WO2012142930A1 - 抗脂肪酸合成酶多肽及其应用 - Google Patents

Description

抗脂肪酸合成酶多肽及其应用 技术领域

本发明涉及多肽药物领域， 具体涉及抗脂肪酸合成酶的多肽和编 码此多肽的多核苷酸， 以及它们的应用。 背景技术

脂肪酸合成酶 （Fatty acid syntheses, FAS ) 是生物体内源性脂肪 酸合成过程中的关键酶， 它通过催化乙酰辅酶 A和丙二酰辅酶 A而生 成长链脂肪酸。 FAS包括乙酰基转移酶（AT)、丙二酰基转移酶（MT)、 β-酮脂酰合酶（KS )、 β-酮脂酰还原酶（KR)、 β-羟脂酰脱水酶（HD)、 烯脂酰还原酶 （ER) 及硫酯酶 （ΤΕ) 等 7个功能域。 FAS与肥胖密切相 关， 在脂肪组织中有较高的表达。 同时， FAS在人的肝脏中甚至有更高 的表达， 肝脏的脂肪酸合成能力较脂肪组织高 8〜9倍， 因此， FAS也与 脂肪肝的形成密切相关。 脂肪肝， 是指由于各种原因引起的肝细胞内 脂肪堆积过多的病变。 此外， 传统的理论认为脂肪酸合成代谢只是一 个能量合成存储途径而已， 但目前大量研究表明， 乳腺癌、 肝癌、 前 列腺癌、 卵巢癌、 结直肠癌和子宫内膜癌等肿瘤组织中 FAS的表达水平 远高于正常组织，而抑制 FAS在上述肿瘤组织的活性可明显抑制肿瘤的 生长。 因此， FAS也正日益成为治疗上述疾病的药物新靶标。 因此， 研究 FAS抑制剂对于抑制内源性脂肪酸生物合成， 从而有 效地控制肿瘤、 脂肪肝、 肥胖及各种相关代谢综合症等疾病的发生、 发展具有重要的意义。 已有研究显示， FAS的特异性小分子抑制剂可以 通过抑制 FAS， 进而减少脂肪酸的合成。 由于脂肪酸合成受阻， 导致其 底物丙二酰辅酶 A浓度升高， 可直接作用于下丘脑的进食中枢， 抑制 促进摄食的神经肽 Y的分泌， 从而导致进食抑制。 此外， FAS抑制剂还 可以改善非胰岛素依赖型糖尿病， 降低高血压、 冠状动脉栓塞及其它 肥胖并发症的症状， 降低其发病率。 目前已知， 硫内酯类 C75结构类似 物、 丁内酯类及丁内酰胺类化合物、 尿素类化合物、 多酚类植物提取 物和羟基喹啉类化合物等化学物质均可能具有抑制脂肪酸生物合成酶 的作用。 但这些化合物抑制剂作为药物均有较强的毒副作用， 且有些 化学性质不稳定， 因此在临床应用中受到诸多限制。 发明内容

本发明涉及一种抗脂肪酸合成酶（FAS )的多肽， 其具有抑制 FAS 转录和表达的作用， 进而在体内外抑制 FAS的表达。 该多肽和它的肽 模拟物， 包括它们的功能片段和功能变体， 以及编码这些多肽、 肽模 拟物或它们的功能片段、 功能变体的基因， 可广泛用于预防和治疗肿 瘤、 脂肪肝和肥胖的发生和发展， 包括抑制肝癌细胞的生长和发展。 一方面， 本发明提供了分离的多肽或肽模拟物， 其包含如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列、 或其功能片段或功能变体， 所述多肽或肽模 拟物具有抑制 FAS转录和表达的功能， 可广泛用于预防和治疗肿瘤、 脂肪肝和肥胖的发生和发展， 包括抑制肝癌的发生和发展。 在本发明的一些实施例中， 上述多肽或肽模拟物可以包含与如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列具有至少 80%， 或者 90%， 或者 95%， 以及甚至更高的相同性的氨基酸序列。 在本发明的另外一些实施例中， 这些多肽或肽模拟物包含在如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的中间或端侧添加或缺失一个或数个 氨基酸， 或者对其序列中的一个或数个氨基酸残基进行置换后得到的 氨基酸序列。 较优选地， 这些多肽或肽模拟物包含在如 SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列的端侧添加或缺失一个氨基酸后得到的氨基酸， 或 者对其氨基酸序列中的一个氨基酸残基进行保守性置换后得到的氨基 酸序列。 更优选地， 这些多肽或肽模拟物包含如 SEQ ID NOs: 1-6所示 的任一种氨基酸序列。 另一方面， 本发明提供分离的多核苷酸， 所述多核苷酸包含编码 如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列、 其功能片段或功能变体的多核苷 酸； 或者包含与编码如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列、 其功能片段 或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。 优选地， 所述如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的功能片段或功能变体包含在如 SEQ

ID NO: 1所示的氨基酸序列的中间或端侧添加或缺失一个或数个氨基 酸， 或者对其序列中的一个或数个氨基酸残基进行置换后得到的氨基 酸序列。 较优选地， 所述如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的功能片 段或功能变体包括在如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的中间或端侧 添加或缺失一个氨基酸所得到的氨基酸序列， 或者对上述如 SEQ ID

NO: 1 所示的氨基酸序列中的一个氨基酸残基进行保守性置换后得到 的氨基酸序列。 更优选地， 上述如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列的 功能片段或功能变体包括如 SEQ ID NOs: 2-6所示的任一种氨基酸序 列。 另一方面， 本发明还提供含有外源多核苷酸的重组表达载体， 其 包含上述编码如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列、 其功能片段或功能 变体的多核苷酸； 或者包含与上述编码如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列、 其功能片段或功能变体的多核苷酸互补或严格杂交的多核苷酸。 此外， 本发明也提供上述多肽或肽模拟物、 核苷酸以及重组表达 载体在制造用于预防和治疗肿瘤、 脂肪肝和肥胖的药物中的应用。 在 一个具体实施例中， 所述药物可应用于在体内外抑制肝癌细胞的生长， 从而可应用于预防和治疗肝癌。 所述药物也可以包含药物组合物， 这 些药物组合物可以包含任选的药物载体。 本发明中， 所述的多肽及其肽模拟物， 包括它们的功能片段和功 能变体， 作为抗 FAS的有效抑制因子， 具有抑制 FAS的转录和表达的 功能， 从而能用于预防和治疗肿瘤、 脂肪肝和肥胖的发生和发展， 包 括预防和治疗肝癌的发生和发展。 值得强调的是， 本发明提供的上述 多肽， 水溶性好， 性质稳定， 无免疫原性， 且具有明显的药效学作用， 因此可以成为治疗上述疾病的有效药物。 附图说明

图 1.应用高压液相色谱 （HPLC ) 对纯化后人工合成多肽

Anti-FAS-P18进行分析， 显示所获得的多肽的纯度为 98.11%。

图 2.应用报告基因检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞中 SREBP-lc和 FAS启动子的影响。结果显示， -Anti-FAS-P18对 HepG2 细胞中 SREBP-lc和 FAS启动子的活性具有抑制作用， 且该抑制作用 呈剂量依赖性， 表明本发明的多肽基因表达产物具有抑制 FAS基因转 录表达的作用。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test统计学分析。

图 3.检测本发明的多肽及其变异体在细胞水平对肝癌细胞 HepG2 中 SREBP-lc和 FAS启动子活性的影响。 结果显示， 人工合成的多肽 Anti-FAS-P18对肝癌 HepG2细胞中 SREBP-lc和 FAS启动子的活性具 有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性， 表明本发明的多肽具有抑 制 FAS基因转录活性的作用。 而 100 μΜ的本发明多肽 Anti-FAS-P18 的变异体 P18-1至 P18-5对 SREBP-lc和 FAS启动子的活性也有不同程 度的抑制作用。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test统计学分析。

图 4.应用免疫印迹检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞中 FAS 蛋白表达水平的影响。结果显示， p-Anti-FAS-P18对 HepG2细胞中 FAS 蛋白表达水平具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性。

图 5.应用免疫印迹检测本发明的多肽对肝癌细胞中 FAS蛋白表达 水平的影响。 结果显示， 人工合成的多肽 Anti-FAS-P18对 HepG2细胞 中 FAS蛋白表达水平具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性。

图 6.应用报告基因检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞中

NF-κΒ 启动子的影响。 结果显示， p-Anti-FAS-P18 对 HepG2 细胞中 NF-κΒ 启动子的活性具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性， 表 明肝癌细胞的增殖能力下降。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test 统计学分析。

图 7.应用报告基因检测本发明的多肽及其变异体对肝癌细胞中 NF-κΒ启动子的影响。结果显示， Anti-FAS-P18对 HepG2细胞中 NF-KB 启动子的活性具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性， 表明肝癌 细胞的增殖能力下降。 100 μΜ 的本发明多肽 Anti-FAS-P18 的变异体 P18-1至 P18-5对 NF-KB的活性也有不同程度的抑制作用。 * P<0.05， ** P<0.01 , 进行 Student's t test统计学分析。

图 8.应用 MTT 检测本发明的多肽基因质粒对肝癌细胞增殖的影 响。 结果显示， p-Anti-FAS-P18对 HepG2细胞的增殖具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test 统计学分析。

图 9. 应用 MTT检测本发明的多肽及其变异体在细胞水平对肝癌 细胞增殖的影响。 结果显示， 人工合成的多肽 Anti-FAS-P18具有抑制 HepG2细胞增殖的作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性。 100 μΜ的本发 明多肽 Anti-FAS-P18的变异体 P18-1至 P18-5对肝癌 HepG2细胞的增 殖也有不同程度的抑制作用。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test 统计学分析。

图 10.人工合成的多肽 Anti-FAS-P18对 HepG2细胞的作用。 裸鼠 接种实验结果显示， 应用本发明人工合成的多肽 Anti-FAS-P18 对 HepG2细胞的生长和增殖具有明显的抑制作用。 ** P<0.01， Student's t test统计学分析

