CN101768081A - 一种脂肪酸合成酶抑制剂及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脂肪酸合成酶抑制剂及其应用。本发明所提供的脂肪酸合成酶抑制剂，其活性成分包括：五没食子酰基葡萄糖酸、没食子酸甲酯和斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷。每克所述脂肪酸合成酶抑制剂中含所述三种活性成分的质量依次为18-20μg、2-3μg、1-2μg。该脂肪酸合成酶抑制剂可在制备减肥药物、制备防治癌症的药物中得到应用，也可作为食品、保健品以及日用化学品添加剂得到广泛应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种脂肪酸合成酶抑制剂及其应用。
背景技术
脂肪酸合成酶(EC2.3.1.85，fatty acid synthase，缩写为FAS)是内源性脂肪酸合成的重要的酶，是一种大分子蛋白复合物，具有7种酶活性。动物体内的脂肪酸合成酶称为I型FAS，原核生物及植物中的脂肪酸合成酶称为II型FAS。国内外基础研究表明，脂肪酸合成酶已成为减肥和抑癌的潜在靶位。
目前为止，已报道的脂肪酸合成酶抑制剂较少，只有合成的C75(Kuhajda F.P.，Pizer E.S.，Li J.N.，et al.Proc Natl Acad Sci USA，97，3450-3454(2000))，较早发现的天然产物浅蓝菌素(cerulenin)(Vance D.，Goldberg I.，Mitsuhashi O.etal.Biochem Biophys Res Commun.48，649-656(1972))和绿茶中的酯型儿茶素EGCG(Wang X.，Tian W.X..Biochem Pharmacol Res Commun，288(5)：1200-1206(2001))和ECG(Wang X.，Song K.S.，Guo Q.X.，et al.Biochem Phamacol，66：2039-2047(2003))。这些抑制剂所具有的共同缺点是抑制活性不够高，应用价值受到局限，因此，在天然产物中寻找抑制活性高的脂肪酸合成酶抑制剂具有重要的实际应用价值。
茶条槭(Acer ginnala Maxim)为槭树科(Aceraceae)槭树属(AcerLinn)落叶大灌木或小乔木，广泛分布于黄河流域、长江中下游及东北地区，资源非常丰富。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酸合成酶抑制剂。
本发明所提供的脂肪酸合成酶抑制剂，其活性成分包括：式I所示的五没食子酰基葡萄糖酸、式II所示的没食子酸甲酯和式III所示斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷；其中，式III中的基团Rha代表L-鼠李糖基。
每克所述脂肪酸合成酶抑制剂中含式I化合物、式II化合物和式III化合物的质量依次为18-20μg、2-3μg、1-2μg。
(式I)
(式II) (式III)
所述脂肪酸合成酶抑制剂可按照如下方法制备：以茶条槭叶为原料，用乙醇水混合溶剂提取得到的。
其中，所述乙醇-水混合溶剂中乙醇的体积百分数可为55％～95％；所述混合溶剂与茶条槭干叶的质量份数比可为(8-30)∶1，具体可为8∶1。
所述提取可为回流提取，所述回流提取的温度为40-100℃；所述提取至少提取一次，具体可提取三次，每次提取的时间可为1-3小时，具体可为1.5小时。
为了提高所述脂肪酸合成酶抑制剂的纯度，所述提取后还进行过滤和浓缩；所述浓缩的方法为除去所述过滤得到的滤液中的乙醇，接着用石油醚萃取水相，除去其中的脂类物质，再收集水相，然后再用乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯萃取液，再减压蒸发除去所述乙酸乙酯萃取液中的乙酸乙酯，得到经浓缩的脂肪酸合成酶抑制剂浸膏。可将所述浸膏进一步(真空)干燥得到固态的脂肪酸合成酶抑制剂。
本发明的另一个目的是提供所述脂肪酸合成酶抑制剂的用途。
本发明所提供的脂肪酸合成酶抑制剂的用途是脂肪酸合成酶抑制剂在制备减肥药中的应用，以及在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。
该脂肪酸合成酶抑制剂还可以作为食品添加剂、日用化学品添加剂及保健品添加剂等得到广泛应用。
以本发明所提供的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分制备的减肥药物以及预防和/或治疗癌症的药物也属于本发明的保护范围。
