JP2023524873A - 方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、細胞を対象に投与するステップを含む、固形がんを処置するための方法であって、細胞が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、方法を提供する。本発明は、固形腫瘍における抗原の不均一性の問題に対処するための手法を提供する。本発明はまた、固形腫瘍の不利な微小環境においてＣＡＲ－Ｔ細胞などの免疫療法細胞を助け、生存し、持続させるための手法を提供する。

Description

発明の分野
本発明は、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）を分泌するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現細胞、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞に関する。ＩＬ－１２コード配列は、ＩＬ－１２が非常に低レベルで分泌されるように、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流に位置する。

発明の背景
腫瘍の不均一性は、異なる腫瘍細胞が、細胞形態学、遺伝子発現、代謝、運動性、増殖、および転移能を含む別個の形態的および表現型プロファイルを示し得るという観察を説明する。

不均一性は、患者間、腫瘍間（腫瘍間不均一性）、および腫瘍内（腫瘍内不均一性）で生じる。遺伝的および非遺伝的変動の両方から生じる複数の種類の不均一性が、腫瘍細胞間で観察されている。

腫瘍細胞間の不均一性は、腫瘍微小環境における不均一性に起因してさらに増加し得る。腫瘍中の領域差異（例えば、酸素の利用能）は、腫瘍細胞に対する異なる選択圧を課し、腫瘍の異なる空間領域におけるドミナントサブクローンのより広いスペクトルをもたらす。クローンの優位性に対する微小環境の影響は、多くの患者において見られる原発性腫瘍と転移性腫瘍との間の不均一性、ならびに同じ腫瘍型を有する患者間で観察される腫瘍間の不均一性についての可能性がある理由でもある。

がん細胞の不均一性は、有効な処置戦略を設計する際にかなりの課題を導入する。

例えば、異種遺伝子型腫瘍は、異なるクローン集団の中で、細胞傷害性薬に対する異なる感受性を示すことがある。これは、治療有効性を阻害または変更し得るクローンの相互作用のせいである。

異種遺伝子型腫瘍における薬物投与は、すべての腫瘍細胞を死滅させることはほとんどない。最初の異種遺伝子型腫瘍集団が妨げとなる可能性があり、したがってほとんどの薬物抵抗性細胞が生存できなくなると予想される（生存したとしてもわずかである）。これは、抵抗性腫瘍集団が、分岐進化機構を通して新たな腫瘍を複製および成長するのを可能にする。生じた再増殖腫瘍は、不均一であり、使用された最初の薬物療法に対して抵抗性である。再増殖腫瘍はまた、より攻撃的な様式で再発し得る。

したがって、固形腫瘍における抗原の不均一性の問題に対処するための代替手法についての必要性が存在する。

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むいくつかの免疫療法剤が、がん処置における使用のために記載されている。

キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。それらの通常の形態は、抗原を認識するアミノ末端、スペーサー、Ｔ細胞の生存および活性化シグナルを伝達する複合エンドドメインにすべて接続された膜貫通ドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。

これらの分子の最も一般的な形態は、シグナル伝達エンドドメインにスペーサーおよび膜貫通ドメインを介して融合された、標的抗原を認識するモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。そのような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答してＴ細胞の活性化をもたらす。Ｔ細胞がそのようなＣＡＲを発現すると、それらは、標的抗原を発現する標的細胞を認識し、死滅させる。いくつかのＣＡＲが、腫瘍関連抗原に対して開発されており、そのようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入手法は、現在、さまざまながんの処置のための臨床試験中である。

これまでに、血液悪性腫瘍において、ＣＡＲ Ｔ細胞は大いに成功している。Ｂ細胞抗原のＣＤ１９に対して標的化されるＣＡＲは、慢性リンパ芽球性白血病（ＣＬＬ）を処置するために最初に成功裏に使用された。２０１７年８月に、ＦＤＡは、小児の再発性または難治性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を処置するためのＣＡＲＴ１９（Ｋｙｍｒｉａｈ）の使用を承認し、同年の１０月に、別のＣＤ１９標的化ＣＡＲ（Ｙｅｓｃａｒｔａ）が、成人の再発性または難治性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫のためにＦＤＡによって承認された。加えて、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）も２０１８年６月にこれらの薬物両方の使用を承認した。しかしながら、広範囲の研究にもかかわらず、固形腫瘍のためのＣＡＲ Ｔ細胞療法はほとんど成功していない。

不利な腫瘍微小環境の克服
固形がんの細胞に基づく免疫療法的処置の成功のために克服することが必要な重要なハードルの１つは、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）であり、これは、Ｔ細胞に不利なものとして広く特徴付けられている。このことは、ＣＡＲ－Ｔ細胞に対して当てはまるが、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）および操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞を使用するなどの他の免疫療法手法にも当てはまる。

腫瘍細胞の解糖代謝は、環境を、低酸素、酸性、低栄養、および酸化的ストレス傾向にする。炎症環境では、腫瘍細胞は、多くの場合、Ｔ細胞上の阻害性受容体に結合するプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）およびガレクチン－９などのリガンドを上方調節する。腫瘍微小環境は、間質細胞様のがん関連線維芽細胞（ＣＡＦ）、ならびに骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、肥満細胞、および調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む抑制性免疫細胞にも依拠する。これらの細胞および腫瘍細胞は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦβ）のような可溶性因子を分泌し、これは、異常な腫瘍血管系に寄与し、ＴＡＭおよび他の免疫細胞の抗炎症極性化を促進し、ＥＭＴに関わる。それらは、活性酸素種（ＲＯＳ）、ならびにラクテート、インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、可溶性Ｆａｓおよびアデノシンのような分子も産生し、これは、Ｔ細胞免疫応答の抑制に寄与する。

腫瘍環境をＴ細胞にとってより不利に極性化し、ＣＡＲ Ｔ細胞のリクルートおよび機能性を改善するサイトカインの投与は、前臨床および臨床試験の両方で試験されている。炎症性免疫細胞のリクルートを誘導するＩＬ－１２の局所送達は、マウスにおける養子移入された抗ＶＥＧＦＲ－２ ＣＡＲ Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増大することを示した。「武装」ＣＡＲと称されるＩＬ－１２などのサイトカインを構成的に分泌するＣＡＲ Ｔ細胞は、固形腫瘍におけるＴ細胞の浸潤および機能を増強するように作出された。しかしながら、これらの手法は、以下の限界がある：サイトカインの全身投与は毒性であり得る；サイトカインの構成的産生は、未制御の増殖および形質転換をもたらすことがある（Nagarkatti et al (1994) PNAS 91:7638-7642;Hassuneh et al (1997) Blood 89:610-620）。

したがって、固形腫瘍の不利な微小環境においてＣＡＲ－Ｔ細胞などの免疫療法細胞を助け、生存し、持続させるための代替手法についての必要性が存在する。

古典的なキメラ抗原受容体を示す概略図。（ａ）キメラ抗原受容体の基本スキーム；（ｂ）第１世代受容体；（ｃ）第２世代受容体；（ｄ）第３世代受容体。 フレームスリップモチーフおよび構築物設計。（Ａ）フレームスリップを促進する、一連の７つのウリジンが導入遺伝子配列に挿入されたフレームスリップモチーフを示す図。フレームスリッピングは、通常、１方向の代替的なリーディングフレームの継続的な転写／翻訳、および機能的タンパク質の生成をもたらす。（Ｂ）導入遺伝子、フレームスリップモチーフ（ＳＬＩＰ）、および２Ａ自己切断ペプチド配列の位置を示す構築物の構造。（Ｃ）ＲＱＲ８選別選択マーカー、それに続く制御配列（６×Ｕ）またはフレームスリップモチーフ（７×Ｕ）のいずれか、ならびにＣＤ１９の膜貫通および短縮型エンドドメインに融合されたＣＤ２２の外部ドメインからなるＣＤ２２－ＣＤ１９キメラタンパク質を含有する構築物で形質導入されたＳｕｐＴ１細胞のフローサイトメトリー分析。フレームスリップモチーフの導入は、ＣＤ２２－ＣＤ１９キメラの発現の劇的な低減をもたらした一方で、同様のレベルのＲＱＲ８選別選択マーカーが観察された。 翻訳リードスルーモチーフおよび構築物設計。（Ａ）公知の翻訳リードスルーモチーフの例。（Ｂ～Ｇ）翻訳リードスルーモチーフ構築物の構造。（Ｂ）翻訳リードスルーモチーフが第１の導入遺伝子の３’ならびに２Ａ自己切断ペプチド配列および導入遺伝子２の５’に配置された２つの導入遺伝子からなる翻訳リードスルー構築物。導入遺伝子１の発現は、導入遺伝子２よりも有意に高い。（Ｂ’）２つの終止コドンが発現レベルを単一の終止コドンで達成されるものよりもさらにいっそう低減するために翻訳リードスルーモチーフに組み込まれた二重終止翻訳リードスルー構築物。（Ｃ）２つの２Ａ自己切断ペプチド配列に隣接する翻訳リードスルーモチーフからなるユニバーサル翻訳リードスルー構築物。この構築物は、予測不可能なレベルの翻訳リードスルーをもたらし得る配列依存的効果を軽減する。（Ｄ）翻訳リードスルーモチーフが導入遺伝子２の発現のレベルをさらにいっそう低減するために減弱シグナルペプチド配列と組み合わされたコンビナトリアル手法。（ＥおよびＥ’）多数のモチーフが低減された導入遺伝子発現のカスケードを生じさせるために直列に配置された複合翻訳リードスルーモチーフ。（Ｅ）多数の導入遺伝子が、翻訳リードスルーモチーフおよび２Ａ自己切断ペプチド配列を使用して単一のカセットから発現される。（Ｅ’）自己切断ペプチド配列を使用して、導入遺伝子２の５’にある翻訳リードスルーモチーフを分離する。 ＩＬ－１２コード配列が「ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ」配列（ＳＳ）、すなわち、終止コドンと組み合わされたフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフの下流に配置されたベクターで形質導入された細胞におけるＩＬ－１２分泌の劇的な低減を示す概略図。 形質導入されていないまま（ＮＴ）かまたはＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する構築物（ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１２）；もしくはＩＬ－１２コード配列が「ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ」配列の下流に配置されたＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する構築物（ＣＡＲ－ＳＳ－ＩＬ１２）で形質導入されたかいずれかの細胞の上清中のＩＬ－１２の濃度を示すＥＬＩＳＡ。 形質導入されていないまま（ＮＴ）かまたはＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する構築物（ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１２）；もしくはＩＬ－１２コード配列が「ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ」配列の下流に配置されたＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する構築物（ＣＡＲ－ＳＳ－ＩＬ１２）で形質導入されたかいずれかの細胞の投与後のマウスの体重を示すグラフ。 形質導入されていないまま（ＮＴ）かまたはＧＤ２ ＣＡＲ単独を発現する構築物（ＣＡＲ）；ＧＤ２ ＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する構築物（ＣＡＲ－２Ａ）；ＩＬ－１２コード配列が「ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ」配列の下流に配置されたＧＤ２ ＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する構築物（ＣＡＲ－ＳＳ）；もしくはＩＬ－１２コード配列が「ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ」配列の下流に配置された標的抗原に無関係のＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する構築物（ＭＲ１－ＳＳ）で形質導入されたかいずれかの細胞の投与後のマウスにおける経時的な腫瘍サイズを示すグラフ。

発明の態様の要旨
本発明者らは、マウスモデルにおいて、高レベルのＩＬ－１２を発現する操作された細胞の投与が毒性であることを示した。本発明者らは、ＩＬ－１２コード配列の上流のモチーフの包含によって、ＩＬ－１２の発現のレベルを劇的に低減する可能性があることも示している。これらの超低ＩＬ－１２発現細胞は、マウスモデルにおいて、有意な毒性を引き起こさない。また、固形腫瘍モデルにおいて、超低ＩＬ－１２発現ＣＡＲ－Ｔ細胞は、ＣＡＲだけを発現する細胞よりも強力な抗腫瘍活性を示す。

そのため、第１の態様では、本発明は、細胞を対象に投与するステップを含む、固形がんを処置するための方法であって、細胞が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、方法を提供する。

方法は、以下のステップ：
（ｉ）対象から細胞試料を単離するステップ；
（ｉｉ）フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２をコードする核酸配列で、細胞試料由来の細胞をトランスフェクトまたは形質導入するステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの形質導入またはトランスフェクトされた細胞を対象に投与するステップ
を含み得る。

ＩＬ－１２をコードする核酸配列は、「ｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２」：リンカーによって接合されたＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットの間の融合物をコードし得る。ｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２は、配列番号１として示される配列を含み得る。

インターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）の下流にある場合、ＦＳＭは、ウラシル塩基、チミン塩基、またはグアニン塩基のリピートを含み得る。例えば、ＦＳＭは、配列ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号２）を含み得る。

ＦＳＭは、終止コドンも含み得る。例えば、ＦＳＭは、以下の配列：
ＵＵＵＵＵＵＵＧＡ（配列番号３）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＧ（配列番号４）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号５）
の１つを含み得る。

インターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列が、翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流にある場合、ＴＲＭは、配列ＳＴＯＰ－ＣＵＡＧまたはＳＴＯＰ－ＣＡＡＵＵＡ（ここで、「ＳＴＯＰ」は、終止コドンである）を含み得る。

翻訳リードスルーモチーフは、以下の配列：
ＵＧＡ－ＣＵＡＧ（配列番号６）
ＵＡＧ－ＣＵＡＧ（配列番号７）
ＵＡＡ－ＣＵＡＧ（配列番号８）
ＵＧＡ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号９）
ＵＡＧ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号１０）
ＵＡＡ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号１１）
の１つを含み得る。

細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、単球、マクロファージ、または腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）などの腫瘍浸潤性免疫細胞であり得る。

細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、以下の標的抗原：ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、上皮性増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ヒト上皮性増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、Ｌ１ＣＡＭ、ムチン１（ＭＵＣ１）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の１つに結合する、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現し得る。

本発明の一実施形態では、細胞は、ＧＤ２に結合するＣＡＲを発現し、
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＳＹＮＩＨ（配列番号１２）
ＣＤＲ２－ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号１３）
ＣＤＲ３－ＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹ（配列番号１４）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号１５）
ＣＤＲ２－ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１６）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＳＧＹＰＩＴ（配列番号１７）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗原結合ドメインを有する。

本発明の別の実施形態では、細胞は、ＰＳＭＡと結合するＣＡＲを発現し、
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＳＳＷＭＮ（配列番号１８）
ＣＤＲ２－ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１９）
ＣＤＲ３－ＧＴＧＹＬＷＹＦＤＶ（配列番号２０）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＤＩＮＥＮＬＡ（配列番号２１）
ＣＤＲ２－ＹＴＳＮＲＡＴ（配列番号２２）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＤＮＬＰＦＴ（配列番号２３）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗原結合ドメインを有する。

細胞は、
ドミナントネガティブＳＨＰ２および／もしくはドミナントネガティブＴＧＦβ受容体；
キメラサイトカイン受容体；ならびに／または
１つもしくは複数のさらなるサイトカインもしくはケモカイン
も発現し得る。

細胞は、以下：ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２の１つまたは複数を発現し得る。特に、細胞は、ＩＬ－７およびＣＣＬ１９、またはＩＬ－１５および／もしくはＣＸＣＬ１２を発現し得る。

そのまたはそれぞれのさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする核酸は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の上流に位置し得る。

あるいは、そのまたはそれぞれのさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする核酸は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流に位置し得る。

本発明の方法は、固形がん、例えば、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、黒色腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、卵巣がん、膵臓がん、神経芽細胞腫、または骨肉腫の処置のためであり得る。

ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲは、固形腫瘍における不均一な発現を有する標的抗原と結合し得る。

第２の態様では、本発明は、対象における抗腫瘍免疫応答のエピトープスプレッディングを誘導するための方法であって、本発明の第１の態様に定義される複数の細胞を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。

第３の態様では、本発明は、対象における腫瘤への免疫細胞の浸潤を誘導するための方法であって、本発明の第１の態様に定義される複数の細胞を、それらが抗腫瘍免疫応答を誘導するように、対象に投与するステップを含む、方法を提供する。

第４の態様では、固形がんの処置における使用のための細胞であって、細胞が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、細胞が提供される。

第５の態様では、固形がんを処置するための医薬の製造における細胞の使用であって、細胞が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、使用が提供される。

