KR20160116427A

KR20160116427A - 부처손으로부터 분리된 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160116427A
Application number: KR1020150044055A
Authority: KR
Inventors: 우미희; 지다정; 최재수
Original assignee: 대구가톨릭대학교산학협력단
Priority date: 2015-03-30
Filing date: 2015-03-30
Publication date: 2016-10-10
Also published as: KR101752247B1

Abstract

본 발명은 부처손으부터 분리된 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 부처손으로부터 분리된 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 저해 효과 또는 포도당의 흡수를 증가시키는 효과가 우수하여 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

부처손으로부터 분리된 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물 {A composition comprising compounds isolated from Selaginella tamariscina for preventing or treating metabolic disorder}

본 발명은 부처손(Selaginella tamariscina)으로부터 분리된 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

최근 경제 발전에 따른 식생활 습관의 변화와 인구의 고령화 및 각종 스트레스와 관련하여, 현대 생명과학의 큰 발전에도 불구하고 암을 비롯한 심혈관 질환 및 대사성 질환의 발병이 증가하고 있는 추세이다. 특히, 상기 대사성 질환 중에서도 당뇨병은 인슐린의 절대적인 결핍이나 저항성으로 인한 당대사의 기능이상을 특징으로 하는 만성 소모성 질환으로써 전신적인 무기력과 저항성 저하, 혈관장애, 뇌경색, 심근경색 등 기타 다양한 합병증을 유발하는 질병이다. 또한, 세계보건기구(WHO)에 따르면 3억 5천만 명의 사람들이 당뇨병을 겪고 있으며 2030년에는 그 숫자가 2배 더 증가할 것이라고 예상하였다(Danaei, G. et al., 2011).

당뇨병은 발병원인과 병태양상에 따라 크게 2가지 유형으로 구분되는데, 특정한 인간 림프구 항원(HLA)과 바이러스 감염 등으로 랑게르한스섬의 베타세포가 파괴되어 인슐린의 분비가 정상적으로 진행되지 않아 발병하는 인슐린 의존형인 제1형 당뇨병이 있으며, 운동부족과 비만, 과식, 스트레스 등으로 인하여 근육, 간, 지방조직 등 말초조직에서 인슐린에 대한 저항성 증가로 유발되는 인슐린 비의존성인 제2형 당뇨병이 이에 해당한다. 특히, 현대 사회의 노령화와 생활습관의 변화로 인해 제2형 당뇨병이 당뇨병 전체 환자의 90% 이상을 차지하고 있으며 그 수도 꾸준히 증가하는 추세이다. 제2형 당뇨병 발병의 주요 원인으로는 인슐린 저항성이며, 이는 일정량의 인슐린 농도에 대한 반응이 정상보다 감소되어 있는 상태를 말하며 일반적으로 유전적, 환경적인 요인으로 발생한다(Hossain, P. et al., 2007).

한편, GLUT4(glucose transporter 4)는 포도당 수송체로서 세포막으로 이동하여 포도당을 세포내로 유입(glucose uptake)시키고, 이 과정은 각 세포에서 포도당 섭취의 속도조절 단계이며 인슐린에 의해 촉진된다. GLUT4에 의해 혈액내의 포도당이 세포내로 이동되면 지방세포에서는 포도당의 산화 및 지방산으로의 전환이 이루어지고, 근육세포에서는 단백질을 합성하기 위한 아미노산의 흡수가 촉진된다. 지방 및 근육세포 이외에 다른 조직에서는 인슐린과 상관없이 확산 등의 기전에 의해 포도당이 세포로 유입되지만, 지방 및 근육세포에서는 인슐린이 있어야만 GLUT4가 세포막으로 이동되어 포도당이 지방 및 근육세포내로 유입된다. 이와 같이 인슐린에 의해서만 포도당이 세포내로 유입되는 것을 인슐린 감수성(insulin sensitivity)이라 하고, 인슐린의 기능이 떨어지거나 분비되지 않으면 GLUT4가 세포막으로 이동하지 않아 지방 및 근육세포에 포도당이 유입되지 못하여 혈중 포도당 농도가 상승되는데 이를 인슐린 저항성(insulin resistance)이라 한다(Huang, S. et al., 2007; Lee, W. Y. et al., 2008). 이 경우 포도당 흡수가 원활하지 못해 조직세포가 효과적으로 사용하지 못하는 상태이므로, 세포에 의한 포도당 섭취를 모니터링하는 것은 특히 대사성 질환의 진단에 있어서 유용하다.

단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)는 하기 참고도 1에서와 같이, 인슐린 수용체(insulin receptor) 및 인슐린 수용체 기질(insulin receptor substrates)의 탈인산화를 일으켜 인슐린의 신호전달 기전을 방해함으로써 인슐린 저항성을 야기시키는 효소로 알려져 있다. 또한, 상기 단백질 타이로신 탈인산화 효소는 렙틴의 신호전달 과정에서도 렙틴 수용체 및 Jak에서 일어나는 인산화를 저해하고 렙틴 신호전달 기전을 억제함으로써 비만을 일으키는 원인으로도 알려져 있다(Malamas, M. S. et al., 2000).

[참고도 1]

비록, 현재까지의 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B에 관한 연구는 상대적으로 초기 단계에 머물러 있지만, 최근 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 생물학적 기능 및 질환 유발 기전이 밝혀짐에 따라 새로운 약물 개발의 타겟이 되고 있다(Thareja, S. et al., 2012). 특히, 당뇨, 비만, 암 등 난치성 질환에 있어서 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 역할이 규명됨으로써 이 효소의 저해를 타겟으로 하는 신약 개발에 많은 투자가 이루어지고 있다. 이에 대한 예로서, 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B) 유전자를 제거한 쥐에서는 인슐린 내성이 제거되어 제2형 당뇨병이 유발되지 않았으며, 비만이 저해되는 현상이 보고되었으며(Elchebly, M. et al., 1999), 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)를 저해하는 물질들이 항당뇨 효과를 보이는 현상이 관찰되고 있다(Klaman, L. D. et al., 2000). 현재까지 임상에 들어간 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B를 비롯한 각종 타이로신 탈인산화효소의 저해제는 하기 참고도 2와 같은데, 대부분 합성 화합물로서 낮은 생체이용률, 독성 및 부작용으로 인해 임상시험에서 탈락된 경우가 많다. 따라서 안전성이 높은 천연물 유래의 저해제 개발이 요구되고 있다(Johnson, T. O. et al., 2002).