图 11 : 人工合成的多肽 Anti-FAS-P18 ( P18 ) 对裸鼠体重的影响。 裸鼠接种实验中， 应用人工合成的多肽 Anti-FAS-P18对裸鼠的体重无 明显影响。

图 12. 构建多肽真核表达载体的连接示意图 具体实施方式

本发明中， 包括说明书和权利要求书， 使用的下列术语除非特别 说明， 具有如下的含义：

"分离的" 一词是指将物质从它原始的环境 （例如， 若是自然产 生的就指其天然环境） 分离出来。 比如说， 一个自然产生的多核苷酸 或多肽存在于活动物中就是没有被分离出来， 而同样的多核苷酸或多 肽同一些或全部在自然系统中与之共存的物质分开就是分离的。 这样 的多核苷酸或多肽可以是某一载体的一部分， 也可以是某一组合物的 一部分。 既然载体和组合物不是它的天然环境的成分， 它们仍然是分 离的。

"纯化的" 一词意指已经在纯度上提高的。 "纯度" 在这是相对 术语， 并不必要地解释为绝对纯度。 例如， 纯度可以是至少约 50%， 或 可以是大于 60 %、 70 %、 80 %、 90 %、 或可以是 100%。 如本发明中所用， 分离的物质是从其原始环境中分离出来。 活体 细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离的， 但同样的多核 苷酸和多肽如与天然状态中存在的其它物质分开， 则为分离的， 同时 纯度上得到了提高， 也因此是纯化的。 "核酸" 、 "核酸序列" 或 "碱基序列" 是指核苷酸， 寡核苷酸 或多核苷酸及其片段或部分。 本发明的核酸能够以 RNA (例如 mRNA) 的形态、 或 DNA的形态 （例如 cDNA或基因组 DNA) 存在。 DNA可以 是双链， 也可以是单链。 单链 DNA或 RNA可以是编码链 （有义链） 、 或非编码链 （反义链） 中任一种。 另外， 本发明的多核苷酸也可以在 其 5 ' 端或 3 ' 端融合编码标签标记 （标签序列或标记物序列） 的多核 苷酸。它们可以是合成的或是从天然来源获得的（例如分离和 /或纯化）， 其可以包含天然的、 非天然的或者修饰过的核苷酸， 并且其可以包含 天然的、 非天然的或改变的核苷酸之间的键， 诸如氨基磷酸酯键或硫 代磷酸酯键， 用来代替在未修饰的寡核苷酸中核苷酸之间存在的磷酸 二酯键。 所谓 "氨基酸序列"或 "多肽"是指肽、 寡肽、 多肽或蛋白质及 其部分片段， 其间以肽键相连接的氨基酸。 当本发明中的 "氨基酸序 列" 涉及一种天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列时， 这种 "多肽" 或 "蛋白质" 并不意味着将氨基酸序列限制为与所述蛋白质分子相关 的完整的天然氨基酸序列。 本发明的氨基酸序列可以含有附加的肽。 作为附加的肽， 如多组氨酸标签 （His-tag) 、 或 Myc、 FLAG等表位标 记的肽为例。 "缺失" 是指在氨基酸序列或核苷酸序列中一个或多个氨基酸或 核苷酸的缺失。

"插入" 或 "添加" 是指在氨基酸序列或核苷酸序列中的改变导 致与天然存在或改变前的分子相比， 一个或多个氨基酸或核苷酸的增 力口。

"置换" 是指由不同的氨基酸或核苷酸替换一个或多个氨基酸或 核苷酸。 "缺失、 置换或添加一个或多个氨基酸或核苷酸" 则是指， 利用 定位诱变法等公知的突变核酸或多肽的制作法缺失、 置换或添加一个 或多个氨基酸或核苷酸， 或对天然存在的核酸或多肽的上述突变进行 分离纯化。 对氨基酸的突变， 可以包含有一个或多个氨基酸残基为 D- 型构象的氨基酸、 自然界存在的稀有氨基酸、 或者是人工修饰的氨基 酸， 这些氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的。 与此相类似 的， 诱导核酸发生突变， 可以包括自然界天然存在的核苷酸， 也可以 包括具有修饰的核苷酸。 多肽的 "功能片段" 是指所述多肽的任何部分， 该部分保留其作 为一部分的多肽 （即 "亲本" 多肽） 的基本相似或相同的生物学活性 和功能。 多肽的 "功能变体" 是指基本上保持如所述多肽或氨基酸序 列相同或相似的生物学功能或活性的氨基酸序列， 它们可以包括， 例 如， 1 )原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基有缺失和 /或一个或多个 氨基酸残基被添加； 或者 2) 原氨基酸序列中一个或多个氨基酸残基被 保守或非保守氨基酸残基置换； 或者 3 ) 原氨基酸序列中一个或多个氨 基酸残基上的某个基团被其它基团取代； 或者 4 ) 原氨基酸序列和另外 的分子或化合物 （比如糖、 脂类、 聚乙二醇等） 的融合； 或者 5 ) 原有 的氨基酸序列与添加的氨基酸序列融合进而形成的多肽序列 （如前导 序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列等） ； 或者 6 ) 原氨基酸序列 的逆反类似物； 或者 7 ) 以上各种情况的混合。 本发明中， 氨基酸序列 的功能变体， 可以包含有一个或多个氨基酸残基构象为 D-型的氨基酸， 自然界存在的稀有氨基酸或人工修饰的氨基酸， 这些氨基酸可以是也 可以不是由遗传密码子编码的。 多肽的 "逆反类似物" 是指包括反转的亲本多肽氨基酸序列的多 肽， 以致所述逆反类似物的氨基酸序列 （当从 N端向 C端读取时） 与当 从 C端向 N端读取时的亲本多肽的氨基酸序列相同； 此外， 逆反类似物 中每一个氨基酸是该氨基酸的 D异构体， D异构体与 L异构体相反。 例 如， 三肽 Val-Ala-Gly的逆反类似物具有氨基酸序列 Gly-Ala-Val， 其中 每个氨基酸是 D异构体。 本发明中， "肽模拟物" 是指具有与相对应多肽基本相同的通用 结构且具有例如能增加其稳定性或生物学功能的修饰的化合物。 肽模 拟物包括， 例如， 包含与相对应多肽的相同氨基酸序列的那些化合物， 但在其中两个或更多个氨基酸之间， 肽模拟物具有改变的主链。 所述 肽模拟物可以包括合成的或非天然存在的氨基酸， 用来代替天然存在 的氨基酸。 本发明中， 核苷酸序列的 "简并变异体"是这样的多核苷酸序列， 其与亲本核苷酸序列有区别， 但编码的蛋白质或多肽和亲本核苷酸序 列所编码的蛋白质或多肽一样。

"核酸杂交"在本领域已公知（参见，例如 Sambrook等， Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed.， Cold Spring Harbor Laboratory, 2001 ) 。 通常， 温度越高， 盐浓度越低， 则严谨性变得越高 （难以杂 交） ， 从而能够取得更加相同的多核苷酸。 适合的杂交温度根据碱基 序列或其碱基序列的长度而异。 另外， 本发明还涉及在 "严格条件" 下杂交。 本发明中， "严格条件" 是指， 在较低离子强度和较高温度 下的杂交和洗脱。例如， 在 42°C的条件下、在杂交溶液（含 50%甲酰胺、 5 X SSC( 150mM 氯化钠 +15mM柠檬酸三钠）、 50mM的磷酸钠（pH7.6 )、

5 X邓哈特溶液、 10%硫酸葡聚糖和 20 g/ml的变性剪切鲑鱼精子 DNA) 中孵育过夜， 然后在 65 °C条件下用 0.1 X SSC洗脱。

"同源性" 是指互补的程度， 可以是部分同源， 也可以是完全同 源。 "部分同源" 是指一种部分互补的序列， 其可部分抑制完全互补 的序列与靶核酸的杂交。 这种抑制可通过在严格性程度降低的条件下 进行杂交（Southern 印迹或 Northern印迹等） 来检测。 基本同源的序列 或杂交探针可竞争和抑制完全互补的序列与靶序列在严格性程度降低 的条件下的结合。 当然， 严格性降低的条件并非允许非特异性的结合， 两条序列相互结合， 仍然需要特异性或选择性的相互作用。 氨基酸序列或核苷酸序列的 "相同性" 或 "同一性" 百分率是指 在两种或多种氨基酸或核苷酸序列比较中， 序列相同或相似的百分率。 有很多本领域技术人员熟知的方法测定相同性百分率， 如通过 MEGALIGN程序 ( Lasergene software package, DNASTA, Inc., Madison,

WI) 。 MEGALIGN程序可根据不同的方法如 Cluster法比较两种或多种 序列 (参见 Higgins & Sharp, Gene 73:237-244, (1988) ) ， Cluster法通过 检査所有配对之间的距离将各组序列排列成簇， 然后将簇以成对或成 组分配。 两个氨基酸序列如序列 A和序列 B之间的相同性百分率可以通 过下式计算：

[ (序列 A与序列 B之间匹配的残基个数） I (序列 A的残基数 -序列 A中间隔残基数 -序列 B中间隔残基数） ] X 100% 同理， 也可以通过 Gluster法或其他本领域已知的方法 （参见 Hein J., Methods in Emzumology 183:625-645, 1990 ) ， 测定核酸序列的相同 性百分率。

"重组表达载体" 是指遗传修饰的寡核苷酸或多核苷酸重组体， 该重组体克隆有编码 mRNA 、 蛋白、 多肽、 或肽的核苷酸序列， 当该 表达载体进入宿主细胞后可表达相应的 mRNA、 蛋白、 多肽、 或肽。 本 发明中， 重组表达载体可以包含任意类型的核苷酸序列， 但不仅限于 是 DNA或 RNA， 可为单链或双链、 人工合成或来自天然， 也可为非天 然的或改变的核苷酸。 核苷酸之间的键可以是天然存在的、 也可以是 非天然存在的或修饰的。 本发明中， "治疗" 和 "预防" 以及由它们派生的词语， 但并不 意味是 100 %的或完全的治疗或预防， 可以认定为本领域技术人员所认 同的治疗或预防程度。 本发明中的 "预防" 可理解为延迟疾病、 或其 症状或病症的发作。 多肽