第６の態様では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、
フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列；および
１つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする１つまたは複数の異種核酸配列
を含む、細胞が提供される。

１つまたは複数の異種核酸配列は、以下：ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２の１つまたは複数をコードし得る。

例えば、１つまたは複数の異種核酸配列は、ＩＬ－７およびＣＣＬ１９をコードし得る。

あるいは、１つまたは複数の異種核酸配列は、ＩＬ－１５および／またはＣＸＣＬ１２をコードし得る。

さらなるサイトカインまたはケモカインをコードする核酸配列は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の上流または下流に位置し得る。さらなるサイトカインまたはケモカインをコードする２つまたはそれよりも多くの核酸配列が存在する場合、１つまたは複数がＦＳＭまたはＴＲＭの上流であり得、そのようにして、それは／それらは高レベルで発現され、かつ１つまたは複数がＦＳＭまたはＴＲＭの下流であり得、そのようにして、それは／それらは低レベルで発現される。

第７の態様では、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列；および
（ｉｉ）フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列；
（ｖｉ）上記に定義される１つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする１つまたは複数の核酸配列
を含む、核酸構築物が提供される。

第８の態様では、本発明の第７の態様による核酸構築物を含むベクターが提供される。

第９の態様では、上記に定義される１つまたは複数の核酸配列をそれぞれコードするベクターのキットが提供される。

第１０の態様では、本発明の第６の態様による細胞を作製するための方法であって、細胞を第７の態様による核酸構築物、第８の態様によるベクター、または第９の態様によるベクターのキットによりｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトまたは形質導入するステップを含む、方法が提供される。

本発明は、ＩＬ－１２を非常に低レベルで分泌するがん、特に、固形腫瘍の処置のための細胞を提供する。

以前に開発された「武装」ＣＡＲ－Ｔ細胞とは異なって、ＩＬ－１２の分泌のレベルは、ＩＬ－１２コード配列の上流のフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフの導入によって低減される。本発明者らは、低レベルのＩＬ－１２の局所発現が、抗腫瘍応答を大いに増強するが、問題があるレベルの毒性を引き起こさないことを示した。

ＩＬ－１２の局所分泌は、２つの効果を有する：第１に、これは、不利な腫瘍環境に対するＣＡＲ－Ｔ細胞の抵抗性を増加させ、ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖および持続を増加させる；第２に、これは、アジュバント効果を有し、抗腫瘍免疫応答の一般的な活性化を引き起こす。

この点において、ＩＬ－１２の放出は、１）Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を増強すること、２）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージの細胞溶解活性を増加させること、３）Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞を活性化すること、ならびに４）ＩＦＮ－γおよび他のサイトカインの産生を誘導することを含む免疫応答の間にさまざまな効果を有する。ＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化することに加えて、ＣＡＲ－Ｔ細胞による低レベルのＩＬ－１２の同時局所発現は、「エピトープスプレッディング」、すなわち、腫瘍細胞上に存在するさらなる標的抗原に対する免疫応答のプライミングをもたらすと考えられる。ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＬ－１２の分泌は、腫瘤への宿主免疫細胞の浸潤も誘導し得る。したがって、抗腫瘍免疫応答は、ＣＡＲ－Ｔ細胞による直接的な細胞死滅、腫瘍への免疫細胞の浸潤、および他の腫瘍関連抗原に対する既存の宿主免疫細胞からの抗がん免疫応答の誘導の組合せにより活性化される。

エピトープスプレッディングの誘導は、多くの場合に標的抗原の発現の不均一性を示す固形腫瘍の処置のために特に有用である。

さらなる態様
本発明は、以下の番号付け項目に要約される追加の態様も提供する。
１．細胞を対象に投与するステップを含む、小細胞肺がんを処置するための方法であって、細胞が、ＧＤ２ ＣＡＲ、ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄｎＳＨＰ２）およびドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩを発現する、方法。
２．細胞が、キメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）も発現する、項目１に記載の方法。
３．ＣＣＲが、ＩＬ－７Ｒエンドドメインを有する、項目２に記載の方法。
４．細胞が、以下の一般構造：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ、
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ、
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＳＧ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ３－ｄｎＴＧＦβＲ、
ｄｎＳＨＰ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＳＧ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ２－ｄｎＴＧＦβＲ
（ここで、
ｄｎＳＨＰは、ドミナントネガティブＳＨＰ－２をコードする核酸配列であり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」、「ｃｏｅｘｐｒ２」および「ｃｏｅｘｐｒ３」は、同じまたは異なっていてもよく、別々の実体としてそれぞれのポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列であり；
「ｄｎＴＧＦβＲ」は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列であり；
「ＣＡＲ」は、抗ＧＤ２キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＳＧ」は、自殺遺伝子、例えば、ＲＱＲ８をコードする核酸配列である）
を有する第１の核酸構築物を含む、項目１に記載の方法。
５．細胞が、以下の一般構造：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣＲ、または
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＳＧ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＣＲ
（ここで、
「ＣＡＲ」は、抗ＧＤ２キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」および「ｃｏｅｘｐｒ３」は、同じまたは異なっていてもよく、別々の実体としてそれぞれのポリペプチドの共発現を可能にする核酸配列であり；
「ＣＣＲ」は、キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列であり；
「ＳＧ」は、自殺遺伝子、例えば、ＲＱＲ８をコードする核酸配列である）
を有する第２の核酸構築物を含む、項目２または３に記載の方法。
６．以下のステップ：
（ｉ）対象から細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）項目４に定義される第１の核酸構築物を発現するベクターで、細胞を形質導入またはトランスフェクションするステップ；および
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップ
を含む、項目１に記載の方法。
７．以下のステップ：
（ｉ）対象から細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）項目４に定義される第１の核酸構築物を発現する第１のベクター、および項目５に定義される第２の核酸構築物を発現する第２のベクターで、細胞を形質導入またはトランスフェクションするステップ；ならびに
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップ
を含む、項目２または３に記載の方法。
８．小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）の処置における使用のための細胞であって、細胞が、ＧＤ２ ＣＡＲ、ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄｎＳＨＰ２）およびドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩを発現する、細胞。
９．小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）を処置するための医薬の製造における細胞の使用であって、細胞が、ＧＤ２ ＣＡＲ、ドミナントネガティブＳＨＰ２（ｄｎＳＨＰ２）およびドミナントネガティブＴＧＦβＲＩＩを発現する、使用。

以下の詳細な説明は、それが核酸およびポリペプチド配列、ポリペプチド構成要素、ベクター、細胞の方法などに関するように、特許請求の範囲における本発明の態様に関して上記の項目に提示された態様と同じように適用する。

詳細な説明
本発明は、非常に低レベルでインターロイキン１２（ＩＬ－１２）を発現する細胞を提供する。細胞は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のＩＬ－１２をコードする核酸を含む。

ＩＬ－１２および他のサイトカイン／ケモカイン
本発明は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む細胞を提供する。細胞はまた、ＩＬ－１２以外のサイトカインおよび／またはケモカインをコードする異種核酸配列を含んでいてもよい。

インターロイキン１２（ＩＬ－１２）は、抗原刺激に応答して、樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびヒトＢリンパ芽球様細胞によって天然に産生されるインターロイキンである。ＩＬ－１２は、Ｔｈ１細胞へのナイーブＴ細胞の分化に関与する。これは、Ｔ細胞の成長および機能を刺激し得るＴ細胞刺激因子として公知である。これは、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）および腫瘍壊死因子－アルファ（ＴＮＦ－α）の産生を刺激し、ＩＦＮ－γのＩＬ－４媒介性抑制を低減する。

ＩＬ－１２は、ナチュラルキラー細胞およびＴリンパ球の活性において重要な役割を果たす。ＩＬ－１２は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害活性の増強を媒介する。

ＩＬ－１２は、腫瘍微小環境をモジュレートして、がんに対して免疫反応を向け直すための特に目的の強力な免疫モジュレート性サイトカインである。ＩＬ－１２は、全身的に毒性であり、したがって、ＩＬ－１２を局所的に産生するための方法が、目的の方法である。

ＩＬ－１２は、２つの別々の遺伝子ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）によってコードされるヘテロ二量体サイトカインである。活性ヘテロ二量体（「ｐ７０」と称される）は、タンパク質合成後に形成される。

本発明の細胞は、ＩＬ－１２Ａおよび／またはＩＬ－１２Ｂをコードする異種核酸配列を含み得る。ヒトＩＬ－１２Ａの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４５９から入手可能である。シグナルペプチドを欠くこの配列の一部分を、配列番号２４として下記に示す。ヒトＩＬ－１２Ｂの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２９４６０から入手可能である。シグナルペプチドを欠くこの配列の一部分を、配列番号２５として下記に示す。

異種核酸配列は、リンカーによって接合されたヒトＩＬ－１２α（ｐ３５）およびＩＬ－１２β（ｐ４０）サブユニットの間の融合物である「ｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２」をコードし得る。好適なｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２配列を、配列番号１として下記に示す。

配列番号１では、マウスカッパ鎖Ｖ－ＩＩＩ領域ＭＯＰＣ６３（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１６６１）由来のシグナルペプチドであるシグナルペプチドは、太字で示され；セリン－グリシンリンカーは、太字で下線が付けられている。ｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２は、配列番号１に示されるが、異なるシグナルペプチドおよび／またはリンカー配列を有する、ＩＬ－１２ＡおよびＢ配列を含み得る。これは、一般構造：
ＳＰ－ＩＬ１２Ａ－Ｌ－ＩＬ１２Ｂ
（ここで、ＳＰは、シグナルペプチドであり；ＩＬ１２Ａは、ヒトＩＬ－１２Ａであり；Ｌは、リンカー配列、例えば、グリシン－セリンリンカーであり；ＩＬ１２Ｂは、ヒトＩＬ－１２Ｂである）
を有し得る。

異種核酸配列は、配列番号１、２４、もしくは２５、またはそのバリアントとして示される配列の１つをコードし得る。バリアント配列がｉｎ ｖｉｖｏで発現される場合にＩＬ－１２機能を保持するという条件で、バリアント配列は、配列番号１、２４、または２５と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有し得る。例えば、バリアント配列は、ｉｎ ｖｉｖｏで細胞傷害性Ｔ細胞の活性を増強する能力を保持していてもよく、および／またはバリアント配列は、Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）の産生を刺激してもよい。

細胞は、ＩＬ－１２に加えて、１つまたは複数のサイトカインをコードする１つまたは複数の異種核酸を含んでいてもよい。核酸配列は、例えば、炎症応答を増強するサイトカイン、および／またはＣＡＲ－Ｔ細胞療法の有効性を増加させるサイトカインをコードし得る。サイトカインは、以下：ＩＬ－７、ＩＬ１５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、ＧＭ－ＣＳＦ、およびＩＬ－２１から選択され得る。特に、さらなるサイトカインは、ＩＬ－７であり得る。

ＩＬ－７
ＩＬ－７は、Ｂ細胞およびＴ細胞の発生のために重要なサイトカインである。ＩＬ－７は、多能性（複能性）造血幹細胞のリンパ系前駆細胞への分化を刺激し、リンパ系列のすべての細胞（Ｂ細胞、Ｔ細胞、およびＮＫ細胞）の増殖を刺激する。

Ｉｌ－７および肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）は、プレ－プロＢ細胞成長刺激因子として機能するヘテロ二量体を形成する。このサイトカインは、初期Ｔ細胞発生の間のＴ細胞受容体ベータ（ＴＣＲβ）のＶ（Ｄ）Ｊ再構成の補因子であることが見出されている。ヒトＩＬ－７のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（受託番号Ｐ１３２３２）から入手可能であり、配列番号２６として下記に示す。

ＩＬ－１５
インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）と構造的類似性を有するサイトカインである。ＩＬ－２のように、ＩＬ－１５は、ＩＬ－２／ＩＬ－１５受容体ベータ鎖および共通ガンマ鎖で構成される複合体に結合し、それを通してシグナル伝達する。ＩＬ－１５は、ウイルスによる感染後に単核食細胞および他の細胞によって分泌され、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化および増殖を調節する。

ヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（受託番号Ｐ４０９３３）から入手可能であり、配列番号２７として下記に示す。

ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、およびＩＬ－２１のアミノ酸配列は、下記の表に示されるように、ＵｎｉＰｒｏｔから利用可能である。

１つまたは複数の異種核酸配列が、１つまたは複数のケモカインをコードし得る。

ケモカインは、細胞によって分泌される小型サイトカインのファミリーである。それらの名称は、すぐ近くの応答性細胞において方向づけされた走化性を誘導するそれらの能力に由来し、それらは、走化性サイトカインである。感染細胞または損傷細胞によって放出されたケモカインは、濃度勾配を形成する。誘引された細胞は、ケモカインのより高い濃度の方に勾配により移動する。

ケモカインは、すべて、およそ８～１０キロダルトンの質量であり、それらの３次元形状を形成するのに重要である保存された場所に４つのシステイン残基を有する。一部のケモカインは、炎症促進性であると考えられており、免疫応答の間に誘導されて、免疫系の細胞を感染部位にリクルートし得る。例としては、ＣＸＣＬ－８、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１１、ＣＸＣＬ１０である。他のケモカインは、恒常性であると考えられており、組織の維持または発生の正常なプロセスの間に細胞の遊走の制御に関与する。これらとしては、ＣＣＬ１４、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、ＣＣＬ２５、ＣＣＬ２７、ＣＸＣＬ１２、およびＣＸＣＬ１３が挙げられる。この分類は、厳密ではなく、例えば、ＣＣＬ２０は、炎症促進性ケモカインとしても作用し得る。

ケモカインは、４つの主要なサブファミリー：ＣＸＣ、ＣＣ、ＣＸ３Ｃ、およびＸＣに分類されている。これらのタンパク質はすべて、それらの標的細胞の表面上で選択的に見られるケモカイン受容体と呼ばれるＧタンパク質結合膜貫通受容体との相互作用によってそれらの生物学的作用を発揮する。

細胞は、恒常性サイトカイン、例えば、ＣＣＬ１９またはＣＸＣＬ１２を発現し得る。

ケモカイン（Ｃ－Ｃモチーフ）リガンド１９（ＣＣＬ１９）は、ＥＢＩ１リガンドケモカイン（ＥＬＣ）およびマクロファージ炎症タンパク質－３－ベータ（ＭＩＰ－３－ベータ）としても公知のＣＣケモカインファミリーに属する小型サイトカインである。ＣＣＬ１９は、ケモカイン受容体ＣＣＲ７への結合によってその標的細胞に対するその効果を誘発する。それは、樹状細胞および抗原がエンゲージされたＢ細胞およびＣＣＲ７＋セントラルメモリーＴ細胞を含むある特定の免疫系の細胞を誘引する。ヒトＣＣＬ１９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（受託番号Ｑ９９７３１）から入手可能であり、配列番号２８として下記に示す。

Ｃ－Ｘ－Ｃモチーフケモカイン１２（ＣＸＣＬ１２）、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）は、同じ遺伝子の選択的スプライシングによって、ＣＸＣＬ１２ａおよびＣＸＣＬ１２ｂの２つの形態で産生される。ケモカインは、２つのジスルフィド結合を形成する４つの保存されたシステインの存在によって特徴付けられる。ＣＸＣＬ１２タンパク質は、ＣＸＣケモカインのグループに属し、そのシステインの最初の対は、１つの介在アミノ酸によって分離される。加えて、ＣＸＣＬ１２のＮ末端の最初の８残基は、受容体結合部位としての機能を果たし、ループ領域中のＲＦＦＥＳＨモチーフ（残基１２～１７、配列番号１０２）は、ＣＸＣＬ１２受容体結合のためのドッキング部位として機能する。

ＣＸＣＬ１２は、脳、胸腺、心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、および骨髄を含むマウスの多くの組織において発現する。ＣＸＣＬ１２は、リンパ球に対して強い走化性である。ヒトＣＸＣＬ１２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（受託番号Ｐ４８０６１）から入手可能であり、配列番号２９として下記に示す。

ＳＴＯＰ ＳＫＩＰモチーフ
フレームスリップ
転写の間に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型に対する相補性に基づいて、成長中のＲＮＡ鎖へのヌクレオチドの組み込みを触媒する。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼが一続きのリピート塩基に遭遇すると、スリッページまたは「スタッタリング」が起こり得る。転写スリッページは、天然では、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｐｙｒＢＩおよびｃｏｄＢＡオペロンの調節、パラミクソウイルスにおけるＰ遺伝子の発現、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓの細胞ｄｎａＸ遺伝子の解読において利用される。

