KR20160141754A - PPARγ 활성화제 - Google Patents

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KR20160141754A
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분부 마스타니
요시오 쓰지노
지영 안
아쓰시 야마쓰
유스케 야마시타
세이유 하라다
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니혼 고준 가부시키가이샤
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Abstract

식(1)로 표현되는 부테놀리드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 PPARγ 활성화제.
[식 1]
Figure pct00009
…(1)
[식(1) 중, R1은 수소 원자, 인산기, 지방산기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 탄소수 1~4의 알킬기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기를 나타내며, R2는 페닐기, 메틸페닐기, 디메틸페닐기, 에틸페닐기, 벤질기, 메틸벤질기, 디메틸벤질기, 에틸벤질기, 페네틸기, 메틸페네틸기, 디메틸페네틸기 또는 에틸페네틸기를 나타낸다.]

Description

PPARγ 활성화제{PPARγ ACTIVATING AGENT}
본 발명은 지질 대사 활성화제, 항당뇨병제 또는 비만증이나 생활 습관병 등의 예방·개선 등에 사용하는 것이 가능한 PPARγ 활성화제에 관한 것이다.
향초(식초)는 주로 찹쌀을 발효시켜 장기간 숙성시켜서 제조되는 발효 식품으로, 중국에서는 오래 전부터 식초 조미료로 이용되고 있다. 향초는 일본에서 일반적으로 사용되는 식초인 쌀 식초보다도 아미노산 등의 유기 화합물의 함유율이 높고, 최근에는 일본에서도 건강의 유지 증진에 도움이 되는 건강 식품으로 인기가 높아지고 있다.
예를 들어, 본 발명자들은 특허문헌1에서, 향초의 저급 알칸올(alkanol) 추출물을 유효 성분으로 함유하는 페르옥시솜(peroxisome) 증식제 응답성 수용체 α 활성화제 및 γ 활성화제를 개시하고 있다. 이에 따르면, 향초의 저급 알칸올 추출물에, 지방산 산화의 자극 및 혈청 지질의 중개 작용에 관여하여 당 대사를 개선하는 페르옥시솜 증식제 응답성 수용체(PPAR) α의 활성화 작용, 그리고 지방 세포의 분화에 관여하여 혈당치 및 혈중 지질의 저하 등을 초래하는 PPARγ의 활성화 작용이 인정되는 것이 기재되어있다.
일본 공개특허공보 제2009-249322호
그러나, 특허문헌1에 개시된 PPAR 활성화제는, 향초를 저급 알칸올에서 추출함으로써 얻은 추출물인 바, 이 추출물의 PPARγ 활성화 작용에 대한 효과 확인은 일반적으로 생체 내에 비해 반응 조건이 갖춰진 실험계에서 행해지고 있으며, 향초의 저급 알칸올 추출물을 1.0%(즉, 10000ppm)라는 높은 비율로 세포 배양액에 첨가한 경우에 있어서, PPARγ 활성화 작용이 나타나는 것으로 확인되고 있다. 따라서, 이 향초의 저급 알칸올 추출물을 PPARγ 활성화제로서 사용할 때에는, 이를 다량으로 첨가 또는 섭취 할 필요가 있다.
또한, 특허문헌1에 개시된 향초의 저급 알칸올 추출물은 여러 성분이 포함된 혼합물이므로, PPAR 활성화제로서의 유효 성분이 구체적으로 무엇인지는 나나타 있지 않다.
따라서, 본 발명의 목적은 향초 중에 포함된 우수한 PPAR 활성화 작용을 가진 유효 성분을 특정하고, 그 유효 성분을 포함한 PPAR 활성화제를 제공하는데 있다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명자들은 향초에 다양한 분획 처리를 실시하고, 얻은 분획물을 검토한 결과, 우수한 PPAR 활성화 작용을 가진 부테놀리드(butenolide) 화합물을 발견했다. 즉, 본 발명의 PPARγ 활성화제는 식(1)로 표현되는 부테놀리드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 함유한다.
[식 1]
Figure pct00001
…(1)
[식(1) 중, R1은 수소 원자, 인산기, 지방산기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 탄소수 1~4의 알킬기, 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기(糖殘基)를 나타내며, R2는 페닐기, 메틸페닐기, 디메틸페닐기, 에틸페닐기, 벤질기, 메틸벤질기, 디메틸벤질기, 에틸벤질기, 페네틸기, 메틸페네틸기, 디메틸페네틸기, 또는 에틸페네틸기를 나타낸다.]
이 부테놀리드 화합물은 PPARγ 리간드 활성을 가지며, PPARγ를 활성화시키는 작용을 가지고 있다. 또한, 이 부테놀리드 화합물은 백색 지방 세포를 갈색 지방 세포화 하고, 지질 대사를 활성화시키는 작용을 특히 가지고 있다. 게다가, 이 부테놀리드 화합물은 당뇨병, 인슐린 저항성, 고지혈증, 고혈압, 동맥 경화, 내장 지방형 비만, 피하 지방 축적, 체중 증가, 렙틴 저항성, 지방간 또는 생활 습관병 등의 PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환의 예방, 개선 또는 치료 등에 효과적이다.
또한, 본 발명의 PPARγ 활성화제는 전술한 식(1)에 있어서, R1이 수소 원자, 인산기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기이고, R2가 페닐기, 4-메틸페닐기, 벤질기 또는 4-메틸벤질기인 것이 바람직하다. 이에 따라, 수용성의 성질을 가지며, PPARγ 활성화제로서 적합한 부테놀리드 화합물이 선택된다.
또한, 본 발명의 의약은 당뇨병, 인슐린 저항성, 비만증, 체중 증가, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 렙틴 저항성, 지질 대사 이상, 고지혈증, 동맥 경화 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질병 예방 혹은 치료를 위한 의약으로서, 상술한 PPARγ 활성화제를 함유한다. 이에 따라, 상술한 부테놀리드 화합물로 이루어진 PPARγ 활성화제의 바람직한 용도가 선택된다.
또한, 본 발명의 보조제는 당뇨병, 인슐린 저항성, 비만증, 체중 증가, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 렙틴 저항성, 지질 대사 이상, 고지혈증, 동맥 경화 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질병의 예방 혹은 개선을 위한 보조제이며, 상술한 PPARγ 활성화제를 포함하고 있다. 이에 따라, 상술한 부테놀리드 화합물로 이루어진 PPARγ 활성화제의 바람직한 용도가 선택된다.
또한, 본 발명의 PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환의 치료, 예방, 억제 또는 개선용 조성물은, 식(2)로 표현되는 부테놀리드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유한다.
[식 2]
Figure pct00002
…(2)
[식(2) 중, R1은 수소 원자, 인산기, 지방산기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 탄소수 1~4의 알킬기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기를 나타내며, R2는 페닐기, 메틸페닐기, 디메틸페닐기, 에틸페닐기, 벤질기, 메틸벤질기, 디메틸벤질기, 에틸벤질기, 페네틸기, 메틸페네틸기, 디메틸페네틸기 또는 에틸페네틸기를 나타낸다.]
PPARγ는 주로 당·지질 대사에 관여하는 인자이며, 대사 증후군, 대사성 질환, 체중 증가, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 비만, 당뇨병, 인슐린 저항성, 고혈압, 동맥 경화, 고지혈증, 염증성 질환 및 악성 종양 등의 증식성 질환에 관여하고 있다. 상술한 부테놀리드 화합물은 PPARγ 리간드 활성을 가지며, PPARγ를 활성화시키는 작용을 가지고 있기 때문에, PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환의 예방, 개선, 억제 또는 치료에 효과적으로 사용된다.
또한, PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환으로는 당뇨병, 인슐린 저항성, 비만증, 체중 증가, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 렙틴 저항성, 지질 대사 이상, 고지혈증, 동맥 경화 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병태, 증상 또는 질환인 것이 바람직하다. 이에 따라, 상술한 부테놀리드 화합물의 특히 바람직한 용도가 선택된다. 이 부테놀리드 화합물은 백색 지방 세포를 갈색 지방 세포화 시키고, 지질을 이용한 열 생성을 촉진시키며, 지질 대사를 활성화시키는 작용을 갖는 것 외에, 체중 증가 억제 작용, 내장 지방 축적 억제 작용, 피하 지방 축적 억제 작용, 아디포넥틴 증강 작용, 인슐린 분비 억제 작용 및 렙틴 분비 억제 작용 등을 가지고 있다. 그러므로 이러한 PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환을 치료, 예방, 억제 또는 개선하는 것이 가능하다.
본 발명에 따르면, 높은 PPARγ 활성화 작용을 가진 부테놀리드 화합물이 얻어진다. 이 부테놀리드 화합물은 백색 지방 세포를 갈색 지방 세포화 시키며 지질 대사를 활성화하는 작용을 갖는 것 외에 체중 증가 억제 작용, 내장 지방 축적 억제 작용, 아디포넥틴 증강 작용, 인슐린 분비 억제 작용 및 렙틴 분비 억제 작용 등을 가지고 있다. 그러므로 인슐린 저항성, 당뇨병, 체중 증가, 비만증, 고지혈증, 고혈압, 동맥 경화, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 지방간 또는 대사 증후군 등의 PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환을 치료, 예방, 억제 또는 개선하기 위하여 사용하는 것이 가능하다. 이와 같이, 상술한 바와 같은 병태 등의 예방 또는 개선에 도움이 되고, 식품이나 보조제, 약제 등에 널리 응용 가능한 부테놀리드 화합물이 얻어진다.
