억제하는 신호를 전달하는 억제 수용체(inhibitory receptors)가 존재하며 NK 세포에서 이 수용체들의 균형에 의해 NK 세포의 면역 활성이 조절된다. NK 세포 표면에 활성 수용체들의 발현이 증가하면 세포 내로 면역 활성화 신호를 강하게 전달해 줌으로써 NK 세포의 면역 활성을 강하게 유도할 수 있다.
인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포들에서 IL-4 사이토카인의 유무에 따른 NK 세포 활성화 수용체(activating receptors)들의 발현 변화를 비교하고자, NK 세포 표면의 NKp30, NKp44, NKp46와 DNAM-1 발현 정도를 FACS(NovoCyte 3000, ACEA Bioscience Inc.)를 사용하여 확인하였다. NK 세포 배양 배지에 IL-4 사이토카인을 처리하거나 처리하지 않은 채로 5％ CO2, 37℃의 배양기에서 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후 PBS로 2회 세척하여 각 항체를 넣고 빛을 차단한 상태로 30분 반응시킨 후 다시 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였다. NK 세포를 1％ BSA/PBS 에 부유시킨 후 FACS를 사용하여 분석하였다. 면역억제성 사이토카인 IL-4를 24 h 또는 48 h 처리해 주었을 때, ICR_3의 세포에서 다른 활성 수용체의 발현은 약하게 증가되거나 오히려 감소함을 나타내었으나, NKp46, DNAM-1의 발현이 주요하게 증가되었다(도 3a 및 도 3b). 반면, CD158a(KIR2DL1), CD158b(KIR2DL2/ DL3), CD159a(NKG2A)와 같은 억제 수용체들의 발현량은 변화가 없었다(data not shown).
실시예 4. 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포의 세포독성
본 실험에서는 인버티드 사이토카인 수용체(ICR)를 도입한 NK 세포의 세포독성을 확인하고자 대조군으로 C.V, ICR_2 NK 세포들과 비교하여 ICR_3 NK 세포의 세포독성을 측정하였다.
세포독성 분석 방법으로 K562 표적 세포(Target cell; T)에 1 x 106 세포(cells)당 최종 농도(final concentration) 0.5 μM이 되도록 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)을 넣어 5％ CO2, 37℃의 환경에서 30분 염색 후 PBS로 3회 세척한 후 96-웰 라운드 보텀 플레이트(96-well round bottom plate)에 4 X 104 개씩 분주하였다. IL-4 사이토카인을 처리하거나 처리하지 않은 채로 5％ CO2, 37℃의 배양기에서 48시간 동안 배양한 NK 세포(Effector cell; E)를 표적세포와 E:T ratio를 1:1 비율로 4 시간 반응시켜 NK 세포의 세포독성을 다음과 같이 측정하였다. 세포를 PBS로 3회 세척한 후 1％ BSA/PBS 100㎕에 부유하고 각 웰에 7-AAD 5 ㎕를 첨가하여 빛을 차단한 상태로 4℃에서 30분 반응하여, 다시 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였다. 이후 NK 세포를 1％ BSA/PBS에 부유시킨 후 유세포분석기(Flow cytometry)를 사용하여 NK 세포에 의한 세포독성을 비교 분석하였다.
IL-4를 처리하지 않은 세포와 처리한 세포의 세포독성을 비교하였을 때, IL-4를 48시간 처리한 ICR_3 NK 세포는 IL-4가 없을 때에 비해 K562 표적세포에 대한 세포독성이 약 2.5배 증가하였다(도 4a). 이 때 NK 세포에서 생성된 그랜자임 B(Granzyme B)와 인터페론-감마(IFN-γ)의 양을 ELISA로 측정하였다. 그 결과, IL-4를 48시간 처리한 ICR_3 NK 세포에서 그랜자임과 인터페론-감마 역시 특이적으로 높게 분비되었음을 확인하였다(도 4b 및 도 4c).
