KR101646916B1 - 베타-카르볼린 알칼로이드 화합물을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 화합물을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산은 전사인자인 Nrf2의 활성화를 통해 HO-1(heme oxgenase-1)의 발현을 증가시켜 염증성 사이토카인 및 각종 염증 인자의 발현을 억제함으로써, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혀로간 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질호나, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 신장염 등과 같은 각종 질환의 치료제나 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

베타-카르볼린 알칼로이드 화합물을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {Composition comprising β-carboline alkaloid for treating or preventing of inflammatory disease}
본 발명은 통캇 알리 플러스로부터 분리한 베타-카르볼린 알칼로이드 화합물을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
염증 반응(inflammation)은 비염 및 기관지염, 간염, 관절염 등 다양한 질환의 원인으로 인간의 건강과 밀접한 관련을 가지고 있다. 특히 평균 수명의 연장으로 인한 인구의 노령화로 그 문제가 심각한 퇴행성질환의 경우, 그 병태 생리가 염증 ·면역 반응과 밀접한 관계가 있다는 연구보고들이 증가하고 있어 염증 반응의 기전 및 역할에 대한 관심이 급격하게 증가하고 있으며, 염증 치료를 위한 치료제 개발에도 관심이 증가하고 있다.
염증 반응은 상처, 미생물 감염 등에 대항하는 숙주의 방어기제에 따른 병리학적인 기작 중 가장 중요한 반응이지만 지속적이고 과도한 염증반응은 조직을 손상시키게 된다. 대식세포는 이러한 염증 반응을 조절하는 가장 대표적인 면역세포로서, 활성화된 대식세포는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-6(interleukin-6), PGE2(prostaglandin E2), NO(nitric oxide), ROS(reactive oxygen species) 등과 같은 다양한 염증성 매개체를 분비한다(Laskin, D. L. et al., 2011). 한편, 이러한 염증성 매개체의 과발현은 류마티스 관절염, 골다공증, 패혈증, 혈관 질환, 암 등을 유도한다(Lawrence, T. et al., 2002).
HO(heme oxygenase)는 헴(heme) 단백질의 산화를 유도하여 일산화탄소, 빌리베르딘(biliverdin), 산화철(ferrous iron) 등을 생성하는 단백질로서, 2개의 타입이 있는데, HO-2는 대부분의 세포에서 항상 발현을 하는 것으로 알려져 있지만, HO-1은 면역성 사이토카인, 산화 스트레스 관련 인자 등의 자극으로 인해 발현이 유도되는 것으로 알려져 있다(Maines, M. D. et al., 2001). 또한 HO-1은 세포의 항상성을 유지하고, 조직 내의 산화적 스트레스와 염증 반응을 줄이는 역할을 한다(Morse, D. et al., 2009; Paine, A. et al., 2010). 이러한 HO-1의 보호 활성은 항산화성, 항염증성, 항아폽토시스성, 항유사분열촉진성에 대한 가능성 등이 있는 빌리루빈, 일산화탄소 등의 부산물에 의해 매개가 되어 유발되는 것으로 여겨진다(Otterbein, L. E. et al., 1999; Ryter, S. W. et al., 2006). HO-1의 발현이나 일산화탄소의 치료는 대식세포의 활성으로 유도된 염증성 매개체로 인해 유도된 사이토카인이나 케모카인의 생성을 억제하는 것으로 확인된 바 있다(Morse, D. et al., 2003; Suh, G. Y. et al., 2006; Nakahira, K. et al., 2006; Wang, X. M. et al., 2009).
면역성 사이토카인, 산화 스트레스 관련 인자에 의한 HO-1의 발현은 PI3K/AKT(phosphoinositide 3-kinase/AKT)와 JNK(c-Jun N-terminal kinase), ERK1/2(extracellular signal regulated kinase-1/2), p38 키나아제(p38 kinase) 등의 MAPK(mitogen-activated protein kinase)를 통한 전사 레벨(transcriptional level)에서 주로 조절되며(Abraham, N. G. et al., 2008; Morse, D. et al., 45-6, 2009), 이를 조절하는 주된 전사 인자는 Nrf 2(nuclear factor erythroid 2-related facor)이다(Maines, M. D. et al., 2001).
Nrf2는 세포에서 HO-1, NQO1(NAD(P)H quinone oxidoreductase 1), GCLC(glutamate cysteine ligase, catalytic subunit) 등과 같이 항산화 기능을 갖는 유전자들의 발현을 조절하여 항산화 반응을 조절하는 대표적인 조절인자이다(Jaramillo, M. C. et al., 2013). 일반적인 상태에서는 Nrf2가 Keap1(Kelch-like ECH associated protein 1) 단백질과 결합하여 활성화가 저해되나, 산화적 스트레스(oxidative stress) 조건에서는 Keap1 단백질이 분해됨으로써 Nrf2가 안정화 되고, 이 Nrf2가 핵으로 들어가 전사인자로서 작용하여 NQO1, HO-1, GCLC 등과 같은 항산화 유전자들의 발현이 증가된다(Jaramillo, M. C. et al., 2013). 한편 Nrf2는 산화적 스트레스로 인해 활성화되는 PI3K/AKT, JNK, ERK1/2, p38 키나아제 등의 MAPK에 의해 인산화됨으로써 안정화되어 활성화되기도 한다(Boutten, A. et al., 2011).