도 1은 본 발명의 PPARγ 활성화제의 유효 성분인 부테놀리드 화합물을 향초로부터 제조하는 방법을 개략적으로 설명하는 흐름도이다.
도 2는 실시예1에 있어서, 향초로부터 순상 칼럼 분획물을 조정하는 방법을 개략적으로 설명하는 흐름도이다.
도 3은 실시예1에 있어서, 순상 칼럼 분획물의 PPARγ 리간드 활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 실시예2에 있어서, 역상 칼럼 분획물을 조정하는 방법을 개략적으로 설명하는 흐름도이다.
도 5는 실시예2에서 얻은 역상 칼럼 분획물(Fr.1~5)과 실시예1에서 얻은 순상 칼럼 분획물(분획 전 Fr.1)의 HPLC 분석 결과를 나타내는 크로마토그램이다. 가로축은 유지 시간(분)을 나타낸다.
도 6은 실시예2에 있어서, 역상 칼럼 분획물의 PPARγ 리간드 활성을 나타내는 그래프이다.
도 7은 실시예3에 있어서, 피크 분획물의 PPARγ 리간드 활성을 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예3에서 얻은 피크 분획물 중, 피크5의 HPLC 분석의 결과를 나타내는 크로마토그램이다. 세로축은 검출 강도를, 가로축은 유지 시간(분)을 나타낸다.
도 9는 실시예3에 있어서, 피크5의 분획물 및 실시예2에서 얻은 역상 칼럼 분획물의 프랙션5의 PPARγ 리간드 활성을 나타내는 그래프이다.
도 10은 실시예4에 있어서, 피크5의 분획물의 LC/MS의 결과를 나타내는 차트이다. 세로축은 검출 강도를, 가로축은 m/z 값을 나타낸다.
도 11은 실시예5에 있어서, UCP-1 유전자의 발현량의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 12는 실시예7에 있어서, 5-히드록시-4-페닐부테놀리드 합성품의 PPARγ 리간드 활성을 나타내는 그래프이다.
도 13은 실시예8에 있어서, 부테놀리드 화합물의 PPARγ 리간드 활성을 나타내는 그래프이다.
도 14는 실시예9에 있어서, 5-히드록시-4-페닐부테놀리드 투여에 따른 쥐의 체중 증가 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 15는 실시예10에 있어서, 쥐 혈액 중에 포함된 아디포넥틴의 양을 나타내는 그래프이다.
도 16은 실시예11에 있어서, 쥐 혈액 중에 포함된 인슐린의 양을 나타내는 그래프이다.
도 17은 실시예12에 있어서, 쥐 혈액 중에 포함된 렙틴의 양을 나타내는 그래프이다.
도 18은 실시예13에 있어서, 5-히드록시-4-페닐부테놀리드 투여에 따른 쥐의 피하 지방 및 내장 지방의 축적 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명의 PPARγ 활성화제에는 유효 성분으로 상술한 식(1)로 표현되는 부테놀리드 화합물이 포함된다. 이 식(1) 중, R1으로 표시되는 원자로는 수소 원자가 바람직하고, 분자로는 인산기, 지방산기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 탄소수 1~4의 알킬기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기를 들 수 있다. 지방산기로는, 라우르산, 미리스틴산, 팔미틴산, 마르가르산 또는 스테아린산 등을 들 수 있다. 탄소수 1~4의 알킬기로는 메틸기, 에틸기, 각종 프로필기 또는 각종 부틸기를 들 수 있다. 또한 인산기, 당잔기에 의한 배당체는 체외에서의 안정성 및 체내에서의 흡수성 관점에서 바람직하고, 당으로는 특별히 한정되지 않지만, 각종 글루코스, 각종 갈락토스 또는 각종 만노오스 등이 사용되며, 특히 글루코스가 바람직한 배당체를 형성하는 당으로 사용된다.
또한 R2는 페닐기, 메틸페닐기, 디메틸페닐기, 에틸페닐기, 벤질기, 메틸벤질기, 디메틸벤질기, 에틸벤질기, 페네틸기, 메틸페네틸기, 디메틸페네틸기 또는 에틸페네틸기가 바람직하며, 특히, 작용 효과의 관점에서 페닐기, 4-메틸페닐기, 벤질기 또는 4-메틸벤질기가 바람직하게 사용된다.
이 식(1)로 표현되는 화합물 중, 특히 약리 활성의 점에서 바람직한 화합물로는 다음 식(3)에 나타낸 5-히드록시-4-페닐부테놀리드나 다음 식(4)에 나타낸 5-히드록시-4-(4-메틸페닐)부테놀리드 외에 5-히드록시-4-(4-메틸벤질)부테놀리드나 5-히드록시-4-벤질부테놀리드를 들 수 있으며, 후술하는 바와 같이, PPARγ 활성화제로 향초 중에서 발견된 5-히드록시-4-페닐부테놀리드 또는 5-히드록시-4-(4-메틸페닐)부테놀리드가 특히 바람직하다.
[식 3]
Figure pct00003
…(3)
[식 4]
Figure pct00004
…(4)
식(3)에 나타낸 부테놀리드 화합물, 즉 5-히드록시-4-페닐부테놀리드는 발효 식품인 향초에서 추출하여 얻는 것이 가능하다. 향초에서 이 부테놀리드 화합물을 얻는 방법으로는 특별히 한정되지 않지만, 일 예로서, 도 1의 흐름도에 나타낸 바와 같이, 향초(를 준비하는 공정)(S0)와, 향초에 포함되어 있는 지질 성분을 제거하는 탈지 처리 공정(S1)과, 용매를 이용하여 목적의 성분을 추출하는 용매 추출 처리 공정(S2)과, 순상 크로마토그래피에 의한 분획 공정(S3)과, 역상 크로마토그래피에 의한 분획 공정(S4)으로 개략 구성된다.
이 향초(S0)는 찹쌀의 누룩을 첨가하여 알코올 발효시키고, 왕겨를 첨가하여 초산 발효시키며, 물을 첨가하여 추출하고, 그 추출액을 일정 기간 숙성시킨 것이다.
도 1에 도시한 탈지 처리(S1)는 향초(S0)에 포함되어 있는 여분의 지질 성분을 제거할 목적으로 행해진다. 향초(S0)의 탈지 처리를 행하는 것에 의해, 향초에 포함되어 있는 여분의 지질 성분이 제거되기 때문에, 후에 행해지는 용매 추출 처리(S2)나 분획 공정(S3) 및(S4)에 있어서, 식(3)으로 표현되는 부테놀리드 화합물을 유효하게 추출하는 것이 가능하게 된다. 구체적으로는 특별히 한정되지 않지만, 향초(S0)에 유기 용매를 가하여 잘 교반하고, 유기 용매 상에 여분의 지질 성분을 이동시킨 후, 원심 분리기 등을 이용하여 수상(水相)과 유기 용매상으로 분리하고, 수상을 회수함으로써 행해지는 것이 가능하다. 이 조작은 여러 번 행해지는 것이 바람직하다. 유기 용매로는 탈지 효과를 가진 것이면 좋고, 예를 들어, 석유계 유기 용매나 알코올류 등이 적절하게 사용되며, 특히 n-헥산이 바람직하게 사용된다. 사용한 유기 용매의 양으로는 향초의 10 중량%에서 1000 중량% 정도가 바람직하고, 향초 양의 절반에서 2배 정도가 가장 바람직하다.
다음으로, 도 1에 도시한 용매 추출 처리(S2)에서는 탈지 처리한 향초에 용매를 가하고, 가한 용매에 목적으로 된 부테놀리드 화합물을 이동시키는 것이 행해진다. 사용되는 용매로는 유기 용매가 바람직하게 사용되며, 특별히 한정되지 않지만, n-부탄올 또는 에탄올 등의 알칸올, 초산 에틸, 부틸렌 글리콜 및 클로로포름 등을 사용하는 것이 가능하다. 이러한 용매 추출 처리(S2)는 단일의 처리에 한정되지 않고, 동일한 용매로의 추출 처리를 여러 번 행하거나, 여러 종류의 용매 추출 처리를 조합시켜 행하는 것도 가능하다.
