CN106456594A

CN106456594A - PPARγ活化剂

Info

Publication number: CN106456594A
Application number: CN201580022943.7A
Authority: CN
Inventors: 桝谷文武; 辻野义雄; 安芝英; 山津敦史; 山下裕辅; 原田清佑
Original assignee: Japan Hengshun Corp
Current assignee: Japan Hengshun Corp
Priority date: 2014-07-11
Filing date: 2015-07-03
Publication date: 2017-02-22
Also published as: EP3167883A1; JPWO2016006548A1; KR20160141754A; US20170105965A1; US9943501B2; EP3167883A4; JP6157041B2; WO2016006548A1

Abstract

一种PPARγ活化剂，其特征在于，含有式(1)所表示的丁烯羟酸内酯化合物或其药学上容许的盐。式(1)中，R¹表示氢原子、磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷基或也可以具有取代基的糖残基，R²表示苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基。

Description

PPARγ活化剂

技术领域

本发明涉及可以用于脂质代谢活化剂、抗糖尿病剂或肥胖症、生活习惯病等的预防·改善等的PPARγ活化剂。

背景技术

香醋（香醋）是主要使糯米发酵并长时间熟化而制造的发酵食品，在中国自古以来被用作醋调味料。香醋与在日本一般使用的醋即米醋相比，氨基酸等有机化合物的含有率高，近年来在日本也作为有益于健康的保持增进的健康食品而人气升高。

例如，本发明人们在专利文献1中公开了含有香醋的低级链烷醇萃取物作为有效成分的过氧化物酶体增殖剂激活受体α活化剂及γ活化剂。据此，记载了在香醋的低级链烷醇萃取物中确认到了参与脂肪酸氧化的刺激及血清脂质的介导作用并改善糖代谢的过氧化物酶体增殖剂激活受体（PPAR）α的活化作用、以及参与脂肪细胞的分化并带来血糖值及血中脂质的降低等的PPARγ的活化作用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2009-249322号公报

发明内容

发明所要解决的问题

然而，专利文献1中公开的PPAR活化剂是通过将香醋以低级链烷醇进行萃取而得到的萃取物，关于该萃取物的PPARγ活化作用的效果确认，在参照一般生物体内而调整了反应条件的实验体系中进行，确认在将香醋的低级链烷醇萃取物以1.0%（即10000ppm）这样高的比例添加到细胞培养液中的情况下，可见PPARγ活化作用。因而，在将该香醋的低级链烷醇萃取物作为PPARγ活化剂使用时，必须将其大量地添加或摄取。

此外，专利文献1中公开的香醋的低级链烷醇萃取物是包含多种成分的混合物，没有示出作为PPAR活化剂的有效成分具体是何物。

因此，本发明的目的在于鉴定香醋中包含的具有优异的PPAR活化作用的有效成分，提供包含该有效成分的PPAR活化剂。

用于解决问题的方法

为了解决上述课题，本发明人们对香醋实施各种分级处理，并对所得到的分级物进行了研究，结果发现了具有优异的PPAR活化作用的丁烯羟酸内酯化合物。即，本发明的PPARγ活化剂含有式（1）所表示的丁烯羟酸内酯化合物或其药学上容许的盐。

[化学式1]

[式（1）中，R¹表示氢原子、磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷基或也可以具有取代基的糖残基，R²表示苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基。]

该丁烯羟酸内酯化合物具有PPARγ配体活性，且具有使PPARγ活化的作用。此外，该丁烯羟酸内酯化合物特别具有将白色脂肪细胞变得褐色脂肪细胞化而使脂质代谢活化的作用。进而，该丁烯羟酸内酯化合物对糖尿病、胰岛素抵抗性、高脂血症、高血压、动脉硬化、内脏脂肪型肥胖、皮下脂肪蓄积、体重增加、瘦素抵抗性、脂肪肝或生活习惯病等PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病的预防、改善或治疗等是有效的。

此外，本发明的PPARγ活化剂优选在上述的式（1）中，R¹为氢原子、磷酸基或也可以具有取代基的糖残基，R²为苯基、4-甲基苯基、苄基或4-甲基苄基。由此，可选择具有水溶性的性质且作为PPARγ活化剂而适合的丁烯羟酸内酯化合物。

此外，本发明的药物为用于预防或治疗选自由糖尿病、胰岛素抵抗性、肥胖症、体重增加、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、瘦素抵抗性、脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化及代谢综合征组成的组中的至少一种疾病的药物，含有上述的PPARγ活化剂。由此，可选择包含上述的丁烯羟酸内酯化合物的PPARγ活化剂的适合的用途。

此外，本发明的补充剂为用于预防或改善选自由糖尿病、胰岛素抵抗性、肥胖症、体重增加、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、瘦素抵抗性、脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化及代谢综合征组成的组中的至少一种疾病的补充剂，包含上述的PPARγ活化剂。由此，选择包含上述的丁烯羟酸内酯化合物的PPARγ活化剂的适合的用途。

此外，本发明的PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病的治疗、预防、抑制或改善用组合物含有式（2）所表示的丁烯羟酸内酯化合物或其药学上容许的盐作为有效成分。

[化学式2]

[式（2）中，R¹表示氢原子、磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷基或也可以具有取代基的糖残基，R²表示苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基。]

PPARγ为主要参与糖·脂质代谢的因子，参与代谢综合征、代谢性疾病、体重增加、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗性、高血压、动脉硬化、高脂血症、炎症性疾病及恶性肿瘤等增殖性疾病。上述的丁烯羟酸内酯化合物由于具有PPARγ配体活性，且具有使PPARγ活化的作用，所以被有效用于PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病的预防、改善、抑制或治疗。

此外，作为PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病，优选为选自由糖尿病、胰岛素抵抗性、肥胖症、体重增加、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、瘦素抵抗性、脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化及代谢综合征组成的组中的1种以上的病理状态、症状或疾病。由此，可选择上述的丁烯羟酸内酯化合物的特别适合的用途。该丁烯羟酸内酯化合物除了具有使白色脂肪细胞变得褐色脂肪细胞化、促进利用了脂质的热产生、使脂质代谢活化的作用以外，还具有体重增加抑制作用、内脏脂肪蓄积抑制作用、皮下脂肪蓄积抑制作用、脂联素增强作用、胰岛素分泌抑制作用及瘦素分泌抑制作用等。因此，能够治疗、预防、抑制或改善这些PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病。