Nrf2의 활성화가 세포의 HO-1 등의 항산화 효소를 유도하여 항산화 반응을 유도함으로써 당뇨, 심혈관계 질환, 염증성 질환, 폐질환, 노화, 암, 퇴행성 신경질환의 예방 및 치료 효과를 유도하는 것으로 알려져 있어, Nrf2는 의약품 개발의 중요한 표적이 될 수 있다(Alfieri, A. et al., 2008; Lau, A. et al., 2008; Mann, G. E. et al., 2009; Boutten, A. et al., 2011; Chapple, S. J. et al., 2012).
따라서, 천연물을 이용한 Nrf2나 HO-1의 활용 방법이 당뇨, 퇴행성 뇌질환, 심혈관계 질환 및 염증성 질환 등을 예방하거나 치료하는 데 있어서 중요한 타겟이 되고 있다(Motterlini, R. et al., 2014; Alfieri, A. et al., 2008; Lau, A. et al., 2008; Mann, G. E. et al., 2009; Boutten et al., 2011; Chapple et al., 2012).
통캇 알리 플러스(Eurycoma longifolia)는 소태나무과(simaroubaceae) 식물로, 동남아시아 나라들이 약용 허브로 주로 사용하고 있다. 통캇 알리 플러스의 추출물은 말라리아, 이질, 임파선 증대 및 성기능 장애와 같은 다양한 질병에 대한 전통적인 약물로 사용되고 있다(Bhat, R. et al., 2010). 통캇 알리 플러스로부터 분리한 콰씨노이드(quassinoids), 칸틴-6-원(canthin-6-one) 및 베타-카르볼린 알칼로이드(β-carboline alkaloids)와 같은 화합물들은 항말라리아, 항궤양, 항암, 항당뇨 뿐만 아니라 정력제와 같은 활성을 지니고 있다(Bhat, R. et al., 2010)는 것이 밝혀졌지만, 항염증 활성에 관한 연구 결과는 2014년에 처음으로 개시되었다(Tran, T. V. et al., 2014).
한편, 한국공개특허 제2001-0037653호에서는 베타-카르볼린 유도체가 항염증제 조성물로 사용가능하며, 염증에 대한 효과가 매우 높다는 것을 개시하고 있다. 한국공개특허 제2006-0006031호에서는 베타-카르볼린 화합물이 Ikk-2가 매개된 질환(예를 들명 염증성 질환 및 암)을 치료하는데 유용한 Ikk-2 억제제임을 개시하고 있다.
이에 본 발명자는 통캇 알리 플러스로부터 새로운 베타-카르볼린 알칼로이드 화합물을 분리하고, 염증 반응과 관련하여 새로운 베타-카르볼린 알칼로이드 화합물이 항염증 활성을 가지고 있다는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
한국공개특허 제2001-0037653호, 베타-카르볼린유도체를 포함하는 항염증제 조성물, 2001년 5월 15일 공개. 한국공개특허 제2006-0006031호, 염증 질환 치료에 유용한 베타-카르볼린, 2006년 1월 18일 공개.
Alfieri, A. et al., Targeting the Nrf2-Keap1 antioxidant defense pathway for neurovascular protection in stroke, J. Physiol., 589, 4125-4136, 2008. Abraham, N. G. et al., Pharmacological and clinical aspects heme oxygenase, Pharmcol. Rev., 60, 79-127, 2008. Bhat, R. et al., Tongkat Ali(Eurycoma longifolia Jack): a review on its ethnobotany and pharmacological improtant, Fitoterapia, 81, 669-679, 2010. Boutten, A. et al., NRF2 targeting: a promising therapeutic strategy in chronic obstructive pulmonary disease. Trends Mol Med., 17, 363-371, 2011. Chapple, S. J. et al., Crosstalk between Nrf2 and the proteasome: therapeutic potential of Nrf2 inducers in vascular disease and aging. Int J Biochem Cell Biol., 44, 1315-1320, 2012. Jaramillo, M. C. et al., The emerging role of the Nrf2-Keap1 signaling pathway in cancer, Genes Dev., 27, 2179-2191, 2013. Laskin, D. L. et al., Macrophages and tissue injury: agents of defense or destruction?, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 51, 267-288, 2011. Lau, A. et al., Dual roles of Nrf2 in cancer, Pharmacol. Res., 58, 262-270, 2008. Lawrence, T. et al., Anti-inflammatory lipid mediators and insights into the resolution of inflammation, Nat. Rev. Immunol., 2, 787-795, 2002. Maines, M. D. et al., The heme oxygenase system and cellular defense mechanisms. Do HO-1 and HO-2 have different functions?, Adv. Exp. Med. Biol., 502, 249-272, 2001. Mann, G. E. et al., Targeting the redox sensitive Nrf2-Keap1 defense pathway in cardiovascular disease: protection afforded by dietary isoflavones, Curr. Opin. Pharmacol., 9, 139-145, 2009. Morse, D. et al., Suppression of inflammatory cytokine production by carbon monoxide involves the JNK pathway and AP-1, J. Biol. Chem., 278, 36993-36998, 2003. Morse, D. et al., Heme oxygenase-1, a critical arbitrator of cell death pathways in lung injury and disease, Free Radic. Biol. Med., 47, 1-12, 2009. Motterlini, R. et al., Heme oxygenase-1 as a target for drug discovery, Antioxid. Redox. Signal., 20, 1810-1826, 2014. Nakahira, K. et al., Carbon monoxide differentially inhibits TLR signaling pathways by regulating ROS-induced trafficking of TLRs to lipid rafts, J. Exp. Med., 203, 2377-2389, 2006. Otterbein, L. E. et al., Carbon monoxide provides protection against hyperoxic lung injury, Am. J. Physiol., 276, L688-L694, 1999. Paine, A. et al., Immenschuh, Signaling to heme oxygenase-1 and its anti-inflammatory