KR20110117531A - 다시마의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다시마의 물 또는 유기용매 바람직하기는 에탄올, 주정 및 아세톤 추출물과 에탄올 추출물로부터 분획한 n-헥산 그리고 그의 디클로로메탄 분획물이 염증매개인자인 iNOS와 COX-2 발현을 억제하고 이 효소에 의해 생성되는 NO와 proinflammatory cytokine의 생성억제에 효과적인 것을 확인하여 염증 관련 질병의 예방 및 치료에 유용한 유효성분을 함유한 것을 특징으로 하는 항염증 약학조성물을 개시한다.

Description

다시마의 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증용 약학조성물{An anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising of extracts as an effective component from Laminaria japonica}

본 발명은 다시마의 추출물로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 항염증 활성이 있는 약학조성물에 관한 것이다.

염증반응은 생체나 조직에 물리적 작용이나 화학적 물질, 세균감염 등의 어떠한 기질적 변화를 가져오는 침습이 가해질 때 그 손상부위를 수복 재생하려는 기전이며, 일단 자극이 가해지면 국소적으로 histamine, serotonine, bradykinin, prostaglandins, hydroxyeicosatetraenoic acid (HETE), leukotriene과 같은 혈관 활성 물질이 유리되어 혈관 투과성이 증대되면서 염증을 유발한다 (Willoughby, D.A. Ann. Rhem. Dis, 34, p471-478, 1975).

대식세포는 NO, 프로스타글란딘 E2 및 전구염증성 cytokine 등을 분비함으로써 염증에 반응하고, 또한 염증, 면역반응 모두에서 중요한 조절세포로 작용하는데, 이렇게 작용하기 위해서는 반드시 활성화과정을 거쳐야 한다. 그람 음성균의 세포벽 구성성분 중의 하나이며 내독소로 잘 알려진 LPS (lipopolysaccharide)는 대식세포의 활성화에 관여하는 가장 잘 알려진 외부인자이다. 특히 RAW 264.7 세포와 같은 대식세포나 단핵세포에서 TNF-α (tumor necrosis factor-alpha), IL-6 (interleukin-6), IL-1β (interleukin-1 beta)와 같은 전구염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokine)을 분비하여 염증부위에서 증가되는 것으로 알려져 있다 (Lee, E. S. et al., Biol. Pharm. Bull. 27, p617-620, 2004).

LPS가 대식세포를 자극하게 되면 iNOS (inducible nitric oxide synthase)라는 효소에 의해 L-arginine이 L-citrulline으로 변하는 과정에서 nitric oxide (NO)가 생성됨으로써 대식세포로부터 NO가 생성된다. 포유동물에서 NO는 세 가지 종류의 NO 합성효소 (NOS, nitric oxide synthase), 즉 nNOS (neuronal NOS), eNOS (endothelial NOS) 및 iNOS (inducible NOS)에 의해 합성된다. 이 중에서 nNOS와 eNOS에 의해 생성되는 NO는 정상적인 생체기능을 위해 생성되며, 조직내에서의 농도는 일정수준으로 낮게 유지된다. 그러나 iNOS에 의해 생성된 NO는 과도하게 생성되어 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직 손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.

염증인자인 프로스타글란딘 E2 (PGE2)는 세포막의 구성성분인 인지질이 LPS에 의해 자극을 받아 포스포리파제 A2 (phospholipase A2)라는 효소에 의해 유리된 아라키돈산이 COXs (cyclooxygenaes)라고 불리우는 효소의 촉매작용을 받아 형성되어 염증반응을 유도하게 된다. COX는 COX-1과 COX-2로 분류되는데, COX-1은 체내에서 혈소판의 형성, 위벽보호, 신장기능의 유지 등 정상적이 생체기능에 작용하며 (Seibert, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 91, p12013-12017, 2004) COX-2는 염증매개물질인 PGE2를 합성한다. PGE2는 염증반응(통증, 발열 등), 면역반응, 그리고 angiogenesis를 촉진하는 등 암 발생에도 깊이 관여하고 있는 것으로 알려져 있다 (Kim, J. Y. et al., FEBS letters., 569, p321-326, 2004).