发明效果

根据本发明，可得到具有高的PPARγ活化作用的丁烯羟酸内酯化合物。该丁烯羟酸内酯化合物除了具有使白色脂肪细胞变得褐色脂肪细胞化而将脂质代谢活化的作用以外，还具有体重增加抑制作用、内脏脂肪蓄积抑制作用、脂联素增强作用、胰岛素分泌抑制作用及瘦素分泌抑制作用等。因此，可以为了治疗、预防、抑制或改善胰岛素抵抗性、糖尿病、体重增加、肥胖症、高脂血症、高血压、动脉硬化、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、脂肪肝或代谢综合征等PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病而使用。像这样，可得到有益于预防或改善上述那样的病理状态等的能够广泛应用于食品、补充剂、药剂等中的丁烯羟酸内酯化合物。

附图说明

图1是简略地说明由香醋制造作为本发明的PPARγ活化剂的有效成分的丁烯羟酸内酯化合物的方法的流程图。

图2是简略地说明实施例1中的由香醋调制为正相柱分级物的方法的流程图。

图3是表示实施例1中的正相柱分级物的PPARγ配体活性的图表。

图4是简略地说明实施例2中的调制为反相柱分级物的方法的流程图。

图5是表示实施例2中得到的反相柱分级物（fr.1～5）和实施例1中得到的正相柱分级物（分级前fr.1）的HPLC分析结果的色谱。横轴表示保留时间（分钟）。

图6是表示实施例2中的反相柱分级物的PPARγ配体活性的图表。

图7是表示实施例3中的峰分级物的PPARγ配体活性的图表。

图8是表示实施例3中得到的峰分级物中的峰5的HPLC分析结果的色谱。纵轴表示检测强度，横轴表示保留时间（分钟）。

图9是表示实施例3中的峰5的分级物及实施例2中得到的反相柱分级物的级分5的PPARγ配体活性的图表。

图10是表示实施例4中的峰5的分级物的LC/MS的结果的图。纵轴表示检测强度，横轴表示m/z值。

图11是表示实施例5中的UCP-1基因的表达量的结果的图表。

图12是表示实施例7中的5-羟基-4-苯基丁烯羟酸内酯合成品的PPARγ配体活性的图表。

图13是表示实施例8中的丁烯羟酸内酯化合物的PPARγ配体活性的图表。

图14是表示实施例9中的由5-羟基-4-苯基丁烯羟酸内酯的投与而带来的小鼠的体重增加抑制效果的图表。

图15是表示实施例10中的小鼠血液中包含的脂联素的量的图表。

图16是表示实施例11中的小鼠血液中包含的胰岛素的量的图表。

图17是表示实施例12中的小鼠血液中包含的瘦素的量的图表。

图18是表示实施例13中的由5-羟基-4-苯基丁烯羟酸内酯的投与而带来的小鼠的皮下脂肪及内脏脂肪的蓄积抑制效果的图表。

具体实施方式

以下，对本发明进行详细说明。本发明的PPARγ活化剂中包含上述的式（1）所表示的丁烯羟酸内酯化合物作为有效成分。该式（1）中，作为R¹所示的原子，优选氢原子，作为分子，可列举出磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷基或也可以具有取代基的糖残基。作为脂肪酸基，可列举出月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、十七烷酸或硬脂酸等。作为碳原子数为1～4的烷基，可列举出甲基、乙基、各种丙基或各种丁基。此外，磷酸基、由糖残基形成的糖苷从在体外的稳定性及在体内的吸收性的观点出发是优选的，作为糖，没有特别限定，可使用各种葡萄糖、各种半乳糖或各种甘露糖等，特别是葡萄糖作为形成适合的糖苷的糖被使用。

此外，R²优选为苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基，特别是从作用效果的观点出发，适宜使用苯基、4-甲基苯基、苄基或4-甲基苄基。

作为该式（1）所表示的化合物中的特别是从药理活性的方面出发优选的化合物，除了以下式（3）所示的5-羟基-4-苯基丁烯羟酸内酯、以下式（4）所示的5-羟基-4-（4-甲基苯基）丁烯羟酸内酯以外，还可列举出5-羟基-4-（4-甲基苄基）丁烯羟酸内酯、5-羟基-4-苄基丁烯羟酸内酯，像后述那样，作为PPARγ活化剂，特别优选从香醋中发现的5-羟基-4-苯基丁烯羟酸内酯或5-羟基-4-（4-甲基苯基）丁烯羟酸内酯。

[化学式3]

[化学式4]

式（3）所示的丁烯羟酸内酯化合物、即5-羟基-4-苯基丁烯羟酸内酯可以从作为发酵食品的香醋中萃取得到。作为由香醋得到该丁烯羟酸内酯化合物的方法，没有特别限定，但作为一个例子，如图1的流程图中所示的那样，由（准备）香醋（的工序）S0、将香醋中包含的脂质成分除去的脱脂处理工序S1、使用溶剂萃取目标成分的溶剂萃取处理工序S2、利用正相色谱法的分级工序S3、和利用反相色谱法的分级工序S4简略构成。

该香醋S0是在糯米中添加酒曲使醇发酵，添加稻壳使醋酸发酵，添加水进行萃取并使该萃取液熟化一定时间而得到的物质。

图1中所示的脱脂处理S1是为了将香醋S0中包含的多余的脂质成分除去而进行的。通过进行香醋S0的脱脂处理，由于香醋中包含的多余的脂质成分被除去，所以在后面进行的溶剂萃取处理S2、分级工序S3及S4中，能够有效地萃取式（3）所表示的丁烯羟酸内酯化合物。具体而言，虽然没有特别限定，但是可以通过如下方式进行：在香醋S0中加入有机溶剂并充分搅拌，使多余的脂质成分移动到有机溶剂相中后，使用离心分离机等分离成水相和有机溶剂相，并将水相回收。该操作优选进行多次。作为有机溶剂，只要是具有脱脂效果的溶剂即可，例如，适宜使用石油系有机溶剂、醇类等，特别适宜使用正己烷。作为使用的有机溶剂的量，优选为香醋的10重量%到1000重量%左右，最优选为香醋的量的一半到2倍左右。

接着，在图1中所示的溶剂萃取处理S2中，在经脱脂处理的香醋中加入溶剂，使作为目标的丁烯羟酸内酯化合物移动到所加入的溶剂中。作为使用的溶剂，可适宜使用有机溶剂，没有特别限定，可以使用正丁醇或乙醇等链烷醇、醋酸乙酯、丁二醇及氯仿等。这些溶剂萃取处理S2不限于单一的处理，也可以进行多次以相同溶剂的萃取处理、或将多种溶剂萃取处理组合进行。