therapeutic potential, Biochem. Pharmacol., 80, 1895-1903, 2010. Ryter, S. W. et al., Heme oxygenase-1/carbon monoxide: from basic science to therapeutic applications, Physiol. Rev., 86, 583-650, 2006. Suh, G. Y. et al., CCAAT/enhancer-binding protein mediates carbon monoxide-induced suppression of cyclooxygenase-2, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 35, 220-226, 2006. Tran, T. V. et al., NF-κB inhibitors from Eurycoma longifolia, J. Nat. Prod., 77, 483-488, 2014. Wang, X. M. et al., The heme oxygenase-1/carbon monoxide pathway suppresses TLR4 signaling by regulating the interaction of TLR4 with caveolin-1, J. Immunol., 182, 3809-3818, 2009.
본 발명의 목적은 통캇 알리 플러스(Eurycoma longifolia)로부터 분리한 베타-카르볼린 알칼로이드 화합물을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산(7-MCPA)을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
Figure 112015067403392-pat00001
상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 조성물은 전사인자 Nrf2의 활성화를 유도를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 증가시킬 수 있다. 상기 화합물은 상기 조성물에 0.001 내지 50중량%로 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올음료, 껌, 차 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 또한, 상기의 화합물은 상기 건강기능식품에 0.001 내지 50중량%로 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화학구조를 갖는 신규 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 제공한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산은 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조 될 수도 있으며, 또는 통캇 알리 플러스 추출물로부터 분리, 정제될 수 있다. 상기 통캇 알리 플러스 추출물은 통캇 알리 플러스의 뿌리에 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있다. 상기 C1 내지 C4 알코올은 메탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 통캇 알리 플러스로부터 분리된 화합물은 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), HP-20 컬럼 크로마토그래피(HP-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피 (High-performance liquid chromatography) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 및 약제학적 부형제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 상기 화합물은 전체 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 40중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 30중량%로 하여 첨가될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨,자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
상기 화합물은 전체 식품 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.001 내지 50중량%, 더 바람직하게는 0.001 내지 30중량%, 가장 바람직하게는 0.001 내지 10중량%로 하여 첨가될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 화합물을 함유하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 화합물은 Nrf2의 활성화를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 증가시켜 염증성 사이토카인 및 각종 염증 인자의 발현을 억제함으로써, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증, 신장염 등과 같은 각종 질환의 치료제나 건강기능식품으로서 용이하게 이용될 수 있다.
도 1은 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 인한 염증 관련 인자인 NO(도 1A), PGE2(도 1B), IL-6(도 1C)의 발현을 그리스 반응법과 ELISA 키트를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 2는 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 대한 세포의 생존율을 확인한 MTT 어세이 실험 결과를 나타낸다.
도 3은 LPS 처리된 마우스에 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 투여 시 확인되는 마우스의 생존율을 나타낸다.
도 4는 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 인한 염증 관련 인자인 iNOS(도 4A), COX-2(도 4B), IL-6(도 4C)의 발현을 리얼-타임 정량 PCR을 이용하여 확인한 결과이다.
도 5는 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리에 의한 Nrf2의 발현 및 Nrf2의 표적 유전자의 변화를 나타내는 것이다. 도 5A는 3 내지 30μM의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 인하여 핵과 세포질에 존재하는 Nrf2 단백질을 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 5B 내지 도5D는 3 내지 30μM의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 인하여 Nrf2의 표적 유전자인 HO-1(도 5B), NQO1(도 5C), GCLC(도 5D)의 RNA 발현을 확인한 결과를 나타낸다.
도 6은 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리에 따른 활성산소의 발현 변화를 나타내는 것이다.
도 7은 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 처리한 세포에 MAPKs의 억제제들을 처리하여 Nrf2의 발현 및 핵 내 이동 활성을 나타내는 것이다. 도 7A는 핵 내 Nrf2의 발현 변화를 나타내는 것이다. 도 7B는 Nrf2의 핵 내 이동을 나타내는 것이다.