상술한 용매 추출 처리(S2)의 일 예로서, 유기 용매로 클로로포름을 사용한 경우의 추출 처리에 대하여 설명한다. 이 클로로포름 추출 처리에서는, 탈지한 향초에 클로로포름을 가하고, 클로로포름상에 목적 성분인 부테놀리드 화합물을 효율 좋게 이동시키는 것이 행해진다. 구체적으로는, 예를 들어 향초와 클로로포름을 분액 깔때기를 사용하여 분배하고, 클로로포름상을 회수함으로써 행해진다. 이 경우, 분배는 여러 번 행해지는 것이 바람직하다. 클로로포름의 첨가량으로는 수상(향초)의 10 중량%에서 1000 중량% 정도가 바람직하고, 수상의 양의 절반에서 2배 정도가 가장 바람직하다. 회수된 클로로포름상은, 감압 농축 처리 등에 의해 용매를 쉽게 제거하는 것이 가능하며, 고체 또는 농축된 향초의 클로로포름 추출물을 얻는 것이 가능하다.
다음으로, 도 1에 도시한 순상 크로마토그래피에 의한 분획 공정(S3)에 대하여 설명한다. 이 분획 공정(S3)에서는 공정(S2)에서 얻어진 용매 추출물에 포함되어 있는 목적 성분의 부테놀리드 화합물을 정제 분리하는 것을 목적으로 하고 있다. 일 예로서, 순상 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획 처리에 대하여 설명한다. 구체적으로는, 특별히 한정되지 않지만, 실리카겔이 충진된 크로마토관 위에 용매 추출물을 흡착시킨 실리카겔을 얹고, 그 위로부터 소정의 이동상(移動相)을 흘려 용출시킴으로써 행해진다. 이동상으로는 특별히 한정되지 않지만, 벤젠-아세톤이 바람직하게 사용되며, 예를 들면, 벤젠:아세톤의 비율을 40:1에서 0:1까지의 구배로 한 이동상으로 용출함으로써 적절하게 분리하는 것이 가능하다. 얻어진 분획물 중 어느 분획물에 목적 물질이 포함되어 있는지를 확인함에 있어서는, 후술하는 PPARγ 활성화 시험이나, PPARγ가 관여하는 유전자(UCP-1 유전자 등)의 발현량을 측정하는 시험 등을 행하는 것이 가능하다.
다음으로, 도 1에 도시한 역상 크로마토그래피에 의한 분획 공정(S4)에 대해서 설명한다. 이 분획 공정(S4)에서는, 공정(S3)에서 얻은 순상 칼럼 분획물에 포함되어 있는 목적 성분의 부테놀리드 화합물을 더 정제 분리하고, 간략히 분리하는 것을 목적으로 하고 있다. 일 예로서, 역상 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의한 분획 처리에 대해서 설명한다. 구체적으로는 특별히 한정되지 않지만, 옥타데실시릴기(C18)에 수식된 실리카겔을 칼럼에 충진하고, 공정(S3)에서 얻은 분획물을 칼럼에 첨가한 후, 소정의 이동상을 흘려 용출시킴으로써 행해진다. 이동상으로는 특별히 한정되지 않지만, 메탄올-물이 바람직하게 사용되며, 예를 들면, 메탄올:물 비율을 1:9에서 1:0까지의 구배로 한 이동상으로 용출함으로써, 적절하게 분리하는 것이 가능하다. 얻어진 분획물 중, 어느 분획물에 목적 물질의 부테놀리드 화합물이 포함되어 있는지를 확인함에 있어서는, 후술하는 PPARγ 활성화 시험이나 PPARγ가 관여하는 유전자(UCP-1 유전자 등)의 발현량 측정 시험 등을 행하는 것이 가능하다. 또한, 얻어진 분획물에 대하여 HPLC 분석을 행하고, 크로마토그램을 확인하여 단일 피크를 얻을 수 있는지를 확인함으로써 부테놀리드 화합물을 분리 가능한지 여부의 확인을 행하는 것이 가능하다.
게다가, 상술한 분획 처리(S3)(S4)는, 단일 처리에 한정되지 않고, 동일한 충진재 또는 다른 충진재에 의한 분획 처리를 여러 번 행하거나, 동일한 이동상 또는 다른 이동상에 의한 분획 처리를 조합시켜 행하는 것도 가능하다.
또한, 식(3)으로 표현된 부테놀리드 화합물은, 향초에서 추출 분리하여 얻는 방법 외에, 공지의 합성 방법으로 제조하는 것도 가능하다. 예를 들어, 페닐아세트알데히드와 글리옥실산에스테르를 알돌 축합시켜 3-페닐-4-옥소-2-히드록시-부탄산에스테르를 얻은 후, 물의 존재 하에서 산을 작용시키는 것(일본 공개특허 평06-211825호 공보), 페닐아세트알데히드와 글리옥실산에스테르를 모르폴린염산염 존재 하에서 반응시키는 것(일본 공개특허 평11-152280호 공보) 등에 의해 본 발명의 부테놀리드 화합물을 제조하는 것이 가능하다. 마찬가지로 식(4) 및 식(1)로 표현되는 기타 부테놀리드 화합물에 대해서도, 공지의 합성 방법(J. Org. Chem. 1981년, 제46권, pp.4889~4894 및 Tetrahedron Letters, 2013년, 제54권, pp.5322~5324 등 참조)으로 제조하는 것이 가능하다.
상술한 부테놀리드 화합물의 약리학적으로 허용되는 염으로는, 산 또는 염기로 형성되는 염이면 좋고, 특별히 한정되지 않는다. 또한, 이 부테놀리드 화합물 또는 그의 염은 수화물이나 알코올 등의 유기 용매화물 등 이어도 좋고, 무수물이어도 좋다. 또한, 각종 이성체나 라세미체, 또는 이들의 혼합물 등도 포함된다. 게다가, 이 부테놀리드 화합물 또는 그의 염은 분자 구조 중에 포함되는 관능기가 수식되는 등으로 하여 생체의 대사 작용에 의한 효과를 나타내게 되는 프로드러그이어도 좋다.
식(1)로 표현되는 부테놀리드 화합물은 PPARγ를 활성화시키는 작용을 가진다. 또한, 본 발명에 있어서, PPARγ 활성화제로는 PPARγ에 결합하는 등으로 PPARγ를 활성화시켜 표적 유전자의 발현을 조절 가능한 물질을 말한다. PPARγ의 표적 유전자로는 예를 들어, 아디포넥틴, UCP-1, 지방산 결합 단백질 또는 aP2 등을 들 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 PPARγ 리간드 활성과 PPARγ 아고니스트 활성은 같은 의미이다.
본 발명의 PPARγ 활성화제는 PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환의 치료, 예방, 억제 또는 개선에 사용되는 것이 가능하다. 여기에서의 치료나 병태의 개선에는 이러한 질환이나 병태에 대한 예방이나 예후의 조치도 포함된다. PPARγ가 관여하는 질병에는, 지방 세포의 분화나 대사에 관여하는 것이 널리 포함되며, 특히 인슐린 저항성, 당뇨병, 고지혈, 고혈압, 내장 지방형 비만, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 지방간, 체중 증가, 비만, 렙틴 저항성, 동맥 경화, 염증 질환, 악성 종양 혹은 대사 증후군 또는 이에 관련한 질환이 포함된다. 본 발명의 PPARγ 활성화제는 이러한 질환의 하나 또는 복수에 대한 치료나 개선, 증상이나 병태의 억제나 예방 등에 사용된다.
또한, 본 발명의 부테놀리드 화합물은 지방을 축적시키는 백색 지방 세포를 지방을 연소시키는 갈색 지방 세포로 변환시키는 작용을 가지고 있기 때문에, 지질 대사 활성화제로서 사용하는 것이 가능하다. 또한, 지질 대사 활성화제로서의 작용 기서(機序)는 상술한 백색 지방 세포를 갈색 지방 세포화 시키는 것으로만 한정되지 않고, 본 발명의 화합물이 PPARγ 활성화 작용을 가지며, PPARγ의 표적 유전자의 전사가 항진하는 것도 관계한다.
게다가, 식(1)로 표현되는 부테놀리드 화합물은 PPARγ 활성화 작용을 가지기 때문에, 항당뇨병제, 인슐린 저항성 치료제, 항비만증제, 체중 증가 억제제, 내장 지방 축적 억제제, 피하 지방 축적 억제제, 렙틴 저항성 치료제, 지질 대사 이상 치료제, 항고지혈증제, 동맥 경화 치료제 및 대사 증후군 억제제로 사용되는 것이 가능하다.
본 발명의 PPARγ 활성화제 등은 상술한 식(1)로 표현되는 부테놀리드 화합물을 유효 성분으로 포함하는 것으로, 인간 또는 동물을 위한 의약품, 의약외품 및 식품으로 사용하는 것이 가능하다. 식품으로는 보조제, 건강 식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품 등도 포함된다.
본 발명의 PPARγ 활성화제 등을 의약품 또는 의약외품으로 사용하는 경우에는, 종래 관용되고 있는 방법에 따라 다양한 형태로 제조하는 것이 가능하다. 이 경우, 통상 제제용의 약리학적으로 허용되는 담체나 부형제, 활택제, 분산제, 붕해 제, 완충제, 용제, 증량제, 보존제, 향료 또는 안정화제 등 의약품의 첨가제로 허용되고 있는 첨가제를 사용하여 제제화 하는 것이 가능하다. 게다가, 이 부테놀리드 화합물의 생물학적 이용 가능성이나 안정성을 향상시키기 위하여, 마이크로 캡슐, 리포좀 제제, 미분말화 또는 시클로덱스트린 등을 이용한 포접화 등의 제제 기술을 포함한 약물수송계를 이용하는 것도 가능하다.
