CN112043819B - Lapf及其相关物质在抗感染中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及了LAPF及其相关物质在抗感染中的应用。具体而言，本申请涉及含PH和FYVE结构域的溶酶体相关凋亡诱导蛋白(LAPF)、其编码序列或其LAPF在制备用于预防和/或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的产品中的用途。本申请还涉及包含LAPF、其编码序列或其促进剂的药物组合物，采用LAPF、其编码序列或其促进剂来预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的方法，以及筛选通过促进LAPF来抗感染的药物的方法。

Description

LAPF及其相关物质在抗感染中的应用
技术领域
本申请属于生物技术和医学领域，具体地说，本申请涉及含PH和FYVE结构域的溶酶体相关凋亡诱导蛋白(lysosome-associated and apoptosis-inducing proteincontaining PH and FYVE domains，LAPF)在感染性疾病(如细菌感染)中的抗感染作用、机制、实施方法和用途。
背景技术
细菌感染是临床常见的疾病，可导致机体局部和全身的感染性表现，甚至导致感染性休克、内毒素性休克以及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunctionsyndrome，MODS)等严重后果。重度感染导致的休克或者多器官功能衰竭，死亡率可高达50-80％。常见的临床细菌感染，如大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌等均可以导致机体局部和全身的炎症反应，引起不同程度的感染性疾病。对于细菌感染的患者，医生一般采用抗生素治疗，但是抗生素的滥用也增加了多药耐药菌感染的风险。
天然免疫系统是机体抵抗入侵病原体的第一道防线。当病原体入侵宿主时，天然免疫细胞，如中性粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dendritic cell，DC)等吞噬细胞可以吞噬和清除病原体【Ostrowski，P.等，Dev Cell.2016；38:135-146；Doherty，G.J.等，AnnuRev Biochem.2009；78:857-902】。
病原体被吞噬到细胞内后，被运送至溶酶体，在溶酶体酶的酸性环境中被水解酶降解【Moretti，J.等，Curr Opin Immunol.2014；26:100-110】。病原体的部分降解产物由巨噬细胞、DCs等抗原提呈细胞提呈给组织相容性复合体(MHC)分子，随后被T细胞表面的受体识别，进而激活CD4+和CD8+的T细胞启动适应性免疫【Cao，X等，Nat Rev Immunol.2016；16:35-50】。同时，巨噬细胞等天然免疫细胞表面的Toll样受体、RIG-I样受体、NOD样受体等模式识别受体(PRR)识别病原体的病原相关分子模式(PAMP)，激活下游多条信号通路，促进炎性细胞因子的产生和释放【Liu，J.等，Immunity.2016；45:15-30】。炎性细胞因子可以招募和激活天然免疫细胞和淋巴细胞，进一步促进对病原体的吞噬和清除【Flannagan，R.S.等，Annu Rev Pathol.2012；7:61-98】。
如果机体不能够及时有效地清除病原体，则机体就会产生慢性炎症(如结核病、慢性肝炎、慢性肾炎以及慢性胃肠道疾病)，而且会引起机体免疫系统功能的紊乱，并且长期的慢性炎症可以引起继发的多种临床疾病【Cook，D.N.等，Nat Immunol.2004，5:975-979】。研究发现，多种自身免疫病、过敏性疾病、动脉粥样硬化、甚至包括多种肿瘤均与慢性炎症密切相关，其发病机制涉及TLR的信号传导异常【Cook，D.N.等，Nat Immunol.2004，5:975-979】。
Toll样受体是一类模式识别受体，广泛分布于免疫细胞，如树突状细胞和巨噬细胞表面，可以通过病原微生物特定的病原体相关分子模式识别抗原并激活相应的信号通路，启动天然免疫应答。TLR是I型跨膜蛋白，属于TIR(Toll/IL-1受体)超家族成员，Toll蛋白最早发现在调控果蝇的胚胎发育过程中起重要作用。TLR受体与相应配体结合可以分别活化下游的MyD88(骨髓分化因子88，myeloid differentiation factor 88)依赖性通路和TRIF(Toll/IL-1receptor(TIR)-domain containing adaptor protein inducing IFN-β)依赖性通路。MyD88继而活化下游的IRAK、TRAF6、TAK1及IKK和MAPK等信号分子，最终导致NF-κB和AP1的早期活化，介导炎性因子如TNF-α、IL-6、IL-1β和一氧化氮的产生；TRIF的活化能激活TBK1、TRAF3和IRF3，最终导致I型干扰素的产生和干扰素诱导基因的活化，如CXCL10和CCL5等【Akira，S.等，Nat.Rev.Immunol.2004；4:499-511；Liew，F.Y.等，Nat.Rev.Immunol.2005；5:446-458】。
含PH和FYVE结构域的溶酶体相关凋亡诱导蛋白(LAPF，lysosome-associatedapoptosis-inducing protein containing the PH and FYVE domains，PLEKHF1)是一类同时具有FYVE(Fab 1,YOTB,Vac 1and EEA1)和PH(Pleckstrin Homology)两个结构域的分子。
FYVE结构域结合早期内体膜中的磷脂酰肌醇3-磷酸(phosphatidylinositol3-phosphate，PI(3)P)，含有该结构域的蛋白通常定位于早期内体，并参与细胞的内吞作用、信号传导、细胞骨架重构、膜转运、吞噬体成熟和自噬等多种生理过程【He，J.等，Proteins,2009；76:852-860；Gunjan，G.PLoS pathog.2019；15:e1007573】。
PH结构域则与细胞膜上的磷脂酰肌醇3,4,5-三磷酸(phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphate，PIP3)和PI(4,5)P2结合【Miao，B.等，Proc Natl Acad Sci USA.2010；107:20126-20131】。含有PH结构域的蛋白质，如Pleckstrin(普列克底物蛋白)、丝苏氨酸激酶Akt等，在细胞吞噬、信号转导、细胞代谢、细胞存活和凋亡过程中发挥重要的调节作用【Agamasu，C.等，J Biol Chem.2017；292:251-263；Mahadevan，D.等，Mol CancerTher.2008；7:2621-2632】。
已有研究表明，LAPF通过溶酶体-线粒体通路诱导非依赖细胞凋亡蛋白酶(Caspase)的凋亡【Chen，W.等，J Biol Chem.2005；280:40985-40995】。LAPF招募磷酸化P53至溶酶体，与磷酸化P53形成复合体，增加溶酶体膜的通透性，促进细胞凋亡【Li，N.等，Cancer Res.2007；67:11176-11185】。
然而，关于LAPF在天然免疫，尤其是细胞内吞和炎症反应方面的研究目前仍没有报道。
综上所述，本领域迫切需要开发出一种可有效促进细胞吞噬和清除细菌的免疫学活性物质。
发明内容
本文中提供了LAPF蛋白、其编码序列和/或其促进剂在抵感染、促进炎性因子产生中的新用途。
在本文的一些方面中，提供了含PH和FYVE结构域的溶酶体相关凋亡诱导蛋白(LAPF)、其编码序列或其LAPF在制备用于预防和/或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的产品中的用途。