作为上述的溶剂萃取处理S2的一个例子，对使用氯仿作为有机溶剂时的萃取处理进行说明。在该氯仿萃取处理中，在经脱脂的香醋中加入氯仿，使作为目标成分的丁烯羟酸内酯化合物高效地移动到氯仿相中。具体而言，例如通过将香醋与氯仿使用分液漏斗进行分配并回收氯仿相来进行。该情况下，分配优选进行多次。作为氯仿的添加量，优选为水相（香醋）的10重量%到1000重量%左右，最优选为水相的量的一半到2倍左右。回收的氯仿相可以通过减压浓缩处理等将溶剂简单地除去，能够得到固体或浓缩的香醋的氯仿萃取物。

接着，对图1中所示的利用正相色谱法的分级工序S3进行说明。在该分级工序S3中，以将工序S2中得到的溶剂萃取物中包含的目标成分即丁烯羟酸内酯化合物纯化分离为目的。作为一个例子，对利用正相硅胶柱色谱法的分级处理进行说明。具体而言，虽然没有特别限定，但是通过在填充有硅胶的柱色谱管上放置吸附有溶剂萃取物的硅胶，从其上方开始流过规定的流动相使其洗脱来进行。作为流动相，没有特别限定，适宜使用苯-丙酮，例如通过以将苯：丙酮的比设定为40：1到0：1的梯度的流动相进行洗脱，从而能够适宜地分离。在确认所得到的分级物中的哪个分级物中包含目标物质时，可以进行后述的PPARγ活化试验、或测定PPARγ所参与的基因（UCP-1基因等）的表达量的试验等。

接着，对图1中所示的利用反相色谱法的分级工序S4进行说明。在该分级工序S4中，以将工序S3中得到的正相柱分级物中包含的目标成分即丁烯羟酸内酯化合物进一步进行纯化分离、粗略离析为目的。作为一个例子，对利用反相硅胶柱色谱法的分级处理进行说明。具体而言，虽然没有特别限定，但是通过将以十八烷基甲硅烷基（C₁₈）修饰的硅胶填充到柱中，并将工序S3中得到的分级物添加到柱中后，流过规定的流动相使其洗脱来进行。作为流动相，没有特别限定，但适宜使用甲醇-水，例如通过以将甲醇：水的比设定为1：9到1：0的梯度的流动相进行洗脱，从而能够适宜地离析。在确认所得到的分级物中的哪个分级物中包含目标物质的丁烯羟酸内酯化合物时，可以进行后述的PPARγ活化试验、或PPARγ所参与的基因（UCP-1基因等）的表达量的测定试验等。此外，对所得到的分级物进行HPLC分析，确认色谱，通过确认是否得到单一峰可以确认是否将丁烯羟酸内酯化合物进行了离析。

另外，上述的分级处理S3、S4不限于单一的处理，也可以进行多次利用相同填充材料或不同填充材料的分级处理、或将利用相同流动相或不同流动相的分级处理组合进行。

此外，式（3）所表示的丁烯羟酸内酯化合物除了从香醋中萃取分离而得到的方法以外，还能够通过公知的合成方法来制造。例如可以通过使苯乙醛与乙醛酸酯进行羟醛缩合得到3-苯基-4-氧代-2-羟基-丁酸酯后，在水的存在下使酸发生作用（日本特开平6-211825号公报）；使苯乙醛与乙醛酸酯在吗啉盐酸盐存在下反应（日本特开平11-152280号公报）等，从而制造本发明的丁烯羟酸内酯化合物。同样地，对于式（4）及式（1）所表示的其他的丁烯羟酸内酯化合物，也可以通过公知的合成方法（参照J.Org.Chem.、1981年、第46卷、pp.4889-4894及Tetrahedron Letters、2013年、第54卷、pp.5322-5324等）来制造。

作为上述的丁烯羟酸内酯化合物的药理学上容许的盐，只要是与酸或碱形成的盐即可，没有特别限定。此外，该丁烯羟酸内酯化合物或其盐可以是水合物、醇等有机溶剂合物等，也可以是无水物。此外，也包含各种异构体、外消旋体、或它们的混合物等。进而，该丁烯羟酸内酯化合物或其盐也可以是分子结构中包含的官能团经修饰等的、通过生物体的代谢作用而显示效果的前体药物。

式（1）所表示的丁烯羟酸内酯化合物具有使PPARγ活化的作用。另外，本发明中，所谓PPARγ活化剂是指与PPARγ结合等而使PPARγ活化、能够调整靶基因的表达的物质。作为PPARγ的靶基因，可列举出例如脂联素、UCP-1、脂肪酸结合蛋白质或aP2等。此外，在本说明书中，PPARγ配体活性与PPARγ激动剂活性含义相同。

本发明的PPARγ活化剂可以用于PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病的治疗、预防、抑制或改善。这里的治疗、病理状态的改善中也包含对于这些疾病或病理状态的预防或预后的处置。PPARγ所参与的疾病中广泛包含参与脂肪细胞的分化或代谢的疾病，特别是包含胰岛素抵抗性、糖尿病、高脂血、高血压、内脏脂肪型肥胖、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、脂肪肝、体重增加、肥胖、瘦素抵抗性、动脉硬化、炎症性疾病、恶性肿瘤或代谢综合征或与它们相关联的疾病。本发明的PPARγ活化剂被用于针对这些疾病中的一个或多个的治疗或改善、对症状或病理状态的抑制、预防等。

此外，本发明的丁烯羟酸内酯化合物由于具有将使脂肪蓄积的白色脂肪细胞转换成使脂肪燃烧的褐色脂肪细胞的作用，所以可以作为脂质代谢活化剂使用。另外，作为脂质代谢活化剂的作用机制并不仅限定于上述的使白色脂肪细胞变得褐色脂肪细胞化，本发明的化合物具有PPARγ活化作用，与PPARγ的靶基因的转录亢进也有关。

进而，由于式（1）所表示的丁烯羟酸内酯化合物具有PPARγ活化作用，所以可以作为抗糖尿病剂、胰岛素抵抗性治疗剂、抗肥胖症剂、体重增加抑制剂、内脏脂肪蓄积抑制剂、皮下脂肪蓄积抑制剂、瘦素抵抗性治疗剂、脂质代谢异常治疗剂、抗高脂血症剂、动脉硬化治疗剂及代谢综合征抑制剂来使用。

本发明的PPARγ活化剂等包含上述的式（1）所表示的丁烯羟酸内酯化合物作为有效成分，可以作为用于人或动物的医药品、医药部外品及食品使用。食品中也包含补充剂、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等。

在将本发明的PPARγ活化剂等作为医药品或医药部外品使用的情况下，可以通过以往惯用的方法调制成各种形态。该情况下，可以使用普通制剂用的药理学上容许的载体或赋形剂、润滑剂、分散剂、崩解剂、缓冲剂、溶剂、增量剂、保存剂、香料或稳定化剂等作为医药品的添加剂而容许的添加剂进行制剂化。进而，为了提高该丁烯羟酸内酯化合物的生物有效度或稳定性，也可以使用包含微胶囊、脂质体制剂、微粉末化或使用了环糊精等的包合化等制剂技术的施药系统。