[참고도 2]

부처손(Selaginella tamariscina)은 관다발식물 석송목 부처손과의 여러해살이풀로, 한자명인 보처수(補處手)에서 온 것이다. 또한, 제주도와 울릉도, 남부, 중부, 북부지방의 돌 틈에서 자라는 상록 다년생 초본이며, 키는 약 20㎝ 정도이고 잎은 1.5~2㎜의 길이로 끝이 실 같은 돌기로 되어 있다. 습기가 많은 때는 가지가 사방으로 퍼지며, 건조할 때는 안으로 말려서 공처럼 되고 습기가 있으면 다시 퍼진다. 포자의 길이는 0.5~1.5㎝이며, 직경은 2㎜로 잔가지 끝에 1개씩 달리며 네모지다.

또한, 상기 부처손은 전통적으로 염증, 만성 감염, 월경통, 자궁출혈, 혈뇨, 고혈당 등의 치료에 사용되어져 왔으며(정보섭 et al., 1990), 플라보노이드(flavonoids), 비플라노이드(biflavonoids), 리그난(lignans), 셀라기넬린(selaginellins) 및 페놀(phenols) 성분을 다량으로 함유하고 있다(Zheng, X. K. et al., 2011; Weng, J. K. et al., 2013).

부처손과 관련된 선행기술 문헌으로써 한국공개특허 제2013-0081852호에는 부처손 추출물 또는 분획물이 면역 강화 효과가 있으며, 한국등록특허 제633344호에는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료 효과가 있다는 것이 개시되어 있다. 또한, 한국공개특허 제2013-0113626호에는 부처손 추출물을 사용하여 당뇨 또는 비만의 예방 및 치료에 관한 연구를 보고하였으나, 부처손으로부터 분리된 화합물이 비만 또는 당뇨에 대한 치료 효과가 있음을 확인한 이전 보고는 아직 없다. 이에 본 발명자들은 부처손으로부터 분리된 화합물이 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 활성을 저해시키거나 포도당의 흡수를 증가시키는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

한국등록특허 제633344호, 권백 추출물을 포함하는 급성 또는 만성 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물, 2006년 01월 06일, 등록. 한국공개특허 제2013-0081852호, 부처손 추출물 또는 이의 분획물을 포함하는 면역력 강화용 조성물, 2013년 07월 18일, 공개. 한국공개특허 제2013-0113626호, 양치식물의 추출물을 유효성분으로 포함하는 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물, 2013년 10월 16일, 공개.

정보섭 et al., 향약(生藥)대사전, 영림사, 88, 1990. Cui, L. et al., Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors from Morus root bark, Bioorg. Med. Chem. Lett., 16(5), 1426-1429, 2006. Danaei, G. et al., National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2·7 million participants, Lancet, 378(9785), 31-40, 2011. Elchebly, M. et al., Increased insulin sensitivity and obesity resistance in mice lacking the protein tyrosine phosphatase-1B gene, Science, 283(5407), 1544-1548, 1999. Hossain, P. et al., Obesity and diabetes in the developing world-a growing challenge, Engl. J. Med., 356(3), 213-215, 2007. Huang, S. et al., The GLUT4 glucose transporter, Cell Metab., 5(4), 237-252, 2007. Johnson, T. O. et al., Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors for diabetes, Nat. Rev. Drug. Discov., 1(9), 696-709, 2002. Klaman, L. D. et al., Increased energy expenditure, decreased adiposity, and tissue-specific insulin sensitivity in protein-tyrosine phosphatase 1B-deficient mice, Mol. Cell. Biol., 20(15), 5479-5489, 2000. Lee, W. Y. et al., Type 2 Diabetes Mellitus and Retinol-Binding Protein 4, Korean Diabetes J., 32, 295-300, 2008. Malamas, M. S. et al., New azolidinediones as inhibitors of protein tyrosine phosphatase 1B with antihyperglycemic properties, J. Med. Chem., 43(5), 995-1010, 2000. Thareja, S. et al., Protein tyrosine phosphatase 1B inhibitors: a molecular level legitimate approach for the management of diabetes mellitus, Med. Res. Rev., 32(3), 459-517, 2012. Weng, J. K. et al., Chemodiversity in Selaginella: a reference system for parallel and convergent metabolic evolution in terrestrial plants, Frontiers in Plant Science, 4, 119, 2013. Zheng, X. K. et al., Anti-diabetic activity and potential mechanism of total flavonoids of Selaginella tamariscina(Beauv.) Spring in rats induced by high fat diet and low dose STZ, J. Ethnopharmacol., 137(1), 662-668. 2011.

본 발명의 목적은 부처손으로부터 분리된 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명은 부처손(Selaginella tamariscina)으로부터 분리된 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 부처손으로부터 분리된 하기 화학식 1의 셀라기넬린(selaginellin, 화합물 1), 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라기넬린 M(selaginellin M, 화합물 3), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6), 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7), 로버스타플라본(robustaflavone, 화합물 8), 커프레서플라본(cupressuflavone, 화합물 9), 타이와니아플라본(taiwaniaflavone, 화합물 10) 및 3,8″-비아피게닌(3,8″-biapigenin, 화합물 11)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 대사성 질환은 비만 또는 당뇨병 중에서 선택되는 질환일 수 있다.

상기 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 활성을 저해하거나 포도당의 흡수(glucose uptake)를 증가시키는 효과가 있다.

상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 투여형으로 제형화되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 부처손으로부터 분리된 상기 화학식 1의 셀라기넬린(selaginellin, 화합물 1), 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라기넬린 M(selaginellin M, 화합물 3), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6), 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7), 로버스타플라본(robustaflavone, 화합물 8), 커프레서플라본(cupressuflavone, 화합물 9), 타이와니아플라본(taiwaniaflavone, 화합물 10) 및 3,8″-비아피게닌(3,8″-biapigenin, 화합물 11)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 하기 화학식 2의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6) 및 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7)로 이루어진 군 중에서 선택되는 신규 화합물에 관한 것이다.