在一些实施方式中，感染由病原体、化学物质、物理因素或其组合引起，例如所述感染由选自下组的一种或多种病原体引起：细菌、真菌、支原体、衣原体和寄生虫。
在一些实施方式中，所述相关病症和/或征状为选自下组中的一种或多种：感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭。
在一些实施方式中，所述炎症因子为选自下组的一种或多种：TNFα、IL-1、IL-6、IFN-I，优选TNFα、IL-1或IL-。
在一些实施方式中，所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠。
在一些实施方式中，所述病原体选自下组中的一种或多种：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、芽孢杆菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肉毒杆菌、炭疽芽孢杆菌、肠杆菌、奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、念珠菌或其组合。
在一些实施方式中，所述LAPF选自：
(a)SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列；
(b)与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列同源(例如80％以上同源，如80％、85％、90％、95％、98％、99％同源)，且具有抑制感染性疾病及其相关病症和/或征状活性的氨基酸序列；
(c)(a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽；和/或
所述LAPF的编码基因选自：
(i)SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列；
(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交，且具有预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的分子；和/或
所述促进剂选自：提高LAPF蛋白水平或促进LAPF功能的物质，例如LAPF表达载体、外源性LAPF、LAPF编码序列的裸DNA、LAPF编码序列的脂质体包裹DNA、能够在体内转化为LAPF的LAFP前体蛋白或偶联物或复合物。
在一些实施方式中，所述LAPF选自：天然纯化的LAPF蛋白、化学合成的产物、或使用重组技术从原核或真核宿主中产生，优选为人LAPF。
在一些实施方式中，所述宿主选自：细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞。
在一些实施方式中，其中，所述产品为药物组合物。
在一些实施方式中，所述产品的形式使其适于采用选自下组的方式给予：口服、注射(例如直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔。
在本文的一些方面中，还提供了一种药物组合物，其包含：
(A)治疗或预防有效量的LAPF、其编码序列或其促进剂；
(B)药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；
(C)可任选地，一种或多种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的其它活性物质。
在一些实施方式中，在给予本申请的药物组合物之前、同时或之后，给予具有预防或治疗感染相关疾病和/或征状活性的其它活性物质。
在一些实施方式中，治疗或预防感染性疾病及其相关病症和/或征状的其它活性物质包括但不限于：临床常用抗生素(包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)的一种或多种。
在一些实施方式中，所述药物组合物中LAPF、其编码序列或促进剂占药物组合物总重量的0.001～99.9wt％。
在一些实施方式中，所述药物组合物中LAPF、其编码序列或促进剂占药物组合物总重量的1～95wt％，优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。
在本申请的一些方面中，提供了一种筛选通过促进LAPF来抗感染的药物的方法，其包括：
(A)用候选物质处理被感染的细胞、组织或动物；
(B)检测所述细胞、组织或动物中LAPF或其编码序列的水平；以及
(C)若LAPF或其编码序列的水平高于候选物质处理前的水平或高于正常对照中的水平，则表明所述候选物质具有通过促进LAPF来抗感染的作用。
在本文的一些方面中，提供了一种预防或治疗感染性疾病及其相关病症和/或征状的方法，所述方法包括：给予需要预防或治疗的对象有效量的LAPF、其编码序列或其促进剂。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本申请的发明构思和保护范围。本申请的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本申请作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本申请的实施方案，而不是为了局限本申请的范围。
图1：Lapf缺陷的巨噬细胞吞噬和清除细菌的能力减弱：
A：免疫荧光分析；
B：细菌计数分析；
C：大肠杆菌克隆数分析；
D：金黄色葡萄球菌克隆数分析；
E：巨噬细胞内活菌数占初始(0小时)吞噬菌数的百分比；
图中，“*”表示P<0.05。
图2：Lapf缺陷小鼠对大肠杆菌(E.coli)感染更敏感：
A：生存率分析；
B：脾脏中大肠杆菌克隆计数；
C：肝脏中大肠杆菌克隆计数；
D：针对TNF-α、IL-6和IFN-β的ELISA分析；
图中，“*”表示P<0.05。
图3：Lapf缺陷的巨噬细胞对E.coli和内毒素产生的炎症反应减弱：
A：针对大肠杆菌中TNF-α、IL-6和IFN-β的ELISA分析结果；
B：针对LPS中的TNF-α、IL-6和IFN-β的ELISA分析结果；
C：针对Tnfa mRNA、IL-6mRNA和lfnb mRNA的定量PCR分析结果；
D：Western印迹分析结果；
图中，“*”表示P<0.05。
图4：Lapf过表达能够促进巨噬细胞吞噬细菌和炎症信号转导：
A：细菌克隆数分析；
B：Western印迹分析结果；
图中，“*”表示P<0.05。
实施方式
本申请人通过大量的研究和细胞及动物模型试验，发现LAPF在感染性疾病中能有效促进机体吞噬和清除细菌、改善器官功能状态、提高患者的生存率。在此基础上本申请人完成了本申请。由此，本申请中揭示了LAPF、其编码序列和促进剂的新功能，即促进感染时机体对病原体的吞噬和清除、保护机体的脏器功能、提高感染个体的生存率。本申请还提供了一种可有效促进感染时机体吞噬和清除病原体的能力、提高感染个体的生存率的新型药物。
具体而言，针对影响巨噬细胞吞噬和清除功能的相关基因进行应用研究是分子生物学和细胞生物学研究的热点，将促进吞噬和清除的基因的核苷酸和蛋白质应用于感染性疾病的预防和治疗是有效的技术，因此无论是在功能基因组研究，还是相关地基因治疗方面均具有广阔地应用前景。
发明人通过研究发现：Lapf缺陷明显减弱小鼠巨噬细胞吞噬和清除细菌的能力。在LPS和大肠杆菌(E.coli)诱导的炎症反应中，观察到Lapf缺陷能够显著减少巨噬细胞产生前炎性细胞因子和I型干扰素。Lapf缺陷小鼠对大肠杆菌的清除能力更弱，对大肠杆菌感染更敏感。此外，LAPF不仅仅可以促进内吞和杀灭细菌，还维持机体适度炎症反应。这些发现提示LAPF可能具备治疗细菌感染等疾病的应用前景。由此，本申请提供了将LAPF分子应用于感染性疾病的预防和治疗中的方法和策略。