상기의 실험결과들에 의해, 본 발명에서 제작한 ICR_3 인버티드 사이토카인 수용체(ICR) 발현 NK 세포는, 면역억제 사이토카인이 풍부하게 존재하는 미세종양환경에서의 면역억제 사이토카인에 의한 면역억제 신호를 역이용하여 세포 내로 면역활성화 신호를 전달함으로써 기존의 NK 세포보다 훨씬 뛰어난 항암 효능을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> Chungbuk National University Industry University Cooperation Foundation CELLGENTEK CO.,LTD. <120> Chimeric Cytokine Receptor Capable of Converting Immunosuppressive Signal to Immunostimmulatory Signal, Immune Cell Expressing the Same, and Anti-Cancer Use Thereof <130> DPB192767 <160> 23 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Gly Trp Leu Cys Ser Gly Leu Leu Phe Pro Val Ser Cys Leu Val 1 5 10 15 Leu Leu Gln Val Ala Ser Ser Gly Asn 20 25 <210> 2 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Lys Val Leu Gln Glu Pro Thr Cys Val Ser Asp Tyr Met Ser Ile 1 5 10 15 Ser Thr Cys Glu Trp Lys Met Asn Gly Pro Thr Asn Cys Ser Thr Glu 20 25 30 Leu Arg Leu Leu Tyr Gln Leu Val Phe Leu Leu Ser Glu Ala His Thr 35 40 45 Cys Ile Pro Glu Asn Asn Gly Gly Ala Gly Cys Val Cys His Leu Leu 50 55 60 Met Asp Asp Val Val Ser Ala Asp Asn Tyr Thr Leu Asp Leu Trp Ala 65 70 75 80 Gly Gln Gln Leu Leu Trp Lys Gly Ser Phe Lys Pro Ser Glu His Val 85 90 95 Lys Pro Arg Ala Pro Gly Asn Leu Thr Val His Thr Asn Val Ser Asp 100 105 110 Thr Leu Leu Leu Thr Trp Ser Asn Pro Tyr Pro Pro Asp Asn Tyr Leu 115 120 125 Tyr Asn His Leu Thr Tyr Ala Val Asn Ile Trp Ser Glu Asn Asp Pro 130 135 140 Ala Asp Phe Arg Ile Tyr Asn Val Thr Tyr Leu Glu Pro Ser Leu Arg 145 150 155 160 Ile Ala Ala Ser Thr Leu Lys Ser Gly Ile Ser Tyr Arg Ala Arg Val 165 170 175 Arg Ala Trp Ala Gln Cys Tyr Asn Thr Thr Trp Ser Glu Trp Ser Pro 180 185 190 Ser Thr Lys Trp His Asn Ser Tyr Arg Glu Pro Phe Glu Gln His 195 200 205 <210> 3 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Leu Leu Leu Gly Val Ser Val Ser Cys Ile Val Ile Leu Ala Val Cys 1 5 10 15 Leu Leu Cys Tyr Val Ser Ile Thr 20 <210> 4 <211> 569 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Lys Ile Lys Lys Glu Trp Trp Asp Gln Ile Pro Asn Pro Ala Arg Ser 1 5 10 15 Arg Leu Val Ala Ile Ile Ile Gln Asp Ala Gln Gly Ser Gln Trp Glu 20 25 30 Lys Arg Ser Arg Gly Gln Glu Pro Ala Lys Cys Pro His Trp Lys Asn 35 40 45 Cys Leu Thr Lys Leu Leu Pro Cys Phe Leu Glu His Asn Met Lys Arg 50 55 60 Asp Glu Asp Pro His Lys Ala Ala Lys Glu Met Pro Phe Gln Gly Ser 65 70 75 80 Gly Lys Ser Ala Trp Cys Pro Val Glu Ile Ser Lys Thr Val Leu Trp 85 90 95 Pro Glu Ser Ile Ser Val Val Arg Cys Val Glu Leu Phe Glu Ala Pro 100 105 110 Val Glu Cys Glu Glu Glu Glu Glu Val Glu Glu Glu Lys Gly Ser Phe 115 120 125 Cys Ala Ser Pro Glu Ser Ser Arg Asp Asp Phe Gln Glu Gly Arg Glu 130 135 140 Gly Ile Val Ala Arg Leu Thr Glu Ser Leu Phe Leu Asp Leu Leu Gly 145 150 155 160 Glu Glu Asn Gly Gly Phe Cys Gln Gln Asp Met Gly Glu Ser Cys Leu 165 170 175 Leu Pro Pro Ser Gly Ser Thr Ser Ala His Met Pro Trp Asp Glu Phe 180 185 190 Pro Ser Ala Gly Pro Lys Glu Ala Pro Pro Trp Gly Lys Glu Gln Pro 195 200 205 Leu His Leu Glu Pro Ser Pro Pro Ala Ser Pro Thr Gln Ser Pro Asp 210 