본 발명의 PPARγ 활성화제 등을 경구 투여 제제로서 이용하는 경우에는, 정제, 과립제, 캡슐제 또는 내복용 액제 등의 형태로 사용하는 것도 가능하지만, 소화관에서의 흡수에 적합한 형태로 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 유통성, 보존성 등의 이유에 따라 소망되는 형태로 제제를 제공하는 경우에도 종래의 제제 기술을 사용하는 것이 가능하다. 또한, 외용제 등의 비경구 투여제로서 이용하는 경우에는 주사제, 좌제 및 테이프제, 파프제 등의 경피 흡수제 등의 형태로 하는 것이 가능하다. 또한, 유통성이나 보존성 등의 이유로 고형 제제를 사용 시에 적당한 용제에서 용해하여 사용하는 것도 가능하며, 액제 및 반고형제의 형태로 제공하는 것도 종래의 제제 기술에 의해 가능하다.
또한, 본 발명의 PPARγ 활성화제 등을 식품으로 이용하는 경우에는, 정제나 캡슐제, 과립제, 시럽제 등의 보조제 형태, 스프, 죽, 음료, 면류, 젤리, 시리얼, 빵, 유제품, 조미료, 식용유, 과자 등의 형태를 들 수 있다. 또한 동물용 식품(사료, 팻 푸드; 건식형, 습식형, 동물용 보조제, 동물용 음료 등)으로 이용하는 것도 가능하다. 식품으로 이용하는 경우에는, 향초에서 유래하는 엑기스 등의 성분이나 비타민, 미네랄 혹은 아미노산 등의 영양소 등을 다양한 첨가하는 것도 가능하다.
본 발명의 PPARγ 활성화제 등의 투여량 또는 유효 섭취량은, 목표로 하는 치료 효과, 투여 방법, 투여 대상 및 제형에 따라 변화하기 때문에, 특별히 한정되지 않지만, 하루의 경구 투여량으로는 유효 성분으로 약 0.01μg/60kg체중~약 300mg/60kg체중이며, 바람직하게는 0.05μg/60kg체중~약 100mg/60kg체중이고, 이를 1~3회 분할하여 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 하루의 비경구적인 투여량으로는 유효 성분으로 약 0.01μg/60kg체중~100mg/60kg체중이고, 바람직하게는 약 0.03μg/60kg체중~50mg/60kg체중이 바람직하다.
다음으로, 본 발명을 실시예에 따라 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이러한 실시예에 의해 아무런 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
이하의 실시예에 있어서 PPAR 활성화 시험의 측정 방법은 다음과 같다.
(1) PPARγ 활성화 시험
(1-1) 준비
인간 유래의 PPARγ 리간드 결합 도메인과 효모 유래의 GAL4 전사 인자의 DNA 결합 도메인으로 이루어진 키메라 단백질을 발현하는 플라스미드의 pM-PPARγ와, 이 키메라 단백질에 의해 발현이 제어되도록 디자인된 GAL4 응답 배열의 하류에 바다 반딧불 유래의 루시페라아제 구조 유전자를 연결한 플라스미드의 p4×UASg-tk-luc을 준비하였다. 또한, 트랜스펙션 효율 보정용 플라스미드로서 세포 내에서 항상 발현하는 바이러스성 발현 프로모터를 가진 바다 표고버섯 유래의 루시페라아제 발현 플라스미드의 pRL-CMV를 준비하였다. 한편, CV-1 세포(아프리카 녹색 원숭이 신장 유래)의 배지로서 10% FBS/DMEM을 이용하여 100mm 샤알레에 CV-1 세포를 4.5×105cells가 되도록 뿌리고, 37℃, 5% CO2 환경 하에서 인큐베이터에서 배양을 행하였다.
(1-2) CV-1 세포의 형질 전환
24시간 배양 후의 CV-1 세포에 2.0μg의 pM-PPARγ, 4.0μg의 p4×UASg-tk-luc 및 0.04μg의 pRL-CMV를 코트랜스펙트하여, CV-1 세포 형질 전환을 실시했다. 형질 전환은 리포좀 법으로 행하고, LipofectAMINE(등록 상표) Reagent(인비트로젠사 제품)를 사용하였다. 형질 전환 조작 후, 37℃, 5% CO2 환경 하에서 3.5시간 배양을 행하였다.
(1-3) 피검 시료의 첨가
배양 후, 트립신 처리에 의해 CV-1 세포를 회수하여 96 well 플레이트에 1×105cells/mL의 농도가 되도록 50mL 파종했다. 피검 시료를 4% FBS/DMEM으로 희석하여 최종 농도의 2배의 농도가 되도록 조정하고, 상술한 96 well 플레이트에 50mL 첨가하였다. 또한, 컨트롤 물질로는 DMSO를 사용 하였다. 피검 시료 및 컨트롤 물질(DMSO)을 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 환경 하에서 24시간 동안 배양을 행하였다.
(1-4) 루시페라아제 활성의 측정
루시페라아제 활성의 측정은 Dual-Luciferase(등록 상표) Reporter Assay System(프로메가사 제품)을 이용하여 행하였다. 96 well 플레이트에서 배양액을 제거하고, 세포를 PBS(-)로 세척하고, 페이퍼 타월로 수분을 제거 하였다. 세포 용해 액(Passive Lysis Buffer)을 30mL 가하고, 96 well 플레이트를 15분 흔들었다. 세포 추출액을 10mL 씩 96well 루미노 플레이트로 옮겼다. 발광 기질액 70mL를 첨가하고, 측정 시간 10초의 설정으로 루시페라아제에 의한 발광 강도를 루미노미터(Micro Lumat Plus, 베르톨드 재팬사 제품)를 이용하여 측정 하였다.
피검 시료의 PPARγ 활성화 작용은 컨트롤에 대한 비율(%)로 평가 하였다. 트랜스펙션 효율을 보정하기 위하여, 측정한 바다 반딧불·루시페라아제 활성치(A)를 측정한 바다 표고버섯·루시페라아제 활성치(B)로 나눈 값(A/B)를 구하였다. 컨트롤군의 A/B값의 평균치를 산출하고, 이 평균치를 100으로 하였다. 피검 시료의 A/B 값을 산출하고, 컨트롤의 평균치에 대한 비율(%)을 피검 시료의 PPARγ 활성화능으로 하였다.
[실시예1 순상 칼럼 분획물의 조정 및 활성 측정]
도 2에 도시한 분획 흐름에 따라, 향초로부터 7개의 순상 칼럼 분획물을 조정 하였다. 이하, 분획 흐름의 각 처리에 대하여 상술한다.
(1) 헥산 탈지 처리
향초(제품명; 8년 숙성 항순 향초, 일본 항순주식회사 제품) 1L에 대하여, 같은 양의 n-헥산을 가하여 잘 교반 한 후, 5000rpm에서 10분간 원심 분리를 행하고, 수층을 회수 하였다. 이 분배 조작을 3회 행하고, 향초에 포함된 여분의 지질 성분을 제거 하였다.
(2) 클로로포름 추출 처리
다음으로 회수한 수층에 같은 양의 클로로포름을 가하고, 분액 로트를 이용하여 3회 분배 조작을 행하여 클로로포름층을 회수 하였다. 회수한 클로로포름층의 감압하 농축을 행하여 용매를 제거하고, 3970mg의 클로로포름 추출물을 얻었다.
(3) 순상 실리카겔 처리
클로로포름 추출에 의해 얻은 추출물 3970mg을 소량의 아세톤에 녹이고, 130g의 실리카겔(실리카겔 60, 0.040~0.063mm 칼럼 크로마토그래피용; 메일크미리포아사 제품)에 흡착시켰다. 다음으로, 유리 크로마토관(크로마토관의 길이 60cm, 직경 2.7cm, 용량 343mL)에 실리카겔을 130g 충진하고, 그 위에 향초의 클로로포름 추출물을 흡착시킨 실리카겔을 올렸다. 벤젠:아세톤 = 20:1, 10:1, 5:1, 3:1, 2:1, 1:1 및 아세톤 100%의 용매 순으로 550mL 씩 각 용매를 흘리고, 용매마다 용출한 분획물을 나누고, 순상 칼럼 분획물(프랙션1~7)로 회수 하였다. 회수한 분획물을 각각 감압 하 농축하여 용매를 제거하고, 얻은 분획물의 고형 중량을 측정 하였다. PPARγ 리간드 활성 측정에 있어서 최종 농도의 1000배 이상의 농도가 되도록, 얻은 분획물의 일부를 적당량의 디메틸설폭시드(DMSO, 나카라이 테스쿠 주식회사 제품)에 용해시켰다.