本申请针对具有抗感染作用的新型分子LAPF，对免疫细胞中巨噬细胞对细菌的吞噬和清除的效应进行了研究，并且验证了应用该分子的序列对细菌感染动物的治疗和保护作用。实验证明：1)Lapf缺陷的巨噬细胞吞噬和清除细菌的能力减弱；2)Lapf缺陷小鼠对大肠杆菌感染更敏感；3)Lapf缺陷的巨噬细胞对大肠杆菌和内毒素产生的炎症反应减弱；4)LAPF过表达能够促进巨噬细胞吞噬细菌和炎性细胞因子产生。
本申请针对Lapf基因的不同的核苷酸和蛋白质产物，用以促进巨噬细胞吞噬和清除细菌，提高小鼠的抗细菌感染能力。这些发明证实Lapf的相关产物可望成为治疗和预防感染性疾病的有效手段。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本申请提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
LAPF蛋白(多肽)
如本文所用，术语“LAPF(多肽)”、“LAPF蛋白(多肽)”、“LAPF”、和“PLEKHF1”可互换使用，具有本领域中已知的定义，是指含PH和FYVE结构域的溶酶体相关凋亡诱导蛋白。LAPF可具有本领域中已知的序列，例如SEQ ID NO：1或3的序列或其同源序列所编码的蛋白质，也可为已知LAPF蛋白具有抗感染作用的变异或修饰形式。举例而言，所述LAPF蛋白可选自：(a)SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列；(b)与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列同源(例如80％以上同源，如80％、85％、90％、95％、98％、99％同源)，且具有抑制感染相关疾病和/或征状活性的氨基酸序列；或(c)在(a)或(b)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗感染作用的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。
本申请的蛋白质或多肽可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等动物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。本申请中LAPF蛋白或多肽优选由人Lapf基因或其同源基因或家族基因编码。本申请中LAPF蛋白或多肽可来自哺乳动物，如人或小鼠。
本申请蛋白质或多肽的变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质或多肽的功能，例如本申请的LAPF蛋白质或多肽可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基而仍然具有促进吞噬和清除细菌的活性。
可采用辐射或暴露于诱变剂下来产生随机诱变，也可通过定点诱变法或其它已知的分子生物学技术来获得上述(c)中的蛋白质或多肽。可利用编码所述蛋白质或多肽的编码序列来构建转基因动物，并观察该转基因动物对细菌感染的抵抗能力是否有所改良来筛选和鉴别所得蛋白质或多肽。
根据重组生产方案所用的宿主，本申请的蛋白质或多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。该术语还包括LAPF蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与LAPF蛋白编码序列杂交的序列所编码的蛋白、以及利用抗LAPF蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本申请还可使用其它多肽，如包含LAPF蛋白或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本申请还包括了LAPF蛋白的可溶性片段。通常，该片段具有LAPF蛋白序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
LAPF蛋白编码序列
如本文所用，术语“Lapf基因”或“LAPF蛋白编码序列”可互换使用，均是指编码本申请所述的LAPF蛋白或多肽的核苷酸序列。举例而言，所述LAPF蛋白编码序列可为SEQ IDNO：1或3的序列或其同源序列；在严格条件下与SEQ ID NO：1或3序列杂交的分子、或与上述分子高度同源的家族基因分子，所述基因的表达对抗细菌感染具有一定的促进作用。本申请的Lapf基因可选自例如：(i)SEQ ID NO：1或3的序列；或(ii)在严格条件下与(i)限定的序列杂交且具有促进吞噬和清除细菌活性的分子。例如，所述编码序列可为Gene ID:72287或MGI:1919537所示序列或其同源序列或由其经过修饰所得的序列。本文的编码序列可来自哺乳动物，如人或小鼠。
如本文所用，术语“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50％，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上、85％以上或90％以上，更优选是95％以上时才发生杂交。例如，所述序列可为(a)中所限定序列的互补序列。
本申请的Lapf基因核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本申请所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
应理解，本申请的Lapf基因优选获自人，获自其它动物的与人Lapf基因高度同源(如具有50％以上，优选55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％、甚至99％序列或以上相同性)的其它基因也在本申请优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如BLAST。
LAPF或其编码序列的促进剂
本申请中还涉及LAPF或其编码序列的“促进剂”。术语“促进剂”或“LAPF或其编码序列的促进剂”可互换使用，是指可提高LAPF或其编码序列的水平和/或活性的物质。可用于本申请中的促进剂包括但不限于：LAPF表达载体、外源性LAPF、LAPF或其编码序列的裸DNA、LAPF或其编码序列的脂质体包裹DNA、LAPF蛋白。
本申请LAPF或其编码序列的促进剂可通过提高LAPF水平或活性用于预防或治疗与感染相关的疾病，例如细菌感染及其相关症状(如感染导致的慢性炎症性疾病)等。
载体、宿主及转基因动物
本申请还涉及包含Lapf基因的载体，以及用该载体经基因工程产生的宿主细胞，以及通过转基因获得高表达LAPF的转基因动物。
通过常规的重组DNA技术(Science，1984；224：1431)，可利用本申请的编码序列可用来表达或生产重组的LAPF蛋白。一般来说有以下步骤：
(1)用本申请的编码LAPF蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；和
(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质或多肽。
本申请中，术语“载体”与“重组表达载体”可互换使用，指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、动物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其它载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Lapf编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本申请中可采用pcDNA3.1载体、pIRES2-EGFP载体、Adeno-X表达系统等。