本发明涉及分离或纯化的多肽， 该多肽可以是包含、 基本由、 或 由 氨 基 酸 序 列 Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Ph e-Thr ( SEQ ID NO: 1 ) 所组成的多肽。

FAS基因的表达受其上游调控因子固醇类调节元件结合蛋白 lc ( sterol regulatory element binding protein lc, SERBP-lc ) 的调控。 当 SERBP-lc转录活性受到抑制时， FAS基因的表达水平下调。 因此， 调 控 SERBP-lc启动子的活性， 可间接调节 FAS基因的表达。 上述本发明 的多肽， 可以通过抑制 SERBP-lc的转录， 进而发挥抑制 FAS转录和表 达的作用， 因此可以用于预防和治疗肿瘤、 脂肪肝和肥胖的发生和发 展， 包括抑制肝癌细胞的发生和发展。 所述抑制作用在分子水平、 细胞水平和动物水平均有体现。 如所 述多肽在分子水平上可以抑制 SREBP-lc和 FAS启动子的活性， 并下调 FAS蛋白的表达水平， 从而构成对 FAS的有效抑制， 且其抑制效果呈量 效关系； 所述多肽的上述抑制作用也体现在细胞水平上， 如所述多肽 通过抗 FAS的作用能抑制体外肿瘤细胞的生长和增殖，且其抑制效果也 呈量效关系； 通过裸鼠接种方法显示， 所述多肽在动物水平也能有效 抑制肿瘤细胞的成瘤能力， 而同时， 所述多肽对裸鼠体重无影响。 本发明还提供所述本发明多肽的各种功能片段。 所述功能片段可 以是本发明多肽的连续氨基酸序列的任何片段， 条件是其与亲本多肽 相比， 能以相似程度、 相同程度、 或更高程度保留亲本多肽的生物活 性， 例如抑制 FAS转录和表达的活性。 参照亲本多肽， 所述功能片段可 以具有例如亲本多肽的约 10%、 20%、 30%、 40%、 50 %、 60%、 70%、 80 %、 90 %、 95%、 100%、 105%、 1 10%、 120%、 150%、 200% 或更 高的活性。 本发明多肽的功能片段， 优选包括与所述亲本多肽具有至 少 70%的序列同一性的氨基酸序列。 另外， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体也包括在本发明范 围之内。 所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体保留与所述亲本 多肽或亲本功能片段基本相似、 相同、 甚至是增强的生物活性， 例如 抑制 FAS的转录和表达， 以及有效地抑制肿瘤细胞的生长和增殖。参照 所述亲本多肽或其功能片段， 所述功能变体可以与所述亲本多肽或其 功能片段的氨基酸序列至少有约 50 %、 60%、 70 %、 80 %、 90 %、 95% 或 100%的同一性。 优选地， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体与 所述亲本多肽或其功能片段具有至少 80%、 或 90%、 或 95%、 甚至更高 的序列同一性。 更优选的， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体与 所述亲本多肽及其功能片段只有一个或数个氨基酸的区别。 在一些特 别优选的实施例中， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体与所述亲 本多肽或亲本功能片段仅仅只有一个氨基酸的区别。 所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体可以包括由亲本多肽 或亲本功能片段氨基酸通过置换得到的氨基酸序列。 例如， 它们可以 包含具有至少一个保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片段氨基酸 序列。 具体来说， 所述本发明的多肽及其功能片段的功能变体可以包 含具有 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 或更多个保守氨基酸置换的亲本多 肽或亲本功能片段的氨基酸序列。 另外， 所述本发明的多肽及其功能 片段的功能变体也可以包含具有至少一个非保守氨基酸置换的亲本多 肽或亲本功能片段的氨基酸序列。 具体来说， 可以包括具有 1个、 2个、 3个、 4个、 5个、 或更多个非保守氨基酸置换的亲本多肽或亲本功能片 段的氨基酸序列。 在这些情形中， 对于所述的氨基酸置换， 优选的是 不妨碍或抑制所述功能变体的生物学功能或活性。 更优选地， 所述氨 基酸置换提高本发明的多肽及其功能片段的功能变体的生物学功能或 活性， 以致当与所述亲本多肽或亲本功能片段相比较时， 所述功能变 体的生物学功能或活性提高。 优选地， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体包括一个或数个 保守氨基酸置换。 在本领域内， 保守氨基酸置换是公知的， 它指的是 这样的氨基酸置换， SP， 其中一个具有某种物理和 /或化学特性的氨 基酸被换为另一个具有相同化学或物理特性的氨基酸。 本领域技术人 员了解， 保守性的氨基酸置换可以不造成蛋白质的结构或功能的显著 改变。 典型的保守性置换包括， 例如， 用酸性氨基酸置换另一个酸性 氨基酸 （例如 Asp或 Glu) ， 用具有非极性侧链的氨基酸置换另一个具 有非极性侧链的氨基酸 （例如 Ala、 Gly、 Val、 lie, Leu、 Met, Phe、 Pro, Trp、 Val等） ， 用碱性氨基酸置换另一个碱性氨基酸 （Lys、 Arg 等） ， 用具有极性侧链的氨基酸置换另一个具有极性侧链的氨基酸 (Asn、 Cys、 Gln、 Ser、 Thr、 Tyr等） ， 用芳香氨基酸 （Trp、 Phe、 Tyr 等） 置换另一个芳香氨基酸， 等。 所述功能变体还可以通过在所述多肽及其功能片段的中间、 其氨 基或羧基端、 和 /或其氨基以及羧基两端， 添加和 /或缺失一个或多个氨 基酸而得到。 优选地， 所述添加或缺失的氨基酸不妨碍所述多肽或功 能片段的生物学功能和活性， 例如， 抑制 FAS的转录和表达， 并有效地 抑制肿瘤细胞， 包括肝癌细胞的生长和增殖。 更优选地， 当与所述亲 本多肽的生物学活性相比较时， 所述额外的氨基酸能够导致增强的生 物学活性。 另外， 本发明的多肽及其功能片段的功能变体还可以包括本发明 的多肽或其功能片段的逆反类似物。 本发明中， "逆反类似物 " 是指 包括反转的亲本多肽氨基酸序列的多肽， 以致所述逆反类似物的氨基 酸序列（当从 N端向 C端读取时）与当从 C端向 N端读取时的亲本多肽的 氨基酸序列相同。 此外， 关于逆反类似物， 每一个氨基酸是该氨基酸 的 D异构体， D异构体与 L异构体相反。 例如， 三肽 Val-Ala-Gly的逆反 类似物具有氨基酸序列 Gly-Ala-Val， 其中每个氨基酸是 D异构体。本发 明中， 所述此类的功能变体优选包括 SEQ ID NO: 1的逆反类似物。 本发明的多肽、 其功能片段或功能变体可以是任意长度的， 艮卩， 可以包括任意数目的氨基酸， 条件是所述多肽 （包括功能片段） 及其 功能变体保留必要的生物学活性， 例如， 抑制 FAS的转录和表达， 以及 有效地抑制癌细胞， 优选是肝癌细胞。 举例来说， 本发明的多肽 （包 括功能片段和功能变体）可以是 4-2000个氨基酸长， 如长度为 5， 6， 7， 8， 9， 10， 11， 12, 13, 14， 15， 16， 18， 20, 25, 30, 40， 50， 60， 70， 80， 90， 100， 125

150， 175， 200， 300， 400， 500， 700， 800， 1000或更多。 优选地， 本发明的 多肽长度在 30个氨基酸以内， 且能满足作为多肽药物的药效学和半衰 期的要求。 在本发明的一些具体实施例中， 本发明提供的多肽具有与如 SEQ

ID NO: 1所示的氨基酸序列具有一个或数个氨基酸区别的氨基酸序列， 包括例如 1个、 2个、 3个、 4个、 5个氨基酸的区别。 这些氨基酸序列可 以通过，例如，在 SEQ ID NO: 1的端侧或中间添加或缺失一个或数个氨 基酸残基，或者将 SEQ ID NO: 1中的某个或某数个氨基酸残基进行替换 等方法获得。这样所获得的功能变体具有与亲本多肽 SEQ ID NO: 1相似 的生物学活性和功能， 例如， 抑制 FAS的转录和表达， 以及有效地抑制 肿瘤细胞， 包括肝癌细胞。 优选地， 这些功能变体可以通过在亲本多 肽 SEQ ID NO: 1的端侧添加一个氨基酸， 或将亲本多肽 SEQ ID NO: 1 中的某个氨基酸进行保守置换得到。 在本发明的一个特定的实施例中， 本发明提供的多肽包括如 SEQ ID NOs: 1-6所示的氨基酸序列中的任一 种氨基酸序列。 本发明还提供所述多肽（包括其功能片段和功能变体） 的模拟物。 在一个优选的实施方案中， 所述肽模拟物是拟肽。 拟肽是指这样的肽 模拟物， 其中每个氨基酸的侧链粘附在氨基酸的氮原子上而不是 α碳 上。 例如， 拟肽可以被视为 Ν-置换的甘氨酸， 其具有 NRCH2CO通用结 构的重复单位， 并且其具有与相对应的多肽相同或基本相同的氨基酸 序列。 在另一个优选的实施方案中， 所述肽模拟物包括改变的主链， 其中在每个氨基酸之间的键是甲基化的。 在这一点上， 所述肽模拟物 可以包括下述结构的甲基化肽主链：

...NCH3 - C_a- CO - NCH3 - C_a- CO...