(4) 순상 칼럼 분획물의 활성 측정
실시예1에서 얻은 7개의 순상 칼럼 분획물을 피검 시료로서 PPARγ 활성화 시험을 행하여 각 분획물의 PPARγ 리간드 활성을 평가 하였다. 각 분획물의 최종 농도는 100μg/mL 및 50μg/mL로 하였다. 각 분획물의 PPARγ 리간드 활성화를 도 3에 도시하였다. 이러한 도의 세로축은 컨트롤 물질(DMSO)의 활성에 대한 분획물의 활성 비율이다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 프랙션1의 분획물(용출 용매가 벤젠:아세톤 = 20:1)에 대해서, 농도 의존적인 PPARγ 리간드 활성이 확인되었다.
[실시예2 역상 칼럼 분획물의 조정 및 활성 측정]
(1) 역상 ODS 칼럼 처리
도 4의 분획 흐름에서 나타낸 바와 같이, 실시예1에서 얻은 PPARγ 활성화 작용이 인정되는 프랙션1의 순상 칼럼 분획물에 대해서, 추가로 역상 크로마토그래피를 행하여 5개의 역상 칼럼 분획물을 조정 하였다. 역상 크로마토그래피는 다음과 같이 행하였다. 유리 크로마토관(크로마토관의 길이 40cm, 직경 2.2cm, 용량 152mL)에 충진재로서 ODS 실리카겔(YMC*GEL ODS-A 6nm S-150μm; 와이엠씨사 제품) 50g을 메탄올에 현탁시켜 충진 하였다. 탈기한 메탄올 100%를 기포가 생기지 않도록 이 충진재에 100mL 흘려 넣었다. 다음으로 충진재의 10배량(760mL)의 탈기한 메탄올 10% 수용액으로 충진재를 평형화 하였다. 실시예1에서 얻은 프랙션1의 분획물 117mg을 메탄올에 녹이고, 그 용액을 충진재의 위에 첨가 하였다. 그리고 메탄올 농도가 10%, 20%, 30%, 40% 및 100%의 탈기한 메탄올 수용액을 이 농도의 순서로 충진재 위에서 180mL 씩 흘리고, 용매마다 용출한 분획물을 나누어 역상 칼럼 분획물(프랙션1~5)로 회수 하였다. 얻어진 역상 칼럼 분획물은 감압 하 농축하여 용매를 제거하고, 얻은 분획물의 일부를 적당량의 디메틸설폭시드에 용해시켰다. 회수 한 분획물에 대해서, 고속 액체 크로마토그래피(사용 칼럼: YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm I.D. S-5μm 30nm, 이동상: 메탄올 20% 수용액-메탄올 70% 수용액, 유속: 1mL/분, 칼럼 온도: 40℃, 검출 조건 UV: 280nm)를 이용하여 분리 상황의 확인을 행하였다. 각 분획물의 HPLC의 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 가로축은 유지 시간(분)을 나타낸다.
(2) 역상 칼럼 분획물의 활성 측정
실시예2에서 얻은 역상 칼럼 분획물(프랙션1~5) 및 실시예1에서 얻은 순상 칼럼 분획물의 프랙션1을 피검 시료로 PPARγ 활성화 시험을 행하고, 각 분획물의 PPARγ 리간드 활성을 평가 하였다. 각 분획물의 최종 농도는 100μg/mL로 하였다. 또한, PPARγ 아고니스트인 트로글리타존(Tro)에 대해서도 PPARγ 활성화 시험을 행하였다. 트로글리타존의 최종 농도는 1μM로 하였다. PPARγ 리간드 활성을 도 6에 나타내었다. 이 도의 세로축은 컨트롤 물질(DMSO)의 활성에 대한 분획물의 활성의 비율이다. 도 6에 도시한 바와 같이, 역상 칼럼 분획물의 프랙션4(용출 용매가 물:메탄올 = 60:40) 및 프랙션5(용출 용매가 메탄올 100%)에 대해서, PPARγ 리간드 활성이 확인되었다.
[실시예3 피크 분획물의 조정 및 활성 측정]
(1) 고속 액체 크로마토그래피에 의한 분획
도 5에 도시한 역상 칼럼 분획물의 HPLC 크로마토그램을 보면, PPARγ 활성화 작용이 인정되는 프랙션4 및 5는 여러 특이적인 피크가 확인된다. 그래서, 프랙션4 및 5에 대해서 특이적인 피크를 나타내는 물질의 분획을 행하여 활성 물질을 정제하는 것을 시도했다. 분획은 역상 고속 액체 크로마토그래피(사용 칼럼: YMC-Pack ODS-A 250×4.6mm I.D. S-5μm 30nm, 이동상: 메탄올 20% 수용액-메탄올 70% 수용액, 유속: 1mL/분, 칼럼 온도: 40℃, 검출 조건 UV: 280nm)를 이용하여 행하였다.
(2) 피크 분획물의 활성 측정
실시예3에서 얻은 피크 분획물 및 트로글리타존(Tro)을 피검 시료로 PPARγ 활성화 시험을 행하여 각 분획물의 PPARγ 리간드 활성을 평가 하였다. 각 분획물의 최종 농도는 100μg/mL, 트로글리타존의 최종 농도는 1μM로 하였다. 결과를 도 7에 나타내었다. 도 7에 도시한 바와 같이, 프랙션4의 피크5의 분획물에서 명확한 PPARγ 리간드 활성이 확인되었다. 또한, 이 피크5의 분획물을 HPLC 분석한 결과, 싱글 피크로 검출되어(도 8 참조) 단일 성분으로 분리 가능한 것으로 나타났다.
게다가, 실시예3에서 얻은 피크5의 분획물, 실시예2에서 얻은 역상 칼럼 분획물의 프랙션5 및 트로글리타존 대해서, PPARγ 활성화 시험을 행하여 각 분획물의 PPARγ 리간드 활성화를 평가 하였다. 피크5의 분획물의 최종 농도는 저농도; 50μg/mL 및 고농도; 100μg/mL로 하고, 역상 칼럼 분획물의 프랙션5의 최종 농도는 25μg/mL 및 50μg/mL, 트로글리타존 최종 농도는 10μM로 하였다. 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에 도시한 바와 같이, 피크5의 분획물의 PPARγ 리간드 활성은 농도 의존적으로 상승하는 것이 확인되었다.
[실시예4 피크 분획물의 구조 결정]
실시예3에서 얻은 피크5의 분획물에 대해서 구조 해석을 행하였다. 구조 해석은 LC/MS, 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC 및 HSQC를 행하였다. LC/MS의 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10의 가로축은 m/z값을, 세로축은 검출 강도를 나타낸다. 도 10에 의해 피크5의 분획물은 분자량 176.1687, 시성식은 C10H8O3인 것이 시사되었다. 또한 1H-NMR, 13C-NMR, HMBC 및 HSQC의 결과보다 피크5에 포함되어 있는 성분은 5-히드록시-4-페닐부테놀리드(이하, "5H4PB"라 한다)인 것으로 밝혀졌다.
[실시예5 UCP-1 유전자 발현량의 측정]
미토콘드리아 탈공역형 단백질(Uncoupling Protein; UCP)은 미토콘드리아 내막에서의 산화적 인산화 반응을 탈공역 시켜, 에너지를 열로 소비하는 기능을 가지고 있다. 그 중, UCP-1은 지방 연소에 의한 열 생성을 행하는 갈색 지방 세포에 특이적으로 발현하고 있다. 최근, 특정의 PPARγ 합성 아고니스트가 지방을 저장하는 백색 지방 세포를 지방 연소시키는 갈색 지방 세포와 같이 변화시키는 것이 보고되고 있다(H. Ohno et al, Cell metabolism, 2012년, Vol.15, pp.395~404). 그래서 PPARγ 리간드 활성이 확인된 피크5의 분획물, 즉 5H4PB가 백색 지방 세포를 갈색 지방 세포화 시키는 작용을 가지고 있는지 확인하기 위하여 UCP-1 유전자의 발현량을 측정하는 시험을 행하였다.
시험은 다음과 같이 행하였다. 간엽계 세포주 10T1/2를 12 well 플레이트에 1×104cells/mL가 되도록 파종했다. 세포가 융합될 때까지 배양한 후, 피크5의 분획물(5H4PB)을 최종 농도가 100μg/mL가 되도록 첨가 하였다. 또한, 컨트롤 물질로는 DMSO를 사용 하였다. 샘플 첨가로부터 24시간 후, 세포에서 mRNA를 회수하여 mRNA양을 정량 하였다. mRNA 정량은 라이트 사이클러(등록 상표, 로슈·어플라이드·사이언스사)를 이용하여 행하였다. 결과를 도 11에 나타내었다. 도의 세로축은 컨트롤 물질(DMSO)의 UCP-1 발현량에 대한 피크5의 분획물의 UCP-1 발현량의 비율이다. 도 11에 도시한 바와 같이, 피크5의 분획물은 UCP-1의 발현 수준을 상승시키는 작용을 가진 것으로 나타났다. UCP-1의 발현량의 증가는 지질로부터의 열 생성의 항진을 나타낸다. 이 결과에 의해, 피크5 분획물, 즉 5H4PB는 UCP-1의 활성화를 매개로 하여 지질 대사의 개선, 촉진에 기여하는 것으로 나타났다.