此外，表达载体还可包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质或多肽。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；动物细胞等。在本申请中，可采用小鼠巨噬细胞作为宿主细胞。
本申请的多核苷酸在高等真核细胞中表达时，如果在载体中插入增强子序列时将会使转录得到增强。增强子是DNA的顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体、启动子、增强子和宿主细胞。
本申请中术语“转基因动物”、或“转化动物”可互换使用，均指通过常规转基因的方法获得的转入本申请Lapf基因并稳定高表达LAPF蛋白或多肽的细胞、器官、组织或个体。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内或在细胞膜上表达或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
药物组合物
本申请还提供了一种药物组合物，所述的组合物含有有效量的本申请的LAPF蛋白或其编码序列或其促进剂，以及药学上可接受的载体。
在较佳的实施方案中，所述药物组合物可用于治疗与现有技术中已知可治疗或预防感染性疾病，例如细菌感染后体内细菌的吞噬和清除；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭。
如本文所用，术语“药学上可接受的”成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。
如本文所用，术语“有效量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。
如本文所用，术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。
在组合物中药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
本申请的组合物中LAPF蛋白或其编码序列或促进剂有效成分占组合物总重量的0.001～99.9wt％；优选为组合物总重量的1～95wt％，较优选为5～90wt％，更优选10～80wt％。余量为药学上可接受的载体以及其它添加剂等物质。
如本文所用，术语“单位剂型”是指为了服用方便，将本申请的组合物制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。
在本申请的另一优选实施方式中，所述组合物为单位剂型或多剂型，且其中LAPF蛋白或其编码序列的含量可为0.01～2000mg/剂，优选0.1～1500mg/剂，更优选1～1000mg/剂。在本申请的另一个优选例中，每天施用1～6剂本申请的组合物，优选施用1～3剂；最优选的，每天服用的剂量为1剂。
应理解，所用LAPF蛋白或其编码序列或促进剂的有效剂量可随待施用或治疗的对象的严重程度而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练医师可以判断的范围内。
本申请的组合物，可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给药途径可采用：(1)直接裸DNA或者蛋白质注射法；(2)将LAPF的cDNA、mRNA和蛋白质与转铁蛋白/多聚L-赖氨酸复合物连接，以增强其生物效应；(3)cDNA、mRNA和蛋白质与带正电荷的脂类形成复合物，以克服磷酸骨架负电荷所致的穿越细胞膜的困难；(4)用脂质体包裹cDNA、mRNA和蛋白质后介导进入细胞，既有利于大分子的顺利进入又免受细胞外各种酶的水解作用；(5)cDNA、mRNA和蛋白质与胆固醇结合使其胞浆保持时间增加10倍；(6)用免疫脂质体转运cDNA、mRNA和蛋白质可使其特异性转运至靶组织和靶细胞；(7)将cDNA、mRNA和蛋白质体外转染给转载细胞(如成纤维细胞)也可较好地将LAPF相关药物载入靶细胞内；(8)电打孔(electroporation)，即借助于电流将cDNA、mRNA和蛋白质导入靶细胞。
此外，本申请的组合物中还可含有用于改善和治疗细菌感染性疾病的其它活性物质，所述的其它活性物质选自下组：临床常用抗生素(包括β-内酰胺类(青霉素类和头孢菌素类)、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内脂类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素)的一种或多种。
本申请的LAPF相关的核苷酸和蛋白质药物相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于感染性疾病(例如细菌感染)的预防和治疗。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。本领域技术人员可对本申请做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本申请的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：Lapf缺陷的巨噬细胞吞噬和清除细菌的能力减弱
1.Lapf缺陷小鼠及对照小鼠
Lapf缺陷小鼠购自上海南方模式生物科技发展有限公司，其构建基于S129胚胎干细胞打靶，植入C57假孕小鼠体内获得F1代。在SPF环境下饲养，F1代小鼠与C57杂交培育10代以上后，再与Lys-cre小鼠杂交获得Lapffl/fl-LysMcre巨噬细胞特异性LAPF敲除小鼠(即Lapf缺陷小鼠)(Lapf-/-)和Lapffl/+-LysMcre对照小鼠(Lapf+/-)。其中，Lapf+/-对照的LAPF蛋白表达正常。
Lapf+/-和Lapf-/-小鼠性别和体重匹配，使用6-8周，18-22g左右小鼠。
2.巨嗜细胞的获得
给Lapf缺陷及对照小鼠(6-8周，18-22g体重)腹腔注射2ml肉汤(购自merck)，四天后以DMEM培养基冲洗腹腔获得巨噬细胞。
3.测试方法
免疫荧光测定：将PI标记的大肠杆菌(E.coli)分别与Lapf+/-和Lapf-/-小鼠的腹腔巨噬细胞(细菌:细胞＝5:1)孵育1h，在冰上用预冷的PBS洗两次，然后将细胞用4％多聚甲醛固定，最后用DAPI染色，用激光共聚焦显微镜观察Lapf+/-和Lapf-/-巨噬细胞对E.coli的吞噬情况。
巨噬细胞吞噬的细菌克隆数测试：用E.coli和金黄色葡萄球菌(S.aureus)分别感染Lapf+/-和Lapf-/-小鼠的腹腔巨噬细胞(细菌:细胞＝5:1)1h，然后将细胞置于冰上，用庆大霉素(100μg/ml)培养30min去除细胞外活菌，再通过细胞裂解液(含0.1％Triton的PBS溶液)的克隆形成数(colony-forming units,CFUs)来分析细胞内的E.coli数量，以检测Lapf+/-和Lapf-/-巨噬细胞的吞噬能力。
巨噬细胞内杀菌效率分析：用E.coli分别感染Lapf+/-和Lapf-/-小鼠的腹腔巨噬细胞(细菌:细胞＝5:1)6h后，通过CFU计算巨噬细胞吞噬细菌的数量(记为0h)，或将胞外菌杀死后继续培养3h-6h，分别计算3h或6h后Lapf+/-和Lapf-/-的巨噬细胞内活菌数占0h吞噬菌数的百分比。
4.结果与讨论
免疫荧光结果如图1的A和B中所示：Lapf缺陷的巨噬细胞吞噬细菌的数量减少，且Lapf-/-巨噬细胞对E.coli的吞噬能力明显弱于Lapf+/-巨嗜细胞。
巨噬细胞吞噬的细菌克隆数如图1的C和D中所示：Lapf缺陷的巨噬细胞吞噬活菌的数量减少，且Lapf-/-巨噬细胞吞噬活菌的数量显著少于Lapf+/-巨嗜细胞。
巨噬细胞内杀菌效率分析如图1的E中所示：Lapf缺陷的巨噬细胞杀菌效率降低，且Lapf-/-巨噬细胞的杀菌效率显著低于Lapf+/-巨嗜细胞。
该实施例表明：Lapf缺陷减弱巨噬细胞吞噬和清除细菌的能力。