215 220 Asn Leu Thr Cys Thr Glu Thr Pro Leu Val Ile Ala Gly Asn Pro Ala 225 230 235 240 Tyr Arg Ser Phe Ser Asn Ser Leu Ser Gln Ser Pro Cys Pro Arg Glu 245 250 255 Leu Gly Pro Asp Pro Leu Leu Ala Arg His Leu Glu Glu Val Glu Pro 260 265 270 Glu Met Pro Cys Val Pro Gln Leu Ser Glu Pro Thr Thr Val Pro Gln 275 280 285 Pro Glu Pro Glu Thr Trp Glu Gln Ile Leu Arg Arg Asn Val Leu Gln 290 295 300 His Gly Ala Ala Ala Ala Pro Val Ser Ala Pro Thr Ser Gly Tyr Gln 305 310 315 320 Glu Phe Val His Ala Val Glu Gln Gly Gly Thr Gln Ala Ser Ala Val 325 330 335 Val Gly Leu Gly Pro Pro Gly Glu Ala Gly Tyr Lys Ala Phe Ser Ser 340 345 350 Leu Leu Ala Ser Ser Ala Val Ser Pro Glu Lys Cys Gly Phe Gly Ala 355 360 365 Ser Ser Gly Glu Glu Gly Tyr Lys Pro Phe Gln Asp Leu Ile Pro Gly 370 375 380 Cys Pro Gly Asp Pro Ala Pro Val Pro Val Pro Leu Phe Thr Phe Gly 385 390 395 400 Leu Asp Arg Glu Pro Pro Arg Ser Pro Gln Ser Ser His Leu Pro Ser 405 410 415 Ser Ser Pro Glu His Leu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Lys Val Glu Asp 420 425 430 Met Pro Lys Pro Pro Leu Pro Gln Glu Gln Ala Thr Asp Pro Leu Val 435 440 445 Asp Ser Leu Gly Ser Gly Ile Val Tyr Ser Ala Leu Thr Cys His Leu 450 455 460 Cys Gly His Leu Lys Gln Cys His Gly Gln Glu Asp Gly Gly Gln Thr 465 470 475 480 Pro Val Met Ala Ser Pro Cys Cys Gly Cys Cys Cys Gly Asp Arg Ser 485 490 495 Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Arg Ala Pro Asp Pro Ser Pro Gly Gly 500 505 510 Val Pro Leu Glu Ala Ser Leu Cys Pro Ala Ser Leu Ala Pro Ser Gly 515 520 525 Ile Ser Glu Lys Ser Lys Ser Ser Ser Ser Phe His Pro Ala Pro Gly 530 535 540 Asn Ala Gln Ser Ser Ser Gln Thr Pro Lys Ile Val Asn Phe Val Ser 545 550 555 560 Val Gly Pro Thr Tyr Met Arg Val Ser 565 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ala <210> 6 <211> 346 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Leu Ala Pro Arg Arg Cys Pro Ala Gln Glu Val Ala Arg Gly Val Leu 1 5 10 15 Thr Ser Leu Pro Gly Asp Ser Val Thr Leu Thr Cys Pro Gly Val Glu 20 25 30 Pro Glu Asp Asn Ala Thr Val His Trp Val Leu Arg Lys Pro Ala Ala 35 40 45 Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg Leu Leu Leu 50 55 60 Arg Ser Val Gln Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys Tyr Arg Ala 65 70 75 80 Gly Arg Pro Ala Gly Thr Val His Leu Leu Val Asp Val Pro Pro Glu 85 90 95 Glu Pro Gln Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser Asn Val Val 100 105 110 Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr Pro Ser Leu Thr Thr Lys Ala Val 115 120 125 Leu Leu Val Arg Lys Phe Gln Asn Ser Pro Ala Glu Asp Phe Gln Glu 130 135 140 Pro Cys Gln Tyr Ser Gln Glu Ser Gln Lys Phe Ser Cys Gln Leu Ala 145 150 155 160 Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser Phe Tyr Ile Val Ser Met Cys Val Ala 165 170 175 Ser Ser Val Gly Ser Lys Phe Ser Lys Thr Gln Thr Phe Gln Gly Cys 180 185 190 Gly Ile Leu Gln Pro Asp Pro Pro Ala Asn Ile Thr Val Thr Ala Val 195 200 205 Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gln Asp Pro His Ser 210 215 220 Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg Tyr Arg Ala 225 230 235 240 Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp Leu Gln His 245 250 255 His Cys Val Ile His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His Val Val Gln 260 265 270 Leu Arg Ala Gln Glu Glu Phe Gly Gln Gly Glu Trp Ser Glu Trp Ser 275 280 285 Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser Pro Pro Ala 290 295 300 Glu Asn Glu Val Ser Thr Pro Met Gln Ala Leu Thr Thr Asn Lys Asp 305 310 315 320 Asp Asp Asn Ile Leu Phe Arg Asp Ser Ala Asn Ala Thr Ser Leu Pro 325 330 335 Val Gln Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro 340 345 <210> 7 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Thr Phe Leu Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys 1 5 10 15 Ile Ala Ile Val Leu 20 <210> 8 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Met Leu Pro Cys Leu Val Val Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ser Leu Arg 1 5 10 15 Leu Gly Ser Asp Ala 20 <210> 9 <211> 218 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Gly Ser Asp Ala His Gly Thr Glu Leu Pro Ser Pro Pro Ser Val Trp 1 5 10 15 Phe Glu Ala Glu Phe Phe His His Ile Leu His Trp Thr Pro Ile Pro 20 25 30 Asn Gln Ser Glu Ser Thr Cys Tyr Glu Val Ala Leu Leu Arg Tyr Gly 35 40 45 Ile Glu Ser Trp Asn Ser Ile Ser Asn Cys Ser Gln Thr Leu Ser Tyr 50 55 60 Asp Leu Thr Ala Val Thr Leu Asp Leu Tyr His Ser Asn Gly Tyr Arg 65 70 75 80 Ala Arg Val Arg Ala Val Asp Gly Ser Arg His Ser Asn Trp Thr Val 85 90 95 Thr Asn Thr Arg Phe Ser Val Asp Glu Val Thr Leu Thr Val Gly Ser 100 105 110 Val Asn Leu Glu Ile His Asn Gly Phe Ile Leu Gly Lys Ile Gln Leu 115 120 125 Pro Arg Pro Lys Met Ala Pro Ala Asn Asp Thr Tyr Glu Ser Ile Phe 130 135 140 Ser His Phe Arg Glu Tyr Glu Ile Ala Ile Arg Lys Val Pro Gly Asn 145 150 155 160 Phe Thr Phe Thr His Lys Lys Val Lys His Glu Asn Phe Ser Leu Leu 165 170 175 Thr Ser Gly Glu Val Gly Glu Phe Cys Val Gln Val Lys Pro Ser Val 180 185 190 Ala Ser Arg Ser Asn Lys Gly Met Trp Ser Lys Glu Glu Cys Ile Ser 195 200 205 Leu Thr Arg Gln Tyr Phe Thr Val Thr Asn 210 215 <210> 10 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Val Ile Ile Phe Phe Ala Phe Val Leu Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ala 1 5 10 15 Tyr Cys Leu Ala Leu 20 <210> 11 <211> 22 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro Leu His Ile Val Leu 1 5 10 15 Trp Thr Arg Ile Ala Ser 20 <210> 12 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Thr Ile Pro Pro His Val Gln Lys Ser Val Asn Asn Asp Met Ile Val 1 5 10 15 Thr Asp Asn Asn Gly Ala Val Lys Phe Pro Gln Leu Cys Lys Phe Cys 20 25 30 Asp Val Arg Phe Ser Thr Cys Asp Asn Gln Lys Ser Cys Met Ser Asn 35 40 45 Cys Ser Ile Thr Ser Ile Cys Glu Lys Pro Gln Glu Val Cys Val Ala 50 55 60 Val Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn Ile Thr Leu Glu Thr Val Cys His 65 70 75 80 Asp Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe Ile Leu Glu Asp Ala Ala Ser 85 90 95 Pro Lys Cys Ile Met Lys Glu Lys