선택성 COX-2 억제제 (selective COX-2 inhibitors)를 포함하는 모든 비스테로이드성 항 염증제 (non-steroidal antiinflammatory drugs, NSAIDs)는 항염증, 해열 및 진통 효과를 나타낸다. 하지만 이러한 약들의 장기간 복용은 심각한 부작용을 초래한다. 예를 들어, 위장관계의 소화성 궤양출혈로 인한 이차적 빈혈 초래, 혈소판 기능 억제, 분만 유도 억제, 신장에 대한 부작용, 간장 손상, 과민 반응 등이 있다. 이러한 약물의 부작용을 극복하기 위하여 보다 개선된 치료제의 개발은 필수적이고 시급한 실정이다. 이것과 관련지어 천연물에서 그 항염증 활성 성분을 찾으려는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

해조류는 최근 여러 가지 생리화학적 효과가 밝혀지면서 해조류에서 분리된 생리활성 물질에 대한 관심이 고조되고 있다. 해조류 중 특히 다시마(Laminaria japonica)는 갈조류에 속하는 다시마과의 한 속으로서 한국, 일본 및 중국 등의 극동 아시아 지역에 서식하며, 독특한 맛과 향으로 기호성이 양호하다(Ito et al., In Proc. of 7 th Int. Seaweed Symp. Nishizawa K, ed Univ. Tokyo Press, Japan. p 558-561, 1972). 또한 갈조류 중에는 중성다당인 laminaran과 황산기를 함유한 산성 다당이 다량 함유되어 있으며, 그 대표적인 것이 함황 산성 다당인 fucoidan과 산성다당인 alginate이며(Kim et al., J. Korean Fish Soc. 18 , p29-36, 1985), fucoidan은 heparin과 같은 혈액응고 억제활성 이외에 항암 및 항 AIDS 등의 활성이 있다는 보고가 있다(Colliec et al., Thromb. Res. 64 , p143-154, 1991). 그리고 해조류는 특히 식이섬유소가 풍부하기 때문에 비만과 관련된 질병의 예방 및 치료제 개발을 위한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

하지만 다시마의 항염증 효과에 대한 연구는 아직 보고되지 않고 있는 실정이다. 특히, 다시마의 에탄올 추출물 중 특히 n-헥산과 디클로로메탄 추출물의 유효성분에 대한 항염증 효과를 확인한 결과 효능이 있음을 규명한 바 없다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 점들을 감안하여 완성한 것으로 다시마의 유기용매 추출물의 염증인자들의 발현을 억제하는 효과를 규명하는데 그 목적이 있다.

본 발명의 다른 목적은 다시마로부터 분리된 알콜, 주정 또는 아세톤 추출물과 특히 항염증활성이 높은 헥산과 디클로로메탄 분획으로부터 분리된 분획물의 유효성분에 대한 항염증 효과를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 다시마로부터 분리한 상기 분획물을 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 인자들의 발현 억제용 약학조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 상기 목적은 유기용매를 이용하여 항염증 활성을 가지는 다시마 조추출물을 제조하고, 이로부터 n-헥산가용추출물을 얻은 다음 그의 디클로로메탄 가용성추출물을 얻어, 이들의 항염증 효과를 검증함으로써 달성하였다.

본 발명의 다시마 (Laminaria japonica)로부터 분리된 알콜, 주정 또는 아세톤 추출물, 헥산 및 그의 디클로로메탄 분획은 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO와 proinflammatory cytokines 생성을 저해할 뿐만 아니라, iNOS와 COX-2 효소단백질의 발현을 효과적으로 저해시킴으로써 염증 질환의 예방 및 치료용 약학조성물로 사용할 수 있는 뛰어난 효과가 있다.

도 2는 다시마의 알콜, 주정, 아세톤 추출물, n-헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물로 대식세포인 RAW 264.7 세포에 처리하여 세포독성을 확인한 그림이다.
도 3은 다시마의 알콜, 주정, 아세톤 추출물, n-헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물로 RAW 264.7 세포에 처리하여 NO의 생성을 확인한 그림이다.
도 4는 다시마의 n-헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물에 의하여 염증성 사이토카인인 IL-1b, IL-6, TNF-α의 생성 여부를 확인한 그림이다.
도 5는 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 다시마의 n-헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물의 효과를 실험한 Western blot 결과를 보인 사진도이다.
도 6은 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 mRNA 발현에 대한 다시마의 n-헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물의 효과를 실험한 RT-PCR을 통하여 분석한 결과를 보인 사진도이다.
도 7은 LPS에 의해 유도된 RAW 264.7 세포에서 다시마의 n-헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물에 의한 NF-kB의 translocation에 대한 효과를 확인한 그림이다.
도 8은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 다시마의 n-헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물에 의한 NF-kB의 활성화에 영향을 미치는 단백질들의 인산화 효과를 확인한 결과를 보인 그림이다.