도 8은 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 HO-1의 발현 및 Nrf2 매개 HO-1의 발현을 나타내는 것이다. 도 8A는 1 내지 30μM의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 인하여 HO-1의 단백질 발현 변화를 웨스턴 블랏으로 확인한 결과를 나타낸다. 도 8B Nrf2의 siRNA를 이용하여 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의한 HO-1의 발현이 Nrf2 매개에 의한 것임을 나타내는 것이다.
도 9는 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의해 발현 되는 염증 관련 인자들인 NO, PGE2, IL-6의 발현이 HO-1에 의해 매개 되는 것을 나타내는 것이다. 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산과 HO-1 특이적 억제제의 동시 처리에 인한 염증 관련 인자인 NO(도 9A), PGE2(도 9B), IL-6(도 9C)의 발현을 그리스 반응법과 ELISA 키트를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리에 의한 NF-κB의 활성을 루시페라아제 활성 측정 키트를 이용하여 확인한 결과를 나타낸다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 통캇 알리 플러스 추출물의 제조 및 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-( E )-2-프로페노익산 화합물의 분리>
7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산은 통캇 알리 플러스의 배양된 가는 뿌리로부터 분리, 정제되었다.
건조된 뿌리 90g에 500㎖의 메탄올을 넣고 초음파 배스(sonic bath)에 처리하는 것을 3회 반복 수행하여 추출물을 얻었다. 얻은 추출물을 농축하여 13.5g의 조추출물을 얻었고, 이를 500㎖의 10% 염화수소와 500㎖의 에틸아세테이트를 이용해 2개의 층으로 분획한 후, 유기층은 제거하고 남은 산성 용액에 1N 수산화나트륨을 넣어 pH가 10이 되도록 하였다. pH를 10으로 맞춘 용액에 에틸아세테이트 300㎖을 처리하여 재분획하는 것을 3회 반복하여 알칼로이드 추출물 651㎎을 얻었다. 알칼로이드 추출물을 가지고 디클로로메탄:메탄올(25:1[v/v])의 등용매 용출조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼 크기: 5×60㎝)로 분획하여 12개의 분획물(F1-F12)을 얻었다. 상기 분획물 중에서 F12(85㎎)를 디클로로메탄:메탄올(20:1[v/v])의 등용매 용출조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼 크기: 2×30㎝)로 분리하여 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 화합물(29.6㎎)을 얻었다.
< 실시예 2. 7- 메톡시 -(9H-베타- 카르볼린 -1-일)-( E )-2- 프로페노익산 화합물의 물리 화학적 구조 확인>
7-Methoxy-(9H-β-carbolin-1-il)-(E)-2-propenoicacid;
노란 비정형 분말;
HR-ESI-MS m/z 269.0929[M+H]+ (calcd, 269.0926 for C15H13N2O3);
1H NMR (500MHz, DMSO-d 6): δ 3.90 (3H, s, 7-OCH 3), 6.13 (1H, d, J=13.0Hz, H-2′), 6.95 (1H, dd, J=2.0, 9.0Hz, H-6), 7.04 (1H, d, J= 2.0Hz, H-8), 7.56 (1H, d, J=13.0Hz, H-1′), 8.19 (1H, d, J=9.0Hz, H-5), 8.24 (1H, d, J=5.5Hz, H-4), 8.37 (1H, d, J=5.5Hz, H-3), 12.4 (1H, br s, NH);
13C NMR (125MHz, DMSO-d 6): δ 133.3 (C-1), 133.7 (C-3), 115.8 (C-4), 123.5 (C-5), 110.8 (C-6), 161.7 (C-7), 94.6 (C-8), 143.5 (C-9), 113.7 (C-10), 131.8 (C-11), 134.8 (C-12), 128.9 (C-1′), 129.1 (C-2′), 166.8 (C-3′), 55.5 (7-OCH3).
< 실시예 3. 세포 배양>
대식세포주인 RAW264.7을 ATCC(American Type Culture Collection, Manassa, VA, USA)로부터 구입하여, 페니실린 (100units/㎖)-스트렙토마이신(100㎍/㎖) 및 FBS(heat-inactivated fetal bovine serum)가 10%(v/v) 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Essential Medium)을 이용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양 유지하였다.
<실시예 4. NO, PGE 2 및 IL-6의 발현 확인>
RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 웰 당 5×105개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 1 내지 30μM이 되도록 RAW264.7 세포에 처리하여 30분간 전반응 시킨 다음 24시간 동안 1㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하고 배양하였다. 세포 배양액에 분비된 NO의 생성량은 그리스 반응법(Griess reaction)을 통해 측정하였다. 각 NO의 함량은 아질산나트륨(sodium nitrite)을 이용하여 작성한 표준곡선을 통해 확인하였다. 그리스 반응법은 세포 배양액 100㎕에 그리스 시약 A(0.1% N-(1-Napthyl) Ethylenediamine dihydrochloride)와 그리스 시약 B(5% H3PO4에 1% Sulfanilic Acid)를 동량으로 혼합한 시약 100㎕를 가하고 잘 혼합한 후 ELISA 분석기를 이용하여 570㎚에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
IL-6의 발현량은 BioLegend의 ELISA 키트(San Diego, CA, USA)로, PGE2 의 발현량은 R&Dsystem의 ELISA 키트(Minneapolis)를 이용하여 확인하였다.