Lys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe 100 105 110 Met Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn Ile Ile Phe Ser 115 120 125 Glu Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu Val Ile Phe Gln 130 135 140 <210> 13 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Val Thr Gly Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val 1 5 10 15 Ile Ile Ile Phe Tyr 20 <210> 14 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Pro Ile Leu Leu Thr Ile Ser Ile Leu Ser Phe Phe Ser Val Ala Leu 1 5 10 15 Leu Val Ile Leu Ala Cys Val Leu Trp 20 25 <210> 15 <211> 195 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro Asp His Lys 1 5 10 15 Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn Leu Asn Val 20 25 30 Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His Arg Val Asp 35 40 45 Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln Asp Thr Phe 50 55 60 Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly Gly Asp Val 65 70 75 80 Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr Pro Glu Ser 85 90 95 Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn Val Ser Ala 100 105 110 Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp Cys Arg Glu 115 120 125 Ser Gly Lys Asn Gly Pro His Val Tyr Gln Asp Leu Leu Leu Ser Leu 130 135 140 Gly Thr Thr Asn Ser Thr Leu Pro Pro Pro Phe Ser Leu Gln Ser Gly 145 150 155 160 Ile Leu Thr Leu Asn Pro Val Ala Gln Gly Gln Pro Ile Leu Thr Ser 165 170 175 Leu Gly Ser Asn Gln Glu Glu Ala Tyr Val Thr Met Ser Ser Phe Tyr 180 185 190 Gln Asn Gln 195 <210> 16 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Trp Met Ala Phe Val Ala Pro Ser Ile Cys Ile Ala Ile Ile Met Val 1 5 10 15 Gly Ile Phe Ser Thr 20 <210> 17 <211> 219 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 His Tyr Phe Gln Gln Lys Val Phe Val Leu Leu Ala Ala Leu Arg Pro 1 5 10 15 Gln Trp Cys Ser Arg Glu Ile Pro Asp Pro Ala Asn Ser Thr Cys Ala 20 25 30 Lys Lys Tyr Pro Ile Ala Glu Glu Lys Thr Gln Leu Pro Leu Asp Arg 35 40 45 Leu Leu Ile Asp Trp Pro Thr Pro Glu Asp Pro Glu Pro Leu Val Ile 50 55 60 Ser Glu Val Leu His Gln Val Thr Pro Val Phe Arg His Pro Pro Cys 65 70 75 80 Ser Asn Trp Pro Gln Arg Glu Lys Gly Ile Gln Gly His Gln Ala Ser 85 90 95 Glu Lys Asp Met Met His Ser Ala Ser Ser Pro Pro Pro Pro Arg Ala 100 105 110 Leu Gln Ala Glu Ser Arg Gln Leu Val Asp Leu Tyr Lys Val Leu Glu 115 120 125 Ser Arg Gly Ser Asp Pro Lys Pro Glu Asn Pro Ala Cys Pro Trp Thr 130 135 140 Val Leu Pro Ala Gly Asp Leu Pro Thr His Asp Gly Tyr Leu Pro Ser 145 150 155 160 Asn Ile Asp Asp Leu Pro Ser His Glu Ala Pro Leu Ala Asp Ser Leu 165 170 175 Glu Glu Leu Glu Pro Gln His Ile Ser Leu Ser Val Phe Pro Ser Ser 180 185 190 Ser Leu His Pro Leu Thr Phe Ser Cys Gly Asp Lys Leu Thr Leu Asp 195 200 205 Gln Leu Lys Met Arg Cys Asp Ser Leu Met Leu 210 215 <210> 18 <211> 25 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly 1 5 10 15 Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile 20 25 <210> 19 <211> 286 