ＲＮＡポリメラーゼがスリップすると、リピート塩基の１つ（またはおそらく２つ）が欠如するので、これは、代替的なリーディングフレームをコードするｍＲＮＡの合成をもたらし得る。

本発明の核酸構築物は、代替的なリーディングフレームをコードするｍＲＮＡをもたらすＲＮＡポリメラーゼのスリッページが存在する場合にのみ下流導入遺伝子の転写が起こるように、転写フレームスリップ部位を含み得る。

タンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳は、リボソーム、開始および伸長因子、アミノアシルトランスファーＲＮＡ（ａａ－ｔＲＮＡ）、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ、ならびに終結因子のオーケストレーションを含む複雑なプロセスである。翻訳の開始は、因子の複合体がｍＲＮＡの５’末端に結合した時に開始し、これは、次いで、４０ＳリボソームのリクルートおよびｍＲＮＡのスキャニングをもたらす。開始因子および４０Ｓリボソームの複合体が、アミノ酸のメチオニン（ＡＵＧコドン）をコードするコドン（ヌクレオチドのトリプレット）に遭遇すると、６０Ｓリボソームが、リクルートされ、ポリペプチド合成が、適切なアミノ酸がロードされた同族ｔＲＮＡの対形成により開始する。翻訳の開始は、ＡＵＧ以外の代替的な開始コドンで起こり得るが、これは、最も頻繁に使用される開始コドンである。ポリペプチドの伸長は、周期的な方法で起こり、それによって、ｔＲＮＡはその同族コドンに結合し、新たに付加されたアミノ酸および伸長中のポリペプチドの間にペプチド結合が形成し、ポリペプチドが転位して次のコドンが露出する。

翻訳の間に、リボソーム中断は、リボソームが特定のコドンで止まる場所で起こり得る。リボソーム中断は、核酸分解経路によるｍＲＮＡの分解を促進し得るか、またはそれは、－１もしくは－２方向のスリップを誘導し得る。ＵＵＵＵＵＵＡなどのｍＲＮＡ内の反復配列は、翻訳フレームスリッピングを誘導することが公知であり、この配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の群特異的抗原遺伝子（ｇａｇ）およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子の３’末端に存在する。ＨＩＶ ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の翻訳フレームスリッピング－１は、Ｇａｇ－Ｐｏｌポリタンパク質の発現をもたらす。

本発明の核酸構築物は、リボソームによるフレームスリップが存在する場合にのみ下流転写産物の翻訳が起こるように、翻訳フレームスリッピング部位を含み得る。

フレームスリップ部位は、同じ種類の一続きの塩基を含み得る。

フレームスリップモチーフは、核酸構築物中の切断部位の上流および／または下流に配置され得る。フレームスリップモチーフは、核酸構築物中の第１および第２の導入遺伝子の間に位置する。

フレームスリップモチーフは、単独で使用されてもよい。この実施形態では、第２の導入遺伝子は、フレームスリップが第２の導入遺伝子の転写または翻訳のために必要であるように、フレームスリッピング部位の下流のフレームの外に配置され得る。

モチーフは、例えば、一続きの５、７、８、１０、または１１個の塩基を含んでいてもよい。部位は、例えば、ウラシル、アデノシン、またはグアニン塩基のリピートを含んでいてもよい。部位は、例えば、配列番号２として示される配列
ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号２）
を含み得る。

あるいは、フレームスリップ部位は、終止コドンと組み合わせて使用されてもよい。この実施形態では、終止コドンは、フレームスリッピングが、終止コドンが無視されるために必要であるように、フレームスリップ部位の下流のフレーム中に位置する。

終止コドンは、ＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡであり得る。フレームスリップ部位は、３の倍数のウラシル、アデノシン、またはグアニン塩基のリピート、例えば、ウラシル、アデノシン、またはグアニン塩基の３、６または９個のリピートを含み得る。

フレームスリップ部位／終止コドン組合せの例を、配列番号３、４、および５として示す。
ＵＵＵＵＵＵＵＧＡ（配列番号３）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＧ（配列番号４）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号５）

翻訳リードスルー
翻訳は、リボソームがＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡ終止コドンに遭遇すると、完了する。この時点で、終結因子は終止コドンを認識し、リボソームの解離およびリサイクルを容易にする。終結因子および近い同族ｔＲＮＡの間の競合、ならびにポリペプチドの継続的な伸長は、その時の０．１％の割合でしか起こらないことに起因して、翻訳の完了は、通常、終止コドンの再コーディングにより高い忠実度で起こる。しかしながら、翻訳リードスルーをもたらす終止コドンの再コーディングのレベルの上昇が、ある特定の遺伝子で報告されている。一部の場合では、これは、機能的リードスルーと称されるプロセスにおいて、さらなる機能的モチーフを有するより長いポリペプチドの生成をもたらした。

終結因子１（ＲＦ１）が終止コドンを認識することに失敗し、近い同族ａａ－ｔＲＮＡがアミノ酸を伸長中のポリペプチドに挿入し、それによって、終止コドンを抑制すると、翻訳リードスルーが起こる。終結因子およびａａ－ｔＲＮＡの局所濃度は、終止コドン抑制および翻訳リードスルーのレベルに影響を及ぼし、低濃度の終結因子は、翻訳リードスルーを促進する。哺乳動物では、ＵＡＧ終止コドンの抑制は、トリプトファン、アルギニン、またはシステイン残基の挿入をもたらす。

終止コドン抑制の最も早く発見された例の１つは、ウサギベータグロビン遺伝子であり、翻訳リードスルーがタンパク質３のＣ末端への２２個のアミノ酸の付加をもたらす。

翻訳リードスルーの頻度は、１）使用される終止コドン（ＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡ）；２）終止コドンにすぐ隣接する配列であって、終止コドンの上流および下流の６ヌクレオチドが特に重要である、および；３）ｍＲＮＡの３’末端におけるシス作用性配列の存在を含む、いくつかの因子に依存する。

３つの終止コドンの完了効率は変わり、ＵＡＡは最も強い終止コドンであり、ＵＧＡは最も弱く、完了効率の序列は、ＵＡＡ＞ＵＡＧ＞ＵＧＡとして定義される。その結果、最高レベルの翻訳リードスルーは、ＵＧＡ終止コドンで、最低は、ＵＡＡ終止コドンで示される。

翻訳リードスルーを示す遺伝子の配列分析は、終止コドン抑制および持続的な翻訳を促進する少なくとも２つの異なるモチーフ：ＳＴＯＰ－ＣＵＡＧおよびＳＴＯＰ－ＣＡＡＵＵＡ（ここで、ｓｔｏｐは、ＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡであり得る）を特定した。翻訳リードスルーのレベルは、使用される終止コドンに依存する：ＵＧＡは最高レベルの翻訳リードスルーをサポートし、漸減レベルのリードスルーがＵＡＧおよびＵＡＡ終止コドンから得られ、その結果、リードスルーの全体的な序列は、ＵＧＡ＞ＵＡＧ＞ＵＡＡである。

本発明の核酸構築物は、配列番号６～１１として示される配列の１つを含み得る。
ＵＧＡＣＵＡＧ（配列番号６）
ＵＡＧＣＵＡＧ（配列番号７）
ＵＡＡＣＵＡＧ（配列番号８）
ＵＧＡＣＡＡＵＵＡ（配列番号９）
ＵＡＧＣＡＡＵＵＡ（配列番号１０）
ＵＡＡＣＡＡＵＵＡ（配列番号１１）

翻訳リードスルー部位は、核酸構築物中の第１および第２の導入遺伝子の間に位置し得る。翻訳リードスルー部位は、核酸構築物中の切断部位の上流および／または下流に配置され得る。翻訳リードスルー部位は、切断部位に隣接し得る（図３Ｃ）。２つまたはそれよりも多くの翻訳リードスルー部位が使用されてもよく、例えば、互いの隣に（図３Ｂ’）または切断部位に隣接して（図Ｅ’）位置し得る。

下流導入遺伝子の発現レベルをさらに低減するために、多数の終止コドンが、翻訳リードスルーモチーフの５’に挿入され得る（図２Ｂ）。多重終止翻訳リードスルーモチーフの例は、２つのＵＧＡ終止コドンがＣＵＡＧリードスルーモチーフの５’に位置する配列番号３０として示される。
ＵＧＡＵＧＡＣＵＡＧ（配列番号３０）

上記の配列は、ＲＮＡとして存在するが、構築物中で、それらは、転写されたらこれらのＲＮＡ配列を生じる同等のＤＮＡ配列であってもよく、上記の配列番号６～１１について、
ＴＧＡＣＴＡＧ（配列番号３１）
ＴＡＧＣＴＡＧ（配列番号３２）
ＴＡＡＣＴＡＧ（配列番号３３）
ＴＧＡＣＡＡＴＴＡ（配列番号３４）
ＴＡＧＣＡＡＴＴＡ（配列番号３５）
ＴＡＡＣＡＡＴＴＡ（配列番号３６）
であろう。

特に、ＴＲＭをコードするＤＮＡ配列は、配列番号３７に示される配列を有していてもよく、これは、ＳＴＯＰ；ロイシン；アラニンをコードする。
ＴＧＡＣＴＡＧＣＡ（配列番号３７）

核酸構築物が２つより多くの導入遺伝子を含む場合、複合翻訳リードスルーモチーフは、切断部位をコードする配列の５’に直列に配置され得る。これは、多数の導入遺伝子が、異なる比で発現されるのを可能にする。それぞれのさらなるリードスルーモチーフにより、発現のレベルは、上流導入遺伝子と比べて１０分の１～５０分の１に低減するはずである。

ＩＬ－１２をコードする核酸配列は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のＩＬ－１２に位置し得る。核酸構築物は、一般構造：
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ－ＩＬ１２
（ここで、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＦＳＭ／ＴＲＭ」は、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；
「ｃｏｅｘｐｒ」は、別々のポリペプチドとしてＣＡＲおよびＩＬ－１２の共発現を可能にする配列であり；
「ＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２またはｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする核酸配列である）
を有し得る。

別のサイトカインまたはケモカインをコードする核酸配列を含む構築物では、これはまた、他のサイトカインまたはケモカインの発現のレベルも低減されるように（ＦＳＭまたはＴＲＭ配列の非存在下で得られるであろう発現のレベルと比較して）、ＦＳＭまたはＴＲＭの下流に配置され得る。この点において、他のサイトカインまたはケモカインの発現のレベルは、ＩＬ－１２の発現のレベルと同等に低減され得る。そのような構築物は、一般構造：
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＩＬ１２－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＣ；または
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２
（ここで、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＦＳＭ／ＴＲＭ」は、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同じまたは異なっていてもよく、別々のポリペプチドとして、ＣＡＲ、ＩＬ－１２、およびサイトカインまたはケモカインの共発現を可能にする配列であり；
「ＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２またはｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする核酸配列であり；
「ＣＣ」は、サイトカイン（ＩＬ－１２以外）またはケモカインをコードする核酸配列である）
を有し得る。

あるいは、他のサイトカインをコードするか、またはケモカインをコードする核酸配列は、その発現がＦＳＭまたはＴＲＭによって影響されないように、ＦＳＭもしくはＴＲＭの上流に、または別々の構築物上に配置されてもよい。そのような構成により、他のサイトカインまたはケモカインの発現のレベルは、ＩＬ－１２の発現のレベルを超える。そのような構築物は、一般構造：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２；または
ＣＣ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２
（ここで、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＦＳＭ／ＴＲＭ」は、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同じまたは異なっていてもよく、別々のポリペプチドとして、ＣＡＲ、ＩＬ－１２、およびサイトカインまたはケモカインの共発現を可能にする配列であり；
「ＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２またはｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする核酸配列であり；
「ＣＣ」は、サイトカイン（ＩＬ－１２以外）またはケモカインをコードする核酸配列である）
を有し得る。

第３の選択肢は、ＩＬ－１２コード配列の上流のものと異なるＦＳＭまたはＴＲＭの下流に配置され得る他のサイトカインまたはケモカインをコードする核酸配列である。これは、「複合」効果を有し得る。例えば、複合翻訳リードスルーモチーフを有する核酸構築物は、構造：
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣ－ＦＳＭ／ＴＲＭ２－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２
（ここで、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＦＳＭ／ＴＲＭ１」および「ＦＳＭ／ＴＲＭ２」は、同じまたは異なっていてもよく、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同じまたは異なっていてもよく、別々のポリペプチドとして、ＣＡＲ、ＩＬ－１２、およびサイトカインまたはケモカインの共発現を可能にする配列であり；
「ＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２またはｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする核酸配列であり；
「ＣＣ」は、サイトカイン（ＩＬ－１２以外）またはケモカインをコードする核酸配列である）
を有し得る。

この構成では、ＣＡＲの発現のレベルは、サイトカイン／ケモカインの発現のレベルよりも高く、これは、ＩＬ－１２の発現のレベルよりも高い。

変更シグナルペプチド
翻訳リードスルーモチーフは、導入遺伝子発現を有意に減少させるが、ある特定の状況では、発現レベルをさらにいっそう低減する必要がある可能性がある。分泌タンパク質について、発現のさらなる低減は、翻訳リードスルーモチーフを変更シグナルペプチド配列と組み合わせることによって達成することができる。この場合では、変更シグナルペプチドおよび第２の導入遺伝子は、翻訳リードスルーモチーフおよび自己切断ペプチド配列の３’に配置される（図３Ｄ）。

シグナルペプチドは、分泌経路の方に向かう新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する一般に５～３０アミノ酸長の短いペプチドである。これらのタンパク質としては、ある特定の細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジ、またはエンドソーム）のいずれかの内に存在し、細胞から分泌されるもの、および膜貫通タンパク質が挙げられる。

シグナルペプチドは、一般に、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する長い一続きの疎水性アミノ酸であるコア配列を含有する。シグナルペプチドは、短い正に荷電した一続きのアミノ酸で開始してもよく、これは、転位の間のポリペプチドの適したトポロジーの強化に役立つ。シグナルペプチドの末端には、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断される一続きのアミノ酸が存在する。シグナルペプチダーゼは、転位の間またはその完了後のいずれかで切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。

シグナルペプチドは、一般に、分子のアミノ末端に位置するが、いくつかのカルボキシ末端シグナルペプチドが公知である。

変更シグナルペプチドは、ＷＯ２０１６／１７４４０９号に詳細に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。変更シグナルペプチドは、それが由来する野生型シグナルペプチドよりも少ない疎水性アミノ酸を有するように、１つまたは複数の突然変異、例えば、置換または欠失を含み得る。「野生型」という用語は、それが由来する天然タンパク質に存在するシグナルペプチドの配列を意味する。

核酸構築物が、両方とも膜貫通タンパク質をコードする２つの導入遺伝子を含む場合、下流導入遺伝子によってコードされるタンパク質（より低い相対発現を有する）は、上流導入遺伝子によってコードされるタンパク質（より高い相対発現を有する）よりも少ない疎水性アミノ酸を含み得る。

シグナルペプチド効率を変更するために突然変異される疎水性アミノ酸は、アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；またはトリプトファン（Ｗ）であり得る。

変更シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸の１、２、３、４または５個のアミノ酸の欠失または置換を含み得る。疎水性アミノ酸は、非疎水性アミノ酸、例えば、親水性または中性のアミノ酸で置き換えられてもよい。

切断部位
本発明は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列；および
（ｉｉ）ＦＳＭ／ＴＲＭの下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。

核酸構築物はまた、以下：
（ｉｉｉ）ドミナントネガティブＳＨＰ２をコードする核酸配列；
（ｉｖ）ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列；
（ｖ）キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列；
（ｖｉ）１つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする１つまたは複数の核酸配列
の１つまたは複数を含んでいてもよい。

ＣＡＲおよびＩＬ－１２、ならびに必要に応じて１つまたは複数のさらなる構成要素が別々のポリペプチドとして発現されるために、構築物は、２つのポリペプチドをコードする核酸配列間に位置する切断部位をコードする配列を含み得る。