I I

侧链 侧链 本发明的多肽 （包括其功能片段和功能变体） 以及肽模拟物中， 可以包括用合成的氨基酸来置换天然存在的氨基酸。 所述合成的氨基 酸在本领域内是已知的， 包括例如氨基环己烷羧酸、 正亮氨酸、 a-氨基 正癸酸、 高丝氨酸、 S-乙酰氨基甲基 -半胱氨酸、 反式 -3-羟脯氨酸、 反 式 -4-羟脯氨酸、 4-氨基苯丙氨酸、 4-苯甲酰苯丙氨酸、 4-硝基苯丙氨酸、

4-氯苯丙氨酸、 4-羧基苯丙氨酸、 β-苯基丝氨酸、 β-羟基苯丙氨酸、 苯 基甘氨酸、 a-萘基丙氨酸、 环己基丙氨酸、 环己基甘氨酸、 二氢吲哚 -2- 羧酸、 1，2，3，4-四氢异哇琳 -3-羧酸、 氨基丙二酸、 氨基丙二酸单酞胺、 Ν'-苄基 -Ν'-甲基-赖氨酸、 Ν',Ν'-二苄基-赖氨酸、 6-羟基赖氨酸、 鸟氨 酸、 a-氨基环戊烷羧酸、 a-氨基环己烷羧酸、 a-氨基环庚烷羧酸、 a-(2- 氨基 -2-降冰片烷) -羧酸、 α，γ-二氨基丁酸、 α，β-二氨基丙酸、 高苯丙氨 酸、 和 α-叔-丁基甘氨酸。 本发明的多肽 （包括其功能片段和功能变体） 以及肽模拟物还可 以例如被脂化 （例如脂肪酸化） 、 糖基化、 酰胺化、 羧酸化、 磷酸化、 酯化、 Ν-酰化、 通过二硫键环化、 转化成酸加成盐、 二聚体化或多聚 体化， 和 /或缀合化。 举例来说， 本发明所述多肽 （包括其功能片段和功能变体） 以及 肽模拟物可以是脂化衍生物。 所含的脂质分子可以包括本领域己知的 任何脂质， 例如脂肪酸、 磷脂基团、 糖磷脂酰肌醇、 磷脂酰丝氨酸、 磷脂酰乙醇胺、 鞘磷脂、 磷脂酰胆碱、 心磷脂、 磷脂酰肌醇、 磷脂酸、 溶血磷酸甘油酯、 和胆固醇基团。 优选地， 所述脂化衍生物是脂肪酸 衍生物， 所述脂肪酸分子可以是任何 C8-C20脂肪酸， 例如月桂酸、 棕 榈酸、 肉豆蔻酸、 硬脂酸、 油酸、 亚油酸、 亚麻酸、 花生四烯酸、 二 十碳五烯酸、 芥酸、 或花生酸等。 所述脂肪酸还可以在任意碳原子上 任选地包含其它官能团， 例如一个或多个氨基。 所述脂肪酸分子可以 附着在本发明多肽 （包括功能片段和功能变体） 以及肽模拟物的任何 适当的部分。 例如， 在本发明的多肽氨基端、 羧基端、 或氨基和羧基 两端包括脂肪酸分子。 脂肪酸分子可以直接或通过连接体附着到本发 明的多肽 （包括功能片段和功能变体） 以及肽模拟物上。 本发明的多肽 （包括功能片段和功能变体） 以及肽模拟物， 包括 其衍生物例如脂肪酸衍生物， 还可以是单体肽、 二聚肽或多聚体肽。 本发明的多肽 （包括功能片段和功能变体） 以及肽模拟物可以通 过本领域技术人员已知的方法获得（参见， 例如 Chan 等， Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis , 牛津大学出版社， 牛津， 英国， 2005 ; Reid，R.， Peptide and Protein Drug Analysis, Marcel Dekker Company, 2000； 以及 美国专利号 5，449，752 ) 。 此外， 也可由核酸重组方法生产多肽而得到 (参见， 例如 Sambrook等， 分子克隆： 实验室手册（Molecular Cloning: A Laboratory Manual ) ， 第 3版， 冷泉港出版社 （Cold Spring Harbor Press ) ， 冷泉港， 纽约， 2001 ) 。 此外， 本发明的一些多肽 （包括其 功能片段以及功能变体） 可以从如植物、 细菌、 昆虫、 哺乳动物如大 鼠、 人等分离和 /或纯化。 分离和纯化的方法在本领域内也是公知的。 备选地， 本文所述的多肽 （包括其功能片段以及功能变体） 可以从商 业公司合成后购买获得。 多核苷酸

本发明还提供编码任一种所述的本发明多肽 （包括其功能片段和 功能变体） 的分离的多核苷酸。 所述多核苷酸包含任一种本发明多肽 (包括其功能片段和功能变体） 的编码序列。 例如， 本发明提供编码 SEQ ID NO: 1的核苷酸序列 SEQ ID NO: 7 ,以及这些编码序列的任一种 简并变异体； 备选地， 所述多核苷酸还可以包含附加编码序列和 /或 非编码序列。 同样，本发明也提供编码如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序 列的功能片段或功能变体的多核苷酸， 这些多核苷酸也还可以包含附 加编码序列和 /或非编码序列。 另一方面， 本发明还提供这样的分离 的多核苷酸或其片段， 其所包含的核苷酸序列与前述的任一种多核苷 酸的核苷酸序列互补或能在严格条件下与其杂交。 本发明还提供上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明多肽 （包 括功能片段和功能变体） 有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的功能片 断、 功能变体。 此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变异 体和插入变异体。 如本领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替 换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入， 但不会从 实质上改变其编码的多肽的功能。 本发明的多核苷酸可以是天然存在通过纯化而得到， 也可以通过 重组产生， 或者可以基于化学合成和 /或酶连接反应， 使用本领域已 知的方法而构建。 本发明的多核苷酸可以含有天然存在的核苷酸， 也 可以包含具有修饰的核苷酸。 所述具有修饰的核苷酸设计成增加分子 的生物学稳定性或增加在杂交时形成的双链体的物理稳定性 （例如， 硫代磷酸衍生物和吖啶置换的核苷酸） ， 包括例如 5-氟尿嘧啶、 5-溴尿 嘧啶、 5-氯尿嘧啶、 5-碘尿嘧啶、 次黄嘌呤、 黄嘌呤、 4-乙酰胞嘧啶、

5- (羧基羟甲基)尿嘧啶、 5-甲氧基氨基甲基 -2-硫尿嘧啶、 尿嘧啶 -5-羟基 乙酸、 5-甲基 -2-硫尿嘧啶、 2-硫胞嘧啶、 2-硫尿嘧啶、 4-硫尿嘧啶、 5- 甲基尿嘧啶、 尿嘧啶 -5-羟基乙酸甲基酯、 3-(3-氨基 -3-N-2-羧丙基)尿嘧 啶、 和 2，6-二氨基嘌呤等。 并且， 其可以包含天然的或改变的核苷酸之 间的键， 诸如氨基磷酸酯键或硫代磷酸酯键， 用来代替天然存在的磷 酸二酯键。 优选的， 本发明的核酸是重组产生的。 重组表达载体

本发明还提供包括任一种本发明多核苷酸的重组表达载体。 所述 重组表达载体可以是任何适当的重组表达载体， 并且可以用于转化或 转染任何适当的宿主细胞。 适当的载体包括设计用于繁殖和扩增或用 于表达， 或同时用于二者， 如质粒或病毒。 所述载体可以通过下列自 由组合： pUC系列、 pcDNA系列， pBluescript、 pET系列、 pGEX 系列 和 pEX系列。 还可以使用噬菌体载体， 诸如 GT10、 GTI λΖαΡΙΚ EMBL4等。 植物表达载体可以包括 pBIOl、 pBI101.2, pBI101.3, pBI121 禾口 pBIN19。 动物表达载体可以包括 pEUK-Cl、 pMAM和 pMAMneo。 在 一个具体的实施例中， 本发明涉及使用 pcDNA系列的质粒。 可以使用标准重组 DNA技术制备本发明的重组表达载体。 可以制 备环形的或线性的表达载体构建体， 以包含在原核或真核宿主细胞中 起作用的复制系统。 理想地， 所述重组表达载体包括调控序列， 诸如 转录和翻译起始与终止密码子。 所述调控序列对于所述载体所引入的 宿主类型 （例如细菌、 真菌、 植物、 或动物） 是特异性的。 所述重组表达载体可以包括一种或多种标记基因， 其允许选择转 化的或转染的宿主。 标记基因包括对杀生物剂的抗性例如对抗生素、 重金属等的抗性， 在营养缺陷型宿主中互补以提供原养型， 以及催化 生物荧光等等。 对于本发明表达载体合适的标记基因包括， 例如新霉 素 / G418抗性基因、 荧光酶素报告基因、 潮霉素抗性基因、 组氨醇抗 性基因、 四环素抗性基因、 和氨苄青霉素抗性基因。 所述重组表达载体可以包括天然的或非天然的启动子。 启动子的 选择， 例如强、 弱、 诱导型， 组织特异型和发育特异型， 在技术人员 的普通技能之内。 相似地， 核苷酸序列与启动子的组合也在技术人员 的技能之内。 启动子可以是非病毒启动子或病毒启动子， 例如巨细胞 病毒 （CMV) 启动子、 SV40启动子、 RSV启动子、 以及在鼠干细胞病 毒长末端重复中存在的启动子。 本发明的重组表达载体可以设计用于 瞬时表达、 用于稳定表达、 或用于二者。 此外， 所述重组表达载体可 以制备成用于组成型表达或用于诱导型表达。 此外， 所述重组表达载体可以包括自杀基因。 "自杀基因" 是指 在细胞中表达后导致细胞死亡的基因。 自杀基因表达后可影响细胞对 某种试剂如药物的敏感性， 进而引起细胞死亡。 自杀基因在本领域内 是已知的 （参见， 例如自杀基因治疗： 方法和综述 （Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews )， Springer, Caroline J. ( Cancer Research

UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK)， Humana Press, 2004 )，例如单纯疤疹病毒（HSV) 胸苷激酶 （TK) 基因和嘌呤核苷磷酸酶， 以及硝基还原酶等。 宿主细胞