이에 대한 결과는 도 1에 나타내었는데, 도 1을 참고하면, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 인해 염증 관련 인자인 NO(도 1A의 Nitrite 함량으로 확인), PGE2(도 1B) 및 IL-6(도 1C)의 발현이 농도 의존적으로 현저하게 저하됨을 알 수 있다.
<실시예 5. 생존율 확인>
실시예 5-1. 세포 생존율 확인
세포 생존율(cell viability)을 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)어세이 방법을 이용하였다. RAW264.7 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×105개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 1 내지 30μM이 되도록 RAW264.7 세포에 처리하여 30분간 전반응 시킨 다음 24시간 동안 1㎍/㎖의 LPS를 처리하고 배양하였다. 24시간 후, 5㎎/㎖ MTT 용액 20㎕을 넣고 37℃에서 4시간 반응시킨 후 배양액을 제거하고 DMSO(dimethyl sulfoxide) 200㎕을 넣었다. 피펫팅으로 잘 섞어 준 다음 10분 동안 방치한 후 570㎚에서 흡광도를 측정하였다. 측정 결과 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산은 1 내지 30μM의 농도에서 세포 독성이 없는 것으로 확인되었으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
실시예 5-2. LPS 처리된 마우스의 생존율 확인
7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 화합물이 LPS 처리된 마우스의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위해 동물 실험을 수행하였다. 본 동물 실험에서는 독성 연구에 주로 사용되는 C57BL/6 생쥐를 이용하였고, 대조군과 실험군(실험군 1과 실험군 2)에 각각 8마리씩 배정하였다. 대조군에는 아무것도 처리하지 않았고, 실험군 1은 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 30㎎/㎏을, 실험군 2에는 10㎎/㎏을 투여하였다. 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 처리하고 한 시간 후에 대조군과 실험군에 각각 LPS를 40㎎/㎏씩 투여한 후 5일 동안 관찰하였다. 투여 5일 후에 각각의 생존율을 조사한 결과 대조군에서는 62.5%의 치사율을 보였으나, 실험군 1에서는 87.5%의 생쥐가 생존한 것을 관찰하였으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
<실시예 6. iNOS, COX-2, IL-6의 발현 확인>
RAW264.7 세포를 직경 6㎝ 세포배양 접시에 1×106개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 3 내지 30μM이 되도록 RAW264.7 세포에 처리하여 30분간 전반응 시킨 다음 8시간 동안 1㎍/㎖의 LPS를 처리하고 배양하였다. 8시간 배양 후 세포를 모아 총 RNA를 RNeasy Mini 키트(Qiagen, Santa Clarita, CA, USA)를 사용하여 추출하였고, 1㎍의 총 RNA와 RT-PCR 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 이용하여 cDNA 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 하여 iNOS, COX-2, IL-6에 대한 리얼-타임 정량 PCR(real-time quantitative PCR)을 TOPreal qPCR 2×PreMIX(SYBR Green, Enzynomics, Daejon, Korea)와 Rotor-GeneQ real-time PCR cycler(Qiagen)을 이용하여 수행하였다.
리얼-타임 정량 PCR에서 각 유전자 증폭을 위한 프라이머의 DNA 염기 서열은 하기와 같다.
iNOS sense : 5'-GGC AAA CCC AAG GTC TAC GTT-3'
iNOS antisense : 5'-TCG CTC AAG TTC AGC TTG GT-3'
COX-2 sense : 5'-TGA GTA CCG CAA ACG CTT CT-3'
COX-2 antisense : 5'-CTC CCC AAA GAT AGC ATC TGG-3'
IL-6 sense : 5'-TCC ATC CAG TTG CCT TCT TGG-3'
IL-6 antisense : 5'-CCA CGA TTT CCC AGA GAA CAT G-3'
β-actin sense : 5'-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TCA AAG-3'
β-actin antisense : 5'-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3'
리얼-타임 정량 PCR 증폭 조건은 95℃에서 10분 동안 1사이클 반응 후, 95℃에서 10초, 60℃에서 15초, 72℃에서 20초 조건으로 40사이클을 반복 수행하였으며, 유전자 증폭량은 2-ΔΔCt 방법으로 분석하였다.
상기 결과는 도 4에 나타내었는데, 도 4A 내지 도 4C를 참고하면, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 처리로 인해 염증관련 인자인 iNOS(도 4A), COX-2(도 4B) 및 IL-6(도 4C)의 발현이 농도 의존적으로 현저하게 저하됨을 알 수 있다.