[실시예6 5H4PB의 합성]
화학 합성에 의해 얻은 5H4PB가 향초에서 추출하여 얻은 5H4PB와 같은 PPARγ 활성화 작용을 가지는지를 확인하기 위하여 5H4PB를 합성 하였다. 합성은 다음과 같이 하여 행하였다. 글리옥실산 일수화물 100mg과 모르폴린 150mg을 1,4-디옥산 450μL에 분산시키고, 물 55μL를 한 방울씩 가하였다. 페닐아세트알데히드 140mg을 가하고 실온에서 1시간 정치한 후, 24시간 가열 환류 하였다. 생성물을 감압 농축하고, 디에틸에테르 2.5mL로 추출 하였다. 추출한 디에틸에테르층에 무수 황산 마그네슘을 가하여 탈수 건조시킨 후, 다시 감압 농축 하였다. 농축물을 아세톤/클로로포름 혼합 용액에 녹여, 재결정에 의해 5H4PB를 140mg 얻었다. 얻어진 합성 5H4PB에 대해서 액체 크로마토그래프 질량 분석(LC/MS)을 행하여, 향초에서 추출하여 얻은 5H4PB(실시예3에서 얻은 피크5의 분획물)과 동일한지를 확인 하였다.
[실시예7 합성품의 활성 측정]
실시예6에서 얻은 5H4PB 합성품을 피검 시료로 PPARγ 활성화 시험을 행하였다. 합성 5H4PB의 최종 농도는 3.5μM로 하였다. 결과를 도 12에 나타내었다. 이 도의 세로축은 컨트롤 물질(DMSO)의 활성에 대한 합성품의 활성의 비율이다. 도 12에 도시한 바와 같이, 화학 합성에 의해 얻어진 5H4PB에 대해서도 향초 유래물과 동일하게 높은 PPARγ 리간드 활성이 확인 되었다.
[실시예8 각종 부테놀리드 화합물의 합성 및 각 합성품의 활성 측정]
5H4PB를 비롯한 각종 부테놀리드 화합물을 합성하여 다양한 농도에 있어서 PPARγ 리간드 활성을 측정 하였다. 본 실시예에 있어서, 5H4PB 및 각종 부테놀리드의 합성은 다음과 같이 하여 행하였다. 우선, 상기 식(3)으로 표현되는 5H4PB에 대해서는 1L 용량의 4구 플라스크에 모르폴린 53mL(0.6mol)와 1,4-디옥산 120mL를 순차적으로 가하고, 빙욕 시키면서 50% 글리옥실산 수용액을 62mL(0.6mol, 1.5당량) 및 진한 염산 50mL를 순차적으로 떨어뜨려 가하였다. 이 혼합물을 내부 온도 87℃까지 가열하고, 페닐아세트알데히드(48% 프탈산디에틸 용액, 0.4mol)를 1,4-디옥산에서 3배 희석한 것을 천천히 떨어뜨려 이 혼합액을 밤새도록 환류 시켰다. 박층 크로마토그래피를 이용하여 환류 후의 반응액 중에 알데히드가 포함되지 않은 것을 확인하고 반응액을 실온까지 복사 냉각 하였다. 반응액을 농축하여 200mL의 아세트산에틸을 가하였다. 포화 중탄산나트륨수로 세척하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축하여 일부 오일 형상의 황색 고체 101g을 얻었다. 이 황색 고체에 200mL의 아세트산에틸을 가하여 용해시키고, 알루미나(염기성)를 첨가하여 교반하여 배치 처리 하였다. 알루미나를 여과하여 제거한 후, 여액을 농축하여 황색 고체(일부 오일) 96g을 얻었다. 이것을 0.5배 양의 아세트산에틸에 용해시켜, 1배 양의 헥산을 가하여 교반하고, 석출된 고체를 취하여 유백색 고체의 5H4PB를 30.2g(수율 40%, GC 순도 98 .6%)을 얻었다.
또한, 상기 식(4)로 표현되는 5-히드록시-4-(4-메틸페닐)부테놀리드(식(1)에 있어서 R2 : 메틸 페닐기)의 화학 합성에 대해서는 페닐아세트알데히드 대신에 4-메틸페닐아세트알데히드(48% 프탈산디에틸 용액, 0.4mol)을 이용하고, 이 알데히드의 적하 온도를 혼합물의 내부 온도 60℃로 하고, 적하 종료 후에 내부 온도 87℃까지 가열한 것 외에는 본 실시예의 5H4PB의 합성 방법(각 시약의 몰비, 반응 시간 등)과 동일하게 행하였다. 얻어진 화합물의 수율은 30%, GC 순도는 97.6%이었다.
또한, 다음 식(5)에 나타낸 5-히드록시-4-(4-메틸벤질)부테놀리드(식(1)에 있어서 R2 : 메틸벤질기)의 화학 합성에 대해서는 페닐아세트알데히드 대신에 3-(4-메틸페닐)프로피온알데하이드(48% 프탈산디에틸 용액, 0.4mol)을 이용한 것 외에는 상술한 5H4PB의 합성 방법과 동일하게 하여 혼합액을 밤새도록 환류시켜 반응시켰다. 박층 크로마토그래피를 이용하여 환류 후의 반응액 중에 알데히드가 포함되지 않은 것을 확인하고, 반응액을 실온까지 복사 냉각 하였다. 반응액을 농축하여 2배 양의 아세트산에틸을 가하였다. 이 용액을 묽은 염산과 포화 중탄산나트륨수로 세척하여 칼럼으로 구분하기 어려운 성분을 제거 하였다. 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축하여 조제 고체를 얻었다. 이 고체를 10배 양의 헥산/아세트산에틸 = 1의 혼합 용매에 용해시키고, 실리카겔(PQS100B) 3배 양으로 배치 처리 하였다. 얻어진 농축액에 헥산을 가하고, 석출된 고체를 취하여 무색 고체의 5-히드록시-4-(4-메틸벤질)부테놀리드를 수율 24%, GC 순도 99.2%로 얻었다.
[식 5]
Figure pct00005
…(5)
게다가, 다음 식(6)에 나타낸 5-히드록시-4-벤질부테놀리드(식(1)의 R2: 벤질기)의 화학 합성에 대해서는 페닐아세트알데히드 대신에 3-페닐프로피온알데히드(48% 프탈산디에틸 용액, 0.4mol)를 이용한 것 외에는 상술한 5H4PB의 합성 방법과 동일하게 하여 혼합액을 밤새도록 환류시켜서 반응시켰다. 박층 크로마토그래피를 이용하여 환류 후의 반응액 중에 알데히드가 포함되지 않은 것을 확인하고 반응액을 실온까지 복사 냉각 하였다. 반응액을 농축하여 2배 양의 아세트산에틸을 첨가 하였다. 포화 중탄산나트륨수로 세척하고, 얻어진 유기층을 황산나트륨으로 건조시키고, 여과 및 농축하여 조제 고체를 얻었다. 이 조제 고체를 실리카겔(PQS100B, 전개 용매: 헥산/아세트산에틸 = 4 → 2.3)로 정제 하였다. 얻어진 농축액에 헥산을 가하고, 석출된 고체를 취하여 무색 고체의 5-히드록시-4-벤질부테놀리드를 수율 60%, GC 순도 99.6%로 얻었다.
[식 6]
Figure pct00006
…(6)
상술한 바와 같이하여 합성한 4종의 부테놀리드 화합물, 즉 5H4PB(식(1)에 있어서 R2 : 페닐기), 5-히드록시-4-(4-메틸페닐)부테놀리드(식(1)에 있어서 R2 : 메틸페닐기), 5-히드록시-4-벤질부테놀리드(식(1)에 있어서 R2 : 벤질기) 및 5-히드록시-4-(4-메틸벤질)부테놀리드(식(1)에 있어서 R2 : 메틸벤질기)에 대해서 다음 표 1에 도시한 피검 시료 농도에서 시험을 행하였다. PPARγ 리간드 활성의 측정은 피검 시료 첨가 후의 배양 시간을 48시간으로 한 이외는, 실시예7과 동일하게 하여 행하였다. 결과를 다음 표 1 및 도 13에 나타내었다. 다음 표에 나타난 수치 및 도의 세로축은 컨트롤 물질(DMSO)의 활성에 대한 각 합성품의 활성의 비율(%)이다. 표 1 및 도 13에서는 피검 시료인 각종 부테놀리드 화합물을 식(1)에 있어서 R2의 관능기로 표시하고 있다.
