KR101648400B1

KR101648400B1 - 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-o-카페오일글리세롤을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101648400B1
Application number: KR1020140177507A
Authority: KR
Inventors: 이정형; 추용연; 우미희; 민병선
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2014-12-10
Filing date: 2014-12-10
Publication date: 2016-08-17
Also published as: KR20160070891A

Abstract

본 발명은 수수 추출물 유래의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 조성물에 관한 것으로서, 상기 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤은 전사인자인 Nrf2의 유도를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)을 활성화하여 염증성 사이토카인 및 각종 염증 인자의 발현을 억제함으로써, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 신장염 등과 같은 각종 질환의 치료제나 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising caffeoylglycolic acid methyl ester or 1-O-caffeoylglycerol for preventing or treating inflammatory diseases}

본 발명은 수수 추출물 유래의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

염증반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응 중의 하나라고 할 수 있다. 대식세포는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 활성화된 대식세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), PGE₂(prostaglandin E₂), NO(nitric oxide), ROS(reactive oxygen species) 등과 같은 다양한 염증성 매개체를 분비한다(Laskin, D. L. et al., 2011). 한편, 이러한 염증성 매개체의 과발현은 류마티스 관절염, 골다공증, 패혈증, 혈관질환, 암 등을 유도한다(Lawrence, T. et al., 2012).

HO(heme oxygenase)는 헴(heme) 단백질의 산화를 유도하여 일산화탄소, 빌리베르딘(biliverdin), 산화철(ferrous iron) 등을 생성하는 단백질로서, HO는 2개의 타입이 있는데, HO-2는 대부분의 세포에서 항상 발현을 하는 것으로 알려져 있지만, HO-1은 면역성 사이토카인, 산화 스트레스 관련 인자 등의 자극으로 인해 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다(Maines, M. D. et al., 2001). HO-1은 세포의 항상성을 유지하고, 조직 내의 산화적 스트레스와 염증 반응을 줄이는 역할을 한다 (Morse, D. et al., 2009; Paine, A. et al., 2010). 이러한 HO-1의 보호 활성은 항산화성, 항염증성, 항아폽토시스성, 항유사분열촉진성에 대한 가능성 등이 있는 빌리루빈, 일산화탄소 등의 부산물에 의해 매개가 되어 유발되는 것으로 여겨진다(Otterbein, L. E. et al., 1999l; Ryter, S. W. et al., 2006). HO-1의 발현이나 일산화탄소의 치료는 대식세포의 활성으로 유도된 염증성 매개체로 인해 유도된 사이토카인이나 케모카인의 생성을 억제하는 것으로 확인된 바 있다(Morse, D. et al., 2003; Suh, G.Y. et al., 2006; Nakahira, K. et al., 2006; Wang, X. M. et al., 2009). HO-1의 전사 인자(transcription factor)인 Nrf2(nuclear factor-E2-related factor 2) 대표적인 표적 유전자의 하나로 잘 알려져 있다. 면역성 사이토카인, 산화 스트레스 관련 인자에 의한 HO-1의 발현은 PI3K/AKT(phosphoinositide 3-kinase/AKT)와 JNK(c-Jun N-terminal kinase), ERK1/2(extracellular signal regulated kinase-1/2), p38 키나아제(p38 kinase) 등의 MAPK(mitogen-activated protein kinase)를 통한 전사 레벨(transcriptional level)에서 주로 조절되며(Abraham, N. G. et al., 2008; Morse, D. et al., 2009), 이를 조절하는 주된 전사 인자는 Nrf2이다(Maines, M. D. et al., 2001).

Nrf2는 세포에서 HO-1, NQO1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1), GCLC(glutamate cysteine ligase, catalytic subunit) 등과 같이 항산화 기능을 하는 유전자들의 발현을 조절하여 항산화반응을 조절하는 대표적인 조절자이다(Jaramillo et al., 2013). 일반적인 상태에서는 Nrf2는 Keap1(Kelch-like ECH-associated protein 1) 단백질과 결합되어 활성화가 저해되나, 산화적 스트레스(oxidative stress) 조건에서는 Keap1 단백질이 분해됨으로써 Nrf2가 안정화되고, 이 Nrf2가 핵으로 들어가 전사인자로서 작용하여 NQO1, HO-1, GCLC 등과 같은 항산화 유전자들의 발현이 증가된다(Jaramillo et al., 2013). 한편 Nrf2는 산화적 스트레스로 인해 활성화되는 PI3K/AKT, JNK, ERK1/2 p38 키나아제 등의 MAPK에 의해 인산화됨으로써 안정화되어 활성화되기도 한다(Boutten et al., 2011). Nrf2의 활성화가 세포의 HO-1 등의 항산화 효소를 유도하여 항산화 반응을 유도함으로써 당뇨, 심혈관계 질환, 염증성 질환, 폐질환, 노화, 암, 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료효과를 유도하는 것으로 알려져 있어, Nrf2는 의약품 개발의 중요한 표적이 될 수 있다(Alfieri, A. et al., 2008; Lau, A. et al., 2008; Mann, G. E. et al., 2009; Boutten et al., 2011; Chapple et al., 2012).