본 발명자들은 다시마로부터 물 또는 유기용매 특히 알콜, 주정 또는 아세톤 추출물, n-헥산 가용성분과 디클로로메탄 가용성분 분획물을 제조하고, 상기 다시마의 유기용매 추출물을 함유하는 조성물을 대식세포 (RAW 264.7 cell)에 항염증 효과를 실험하여 염증 반응에 대한 효과가 강력한 것으로 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 다시마의 에탄올, 주정 또는 아세톤 추출물로부터 분획된 n-헥산 가용성분과 그의 디클로로메탄 가용성물질의 항염증제로서의 용도 및 이들을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 예방 및 치료용 약학조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 상기 다시마 추출물은 조추출물 또는 비극성용매 가용 추출물로서, 조추출물은 물 또는 유기용매 예컨데, 에탄올, 주정, 아세톤, 메탄올, 부탄올과 같은 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 에탄올, 주정 또는 70% 아세톤에 가용한 추출물을 포함하며, 비극성용매 가용추출물은 n-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸 아세테이트로부터 선택된 비극성용매로, 바람직하게는 n-헥산 또는 디클로로메탄으로 추출한 것을 포함한다.

본 발명의 다시마 조추출물은 다시마를 음지에서 자연건조 후 마쇄하여 분말화한 후, 다시마 건조 중량의 약 3 내지 20배, 바람직하게는 약 3 내지 10배에 달하는 부피의 물, 주정, 메탄올, 에탄올 및 부탄올과 같은 저급 알코올, 바람직하게는 주정, 에탄올 및 70% 아세톤을 이들의 약 1:1 내지 1:50의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 에탄올 또는 주정으로 20 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 70℃의 추출 온도에서 약 0.5 시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 3회 연속 추출하여 수득한 후, 감압여과하고 여액을 진공회전농축기로 20내지 100℃, 바람직하게는 40 내지 70℃에서 감압농축하여 물, 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 것으로서 공시재료로 수득할 수 있다.

본 발명의 공시재료가 되는 다시마 조추출물은 물에 현탁한 후, n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 순으로 용매를 이용하여 추출하여 본 발명의 다시마 비극성용매 가용 추출물, 바람직하게는 n-헥산 또는 디클로로메탄 가용성 분획물을 수득할 수 있고, 더욱 구체적으로는 다시마 조추출물 즉, 다시마 에탄올추출물에 n-헥산:물:에탄올을 일정 비율, 바람직하게는 10:9:1로 혼합하여 n-헥산가용성 분획물 및 물가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기 물가용성 분획물을 디클로로메탄으로 추출하여 물가용성 분획물 및 디클로로메탄 가용성 분획물을 수득할 수 있으며, 이 물가용성 분획물에 에틸아세테이트를 가하여 에틸아세테이트 가용성 분획물 및 물가용성 분획물을 수득할 수 있고, 마지막으로 상기 물가용성 분획물을 부탄올로 추출하여 부탄올가용성 분획물과 물가용성 분획물을 수득할 수 있다.

또는, 본 발명은 다시마 조추출물 및 비극성용매 가용성추출물로부터 분리되는 항염증 유효성분이 함유된 화합물을 분리, 정제하는 방법을 제공한다.

본 발명은 상기 방법으로 수득된 화합물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항염증 활성을 가지는 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 다시마 추출물 또는 그로부터 분획된 활성성분의 염증반응에 대한 항염증 약학조성물로써의 효능을 조사하기 위하여, 염증과 관련된 실험에 사용하는 세포주 중에서 염증반응에 있어 아주 특이적인 결과를 보여주는 세포인 RAW 264.7 세포를 사용하여 LPS로 유발된 염증반응에 대한 효과를 측정하였다. 실험결과, 따른 다시마 추출물 중에서 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물이 RAW 264.7 세포에 대한 항염증효과가 효과적으로 나타났음을 확인하였다.