实施例2：Lapf缺陷小鼠对大肠杆菌感染更敏感
1.Lapf缺陷小鼠及对照小鼠
同实施例1
2.测试方法
采用2×107个大肠杆菌腹腔注射Lapf缺陷及对照小鼠，动态观察小鼠的生存率；在不同时间眼球取血，用ELISA(购自R&D公司)检测血清中炎性因子TNF-α、IL-6以及IFN-β产量；并用细菌培养法检测脾脏和肝脏中大肠杆菌数量(CFU)。
3.结果与讨论
感染大肠杆菌后小鼠生存率如图2的A中所示。结果显示：Lapf缺陷小鼠更早死亡，且Lapf-/-小鼠的存活率显著低于Lapf+/-小鼠。
脾脏和肝脏中的大肠杆菌数量如图2的B和C中所示。结果显示：大肠杆菌在Lapf缺陷小鼠体内CFU更高，表明该缺陷导致细菌有更强的扩散，且Lapf-/-小鼠中的CFU显著高于Lapf+/-小鼠。
对血清中炎性因子TNFα、IL-6以及IFN-β产量的ELISA分析结果如图2的D中所示。结果显示：Lapf缺陷小鼠在感染大肠杆菌后产生的炎性因子TNFα、IL-6以及IFN-β减少，且Lapf-/-小鼠中的炎症因子产量显著低于Lapf+/-小鼠。
该实例表明：Lapf缺陷小鼠对大肠杆菌感染更敏感。
实施例3：Lapf缺陷的巨噬细胞对大肠杆菌和内毒素产生的炎症反应减弱
1.Lapf缺陷小鼠及对照小鼠
同实施例1
2.巨嗜细胞的获得
给Lapf缺陷小鼠腹腔注射2ml肉汤，四天后以培养基冲洗腹腔获得巨噬细胞(同实施例1)。
3.测试方法
分别用大肠杆菌(MOI,10)和100ng/ml LPS(溶剂为1640培养基)处理腹腔巨噬细胞(1×105个细胞/ml RPMI 1640培养基)。
收集细胞培养上清，通过ELISA(所用试剂盒购自R&D公司)测定细胞因子产量。同时收集全细胞RNA用定量PCR检测细胞因子RNA水平的表达，并用Western印迹法检测TLRs信号转导活化。
4.结果与讨论
Lapf缺陷小鼠腹腔巨噬细胞对大肠杆菌感染产生的炎症因子如图3的A中所示，对LPS刺激产生的细胞因子如图3的B和C中所示，对LPS刺激诱导的TLRs信号转导如图3的D中所示。
结果显示：Lapf缺陷小鼠腹腔巨噬细胞在受到大肠杆菌和TLR配体刺激后产生更少的炎性因子；同时信号转导分子活化更弱。
该结果表明：Lapf缺陷减少小鼠来源的腹腔巨噬细胞炎症因子的产生。
实施例4：LAPF过表达能够促进巨噬细胞吞噬细菌和炎性细胞因子产生。
1.质粒与细胞
野生型LAPF质粒(由LAPF全长CDS经PCR克隆到pCMV质粒获得)和对照质粒(pCMV空载体质粒)购自Invitrogen公司购买。
RAW264.7细胞(购自ATCC)。
2.过表达LAPF的细胞与对照细胞的获得
用野生型LAPF质粒和对照质粒转染(jetpei试剂转染)RAW264.7细胞，48小时后用1500ng/ml G418筛选单克隆，得到稳定过表达LAPF的RAW264.7细胞和对照细胞(pCMV空载体质粒转染)。
3.测试方法
用大肠杆菌感染稳定过表达LAPF的RAW264.7细胞和对照细胞(细菌:细胞＝5:1)，检测细胞吞噬大肠杆菌的数量。用100ng LPS处理过表达LAPF的RAW264.7细胞和对照细胞(1×105个细胞/ml RPMI 1640培养基)。收集细胞做Western印迹法检测TLRs信号转导活化。
4.结果与讨论
过表达LAPF对细胞吞噬细菌数量的影响如图4的A中所示，对TLR4信号转导的影响如图4的B中所示。
结果显示：过表达LAPF促进细胞吞噬细菌，促进TLR4信号转导(主要体现在NF-κB和IRF3)。
在本申请提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本申请的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本申请作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> LAPF及其相关物质在抗感染中的应用
<130> 194039 1CNCN
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 840
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(840)
<400> 1
atg gtg gac cac ttg gcc aac acg gag atc aac agc cag cgc atc gcg 48
Met Val Asp His Leu Ala Asn Thr Glu Ile Asn Ser Gln Arg Ile Ala
1 5 10 15
gca gtg gag agc tgc ttc ggg gcc tcg ggg cag ccg ctg gcg ctg cca 96
Ala Val Glu Ser Cys Phe Gly Ala Ser Gly Gln Pro Leu Ala Leu Pro
20 25 30
ggc cga gtg ctg ctg ggc gag ggc gtg ctg acc aaa gag tgc cgc aag 144
Gly Arg Val Leu Leu Gly Glu Gly Val Leu Thr Lys Glu Cys Arg Lys
35 40 45
aag gcc aag ccg cgc atc ttc ttc ctc ttt aac gac atc ctg gtg tat 192
Lys Ala Lys Pro Arg Ile Phe Phe Leu Phe Asn Asp Ile Leu Val Tyr
50 55 60
ggc agc atc gtg ctc aac aag cgc aag tac cgc agc cag cac atc atc 240
Gly Ser Ile Val Leu Asn Lys Arg Lys Tyr Arg Ser Gln His Ile Ile
65 70 75 80
ccc ctg gag gag gtc aca ctg gag ctg ttg ccg gag acg ctg cag gcc 288
Pro Leu Glu Glu Val Thr Leu Glu Leu Leu Pro Glu Thr Leu Gln Ala
85 90 95
aag aac cgc tgg atg atc aag acg gcc aag aag tcc ttt gtg gtg tcg 336
Lys Asn Arg Trp Met Ile Lys Thr Ala Lys Lys Ser Phe Val Val Ser
100 105 110
gcc gcc tcc gct acg gag cgc cag gaa tgg att agc cac atc gag gag 384
Ala Ala Ser Ala Thr Glu Arg Gln Glu Trp Ile Ser His Ile Glu Glu
115 120 125
tgc gtg cgg cgg caa ctg agg gcc acg ggc cgc ccg ccc agc acg gag 432
Cys Val Arg Arg Gln Leu Arg Ala Thr Gly Arg Pro Pro Ser Thr Glu
130 135 140
cac gcg gca ccc tgg atc ccc gac aag gcc acg gac atc tgc atg cgc 480
His Ala Ala Pro Trp Ile Pro Asp Lys Ala Thr Asp Ile Cys Met Arg
145 150 155 160
tgc acg cag acg cgc ttc tct gcc ctc acg agg cgc cac cac tgc cgc 528
Cys Thr Gln Thr Arg Phe Ser Ala Leu Thr Arg Arg His His Cys Arg
165 170 175
