KR20210036622A - IL-32γ 단백질을 발현하는 면역 세포 및 그 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 IL-32γ, IFN-γ, IL-32γ 또는 이의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질이 발현되도록 형질전환된 면역세포 및 이 형질전환된 면역세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 형질전환된 면역세포는 암세포에 대한 세포 독성 활성이 크게 향상되어, 암의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

IL-32γ 단백질을 발현하는 면역 세포 및 그 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물{Immune Cell Expressing IL-32γ and Pharmaceutical Composition Comprising the Same As Active Ingredient}

본 발명은 IL-32γ 단백질을 발현하는 면역 세포 및 그 면역 세포를 유효성분으로 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

암 치료는 기존에 각광받던 표적치료제에서 면역치료제로 ‘패러다임 시프트’가 이루어지고 있으며, 최근 3-4년 사이 면역요법의 암 치료는 한 단계 더 진보하여 효과를 입증하는 물질들이 개발되었다. 항암 면역세포치료제는 면역치료제의 한 종류로 면역세포인 수지상세포, NK 세포, T 세포 등의 면역세포들을 이용하여 체내의 면역반응을 활성화시켜 암을 치료할 목적으로 사용되는 의약품이다.

인터페론-감마(Interferon-γ, IFN-γ)는 면역체계 세포 뿐만 아니라 병원균에 감염된 모든 인간 세포에서 생성된다. IFN-γ은 여러 기능을 가진 사이토카인(cytokine)으로 항바이러스, 항증식, 항암 및 면역 조절 효과를 가지고 있다. IFN-γ의 세포막 수용체는 IFN-γ R1과 IFN-γ R2로 이루어져 있으며, JAK(Janus kinase)-signal transducer 또는 STAT1 (activator of transcription 1)에 의하여 신호전달이 이루어진다. IFN-γ에 대한 세포막 수용체는 2개의 서브유닛인 IFN-γ R1 및 IFN-γ R2로 구성된다. IFN-γ 수용체에 IFN-γ가 결합하면 IFN-γ 수용체는 야누스 티로신 키나아제(Janus tyrosine kinase)인 JAK1 및 JAK2와 빠르게 결합한다. JAK 효소들은 서로를 인산화시키고, IFN-γ의 수용체를 인산화한다. 상기 인산화 과정을 통해 IFN-γ의 세포막 수용체는 전사 인자인 STAT1(signal transducer and activator of transcription)의 결합부위를 만든다.

인터루킨-32(Interleukin-32, IL-32)는 비교적 최근에 규명된 T 세포와 NK 세포에서 발현되는 친염증성(pro-inflammatory) 사이토카인으로, 단핵구세포(monocyte), 대식세포(macrophage)와 같은 항원제시세포를 자극하여 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor-alpha, TNF-α)와 인터루킨-6(Interluekin-6, IL-6)의 생산을 유도하는 것으로 알려져 있다. 7개의 이소폼(isoform)이 존재하며 이 중 가장 긴 전사물(transcript)인 IL-32γ 이소폼(isoform)은 NK 세포에서 주로 발현된다. 최근에 다양한 질환과 연관한 IL-32에 대한 많은 연구들이 이루어지면서 최근 IL-32γ의 항바이러스 효능 및 항암 효능에 대한 흥미로운 결과들이 보고되고 있다.

세포내 효과기(intracellular effector)로서 IL-32γ가 간세포 내부에서 세포내 신호전달을 조절함으로써 만성 간염의 주원인인 B형 간염바이러스의 전사와 복제를 직접 막아내는 강력한 항바이러스 효과를 나타낸다는 연구결과가 보고되었다(Kim et al., Nat comm 2018. 9:3284). 하지만, 아직 면역세포 및 면역시스템에서 IL-32γ의 기능 및 효능에 대한 연구결과는 보고된 바가 없다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

Nature Communications volume 9, Article number: 3284 (2018)"Intracellular interleukin-32γ mediates antiviral activity of cytokines against hepatitis B virus"

본 발명의 목적은 엔지니어링된 사이토카인 단백질을 발현하도록 형질전환되어, 보다 강력한 항암효과를 가지는 면역세포를 제조하여 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 면역세포를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

상기 과제를 해결하기 위해,

본 발명은, (i) IL-32γ 단백질; (ⅱ) IFN-γ 단백질; (ⅲ) IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합 단백질; 또는 (ⅳ) IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질이 발현되도록 형질전환된 면역세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환된 면역세포를 유효성분으로 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명은 암세포에 대해 보다 강력한 세포독성을 보이는 IL-32γ 단백질을 발현하는 면역세포에 관한 것이다. 이러한 항암 효과를 갖는 본 발명의 형질전환된 면역세포는 암의 치료 및 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.