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn 1 5 10 15 Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly 20 25 30 Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe 35 40 45 Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu 50 55 60 Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro Glu 65 70 75 80 Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr Asn 85 90 95 Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu Ala 100 105 110 Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro Asp 115 120 125 Glu Gly Val Ala Gly Ala Pro Thr Gly Ser Ser Pro Gln Pro Leu Gln 130 135 140 Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp 145 150 155 160 Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro Pro 165 170 175 Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro Pro 180 185 190 Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly 195 200 205 Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro 210 215 220 Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro 225 230 235 240 Arg Glu Gly Val Ser Phe Pro Trp Ser Arg Pro Pro Gly Gln Gly Glu 245 250 255 Phe Arg Ala Leu Asn Ala Arg Leu Pro Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu 260 265 270 Ser Leu Gln Glu Leu Gln Gly Gln Asp Pro Thr His Leu Val 275 280 285 <210> 20 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Gly Val Val Leu Leu Tyr Ile Leu Leu Gly Thr Ile Gly Thr Leu Val 1 5 10 15 Ala Val Leu Ala Ala 20 <210> 21 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Ala Leu Leu Tyr Arg His Trp Ile Glu Ile Val Leu Leu Tyr Arg 1 5 10 15 Thr Tyr Gln Ser Lys Asp Gln Thr Leu Gly Asp Lys Lys Asp Phe Asp 20 25 30 Ala Phe Val Ser Tyr Ala Lys Trp Ser Ser Phe Pro Ser Glu Ala Thr 35 40 45 Ser Ser Leu Ser Glu Glu His Leu Ala Leu Ser Leu Phe Pro Asp Val 50 55 60 Leu Glu Asn Lys Tyr Gly Tyr Ser Leu Cys Leu Leu Glu Arg Asp Val 65 70 75 80 Ala Pro Gly Gly Val Tyr Ala Glu Asp Ile Val Ser Ile Ile Lys Arg 85 90 95 Ser Arg Arg Gly Ile Phe Ile Leu Ser Pro Asn Tyr Val Asn Gly Pro 100 105 110 Ser Ile Phe Glu Leu Gln Ala Ala Val Asn Leu Ala Leu Asp Asp Gln 115 120 125 Thr Leu Lys Leu Ile Leu Ile Lys Phe Cys Tyr Phe Gln Glu Pro Glu 130 135 140 Ser Leu Pro His Leu Val Lys Lys Ala Leu Arg Val Leu Pro Thr Val 145 150 155 160 Thr Trp Arg Gly Leu Lys Ser Val Pro Pro Asn Ser Arg Phe Trp Ala 165 170 175 Lys Met Arg Tyr His Met Pro Val Lys Asn Ser Gln Gly Phe Thr Trp 180 185 190 Asn Gln Leu Arg Ile Thr Ser Arg Ile Phe Gln Trp Lys Gly Leu Ser 195 200 205 Arg Thr Glu Thr Thr Gly Arg Ser Ser Gln Pro Lys Glu Trp 210 215 220 <210> 22 <211> 21 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Gly Trp Asn Pro His Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Val Ile Val Phe 1 5 10 15 Ile Pro Ala Phe Trp 20 <210> 23 <211> 285 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ser Leu Lys Thr His Pro Leu Trp Arg Leu Trp Lys Lys Ile Trp Ala 1 5 10 15 Val Pro Ser Pro Glu Arg Phe Phe Met Pro Leu Tyr Lys Gly Cys Ser 20 25 30 Gly Asp Phe Lys Lys Trp Val Gly Ala Pro Phe Thr Gly Ser Ser Leu 