aag tgc ggc ttc gtg gtc tgc gct gag tgc tcg cgc cag cgc ttc ctg 576
Lys Cys Gly Phe Val Val Cys Ala Glu Cys Ser Arg Gln Arg Phe Leu
180 185 190
ctc ccg cgc ctg tcc ccc aag ccc gtg cgc gtc tgc agc ctc tgc tac 624
Leu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Pro Val Arg Val Cys Ser Leu Cys Tyr
195 200 205
cgc gaa ctg gcc gcc cag cag cgg cag gag gag gcg gag gag cag ggc 672
Arg Glu Leu Ala Ala Gln Gln Arg Gln Glu Glu Ala Glu Glu Gln Gly
210 215 220
gcg ggg tcc cca ggg cag cca gcc cac ctg gcc cgg ccc atc tgc gga 720
Ala Gly Ser Pro Gly Gln Pro Ala His Leu Ala Arg Pro Ile Cys Gly
225 230 235 240
gcg tcc agt gga gat gac gat gac tcc gac gag gac aag gag ggc agc 768
Ala Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Ser Asp Glu Asp Lys Glu Gly Ser
245 250 255
agg gac ggc gac tgg ccc agc agc gtg gag ttc tac gcc tcg ggg gtg 816
Arg Asp Gly Asp Trp Pro Ser Ser Val Glu Phe Tyr Ala Ser Gly Val
260 265 270
gcc tgg tct gcc ttc cac agc tga 840
Ala Trp Ser Ala Phe His Ser
275
<210> 2
<211> 279
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 2
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1 5 10 15
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<211> 279
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
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Ala Val Glu Ser Cys Phe Gly Ala Ser Gly Gln Pro Leu Ala Leu Pro
20 25 30
Gly Arg Val Leu Leu Gly Glu Gly Val Leu Thr Lys Glu Cys Arg Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Pro Arg Ile Phe Phe Leu Phe Asn Asp Ile Leu Val Tyr
50 55 60
Gly Ser Ile Val Leu Asn Lys Arg Lys Tyr Arg Ser Gln His Ile Ile
65 70 75 80
Pro Leu Glu Glu Val Thr Leu Glu Leu Leu Pro Glu Thr Leu Gln Ala
85 90 95
Lys Asn Arg Trp Met Ile Lys Thr Ala Lys Lys Ser Phe Val Val Ser
100 105 110
Ala Ala Ser Ala Thr Glu Arg Gln Glu Trp Ile Ser His Ile Glu Glu
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<220>
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<222> (1)..(840)
<400> 4
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Ala Val Glu Ser Cys Phe Gly Ala Ser Gly Gln Pro Leu Ala Leu Pro
20 25 30
ggc cgt gtg ctc cta ggc gag ggg gta ctg acc aag gag tgc cgc aag 144
Gly Arg Val Leu Leu Gly Glu Gly Val Leu Thr Lys Glu Cys Arg Lys
35 40 45
aag gcc aag cca cgc atc ttc ttt ctt ttc aac gac atc ctg gtg tat 192
Lys Ala Lys Pro Arg Ile Phe Phe Leu Phe Asn Asp Ile Leu Val Tyr
50 55 60
ggc agt att gtg ctt agc aag cgc aag tac cgc agc cag cat att att 240
Gly Ser Ile Val Leu Ser Lys Arg Lys Tyr Arg Ser Gln His Ile Ile
65 70 75 80
ccc cta gaa gag gta aca ttg gag cca ctg ccc gag acc ctg cag gcc 288
Pro Leu Glu Glu Val Thr Leu Glu Pro Leu Pro Glu Thr Leu Gln Ala
85 90 95
aag aac cga tgg atg atc aag aca gcc aag aag tcc ttt gtg gtg tcg 336
Lys Asn Arg Trp Met Ile Lys Thr Ala Lys Lys Ser Phe Val Val Ser
100 105 110
gca gcc tcc acc acg gag cgc cag gaa tgg ata agc cac atc gaa gag 384
Ala Ala Ser Thr Thr Glu Arg Gln Glu Trp Ile Ser His Ile Glu Glu
115 120 125
tgt gtg cgg agg cag cta ctg gcc aca ggc cgc cag ccc acc acg gag 432
Cys Val Arg Arg Gln Leu Leu Ala Thr Gly Arg Gln Pro Thr Thr Glu
130 135 140
cac gca gct ccc tgg atc ccg gac aag gcc acg gac att tgc atg cgc 480
His Ala Ala Pro Trp Ile Pro Asp Lys Ala Thr Asp Ile Cys Met Arg
145 150 155 160
tgc acg cag acg cgc ttc tcc gca ctc acc cgg cgt cac cac tgc cgc 528
Cys Thr Gln Thr Arg Phe Ser Ala Leu Thr Arg Arg His His Cys Arg
165 170 175
aaa tgc ggg ttt gtg gtc tgt gct gag tgt tcc agg gag cgt ttc ctg 576