한편, 본 발명의 다시마 추출물 또는 그로부터 분리한 항염증 활성성분을 함유하는 조성물을 독성 및 부작용이 없으므로 염증 예방 기능성 식품조성물로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 다시마 추출물 또는 그로부터 분리된 활성성분이 함유된 화합물을 함유하는 항염증용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 활성성분이 함유된 화합물을 0.1 %~ 50 % 중량으로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물 또는 염증예방 기능성 식품조성물은 그 제조시 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

또, 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈. 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등의 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로즈 (sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 혼합하여 조제할 수 있다. 또, 단순한 상기 부형제 이외에도 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용하여도 좋다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비 경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물 또는 그로부터 분리한 활성성분의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 항염증 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.01 내지 250 mg/kg으로, 바람직하게는 0.1 내지 100 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있다. 또한 그 화합물의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 본 발명을 실시예를 도면을 참조하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예 및 실험 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 다시마 알콜 조추출물의 제조

본 발명에 사용한 다시마는 부산시 기장군과 전남 완도군에서 양식산을 구입하여 사용하였다. 다시마는 음지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 3 kg과 에탄올 10 L를 넣고 70℃에서 일정시간 간격으로 3회 반복하여 환류냉각추출한 후 여지 (와트만사, 미국)로 감압여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 40℃에서 에탄올을 제거한 후 추출된 잔사로서 다시마 조추출물(A) 500-800 g을 수득하였으며(도1), 이 중 1 g을 취하여 항염증 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 2. 다시마 주정 조추출물의 제조

본 발명에 사용한 다시마는 부산시 기장군과 전남 완도군에서 양식산을 구입하여 사용하였다. 다시마는 음지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 3 kg과 주정 10 L를 넣고 70℃에서 일정시간 간격으로 3회 반복하여 환류냉각추출한 후 여지 (와트만사, 미국)로 감압여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 40℃에서 에탄올을 제거한 후 추출된 잔사로서 다시마 조추출물(A) 500-800 g을 수득하였으며(도1), 이 중 1 g을 취하여 항염증 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 3. 다시마 아세톤 조추출물의 제조

본 발명에 사용한 다시마는 부산시 기장군과 전남 완도군에서 양식산을 구입하여 사용하였다. 다시마는 음지에서 자연건조 후 마쇄하여 얻은 분말 3 kg과 50-90% 아세톤 10 L를 넣고 70℃에서 일정시간 간격으로 3회 반복하여 환류냉각추출한 후 여지 (와트만사, 미국)로 감압여과한 다음, 여과 추출물은 진공회전농축기로 40℃에서 아세톤을 제거한 후 추출된 잔사로서 다시마 조추출물(A) 500-800 g을 수득하였으며(도1), 이 중 1 g을 취하여 항염증 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 4. 다시마 n-헥산 가용 추출물의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 다시마 조추출물 700 g에 n-헥산:메탄올:물=10:9:1 의 혼합용매 4 L를 가하여 혼합한 후 수가용성 분획물 2 L 및 n-헥산 가용성 분획물 2 L를 얻었으며, 수가용성 분획물 2 L에 n-헥산 2 L을 가하여 3~4차례 분획하여 얻은 후 n-헥산 가용성 분획물을 건조하여 n-헥산 가용 추출물(B) 135.5 g을 수득하여 시료로 사용하였으며(도1), 이 중 1 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 5. 다시마 디클로로메탄 가용 추출물의 제조

상기 실시예 2에서 얻은 수가용성 분획물 2 L에 디클로로메탄 2 L를 가하여 혼합한 후 수가용성 분획물 2 L 및 디클로로메탄 가용성 분획물 2 L를 얻었으며, 수가용성 분획물 2 L에 n-헥산 2 L을 가하여 3~4차례 분획하여 얻은 후 이 디클로로메탄 가용성 분획물을 건조하여 디클로로메탄 가용 추출물(C) 18.1 g을 수득하여 시료로 사용하였으며(도1), 이 중 1 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 6. 다시마 에틸아세테이트 가용 추출물의 제조