도 1은 IL-32γ 단백질 발현 NK 세포를 확립하였음을 보여주는 결과이다. 본 발명에서 제작한 IL-32γ 단백질, 또는 IL-32γ와 IFNγ와의 융합단백질을 발현하는 NK 세포에서의 각 단백질들의 발현을 웨스턴 블롯(패널 A)과, 유세포분석(패널 B)으로 확인한 결과이다.
도 2는 K562 암세포에 대한 IL-32γ 단백질, 또는 IL-32γ와 IFNγ와의 융합단백질을 발현하는 NK 세포의 세포독성을 보여주는 그래프이다.
도 3는 K562 암세포에 대한 IL-32γ 단백질, 또는 IL-32γ와 IFNγ와의 융합단백질이 발현된 NK 세포의 세포독성능력을 다양한 E:T 비율로 확인한 그래프(패널 A)이며, 그에 따른 그랜자임(granzyme) B 분비 변화(패널 B)를 보여주는 그래프이다.
도 4는 RPMI8226, IM9, MM.1R, H929와 같은 다발골수종 세포주에 대한 IL-32γ 단백질, 또는 IL-32γ와 IFNγ와의 융합단백질을 발현하는 NK 세포의 세포독성효과를 보여주는 그래프이다.

본 발명자들은 IL-32γ 단백질, IFN-γ 단백질, IL-32γ 단백질 또는 이의 단편과 IFN-γ와의 융합단백질이 발현되도록 형질전환된 면역세포를 암 치료에 사용하면, 면역세포의 항암 효과가 상승적으로 극대화될 수 있음을 실험적으로 확인하여 본 발명을 완성하였다.

이하에서 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은

(i) IL-32γ 단백질;

(ⅱ) IFN-γ 단백질;

(ⅲ) IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합 단백질; 또는

(ⅳ) IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질의 형태가 발현되도록 형질전환된 면역세포를 제공한다.

본 발명에서 용어 “IFN-γ” 또는 “IFN-γ 단백질”은 인간 IFN-γ 유전자가 발현된 단백질을 의미한다.

상기 IFN-γ 단백질은 인터페론 타입 Ⅱ 클래스에 속하는 이량성 가용성 사이토카인이다(Nature 298 (5877)859-63, "Structure of the human immune interferon gene"). 인간에서 IFN-γ 단백질은 IFNG 유전자에 의해 코딩된다(Naylor SL, et al., March 1983, "Human immune interferon gene is located on chromosome 12". J.Exp. Med. 157 (3): 10207; "Entrez Gene: IFNGR2"). IFN-γ은 바이러스, 박테리아, 원생동물에 대한 선천성 및 후천성 면역에서 매우 중요한 역할을 하는 사이토카인이고, 대식세포의 중요한 활성자이면서 클래스 Ⅱ MHC(major histocompatibility complex) 분자 발현 유도자이다. IFN-γ는 바이러스 복제를 직접적으로 억제할 뿐만 아니라 면역촉진 및 면역조절자로서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. IFN-γ는 자연살해세포(natural killer cell, NK cell) 및 자연살해 T 세포(natural killer T cell, NKT cell)에 의해 생성되고, 항원-특이적 면역이 전개되면 CD4 Th1 및 CD8 CTL(cytotoxic T lymphocyte) 효과기(effector) 세포에 의해서도 생성된다(Schoenborn JR, Wilson CB (2007). "Regulation of interferon-gamma during innate and adaptive immune responses". Adv. Immunol. 96: 41101). IFN-γ는 항바이러스 활성, 면역조절활성 및 항종양 활성을 갖는다(Schroder K, et al., February 2004, "Interferon-gamma: an overview of signals, mechanisms and functions". J. Leukoc. Biol. 75 (2): 16389).

본 발명의 일 구현예에서, 상기 IFN-γ 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4에 개시된 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 용어 “IL-32γ 단백질”는 인간 IL-32γ 유전자로부터 발현되는 단백질을 의미한다.

IL-32 단백질은 인간 IL-32 유전자에 의해 코딩되는 단백질로서, NK 세포, 혈액단핵세포, T 림프구 및 상피세포 등에서 생성되며 7개의 스플라이싱 변이체인 IL-32α, IL-32β, IL-32γ, IL-32δ, IL-32ε, IL-32ζ 및 IL-32θ가 존재하는 것으로 알려져 있다. IL-32는 면역세포들이 TNF-α 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인을 분비하도록 유도할 수 있는 염증 유도 사이토카인으로 역할을 하며, IL-8 및 MIP-2/CXCL2와 같은 케모카인의 생성도 유도할 수 있다(Kim SH, et al., January 2005. "Interleukin-32: a cytokine and inducer of TNFalpha". Immunity 22 (1):13142). 또한, IL-32는 MAPK/ERK 경로 및 액틴 세포골격을 조절함으로써 파골세포 분화를 촉진하나 파골세포의 활성화는 촉진하지 않는 것으로 알려져 있다(Mabilleau G, Sabokbar A (2009). "Interleukin-32 promotes osteoclast differentiation but not osteoclast activation". PLoS ONE 4 (1): e4173).