따라서, 천연물을 이용한 Nrf2나 HO-1의 활용 방법이 당뇨, 퇴행성 뇌질환, 심혈관계 질환 및 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는데 있어서 중요한 타겟이 되고 있다(Motterlini, R. et al., 2014; Alfieri, A. et al., 2008; Lau, A. et al., 2008; Mann, G. E. et al., 2009; Boutten et al., 2011; Chapple et al., 2012).

수수(Sorghum bicolor (L.) Moench)의 종자에는 1-O-카페오일글리세롤(1-O-caffeoylglycerol, 1-O-CG)과 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(caffeoylglycolic acid methyl ester, CGME)와 같은 카페오일글리세롤(caffeoylglycerol)이 풍부하다(Nguyen, P. H. et al., 2015). 카페오일글리콜산 메틸 에스테르는 항산화성이 뛰어나고(Saleem, M. et al., 2004), HIV(human immunodeficiency virus)에 대한 저해활성이 있음이 확인된 바 있다(Lee, S. U. et al., 2007).

본 발명자들은 수수 추출물이 갖는 다양한 생리활성을 연구하던 중, 상기 수수 추출물 유래의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤이 항염증 효과가 있어 각종 염증성 질환의 치료제로 다양하게 이용 가능함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 한편, 한국공개특허 제2014-0065535호에는 황금찰수수나 마일로수수, 마일로찰수수 등의 추출물 또는 분획물이 항염증 효과가 있음이 개시되어 있지만, 상기와 같은 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤 화합물의 특정 효과에 관해서는 전혀 개시되어 있지 않다.

한국공개특허 제2014-0065535호 (수수 및 수수 부산물 유래 폴리페놀계 화합물을 함유하는 추출물과 이를 유효성분으로 함유하는 염증성 질환 예방 및 치료용 약학 조성물, 2014.05.30. 공개)