상기 실시예 3에서 얻은 수가용성 분획물 2 L에 에틸아세테이트 2 L를 가하여 혼합한 후 수가용성 분획물 2 L 및 에틸아세테이트 가용성 분획물 2 L를 얻었으며, 분획물 2 L를 얻었으며, 수가용성 분획물 2 L에 n-헥산 2 L을 가하여 3~4차례 분획하여 얻은 후 이 에틸아세테이트 가용성 분획물을 건조하여 에틸아세테이트 가용 추출물(D) 39.6 g을 수득하여 시료로 사용하였으며(도1), 이 중 1 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실시예 7. 다시마 부탄올 가용 추출물의 제조

상기 실시예 4에서 얻은 수가용성 분획물 2 L에 부탄올 2 L를 가하여 혼합한 후 수가용성 분획물 2 L 및 부탄올 가용성 분획물 2 L를 얻었으며, 수가용성 분획물 2 L에 n-헥산 2 L을 가하여 3~4차례 분획하여 얻은 후 이 부탄올 가용성 분획물을 건조하여 수가용 추출물 및 부탄올 가용 추출물(E) 55 g을 수득하여 시료로 사용하였으며(도1), 이 중 1 g을 취하여 염증반응에 대한 활성검색을 위한 시료로 사용하였다.

실험예 1. 다시마의 알콜, 주정, 아세톤 추출물, n-헥산 분획물 및 디클로로메탄 분획물의 세포독성 효과

상기 실시예 1-5에서 얻은 다시마의 알콜, 주정 및 아세톤 추출물(A), n-헥산 분획물(B) 및 디클로로메탄 분획물(C)로 대식세포인 RAW 264.7 세포에 LPS (1 μg/ml)을 처리하여 적절한 농도내에서 항염증 활성을 확인하기 위하여 세포독성을 측정하였다. RAW 264.7 세포 (5×104 cells/well)를 DMEM 배지에 시험 약물(다시마 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물)을 처리하여 24시간 배양하였다. 96 well plate에 배지 95 ㎕와 MTS 용액 5 ㎕를 넣고 3 시간 정도 반응시킨 후 microplate reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정치는 3회 반복 실험의 평균값으로 하여, 그 결과를 하기 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타나듯이, RAW 264.7 세포에 대한 다시마의 알콜, 주정, 아세톤 추출물, n-헥산 분획물과 디클로메탄 분획물의 세포 독성은 100 μg/ml의 농도까지 나타나지 않았다.

실험예 2. NO 생성에 대한 다시마의 알콜, 주정, 아세톤 추출물, n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물의 영향

RAW 264.7 세포 (5×104 cells/well)를 DMEM 배지를 이용하여 96 well plate에 접종하고, 알콜, 주정 및 아세톤 추출물(A), 다시마 헥산 분획물(B) 또는 디클로로메탄 분획물(C)과 LPS (1 μg/ml)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2-의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 (1% sulfanilamide, 0.1% naphtyl-ethylenediamine in 5% phosphoric acid) 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준농도 곡선은 sodium nitrite (NaNO2)를 serial dilution(연속 희석)하여 얻었고, 그 결과는 하기 도 3에 나타내었다.

도 3에서 볼 수 있듯이, 다시마의 알콜, 주정, 아세톤 추출물과 헥산 분획물 또는 디클로로메탄 분획물은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 효과적으로 NO의 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 3. Proinflammatory cytokine production에 대한 다시마의 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물의 영향

실험2에 예시한 바와 같이 알콜, 주정 및 아세톤 추출물(A), 다시마 헥산 분획물(B) 또는 디클로로메탄 분획물(C)은 염증매개인자인 NO의 생성을 농도 의존적으로 저해하였다. 따라서 proinflammatory cytokine인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성 억제 효과를 헥산과 디클로로메탄 분획물을 대상으로 분석하였다. 세포배양액 내의 IL-1β, IL-6, TNF-α 농도 측정은 BD Biosciences (San Jose, USA)사의 ELISA kit를 사용하였다. 세포에 다시마의 n-헥산 추출물(B) 또는 디클로로메탄 추출물(C)과 1 μg/ml의 LPS를 함께 처리하였다. 24시간 후 세포 배양액을 원심분리하여 상층액에서 IL-1β, IL-6, TNF-α을 측정하였다. Microplate reader를 사용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였고 그 결과는 도 4에 나타내었다.