피검 시료 농도(μg/mL)
0.032 0.08 0.16 0.4 0.8 2 4 10 20
식1의 R2 페닐(5H4PB) 100 80 120 120 220* 370* 520* 710* -
메틸페닐 170 110 120 180 260* 560* 710* 1270* -
벤질 120 220 110 130 170 310* 360* - -
메틸벤질 130 110 120 130 140 130 240* 340* 520*
표 1 및 도 13에 나타낸 바와 같이, 4종의 피검 시료 모두 PPARγ 리간드 활성을 가진 것으로 나타났다. 이 가운데, 표 1에 있어서 *가 붙여진 수치의 시험구는 컨트롤에 비해 2배 이상의 활성을 나타내며, p<0.05(유의차 있음) 이었다. 이 결과에 의해, 5H4PB(R2 : 페닐기) 및 5-히드록시-4-(4-메틸페닐)부테놀리드(R2 : 메틸페닐기)는 0.8~10μg/mL의 범위에서 높은 활성을 나타내고, 5-히드록시-4-벤질부테놀리드(R2 : 벤질기)는 2~4μg/mL의 범위에서 높은 활성을 나타내며, 5-히드록시-4-(4-메틸벤질)부테놀리드(R2 : 메틸벤질기)는 4~20μg/mL의 범위에서 높은 활성을 나타내는 것으로 나타났다. 이 가운데, 5H4PB 및 5-히드록시-4-(4-메틸페닐)부테놀리드는 낮은 농도 범위에 있어서 높은 활성을 가지며, 특히 5-히드록시-4-(4-메틸페닐)부테놀리드는 가장 높은 활성을 가진 것이 밝혀졌다.
[실시예9 식이성 비만 모델 쥐에 대한 항비만 작용의 검증]
실시예6에서 얻은 5H4PB를 고지방식을 먹인 쥐에 투여하여 항비만 작용을 검증 하였다. 5주령의 수컷 C57BL/6J 쥐(공급원 : 일본 찰스·리버 주식회사)를 온도가 20~26℃, 습도가 35~75%, 조명이 12시간(7:00~19:00)의 환경 조건 하에서, 1케이지 당 1마리씩 단사 하였다. 1주일 정도 순화시킨 후, 다음 표 2에 나타낸 바와 같이, 6~8마리씩 6군으로 나누었다. 시험군 중, 정상군에는 시험 기간 동안 통상 고형 사료 CRF1(오리엔탈 효모 주식회사 제품, 3.57kcal/g)을 먹이고, 컨트롤군과 약제투여군에는 시험 기간 동안 고칼로리 고형 사료 D12492(리서치 다이어트사 제품, 5.24kcal/g)을 먹였다. 사료는 자유 섭취로 하고, 음수도 급수병으로부터 자유 음수로 하였다.
번호 시험군 약제투여량 먹인 사료 개체 수
1 정상 - 통상 사료 CRF1
(3.57kcal/g)		 6
2 컨트롤 - 고지방 사료
D12492
(5.24kcal/g)		 8
3 5H4PB 0.037μg/kg/일 8
4 0.01mg/kg/일 8
5 로시글리타존
(양성대조)		 0.037μg/kg/일 6
6 10mg/kg/일 6
각 약제투여군의 쥐에 대해, 피검 물질인 5H4PB(실시예6에서 제조) 또는 양성 대조 물질인 로시글리타존(화광순약공업 주식회사 제품)을 표 2에 나타낸 소정의 투여량으로 1일 1회 12주 동안에 걸쳐 투여 하였다. 또한, 로시글리타존은 선택적 PPARγ 리간드이며, PPARγ와 결합하여 글루코스, 지방산, 인슐린의 혈중 농도를 저하시키는 작용을 가진 물질이다. 투여에 있어서는 주 1회 체중 측정하여 각 개체로의 투여량을 산출 하였다. 5H4PB 및 로시글리타존은 각각 0.5w/v% 메틸셀룰로오스 수용액에 현탁시켜, 이 수용액에서 희석하여 투여 용량이 10mL/kg이 되도록 조정한 후, 주사기 및 플렉시블 위관을 이용하여 위 내에 강제 투여 하였다. 또한, 정상군과 컨트롤군의 쥐에 대해서는 0.5w/v% 메틸셀룰로오스 수용액만을 10mL/kg의 투여 용량으로 1일 1회 12주 동안에 걸쳐 투여 하였다.
시험(투여) 개시로부터 주 1회의 빈도로 각 개체의 체중을 측정하고, 시험군 별로 평균치를 구하였다. 결과를 도 14에 나타내었다. 도의 세로축은 쥐의 체중(g)이며, 가로축은 시험 개시로부터의 일수(일)를 나타내고 있다. 도 14에 나타낸 바와 같이, 컨트롤군은 시험 개시 21일 이후, 정상군과 비교하여 체중의 의미 있는 증가가 확인 되었다. 또한, 5H4PB를 투여한 군에서는 컨트롤군에 비해 고칼로리식에 의한 체중 증가가 억제되는 것이 나타났다. 구체적으로는, 시험 종료 시점(84일째)에 있어서 고칼로리식에 의한 컨트롤군의 체중 증가량(컨트롤군의 체중으로부터 정상군의 체중을 뺀 값)에 대해 5H4PB를 0.037μg/kg/일 투여한 시험군은 체중 증가가 25.8% 억제되고, 5H4PB를 0.01mg/kg/일 투여한 시험군은 체중 증가가 27.8% 억제 되었다. 이와 같이, 5H4PB는 높은 항비만 효과가 있는 것이 확인되었다. 한편, PPARγ 리간드 활성을 가진 로시글리타존의 투여 결과에 따르면, 로시글리타존을 0.037μg/kg/일 투여한 저용량의 시험군에서는 컨트롤군보다도 체중이 증가하고, 항비만 효과는 관찰되지 않았다. 또한, 로시글리타존을 10mg/kg/일 투여한 고용량의 시험군에 대해서는 5H4PB를 0.037μg/kg/일 투여한 시험군과 비교하여도 체중 증가 억제율은 낮았다. 이에 따라, 5H4PB는 저용량 투여에 있어서도 항비만 효과를 얻는 것으로 나타났다.
[실시예10 식이성 비만 모델 쥐에 있어서 혈중 아디포넥틴의 측정]
아디포넥틴은 인슐린 저항성이나 당뇨병, 동맥 경화 등 대사 이상 증후군과 관련된 분비 단백질이다. 아디포넥틴 결손 쥐는 야생형 쥐에 비해 인슐린 저항성을 발병하기 쉽고, 동맥 경화에 걸리기 쉬운 성질을 가지고 있으며, 인간에 있어서도 아디포넥틴 농도의 저하와 당뇨병 및 동맥 경화 등 대사 이상 증후군이 관련된 것으로 알려져 있다. 따라서, 실시예9에 있어서 식이성 비만 모델 쥐에 대하여 혈중 아디포넥틴의 양을 측정하는 시험을 행하였다.
실시예9의 시험 개시로부터 85일 경과한 수컷 C57BL/6J 쥐의 각 개체에 대해서 2% 이소플루레인 마취 하에서 헤파린 첨가한 주사기를 이용하여 복부 대정맥에서 채혈을 행하였다. 채혈량은 약 0.8mL 이었다. 채취한 혈액은 원심 분리할 때까지 빙랭 하에 보존하고, 원심 분리(조건 : 4℃, 1800×g, 10분)한 후, 상층을 회수하여 혈장을 얻었다. 혈장은 샘플링 튜브로 분주하여 측정을 행할 때까지 냉동 보존 하였다. 각 개체에서 얻은 쥐 혈장 내에 포함된 쥐 아디포넥틴 농도를 시판의 ELISA 키트를 사용하여 측정하고 시험군 별로 평균치를 구하였다. 결과를 도 15에 나타내었다.
도의 세로축은 쥐 혈장 내의 아디포넥틴의 농도(ng/mL)이며, 막대그래프의 각 막대는 왼쪽으로부터 정상군, 컨트롤군, 5H4PB 0.037μg/kg/일 투여군, 5H4PB 0.01mg/kg/일 투여군, 로시글리타존 0.037μg/kg/일 투여군 및 로시글리타존 10mg/kg/일 투여군을 나타내고 있다. 이 결과에 따르면, 컨트롤군에 비하여 5H4PB를 투여한 군에서는 아디포넥틴 농도가 상승하는 것이 확인되었다. 또한, t검정의 결과 특히 0.01mg/kg/일 투여군에 있어서 의미 있는 아디포넥틴 농도의 상승이 확인되었다. 이러한 것으로부터, 5H4PB의 투여에 의해 아디포넥틴이 작용하는 인슐린 저항성이나 당뇨병, 고지혈증, 동맥 경화 등의 예방·개선 효과를 얻는 것으로 나타났다.
[실시예11 식이성 비만 모델 쥐에 있어서 혈중 인슐린의 측정]
실시예10에 있어서 각 개체로부터 얻은 쥐 혈장 내에 포함된 쥐 인슐린 량을 시판의 ELISA 키트를 사용하여 측정하여 시험군별로 평균치를 구하였다. 결과를 도 16에 나타내었다. 도의 세로축은 쥐 혈장 내의 인슐린 농도(ng/mL)이며, 막대그래프의 각 막대가 나타내는 시험군은 상술한 도 15와 동일하다. 이 결과에 따르면, 비만에 의한 고인슐린 혈증이 확인되는 컨트롤군에 비하여 5H4PB를 투여한 군에서는 특히 저용량의 군에 있어서 인슐린 농도의 상승이 억제되고 있는 것이 확인되었다. 이러한 것으로부터, 5H4PB의 투여에 의해 인슐린 저항성이나 당뇨병의 예방·개선 효과를 얻는 것으로 나타났다.