需要的时候，在上述这些药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等，必要时还可以加入香味剂、甜味剂、和着色剂等。
用本发明的脂肪酸合成酶抑制剂为活性成分制备的药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
实验证明，本发明所提供的脂肪酸合成酶抑制剂具有较高的脂肪酸合成酶抑制活性。且对分离出的三种组分五没食子酰基葡萄糖酸、没食子酸甲酯和斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷分别进行抑制FAS的活性检测，结果表明上述三种组分均能抑制脂肪酸合成酶的活性，是所述脂肪酸合成酶抑制剂的活性组分。
本发明所提供的以茶条槭叶为原料制备的脂肪酸合成酶抑制剂能有效抑制脂肪酸合成酶活性，且用不同季节采集的茶条槭叶为原料制备的脂肪酸合酶抑制剂对脂肪酸合酶的抑制活性无显著性差异。本发明的脂肪酸合成酶抑制剂将在以脂肪酸合成酶为靶点的相关疾病的预防及辅助治疗方面，在制备控制体重、防治与肥胖相关的疾病等方面的药物，特别是在制备防治癌症的药物中发挥巨大作用。同时，本发明的脂肪酸合成酶抑制剂在保健品及化妆品的生产中也会有较大的应用价值。
附图说明
图1为实施例1分离的五没食子酰基葡萄糖酸的高效液相色谱图(B)与实施例1中的脂肪酸合成酶抑制剂的高效液相色谱图(A)。
图2为实施例1分离的五没食子酰基葡萄糖酸的氢谱图。
图3为实施例1分离的五没食子酰基葡萄糖酸的碳谱图。
图4为实施例1分离的五没食子酰基葡萄糖酸的质谱图。
图5为实施例1分离的没食子酸甲酯用氯仿-甲醇-甲酸(体积比为3∶0.5∶0.2)作展开剂的薄层色谱图。
图6为实施例1分离的没食子酸甲酯用乙醇-水(体积比为95∶5)作展开剂的薄层色谱图。
图7为实施例1分离的没食子酸甲酯的液相色谱图(B)与实施例1中的脂肪酸合成酶抑制剂的液相色谱图(A)。
图8为实施例1分离的没食子酸甲酯的氢谱图。
图9为实施例1分离的没食子酸甲酯的碳谱图。
图10为实施例1分离的没食子酸甲酯的质谱图。
图11为实施例1分离的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷用氯仿-甲醇-甲酸(体积比为3∶0.5∶0.2)作展开剂的薄层色谱图。
图12为实施例1分离的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷用乙醇-水(体积比为95∶5)作展开剂的薄层色谱图。
图13为实施例1分离的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的液相色谱图(B)与实施例1中的脂肪酸合成酶抑制剂的液相色谱图(A)。
图14为实施例1分离的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的氢谱图。
图15为实施例1分离的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的碳谱图。
图16为实施例1分离的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的质谱图。
图17为实施例2中脂肪酸合成酶抑制剂对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线图。
图18为实施例3中五没食子酰基葡萄糖酸对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线图。
图19为实施例3中没食子酸甲酯对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线图。
图20为实施例3中斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线图。
图21为实施例3中没食子酸甲酯对FAS酮酰还原反应的抑制作用的线性回归曲线图。
具体实施方式
下述实施例中，所用的脂肪酸合成酶是采用常规方法自新鲜鸭肝中分离提纯得到的，并经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带(W.X.Tian etal.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996，不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系，生物化学杂志，12(2)：234-236)。