Alfieri, A. et al., Targeting the Nrf2-Keap1 antioxidant defense pathway for neurovascular protection in stroke, J. Physiol., 2008, 589, 4125-4136. Abraham, N. G. et al., Pharmacological and clinical aspects heme oxygenase, Pharmcol. Rev., 2008, 60, 79-127. Boutten, A. et al., NRF2 targeting: a promising therapeutic strategy in chronic obstructive pulmonary disease. Trends Mol Med., 2011, 17, 363-371. Chapple, S.J., et al., Crosstalk between Nrf2 and the proteasome: therapeutic potential of Nrf2 inducers in vascular disease and aging. Int J Biochem Cell Biol. 2012 44, 1315-1320. Jaramillo, M. C. et al., The emerging role of the Nrf2-Keap1 signaling pathway in cancer, Genes Dev., 2013, 27, 2179-2191. Laskin, D. L. et al., Macrophages and tissue injury: agents of defense or destruction?, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2011, 51, 267-288. Lau, A. et al., Dual roles of Nrf2 in cancer, Pharmacol. Res., 2008, 58, 262-270. Lawrence, T. et al., Anti-inflammatory lipid mediators and insights into the resolution of inflammation, Nat. Rev. Immunol., 2002, 2, 787-795. Lee, S. U. et al., Caffeoylglycolic and caffeoylamino acid derivatives, halfmers of L-chicoric acid, as new HIV-1 integrase inhibitors, Eur. J. Med. Chem., 2007, 42, 1309-1215. Maines, M. D. et al., The heme oxygenase system and cellular defense mechanisms. Do HO-1 and HO-2 have different functions?, Adv. Exp. Med. Biol., 2001, 502, 249-272. Mann, G. E. et al., Targeting the redox sensitive Nrf2-Keap1defense pathway in cardiovascular disease: protection afforded by dietary isoflavones, Curr. Opin. Pharmacol., 2009, 9, 139-145. Morse, D. et al., Suppression of inflammatory cytokine production by carbon monoxide involves the JNK pathway and AP-1, J. Biol. Chem., 2003, 278, 36993-36998. Morse, D. et al., Heme oxygenase-1, a critical arbitrator of cell death pathways in lung injury and disease, Free Radic. Biol. Med., 2009, 47, 1-12. Motterlini, R. et al., Heme oxygenase-1 as a target for drug discovery, Antioxid. Redox. Signal., 2014, 20, 1810-1826. Nakahira, K. et al., Carbon monoxide differentially inhibits TLR signaling pathways by regulating ROS-induced trafficking of TLRs to lipid rafts, J. Exp. Med., 2006. 203, 2377-2389. Nguyen, P. H. et al., Isolation of benzoic and cinnamic acid derivatives from the grains of Sorghum bicolor and their inhibition of lipopolysaccharide-induced nitric oxide production in RAW 264.7 cells, Food Chemistry, 2015,168, 512-519. Otterbein, L. E. et al., Carbon monoxide provides protection against hyperoxic lung injury, Am. J. Physiol., 1999, 276, L688-L694. Paine, A. et al., Immenschuh, Signaling to heme oxygenase-1 and its anti-inflammatorytherapeutic potential, Biochem. Pharmacol., 2010, 80, 1895-1903. Ryter, S. W. et al., Heme oxygenase-1/carbon monoxide: from basic science to therapeutic applications, Physiol. Rev., 2006, 86, 583-650. Saleem, M. et al., Antioxidant caffeic acid derivatives from leaves of Parthenocissus tricuspidata, Arch. Pharm. Res., 2004, 27, 300-304. Suh, G.Y. et al., CCAAT/enhancer-binding protein mediates carbon monoxide-induced suppression of cyclooxygenase-2, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 2006, 35, 220-226. Wang, X. M. et al., The heme oxygenase-1/carbon monoxide pathway suppresses TLR4 signaling by regulating the interaction of TLR4 with caveolin-1, J. Immunol., 2009, 182, 3809-3818.

본 발명의 목적은 수수 추출물 유래의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(caffeoylglycolic acid methyl ester, 화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-caffeoylglycerol, 화합물 2) 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 조성물은 전사인자 Nrf2 유도를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)을 활성화할 수 있다. 상기 화합물은 상기 조성물에 0.001~30 중량%로 첨가될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(caffeoylglycolic acid methyl ester, 화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-caffeoylglycerol, 화합물 2) 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 상기 화합물은 상기 건강기능식품에 0.001~30 중량%로 첨가될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 1의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(화합물 2) 중 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤은 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있으며, 또는 수수 추출물로부터 분리 정제될 수 있다. 상기 수수 추출물은 수수를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다. 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 수수 추출물의 제조 시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 수수 사용 중량 기준 1~15배 부피(1kg 기준 1~15ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~10배를 사용할 수 있다. 상기 수수 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1~48시간일 수 있다. 또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 수수의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획할 수 있다.

바람직하게는 상기 수수 추출물은 수수를 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 수수 추출물을 수수 추출물의 중량의 1~1000배, 바람직하게는 1~100배, 더 바람직하게는 1~50배의 물을 가하여 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 얻은 수수 분획물로 제조할 수 있다. 상기 수수 분획물은 바람직하게는, 수수를 물, 탄소수 1 내지 4개의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 수수 추출물을 물에 현탁한 후 헥산과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 디클로로메탄을 혼합하여 얻은 디클로로메탄층의 농축물, 또는 상기 디클로로메탄층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 에틸아세테이트를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 상기 에틸아세테이트층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 부탄올을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물, 또는 상기 부탄올층을 제거하고 남은 잔사(물층)의 농축물일 수 있다. 한편, 이 외의 분획조건은 제한되지는 않으나, 상기 수수 추출물에 수수 추출물의 중량의 1~50배의 물을 가하여 현탁물을 제조한 후, 상기 물과 동량의 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 분획할 수 있다. 또한, 헥산층을 제거한 후 남은 잔사에 디클로로메탄을 가하고, 디클로로메탄층을 제거하고 남은 잔사에 에틸아세테이트를 가하고, 에틸아세테이트를 제거하고 남은 잔사에 부탄올을 가할 때에도, 단계적으로 이루어 질 때도 역시 잔사와 동량의 각 용매(디클로로메탄, 에틸아세테이트 또는 부탄올)를 순차적으로 가하여 분획할 수 있다.