< 실시예 7. Nrf2 의 발현 및 활성화 확인>
실시예 7-1. Nrf2 의 발현 확인
RAW264.7 세포를 직경 6㎝ 세포배양 접시에 1×106개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 3 내지 30μM이 되도록 RAW264.7 세포에 처리하고 2시간 동안 배양하였다. 이때 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의한 Nrf2 활성화에 대한 항산화제의 영향을 검토하기 위해 NAC(N-acetyl-L-cystenine)와 본 발명의 화합물을 동시에 처리하였다. 이후 세포를 회수한 후 핵과 세포질 단백질을 분리하기 위해 NE-PER Nucler and Cytoplasmic Extraction Reagent Kit를 이용하여 핵 추출물과 세포질 추출물을 얻은 후 각각 동량으로 SDS-PAGE 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 통해 각각의 크기별로 분리한 후, Hybond-P 멤브레인(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)로 이동시켰다. 상기 멤브레인들은 상온에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹시킨 다음 상온에서 2시간 동안 각 해당 1차 항체와 반응시켰다. 이후 1차 항체를 세척하고 해당 2차 항체를 반응시킨 후 ECL(enhanced chemiluminescence system)을 이용하여 각 단백질의 함량을 확인하였다. PARP(poly ADP-ribose polymerase)는 핵 마커로, GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)는 세포질 마커로 사용하였다.
도 5A를 참고하면 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산의 처리로 인해 핵 내 Nrf2의 양이 증가하는 반면, 세포질 내에 존재한 Nrf2의 양이 감소하는 것을 확인할 수 있으며 항산화제인 NAC는 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산의 처리에 의한 핵 내 Nrf2 양의 증가를 억제함을 확인할 수 있었다.
실시예 7-2. Nrf2의 활성화 확인
Nrf2의 활성화를 한 번 더 확인하기 위해 Nrf2의 표적 유전자인 HO-1, NQO1, GCLC의 발현을 확인하였다. RAW264.7 세포를 직경 6㎝ 세포배양 접시에 1×106개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 3 내지 30μM이 되도록 RAW264.7 세포에 처리하고 8시간 동안 배양하였다.
8시간 배양 후 실시예 6에서 수행한 방법과 같은 방법으로 총 RNA 추출, cDNA 합성, 리얼-타임 정량 PCR 및 분석을 수행하였다.
리얼-타임 정량 PCR에서 각 유전자 증폭을 위한 프라이머의 DNA 염기 서열은 하기와 같다.
HO-1 sense : 5'-CGC AAC AAG CAG AAC CCA-3'
HO-1 antisense : 5'-GCG TGC AAG GGA TGA TTT CC-3'
NQO1 sense : 5'-CGC CTG AGC CCA GAT ATT GT-3'
NQO1 antisense : 5'-GCA CTC TCT CAA ACC AGC CT-3'
GCLC sense : 5'-GTC TGA CAC GTA GCC TCG GTA A-3'
GCLC antisense : 5'-TGG CCA CTA TCT GCC CAA TT-3'
β-actin sense : 5'-GGG AAA TCG TGC GTG ACA TCA AAG-3'
β-actin antisense : 5'-AAC CGC TCG TTG CCA ATA GT-3'
상기 실험 결과를 도 5에 나타내었다.
Nrf2의 표적 유전자의 발현을 확인한 결과 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산의 농도에 따라 HO-1(도 5B), NQO1(도 5C) 및 GCLC(도 5D)의 발현양이 증가하는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산이 Nrf2를 활성화시키는 효과가 매우 우수함을 알 수 있다.
<실시예 8. 활성산소 확인>
산화 스트레스(oxidative stress)는 Nrf2의 활성화에 중요한 작용을 한다. 따라서 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산이 활성산소의 증가와 관련이 있는지 확인하기 위해 세포 내 활성산소의 양을 측정하였다.
활성산소의 양은 DCF-DA(2′,7′-dichlorofluorescein diacetate)를 이용하여 측정하였다. DCF-DA가 세포내로 들어가게 되면 가수분해반응에 의해 DCF-H(2′,7′-dihydro-dichlorofluorescein)로 전환이 되고, 이 물질은 활성산소가 발생하는 곳에서 형광 빛을 발하는 DCF(dichlorofluorescein)로 산화반응을 측정함으로서 확인할 수 있다.
RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 웰 당 5×105개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, DCF-DA 25μM을 RAW267.4에 처리한 후 어두운 곳에서 30분간 배양하였다. 30분 후 DCF-DA를 제거하고 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 3 내지 30μM이 되도록 처리하고 30분간 어두운 곳에서 배양하였다. 이때 항산화제인 NAC 100μM을 동시에 처리하여 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의한 활성산소에 대한 항산화제의 영향을 검토하였다. 배양 후 배양 접시에서 나오는 형광을 여기 파장 545㎚ 및 발광 파장 585㎚에서 측정하였다.
그 결과는 도 6에서 보여주듯이 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 농도 의존적으로 형광이 증가하는 것을 확인할 수 있다. 이를 통해 산화 스트레스가 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 매개 Nrf2의 활성에 관련되어 있음을 예측할 수 있다.