Lys Cys Gly Phe Val Val Cys Ala Glu Cys Ser Arg Glu Arg Phe Leu
180 185 190
ttg cca cgt ctc tct ccc aag ccc ctt cgc gtc tgc agc ctg tgc tac 624
Leu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Pro Leu Arg Val Cys Ser Leu Cys Tyr
195 200 205
cga gag ctg gcc gcc cag aag ctg agg gag gag gcc agg gag ggg atc 672
Arg Glu Leu Ala Ala Gln Lys Leu Arg Glu Glu Ala Arg Glu Gly Ile
210 215 220
gga ggc tct cca ccg cag ctg tcc cac cta ggc ggc act gtc tgt ggt 720
Gly Gly Ser Pro Pro Gln Leu Ser His Leu Gly Gly Thr Val Cys Gly
225 230 235 240
gca tcc agt ggc gat gac gat gac tcc gat gag gac aga gag ggc aat 768
Ala Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Ser Asp Glu Asp Arg Glu Gly Asn
245 250 255
gga gat ggt gac tgg ccc acc cag gtg gag ttc tat gct tct ggt gtc 816
Gly Asp Gly Asp Trp Pro Thr Gln Val Glu Phe Tyr Ala Ser Gly Val
260 265 270
tcc tgg tca gcc ttc cat agt tga 840
Ser Trp Ser Ala Phe His Ser
275
<210> 5
<211> 279
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 5
Met Val Asp His Leu Ala Asn Thr Glu Ile Asn Ser Gln Arg Ile Ala
1 5 10 15
Ala Val Glu Ser Cys Phe Gly Ala Ser Gly Gln Pro Leu Ala Leu Pro
20 25 30
Gly Arg Val Leu Leu Gly Glu Gly Val Leu Thr Lys Glu Cys Arg Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Pro Arg Ile Phe Phe Leu Phe Asn Asp Ile Leu Val Tyr
50 55 60
Gly Ser Ile Val Leu Ser Lys Arg Lys Tyr Arg Ser Gln His Ile Ile
65 70 75 80
Pro Leu Glu Glu Val Thr Leu Glu Pro Leu Pro Glu Thr Leu Gln Ala
85 90 95
Lys Asn Arg Trp Met Ile Lys Thr Ala Lys Lys Ser Phe Val Val Ser
100 105 110
Ala Ala Ser Thr Thr Glu Arg Gln Glu Trp Ile Ser His Ile Glu Glu
115 120 125
Cys Val Arg Arg Gln Leu Leu Ala Thr Gly Arg Gln Pro Thr Thr Glu
130 135 140
His Ala Ala Pro Trp Ile Pro Asp Lys Ala Thr Asp Ile Cys Met Arg
145 150 155 160
Cys Thr Gln Thr Arg Phe Ser Ala Leu Thr Arg Arg His His Cys Arg
165 170 175
Lys Cys Gly Phe Val Val Cys Ala Glu Cys Ser Arg Glu Arg Phe Leu
180 185 190
Leu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Pro Leu Arg Val Cys Ser Leu Cys Tyr
195 200 205
Arg Glu Leu Ala Ala Gln Lys Leu Arg Glu Glu Ala Arg Glu Gly Ile
210 215 220
Gly Gly Ser Pro Pro Gln Leu Ser His Leu Gly Gly Thr Val Cys Gly
225 230 235 240
Ala Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Ser Asp Glu Asp Arg Glu Gly Asn
245 250 255
Gly Asp Gly Asp Trp Pro Thr Gln Val Glu Phe Tyr Ala Ser Gly Val
260 265 270
Ser Trp Ser Ala Phe His Ser
275
<210> 6
<211> 279
<212> PRT
<213> 小鼠（Mus musculus）
<400> 6
Met Val Asp His Leu Ala Asn Thr Glu Ile Asn Ser Gln Arg Ile Ala
1 5 10 15
Ala Val Glu Ser Cys Phe Gly Ala Ser Gly Gln Pro Leu Ala Leu Pro
20 25 30
Gly Arg Val Leu Leu Gly Glu Gly Val Leu Thr Lys Glu Cys Arg Lys
35 40 45
Lys Ala Lys Pro Arg Ile Phe Phe Leu Phe Asn Asp Ile Leu Val Tyr
50 55 60
Gly Ser Ile Val Leu Ser Lys Arg Lys Tyr Arg Ser Gln His Ile Ile
65 70 75 80
Pro Leu Glu Glu Val Thr Leu Glu Pro Leu Pro Glu Thr Leu Gln Ala
85 90 95
Lys Asn Arg Trp Met Ile Lys Thr Ala Lys Lys Ser Phe Val Val Ser
100 105 110
Ala Ala Ser Thr Thr Glu Arg Gln Glu Trp Ile Ser His Ile Glu Glu
115 120 125
Cys Val Arg Arg Gln Leu Leu Ala Thr Gly Arg Gln Pro Thr Thr Glu
130 135 140
His Ala Ala Pro Trp Ile Pro Asp Lys Ala Thr Asp Ile Cys Met Arg
145 150 155 160
Cys Thr Gln Thr Arg Phe Ser Ala Leu Thr Arg Arg His His Cys Arg
165 170 175
Lys Cys Gly Phe Val Val Cys Ala Glu Cys Ser Arg Glu Arg Phe Leu
180 185 190
Leu Pro Arg Leu Ser Pro Lys Pro Leu Arg Val Cys Ser Leu Cys Tyr
195 200 205