[화학식 2]

본 발명은 부처손을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 부처손 추출물을 제조하는 단계; 상기 부처손 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하는 단계; 및 상기 각 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 상기 화학식 2의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6) 및 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 부처손(Selaginella tamariscina)으로부터 분리된 상기 화학식 1의 화합물 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 화합물은 부처손의 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매 추출물을 크로마토그래피로 분획하여 얻을 수 있으며, 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는, 부처손 지상부를 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 부처손 추출물을 얻고, 상기 부처손 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하여 각각의 분획물을 얻은 후, 상기 각 분획물을 크로마토그래피로 분획함으로써 얻을 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 중에서 선택될 수 있다.

한편, 본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수도 있다.

또한, 본 발명은 부처손으로부터 분리된 상기 화학식 1의 화합물 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다. 상기 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 부처손으로부터 분리된 상기 화학식 1의 화합물 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 당뇨 또는 비만과 같은 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다. 상기 화합물은 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명은 부처손으로부터 분리된 화합물을 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 상기 부처손으로부터 분리된 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 저해 효과 또는 포도당의 흡수를 증가시키는 효과가 우수하여 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 화합물 1 내지 11의 세포생존율을 확인하는 MTT 어세이 결과이다.
도 2는 화합물 2, 4 및 5의 ¹H-¹H COSY (bold lines)와 ¹H-¹³C HMBC의 상관관계(arrow)를 나타내는 그림이다.
도 3는 화합물 6 및 7의 ¹H-¹H COSY (bold lines)와 ¹H-¹³C HMBC의 상관관계(arrow)를 나타내는 그림이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 부처손 유래 화합물의 분리>

본 발명에서 사용된 부처손(Selaginella tamariscina) 지상부는 2010년 1월, 한국 경북 영천시장에서 구입하였다. 상기 부처손 지상부(10㎏)를 매회 메탄올(10ℓ)로 45℃에서 10시간의 조건으로, 4회 반복하여 초음파 처리함으로써 1.5㎏의 메탄올 추출물을 얻었다. 또한, 상기 메탄올 추출물을 2ℓ의 물에 현탁하고, 매회 디클로로메탄(2ℓ), 에틸아세테이트(2ℓ) 및 n-부탄올(2ℓ)을 순차적으로 4회 반복하여, 디클로로메탄 분획물(470g), 에틸아세테이트 분획물(150g) 및 n-부탄올 분획물(550g)과 마지막으로 물층 잔사를 포함하는 분획물(220g)을 얻었고, 지방세포에서 포도당 흡수 효과가 상대적으로 높은 에틸아세테이트 분획물에서 본 발명의 화합물을 분리하였다.

상기 에틸아세테이트 분획물을 디클로로메탄:메탄올(10:1→0:1[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기:20×80㎝, 입자크기:63-200㎛)로 분획하여 5개의 소분획물(ST.1~ST.5)을 얻었다. 이 중 포도당 흡수 효과가 상대적으로 높은 소분획물 ST.2를 메탄올:물(6:4→1:0[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 RP-18 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기:4.5×60㎝, 입자크기:40-63㎛)로 분획하여 5개의 소분획물(ST.2.1~ST.2.5)을 얻었다. 상기 소분획물 중 ST.2.2는 고성능 액체 크로마토그래피(Gilson HPLC system, YMC C₁₈ 컬럼, 컬럼크기:10×250㎜, 입자크기:5㎛, UV:225㎚, 이동상:0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴(acetonitrile, MeCN)-물; 0~30분:38%[v/v] MeCN, 30~33분:38~100%[v/v] MeCN, 33~41분:100% MeCN, 41~43분:100~38%[v/v] MeCN, 43~45분:38%[v/v] MeCN)를 사용하여 화합물 6(selariscinin D, 4.8㎎, t _R=20.7분)을 분리하였다.

또 다른 조건에서, 상기 소분획물 ST.2.2를 고성능 액체 크로마토그래피(RS Tech Optima Pak C₁₈ 컬럼, 컬럼크기:10×250㎜, 입자크기:10㎛, UV:225㎚, 이동상:0.1% 포름산이 포함된 아세토니트릴(acetonitrile)-물; 0~30분:38%[v/v] MeCN, 30~33분:38~100%[v/v] MeCN, 33~41분:100% MeCN, 41~43분:100~38%[v/v] MeCN, 43~45분:38%[v/v] MeCN)를 사용하여 화합물 4(selariscinin B, 4.4㎎, t _R=20.7분)를 분리하였다.

소분획물 ST.2.4는 등용매 용출 조건(용매:0.1% 포름산이 포함된 60%[v/v] 메탄올 수용액)에 따른 고성능 액체 크로마토그래피(Gilson HPLC system, RP C18 컬럼, 컬럼크기:10×250㎜, 입자크기:10㎛)로 분획하여 화합물 7(selarircinin E, 15.8㎎, t _R=32.6분)을 얻었고, 또 다른 등용매 용출 조건(용매:0.1% 포름산이 포함된 64%[v/v] 메탄올 수용액, UV:225㎚)을 이용하여 화합물 3(selaginellin M, 16.3㎎, t _R=26.5분) 및 화합물 5(selariscinin C, 2.8㎎, t _R=30.2분)를 분리하였다.

또한, 소분획물 ST.3은 디클로로메탄:메탄올(1:1→0:1[v:v])의 용출 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분획하여 10개의 소분획물(ST.3.1~ST.3.10)을 얻었으며, 그 중 ST.3.3, ST.3.4 및 ST.3.5를 메탄올:물(4:6→4:1[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 RP-18 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기:5.0×20㎝, 입자크기:75㎛)를 사용하여 화합물 8(robustaflavone, 7.8㎎) 및 화합물 9(cupressuflavone, 5.6㎎)를 분리하였다.