在将本发明的PPARγ活化剂等作为经口投与制剂使用的情况下，可以以片剂、颗粒剂、胶囊剂或内服用液剂等形态使用，但优选以适于从消化道吸收的形态使用。此外，在由于流通性、保存性等理由而提供所期望的形态的制剂的情况下，也可以使用以往的制剂技术。此外，在作为外用剂等非经口投与剂使用的情况下，可以制成注射剂、坐剂及胶带剂、外敷软膏剂等经皮吸收剂等形态。此外，在由于流通性、保存性等理由而使用固形制剂时，也可以用适当的溶剂溶解后使用，也能够通过以往的制剂技术以液剂及半固形剂的形态提供。

此外，在将本发明的PPARγ活化剂等作为食品使用的情况下，可列举出片剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆制剂等补充剂形态、汤、粥、饮料、面类、果冻、谷类食物、面包、乳制品、调味料、食用油、糕点等形态。此外，也可以作为动物用食品（饲料、宠物食物；干式、湿式、动物用补充剂、动物用饮料等）使用。在作为食品使用时，也可以添加各种来源于香醋的提取物等的成分、或维他命、矿物质或氨基酸等营养素等。

本发明的PPARγ活化剂等的投与量或有效摄取量由于根据作为目标的治疗效果、投与方法、投与对象及剂型而发生变化，所以没有特别限定，但作为一天的经口投与量，以有效成分计约为0.01μg/60kg体重～约300mg/60kg体重，优选为0.05μg/60kg体重～约100mg/60kg体重，优选将其分成1～3次进行投与。此外，作为一天的非经口的投与量，优选以有效成分计约为0.01μg/60kg体重～100mg/60kg体重，优选为约0.03μg/60kg体重～50mg/60kg体重。

接着，通过实施例对本发明进一步进行详细说明，但本发明并不受这些实施例的任何限定。

实施例

以下的实施例中的PPAR活化试验的测定方法如下所述。

（1）PPARγ活化试验

（1-1）准备

准备表达由来自人的PPARγ配体结合域和来自酵母的GAL4转录因子的DNA结合域构成的嵌合蛋白质的质粒的pM-PPARγ、和按照通过该嵌合蛋白质来控制表达的方式设计的在GAL4应答序列的下游连结有来自海萤的荧光素酶结构基因的质粒的p4×UASg-tk-luc。此外，作为转染效率修正用质粒，准备具有在细胞内恒常表达的病毒性表达启动子的来自海肾的荧光素酶表达质粒的pRL-CMV。另一方面，作为CV-1细胞（来自非洲绿猴肾脏）的培养基，使用10%FBS/DMEM，在100mm培养皿中按照成为4.5×10⁵cells的方式播种CV-1细胞，在37℃、5%CO₂环境下用孵化器进行培养。

（1-2）CV-1细胞的转化

对培养24小时后的CV-1细胞，共转染2.0μg的pM-PPARγ、4.0μg的p4×UASg-tk-luc、及0.04μg的pRL-CMV，进行CV-1细胞的转化。转化以脂质体法来进行，使用LipofectAMINE（注册商标）Reagent（Invitrogen公司制品）。在转化操作后，在37℃、5%CO₂环境下进行3.5小时培养。

（1-3）待检试样的添加

孵化后，通过胰蛋白酶处理将CV-1细胞回收，在96孔板中按照成为1×10⁵cells/mL的浓度的方式播种50mL。将待检试样用4%FBS/DMEM进行稀释，按照成为最终浓度的2倍浓度的方式进行调整，在上述的96孔板中添加50mL。另外，作为对照物质，使用DMSO。添加待检试样及对照物质（DMSO）后，在37℃、5%CO₂环境下进行24小时孵化。

（1-4）荧光素酶活性的测定

荧光素酶活性的测定使用Dual-Luciferase（注册商标）Reporter Assay System（Promega Corporation制品）来进行。从96孔板中除去培养液，将细胞用PBS（-）进行洗涤，用纸巾除去水分。加入30mL细胞溶解液（Passive Lysis Buffer），将96孔板振荡15分钟。将细胞萃取液各10mL地转移到96孔荧光板中。添加发光基质液70mL，以测定时间10秒的设定使用照度计（Micro Lumat Plus、Berthold Japan co.ltd.制品）测定由荧光素酶产生的发光强度。

待检试样的PPARγ活化作用以相对于对照的比例（%）进行评价。为了修正转染效率，求出测定的海萤·荧光素酶活性值（A）除以测定的海肾·荧光素酶活性值（B）而得到的值（A/B）。算出对照组的A/B值的平均值，将该平均值作为100。算出待检试样的A/B值，将相对于对照的平均值的比例（%）作为待检试样的PPARγ活化能力。

[实施例1正相柱分级物的调制及活性测定]

通过图2中所示的分级流程，由香醋调制为7个正相柱分级物。以下，对分级流程的各处理进行详述。

（1）己烷脱脂处理

在香醋（制品名；8年熟化恒顺香醋、日本恒顺株式会社制品）1L中加入等量的正己烷并充分搅拌后，以5000rpm进行10分钟离心分离，回收水层。将该分配操作进行3次，除去香醋中包含的多余的脂质成分。

（2）氯仿萃取处理

接着，在回收的水层中加入等量的氯仿，使用分液漏斗进行3次分配操作，回收氯仿层。对回收的氯仿层进行减压下的浓缩而除去溶剂，得到3970mg的氯仿萃取物。

（3）正相硅胶柱处理

将通过氯仿萃取而得到的萃取物3970mg溶解到少量的丙酮中，吸附到130g的硅胶（硅胶60，0.040-0.063mm柱色谱法用；Merck Millipore Corporation制品）上。接着，在玻璃柱色谱管（柱色谱管的长度为60cm、直径为2.7cm、容量为343mL）中填充130g的硅胶，在其上放置吸附有香醋的氯仿萃取物的硅胶。按照苯：丙酮=20：1、10：1、5：1、3：1、2：1、1：1及丙酮100%的溶剂的顺序各550mL地流过各溶剂，将每种溶剂洗脱的分级物分开，作为正相柱分级物（级分1～7）回收。将回收的分级物分别在减压下浓缩而除去溶剂，测定所得到的分级物的固体重量。按照成为PPARγ配体活性测定中的最终浓度的1000倍以上的浓度的方式，将所得到的分级物的一部分溶解到适量的二甲基亚砜（DMSO、Nacalai Tesque株式会社制品）中。