본 발명의 일 구현예에서, IL-32γ 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에서 상기 IL-32γ 단백질 뿐만 아니라 이의 절단된 형태 또는 이들과 IFN-γ와의 융합단백질로 발현시키는 경우 형질전환된 면역세포의 항암효과를 상승적으로 향상시킨다.

본 발명에서 용어 “IL-32γ 단백질의 절단된 형태”는 상승적 항암 효과를 유지하거나 더욱 증강시키는 범위내이면 어떠한 형태로 절단된 형태이든 모두 포함하는 의미이다.

본 발명에서 용어 “IL-32γ 단백질의 절단된 형태”는 “IL-32γ 단백질의 절편” 또는 “IL-32γ 단백질의 단편”과 동일한 의미로 혼용된다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 IL-32γ 단백질의 절단된 형태는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7, 및 서열번호 8로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 융합 단백질은 IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합 단백질 형태, 또는 IL-32γ의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합 단백질은 서열번호 1 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열; 및 서열번호 5, 6, 7 및 8로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상술한 융합단백질들에서 IL-32γ 단백질 또는 이의 단편과, IFN-γ이 링커(linker)를 통해 서로 연결될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 링커는 아미노산의 서열로 이루어지는 펩타이드 링커일 수 있다.

단백질 또는 펩타이드 사이를 연결하여 융합단백질 제조에 사용될 수 있는 펩타이드 링커에 대한 내용은 문헌 Argos, P. (1990) J, Mol. Biol., 211, 943-958; Alfthan, K et al., (1995) Protein Eng., 8, 725-731; Suzuki, C., et al., (1999) J. Immunol. Methods, 224, 171-184에 기재되어 있으며, 이들 문헌은 본 명세서에 참조로써 삽입된다.

또한, 상기 펩타이드 링커는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 이소루신(isoleucine), 발린(valine), 글루타민산(glutamic acid), 아스파라진(asparagine), 시스테인(cysteine), 라이신(lysine), 메티오닌(methionine), 세린(serine), 트레오닌(threonine), 루신(leucine), 글루타민(glutamine), 및 페닐알라닌(phenylalanine)으로 이루어지는 아미노산 군에서 선택된 2-100개의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.

본 발명에서 링커는 IL-32γ 단백질 및 IFN-γ 단백질의 기능을 유지하면서 상기 2가지 단백질을 연결하는 역할을 한다면 아무런 제한 없이 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 일 구현예에서, 상기 링커는 서열번호 11에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 1 및 서열번호 4의 아미노산 서열이 서열번호 11의 서열의 링커 펩타이드에 의해 연결된 형태이거나;

또는 서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열이 서열번호 11의 서열의 링커 펩타이드에 의해 연결된 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 3의 아미노산 서열과; 서열번호 5, 6, 7 및 8로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열이 서열번호 11의 서열의 링커 펩타이드에 의해 연결된 형태일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, IL-32γ, 이의 단편, IFN-γ 또는 이들이 융합된 융합 단백질은 신호 펩타이드를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 “신호 펩타이드(signal peptide)”는 예를 들어, 소포체(endoplasmic reticulum)와 같은 특정 세포 소기관 및/또는 세포 표면과 같이 세포 내에서 단백질의 수송 및 위치를 지정하는 펩타이드 서열을 지칭한다.

본 발명에서 신호 펩타이드는 IL-32γ 단백질, 이의 단편, IFN-γ 단백질, 또는 이들의 융합 단백질의 말단, 특히 N-말단에 연결될 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 상기 신호 펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10에 개시된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에서, 면역세포는 NK(natural killer) 세포, T 세포, 세포독성(cytotoxic) T 세포, 조절(regulatory) T 세포, B 세포, 또는 NK-T 세포이며, 보다 바람직하게는 NK 세포 또는 T 세포일 수 있다.

바람직하게는 상기 세포는 인간 유래 면역 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 NK 세포일 수 있다.

본 발명에서 형질전환된 면역세포는 상술한 (i) IL-32γ 단백질; (ⅱ) IFN-γ 단백질; (ⅲ) IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합 단백질; 또는 (ⅳ) IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 면역세포에 안정적으로 도입하여 제조할 수 있다.