소분획물 ST.4는 메탄올:물(5:5→5:1[v:v])의 농도구배 용출 조건에 따른 RP-18 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기:3.0×20㎝, 입자크기:40-63㎛)로 분획하여 화합물 1(selaginellin, 115.6㎎) 및 화합물 2(selariscinin A, 65.0㎎)를 얻었다. 또 다른 조건에서, 소분획물 ST.4는 n-헥산:아세톤(3:1→1:2[v:v])의 용출 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기:3.0×20㎝, 입자크기:40-63㎛)를 이용하여 10개의 소분획물(ST.4.1~ST.4.10)을 분리하였다. 그 중 ST.4.3은 등용매 용출 조건(메탄올:물, 50:50[v/v])에 따른 RP-컬럼 크로마토그래피(입자크기:40-63㎛)로 분획하여 화합물 10(taiwaniaflavone, 3.8㎎)을 얻었으며, 소분획물 ST.4.5는 메탄올:물(1:1→9:1[v:v])의 농도구배 용출 조건으로 RP-컬럼 크로마토그래피(입자크기:40-63㎛)를 사용하여 화합물 11(3,8″-biapigenin, 4.5㎎)을 분리하였다.

<실시예 2. 부처손으로부터 분리된 화합물의 물리화학적 구조 확인>

실시예 2-1. 셀라기넬린(화합물 1)

selaginellin;

M.W. : 512.56;

¹H (400 ㎒) and ¹³C (100 ㎒) NMR Data in MeOH-d ₄ (표 1 참고).

실시예 2-2. 셀라리시닌 A(화합물 2)

selariscinin A;

(S)-4-[(4′-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-3-((4-hydroxyphenyl)ethynyl)biphenyl-2-yl)(4-hydroxyphenyl)methylene]-2,5-cyclohexadien-1-one;

M.W. : 512.56;

purple amorphous powder (acetone);

: +105.03 (c 0.5, MeOH);

UV (c 0.025, MeOH) λ _max ㎚ : 199, 265, 299 and 440;

IR v _max (KBr) ㎝^-1: 3394 (OH), 2943 (C-H), 2203 (C≡C), 1641, 1631 (C=C), 1381 (C-H), 1077, 1045 (C-O);

¹H (400 ㎒) and ¹³C (100 ㎒) NMR Data in MeOH-d ₄ (표 1 참고);

HREIMS m/z : 512.1626 [M]⁺ (calcd for C₃₄H₂₄O₅, 512.1624).

실시예 2-3. 셀라기넬린 M(화합물 3)

selaginellin M;

M.W. : 526.59;

¹H (400 ㎒) and ¹³C (100 ㎒) NMR Data in MeOH-d ₄ (표 1 참고).

실시예 2-4. 셀라리시닌 B(화합물 4)

selariscinin B;

2-(hydroxybis(4-hydroxyphenyl)methyl)-3-((4-hydroxyphenyl)ethynyl)-4-(hydroxymethyl)-biphenyl-2′,4′-diol;

M.W. : 546.58;

greenish-pink amorphous powder;

: 4.70 (c 0.25, MeOH);

UV (c 0.025, MeOH) λ _max ㎚ : 199, 298 and 440;

IR v _max (KBr) ㎝^-1: 3386 (OH), 2943 (C-H stretching), 2205-2198 (C≡C), 1641, 1599 (C=C), 1453, 1379 (C-H bending), 1166, 1078, 1041 (C-O), 887, 669;

¹H (400 ㎒) and ¹³C (100 ㎒) NMR Data in acetone-d ₆ (표 2 참고);

HREIMS m/z : 546.1683 [M]⁺ (calcd for C₃₄H₂₆O₇, 546.1679).

실시예 2-5. 셀라리시닌 C( selariscinin C, 화합물 5)

selariscinin C;

2-(hydroxybis(4-hydroxyphenyl)methyl)-3-((4-hydroxyphenyl)ethynyl)-4-(methoxymethyl)-biphenyl-2′,4′-diol;

M.W. : 560.60;

pale yellow amorphous powder;

: 82.14 (c 0.1, MeOH);

UV (c 0.025, MeOH) λ _max ㎚ : 196, 265, 299, 438;

IR v _max (KBr) ㎝^-1: 3400 (OH), 2201 (C≡C), 1641, 1622 (C=C), 1468, 1374 (C-H bending), 1154, 996 (C-O);

¹H (400 ㎒) and ¹³C (100 ㎒) NMR Data in MeOH-d ₄ (표 2 참고);

HREIMS m/z : 560.1839 [M]⁺ (calcd for C₃₅H₂₈O₇, 560.1835).

실시예 2-6. 셀라리시닌 D(화합물 6)

selariscinin D;

4′-hydroxy-4-(hydroxymethyl)-3-[(4-hydroxyphenyl)ethynyl]biphenyl-2-carboxylic acid;

M.W. : 360.37;

red amorphous powder;

IR v _max (KBr) : 3394 (OH), 2943 (C-H), 2203 (C≡C), 1674 (C=O), 1631 (C=C), 1381 (C-H), 1077, and 1045 ㎝^-1;

UV (c 0.02, MeOH) λ_max (logε) : 205 (4.99), 264 (4.77), 300 (4.71), 322 (4.57), 420 (4.38) ㎚;

¹H (400 ㎒) and ¹³C (100 ㎒) NMR data in MeOH-d ₄, (표 3 참고);

HREIMS m/z : 360.1026 [M]⁺, (calcd. for C₂₂H₁₆O₅, 360.0998).

실시예 2-7. 셀라리시닌 E( selariscinin E, 화합물 7)

selariscinin E;

(2S)-2,3-dihydro-5,7,7″,2′,4′,4″′-hexahydroxy-(5′-8″)biflavone;

M.W. : 540.48;

yellow amorphous powder;

: 6.3 (c 0.25, MeOH);

UV (c 0.02, MeOH) λ _max (logε) : 204 (4.53), 221 (4.51), 286 (4.32), 329 (4.14) ㎚;

IR v _max (KBr)㎝^-1 : 3331 (OH), 2916 (C-H), 1670 (C=O), 1593, 1242, 1033

CD (MeOH) [θ]₂₂₁+18.6, [θ]₂₈₆ -8.7, [θ]₃₃₀ +4.5;

¹H (400 ㎒) and ¹³C (100 ㎒) NMR data in MeOH-d ₄, (표 3 참고);

HRFABMS m/z : 540.1060 [M]⁺ (calcd for C₃₀H₂₀O₁₀, 540.1056).