（4）正相柱分级物的活性测定

将实施例1中得到的7个正相柱分级物作为待检试样，进行PPARγ活化试验，评价各分级物的PPARγ配体活性。各分级物的最终浓度设定为100μg/mL及50μg/mL。将各分级物的PPARγ配体活性示于图3中。这些图的纵轴为分级物的活性相对于对照物质（DMSO）的活性的比例。如图3中所示的那样，关于级分1的分级物（洗脱溶剂为苯：丙酮=20：1），可见浓度依赖性的PPARγ配体活性。

[实施例2反相柱分级物的调制及活性测定]

（1）反相ODS柱处理

如图4的分级流程中所示的那样，对于实施例1中得到的见到PPARγ活化作用的级分1的正相柱分级物，进一步进行反相色谱法，调制为5个反相柱分级物。反相色谱法如下进行。将ODS硅胶（YMC*GEL ODS-A 6nm S-150μm；YMC CO.,LTD.制品）50g用甲醇悬浮后填充到玻璃柱色谱管（柱色谱管的长度为40cm、直径为2.2cm、容量为152mL）中作为填充材料。将脱气后的甲醇100%按照不产生气泡的方式注入100mL使其流入该填充材料中。接着，以填充材料的10倍量（760mL）的脱气后的甲醇10%水溶液将填充材料进行平衡化。将实施例1中得到的级分1的分级物117mg溶解到甲醇中，将该溶液从填充材料上方进行添加。然后，将甲醇浓度为10%、20%、30%、40%及100%的脱气后的甲醇水溶液按照该浓度的顺序从填充材料的上方开始各180mL地流过，将每种溶剂洗脱的分级物分开，作为反相柱分级物（级分1～5）回收。所得到的反相柱分级物在减压下浓缩而除去溶剂，将所得到的分级物的一部分溶解到适量的二甲基亚砜中。对于所回收的分级物，使用高效液相色谱法（使用柱：YMC-Pack ODS-A250×4.6mmI.D.S-5μm 30nm、流动相：甲醇20%水溶液-甲醇70%水溶液、流速：1mL/分钟、柱温度：40℃、检测条件UV：280nm）进行分离状况的确认。将各分级物的HPLC的结果示于图5中。图5的横轴表示保留时间（分钟）。

（2）反相柱分级物的活性测定

将实施例2中得到的反相柱分级物（级分1～5）及实施例1中得到的正相柱分级物的级分1作为待检试样，进行PPARγ活化试验，评价各分级物的PPARγ配体活性。各分级物的最终浓度设定为100μg/mL。此外，对作为PPARγ激动剂的曲格列酮（Tro）也进行PPARγ活化试验。曲格列酮的最终浓度设定为1μM。将PPARγ配体活性示于图6中。这些图的纵轴为分级物的活性相对于对照物质（DMSO）的活性的比例。如图6中所示的那样，关于反相柱分级物的级分4（洗脱溶剂为水：甲醇=60：40）及级分5（洗脱溶剂为甲醇100%），见到了PPARγ配体活性。

[实施例3峰分级物的调制及活性测定]

（1）利用高效液相色谱法的分级

若看图5中所示的反相柱分级物的HPLC色谱，则在见到PPARγ活化作用的级分4及5中，可见多个特异性的峰。因此，对级分4及5进行显示特异性的峰的物质的分级，尝试将活性物质纯化。分级使用反相高效液相色谱法（使用柱：YMC-Pack ODS-A 250×4.6mmI.D.S-5μm 30nm、流动相：甲醇20%水溶液-甲醇70%水溶液、流速：1mL/分钟、柱温度：40℃、检测条件UV：280nm）来进行。

（2）峰分级物的活性测定

将实施例3中得到的峰分级物及曲格列酮（Tro）作为待检试样，进行PPARγ活化试验，评价各分级物的PPARγ配体活性。各分级物的最终浓度设定为100μg/mL，曲格列酮的最终浓度设定为1μM。将结果示于图7中。如图7中所示的那样，在级分4的峰5的分级物中可见明确的PPARγ配体活性。另外，将该峰5的分级物进行HPLC分析，结果作为单峰被检测到（参照图8），获知能够作为单一成分而离析。

进而，对实施例3中得到的峰5的分级物、实施例2中得到的反相柱分级物的级分5及曲格列酮，进行PPARγ活化试验，评价各分级物的PPARγ配体活性。峰5的分级物的最终浓度设定为低浓度：50μg/mL、及高浓度：100μg/mL，反相柱分级物的级分5的最终浓度设定为25μg/mL及50μg/mL，曲格列酮的最终浓度设定为10μM。将结果示于图9中。如图9中所示的那样，可见峰5的分级物的PPARγ配体活性为浓度依赖性地上升。

[实施例4峰分级物的结构決定]

对实施例3中得到的峰5的分级物进行结构解析。关于结构解析，进行LC/MS、¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC及HSQC。将LC/MS的结果示于图10中。图10的横轴表示m/z值，纵轴表示检测强度。由图10启示了峰5的分级物的分子量为176.1687，示性式为C₁₀H₈O₃。此外，由¹H-NMR、¹³C-NMR、HMBC及HSQC的结果明白，峰5中包含的成分为5-羟基-4-苯基丁烯羟酸内酯（以下，称为“5H4PB”）。

[实施例5 UCP-1基因表达量的测定]

线粒体解偶联型蛋白质（Uncoupling Protein；UCP）具有使线粒体内膜中的氧化的磷酸化反应解偶联、并将能量作为热而消耗的功能。其中，UCP-1在进行利用脂肪燃烧而产生热的褐色脂肪细胞中特异性地表达。近年来，报道了特定的PPARγ合成激动剂使储藏脂肪的白色脂肪细胞变化成使脂肪燃烧的褐色脂肪细胞（H.Ohno等、Cell metabolism、2012年、Vol.15、pp.395-404）。因此，为了确认见到了PPARγ配体活性的峰5的分级物、即5H4PB是否具有使白色脂肪细胞变得褐色脂肪细胞化的作用，进行了测定UCP-1基因的表达量的试验。

试验如下进行。将间充质细胞株10T1/2按照成为1×10⁴cells/mL的方式播种到12孔板中。培养至细胞变得融合后，按照最终浓度成为100μg/mL的方式添加峰5的分级物（5H4PB）。此外，作为对照物质，使用DMSO。自样品添加起24小时后，从细胞中回收mRNA，对mRNA量进行定量。mRNA定量使用LightCycler（注册商标、Roche Applied Science公司）来进行。将结果示于图11中。图的纵轴为峰5的分级物的UCP-1表达量相对于对照物质（DMSO）的UCP-1表达量的比值。如图11中所示的那样，获知峰5的分级物具有使UCP-1的表达水平上升的作用。UCP-1的表达量的增加表示来自脂质的热产生的亢进。由该结果获知，峰5的分级物、即5H4PB介由UCP-1的活化而有助于脂质代谢的改善、促进。