본 발명에서 용어 “코딩”은 천연 상태에서 또는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 조작될 때, 폴리펩티드 및/또는 그의 단편에 대한 mRNA를 제조하기 위해 전사 및/또는 번역될 수 있는 경우, 폴리펩티드를 “코딩”한다고 언급되는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본 발명에서 용어 “폴리뉴클레오타이드(polynucleotide)”는 상호 교환적으로 사용되며 리보뉴클레오티드 또는 디옥시리보뉴클레오티드 중 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머형태를 지칭한다. 상기 용어 폴리뉴클레오타이드는 단일, 이중, 또는 다중가닥 DNA 또는 RNA, 게놈 DNA, cDNA, DNA-RNA 하이브리드(hybrid), 또는 퓨린 및 피리미딘 염기 또는 다른 자연적, 화학적 또는 생화학적으로 변형된, 비자연적, 또는 유도체화된(derivatized) 뉴클레오타이드 염기를 포함하는 폴리머를 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.

본 발명에서 상기 발현 목적 단백질들을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 코돈(codon)의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 단백질을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에서, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터는 당 분야에 공지된 벡터를 다양하게 사용할 수 있고, 상기 단백질을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.

본 발명의 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다.

본 발명에서 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 앰피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신, 푸로마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.

본 발명에서 상기 재조합 벡터는 면역세포에 형질도입 또는 형질전환될 수 있다.

본 발명에서 용어 “형질도입(transduction)” 또는 “트랜스펙션(transfection)“은 외래 뉴클레오티드 서열이 세포 내로 도입되는 과정을 의미한다.

본 발명의 재조합 벡터를 세포내로 도입하는 방법은 공지된 트랜스펙션(transfection) 방법을 사용할 수 있으며, 예를 들어 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell 22, 479 (1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology 52, 456 (1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J. 1, 841 (1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10, 87 (1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol. Cell Biol. 5, 1188-1190 (1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 9568-9572 (1990)) 등이 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 세포는 면역세포이고, 바람직하게는 NK (natural killer) 세포, T 세포, 세포독성 (cytotoxic) T 세포 또는 조절 (regulatory) T 세포일 수 있다. 바람직하게는 상기 세포는 인간 유래 면역 세포이며, 보다 바람직하게는 인간 유래 NK 세포일 수 있다.

본 발명에서 용어 “T 세포”는 흉선에서 성숙하는 림프구의 종류를 지칭한다. T 세포는 세포-매개 면역에서 중요한 역할을 하며, 세포 표면에 T 세포 수용체의 존재에 의해 B 림프구와 같은 다른 림프구와 구별된다. T 세포는 또한 분리되거나 상업적으로 이용가능한 공급원으로부터 얻을 수 있다. T 세포는 헬퍼 T 세포(CD4+ cells), 세포독성(cytotoxic) T 세포(CD8+ cells), 자연살해 T 세포(NKT cells), 조절 T 세포(Treg) 및 감마-델타 T 세포를 포함하여 CD3을 발현하는 모든 종류의 면역세포를 포함한다. “세포독성 세포”는 세포독성 반응을 매개할 수 있는 CD8+ T 세포, NK(natural-killer) 세포, 및 호중구를 포함한다.

본 발명에서 용어 “NK 세포”는 자연살해세포(natural killer cell)로도 알려져 있으며, 선천성 면역 체계(innate immune system)에서 중요한 역할을 하는, 골수에서 유래한 림프구의 종류를 지칭한다. 세포 표면에 주요 조직 적합 유전자 복합체(major histocompatibility complex) 또는 항체가 없어도, NK 세포는 바이러스 감염된 세포, 종양 세포 또는 다른 스트레스를 받은 세포(stressed cell)에 대한 빠른 면역 반응을 제공한다. 상업적 NK 세포주의 비제한적 예시는 NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™)을 포함한다. 추가적인 예시는 NK 세포주 HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90, YT 및 NK101를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 이러한 상업적으로 이용가능한 세포주의 비제한적 예시적 공급원은 American Type Culture Collection, 또는 ATCC, (http://www.atcc.org/) 및 the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)를 포함한다.

본 발명에서 형질전환된 세포를 선별하는 단계는 상술한 벡터의 선택표지에 의해 발현되는 표현형(phenotype)을 이용하여, 용이하게 실시할 수 있다. 예컨대, 상기 선택표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환된 세포를 용이하게 선별할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기 설명된 형질전환된 면역세포를 유효성분으로 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 용어 “치료”는 (a) 질환 또는 질병의 발전의 억제; (b) 질환 또는 질병의 경감; 및 (c) 질환 또는 질환의 제거를 의미한다.

본 발명에서 용어 "예방"은 질환 또는 질병을 보유하고 있다고 진단된 적은 없으나, 이러한 질환 또는 질병에 걸리기 쉬운 경향이 있는 동물에서 질환 또는 질병의 발생을 억제하는 것을 의미한다.