本发明还提供包括本文所述的任何一种重组表达载体的宿主细 胞。 宿主细胞是包含本发明重组表达载体的任何类型的细胞。 宿主细 胞可以是真核细胞例如植物、 动物、 真菌、 或藻类， 或者可以是原核 细胞例如细菌或原生动物。 宿主细胞可以是培养的细胞或原代细胞， SP , 直接从生物体如人分离的原代细胞。 宿主细胞可以是贴壁细胞或 悬浮的细胞， SP， 在混悬液中生长的细胞。 适当的宿主细胞在本领域 内是己知的， 包括例如 0115„大肠杆菌细胞、 中国仓鼠卵巢细胞、 猴 VERO细胞、 COS细胞、 HEK293细胞等。 为了扩增或复制所述重组表 达载体的目的， 所述宿主细胞优选是原核细胞。 为了产生重组修饰的 多肽或蛋白的目的， 宿主细胞优选是哺乳动物细胞。 人源细胞为优选 的宿主细胞。 宿主细胞可以是任何细胞类型， 可以来自任何类型的组 织， 并且可以是任何发育阶段的。 本发明还提供包括至少一种本文所述的宿主细胞的细胞群体。 所 述细胞群体可以是异种群体， 包括包含任一种所述重组表达载体的宿 主细胞， 以及至少一种其它细胞例如不包含任何所述重组表达载体的 宿主细胞（例如 T 细胞） ， 或除 T细胞之外的细胞例如 B 细胞、 巨噬细 胞、 嗜中性粒细胞、 红细胞、 肝细胞、 内皮细胞、 上皮细胞、 肌细胞、 脑细胞等。 备选地， 所述细胞群体可以是基本同种群体， 其中所述群 体主要包括包含所述重组表达载体的宿主细胞 （例如， 主要由包含所 述重组表达载体的宿主细胞组成） 。 所述群体还可以是细胞的克隆群 体， 其中所述群体的所有细胞是包含重组表达载体的单一宿主细胞的 克隆， 以致该群体的所有细胞包含所述重组表达载体。 在本发明的一 个实施方案中， 所述细胞群体是包括包含本文所述的重组表达载体的 宿主细胞的克隆群体。 缀合物

本发明还包括缀合物例如生物缀合物， 其包括本发明的多肽 （包 括其功能片段和功能变体） 以及肽模拟物、 多核苷酸、 重组表达载体、 或宿主细胞中的任一种。 缀合物， 以及通常合成缀合物的方法在本领 域内也是已知的（参见，例如 Hudecz, F.，分子生物学方法（Methods Mol. Biol. ) 298: 209-223 (2005)和 Kirin等， 无机化学 ( Inorg. Chem. ) 44(15): 5405-5415 (2005)) 。 药物组合物 本发明所提供的上述各种物质， 包括多肽 （包括其功能片段和功 能变体） 以及肽模拟物、 脂肪酸衍生物、 多核苷酸、 重组表达载体、 以及宿主细胞 （包括其群体） 、 缀合物等 （笼统称为 "本发明物质" ） 可以是分离的、 纯化的、 合成的、 和 /或重组的。 本发明物质还可以配制成组合物， 诸如药物组合物。 在这一点上， 本发明提供包括任意所述多肽 （包括功能片段和功能变体） 以及肽模 拟物、 脂肪酸衍生物、 缀合物、 核酸、 重组表达载体和宿主细胞 （包 括其群体） ， 以及药用载体的药物组合物。 包含任意本发明物质的本 发明药物组合物可以包括多于一种本发明物质， 例如： 多肽和核酸， 或两种或更多不同的多肽。 备选地， 所述药物组合物可以包括与另一 种或多种药物活性试剂或药物的组合。 所述另一种或多种药物活性试 剂或药物优选可以包括诸如化疗剂， 例如天冬酰胺酶、 白消安、 卡铂、 顺铂、 柔红霉素、 多柔比星、 氟尿嘧啶、 吉西他滨、 羟基脲、 甲氨蝶 呤、 紫杉醇、 利妥昔单抗、 长春碱、 长春新碱等。 关于药物组合物， 药用载体可以是任意常规所用的那些， 它们可 以仅通过化学物理因素， 诸如溶解性和缺乏与活性化合物的反应性， 以及通过施用的途径， 进行限定。 本发明所述的药用载体例如媒介物、 佐剂、 赋形剂和稀释剂等， 是本领域技术人员公知的， 并且容易为公 众所获得。 优选地， 所述药用载体对活性试剂是化学惰性的， 在使用 条件下不具有有害副作用或毒性。 为了达到本发明的目的， 施用的本发明物质的量或剂量应该在合 理时间范围内在受试者或动物内产生例如治疗或预防响应。 例如， 本 发明物质的剂量应该足以在从施用时刻起约 1小时以上如 12-24小时或 更长的时间期间内， 抑制患病细胞的增殖， 起到治疗或预防疾病 （例 如肿瘤等） 的作用。 在某些实施方案中， 所述时间期间甚至可以更长。 剂量应该由特定的本发明物质的功效和待治疗的动物 （例如人） 的状 况， 以及动物 （例如人） 的体重所确定。 确定施用剂量的许多测定方 法是本领域内己知的。 本领域普通技术人员应该容易理解， 本发明物 质可以以任何方式修饰， 以提高本发明物质的治疗或预防功效。 例如， 本发明物质可以直接或通过连接体间接与靶向的部分缀合。 使化合物 例如本发明物质与靶向部分缀合的实践， 在本领域内是公知的 （参见， 例如美国专利号 5，087，616 ) 。 在另一个实施方案中， 本发明物质可以 被修饰成贮存库形式， 以便使本发明物质释放到其所施用的体内的方 式在时间和体内部位方面受到控制（参见，例如美国专利号 4，450，150 )。 本发明物质的贮存库形式可以是例如包括本发明物质和多孔或非多孔 物质如聚合物的可植入组合物， 其中本发明物质通过所述物质和 /或 所述非多孔物质的降解而扩散。 然后， 将贮存库植入体内的理想部位， 并且本发明物质以预先确定的速率从所述植入物释放。 本领域技术人员应该理解， 本发明提供的预防和治疗肿瘤， 脂肪 肝或肥胖的方法， 包括使患病细胞与具有有效抑制量的本发明所述的 任意药物组合物接触。 可以采用任意常规的方法将本发明所述药物组 合物传递给患病细胞。 在本发明方法的一个优选的实施方案中， 将所 述药物组合物通过局部施用给宿主。 在另一个优选的实施方案中， 所 述药物组合物直接施用到患病细胞， 例如， 对于肿瘤细胞采取肿瘤内 递送。 本发明的药物组合物， 包含多肽 （包括功能片段和功能变体） 以 及肽模拟物、 核酸、 重组表达载体、 和 /或宿主细胞， 可以用在预防和 治疗肿瘤， 脂肪肝和肥胖等病症的方法中。 本领域普通技术人员应该 容易理解， 本发明所述的上述病症可以存在于任何宿主中。 优选地， 所述宿主是哺乳动物。 特别优选地， 所述宿主是人。 下面结合具体实施例， 对本发明作进一步的阐述说明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本发明而不在于限制本发明的范围。 下述实施 例中的实验方法， 如无特殊说明， 均为常规方法； 所用的材料， 如无 特殊说明， 均为自常规生化试剂公司购买得到的。 实施例一： 多肽的设计和制备

人工合成多肽功能片段 Anti-FAS-P18:

本 发 明 用 人 工 合 成 的 方 法 合 成 了 氨 基 酸 序 列 为 Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Ph e-Thr ( SEQ ID NO: 1 ) 的多肽 (以下称 Anti-FAS-P18 ) 。 该多肽的制 备采用固相合成方法， 如应用 AAPPTECApex396型多肽合成仪器 （购 自香港环球分析测试仪器有限公司） ， 在密闭的防爆玻璃反应器中使 氨基酸按 SEQ ID NO: 1所示的序列， 从 C端-羧基端向 N端-氨基端合 成 ， 这 是 指 第 一 个 被 加 入 到 该 氨 基 酸 序 列

Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Ph e-Thr的氨基酸单体是 C末端的 Thr， 然后再是 Phe， 再是 Phe， 一直到 最后的 Gly以及 N末端的 Gly， 不断添加、 反应、 合成、 操作， 最终 得到所要的氨基酸序列。 固相合成法， 大大的减轻了每步产品提纯的 难度。 为了防止副反应的发生， 参加反应的氨基酸的侧链都是受保护 的。 羧基端是游离的， 并且在反应之前必须活化。 具体合成由下列几个循环组成：

1 ) 去保护： Fmoc 保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂 (piperidine) 去除氨基的保护基团。

2 ) 激活和交联： 下一个氨基酸的羧基被一种活化剂所活化。 活 化的单体与游离的氨基反应交联， 形成肽键。 在此步骤使用大量的超 浓度试剂驱使反应完成。 循环： 这两步反应反复循环直到合成完成。

3 ) 洗脱和脱保护： 多肽从柱上洗脱下来， 其保护基团被一种脱 保护剂 （TFA) 洗脱和脱保护。 从 C端 （羧基端） 向 N端 （氨基端） 合成， 把 C端的第一个氨基酸 Thr固定在树脂上， 脱去 Thr氨基酸的 保护基团， 并活化下一个氨基酸 Phe 的羧基端， 使之发生缩和反应， 以此类推到合成完最后一个氨基酸后， 从树脂上切割下来， 粗肽经 HPLC纯化， 获得 98%纯度的 Anti-FAS-P18， 最后通过质谱做进一步的 鉴定， 其分子量为 1921.6 Kd。 在固相合成中， 肽链的延长是在不溶性的聚苯乙烯树脂载体上进 行的。 合成多肽的 C-末端先和氯甲基聚苯乙烯树脂 （氯化苄酯树脂） 反应形成苄酯， 然后按肽链一级结构的顺序将氨基端已被保护的氨基 酸逐个加上去， 使肽链延长。 人工合成多肽 Anti-FAS-P18用高压液相色谱（HPLC) (应用 PLC Agela C18柱） 分析， 显示所获得的纯度为 98.11% (图 1 ) 。 实施例二： 离体 （in vitro) 多肽的抗 FAS活性