상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 50℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 1주일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 수수 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 수수 추출물 또는 분획물은 칼럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.

상기 수수 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(화합물 2) 중 1종 이상의 화합물 및 약제학적 부형제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 본 발명의 약학 조성물에 바람직하게는 0.001~90 중량%, 더 바람직하게는 0.001~60 중량%, 가장 바람직하게는 0.001~30 중량%로 하여 첨가될 수 있다.

상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(화합물 2) 중 1종 이상의 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 화합물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.

본 발명은 수수 추출물 유래의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 조성물에 관한 것으로서, 상기 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 또는 1-O-카페오일글리세롤은 Nrf2 유도를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 유도하여 염증성 사이토카인 및 각종 염증 인자의 발현을 억제함으로써, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 신장염 등과 같은 각종 질환의 치료제나 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)에 대한 세포독성을 확인한 MTT 어세이 실험 결과를 나타낸다.
도 2는 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2)의 Nrf2(nuclear factor-E2-related factor 2) 활성을 나타내는 것이다.
도 2A는 3~100μM의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인하여 핵으로 이동한 Nrf2 단백질과 세포질에 남은 Nrf2 단백질을 웨스턴 블롯으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2B는 3~100μM의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인하여 핵으로 이동한 Nrf2 단백질과 세포질에 남은 Nrf2 단백질을 형광면역염색으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 2C는 3~30μM의 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2) 처리로 인해 핵으로 이동한 Nrf2 단백질과 세포질에 남은 Nrf2 단백질을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2)의 HO-1(heme oxygenase-1) 활성을 나타내는 것으로서, 도 3A 및 도 3B는 각각 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인한 HO-1 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 농도 또는 시간 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 3C와 도 3D는 각각 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인한 HO-1 RNA 발현을 RT-PCR을 이용하여 농도 또는 시간 의존적으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 3E는 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2) 처리로 인한 HO-1 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 4는 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인한 염증관련 인자인 NO(도 4A), IL-6(도 4B), PGE₂(도 4C)의 발현을 그리스 반응법과 ELISA를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 5는 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)의 염증성 사이토카인 억제활성을 나타내는 것이다. 도 5A 내지 도 5C는 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인한 염증관련 인자인 iNOS(도 5A), COX-2(도 5B), IL-6(도 5C)의 발현을 리얼-타임 PCR을 이용하여 확인한 결과를 나타내며, 도 5D는 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인한 iNOS와 COX-2의 단백질 발현을 웨스턴 블롯을 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 LPS 처리된 마우스에 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 투여시 확인되는 마우스의 생존율을 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 수수 추출물의 제조, 각 화합물의 분리 정제>

카페오일글리콜산 메틸 에스테르(caffeoylglycolic acid methyl ester, CGME) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-caffeoylglycerol)은 수수(Sorghum bicolor (L.) Moench var. hwanggeumchal)로부터 분리 정제되었다.

수수 70kg을 95% 에탄올을 이용하여 상온에서 3회 추출하고 농축하여 수수 에탄올 추출물 약 2.1kg을 얻었다. 에탄올 추출물을 다시 5ℓ의 증류수로 현탁한 후 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올로 순차적으로 분획하여 에틸아세테이트 추출물 10g을 얻은 후 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여(컬럼크기: 5×60cm; 실리카 입자 크기: 63~200μm, 용매 조건: 농도 구배 조건[디클로로메탄:MeOH=100:1[v/v] → 0:1]) 총 10개의 분획으로 나누었다. 이렇게 하여 얻은 분획 중 분획 7를 다음의 조건에서 고성능 액체 크로마토그래피를 실시하여 정체시간(retention time) 56.1분에서 화합물 1(115㎎)을 얻었다. 화합물 1을 얻기 위한 고성능 액체 크로마토그래피 조건은 RS Tech OptimaPak C18 컬럼(컬럼크기:10×250㎜, 입자크기:5μm)을 사용하였고 이동상으로는 0.1% 포름산(formic acid)이 포함된 물과 메탄올(0-30min:35%[v/v] 메탄올, 30-35min:35-100%[v/v] 메탄올, 35-40min:100% 메탄올)을 사용하였다. 화합물 2는 분획 6을 다음의 조건에서 고성능 액체 크로마토그래피를 실시하여 정체시간 33.8분에서 화합물 2(100㎎)를 얻었다. 화합물 2를 얻기 위한 고성능 액체 크로마토그래피조건은 RS Tech OptimaPak C18 컬럼(컬럼크기:10×250㎜, 입자크기: 5μm)을 사용하였고 이동상으로는 0.1% 포름산이 포함된 물과 메탄올(0-40min:40%[v/v] 메탄올, 40-55min:40-100%[v/v] 메탄올, 45-60min:100% 메탄올)을 사용하였다.