35 40 45 Glu Leu Gly Pro Trp Ser Pro Glu Val Pro Ser Thr Leu Glu Val Tyr 50 55 60 Ser Cys His Pro Pro Arg Ser Pro Ala Lys Arg Leu Gln Leu Thr Glu 65 70 75 80 Leu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Val Glu Ser Asp Gly Val Pro Lys Pro 85 90 95 Ser Phe Trp Pro Thr Ala Gln Asn Ser Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Glu 100 105 110 Glu Arg Asp Arg Pro Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asp Thr Val Thr Val 115 120 125 Leu Asp Ala Glu Gly Pro Cys Thr Trp Pro Cys Ser Cys Glu Asp Asp 130 135 140 Gly Tyr Pro Ala Leu Asp Leu Asp Ala Gly Leu Glu Pro Ser Pro Gly 145 150 155 160 Leu Glu Asp Pro Leu Leu Asp Ala Gly Thr Thr Val Leu Ser Cys Gly 165 170 175 Cys Val Ser Ala Gly Ser Pro Gly Leu Gly Gly Pro Leu Gly Ser Leu 180 185 190 Leu Asp Arg Leu Lys Pro Pro Leu Ala Asp Gly Glu Asp Trp Ala Gly 195 200 205 Gly Leu Pro Trp Gly Gly Arg Ser Pro Gly Gly Val Ser Glu Ser Glu 210 215 220 Ala Gly Ser Pro Leu Ala Gly Leu Asp Met Asp Thr Phe Asp Ser Gly 225 230 235 240 Phe Val Gly Ser Asp Cys Ser Ser Pro Val Glu Cys Asp Phe Thr Ser 245 250 255 Pro Gly Asp Glu Gly Pro Pro Arg Ser Tyr Leu Arg Gln Trp Val Val 260 265 270 Ile Pro Pro Pro Leu Ser Ser Pro Gly Pro Gln Ala Ser 275 280 285

Claims (16)

  1. (ⅰ) 사이토카인 결합 도메인으로서 IL-4 수용체의 세포외 영역;
    (ⅱ) 막 관통 도메인으로서 IL-21 수용체의 막 관통 영역; 및
    (ⅲ) 세포내 도메인으로서 IL-21 수용체의 세포내 영역;을 포함하는 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 자연살해(Natural Killer, NK) 세포.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-4 수용체의 세포외 영역은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 자연살해 세포.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-21 수용체의 막 관통 영역은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 자연살해 세포.
  6. 삭제
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 IL-21 수용체의 세포내 영역은 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 자연살해 세포.
  8. 삭제
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 사이토카인 결합 도메인으로서 IL-4 수용체의 세포외 영역은 IL-4 수용체의 신호 펩타이드를 더 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 자연살해 세포.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 IL-4 수용체의 신호 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 것인, 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 자연살해 세포.
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 제 1 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항 또는 제 10 항에 기재된 키메릭 사이토카인 수용체를 발현하는 형질전환된 자연살해 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 담낭암, 혈액암, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 급성 골수모구성 백혈병, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암, 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 난소암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 골수암, 및 다발성골수종으로 이루어진 군에서 선택된 암인, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
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Title
Frontiers in immunology, Vol. 10, Article 1691 (2019. 7.)*
Molecular Therapy, Vol. 22, No. 6, pp.1211-1220 (2014. 6.)*

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