실시예 2-8. 로버스타플라본(화합물 8)

robustaflavone;

M.W. : 538.46;

m.p. : 350-352℃;

IR (KBr) ㎝^-1: 3435, 1657, 1405, 1247, 838;

FABMS m/z : 391 [M+H]⁺;

¹H-NMR (pyridine-d ₅ , 400 ㎒) : δ 7.06 (H-3), 6.77 (H-6, d, J = 2.22 Hz), 6.85 (H-8, d, J = 2.2 ㎐), 8.59 (H-2′), 7.17 (H-5′, d, J = 8.6 ㎐), 7.92 (H-6′, d, J = 8.6 ㎐), 6.93 (H-3″), 6.81 (H-8″), 7.92 (H-2″′, 6″′, d, J = 8.6 ㎐), 7.17 (H-3″′, 5″′, d, J = 8.6 ㎐);

¹³C-NMR (pyridine-d ₅ , 100 ㎒) : δ 165.3 (C-2), 104.1 (C-3), 181.9 (C-4), 163.3 (C-5), 100.3 (C-6), 166.4 (C-7), 95.3 (C-8), 159.6 (C-9), 105.5 (C-10), 122.1 (C-1′), 128.9 (C-2′), 123.4 (C-3′), 161.5 (C-4′), 117.9 (C-5′), 132.9 (C6′), 165.0 (C-2″), 103.5 (C-3″), 181.5 (C-4″), 164.7 (C-5″), 105.9 (C-6″), 162.6 (C-7″), 95.3 (C-8″), 156.7 (C-9″), 105.4 (C-10″), 123.2 (C-1″′), 129.5 (C-2″′, 6″′), 117.0 (C-3″′, 5″′), 162.7 (C-4″′).

실시예 2-9. 커프레서플라본(화합물 9)

cupressuflavone;

M.W. : 538.46;

m.p. : 360-361℃;

IR (KBr) ㎝^-1 : 3424, 1647, 1409, 1245, 836;

FABMS m/z : 391 [M+H]⁺;

¹H-NMR (acetone-d ₆ , 400 ㎒) : δ 6.81 (2H, s, H-3, 3″), 6.49 (2H, s, H-6′, 6″), 7.52 (4H, d, J = 8.7 ㎐, H-2′ ,2″′ ,6′, 6″′), 6.76 (4H, d, J = 8.7 ㎐, H-3′, 3″′, 5′, 5″′);

¹³C-NMR (acetone-d ₆ , 100 ㎒) : δ 163.1 (C-2, 2″), 102.1 (C-3, 3″), 181.8 (C-4, 4″), 160.5 (C-5, 5″), 100.0 (C-6, 6″), 161.0 (C-7, 7″), 99.9 (C-8, 8″), 154.5 (C-9, 9″), 102.9 (C-10, 10″), 121.0 (C-1′, 1″), 127.5 (C-2′, 2″′, 6′, 6″′), 115.6 (C-3′, 3″′, 5′, 5″′), 161.0 (C-4′, 4″′).

실시예 2-10. 타이와니아플라본(화합물 10)

taiwaniaflavone;

M.W. : 538.46;

¹H-NMR (Methanol-d ₄ , 500 ㎒) : δ 6.51 (IH, s, H-3), 6.08 (IH, s, H-6) , 7.64 (2H, d, J = 8.5 ㎐, H-2', 6'), 6.57-6.59 (3H, s, H-3', 5', 3″), 6.53 (1H, s, H-6″), 6.08 (1H, s, H-8″), 8.26(1H, br d, J = 2.0 ㎐, H-2″′), 7.08 (1H, d, J = 8.5 ㎐, H-5″′), 7.86 (1H, br dd, J = 8.5, 2.0 ㎐, H-6″′);

¹³C-NMR (Methanol-d ₄ , 125 ㎒) : δ 166.1 (C-2), 109.1 (C-3), 183.9 (C-4), 165.6 (C-5), 103.0 (C-6), 163.7 (C-7), 96.7 (C-8), 159.8 (C-9), 103.8 (C-10), 122.8 (C-1′), 129.4 (C-2′), 117.2 (C-3′), 163.4 (C-4′), 117.2(C-5′), 129.4 (C-6′), 165.6 (C-2″), 103.2 (C-3″), 189.3 (C-4″), 162.8 (C-5″), 102.9 (C-6″), 162.2 (C-7″), 96.7 (C-8″), 159.8 (C-9″), 103.6 (C-10″), 121.9 (C-1″′), 132.8 (C-2″′), 125.1 (C-3″′), 156.7 (C-4″′), 121.0 (C-5″′), 127.5 (C-6″′).

실시예 2-11. 3,8″- 비아피게닌 (화합물 11)

3,8″-biapigenin;

M.W. : 538.46;

¹H-NMR(400 ㎒, DMSO) : δ 6.30 (1H, s, H-6), 6.55 (1H, s, H-8), 7.38 (2H, d, J = 8.8 ㎐, H-2′, 6′), 6.71 (2H, d, J = 8.8 ㎐, H-3′, 5′), 6.56 (1H, s, H-3″), 6.31 (1H, s, H-6″), 7.60 (2H, d, J = 8.8 ㎐, H-2″′, 6″′), 6.81 (2H, d, J = 8.8 ㎐, H-3″′, 5″′).

¹³C-NMR(400 ㎒, DMSO) : δ 163.7 (C-2), 110.3 (C-3), 180.7 (C-4), 162.5 (C-5), 99.0 (C-6), 164.7 (C-7), 94.1 (C-8), 157.7 (C-9), 99.4 (C-10), 123.2 (C-1′), 128.3 (C-2′), 115.5 (C-3′), 161.4 (C-4′), 115.4 (C-5′), 128.3 (C-6′), 164.0 (C-2″), 103.3 (C-3″), 182.2 (C-4″), 160.2 (C-5″), 99.5 (C-6″), 161.8 (C-7″), 103.1 (C-8″), 155.2 (C-9″), 104.0 (C-10″), 121.4 (C-1″′), 130.0 (C-2″′), 116.2 (C-3″′), 161.4 (C-4″′), 116.2 (C-5″′), 130.0 (C-6″′).