脂肪酸合酶全反应和酮酰反应活性采用乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、NADPH(还原性辅酶II)为底物的标准测活方法测定(W.X.Tian etal.，1985.J.Biol.Chem.，260(20)：11375-11387；田维熙等，1996，不同生长期蛋鸡的体脂水平和肝脏脂肪酸合成酶活性的关系，生物化学杂志，12(2)：234-236)。
实施例1、脂肪酸合成酶抑制剂的制备
将在黑龙江省镜泊湖九月采集的茶条槭叶洗净，自然晾干或低温烘干(＜50℃)后将其粉碎，用下述方法制备脂肪酸合成酶抑制剂：
用乙醇-水混合溶剂(乙醇的体积百分数为75％)与上述粉碎的茶条槭叶按质量份数比8∶1混合，78℃回流1.5小时，过滤；在同样条件下重复上述回流操作两次，过滤，将三次滤液合并。减压低温(0.09MPa，55℃)蒸发浓缩，除去乙醇，得到含有效物质的水相，用适量甲醇溶解，再用等体积的石油醚(沸点60～90℃)分3-4次进行萃取，除去其中的脂类物质，收集水相，再用乙酸乙酯萃取水相，将乙酸乙酯提取液减压低温(0.09MPa，55℃)蒸发浓缩，除去有机溶剂，得到经浓缩的脂肪酸合成酶抑制剂的浸膏，可将该浸膏(真空)干燥得到固态的脂肪酸合成酶抑制剂。
三次重复实验的脂肪酸合成酶抑制剂的提取率(提取率＝脂肪酸合酶抑制剂的质量/茶条槭干叶的质量)为42.15±2.031g/kg干叶。
活性组分的分离：
1)五没食子酰基葡萄糖酸
将15g脂肪酸合成酶抑制剂的浸膏用60ml体积百分含量为30％的乙醇溶液溶解，有固体沉淀析出，过滤除去沉淀收集上清液。将收集得到的上清液(30％乙醇溶解部分)经聚酰胺柱层析，用100-200目的聚酰胺装柱，柱床的长度为90cm，柱的内径为5cm，按照3～7ml/min的流速用如下4个梯度的乙醇和水混合液依次进行梯度洗脱：乙醇和水的体积比为30∶70的混合液1，乙醇和水的体积比为50∶50的混合液2，乙醇和水的体积比为75∶25的混合液3，乙醇和水的体积比为95∶5的混合液4。每个梯度洗脱量为23倍柱床体积。收集乙醇-水体积比为30∶70时的洗脱组分，经聚酰胺薄层检测，合并相同馏分放入4℃冰箱，有黄色晶体析出，干燥得到0.04g五没食子酰基葡萄糖酸1，2，3，4，6-Penta-O-galloyl-beta-d-glucose-acid(1，2，3，4，6-五没食子酰基葡萄糖酸)。
五没食子酰基葡萄糖酸，结构如式I所示，为淡黄色晶体，其熔点为209℃～211℃，所用仪器为X4型显微熔点测定仪(温度计未校正)。
(式I)
结构确证：
a、高效液相色谱(HPLC)检测
色谱条件如下：
色谱柱SpherisorbC18(4.6mm×250mm，5μm)
流动相乙腈-体积百分含量为2.5％的乙酸水溶液(0～30min)(乙腈和2.5％乙酸水溶液的体积比从25∶75到90∶10梯度洗脱)
流速0.5ml/min检测波长280nm
将分离得到的五没食子酰基葡萄糖酸用甲醇溶解，配成浓度为0.3701mg/ml的溶液，取5μl进样，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图1B。
将制备的脂肪酸合成酶抑制剂用甲醇溶解，配成浓度为0.1343mg/ml的溶液，取5μl进样，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图1A。
由图1可知五没食子酰基葡萄糖酸为脂肪酸合成酶抑制剂的组成成分，计算得到五没食子酰基葡萄糖酸在脂肪酸合成酶抑制剂总提物中的含量为19.04μg/g。
b、氢谱(见图2)
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm：9.3(15H，s，galloyl-OH)，6.9(10H，s，galloyl-H)，6.97(1H，d，J＝9.5Hz，glu-H-1)，5.46(1H，t，J＝9.5Hz，glu-H-2)，5.46(1H，t，J＝9.5Hz，glu-H-3)，5.43(1H，t，J＝9.5Hz，glu-H-4)，4.77(1H，m glu-H-5)，4.75(1H，mglu-H-6)，4.48(1H，dd，J＝3.12Hz，glu-H-6).
c、碳谱(见图3)
13C NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm：165.9-164.4
146.1-145.8(galloyl-C-3’，C-5’)，139.1-138.29(galloyl-C-4’)，119.4-117.9(galloyl-C-1’)，109.5-109.2(galloyl-C-2’，C-6’)，78.82(glu-C-1)，72.6～68.2(glu-C)，66.6(glu-C-6).