切断部位は、核酸構築物の翻訳によって産生するポリペプチドが分割または分離されるようになるのを可能にする任意の配列であり得る。

「切断」という用語は、本明細書では便宜上使用されるが、切断部位は、古典的切断以外の機構によって、２つのポリペプチドを個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（下記を参照されたい）について、「切断」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解、または翻訳効果を説明するさまざまなモデルが提案されている（Donnelly et al (2001) J. Gen. Virol. 82:1027-1041）。切断部位が、第１および第２のポリペプチドをコードする核酸配列の間に位置する場合に、第１および第２のポリペプチドを別個の実体として発現させる限り、そのような「切断」の正確な機構は、本発明の目的のために重要ではない。

切断部位は、フューリン切断部位であってもよい。

フューリンは、サブチリシン様プロタンパク質変換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在的な前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な産物にプロセシングするプロタンパク質変換酵素である。フューリンは、それらの対形成した塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断し得るカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリン基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロ－ベータ－セクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニット、およびフォンヴィルブランド因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ－Ｘ－（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）－Ａｒｇ’（配列番号３８））のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ装置中で豊富である。

切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であってもよい。

ＴＥＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。それは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で融合タンパク質の制御された切断のために頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（配列番号３９）（ここで、「＼」は切断されるペプチド結合を表す）である。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。そのため、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼも、哺乳動物細胞において発現されなければならない。

切断部位は、自己切断ペプチドをコードしてもよい。

「自己切断ペプチド」は、第１および第２のポリペプチドを含むポリペプチドならびに自己切断ペプチドが産生されると、任意の外部切断活性を必要とせずに、それが別個の別々の第１および第２のポリペプチドにすぐに「切断」または分離されるように機能するペプチドを指す。

自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであってもよい。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの主な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自身のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスでは、２Ａ領域は、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存的プロリン残基）と一緒に、それ自身のＣ末端で「切断」を媒介することができる自律的エレメントに相当する、約１８個のアミノ酸の短いセクションである。

より長いカルジオウイルスタンパク質のＣ末端の１９個のアミノ酸は、２ＢのＮ末端プロリンと一緒に、アフトウイルスＦＭＤＶ ２ａ配列とおよそ等しい効率で「切断」を媒介する。カルジオウイルスとしては、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）およびタイラーマウス脳炎ウイルス（ＴＭＥＶ）が挙げられる。

ＥＭＣＶおよびＦＭＤＶ ２Ａの突然変異分析は、モチーフＤｘＥｘＮＰＧＰ（配列番号４０）が「切断」活性に密接に関与することを明らかにした（上記のDonelly et al (2001)）。

本発明の切断部位は、アミノ酸配列：Ｄｘ_１Ｅｘ_２ＮＰＧＰ（ここで、ｘ_１およびｘ_２は、任意のアミノ酸であり；Ｘ_１は、以下の群：Ｉ、Ｖ、Ｍ、およびＳから選択され得；Ｘ_２は、以下の群：Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、Ｑ、およびＦから選択され得る）を含み得る。

例えば、切断部位は、表１に示されるアミノ酸配列の１つを含み得る。

２Ａ配列に基づく切断部位は、例えば１５～２２アミノ酸長であり得る。配列は、２Ａタンパク質のＣ末端、それに続いてプロリン残基（２ＢのＮ末端プロリンに対応する）を含み得る。

突然変異研究は、天然に存在する２Ａ配列に加えて、いくつかのバリアントも活性であることも示した。切断部位は、１、２または３つのアミノ酸置換を有する天然に存在する２Ａポリペプチド由来のバリアント配列に対応し得、これは、２つまたはそれよりも多くの別々のタンパク質へのポリタンパク質配列の「切断」を誘導する能力を保持する。

切断配列は、すべてがある程度まで活性であることが示されている以下のものから選択され得る（上記のDonnelly et al (2001)）：

ＤｘＥｘＮＰＧＰの配列に基づいて、モチーフの「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｓｐｐ、および細菌配列内の反復配列で見出された（上記のDonnelly et al (2001)）。切断部位は、これらの２Ａ様配列、例えば：

の１つを含み得る。

切断部位は、配列番号６３（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）として示される２Ａ様配列、または配列ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号７０）を有するＴｈｏｓｅａ ａｓｉｇｎａウイルスカプシドタンパク質由来の２Ａペプチドを含み得る。

５～３９アミノ酸のＮ末端「伸長」を含めることにより、活性を増加させることができることが示されている（上記のDonnelly et al (2001)）。特に、切断配列は、以下の配列の１つ、または切断部位活性を保持する、例えば最大で５つのアミノ酸変化を有するそのバリアントを含み得る：

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に概略的に示されるＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、それは、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づき得る。スペーサードメインは、通常、膜からバインダーを分離し、それを好適な配向にするのを可能にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に応じて、よりコンパクトなスペーサー、例えば、ＣＤ８α由来のストーク、およびさらにはＩｇＧ１ヒンジ単独で十分であり得る。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有していた。その結果として、これらの第１世代受容体は、免疫学的シグナル１を伝達し、これは、同族標的細胞のＴ細胞死滅の引き金を引くために十分であったが、Ｔ細胞を完全に活性化して、増殖および生存させることはできなかった。この制限を克服するために、複合エンドドメインが構築された：ＣＤ３ζのものへのＴ細胞共刺激分子の細胞内部分の融合は、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代受容体をもたらす。最も一般に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、Ｔ細胞増殖の引き金を引く最も強力な共刺激シグナル－すなわち、免疫学的シグナル２を供給する。生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。現在では、活性化、増殖、および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらにより強力な第３世代ＣＡＲが記載されている。

ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスベクターを使用してＴ細胞に移入されて、養子細胞移入のためのがん特異的Ｔ細胞を生成し得る。ＣＡＲが標的抗原と結合すると、これは、それが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。そのため、ＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞の方にＴ細胞の特異性および細胞傷害性を向ける。

タンデムＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲとして公知の二重特異性ＣＡＲは、２つまたはそれよりも多くのがん特異的マーカーを同時に標的にするように開発された。ＴａｎＣＡＲでは、細胞外ドメインは、リンカーによって接合された２つの抗原結合特異性をタンデムで含む。そのため、２つの結合特異性（ｓｃＦｖ）は、両方とも、単一の膜貫通部分に連結される：一方のｓｃＦｖは膜に近接しており、他方は遠位にある。ＴａｎＣＡＲが標的抗原のいずれかまたは両方と結合する場合、これは、それが発現される細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。抗体、抗体ミメティック、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含む多数の抗原結合ドメインが当技術分野において公知である。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然リガンド；標的に対して十分な親和性を有するペプチド；シングルドメイン抗体；Ｄａｒｐｉｎなどの人工単一バインダー（設計アンキリンリピートタンパク質）；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。

古典的ＣＡＲでは、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。ドメイン抗体（ｄＡｂ）またはＶＨＨ抗原結合ドメインを有するか、またはＦａｂ断片、例えばモノクローナル抗体のＦａｂ断片を含む、ＣＡＲも生成されている。ＦａｂＣＡＲは、２つの鎖：抗体様軽鎖可変領域（ＶＬ）および定常領域（ＣＬ）を有する鎖；ならびに重鎖可変領域（ＶＨ）および定常領域（ＣＨ）を有する鎖を含む。一方の鎖は、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインも含む。ＣＬおよびＣＨの間の会合は、受容体のアセンブリーを引き起こす。

Ｆａｂ ＣＡＲの２つの鎖は、一般構造：
ＶＨ－ＣＨ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＬ－ＣＬ
または
ＶＬ－ＣＬ－スペーサー－膜貫通ドメイン－細胞内シグナル伝達ドメイン；および
ＶＨ－ＣＨ
を有し得る。

Ｆａｂ型キメラ受容体について、抗原結合ドメインは、一方のポリペプチド鎖由来のＶＨ、および他方のポリペプチド鎖由来のＶＬで構成される。

ポリペプチド鎖は、ＶＨ／ＶＬドメインおよびＣＨ／ＣＬドメインの間にリンカーを含んでいてもよい。リンカーは、可撓性であってもよく、ＶＨ／ＶＬドメインをＣＨ／ＣＬドメインから空間的に分離する働きをし得る。

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、腫瘍関連抗原と結合し得る。例えば、以下の表２に示されるように、さまざまな腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）が公知である。

ＣＡＲは、下記の表３に要約された標的の１つに結合し得る。特に、ＣＡＲは、以下の標的抗原：ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、上皮性増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ヒト上皮性増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、Ｌ１ＣＡＭ、ムチン１（ＭＵＣ１）、または前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の１つと結合し得る。

本発明の一実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＭＡ以外の抗原と結合し得る。ＣＡＲは、ＰＳＭＡではない表３に列挙された標的抗原の１つと結合し得る。例えば、ＣＡＲは、以下の標的抗原：ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、上皮性増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ヒト上皮性増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、Ｌ１ＣＡＭ、およびムチン１（ＭＵＣ１）の１つと結合し得る。

ジシアロガングリオシドＧＤ２
シアル酸含有糖スフィンゴ脂質（glycosphinolipid）であるジシアロガングリオシド（ＧＤ２）と結合するＣＡＲが開発されている。そのようなＣＡＲは、例えば、ＧＤ２バインダーの１４ｇ２ａ、またはＷＯ２０１５／１３２６０４号に記載されるｈｕＫ６６６に基づき得る。

ＧＤ２と結合するＣＡＲは、
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＳＹＮＩＨ（配列番号１２）
ＣＤＲ２－ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号１３）
ＣＤＲ３－ＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹ（配列番号１４）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号１５）
ＣＤＲ２－ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１６）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＳＧＹＰＩＴ（配列番号１７）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗原結合ドメインを有し得る。

ＧＤ２結合ドメインは、配列番号７５に示される配列を有するＶＨドメイン；および／または配列番号７６に示される配列を有するＶＬドメインを含み得る。

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、バリアント配列がＧＤ２と結合する能力を保持するという条件で、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号７５または７６のバリアントを含み得る。

上皮性増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）
上皮性増殖因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥｒｂＢ－１；ヒトではＨＥＲ１）は、細胞外タンパク質リガンドの上皮増殖因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーに対する受容体である膜貫通タンパク質である。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ００５３３から入手可能である。ＥＧＦＲは、不活性な単量体形態から活性なホモ二量体への移行を受ける。ＥＧＦＲ二量体化は、その固有の細胞内タンパク質チロシンキナーゼ活性を刺激し、Ｙ９９２、Ｙ１０４５、Ｙ１０６８、Ｙ１１４８、およびＹ１１７３を含むＣ末端ドメインのいくつかのチロシン（Ｙ）残基の自己リン酸化を引き起こす。自己リン酸化は、それら自身のホスホチロシン結合ＳＨ２ドメインを通してリン酸化チロシンと会合するいくつかの他のタンパク質によって、下流の活性化およびシグナル伝達を誘発する。これらの下流のシグナル伝達タンパク質は、いくつかのシグナル伝達カスケード、特に、ＭＡＰＫ、Ａｋｔ、およびＪＮＫ経路を開始し、ＤＮＡ合成および細胞増殖をもたらす。

ＥＧＦＲの過剰発現は、多種多様な腫瘍の発生に関連する。ＥＧＦＲ過剰発現（上方調節または増幅として公知）をもたらす突然変異は、肺の腺癌（症例の４０％）、肛門がん、神経膠芽腫（５０％）、および頭頸部の上皮性腫瘍（８０～１００％）を含む、いくつかのがんに関連している。ＥＧＦＲが関与するこれらの体細胞突然変異は、その一定の活性化をもたらし、これは、未制御の細胞分裂を生じる。神経膠芽腫では、ＥＧＦＲｖＩＩＩと呼ばれるＥＧＦＲの特異的突然変異が多くの場合に観察される。ＥＧＦＲまたはファミリーメンバーの突然変異、増幅、または誤調節は、すべての上皮がんの約３０％に関わる。

いくつかの抗ＥＧＦＲ抗体、例えば、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、およびマツズマブが公知である。

上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、上皮においてＣａ２＋非依存性同型細胞間接着を媒介する膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、細胞のシグナル伝達、遊走、増殖、および分化にも関与する。加えて、ＥｐＣＡＭは、ｃ－ｍｙｃ、ｅ－ｆａｂｐ、ならびにサイクリンＡおよびＥを上方調節するその能力を介して発がんの可能性を有する。ＥｐＣＡＭは、上皮および上皮由来新生物において独占的に発現されるので、ＥｐＣＡＭは、さまざまながんのための診断マーカーとして使用することができる。癌腫の腫瘍形成および転移において役割を果たすと思われ、そのため、これは、予後マーカーとして、および免疫療法戦略のための標的としても作用し得る。ＥｐＣＡＭは、多くの場合、乳がん、結腸がん、および皮膚の基底細胞癌を含むある特定の癌腫において過剰発現される。

ＥｐＣＡＭは、グリコシル化された３０～４０ｋＤａのＩ型膜タンパク質である。ヒトＥｐＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１６４２２から入手可能である。分子に発がんの可能性を与えるＥｐＣＡＭが切断され得る。切断の際に、細胞外ドメイン（ＥｐＥＸ）は、細胞の周囲の領域に放出され、細胞内ドメイン（ＥｐＩＣＤ）は、細胞の細胞質に放出される。ＥｐＩＣＤは、核の内部でタンパク質のＦＨＬ２、β－カテニン、およびＬｅｆと複合体を形成する。次いで、この複合体は、ＤＮＡに結合し、さまざまな遺伝子の転写を促進する。上方調節の標的としては、ｃ－ｍｙｃ、ｅ－ｆａｂｐ、ならびにサイクリンＡおよびＥが挙げられる。これは、腫瘍成長を促進する効果を有する。加えて、切断されたＥｐＥＸは、さらなるＥｐＣＡＭ分子の切断を刺激し、ポジティブフィードバックループをもたらすことができる。ＥｐＣＡＭはまた、腫瘍における上皮間葉移行（ＥＭＴ）において役割を果たし得る。

ＥｐＣＡＭは、主に、正常な上皮の側底膜において発現されるので、これががん細胞表面において均一に分布する場合、がん組織において、ＥｐＣＡＭよりも抗体にはるかに接近しにくいはずである。多くの癌腫において過剰発現されることに加えて、ＥｐＣＡＭは、がん幹細胞において発現され、ＥｐＣＡＭを免疫療法のための魅力的な標的にする。しかしながら、癌腫におけるＥｐＣＡＭの不均一な発現、およびＥｐＣＡＭが腫瘍特異的ではない（すなわち、正常な上皮において見出される）という事実は、これまでに、ＥｐＣＡＭの方に向かう免疫療法手法の開発を妨げていた。

それぞれ、マウスＩｇＧ２ａのエドレコロマブ、およびそのマウス／ヒトキメラＩｇＧ１抗体バージョン、ならびにヒト化、ヒト操作された、および完全ヒトＩｇＧ１抗体の３６２２Ｗ９４、ＩＮＧ－１、ならびにアデカツムマブ（ＭＴ２０１）を含むいくつかの抗ＥｐＣＡＭ抗体が公知である。

グリピカン３（ＧＰＣ３）
グリピカン－３は、細胞分裂および成長調節の制御において役割を果たす。ＧＰＣ３のタンパク質コアは、２つのサブユニットからなり、Ｎ末端サブユニットは約４０ｋＤａのサイズを有し、Ｃ末端サブユニットは約３０ｋＤａである。ヒトＧＰＣ３のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ５１６５４から入手可能である。

哺乳動物において、６つのグリピカン（ＧＰＣ１～６）が特定されている。細胞表面のヘパラン硫酸プロテオグリカンは、可変数のヘパラン硫酸鎖で置換された膜関連タンパク質コアから構成されている。グリピカン関連膜内在性プロテオグリカンファミリー（ＧＲＩＰＳ）のメンバーは、グリコシルホスファチジルイノシトール連結を介して、細胞質膜に固定されたコアタンパク質を含有する。ＧＰＣ３は、Ｗｎｔおよびｆｒｉｚｚｌｅｄ（ＦＺＤ）の両方と相互作用して、複合体を形成し、下流のシグナル伝達の引き金を引く。