[실시예12 식이성 비만 모델 쥐에 있어서 혈중 렙틴의 측정]
렙틴은 식욕과 대사의 조절을 행하는 단백질 호르몬이지만, 비만에 의한 혈중 렙틴 농도가 상승하여 렙틴 저항성이 생기는 것으로 알려져 있다. 실시예10에 있어서 각 개체로부터 얻은 쥐 혈장 내에 포함된 쥐 렙틴 양을 시판의 ELISA 키트를 사용하여 측정하고 시험군별로 평균치를 구하였다. 결과를 도 17에 나타내었다. 도의 세로축은 쥐 혈장 내의 렙틴 농도(pg/mL)이며, 막대그래프의 각 막대가 나타내는 시험군은 상술한 도 15 및 도 16과 같다. 이 결과에 따르면, 비만에 의한 높은 렙틴 혈증이 확인되는 컨트롤군과 비교하여 5H4PB를 투여한 군에서는 용량 의존적으로 렙틴 농도의 상승이 억제되고 있는 것이 확인되었다. 이러한 것으로부터, 5H4PB의 투여에 의해 렙틴 저항성이나 비만의 예방·개선 효과를 얻는 것으로 나타났다.
[실시예13 식이성 비만 모델 쥐에 있어서 피하 지방량 및 내장 지방량의 측정]
실시예9의 시험 개시로부터 85일 경과한 수컷 C57BL/6J 쥐의 각 개체에 대해서 2% 이소플루레인 마취 하에서 채혈 후, 안락사 시켰다. 각 개체로부터 서혜부 피하 지방, 정소 주위 지방, 신장 주위 지방 및 장간막 지방을 채취하여 각 지방의 중량을 측정하고 시험군별로 평균치를 구하였다.
결과를 도 18(A)~(D)에 나타내었다. 각 도의 세로축은 측정한 각 지방 조직의 중량(g)이며, 막대그래프의 각 막대는 왼쪽에서부터 정상군, 컨트롤군, 5H4PB 0.037μg/kg/일 투여군, 5H4PB 0.01mg/kg/일 투여군, 로시글리타존 0.037μg/kg/일 투여군 및 로시글리타존 10mg/kg/일 투여군을 나타내고 있다. 도 18에 도시한 바와 같이, 이 결과에 따르면 컨트롤군과 비교하여 5H4PB를 투여한 군에서는 고칼로리식에 의한 피하 지방 및 내장 지방의 축적이 억제되는 것으로 나타났다. 구체적으로는 고칼로리식에 의한 컨트롤군의 각 지방 조직의 증가량(컨트롤군의 지방 조직 중량으로부터 정상군의 지방 조직 중량을 뺀 값)에 대하여 5H4PB를 0.037μg/kg/일 투여한 시험군에서는 서혜부 피하 지방은 약 35%, 정소 주위 지방은 약 18%, 신장 주위 지방은 약 13% 및 장간막 지방은 약 16%, 각각 지방 조직의 증가가 억제되고, 5H4PB 를 0.01mg/kg/일 투여한 시험군에서는 서혜부 피하 지방은 약 34%, 정소 주위 지방은 약 15%, 신장 주위 지방은 약 13% 및 장간막 지방량은 약 40%, 각각 지방 조직의 증가가 억제되었다. 이와 같이, 5H4PB는 저용량의 투여에 있어서 피하 지방 및 내장 지방의 축적 억제 효과가 있는 것을 확인하였다. 또한, PPARγ 리간드 활성을 가진 로시글리타존의 투여 결과에 따르면, 로시글리타존을 저용량(0.037μg/kg/일)으로 투여한 시험군에서는 컨트롤군보다도 내장 지방량이 증가하고, 내장 지방의 축적 억제 효과는 관찰되지 않았다. 이에 따라, 5H4PB는 저용량의 투여에 있어서도 피하 지방 및 내장 지방의 축적 억제 효과를 얻는 것으로 나타났다.
[실시예14 5H4PB의 투여에 의한 간 조직으로의 영향의 검토]
실시예13에 있어서 각 개체로부터 지방 조직을 채취할 때에, 간을 채취하여 병리 조직 검사를 행하였다. 병리 조직 검사 소견은 다음과 같았다.
정상군의 개체에 대해서는 간세포 내에 지방 방울의 침착은 확인되지 않고, 극경도 염증성 세포의 침윤만이 확인되었다. 한편, 컨트롤군의 개체에 대해서는 8개체 중 7개체에 간세포 내에 소형~대형 지방 방울의 침착이 극경도~경도로 확인되며, 정상군과 마찬가지로 염증성 세포의 침윤이 극경도로 확인되었다. 5H4PB를 0.037μg/kg/일 투여한 시험군 및 0.01mg/kg/일 투여한 시험군에 대해서는 간세포 내의 지방 방울의 침착이 전혀 없거나 혹은 약한 침착에 머물렀다. 로시글리타존 0.037μg/kg/일 투여군에서는 간세포 내에 미세·소형·대형 지방 방울이 혼재하여 극경도~경도의 침착이 확인되고, 로시글리타존 10mg/kg/일 투여군에서는 이러한 지방 방울은 증가하고, 중간 정도의 침착이 확인되는 동시에 간세포는 경도의 비대를 나타내고 있었다.
이러한 병리 조직 검사 소견에 따르면, 로시글리타존 투여군이나 컨트롤군과 비교하여 5H4PB에 의한 간 손상은 확인되지 않았다. 이에 따라, 5H4PB가 안전성 높은 성분인 것이 확인되었다.
이상에서 설명한 실시예는 모두 본 발명을 예시적으로 나타낸 것에 있어서 한정적으로 보는 것은 아니고, 본 발명은 다른 다양한 변형 형태 및 변경 형태로 실시하는 것이 가능하다. 따라서 본 발명의 범위는 특허 청구 범위 및 그 균등 범위에 의해서만 규정되는 것이다.
[산업상 이용 가능성]
본 발명은 PPARγ가 관여하는 생활 습관병이나 기타 병태를 예방 또는 개선하는 PPARγ 활성화제를 제공하기 위하여, 의료나 식품 분야(보조제, 건강 식품, 기능성 식품, 특정 보건용 식품 등도 포함)의 산업에 있어서 폭넓게 도움이 되는 것이다.

Claims (6)

  1. 식(1)로 표현되는 부테놀리드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 함유하는 것을 특징으로하는 PPARγ 활성화제.
    [식 1]
    Figure pct00007
    …(1)
    [식(1) 중, R1은 수소 원자, 인산기, 지방산기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 탄소수 1~4의 알킬기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기를 나타내며, R2는 페닐기, 메틸페닐기, 디메틸페닐기, 에틸페닐기, 벤질기, 메틸벤질기, 디메틸벤질기, 에틸벤질기, 페네틸기, 메틸페네틸기, 디메틸페네틸기 또는 에틸페네틸기를 나타낸다.]
  2. 제1항에 있어서, 상기 R1이 수소 원자, 인산기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기이고, 상기 R2가 페닐기, 4-메틸페닐기, 벤질기 또는 4-메틸벤질기인 것을 특징으로 하는 PPARγ 활성화제.
  3. 당뇨병, 인슐린 저항성, 비만증, 체중 증가, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 렙틴 저항성, 지질 대사 이상, 고지혈증, 동맥 경화 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질병의 예방 혹은 치료를 위한 의약에 있어서, 제1항 또는 제2항의 PPARγ 활성화제를 포함하는 의약.
  4. 당뇨병, 인슐린 저항성, 비만증, 체중 증가, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 렙틴 저항성, 지질 대사 이상, 고지혈증, 동맥 경화 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 질병의 예방 혹은 개선을 위한 보조제에 있어서, 제1항 또는 제2항의 PPARγ 활성화제를 포함하는 보조제.
  5. 식(2)로 표현되는 부테놀리드 화합물 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환의 치료, 예방, 억제 또는 개선용 조성물.
    [식 2]
    Figure pct00008
    …(2)
    [식(2) 중, R1은 수소 원자, 인산기, 지방산기, 치환기를 가지고 있어도 좋은 탄소수 1~4의 알킬기 또는 치환기를 가지고 있어도 좋은 당잔기를 나타내며, R2는 페닐기, 메틸페닐기, 디메틸페닐기, 에틸페닐기, 벤질기, 메틸벤질기, 디메틸벤질기, 에틸벤질기, 페네틸기, 메틸페네틸기, 디메틸페네틸기 또는 에틸페네틸기를 나타낸다.]
  6. 제5항에 있어서, 상기 PPARγ가 관여하는 병태, 증상 또는 질환이 당뇨병, 인슐린 저항성, 비만증, 체중 증가, 내장 지방 축적, 피하 지방 축적, 렙틴 저항성, 지질 대사 이상, 고지혈증, 동맥 경화 및 대사 증후군으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 병태, 증상 또는 질환인 것을 특징으로 하는 조성물.
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