[实施例6 5H4PB的合成]

为了确认通过化学合成而得到的5H4PB具有与从香醋中萃取得到的5H4PB同样的PPARγ活化作用，合成了5H4PB。合成如下进行。使乙醛酸一水合物100mg和吗啉150mg分散到1,4-二噁烷450μL中，一滴一滴地加入水55μL。加入苯乙醛140mg，在室温下静置1小时后，加热回流24小时。将生成物进行减压浓缩，用二乙基醚2.5mL进行萃取。在萃取的二乙基醚层中加入无水硫酸镁使其脱水干燥后，再次进行减压浓缩。将浓缩物溶解到丙酮/氯仿混合溶液中，通过再结晶得到140mg的5H4PB。对所得到的合成5H4PB，进行液相色谱质量分析（LC/MS），确认与由香醋中萃取得到的5H4PB（实施例3中得到的峰5的分级物）相同。

[实施例7合成品的活性测定]

将实施例6中得到的5H4PB合成品作为待检试样，进行PPARγ活化试验。合成5H4PB的最终浓度设定为3.5μM。将结果示于图12中。这些图的纵轴为合成品的活性相对于对照物质（DMSO）的活性的比例。如图12中所示的那样，关于通过化学合成得到的5H4PB，也可见与香醋来源物同样高的PPARγ配体活性。

[实施例8各种丁烯羟酸内酯化合物的合成及各合成品的活性测定]

化学合成了以5H4PB为代表的各种丁烯羟酸内酯化合物，测定各种浓度下的PPARγ配体活性。本实施例中，5H4PB及各种丁烯羟酸内酯的合成如以下那样进行。首先，关于上述式（3）所表示的5H4PB，在1L容量的四口烧瓶中依次加入吗啉53mL（0.6mol）和1,4-二噁烷120mL，边进行冰浴边依次滴加地加入50%乙醛酸水溶液62mL（0.6mol、1.5当量）及浓盐酸50mL。将该混合物加热至内温87℃，缓慢地滴加将苯乙醛（48%邻苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）用1,4-二噁烷稀释3倍而得到的溶液，使该混合液回流一整夜。使用薄层色谱法确认回流后的反应液中不包含醛，将反应液放冷至室温。将反应液浓缩后加入200mL的醋酸乙酯。用饱和碳酸氢钠水进行洗涤，将所得到的有机层用硫酸钠干燥，过滤及浓缩而得到一部分油状的黄色固体101g。在该黄色固体中加入200mL的醋酸乙酯使其溶解，加入氧化铝（碱性）搅拌并进行成批处理（batch treatment）。将氧化铝过滤而除去后，将滤液浓缩而得到黄色固体（一部分油）96g。将其溶解到0.5倍量的醋酸乙酯中，加入1倍量的己烷进行搅拌，滤取析出的固体而得到30.2g（收率为40%、GC纯度为98.6%）乳白色固体的5H4PB。

此外，关于上述式（4）所表示的5-羟基-4-（4-甲基苯基）丁烯羟酸内酯（式（1）中的R²：甲基苯基）的化学合成，使用4-甲基苯乙醛（48%邻苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）来代替苯乙醛，将该醛的滴加温度设定为混合物的内温60℃，在滴加结束后加热至内温87℃，除此以外与本实施例的5H4PB的合成方法（各药剂的摩尔比、反应时间等）同样地进行。所得到的化合物的收率为30%，GC纯度为97.6%。

此外，关于以下式（5）中所示的5-羟基-4-（4-甲基苄基）丁烯羟酸内酯（式（1）中的R²：甲基苄基）的化学合成，除了使用3-（4-甲基苯基）丙醛（48%邻苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）来代替苯乙醛以外，与上述的5H4PB的合成方法同样地操作，使混合液回流一整夜而进行反应。使用薄层色谱法确认回流后的反应液中不包含醛，将反应液放冷至室温。将反应液浓缩后加入2倍量的醋酸乙酯。将该溶液用稀盐酸和饱和碳酸氢钠水进行洗涤，除去用柱难以分离的成分。将所得到的有机层用硫酸钠干燥，过滤及浓缩而得到粗制固体。将该固体溶解到10倍量的己烷/醋酸乙酯=1的混合溶剂中，用硅胶（PQS100B）3倍量进行成批处理。在所得到的浓缩液中加入己烷，滤取析出的固体而以收率24%、GC纯度99.2%得到无色固体的5-羟基-4-（4-甲基苄基）丁烯羟酸内酯。

[化学式5]

进而，关于以下式（6）中所示的5-羟基-4-苄基丁烯羟酸内酯（式（1）中的R²：苄基）的化学合成，除了使用3-苯基丙醛（48%邻苯二甲酸二乙酯溶液、0.4mol）来代替苯乙醛以外，与上述的5H4PB的合成方法同样地操作，使混合液回流一整夜而进行反应。使用薄层色谱法确认回流后的反应液中不包含醛，将反应液放冷至室温。将反应液浓缩后加入2倍量的醋酸乙酯。用饱和碳酸氢钠水进行洗涤，将所得到的有机层用硫酸钠干燥，过滤及浓缩而得到粗制固体。将该粗制固体用硅胶（PQS100B、展开溶剂：己烷/醋酸乙酯=4→2.3）进行纯化。在所得到的浓缩液中加入己烷，滤取析出的固体而以收率60%、GC纯度99.6%得到无色固体的5-羟基-4-苄基丁烯羟酸内酯。

[化学式6]

对如上述那样操作而合成的4种丁烯羟酸内酯化合物、即5H4PB（式（1）中的R²：苯基）、5-羟基-4-（4-甲基苯基）丁烯羟酸内酯（式（1）中的R²：甲基苯基）、5-羟基-4-苄基丁烯羟酸内酯（式（1）中的R²：苄基）及5-羟基-4-（4-甲基苄基）丁烯羟酸内酯（式（1）中的R²：甲基苄基），进行以下表1中所示的待检试样浓度下的试验。关于PPARγ配体活性的测定，除了将添加待检试样后的孵化时间设定为48小时以外，与实施例7同样地进行。将结果示于以下表1及图13中。以下表中所示的值及图的纵轴为各合成品的活性相对于对照物质（DMSO）的活性的比例（%）。在表1及图13中，将作为待检试样的各种丁烯羟酸内酯化合物以式（1）中的R²的官能团表示。