ＧＰＣ３は、肝臓がんを処置するための前途有望な治療標的である。ＧＣ３３、ＨＮ３、およびＹＰ７を含むいくつかの治療用抗ＧＰＣ３抗体が開発されている。ＹＰ７およびそのヒト化形態ｈＹＰ７は、ＧＰＣ３のＣローブと結合し、シングルドメイン抗体のＨＮ３は、ＧＰＣ３のＮローブを標的するが、ヒトモノクローナル抗体は、ＧＰＣ３のヘパラン硫酸部分を標的にする。ＧＣ３３、ｈＹＰ７、およびＨＮ３に基づくキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞免疫療法は、肝臓がんを処置するために、さまざまな段階で開発中である。

ヒト上皮性増殖因子受容体（ＨＥＲ２）
ＨＥＲ２（ヒト上皮性増殖因子受容体２由来）は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、受容体チロシン－タンパク質キナーゼｅｒｂＢ－２、ＣＤ３４０（表面抗原分類３４０）、プロトオンコジーンＮｅｕ、Ｅｒｂｂ２（齧歯動物）、およびＥＲＢＢ２（ヒト）としても公知である。

ＨＥＲ２は、ヒト上皮性増殖因子受容体（ＨＥＲ／ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ）ファミリーのメンバーである。このオンコジーンの増幅または過剰発現は、ある特定の攻撃的な種類の乳がんの発生および進行において重要な役割を果たすことが示されている。近年では、このタンパク質は、重要なバイオマーカー、および乳がん患者のおよそ３０％に対する治療の標的になっている。

ＥｒｂＢファミリーは、４つの細胞膜結合受容体チロシンキナーゼからなる。その１つはｅｒｂＢ－２であり、他のメンバーは、上皮性増殖因子受容体のｅｒｂＢ－３（ニューレグリン結合性；キナーゼドメインを欠く）、およびｅｒｂＢ－４である。４つすべてが、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびに多数のシグナル伝達分子と相互作用し、リガンド依存性およびリガンド非依存性の活性の両方を示し得る細胞内ドメインを含有する。ＨＥＲ２は、他の３つの受容体のいずれかとヘテロ二量体化することができ、他のＥｒｂＢ受容体の好ましい二量体化パートナーであると考えられる。二量体化は、受容体の細胞質ドメイン内でのチロシン残基の自己リン酸化をもたらし、各種のシグナル伝達経路を開始する。ヒトＨＥＲ２のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０４６２６から入手可能である。

ＨＥＲ２は、モノクローナル抗体のトラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎとして販売）の標的である。トラスツズマブは、ＨＥＲ２が過剰発現しているがんにおいてのみ有効である。ＨＥＲ２に結合するトラスツズマブの重要な下流の効果は、細胞増殖を停止するタンパク質のｐ２７の増加である。ＨＥＲ２およびＨＥＲ３受容体の二量体化を阻害する別のモノクローナル抗体であるペルツズマブは、２０１２年６月に、トラスツズマブとの併用についてＦＤＡによって承認された。

Ｌ１細胞接着分子（Ｌ１ＣＡＭ）
Ｌ１としても公知のＬ１ＣＡＭは、Ｌ１ＣＡＭ遺伝子によってコードされる、Ｌ１タンパク質ファミリーの膜貫通タンパク質メンバーである。２００～２２０ｋＤａのこのタンパク質は、６つの免疫グロブリンドメイン、それに続く膜貫通ヘリックスによって小型細胞内ドメインに接続されている５つのＩＩＩ型フィブロネクチンドメインから形成される。ヒトＬ１ＣＡＭのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ３２００４から入手可能である。

Ｌ１ＣＡＭは、細胞の遊走、接着、神経突起伸長、ミエリン形成、およびニューロン分化において強い関わりを有する神経細胞接着分子である。Ｌ１ＣＡＭは、ニューロンの表面上の神経系全体にわたって位置する。これは、細胞膜に沿って配置され、その結果、タンパク質の一端は、神経細胞の内部に留まるが、他端は、ニューロンの外側表面にある。この位置は、タンパク質が、ニューロンを通して伝播する化学シグナルを活性化するのを可能にする。

ニューロンのためのサポートおよび保護を提供し、ミエリンを形成する非神経細胞である未成熟乏突起膠細胞およびシュワン細胞；細胞媒介免疫に関与するリンパ球であるＴ細胞；Ｂ細胞および単球などの他の種類のリンパ球を含む多種多様な細胞がＬ１ＣＡＭを発現する。Ｌ１ＣＡＭは、多数の腫瘍の種類、例えば、黒色腫および肺癌細胞において発現される。

Wolterink et al (2010) Cancer Res 15:2504-2515は、抗体Ｌ１－９．３を含む、Ｌ１ＣＡＭ外部ドメインに対する一連の新規モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成を記載している。

ムチン１（ＭＵＣ１）
多形上皮ムチン（ＰＥＭ）または上皮膜抗原またはＥＭＡとも呼ばれる細胞表面関連のムチン１（ＭＵＣ１）は、ヒトにおいて、ＭＵＣ１遺伝子によってコードされるムチンである。ＭＵＣ１は、その細胞外ドメインの広範囲のＯ－連結グリコシル化を有する糖タンパク質である。ムチンは、肺、胃、腸、眼、およびいくつかの他の器官の上皮細胞の頂端膜側を覆っている。ムチンは、病原体が細胞外ドメイン中のオリゴ糖に結合し、病原体が細胞表面に達するのを防止することによって、感染から身体を保護する。ＭＵＣ１の過剰発現は、多くの場合、結腸がん、乳がん、卵巣がん、肺がん、および膵臓がんに関連する。ヒトＭＵＣ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１５９４１から入手可能である。

ＰＤＴ^＊Ｒモチーフ（アスタリスクはＯ－グリコシル化部位を表す、配列番号１０４）で特定のＯ－グリカン構造を認識する１Ｂ２および１２Ｄ１０を含む多数の抗ムチン１（抗ＭＵＣ１）抗体が開発され、特性評価されている。１Ｂ２は、ＧａｌＮＡｃ残基の無置換Ｏ－６位（Ｔｎ、Ｔ、および２３ＳＴ）でＯ－グリカンを認識するが、１２Ｄ１０は、同じ位置（ＳＴｎ、２６ＳＴ、およびｄＳＴ）でＮｅｕ５Ａｃを認識する。

前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）
グルタミン酸カルボキシペプチダーゼＩＩ（ＧＣＰＩＩ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－アスパルチル－Ｌ－グルタミン酸ペプチダーゼＩ（ＮＡＡＬＡＤａｓｅ Ｉ）、またはＮＡＡＧペプチダーゼとしても公知の前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、亜鉛金属酵素である。これは、Ｎ－アセチルアスパルチルグルタメート（ＮＡＡＧ）のグルタミン酸およびＮ－アセチルアスパルテート（ＮＡＡ）への加水分解を触媒するクラスＩＩ膜糖タンパク質である。ヒトＭＵＣ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０４６０９から入手可能である。

ヒトＰＳＭＡは、ほとんどの他の組織よりもおよそ１００倍高く、前立腺において高度に発現される。一部の前立腺がんでは、ＰＳＭＡは、非がん性前立腺細胞のレベルに対して８～１２倍の増加で、２番目に多く上方調節された遺伝子産物である。この高発現のために、ＰＳＭＡは、一部のがんの療法およびイメージングのための可能性があるバイオマーカーとして開発中である。ヒト前立腺がんでは、より高く発現している腫瘍は、より迅速な腫瘍増殖停止時間、および再発を患う患者のより高いパーセンテージに関連する。ＰＳＭＡレベルの減少を有する前立腺がんおよび乳がんの細胞系を使用するｉｎ ｖｉｔｒｏ研究は、細胞の増殖、遊走、侵襲、接着、および生存の有意な減少を示した。

前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的なＣＡＲを発現するＴ細胞は、現在、前立腺がんの処置のための臨床試験中である（Junhans et al (2016) Prostate 76:1257-1270）。

英国特許出願第１９１９０１９．８号は、ＣＡＲにおける使用に好適なさまざまなＰＳＭＡ抗原結合ドメインを記載した。

ＰＳＭＡと結合するＣＡＲは、
ａ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＳＳＷＭＮ（配列番号１８）
ＣＤＲ２－ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１９）
ＣＤＲ３－ＧＴＧＹＬＷＹＦＤＶ（配列番号２０）
を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
ｂ）以下の配列：
ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＤＩＮＥＮＬＡ（配列番号２１）
ＣＤＲ２－ＹＴＳＮＲＡＴ（配列番号２２）
ＣＤＲ３－ＱＱＹＤＮＬＰＦＴ（配列番号２３）
を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む抗原結合ドメインを有し得る。

ＰＳＭＡ結合ドメインは、配列番号７７に示される配列を有するＶＨドメイン；および／または配列番号７８に示される配列を有するＶＬドメインを含み得る。

ＣＡＲの抗原結合ドメインは、バリアント配列がＰＳＭＡと結合する能力を保持するという条件で、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号７７または７８のバリアントを含み得る。

しかしながら、本発明の一実施形態では、ＣＡＲは、ＰＳＭＡ以外の抗原に結合する。ＣＡＲは、非ＰＳＭＡ特異的抗原結合ドメインを有し得る。

細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
ＣＡＲは、活性化エンドドメイン：ＣＡＲのシグナル伝達部分を含み得るか、それと会合し得る。抗原認識後、受容体のクラスターおよびシグナルは、細胞に伝達される。最も一般的に使用されるエンドドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３－ゼータのエンドドメインである。これは、抗原が結合した後、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３－ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しないことがあり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要であることがある。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０を、増殖／生存シグナルを伝達するためにＣＤ３－ゼータとともに使用することができ、または３つすべてを一緒に使用することができる。

ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８エンドドメインおよびＣＤ３－ゼータエンドドメインを含み得る。これらのエンドドメインの配列を、それぞれ、下記に配列番号７９および８０として示す。

エンドドメインは、
（ｉ）ＩＴＡＭ含有エンドドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメイン；および／または
（ｉｉ）共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８由来のエンドドメイン；および／または
（ｉｉｉ）生存シグナルを伝達するドメイン、例えば、ＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメイン、例えば、ＯＸ－４０もしくは４－１ＢＢ
を含み得る。

ＩＴＡＭモチーフを含有するエンドドメインは、本発明において活性化エンドドメインとして作用し得る。いくつかのタンパク質は、１つまたは複数のＩＴＡＭモチーフを有するエンドドメインを含有することが公知である。そのようなタンパク質の例としては、２～３例を挙げると、ＣＤ３イプシロン鎖、ＣＤ３ガンマ鎖、およびＣＤ３デルタ鎖が挙げられる。ＩＴＡＭモチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンとして容易に認識することができ、シグネチャーＹｘｘＬ／Ｉ（配列番号８１）を与える。常にではないが典型的には、これらのモチーフの２つは、分子のテイルにおいて、６～８個のアミノ酸によって分離される（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６－８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。そのため、当業者は、活性化シグナルを伝達するために１つまたは複数のＩＴＡＭを含有する既存のタンパク質を容易に見出すことができる。さらに、モチーフが単純であって、複雑な二次構造を必要としないことを考慮すると、当業者は、活性化シグナルを伝達するための人工ＩＴＡＭを含有するポリペプチドを設計することができる（合成シグナル伝達分子に関するＷＯ２０００／０６３３７２号を参照されたい）。

ＷＯ０１５／１５０７７１号；ＷＯ２０１６／１２４９３０号、およびＷＯ２０１６／０３０６９１号に記載のものなどのＣＡＲの抗原認識部分がシグナル伝達部分由来の別々の分子上にあるいくつかの系が記載されている。本発明の方法で使用されるウイルスベクターの１つまたは複数は、そのような「分割ＣＡＲ」をコードし得る。あるいは、１つのベクターは、抗原認識部分をコードする核酸配列を含み得、１つのベクターは、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする核酸配列を含み得る。

シグナルペプチド
ベクター中の１つまたは複数の核酸配列は、シグナルペプチドをコードし得、その結果、ＣＡＲ、サイトカイン、またはケモカインが細胞の内側で発現されると、新生タンパク質は、小胞体に向けられ、その後、細胞表面に向けられ、そこで発現される（またはサイトカインもしくはケモカインの場合はそこで分泌される）。

シグナルペプチドのコアは、単一のアルファ－ヘリックスを形成する傾向がある長い一続きの疎水性アミノ酸を含有し得る。シグナルペプチドは、短い正に荷電した一続きのアミノ酸で開始してもよく、これは、転位の間のポリペプチドの適したトポロジーの強化に役立つ。シグナルペプチドの末端には、典型的には、シグナルペプチダーゼによって認識および切断される一続きのアミノ酸が存在する。シグナルペプチダーゼは、転位の間またはその完了後のいずれかで切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼによって消化される。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。

ＣＡＲは、一般式：
シグナルペプチド－抗原結合ドメイン－スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
を有し得る。

スペーサー
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと接続し、抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するスペーサー配列を含み得る。可撓性スペーサーは、抗原結合ドメインが異なる方向に配向して、抗原結合を可能にさせる。

スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、もしくはＣＤ８ストーク、またはその組合せを含み得る。スペーサーは、代替的に、ＩｇＧ１ Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジ、またはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインスペーシング特性を有する代替配列を含み得る。

ウイルスベクターの組成物がＣＡＲをコードする核酸配列を含む２つ以上のベクターを含む場合、ＣＡＲは、異なるスペーサーを有していてもよい。

ＯＲゲート
本発明の細胞組成物は、２つまたはそれよりも多くのＣＡＲを含んでいてもよい。これは、ＣＡＲをコードする核酸配列をそれぞれ含む２つもしくはそれよりも多くのベクターでの形質導入の結果としてであり得るか、または２つもしくはそれよりも多くのＣＡＲをコードする核酸構築物を含む単一ベクターでの形質導入の結果としてであり得る。

ＣＡＲは、１つまたは複数の他の活性化キメラ抗原受容体または阻害性キメラ抗原受容体と組み合わせて使用してもよい。例えば、それらは、「論理ゲート」において１つまたは複数のＣＡＲと組み合わせて使用してもよく、ＣＡＲの組合せは、Ｔ細胞などの細胞によって発現される場合に、少なくとも２つの標的抗原の特定の発現のパターンの検出を可能にする。少なくとも２つの標的抗原が抗原Ａおよび抗原Ｂとして任意に表される場合、３つの可能な選択肢は以下の通りである：
「ＯＲゲート」－Ｔ細胞は、抗原Ａまたは抗原Ｂのいずれかが標的細胞上に存在する場合に、引き金を引く
「ＡＮＤゲート」－Ｔ細胞は、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在する場合のみ、引き金を引く
「ＡＮＤ ＮＯＴゲート」－Ｔ細胞は、抗原Ａが単独で標的細胞上に存在する場合に、引き金を引くが、抗原ＡおよびＢの両方が標的細胞上に存在する場合に引き金を引かない。

これらのＣＡＲの組合せを発現する操作されたＴ細胞は、２またはそれより多くのマーカーのそれらの特定の発現（または発現の欠如）に基づいて、がん細胞に精巧に特異的であるように調整することができる。

そのような「論理ゲート」は、例えば、ＷＯ２０１５／０７５４６９号、ＷＯ２０１５／０７５４７０号、およびＷＯ２０１５／０７５４７０号に記載されている。

「ＯＲゲート」は、標的細胞によって発現された別個の標的抗原にそれぞれ対する２つまたはそれより多くの活性化ＣＡＲを含む。ＯＲゲートの利点は、有効に抗原Ａ＋抗原Ｂとなるように、有効な標的可能な抗原が標的細胞上で増加することである。単一抗原のレベルが、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって有効に標的にするために必要な閾値を下回り得るので、これは、標的細胞上に可変のまたは低い密度で発現される抗原のために特に重要である。また、それは、抗原逃避の現象を回避する。

トランスジェニックＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明の細胞は、トランスジェニックＴＣＲを発現し得る。

Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、抗原の断片を主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして認識する原因となるＴ細胞の表面上で見られる分子である。

ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロ二量体である。ヒトでは、９５％のＴ細胞では、ＴＣＲはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）からなるが、５％のＴ細胞では、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）からなる。

ＴＣＲが、抗原ペプチドおよびＭＨＣとエンゲージする場合（ペプチド／ＭＨＣ）、Ｔリンパ球は、シグナル伝達を介して活性化される。

従来の抗体指向性標的抗原とは対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、プロセシングされ、かつペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される潜在的な細胞内タンパク質のアレイ全体を含み得る。