IL-1β, IL-6, TNF-α는 proinflammatory cytokine 들로서 염증반응을 유발시켜 유해한 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 도 4에 나타난 바와 같이 다시마 n-헥산 가용성 추출물에 의하여 염증성 사이토카인의 일종인 IL-1β, IL-6, TNF-α의 생성을 농도의존적으로 감소시킴을 알 수 있었다.

NO는 산화질소 합성효소 (NOS)에 의해 L-arginine으로부터 합성된다. 병리적인 조건 하에서 NO의 상당한 증가는 염증성 과정을 자극하고 다른 염증 매개체와 함께 상승효과를 나타내는 iNOS에 의해 합성된다. 또한, iNOS는 염증성 사이토카인과 박테리아성 endotoxin에 노출되었을 때 강하게 자극된다. 화합물들은 iNOS에 의한 NO 생성을 감소시킬 수 있고 항염증제로써 매력이 있을 수도 있다. 이런 이유로 iNOS 활성에 대한 폴리페놀의 효과는 항염증제로 개발하기 위해서 집중적으로 연구되고 있다. 도 3은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 NO 생성에 대한 다시마의 알콜 추툴물, 주정 추출물, 아세톤 추출물, n-헥산 추출물 및 디클로로메탄 추출물의 효과를 보여준다. 이들 추출물은 LPS로 유도된 NO 생성량을 농도 의존적으로 감소시켰다. 따라서 다시마의 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물은 LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS 단백질 발현의 억제효과 또는 iNOS mRNA의 전사저해 효과를 가지고 있다는 것을 알 수 있다.

실험예 4. iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 다시마의 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물의 효과

LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 다시마의 n-헥산 추출물(B)과 디클로로메탄 추출물(C)의 효과를 웨스턴 블롯을 통하여 관찰하였다. 도 5에서는 RAW 264.7 세포에서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현에 대한 다시마의 헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물의 효과를 나타낸 것이다.

1 μg/ml의 LPS를 세포에 처리하면 대조군에 비해서 iNOS와 COX-2의 단백질 발현이 크게 증가한다. 하지만 다시마의 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물을 처리하였을 경우, iNOS의 단백질 발현은 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물 모두 농도의존적으로 감소시켰다. 하지만 COX-2의 단백질 발현은 iNOS 발현 억제와는 달리 약하게 감소시킨다는 것을 알 수 있다.

실험예 5. 세포내 항염증 신호전달 관련 인자 분석

일반적으로 LPS로 유도된 대식세포에는 iNOS, COX-2와 같은 염증 관련 단백질들이 활성화된다. 염증상태에서 활성화된 iNOS에 의해 생성된 NO는 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다. COX-2에 의한 프로스타글란딘의 합성은 염증반응을 매개하는 것으로 여겨진다. RAW 264.7에 LPS를 처리하여 생성되는 NO와 proinfammatory cytokine에 대한 다시마의 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물의 효과를 살펴본 결과 강한 억제 효과를 보였다(도 2, 3). 그리고 염증 관련 인자인 iNOS와 COX-2의 단백질과 mRNA 발현을 RT-PCR (reverse-transcriptase PCR)을 통해 분석하였다. 그 결과 단백질 수준은 물론 mRNA 발현 수준에서도 다시마의 헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물을 처리한 군이 LPS 단독 처리군에 비해 강한 억제효과를 나타내었다(도 6).

전사인자인 NF-κB는 일반적인 상태에서는 inhibitory κB-alpha (IκB-α)와 함께 결합하여 세포질에 존재한다. 하지만 LPS와 같은 외부자극에 의해 자극을 받으면 IκB-α가 분해되어 유리형의 NF-κB는 핵으로 이동하여 cytokine, cytokine receptor, cell adhesion molecule, growth factor 등의 발현에 관여하는 유전자의 promoter나 enhancer의 κB site에 결합함으로써 전사를 유도한다. LPS로 유도된 RAW 264.7 세포에서 다시마의 헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물에 의한 NF-κB의 translocation을 immunoblot으로 관찰하였다. 확인한 결과 LPS에 의해 핵으로 이동한 NF-κB가 다시마의 헥산 추출물(B)과 디클로로메탄 추출물(C)을 처리함으로써 핵으로의 이동이 억제된다는 것을 알 수 있었다(도 7).