表1

如表1及图13中所示的那样，获知4种待检试样均具有PPARγ配体活性。其中，表1中带*的数值的试验区表示与对照相比为2倍以上的活性，p<0.05（有显著差异）。由该结果获知，5H4PB（R²：苯基）及5-羟基-4-（4-甲基苯基）丁烯羟酸内酯（R²：甲基苯基）在0.8～10μg/mL的范围内显示高的活性，5-羟基-4-苄基丁烯羟酸内酯（R²：苄基）在2～4μg/mL的范围内显示高的活性，5-羟基-4-（4-甲基苄基）丁烯羟酸内酯（R²：甲基苄基）在4～20μg/mL的范围内显示高的活性。其中，明白了5H4PB及5-羟基-4-（4-甲基苯基）丁烯羟酸内酯在低浓度范围内具有高的活性，特别是5-羟基-4-（4-甲基苯基）丁烯羟酸内酯具有最高的活性。

[实施例9对于食饵性肥胖模型小鼠的抗肥胖作用的验证]

将实施例6中得到的5H4PB对给饵了高脂肪食的小鼠进行投与，验证其抗肥胖作用。将5周龄的雄性C57BL/6J小鼠（供给源：日本Charles River株式会社）在温度为20～26℃、湿度为35～75%、照明为12小时（7：00～19：00）的环境条件下每1笼各1只进行单饲。驯化1周左右后，如以下表2中所示的那样，各6～8只地分成6组。对于试验组中的正常组，在试验期间，给饵普通固体饲料CRF1（Oriental Yeast Co.,ltd.制品、3.57kcal/g），对于对照组及药剂投与组，在试验期间，给饵高卡路里固体饲料D12492（Research Diets公司制品、5.24kcal/g）。饲料设定为自由摄取，饮水也设定为从给水瓶的自由饮水。

表2

对各药剂投与组的小鼠，以表2中所示的规定的投与量1天1次在整个12周投与作为待检物质的5H4PB（实施例6中制造）或作为阳性对照物质的罗格列酮（和光纯药工业株式会社制品）。另外，罗格列酮为选择性PPARγ配体，是具有与PPARγ结合而使葡萄糖、脂肪酸、胰岛素的血中浓度降低的作用的物质。在投与时，每周进行1次体重测定，算出对各个体的投与量。将5H4PB及罗格列酮分别悬浮到0.5w/v%甲基纤维素水溶液中，利用相同水溶液进行稀释，并按照投与容量成为10mL/kg的方式调整后，使用注射筒及柔软的胃饲管对胃内强制投与。另外，对正常组及对照组的小鼠，以10mL/kg的投与容量1天1次在整个12周投与仅0.5w/v%甲基纤维素水溶液。

从试验（投与）开始起以每周1次的频率测定各个体的体重，求出各试验组的平均值。将结果示于图14中。图的纵轴为小鼠的体重（g），横轴表示从试验开始起的天数（天）。如图14中所示的那样，对照组在试验开始21天以后，与正常组相比可见到体重的显著性增加。此外，在投与了5H4PB的组中，与对照组相比，显示出由高卡路里食引起的体重增加被抑制。具体而言，相对于试验结束时刻（第84天）的由高卡路里食引起的对照组的体重增加量（由对照组的体重减去正常组的体重的值），以0.037μg/kg/天投与了5H4PB的试验组的体重增加被抑制25.8%，以0.01mg/kg/天投与了5H4PB的试验组的体重增加被抑制27.8%。像这样，认识到5H4PB具有高的抗肥胖效果。另一方面，根据具有PPARγ配体活性的罗格列酮的投与结果，在以0.037μg/kg/天投与了罗格列酮的低用量的试验组中，与对照组相比体重增加，没有观察到抗肥胖效果。此外，关于以10mg/kg/天投与了罗格列酮的高用量的试验组，与以0.037μg/kg/天投与了5H4PB的试验组相比，体重增加抑制率也低。由这些获知，5H4PB即使为低用量的投与，也可以得到抗肥胖效果。

[实施例10食饵性肥胖模型小鼠中的血中脂联素的测定]

脂联素是与胰岛素抵抗性或糖尿病、动脉硬化等代谢异常症候群有关的分泌蛋白。已知脂联素缺损小鼠与野生型小鼠相比，具有容易发生胰岛素抵抗性疾病，容易罹患动脉硬化的性质，在人体内，脂联素浓度的降低也与糖尿病及动脉硬化等代谢异常症候群有关联。因此，对于实施例9中的食饵性肥胖模型小鼠，进行了测定血中脂联素量的试验。

对于从实施例9的试验开始起经过85天的雄性C57BL/6J小鼠的各个体，在2%异氟醚麻醉下使用添加了肝素的注射筒从腹部大静脉进行采血。采血量设定为约0.8mL。采集的血液在冰冷下保存至进行离心分离为止，离心分离（条件：4℃、约1800×g、10分钟）后，回收上层而得到血浆。血浆分注到采样管中，冷冻保存至进行测定为止。使用市售的ELISA试剂盒测定由各个体得到的小鼠血浆中包含的小鼠脂联素浓度，求出各试验组的平均值。将结果示于图15中。

图的纵轴为小鼠血浆中的脂联素的浓度（ng/mL），柱形图的各柱从左侧起表示正常组、对照组、5H4PB 0.037μg/kg/天投与组、5H4PB 0.01mg/kg/天投与组、罗格列酮0.037μg/kg/天投与组及罗格列酮10mg/kg/天投与组。根据该结果，与对照组相比，在投与了5H4PB的组中，可见脂联素浓度上升。此外，t检验的结果是，特别是在0.01mg/kg/天的投与组中，确认到显著的脂联素浓度的上升。由这些结果获知，通过5H4PB的投与，可以得到脂联素起作用的胰岛素抵抗性或糖尿病、高脂血症、动脉硬化等的预防·改善效果。

[实施例11食饵性肥胖模型小鼠中的血中胰岛素的测定]

使用市售的ELISA试剂盒测定在实施例10中由各个体得到的小鼠血浆中包含的小鼠胰岛素量，求出各试验组的平均值。将结果示于图16中。图的纵轴为小鼠血浆中的胰岛素浓度（ng/mL），柱形图的各柱所表示的试验组与上述的图15同样。根据该结果，与见到了由肥胖引起的高胰岛素血症的对照组相比，在投与了5H4PB的组中，特别是低用量的组中，确认了胰岛素浓度的上升得到抑制。由这些结果获知，通过5H4PB的投与，可以得到胰岛素抵抗性或糖尿病的预防·改善效果。

[实施例12食饵性肥胖模型小鼠中的血中瘦素的测定]