d、液质谱(见图4)
ESI-MS m/z：957.6(M+1)。
2、没食子酸甲酯和斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷
取脂肪酸合成酶抑制剂的浸膏5g，拌200目硅胶5g，经常压硅胶柱层析，用200目的硅胶装柱，柱床的长度为50cm，柱的内径为5cm，按照6ml/min的流速用如下6个梯度的氯仿和甲醇混合液依次进行梯度洗脱：氯仿-甲醇的体积比为12∶1的混合液1，氯仿-甲醇的体积比为11∶1的混合液2，氯仿-甲醇的体积比为10∶1的混合液3，氯仿-甲醇的体积比为8∶1的混合液4，氯仿-甲醇的体积比为4∶1的混合液5，氯仿-甲醇的体积比为1∶1的混合液6，每250ml为一个流份，每个梯度洗脱量为40～60个流分不等(根据薄层检测的结果进行判定)，共洗脱313份。
将2-37流份合并，经过硅胶柱层析(洗脱剂为体积比为12∶1的氯仿与甲醇的混合液)，在60℃进行常压浓缩，得0.05g式II所示的化合物没食子酸甲酯。
将40-70流份合并，反复硅胶柱层析(洗脱液为体积比为10∶1的氯仿与甲醇的混合液)，常压60℃浓缩溶剂，浓缩后的流分放4℃冰箱静置，有黄色晶体析出，对析出的晶体采用热溶冷析法进行重结晶(用无水乙醇反复溶解4℃冷析)，得0.025g式III所示的化合物斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷。
(式II) (式III)
分离得到的没食子酸甲酯的结构确证：
a、硅胶薄层色谱检测
色谱条件如下：
采用硅胶G硅胶板
展开剂：氯仿-甲醇-甲酸(体积比为3∶0.5∶0.2)
制备样品：将分离得到的没食子酸甲酯用甲醇溶解，配成浓度为4mg/ml的溶液，取30μl点样，所得色谱图如图5所示。图5中1为没食子酸甲酯，2为脂肪酸合成酶抑制剂(乙酸乙酯总提物)。
另采用聚酰胺薄层板，以乙醇-水(体积比为95∶5)作展开剂，对没食子酸甲酯进行薄层色谱分析，所得色谱图如图6所示。
图6中1为脂肪酸合成酶抑制剂(乙酸乙酯总提物)，2为槲皮素-3-O-L-鼠李糖，3为五没食子酰基葡萄糖酸，4为没食子酸甲酯。
b、液相色谱(见图7)
色谱条件如下：
色谱柱SpherisorbC18(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：乙腈-体积百分含量为2.5％乙酸水溶液(0～30min)(乙腈和2.5％乙酸水溶液的体积比从25∶75到90∶10梯度洗脱)
流速：0.5ml/min检测波长280nm
将分离得到的没食子酸甲酯用甲醇溶解，配成浓度为0.0486mg/ml的溶液，取5μl进样，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图7B。
将制备的脂肪酸合成酶抑制剂用甲醇溶解，配成浓度为0.1343mg/ml的溶液，取5μl进样，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图7A。
由图7可知没食子酸甲酯为脂肪酸合成酶抑制剂的组成成分，计算得到没食子酸甲酯在脂肪酸合成酶抑制剂总提物中的含量为2.502μg/g。
c、氢谱(见图8)
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)6.94(2H，s，H-2，6)，3.73(3H，s，-OCH3).