	화합물 1( selaginellin )		화합물 2( selariscinin A)		화합물 3( selaginellin M)
pos .	δ _H ( J in ㎐)	δ _C , type	δ _H ( J in ㎐)	δ _C , type	δ _H ( J in ㎐)	δ _C , type
1		165.6, C		181.7, C		189.4, C
2	6.51 (br d, 8.8)	122.3, CH	6.46 (dd, 2.0, 8.8)	123.3, CH	6.47 (dd, 2.4, 10.0)	128.6, CH
3	7.14 (br d, 8.8)	138.9, CH	7.18 (dd, 2.0, 8.8)	140.6, CH	7.48 (dd, 2.8, 10.0)	142.4, CH
4		131.9, C		131.6, C		131.8, C
5	7.14 (br d, 8.8)	138.9, CH	7.18 (dd, 2.0, 8.8)	140.6, CH	7.59 (dd, 2.8, 10.0)	141.7, CH
6	6.51 (br d, 8.8)	122.3, CH	6.46 (dd, 2.0, 8.8)	123.3, CH	6.44 (dd, 2.4, 10.0)	129.0, CH
7		165.6, C		170.2, C		164.6, C
8	7.14 (br d, 8.8)	138.9, CH	7.18 (dd, 2.0, 8.8)	140.6, CH	6.77 (dd, 2.0, 8.8)	134.2, CH
9	6.51 (br d, 8.8)	122.3, CH	6.46 (dd, 2.0, 8.8)	128.5, CH	6.75 (dd, 2.0, 8.8)	114.7, CH
10		165.6, C		181.7, C		163.1, C
11	6.51 (br d, 8.8)	122.3, CH	6.46 (dd, 2.0, 8.8)	128.5, CH	6.75 (dd, 2.0, 8.8)	114.7, CH
12	7.14 (br d, 8.8)	138.9, CH	7.18 (dd, 2.0, 8.8)	140.6, CH	6.77 (dd, 2.0, 8.8)	134.2, CH
13		131.9, C		131.6, C		132.6, C
14		123.9, C		124.4, C		123.8, C
15		143.0, C		142.8, C		143.1, C
16	7.70 (d, 8.0)	128.9, CH	7.74 (d, 8.0)	128.8, CH	7.72 (d, 7.6)	128.7, CH
17	7.33 (d, 8.0)	131.1, CH	7.38 (d, 8.0)	130.7, CH	7.34 (d, 7.6)	131.0, CH
18		143.6, C		143.9, C		143.5, C
19		142.4, C		142.5, C		143.0, C
20	6.76 (br d, 8.4)	131.2, CH	6.87 (dd, 2.0, 8.4)	130.9, CH	6.85 (dd, 2.0, 8.8)	131.2, CH
21	6.53 (br d, 8.4)	115.9, CH	6.51 (dd, 2.0, 8.4)	115.8, CH	6.54 (dd, 2.0, 8.8)	115.9, CH
22		158.0, C		158.0, C		158.1, C
23	6.53 (br d, 8.4)	115.9, CH	6.51 (dd, 2.0, 8.4)	115.8, CH	6.54 (dd, 2.0, 8.8)	115.9, CH
24	6.76 (br d, 8.4)	131.2, CH	6.87 (dd, 2.0, 8.4)	130.9, CH	6.85 (dd, 2.0, 8.8)	131.2, CH
25		133.1, C		133.1, C		132.7, C
26	4.94 (s)	63.7, CH₂	4.94 (s)	63.6, C	4.96 (s)	63.7, CH₂
27		84.7, C		84.4, C		84.7, C
28		100.7, C		101.1, C		100.7, C
29	6.98 (br d, 8.8)	134.2, CH	6.97 (dd, 2.0, 8.8)	134.3, CH	6.99 (dd, 2.0, 8.8)	134.7, CH
30	6.62 (br d, 8.8)	116.5, CH	6.62 (dd, 2.0, 8.8)	116.8, CH	6.63 (dd, 2.0, 8.8)	116.5, CH
31		159.6, C		160.5, C		159.7, C
32	6.62 (br d, 8.8)	116.5, CH	6.62 (dd, 2.0, 8.8)	116.8, CH	6.63 (dd, 2.0, 8.8)	116.5, CH
33	6.98 (br d, 8.8)	134.2, CH	6.97 (dd, 2.0, 8.8)	134.3, CH	6.99 (dd, 2.0, 8.8)	134.7, CH
34		114.6, C		114.1, C		114.6, C
OCH₃					3.77 (s)	56.1, CH₃

	화합물 4(selariscinin B ^a )		화합물 5( selariscinin C)
pos.	δ _H ( J in ㎐)	δ _C , type	δ _H ( J in ㎐)	δ _C , type
1		156.9, C		157.1, C
2	6.66 (dd, 2.0, 8.8)	115.2, CH	6.58 (dd, 2.0, 8.4)	115.4, CH
3	7.15 (dd, 2.0, 8.8)	131.2, CH	7.10 (dd, 2.0, 8.4)	131.5, CH
4		134.9, C		135.3, C
5	7.15 (dd, 2.0, 8.8)	131.2, CH	7.10 (dd, 2.0, 8.4)	131.5, CH
6	6.66 (dd, 2.0, 8.8)	115.2, CH	6.58 (dd, 2.0, 8.4)	115.4, CH
7		65.8, C		66.3, C
8	7.15 (dd, 2.0, 8.8)	131.2, CH	7.10 (dd, 2.0, 8.4)	131.5, CH
9	6.66 (dd, 2.0, 8.8)	115.2, CH	6.58 (dd, 2.0, 8.4)	115.4, CH
10		156.9, C		157.1, C
11	6.66 (dd, 2.0, 8.8)	115.2, CH	6.58 (dd, 2.0, 8.4)	115.4, CH
12	7.15 (dd, 2.0, 8.8)	131.2, CH	7.10 (dd, 2.0, 8.4)	131.5, CH
13		134.9, C		135.3, C
14		119.7, C		122.1, C
15		143.1, C		138.5, C
16	7.59 (d, 8.0)	126.7, CH	7.42 (d, 7.6)	129.1, CH
17	7.75 (d, 8.0)	119.5, CH	7.67 (d, 7.6)	119.5, CH
18		140.7, C		142.3, C
19		152.9, C		153.9, C
20	7.67 (d, 8.0)	121.5, CH	7.61 (d, 8.4)	121.9, CH
21	6.84 (dd, 2.0, 8.0)	115.6, CH	6.78 (dd, 2.0, 8.4)	115.9, CH
22		158.8, C		159.6, C
23	6.78 (d, 2.0)	113.4, CH	6.71 (d, 2.0)	113.6, CH
24		157.3, C		157.8, C
25		131.8, C		132.1, C
26	4.82 (s)	63.3, CH₂	4.63 (s)	74.4, CH₂
27		85.3, C		85.7, C
28		102.1, C		102.5, C
29	6.98 (dd, 2.0, 8.8)	133.5, CH	6.87 (dd, 2.0, 8.8)	133.9, CH
30	6.80 (dd, 2.0, 8.8)	116.5, CH	6.69 (dd, 2.0, 8.8)	116.7, CH
31		158.8, C		159.4, C
32	6.80 (dd, 2.0, 8.8)	116.5, CH	6.69 (dd, 2.0, 8.8)	116.7, CH
33	6.98 (dd, 2.0, 8.8)	133.5, CH	6.87 (dd, 2.0, 8.8)	133.9, CH
34		115.5, C		115.9, C
OCH₃			3.43 (s)	58.9, CH₃
^a Compound was measured in acetone-d ₆