<실시예 2. 각 화합물의 분리 및 물리 화학적 성질 확인>

실시예 1에서 분리된 화합물들의 물리화학적 성질은 하기와 같다.

실시예 2-1. 카페오일글리콜산 메틸 에스테르 (화합물 1)

caffeoylglycolic acid methyl ester;

white amorphous powder;

C₁₂H₁₂O₆;

[M]⁺ peak at m/z 252;

¹H-NMR (Methanol-d ₄, 400 MHz) δ 7.61 (1H, d, H-7), 7.06 (1H, d, H-2), 6.95 (1H, dd, H-6), 6.78 (1H, d, H-5), 6.32 (1H, d, H-8), 4.72 (2H, s, H-10), 3.75 (-OCH₃).

¹³C-NMR (Methanol-d ₄, 100 MHz) δ 170.6 (11-COO-), 168.5 (9-COO-), 150.0 (C-4), 148.2 (C-7), 147.0 (C-3), 127.7 (C-1), 123.3 (C-6), 116.7 (C-5), 115.4 (C-2), 114.1 (C-8), 61.7 (C-10), 52.8 (-OCH₃).

실시예 2-2. 1-O-카페오일글리세롤 (화합물 2)

1-O-caffeoylglycerol;

Brown amorphous powder;

C₁₂H₁₄O₆;

[M]⁺ peak at m/z 254;

¹H-NMR (Methanol-d ₄, 400 MHz) δ 7.05 (1H, br. br, s, H-2), 6.78 (1H, d, H-5), 6.95 (1H, br, d, H-6), 7.58 (1H, d, H-7), 6.29 (1H, d, H-8), 4.16 and 4.26 (2H, m, H-1'), 3.90 (1H, m, H-2'), 3.60 and 3.61 (2H, m, H-3').

¹³C-NMR (Methanol-d ₄, 100 MHz) δ 127.9 (C-1), 115.3 (C-2), 146.9 (C-3), 149.5 (C-4), 115.0 (C-5), 123.1 (C-6), 147.2 (C-7), 116.3 (C-8), 16.94 (C-9), 66.7 (C-1'), 71.4 (C-2'), 64.2 (C-3').

<실시예 3. 세포배양>

대식세포주인 RAW264.7을 ATTC(American Type Culture Collection, Manssas, VA, USA)로부터 구입하여, 페니실린(100units/㎖)-스트렙토마이신(100㎍/㎖)과, FBS(heat-inactivated fetal bovine serum)가 10%(v/v) 포함된 DMEM(Dulbecco' Modified Essential Medium)을 이용하여 5% CO₂, 37℃ 조건에서 배양 유지하였다.

<실시예 4. 세포독성 확인>

세포 생존율은 MTT 어세이 방법을 이용하여 확인하였다. *MTT:3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. RAW264.7을 96웰 플레이트에 웰당 5×10⁵개로 분주한 후, 24시간 후 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2)을 최종농도가 3~100μM이 되도록 RAW264.7에 처리하였다. 48시간 후, 100㎕의 1㎎/㎖ MTT 용액을 세포에 더하여 4시간 동안 반응시켰다. 이 후 DMSO(dimethyl sulfoxide) 150㎕를 더하여, 세포 내에 생성된 포마잔염(formazan salt)을 용해시킨 후, 이 포마잔의 양을 Microplate reader(Tecan Austria GmbH, Austria)를 이용하여 540nm에서 측정하였다. 측정 결과 본 발명의 화합물들은 모두 3~100μM의 농도에서 세포독성이 없는 것으로 확인되었으며, 이 중에서 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)에 관한 결과를 도 1에 나타내었다.