d、碳谱(见图9)
13C NMR(500MHz，DMSO-d6)166.8(-COOH)，146.0(C-3，5)，138.9(C-4)，119.8(C-1)，109.0(C-2，6)，52.0(-OCH3)
e、质谱(见图10)
FAB-MS m/z：182(M++1)
分离得到的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的结构确证：
a、硅胶薄层色谱检测
色谱条件如下：
采用硅胶G硅胶板
展开剂：氯仿-甲醇-甲酸(体积比为3∶0.5∶0.2)
制备样品：将分离得到的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷用甲醇溶解，配成浓度为4mg/ml的溶液，取30μl点样，所得色谱图如图11所示。
图11中1为斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷，2为脂肪酸合成酶抑制剂(乙酸乙酯总提物)。
另采用聚酰胺薄层板，以乙醇-水(体积比为95∶5)作展开剂，对斛皮素-3-O L-鼠李糖苷进行薄层色谱分析，所得色谱图如图12所示。
图12中1为脂肪酸合成酶抑制剂(乙酸乙酯总提物)，2为槲皮素-3-O-L-鼠李糖，3为五没食子酰基葡萄糖酸，4为没食子酸甲酯。
b、液相色谱(见图13)
色谱条件如下：
色谱柱：SpherisorbC18(4.6mm×250mm，5μm)
流动相：乙腈-体积百分含量为2.5％的乙酸水溶液(O～30min)(乙腈和2.5％乙酸水溶液的体积比从25∶75到90∶10梯度洗脱)
流速：0.5ml/min检测波长373nm
将分离得到的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷用甲醇溶解，配成浓度为0.02958mg/ml的溶液，取5μl进样，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图13B。
将制备的脂肪酸合成酶抑制剂用甲醇溶解，配成浓度为0.1343mg/ml的溶液，取5μl进样，在上述色谱条件下进行分析，所得色谱图见图13A。
由图13可知斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷为脂肪酸合成酶抑制剂的组成成分，计算得到斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷在脂肪酸合成酶抑制剂总提物中的含量为1.522μg/g。
c、氢谱(见图14)
1H NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm：12.60(1H，s，5-OH)，7.29(1H，d，J＝1.5Hz，H-2)，7.24(1H，d，J＝8.4Hz，H-6)，6.85(1H，d，J＝8.4Hz，H-5)，6.36(1H，br.s，H-8)，6.19(1H，br.s，H-6)，5.25(1H，s，H-1)，0.81(3H，d，J＝6.0Hz，-CH3).
d、碳谱(见图15)
13C NMR(500MHz，DMSO-d6)δppm：156.9(C-2)，134.6(C-3)，178.2(C-4)，161.8(C-5)，99.3(C-6)，165.1(C-7)，94.1(C-8)，157.7(C-9)，104.4(C-10)，121.6(C-1’)，115.9(C-2’)，145.7(C-3’)，149.0(C-4’)，116.1(C-5’)，121.2(C-6’)，102.3(C-1”)，70.8(C-2”)，71.0(C-3”)，71.7(C-4”)，70.5(C-5”)，18.0(C-6”)
e、质谱(见图16)
FAB-MS m/z：449(M++1)
综上，可以得出每克脂肪酸合成酶抑制剂中所含五没食子酰基葡萄糖酸、没食子酸甲酯和斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的质量依次为19.04μg、2.502μg、1.522μg。
实施例2、本发明的脂肪酸合成酶抑制剂对FAS抑制活性的检测
试验中所用的NADPH、乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、DTT(二硫苏糖醇)均购于为罗氏诊断公司。
在37℃下，在2ml石英比色皿中加入FAS的底物：0.2mM乙酰辅酶A溶液25μl，0.4mM丙二酸单酰辅酶A溶液50μl和1.3mM NADPH溶液50μl，再加入0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液1.85ml及FAS溶液25μl混匀，启动酶促反应。用分光光度计检测单位时间内340nm波长处吸光值A的变化(ΔA/min)来表示FAS的活力。在一定浓度实施例1制备的脂肪酸合成酶抑制剂溶液存在下FAS全酶反应的活力下降，当其活力下降一半时所需脂肪酸合成酶抑制剂的浓度即为IC50，用该数值表示脂肪酸合成酶抑制剂对FAS的抑制能力。每个测定设三次重复。
脂肪酸合成酶(FAS)活性被抑制的用I％(抑制程度)来表示，其计算方法为：底物中加入脂肪酸合成酶抑制剂溶液的为实验组，测得其脂肪酸合成酶活性值为Ai，以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合成酶的活性值，该值用A0表示，并设定其为100％；