	화합물 6( selariscinin D)		화합물 7( selariscinin E)
pos .	δ _H ( J in ㎐)	δ _C	δ _H ( J in ㎐)	δ _C
1		123.8
2		143.0	5.42 (1H, dd, 12.8, 2.8)	80.6
3	7.69 (1H, d, 8.0)	129.0	3.18 (1H, dd, 12.8, 16.8) 2.76 (1H, dd, 2.8, 16.8)	44.1
4	7.31 (1H, d, 8.0)	131.0		198.0
5		143.6		168.5
6		142.7	5.87 (1H, d, 2.0)	97.2
7		165.5		165.6
8	4.91 (2H, s)	63.7	5.90 (1H, d, 2.0)	96.4
9		84.7		165.1
10		100.7		103.5
1′		114.6		131.2
2′	6.97 (1H, dd, 8.8, 2.0)	134.2		162.4
3′	6.62 (1H, dd, 8.8, 2.0)	116.5	6.38 (1H, s)	100.2
4′		159.6		163.8
5′	6.62 (1H, dd, 8.8, 2.0)	116.5		103.4
6′	6.97 (1H, dd, 8.8, 2.0)	134.2	7.44 (1H, s)	128.9
1″		133.1
2″	6.75 (1H, dd, 8.4, 2.0)	131.2		166.3
3″	6.53 (1H, dd, 8.4, 2.0)	115.9	6.60 (1H, s)	103.4
4″		158.0		184.5
5″	6.53 (1H, dd, 8.4, 2.0)	115.9	7.41 (1H, d, 8.4)	131.3
6″	6.75 (1H, dd, 8.4, 2.0)	131.2	7.05 (1H, d, 8.4)	117.0
7″				157.4
8″				120.8
9″				156.6
10″				106.4
1″′				123.4
2″′			7.55 (1H, dd, 8.8, 2.4)	129.6
3″′			6.79 (1H, dd, 8.8, 2.4)	117.0
4″′				162.7
5″′			6.79 (1H, dd, 8.8, 2.4)	117.0
6″′			7.55 (1H, dd, 8.8, 2.4)	129.6

< 실시예 3. 세포생존율 측정>

상기 실시예 1에서 부처손으로부터 분리된 화합물 1 내지 11의 세포생존율을 측정하기 위해, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 실시하였다.

3T3-L1 세포(American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA)를 96웰 플레이트(96well microtiter plate)에 1×10⁴세포가 되도록 각 웰에 분주하고 본 발명의 화합물 1 내지 11을 처리하여 48시간 동안 배양하였다. 이후, 1㎎/㎖의 MTT 용액을 첨가하고 37℃에서 1시간 반응하였으며, 포르마잔 결정에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 분주하여 용해시킨 뒤 분광 광도계(Immuno Mini NJ-2300, Japan)로 540㎚에서 흡광도를 측정하여 도 1에 나타내었다.

도 1의 결과, 본 발명의 화합물 1 내지 11은 대조군(무처리군)과 유사한 세포생존율 결과를 나타내어, 세포독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있다.

< 실시예 4. 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B의 저해활성 측정>

단백질 타이로신 탈인산화효소 1B에 의해 기질인 p-니트로페닐 인산염(p-nitrophenyl phosphate, p-NPP)이 p-니트로페놀(p-nitrophenol, p-NP)로 변화되면서 노란색을 나타내므로 405㎚에서 흡광도의 변화를 통해 효소활성을 측정하였다(Cui, L. et al., 2006).

단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(human, recombinant)는 BIOMOL^® International LP(Plymouth Meeting, PA)에서 구입하였다. 96웰 플레이트(96wells microtiter plate)에 최종 부피 110㎕로 완충액((50mM citrate, pH 6.0), 0.1M NaCl, 1mM EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 1mM DTT(dithiothreitol))에 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B와 본 발명의 화합물 1 내지 11이 각각 포함된 혼합 처리물을 만든 뒤 37℃에서 10분 동안 반응하였다. 이후, 50㎕의 p-NPP를 더하여 20℃에서 20분간 반응하였고, 10M 수산화나트륨(10M NaOH)을 처리하여 반응을 종결시켰으며, 최종 남아있는 p-니트로페닐 인산염의 양을 405㎚에서 VERSA max(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) microplate reader로 확인하였다. 각 화합물의 활성은 하기 표 4에 IC₅₀(the half maximal inhibitory concentration)으로 나타내었다.