ベクターを使用して細胞にＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子またはＴＲＧ遺伝子およびＴＲＤ遺伝子を人為的に導入することによって、異種（すなわち、非ネイティブ）ＴＣＲ分子を発現するように細胞を操作することが可能である。例えば、操作されたＴＣＲの遺伝子を自己Ｔ細胞に導入し、Ｔ細胞養子療法のために患者に移入して戻すことができる。そのような「異種」ＴＣＲは、本明細書で「トランスジェニックＴＣＲ」または操作されたＴＣＲとも称され得る。

本発明の細胞は、ＴＲＡ遺伝子およびＴＲＢ遺伝子をコードする１つもしくは複数の異種核酸配列、またはＴＲＧ遺伝子およびＴＲＤ遺伝子をコードする１つもしくは複数の異種核酸配列を含み得る。

ドミナントネガティブＳＨＰ－２
本発明の細胞は、ドミナントネガティブＳＨＰ－２を発現し得る。

ＷＯ２０１６／１９３６９６号は、阻害性免疫受容体、例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＬＡＧ－３、２Ｂ４、またはＢＴＬＡ１によって媒介される阻害を遮断または低減するＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の短縮型バージョンを記載している。ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２の短縮型形態は、一方または両方のＳＨ２ドメインを含むが、ホスファターゼドメインを欠く。ＣＡＲ－Ｔ細胞において発現されると、これらの分子は、野生型ＳＨＰ－１およびＳＨＰ－２のドミナントネガティブバージョンとして作用し、リン酸化されたＩＴＩＭへの結合について内因性分子と競合する。

本発明の細胞は、リン酸化された免疫受容抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）と結合するが、ホスファターゼドメインを欠くタンパク質由来のＳＨ２ドメインを含む短縮型タンパク質を発現し得る。短縮型タンパク質は、一方または両方のＳＨＰ－１ ＳＨ２ドメインを含み得るが、ＳＨＰ－１ホスファターゼドメインを欠き得る。あるいは、短縮型タンパク質は、一方または両方のＳＨＰ－２ ＳＨ２ドメインを含み得るが、ＳＨＰ－２ホスファターゼドメインを欠き得る。

ＳＨＰ－１
Ｓｒｃ相同領域２ドメイン含有ホスファターゼ－１（ＳＨＰ－１）は、タンパク質チロシンホスファターゼファミリーのメンバーである。これは、ＰＴＰＮ６としても公知である。

ＳＨＰ－１のＮ末端領域は、ＳＨＰ－１およびその基質の相互作用を媒介する２つのタンデムＳＨ２ドメインを含有する。Ｃ末端領域は、チロシン－タンパク質ホスファターゼドメインを含む。

ＳＨＰ－１は、いくつかの阻害性免疫受容体またはＩＴＩＭ含有受容体に結合し、それからのシグナルを伝播することができる。そのような受容体の例としては、限定されるものではないが、ＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、およびＫＩＲ３ＤＬ３が挙げられる。

ヒトＳＨＰ－１タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ２９３５０を有する。

活性モジュレーターは、下記に配列番号８２として示されるＳＨＰ－１タンデムＳＨ２ドメインを含むか、またはそれからなり得る。

ＳＨＰ－１は、配列のＮ末端の残基４～１００および１１０～２１３に２つのＳＨ２ドメインを有する。活性モジュレーターは、配列番号８３および８４として示される配列の一方または両方を含み得る。

細胞は、バリアント配列が必要な特性を有するＳＨ２ドメイン配列であることを条件として、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号８２、８３、または８４のバリアントを発現し得る。言い換えれば、バリアント配列は、ＳＨＰ－１のリクルートが可能なＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、またはＫＩＲ３ＤＬ３の少なくとも１つの細胞質尾部中のリン酸化されたチロシン残基に結合することができるはずである。

ＳＨＰ－２
ＰＴＰＮ１１、ＰＴＰ－１Ｄ、およびＰＴＰ－２Ｃとしても公知のＳＨＰ－２は、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ファミリーのメンバーである。ＰＴＰＮ６のように、ＳＨＰ－２は、そのＮ末端の２つのタンデムＳＨ２ドメイン、それに続くタンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰ）ドメインからなるドメイン構造を有する。不活性状態では、Ｎ末端ＳＨ２ドメインは、ＰＴＰドメインと結合し、活性部位への潜在的な基質の接近を遮断する。そのため、ＳＨＰ－２は自己阻害される。標的のホスホ－チロシル残基への結合の際に、Ｎ末端ＳＨ２ドメインは、ＰＴＰドメインから放出され、自己阻害を取り除くことによって酵素を触媒的に活性化する。

ヒトＳＨＰ－２は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受託番号Ｐ３５２３５－１を有する。

活性モジュレーターは、下記に配列番号８７として示されるＳＨＰ－１タンデムＳＨ２ドメインを含むか、またはそれからなり得る。ＳＨＰ－１は、配列のＮ末端の残基６～１０２および１１２～２１６に２つのＳＨ２ドメインを有する。活性モジュレーターは、配列番号８５および８６として示される配列の一方または両方を含み得る。

細胞は、バリアント配列が必要な特性を有するＳＨ２ドメイン配列であることを条件として、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号８５、８６、または８７のバリアントを発現し得る。言い換えれば、バリアント配列は、ＳＨＰ－２のリクルートが可能なＰＤ１、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ４、ＬＩＬＲＢ１、ＬＡＩＲ１、ＣＴＬＡ４、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、またはＫＩＲ３ＤＬ３の少なくとも１つの細胞質尾部中のリン酸化されたチロシン残基に結合することができるはずである。

ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体
本発明の細胞は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体を発現し得る。

操作された細胞は、養子免疫療法を制限する不利な微小環境に直面する。腫瘍微小環境内の主要な阻害機構の１つは、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦβ）である。ＴＧＦβシグナル伝達経路は、各種の細胞プロセスを制御する調節性シグナル伝達において極めて重要な役割を有する。ＴＧＦβは、Ｔ細胞ホメオスタシスおよび細胞機能の制御においても中心的な役割を果たす。特に、ＴＧＦβシグナル伝達は、増殖および活性化の低減を伴って、Ｔ細胞の免疫低下状態に関連する。ＴＧＦβ発現は、腫瘍の免疫抑制性微小環境に関連する。

各種のがん性腫瘍細胞は、ＴＧＦβを直接産生することが公知である。がん性細胞によるＴＧＦβ産生に加えて、ＴＧＦβは、腫瘍部位に存在する多種多様な非がん性細胞、例えば、腫瘍関連Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、上皮細胞、および間質細胞によって産生され得る。

トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体は、セリン／トレオニンキナーゼ受容体のスーパーファミリーである。これらの受容体は、増殖因子およびサイトカインシグナル伝達タンパク質のＴＧＦβスーパーファミリーのメンバーと結合する。５つのＩＩ型受容体（活性化受容体である）および７つのＩ型受容体（シグナル伝達伝播受容体である）がある。

補助共受容体（ＩＩＩ型受容体としても公知）も存在する。リガンドのＴＧＦβスーパーファミリーのそれぞれのサブファミリーは、Ｉ型およびＩＩ型受容体に結合する。

３つのトランスフォーミング増殖因子は、多くの活性を有する。ＴＧＦβ１および２は、がんに関与し、ここで、それらは、がん幹細胞を刺激し、線維症／線維形成性反応を増加させ、腫瘍の免疫認識を抑制し得る。

活性ＴＧＦβ受容体（ＴβＲ）は、２つのＴＧＦβ受容体Ｉ（ＴβＲＩ）および２つのＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴβＲＩＩ）によって構成されるヘテロ四量体である。ＴＧＦβ１は、潜在形態で分泌され、多数の機構によって活性化される。活性化されたら、それは、ＴβＲＩをリン酸化および活性化するＴβＲＩＩ ＴβＲＩと複合体を形成する。

本発明の細胞は、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体を発現し得る。ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体は、キナーゼドメインを欠き得る。

例えば、ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦ受容体ＩＩの単量体バージョンである配列番号８８として示される配列を含むか、またはそれからなり得る。

ドミナントネガティブＴＧＦ－βＲＩＩ（ｄｎＴＧＦ－βＲＩＩ）は、攻撃的なヒト前立腺がんマウスモデルにおいて、ＰＳＭＡ標的ＣＡＲ－Ｔ細胞増殖、サイトカイン分泌、疲弊に対する抵抗性、長期間のｉｎ ｖｉｖｏ持続、および腫瘍根絶の誘導を増強することが報告されている（Kloss et al (2018) Mol. Ther.26:1855-1866）。

キメラサイトカイン受容体
本発明の細胞は、キメラサイトカイン受容体を発現し得る。

ＷＯ２０１７／０２９５１２号は、非サイトカインリガンドに結合するエキソドメイン；およびサイトカイン受容体エンドドメインを含むキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）を記載している。

非サイトカインリガンドは、腫瘍分泌因子、ケモカイン、および細胞表面抗原から選択され得る。

キメラサイトカイン受容体は、２つのポリペプチド：
（ｉ）（ａ）リガンドの第１のエピトープと結合する第１の抗原結合ドメイン
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）（ａ）リガンドの第２のエピトープと結合する第２の抗原結合ドメイン
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含み得る。

あるいは、このキメラサイトカイン受容体は、２つのポリペプチド：
（ｉ）（ａ）重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）（ａ）軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含む。

例えば、サイトカイン受容体エンドドメインは、
（ｉ）ＩＬ－２受容体β鎖エンドドメイン；
（ｉｉ）ＩＬ－７受容体α鎖エンドドメイン；
（ｉｉｉ）ＩＬ－１５受容体α鎖エンドドメイン；または
（ｉｖ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含み得る。

サイトカイン受容体エンドドメインは、（ｉ）、（ｉｉ）、または（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）を含み得る。

サイトカイン受容体エンドドメインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦ－Ｒ）由来のα鎖エンドドメインおよびβ鎖エンドドメインを含み得る。

リガンドは、腫瘍分泌因子、例えば、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、およびＣＡ１２５から選択される腫瘍分泌因子であり得る。

リガンドは、ケモカイン、例えば、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ４、ＣＣＬ５、およびＣＣＬ２２から選択されるケモカインであり得る。

リガンドは、細胞表面分子、例えば、膜貫通タンパク質であり得る。リガンドは、例えば、ＣＤ２２であり得る。

構成的に活性なキメラサイトカイン受容体
本発明の細胞は、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体を発現し得る。構成的に活性なキメラサイトカイン受容体は、自発的にまたは薬剤（二量体化の化学誘導物質またはＣＩＤ）の存在下のいずれかで、２つのサイトカイン受容体エンドドメインを一緒にして二量体化する２つの鎖を含み得る。

したがって、構成的に活性なキメラサイトカイン受容体は、二量体化ドメイン、およびサイトカイン受容体エンドドメインを含み得る。

二量体化は自発的に起こってもよく、その場合、キメラ膜貫通タンパク質は構成的に活性である。あるいは、二量体化は二量体化の化学誘導物質（ＣＩＤ）の存在下でのみ起こってもよく、その場合、膜貫通タンパク質のみが、ＣＩＤの存在下でサイトカイン型シグナル伝達を引き起こす。

好適な二量体化ドメインおよびＣＩＤは、ＷＯ２０１５／１５０７７１号に記載されており、その内容はこれにより参照により本明細書に組み込まれる。

二量体化ドメインが自発的にヘテロ二量体化する場合、それは、抗体の二量体化ドメインに基づき得る。特に、それは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の二量体化部分を含み得る。定常ドメインの「二量体化部分」は、鎖間ジスルフィド結合を形成する配列の部分である。

キメラサイトカイン受容体は、エキソドメインとして抗体のＦａｂ部分を含み得る。この点において、キメラ抗原は、２つのポリペプチド：
（ｉ）（ａ）重鎖定常ドメイン（ＣＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）（ａ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含み得る。

サイトカイン受容体エンドドメインは、
（ｉ）ＩＬ－２受容体β鎖エンドドメイン；
（ｉｉ）ＩＬ－７受容体α鎖エンドドメイン；もしくは
（ｉｉｉ）ＩＬ－１５受容体α鎖エンドドメイン；および／または
（ｉｖ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含み得る。

サイトカイン受容体エンドドメインは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子受容体（ＧＭＣＳＦ－Ｒ）由来のα鎖エンドドメインおよびβ鎖エンドドメインを含み得る。

ＩＬ－２、ＩＬ－７、またはＧＭ－ＣＳＦ受容体エンドドメインを有する構成的に活性なＣＣＲは、以下の構造
Ｆａｂ＿ＣＣＲ＿ＩＬ２：ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａ－ＩＬ２ＲｇＴＭ－ＩＬ２ＲｇＥｎｄｏ－２Ａ－ＨｕＣＨ１－ＩＬ２ｂＴＭ－ＩＬ２ＲｂＥＮＤＯ
Ｆａｂ＿ＣＣＲ＿ＩＬ７：
ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａ－ＩＬ２ＲｇＴＭ－ＩＬ２ＲｇＥｎｄｏ－２Ａ－ＨｕＣＨ１－ＩＬ７ＲａＴＭ－ＩＬ７ＲａＥＮＤＯ
Ｆａｂ＿ＣＣＲ＿ＧＭＣＳＦ：
ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａ－ＧＭＣＳＦＲｂＴＭ－ＧＭＣＳＦＲｂＥｎｄｏ－２Ａ－ＨｕＣＨ１－ＧＭＣＳＦＲａＴＭ－ＧＭＣＳＦＲａＥＮＤＯ
（ここで、
ＨｕＬｉｇｈｔＫａｐｐａは、ヒト軽カッパ鎖であり、
ＩＬ２ＲｇＴＭは、ヒトＩＬ２Ｒ共通ガンマ鎖由来の膜貫通ドメインであり、
ＩＬ２ＲｇＥｎｄｏは、ヒトＩＬ２Ｒ共通ガンマ鎖に由来するエンドドメインであり、
２Ａは、２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドであり得る２つのポリペプチドの共発現を可能にする配列であり、
ＨｕＣＨ１は、ヒトＣＨ１であり、
ＩＬ２ｂＴＭは、ヒトＩＬ－２Ｒベータ由来の膜貫通ドメインであり、
ＩＬ２ＲｂＥＮＤＯは、ヒトＩＬ２Ｒベータ由来のエンドドメインであり、
ＩＬ７ＲａＴＭは、ヒトＩＬ－７Ｒアルファ由来の膜貫通ドメインであり、
ＩＬ７ＲａＥＮＤＯは、ヒトＩＬ－７Ｒアルファ由来のエンドドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲｂＴＭは、ヒトＧＭ－ＣＳＦＲ共通ベータ鎖由来の膜貫通ドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲｂＥｎｄｏは、ＧＭ－ＣＳＦＲ共通ベータ鎖由来のエンドドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲａＴＭは、ヒトＧＦ－ＣＳＦＲアルファ由来の膜貫通ドメインであり、
ＧＭＣＳＦＲａＥＮＤＯは、ヒトＧＭ－ＣＳＦＲアルファに由来するエンドドメインである）
の１つを有し得る。

配列番号８９～１０１として下記に示される構成的に活性なサイトカイン受容体を作製するための構成要素についての配列。

構成的に活性なＣＣＲは、バリアント配列が必要な特性を有することを条件として、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８、または９９％の配列同一性を有する配列番号８９～１０１の１つまたは複数のバリアントを含み得る。例えば、バリアントＣＨまたはＣＬ配列は、ＣＬ／ＣＨ含有鎖と二量体化する能力を保持していなければならない。サイトカイン受容体エンドドメイン由来のバリアント鎖は、そのサイトカイン受容体の相互鎖とカップリングした場合に、サイトカイン媒介性シグナル伝達の引き金を引く能力を保持していなければならない。

核酸配列
本発明は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を提供する。

核酸配列は、細胞がＩＬ－１２を非常に低レベルで分泌するように、細胞に導入され得る。

核酸配列は、配列番号１、２４、または２５として示される配列を含むポリペプチドをコードし得る。

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」という用語は、互いに同義であることが意図される。

遺伝コードの縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードし得ることが当業者に理解されるであろう。加えて、当業者は、ポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用頻度を反映するように、ルーチンの技法を使用して、本明細書に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行ってもよいことが理解されるべきである。