본 발명에서 치료 대상 질병인 암(cancer)은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적 특성, 주위 조직에 침투하는 침윤적 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 치료 대상 암은 간암, 위암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 다발골수종, 난소암, 신장암, 담낭암, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수모구성 백혈병(AML), 고형 조직 육종, 난소선암, 방광 이행성 세포암, 신장 투명 세포암, 편평세포 폐암, 또는 자궁암일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 약학적 조성물은 전형적으로 세포를 포함하는 현탁액 형태의 주사제로 제조될 수 있다. 주사에 적합한 제약 형태는 용액 또는 분산액의 즉시 준비가 가능한 멸균 수성 용액 또는 분산액을 포함한다. 모든 경우에 주사액 형태의 제약제는 멸균되어야 하며, 주사가 용이할 정도로 유동성이 있어야 한다.

본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

상기 용어 "약학적으로 허용되는"은 사람에게 투여되었을 때 알레르기 반응이나 유사한 불리한 반응을 야기하지 않는다는 것을 의미한다. 이러한 담체로는 특정 용매, 분산매질, 코팅제, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제 등을 포함한다. 약학적으로 활성인 물질에 이러한 매질 및 제제를 사용하는 것은 당업계에 공지되어 있다.

약학적 조성물의 담체는, 예를 들어 물, 식염수, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌글리콜 및 액상 폴리에틸렌글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물유를 함유하는 용매 또는 분산매질일 수 있다. 레시틴과 같은 코팅제의 사용에 의해 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 오염을 막기 위해 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등과 같은 다양한 항균제 및 항진균제가 포함될 수 있으며, 당 또는 염화나트륨 등의 등장제도 포함될 수 있다. 또한, 체내 투여시 흡수작용을 연장시키기 위해 조성물에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴를 포함시킬 수 있다. 멸균 주사 용액은, 필요에 따라 상기 언급된 여러 다른 성분들을 가진 적합한 용매에 필요한 양의 활성 화합물을 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조된다.

본 발명의 약학적 조성물은 바람직하게는 비경구, 복강내, 진피내, 근육내, 정맥내 경로로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 제형과 양립되는 방식으로 치료적으로 효과적인 양으로 투여된다. 또한, 치료될 대상의 상태 또는 조건에 따라 투여량을 조절할 수 있다. 수성의 주사 용액으로 비경구 투여하기 위하여, 용액은 필요에 따라 적합하게 완충되어야 하며, 먼저 액체 희석제를 충분한 식염수 또는 글루코오스로 등장성으로 만든다. 이들 특수한 수성 용액은 특히 정맥내, 근육내, 피하, 진피내 및 복강내 투여에 적합하다.

본 발명의 약학적 조성물에 사용될 수 있는 담체 및 제제, 매질에 대한 내용은 당업계에 공지되어 있다 ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 1995, 15판 참조).

실시예

실시예 1: 세포 배양 및 배양 조건

K562, RPMI8226, IM9, MM1.R, H929 등의 암세포들은 RPMI 1640 배지에서 배양하였다. NK 세포 배양 시에는 MEM-α (no nucelosides) 배지를 사용하였으며 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 100 U/ml의 재조합 IL-2를 첨가하였다. 모든 배지에는 열-불활성화한 10% FBS, 2mM L-글루타민, 100 U/ml 페니실린, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신을 첨가하였다.

실시예 2: IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ와 IFN-γ와의 융합단백질을 발현하는 NK 세포의 제조

하기 표 1에 본 발명에서 사용한 IL-32γ 단백질, 이의 단편, IFN-γ, 링커 펩타이드, 및 태그(Strep-Taq)의 아미노산 서열들을 정리하여 나타내었다. 본 발명에서 사용한 각 단백질의 아미노산 서열은 동물 세포에서의 단백질 발현에 적합하도록 코돈 최적화(Codon optimization)하여 핵산 서열로 변환하였고, 이를 PCR 또는 유전자 합성으로 각기 다른 다양한 형태의 IL-32γ 단백질 또는 IL-32γ와 IFN-γ와의 융합단백질을 코딩하는 유전자들을 확보하였다. 본 발명에서 사용한 다양한 형태의 IL-32γ 단백질 또는 융합 단백질은 다음과 같은 서열들의 조합으로 제조하였다.

(ⅰ) IL-32γ 단백질: 서열번호 1의 서열;

(ⅱ) IFN-γ 단백질: 서열번호 3의 서열;

(ⅲ) IL-32γ/IFN-γ 융합단백질 1: 서열번호 3 및 5의 서열을 서열번호 11의 서열(링커 펩타이드)로 연결;

(ⅳ) IL-32γ/IFN-γ 융합단백질 2: 서열번호 3 및 서열번호 6의 서열을 서열번호 11의 서열(링커 펩타이드)로 연결;

(ⅴ) IL-32γ/IFN-γ 융합단백질 3: 서열번호 3 및 서열번호 7의 서열을 서열번호 11의 서열(링커 펩타이드)로 연결;

(ⅵ) IL-32γ/IFN-γ 융합단백질 4: 서열번호 3 및 서열번호 8의 서열을 서열번호 11의 서열(링커 펩타이드)로 연결.