조건	단백질 타이로신 탈인산화효소 1B 저해 효과(IC₅₀)
실시예 1의 메탄올 추출물	121.3㎍/㎖
실시예 1의 에틸아세테이트 분획물	71.5㎍/㎖
우르솔산	1.6㎍/㎖ (3.5uM)
RK-682¹⁾	1.7㎍/㎖ (4.5uM)
화합물 1	8.1㎍/㎖ (15.9uM)
화합물 2	2.4㎍/㎖ (4.6uM)
화합물 3	6.1㎍/㎖ (11.5uM)
화합물 4	11.8㎍/㎖ (21.6uM)
화합물 5	10.9㎍/㎖ (19.4uM)
화합물 6	4.8㎍/㎖ (13.2uM)
화합물 7	5.3㎍/㎖ (9.8uM)
화합물 8	3.3㎍/㎖ (6.2uM)
화합물 9	5.2㎍/㎖ (9.6uM)
화합물 10	2.9㎍/㎖ (5.4uM)
화합물 11	2.4㎍/㎖ (4.5uM)
¹⁾ 양성대조 물질(통상적인 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B 저해제)

표 4의 결과를 참고하면, 화합물 1 내지 11은 실시예 1의 메탄올 추출물에 비해 10~51배 더 강한 저해활성을 가지는 것으로 확인되고, 실시예 1의 에틸아세테이트 분획물에 비해서는 6~30배 더 강한 저해활성을 가지는 것으로 확인된다. 따라서 본 발명의 부처손 유래 화합물이 타이로신 탈인산화효소 1B에 대해 우수한 저해 효과를 나타냄을 확인할 수 있다.

<실시예 5. 지방세포에서의 포도당 흡수 측정>

지방세포에서의 포도당 흡수(glucose uptake)를 모니터링 하기 위해 형광이 부착된 포도당 유사체인 2-NBDG(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose)를 사용하였다.

96-블랙 웰 플레이트(96-black well plates)에 3T3-L1 세포와 5μM의 본 발명의 화합물 1 내지 11을 각각 처리하고 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 배양하였다. 이후, 1%[w/v] BSA(bovine serum albumin)가 첨가된 PBS(phosphate buffer saline) 용액에 2-NBDG를 용해하여 각 웰에 2-NBDG의 최종농도가 250μM이 되게 첨가한 뒤 30분 더 반응하였고, 반응 후에는 PBS로 2회 세척하였다. 남아있는 세포의 형광은 Perkin Elmer Victor3 V 1420 Multilabel Plate Counter (Perkin Elmer, USA)를 사용하여 여기 파장 485㎚ 및 발광 파장 535㎚에서 형광을 측정하여 표 5에 나타내었다.

조건	포도당 흡수(fold of induction)
DMSO	1
인슐린	1.5
화합물 1	1.2
화합물 2	1.3
화합물 3	1.4
화합물 4	1.1
화합물 5	1.2
화합물 6	1.2
화합물 7	0.9
화합물 8	1
화합물 9	1.1
화합물 10	1.5
화합물 11	1.4

표 5의 결과, 화합물 3, 10 및 11의 경우 인슐린과 유사한 포도당 흡수 결과를 나타내어, 포도당 흡수를 원활하게 하고 혈당을 낮추는 효과가 우수한 것임을 확인할 수 있다.

< 실시예 6. 독성실험>

실시예 6-1. 급성독성

본 발명의 셀라리시닌(selariscinin A, 화합물 2)를 단기간에 과량을 섭취하였을 때 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스를 20마리를 준비하였고, 각 군별로 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 30% PEG-400만을 투여하고, 실험군은 본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2)를 1.0g/㎏의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 상기 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2)를 투여한 실험군에서는 모두 생존하였다.

실시예 6-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2)를 1.0g/㎏의 농도로 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(blood urea nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(vital scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 절취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으나 특이한 이상은 관찰되지 않았다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2) 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사제의 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2) 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2. 식품 제조>

제제예 2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2)를 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2)를 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2)를 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.

제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2)를 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

제제예 2-5. 야채주스 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2) 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.

제제예 2-6. 과일주스 제조

본 발명의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2) 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims

부처손(Selaginella tamariscina)으로부터 분리된 하기 화학식 1의 셀라기넬린(selaginellin, 화합물 1), 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라기넬린 M(selaginellin M, 화합물 3), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6), 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7), 로버스타플라본(robustaflavone, 화합물 8), 커프레서플라본(cupressuflavone, 화합물 9), 타이와니아플라본(taiwaniaflavone, 화합물 10) 및 3,8″-비아피게닌(3,8″-biapigenin, 화합물 11)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 대사성 질환은 비만 또는 당뇨병 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 화합물은 포도당 흡수(glucose uptake)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가하여 약제학적 투여형으로 제형화되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물.
부처손(Selaginella tamariscina)으로부터 분리된 하기 화학식 1의 셀라기넬린(selaginellin, 화합물 1), 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라기넬린 M(selaginellin M, 화합물 3), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6), 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7), 로버스타플라본(robustaflavone, 화합물 8), 커프레서플라본(cupressuflavone, 화합물 9), 타이와니아플라본(taiwaniaflavone, 화합물 10) 및 3,8″-비아피게닌(3,8″-biapigenin, 화합물 11)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 포함하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
[화학식 1]
제6항에 있어서,
상기 대사성 질환은 비만 또는 당뇨병 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제6항에 있어서,
상기 화합물은 단백질 타이로신 탈인산화효소 1B(protein tyrosine phosphatase 1B, PTP1B)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
제6항에 있어서,
상기 화합물은 포도당 흡수(glucose uptake)를 증가시키는 것을 특징으로 하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
하기 화학식 2의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6) 및 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7)로 이루어진 군에서 선택되는 신규 화합물.
[화학식 2]
부처손(Selaginella tamariscina)을 물, C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출하여 부처손 추출물을 제조하는 단계; 상기 부처손 추출물을 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올을 이용하여 순차적으로 분획하는 단계; 및 상기 각 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 하기 화학식 2의 셀라리시닌 A(selariscinin A, 화합물 2), 셀라리시닌 B(selariscinin B, 화합물 4), 셀라리시닌 C(selariscinin C, 화합물 5), 셀라리시닌 D(selariscinin D, 화합물 6) 및 셀라리시닌 E(selariscinin E, 화합물 7)로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 분리하는 방법.
[화학식 2]