<실시예 5. Nrf2 활성화 확인>

RAW264.7이 60㎜ 세포배양 플레이트에 70~90% 정도 차도록 배양한 후, 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2)을 최종농도가 3~100μM이 되도록 RAW264.7에 2시간 동안 처리하였다. 이후 세포를 회수한 후 NE-PER 핵과세포질 추출 키트(NE-PER nuclear and cytoplasmic extraction kit, Thermo Fischer Scientific, Rockford, USA)를 이용하여 핵추출물과 세포질 추출물을 얻은 후 각각 동량으로 SDS-PAGE 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 통해 각각의 크기별로 분리한 후, Hybond-P 멤브레인(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인들은 25℃ 실온에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹한 후 2시간 동안 각 해당 1차 항체와 반응시켰다. 이 후 1차 항체를 세척하고 해당 2차 항체를 반응시킨 후 각 단백질의 함량을 확인하였다(enhanced chemiluminescence system 이용, Intron, Seongnam, Korea). PARP(Poly ADP-ribose polymerase)는 핵 마커로, GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)는 각각 세포질 마커로 사용하였다.

또한 Nrf2의 활성화를 한 번 더 확인하기 위하여 면역염색 후 공초점 현미경을 통하여 Nrf2가 핵으로 이동했는지를 확인하였다. RAW264.7을 커버슬립(coverslip)에 배양한 후 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)를 30μM의 농도로 RAW264.7에 2시간 동안 처리한 후 4% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)로 세포를 고정하고, 0.5% 트리톤 X-100(Triton X-100)을 처리하였다. 이 후 1% 염소 혈청에 30분간 반응시키고 세척하여 Nrf2 항체로 염색을 실시하였다. 이후 AlexaFlour 546로 표지된 2차 항체를 반응시킨 후 공초점 현미경 (OLYMPUS FV1000, Olympus)을 이용하여 Nrf2의 위치를 확인하였다. 이 때 핵의 위치를 확인하기 위하여 2차 항체 염색을 수행한 후 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 처리하였다. 상기 실험결과들은 도 2에 나타내었다.

도 2A를 참고하면 3~100μM의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인해 Nrf2의 핵으로의 이동이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있다. 도 2B에서는 30μM의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인해 Nrf2가 핵으로 이동하는 것을 확인할 수 있다(Veh는 화합물 무처리군). 또한 도 2C를 통해 Nrf2의 핵으로의 이동이 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2)의 농도 의존적(3~30μM)으로 증가하는 것을 알 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물들이 Nrf2를 활성화하는 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.

<실시예 6. HO-1의 발현량 확인>

RAW264.7이 60㎜ 세포배양 플레이트에 70~90% 정도 차도록 배양한 후, 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 및 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2)을 최종농도가 3~100μM이 되도록 RAW264.7에 3~24시간 동안 처리하였다. 단, 시간 의존 실험의 화합물 처리 농도는 30μM, 농도 의존 실험의 화합물 처리 시간은 6시간으로 하였다. 또한 본 발명의 화합물에 의한 HO-1의 발현이 Nrf2 의존적임을 확인하기 위하여 RAW264.7이 60㎜ 세포배양 플레이트에 70~90% 정도 차도록 배양한 후, OriGene Technologies(Rockville, MD, USA)사로부터 구입한 생쥐의 Nrf2 siRNA(small interfering RNA)를 Fugene HD(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 형질전환 한 후 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)를 최종농도가 30μM이 되도록 6시간 동안 처리하였다.

HO-1(heme oxygenase-1)의 단백질 발현량은 총 단백질 추출 후, 웨스턴 블롯 분석법(Western blot analysis)을 이용하여 확인하였다. 이를 위해 상기 조건으로 화합물이 처리되어 배양된 세포를 세포용해버퍼에 녹여 단백질 정량분석을 위한 총 세포 용해물을 얻었다(이 세포 용해물은 실시예 8의 웨스턴 블롯 수행에도 이용됨). *세포용해버퍼의 조성 : 50mM Tris-HCl (pH 7.5), 1% Nonidet P-40, 1mM EDTA, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10㎍/㎖ pepstatin A, 10㎍/㎖aprotinin, 2mM benzamidine, 50mM NaF, 5mM sodium orthovanadate, 150 mM NaCl.

이렇게 얻은 각각의 총 세포 용해물을 단백질 정량한 후, 같은 단백질 함량으로 SDS-PAGE 겔(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)에 주입하여 전기영동(electrophoresis)함으로써 크기별로 분리한 후, Hybond-P 멤브레인(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인들은 25℃ 실온에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹한 후 2시간 동안 각 해당 1차 항체와 반응시켰다. 이 후 1차 항체를 세척하고 2차 항체를 반응시킨 후 각 단백질의 함량을 확인하였다(enhanced chemiluminescence system 이용, Intron, Seongnam, Korea).