상기와 같은 서열들의 C-말단에 Strep-Tag 서열(서열번호 12)을 연결하고, 이와 같은 서열번호들로 표시되는 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 준비하여 벡터에 클로닝 하였다. LONZA사의 Nucleofector Cell Line Nucleofector® Kit (Lonza)을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 NK 세포에 목적 유전자를 도입(transfection)하였다. 트랜스펙션 후에 세포는 0.1 mM 2-머캅토에탄올(mercaptoethanol)과 100 U/ml의 재조합 IL-2이 포함된 MEM-α 배지에서 48시간 안정화시킨 후 푸로마이신(puromycin) 또는 게네티신(Geneticin, G418)의 항생제를 사용하여 형질전환된 세포만을 선별(selection) 배양하여 NK 세포주를 확립하였다.

서열번호	서 열 정 보	설명
1	MCFPKVLSDDMKKLKARMVMLLPTSAQGLGAWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDKVMRWFQAMLQRLQTWWHGVLAWVKEKVVALVHAVQALWKQFQSFCCSLSELFMSSFQSYGAPRGDKEELTPQKCSEPQSSK	IL-32γ
2	AWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDKVMRWFQAMLQRLQTWWHGVLAWVKEKVVALVHAVQALWKQFQSFCCSLSELFMSSFQSYGAPRGDKEELTPQKCSEPQSSK	IL-32γ (신호 펩타이드 제외)
3	MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYCQDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ	IFN-γ
4	QDPYVKEAENLKKYFNAGHSDVADNGTLFLGILKNWKEESDRKIMQSQIVSFYFKLFKNFKDDQSIQKSVETIKEDMNVKFFNSNKKKRDDFEKLTNYSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQMLFRGRRASQ	IFN-γ (신호펩타이드 제외)
5	AWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDKVMRWFQAMLQRLQTWWHGVLAWVKEKVVALVHAVQALWKQFQSFCCSLSELFMSSFQSYGAPRGDKEELTPQKCSEPQSSK	IL-32γ 단편 1
6	AWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDK	IL-32γ 단편 2
7	SSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEEQHPELTPLLEKERDGLRCRGNRSPVPDVEDPATEEPGESFCDK	IL-32γ 단편 3
8	AWVSACDTEDTVGHLGPWRDKDPALWCQLCLSSQHQAIERFYDKMQNAESGRGQVMSSLAELEDDFKEGYLETVAAYYEE	IL-32γ 단편 4
9	MKYTSYILAFQLCIVLGSLGCYC	신호 펩타이드 1
10	MCFPKVLSDDMKKLKARMVMLLPTSAQGLG	신호 펩타이드 2
11	GGGGSGGGGS	링커 펩타이드
12	NWSHPQFEKGGGGSGGGGSNWSHPQFEK	Strep-tag

실시예 3: 유전자 도입 NK 세포의 단백질 발현 확인

IL-32γ 단백질, IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합단백질, 또는 IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합단백질을 발현하는 NK 세포에서 각각의 유전자의 발현을 IL-32γ 또는 IFN-γ 항체를 사용하여 전세포 용해물(whole cell Lysate, Lysate)로 세포내 단백질 발현을, 세포배양액(Sup)으로 세포 외로 분비된 단백질을 웨스턴 블롯(Western blot)으로 각각 확인하였다. 그 결과, 제작된 NK 세포에서 도입된 유전자가 모두 정상적으로 발현함을 확인하였다(도 1의 패널 A). 또한, 도입된 유전자의 각 단백질의 C-말단에 있는 태그(Strep-taq)에 대한 항체를 사용하여 각각의 단백질의 NK 세포내에서 유전자 발현을 유세포 분석(Flow cytometry)으로 확인하였다(도 1의 패널 B).

실시예 4: IL-32γ와 IFN-γ와의 융합단백질 발현에 의한 NK 세포의 세포살상 효능 향상

세포독성분석 방법으로 표적 세포(Target cell; T)에 1 X 10⁶ 세포(cells) 당 최종 농도(final concentration) 0.5μM이 되도록 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester)을 넣어 5％ CO₂, 37℃의 환경에서 30분 염색 후 PBS로 3회 세척한 후 96-웰 라운드 보텀 플레이트(96-well round bottom plate)에 4 x 10⁴ 개씩 분주하였다. NK 세포(Effector cell; E)를 E:T ratio를 1:1, 또는 0.3:1, 0.1:1 의 비율에 맞춰 웰(well)에 분주한 후 5％ CO₂, 37℃의 환경에서 4 시간 반응시켰다. PBS로 3회 세척한 후 1％ BSA/PBS 100㎕에 부유하고 각 웰에 7-AAD 5 ㎕를 첨가하여 빛을 차단한 상태로 4℃에서 30분 반응하여, 다시 PBS를 이용하여 세포를 2회 세척하였다. 이후 NK 세포를 1％ BSA/PBS에 부유시킨 후 유세포분석기(Flow cytometry)를 사용하여 NK 세포에 의한 세포독성을 비교 분석하였다.

IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합단백질, 또는 IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합단백질이 발현되는 NK 세포가, IL-32γ 단백질 또는 IFN-γ 단백질만이 단독으로 발현되는 NK 세포에 비하여 세포살상 효능이 높음을 확인하였다.

본 발명에서 제조한 NK 세포들의 효능을 K562 세포에 대한 세포독성으로 비교해 본 결과, IL-32γ 또는 IFN-γ 단백질 단독으로 발현하는 NK 세포(NK-IL32γ 또는 NK-IFNγ)의 세포독성이 대조군 NK 세포(NK-Ctrl)에 비해 2배 이상 높게 나타나는데, IL-32γ와 IFN-γ와의 융합단백질을 발현하는 NK 세포(NK-IL32γ/IFNγ1)는 NK-IL32γ 또는 NK-IFNγ 세포보다도 2배 정도 더 높은 세포독성을 보여주었다(도 2). 또한 K562 암세포에 대한 NK 세포의 비율을 0.1, 0.3, 1로 증가함에 따라 세포 살해능이 증가하고 그랜자임(granzyme) B 분비량도 증가하는 것을 확인하였다(도 3).

K562 세포에서 보여준 결과와 같이, 다발골수종 세포주 RPMI8226, IM9, MM.1R, H929 4종에 대해서도 대조군 NK 세포(NK-Ctrl), IL-32γ 또는 IFN-γ 단백질을 단독으로 발현하는 NK 세포(NK-IL32γ 또는 NK-IFNγ)에 비해, IL-32γ와 IFN-γ와의 융합단백질이 발현되는 NK-IL32γ/IFNγ1 세포에서 가장 높은 세포독성능을 나타냈다(도 4).

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

<110> Chungbuk National University Industry University Cooperation Foundation <120> Immune Cell Expressing IL-32 gamma and Pharmaceutical Composition Comprising the Same As Active Ingredient <130> DPB192769 <160> 12 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Cys Phe Pro Lys Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Met Val Met Leu Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly Ala Trp 20 25 30 Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly Pro Trp 35 40 45 Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser Ser Gln 50 55 60 His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala Glu Ser 65 70 75 80 Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp Asp Phe 85 90 95 Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu Gln His 100 105 110 Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu Arg Cys 115 120 125 Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala Thr Glu 130 135 140 Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe Gln Ala 145 150 155 160 Met Leu Gln Arg Leu Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala Trp Val 165 170 175 Lys Glu Lys Val Val Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu Trp Lys 180 185 190 Gln Phe Gln Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met Ser Ser 195 200 205 Phe Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu Thr Pro 210 215 220 Gln Lys Cys Ser Glu Pro Gln Ser Ser Lys 225 230 <210> 2 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Trp Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly 1 5 10 15 Pro Trp Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser 20 25 30 Ser Gln His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala 35 40 45 Glu Ser Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Asp Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu 65 70 75 80 Gln His Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu 85 90 95 Arg Cys Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala 100 105 110 Thr Glu Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe 115 120 125 Gln Ala Met Leu Gln Arg Leu Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala 130 135 140 Trp Val Lys Glu Lys Val Val Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu 145 150 155 160 Trp Lys Gln Phe Gln Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met 165 170 175 Ser Ser Phe Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu 180 185 190 Thr Pro Gln Lys Cys Ser Glu Pro Gln Ser Ser Lys 195 200 <210> 3 <211> 166 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu 20 25 30 Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn 35 40 45 Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp 50 55 60 Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75 80 Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile 85 90 95 Lys Glu Asp Met Asn Val Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg 100 105 110 Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val 115 120 125 Gln Arg Lys Ala Ile His Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser 130 135 140 Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg 145 150 155 160 Gly Arg Arg Ala Ser Gln 165 <210> 4 <211> 143 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe Asn 1 5 10 15 Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly Ile 20 25 30 Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser Gln 35 40 45 Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp Gln 50 55 60 Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val Lys 65 70 75 80 Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu Thr 85 90 95 Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His Glu 100 105 110 Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly Lys 115 120 125 Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln 130 135 140 <210> 5 <211> 204 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Trp Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly 1 5 10 15 Pro Trp Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser 20 25 30 Ser Gln His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala 35 40 45 Glu Ser Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Asp Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu 65 70 75 80 Gln His Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu 85 90 95 Arg Cys Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala 100 105 110 Thr Glu Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys Val Met Arg Trp Phe 115 120 125 Gln Ala Met Leu Gln Arg Leu Gln Thr Trp Trp His Gly Val Leu Ala 130 135 140 Trp Val Lys Glu Lys Val Val Ala Leu Val His Ala Val Gln Ala Leu 145 150 155 160 Trp Lys Gln Phe Gln Ser Phe Cys Cys Ser Leu Ser Glu Leu Phe Met 165 170 175 Ser Ser Phe Gln Ser Tyr Gly Ala Pro Arg Gly Asp Lys Glu Glu Leu 180 185 190 Thr Pro Gln Lys Cys Ser Glu Pro Gln Ser Ser Lys 195 200 <210> 6 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Trp Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly 1 5 10 15 Pro Trp Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser 20 25 30 Ser Gln His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala 35 40 45 Glu Ser Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Asp Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu 65 70 75 80 Gln His Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly Leu 85 90 95 Arg Cys Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro Ala 100 105 110 Thr Glu Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys 115 120 <210> 7 <211> 92 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ser Ser Gln His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn 1 5 10 15 Ala Glu Ser Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu 20 25 30 Asp Asp Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu 35 40 45 Glu Gln His Pro Glu Leu Thr Pro Leu Leu Glu Lys Glu Arg Asp Gly 50 55 60 Leu Arg Cys Arg Gly Asn Arg Ser Pro Val Pro Asp Val Glu Asp Pro 65 70 75 80 Ala Thr Glu Glu Pro Gly Glu Ser Phe Cys Asp Lys 85 90 <210> 8 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Trp Val Ser Ala Cys Asp Thr Glu Asp Thr Val Gly His Leu Gly 1 5 10 15 Pro Trp Arg Asp Lys Asp Pro Ala Leu Trp Cys Gln Leu Cys Leu Ser 20 25 30 Ser Gln His Gln Ala Ile Glu Arg Phe Tyr Asp Lys Met Gln Asn Ala 35 40 45 Glu Ser Gly Arg Gly Gln Val Met Ser Ser Leu Ala Glu Leu Glu Asp 50 55 60 Asp Phe Lys Glu Gly Tyr Leu Glu Thr Val Ala Ala Tyr Tyr Glu Glu 65 70 75 80 <210> 9 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Met Lys Tyr Thr Ser Tyr Ile Leu Ala Phe Gln Leu Cys Ile Val Leu 1 5 10 15 Gly Ser Leu Gly Cys Tyr Cys 20 <210> 10 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Met Cys Phe Pro Lys Val Leu Ser Asp Asp Met Lys Lys Leu Lys Ala 1 5 10 15 Arg Met Val Met Leu Leu Pro Thr Ser Ala Gln Gly Leu Gly 20 25 30 <210> 11 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide <400> 11 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 12 <211> 28 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker Peptide <400> 12 Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 1 5 10 15 Gly Gly Ser Asn Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys 20 25