<실시예 9. MAPKs와의 관계 확인>
실시예 9-1. MAPKs 억제제를 이용한 핵내 Nrf2 발현 확인
RAW264.7 세포를 직경 6㎝ 세포배양 접시에 1×106개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 30μM가 되도록 단독으로 또는 JNK 억제제인 SP600125(10μM), MEK 억제제인 U0126(10μM) 또는 p38 MAPK 억제제인 SB20358(10μM)과 함께 처리하였다. 이때 항산화제인 NAC 100μM을 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산과 함께 처리하여, 2시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 모아서 NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent Kit를 이용하여 핵단백질을 분리하였다. 핵 추출물을 각각 동량으로 SDS-PAGE 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyarylamide gel electrophoresis)을 통해 각각의 크기별로 분리한 후, Hybond-P 멤브레인(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인들은 상온에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹시킨 다음 상온에서 2시간 동안 각 해당 1차 항체와 반응시켰다. 이후 1차 항체를 세척하고 해당 2차 항체를 반응시킨 후 ECL(enhanced chemiluminescence system)을 이용하여 각 단백질의 함량을 확인하였다. PARP(poly ADP-ribose polymerase)는 핵 마커로 사용하였다. 상기 실험 결과를 도 7A에 나타내었다.
도 7A를 참고하면, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산의 처리로 인해 Nrf2의 핵 내 이동이 증가하였으나, p38 MAPK의 억제제인 SB20358를 처리한 경우에는 이러한 Nrf2의 핵 내 이동이 억제되었다. 반면에 JNK의 억제제인 SP600125와 MEK의 억제제인 U0126을 처리한 경우에는 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의한 Nrf2의 핵 내 이동 증가 에 영향을 주지 않은 것을 확인하였다.
실시예 9-2. p38 MAPKs 억제제를 이용한 Nrf2 의 핵내 이동 억제 확인
7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 매개 Nrf2 활성과 MAPKs의 관련성을 확인하기 위해 MAPKs의 억제제에 의한 Nrf2의 핵 내 이동 여부를 확인하였다.
RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 웰 당 5×105개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 30μM가 되도록 단독으로 또는 p38 MAPK 억제제인 SB20358(10μM)과 함께 처리하였다. 이때 항산화제인 NAC 100μM을 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산과 함께 처리하여, 2시간 동안 배양하였다. 배양 후 PBS로 세포를 세척하고 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고, 0.5% 트리톤 X-100을 처리하여 세포의 투과성을 높였다. 이 후 1% 염소 혈청에 30분간 반응시키고 Nrf2 항체로 염색시켰다. 이후 PBS로 Nrf2 항체를 세척하고, 형광물질인 Alexa Fluore 546으로 표지 된 2차 항체를 반응시킨 후 공초점 현미경(OLYMPUS FV1000, Olympus)을 이용하여 Nrf2의 위치를 확인하였다. 이때 핵의 위치를 확인하기 위해 2차 항체 염색을 수행한 후에 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole)을 처리하였다. 상기 실험 결과들을 도 7B에 나타내었다.
도 7B에서는 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의해 Nrf2가 핵으로 이동하는 것을 확인하였고, p38 MAPK 억제제에 의해 억제 되는 것을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의한 Nrf2 활성화가 활성산소 의존적 p38 MAPK 신호 전이 과정을 통해 이루어진다는 것을 알 수 있다.
<실시예 10. HO-1 발현량 확인>
RAW264.7 세포를 직경 6㎝ 세포배양 접시에 1×106개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 1 내지 30μM이 되도록 RAW264.7 세포에 처리하고 6시간 동안 배양하였다. 또한 본 발명의 화합물에 의한 HO-1의 발현이 Nrf2 의존적임을 확인하기 위해 RAW264.7 세포를 6㎝ 세포 배양 플레이트에 70 내지 90% 정도 차도록 배양한 후 OriGene Technologies(Rockville, MD, USA)사로부터 구입한 Nrf2 siRNA(small interfering RNA)와 대조군으로 사용할 siRNA(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 형질전환 한 후 (48시간 배양) 본 발명의 화합물인 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 30μM이 되도록 처리하고 6시간 동안 배양하였다.
배양한 세포를 모아 세포 용해 버퍼(50mM Tris-HCl(pH 7.5), 1% Nonidet P-40, 1mM EDTA, 1mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 10㎍/㎖ pepstatin A, 10㎍/㎖ aprotinin, 2mM benzamidine, 50mM NaF, 5mM sodium orthovanadate, 150mM NaCl)에 녹여 총 세포 용해물을 얻었다.
이렇게 얻은 각각의 총 세포 용해물을 동량으로 SDS-PAGE 겔 전기영동(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)을 통해 각각의 크기별로 분리한 후, Hybond-P 멤브레인(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)으로 이동시켰다. 상기 멤브레인들은 상온에서 1시간 동안 5% 탈지분유로 블로킹시킨 다음 상온에서 2시간 동안 각 해당 1차 항체와 반응 시켰다. 이후 1차 항체를 세척하고 해당 2차 항체를 반응시킨 후 ECL(enhanced chemiluminescence system)을 이용하여 각 단백질의 함량을 확인하였다. 튜불린(tubulin)은 로딩 대조군으로 이용하였다.