HO-1의 RNA 발현량은 총 RNA 추출 후, RT-PCR을 이용하여 확인하였다.

이를 위해 상기 조건으로 화합물이 처리되어 배양된 세포를 수집하여 총 RNA를 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Santa Clarita, CA, USA)을 사용하여 추출하였고, 1㎍의 총 RNA와 RT-PCR 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 cDNA를 합성하였다(이 cDNA는 실시예 8의 리얼-타임 PCR의 수행에도 이용됨).

각 유전자 증폭을 위한 프라이머의 DNA 염기서열은 하기와 같다.

HO-1 sense : 5'-CGC AAC AAG CAG AAC CCA-3'

HO-1 antisense : 5'-TGA CGC CAT CTG TGA GGG-3'

β-actin sense : 5'-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3'

β-actin antisense : 5'-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3'

RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction) 증폭조건은 94℃에서 5분 동안 1사이클 반응 후, 94℃에서 1분, 56℃에서 30초, 72℃에서 1분 조건으로 27사이클을 반복하여 수행하였다.

상기 실험결과들은 도 3에 나타내었는데, 도 3A를 참고하면 3~100μM의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인해 HO-1 단백질 발현이 농도 의존적으로 발현하는 것을 확인할 수 있다. 도 3B를 참고하면 30μM의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인해 HO-1 단백질 발현이 시간 의존적으로 발현하는 것을 알 수 있다. 도 3C와 도 3D에서도 각각 3~100μM의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인해 HO-1의 RNA 발현이 농도 및 시간 의존적으로 발현하는 것을 확인할 수 있다. 도 3E를 통해 3~100μM의 1-O-카페오일글리세롤(1-O-CG, 화합물 2) 처리로 인해서도 HO-1 단백질 발현이 농도 의존적으로 발현하는 것을 나타낸다. 도 3F를 통해 siRNA을 이용하여 Nrf2의 발현을 억제하면 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)의 HO-1의 유도활성이 소실됨을 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 화합물들이 실시예 5에서 확인한 Nrf2의 활성화를 통해 HO-1의 발현을 유도함을 알 수 있다.

< 실시예 7. NO , IL -6 및 PGE ₂ 의 발현>

RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 5×10⁵세포/웰로 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 화합물 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)를 최종농도가 3~100μM이 되도록 RAW264.7에 30분간 전반응시킨 다음 24시간 동안 1㎍/㎖의 LPS를 처리하고 세포배양액에 분비된 NO의 생성량은 그리스 반응법(Griess reaction)을 통해 측정하였다. 각 NO의 함량은 아질산나트륨(sodium nitrite)을 이용하여 작성한 표준곡선을 통해 확인하였다. 그리스 반응법은 세포 배양액 100㎕에 그리스 시약 A(0.1% N-(1-Napthyl) Ethylenediamine dihydrochloride)와 그리스 시약 B(5% H₃PO₄에 1% Sulfanilic Acid)를 동량으로 혼합한 액을 100㎕ 가하고 잘 혼합한 후 ELISA 분석기를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

IL-6의 발현량은 BioLegend의 ELISA 키트(San Diego, CA, USA), PGE₂의 발현은 R&D 시스템의 ELISA 키트(Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 확인하였다.

이에 대한 결과는 도 4에 나타내었는데, 도 4를 참고하면, 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인해 염증관련 인자인 NO(도 4A의 Nitrite 함량으로 확인), IL-6(도 4B), PGE₂(도 4C)의 발현이 농도 의존적으로 현저하게 저하됨을 알 수 있다.

한편, 상기 도 4를 통해 확인된 본 발명의 화합물 1 및 2의 NO, IL-6, PGE₂의 IC₅₀(the half maximal inhibitory concentration)은 30μM(약 7.2~7.3㎍/㎖) 보다 약간 낮음을 알 수 있는데, 실시예 1에서 제조한 수수 에탄올 추출물의 IC₅₀은 100~200㎍/㎖인 것으로 나타나(도 4에 나타내지는 않음) 본 발명의 화합물 1 및 2의 활성이 수수 추출물에 비해 현저하게 우수함을 알 수 있다.

< 실시예 8. iNOS , COX -2, IL -6의 발현 확인>

실시예 6에서 합성한 cDNA를 이용하여 iNOS, COX-2, IL-6에 대한 리얼-타임 PCR(real-time quantitative PCR)을 TOPreal qPCR 2X PreMIX(SYBR Green, Enzynomics. Daejon, Korea)와 Rotor-Gene Q real-time PCR cycler(Qiagen)를 이용하여 수행하였다.