Claims (11)

1. (i) IL-32γ 단백질;
   (ⅱ) IFN-γ 단백질;
   (ⅲ) IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합 단백질; 또는
   (ⅳ) IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질이 발현되도록 형질전환된 면역세포.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-32γ 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포.
3. 제 1 항에 있어서, 상기 IFN-γ 단백질은 서열번호 3 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포.
4. 제 1 항에 있어서, 상기 IL-32γ 단백질의 단편은 서열번호 5, 6, 7, 및 8으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포.
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 IL-32γ 단백질과 IFN-γ와의 융합 단백질은
   서열번호 1 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하거나; 또는
   서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포.
6. 제 5 항에 있어서,
   서열번호 1 및 서열번호 4의 아미노산 서열은 서열번호 11의 서열의 링커 펩타이드에 의해 연결되고; 또는
   서열번호 2 및 서열번호 3의 아미노산 서열은 서열번호 11의 서열의 링커 펩타이드에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 면역세포.
7. 제 1 항에 있어서,
   상기 IL-32γ 단백질의 단편과 IFN-γ와의 융합 단백질은
   서열번호 3의 아미노산 서열과,
   서열번호 5, 6, 7 및 8로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 면역세포.
8. 제 7 항에 있어서,
   상기 서열번호 3의 아미노산 서열과,
   상기 서열번호 5, 6, 7 및 8로 이루어지는 군에서 선택된 어느 하나의 아미노산 서열은 서열번호 11의 서열의 링커 펩타이드에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 면역세포.
9. 제 1 항에 있어서, 상기 면역세포는 NK 세포, T 세포 또는 조절 T 세포인 것을 특징으로 하는 면역 세포.
10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 기재된 면역세포를 유효성분으로 포함하는, 암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 암은 간암, 위암, 췌장암, 피부암, 뇌암, 다발골수종, 난소암, 신장암, 담낭암, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 호지킨 및 비호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 급성 림프모구성 백혈병(ALL), 급성 골수모구성 백혈병(AML), 고형 조직 육종, 난소선암, 방광 이행성 세포암, 신장 투명 세포암, 편평세포 폐암, 및 자궁암으로 이루어진 군에서 선택되는 암인 것인, 약학적 조성물.
    

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