已知瘦素是进行食欲和代谢的调节的蛋白质激素，但通过肥胖而导致血中瘦素浓度上升，产生瘦素抵抗性。使用市售的ELISA试剂盒测定在实施例10中由各个体得到的小鼠血浆中包含的小鼠瘦素量，求出各试验组的平均值。将结果示于图17中。图的纵轴为小鼠血浆中的瘦素浓度（pg/mL），柱形图的各柱所表示的试验组与上述的图15及图16同样。根据该结果，与见到了由肥胖引起的高瘦素血症的对照组相比，在投与了5H4PB的组中，确认到瘦素浓度的上升被用量依赖性地抑制。由这些结果获知，通过5H4PB的投与，可以得到瘦素抵抗性或肥胖的预防·改善效果。

[实施例13食饵性肥胖模型小鼠中的皮下脂肪量及内脏脂肪量的测定]

对于从实施例9的试验开始起经过85天的雄性C57BL/6J小鼠的各个体，在2%异氟醚麻醉下采血后，使其安乐死。由各个体采集鼠蹊部皮下脂肪、精巢周围脂肪、肾脏周围脂肪及肠系膜脂肪，测定各脂肪的重量，求出各试验组的平均值。

将结果示于图18（A）～（D）中。各图的纵轴为测定的各脂肪组织的重量（g），柱形图的各柱从左侧起表示正常组、对照组、5H4PB 0.037μg/kg/天投与组、5H4PB 0.01mg/kg/天投与组、罗格列酮0.037μg/kg/天投与组及罗格列酮10mg/kg/天投与组。如图18中所示的那样，根据其结果，与对照组相比，在投与了5H4PB的组中，显示由高卡路里食引起的皮下脂肪及内脏脂肪的蓄积得到抑制。具体而言，相对于由高卡路里食引起的对照组的各脂肪组织的增加量（由对照组的脂肪组织重量减去正常组的脂肪组织重量而得到的值），在以0.037μg/kg/天投与了5H4PB的试验组中，鼠蹊部皮下脂肪的脂肪组织的增加被抑制约35%，精巢周围脂肪的脂肪组织的增加被抑制约18%，肾脏周围脂肪的脂肪组织的增加被抑制约13%及肠系膜脂肪的脂肪组织的增加被抑制约16%，在以0.01mg/kg/天投与了5H4PB的试验组中，鼠蹊部皮下脂肪的脂肪组织的增加被抑制约34%，精巢周围脂肪的脂肪组织的增加被抑制约15%，肾脏周围脂肪的脂肪组织的增加被抑制约13%及肠系膜脂肪量的脂肪组织的增加被抑制约40%。像这样，认识到5H4PB在低用量的投与中具有皮下脂肪及内脏脂肪的蓄积抑制效果。此外，根据具有PPARγ配体活性的罗格列酮的投与结果，在以低用量（0.037μg/kg/天）投与了罗格列酮的试验组中，与对照组相比，内脏脂肪量增加，没有观察到内脏脂肪的蓄积抑制效果。由这些结果获知，5H4PB即使是低用量的投与，也可以得到皮下脂肪及内脏脂肪的蓄积抑制效果。

[实施例14由5H4PB的投与产生的对肝脏组织的影响的研究]

在实施例13中，由各个体采集脂肪组织时，采集肝脏进行病理组织检查。病理组织检查所见如下所述。

关于正常组的个体，在肝细胞内没有见到脂肪滴的沉积，仅见到极轻度的炎症性细胞的浸润。另一方面，关于对照组的个体，在8个个体中的7个个体中，在肝细胞内极轻度～轻度地可见小型～大型脂肪滴的沉积，与正常组同样，极轻度地见到炎症性细胞的浸润。关于以0.037μg/kg/天投与了5H4PB的试验组及以0.01mg/kg/天投与了5H4PB的试验组，肝细胞内的脂肪滴的沉积完全没有或止于弱的沉积。在罗格列酮0.037μg/kg/天投与组中，在肝细胞内混合存在微细·小型·大型脂肪滴，可见极轻度～轻度的沉积，在罗格列酮10mg/kg/天投与组中，这些脂肪滴增加，可见中等程度的沉积，同时肝细胞呈现轻度的肥大。

根据这些病理组织检查所见，与罗格列酮投与组或对照组相比，没有可见由5H4PB引起的肝障碍。由此，确认5H4PB为安全性高的成分。

以上叙述的实施例全部为例示性示出本发明的例子，并非限定性示出本发明，本发明能够以其它各种变形方式及变更方式来实施。因此，本发明的范围并不仅限于权利要求书及其均等范围的规定。

产业上的可利用性

本发明由于提供预防或改善PPARγ所参与的生活习惯病或其它病理状态的PPARγ活化剂，所以在医疗或食品领域（也包括补充剂、健康食品、功能性食品、特定保健用食品等）的产业中广泛有用。

Claims

1.一种PPARγ活化剂，其特征在于，含有式(1)所表示的丁烯羟酸内酯化合物或其药学上容许的盐，

式(1)中，R¹表示氢原子、磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷基或也可以具有取代基的糖残基，R²表示苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基。

2.根据权利要求1所述的PPARγ活化剂，其特征在于，所述R¹为氢原子、磷酸基或也可以具有取代基的糖残基，所述R²为苯基、4-甲基苯基、苄基或4-甲基苄基。

3.一种药物，其包含权利要求1或2所述的PPARγ活化剂，是用于预防或治疗选自由糖尿病、胰岛素抵抗性、肥胖症、体重增加、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、瘦素抵抗性、脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化及代谢综合征组成的组中的至少一种疾病的药物。

4.一种补充剂，其包含权利要求1或2所述的PPARγ活化剂，是用于预防或改善选自由糖尿病、胰岛素抵抗性、肥胖症、体重增加、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、瘦素抵抗性、脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化及代谢综合征组成的组中的至少一种疾病的补充剂。

5.一种组合物，用于治疗、预防、抑制或改善PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病，其特征在于，含有式(2)所表示的丁烯羟酸内酯化合物或其药学上容许的盐作为有效成分，

式(2)中，R¹表示氢原子、磷酸基、脂肪酸基、也可以具有取代基的碳原子数为1～4的烷基或也可以具有取代基的糖残基，R²表示苯基、甲基苯基、二甲基苯基、乙基苯基、苄基、甲基苄基、二甲基苄基、乙基苄基、苯乙基、甲基苯乙基、二甲基苯乙基或乙基苯乙基。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述PPARγ所参与的病理状态、症状或疾病为选自由糖尿病、胰岛素抵抗性、肥胖症、体重增加、内脏脂肪蓄积、皮下脂肪蓄积、瘦素抵抗性、脂质代谢异常、高脂血症、动脉硬化及代谢综合征组成的组中的1种以上的病理状态、症状或疾病。