本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、一本鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、合成ヌクレオチドまたは改変ヌクレオチドをそれら内に含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変は当技術分野において公知である。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端でのアクリジンまたはポリリシン鎖の付加が挙げられる。本明細書に記載される使用の目的のために、ポリヌクレオチドが当技術分野において利用可能な任意の方法によって改変され得ることが理解されるべきである。そのような改変は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために行われ得る。

ヌクレオチド配列に関連する「バリアント」、「相同体」、または「誘導体」という用語は、配列からまたは配列への１つ（または複数）の核酸の任意の置換、変形、改変、置き換え、欠失、または付加を含む。

核酸構築物
本発明は、本発明の核酸配列を含む核酸構築物を提供する。核酸構築物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列も含み得る。

したがって、核酸構築物はまた、以下：
ドミナントネガティブＳＨＰ２をコードする核酸配列；
ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列；
キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列；
１つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする１つまたは複数の核酸配列
の１つまたは複数を含んでいてもよい。

本発明は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列；
（ｉｉ）フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）もしくは翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列；および
（ｉｉｉ）ＩＬ－１５をコードする核酸配列；ならびに／または
（ｉｖ）ＣＸＣＬ１２をコードする核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。

本発明は、
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列；
（ｉｉ）フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）もしくは翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列；および
（ｉｉｉ）ＩＬ－７をコードする核酸配列；ならびに／または
（ｉｖ）ＣＣＬ１９をコードする核酸配列
を含む核酸構築物を提供する。

核酸構築物は、核酸配列間に共発現配列を含んでいてもよく、その結果、共発現配列の上流および下流の導入遺伝子は、別々のポリペプチドとして細胞によって発現される。共発現配列は、上記により詳細に記載される自己切断ペプチドをコードしてもよい。

上記で説明されたように、低レベルのＩＬ－１２を伴うＣＡＲの共発現のための核酸構築物は、一般構造：
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ－ＩＬ１２
（ここで、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＦＳＭ／ＴＲＭ」は、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；
「ｃｏｅｘｐｒ」は、別々のポリペプチドとしてＣＡＲおよびＩＬ－１２の共発現を可能にする配列であり；
「ＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２またはｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする核酸配列である）
を有し得る。

別のサイトカインまたはケモカインをコードする核酸配列を含む構築物は、一般構造：
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＩＬ１２－ｃｏｅｘｐｒ２－ＣＣ；または
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２；
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２；
ＣＣ－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２
（ここで、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＦＳＭ／ＴＲＭ」は、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同じまたは異なっていてもよく、別々のポリペプチドとして、ＣＡＲ、ＩＬ－１２、およびサイトカインまたはケモカインの共発現を可能にする配列であり；
「ＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２またはｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする核酸配列であり；
「ＣＣ」は、サイトカイン（ＩＬ－１２以外）またはケモカインをコードする核酸配列である）
を有し得る。

複合翻訳リードスルーモチーフを有する核酸構築物は、構造：
ＣＡＲ－ＦＳＭ／ＴＲＭ１－ｃｏｅｘｐｒ１－ＣＣ－ＦＳＭ／ＴＲＭ２－ｃｏｅｘｐｒ２－ＩＬ１２
（ここで、
「ＣＡＲ」は、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列であり；
「ＦＳＭ／ＴＲＭ１」および「ＦＳＭ／ＴＲＭ２」は、同じまたは異なっていてもよく、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；
「ｃｏｅｘｐｒ１」および「ｃｏｅｘｐｒ２」は、同じまたは異なっていてもよく、別々のポリペプチドとして、ＣＡＲ、ＩＬ－１２、およびサイトカインまたはケモカインの共発現を可能にする配列であり；
「ＩＬ－１２」は、ＩＬ－１２またはｆｌｅｘｉ－ＩＬ１２をコードする核酸配列であり；
「ＣＣ」は、サイトカイン（ＩＬ－１２以外）またはケモカインをコードする核酸配列である）
を有し得る。

ベクター
本発明は、本発明の核酸配列または核酸構築物を含むベクターも提供する。

そのようなベクターを使用して、低レベルのＩＬ－１２を発現するように、宿主細胞に核酸配列または構築物を導入し得る。

ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンに基づくベクター、または合成ｍＲＮＡであり得る。

ベクターは、哺乳動物細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。

ベクターのキット
本発明は、複数のベクターを含むキットであって、少なくとも１つのベクターが、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、キットも提供する。

キット中のベクターまたは他のベクターは、以下：
ＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列；
ドミナントネガティブＳＨＰ２をコードする核酸配列；
ドミナントネガティブＴＧＦβ受容体をコードする核酸配列；
キメラサイトカイン受容体をコードする核酸配列；
１つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする１つまたは複数の核酸配列
の１つまたは複数を含み得る。

キットは、
ＣＡＲをコードする核酸配列およびフレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む第１のベクター；ならびに
ＣＡＲをコードする核酸配列、ドミナントネガティブＳＨＰ２をコードする核酸配列、およびドミナントネガティブＴＧＦβをコードする核酸配列を含む第２のベクター
を含み得る。

細胞
本発明は、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む細胞を提供する。

細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、単球、マクロファージ、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）、樹状細胞、好中球、肥満細胞、好酸球、もしくは好塩基球などの腫瘍浸潤性免疫細胞であり得るか、またはそれである。

細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞などの細胞溶解性免疫細胞であり得る。

Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介免疫において中心的役割を果たすリンパ球の種類である。それらは、細胞表面におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球から区別することができる。下記で概説するように、さまざまな種類のＴ細胞がある。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞およびメモリーＢ細胞へのＢ細胞の成熟、ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む、免疫学的プロセスにおいて他の白血球を支援する。ＴＨ細胞は、それらの表面でＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原で提示される場合に活性化されるようになる。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して、異なる種類の免疫応答を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９、またはＴＦＨを含む、いくつかのサブタイプの１つに分化し得る。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、また移植拒絶反応にも関与する。ＣＴＬは、それらの表面でＣＤ８を発現する。これらの細胞は、すべての有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによって、それらの標的を認識する。調節性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ－１０、アデノシン、および他の分子を通して、ＣＤ８＋細胞は、アネルギー状態に不活化され得、これは、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防止する。

メモリーＴ細胞は、感染が消散した後に長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。それらは、それらの同種抗原への再曝露の際に、多数のエフェクターＴ細胞に迅速に拡大増殖し、このようにして、過去の感染に対する「メモリー」を有する免疫系を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプ：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。メモリーＴ細胞は、典型的には、細胞表面タンパク質のＣＤ４５ＲＯを発現する。

以前にはサプレッサーＴ細胞として公知の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫学的寛容の維持のために非常に重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終わりに向けてＴ細胞媒介免疫を終了すること、および胸腺における負の選択のプロセスを逃避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス－天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。

天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知）は、胸腺において生じ、発達中のＴ細胞と、ＴＳＬＰで活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）樹状細胞および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との間の相互作用に関連している。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって他のＴ細胞から区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の突然変異は、調節性Ｔ細胞の発達を防止して、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸを引き起こし得る。

適応Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知）は、正常な免疫応答の間に生じ得る。

ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣ非依存性の様式で、ウイルス感染細胞からの生得的シグナルに対する迅速な応答を提供する。

ＮＫ細胞（自然リンパ球の群に属する）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を生じる共通のリンパ前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺、および胸腺において分化および成熟し、次いで、それらが循環系に入ることが公知である。

ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞の両方の特性を共有するＴ細胞の異種の群である。これらの細胞の多くは、自己および外来性脂質および糖脂質と結合する抗原提示分子である非多形ＣＤ１ｄ分子を認識する。それらは、すべての末梢血Ｔ細胞のおよそ０．１％しか構成しない。

ＮＫＴ細胞は、αβＴ細胞受容体を共発現するＴ細胞のサブセットであるが、ＮＫ１．１などのＮＫ細胞に典型的に関連する各種の分子マーカーも発現する。最も公知のＮＫＴ細胞は、それらのＴ細胞受容体が、非常に多様性が制限されている点で、従来のαβＴ細胞と異なる（「インバリアント」または「１型」ＮＫＴ）。それらおよび他のＣＤ１ｄ拘束性Ｔ細胞（「２型」ＮＫＴ）は、ペプチド－主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）よりもむしろ、抗原提示分子のＣＤ１ファミリーのメンバーであるＣＤ１ｄ分子によって提示される脂質および糖脂質を認識する。このように、ＮＫＴ細胞は、結核を引き起こすＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍなどの生物由来の糖脂質の認識において重要である。

ＮＫＴ細胞としては、ＮＫ１．１＋およびＮＫ１．１－、ならびにＣＤ４＋、ＣＤ４－、ＣＤ８＋およびＣＤ８－細胞の両方が挙げられる。ナチュラルキラーＴ細胞はまた、ＣＤ１６およびＣＤ５６発現ならびにグランザイム産生などのＮＫ細胞による他の特徴を共有し得る。

サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞様の混合表現型を特徴とする免疫エフェクター細胞の群である。それらは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または臍帯血単核細胞の、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、抗ＣＤ３抗体、組換えヒトインターロイキン（ＩＬ－）１、および組換えヒトインターロイキン（ＩＬ－）２とのｅｘ ｖｉｖｏインキュベーションによって生成される。

典型的には、免疫細胞は、感染細胞表面において提示された主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）を検出し、サイトカイン放出の引き金を引き、溶解またはアポトーシスを引き起こす。しかしながら、ＣＩＫ細胞は、抗体およびＭＨＣの非存在下で感染細胞またはさらに悪性細胞を認識する能力を有し、素早く不偏の免疫反応を可能にする。これは、ＭＨＣマーカーの欠落がＴリンパ球などの他の免疫細胞によって追跡および攻撃され得ない有害な細胞として、特に重要なものである。特定の特徴として、最終分化したＣＤ３＋ＣＤ５６＋ ＣＩＫ細胞は、ＭＨＣ拘束性およびＭＨＣ非拘束性の両方の抗腫瘍細胞傷害性についての能力を持つ。これらの特性は、とりわけ、がんおよびウイルス感染症に対する可能性のある療法として、ＣＩＫ細胞を魅力的なものにする。

ＮＫ細胞の新たなサブクラスは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で作出された。サイトカイン誘導メモリー様ナチュラルキラー細胞と称されるこれらのＮＫ細胞は、サイトカイン、最も一般的には、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－１８のミックスを使用して誘導される。これらのＮＫ細胞は、これらのサイトカインによって活性化されて、感染を刺激し、適応免疫応答を誘導する。腫瘍標的などの標的細胞と共培養されると、これらのＮＫ細胞は、メモリー様能力を有し、防御を開始する際に、より適応し、かつより有効である。

本発明の細胞は、上記で述べた細胞型のいずれかであり得る。

細胞は、血液試料、例えば、白血球除去物に由来し得る。細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得るか、またはそれを含み得る。

細胞は、患者自身の末梢血から（第１パーティー）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（第２パーティー）、または非関連ドナーからの末梢血（第３パーティー）のいずれかから、ｅｘ ｖｉｖｏで作出され得る。

あるいは、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞の例えばＴ細胞またはＮＫ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏ分化から誘導され得る。あるいは、その溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる不死化Ｔ細胞系が使用され得る。

細胞は、本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを提供する分子をコードする核酸で形質導入される前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって、活性化および／または拡大増殖され得る。

医薬組成物
本発明の細胞は、医薬組成物として患者に投与され得る。

医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤をさらに含んでいてもよい。医薬組成物は、必要に応じて、１種または複数のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含んでいてもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に好適な形態であってもよい。

細胞を作製するための方法
さらなる態様では、本発明は、本発明による細胞を作製するための方法であって、本発明の核酸配列、核酸構築物、ベクター、またはベクターのキットを細胞に導入するステップを含む、方法を提供する。

核酸配列、核酸構築物、ベクター、またはベクターのキットは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏの形質導入またはトランスフェクションによって導入され得る。

細胞は、対象から単離された細胞、例えば、対象から単離されたＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。

細胞は、自家または同種異系であり得る。

処置の方法
本発明は、疾患を処置するための方法であって、本発明の細胞組成物（例えば、上記の医薬組成物）を対象に投与するステップを含む、方法を提供する。

疾患を処置するための方法は、本発明の細胞組成物の治療的使用に関する。細胞組成物は、疾患に関連する少なくとも１つの症状を少なくするため、低減するため、もしくは改善するため、および／または疾患の進行を遅らせるため、低減するため、もしくは遮断するために、既存の疾患または状態を有する対象に投与され得る。

疾患を予防するための方法は、本発明の細胞組成物の予防的使用に関する。細胞組成物は、疾患の原因を予防するため、もしくは減じるため、または疾患に関連する少なくとも１つの症状の発生を低減するため、もしくは予防するために、まだ疾患に罹患していない対象および／または疾患の任意の症状を示していない対象に投与され得る。対象は、疾患の素因を有し得るか、または疾患を発生するリスクがあると考えられ得る。

方法は、
（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）そのような細胞を少なくとも２つのウイルスベクターの混合物で形質導入するステップ；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）からの細胞を対象に投与するステップ
を含み得る。

本発明は、疾患の処置および／または予防における使用のための本発明の細胞組成物も提供する。

本発明は、疾患の処置のための医薬の製造における本発明の細胞組成物の使用にも関する。

本発明の方法によって処置される疾患は、がん性疾患、例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんであり得る。

本発明の組成物の細胞は、がん細胞などの標的細胞を死滅させることが可能であり得る。標的細胞は、標的細胞の近傍の腫瘍分泌リガンドまたはケモカインリガンドの存在によって特徴付けられ得る。標的細胞は、標的細胞表面の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と一緒の可溶性リガンドの存在によって特徴付けられ得る。

特に、本発明の細胞は、固形がんを処置するために使用され得る。固形がんは、塊を形成することがない組織に散在性に浸潤し得るリンパ増殖性の悪性白血病とは対照的に、例えば、脳、乳房、前立腺、結腸直腸、腎臓の別個の腫瘤を形成する悪性腫瘍；肉腫；黒色腫である。

本発明の細胞は、表３に列挙されるがんの１つを処置するために使用され得る。

特に、本発明の細胞は、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、黒色腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、卵巣がん、膵臓がん、神経芽細胞腫、骨肉腫を処置するために使用され得る。これらの実施形態では、細胞は、ＧＤ２特異的ＣＡＲを発現し得る。

がんの不均一性およびエピトープスプレッディング
がんは不均一であり得る。この点において、ＣＡＲ標的抗原の発現のレベルは、がん細胞間で変わり得る。ＣＡＲ標的抗原を発現する腫瘍中の細胞の割合は、検出可能なレベルまたはＣＡＲ－Ｔ細胞に認識可能なレベルで標的抗原を発現し得る腫瘍中の細胞の１００％未満、例えば、約９５、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０％未満であり得る。固形がんの細胞の一部は、抗原陰性または抗原弱であり得る、すなわち、低レベルの標的抗原を発現し得る。「抗原弱」の標的細胞は、平均で、細胞あたり約１０００、７５０、５００、または２５０コピーより少ない標的抗原を発現し得る。

本発明の細胞は、ＩＬ－１２のアジュバント効果のために、不均一な腫瘍を標的にするのに特によく適している。ＩＬ－１２は、ナイーブＴ細胞およびマクロファージを活性化することによって、抗腫瘍免疫応答を活性化する。１）Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖を増強すること、２）Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージの細胞溶解活性を増加させること、３）Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞を活性化すること、ならびに４）ＩＦＮ－γおよび他のサイトカインの産生を誘導することが示されている。ＩＬ－１２は、隣接するＣＡＲ－Ｔ細胞を活性化し、それらの細胞傷害性を増強して、低レベルの標的抗原で腫瘍細胞を死滅させるそれらの能力を増強する。

ＣＡＲ Ｔ細胞療法の機構は、ＣＡＲを発現するＴ細胞による標的抗原を発現する細胞の直接死滅による。理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＬ－１２の同時局所発現が、「エピトープスプレッディング」、すなわち、腫瘍細胞上に存在するさらなる標的抗原に対する免疫応答のプライミングをもたらすと考えている。ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＬ－１２の分泌は、腫瘤への宿主免疫細胞の浸潤も誘導し得る。