采用两种方法检测离体情况下实施例一中的多肽的抗 FAS 的活 性： 第一种方法是采用分子克隆技术， 将表达实施例一中的多肽的 cDNA 克隆进真核表达载体 pcDNA3.1 ( + ) 上， 通过基因转染， 在肝 癌细胞内实现表达所研究多肽的目的，进而观察所研究的多肽抑制 FAS 的效果； 第二种方法是采用人工合成的多肽， 直接加入到培养肝癌细 胞的培养液中， 观察多肽抑制 FAS的效果。 实验中采用的细胞为肝癌 HepG2细胞。 由于 SREBP-lc为 FAS的上 游转录调控因子， 通过荧光素酶报告基因检测方法， 在分子水平检测 SREBP-lc的启动子活性是否受到抑制， 可反映 FAS的基因转录情况。 同时， 检测 FAS启动子活性， 可直接反映 FAS的转录是否受到抑制； 核 因子 κΒ ( nuclear factor κΒ, NF-κΒ ) 是一个重要的转录因子。 NF-κΒ启 动子活性增强意味着细胞增殖加快。 因此， 检测 NF-κΒ启动子的活性， 可反映细胞增殖情况。 因此， 通过 NF-κΒ启动子活性检测和 3-(4，5-二甲 基 -2-噻唑) -2，5-二苯基四氮唑溴盐 （MTT) 检测实施例一中的多肽对上 述 HepG2细胞增殖的影响。

A.多肽真核表达载体的构建

1.主要材料：

1 ) 菌株： . co/ DH5„ (购自原平皓 （天津） 生物技术有限公司） 2 ) 质粒： pcDNA3.1 ( + ) (购自 Invitrogen) ， pEGFP-C2 (购自 Invitrogen)

2.主要试剂

试剂名称 来源 （公司名称， 地址） 琼脂糖 Solarbio , 中国北京 质粒小提试剂盒 Transgen, 中国北京

氨节青霉素 BBI, 美国波士顿生物技术公司 胰蛋白酶 BBI, 美国波士顿生物技术公司 胰蛋白胨 Promega, 美国 酵母提取物 Promega, 美国

EcoRI内切酶 Takara, 中国大连

Xhol内切酶 Takara, 中国大连 rTaq酶 Takara, 中国大连

T4 DNA 连接酶 Takara, 中国大连

氯仿 BBI, 美国波士顿生物技术公司

3.主要溶液配制：

1 ) LB液体培养基

胰化蛋白胨 2.0g

酵母提取物 l .Og

NaCl 2.0g

加双蒸水溶解定容至 200ml

1.03 X 10⁵ Pa 蒸汽灭菌 20min。

2 ) LB固体培养基

胰化蛋白胨 2.0g

酵母提取物 l .Og

NaCl 2.0g

琼脂粉 3.0g

双蒸水溶解定容至 200ml

1.03 X 10⁵ Pa 蒸汽灭菌 20min。 3 ) lOmg/ml溴化乙锭

溴化乙锭 0.2g

双蒸水 20ml

工作液： 0.5ug/ml

4 ) TBE电泳缓冲液

5 X贮存液：

Tris 碱 54 g

硼酸 27.5 g

0.5 mol/L EDTA ( H 8.0) 20 ml

加双蒸水定容至 1000 ml

4.退火体系

试剂 加入量 ( μΐ) 灭菌双蒸水 20

5 Annealing Buffer 10

Forward DNA oligo (50 μΜ) 10 (5'-AATTCATGGGAGGCTGTAGGCATAAATTGGTCTGCGC

ACCAGCACCATGCAACTTTTTCACCTGAC-3 ' )

(SEQ ID NO:13)

Reverse DNA oligo (50 μΜ) 10 ( 5 '-TCGAGTCAGGTGAAAAAGTTGCATGGTGCT

GGTGCGCAGACCAATTTATGCCTACAGCCTCCCATG-3 ' )

(SEQ ID NO: 14)

5.退火条件： 95 °C， 2分钟； 每 8秒下降 0.1 °C至 25 °C， 90分钟； 4°C， ∞。

6. pcDNA3.1 ( + ) 空质粒载体的小量提取

将含有 pcDNA3.1 ( + ) 质粒的 DH5a菌株 （购自原平皓 （天津） 生物技术有限公司）进行活化，挑取单克隆，加入 LB液体培养基中（含 氨苄霉素 100 mg/L) 37°C过夜培养。 使用 TransGen的质粒小提试剂盒 提取质粒。

7. 双酶切反应体系：

试剂 加入量 ( μΐ)

限制性内切酶 EcoR l 2

限制性内切酶 Xhol 2

10 M buffer 4

DNA 小于 2 μ_δ

ddH₂O 使总体积为 40 μΐ 混匀后， 37°C反应 3-6小时。

8.连接反应体系：

试剂 加入量 ( μΐ) 退火产物 0.3 pmol

质粒双酶切回收产物 0.03 pmol

10 连接缓冲液 2.5 μΐ

连接酶 1 μΐ

ddH₂O 使总体积为 25 μΐ 混匀后 16°C反应过夜。 合成碱基序列包括 ggaggctgta ggcataaatt ggtctgcgca ccagcaccat gcaacttttt cacc ( SEQ ID NO: 7 ) ， 连接示意图如图 12所示。

9.转化步骤

1 ) 将 DH5_a感受态菌株 （100 μΐ) 在冰上解冻；

2 ) 在超净台中将步骤 8中的 25 μΐ连接产物全部加入含有感受态 细菌的离心管中， 用枪头混匀， 冰上静置 30分钟；

3 ) 将离心管放入 42°C水浴中准确热激 90秒；

4 ) 立即放入冰上静置 2分钟；

5 ) 向离心管中加入 500 μΐ无抗性 LB液体培养基， 37°C预培养 45分钟；

6 ) 取 100 μΐ菌液 （可根据形成克隆的密集程度做适度调整） 均 匀涂布于 LB固体培养板上（含氨苄霉素 100 mg/L) ， 待液体渗入培养 基后， 倒置 37°C培养过夜；

7 ) 待平板上长出清晰可见的单克隆菌斑之后， 用接菌针小心挑 取独立的单克隆在 LB液体培养基中 37°C培养过夜。

10.菌落 PCR反应体系

试剂 加入量 ( μΐ) 灭菌双蒸水 35.75

10 buffer 5 dNTP ( 10mmol/L) 4

Forward Primer (20 μΜ) 1

5 '-TAATACGACTCACTATAGGG-3 ' (SEQ ID NO: 15)

Reverse Primer (20 μΜ) 1

5 ' -TAGAAGGCACAGTCGAGG-3 ' (SEQ ID NO: 16)

模板 DNA (菌液） 3

Taq 酶 0.25

11.菌落 PCR反应条件：

94 °C 10分钟

94 °C ' 30秒 、

53 °C -< 30秒 35个循环

72 °C . 15秒 .

72 °C 10分钟 4°C oo

反应完毕后取反应产物在 1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳分析。 将阳 性克隆送交生物公司进行测序。 并将该质粒命名为 p-Anti-FAS-P18。

B . 体外有效性实验

1. 细胞系：

实验中应用的肝癌 HepG2 细胞系购自上海劲马生物科技有限公 司。

2.主要试剂

试剂名称 来源

RPMI1640培养液 Gibco

DMEM培养液 Gibco

Lipofectamine 2000 Invitrogen 青链霉素 Solarbio

胰蛋白酶 BBI 胎牛血清 Hyclone

3.双荧光素酶报告基因分析

(1) 将对数生长期的细胞（为上述表 1中列举的细胞）以 0.75x 10⁵ 个 /ml 的密度接种于 24孔细胞培养板， 每孔接种 500μ1细胞， 当细胞 汇合至 90%时进行基因转染。

(2) 启 动 子 报 告 基 因 载 体 （ SREBP-lc-571-Luc-WT ， pFAS-WT-Luc, pGL3-NF-KB , 各 0.3 μ g， 可购自原平皓 （天津） 生物 技术有限公司） 分别以脂质体法转染至细胞同时以海肾荧光素酶表达 载体 （pRL-TK， 0.1 μ g, 购自 Promega公司） 为内参。 同时转染不同 质量的由步骤 A得到的多肽质粒 （0.5 w g， 1.0 u g 2.0 μ g/孔） 或 加入不同浓度的由实施例 1获得的合成多肽 （1 μ Μ， 10 μ Μ和 100 μ Μ) ， 每个浓度重复 3个孔。

(3) 在转染后 48小时（或应用人工合成多肽 Anti-FAS-P18及其变 异体作用后 24小时） ， 用 PBS将细胞洗 3次。 (4) 向每孔转染的细胞加入 100 μΐ I X Passive Lysis Buffer (PLB ) ， 于室温下作用 15 min使细胞充分裂解， 用细胞刮子将细胞 裂解物刮下来， 转入 1.5 ml Eppendorf (EP) 管中。