RA％(剩余活性)＝Ai/A0×100％
I％(抑制程度)＝(1-Ai/A0)×100％
脂肪酸合成酶抑制剂溶液的制备：将3mg实施例1制备的脂肪酸合成酶抑制剂溶于1ml的甲醇中，得到浓度为3mg/ml的脂肪酸合成酶抑制剂溶液。
表1、不同浓度的脂肪酸合成酶抑制剂对FAS的抑制活性
| 脂肪酸合成酶抑制剂溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中脂肪酸合成酶抑制剂的量(mg) | 折算成每毫克FAS中脂肪酸合成酶抑制剂的量(mg) | 抑制率(％) |
| 0 | 0 | 0 | 0％ |
| 1 | 1.5 | 0.2586 | 21.68％ |
| 2 | 3 | 0.5172 | 37.24％ |
| 5 | 7.5 | 1.293 | 56.43％ |
| 6 | 9 | 1.552 | 68.76％ |
| 10 | 15 | 2.586 | 91.53％ |
根据表1数据绘制脂肪酸合成酶抑制剂对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线见图17，回归方程为：y＝-0.0575x+0.8855，计算得到脂肪酸合成酶抑制剂对FAS的IC50为0.0067mg/ml。
实施例3、五没食子酰基葡萄糖酸、没食子酸甲酯和斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷分别对FAS抑制活性的检测
具体的测定方法同实施例2中脂肪酸合成酶抑制剂对FAS抑制活性的检测。
五没食子酰基葡萄糖酸溶液的制备：将16.8mg实施例1分离得到的五没食子酰基葡萄糖酸溶于1ml的甲醇中，得到浓度为16.8mg/ml的五没食子酰基葡萄糖酸溶液。
没食子酸甲酯溶液的制备：将16mg实施例1分离得到的没食子酸甲酯溶于1ml的甲醇中，得到浓度为16mg/ml的没食子酸甲酯溶液。
斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷溶液的制备：将20mg实施例1分离得到的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷溶于1ml的甲醇中，得到浓度为20mg/ml的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷溶液。
五没食子酰基葡萄糖酸、没食子酸甲酯和斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷分别对FAS抑制活性的结果分别见表2-4。
表2、不同浓度的五没食子酰基葡萄糖酸对FAS的抑制活性
| 五没食子酰基葡萄糖酸溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中五没食子酰基葡萄糖酸的量(μg) | 折算成每毫克FAS中五没食子酰基葡萄糖酸的量(μg) | 抑制率(％) |
| 0 | 0 | 0 | 30.76％ |
| 2 | 16.8 | 2.897 | 36.08％ |
| 3 | 25.2 | 4.3448 | 64.47％ |
| 五没食子酰基葡萄糖酸溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中五没食子酰基葡萄糖酸的量(μg) | 折算成每毫克FAS中五没食子酰基葡萄糖酸的量(μg) | 抑制率(％) |
| 4 | 33.6 | 5.7931 | 64.65％ |
| 5 | 42 | 7.241 | 67.12％ |
根据表2数据绘制五没食子酰基葡萄糖酸对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线见图18，回归方程为：y＝-0.0167x+0.996，计算得到计算得到五没食子酰基葡萄糖酸对FAS的IC50为0.0297mg/ml。
表3、不同浓度的没食子酸甲酯对FAS的抑制活性
| 没食子酸甲酯溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中没食子酸甲酯的量(μg) | 折算成每毫克FAS中没食子酸甲酯的量(μg) | 抑制率(％) |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 13 | 2.2 | 27.72％ |
| 4 | 26 | 4.5 | 33.7％ |
| 5 | 32.5 | 5.6 | 46.74％ |
| 6 | 39 | 6.7 | 64.68％ |
| 8 | 52 | 8.9 | 73.92％ |
| 10 | 65 | 11.2 | 76.63％ |
由表3可知，没食子酸甲酯对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线见图19，回归方程为：y＝-0.0121x+0.9328，计算得到没食子酸甲酯对FAS的IC50为0.03576mg/ml。
表4、不同浓度的斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷对FAS的抑制活性
| 斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的量(μg) | 折算成每毫克FAS中斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的量(μg) | 抑制率(％) |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2.5 | 100 | 17.2 | 21.17％ |