Arg Glu Leu Ala Ala Gln Lys Leu Arg Glu Glu Ala Arg Glu Gly Ile
210 215 220
Gly Gly Ser Pro Pro Gln Leu Ser His Leu Gly Gly Thr Val Cys Gly
225 230 235 240
Ala Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Ser Asp Glu Asp Arg Glu Gly Asn
245 250 255
Gly Asp Gly Asp Trp Pro Thr Gln Val Glu Phe Tyr Ala Ser Gly Val
260 265 270
Ser Trp Ser Ala Phe His Ser
275

Claims (32)

1.含PH和FYVE结构域的溶酶体相关凋亡诱导蛋白(LAPF)、其编码序列或其促进剂在制备用于预防和/或治疗细菌引起的感染性疾病及其相关病症和/或症状的产品中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其中，所述感染相关病症和/或症状为选自下组中的一种或多种：感染后炎症因子的过量产生；内毒素性休克或死亡；器官的炎性损伤；多器官功能衰竭。
3.如权利要求2所述的用途，其中，所述炎症因子为选自下组的一种或多种：TNFα、IL-1、IL-6或IFN-I。
4.如权利要求2所述的用途，其中，所述炎症因子为选自下组的一种或多种：TNFα、IL-1或IL-6。
5.如权利要求2所述的用途，其中，所述器官选自：肝脏、脾脏、脑、肾、心脏、肺、胃、肠。
6.如权利要求1所述的用途，其中，所述细菌为选自下组中的一种或多种：大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、粪肠球菌、芽孢杆菌、嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、幽门螺杆菌、肉毒杆菌、炭疽芽孢杆菌、肠杆菌、奈瑟氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、念珠菌或其组合。
7.如权利要求1所述的用途，其中，所述LAPF选自：
(a) SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列；
(b) 与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列同源，且具有抑制细菌引起的感染性疾病及其相关病症和/或症状活性的氨基酸序列；
(c) (a)或(b)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸、且具有预防或治疗细菌引起的感染性疾病及其相关病症和/或症状活性的由(a)或(b)衍生的蛋白质或多肽。
8.如权利要求7所述的用途，其中，(b)中所限定的序列与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列80%以上同源。
9.如权利要求7所述的用途，其中，(b)中所限定的序列与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列85%同源。
10.如权利要求7所述的用途，其中，(b)中所限定的序列与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列90%同源。
11.如权利要求7所述的用途，其中，(b)中所限定的序列与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列95%同源。
12.如权利要求7所述的用途，其中，(b)中所限定的序列与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列98%同源。
13.如权利要求7所述的用途，其中，(b)中所限定的序列与SEQ ID NO：2或4的氨基酸序列99%同源。
14.如权利要求1所述的用途，其中，所述LAPF的编码基因选自：
(i) SEQ ID NO：1或3的核苷酸序列；
(ii) 在严格条件下与(i)限定的序列杂交，且具有预防或治疗细菌引起的感染性疾病及其相关病症和/或症状的分子。
15.如权利要求1所述的用途，其中，所述促进剂选自：提高LAPF蛋白水平或促进LAPF功能的物质。
16.如权利要求15所述的用途，其中，所述促进剂选自：LAPF表达载体、外源性LAPF、LAPF编码序列的裸DNA、LAPF编码序列的脂质体包裹DNA、能够在体内转化为LAPF的LAFP前体蛋白或偶联物或复合物。
17.如权利要求1所述的用途，其中，所述LAPF选自：天然纯化的LAPF蛋白、化学合成的产物、或使用重组技术从原核或真核宿主中产生。
18.如权利要求1所述的用途，其中，所述LAPF为人LAPF。
19.如权利要求17所述的用途，其中，所述宿主选自：细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞。
20.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品为药物组合物。
21.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品的形式使其适于采用选自下组的方式给予：口服、注射、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒DNA法、复制缺陷腺病毒携带目的DNA法或目的基因所编码蛋白质、电致孔。
22.如权利要求1所述的用途，其中，所述产品的形式使其适于采用选自下组的方式给予：直接裸DNA或蛋白质注射法、脂质体包裹DNA或蛋白质注射法。
23.一种药物组合物，其包含：
(A) 治疗或预防有效量的LAPF、其编码序列或其促进剂；
(B) 药学上或免疫学上可接受的载体或赋形剂；
(C) 一种或多种预防或治疗细菌引起的感染性疾病及其相关病症和/或症状的其它活性物质。
24.如权利要求23所述的药物组合物，其中，在给予所述药物组合物之前、同时或之后，给予所述的其它活性物质。
25.如权利要求23所述的药物组合物，其中，所述其它活性物质为一种或多种：临床常用抗生素。
26.如权利要求25所述的药物组合物，其中，所述临床常用抗生素选自：β-内酰胺类、氨基糖甙类、四环素类、氯霉素类、大环内酯类、抗真菌抗生素、抗结核类抗生素。
27.如权利要求25所述的药物组合物，其中，所述临床常用抗生素选自：青霉素类和头孢菌素类。
28.如权利要求23所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中LAPF、其编码序列或促进剂占药物组合物总重量的0.001～99.9wt%。
29.如权利要求23所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中LAPF、其编码序列或促进剂占药物组合物总重量的1～95wt%。
30.如权利要求23所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中LAPF、其编码序列或促进剂占药物组合物总重量的5～90wt%。
31.如权利要求23所述的药物组合物，其中，所述药物组合物中LAPF、其编码序列或促进剂占药物组合物总重量的10～80wt%。
32.一种筛选通过促进LAPF来抗细菌感染的药物的方法，其包括：
(A) 用候选物质处理被细菌感染的细胞、组织或动物；
(B) 检测所述细胞、组织或动物中LAPF或其编码序列的水平；以及
(C) 若LAPF或其编码序列的水平高于候选物质处理前的水平或高于正常对照中的水平，则表明所述候选物质具有通过促进LAPF来抗细菌感染的作用。
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