(5) 12,000 rpm 离心 30 min, 将上清吸入新的 EP管中。

(6) 向每个装有 100 μΐ 荧光素酶测定缓冲液 （Luciferase Assay

Buffer II, LARII) 的 EP管中加入等量细胞裂解液， 混匀。

(7) 立即将 EP管放入生物化学发光检测仪（Turner Biosystems公 司产品） ， 2 sec平衡后， 测定 10 sec后的光输出。

(8) 加入 100 μΐ荧光淬灭剂， 淬灭萤火虫荧光素酶同时启动海肾 荧光素酶反应。

(9) 测定 lOsec后的光输出。 第一次的荧光数值与第二次荧光数值的比值为相对活性。 每组实验均作 3次独立重复， 以 Mean± SD作为统计依据， 进行

Student's t test统计学分析。 如图 2所示， p-Anti-FAS-P18对 HepG2细胞中 SREBP-lc和 FAS 启动子的活性具有抑制作用， 呈剂量依赖性， 表明本发明的多肽基因 表达产物具有抑制 FAS基因表达转录的作用。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test统计学分析。 如图 3所示，人工合成的多肽 Anti-FAS-P18对肝癌 HepG2细胞中 SREBP-lc和 FAS启动子的活性具有抑制作用，且该抑制作用呈剂量依 赖性， 表明本发明的多肽具有抑制 FAS基因表达转录的作用。 100 μΜ 的本发明多肽 Anti-FAS-P18的变异体 P18-1至 P18-5对 SREBP-lc和 FAS启动子的活性有不同程度的抑制作用。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test统计学分析。 4.免疫印迹检测 1 ) 样品制备

分别取长至 90%的单层培养的细胞， 用预冷的 PBS洗 3次； 加入适量 0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞， 待细胞质回缩， 细胞间 隙增大时， 弃掉胰蛋白酶溶液， 用预冷的 PBS洗 3次；

加入 10ml 预冷的 PBS， 吹打成细胞悬液， 转入离心管中， 4000rpm/min, 4°C 离心 10min， 收集细胞。 用预冷的 PBS洗 2次；

彻底去除上清， 加入适量细胞裂解液 （8M urea， 4 % CHAPS , 2 % Pharmalyte 3-10 )并加入 Protease Inhibitor Cocktail,室温作用 30min;

13000rpm, 4°C 离心 15min， 取上清， 转入新的 Eppendorf管中， -70°C保存。

2 ) 蛋白质浓度测定一考马斯亮蓝染色法

考马斯亮蓝染色液： 含 0.01%(W/V)G-250， 4.7%(W/V)乙醇， 8.5%(W/V)磷酸；

标准蛋白质溶液：结晶牛血清白蛋白（BSA)，用 PBS配制成 2mg/ml 蛋白溶液；

制定标准曲线： 取 6支试管， 按下表操作:

试管编号 0 1 2 3 4 5

PBS/μΙ 100 90 80 70 60 50

2mg/ml BSA/μΙ 0 10 20 30 40 50 考马斯亮蓝染色液 3ml

A595 nm

摇匀， 放置 10-15 min， 40 min内以 0号管为空白对照， 在 595nm 处比色。 以 A595nm为纵坐标， 标准蛋白含量为横坐标， 在坐标纸上绘制 标准曲线。 测定样品浓度

另取 4支试管， 按下表操作:

试管编号 6 (样品 A) 7(样品 A) 8 (样品 B) 9 (样品 B)

PBS/μΙ 95 90 95 90

样品 /μΐ 10 10 10 10

考马斯亮蓝染色液 3ml

A595nm

摇匀， 放置 10-15 min， 在 595nm处比色。 测定方法同上， 取合适的蛋白样品体积， 使其测定值在标准曲线 的直线范围内， 根据测定的值， 在标准曲线上査出其相当于标准蛋白 的量， 从而计算出样品的蛋白质浓度。

) 分离胶的选择

蛋白质分子量大小 分离胶浓度

60-200 kDa 5%

40-100 kDa 8%

16-70 kDa 10%

15-60 kDa 12%

12-45 kDa 15% 按下表分别配制分离胶和浓缩胶， AP和 TEMED最后再加。 分离胶 （ml) 浓缩胶 （ml) 试剂

5% 8% 10% 12% 15% 5%

30%凝胶储备液 1 2 3 4 5 0.83 分离胶缓冲液 （3MTris-HCl) 1.25 1.25 1.25 1.25 1.25 - 浓缩胶缓冲液 （0.5MTris-HCl) - - - - - 1.26

10%SDS 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.05 重蒸水 7.55 6.55 5.55 4.55 3.55 2.81

10%AP 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.05

1%TEMED 0.004 0.004 0.004 0.004 0.004 0.005 分离胶溶液加至电泳板中， 在上面铺上水层， 以隔绝空气。 待凝 固后， 倾去上面的水层。 迅速加入浓缩胶， 小心插入梳子， 避免混入 气泡。 待浓缩胶聚合完全后， 在电泳槽中加入电泳缓冲液， 小心移出 梳子。 取细胞裂解液与溴酚蓝以 4:1比例混匀上样， 进行稳压电泳 （浓 缩胶， 100V; 分离胶， 200V) 。

4 ) 电转移

根据凝胶大小剪取 6张滤纸和 1张 PVDF膜， 使其大小和凝胶的 大小完全相等或略小于凝胶；

PVDF膜先在甲醇中浸泡 10-15秒， 再在纯水中浸泡 2min， 然后 在转移缓冲液中浸泡平衡 15分钟； 滤纸浸泡于转移缓冲液中；

在湿转移电泳槽上， 由阴极到阳极安装转移装置： （- ) 海绵垫- 滤纸 （双层） -凝胶 -PVDF膜-滤纸-海绵垫 （+ ) ； 并且用玻璃棒仔细去 除气泡。 PVDF膜的一侧靠近正极， 要保持膜是湿润的。 恒压电泳 90V 电转移 90 min;

转移后， 在滤膜左下角剪口做标记， 并转移到丽春红染液中 5-10 min, 其间轻轻摇动染液。蛋白带出现后， 于室温用去离子水漂洗滤膜， 其间换水数次；

同时， 可将凝胶转移到考马斯亮蓝染液中染色；

5 ) 免疫印迹

封闭： 将 PVDF膜浸泡于 5%牛奶封闭液中， 室温摇动 lh， 或 4°C 静置过夜；

加一抗 （兔抗脂肪酸合成酶多克隆抗体， 购自美国 Cell Signaling 公司） 。 准备塑料袋， 将滤膜放入其中， 稀释好的一抗加在滤膜上表 面 （0.1ml/cm2) 。 赶气泡， 封口。 室温摇动 2h;

冲洗。 用 0.1%Triton X-100 PBS液洗滤膜， 共 4次， 每次 15min; 加辣根过氧化物酶标记的二抗 （广谱二抗， 购自天津津脉公司） 。 准备塑料袋， 将滤膜放入其中， 稀释好的二抗加在滤膜上表面 ( 0.1ml/cm2) 。 赶气泡， 封口。 室温摇动 2h; 冲洗。 如步骤 3 ) ；

取等量 ECL A、 B液 （购自北京全式金公司） ， 混匀， 将混和液 加于膜上反应 2-3 min;

暗室曝光。 在暗盒内依次放上保鲜膜、 滤膜、 保鲜膜， 固定。 黑 暗中， 再将 X光片置于膜上， 曝光 3-5min_;

曝光完毕， 将 X光片在显影液中浸泡 3-5min， 待出现暗带时， 于 自来水下冲洗；

将 X光片在定影液中浸泡 3-5min， 自来水冲洗， 晾干保存， 并拍 昭 .

八、、？ 如图 4所示， p-Anti-FAS-P18对 HepG2细胞中 FAS蛋白表达水 平具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性。 如图 5所示，人工合成的多肽 Anti-FAS-P18 HepG2细胞中 FAS 蛋白表达水平具有抑制作用， 且该抑制作用呈剂量依赖性。

5.MTT检测

(1) 接种细胞： 将对数生长期的细胞 （为表 1 中列举的细胞） 用 含 10%胎牛血清的 RPMI1640或 DMEM培养液配成单个细胞悬液， 以 每孔 4000-5000个细胞接种到 96孔细胞培养板中， 每孔体积 100 ul。

(2) 培养细胞： 待 12h后细胞贴壁， 转染不同质量的在本实施例 的步骤 B中所获得的多肽质粒 （0.3 g， 0.5 g n 1.0 g/孔） 或加入 不同浓度的在实施例 1 中所获得的合成多肽及其变异体 （Ι .Ο μ Μ, 10 μ Μ和 ΙΟΟ μ Μ/孔） ， 每个浓度重复 8个孔， 同一般培养条件， 培养 48h。 将 0.3 u g pEGFP-C2质粒与 0.3 μ g p-Anti-FAS-P18 混合后共转 染， 24 小时后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光， 确定其转染效率可 达到 70%。

(3) 呈色： 每孔加 MTT溶液 （5 mg/ml， 用 PBS <pH=7.4>配） 20 μ 1.

(4) 继续孵育 4 小时， 终止培养， 小心吸弃孔内培养上清液。 每 孔加 150ulDMSO， 振荡 10分钟， 使结晶物充分融解。

(5) 比色： 选择 490 nm波长， 在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸 收值， 记录结果， 进行 Student's t test统计学分析。 如图 6所示， p-Anti-FAS-P 18对 HepG2细胞中 NF-κΒ启动子的 活性具有抑制作用， 呈剂量依赖性， 表明肝癌细胞的增殖能力下降。 * P<0.05, ** P<0.01， 进行 Student's "est统计学分析。 如图 7所示， Anti-FAS-P18对 HepG2细胞中 NF-κΒ启动子的活 性具有抑制作用， 且呈剂量依赖性， 表明肝癌细胞的增殖能力下降。

100 μΜ的本发明多肽 Anti-FAS-P18的变异体 P18-1至 P18-5对 NF-KB 的活性也有不同程度的抑制作用。 * P<0.05， ** P<0.01， 进行 Student's t test统计学分析。 实施例三： 动物体内 (in vivo) 多肽有效性实验

将对数生长期的 HepG2细胞用胰酶消化制成细胞悬液， 计算细胞 数， 用无菌的生理盐水细胞稀释至 IX 10⁷ 个细胞 /ml， 置冰水中存放。 再取 12只 4到 6周雌性 BALB/C裸鼠， 将小鼠随机分为 2 组： ①对照 组， 在每只小鼠右前肢腋下皮下注射上述稀释后的细胞 0.2 ml, 仅注 射 0.5 ml灭菌蒸馏水（不含多肽药物）；②实验组（给药剂量为 10 mg/kg 体重） 。 在每只小鼠右前肢腋下皮下注射上述稀释后的细胞 0.2 ml, 注射 7天后， 肿瘤体积 （V=LXW²X 0.5) 达到 100mm³, 再分别皮下 注射上述多肽药物（用 0.5ml灭菌蒸馏水溶解冻干的多肽药物） ， 每两 天注射一次，共注射 10次，每次注射前测量肿瘤体积。末次给药 24 小 时后， 称量小鼠的体重， 然后将小鼠脱颈椎处死， 剥取瘤体组织称重， 按下列公式计算抑瘤率。 对照组平均瘤重-实验组平均瘤重