상기 실험 결과들을 도 8에서 보여주고 있는데, 도 8A를 참고하면, HO-1의 발현양이 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 농도 의존적으로 발현하는 것을 확인할 수 있다. 도 8B를 참고하면, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산의 처리에 의해 발현된 HO-1이 Nrf2의 siRNA를 처리했을 때 발현이 사라지는 것을 알 수 있다.
이를 통해 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산이 Nrf2를 통해 HO-1의 발현을 유도한다는 것을 알 수 있다.
<실시예 11. 항염증 활성 확인>
7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산이 항염증 활성에 관여하는지를 확인하기 위해 Nrf2/HO-1의 신호기전과의 관련성을 확인하였다.
RAW264.7 세포를 24웰 플레이트에 웰 당 5×105개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 30μM을 단독 또는 HO-1 특이적 억제제인 SnPP 10μM 및 비활성 화합물인 CuPP 10μM을 음성 대조군으로 RAW264.7 세포에 함께 처리하고 30분 동안 배양하였다. 그리고 LPS를 1㎍/㎖ 농도가 되도록 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 가지고 염증 매개체인 NO, PGE2, IL-6의 발현을 확인하였다. NO, PGE2, IL-6의 발현을 확인하는 방법은 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다.
도 9에서 보여주듯이 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산에 의해 억제된 NO, PGE2, IL-6의 발현 정도를 SnPP가 회복시키는 것을 알 수 있다. 이를 통해 LPS-유도 염증 반응에서 Nrf2 활성에 의해 유도된 HO-1이 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산의 활성을 매개한다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 12. NF-κB에의 영향 확인>
활성화된 Nrf2가 NF-κB의 활성을 약화시킨다는 것은 이미 밝혀졌다. 이를 바탕으로 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산이 NF-κB의 활성에 어떤 관련이 있는지 확인하고자 하였다.
RAW264.7 세포를 직경 6㎝ 세포배양 접시에 1×106개 세포가 되도록 분주하고 24시간 동안 배양한 후, RAW264.7 세포에 NF-κB-의존적 리포터 유전자를 형질주입하고 24시간 동안 배양하였다. 24시간 배양 한 세포에 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 최종 농도가 3 내지 30μM이 되도록 처리하고 30분간 배양하고, LPS를 1㎍/㎖ 농도가 되도록 처리하여 12시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 모아 용해하여 루시페라아제 활성 측정 키트(Dual-luciferase reporter assay system)를 이용하여 루시페라아제(luciferase) 활성을 측정하였다. 도 10에서 보여주듯이 루시페라아제 활성을 확인한 결과 LPS-유도 NF-κB의 활성을 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산이 저해하는 것을 확인하였다.
<실시예 13. 장기 및 조직 독성 실험>
장기 독성 실험은 본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 각 농도로 8주 동안 C57BL/6J 마우스(각 군당 10마리)에 투여하여 실험하였다. 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위해 본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 투여한 실험군과 PEG-400:트윈-80:에탄올(8:1:1, v:v:v)만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간 독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장 독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직 절편 제작 과정을 거쳐 광학 현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 모든 조직에서 특이한 이상이 관찰되지 않았다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 200g을 락토즈 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄하여 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활성 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 조리용 양념에 1중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 밀가루에 0.1중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 스프 및 육즙에 0.1중량%로 첨가하여 건강 증진용 스프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 우유에 0.1중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스의 제조
본 발명의 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

Claims (9)

  1. 하기 화학식 1의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
    [화학식 1]
    Figure 112015067403392-pat00002
  2. 제1항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 전사인자 Nrf2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2)의 활성화를 통해 HO-1(heme oxygenase-1)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 화합물은 조성물 총 중량을 기준으로 0.001 내지 50중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
  5. 하기 화학식 1의 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
    [화학식 1]
    Figure 112015067403392-pat00003
  6. 제5항에 있어서,
    상기 염증성 질환은 알레르기성 질환, 염증성 장질환, 죽상동맥경화, 염증성 콜라겐 혈관 질환, 사구체신염, 염증성 피부 질환, 유육종증, 망막염, 위염, 간염, 장염, 관절염, 편도선염, 인후염, 기관지염, 폐렴, 췌장염, 패혈증 및 신장염으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 건강기능식품은 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올음료, 껌, 차 및 비타민 복합제로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  8. 제5항에 있어서,
    상기 화합물은 건강기능식품 총 중량을 기준으로 0.001 내지 50중량%로 첨가되는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  9. 하기 화학구조를 갖는 신규 화합물 7-메톡시-(9H-베타-카르볼린-1-일)-(E)-2-프로페노익산.
    Figure 112015067403392-pat00004




















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