리얼-타임 PCR에서 각 유전자 증폭을 위한 프라이머의 DNA 염기서열은 하기와 같다.

iNOS sense : 5'-GGC AAA CCC AAG GTC TAC GTT-3'

iNOS antisense : 5'-TCG CTC AAG TTC AGC TTG GT-3'

COX-2 sense : 5'-TGA GTA CCG CAA ACG CTT CT-3'

COX-2 antisense : 5'-CTC CCC AAA GAT AGC ATC TGG-3'

IL-6 sense : 5'-TCC ATC CAG TTG CCT TCT TGG-3'

IL-6 antisense : 5'-CCA CGA TTT CCC AGA GAA CAT G-3'

β-actin sense : 5'-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TCA AAG-3'

β-actin antisense : 5'-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3'

리얼-타임 qPCR 증폭조건은 95℃에서 10분 동안 1사이클 반응 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 20초 조건으로 40사이클을 반복하여 수행하였으며 유전자 증폭량은 2-ΔΔCt 방법으로 분석하였다.

상기 결과는 도 5A 내지 도 5C에 나타내었는데, 도 5A 내지 도 5C를 참고하면, 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1) 처리로 인해 염증관련 인자인 iNOS(도 5A), COX-2(도 5B), IL-6(도 5C)의 발현이 농도 의존적으로 현저하게 저하됨을 알 수 있다.

또한, 실시예 6에서 얻은 총 세포 용해물을 이용하여 iNOS와 COX-2에 대한 웨스턴 블롯을 수행한 바, 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)가 농도 의존적으로 iNOS와 COX-2의 발현을 억제함을 알 수 있다(도 5D 참조).

한편, 상기 도 5를 통해 확인된 본 발명의 화합물 1 및 2의 iNOS, COX-2, IL-6의 IC₅₀(the half maximal inhibitory concentration)은 30μM(약 7.2~7.3㎍/㎖)인 것으로 나타나는데, 실시예 1에서 제조한 수수 에탄올 추출물의 IC₅₀은 100~200㎍/㎖인 것으로 나타나(도 5에 나타내지는 않음) 본 발명의 화합물 1 및 2의 활성이 수수 추출물에 비해 현저하게 우수함을 알 수 있다.

<실시예 8. LPS 처리된 마우스의 생존율 확인>

수컷 C57BL/6 마우스(20~22g)의 복강 내로 LPS(40mg/kg)를 주사하기 1시간 전에 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)(용매:dimethyl sulfoxide:chremophore-EL:PBS=1:1:8[v:v:v])를 50㎎/kg 및 20㎎/kg의 농도로 주사한 후, 5일 동안 각 마우스의 생존을 확인하여 도 6에 나타내었다.

도 6을 참고하면, 5일 후에 LPS 단독 처리군(8마리, Vehicle)의 마우스는 20%만이 생존하는 것으로 확인되나, LPS와 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(CGME, 화합물 1)가 함께 처리된 군의 마우스(각 그룹당 8마리)는 거의 대부분 생존하는 것으로 확인된다(도 6에는 나타내지 않았으나, LPS와 화합물을 모두 처리하지 않은 군은 모두 생존하였음).

<실시예 9. 독성실험>

실시예 9-1. 급성독성

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군과 실험군에 각각 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 PEG-400:tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v) 만을 투여하고, 실험군은 본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 상기 PEG-400:tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)에 녹여 각각 경구투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2g/㎏/day 농도의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 투여한 실험군에서 마우스가 모두 생존하는 것으로 확인되었다.

실시예 9-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 각 농도로 8주 동안 C57BL/6J 마우스(각 군당 10마리)에 투여하여 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 투여한 실험군과 PEG-400:tween-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 모든 조직에서 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르) 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르) 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르)을 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르) 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

본 발명의 화합물 1(카페오일글리콜산 메틸 에스테르) 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(caffeoylglycolic acid methyl ester, 화합물 1)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 전사인자 Nrf2의 유도를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)을 활성화하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 상기 조성물에 0.001~30 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1의 카페오일글리콜산 메틸 에스테르(caffeoylglycolic acid methyl ester, 화합물 1)를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
제5항에 있어서,
상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제5항에 있어서,
상기 화합물은 상기 건강기능식품에 0.001~30 중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.