抑瘤率 = xl 00%

对照组平均瘤重 如表 1和图 10所示， 动物实验检测结果表明， 应用人工合成的多 肽 Anti-FAS-P18对 HepG2细胞的生长和增殖具有抑制作用。 ** P<0.01， 进行 Student's t test统计学分析。 如图 11所示， 动物实验检测结果表明， 与对照组相比， 应用人工 合成的多肽 Anti-FAS-P18对裸鼠体重无明显影响。进行 Student's t test 统计学分析。 表 1 : 人工合成的多肽 Anti-FAS-P18对 HepG2细胞的作用:

实施例四： 多肽的功能片段及变体

本发明还探讨了多肽及其功能片段的功能变体的作用。 下表所示 的序列为以 Anti-FAS-P18为基础进行氨基酸添加 （例如在端侧添加一 个氨基酸） 或保守氨基酸置换 （例如用一个氨基酸置换另一个相同类 型的氨基酸） 而得到的。 按照所述序列进行人工合成多肽片段 （方法 如上） ， 然后， 采用上述报告基因和 MTT检测的方法， 观察所得的多 肽的作用的变化。 合成多肽片断 氨 基 酸 序 列 SEQ ID NO.

Anti-FAS-P18 Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr 1 (P18) 或 G-G-C-R-H-K-L-V-C-A-P-A-P-C-N-F-F-T

Anti-FAS-P18-1 Val-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala -Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr 2 (P18-1) 或 V-G-G-C-R-H-K-L-V-C-A-P-A-P-C-N-F-F-T

Anti-FAS-P18-2 Ile-Gly-Gly-Cys-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr 3 (PI 8-2) 或 I-G-G-C-R-H-K-L-V-C-A-P-A-P-C-N-F-F-T

Anti-FAS-P18-3 Gly-Gly-Cys-Lys-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr 4 (PI 8-3) 或 G-G-C-K-H-K-L-V-C-A-P-A-P-C-N-F-F-T

Anti-FAS-P18-4 Gly-Gly-Arg-Arg-His-Lys-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr 5 (PI 8-4) 或 G-G-C-R-R-K-L-V-C-A-P-A-P-C-N-F-F-T

Anti-FAS-P18-5 Gly-Gly-Cys-Arg-His-His-Leu-Val-Cys-Ala-Pro-Ala-Pro-Cys-Asn-Phe-Phe-Thr 6 (PI 8-5) 或 G-G-C-R-H-H-L-V-C-A-P-A-P-C-N-F-F-T

合成多肽片断 核苷酸序列 SEQ ID NO.

Anti-FAS-P18 ggaggctgta ggcataaatt ggtctgcgca ccagcaccat gcaacttttt cacc 7 (P18)

Anti-FAS-P18-1 gtcggaggct gtaggcataa attggtctgc gcaccagcac catgcaactt tttcacc 8 (P18-1)

Anti-FAS-P18-2 atcggaggct gtaggcataa attggtctgc gcaccagcac catgcaactt tttcacc 9 (PI 8-2)

Anti-FAS-P18-3 ggaggctgta aacataaatt ggtctgcgca ccagcaccat gcaacttttt cacc 10 (PI 8-3)

Anti-FAS-P18-4 ggaggctgtc atcataaatt ggtctgcgca ccagcaccat gcaacttttt cacc 11 (PI 8-4)

Anti-FAS-P18-5 ggaggctgta ggcatcattt ggtctgcgca ccagcaccat gcaacttttt cacc 12 (PI 8-5) 如图 3， 图 7 和图 9所示， 本发明的多肽 Anti-FAS-P18的功能变 体对 SERBP-lc、 FAS和 NF-κΒ的启动子活性和肝癌 HepG2细胞的增 殖有不同程度的抑制作用。 实施例五： 多肽药物急性毒性试验

取昆明小白鼠，每组 10只，每组雌雄各 5只。分实验组和对照组。

实验组， 以 lg/kg的浓度从小鼠尾静脉单次注射多肽 Anti-FAS-P18 (用

0.125 ml灭菌蒸馏水溶解冻干的 2.5 mg多肽） ； 对照组注射 0.25 ml灭 菌蒸馏水。 注射后连续观察 24小时。 多肽药物急性毒性试验结果显示， 小鼠无异常表现。 与对照组相 比体重无异常变化。 本发明引用的所有参考文献， 包括出版物、 专利申请、 和专利， 通过引用结合于此， 并且完全结合于此。 本文提供的任何以及所有实 施例， 或示例性语言 （例如、 诸如等） 仅意欲更好地阐述本发明， 并 不形成对本发明范围的限制， 除非另外要求。 本发明描述了优选实施 方案， 包括本发明人已知实施本发明的最佳模式。 本发明包含这些优 选实施方案可能的变化， 本发明人意欲以这些与本文具体描述不同的 方式实施本发明， 同样， 本领域普通技术人员也清楚了解这些变化， 并预期能熟练地利用所述变化。 在法律所能允许的范围， 本发明包括 了在所附权利要求中引用的主题的所有修改和等价物， 除非本文另外 指明， 或明显与上下文相抵触。

序列表

<110> 天津托普泰克生物科技有限公司 <120> 抗脂肪酸合成酶多肽及其应用

<130> PCnQ217CN

<160> 16

<170> F¾t ent I n ver si on 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> PRT

<213> 多肽

<400> 1

Qy Qy Q^s A-g H s Lys Leu Val C s Λ a o Λ a o C s ^sn Fhe 1 5 10 15

Fhe T r

<210> 2

<211> 19

<212> PRT

<213> 多肽

<400> 2

Val Q y Q y Q^s A-g H s Lys Leu Val (^s Λ a o Λ a o (^s ^sn 1 5 10 15

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<210> 3

<211> 19

<212> PRT

<213> 多肽

<400> 3

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JLi Sid 3iy <210> 7

<211> 54

<212>

<213> 人工序列

<400> 7

ggaggct gt a ggcat aaat t ggt ct gcgca ccagcaccat gcaact t t t t cacc 54

<210> 8

<211> 57

<212> C

<213> 人工序列

<400> 8

gt cggaggct gt aggcat aa at t ggt ct gc gcaccagcac cat gcaact t 111 cacc 57

<210> 9

<211> 57

<212>

<213> 人工序列

<400> 9

at cggaggct gt aggcat aa at t ggt ct gc gcaccagcac cat gcaact t t t t cacc

<210> 10

<211> 54

<212>

<213> 人工序列

<400> 10

ggaggct gt a aacat aaat t ggt ct gcgca ccagcaccat gcaact t t t t cacc 54

<210> 11

<211> 54

<212> r

<213> 人工序列

<400> 11

ggaggct gt c at cat aaat t ggt ct gcgca ccagcaccat gcaact t t t t cacc 54

<210> 12

<211> 54

<212> cm

<213> 人工序列

<400> 12 -os/uosld/s

ς

01

o

Claims

权 利 要 求

1. 分离的多肽或肽模拟物，其包含如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸 序列、 或其功能片段或功能变体， 所述多肽或肽模拟物具有抑制脂肪 酸合成酶的功能， 并能抑制肿瘤、 脂肪肝和肥胖的发生和发展。

2. 权利要求 1所述的多肽或肽模拟物， 所述肿瘤包括肝癌。

3. 权利要求 1所述的多肽或肽模拟物， 其包含与 SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列具有至少 80%的相同性的氨基酸序列。

4. 权利要求 1所述的多肽或肽模拟物， 其包含与 SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列具有至少 90%的相同性的氨基酸序列。

5. 权利要求 1所述的多肽或肽模拟物， 其包含与 SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列具有至少 95%的相同性的氨基酸序列。

6. 权利要求 1所述的多肽或肽模拟物， 其包含由 SEQ ID NO: 1 所示的氨基酸序列经过一个氨基酸的保守置换或在其端侧添加或缺失 一个氨基酸而得到的氨基酸序列。

7. 权利要求 1所述的多肽或肽模拟物，其包含如 SEQ ID NOs: 1-6 所示的任一种氨基酸序列。

8. 分离的多核苷酸， 所述多核苷酸包含选自下组中的一种： a) 编码如 SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列、 或其功能片段或功 能变体的多核苷酸； 或者

b) 与多核苷酸 a)互补或严格杂交的多核苷酸。

9. 权利要求 8的多核苷酸，所述多核苷酸包含选自下组中的一种： a)编码如 SEQ ID NOs: 1-6所示的任一种氨基酸序列的多核苷酸； 或者

b) 与多核苷酸 a)互补或严格杂交的多核苷酸。

10. 重组表达载体， 其包含权利要求 8或 9所述的多核苷酸。

11. 包括权利要求 10所述的重组表达载体的宿主细胞。

12. 权利要求 1-7任一项所述的多肽在制造抗肿瘤、脂肪肝和肥胖 的药物中的应用。

13. 权利要求 8-9任一项所述的核苷酸在制造抗肿瘤、脂肪肝和肥 胖的药物中的应用。

14. 权利要求 10所述的重组表达载体在制造抗肿瘤、 脂肪肝和肥 胖的药物中的应用。

15. 药物组合物，其包含权利要求 1-7任一项所述的多肽或肽模拟 物， 以及任选的药物载体。

16. 药物组合物， 其包含权利要求 8-9任一项所述的多核苷酸， 以 及任选的药物载体。

17. 药物组合物， 其包含权利要求 10所述的重组表达载体， 以及 任选的药物载体。