| 斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的量(μg) | 折算成每毫克FAS中斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷的量(μg) | 抑制率(％) |
| 3 | 120 | 20.7 | 37.6％ |
| 4 | 160 | 27.6 | 50.37％ |
| 5 | 200 | 34.48 | 65.12％ |
| 7.5 | 300 | 51.7 | 96.35％ |
由表4可知，斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷对FAS全反应的抑制作用的线性回归曲线见图20，回归方程为：y＝-0.0033x+1.0364，计算得到斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷对FAS的IC50为0.1625mg/ml。
综上，五没食子酰基葡萄糖酸、没食子酸甲酯和斛皮素-3-O-L-鼠李糖苷均对FAS具有抑制活性，表明上述三种物质均为本发明的脂肪酸合成酶抑制剂的活性成分。
实施例4、没食子酸甲酯对酮酰还原反应抑制活性的检测
酮酰还原反应活性测定：
在37℃下，在2ml石英比色皿中加入0.1M pH7.0磷酸盐缓冲液(KH2PO4-K2HPO4缓冲液，含1mmol/L EDTA 1.90ml)，60mmol/L乙酰乙酸乙酯，1.3mMNADPH溶液50μl，及FAS溶液15～25μl混匀，启动酶促反应。用分光光度计检测单位时间内340nm波长处吸光值A的变化(ΔA/min)来表示FAS的活力。在一定浓度实施例1制备的没食子酸甲酯溶液存在下FAS的活力下降，当其活力下降一半时所需没食子酸甲酯的浓度即为IC50，用该数值表示没食子酸甲酯对FAS的抑制能力。每个测定设三次重复。
脂肪酸合成酶(FAS)活性被抑制的用I％(抑制程度)来表示，其计算方法为：底物中加入脂肪酸合成酶抑制剂溶液的为实验组，测得其脂肪酸合成酶活性值为Ai，以底物中只加入相应提取溶剂的为对照，测定其脂肪酸合成酶的活性值，该值用A0表示，并设定其为100％；
RA％(剩余活性)＝Ai/A0×100％
I％(抑制程度)＝(1-Ai/A0)×100％
表5、不同浓度的没食子酸甲酯对FAS酮酰还原反应的抑制活性
| 没食子酸甲酯溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中没食子酸甲酯的量(μg) | 折算成每毫克FAS中没食子酸甲酯的量(μg) | 抑制率(％) |
| 0 | 0 | 0 | 0 |
| 2 | 13 | 2.2 | 5.48％ |
| 没食子酸甲酯溶液加入量(μl) | 折算成每毫升测活溶液中没食子酸甲酯的量(μg) | 折算成每毫克FAS中没食子酸甲酯的量(μg) | 抑制率(％) |
| 4 | 26 | 4.4 | 12.36％ |
| 5 | 32.5 | 5.6 | 39.73％ |
| 6 | 39 | 6.7 | 52.05％ |
| 7 | 45.5 | 7.8 | 54.73％ |
| 8 | 52 | 8.9 | 82.1％ |
| 10 | 65 | 11.2 | 87.64％ |
根据表5数据绘制，没食子酸甲酯对FAS酮酰还原反应的抑制作用的线性回归曲线见图21，回归方程为：y＝-0.0154x+1.1065，计算得到没食子酸甲酯对酮酰还原反应的IC50为0.03938mg/ml。
Claims (9)
1.一种脂肪酸合成酶抑制剂，其活性成分包括：式I所示的化合物、式II所示的化合物和式III所示的化合物；
(式I)
(式II) (式III)
其中，式III中的基团Rha代表L-鼠李糖基。
2.根据权利要求1所述的脂肪酸合成酶抑制剂，其特征在于：每克所述脂肪酸合成酶抑制剂中含式I化合物、式II化合物和式III化合物的质量依次为18-20μg、2-3μg、1-2μg。
3.权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂在制备预防和/或治疗癌症药物中的应用。
4.权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂在制备减肥药中的应用。
5.权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂在作为食品添加剂中的应用。
6.权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂在作为保健品添加剂中的应用。
7.权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂在作为日用化学品添加剂中的应用。
8.一种预防和/或治疗癌症的药物，其活性成分为权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂。
9.一种减肥药，其活性成分为权利要求1或2所述的脂肪酸合成酶抑制剂。
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