そのため、Ｔ細胞から分泌されたＩＬ－１２は、腫瘍細胞によって媒介される免疫抑制を克服するだけでなく、エピトープスプレッディングのための助けとなる環境も提供し、ここで、免疫細胞は、元の抗原に加えて、多数の腫瘍関連標的を攻撃するように多様化する。腫瘍根絶の作用機構は、ＣＡＲ－Ｔ細胞による直接的な細胞死滅、腫瘍への免疫細胞の浸潤、および他の腫瘍関連抗原に対する既存の宿主免疫細胞からの抗がん免疫応答の誘導の組合せによるものである。

エピトープスプレッディングは、標的抗原が弱いまたは陰性である細胞の死滅を可能にするので、不均一な腫瘍の処置のために重要である。また、これは、悪性腫瘍がそうでなければ抗原陰性集団として再発され得る場合を予防するＣＡＲ－Ｔ細胞療法から、腫瘍の免疫逃避を防止するのを助ける。

ここに、本発明を実施例によってさらに説明するが、これは、本発明を行う際に当業者を支援する役割を果たすことを意味し、本発明の範囲を決して限定することを意図するものではない。

（実施例１）
ＣＡＲ－Ｔ細胞によるＩＬ－１２の発現
２つの導入遺伝子をコードする構築物において、ＦＭＤＶ由来２Ａペプチド配列などの自己切断ペプチドを含めることで、２つのポリペプチドのおよそ同等の発現をもたらす。構築物がＣＡＲおよびＩＬ－１２を共発現する場合、これは、ＣＡＲ－Ｔ細胞による高レベルのＩＬ－１２の分泌をもたらす（図４Ａの左側の図に概略的に示される）。

しかしながら、ＩＬ－１２コード配列の上流の「ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ」配列の組み込みは、ＣＡＲ－Ｔ細胞によって産生されるＩＬ－１２の量を劇的に低減するはずである（図４Ａの左側の図に概略的に示される）。

実験的に実証するために、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、以下の構築物をコードするウイルスで形質導入した：
ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ－１２：ＣＡＲコード配列、２Ａ自己切断ペプチド、およびｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２をコードする配列（配列番号１に示される配列を有する）を含む、ならびに
ＣＡＲ－ＳＳ－ＩＬ－１２：ＣＡＲコード配列、ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ配列（配列番号３７に示される配列を有する）、およびｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ配列の下流に位置するｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２をコードする配列を含む。

形質導入されていない細胞（ＮＴ）およびいずれかの構築物で形質導入されたＰＢＭＣを、１×１０Ｅ^６個細胞／ｍｌで９６ウェルプレートに蒔き、４８時間後、ＥＬＩＳＡによる放出されたＩＬ－１２の定量化のために、培地を収集した。結果を図４Ｂに示す。

ＩＬ－１２をコードする配列がｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ配列の下流に配置された場合に、形質導入細胞によるＩＬ－１２の産生は劇的に低減されたが、依然として検出可能であった。

（実施例２）
ｉｎ ｖｉｖｏでＩＬ－１２を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の抗腫瘍活性の調査
次に、ｉｎ ｖｉｖｏでのＳＳ－ＩＬ１２モジュールの機能性を、免疫適格マウスモデルを使用して調査した。

ＣＡＲ発現細胞を、以下の構築物を発現するベクターによるマウスＰＢＭＣの形質導入によって作出した。

ここで、「Ｔｈｙ１．１」は、形質導入マーカーであり；「ａＧＤ２＿ｍｕＫ６６６－ｍｕＣＤ８ＳＴＫ－ｍｕＣＤ２８Ｚ」は、第２世代マウスＧＤ２ ＣＡＲであり；「ｍｆＩＬ－１２」は、マウスｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２であり；「ＳＫＩＰ＿ＴＧＡＣＡＡＴＴＡ」は、マウスｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２コード配列の上流に配置された翻訳リードスルーモチーフであり；「ａＥＧＦＲｖＩＩＩ＿ＭＲ１－ｍｕＣＤ８ＳＴＫ－ｍｕＣＤ２８Ｚ」は、陰性対照として使用されるａＥＧＦＲｖＩＩＩに対する第２世代マウスＣＡＲである。

スライドの右側において、ＩＬ－１２全身毒性に起因するＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１２コホートの劇的な体重減少をチャートに見ることができ、これらのマウスは、安楽死させた。腫瘍成長制御に関して、右側において、本発明者らは、腫瘍成長が、ＣＡＲ単独コホートにおいて全く制御されなかったが、ＣＡＲ－ＳＳ－ＩＬ１２を注射されたマウスは、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１２マウスコホートによって示される毒性なしで、腫瘍成長の制御の劇的な低減を有していたことを見ることができる。
本発明者らは、ＳＳ－ＩＬ１２モジュールが、困難なマウスモデルにおいて、強力な抗腫瘍活性を維持しながら、毒性を防止すると結論付けることができる。
ｉｎ ｖｉｖｏアッセイを使用して、マウスＢ１６黒色腫モデルにおいて、ＩＬ－１２ありまたはなしで、ＧＤ２を発現するＴ細胞の抗腫瘍活性を調査した。

Ｂ１６．Ｆ１０．ＧＤ２（０．１×１０^６個）を、０日目に、マウスに皮下投与した。７日後、３×１０^６個のＣＡＲ－Ｔ細胞を静脈内投与し、腫瘍成長を、それに続いて１４日間、モニターした。

図６に示されるように、ＣＡＲ－２Ａ－ＩＬ１２コホート、すなわち、ｓｔｏｐ－ｓｋｉｐ配列なしでＩＬ－１２と組み合わせてＣＡＲを発現する細胞を受けているマウスは、ＩＬ－１２の全身毒性に起因して、劇的な体重減少を示した。これらのマウスは、１２日目の前に安楽死させた。ＣＡＲ－ＳＳ－ＩＬ１２コホート、すなわち、超低レベルのＩＬ－１２と組み合わせてＣＡＲを発現する細胞を受けているマウスは、任意の有意な体重減少またはＩＬ－１２に関連する毒性を示さなかった。

腫瘍成長アッセイの結果を図７に示す。単純なＧＤ２ ＣＡＲを単独で発現するＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内送達は、腫瘍成長に対する有意な効果がなかった（図７「ＣＡＲ」）。発現のレベルを制御する翻訳リードスルーモチーフなしでＩＬ－１２を発現するＣＡＲ－Ｔ細胞の導入は、マウスに対して致命的な毒性であった（図７「ＣＡＲ－２Ａ」）。しかしながら、ＩＬ－１２コード配列が翻訳リードスルーモチーフの下流に配置された超低レベルのＩＬ－１２を共発現するＣＡＲ Ｔ細胞の静脈内送達は、強力な抗腫瘍活性およびマウスの生存の延長を示した（図７「ＣＡＲ－ＳＳ」）。

（実施例３）
免疫応答の間のエピトープスプレッディングを誘導する超低ＩＬ－１２発現ＣＡＲ－Ｔ細胞の能力の調査
ｉｎ ｖｉｖｏでエピトープスプレッディング応答を誘導するｓｓＩＬ１２モジュールの能力を調べるために、標的細胞系を、プラスミド膜においてＧＤ２を合成するために必要な２つの前駆体酵素（ＧＤ２およびＧＤ３シンターゼ）を発現するように形質導入されたマウス黒色腫細胞系Ｂ１６．Ｆ１０から生成した。この標的細胞系は、ＧＤ２発現について１００％陽性であり、固定比での非形質導入Ｂ１６．Ｆ１０細胞の添加によって、標的細胞の不均一な集団を作製するために使用される。

生成された不均一な標的集団は、１０％、３０％、５０％、７０％、または９０％のＧＤ２陽性であり、１００％ＧＤ２陽性細胞の均一な対照と比較される。１Ｅ^５個の標的細胞を、自家レシピエントに皮下注射し、５Ｇｒａｙの全身照射の投与の前に６日間、定着させる。

翌日、３Ｅ^６個のＣＡＲ Ｔ細胞を静脈内注射する。マウスを、毒性の徴候（体重、血清サイトカイン、および一般状態）、および有効性（腫瘍サイズのキャリパー測定）について定期的にモニターする。

停止する時点で、ＣＡＲ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、および単球の割合の分析のために、マウスから脾臓を採取する。停止の時点で任意の残った腫瘍を、免疫組織化学的分析（免疫浸潤および腫瘍形態を評価するため）およびフローサイトメトリー（ＧＤ２陽性腫瘍の免疫浸潤および割合および発現レベルを評価するため）の両方のために収集する。

エピトープスプレッディングの程度を、レシピエントマウスからの不均一な標的を消失させるモジュールの能力、および／または腫瘤中で免疫浸潤を誘導するモジュールの能力によって決定する。

上記の明細書で述べたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の記載された方法およびシステムのさまざまな改変および変形形態は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明を特定の好ましい実施形態と併せて説明したが、特許請求の範囲に記載された発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連する分野における当業者に自明である、本発明を行うための記載された方法のさまざまな改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。

Claims (40)

1. 細胞を対象に投与するステップを含む、固形がんを処置するための方法であって、前記細胞が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、方法。
2. 以下のステップ：
   （ｉ）対象から細胞試料を単離するステップ；
   （ｉｉ）フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２をコードする核酸配列で、細胞試料由来の細胞をトランスフェクトまたは形質導入するステップ；および
   （ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）からの形質導入またはトランスフェクトされた細胞を前記対象に投与するステップ
   を含む、請求項１に記載の方法。
3. ＩＬ－１２をコードする前記核酸配列が、「ｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２」：リンカーによって接合されたＩＬ－１２αサブユニットおよびＩＬ－１２βサブユニットの間の融合物をコードする、請求項１または２に記載の方法。
4. ｆｌｅｘｉ－ＩＬ－１２が、配列番号１として示される配列を含む、請求項３に記載の方法。
5. インターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする前記核酸配列が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）の下流であり、前記ＦＳＭが、ウラシル塩基、チミン塩基、またはグアニン塩基のリピートを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
6. 前記ＦＳＭが、配列ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号２）を含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記ＦＳＭが、終止コドンも含む、請求項５または６に記載の方法。
8. 前記ＦＳＭが、以下の配列：
   ＵＵＵＵＵＵＵＧＡ（配列番号３）
   ＵＵＵＵＵＵＵＡＧ（配列番号４）
   ＵＵＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号５）
   の１つを含む、請求項７に記載の方法。
9. インターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする前記核酸配列が、配列ＳＴＯＰ－ＣＵＡＧまたはＳＴＯＰ－ＣＡＡＵＵＡ（ここで、「ＳＴＯＰ」は、終止コドンである）を含む翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流にある、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
10. 前記翻訳リードスルーモチーフが、以下の配列：
    ＵＧＡ－ＣＵＡＧ（配列番号６）
    ＵＡＧ－ＣＵＡＧ（配列番号７）
    ＵＡＡ－ＣＵＡＧ（配列番号８）
    ＵＧＡ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号９）
    ＵＡＧ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号１０）
    ＵＡＡ－ＣＡＡＵＵＡ（配列番号１１）
    の１つを含む、請求項９に記載の方法。
11. 前記細胞が、腫瘍浸潤性免疫細胞である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
12. 前記細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫＴ細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、単球、マクロファージ、または腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
14. 前記ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲが、以下の標的抗原：ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）、上皮性増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、ヒト上皮性増殖因子受容体（ＨＥＲ２）、Ｌ１ＣＡＭ、ムチン１（ＭＵＣ１）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の１つに結合する、請求項１２または１３に記載の方法。
15. 前記細胞が、ＧＤ２に結合するＣＡＲを発現し、
    ａ）以下の配列：
    ＣＤＲ１－ＳＹＮＩＨ（配列番号１２）
    ＣＤＲ２－ＶＩＷＡＧＧＳＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号１３）
    ＣＤＲ３－ＲＳＤＤＹＳＷＦＡＹ（配列番号１４）
    を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
    ｂ）以下の配列：
    ＣＤＲ１－ＲＡＳＳＳＶＳＳＳＹＬＨ（配列番号１５）
    ＣＤＲ２－ＳＴＳＮＬＡＳ（配列番号１６）
    ＣＤＲ３－ＱＱＹＳＧＹＰＩＴ（配列番号１７）
    を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
    を含む抗原結合ドメインを有する、請求項１４に記載の方法。
16. 前記細胞が、ＰＳＭＡと結合するＣＡＲを発現し、
    ａ）以下の配列：
    ＣＤＲ１－ＳＳＷＭＮ（配列番号１８）
    ＣＤＲ２－ＲＩＹＰＧＤＧＤＴＮＹＡＱＫＦＱＧ（配列番号１９）
    ＣＤＲ３－ＧＴＧＹＬＷＹＦＤＶ（配列番号２０）
    を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）；および
    ｂ）以下の配列：
    ＣＤＲ１－ＲＡＳＱＤＩＮＥＮＬＡ（配列番号２１）
    ＣＤＲ２－ＹＴＳＮＲＡＴ（配列番号２２）
    ＣＤＲ３－ＱＱＹＤＮＬＰＦＴ（配列番号２３）
    を有するＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）
    を含む抗原結合ドメインを有する、請求項１４に記載の方法。
17. 前記細胞が、ドミナントネガティブＳＨＰ２および／またはドミナントネガティブＴＧＦβ受容体も発現する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
18. 前記細胞が、キメラサイトカイン受容体も発現する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
19. 前記細胞が、１つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインも発現する、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
20. 前記細胞が、以下：ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２の１つまたは複数を発現する、請求項１９に記載の方法。
21. 前記細胞が、ＩＬ－７およびＣＣＬ１９を発現する、請求項２０に記載の方法。
22. 前記細胞が、ＩＬ－１５および／またはＣＸＣＬ１２を発現する、請求項２０に記載の方法。
23. 前記またはそれぞれのさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする核酸が、前記フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の上流に位置する、請求項１９～２２のいずれかに記載の方法。
24. 前記またはそれぞれのさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする核酸が、前記フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流に位置する、請求項１９～２２のいずれかに記載の方法。
25. 小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、黒色腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、卵巣がん、膵臓がん、神経芽細胞腫、骨肉腫の処置のための、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
26. 前記細胞が、標的抗原と結合するＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現し、固形腫瘍上の前記標的抗原の発現が、不均一である、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
27. 対象における抗腫瘍免疫応答のエピトープスプレッディングを誘導するための方法であって、先行する請求項のいずれかに定義される複数の細胞を前記対象に投与するステップを含む、方法。
28. 対象における腫瘤への免疫細胞の浸潤を誘導するための方法であって、先行する請求項のいずれか一項に定義される複数の細胞を、それらが抗腫瘍免疫応答を誘導するように、前記対象に投与するステップを含む、方法。
29. 固形がんの処置における使用のための細胞であって、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、細胞。
30. 固形がんを処置するための医薬の製造における細胞の使用であって、前記細胞が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列を含む、使用。
31. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、
    フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列；および
    １つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする１つまたは複数の異種核酸配列
    を含む、細胞。
32. 前記１つまたは複数の異種核酸配列が、以下：ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＣＣＬ１９、ＣＸＣＬ１２の１つまたは複数をコードする、請求項２５に記載の細胞。
33. 前記１つまたは複数の異種核酸配列が、ＩＬ－７およびＣＣＬ１９をコードする、請求項２５に記載の細胞。
34. 前記１つまたは複数の異種核酸配列が、ＩＬ－１５および／またはＣＸＣＬ１２をコードする、請求項２５に記載の細胞。
35. １つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする前記異種核酸配列の１つまたは複数が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の上流に位置する、請求項３１～３４のいずれかに記載の細胞。
36. １つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする前記異種核酸配列の１つまたは複数が、フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流に位置する、請求項３１～３４のいずれかに記載の細胞。
37. （ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸配列；および
    （ｉｉ）フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）の下流のインターロイキン１２（ＩＬ－１２）をコードする核酸配列；
    （ｖｉ）請求項３２～３６のいずれか一項に定義される１つまたは複数のさらなるサイトカインまたはケモカインをコードする１つまたは複数の核酸配列
    を含む、核酸構築物。
38. 請求項３７に記載の核酸構築物を含むベクター。
39. 請求項３７に定義される１つまたは複数の核酸配列をそれぞれコードする、ベクターのキット。
40. 請求項３１～３６のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、細胞を請求項３７に記載の核酸構築物、請求項３８に記載のベクター、または請求項３９に記載のベクターのキットによりｅｘ ｖｉｖｏでトランスフェクトまたは形質導入するステップを含む、方法。

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