다양한 외부자극에 의한 NF-κB 전사인자의 활성화를 통해 iNOS나 COX-2의 발현을 유도하는 과정을 조절하는 분자신호 전달기전은 주요 MAPK superfamily에 속하는 세 가지 효소들로 extracellular-regulated protein kinase (ERK), c-Jun NH2-protein kinase (JNK)/stress-activated pretein kinase (SAPK), serine/threonine protein kinase인 p38 MAPK들을 들 수 있다. 이러한 세포내 단백질의 인산화에 관한 다시마의 n-헥산 추출물과 디클로로메탄 추출물의 효과를 알아보기 위하여 immunoblot으로 관찰한 결과, LPS에 의해 유도된 ERK, JNK, p38 MAPK의 인산화는 물론 PI3K의 downstream effector인 Akt의 인산화에 대한 강력한 저해를 보였다. 따라서 LPS에 의해 유도된 대식세포에서 다시마의 n-헥산 추출물(B)과 디클로로메탄 추출물(C)은 다양한 세포내 신호 단백질 경로를 차단함으로써 염증 반응을 저해한다고 볼 수 있다(도 8).

LPS 처리에 의하여 ERK, JNK, p38의 인산화로 인하여 IκB-α의 세포질에서의 분해가 확인되었으며 이러한 결과로 인하여 NF-κB의 핵으로의 이동이 확연하게 나타났다. 그러나 다시마의 n-헥산 추출물(B)과 디클로로메탄 추출물(C)에 의하여 Akt, ERK, JNK, p38의 인산화가 억제되었으며, 그로인해 IκB-α의 분해가 억제됨으로써 NF-κB의 핵으로의 이동을 감소시켜 iNOS의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.

하기에 상기 약학조성물의 제제 예를 설명하지만, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 하는 것이므로 균등물의 단순한 치환, 화합물의 첨가수치의 단순한 한정은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것은 물론이다.

제제예 1. 주사제제의 제조

다시마 추출물 50 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2976 mg

Na2HPO4, 12H2O 24 mg

상기의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

제제예 2. 정제의 제조

다시마 추출물 150 mg

유당 75 mg

전분 75 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3. 캡슐제의 제조

다시마 추출물 100 mg

유당 50 mg

전분 50 mg

탈크 2 mg

스테아린산 마그네슘 적량

상기의 성분을 혼합하고 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4. 액제의 제조

다시마 추출물 100 mg

설탕 20 g

이성화당 15 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 100 ㎖으로 맞추었다.

상기의 성분을 통상의 액제의 제조방법에 따라서 혼합하고 레몬향을 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖의 갈색병에 충전하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 5. 건강 음료의 제조

다시마 추출물 100 mg

비타민 C 15.5 g

비타민 E 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.25 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3 g

물 정량

통상의 건강음료 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강 음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

다시마 (Laminaria japonica)의 알콜 추출물, 주정 추출물, 아세톤 추출물 추출물, n-헥산 분획물 및 디클로로메탄 분획물물은 RAW 264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO와 proinflammatory cytokine의 생성을 저해하는 뛰어난 효과가 있고 iNOS 및 COX-2 효소단백질의 mRNA와 단백질의 발현저해는 NO와 proinflammatory cytokine의 생성 저해와 직접적인 연관이 있으므로 염증 질환의 예방 및 치료용 의료산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

1. 다시마의 주정, 에탄올, 70% 아세톤 중 어느 하나의 유기용매 추출물을 포함하는 염증억제용 약학조성물.
   
2. 다시마의 헥산 추출물을 유효성분으로 함유 하는 염증억제용 약학조성물.
   
3. 다시마의 디클로로메탄 추출물을 유효성분으로 함유 하는 염증억제용 약학조성물.
   
4. 다시마의 헥산과 디클로로메탄 추출물을 혼합한 것을 특징으로 하는 염증억제용 약학조성물.
   
5. 다시마의 헥산과 디클로로메탄 획분으로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 항염증 약학조성물.
   
6. 다시마 추출물 또는 그로 부터 분리된 화합물을 포함하는 염증예방 기능성 식품조성물.

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